Aspectos estructurales y cinéticos de la interacción ligando-receptor relevantes en la farmacología de la esquizofrenia

TESIS DOCTORAL ASPECTOS ESTRUCTURALES Y CINÉTICOS DE LA INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR RELEVANTES EN LA FARMACOLOGÍA DE LA ESQUIZOFRENIA Javier Rodríguez Carracedo Departamento de Farmacología Facultad de Farmacia SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 ASPECTOS ESTRUCTURALES Y CINÉTICOS DE LA INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR RELEVANTES EN LA FARMACOLOGÍA DE LA ESQUIZOFRENIA Memoria presentada para optar al grado de Doctor Javier Rodríguez Carracedo 2015 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Dña. María Isabel Loza García, doctora en Farmacia por la Universidad de Santiago de Compostela, y Dña. María de los Ángeles Castro Pérez, Doctora en Farmacia por la Universidad Complutense de Madrid, CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada “Aspectos estructurales y cinéticos de la interacción ligando-receptor relevantes en la farmacología de la esquizofrenia”, que para optar al grado de Doctor presenta D. Javier Rodríguez Carracedo, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el departamento de Farmacología de la Facultad de Farmacia y cumple los requisitos para ser presentada y juzgada por el tribunal correspondiente. En Santiago de Compostela, a 9 de noviembre de 2015. Fdo.: María Isabel Loza García Fdo.: María de los Ángeles Castro Pérez FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Campus Universitario Vida s/n. 15782 Santiago de Compostela RESUMEN DE LA TESIS En este trabajo, se investigó en primer lugar la relevancia de ciertos determinantes estructurales en el bolsillo de unión de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) pertenecientes al receptoroma de antipsicóticos, para la afinidad y selectividad de dos antipsicóticos atípicos de gran relevancia farmacológica y clínica, clozapina y olanzapina. Partiendo de un análisis biocomputacional multirreceptorial de los perfiles de afinidad de ambos fármacos por distintos GPCRs así como de datos de modelización y acoplamiento ligando-receptor disponibles, se generaron receptores (serotoninérgico 5-HT2A, dopaminérgico D2) mutados en posiciones de interés y se determinó la afinidad de ambos antipsicóticos mediante ensayos de unión de radioligandos de competición en el equilibrio, identificándose posiciones aminoacídicas cuya identidad es relevante para el perfil de afinidad y selectividad de estos fármacos. Por otra parte, se abordó un estudio de las cinéticas de interacción del antipsicótico atípico lurasidona con uno de los GPCRs diana más relevante en su perfil farmacológico, el receptor de serotonina 5HT7. Así, se cuantificó el parámetro tiempo de residencia del fármaco en dicho receptor en ensayos de unión de radioligandos cinéticos mediante el método de competición cinética de Motulsky y Mahan. Esto supuso la puesta a punto y la ejecución de un primer paso de cara a la caracterización del perfil de selectividad cinético de lurasidona. La determinación de este parámetro permitió obtener información farmacológica relevante relativa al fármaco. Por último, se estudió la relevancia para las cinéticas de interacción ligando-receptor de la identidad de un residuo en el bucle extracelular 3 del receptor de adenosina A2A, receptor postulado como de interés terapéutico en esquizofrenia. Mediante ensayos de unión de radioligandos cinéticos, se pudo comprobar que dicho residuo, identificado como de potencial interés en base a datos de simulación de dinámica molecular, resulta determinante para la cinética de disociación del radioligando antagonista A2A-selectivo [3H]-ZM241385. Palabras clave: Receptores acoplados a proteínas G, antipsicóticos, perfil de selectividad, cinéticas de la interacción ligando-receptor y tiempo de residencia. THESIS ABSTRACT In this work, we first investigated the relevance of certain structural determinants in the binding site of G protein-coupled receptors (GPCRs) belonging to the receptorome of antipsychotics, for the affinity and selectivity of two pharmacologically and clinically relevant atypical antipsychotics, clozapine and olanzapine. Based on biocomputational multirreceptorial analysis of the affinity profiles of both drugs at different GPCRs, as well as on data available from modeling and docking studies, specific receptors (serotonin 5-HT2A, dopamine D2) were mutated at the positions of interest and the affinity of both antipsychotics for the mutant receptors was determined in radioligand competition binding assays. This led us to identify amino acids in specific positions of the receptors relevant for the affinity and selectivity of both drugs. As a second step in our study of structural determinants relevant for the ligand-receptor interactions in schizophrenia, we addressed the determination of the ligand binding kinetics of the atypical antipsychotic lurasidone at one of the most relevant target GPCRs in its receptorome, the serotonin 5-HT7 receptor. Hence, the parameter residence time of the drug in the receptor was quantified in kinetic radioligand competition binding assays, applying the Motulsky and Mahan method. The successful implementation of this methodology represents the first step towards a characterization of the kinetic selectivity profile of lurasidone. The determination of the residence time of lurasidone at 5-HT7 receptors allowed us to extract relevant pharmacological information related to the drug. Finally, we studied the relevance of the identity of a residue in extracellular loop 3 of the adenosine A2A receptor, another GPCR of interest in schizophrenia, for the ligand-receptor interaction kinetics. By kinetic radioligand binding assays, we found that this residue, identified upon the analysis of data available from molecular dynamics simulations, is indeed determinant for the dissociation kinetics of the A2Aselective antagonist radioligand [3H]-ZM241385. Keywords: G protein-coupled receptors, antipsychotics, selectivity profile, ligand-receptor interaction kinetics and residence time. Índice XVI Otras patologías en las que están indicados los fármacos antipsicóticos o éstos tienen potencial utilidad .................................................................................................. 29 Necesidad terapéutica en esquizofrenia: énfasis en la sintomatología negativa y cognitiva .......................................................................................................................... 30 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G (GPCRS) OBJETO DE ESTUDIO, RELEVANTES EN LA PATOLOGÍA Y LA TERAPÉUTICA DE LA ESQUIZOFRENIA ................ 32 Introducción a los receptores acoplados a proteínas G ...................................... 32 El ciclo de vida de un GPCR ................................................................................. 35 Dimerización y oligomerización de GPCRs.......................................................... 38 Cambios conformacionales en GPCRs y selectividad funcional .......................... 40 Modulación alostérica en GPCRs .......................................................................... 45 GPCRs implicados en la fisiopatología de la esquizofrenia ................................ 47 El receptor 5-HT2A de serotonina .......................................................................... 47 El receptor de dopamina D2 ................................................................................... 51 El receptor de serotonina 5-HT7 ............................................................................ 53 El receptor de adenosina A2A ................................................................................ 58 Aspectos estructurales y cinéticos de la interacción ligando-receptor en GPCRs ...................................................................................................................... 63 Recientes avances en el conocimiento de la estructura y las conformaciones de los GPCRs ............................................................................... 63 Aspectos cinéticos de la interacción ligando-receptor: el tiempo de residencia (tR) ......................................................................................................... 72 XVII Índice ESTUDIO DE DETERMINANTES ESTRUCTURALES EN EL SITIO DE UNIÓN DEL RECEPTOR RELEVANTES PARA EL PERFIL DE AFINIDAD Y SELECTIVIDAD DE ANTIPSICÓTICOS SOBRE GPCRS DE SU RECEPTOROMA ................................................ 87 Relevancia del residuo en posición 3.36 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma .................................................................................. 92 Relevancia de los residuos en las posiciones 5.43 y 5.46 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma .......................................................... 95 Relevancia del residuo en posición 3.33 para la unión de antipsicóticos a GPCRs diana y antidiana de su receptoroma ................................................. 100 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: TIEMPO DE RESIDENCIA DEL ANTIPSICÓTICO ATÍPICO LURASIDONA EN EL RECEPTOR DE SEROTONINA 5-HT7 ............................................................................. 105 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: RELEVANCIA DEL RESIDUO HIS264 EN EL3 PARA LAS CINÉTICAS DE ASOCIACIÓN Y DISOCIACIÓN DE [3H]-ZM241385 AL RECEPTOR DE ADENOSINA A2A ............................................................................................................................. 110 HIPÓTESIS .................................................................................................................. 117 OBJETIVOS ................................................................................................................. 118 MATERIALES Y COMPUESTOS ..................................................................................... 123 MÉTODOS ................................................................................................................... 125 Mutagénesis dirigida ............................................................................................ 125 Cultivo celular y generación de líneas celulares expresando establemente los receptores a estudio .................................................................. 128 Preparación de membranas para ensayos de unión de radioligandos ............ 130 Preparación de membranas de líneas celulares CHO-5-HT2A y receptores CHO-D2S ............................................................................................................... 130 Preparación de membranas de líneas CHO-5-HT1A ............................................ 130 Índice XVIII Preparación de membranas de la línea celular que expresa el receptor 5HT7 ........................................................................................................................ 131 Preparación de membranas de líneas celulares expresando receptores A2A ........ 131 Determinación de la concentración de proteína en las preparaciones de membranas ............................................................................................................ 132 Ensayos de unión de radioligandos ..................................................................... 132 Ensayos sobre receptores 5-HT2A, D2 y 5-HT1A para el estudio de determinantes estructurales en el sitio de unión del receptor relevantes para el perfil de afinidad y selectividad de antipsicóticos ............................................ 132 Determinaciones de unión específica para la selección de clones celulares expresando receptores mutados ..................................................................................... 132 Selección de clones expresando el receptor 5-HT2A-Ser3.36Cys .................................. 132 Selección de clones expresando receptores D2S-Cys3.36Ser, D2SSer5.43Thr/Ser5.46Ala y D2S-Val3.33Tyr ..................................................................... 133 Selección de clones expresando el receptor 5-HT1A-Thr5.43Ser/Ala5.46Ser................ 134 Ensayos de saturación ................................................................................................... 134 Ensayos de saturación en receptores 5-HT2A y 5-HT2A-Ser3.36Cys.............................. 134 Ensayos de saturación en receptores D2S, D2S-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala y D2SVal3.33Tyr ..................................................................................................................... 135 Ensayos de competición ................................................................................................ 135 Ensayos de competición en receptores 5-HT2A y 5-HT2A-Ser3.36Cys .......................... 135 Ensayos de competición en receptores D2S, D2S-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala y D2SVal3.33Tyr ..................................................................................................................... 135 Ensayos sobre el receptor 5-HT7 ......................................................................... 136 Ensayos de saturación ................................................................................................... 136 Ensayos de competición en el equilibrio ....................................................................... 137 Ensayos cinéticos de disociación de [3H]-SB269970 para la determinación de la constante de velocidad de disociación del radioligando ........................................... 137 XIX Índice Ensayos cinéticos de asociación de [3H]-SB269970 para la determinación de la constante de velocidad de asociación del radioligando ................................................ 138 Ensayos de competición cinética para la determinación de las constantes de velocidad de asociación (kon, k3) y disociación (koff, k4) de lurasidona.......................... 139 Ensayos sobre receptores A2A ............................................................................. 140 Determinaciones de unión específica para la selección de clones celulares expresando el receptor A2A-His7.29Asn......................................................................... 140 Ensayos de saturación ................................................................................................... 141 Ensayos cinéticos de disociación de [3H]-ZM241385 para la determinación de la constante de velocidad de disociación del radioligando ........................................... 141 Ensayos cinéticos de asociación de [3H]-ZM241385 para la determinación de la constante de velocidad de asociación del radioligando ............................................ 141 Análisis de los resultados de ensayos de unión de radioligandos ....................... 142 Ensayos de saturación ................................................................................................... 142 Ensayos de competición en el equilibrio ....................................................................... 142 Ensayos cinéticos de disociación para la determinación de la constante de velocidad de disociación del radioligando .................................................................... 144 Ensayos cinéticos de asociación para la determinación de la constante de velocidad de asociación observada del radioligando.................................................... 145 Cálculo de la constante de velocidad de asociación (kon) del radioligando a partir de datos de koff y kobs ............................................................................................ 146 Cálculo de la “constante de disociación cinética” (Kd,cin) del radioligando y lurasidona a partir de datos de koff y kon ........................................................................ 146 Determinación de las constantes de velocidad koff y kon de radioligandos a partir de los valores de constante de velocidad de asociación observada (kobs) mediante regresión. ....................................................................................................... 147 Índice XX Ensayos de competición cinética para la determinación de las constantes de velocidad de asociación (kon, k3) y disociación (koff, k4) de un ligando competidor no marcado ................................................................................................. 148 ESTUDIO DE DETERMINANTES ESTRUCTURALES EN EL SITIO DE UNIÓN DEL RECEPTOR RELEVANTES PARA EL PERFIL DE AFINIDAD Y SELECTIVIDAD DE ANTIPSICÓTICOS SOBRE GPCRS DE SU RECEPTOROMA .............................................. 153 Relevancia del residuo en posición 3.36 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma ................................................................................ 153 Unión del radioligando [3H]-ketanserina a los receptores 5-HT2A y 5HT2A-Ser3.36Cys .................................................................................................. 153 Unión del radioligando [3H]-espiperona a los receptores D2 y D2Cys3.36Ser ............................................................................................................ 155 Afinidad de clozapina y olanzapina por los receptores 5-HT2A y 5-HT2ASer3.36Cys ............................................................................................................ 155 Relevancia de los residuos en las posiciones 5.43 y 5.46 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma ........................................................ 159 Unión del radioligando [3H]-espiperona a los receptores D2 y D2Ser5.43Thr/Ser5.46Ala ......................................................................................... 159 Unión del radioligando [3H]- 8-OH-DPAT a los receptores 5-HT1A y 5HT1A-Thr5.43Ser/Ala5.46Ser ............................................................................... 161 Afinidad de clozapina y olanzapina por los receptores D2 y D2Ser5.43Thr/Ser5.46Ala ......................................................................................... 162 Relevancia del residuo en posición 3.33 para la unión de antipsicóticos a GPCRs diana y antidiana de su receptoroma ................................................. 164 XXI Índice Unión del radioligando [3H]-espiperona al receptor D2S-Val3.33Tyr ................. 164 Afinidad de clozapina y olanzapina por los receptores D2 y D2Val3.33Tyr ............................................................................................................ 165 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: TIEMPO DE RESIDENCIA DEL ANTIPSICÓTICO ATÍPICO LURASIDONA EN EL RECEPTOR DE SEROTONINA 5-HT7 ............................................................................. 169 Afinidad de lurasidona por el receptor 5-HT7 ................................................... 169 Determinación de parámetros cinéticos de unión del radioligando [3H]- SB269970 y lurasidona al receptor 5-HT7 .......................................................... 170 Determinación de la constante de velocidad de disociación del radioligando [3H]-SB269970 del receptor 5-HT7 ................................................. 170 Determinación de la constante de velocidad de asociación del radioligando [3H]-SB269970 al receptor 5-HT7 ................................................... 172 Determinación de las constantes de velocidad koff y kon del radioligando [3H]-SB269970 a partir de valores de constante de velocidad de asociación observada (kobs) mediante regresión ..................................................................... 173 Cálculo del valor de la “constante de disociación cinética” (Kd,cin) del radioligando [3H]-SB269970 en el receptor 5-HT7 .............................................. 174 Determinación de las constantes de velocidad de asociación (kon) y disociación (koff) de lurasidona en el receptor 5-HT7 ........................................... 175 Cálculo del tiempo de residencia (tR) de lurasidona en el receptor 5-HT7 .......... 177 Cálculo del valor de la “constante de disociación cinética” (Kd,cin) de lurasidona en el receptor 5-HT7 ............................................................................ 177 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: RELEVANCIA DEL RESIDUO HIS264 EN EL3 PARA LAS CINÉTICAS DE ASOCIACIÓN Y DISOCIACIÓN DE [3H]-ZM241385 AL RECEPTOR DE ADENOSINA A2A ............................................................................................................................. 178 Índice XXII Afinidad de [3H]-ZM241385 por los receptores A2A y A2A-His7.29Asn ........... 178 Determinación de parámetros cinéticos de unión del radioligando [3H]- ZM241385 a los receptores A2A y A2A-His7.29Asn ............................................. 179 Determinación de la constante de velocidad de disociación de [3H]- ZM241385 de ambos receptores ........................................................................... 179 Cálculo del tiempo de residencia (tR) del radioligando [3H]-ZM241385 en los receptores A2A y A2A–His7.29Asn .................................................................. 181 Determinación de la constante de velocidad de asociación del radioligando [3H]-ZM241385 al receptor A2A ...................................................... 181 Determinación de las constantes de velocidad koff y kon del radioligando [3H]-ZM241385 en el receptor A2A-His7.29Asn a partir de valores de constante de velocidad de asociación observada (kobs) mediante regresión ......... 182 Cálculo del valor de la “constante de disociación cinética” (Kd,cin) del radioligando [3H]-ZM241385 en los receptores A2A y estimación de la constante de velocidad de asociación (kon) de [3H]-ZM241385 al receptor A2A-His7.29Asn a partir de datos experimentales de Kd en el equilibrio y koff ......................................................................................................................... 184 ESTUDIO DE DETERMINANTES ESTRUCTURALES EN EL SITIO DE UNIÓN DEL RECEPTOR RELEVANTES PARA EL PERFIL DE AFINIDAD Y SELECTIVIDAD DE ANTIPSICÓTICOS SOBRE GPCRS DE SU RECEPTOROMA .............................................. 189 Relevancia del residuo en posición 3.36 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma ................................................................................ 189 Relevancia de los residuos en las posiciones 5.43 y 5.46 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma ........................................................ 194 Relevancia del residuo en posición 3.33 para la unión de antipsicóticos a GPCRs diana y antidiana de su receptoroma ................................................. 201 XXIII Índice ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: TIEMPO DE RESIDENCIA DEL ANTIPSICÓTICO ATÍPICO LURASIDONA EN EL RECEPTOR DE SEROTONINA 5-HT7 ............................................................................. 206 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: RELEVANCIA DEL RESIDUO HIS264 EN EL3 PARA LAS CINÉTICAS DE ASOCIACIÓN Y DISOCIACIÓN DE [3H]-ZM241385 AL RECEPTOR DE ADENOSINA A2A ............................................................................................................................. 211 CONCLUSIONES ........................................................................................................... 217 XXV Índice de Figuras ÍNDICE DE FIGURAS Fig. 1. Estructura química de haloperidol, una butirofenona. ........................ 15 Fig. 2. Estructura química de lurasidona. ...................................................... 24 Fig. 3. Resumen de los ensayos clínicos con lurasidona para el tratamiento de la esquizofrenia.. ................................................................................. 28 Fig. 4. Estructura de la rodopsina bovina, con los 3 bucles extracelulares (E-I, E-II y E-III), el extremo N-terminal (extracelular), los 3 bucles citoplasmáticos (C-I, C-II, C-III) y el extremo C-terminal (citoplasmático). ................................................................................. 32 Fig. 5. Representación de la relación filogenética entre los GPCRs del genoma humano (Fredriksson y col., 2003). .................................................... 34 Fig. 6. Representación de la relación filogenética entre los GPCRs de los grupos α y β de la familia rodopsina del genoma humano.. ............... 35 Fig. 7. Ciclo de vida de un GPCR.. ................................................................ 37 Fig. 8. Ejemplos de receptores heteroméricos y heterómeros receptoriales. . 39 Fig. 9. Cambios conformacionales en TM6 tras la activación del receptor β2adrenérgico. ........................................................................................ 43 Fig. 10. Selectividad funcional de ligandos de GPCRs. .................................. 45 Fig. 11. Representación esquemática del fenómeno de modulación alostérica. ............................................................................................ 46 Fig. 12. Modelo del receptor 5-HT2A humano unido a su antagonista selectivo ketanserina (Dezi y col., 2007) ........................................................... 49 Fig. 13. Gráfica que representa las principales vías de señalización del receptor 5-HT7. ................................................................................................. 55 Fig. 14. Estructura química de ZM241385. ..................................................... 60 Fig. 15. Modelo de la estructura del receptor de adenosina A2A-T4L-ΔC cristalizado por Jaakola y col., (2008). ............................................... 61 Fig. 16. Sitio de unión de del receptor de adenosina A2A-T4L-ΔC uniendo el ligando ZM241385. ............................................................................ 62 Fig. 17. Áreas, variabilidad y cambios conformacionales de los GPCRs........ 67 Índice de Tablas XXXII SB269970 en el receptor 5-HT7 obtenidos en este estudio y recogidos en la literatura. .......................................................................................... 175 Tabla 13. Resumen de los valores de las constantes calculadas en los ensayos realizados con los receptores de adenosina A2A no mutado y A2AHis7.29Asn. ......................................................................................... 185 Lista de abreviaturas XXXIII LISTA DE ABREVIATURAS [nM] concentración (nM) °C grados Celsius ∆G energía libre de Gibbs (incremento) °K grados Kelvin αX receptor adrenérgico α subtipos: 1A, 2A, 2B o 2C βX receptor β-adrenérgico subtipos: 1, 2 o 3 µg microgramo µM micromolar 3H tritio 5-CT 5-carboxamidotriptamina 5-HT 5-hidroxitriptamina, serotonina 5-HTP 5-hidroxitriptófano 5-HTX receptor de serotonina 5-HT subtipo X: 1A,1B, 1D, 2A, 2B, 2C, 3, 4, 5A, 6 y 7 8-OH-DPAT 7-(dipropilamino)-5,6,7,8-tetrahidro-1-naftalenol Å Angstrom AA ácido araquidónico AC adenilato ciclasa ADA adenosina deaminasa ADN ácido desoxirribonucleico ADNc ácido desoxirribonucleico copia AEMPS Agencia española de medicamentos y productos sanitarios Akt proteína cinasa B Ala alanina AMP adenosín-5'-monofosfato AMPA ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxiazolpropiónico AMPc adenosín monofosfato 3’,5’ cíclico Lista de abreviaturas XXXIV ANOVA análisis de la varianza Arg arginina ARNm ácido ribonucleico mensajero AS-19 (2S)-(+)-5-(1,3,5-trimetilpirazol-4-il)-2-(dimetilamino)tetralina Asn asparagina Asp aspártico AT1 receptor AT1 de angiotensina II ATCC colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection) ATP adenosín-5'-trifosfato ATV área tegmental ventral AX receptor de adenosina A2A subtipos X: 1, 2A, 2B y 3 BDNF factor neurotrófico derivado de cerebro (Brain Derived Neurotrophic Factor) BES ácido N,N-bis(2-hidroxietil)2-aminoetanosulfónico Bmax densidad máxima de sitios de unión BSA albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin) CBX receptor canabinoide subtipo X: 1-2 CDC42 homólogo de la proteína de control de división celular 42 (Cell Division Control protein 42 homolog) CHO-K1 línea celular de ovario de hámster chino (Chinese Hamster Ovary) Ci curio cpm cuentas por minuto CREB elemento de respuesta a AMPc (cAMP Response Element-Binding protein) Cys cisteína DAG diacilglicerol DE desviación estándar DMEM medio de cultivo celular Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Lista de abreviaturas XXXV DMEM/F-12 medio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F12 Ham DMSO dimetilsulfóxido DMSZ colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) DOI (±) 2,5-dimetoxi-4-yodoanfetamina, 1-(2,5-dimetoxi-4yodofenil)-2-aminopropano DOM (±) 2,5-dimetoxi-4-metilanfetamina 1-(2,5-dimetoxi-4metilfenil)-2-aminopropano dpm desintegraciones por minuto DX receptor de dopamina D subtipo X: 1, 2 , 3, 4 y 5 EC50 concentración eficaz 50 EDTA ácido etilendiaminotetraacético (ethylenediaminetetraacetic acid) EE error estándar EEM error estándar de la media egr-2 factor de transcripción early growth response 2 EGTA ácido etilenglicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N′,N′-tetraacético (ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) EL bucle extracelular (Extracellular Loop) EMA Agencia Europea del Medicamento Emax efecto máximo ERK cinasas reguladas por señales extracelulares (Extracellular SignalRegulated Kinases) FBS suero bovino fetal (Fetal Bovine Serum) FRET transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (Fluorescence Resonance Energy Transfer) o transferencia de energía de resonancia de Förster (Förster resonance energy transfer) FSH hormona estimulante del folículo FST test de natación forzada Lista de abreviaturas XXXVI g gramo GABA ácido γ amino-butírico GDP guanosina-5'-difosfato GIRK canales de potasio de rectificación de entrada regulados por proteínas G (G protein-coupled Inwardly-Rectifying Potassium channels) Gln glutamina Glu glutámico Glu169 Se ejemplifica un código de posición de aminoácidos. Se indica la posición del aminoácido Glu en la secuencia de aminoácidos de una proteína Glu1695.30 Se ejemplifica un código de posición de aminoácidos. Se indica la posición del aminoácido Glu en la secuencia de aminoácidos de una proteína y la posición de acuerdo con el número de Ballesteros y Weinstein (1995) Glu5.30 Para indicar la posición de un aminoácido se hace uso preferente de la nomenclatura propuesta por Ballesteros y Weinstein (1995). El primer dígito indica el segmento transmembrana y el segundo número (separado por un punto) la posición en el segmento con respecto al aminoácido más conservado. Gly glicina GM1 gangliósido GM1. Monosialotetrahexosilgangliósido. GPCRDB base de datos de receptores acoplados a proteínas G (ver Isberg y col., 2014) GPCRs receptores acoplados a proteínas G (G Protein-Coupled Receptors) GRK cinasas de receptores acoplados a proteína G (G protein-coupled Receptor Kinases) GSK3 glucógeno sintasa cinasa 3 GTP guanosina-5'-trifosfato GTPasa guanosina-5'-trifosfatasa GWAS Estudio de asociación de genoma completo (Genome-Wide Association Study) GX Proteína G (heterotrímero) tipos X: S, i/o, q y 12 Lista de abreviaturas XXXVII h hora Hₒ Hipótesis nula HEK293 células embrionarias de riñón humano 293 (Human Embryonic Kidney 293) HEK-5-HT7 línea HEK293 que expresa de forma estable el receptor 5-HT7 humano HeLa229 línea de células epiteliales de adenocarcinoma de cérvix humanas. HeLa-A2A línea HeLa que expresa de forma estable el receptor A2A HEPES ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico His histidina HTS métodos de cribado de alto rendimiento (High-Throughput Screening) HX receptor histaminérgico subtipo X: 1, 2, 3 y 4 IC50 concentración inhibitoria del 50% de la unión o de la respuesta IL bucle intracelular Ile isoleucina IL-1β interleucina 1β IP3 inositol 1,4,5-trifosfato IPs inositoles fosfato JAK/STAT cinasa Janus/transductor de señal y activador de la transcripción (Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription) k1 constante de velocidad de asociación del radioligando en el modelo de competición cinética de Motulsky y Mahan (1983). En los modelos de mecanismos cinéticos de unión ligando-receptor (Tummino y Copeland, 2008) su significado depende del mecanismo concreto. k2 constante de velocidad de disociación del radioligando en el modelo de competición cinética de Motulsky y Mahan (1983). En los modelos de mecanismos cinéticos de unión ligando-receptor (Tummino y Copeland, 2008) su significado depende del mecanismo concreto. k3 constante de velocidad de asociación del ligando competidor en el modelo de competición cinética de Motulsky y Mahan (1983). En los modelos de mecanismos cinéticos de unión ligando-receptor Lista de abreviaturas XXXVIII (Tummino y Copeland, 2008) su significado depende del mecanismo concreto. k4 constante de velocidad de disociación del ligando competidor en el modelo de competición cinética de Motulsky y Mahan (1983). En los modelos de mecanismos cinéticos de unión ligandoreceptor (Tummino y Copeland, 2008) su significado depende del mecanismo concreto. Kd constante de disociación en el equilibrio Kd,cin constante de disociación “cinética”. Calculada a partir de constantes de unión cinéticas Ki constante de disociación en el equilibrio kobs constante de velocidad de asociación observada koff constante de velocidad de disociación kon constante de velocidad de asociación L litro LB medio de cultivo bacteriano lisogénico (Lysogeny Broth) L-DOPA L-3,4-dihidroxifenilalanina Leu leucina LH hormona luteinizante LP-211 N-(4-cianofenilmetil)-4-(2-difenil)-1-piperazinohexanamida LSD dietilamida de ácido lisérgico (Lysergic Acid Diethylamide) Lys lisina M molar MAPK cinasa activada por mitógeno (Mitogen-Activated Protein Kinase) MEM medio Minimum Essential Medium Met metionina mg miligramo mGlu2 receptor metabotrópico de glutamato mGlu2 mGlu5 receptor metabotrópico de glutamato mGlu5 MIC concentración mínima inhibitoria Lista de abreviaturas XXXIX min minuto mL mililitro mm milímetro mM milimolar MX receptor de acetilcolina muscarínico M subtipo X: 1, 2, 3, 4 o 5. NCS-1 sensor de calcio neuronal 1 NECA 5´-N-etilcarboxamidoadenosina NECAB2 proteína de unión de calcio neuronal 2. (N-terminal EF-hand calcium binding protein 2) NGF factor de crecimiento nervioso (Nerve Growth Factor) nH coeficiente de Hill nm nanómetro nM nanomolar NMDA N-metil-D-aspartato, agonista específico de los receptores heteroméricos ionotrópicos de NMDA de glutamato (subunidades GluNX: 1, 2A, 2B, 2C, 2D, 3A y 3B) NOR test de reconocimiento de objetos nuevos NRG1 neurregulina 1 PBS tampón de fosfato salino (Phosphate Buffered Saline) PCP fenciclidina PCR pdH reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) enlace mediante puente de hidrógeno PDB Base de datos de proteínas. Protein Data Bank. Berman y col. (2000). PDB ID código identificador de proteína en Protein Data Bank PDE fosfodiesterasa PDZ Dominio PDZ, implicado en señalización celular y presente en proteínas como la proteína de densidad postsináptica PSD95 (Post Synaptic Density Protein 95), la proteína supresora de tumores en Drosophila DlgA (Drosophila disc large tumor suppressor), y la Lista de abreviaturas XL proteína zonula occludens-1, zo-1 (zonula occludens-1 protein). El acrónimo combina las iniciales de estas tres proteínas. PEI polietileneimina Phe fenilalanina pIC50 -log de la concentración inhibitoria del 50% de la unión o de la respuesta PIP2 fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PKA proteína cinasa A PKC proteína cinasa C pKi -log de la constante de disociación en el equilibrio PKPD Integración farmacocinética-farmacodinámica (farmacología cuantitativa) PLA2 fosfolipasa A2 PLC-β fosfolipasa C-β PLD fosfolipasa D pM picomolar PPI test de inhibición prepulso Pro prolina PSD95 proteína de densidad postsináptica PSD95 (Post Synaptic Density protein 95) RGS proteínas reguladoras de la señalización de proteína G (Regulators of G protein Signaling) rpm revoluciones por minuto RSK2 cinasa de la proteína ribosómica S6 de la subfamilia p90 subtipo 2 s segundo SAR relación estructura-actividad (Structure-Activity Relationship) SB269970 2R-1-[(3-hidroxifenil)sulfonil]-2-[2-(4-metil-1piperidinil)etil]pirrolidina Ser serina SERT transportador de serotonina (Serotonin Transporter) Lista de abreviaturas XLI SKR estudios de relación cinético-estructurales SNC sistema nervioso central SNP sistema nervioso periférico t tiempo TDM trastorno depresivo mayor TGF-β factor de crecimiento transformante-β (Transforming Growth Factor-β) Thr treonina TM dominio transmembrana (Transmembrane Domain) TMDD Modelo farmacocinético de disposición de fármaco mediada por diana (Target-Mediated Drug Disposition) tR tiempo de residencia Tris tris(hidroximetil)aminometano Trp triptófano TST test de suspensión de cola Tyr tirosina U unidad UK 432097 (2-(3-[1-(piridin-2-il)piperidin-4-il]ureido)etil-6-N-(2,2difeniletil)-5′-N-etilcarboxamidoadenosina-2-carboxamida) Val valina VIH virus de inmunodeficiencia humano WT no mutado, nativo (wild-type) x g unidad relativa de medida de aceleración ZM241385 4-(2-((7-amino-2-(furan-2-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]- [1,3,5]triazin-5-il)amino)etil)fenol Introducción 4 Hallazgos neuropatológicos y de neuroimagen* Los estudios mediante de técnicas de neuroimagen estructural y funcional indican que en pacientes con esquizofrenia hay una dilatación de los ventrículos laterales y del tercer ventrículo, una reducción global del volumen de sustancia gris cerebral, especialmente en los lóbulos temporales y en el lóbulo frontal izquierdo (atrofia cortical global con predominio prefrontal) y también una reducción del volumen del tálamo, amígdala e hipocampo (Padín, 2007; Bernardo y Vioque, 2015). Las anomalías estructurales descritas no son específicas ni diagnósticas (Bernardo y Vioque, 2015). La explicación etiológica clásica: la implicación de la dopamina Respecto al sistema dopaminérgico se pueden considerar cuatro vías como relevantes para comprender la fisiopatología de la esquizofrenia:  Vía mesocortical. Se proyecta principalmente hacia la corteza orbitofrontal, prefrontal medial y cingulada, pero también hacia la corteza dorsolateral prefrontal y la corteza temporal y parietal, desde los cuerpos celulares dopaminérgicos del área tegmental ventral. Tiene origen en el grupo neuronal A10 de neuronas mesencefálicas. Continúa discutiéndose su participación en los síntomas negativos y en ciertos síntomas cognitivos de la esquizofrenia. La hipofunción dopaminérgica que se observa en esquizofrenia en esta vía podría ser primaria o secundaria a otras alteraciones.  Vía mesolímbica. Se proyecta también desde los cuerpos celulares dopaminérgicos del área tegmental ventral hacia ciertos núcleos como el núcleo accumbens, núcleos de la estría terminal, la amígdala, el tubérculo olfatorio, núcleos septales laterales y áreas límbicas del estriado y otros de la región límbica. También tiene origen en el grupo neuronal A10 de neuronas mesencefálicas. Se propone que la hiperactividad de esta vía es causa de los síntomas positivos de la esquizofrenia tales como alucinaciones, delirios y conductas emocionales.  Vía nigroestriada. Envía proyecciones desde la sustancia negra hacia el cuerpo estriado (caudado y putamen). Conlleva activación de las neuronas con receptores D1 acoplados a Gs (circuito directo) e inhibición de las neuronas con receptores D2 Introducción 5 acoplados a Gi (circuito indirecto) del núcleo caudado. El antagonismo D2 en esta vía se asocia a bradicinesia iatrogénica.  Vía tuberoinfundibular. Los cuerpos celulares se encuentran en el núcleo arqueado y en el área periventricular del hipotálamo y envían proyecciones hacia el infundíbulo y la hipófisis anterior controlando la liberación de hormonas tales como la prolactina (control pulsátil). Su bloqueo en el tratamiento con antipsicóticos origina las reacciones adversas ginecomastia y galactorrea. Existen varios subtipos de receptores dopaminérgicos: los receptores D1 y D5 (familia D1) y los receptores D2, D3 y D4 (familia D2). Los receptores D1 predominan en la corteza, los D2 en el estriado, y los D3 y D4 en la región límbica (Kapur y Remington, 1996). Se ha descrito que en la esquizofrenia hay alteraciones en los niveles de expresión de los receptores D1 (disminución en córtex), D2 (incremento estriatal) y D3 (aumento en corteza cerebral) (Harrison, 1999). Con respecto a los niveles y actividad de la dopamina, las evidencias de su alteración en esquizofrenia son de las más evidentes (Harrison, 1999). Se sugiere que el conjunto de evidencias obtenidas mediante estudios de neuroimagen indican una alteración del sistema dopaminérgico a nivel presináptico (Ginovart y Kapur, 2012). Según la hipótesis dopaminérgica de etiopatología de la esquizofrenia, en esta subyace una hiperfunción dopaminérgica en la vía mesolímbica (aparición de síntomas positivos) y en una hipofunción de las proyecciones dopaminérgicas mesocorticales a la corteza prefrontal causante de los síntomas negativos y cognitivos. Se habla de la existencia de una desconexión cortico-subcortical primaria (Bertolino y col., 2000). Los fármacos antipsicóticos normalizarían la neurotransmisión mesolímbica mediante el bloqueo de la señalización dopaminérgica D2. La primera hipótesis (Meltzer y Stahl, 1976) sólo se refería a la relación de la hiperactividad dopaminérgica con los síntomas positivos. La llamada hipótesis dopaminérgica “revisada” incorpora además la hipofunción dopaminérgica de las proyecciones mesocorticales a la corteza prefrontal como causa de los síntomas negativos y cognitivos. Una posible explicación de la hiperfunción dopaminérgica mesolímbica sería que un posible estado hipoglutamatérgico modularía la actividad del área mesolímbica favoreciendo la liberación de dopamina, aunque esta hipofunción tendría un alcance limitado (Carlsson y col., 1999; Carlsson y col., 2004). También se ha sugerido que Introducción 6 anomalías de la neurotransmisión dopaminérgica en la que interviene el receptor D1 a nivel de la corteza prefrontal serían la causa de los síntomas cognitivos y negativos (GoldmanRakic y col., 2000). El papel de la serotonina La hipótesis de que la serotonina juega algún papel en la etiopatogenia de la esquizofrenia es anterior incluso a la hipótesis dopaminérgica. Comenzó basándose en las actividades psicotomiméticas de la mescalina y de la dietilamida del ácido lisérgico (LSD) (Stoll, 1947), continuó al proponerse la hipótesis de la transmetilación (Osmond y Smythies, 1952) y perdió interés al plantearse la hipótesis dopaminérgica de la esquizofrenia. En el caso de la serotonina no está descrita una alteración primaria en una vía neuroanatómica, similar a la hiperfunción dopaminérgica en el sistema límbico, y que se relacione con la etiología de la esquizofrenia. Desde la aparición de la clozapina y su actividad antagonista de los receptores 5-HT2A, presente en todos los antipsicóticos atípicos, se ha renovado especialmente el interés en conocer las posibilidades terapéuticas de este sistema. Como vía neuroanatómica del sistema de modulación difuso de serotonina del SNC destacar la vía serotoninérgica ascendente ventral, con origen en el grupo B7 (núcleo dorsal del rafe) y en el complejo B6-B8 (en el mesencéfalo y la frontera pontomesencefálica) (García-Porrero y Hurlé, 2015), y que inerva el tálamo, hipotálamo (núcleos mamilares y área hipotalámica lateral), estriado, neocorteza y núcleos del sistema límbico como el fascículo del cíngulo, amígdala, corteza entorrinal, hipocampo, giro dentado y núcleo accumbens. Las neuronas dopaminérgicas de los grupos neuronales origen de las vías mesocortical, mesolímbica y nigroestriada son inervadas por neuronas serotoninérgicas del núcleo del rafe (Adell y col., 2010). Hay una serie de localizaciones neuroanatómicas en las cuales la modulación de la actividad de receptores de serotonina localizados en las mismas conlleva la modulación de la actividad de neuronas de las vías dopaminérgicas implicadas en la fisiopatología de la esquizofrenia. Destaca la vía serotoninérgica ascendente ventral y la inervación que realiza del núcleo A10. Como ejemplo decir que todos los fármacos antipsicóticos considerados como de segunda generación presentan un perfil multirreceptorial que incluye afinidades por distintos subtipos de receptores serotoninérgicos, de forma muy relevante por el receptor Introducción 7 5-HT2A. Tras la aparición de los antipsicóticos atípicos, se sugirió que la superioridad que manifiestan en el tratamiento de los síntomas negativos se debería a la desinhibición de la transmisión dopaminérgica en la corteza prefrontal (Kapur y Remington, 1996), atribuida al antagonismo 5-HT2A de clozapina (con actividad agonista parcial según algunos autores; Weiner y col., 2001). Ya se ha dicho que este receptor se relaciona con la vía serotoninérgica ascendente ventral que inerva neuronas dopaminérgicas del ATV. Su agonismo a nivel de esta vía serotoninérgica conlleva la activación de las mismas neuronas, no sólo de forma directa, sino que están implicadas también acciones a nivel presináptico y mecanismos de inhibición de neuronas gabaérgicas o la excitación de neuronas glutamatérgicas (Meltzer y col., 2003). Este receptor también se encuentra en distintas zonas potencialmente moduladoras de la actividad de vías dopaminérgicas implicadas en esquizofrenia, tales como neuronas piramidales corticales o proyecciones corticotegmentales glutamatérgicas (De Almeida y Mengod, 2007). Otras evidencias que apoyan un papel, por lo menos en la terapéutica, de la serotonina en la esquizofrenia la aportan algunos estudios que sugieren que la liberación de serotonina y el agonismo de los receptores 5-HT2A puede ser determinante para la hiperactividad motora en modelos animales de síntomas positivos de esquizofrenia conseguidos mediante la administración aguda de antagonistas NMDA (Millan y col., 1999). El agonismo parcial 5-HT1A produce el mismo efecto en modelos animales (Meltzer y Huang, 2008). Los fármacos antipsicóticos atípicos presentan además como dianas en su perfil multirreceptorial el agonismo parcial 5-HT1A y el antagonismo 5-HT7. En relación con el receptor 5-HT1A, su activación se relaciona con inhibición de neuronas del rafe (Meltzer y col., 2003). Se ha relacionado su presencia y su agonismo en corteza con la liberación de dopamina en córtex cerebral (ensayos in vivo) y el agonismo 5-HT1A con la mejoría de síntomas negativos y cognitivos en esquizofrenia (Sumiyoshi y col., 2001; Sumiyoshi y col, 2007; Meltzer y col., 2012). En relación con el antagonismo 5-HT7 se postula una acción de mejora cognitiva (ensayos en modelo de disfunción cognitiva y reconocimiento de objetos nuevos) demostrada con amisulprida en ensayos in vivo (Meltzer y Massey, 2011). De forma importante, la amisulprida (un antagonista D2/D3 y antagonista 5-HT7) obtuvo mejores resultados que olanzapina en ensayos clínicos con pacientes con esquizofrenia en el área de aprendizaje, memoria verbal y declarativa (Rey Auditory Verbal Learning Test, RAVLT; Mortimer y col., 2007). El agonismo 5-HT2C es capaz de disminuir Introducción 8 la señalización dopaminérgica en corteza cerebral y núcleo accumbens y, de hecho, el agonismo inverso 5-HT2C se considera un componente de interés en el perfil de fármacos antipsicóticos, aunque no existen evidencias de que los antipsicóticos atípicos sean agonistas inversos efectivos en humano (Meltzer y Huang, 2008; Meltzer y Massey, 2011). Recientemente se ha descrito la existencia del dímero 5-HT2A/mGlu2 en neuronas piramidales de la corteza cerebral de los que se postula su implicación en los procesos fisiopatológicos de la corteza que ocurren en esquizofrenia (González-Maeso y col., 2008). En relación con esta localización, se han encontrado disminuciones en los niveles de este receptor en el córtex (Harrison, 1999). De todo lo expuesto anteriormente puede deducirse una interacción entre las vías de señalización serotoninérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas muy estrecha, con relevancia potencial o probada en la etiología y terapéutica de la esquizofrenia. La implicación de los neurotransmisores glutamato y GABA Se trata de una hipótesis que podría explicar el origen de las anomalías en la neurotransmisión dopaminérgica en el área mesolímbica y las vías mesocorticales. Una de las primeras evidencias que apuntaron a esta hipótesis se obtuvo con la administración de los anestésicos disociativos fenciclidina (PCP) o ketamina, ambos bloqueantes de los receptores NMDA que inducen síntomas psicóticos en sujetos sanos (Javitt, 1987; Javitt y Coyle, 2004). Estos agentes farmacológicos son capaces de provocar alucinaciones, así como alteraciones formales del pensamiento o síntomas cognitivos (Jentsch y col., 1999). Se llegó así a pensar que en el cerebro de los pacientes esquizofrénicos podría existir cierto grado de hipofunción glutamatérgica NMDA. Los hallazgos a favor de esta hipótesis incluyen alteraciones en el número y disposición de sinapsis axodendríticas de la capa III de la corteza, en las que se localizan receptores NMDA (y que podrían guardar relación con el denominado circuito excitador intrínseco) o la presencia de anomalías en la densidad de receptores NMDA en pacientes esquizofrénicos en la corteza y ganglios basales. La disminución de esas sinapsis podría ser responsable de un estado de hipofunción glutamatérgica en esquizofrenia. Se sugiere que el circuito excitador intrínseco podría ser el sustrato neuroanatómico de la memoria de trabajo (Riaza y Chinchilla, 2007). Introducción 9 La actividad de vías glutamatérgicas influye en la actividad de las vías dopaminérgicas mesocorticales, mesolímbicas y nigroestriatales, de forma que existe una interconexión entre estos sistemas. En esta interconexión es importante el sistema de modulación glutamatérgico, que parte de la corteza prefrontal y actúa sobre la actividad de neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral (Javitt y Laruelle, 2008). Este sistema consta de una vía activadora, formada principalmente por proyecciones glutamatérgicas hacia neuronas dopaminérgicas mesocorticales, y de una vía inhibidora, con eferentes glutamatérgicos hacia interneuronas gabaérgicas del cerebro medio y mesencefálicas y que modula la actividad de neuronas dopaminérgicas subcorticales (Javitt y Laruelle, 2008). Una hipofunción de la transmisión glutamatérgica en estas vías podría desembocar en una disminución de la actividad dopaminérgica mesocortical y en la hiperactividad dopaminérgica en regiones subcorticales (Javitt y Laruelle, 2008). Además, varios estudios señalan la influencia de los antipsicóticos sobre la transmisión glutamatérgica al interaccionar con receptores de glutamato. En el caso de la clozapina, esta parece actuar como agonista parcial en el sitio de glicina del receptor NMDA (Riaza y Chinchilla, 2007). Los antipsicóticos también pueden modificar los niveles de expresión de receptores glutamatérgicos en lugares como el estriado (Riva y col. 1997). Como ya se ha dicho, la administración aguda de antagonistas NMDA constituye la base de los modelos animales de sintomatología positiva de esquizofrenia (Meltzer y col., 2011; Meltzer y Massey, 2011). En estos modelos se produce un aumento de liberación de dopamina en áreas como el núcleo accumbens (Del Arco y col., 2007). Los modelos de disfunción cognitiva en animales se basan en la administración subcrónica de los mismos antagonistas (Meltzer y Massey, 2011). Entre otros hechos que dan soporte a la hipótesis glutamatérgica de la esquizofrenia, y que la relacionan con otras hipótesis como la neurodegenerativa, se encuentra el bloqueo de la señalización glutamatérgica de neuronas excitadoras corticales producido por antagonistas NMDA y la reducción asociada de la actividad de interneuronas gabaérgicas responsables de la inhibición de otras neuronas glutamatérgicas. Esto conlleva un aumento del nivel de activación de estas últimas y un exceso en la liberación de glutamato en otras zonas distintas de la corteza, con potenciales efectos neurotóxico y neurodegenerativos mediante la interacción con receptores tipo AMPA y kainato (Pietraszek, 2003; Olney y Farber, 1995). La hipofunción glutamatérgica NMDA tiene consecuencias en los procesos Introducción 10 de neurodesarrollo y de plasticidad sináptica interfiriendo con la migración de neuroblastos y alterando fenómenos de sinaptogénesis (Riaza y Chinchilla, 2007). Existe además un interés en la investigación de rutas celulares proapoptóticas activadas mediante receptores AMPA/kainato (Riaza y Chinchilla, 2007). Como se puede ver, hay conexiones entre esta hipótesis y las explicaciones neurodegenerativa, de alteraciones en el neurodesarrollo y de neuroplasticidad de la esquizofrenia. Por último, comentar en este apartado que el GABA cumple una función moduladora inhibitoria de la actividad dopaminérgica. Una desregulación en la actividad de las neuronas gabaérgicas podría dar lugar alteraciones en las vías dopaminérgicas responsables de los síntomas psicóticos (Puente y col., 2007). Hipótesis del neurodesarrollo, de la neurodegeneración, patología sináptica e hipótesis inmunológica. Hay una serie de evidencias que apuntan a que la esquizofrenia podría ser una enfermedad del neurodesarrollo, causada por un desarrollo temprano aberrante del cerebro. Entre ellas se encuentra el retraso de los pacientes en el alcance de hitos de desarrollo en la infancia y la documentación de anormalidades cognitivas, motoras o del comportamiento indicativas de un funcionamiento cerebral anormal antes del diagnóstico (Arnold y col., 2005). Otras evidencias vienen dadas por el hecho de que las complicaciones obstétricas incrementan el riesgo de esquizofrenia y de que los hallazgos neuropatológicos post mortem indican posibles alteraciones en la organización histológica durante el neurodesarrollo en ausencia de indicadores de neurodegeneración (Riaza y col., 2007a; Arnold y col., 2005). Particularmente, se encuentran patrones alterados de organización laminar en regiones ventromediales de los lóbulos temporales y en la orientación espacial de ciertas poblaciones neuronales de hipocampo, corteza entorrinal y cíngulo anterior. Otras líneas de investigación se centran en posibles defectos en la mielinización postnatal (Riaza y col., 2007a). Otra hipótesis que se considera en esquizofrenia es la neurodegenerativa, que se basa en el conocimiento de la evolución temporal del deterioro cognitivo y de su naturaleza y de las variaciones de parámetros neuroanatómicos indicativos de deterioro en los pacientes. En este último caso se tienen en cuenta la dilatación ventricular (Molina y col., 2004) o los Introducción 11 cambios de tamaño de los lóbulos temporales. Como ya se ha comentado, la hipótesis de la neurodegeneración puede guardar relación con la hipofunción NMDA, ya que esta puede provocar fenómenos de estimulación de la liberación de glutamato secundarios (por inhibición de neuronas gabaérgicas responsables de inhibición tónica) que causen degeneración o apoptosis a través de los receptores AMPA o de kainato (Konradi y Heckers, 2003; Heckers y Konradi., 2014). En cuanto a indicios de patología sináptica en esquizofrenia, la disminución de la actividad excitatoria intrínseca, en la que es determinante la señalización glutamatérgica, podría afectar a la formación y remodelado de sinapsis en la adolescencia (Riaza y col., 2007c). El complejo de proteínas SNARE está implicado en funciones como neurotransmisión o plasticidad neuronal. El complejo SNARE lo forman sintaxina-1, SNAP25 y Vamp2. Otras proteínas relacionadas con este complejo son Munc18 y sinapsina. En general los estudios de asociación con esquizofrenia de polimorfimos de genes que codifican proteínas del complejo SNARE como sintaxina-1 o SNAP25 obtienen resultados positivos (Fanous y col., 2010; en Guerrero y col., 2012 Libro) aunque no todos (Kawashima y col., 2008). En relación con esquizofrenia un estudio GWAS encuentra un sitio de riesgo para esta enfermedad relacionado con el gen TSNARE1 (Ripke y col., 2013). Otras líneas de investigación en la etiopatología de la esquizofrenia en esta dirección (Riaza y col., 2007c) se centran en una serie de proteínas de las que en general puede decirse que participan en el proceso de neurodesarrollo y plasticidad sináptica tales como: - Se estudia la participación de ácido retinoico durante el desarrollo fetal en la configuración de regiones anatómicas importantes en la fisiopatología de la esquizofrenia. - Se estudia la participación de reelina (Varela y col., 2015), una proteína de matriz extracelular producida por las células de Cajal-Retzius que desempeña un papel importante en el neurodesarrollo facilitando la migración de los neuroblastos y la sinaptogénesis. - Se estudia la implicación de la familia de proteínas Wnt las cuales tienen efectos en el neurodesarrollo y la plasticidad sináptica y suprimen la expresión constitutiva de GSK3β (glucógeno sintasa cinasa 3). Introducción 12 - Se estudia la glucoproteína NCAM (molécula de adhesión celular neuronal) expresada en terminaciones sinápticas e implicada en el neurodesarrollo. - Se estudia la proteína neurregulina 1 (NRG1), que participa en varios procesos de neurodesarrollo como la migración y la supervivencia neuronal. - Asimismo, se estudian las neurotrofinas NGF (factor de crecimiento nervioso) y BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro) (Guillin y col., 2007). Por último, hay diversas evidencias que apoyan la hipótesis inmunológica de la etiología de la esquizofrenia. Entre otras, existe un grupo de pacientes que presentan anomalías en varios marcadores de actividad inmunológica y en ellos predomina la actividad de los linfocitos T CD4+ Th2 sobre la de Th1 (Riaza y col., 2007b; Schwarz y col., 2001). En general se trata de pacientes con mal pronóstico y resistencia al tratamiento. El sistema de modulación de adenosina La adenosina ejerce funciones moduladoras sobre los sistemas de señalización glutamatérgica y dopaminérgica. Las primeras hipótesis acerca de la implicación de la adenosina en esquizofrenia se basaron en la modulación alostérica negativa de los agonistas A2A en la señalización dopaminérgica a través de heterómeros A2A-D2 del estriado (Ferré y col., 1994). En el estriado y la corteza, los receptores A1 presinápticos inhiben la liberación de dopamina y de glutamato (Solinas y col., 2002). La activación del receptor A2A presináptico y del localizado en astrocitos originan una liberación de glutamato y una disminución de su recaptación por astrocitos (transportador GLT-1), respectivamente. Existe un ensayo clínico con dipiridamol (inhibidor de la recaptación de adenosina) como monoterapia a 200 mg/día esquizofrenia que muestra mejoría de los síntomas positivos y negativos (Wonodi y col., 2011). Basándose en las dos últimas menciones y la influencia de la adenosina en la señalización glutamatérgica, se propuso la hipótesis etiológica de la hipofunción de adenosina (Lara y col., 2006). Actualmente (Rial y col., 2014) se propone una simultánea disminución en la función del receptor A1 y una desregulación A2A (incremento de los receptores A2A neuronales y disminución de los de astrocitos) como cambios fisiopatológicos en la esquizofrenia. Según Rial y col., las estrategias terapéuticas en esquizofrenia que actúen sobre este sistema deben dirigirse para actuar en ambas dianas simultáneamente. Introducción 13 Fármacos antipsicóticos Recomendaciones terapéuticas en esquizofrenia La eficacia del tratamiento farmacológico de la esquizofrenia con los fármacos antipsicóticos ha sido ampliamente demostrada: según un estudio el uso a largo plazo de antipsicóticos se asocia a una menor tasa de mortalidad en los pacientes con esquizofrenia frente a los pacientes sin tratamiento. En el caso de antipsicóticos de segunda generación, la clozapina se asocia a una mortalidad significativamente menor que el resto (Tiihonen y col., 2009). La eficacia de los distintos antipsicóticos en el control de los síntomas positivos está claramente demostrada, pero existen distintas opiniones acerca de la eficacia y superioridad de los antipsicóticos de segunda generación en el tratamiento de síntomas negativos y cognitivos. En la farmacoterapia de esquizofrenia (Guía de práctica clínica sobre la esquizofrenia MSC, 2009) se recomienda determinar una serie de parámetros (como peso, parámetros hematológicos, valoración neurocognitiva o electrocardiograma) antes de comenzar el tratamiento del paciente esquizofrénico. Se recomienda extremar la precaución en los pacientes que no se han sometido a ningún tratamiento previo. También se recomienda la elección de medicación antipsicótica de segunda generación (mejor tolerabilidad y menores síntomas extrapiramidales). Además, se distingue el tratamiento de un episodio psicótico y su fase de recuperación del tratamiento de la esquizofrenia en sus fases de estabilización y estable. Se aboga por el uso de la medicación de segunda generación administrada por vía oral como la risperidona, olanzapina, quetiapina, amisulprida y aripiprazol, como primera y segunda línea de tratamiento en el primer episodio de psicosis, debido al menor riesgo a corto y largo plazo de efectos adversos extrapiramidales. Se recomienda el mantenimiento de la medicación antipsicótica para el tratamiento de un primer episodio de psicosis durante un mínimo de dos años, después de la primera recuperación de los síntomas (fase de recuperación). Se debe mantener la farmacoterapia para la prevención de recaídas en las fases de estabilización y estable. En el caso de recaídas pese a adherencia o en caso de no mejoría de los síntomas en pacientes bajo tratamiento con fármacos de primera generación se propone el cambio a antipsicóticos atípicos. No se recomienda la administración Introducción 20 afinidad por los receptores D2 estriatales y una mayor afinidad por el receptor D4 (Meltzer y col., 2003; Meltzer, 2004; Seeman, 2005). Así, algunos trabajos se centran en explicar las características que determinarían la atipicidad de los fármacos en base a un aumento de la liberación de dopamina y acetilcolina en el área mesocortical, un área cuya hipofunción dopaminérgica se relaciona con aparición de sintomatología negativa y cognitiva (Huerta, 2007). La hipofunción dopaminérgica mesocortical se vería corregida con los antipsicóticos atípicos mediante el antagonismo 5HT2A y el agonismo 5-HT1A (Meltzer y col., 2003; Álamo y col., 2007). Según otros autores la atipicidad estaría basada en diferencias en la localización preferente de los fármacos en las distintas vías dopaminérgicas. Se sugiere que los antipsicóticos atípicos tienen afinidad preferente por las vías dopaminérgicas límbicas y corticales. Algunos fármacos atípicos presentan una localización preferente en neuronas del área tegmental ventral con respecto a neuronas del núcleo A9 (en sustancia negra), relacionada con extrapiramidalismos (Xiberas y col., 2001; Álamo y col., 2004). Otros autores proponen las diferencias en el tiempo de residencia (tR) del fármaco en el receptor dopaminérgico (concretamente velocidad de disociación elevada) como la explicación del carácter atípico. Diversos antipsicóticos presentan un reducido tiempo de residencia sobre el receptor D2, de 1 min para el caso de clozapina, amisulprida o quetiapina y siendo superior (≈30 min) para haloperidol, clorpromazina o racloprida. Un tR reducido debería permitir una mejor trasmisión dopaminérgica fisiológica que conllevaría menos extrapiramidalismos, menor hiperprolactinemia y una menor contribución a los síntomas cognitivos y negativos. Esta propuesta inicial se refería a la clozapina y sus bajos niveles de efectos adversos extrapiramidales (Seeman, 2014). Estos fármacos presentan en general y al igual que los fármacos clásicos una notable afinidad por los receptores H1-histaminérgicos, α-adrenérgicos y muscarínicos no implicados en su efecto terapéutico y que conllevan acciones farmacológicas que pueden derivar en efectos secundarios o reacciones adversas. Pero en este grupo son generalmente más leves y, debido a que no existe homogeneidad en el perfil multirreceptorial, existen fármacos en los que predominan determinadas reacciones adversas y están ausentes otras. Así, con estos fármacos también son frecuentes la aparición de sedación, hipotensión, arritmias, ganancia de peso, dislipidemias o trastornos hematológicos pero cada fármaco Introducción 21 tiene su particular tasa de incidencia. Pueden causar convulsiones, tromboembolismo, aumento de los niveles de enzimas hepáticas o prolongar el intervalo QT. Son fármacos que no están exentos de provocar síntomas extrapiramidales agudos, pero la incidencia es baja, lo que también es un factor predictivo de disminución del riesgo de discinesia tardía. Hoy existe una controversia acerca del aumento de mortalidad y del riesgo de sufrir eventos cardiovasculares en tratamientos a largo plazo con antipsicóticos, respecto a lo que algunos autores consideran que el antagonismo 5-HT2A debería tener algún papel en la reducción del riesgo cardiovascular (Blasco-Fontecilla H y col., 2010). En cuanto a la eficacia clínica, los antipsicóticos atípicos son superiores a los antipsicóticos de primera generación tal como el haloperidol en eficacia, prevención de recaídas, incidencia de depresión o aparición de efectos adversos extrapiramidales, aunque esta superioridad en todos los parámetros de eficacia no es extensible a todo el grupo de antipsicóticos de segunda generación de manera generalizada, sino que hay determinados fármacos que destacan en alguna propiedad como amisulprida, clozapina, olanzapina y risperidona en eficacia o aripiprazol y quetiapina en depresión (Leucht y col., 2009; Martin y col., 2006). También destaca la superioridad de clozapina en baja incidencia de reacciones adversas extrapiramidales (Leucht y col., 2013) o aripiprazol en baja sedación (Leucht y col., 2009). Sin embargo, no ofrecen generalmente una ventaja, sino que son inferiores en aspectos como sedación, especialmente clozapina (Leucht y col., 2013) o ganancia de peso, especialmente olanzapina (Swartz y col., 2008) frente a fármacos de primera generación (haloperidol y clorpromazina en el primer caso y perfenazina en el segundo). En general puede afirmarse que los antipsicóticos atípicos son más eficaces que los antipsicóticos clásicos en el tratamiento de los síntomas negativos (Álamo y col., 2007) sean primarios o secundarios a la psicosis. Clozapina es especialmente eficaz en el tratamiento de la elevada sintomatología negativa en pacientes (Meltzer y McGurk, 1999). En general puede decirse que son moderadamente eficaces en la mejora de los síntomas cognitivos; puede concluirse que producen una mejora de la función cognitiva global específicamente en los dominios de aprendizaje y de procesamiento del lenguaje (Woodward y col., 2005; metaanálisis). El metaanálisis realizado por Leucht y col., (2009) concluye que los antipsicóticos atípicos (quetiapina, sertindol, olanzapina, risperidona) tienen una moderada ventaja en Introducción 22 tolerabilidad y eficacia, tanto global como en síntomas positivos y negativos sobre los clásicos. Aunque respecto a estos resultados, algunos autores (Geddes y col., 2003) los atribuyen a las dosis del antipsicótico típico analizadas, de manera que una vez considerada una dosis equivalente desaparece la ventaja terapéutica. Del metaanálisis de Davis (2003) puede concluirse que los agentes atípicos son moderadamente más eficaces que los clásicos en sintomatología negativa, cognitiva y afectiva y ligeramente en el tratamiento de sintomatología positiva. Existe una controversia relacionada con lo anterior, relacionada con la explicación de la eficacia en sintomatología negativa de los antipsicóticos de segunda generación. Para algunos autores, los antipsicóticos atípicos son capaces de causar una mejoría primaria, para otros sólo mejoran síntomas secundarios a la psicosis, depresión, extrapiramidalismos y otros efectos secundarios (Álamo y col., 2007a). Antipsicóticos de segunda generación o atípicos: clozapina y otros fármacos Comenzando por clozapina (8-cloro-11-(4-metil-1-piperazinil)-5H-dibenzo[b,e] [1,4]diazepina; estructura tipo dibenzodiazepina) sólo se utiliza para el tratamiento de esquizofrenia resistente y de psicosis en el curso de la enfermedad de Parkinson (Ficha técnica de Leponex, 2014). En España está tipificada como fármaco de especial control médico o con medidas especiales de seguridad debido al riesgo de agranulocitosis, de forma que previamente al inicio del tratamiento el recuento leucocitario ha de ser mayor a 3500/mm3 y el recuento absoluto de neutrófilos ha de ser mayor de 2000/mm3. Debe realizarse posteriormente un control frecuente del mismo parámetro de forma que si los valores caen por debajo de 3000/mm3 (leucocitos) o de 1500/mm3 (neutrófilos) debe suspenderse la medicación (Ficha técnica de Leponex, 2014). La posibilidad de neutropenia o leucopenia obliga a tener que tomar precauciones en caso de infección. Es significativo además el aumento del riesgo de miocarditis, que en algunos casos ha sido mortal. Clozapina es metabolizada principalmente en el citocromo P450 isoenzima CYP1A2 y sus metabolitos son N-desmetil-clozapina y N-óxido-clozapina (Ficha técnica de Leponex, 2014). Unas concentraciones plasmáticas de fármaco superiores a 350 ng/mL se asocian a una mejor respuesta. Son significativos el aumento de peso y la alteración de los parámetros lipídicos sanguíneos (Wirshing y col., 2002). También produce convulsiones, sedación y Introducción 23 estreñimiento (Marder y Wirshing, 2006; Leucht y col., 2013; Ficha técnica de Leponex, 2014). Olanzapina (2-metil-4-(4-metil-1-piperazinil)-10H-tieno[2,3-b][1,5]benzodiazepina es otro antipsicótico atípico indicado en el tratamiento de la esquizofrenia en la terapia de continuación en pacientes que muestran una respuesta inicial al tratamiento para el mantenimiento de la mejoría clínica. Olanzapina también está indicada en el tratamiento del episodio maníaco de moderado a grave y en la prevención de las recaídas en pacientes que presentan trastorno bipolar con respuesta previa en la fase maníaca. No está autorizado el uso de olanzapina en pacientes con psicosis y/o trastornos del comportamiento asociados a demencia debido a un aumento de la mortalidad y del riesgo de accidente cerebrovascular (Nota informativa de AEMPS, 2004/03; Gill y col., 2007). Risperidona (3-[2-(4-[6-fluoro-1,2-benzisoxazol-3-il]-1-piperidinil)-etil]-6,7,8,9tetrahidro-2-metil-4H-pirido-[1,2-a]-pirimidin-4-ona, es otro antipsicótico atípico indicado en el tratamiento de la esquizofrenia aguda y crónica. También está indicado en el tratamiento de los episodios maníacos de moderados a graves asociados a los trastornos bipolares, en el tratamiento a corto plazo (hasta 6 semanas) de la agresión persistente que puede aparecer en pacientes con demencia de tipo Alzheimer y en el tratamiento sintomático de la agresión persistente en los trastornos de la conducta en niños de 5 años de edad en adelante y adolescentes (Ficha técnica de Risperdal, 2013). Está disponible una formulación de liberación prolongada de risperidona que se administra cada dos semanas. Tampoco se recomienda su uso en pacientes con demencia distinta de Alzheimer debido al aumento del riesgo cardiovascular (Nota informativa de AEMPS, 2008/19). Lurasidona (Fig. 2) es un antipsicóticos atípico de reciente aprobación, derivado de benzoisotiazol, que contiene una estructura de norbornano fusionado a un grupo imida. Éste se une mediante un anillo ciclohexilo y un anillo piperazínico al primer grupo mencionado. Introducción 24 Fig. 2. Estructura química de lurasidona. (3aR,4S,7R,7aS)-2-((1R,2R)-2-(4-(1,2-benzisotiazol3-il)-1-piperazinilmetil]-1-ciclohexilmetil}hexahidro-4,7-metano-2H-isoindol-1,3-diona; SM13496]. Este fármaco es un antagonista de los receptores de dopamina D2 y de serotonina 5HT2A y 5-HT7 con una afinidad de 0.994, 0.47 y 0.495 nM, respectivamente (Ficha técnica de Latuda, 2015). También es un agonista parcial de los receptores 5-HT1A con una afinidad de 6.38 nM. No tiene afinidad apreciable por los receptores de histamina H1 ni por los receptores muscarínicos, aunque sí por los adrenérgicos α2C y α2A con una afinidad de 10.8 nM y 40.7 nM respectivamente. (Ishibashi y col., 2010; Ichikawa y col., 2012; Ficha técnica, 2014). La Tabla 1 recoge los valores de afinidad por distintos receptores de los antipsicóticos presentados hasta este punto. Introducción 25 Tabla 1. Perfiles de afinidad por distintos receptores de lurasidona y otros antipsicóticos atípicos. Los valores se expresan en unidades nM. n.t., no probado. ael número entre paréntesis indica la ratio de potencia relativa entre el valor de Ki para los distintos receptores y el valor correspondiente al receptor D2. bvalor de IC50. (Tomado de Ishibashi y col, 2010). Se han realizado estudios de modelización de receptores y de análisis de acoplamiento de ligando que han determinado los sitios relevantes de interacción entre lurasidona y receptores relevantes para su acción antipsicótica como D2, 5-HT2A y 5-HT7 (Ichikawa y col., 2012). Lurasidona se dispone en estos receptores en el sitio de unión en una localización próxima a la cara extracelular del receptor. En los tres receptores se conserva la interacción de Asp3.32 con el grupo amino protonado de la piperazina intermedia y las interacciones hidrofílicas del grupo benzoisotiazol con aminoácidos situados en el segmento TM5 y proximidades como Ser5.43 y Ser5.46 en el caso del receptor D2, Ser239 y Ser242 del receptor 5-HT2A o Ser243 y Thr244 del receptor 5-HT7. Existen entre otras interacciones las de aminoácidos hidrofóbicos con el norbornano y el anillo aromático bencénico de lurasidona (Ichikawa y col., 2012). Lurasidona no muestra afinidad apreciable por receptores muscarínicos M1 e histaminérgicos H1, por lo que se espera minimizar los efectos adversos derivados de ese antagonismo en este antipsicótico. Para ello resulta determinante estructuralmente el poseer un grupo intermedio voluminoso (ciclohexilo) y una mitad también voluminosa (norbornano-2,3-carboximida) que interaccionan y generan impedimento estérico con los residuos Ile454 y Trp103 de H1 y Tyr82 de M1 (Ichikawa y col., 2012). Experimentos utilizando lurasidona en modelos animales de déficit cognitivo mediante la administración subcrónica de antagonistas NMDA (MK-801) describen mejorías en los déficits de memoria y aprendizaje y se atribuyen al antagonismo 5-HT7 Introducción 26 (Ishibashi y col., 2010; Horisawa y col., 2013). Otros estudios preclínicos realizados con los ligandos MDL100907 y ACP-103 (antagonistas 5-HT2A), encuentran que éstos son capaces de mejorar los resultados en el test de reconocimiento de objetos in vivo administrados conjuntamente con una dosis subefectiva de lurasidona (Meltzer y Massey, 2011; Snigdha y col., 2010), lo que indica que en esta actividad puede tener efecto otro receptor serotoninérgico como el 5-HT2A, presente el perfil de lurasidona. Se investiga la mejora en índices de depresión en modelos de depresión en ratones (test de natación forzada, FST, y test de suspensión de cola, TST) tratados con lurasidona, que se relacionan con su actividad antagonista 5-HT7 (Cates y col., 2013). En la clínica, lurasidona se ha mostrado eficaz en el tratamiento de la esquizofrenia (Meltzer y col., 2011; Potkin y col., 2011) y en la actualidad está autorizado en Estados Unidos con las indicaciones para el tratamiento de la esquizofrenia y de la fase de depresión asociada al trastorno bipolar de tipo I. Además, está autorizado en la Unión Europea para el tratamiento de la esquizofrenia (Plan de seguridad de Latuda de EMA, 2014; Ficha técnica de Latuda, 2015). El inicio del tratamiento con lurasidona se recomienda con una dosis de 37 mg/día para ir aumentándola paulatinamente hasta un máximo de 148 mg/día. En caso de insuficiencia renal e insuficiencia hepática moderada e recomienda el inicio con 18.5 mg y no más de 74 mg/día. En caso de insuficiencia hepática severa el límite se sitúa en 37.5 mg /día (Plan de seguridad de Latuda, 2014; Ficha técnica de Latuda, 2015). En cuanto al perfil de seguridad de lurasidona, está contraindicada su administración concomitante con inhibidores e inductores potentes del citocromo P450 isoenzima CYP3A4 y en supuestos de hipersensibilidad. Con respecto a embarazo está clasificada como de categoría B (Micromedex [base de datos], 2014). Con respecto a los efectos adversos lurasidona puede provocar ansiedad, agitación y somnolencia y otras reacciones adversas derivadas del bloqueo dopaminérgico D2 tales como acatisia, discinesia, distonía, discinesia tardía, hiperprolactinemia o síndrome neuroléptico maligno. También puede producir hipotensión ortostática, insomnio y efectos adversos gastrointestinales (Micromedex [base de datos], 2014). Asimismo, se recomienda la toma de precauciones en pacientes con manía o con posibilidad de convulsiones en los que existe un riesgo aumentado. Con respecto a otras Introducción 27 reacciones adversas graves se recomienda la toma de precauciones por tratarse de efectos adversos observados en tratamientos con otros fármacos antipsicóticos atípicos y especialmente para las posibilidades de: cambios metabólicos tales como hiperglucemia, dislipidemia o ganancia de peso; de eventos cerebrovasculares isquémicos, de los cuales existe un riesgo demostrado en ancianos con demencia en tratamiento con antipsicóticos atípicos, condiciones estas en las que se ha demostrado además un aumento de la tasa de mortalidad (debe recordarse que lurasidona no está aprobada para el tratamiento de psicosis asociada a demencia); desregulación de la temperatura corporal; y agranulocitosis, leucopenia y neutropenia (Plan de seguridad de Latuda de EMA, 2014; Micromedex [base de datos], 2014). En cuanto a eficacia clínica de lurasidona se han realizado varios ensayos clínicos de eficacia en el tratamiento de la esquizofrenia (Fig. 3) tenidos en cuenta para su aprobación inicial (Micromedex [base de datos], 2014). Con respecto a la eficacia en el tratamiento agudo lurasidona se comparó frente a ziprasidona mediante un ensayo doble ciego, prospectivo y de tres semanas, siendo los resultados similares para ambos fármacos en cuanto eficacia en el tratamiento de la esquizofrenia aguda (puntuación en escala de síndromes positivos y negativos, PANSS; puntuación en la Escala de Calgary para depresión en esquizofrenia, CDSS; en la puntuación de severidad e impresiones globales clínicas, CGI-S), cambios en parámetros metabólicos o cardiacos, tasa de efectos adversos severos o tasas de discontinuación (Potkin y col., 2011). También obtuvo resultados comparables a olanzapina en cuanto a eficacia y perfil de reacciones adversas en el tratamiento de esquizofrenia aguda en otro ensayo prospectivo multicéntrico, doble ciego y controlado con placebo (Meltzer y col., 2011a). Lurasidona se demostró no inferior a quetiapina en cuanto a recaída tras un tratamiento de doce meses en estudios controlados con placebo en pacientes con esquizofrenia crónica que mostraron respuesta al tratamiento inicial de seis semanas con uno u otro fármaco. El tratamiento con lurasidona tuvo una tasa de hospitalización menor con respecto al tratamiento con quetiapina. La tasa de reacciones adversas extrapiramidales fue superior para lurasidona y ambos tratamientos presentaron una ganancia de peso similar (Loebel y col., 2013). El estudio comparativo de lurasidona y ziprasidona demostró un perfil similar de efectos adversos y de eficacia para ambos en el tratamiento de esquizofrenia crónica y estable y de trastornos esquizoafectivos (Potkin y col., 2011). La indicación de lurasidona para el tratamiento de la fase depresiva del trastorno Introducción 28 bipolar I en adultos en monoterapia o como terapia complementaria a litio o valproico viene avalada, entre otros, por dos estudios con pacientes con episodio depresivo mayor asociado a trastorno bipolar I sin psicosis y seis semanas de tratamiento con lurasidona en monoterapia o como terapia complementaria a litio o valproico frente a placebo. Se demostró mejoría en las puntuaciones en la escala de depresión Montgomery-Asberg (MADRS) y en la escala de impresión global clínica y de severidad de la enfermedad bipolar (CGI-BP-S) (Micromedex [base de datos], 2014). En la Fig. 3 se enumeran parte de los ensayos clínicos con lurasidona en el tratamiento agudo y crónico de la esquizofrenia realizados (Harvey, 2015). Fig. 3. Resumen de los ensayos clínicos con lurasidona para el tratamiento de la esquizofrenia. Los estudios 006, 049 y 196 son estudios de eficacia en el tratamiento agudo (respectivamente, Ogasa y col., 2013; Nakamura y col., 2009; Nasrallah y col., 2013). Los estudios 233, 237, 289 y 238 son estudios de seguridad y eficacia en el tratamiento de la esquizofrenia a largo plazo (respectivamente, Loebel y col., 2013; Citrome y col., 2012; Citrome y col., 2014 y Tandon y col., 2014). OL: Estudio abierto; DB: Doble ciego. (Tomado de Harvey, 2015). Introducción 29 Otras patologías en las que están indicados los fármacos antipsicóticos o éstos tienen potencial utilidad Con respecto a otras indicaciones de los antipsicóticos de primera generación distintas de esquizofrenia, destacar que las benzamidas tienen interés en el tratamiento de neurosis, vértigo, depresión (sulpirida), el síndrome de abstinencia alcohólica y trastornos del movimiento (tiaprida). Otros antipsicóticos (clásicos) pueden tener aplicación en patologías concretas y éstos se adecúan por poseer un perfil farmacológico y de comportamiento clínico específico, aunque pueden en la práctica estar relegados por otros fármacos. Así, haloperidol está indicado en el tratamiento de agitación psicomotora y determinados movimientos anormales (tics y corea). Levomepromazina (fenotiazina con cadena alifática) se utiliza en estados de agitación psicomotriz, y además en ansiedad y depresión. Perfenazina (piperazina) está indicada en depresión mayor con componente psicótico y periciazina (piperidina) en episodios agudos de neurosis. Droperidol se utiliza para prevenir náuseas y vómitos provocados por la anestesia. Pimozida (difenilbutilpiperidina) está indicada en ansiedad (Antipsicóticos, Catálogo CGCOF, 2015). De otras indicaciones de los antipsicóticos de segunda generación distintas de esquizofrenia, destacar su eficacia en la reducción de episodios de manía y depresivos y en la disminución de recaídas, en monoterapia (aripiprazol y olanzapina) o como tratamientos complementarios (risperidona y quetiapina) en el trastorno bipolar (Vieta y col., 2014; Goodwin y col., 2009). Los anteriormente citados se han propuesto como de primera línea (Yatham, 2009). Quetiapina y clotiapina se utilizan en depresión. La primera tanto en fases depresivas del trastorno bipolar (Yatham y col., 2009; estudios BOLDER I y II y EMBOLDEN I y II: para los dos últimos Young y col., 2010; McElroy y col., 2010) (al igual que lurasidona) como en trastorno depresivo mayor (indicación). En general en el tratamiento de la depresión unipolar utilizados como terapia complementaria con antidepresivos el aumento de la tasa de remisión es modesto (Nelson y Papakostas, 2009), como en el tratamiento adicional del trastorno depresivo mayor sin respuesta. Olanzapina, risperidona y ziprasidona son eficaces y de primera línea en el control de los síntomas de agitación en esquizofrenia y manía (Rocca y col., 2006). Introducción 36 dímero. La subunidad α contiene el sitio de unión de GDP y GTP y posee actividad GTPasa. Se han descrito 23 formas de subunidades α distintas, 7 de subunidades β y 12 de subunidades γ. Los subtipos de subunidad α se agrupan en cuatro subfamilias αs, αi/o, αq y α12 que dan nombre a las proteínas G heterotriméricas (Sallés y Flórez, 2014). La proteína heterotrimérica permanece unida en estado inactivo con el GDP unido a la subunidad α. El proceso de activación provoca que el GDP se intercambie por GTP de forma dependiente de Mg+2. Esto provoca la disociación de la subunidad α del dímero βγ, y ambos actúan sobre los sistemas efectores hasta que la actividad GTPasa de la subunidad α provoca la hidrólisis del GTP a GDP, tras lo que la subunidad α se reasocia al dímero βγ (Sallés y Flórez, 2014). Son sistemas efectores (y su mediador) de las proteínas G la adenilil ciclasa (síntesis de AMPc), la fosfolipasa C-β (hidrólisis de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP2 y liberación de inositol-1,4,5-trifosfato IP3 y diacilglicerol DAG), la fosfolipasa A2 (liberación de ácido araquidónico), fosfolipasa D (producción de ácido fosfatídico), las fosfodiesterasas (PDE), las proteínas cinasas RhoA/Rho o las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAP cinasa). El dímero βγ puede señalizar a través de sistemas efectores como ciertas formas de fosfolipasa C-β, inhibir ciertas formas de adenilil ciclasa y contribuir a la activación de cinasas como las de receptores acoplados a proteínas G (GRK) o MAP cinasas, entre otros efectores, o regular canales iónicos modulados por dímeros βγ (GIRK). 3.-Desensibilización. En términos generales, los GPCRs se pueden desensibilizar tras su exposición a agonistas, aunque la velocidad y extensión del proceso varía para cada receptor y tipo celular. El proceso conduce a un desacoplamiento funcional y posiblemente físico entre el receptor y las proteínas G. Las quinasas dependientes de segundos mensajeros (PKA, PKC) son responsables de los procesos denominados desensibilización heteróloga, mientras que las GRKs son responsables de la desensibilización homóloga de estos receptores. La fosforilación mediada por GRKs es en general insuficiente para una desensibilización total del receptor, requiriéndose para ello el reclutamiento de β-arrestinas, que interaccionan con el receptor fosforilado interfiriendo con su acoplamiento a las proteínas G. 4.-Internalización. Numerosos GPCRs internalizan en un proceso que implica la fosforilación del receptor por GRKs, su posterior unión de β-arrestinas 1 y/o 2 y la Introducción 37 formación de vesículas de clatrina, en un proceso particularmente bien establecido para el caso del receptor β2-adrenérgico (Luttrell y col., 2001) aunque no necesariamente común a todos los GPCRs. 5.-Degradación y/o reciclaje. La facilitación de los mecanismos de degradación constituye una forma de regulación de la actividad de GPCRs, mediante la disminución del número de receptores complementaria a la inhibición de la síntesis. Ambas producen una regulación a la baja del número de receptores, un proceso que se desarrolla en el intervalo de horas (Sallés y Flórez, 2014). Fig. 7. Ciclo de vida de un GPCR. (1) Los receptores sintetizados por la célula alcanzan la membrana plasmática. (2, 3) En la membrana interaccionan con diversos ligandos agonistas y antagonistas. (4) Eso desencadena la transducción de una serie de señales específicas al interior de la célula. (5) Simultáneamente, la expresión y la función de los GPCRs en la membrana plasmática están sometidas a una continua regulación por mecanismos de desensibilización, fosforilación, interacción con otras proteínas u otros GPCRs, internalización, reciclaje o degradación. Estos mecanismos operan tanto a nivel basal como a consecuencia de la interacción del receptor con sus ligandos. (Tomado de Terrillon y Bouvier, 2004). Introducción 38 Dimerización y oligomerización de GPCRs En la última década se han realizado numerosos estudios que corroboran que los GPCR son capaces de formar dímeros u oligómeros, de naturaleza tanto homocomo heteromérica. Estas crecientes evidencias han llevado a proponer una terminología recomendada actualmente para receptores cuyas unidades funcionales están formadas por más de una subunidad y entre los que habría ejemplos de GPCRs (Ferré y col., 2009). Los términos receptores heteroméricos y receptores homoméricos hacen referencia a complejos (diméricos u oligoméricos) cuya unidad mínima funcional está formada por 2 o más subunidades (diferentes o iguales, respectivamente) que no serían funcionales individualmente (Fig. 8). Un ejemplo de este tipo entre los GPCRs sería el receptor metabotrópico del ácido γ-amino-butírico GABAB, cuya mínima unidad funcional está necesariamente formada por dos subunidades de proteínas con 7 dominios transmembrana (GABAB1 y GABAB2), que no resultan funcionales como GPCR por sí mismas. Los términos heterómero u homómero receptorial se refieren a complejos macromoleculares compuestos por dos (dímero) o más (oligómero) unidades receptoriales que son funcionales por sí mismas. Dan lugar a un complejo con propiedades farmacológicas de algún modo distinguibles de las propiedades que presentan individualmente las unidades que lo componen, en aspectos como unión de ligandos, regulación del heterómero o vías de señalización. Introducción 39 Fig. 8. Ejemplos de receptores heteroméricos y heterómeros receptoriales: (a) receptor heteromérico ionotrópico NMDA de glutamato; (b) receptor heteromérico GABAB (de tipo GPCR); (c) heterómero A2A-D2 (unidades funcionales de tipo GPCR); (d) heterómero D1-NMDA (combina una unidad de tipo GPCR y una unidad de tipo receptor ionotrópico). (Tomado de Ferré y col., 2009). La dimerización es un proceso descrito para numerosos GPCRs en las dos últimas décadas; a la vez se ha podido demostrar la funcionalidad de monómeros de GPCRs individuales (Whorton y col., 2007; Whorton y col., 2008; Kuszak y col., 2009; Bayburt y col., 2011; Damian y col., 2012). Por ello, la relevancia fisiológica y consecuencias funcionales de la dimerización y oligomerización de GPCRs son objeto de estudio de forma muy activa actualmente. Que un determinado GPCR forme homoo heterooligomeros posibilita la aparición de una farmacología distinta que puede presentar el complejo respecto a las unidades mínimas funcionales (Schwartz y Holst, 2007). Se ha descrito la homodimerización de los receptores 5-HT2A (Brea y col., 2009), 5HT7 (Teitler y col., 2010; Smith y col., 2011), D2 (Lane y col., 2014) y A2A (Canals y col., 2004; Fanelli y col., 2011). Con respecto a la heterodimerización, esta se ha descrito para las siguientes parejas de receptores: A1-A2A (Ferré y col., 2008); A2A-D2 (Canals y col., 2003); 5-HT2A-mGlu2 (González-Maeso y col., 2008); 5-HT2A-D2 (Lukasiewicz y col., 2010) y D1-D2 (George y col., 2014) entre otros. Introducción 40 Se propone que la dimerización es relevante en los distintos aspectos del ciclo de vida de un GPCR. La dimerización juega un papel esencial en la maduración del receptor y permite un correcto transporte de los receptores desde el retículo endoplasmático a la superficie celular. La dimerización en el retículo es determinante en el caso del receptor GABAB (subunidades GABAB1 y GABAB2) para su transporte a la membrana plasmática. (Terrillon y Bouvier, 2004). En algunos casos, la derivación del receptor internalizado hacia una ruta de degradación y/o reciclaje puede verse regulada por dimerización. Así, recientemente se ha demostrado que el heterodímero formado por el protómero receptor canabinoide CB1 y el protómero receptor de orexina 1 presenta una localización predominante en endosomas. El tratamiento con un antagonista de cualquiera de los protómeros provoca que cambie su localización a la membrana (Ellis y col., 2006). Cambios conformacionales en GPCRs y selectividad funcional Los GPCRs son moléculas dinámicas en las que ocurren fluctuaciones estructurales rápidas y pequeñas. La activación de un GPCR por unión de agonistas conlleva el paso de un estado basal a otro activo, teniendo lugar una serie de cambios conformacionales. El estado basal de un GPCR, esto es, el estado del receptor en ausencia del ligando, se estabiliza por la contribución de los bucles intray extracelulares, que contribuyen a mantener la estructura del receptor y de interacciones no covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos de los dominios transmembrana (TM) (Kobilka, 2007). La unión de ligandos induce cambios conformacionales y en las interacciones que estabilizan el estado inactivo, de manera que se estabiliza una nueva conformación del receptor (Nygaard y col., 2013). A modo de ejemplo, en la estructura cristalina de la rodopsina determinada por primera vez en el año 2000 (Palczewski y col., 2000), que corresponde al estado inactivo del receptor, se constata la estabilización de este estado mediante la interacción del 11-cisretinal, unido covalentemente en el sitio de unión del receptor, con residuos específicos en los dominios TM3, 6 y 7 del receptor. El motivo Asp/Glu-Arg-Tyr/Trp (motivo “DRY”) en el segmento citoplasmático final de TM3 también contribuye a la estabilidad de la conformación inactiva. Este motivo es común entre GPCRs de la clase A y su aminoácido Arg3.50 interacciona en rodopsina con Glu6.30 en el extremo citoplasmático de TM6, formando una interacción conocida como “ionic lock”, que estabiliza al receptor en el estado inactivo (basal) (Meng y Bourne, 2001; Katritch y col., 2013). Así, se ha comprobado que Introducción 41 mutaciones que rompen las interacciones moleculares estabilizadoras incrementan la flexibilidad del receptor y el movimiento de los TM, lo que incrementa a su vez la probabilidad de que el receptor pueda adoptar una conformación activa en ausencia de un agonista, mostrando actividad constitutiva. Mutaciones en los residuos implicados en el “ionic lock” incrementan la actividad basal en varios GPCRs, incluyendo el β2-adrenérgico, el H2 de histamina, el α1B-adrenérgico o el AT1 de angiotensina (Kobilka y Deupi, 2007). Otras evidencias experimentales indican que Glu134 (3.49) del motivo “DRY” se protona durante la activación de la rodopsina, sugiriendo que la rotura de esta red de interacciones es parte del proceso normal de activación del receptor, de manera que se acepta que, durante la activación de los GPCRs, como mecanismo general variaría la posición relativa de TM3 y TM6, rompiéndose el “ionic lock”, entre otros cambios conformacionales (Meng y Bourne, 2001). A partir del año 2007, con la publicación de varias estructuras cristalográficas ha podido saberse que en otros GPCRs el papel estabilizador del “ionic lock” podría ser más limitado ya que está ausente en algunas estructuras de GPCRs como el receptor β1adrenérgico (en alguna estructura unido antagonista) y el aminoácido con un grupo carboxilo en 6.30 sólo se conserva en un 30% de los GPCRs (Katritch y col., 2013). Otra interacción relacionada con el motivo DRY, un enlace iónico entre Arg3.50-Asp3.49, aparece en todas las estructuras inactivas cristalizadas (Katritch y col., 2013) y con respecto a las activas el enlace solamente no aparece en rodopsina y el receptor β2-adrenérgico. En estos dos receptores en estado activo Arg3.50 experimenta un cambio en la conformación rotamérica e interactúa con la hélice C-terminal de la subunidad Gα. Adicionalmente, se ha propuesto la existencia de otro cambio conformacional asociado a la activación de GPCRs, conocido como “rotamer toggle switch”, para los receptores pertenecientes a la familia de la rodopsina (Kobilka y Deupi, 2007). Este mecanismo implica un cambio en la curvatura del TM6 a nivel del residuo prolina más altamente conservado entre los GPCRs en esta hélice y una rotación de la hélice sobre su eje. Estos movimientos transmembrana permitirían la exposición de dominios en el lado citosólico (en IL3) que conducirían la señalización a través de proteínas G heterotriméricas (Meng y Bourne, 2001). El reordenamiento de las hélices 3 y 6 durante la activación del receptor ha sido cuantificado mediante técnicas biofísicas tales como FRET en diferentes Introducción 42 GPCRs de las clases 1 y 2 (Vilardaga y col., 2003; Hoffmann y col., 2005; Lohse y col., 2014). La comparación de las estructuras de cristalización publicadas del receptor β2adrenérgico también permite comprobar el movimiento de TM6 (Fig. 9). Experimentos biofísicos realizados con el receptor β2-adrenérgico sugieren que estos dos mecanismos mencionados, la ruptura del “ionic lock” y el “rotamer toggle switch”, se activan independientemente, siendo los propios agonistas los que difieren en la capacidad de promover uno u otro. Además, las evidencias indican que se requiere más de un cambio conformacional y la rotura de diversas interacciones para lograr el estado completamente activo del receptor (Kobilka y Deupi, 2007). Relacionado con el aminoácido Pro comentado y pertenecientes ambos al motivo Cys-Trp-x-Pro (“CWxP”) de TM6, el aminoácido Trp6.48 experimenta un cambio rotamérico en algunas estructuras, y aunque fue inicialmente relacionado con activación en el receptor β2-adrenérgico, se ha visto en estructuras cristalográficas que no se correlaciona con el estado de activación del receptor (Katritch y col., 2013; Manglik y Kobilka, 2014). Introducción 43 Fig. 9. Cambios conformacionales en TM6 tras la activación del receptor β2-adrenérgico. El segmento TM6 experimenta un movimiento hacia afuera y rotación asociados a la activación del receptor (“rotamer toggle switch”). Se representan la conformación de TM6 en las estructuras cristalográficas del receptor β2-adrenérgico inactivo (gris, código PDB: 2RH1), activo unido a anticuerpo y de forma débil a proteína G (amarillo; código PDB: 3POG) y activo unido de forma completa a proteína G (verde; código PDB: 3SN6). (Tomado de Katritch y col, 2013). Durante el proceso de activación hay un desplazamiento del segmento TM7 hacia el interior del GPCR en dirección a su eje, especialmente acusado en rodopsina y A2A. El motivo “NPxxY” (Asn-Pro-x-x-Tyr) se localiza en TM7 cerca del extremo C-terminal y contiene el residuo Tyr7.53. Éste experimenta un cambio en su conformación rotamérica de manera que pasa de estar dirigido hacia TM1, 2 o 8 (visto en todas las estructuras de cristalización inactivas) a apuntar hacia el eje del receptor en todas las estructuras cristalizadas de GPCRs en estado activo (Katritch y col., 2013). Como consecuencia de la unión de distintos ligandos a GPCRs, pueden tener lugar cambios conformacionales intermedios o distintos de la estructura del receptor y éstos a su vez relacionarse con distintas vías de activación. En el caso del receptor β2-adrenérgico la Introducción 44 unión de un ligando al receptor puede estabilizar una conformación que no se corresponde con la conformación completamente activa del receptor unido a proteínas Gs. De hecho, la unión de agonistas al receptor β2-adrenérgico que activan la vía de señalización mediante arrestinas provocan un cambio conformacional limitado (Liu y col., 2012). En relación con estructuras cristalográficas algún autor considera que las estructuras disponibles que faciliten información acerca de la interacción con proteínas G son escasas. Se espera que futuras estructuras expliquen la selectividad por determinadas proteínas G, selectividad que podría estar dirigida por ligando (Katritch y col., 2013). La unión de agonistas a un GPCR se relaciona con heterogeneidad conformacional que es importante para permitir el acoplamiento a distintas proteínas de señalización (Nygaard y col., 2013). Así, un ligando A promovería o estabilizaría una conformación del receptor ligeramente diferente a la estabilizada por un ligando B, lo que constituiría una base molecular para la aparición de una farmacología específica para cada uno de los ligandos A y B (Fig. 10). En el caso del receptor 5-HT2A, se ha descrito que algunos ligandos como LSD señalización preferencial a través Gq/11 (Cussac y col., 2008) y del efector PLA2AA (Berg y col., 1998) en comparación con otros, que señalizan preferentemente mediante el efector PLC-IP (Berg y col., 1998) y la liberación de Ca+2 (Cussac y col., 2008). Para este receptor existen diferencias en la señalización entre ligandos alucinógenos (como DOI) y no alucinógenos, siendo los primeros los únicos que señalizan a través de proteínas Gi, aunque en este caso la potencia de la señalización es dependiente de otros factores como la coexpresión de mGlu2 (aumenta) o la unión de agonistas glutamatérgicos al dímero 5-HT2AmGlu2 (la inhiben) (González-Maeso y col., 2007; González-Maeso y col., 2008). A esto se le denomina selectividad funcional o eficacia colateral (agonist-directed trafficking of signaling, ligand-directed biased signaling) (Kenakin, 2007; Kenakin, 2007b; Kenakin, 2013). Introducción 45 Fig. 10. Selectividad funcional de ligandos de GPCRs. Distintos ligandos de un GPCR pueden promover o estabilizar estados conformacionales diferentes del receptor, con consecuencias funcionales de selectividad funcional (también denominada eficacia colateral o agonist trafficking), resultando en comportamientos funcionales selectivos de determinadas rutas de señales. Modulación alostérica en GPCRs Las características farmacológicas tales como afinidad, potencia o vía de señalización regulada, de un ligando que se une a un GPCR en su sitio ortostérico de unión de ligandos, pueden verse modificadas por la unión de moduladores alostéricos a sitios alostéricos del receptor. Este fenómeno de modulación puede darse tanto en sitios localizados en un GPCR monomérico como entre sitios en distintos protómeros de un GPCR dimérico, y afectar tanto a la unión de ligandos como a la señalización del receptor (Fig. 11). Así, la dimerización de GPCRs amplía las posibilidades de regulación alostérica, pudiendo darse fenómenos de cooperatividad tanto positiva como negativa entre protómeros (Schwartz y Holst, 2007; Kenakin, 2007a). Introducción 52 el consiguiente aumento de Ca+2 intracelular y activación de la calcineurina (Hernández y López., 2000; Lee y col., 2004; Beaulieu y Gainetdinov, 2011). Asimismo, este dímero también modifica la actividad de los canales de calcio de tipo Ny Ly de canales de potasio de rectificación de entrada regulados por proteínas G (GIRK). El receptor D2 también activa vías de señalización de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK) tales como ERK1 y 2 y promueve la fosforilación de CREB (Banisashemi y Albert., 2002). Este receptor también puede señalizar mediante mecanismos AMPc independientes a través de la proteína β-arrestina2 (Beaulieu y col, 2004; Masri y col., 2008). El haloperidol (pKi en rango de 7.4–8.8; Alexander y col., 2013) es un antagonista de la familia D2, al igual que espiperona, otra butirofenona que está disponible como radioligando tritiado. Racloprida es un antagonista selectivo del receptor D2 también disponible como radioligando. Se ha descrito el heterómero de receptores de dopamina D1-D2 con potencial interés para el tratamiento de la esquizofrenia (George, 2014), aunque se relaciona también con enfermedad de Parkinson (Fuxe y col., 2015). El dímero A2A-D2 (Borroto-Escuela y col., 2011) se localiza en terminaciones glutamatérgicas cortico-estriatales y en neuronas gabaérgicas estriatopalidales (Fuxe y col., 2007a). Se considera que la activación del protómero A2A de este dímero conlleva una reducción de la señalización del receptor D2, y una consiguiente activación de neuronas gabaérgicas y disminución de la actividad de la vía indirecta de los ganglios basales, de forma que el antagonismo A2A presenta potencial interés en el tratamiento del Parkinson (Fuxe y col., 2007). Se ha demostrado la existencia del dímero 5-HT2A-D2 (in vitro) y en el caso del dímero 5-HT2A-His452Tyr/D2 que incorpora un protómero 5-HT2A mutado, se ha descrito una dimerización reducida corregida por clozapina (Lukasiewicz y col., 2011). En relación con esquizofrenia, el bloqueo de este receptor tanto a nivel postsináptico como presináptico va a mediar las acciones terapéuticas de los antipsicóticos en las vías mesolímbica y mesocortical. Se considera que el bloqueo presináptico conlleva un silenciamiento por bloqueo por despolarización, especialmente en la vía mesolímbica y de forma ausente en la vía mesocortical, que se añade al postsináptico (Martínez-Cué y Flórez, 2014). Introducción 53 El receptor de serotonina 5-HT7 Al igual que todos los anteriores, se trata de un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) perteneciente al grupo α de la familia rodopsina. El trabajo de clonación del receptor 5-HT7 inicial fue publicado en 1993 (Lovenberg y col. 1993; Bard y col. 1993; Ruat y col. 1993; Shen y col. 1993). Es el subtipo de receptor de serotonina que presenta la mayor afinidad por la serotonina (Ruat y col., 1993), que está en el orden nanomolar. Su gen (HTR7) está localizado en el cromosoma 10q21-q24. La modificación posttranscripcional del transcrito genera tres variantes del receptor en humano (5-HT7 (a), 5-HT7 (b) y 5-HT7 (d)) que difieren sólo en el extremo carboxi-terminal (Heidman y col., 1997), que presentan similares propiedades farmacológicas (Pytliak y col., 2011). Se expresa a altos niveles en núcleos del sistema límbico en el tálamo (núcleos anterior y mediodorsal) y formación hipocámpica (giro dentado). Otras regiones con expresión intermedia son el hipotálamo, las regiones hipocampales CA1 y CA2, el septum, el núcleo basolateral de la amígdala, el giro anterior cingulado (Varnäs y col., 2004). Son áreas de baja expresión ciertas áreas de la corteza (células piramidales y neuronas gabaérgicas) y células de Purkinje del cerebelo (Varnäs y col., 2004; Hagan y col., 2000; Mengod y col., 2010) del cerebro humano y, al contrario que en otras especies, también se encuentran ciertos niveles de expresión en el núcleo caudado, putamen y en la sustancia negra (ganglios basales) (Martín-Cora y Pazos, 2004). La mayoría se localiza en el soma y axones terminales de neuronas gabaérgicas (Díaz y col., 2011). Este receptor se ha implicado en la regulación de los ritmos circadianos (Glass y col. 2003). También en la regulación fisiológica del humor, termorregulación (Hedlund, 2009) y en procesos de aprendizaje contextual dependiente de hipocampo (Gasbarri y col, 2008; Sarkisyan y Hedlund, 2009). Presenta sobre todo interés en el tratamiento de la depresión, una patología para la que las evidencias de su potencial utilidad son las más numerosas (Bonaventure y col., 2007; Sarkisyan y col., 2010; Naumenko y col., 2014). En relación con esta patología se estudia su papel en la modulación de la actividad de las neuronas del rafe. De hecho, existen evidencias de que el antagonismo de este receptor es capaz de prevenir la inhibición de neuronas del rafe (Mnie-Filali y col., 2011). Se sugiere que el receptor 5-HT7 está localizado en los axones terminales de neuronas glutamatérgicas que llegan al mismo núcleo, y que esta relación es relevante funcionalmente (experimentos en rata; Harsing y Introducción 54 col., 2004). Con mayor relevancia para la esquizofrenia, se estudia la capacidad de este receptor de modular la actividad de neuronas del ATV y su relación con la actividad de la vías dopaminérgicas mesocortical y mesolímbica (Mnie-Filali y col., 2007). Además, se estudia su potencial utilidad en el tratamiento de patologías como ansiedad, dolor, epilepsia y migraña (Hedlund, 2009; Leopoldo y col., 2011). Fuera del SNC se implica en la contracción de células del músculo liso (Hedlund y col., 2004) y modula la inflamación en el tracto gastrointestinal (Guseva y col., 2014a). El receptor 5-HT7 se acopla a proteínas Gs y estimula la AC, incluyendo algunas isoformas de AC específicas de neuronas, estimuladas por Ca+2/calmodulina. Esto conlleva el aumento de los niveles intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y la activación de proteína cinasa A (PKA) (Fig. 13), que finalmente provoca la activación de múltiples cascadas de señalización como la de las cinasas reguladas por señal extracelular (ERK) y proteína cinasa B (Akt) de forma Ras-dependiente y Rap-1 independiente (Guseva y col., 2014). La interacción del receptor 5-HT7 con proteínas G12 activa pequeñas GTPasas (Rho y Cdc42) que controlan la expresión de genes o las modificaciones en los filamentos de actina (Kvachnina y col., 2005). La depleción de colesterol y de los constituyentes esfingomielina, gangliósido 1 (GM1) o caveolina-1 de las balsas lipídicas modifican la unión de serotonina a este receptor (Sjögren y col., 2006; Sjögren y Svenningsson, 2007). Introducción 55 Fig. 13. Gráfica que representa las principales vías de señalización del receptor 5-HT7. Se muestra la señalización mediante acoplamiento a proteínas Gs como a proteínas G12. Ésta activa pequeñas GTPasas (Rho y Cdc42). (Tomado de Woehler y Ponimaskin, 2009). Se ha descrito que el receptor 5-HT7 puede formar homooligómeros en cultivos recombinantes (Teitler y col., 2010). Sus homodímeros se han observado en cultivos primarios de astrocitos de rata (Smith y col., 2011). Varios antipsicóticos son antagonistas de receptores 5-HT7 (Roth y col., 1994), entre otros aripiprazol (Hedlund, 2009), clozapina y risperidona (Díaz y col., 2011). Son agonistas de alta afinidad la 5-carboxamidotriptamina (5-CT) y 7-(dipropilamino)-5,6,7,8-tetrahidro1-naftalenol (8-OH-DPAT), aunque no son agonistas selectivos pues ambos presentan también afinidad por el receptor 5-HT1A. Se han descrito antagonistas pseudoirreversibles del receptor 5-HT7, inactivantes de la producción de AMPc (risperidona, 9hidroxirisperidona, metiotepina, bromocriptina, lisurida y metergolina) (Klein y Teitler, 2011). La unión de risperidona y hidroxirisperidona puede ser revertida por antagonistas competitivos (clozapina y mesulergina). Estas y otras peculiaridades de su comportamiento podrían explicarse teniendo en cuenta la homodimerización (Teitler y col., 2010; Smith y col., 2011; y Teitler y Klein, 2012). Un agonista de alta afinidad y selectivo de 5-HT7 es el LP-211 (Leopoldo y col., 2008). Éste se distribuye ampliamente en el SNC (Hedlund y col., 2010) y es útil para la realización de estudios in vivo. Las arilpiperazinas LP-211 (N-(4-cianofenilmetil)-4-(2difenil)-1-piperazinohexanamida) y MEL-9 (N-bencil-4-(2-difenil)-1piperazinohexanamida) presentan un comportamiento farmacológico similar en algunos Introducción 56 aspectos al descrito para algunos antipsicóticos antagonistas irreversibles del receptor 5HT7. Ambos ligandos antagonizan de forma no remontable la producción de AMPc inducida por 5-CT en células HEK293 y también inhiben la actividad de AC inducida por forskolina en las mismas células. La unión es resistente a lavados en ensayos en célula entera (HEK293) de unión de radioligandos y también en ensayos de producción de AMPc bloquean la respuesta a 5-CT y forskolina de forma irreversible (resistente a lavados) (Leopoldo y col., 2004; Leopoldo y col., 2007; Atanes y col., 2013). Queda por determinar cuál es la traslación de estas observaciones in vitro en relación con el comportamiento in vivo del ligando LP-211 como agonista 5-HT7. El SB269970 (2R-1-[(3-hidroxifenil)sulfonil]-2-[2-(4-metil-1piperidinil)etil]pirrolidina) es un antagonista del receptor 5-HT7 del que se ha descrito su buena distribución cerebral (Hagan y col., 2000: en rata) y que se encuentra disponible como radioligando tritiado (Kd = 1.2·109; Alexander y col., 2013) Estudios con este compuesto utilizando ensayos de inhibición prepulso (PPI) en ratones parecen indicar que el antagonismo 5-HT7 ejerce una modulación de la transmisión dopaminérgica y glutamatérgica con potencial utilidad en el tratamiento de la sintomatología positiva en esquizofrenia (Galici y col., 2008). Con respecto al receptor 5-HT7 hay que destacar su relación con la plasticidad estructural de circuitos cerebrales (Volpicelli y col., 2014). Está implicado en la conformación de la citoarquitectura neuronal y formación de redes neuronales durante el desarrollo embrionario y en la vida postnatal temprana. Su activación en neuronas hipocampales postnatales de ratón produce un incremento del número de sinapsis y de la actividad sináptica (Kobe y col., 2012). Además, en estas mismas neuronas su activación modula la señalización del receptor de glutamato NMDA (Vasefi y col., 2013). En el caso del cerebro adulto o adolescente el receptor 5-HT7 también parece jugar un papel en la modulación de la plasticidad estructural de las redes neuronales (Volpicelli y col., 2014). Ensayos in vivo en ratones con LP-211 mostraron un incremento significativo en el número total y densidad de espinas dendríticas en neuronas del estriado (Speranza y col., 2015). Otra actividad con la que está relacionada este receptor es la intelectiva-cognitiva. En relación con el aprendizaje y estudios preclínicos, el ratón carente del gen 5-HT7 (“knock-out”) presenta una actividad normal en los test de reconocimiento de objetos Introducción 57 nuevos, un test que evalúa un tipo de memoria episódica que depende de la corteza cerebral y que se relaciona con la memoria declarativa episódica humana. En estudios de aprendizaje contextual en modelos animales, en general, se realizan pruebas tales como el test de nueva localización o el de condicionamiento al miedo contextual; en éstos el ratón knock-out 5HT7 muestra déficits en aprendizaje contextual (Roberts y col., 2004) y el antagonismo selectivo de este receptor empeora también los resultados (Roberts y Hedlund, 2012). Otros hallazgos en estudios con animales indican que el bloqueo del receptor 5-HT7 mediante ligandos como el antagonista selectivo SB269970 y amisulprida, es capaz de mejorar los déficits cognitivos y psicomotores en modelos animales de síntomas de esquizofrenia desarrollados mediante la administración de antagonistas NMDA, particularmente en el test de reconocimiento de objetos nuevos (NOR) (administración subcrónica de antagonista) y en modelo animal de síntomas positivos de hiperactividad locomotora (administración aguda de antagonista NMDA) (Horiguchi y col, 2011; Meltzer y Massey, 2011). Sin embargo, los resultados no son concluyentes en el ensayo de inhibición prepulso (PPI) en modelo animal obtenido mediante la administración de antagonista NMDA (PCP o ketamina), ya que se obtienen resultados contradictorios (Galici y col., 2008; Semenova y col., 2008). Con respecto a este receptor existen evidencias de la actividad antidepresiva de su deleción genética y del tratamiento con antagonistas 5-HT7 en los ensayos de natación forzada (FST) y de suspensión de cola (TST) (Hedlund y col., 2005; Guscott y col., 2005). De forma muy importante se ha atribuido al antagonismo 5-HT7 la acción antidepresiva de amisulprida, una benzamida desarrollada inicialmente como antagonista D2/D3 selectivo para el tratamiento de la esquizofrenia (Abbas y col., 2009). Amisulprida está autorizada en Italia para el tratamiento de la distimia, una forma de depresión moderada, que se presenta con síntomas de tristeza, anhedonia, pérdida de vitalidad, baja autoestima y que tiende a la cronicidad. Algunos autores sugieren que el antagonismo 5-HT7 podría explicar la eficacia antidepresiva (Abbas y col., 2009). De manera destacada, antidepresivos de nueva generación tales como vortioxetina (medicamento Brintellix) presentan entre sus actividades farmacológicas el antagonismo 5-HT7, aunque vortioxetina presenta otras actividades como antagonismo de los receptores 5-HT3, 5-HT7 y 5-HT1D, agonismo parcial del receptor 5-HT1B, agonismo del receptor 5-HT1A e inhibición del transportador de serotonina (SERT). Los antipsicóticos clozapina, risperidona, olanzapina y amisulprida Introducción 58 (fármacos atípicos) y clorpromazina, flufenazina y pimozida (antipsicóticos clásicos) también tienen alta afinidad por este receptor. Su papel en el tratamiento de la disfunción cognitiva u otras acciones terapéuticas en el paciente con esquizofrenia necesita una mayor investigación (Gray y Roth, 2007). El receptor de adenosina A2A La familia de receptores de adenosina comprende los subtipos de receptores A1, A2A, A2B y A3. El receptor A2A es un GPCR de la clase A y grupo α de la familia rodopsina, con relativamente alta afinidad por adenosina. Se han publicado valores de EC50 de adenosina de 0.7 µM (Fredholm y col., 2001) para el receptor A2A y de 34 µM en el caso del receptor A2B. El gen de este receptor (ADORA2A) se encuentra en el cromosoma 22q11.23. El receptor A2A está implicado en la fisiología de la plasticidad neuronal, el control del sueño y el control de las actividades motoras en el estriado (Cheng y col., 2014). Es una potencial diana moduladora del aprendizaje y de la memoria y se relaciona con ansiedad y depresión (Cheng y col., 2014a). Se encuentran elevados niveles de expresión de este receptor en el estriado dorsal y ventral (fundamentalmente de localización postsináptica) y en el tubérculo olfatorio. Se expresa a menores niveles en regiones como el hipocampo y la corteza cerebral (Svenningsson y col., 1997). Se encuentra de forma presináptica en terminaciones corticoestriatales y en hipocampo de rata (Rebola y col., 2005). Se expresa también en células inmunes y de la glía, sobre todo en respuesta a interleucina β (IL-β), donde controla la neuroinflamación (Cheng y col., 2014). La principal vía de señalización del receptor A2A se deriva de su acoplamiento a proteínas Gs, con aumento de AMPc y activación de PKA. Esta última fosforila entre otras el factor CREB y activa la vía Src/Ras/Raf-1/MEK/ERK (Schulte y Fredholm, 2003). Interacciona con α-actinina, un regulador de la internalización y tráfico β-arrestina dependiente (Burgueño y col., 2003). Además, se ha descrito que este receptor interacciona con proteínas que unen Ca+2 como NECAB2, NCS-1 y calmodulina (Canela y col., 2007; Navarro y col., 2009; y Navarro y col., 2012). El antagonismo A2A es una posible estrategia neuroprotectora (Cunha y col., 2008). La activación del receptor A2A también es necesaria para un correcto neurodesarrollo de los Introducción 59 circuitos hipocampales (Silva y col., 2013). La activación del receptor A2A en el hipocampo modula la plasticidad sináptica a través de múltiples mecanismos (Cheng y col., 2014a). Asimismo, existen claras evidencias de que su antagonismo o supresión mejora el aprendizaje y la memoria en animales (Cunha y Agostinho, 2010; Cheng y col., 2014a). En los últimos años ha habido una intensa investigación en el campo de dimerización de este receptor. Se ha descrito la existencia de homodimerización de este receptor (Canals y col., 2004), sobre el que se han predicho los dominios de interacción mediante estudios de simulación (Fanelli y Felline, 2011). Del heterodímero A1-A2A se ha propuesto su implicación en la regulación de la liberación de glutamato (Ciruela y col., 2006; Ciruela y col., 2011). Se ha caracterizado el dímero A2A-D2 del que se ha propuesto (Fuxe y col., 2005; Fuxe y col., 2010; Trincavelli y col., 2012) que podría actuar como diana de agonistas A2A en neuronas gabaérgicas de la vía estriatopalidal ventral para, en el tratamiento de la esquizofrenia, reducir la hipofunción glutamatérgica de las proyecciones desde el núcleo talámico mediodorsal a la corteza prefrontal. También existe el dímero A2A-mGlu5 en neuronas del estriado (Ferré y col., 2002; Ciruela y col., 2011). Con respecto a los ligandos de este receptor, decir que la amilorida es un modulador alostérico del receptor A2A (Gao y Ijzerman, 2000). Se sugiere que este fármaco puede unirse al sitio alostérico de unión de Na+, sitio que presenta interés como potencial diana de moduladores alostéricos (Gutiérrez-de-Terán y col., 2013). El ligando 5´-Netilcarboxamidoadenosina (NECA) y CGS-15943 (9-cloro-2-(2-furanil)- [1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazolin-5-amina) son un agonista y un antagonista selectivos respectivamente de la familia de receptores adenosínicos. Los ligandos CGS-21680 (2-(4- (2-carboxietil)-fenetilamino)-5'-N-etilcarboxamidoadenosina) y ZM241385 (Poucher y col., 1995; Palmer y col., 1995) (Fig. 14) son un agonista y un antagonista respectivamente del receptor A2A disponibles como radioligandos (Kd en los rangos 1.6·10-8 – 2.2·10-8 M y 8·10-10 – 1.8·10-9 M para cada radioligando respectivamente; Alexander y Millns, 2001; Alexander y col., 2013). Introducción 60 Fig. 14. Estructura química de ZM241385. (4-(2-((7-amino-2-(furan-2-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]- [1,3,5]triazin-5-il)amino)etil)fenol), un derivado de triazolotriazina. Con respecto a este receptor, hay que destacar especialmente las recientes investigaciones en el campo de la determinación estructural mediante técnicas cristalográficas y los estudios de simulación de dinámica molecular. Desde el año 2008 se han publicado una serie de trabajos que tienen por objeto la determinación de la estructura y conformación del receptor A2A mediante técnicas cristalográficas y de difracción de rayos X. Dos de estos (la primera publicada de Jaakola en 2008) y (Doré y col., 2011) describen la estructura del receptor A2A formando un complejo con el antagonista específico ZM241385. Con respecto al primero de estos trabajos (Jaakola y col, 2008), la incorporación del antagonista selectivo ZM241385 cumple una función de termoestabilización del complejo. El receptor presenta una sustitución del tercer bucle intracelular (IL3) por la lisozima del bacteriófago T4 y la supresión de parte del extremo C-terminal para conseguir una estabilidad conformacional adecuada para su cristalización (Jaakola y col., 2008) (Fig. 15). En este complejo A2A-ZM241385, el ligando mostró una considerable superficie de contacto con Trp6.48, lo que sugeriría que el antagonista estabiliza al receptor en un estado inactivo (Jaakola y col., 2008) (Fig. 16). En esta estructura no se observa la interacción entre el motivo D/ERY y Glu6.30 constitutiva del cierre iónico (“ionic lock”) que, como ya se ha dicho (ver más arriba), se relaciona con la inactivación del receptor (Vogel y col., 2008). Introducción 61 Fig. 15. Modelo de la estructura del receptor de adenosina A2A-T4L-ΔC cristalizado por Jaakola y col., (2008). Se muestran los dominios transmembrana (marrón), la proteína T4L fusionada (azul claro) y los bucles extracelulares (verde). También se muestran el ligando ZM241385 (azul oscuro) y moléculas lipídicas (rojo). (Tomado de Jaakola y col., 2008). Introducción 68 estructura secundaria en H1 y D3, hasta una lámina β en A2A que interacciona con otra lámina β de EL1. EL2b posee también variabilidad: posee sólo 4 aminoácidos en D3 y siete en A2A, en este caso con una hélice α. Otros bucles (EL1 y EL3) presentan una menor variabilidad. En el caso de A2A, y al contrario que en otros receptores, EL1 está desplazado hacia el interior y define la entrada al sitio de unión (Katritch y col., 2012). En este receptor la estructura secundaria de TM5 del receptor A2A también difiere de otros receptores: se trata de una π-hélice (i+5) con más aminoácidos por vuelta que la α-hélice estándar. El área de la mitad extracelular de los receptores dispone de otras zonas de variabilidad, aunque de la forma del haz de hélices podría decirse que se conserva, sobre todo comparándola con la que presenta la mitad intracelular del receptor (Katritch y col., 2012). Con respecto al sitio de unión ortostérico decir que son dominios bastante rígidos en los que ocurren cambios conformacionales limitados (Katritch y col., 2012). Esto podría conllevar ventajas a la hora de plantear un descubrimiento racional de fármacos a partir de la información de las estructuras publicadas. Los sitios de unión presentan variabilidad en la localización en la estructura global del receptor, haces de hélices que lo conforman y, por supuesto, aminoácidos que lo forman. En el caso del receptor A2A, el sitio de unión se dispone de manera muy próxima a los bucles extracelulares y la interacción de ligandos con aminoácidos como Phe168 o Glu5.30 de EL2 y His264(7.29) de EL3 están presentes en las uniones de antagonistas de alta afinidad como ZM241385 (Jaakola y col., 2008), pero ausentes en los complejos con agonistas como NECA y adenosina que carecen de un sustituyente adecuado (Lebon y col., 2011). En el caso del receptor H1 el sitio de unión se dispone en una zona profunda del haz de hélices y el ión fosfato (PO4˗3) modula el acceso al mismo (Katritch y col., 2012) (Fig. 18). Introducción 69 Fig. 18. Representación de los sitios de unión de los receptores de adenosina A2A (A, izquierda, código PDB 3EML) y de histamina H1 (B, derecha, código PDB 2RH1). El sitio de unión de adenosina del receptor A2A se encuentra próximo a los bucles extracelulares y es similar a un canal accesible. El sitio de unión de H1 se encuentra en una zona profunda del haz de hélices. (Tomado de Katritch y col., 2012). Con respecto a la mitad intracelular de los GPCRs, hay una serie de secuencias que se conservan en todos los receptores de la clase A como el motivo D[E]RY en TM3, Glu6.30 o el motivo NPxxY en TM7 (Katritch y col., 2012). Con respecto al grado de variabilidad entre GPCRs en esta área, del que ya se ha dicho que es menor que el existente entre la mitad extracelular entre los mismos, IL1 y TM8 son regiones muy conservadas. Por el contrario la longitud de IL3 es muy variable (Katritch y col., 2012). Asimismo, la comparación de las formas activas e inactivas de los receptores aporta información acerca de los cambios estructurales que ocurren durante el proceso de activación (Fig. 19 y Tabla 3). Introducción 70 Fig. 19. Distintas configuraciones debidas a cambios conformacionales en el proceso de activación de GPCRs caracterizadas cristalográficamente. Se representa: el estado inactivo estabilizado por agonistas inversos o antagonistas (R); el estado inactivo con unión de baja afinidad de agonistas (R´); el estado activo (R´´); dos estados activos en los que hay unión de la proteína G heterotrimérica, siendo el último un estado de unión y señalización a través de proteínas G completo tras la liberación de GTP (R* y R*G). R*GRK y R*A son estados conformacionales favorables a la unión a cinasas de GPCR y β-arrestinas. (Tomado de Katritch y col., 2013). Introducción 71 Tabla 3. Distintos estados de activación caracterizados en las distintas estructuras cristalográficas de GPCRs. El receptor A2A se ha caracterizado en la forma inactiva y activa. Los estados conformacionales de los receptores tabulados son el estado inactivo (R), el estado inactivo con unión de baja afinidad de agonistas (R´), el estado activo (R´´), y dos estados activados en los que hay unión de la proteína G heterotrimérica, siendo el último un estado de unión y señalización a través de proteínas G completo tras la liberación de GTP (R* y R*G). (Tomado de Katritch y col., 2013). En el área implicada en la unión a proteínas de señalización de GPCRs, la variación de la posición de TM6 en los distintos estados de activación se ha cuantificado desde 3.5 Å (receptor A2A) hasta 14 Å (receptor β2-adrenérgico acoplado a proteínas G) (Katritch y col., 2013). Otros motivos estructurales de este área como el enlace iónico entre Arg3.50Asp(Glu)3.49 se han encontrado en todas las estructuras cristalizadas inactivas y también en la activa de A2A (Katritch y col., 2013). Mediante los estudios de cristalización pueden caracterizarse sitios alostéricos del receptor, tales como el bolsillo alostérico presente en el receptor A2A en un canal que une el área extracelular e intracelular del receptor y que aloja un átomo de sodio. Este bolsillo se colapsa en el proceso de activación. Con respecto a la unión de Na se ha observado un efecto modulador alostérico negativo de la unión de agonistas en este y otros GPCRs (Katritch y col., 2013). También presenta interés el estudio de la diy oligomerización; un ejemplo es la determinación de dos grupos consenso de interfaces de simetría a partir del estudio de las estructuras cristalográficas, las interfaces de simetría A (para rodopsina y el receptor opioide Introducción 72 κ entre otros, implica a TM1, TM2 y TM8) y B (para el receptor de quimiocina CXCR4 entre otros, implica a las zonas extracelulares de TM5 y TM6, intracelulares de TM3 y TM4 y a TM5 y TM6). La disposición en el dímero de estas interfaces es antiparalela (Katritch y col., 2013). En la actualidad cobran importancia los estudios de simulación de dinámica molecular y otras aproximaciones bioinformáticas de modelización de GPCRs, realizados a partir de datos obtenidos de las estructuras cristalográficas con métodos informáticos (Rodríguez y col., 2011). En general, a la hora de construir un modelo sobre el que realizar las simulaciones se tiene en cuenta todo tipo de información presente en los estudios cristalográficos del receptor, como pueden ser enlaces iónicos entre aminoácidos o interacciones entre dominios bien definidas. Se realizan análisis de las conformaciones más probables de determinados segmentos (TM) y se atribuyen valores de fluctuación a cada área que se incorporan a la dinámica del receptor simulado, pudiendo incluirse simulaciones de la interacción con agua y la membrana plasmática (Rodríguez y col., 2011). Aspectos cinéticos de la interacción ligando-receptor: el tiempo de residencia (tR) Los parámetros que caracterizan la unión de un fármaco o ligando a un receptor en el equilibrio, como las constantes de disociación en el equilibrio (Kd y Ki), no aportan información acerca de la dimensión temporal del proceso de unión ligando-receptor. Los ensayos de determinación de estos parámetros se realizan en sistemas cerrados en el equilibrio, en los cuales las concentraciones de ligando libre prácticamente se mantienen invariables. Sin embargo, los sistemas in vivo son sistemas abiertos en los cuales la concentración de fármaco libre puede variar o ser objeto de una serie de fenómenos que modifican su unión al receptor con respecto a condiciones de equilibrio en ensayos in vitro, tales como el rebinding (ver más adelante). El parámetro tR permite obtener una medida de la duración del complejo ligando-receptor, un parámetro menos variable en las distintas condiciones in vitro o in vivo. El parámetro tiempo de residencia (tR) se define como el tiempo de unión medio al receptor de cada molécula de una determinada población de las mismas. Se define matemáticamente como la inversa de la constante de velocidad de disociación (1/koff). También se define el parámetro vida media de disociación (t1/2diss) como la vida media del complejo ligando-receptor y se calcula como t1/2diss = ln 2/koff (Tummino Introducción 73 y Copeland, 2008). El parámetro tiempo de residencia (tR) presenta interés en el proceso de búsqueda de fármacos, en el estudio de la farmacodinamia de fármacos y de su farmacocinética y por su relación con la eficacia, seguridad y selectividad de fármacos en terapéutica (Copeland, 2010). Con respecto a los fenómenos que condicionan la unión del ligando al receptor en in vivo es preciso destacar el fenómeno de rebinding. De acuerdo con algunos autores, el fenómeno de unión de determinados fármacos estaría condicionado por la formación de una capa de medio extracelular alrededor de la célula que actuaría como una barrera de difusión de moléculas de fármaco promoviendo su unión de nuevo al receptor. Este límite a la difusión es favorecido por la complejidad anatómica y fisiológica, la complejidad de la matriz extracelular, interacciones electrostáticas e hidrofóbicas y factores patológicos (Vauquelin y Charlton, 2010). Basándose en este concepto, se propuso un modelo para explicar el comportamiento farmacocinético de [3H]-diprenorfina (Perry y col., 1980) caracterizado mediante un microcompartimento del receptor en el que se contiene la barrera de difusión y en el cual ocurren fenómenos de asociación y disociación de acuerdo con las constantes de velocidad de asociación y disociación kon y koff. El fármaco difunde y se reequilibra con el fármaco presente en otras áreas del cerebro de acuerdo con las constantes de primer orden kin y kout. Así, y de acuerdo con este modelo, la probabilidad de rebinding depende de la kon y no de la afinidad (Vauquelin, 2010). Otro modelo de explicación del rebinding que guarda similitudes es el de Goldstein y col. (1995). El fenómeno de rebinding se considera un parámetro fundamental a tener en cuenta en condiciones tanto in vitro como in vivo y del que se espera que prolongue la duración de la acción al hacer que aumente o se estabilice la ocupación del receptor en los distintos tiempos de la curva farmacocinética de una administración, pese a la barrera para la unión del ligando al receptor que supone la capa de difusión en los estadíos iniciales de la administración (Vauquelin, 2010). Con respecto a la interpretación de ensayos funcionales en los que se observa un antagonismo no remontable existen dos explicaciones: la actividad moduladora alostérica o la existencia de fenómenos de cooperatividad negativa y el recurso a tR elevado del competidor en el receptor, sobre todo en ausencia de reserva de receptores o tratándose de un proceso de unión del ligando al receptor de un solo paso (Vauquelin y Szczuka, 2007). Introducción 74 La dimensión tiempo del fenómeno de unión del fármaco al receptor puede ser caracterizado mediante las constantes de velocidad de asociación y disociación del fármaco del receptor (kon y koff, respectivamente). Ambas definen el valor de la constante de disociación cinética (Kd) de acuerdo con la ecuación koff/kon, ecuación válida para referirse al primer paso de unión del complejo binario ligando-receptor (Tummino y Copeland, 2008) (Fig. 20). La constante de disociación (Kd) se relaciona, además, con parámetros termodinámicos como la energía libre de Gibbs (ΔG) ya que las diferencias de energía libre entre los estados unido y libre del fármaco al receptor (ΔGd) determina el valor de afinidad. Éstas se relacionan mediante la ecuación que define la variación de energía libre como ΔGd = R·T·ln (Kd), siendo R = 8.314 (J·°K-1·mol-1) y T la temperatura en grados kelvin (Pan y col., 2013). La constante de velocidad de disociación (koff) informa acerca de la dimensión temporal del fenómeno de unión del ligando al receptor, concretamente de la tasa de disociación de los elementos del complejo. La constante de velocidad de asociación (kon) hace referencia a la velocidad de formación del complejo fármaco-receptor. El cálculo de esta a partir de la constante de velocidad de asociación observada (kobs) depende de la concentración del ligando que se asocia y del mecanismo cinético de unión ligando-receptor (Fig. 20). Se han definido tres mecanismos cinéticos de interacción ligando-receptor (Tummino y Copeland, 2008): - El primero (mecanismo A) consiste en un mecanismo de asociación y disociación de un solo paso de manera que el receptor (R) y el ligando (L) se unen para formar el complejo (RL), y esta formación es el único paso determinante cinéticamente. La constante de velocidad de disociación (koff) equivale a la constante de velocidad de disociación k2 y la constante de velocidad de asociación (kon) equivale a la constante de asociación k1. En este modelo el valor de la constante de asociación observada equivale a k1·[L]+k2, siendo [L] la concentración de radioligando. El modelo de asociación de un paso de unión y otro de disociación, se esquematiza en la siguiente figura: 𝐿+𝑅 𝑘𝑜𝑛 → 𝑅𝐿 𝑘𝑜𝑓𝑓 → L + R Este mecanismo cinético de unión se considera predominante en la mayoría de los procesos de unión ligando a GPCRs (Guo y col., 2014a). Introducción 75 - Un segundo modelo de interacción ligando-receptor (mecanismo B) (Tummino y Copeland, 2008) es análogo al modelo de interacción enzima-sustrato con ajuste inducido (Koshland y col., 1958). En este modelo hay una formación inicial de un complejo (RL), a partir del cual se forma mediante isomerización otro complejo (R*L). Ambas fases determinan la velocidad de unión del ligando. El valor de la constante de velocidad de disociación en este caso viene definido en función de una ecuación que incorpora las dos microconstantes de disociación (k2, correspondiente a la disociación del complejo RL y k4, correspondiente a la reversión de isomerización del complejo R*L). Puede esperarse que en la mayoría de los casos sea la reversión de isomerización k4 el factor limitante de la disociación del complejo. Unos valores similares para k2 y k4 provocaría que ambas fueran limitantes de la disociación del complejo ligando-receptor. Puede determinarse una constante de disociación en el equilibrio correspondiente a la formación del complejo RL (Kd) y otra correspondiente a la afinidad del complejo final R*L (Kd*) (Fig. 20). Este mecanismo cinético de asociación de un paso de unión y otro de disociación, se esquematiza en la siguiente figura: L+𝑅 𝑘1 → 𝑅𝐿 𝑘3 → 𝑅´𝐿 𝑘4 → 𝑅𝐿 𝑘2 → L + R Este mecanismo cinético de unión se considera predominante en la mayoría de los procesos de unión ligando-receptor (Guo y col., 2014a). - El tercer mecanismo propuesto (mecanismo C) (Tummino y Copeland, 2008) se trata de una selección conformacional. En este modelo existe un equilibrio entre dos estados conformacionales en ausencia de ligando. A uno de ellos es capaz de unirse el ligando (R*). A medida que se une ligando y se forma el complejo (R*L) en función de la concentración de L y de la microconstante k3 decrece la población de receptores R*, que se forman a partir de receptores R según la microconstante k1. Una característica que lo diferencia de los mecanismos A y B es que el valor de la constante de asociación observada (kobs) disminuye al aumentar la concentración de L (aumenta en los modelos de mecanismos A y B). Introducción 76 Fig. 20. Mecanismos cinéticos de unión ligando-receptor y definiciones matemáticas de constantes para los modelos A (mecanismo de un solo paso), B (mecanismo de tipo ajusteinducido) y C (equilibrio conformacional). bKd es la constante de disociación en el equilibrio referida al complejo inicial RL. cKd* es la constante de disociación en el equilibrio para el complejo final binario R*L en un mecanismo cinético de unión de dos pasos. dkobs es la constante de velocidad de asociación observada y ekoff la constante de velocidad de disociación. k1 y k2 equivalen a kon y koff en el mecanismo A. En el mecanismo B hay dos constantes de velocidad de asociación (k1 y k3) y dos constantes de velocidad de disociación (k2 y k4); k3 y k4 corresponden al ajuste conformacional. En el mecanismo C hay dos constantes de velocidad de interconversión entre estados de un receptor (k1 y k2); una constante de velocidad de asociación (k3) y una constante de velocidad de disociación (k4) al receptor competente para unir ligando (R*). fτ es el tiempo de residencia (tR) y gt1/2diss la vida media de disociación del complejo receptor-ligando. (Tomado de Tummino y Copeland, 2008). A partir de la constante de asociación observada (kobs) puede determinarse la kon en los distintos modelos de unión de acuerdo con las ecuaciones apropiadas. La correspondiente al mecanismo A define kon como el cociente (kobs - koff)/[L], siendo [L] la concentración experimental del radioligando que se asocia. En relación a los mecanismos que se acaban de mencionar la kobs presenta un perfil de variación característico en función de la concentración de ligando y los distintos mecanismos cinéticos de unión (Fig. 21). Introducción 77 Fig. 21. Valores observados experimentalmente de la constante de asociación observada (kobs; constante de pseudoprimer orden) en función de la concentración del ligando (inhibitor) y del mecanismo de unión al receptor (A, B o C). La curva A (ajuste lineal) corresponde al modelo cinético de asociación simple o de un solo paso. La curva B corresponde al modelo cinético de dos pasos (con isomerización tras la unión) y es análogo al modelo de ajuste inducido de interacciones enzima-sustrato. Los datos correspondientes al mecanismo B se ajustan a un modelo de hipérbola. La curva C corresponde al modelo cinético de selección conformacional. (Tomado de Tummino y Copeland, 2008). Son determinantes a nivel molecular de la cinética de unión de un ligando a un receptor aspectos como: la accesibilidad del sitio de unión y las interacciones que establece el fármaco hasta llegar al sitio de unión; los cambios conformacionales de los distintos dominios en el acceso del ligando al sitio de unión; las interacciones del ligando con el receptor de tipo iónico, mediante puentes de hidrógeno o de tipo van der Waals, no siendo la complementariedad iónica un factor determinante para una rápida unión de ligandos (Collins, 2012); y la presencia de moléculas de agua (Pan y col., 2013). En estudios de simulación computacionales en el receptor A2A se ha relacionado la presencia de moléculas de agua con disminuciones del tR de antagonistas del receptor de adenosina A2A (Bortolato y col., 2013). Las numerosas estructuras cristalográficas de GPCR, publicadas en los últimos años contribuirán a determinar aminoácidos o dominios que podrían ser condicionantes de la cinética de unión de ligandos. En relación con determinantes estructurales del tR y como ejemplo, destacar que se ha relacionado la mayor flexibilidad del segundo bucle extracelular del receptor Introducción 84 microbalance”) y las técnicas basadas en la fluorescencia y unión de ligandos (Hoffmann y col., 2015). El primero es una técnica biofísica comparable a la SPR en muchas ventajas e inconvenientes. Las técnicas de fluorescencia comprenden las basadas en la intensidad de fluorescencia, la anisotropía de fluorescencia, la espectroscopía de correlación de fluorescencia y podrían clasificarse como tales las basadas en la transferencia de energía de resonancia. Presentan como inconveniente general el que el uso de ligandos modificados incorporando fluoróforos requiere realizar una caracterización farmacológica de los mismos. Las técnicas de anisotropía y de espectroscopía de correlación no necesitan la separación del radioligando no unido del unido. Para hacer uso de las técnicas basadas en transferencia de energía entre ligando y receptor mediante fluorescencia o bioluminiscencia se necesita el diseño, clonación y validación de los receptores incorporando la secuencia de la proteína fluorescente adecuada. Las tres últimas técnicas posibilitan el análisis en tiempo real (Hoffman y col., 2015). JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Justificación y Objetivos 87 ESTUDIO DE DETERMINANTES ESTRUCTURALES EN EL SITIO DE UNIÓN DEL RECEPTOR RELEVANTES PARA EL PERFIL DE AFINIDAD Y SELECTIVIDAD DE ANTIPSICÓTICOS SOBRE GPCRS DE SU RECEPTOROMA La primera parte del trabajo presentado se centra en conocer la contribución de determinados componentes estructurales en el bolsillo de unión de GPCRs pertenecientes al receptoroma de antipsicóticos a la interacción ligando-receptor para estos fármacos. Clozapina es uno de los antipsicóticos más eficaces, considerado el “gold standard” entre los antipsicóticos actuales, pero presenta el inconveniente del grave efecto adverso de agranulocitosis y se reserva para el tratamiento de psicosis refractarias. Olanzapina, con mejor perfil de seguridad, constituye una opción ampliamente utilizada con una buena eficacia clínica (Juliano y col., 2013). Con respecto al perfil multirreceptorial característico de estos fármacos existe un interés en conocer el perfil “ideal” asociado a eficacia y disminución de efectos adversos. El estudio de este perfil siempre conlleva un aumento del conocimiento acerca de la fisiopatología y clínica de la enfermedad y permite comprender aspectos como selectividad farmacológica y su relación con las reacciones adversas o con la eficacia clínica, vías de señalización molecular celulares y vías de señalización cerebrales, relaciones estructura-actividad de fármacos y estructura de receptores. El primer objetivo de nuestro trabajo fue conocer si determinados residuos localizados en el sitio de unión de GPCRs relevantes en la farmacología de los antipsicóticos son determinantes para el perfil de afinidad y selectividad de estos fármacos, centrándonos en los antipsicóticos de gran relevancia terapéutica clozapina y olanzapina (Fig. 23) como modelo de estudio. Fig. 23. Estructura química de la clozapina (dibenzodiazepina) y de la olanzapina (tienobenzodiazepina). Aparecen señalados los átomos de N en posiciones 5 y 10. Justificación y Objetivos 88 Este trabajo se llevó a cabo en el contexto de un proyecto de colaboración con el grupo de Informática Biomédica del Dr. Manuel Pastor (IMIM/Universitat Pompeu Fabra). Nuestro estudio partió de resultados previos obtenidos por dicho grupo, a partir de modelos computacionales de 14 receptores GPCR diana de antipsicóticos (entre ellos los serotoninérgicos 5-HT1A y 5-HT2A y el dopaminérgico D2) realizados por homología en base a la estructura cristalográfica del receptor β2-adrenérgico unido a carazolol (código PDB, Protein Data Bank: 2RH1; Cherezov y col., 2007), disponible en el momento en el que se llevaron a cabo estos estudios (Selent y col., 2008). El trabajo se completó con el estudio de los perfiles de afinidad de clozapina y olanzapina por los distintos GPCRs modelizados, estudios de acoplamiento de ligandos a estos receptores (“docking”) y análisis de la relación entre estos aspectos y la secuencia aminoacídica y estructura de los GPCRs a estudio. El trabajo de Selent y col. (2008), base para nuestros estudios, abordó en primer lugar un análisis del perfil de afinidad de clozapina y olanzapina por 14 GPCRs del receptoroma de antipsicóticos, en concreto, los serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT6 y 5-HT7; dopaminérgicos D2, D3 y D4; muscarínicos M1 y M4; adrenérgicos α1 y α2 e histaminérgico H1. Los valores de afinidad tenidos en cuenta para la realización de este estudio corresponden a datos experimentales que se recopilaron de la literatura, así como de bases de datos públicas, y son los que se recogen en la Tabla 4. Justificación y Objetivos 89 Tabla 4. Características de los GPCRs modelizados en el trabajo de Selent y col., 2008. [13]Los valores de afinidad (pKi) de clozapina y olanzapina se tomaron de Lange y col., (2007). [a]Las columnas de homología se refieren al porcentaje de identidad de secuencia entre residuos del sitio de unión de los receptores. [b]Olanzapina no presenta afinidad por el receptor 5-HT1A, asignándosele un valor de 5 (pKi) de cara a llevar a cabo posteriores análisis. [c]Los valores de afinidad por el receptor D2 se refieren a la variante D2S. [d]Los valores de afinidad por el receptor D4 se refieren a la isoforma D4.4. [e]Los valores de afinidad por el receptor α2 se refieren al receptor de rata; entre paréntesis se muestran los valores correspondientes al receptor humano tomados de la base de datos PDSP (National Institutes of Mental Health Psychoactive Drug Screening Program, PDSP Ki Database: http://pdsp.med.unc.edu/). (Tomado de Selent y col., 2008). Posteriormente, en el citado trabajo de Selent y col. se realizó un análisis de la estructura del sitio de unión de estos 14 GPCRs en complejo con clozapina y olanzapina. Se realizaron superposiciones de los modelos por homología de los distintos receptores generados que permitieron realizar una comparación de la estructura del sitio de unión de los distintos GPCRs. También se incluyó un análisis de la superposición de las posiciones de acoplamiento de los antipsicóticos clozapina y olanzapina en los distintos receptores (Fig. 24), lo que permitió hacer una comparación de las interacciones que tienen lugar en los distintos complejos ligando-receptor. Justificación y Objetivos 90 Fig. 24. Superposición de los modelos por homología de los 14 GPCRs modelizados en el trabajo de Selent y col., (2008). (a) Se muestran la disposición de las cadenas laterales en el sitio de unión de los GPCRs y (b) la superposición de las posiciones de acoplamiento de clozapina en los mismos receptores. (Tomado de Selent y col., 2008). A partir de los modelos receptoriales generados en el citado trabajo, los autores identificaron una serie de características estructurales comunes a los 14 GPCRs (Selent y col., 2008): el aspártico en posición 3.32 determinante para la unión de ligandos; regiones hidrofílicas en TM3 y TM5; regiones hidrofóbicas como el agrupamiento aromático entre TM5 y TM6 y residuos alifáticos en TM1 y TM2. Las regiones hidrofílicas identificadas comprenden la posición Cys/Ser 3.36 y las posiciones en TM5 5.42, 5.43 y 5.46, para las que ya se había descrito algún papel, tanto en la modulación de la afinidad y el posicionamiento de ligandos serotoninérgicos con determinadas características estructurales en el caso de la posición 3.36 en el bolsillo de unión del receptor 5-HT2A (Almaula y col., 1996) como en la selectividad por grupos aromáticos (fenol, catecol, imidazol, indol) de ligandos endógenos por el receptor beta-adrenérgico (posiciones 5.42, 5.43 y 5.46 ) (Kobilka, 2004) (Fig. 25). Justificación y Objetivos 91 Fig. 25. Representación de zonas y posiciones homólogas identificadas en el estudio de Selent y col. (2008) en el sitio de unión entre los receptores modelizados. Se señalan el residuo Asp3.32 conservado en TM3 (naranja); regiones hidrofóbicas (verde): agrupamiento aromático en TM5 y TM6 y residuos alifáticos en TM1 y TM2; regiones hidrofílicas (azul): posiciones 3.36 y 3.37 (TM3) y 5.42, 5.46 y 5.47 (TM5). En la esquina inferior derecha se representa para comparación un alineamiento de la secuencia en el sitio de unión de los receptores 5-HT2A y D2 humanos, resaltando en rojo los residuos conservados. (Tomado de Selent y col., 2008). De los mencionados estudios de modelización de GPCRs del receptoroma de los antipsicóticos y de acoplamiento de ligandos (clozapina, olanzapina) en esos modelos derivan tres hipótesis acerca de la interacción ligando-receptor que fueron confrontadas experimentalmente en este bloque de trabajo. Estas hipótesis plantean comprobar la relevancia de aminoácidos en determinadas posiciones de GPCRs del receptoroma de antipsicóticos para el perfil de afinidad y selectividad de clozapina y olanzapina, entre otros ligandos, por esos GPCRs. Con el planteamiento y comprobación de estas hipótesis se espera que los resultados verifiquen y complementen la información disponible y obtenida en los estudios de modelización y acoplamiento de ligandos (Selent y col., 2008). Se considera que los resultados aportarán información acerca de la relevancia de los aminoácidos en determinadas posiciones de los receptores o de determinados componentes estructurales de los ligandos para los perfiles de afinidad y selectividad por GPCRs. El conocimiento acerca de la biología estructural de receptores podría verse aumentado al igual que podrían definirse mejor los determinantes del perfil multirreceptorial de fármacos Justificación y Objetivos 92 antipsicóticos. Indirectamente, se podría ampliar la información disponible en el área de descubrimiento de fármacos (optimización de cabezas de serie, modelización). Relevancia del residuo en posición 3.36 para la unión de antipsicóticos a GPCRs de su receptoroma El estudio planteado en este subapartado de nuestro trabajo parte de observación de que los perfiles de afinidad de clozapina y olanzapina por distintos GPCRs guardan relación con la identidad del residuo en la posición 3.36 del receptor. En concreto, la presencia de Ser o Cys en dicha posición definiría dos grupos de receptores por los que ambos antipsicóticos presentarían mayor y menor afinidad, respectivamente. De acuerdo con esta observación, la importancia del residuo 3.36 ya había sido evidenciada en estudios previos en los que se demostró que era determinante para la afinidad de serotonina por el receptor 5-HT2A (Almaula y col., 1996). Concretamente, Selent y col. encontraron, en base a datos experimentales recogidos de la literatura de ensayos de unión de radioligandos, una afinidad de clozapina y olanzapina significativamente mayor (test t de Student, p < 0.001) por los receptores con un residuo Ser en la posición 3.36, entre los que se encuentran los receptores 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, M1, M4 y H1, que por los receptores con un residuo Cys en esta posición (D2, D3, D4, 5-HT1A, 5-HT6, 5-HT7, α1 y α2), siendo el incremento medio del valor de afinidad de olanzapina asociado a Ser3.36 de aproximadamente una unidad logarítmica (algo menor en el caso de clozapina: 0.8) en unidades pKi (Fig. 26) (Selent y col., 2008). Justificación y Objetivos 93 Fig. 26. La gráfica resume los valores de afinidad (pKi) de olanzapina y clozapina por los distintos receptores con Cys o Ser en posición 3.36 (grupos C3.36 y S3.36, respectivamente). Los dos antipsicóticos presentan mayor afinidad por los receptores con Ser en posición 3.36 con respecto a los receptores con Cys en esa posición (test t de Student, p < 0.001). (Tomado y modificado de Selent y col., 2008). Receptores Cys3.36: D2, D3, D4, 5-HT1A, 5-HT6, 5-HT7, α1 y α2; receptores Ser3.36: 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, M1, M4 y H1. Dentro de los dos grupos de receptores identificados, destacan por su relevancia en el perfil farmacológico de los antipsicóticos los receptores D2 y 5-HT2A, que notablemente constituyen ejemplos de los grupos de GPCRs Cys3.36 y Ser3.36, respectivamente. Los estudios de acoplamiento de antipsicóticos en los modelos de receptores generados llevados a cabo por Selent y col. (2008) encontraron similitudes entre una serie de interacciones que clozapina y olanzapina establecían tanto con el receptor 5-HT2A como en el D2: disposición del anillo tricíclico de forma perpendicular al plano de la membrana; formación de un enlace iónico entre el átomo de nitrógeno protonado en el anillo piperazina del ligando y Asp3.32; la existencia de una zona de unión hidrofóbica que empareda al ligando conformada por los residuos Phe6.52 y Val3.33; formación de un enlace mediante puente de hidrógeno entre el átomo de nitrógeno 5 del ligando y Ser5.46; y existencia de una interacción aromática entre el anillo tricíclico y Trp6.48 (Fig. 27). Justificación y Objetivos 100 que haría que interacciones mejor con el anillo fenilo de la clozapina que con el anillo tiofeno más polar presente en olanzapina. Así, teniendo en cuenta los datos aportados por los estudios de acoplamiento en GPCRs diana de antipsicóticos de Selent y col. (2008) y los datos relativos a la diferencia de afinidades de clozapina y olanzapina por distintos receptores, nos planteamos investigar experimentalmente la relevancia de los aminoácidos en las posiciones 5.43 y 5.46 de GPCRs diana de antipsicóticos para el perfil farmacológico diferencial de clozapina y olanzapina así como las diferentes interacciones que estos dos ligandos distintos podrían establecer con estos aminoácidos. Así, en este subapartado de este trabajo se propuso comprobar si la diferencia en la identidad de los aminoácidos que ocupan las posiciones 5.43 y 5.46 de receptores adscritos a los dos distintos grupos, contribuye de forma determinante a la preferencia de afinidades que presentan, comparativamente, los antipsicóticos olanzapina y clozapina (mayor afinidad de olanzapina en comparación con clozapina por el grupo de receptores Ser5.43/Ser5.46 y mayor afinidad de clozapina en comparación con olanzapina por los receptores del grupo presentando aminoácidos más hidrofóbicos en estas mismas posiciones). Para comprobar experimentalmente esta hipótesis, nuestro trabajo se centró en los receptores D2 (como prototipo de receptor del grupo Ser5.43/Ser5.46) y 5-HT1A (receptor del grupo con residuos hidrofóbicos, en este caso Thr5.43/Ala5.46). De manera que se planteó un intercambio de estos aminoácidos en cada uno de los receptores mediante mutagénesis dirigida, con el fin de comprobar mediante ensayos de unión de radioligandos el impacto de las mutaciones en el perfil de afinidades de los antipsicóticos clozapina y olanzapina por ambos receptores. Relevancia del residuo en posición 3.33 para la unión de antipsicóticos a GPCRs diana y antidiana de su receptoroma Al igual que en los dos subapartados anteriores, la hipótesis de este trabajo parte de los resultados del estudio realizado por Selent y col., 2008. Mediante estudios de acoplamiento de los antipsicóticos clozapina y olanzapina en los distintos GPCRs modelizados se determinó que los ligandos, en su unión a los receptores 5-HT2A y D2, interaccionan con un sándwich hidrofóbico conformado por los residuos Phe6.52 y Val3.33 (Selent y col., 2008). Estos residuos se encuentran conservados en otros receptores del Justificación y Objetivos 101 receptoroma de los antipsicóticos como los dopaminérgicos D3 y D4, de serotonina 5-HT1A, 5-HT2A y 5-HT7 y adrenérgicos α2 (Tabla 5). Tabla 5. Secuencia de aminoácidos de distintos GPCRs del receptoroma de los antipsicóticos. La presente hipótesis se centra en el residuo en posición 3.33, ocupado por Val en muchos de los GPCRs asociados a la acción terapéutica de los antipsicóticos. En receptores antidiana como el histaminérgico H1 o el muscarínico M1 esta posición la ocupa Tyr. (Tomado de GPCRDB, 2015). El receptor H1 es uno de los receptores por el que los antipsicóticos clozapina y olanzapina presentan una mayor afinidad; responsable en gran medida del efecto adverso de sedación, causado especialmente por estos dos antipsicóticos, o de la ganancia de peso (Kroeze y col., 2003; Deng y col., 2010; Benedí e Iglesias, 2012; Leucht y col., 2013). Este receptor presenta en posición 3.33 un residuo tirosina, aminoácido también presente en esa posición en otras antidianas de fármacos antipsicóticos como los receptores muscarínicos M1, M2 y M3, relacionados con reacciones adversas de tipo cardíaco o ganancia de peso, entre otras. El análisis multirreceptorial de las afinidades que presentan clozapina y olanzapina por distintos GPCRs de su receptoroma junto con el alineamiento múltiple de las secuencias de esos receptores llevado a cabo por Selent y col (2008) viene a indicar que clozapina y olanzapina presentarían una mayor afinidad por receptores con Tyr en posición 3.33, una característica estructural presente en los receptores aceptados como antidianas de los antipsicóticos atípicos, que por receptores con Val en esa posición, aspecto estructural Justificación y Objetivos 102 compartido por diversos GPCRs considerados dianas asociadas a la eficacia terapéutica de estos fármacos. Para ilustrar esta observación, en la Tabla 6 se recogen algunos valores de afinidad de clozapina y olanzapina por estos receptores recogidos de distintas fuentes que pueden servir como referencia, y que sitúan al receptor de histamina H1 (Tyr3.33) como el GPCR por el que ambos fármacos presentan la mayor afinidad. 5-HT2A D2 H1 Ki (nM) (PDSP) Ki (nM) (Ishibashi y col., 2010) Ki (nM) (PDSP) Ki (nM) (Ishibashi y col., 2010) Ki (nM) (PDSP) Ki (nM) (Ishibashi y col., 2010) Clozapina 5.92 (1 – 11)1 9.17 ± 1.462 157 (44 – 260)3 108 ± 274 1.25 2.02 ± 0.206 Olanzapina 3.13 (1.31 – 5.8)1 5.78 ± 0.892 34.23 (3.7 – 78)3 14.4 ± 3.24 3.83 ± 0.526 Tabla 6. Valores de afinidad (Ki) de clozapina y olanzapina por los receptores 5-HT2A, D2 y H1 humanos, así como de otras especies. 1Media (rango) de valores de Ki (nM) tomados de PDSP (National Institutes of Mental Health Psychoactive Drug Screening Program, PDSP Ki Database: http://pdsp.med.unc.edu/) (receptor humano clonado, [3H]-ketanserina). 2Valor de Ki (nM, media ± EEM) tomado de Ishibashi y col., 2010 (córtex de rata, 1 nM [3H]-ketanserina). 3Media (rango) de valores de Ki (nM) tomados de PDSP (receptor humano clonado, [3H]- espiperona). 4Valor de Ki (nM, media ± EEM) tomado de Ishibashi y col., 2010 (estriado de rata, 0.05 nM [3H]-espiperona). 5Valor de Ki (nM) tomado de PDSP (membranas de córtex humano, [3H]-doxepina). 6Valor de Ki (nM, media ± EEM) tomado de Ishibashi y col., 2010 (cerebro de cobaya, 0.4 nM [3H]-pirilamina). Justificación y Objetivos 103 Los estudios acerca de la estructura del receptor histaminérgico humano H1 mediante cristalización determinan la interacción hidrofóbica de Tyr3.33 con un anillo bencénico del ligando cristalizado doxepina (estructura dibenzoxepina) (Shimamura y col., 2011) y también con su cadena alifática lateral (Fig. 30). Es, por tanto, un aminoácido que participa en la unión de ligandos, al igual que se observa en estudios de modelización de este receptor y del receptor M1 (ambos con Tyr3.33) con el antipsicótico de estructura benzoisotiazol lurasidona (Fig. 31, Ichikawa y col., 2012), realizados sobre modelos de receptores generados tomando como base la estructura cristalográfica 3PBL del receptor D3 (Chien y col., 2010). Por lo que respecta al sistema aromático de lurasidona, decir que posee una estructura similar al de olanzapina (benzoisotiazol). En este último caso, el grupo benzoisotiazol de lurasidona en ambos receptores está próximo a Tyr3.33 (Ichikawa y col., 2012). Fig. 30. Representación del sitio de unión del receptor de histamina H1 en complejo con doxepina realizada a partir de los datos de cristalización aportados por Shimamura y col. (2011). (a) Se muestra el ligando doxepina en amarillo. Los puentes de hidrógeno o uniones iónicas se muestran mediante líneas punteadas en azul. Los átomos de oxígeno están en rojo. (b) Se muestra Tyr3.33, que se dispone hacia el interior del sitio de unión e interacciona con un anillo bencénico y con la cadena lateral alifática de doxepina. (Tomado de Shimamura y col., 2011). Justificación y Objetivos 104 Fig. 31. Representación de modelos del sitio de unión de los receptores H1 y M1 en complejo con el antipsicótico atípico lurasidona, indicándose los aminoácidos que establecen interacciones con el fármaco, según se describen por Ichikawa y col. (2012). El trabajo de Ichikawa y col., (2012) realiza estudios de acoplamiento y simulación de dinámica molecular con modelos de estos dos receptores generados a partir de la estructura cristalográfica 3PBL del receptor D3 (Chien y col., 2010). En ambos receptores el residuo de Asp3.32 interacciona con el átomo de N de la piperazina del ligando. Los residuos Tyr de la posición 3.33 son Tyr108 (H1) y Tyr106 (M1), y ambos están próximos al grupo benzoisotiazol. En gris se muestran los aminoácidos hidrofóbicos y en azul claro los hidrofílicos. (Tomado de Ichikawa y col., 2012). Así, en este subapartado se planteó el estudio de la posible relevancia de la interacción que se establece entre los ligandos clozapina y olanzapina y el aminoácido en posición 3.33 en receptores diana (tales como el receptor D2) y antidiana (en particular el receptor H1) como determinante de la distinta afinidad de estos antipsicóticos por receptores presentando residuos Val o Tyr en esa posición. En concreto y como primera aproximación a esta cuestión nos centramos en el receptor D2 y nos planteamos intercambiar mediante mutagénesis dirigida el aminoácido Val en posición 3.33 por Tyr con el fin de comprobar mediante ensayos de unión de radioligandos de competición el efecto de esta mutación sobre la afinidad de los antipsicóticos clozapina y olanzapina por este receptor. Justificación y Objetivos 105 ESTUDIO DE LAS CINÉTICAS DE INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR EN GPCRS: TIEMPO DE RESIDENCIA DEL ANTIPSICÓTICO ATÍPICO LURASIDONA EN EL RECEPTOR DE SEROTONINA 5-HT7 El parámetro tiempo de residencia (tR) cuantifica el tiempo medio que una molécula de ligando o fármaco permanece unida a la diana. En el caso de fármacos con perfil multirreceptorial, una característica en general muy deseable en fármacos antipsicóticos y otros fármacos para enfermedades psiquiátricas complejas, el tR podría ser un factor determinante para el perfil de eficacia y de reacciones adversas al poder conferir selectividad cinética sobre las distintas dianas (Seeman, 2005; Copeland y col., 2006). Esto puede ser particularmente relevante cuando el fármaco ha de actuar en presencia de ligandos endógenos que pueden alcanzar concentraciones muy elevadas puntualmente, como en las sinapsis, situación en la que los tiempos de residencia pueden determinar la capacidad del fármaco de competir de forma efectiva por la diana (Vauquelin y van Liefde, 2006; Vauquelin y Charlton., 2010). En el caso de fármacos con un aclaramiento lento del compartimento diana, un tR elevado puede constituirse en el factor determinante de la duración de acción, en particular en el caso de antagonistas (Dahl y Akerud, 2013), aunque siempre valorado integrando otros aspectos farmacocinéticos y farmacodinámicos. De hecho, el parámetro tiempo de residencia presenta un enorme interés desde el punto de vista de la farmacología integrativa, que integra e interrelaciona la farmacodinamia y la farmacocinética de forma cuantitativa, ayudándose de los nuevos modelos PKPD (Derendorf y col., 2000; Ploeger y col., 2009; Gabrielsson y Green, 2009). La integración de este parámetro podría ayudar a definir y explicar un determinado perfil clínico en relación a eficacia o reacciones adversas. En investigación y desarrollo de fármacos, el tiempo de residencia de fármacos sobre sus dianas o antidianas se considera un parámetro que podría aportar una caracterización más fiable y representativa del proceso de unión ligando-receptor en condiciones in vivo que otros parámetros clásicos de afinidad calculados en condiciones in vitro de equilibro. En cribado de moléculas y en optimización de cabezas de serie, se valora actualmente adoptar criterios de selección de moléculas que incorporen parámetros cinéticos como tR, una vez que se han desarrollado métodos experimentales relativamente sencillos para su determinación como los ensayos de unión de radioligandos de competición cinética de dos Justificación y Objetivos 106 puntos (Guo y col., 2012a). Asimismo, han podido establecerse correlaciones del tR con otros parámetros obtenidos experimentalmente referidos a efectos celulares e in vivo (Guo y col., 2012), lo que sugiere que las bases moleculares de la eficacia de un agonista podrían estar ligadas al tiempo de residencia del ligando en el receptor. Por todo ello, hoy se aboga en general por la introducción sistemática de medidas de tR en fases tempranas de cribado de moléculas y de generación y optimización de cabezas de serie (Copeland y col., 2006; Lu y Tonge, 2010). La lurasidona como fármaco antipsicótico atípico presenta un perfil multirreceptorial, considerado como la base de la superioridad de estos fármacos respecto a la aproximación terapéutica de los antipsicóticos clásicos. Conocer las cinéticas de asociación y disociación, los tiempos de residencia en las distintas dianas y la selectividad cinética cobra especial interés para fármacos con un perfil de selectividad complejo como son los antipsicóticos atípicos, pues es una información que podría interesar para su incorporación en el proceso de desarrollo de nuevos fármacos. Un primer ejemplo de la relevancia del tR de los fármacos antipsicóticos para su eficacia y perfil de efectos adversos lo constituye la teoría de que un tiempo de residencia corto de los antipsicóticos atípicos en el receptor D2 se relaciona con su baja incidencia de reacciones adversas extrapiramidales (Kapur y Seeman, 2001). Como fármaco antipsicótico, lurasidona es el antipsicótico de segunda generación con mayor afinidad por el receptor 5-HT7 (Ki = 0.495 nM, frente a 5-CT) (Ishibashi y col., 2010), del que es antagonista (Samalin y col., 2014), siendo su afinidad por este receptor superior a la de otros antipsicóticos con un componente destacado de afinidad por 5-HT7 en su perfil farmacológico como amisulprida (Ki = 135.5 nM, frente a 5-CT) (Abbas y col., 2009), aripiprazol (Ki = 9.6 nM) (Kroeze y col., 2003) o quetiapina (Ki = 307 nM) (LópezMuñoz y Álamo, 2013). Clozapina, risperidona y ziprasidona también presentan afinidades destacables por este receptor, con un valor de Ki en torno a 10 nM (Kroeze y col., 2003). En estudios preclínicos, lurasidona se ha demostrado capaz de mejorar los resultados en ensayos de reconocimiento de objetos (NOR) en modelos de disfunción cognitiva inducidos mediante la administración subcrónica de antagonistas NMDA como MK-801 (Ishiyama y col., 2007; Horisawa y col., 2013) o fenciclidina (PCP) (Horiguchi y col., 2011), lo que constituye un modelo farmacológico de sintomatología cognitiva en esquizofrenia Justificación y Objetivos 107 (Meltzer y Massey, 2011). También se atribuyen al antagonismo 5-HT7 de amisulprida efectos procognitivos en el mismo modelo (Abbas y col., 2009). En ensayos clínicos, el estudio comparativo de lurasidona frente a quetiapina y placebo administrados en un periodo de 6 meses también encuentra mejoría en síntomas positivos frente a quetiapina para todas las dosis de lurasidona (40-160 mg) (YasuiFurukori, 2012; Harvey y col., 2015a). A pesar de esto, hay que tener en cuenta que la mejoría de síntomas cognitivos también se ha relacionado con otras actividades farmacológicas presentes en el perfil farmacológico de lurasidona, como el antagonismo 5HT2A o el agonismo 5-HT1A, tanto en estudios preclínicos in vivo como en ensayos clínicos (Meltzer y Massey, 2011). Asimismo, en el perfil multirreceptorial de lurasidona la falta de afinidad por receptores como H1 y M1 también sería favorable en este sentido (YasuiFurukori, 2012). Por otra parte, existe la hipótesis de que la mejoría en sintomatología negativa y cognitiva podría deberse a una mejoría de los síntomas positivos (Álamo y col., 2007; Álamo y col., 2007a). Con todo, el antagonismo 5-HT7 se considera un componente muy relevante en la eficacia terapéutica de lurasidona frente a la sintomatología de la esquizofrenia y en particular, en una dimensión mal cubierta por los fármacos antipsicóticos actualmente disponibles como es la negativa/cognitiva. Algunos antipsicóticos atípicos con una afinidad destacada por el receptor 5-HT7 se han mostrado moderadamente eficaces en el tratamiento de la depresión, especialmente quetiapina y aripiprazol en el tratamiento del trastorno depresivo mayor (TDM) y amisulprida en el de la distimia (Komossa y col., 2010). Los dos primeros de esos fármacos están aprobados para el tratamiento del trastorno depresivo mayor en Estados Unidos, pero sólo como terapia complementaria antidepresivos y quetiapina en la forma de liberación prolongada. De éstos, sólo quetiapina tiene la indicación para el tratamiento del trastorno depresivo mayor aprobada en España. Lurasidona, al igual que quetiapina, está aprobada para el tratamiento de la fase depresiva del trastorno bipolar en Estados Unidos (Micromedex [base de datos], 2014). Para esta indicación, lurasidona se ha demostrado eficaz tanto en monoterapia como de forma complementaria a litio o valproico (Micromedex [base de datos], 2014), mejorando la puntuación en la escala de calificación de la depresión de Montgomery-Asberg (Citrome y col., 2014a). Este fármaco también mejoró la Justificación y Objetivos 108 puntuación en la misma escala en el tratamiento de la esquizofrenia (Citrome y col., 2014b; Samalin y col., 2014). La acción antidepresiva constituye quizás el efecto terapéutico asociado a antagonismo 5-HT7 de mayor interés hoy en día. En ensayos in vivo en ratones, la acción antidepresiva del antagonismo 5-HT7 se ha demostrado con el antagonista SB269970 y empleando ratones carentes del gen HTR7, mediante ensayos de suspensión de cola y de natación forzada (Hedlund y col., 2005). En otro estudio con lurasidona, empleando los mismos ensayos de evaluación de actividad antidepresiva en ratones, se observó cierto efecto antidepresivo que se relacionó igualmente con el antagonismo 5-HT7 del fármaco (Cates y col., 2013). Consistentemente con estas observaciones preclínicas, antidepresivos de nueva generación incorporan el antagonismo 5-HT7 como una de sus actividades, como es el caso de vortioxetina, aunque no puede concluirse que su eficacia antidepresiva sea debida totalmente a la actividad antagonista 5-HT7 (Sánchez y col., 2014) al presentar otras actividades como el agonismo parcial 5-HT1A e inhibición de la recaptación de serotonina que podrían contribuir a este efecto (Sánchez y col., 2014). Lo mismo ocurriría con lurasidona, del que tampoco puede concluirse que el antagonismo 5-HT7 sea totalmente responsable de su acción antidepresiva (Fountoulakis y col., 2015), sobre todo cuando están presentes otras actividades potencialmente relacionadas con tal acción como el agonismo 5HT1A y el antagonismo 5-HT2A (Fountoulakis y col., 2015). En cualquier caso, otros antidepresivos como mianserina, fluoxetina, maprotilina o imipramina también incorporan un componente de antagonismo 5-HT7 en su perfil farmacológico, aunque no se considere el principal responsable de su acción terapéutica. En base a todo lo expuesto, en este apartado de nuestro trabajo partimos de la hipótesis de que el conocimiento de los tiempos de residencia del antipsicótico atípico de reciente aprobación lurasidona en sus distintos receptores diana puede aportar información acerca de su mecanismo de acción y de las bases farmacológicas de su perfil clínico de eficacia y seguridad. Esta información puede resultar de interés tanto desde el punto de vista terapéutico en relación al uso clínico de este fármaco como desde el punto de vista de la investigación y desarrollo de nuevos fármacos antipsicóticos. Así, como un primer paso en esta dirección, hemos abordado el objetivo de cuantificar el tR de lurasidona en el receptor Justificación y Objetivos 109 5-HT7 humano, que nos podría servir como modelo de partida para la puesta a punto metodológica necesaria y que podría aportar información de interés al tratarse de un receptor muy relevante en el perfil farmacológico característico y distintivo de este fármaco. Discusión y Conclusiones 212 nuestro estudio, calculado como la inversa de koff, es prácticamente idéntico al valor de tR de 71 min para el mismo complejo ligando-receptor descrito en la literatura empleando la misma metodología (ensayo cinético de disociación de radioligandos) y en condiciones experimentales comparables a las nuestras (4ºC) (Guo y col., 2014). Sobre el receptor mutado A2A-His7.29Asn, el radioligando experimenta una aceleración en su velocidad de disociación claramente apreciable mediante la simple observación de los perfiles de las curvas de disociación, con un incremento de aproximadamente 11 veces de su koff (tR de 6.59 min) lo que resulta en una diferencia estadísticamente significativa respecto al receptor no mutado (**p < 0.01, test t no pareado, dos colas). Estos resultados sugieren que la pérdida de afinidad observada para el radioligando por el receptor mutado es en gran medida un reflejo de la aceleración del proceso de disociación del ligando, esto es, de una mayor facilidad para salir del bolsillo de unión. De esta manera, los resultados se interpretan como indicativos de una relevancia determinante de la interacción Glu5.30-His7.29 para la duración del complejo entre el ligando [3H]-ZM241385 y el receptor A2A, interacción que no reproduce adecuadamente el par Glu5.30-Asn7.29 en las mismas posiciones y que, por tanto, permite hipotetizar sobre posibles cinéticas de disociación rápidas de ligandos en el receptor A2B. En el caso del receptor A2A no mutado, la ejecución de los experimentos de asociación permitió extraer un valor medio de kon de 4.4 ± 0.58 · 107 M-1 · min-1, calculado directamente a partir de los datos de kobs y koff obtenidos experimentalmente y teniendo en cuenta la concentración de radioligando empleada en cada experimento. Este valor resultó similar a valores de kon [3H]-ZM241385 en el receptor A2A descritos en la literatura, obtenidos en condiciones experimentales similares a las nuestras (1.50 · 107 M-1·min-1; 2.0 · 107 M-1·min-1) (Guo y col., 2012). Así, los valores de koff y kon del radioligando en el receptor no mutado obtenidos experimentalmente en nuestro trabajo arrojan un valor de Kd,cin (koff/kon) de 0.35 nM, que resultó ser próximo al valor de Kd obtenido en condiciones de equilibrio (0.65 nM), validando nuestros protocolos experimentales en ensayos cinéticos. Esta buena correlación de valores en el receptor no mutado nos permite estimar un valor de kon para el receptor A2A-His7.29Asn de 3.0 · 107 M-1·min-1 indirectamente a partir de los datos medios de Kd en el equilibrio y koff obtenidos experimentalmente. Discusión y Conclusiones 213 No obstante, en el caso del receptor A2A-His7.29Asn, la kon de [3H]-ZM241385 pudo ser determinada mediante regresión lineal a partir de los valores de kobs obtenidos experimentalmente en estudios de asociación empleando distintas concentraciones de radioligando. Esta aproximación reportó por una parte un valor de koff de 0.11 min-1, muy próximo al valor medio de koff obtenido directamente a partir de experimentos de disociación (0.15 min-1). Por otra parte, el valor de kon extraído fue de 1.96 · 107 M-1·min-1, similar al valor de 3.0· 107 M-1·min-1 estimado indirectamente. Esto está de nuevo de acuerdo con que la perdida de afinidad reflejada por la Kd del radioligando en el receptor mutado proviene en mayor medida de una rápida disociación del complejo, y no de un importante cambio en la cinética de asociación. Estos valores de koff y kon calculados mediante regresión para el receptor mutado arrojan un valor de Kd,cin de 5.62 nM, similar al valor de Kd 4.98 nM obtenido experimentalmente a partir de ensayos de saturación en el equilibrio, validando igualmente de forma interna los resultados de nuestros experimentos cinéticos. Adicionalmente, la representación de los valores de kobs obtenidos en ensayos de asociación en el receptor A2A-His7.29Asn para distintas concentraciones de [3H]-ZM241385 nos permitió comprobar su buen ajuste a un modelo de regresión lineal (ver resultados), lo que nos llevó a considerar un mecanismo de unión radioligando-receptor de un solo paso (mecanismo A de Tummino y Copeland, 2008). Nuestra interpretación estructural de los resultados se basa principalmente en la información estructural aportada por el trabajo de Rodríguez y col., (2011). En este trabajo se describe la interacción entre el aminoácido en posición 5.30 (EL2) de los receptores A2A y A2B y el aminoácido en posición 7.29 (EL3) de A2A (His) y A2B (Asn). La interacción Glu5.30-His7.29 modelizada por Rodríguez y col. (2011) en el receptor A2A contempla dos estados de His: neutro y cargado positivamente. En el primer caso, la interacción Glu5.30His7.29 se rompe fácilmente durante las simulaciones con el receptor desocupado (forma apo), lo que sugiere que, en esta situación, el acceso al bolsillo de unión desocupado del receptor por parte de ligandos difusibles se vería facilitado por la apertura de los bucles EL2 y EL3. En el segundo caso, la interacción Glu5.30-His7.29 es frecuentemente observada en el receptor desocupado (en torno al 60% del tiempo de simulación). La simulación en presencia del ligando ZM241385 (receptor en forma holo) en esta situación (His cargada positivamente) estabiliza el cierre en forma de tapa formado por EL2 y EL3 que se observa en la estructura cristalográfica 3EML del complejo A2A:ZM241385, la cual sirvió de base Discusión y Conclusiones 214 para la modelización de los receptores en el trabajo de Rodriguez y col., (2011), favoreciendo la estabilización del complejo A2A-ZM241385. Así, las simulaciones de dinámica molecular indican que la interacción Glu5.30-His7.29 gobierna la estabilidad de la “tapa” conformada por los bucles EL2 y EL3 sobre el bolsillo de unión. La diferencia entre las interacciones modelizadas por Rodríguez y col. (2011) en el receptor A2A (entre los aminoácidos Glu5.30 e His7.29) y o A2B (entre los aminoácidos Glu5.30 y Asn7.29) sería análoga a la diferencia entre la interacción en el receptor A2A no mutado y mutado A2A-His7.29Asn estudiados experimentalmente en nuestro trabajo, por lo que podríamos concluir que esa diferencia sería la principal causante de las diferencias observadas entre los tR del ligando [3H]-ZM241385 sobre ambos receptores en el presente estudio. Este carácter determinante puede explicarse por la unión más estable y duradera de los aminoácidos Glu5.30-His7.29 con respecto a la que forman Glu5.30-Asn.7.29 en el receptor A2A, de forma que, como consecuencia, la conformación más cerrada de los bucles extracelulares sobre el bolsillo de unión del receptor estabiliza al ligando unido dificultando su salida del mismo, resultando en un mayor tiempo de residencia de ZM241385 en el receptor no mutado. En general, las diferencias en tR entre complejos ligando-receptor se relacionan teóricamente con determinados factores físicos-químicos como la accesibilidad del bolsillo de unión a ligandos difusibles o el tamaño molecular del propio ligando (Pan y col., 2013). En el caso del receptor A2A, la localización del bolsillo de unión muy próxima a la zona extracelular, el hecho de que EL2 sea la segunda región con mayor movilidad del receptor A2A de acuerdo a resultados de dinámica molecular (Rodríguez y col., 2011), y el hecho de que EL3 presenta una movilidad reducida, son aspectos estructurales que deben considerarse a la hora de estimar la cinética de unión de ligandos. En el caso de la interacción de este receptor y el ligando ZM243185 y con respecto a EL3, el cierre de EL2, tras estabilizarse la unión de Glu5.30 con el aminoácido en posición 7.29, favorecería especialmente las interacciones descritas de residuos como Leu7.32 y Met7.35 situados en EL3 con el grupo fenol del ligando (Jaakola e Ijzerman, 2011). La aproximación de EL2 a EL3 y al bolsillo de unión permitiría también la formación de interacciones de Phe1685.29 y Glu1695.30 con el ligando (Jaakola y col., 2008). Así, diversas interacciones observadas en la estructura cristalográfica del complejo A2A:ZM241385 que implican a residuos de los Discusión y Conclusiones 215 bucles extracelulares contribuirían a producir una estabilización del ligando ZM241385 en el bolsillo de unión del receptor. Algunas diferencias importantes en la interacción de EL2 con los ligandos encontradas en las distintas estructuras de A2A determinadas mediante cristalografía con respecto a la de Jaakola (2008) comprenden un desplazamiento de los bucles extracelulares (entre ellos EL2), alejándose del bolsillo de unión para dar cabida a los sustituyentes voluminosos del agonista UK 432097 (Jacobson, 2013; Xu y col., 2011). Otros agonistas como adenosina y NECA también interaccionan con EL2 (Lebon y col., 2011). Estas diferencias pueden estar relacionadas con la distinta identidad de los ligandos cocristalizados. Sin embargo, existe una diferencia fundamental con la otra estructura del complejo A2A-ZM241385 descrita por Doré y col., (2011) en cuanto a la orientación del grupo fenólico de ZM241385, en este caso dirigido hacia las proximidades de los extremos extracelulares de TM1, TM2 y TM7. Las diferencias se atribuyen a la flexibilidad del área extracelular y a las distintas condiciones de cristalización (Doré y col., 2011). Aun así, esta diferencia no descarta una influencia decisiva del cierre de los bucles EL2-EL3 en la cinética de interacción de ligandos en el receptor A2A. Con respecto a las características del ligando y su relación con el tiempo de residencia del mismo, la presencia en la estructura de un anillo de ribosa en compuestos como UK 432097 se ha asociado a un considerablemente mayor tR por interacción con aminoácidos de la zona más profunda del bolsillo de unión, tales como His7.43, Ser7.42 o Leu6.51 (Guo y col., 2012; Xu y col., 2011). Con mayor relevancia para la presente hipótesis, la longitud (dos átomos de C) de la cadena alifática uniendo la triazina y el fenol en una serie de derivados de ZM241385, así como la presencia de un átomo de N en el extremo en un anillo piperazina análogo al grupo fenol del mismo ligando, se asocian con un tR prolongado determinado en condiciones experimentales similares a las que fueron utilizadas en el presente trabajo (Guo y col., 2014). En estos ligandos, el alargamiento de la cadena o la supresión del átomo de N piperazínico produjo una reducción del tR de gran magnitud (Guo y col., 2014). De esta forma, los citados estudios han permitido extraer conclusiones en cuanto a relaciones estructura-cinética (Structure–Kinetics Relationships, SKR) en el receptor A2A. Discusión y Conclusiones 216 La asociación entre tR y movilidad de los bucles extracelulares ya ha sido señalada como relevante en otros GPCRs y ligandos. Para otros receptores como los receptores muscarínicos M3 y M2 se encontró una diferencia entre los dos receptores en cuanto a la flexibilidad de EL2, siendo mayor la del receptor M2. Así, en simulaciones de dinámica molecular se ha observado que EL2 permanece durante más tiempo en un estado de conformación abierto en el receptor M2 en comparación con M3. Esto se relaciona con una salida más fácil del ligando fuera del bolsillo de unión, lo que se relacionó con el tR más reducido del antagonista muscarínico y broncodilatador de larga duración de acción tiotropio en el receptor M2 con respecto al receptor M3 (Kruse y col, 2013; Pan y col., 2013). Esta selectividad cinética de tiotropio por M3 con respecto a M2 se ha señalado como relevante para su perfil clínico (Sykes y col. 2012). Estas observaciones que se comentan guardan evidentes similitudes con las diferencias en los tiempos de residencia obtenidos en el presente trabajo y su relación con la mayor o menor movilidad de EL2 en los receptores A2A y A2A-His7.29Asn. Por último, mencionar que con respecto a EL2 del receptor A2A, ya se había propuesto previamente una función de control de acceso de ligandos al sitio de unión, su implicación en la unión de ligandos o la selectividad de ligandos, entre otros aspectos (Seibt y col., 2013). También existen referencias previas en algunos trabajos a la posible importancia de la identidad de los residuos en bucles extracelulares de receptores de adenosina en relación al acceso y unión de ligandos a los receptores. Un trabajo previo ha señalado que el carácter polar de una buena parte de los aminoácidos localizados en la entrada al sitio de unión del receptor A2A, y especialmente de la pareja Glu5.30-His7.29, en contraposición al carácter apolar de residuos como una Val en el receptor A3 que ocupa una posición análoga a Glu5.30 en A2A, sería relevante para diferencias en el acceso y la unión de ligandos en estos dos receptores (Lenzi y col., 2009). Discusión y Conclusiones 217 CONCLUSIONES 1. La herramienta generada, el receptor 5-HT2A-Ser3.36Cys, ha permitido investigar experimentalmente la relevancia del aminoácido 3.36 para el perfil de afinidad y selectividad de clozapina y olanzapina por GPCRs de su receptoroma. 2. La afinidad de [3H]-ketanserina por el receptor 5-HT2A-Ser3.36Cys determinada en ensayos de saturación y la afinidad de serotonina por el mismo receptor determinada en ensayos de competición fueron similares a las descritas previamente por otros autores sobre un receptor 5-HT2A portando la misma mutación. 3. Los datos de afinidad obtenidos para clozapina y olanzapina sobre los receptores 5-HT2A y 5-HT2A-Ser3.36Cys indican que el aminoácido Ser3.36 del receptor 5-HT2A no es determinante para el perfil de afinidad preferente de clozapina y olanzapina por el receptor 5-HT2A con respecto a receptores del grupo Cys3.36. Por extensión, se podría concluir que el aminoácido en posición 3.36 no resulta definitorio de los grupos de GPCRs Ser3.36 y Cys3.36 establecidos en base a secuencia y perfil de afinidad y selectividad de clozapina y olanzapina. 4. La herramienta generada, el receptor D2S-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala, ha permitido investigar experimentalmente la relevancia de los aminoácidos en posición 5.43 y 5.46 para el perfil de afinidad y selectividad de clozapina y olanzapina por GPCRs de su receptoroma. 5. Nuestros resultados experimentales para clozapina y olanzapina en los receptores D2S y D2S-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala han permitido determinar que la orientación del N10 hacia el exterior del bolsillo de unión es la forma de posicionamiento predominante de ambos ligandos. Discusión y Conclusiones 218 6. Los resultados obtenidos mediante ensayos de competición en el equilibrio han confirmado la relevancia de los aminoácidos en posición 5.43 y 5.46 para el perfil de afinidad selectivo de clozapina y olanzapina por el receptor D2. Por extensión, se podría concluir que estas posiciones son potencialmente determinantes para la afinidad y selectividad de estos antipsicóticos por los GPCRs de los grupos 1 (Ser5.43/Ser5.46) y 2 (aminoácidos más hidrofóbicos en estas posiciones). 7. Nuestros resultados experimentales para clozapina y olanzapina en los receptores D2S y D2S-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala están de acuerdo con los resultados de modelización de los receptores D2, D2-Ser5.43Thr/Ser5.46Ala y 5-HT1A en complejo con ambos antipsicóticos. Estos modelos indican que la posición 5.46 sería la más determinante de las dos estudiadas para el perfil de afinidad y selectividad de clozapina y olanzapina por los receptores modelizados. 8. La herramienta generada, el receptor D2S-Val3.33Tyr, ha permitido demostrar la importancia del aminoácido en posición 3.33 para la afinidad de clozapina y olanzapina por el receptor D2. 9. Nuestros resultados experimentales para clozapina y olanzapina en los receptores D2S y D2S-Val3.33Tyr, están de acuerdo con los resultados de modelización de los receptores D2 y D2-Val3.33Tyr en complejo con estos antipsicóticos, en modelos receptoriales basados en estructuras cristalográficas recientemente publicadas. Estos modelos indican la pérdida de interacción del ligando clozapina con el aminoácido Tyr3.33 en el receptor D2 mutado, mientras que predicen que una antidiana de antipsicóticos conteniendo Tyr en posición 3.33, como es el receptor H1, es capaz de establecer una fuerte interacción con los ligandos a través de este aminoácido, lo que podría contribuir a la alta afinidad de los ligandos por este receptor. Discusión y Conclusiones 219 10. Nuestros resultados experimentales para clozapina y olanzapina en los receptores D2S y D2S-Val3.33Tyr, junto con los más recientes resultados de modelización, indican que la identidad del aminoácido 3.33 puede ser relevante para la afinidad y selectividad de los antipsicóticos por GPCRs diana y antidiana de su receptoroma. 11. Se han determinado las constantes de velocidad de asociación y disociación del radioligando [3H]-SB269970 sobre el receptor 5-HT7, obteniéndose valores de acuerdo con la literatura, así como coherentes con los valores de afinidad (Kd) en el equilibrio del radioligando. Esto valida los experimentos cinéticos de asociación y disociación llevados a cabo. Los resultados son indicativos de un mecanismo cinético de unión radioligando-receptor de un solo paso. 12. Se ha establecido el método competición cinética descrito por Motulsky y Mahan (1984) para la determinación de constantes de velocidad de asociación y disociación de ligandos no marcados, aplicado al receptor 5HT7 y empleando el radioligando [3H]-SB269970, en un formato de ensayo implementable en actividades de cribado de alto rendimiento. 13. Se han determinado las constantes de velocidad de asociación y disociación de lurasidona en el receptor 5-HT7 mediante el método indicado anteriormente obteniéndose valores consistentes con el valor de afinidad (Ki) obtenido en ensayos de competición en el equilibrio, lo que sirvió como validación del método establecido. 14. Se ha determinado el tR de lurasidona en el receptor 5-HT7, lo que constituye un primer paso en la caracterización del perfil de selectividad cinética de este antipsicótico. 15. El tR de 10 min en el receptor 5-HT7 obtenido para lurasidona en nuestros ensayos, se puede considerar adecuado desde el punto de vista farmacológico Discusión y Conclusiones 220 para lograr eficacia terapéutica derivada del antagonismo de una diana no asociada a reacciones adversas destacables, manteniendo una cierta acción fisiológica del neurotransmisor endógeno serotonina. 16. Considerando parámetros farmacocinéticos conocidos de lurasidona, el valor de 10 min de tR obtenido para el fármaco en el receptor 5-HT7 sugiere que este parámetro no será determinante para la duración de su acción farmacológica sobre este receptor una vez que se haya eliminado el fármaco del compartimento diana. 17. La herramienta generada, el receptor A2A-His7.29Asn, ha permitido investigar experimentalmente la relevancia del aminoácido en posición 7.29 del receptor A2A para las cinéticas de asociación y disociación del radioligando [3H]-ZM241385 en este receptor, y su posible carácter diferencial respecto al receptor A2B en términos de cinética de unión de ligandos. 18. Se han determinado las constantes de velocidad de asociación y disociación del radioligando [3H]-ZM241385 sobre el receptor A2A no mutado, obteniéndose valores de acuerdo con la literatura así como coherentes con los valores de afinidad (Kd) en el equilibrio del radioligando. Esto valida los experimentos cinéticos de asociación y disociación llevados a cabo. 19. Se han determinado las constantes de velocidad de asociación y disociación del radioligando [3H]-ZM241385 sobre el receptor A2A-His7.29Asn, obteniéndose valores indicativos de un mecanismo cinético de unión radioligando-receptor de un solo paso. 20. Nuestros resultados experimentales de ensayos cinéticos de [3H]-ZM241385 en los receptores A2A y A2A-His7.29Asn, indican que la identidad del aminoácido 7.29 es determinante para la cinética de disociación del radioligando y sugieren que la pérdida de afinidad observada para el Discusión y Conclusiones 221 radioligando por el receptor mutado es consecuencia en gran medida de la aceleración de su disociación. Los resultados son indicativos de un mecanismo cinético de unión radioligando-receptor de un solo paso. 21. De acuerdo con resultados de simulaciones de dinámica molecular en los receptores A2A y A2B disponibles, nuestros resultados experimentales son compatibles con una interacción Glu5.30-His7.29 que posibilita una conformación cerrada de los bucles extracelulares EL2 y EL3 sobre el bolsillo de unión del receptor, estabilizando el complejo ZM241385-receptor A2A. Esa interacción no sería adecuadamente reproducida por el par de aminoácidos Glu5.30-Asn7.29 en las mismas posiciones del receptor A2AHis7.29Asn. Por tanto, nos parece esperable que las cinéticas de disociación de los ligandos en el receptor A2B serán rápidas. Bibliografía 228 AKT/glycogen synthase kinase 3 signaling cascade. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 5099–5104. Benedí J, Iglesias I. Fármacos antipsicóticos. En: Terapéutica farmacológica de los trastornos del sistema nervioso. Programa de Actualización en Farmacología y Farmacoterapia. Madrid: Consejo General de Colegios Oficiales de Farmacéuticos; 2012. p. 215-240. Berg KA, Maayani S, Goldfarb J, Scaramellini C, Leff P, Clarke WP. Effector pathwaydependent relative efficacy at serotonin type 2A and 2C receptors: evidence for agonist-directed trafficking of receptor stimulus. Mol Pharmacol. 1998; 54(1): 94104. Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, I.N y col. 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