Caracterización molecular de Escherichia coli bacteriémicos pertenecientes a los serogrupos O1 e O2

1 FACULTADE DE CIENCIAS GRAO EN BIOQUÍMICA D./ D.ª Paula Martínez López CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ESCHERICHIA COLI BACTERIÉMICOS PERTENECIENTES A LOS SEROGRUPOS O1 Y O2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ESCHERICHIA COLI BACTERIÉMICOS PERTENCENTES AOS SEROGRUPOS O1 E O2. MOLECULAR CHARACTERISATION OF BACTERAEMIC ESCHERICHIA COLI BELONGING TO SEROGROUPS O1 AND O2. Traballo Fin de Grao Xuño 2024 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 2 CONTENIDO 1. ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................................................... 4 2. ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................................................... 4 3. RESUMEN, RESUMO, ABSTRACT ................................................................................................................. 5 3.1 RESUMEN ...................................................................................................................................................... 5 3.2 RESUMO ........................................................................................................................................................ 5 3.3 ABSTRACT ..................................................................................................................................................... 6 4. ABREVIATURAS .............................................................................................................................................. 7 5. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................... 9 5.1 HISTORIA .............................................................................................................................................. 9 5.2. CARACTERÍSTICAS Y DIVERSIDAD DE E. COLI ............................................................................................... 9 5.2.1 E. COLI PATÓGENO ................................................................................................................................ 9 5.3 TIPADO ........................................................................................................................................................ 10 5.3.1 SEROTIPADO ........................................................................................................................................ 10 5.3.2 FILOTIPADO .......................................................................................................................................... 11 5.3.3 SECUENCIA TIPO .................................................................................................................................. 12 5.3.3.1 ST95 .............................................................................................................................................. 12 5.4 GENOMA CENTRAL Y ACCESORIO ............................................................................................................... 13 5.4.1 TEORÍAS ............................................................................................................................................... 13 5.4.2 FACTORES DE VIRULENCIA Y SUPERVIVENVICIA .................................................................................. 14 5.4.2.1 ADHESINAS ................................................................................................................................... 14 5.4.2.2 TOXINAS ........................................................................................................................................ 15 5.4.2.3 SIDERÓFOROS ............................................................................................................................... 15 5.4.2.4 CÁPSULA ....................................................................................................................................... 16 5.4.2.5 ANTÍGENO O ................................................................................................................................. 16 6. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................................................................ 18 7. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................................... 19 7.1 CEPAS CONTROL Y CONSERVACÓN DE CEPAS ............................................................................................ 19 7.2 OBNTENCIÓN DE LAS CEPAS CLÍNICAS DE E. COLI ...................................................................................... 19 7.3 ESTUDIO FENOTÍPICO ................................................................................................................................. 19 7.3.1 SEROTIPADO ........................................................................................................................................ 19 7.3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES BACTERIANAS .................................................................. 20 7.3.1.2 DETERMINACIÓN DEL SEROGRUPO O .......................................................................................... 20 7.3.1.3 TITULACIÓN SEROGRUPO O .......................................................................................................... 20 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 3 7.3.2 ANTIBIOGRAMA ................................................................................................................................... 20 7.4 ESTUDIO GENOTÍPICO................................................................................................................................. 21 7.4.1 EXTRACCIÓN DE ADN ........................................................................................................................... 21 7.4.1.1 MEZCLA DE REACCIÓN .................................................................................................................. 21 7.4.1.2 AMPLIFICACIÓN ............................................................................................................................ 21 7.4.1.3 REVELADO DE RESULTADOS ......................................................................................................... 21 7.4.2 GRUPO FILOGENÉTICO......................................................................................................................... 21 7.4.2.1 MEZCLA DE REACCIÓN .................................................................................................................. 22 7.4.2.2 AMPLIFICACIÓN ............................................................................................................................ 22 7.4.2.3 CEBADORES ................................................................................................................................... 22 7.4.3 GENES EXPEC ....................................................................................................................................... 23 7.4.3.1 CEBADORES ................................................................................................................................... 24 7.5 ESTUDIO CEPAS PERTENECIENTES A ST95 .................................................................................................. 25 7.5.1 PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN ................................................................................... 25 7.5.2 AMPLIFICACIÓN ............................................................................................................................... 25 7.5.3 CEBADORES ...................................................................................................................................... 26 7.6 SECUENCIACIÓN SANGER ........................................................................................................................... 26 7.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................................ 27 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 28 8.1 DETERMINACIÓN DE LOS SEROGRUPOS DE LOS AISLADOS CLÍNICOS ........................................................ 28 8.1.3 PERFIL DE RESISTENCIA ........................................................................................................................ 29 8.1.1 PERFIL DE VIRULENCIA ......................................................................................................................... 30 8.1.3 GRUPOS FILOGENÉTICOS ..................................................................................................................... 32 8.2 GRUPO CLONAL ST95 .................................................................................................................................. 32 9. CONCLUSIONES ......................................................................................................................................... 39 10. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................... 40 11. ANEXO: CONTROLES POSITIVOS ............................................................................................................... 55 MÚLTIPLEX GRUPO FILOGENÉTICO .................................................................................................................. 55 PCR GRUPO FILOGENÉTICO E ........................................................................................................................... 55 PCR GRUPO FILOGENÉTICO C ........................................................................................................................... 55 PCRS GENES DE VIRULENCIA ............................................................................................................................ 55 PCR ST95 ........................................................................................................................................................... 55 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 4 1. ÍNDICE DE FIGURAS Ilustración 1. Esquema grupos filogenéticos E. coli. ............................................................................................. 23 Ilustración 2. Distribución de los alelos fimH de 23 cepas ST95. Este árbol fue realizado en MEGA 11. Método estadístico UPGMA (método Bootstrap). ............................................................................................................. 37 2. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Serogrupos O más frecuentes entre cepas de E. coli bacteriémicas aisladas de pacientes en el hospital Universitario Lucus Augusti (HULA). Comparación entre los períodos 2020-2022 (datos no publicados del LREC-USC) y 1989-2011 (período 1989-2011, Tesis doctoral Rosalia S. Mamani, USC, 2015). ................................................................................................................................................................... 17 Tabla 2. Cebadores utilizados en la Multiplex de grupos filogenéticos ................................................................ 22 Tabla 3. Cebadores utilizados en la clasificación del grupo filogenético E. .................................................. 23 Tabla 4. Cebadores utilizados en la clasificación del grupo filogenético C. .......................................................... 23 Tabla 5. Cebadores utilizados en la detección de genes de virulencia de los aislados ExPEC. ............................. 24 Tabla 6. Cebadores empleados para la identificación del ST95 y sus subgrupos. ............................................... 26 Tabla 7. Cebadores utilizados en la secuenciación del del alelo fimHtr. .............................................................. 26 Tabla 8.Distribución de los serogrupos por años (Lugo, 2020-2022). .................................................................. 28 Tabla 9. Resistencia de las cepas E. coli de los serogrupos O1 y O2 (Lugo, 2020-2022). ..................................... 29 Tabla 10. Genes de virulencia de las cepas pertenecientes a los serogrupos O1 y O2 (Lugo, 2020-2022). ......... 31 Tabla 11. Pertenencia a los grupos filogenéticos de las cepas de los serogrupos O1 y O2 (Lugo, 2020-2022). ... 32 Tabla 12.Distribución de las cepas ST95 por serogrupos (Lugo, 2020-2022). ...................................................... 32 Tabla 13. Resistencias de las cepas ST95 y de otras secuencias tipo (Lugo, 2020-2022). ................................... 34 Tabla 14. Genes virulencia y estatus de las cepas ST95 y de otras secuencias tipo (Lugo, 2020-2022). .............. 35 Tabla 15. Análisis filogenético de las cepas pertenecientes a ST95 (Lugo, 2020-2022). ...................................... 36 Tabla 16. Distribución de las cepas de ST95 en los distintos subgrupos .............................................................. 37 RESUMEN, RESUMO, ABSTRACT 5 3. RESUMEN, RESUMO, ABSTRACT 3.1 RESUMEN En los últimos años se ha observado un aumento de bacteriemias causadas por E. coli patógenos extraintestinales (ExPEC), E. coli uropatogénicos (UPEC) y E. coli patógenos aviares (APEC). Entre los serogrupos más prevalentes a nivel global se encuentran los serogrupos O1 y O2. Nuestro objetivo es caracterizar las cepas pertenecientes a estos serogrupos, buscando entender las razones de su éxito. Determinar las características de estas cepas es vital para diseñar vacunas adaptadas a la epidemiología actual de nuestra área sanitaria. Para el estudio y caracterización de las 53 cepas de E. coli causantes de bacteriemias en un hospital lucense (HULA) durante los años 2020 a 2022 utilizamos métodos fenotípicos (serotipado, determinación de CMIs) y moleculares. Determinamos serotipos, grupos filogenéticos y genes de virulencia para establecer los estatus ExPEC, UPEC y APEC. La colección incluye 20 cepas O1, 33 O2, de las cuales solo 6 resultaron ser multirresistentes (MDR). La caracterización molecular muestra que el grupo filogenético más abundante es el B2 (42 cepas). Las cepas del presente estudio mostraron una amplia colección de factores de virulencia. En base a sus genes de virulencia, 46 cepas se calificaron como ExPEC, 48 UPEC y 31 APEC. Además, se detectaron 24 aislados pertenecientes a la secuencia tipo 95. Los resultados confirman que un porcentaje significativo de cepas causantes de septicemias en la población lucense son positivas para ExPEC, UPEC y APEC. Asimismo, se reafirma la idea de que el éxito de los serogrupos O1 y O2 no se debe a su resistencia a los antibióticos si no al elevado número de factores de virulencia. Palabras clave: Escherichia coli, E.coli, ExPEC, APEC, UPEC, ST95, factores de virulencia, serogrupo. 3.2 RESUMO Nos últimos anos observouse un aumento de bacteriemias causadas por E. coli patóxenos extraintestinales (ExPEC), E. coli uropatoxénicos (UPEC) e E. coli patóxenos aviarios (APEC). Entre os serogrupos máis prevalecentes a nivel global atópanse os serogrupos O1 e O2. O noso obxectivo é caracterizar as cepas pertencentes a estes serogrupos, buscando entender as razóns do seu éxito. Determinar as características destas cepas é vital para deseñar vacinas adaptadas á epidemioloxía actual da nosa área sanitaria. Para o estudo e caracterización das 53 cepas de E. coli causantes de bacteriemias nun hospital lucense (HULA) durante os anos 2020 a 2022 utilizamos métodos fenotípicos (serotipado, determinación de CMIs) e moleculares. Determinamos serotipos, grupos filogenéticos e xenes de virulencia para establecer os status ExPEC, UPEC e APEC. A colección inclúe 20 cepas O1, 33 O2, das cales só 6 resultaron ser multirresistentes (MDR). A caracterización molecular mostra que o grupo filogenético máis abundante é o B2 (42 cepas). As cepas do presente estudo mostraron unha ampla colección de factores de virulencia. En base aos seus xenes de virulencia, 46 cepas cualificáronse como ExPEC, 48 UPEC e 31 APEC. Ademais, detectáronse 24 illados pertencentes á secuencia tipo 95. Os resultados confirman que unha porcentaxe significativa de cepas causantes de septicemias na poboación lucense son positivas para ExPEC, UPEC e APEC. Así mesmo, reafírmase a idea de que o éxito dos serogrupos O1 e O2 non se debe á súa resistencia aos antibióticos se non ao elevado número de factores de virulencia. RESUMEN, RESUMO, ABSTRACT 6 Palabras chave: Escherichia coli, E.coli, ExPEC, APEC, UPEC, ST95, factores de virulencia, serogrupo. 3.3 ABSTRACT Recent years have seen an increase in bacteraemias caused by extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC), uropathogenic E. coli (UPEC) and avian pathogenic E. coli (APEC). Among the most prevalent serogroups globally are serogroups O1 and O2. Our objective is to characterise strains belonging to these serogroups, seeking to understand the reasons for their success. Determining the characteristics of these strains is vital to design vaccines adapted to the current epidemiology of our health area. For the study and characterisation of the 53 E. coli strains causing bacteraemia in a hospital in Lugo (HULA) during the years 2020 to 2022, we used phenotypic (serotyping, determination of MICs) and molecular methods. We determine serotypes, phylogenetic groups and virulence genes to establish ExPEC, UPEC and APEC status. The collection includes 20 O1, 33 O2 strains, of which only 6 were found to be multidrug resistant (MDR). Molecular characterisation shows that the most abundant phylogenetic group is B2 (42 strains). The strains in the present study showed a broad collection of virulence factors. Based on their virulence genes, 46 strains were qualified as ExPEC, 48 UPEC and 31 APEC. In addition, 24 isolates belonging to sequence type 95 were detected. The results confirm that a significant percentage of strains causing septicaemia in the population of Lugo are positive for ExPEC, UPEC and APEC. Likewise, it reaffirms the idea that the success of serogroups O1 and O2 is not due to their resistance to antibiotics but to the high number of virulence factors . Key words: : Escherichia coli, E.coli, ExPEC, APEC, UPEC, ST95, virulence factors, serogroup. ABREVIATURAS 7 4. ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico AIEC Del inglés “Adherent Invasive Escherichia coli” APEC Del inglés “Avian pathogenic Escherichia coli” BLEE β-lactamasas de espectro extendido BSI Del inglés “blood stream infection” CC Complejo clonal CGE Del inglés “Center for Genomic Epidemiology” CIM Concentración mínima inhibitoria DAEC Del inglés “Diffusely Adherent Escherichia coli” EAEC Del inglés “Enteroaggregative Escherichia coli” EHEC Del inglés “Enterohemorrhagic Escherichia coli” EIEC Del inglés “Enteroinvasive Escherichia coli” EPEC Del inglés “Enteropathogenic Escherichia coli” ETEC Del inglés “Enterotoxigenic Escherichia coli” EUCAST Del inglés “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” ExPEC Del inglés “Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli” fimH Gen que codifica la adhesina FimH FV Factor de virulencia hlyF gen hemolisina F HULA Hospital Universitario Lucus Augusti InPEC Del inglés “Intestinal Pathogenic Escherichia coli” Iss Del inglés “Increased serum survival gene” ITU Infección del tracto urinario LPS Lipopolisacárido LREC-USC Laboratorio de Referencia de Escherichia coli – Universidade de Santiago de Compostela. MDR Del inglés “Multidrug-resistant MLST Del inglés “multilocus sequence typing” ABREVIATURAS 8 NCBI Del inglés “National Center for Biotechnology Information” NIH Del inglés “National Institutes of Health” NMEC Del inglés “Neonatal meningitis Escherichia coli” Pb Pares de bases PCR Del inglés “Polymerase chain reaction” SEPEC o SEC Del inglés “Septicemic E. coli o Sepsis‐causing E. coli” ST Secuencia tipo TFG Trabajo fin de grado TSA Agar triptona soja tsh Del inglés “Temperature-sensitive hemaglutinin gene” UPEC Del inglés “Uropathogenic Escherichia coli” WGS Del inglés “Whole-genome sequencing” INTRODUCCIÓN 9 5. INTRODUCCIÓN 5.1 HISTORIA En 1884 tras su aislamiento e identificación como el agente causante de la diarrea infantil (Friedmann 2014) de neonatos lactantes, Theodor Escherich denominó a esta bacteria Bacterium coli commune. Originalmente era considerada Bacillus, no fue rebautizada hasta 1919 como Escherichia coli en honor a su descubridor. Ya en 1958 fue reconocida oficialmente, estableciendo así Escherichia como género y E. coli como primera especie(“Etymologia: Escherichia coli,” 2015). Irónicamente, la secuenciación del genoma de la cepa original del laboratorio del Dr. Escherich reveló que la bacteria aislada se trataba de un miembro de la microbiota intestinal normal (Méric et al., 2016) Desde su descubrimiento E. coli ha sido estudiada exhaustivamente desde el punto de vista molecular, serológico y bioquímico. A día de hoy es considerado uno de los sistemas modelos fundamentales en microbiología siendo la especie tipo mejor caracterizada y representativa del género Escherichia (Yu et al., 2021) 5.2. CARACTERÍSTICAS Y DIVERSIDAD DE E. COLI Escherichia coli, es una bacteria anaerobia facultativa Gram negativa no esporulante que pertenece a la familia Enterobacteriaceae. E. coli forma parte de la microbiota normal de mamíferos, aves y reptiles sanos (Gordon & Cowling, 2003). En el intestino, es necesaria, junto con otras bacterias, para el correcto funcionamiento del proceso digestivo. Participa en diferentes funciones fisiológicas beneficiosas para su hospedador, tales como la absorción de nutrientes, la síntesis de las vitaminas K y B, el procesamiento de los residuos alimenticios y la estimulación de la respuesta inmune en el hospedador. Además, ejerce una inhibición competitiva sobre el crecimiento de enteropatógenos (Kruis et al., 2004). E. coli es la especie predominante de la microbiota aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo de la mayoría de los animales de sangre caliente y está presente en más del 90% de todos los seres humanos (Tenaillon et al., 2010).Asimismo, se utilizan aislados particulares de E. coli como tratamiento probiótico para ciertos desequilibrios intestinales. Además de su inofensiva y beneficiosa existencia como comensal intestinal, E. coli es responsable de un número importante de enfermedades que afectan a todos los grupos de edad en humanos y animales (Martinez-Medina et al., 2009). Entre las bacterias resistentes, E. coli es el patógeno bacteriano Gram negativo más común. Por ello, poder distinguir los diferentes tipos de cepas más allá de la especie es esencial y útil en múltiples circunstancias(Flament Simon, 2021). 5.2.1 E. COLI PATÓGENO Los diversos linajes patógenos se clasifican en dos grandes categorías: E. coli patógenas intestinales (InPEC) y E. coli patógenas extraintestinales (ExPEC). Las cepas InPEC son el agente causante de infecciones intestinales como la diarrea infantil y la diarrea del viajero, síndrome urémico hemolítico, colitis hemorrágica e incluso la enfermedad inflamatoria intestinal Crohn (Barnich & Darfeuille-Michaud, 2007; Gómez-Duarte, 2014; Scaletsky et al., 2002). Por su parte, las cepas ExPEC son de los principales agentes etiológicos responsables de infecciones extraintestinales como septicemias, bacteriemias, meningitis neonatal, infecciones del tracto urinario y INTRODUCCIÓN 16 importantes factores de virulencia. La elevada afinidad de los sideróforos por este metal les permite competir no solo por el hierro libre sino también arrebatarlo de fuentes de reserva del hospedador tales como la ferritina. Tras captar el hierro del medio externo la bacteria debe internalizarlo(Balado Dacosta, 2009). Las cepas ExPEC pueden sintetizar hasta cuatro sistemas de captación de hierro: enterobactinas, salmoquelina, aerobactina y yersiniabactina. La adquisición de hierro mediate estos sistemas se componen de varias etapas como la síntesis del sideróforo en el citoplasma, su secreción, la recepción del complejo hierro-sideróforo por receptores bacterianos como iutA, e internalización del complejo y finalmente liberación de hierro en el citoplasma (Garénaux et al., 2011). 5.4.2.4 CÁPSULA La cápsula a menudo constituye la capa más externa de las cepas de E.coli por lo que suele intervenir en las interacciones entre la bacteria y su entorno inmediato. Entre las funciones de los polisacáridos que constituyen las capsulas bacterianas se encuentran la prevención de la desecación, la adherencia y la resistencia al sistema inmune tanto innato como adquirido. Los polisacáridos capsulares son increíblemente diversos ya que no solo existen diferentes unidades de monosacáridos, sino también difieren en su forma de unión. En el caso de E. coli se han descrito casi 80 variedades del antígeno K de acuerdo a sus propiedades serológicas, de los cuales una pequeña fracción están asociados con infecciones invasivas (Roberts, 1996; Whitfield, 2006). Los antígenos K de E. coli se divididen en 4 grupos (IA, IB, II y III). Los grupos IA y IB se encuentran en aislados de E. coli que causan infecciones intestinales (EPEC, ETEC y EHEC) y las cápsulas de los grupos II y III se encuentran en cepas que causan infecciones extraintestinales. Estas cápsulas contribuyen en la protección contra la fagocitosis y la actividad bactericida del suero(Whitfield, 2006). Los genes que codifican para la cápsula de los grupos II y III son denominados kps (Mamani Huarani, 2015). Otros componentes de la membrana externa también se han relacionado con la resistencia al suero en E. coli incluyendo ciertas proteínas como Iss (del inglés “increased serum survival”) y TraT. La resistencia al suero parece ser una característica de virulencia de E. coli ampliamente propagada, se cree que la proteína Iss puede ser un factor de virulencia importante y útil en la discriminación entre cepas virulentas y avirulentas (Nolan et al., 2003). 5.4.2.5 ANTÍGENO O La membrana externa de las bacterias gramnegativas está formada por una bicapa lipídica asimétrica en la cual la cara interna está compuesta por fosfolípidos mientras que la cara externa está compuesta en su mayor parte por moléculas de lipopolisacáridos (LPS) (Funahara & Nikaido, 1980; Kita & Nikaido, 1973; Llompart Vázquez, 2009). Los LPS juegan un papel muy importante en la patogénesis de las infecciones bacterianas, así como en la interacción con el hospedador y su sistema de defensa. Básicamente el LPS se compone de 3 partes: el lípido A, el núcleo y la cadena O. La cadena O, es la región del LPS más expuesta al medio externo, por lo que sus características son esenciales para la supervivencia de la bacteria en los diferentes ambientes. Presenta gran variabilidad en cuanto a longitud y tipos de azúcar presentes, y contiene los determinantes antigénicos responsables de la especificidad serológica del microorganismo (Llompart Vázquez, 2009). Desde su descubrimiento, el LPS fue reconocido como una molécula con una potente acción endotóxica, en la actualidad, se le atribuye otras funciones entre las que se incluyen: mantenimiento y organización de la membrana externa, inhibición de anticuerpos, variaciones antigénicas, activador del sistema inmune y mediación en la adherencia a las células y tejidos del hospedador(Harvill et al., 2000; Raetz & Whitfield, 2002; Romero et al., 2010). INTRODUCCIÓN 17 Las cepas de E. coli patógenas extraintestinales (ExPEC) son responsables de la mayoría de las infecciones extraintestinales a nivel mundial y aunque comprenden una gran variedad de linajes, tan solo un pequeño grupo de clones son responsables de la mayoría de las infecciones. Estos clones de alto riesgo están a su vez representados por un número limitado de serogrupos. La mayor parte de las cepas de E. coli causantes de ITU y bacteriemias a nivel global pertenecen a los serogrupos O1, O2, O4, O6, O7, O16, O18 y O75 E. coli (Mamani Huarani, 2015). Pese a que los mismos serogrupos O parece que predominan en todo el mundo, existen diferencias entre las distintas regiones geográficas (J. Blanco et al., 1992). El hecho de que existan numerosos serogrupos representados en las cepas de E. coli extraintestinales dificulta el diseño de una vacuna eficaz a nivel mundial (Blum-Oehler et al., 1997; J. R. Johnson et al., 2009; Korhonen et al., 1985; Ørskov & Ørskov, 1985; Prats et al., 2000; Van Den Bosch et al., 1982). Con el fin de comprender con mayor profundidad la epidemiología local de E. coli, el LREC ha realizado un seguimiento epidemiológico de los serogrupos causantes de bacteriemias a lo largo de los años en el HULA en una importantísima colección de cepas, en un primer estudio se analizaron un total de 3.260 cepas aisladas en el periodo 1989-2011 y en un segundo estudio aún en desarrollo se busca contrastar cambios epidemiológicos transcurridos 9 años. Actualmente el LREC-USC cuenta con 348 cepas procedentes del periodo 2020-2022. En el presente trabajo se han caracterizado 53 cepas pertenecientes a los serogrupos O1 (20 cepas) y O2 (33 cepas), aisladas durante los años 2020, 2021 y 2022 a partir de hemocultivos de pacientes del HULA de Lugo (Tabla 1). Tabla 1. Serogrupos O más frecuentes entre cepas de E. coli bacteriémicas aisladas de pacientes en el hospital Universitario Lucus Augusti (HULA). Comparación entre los períodos 2020-2022 (datos no publicados del LREC-USC) y 1989-2011 (período 1989-2011, Tesis doctoral Rosalia S. Mamani, USC, 2015). Número (%) de cepas E. coli Serogrupos* Estudio 2020-2022 (n = 348) Estudio 1989-2011 (n = 3.260) p-valor O1 20 (5,7) 214 (6,6) O2 34 (9,8) 270 (8,3) O4 13 (3,7) 117 (3,6) O6 27 (7,8) 278 (8,5) O7 4 (1,1) 37 (1,1) O8 34 (9,8) 243 (7,5) O9 11 (3,1) 120 (3,7) O15 14 (4,0) 137 (4,2) O18 7 (2,0) 129 (4,0) O25 34 (9,7) 220 (6,7) 0,047151 O75 11 (3,2) 58 (1,8) O83 5 (1,4) 37 (1,1) O101 14 (4,0) 70 (2,1) 0.043394 O153 6 (1,7) 37 (1,1) *Aparecen únicamente los serogrupos O encontrados en ambos períodos con una prevalencia superior al 1,0 % HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 18 6. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS En los últimos años se ha observado un aumento de bacteriemias causadas por E. coli patógenos extraintestinales (ExPEC), E. coli uropatogénicos (UPEC) y E. coli patógenos aviares (APEC). Entre los serogrupos más prevalentes a nivel global se encuentran los serogrupos O1 y O2. Nuestro objetivo es caracterizar las cepas pertenecientes a estos serogrupos, buscando entender las razones de su éxito. Determinar las características de estas cepas es vital para diseñar vacunas adaptadas a la epidemiología actual de nuestra área sanitaria. MATERIALES Y MÉTODOS 19 7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1 CEPAS CONTROL Y CONSERVACÓN DE CEPAS En todos los ensayos tanto fenotípicos como genotípicos empleamos cepas procedentes de hemocultivos de la colección del Laboratorio de Referencia de Escherichia coli de la Universidade de Santiago de Compostela (LRECUSC). Todos los aislados se conservaron en las mismas condiciones siguiendo el protocolo LREC-USC, en agar nutritivo con 0,75% (p/v) de agar a temperatura ambiente en tubos Vacutainer ™. Gracias a este medio conseguimos que las cepas mantengan su viabilidad durante al menos 10 años. Para preparar este medio mezclamos agar nutritivo 11,5 (g/l) (Applichem Panreac) y caldo nutritivo 4 (g/l) (Applichem-Panreac). Se distribuyen aproximadamente 3 ml del medio en los tubos estériles. 7.2 OBNTENCIÓN DE LAS CEPAS CLÍNICAS DE E. COLI Las cepas seleccionadas para la realización de este Trabajo Fin de Grado (TFG) proceden de una selección realizada sobre 348 cepas obtenidas a través de un estudio en colaboración realizado entre el HULA y el LRECUSC. Se trata de cepas procedentes de infecciones extraintestinales causadas por E. coli, concretamente cepas aisladas de hemocultivos (bacteriemias), donde un total de 54 cepas fueron identificadas como pertenecientes a los serogrupos O1 y O2 (Tabla 1). Para el desarrollo de este TFG se seleccionaron aleatoriamente 53 de estas cepas. Las 53 cepas analizadas fueron obtenidas en los años 2020 (n=14), 2021 (n=31) y 2022 (n=8). En el HULA se llevó a cabo el aislamiento, identificación y antibiograma de las cepas. 7.3 ESTUDIO FENOTÍPICO 7.3.1 SEROTIPADO El método empleado para la determinación del antígeno O de los aislados está basado en procedimiento originalmente descrito por Van Den Bosch et al., (1982) y posteriormente modificado por Blanco et al., (1996). Los antisueros se obtienen en el LREC-USC mediante la inmunización de conejos con cepas seleccionadas del patógeno y posteriormente adsorbidos para eliminar reacciones cruzadas, siendo capaces de reconocer las variedades de la O1 a la O185 con gran fiabilidad. Este método determina los antígenos O de E. coli mediante aglutinación positiva con los antisueros O (O1 a O181) disponibles. Los antisueros de diagnóstico utilizados se produjeron y se dotaron monoespecíficos en el LREC-USC. La especificidad se controló mediante ensayos de aglutinación con cepas de referencia conocidas. Los tipos de antígenos O31, O47, O67, O72, O93, O94 y O122 se excluyeron de esta clasificación, ya que se demostró que no son antígenos somáticos. El procedimiento de serotipado LREC-USC incluye 174 antisueros O monovalentes agrupados en 25 antisueros polivalente para simplificar el proceso. Los antisueros se emplean en dos diluciones de ensayo 1/80, en su gran mayoría, o 1/40. Dicha dilución se determina al ensayar cada antisuero una vez se ha completado el proceso de adsorción, frente a su cepa O homóloga de referencia. Si el título es ≥ 1/640 con la cepa control, la dilución de ensayo será 1/80, mientras que si es <1/640, la dilución de ensayo es 1/40. Todas las diluciones se preparan con una solución salina estéril (NaCl 0,85%). MATERIALES Y MÉTODOS 20 7.3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES BACTERIANAS Sembramos las cepas en medio agar Triptona-Soja (TSA) e incubamos (37ºC/ 24h). Rotulamos los números de referencia de las cepas en tubos de ensayo donde suspendemos las colonias obtenidas en 2 ml de solución salina (0,85% NaCl). Llevamos a hervir los tubos con las soluciones (100ºC/ 1h), de esta forma conseguimos destruir el antígeno K desenmascarando así el antígeno O. Tras enfriar, se añaden 2 ml de solución salina formalinizada (0,5%, v/v) con violeta de genciana (0,005%, p/v) en cada suspensión. Las suspensiones permanecen viables durante meses si se conservan bien cerradas a 4°C. 7.3.1.2 DETERMINACIÓN DEL SEROGRUPO O Para enfrentar los aislados a los antisueros empleamos placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos (16 placas en total), facilitando la lectura de los resultados y necesitando la cantidad mínima de antisuero. Rotulamos en la parte superior de las placas de microtitulación las letras de la A-Y correspondientes a los antisueros polivalentes (combinación conocida de antisueros específicos frente a un antígeno O) y numeramos las filas de la 1 a la 53 correspondiendo a cada una de nuestras cepas. Repartimos cantidades equivalentes del antisuero y la bacteriana problema obteniendo un volumen final de 100 µl. Dejamos incubar las muestras 37ºC durante 24h. La interpretación de los resultados se realiza estudiando las reacciones de aglutinación. Si los anticuerpos presenten en el antisuero reaccionan con los antígenos de la muestra se forma una red que evita que las bacterias sedimenten (resultado positivo). Por el contrario, si ningún anticuerpo presente en el antisuero reacciona con la muestra, las bacterias teñidas con el cristal violeta sedimentan dando lugar a un punto visible en el fondo del pocillo (resultado negativo). Tras obtenerse las reacciones positivas con los antisueros polivalentes, la suspensión de antígeno O de la cepa deberá enfrentarse con todos los antisueros monovalentes incluidos en el polivalente correspondiente. 7.3.1.3 TITULACIÓN SEROGRUPO O La determinación del antígeno O se completa con el proceso de confirmación de titulación. El título representa la dilución máxima del suero capaz de aglutinar a la cepa problema. Para lo cual enfrentaremos la cepa problema a una dilución seriada del monovalente específico y dejamos a incubar la placa de microtitulación a 37°C/24h. Transcurrido el tiempo, realizamos la lectura de los resultados por aglutinación y determinamos los títulos. 7.3.2 ANTIBIOGRAMA La determinación de las concentraciones mínimas inhibitoria (CMI) y susceptibilidad a los antimicrobianos fue determinada en el Hospital Lucus Augusti (HULA) mediante el sistema MicroScan. Los resultados se interpretaron siguiendo los estándares EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) que establece 3 categorías en función del grado de sensibilidad a un antibiótico para un microorganismo: Resistente (R), Sensible (S) e Intermedia (I). Se analizaron 10 clases de agentes antimicrobianos de gran interés clínico y epidemiológico: penicilinas (ampicilina, piperacilina), cefamicinas (cefoxitina), cefalosporinas de 3º y 4º generación (cefotaxima, ceftazidima y cefepima), carbapenems (imipenem, meropenem, ertapenem) y monobactámicos (aztreonam), betalactámicos con inhibidores de β-lactamasas (amoxicilina-ácido clavulánico y piperacilina-tazobactam), aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina y amikacina), inhibidores de la vía del folato (trimetoprimasulfametoxazol), quinolonas (ácido nalidíxico, levofloxacina y ciproflozacina) y tigeciclina. La designación de MDR (del inglés “Multidrug Resistant”) se definió como la resistencia a más de tres clases de fármacos antimicrobianos probados (Magiorakos et al., 2012). La producción de ESBL (del inglés “Extended-spectrum betalactamase”) se llevó a cabo mediante el test de sinergia (Jarlier et al., 1988). MATERIALES Y MÉTODOS 21 7.4 ESTUDIO GENOTÍPICO 7.4.1 EXTRACCIÓN DE ADN Para la extracción del ADN, primero sembramos todas las cepas en medio agar TSA e incubamos (37ºC/ 24h). Añadimos en tubos eppendorf con 600 µl de agua destilada autoclavada aproximadamente 10 µM (utilizando asas de inoculación estériles de 10 µ M) de cada cultivo puro. Llevamos a hervir las suspensiones a 100ºC durante 5 minutos. Luego, centrifugamos 2 min a 11.000 rpm. Por último, retiramos el sobrenadante y traspasamos a nuevos tubos eppendorf que congelamos para poder usar en las PCRs siguientes. En todos los procedimientos se incluyen sistemáticamente controles negativos y positivos (cepas de referencia procedentes del LREC-USC, (ANEXO: CONTROLES POSITIVOS). Con el fin de estandarizar nuestro protocolo de trabajo, se trabajaron con las siguientes condiciones: 7.4.1.1 MEZCLA DE REACCIÓN La mezcla de reacción se prepara para un volumen final de 25 µl por cada muestra y contiene: El ADN extraído de la cepa problema (5 µl) Cebadores (0,31 µl) Master Mix coloreado (NZYTaq 2x Green Master Mix) (12,5 µl) Agua miliQ y autoclavada hasta completar el volumen final de 25 µl. 7.4.1.2 AMPLIFICACIÓN Las mezclas fueron sometidas a: Un ciclo de des naturalización inicial (94ºC/ 3 min) Seguido de 35 ciclos de 94ºC/ 1min (desnaturalización), Tº de hibridación del cebador 1 min y 72ºC/ 90 seg (polimerización) Un ciclo de polimerización final de 72ºC/ 3 min. 7.4.1.3 REVELADO DE RESULTADOS La lectura de los fragmentos de ADN amplificados se realizó mediante electroforesis convencional en gel de agarosa bajo luz UV [agarosa Seakem® LE al 1.5% en tampón TAE 1X (Tris 1,6 M, acetato sódico 0,8 M, EDTA 0,025 M) con 6µl de marcador Green Safe Premium (Nzytech) por 200 ml. Cargando en cada pocillo 7 µl de muestra. En todas las PCRs se incluyeron cepas para el control positivo y un blanco. Las electroforesis se realizaron con fuentes y cubetas de Bio-Rad. El voltaje aplicado a los geles grandes (200ml tampón TAE, 3 g agarosa, 6 µl Green safe) fue de 140V durante 20-30 min dependiendo del tamaño del amplificado. Los geles se leyeron en un transiluminador y analizados con el software Image Lab. A continuación, se muestran solo aquellas reacciones donde las condiciones de trabajo sean distintas. 7.4.2 GRUPO FILOGENÉTICO La detección de los genes se realizó mediante PCR convencional con un protocolo adaptado de (Clermont et al., 2013a) MATERIALES Y MÉTODOS 22 7.4.2.1 MEZCLA DE REACCIÓN Las mezclas de reacción se preparan para un volumen final de 25 µl que contienen: ADN extraído del aislado correspondiente (5 µl) Master mix (NZYTaq 2x Green Master Mix) (12,5 µl) Cebadores (0,51 µl) Agua destilada autoclavada hasta completar el volumen final de 25 µl. 7.4.2.2 AMPLIFICACIÓN Las mezclas de reacción para la PCR multiplex fueron sometidas a: Un ciclo de desnaturalización inicial (94ºC/ 4 min) Seguido de 30 ciclos de 94ºC/ 5 seg (desnaturalización), fase de hibridación a 58ªC 20 seg y 72ºC/ 1min (polimerización) Un paso de extensión final de 72ºC/ 5 min. Las mezclas de reacción para las PCR de los grupos E y C fueron sometidas a: Un ciclo de desnaturalización inicial (94ºC/ 3 min) Seguido de 35 ciclos de 94ºC/ 1 min (desnaturalización), fase de hibridación Tº de anillamiento de los cebadores 1min y 72ºC/ 1min 30 seg (polimerización) Un paso de extensión final de 72ºC/ 3 min. 7.4.2.3 CEBADORES Los cebadores usados en las pruebas de PCR, sus secuencias nucleotídicas y el tamaño del producto amplificado de pares de bases se indican en las Tabla 2, Tabla 3 y Tabla 4. Tabla 2. Cebadores utilizados en la Multiplex de grupos filogenéticos Nombre del gen Primers [ 50 µl ] Tª de annealing Secuencia nucleotídica (5´‐ 3´) Tamaño (pb) Referencia chuA chuA.1b 0.5 µl 58 ºC ATGGTACCGGACGAACCAAC 288 (Clermont et al., 2013a) chuA.2 TGCCGCCAGTACCAAAGACA (Clermont et al., 2000b) yjaA yjaA.1b 0.5 µl CAAACGTGAAGTGTCAGGAG 211 (Clermont et al., 2013b) yjaA.2b AATGCGTTCCTCAACCTGTG TspE4C2 TspE4C2.1 b 1 µl CACTATTCGTAAGGTCATCC 152 TspE4C2.2 b AGTTTATCGCTGCGGGTCGC arpA AceK.f 1 µl AACGCTATTCGCCAGCTTGC 400 ArpA1.r TCTCCCCATACCGTACGCTA MATERIALES Y MÉTODOS 23 Tabla 3. Cebadores utilizados en la clasificación del grupo filogenético E. Nombre del gen Primers [50µM] Tª de anneling Secuencia nucleotídica (5´‐ 3´) Tamaño (pb) Referencia arpA ArpAgpE.f 0.5 µl 57 ºC GATTCCATCTTGTCAAAATATGC C 301 (Lescat et al., 2013) ArpAgpE.r GAAAAGAAAAAGAATTCCCAAG AG trpA trpBA.f 0.3 µl CGGCGATAAAGACATCTTCAC 489 (Clermont et al., 2008) trpBA.r GCAACGCGGCCTGGCGGAAG Tabla 4. Cebadores utilizados en la clasificación del grupo filogenético C. Diana Primers [50µM] Tª de anneling Secuencia nucleotídica (5´‐ 3´) Tamaño (pb) Referencia trpAgpC trpAgpC.1 0.5 µl 56 ºC AGTTTTATGCCCAGTGCGAG 219 (Lescat et al., 2013) trpAgpC.2 TCTGCGCCGGTCACGCCC trpA trpBA.f 0.1 µl CGGCGATAAAGACATCTTCAC 489 (Clermont et al., 2008) trpBA.r GCAACGCGGCCTGGCGGAAG La identificación de los distintos grupos filogenéticos de E. coli se realizó por PCR siguiendo el método descrito por Clermont et al., (2013a) (Ilustración 1). Ilustración 1. Esquema grupos filogenéticos E. coli. 7.4.3 GENES EXPEC La detección de los genes de virulencia se realizó mediante PCR convencional y múltiple, agrupando cebadores con la misma temperatura de anillamiento. MATERIALES Y MÉTODOS 24 7.4.3.1 CEBADORES Los cebadores usados en las pruebas de PCR, sus secuencias nucleotídicas, el tamaño de producto amplificado, así como su temperatura de anillamiento se indican en la Tabla 5. Tabla 5. Cebadores utilizados en la detección de genes de virulencia de los aislados ExPEC. Diana Primer Secuencia nucleotídica (5´-3´) [20 µM] Tamañp (pb) Tº Referencia papC Forward GTGGCAGTATGAGTAATGACCGTTA 0,5 205 60 (J. R. Johnson et al., 2015) Reverse ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA hlyF Forward TCGTTTAGGGTGCTTACCTTCAAC 0,5 444 (Morales et al., 2004) Reverse TTTGGCGGTTTAGGCATTCC ompT Forward ATCTAGCCGAAGAAGGAGGC 1 559 (J. R. Johnson et al., 2015) Reverse CCCGGGTCATAGTGTTCATC yfcV yfcV-F ACATGGAGACCACGTTCACC 0.5 292 66 (Spurbeck et al., 2012) yfcV-R GTAATCTGGAATGTGGTCAGG fyuA fyuA-F GTAAACAATCTTCCCGCTCGGCAT 0.5 850 (Spurbeck et al., 2012) fyuA-R TGACGATTAACGAACCGGAAGGGA vat vat-F TCAGGACACGTTCAGGCATTCAGT 0.5 1100 (Spurbeck et al., 2012) vat-R GGCCAGAACATTTGCTCCCTTGTT iroN Ironec-f AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG 0.3 665 (J. R. Johnson, Russo, et al., 2000) Ironec-r GACGCCGACATTAAGACGCAG iss is-f CAGCAACCCGAACCACTTGATG 0.3 323 (T.J.Johnson, Wannemuehler, & Nolan, 2008) is-r AGCATTGCCAGAGCGGCAGAA papEF PapEF F GCAACAGCAACGCTGGTTGCATCAT 0.5 336 64 (Yamamoto A-B et al., 1995) PapEF R AGAGAGAGCCACTCTTATACGGACA tsh tsh03 GGTGGTGCACTGGAGTGG 0.5 640 (Dozois et al., 2000) tsh15 AGTCCAGCGTGATAGTGG iucD Aer f TACCGGATTGTCATATGCAGACCGT 0.5 602 Yamamoto et al. (1995) Aer r AATATCTTCCTCCAGTCCGGAGAAG iutA aer-851f GGCTGGACATCATGGGAACTGG 0.5 301 (J. R. Johnson et al., 1997) aer1152r CGTCGGGAACGGGTAGAATCG sfa/foc DE sfa 1 CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC 0.5 410 Le Bouguenec et al. (1992) sfa 2 CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA afa/dra BC afa1 GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC 0.5 750 64 (Le Bouguenec et al., 1992) afa2 CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG neuc-k1 neu1 AGGTGAAAAGCCTGGTAGTGTG 0.5 676 (Moulin-Schouleur et al., 2006) neu2 GGTGGTACATCCCGGGATGTC kps M II KpsII f GCGCATTTGCTGATACTGTTG 0.5 272 (J. R. Johnson & Stell, 2000) KpsII r CATCCAGACGATAAGCATGAGCA hlyA hly f AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT 0.3 1177 (Yamamoto A-B et al., 1995) hly r ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA MATERIALES Y MÉTODOS 25 7.5 ESTUDIO CEPAS PERTENECIENTES A ST95 Para determinar que cepas de nuestra colección pertenecen a la secuencia tipo ST95 adaptamos la PCR descrita por Gordon et al. (2017a). Para la puesta a punto probamos distintas temperaturas de anillamiento y concentraciones para cada cebador. Una vez determinadas las mejores condiciones de trabajo se pudo realizar:1) la detección de las cepas pertenecientes al complejo clonal 95 (positivas a svg) y 2) determinar a qué subgrupo pertenece cada cepa dentro de este (subgrupos A-E) en base a la detección de genes específicos de cada cluster (subgrupo A, gpA; subgrupo B, gpB; subgrupo C, gpC; subgrupo D, gpD y subgrupo E, gpE). 7.5.1 PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN Primero hacemos una PCR para conocer que cepas pertenecen al ST95. Para ello preparamos una mezcla de reacción para un volumen final de 25 µl por muestra que contiene: El ADN de nuestras 53 cepas (5 µl) Master Mix para multiplex (NZYTaq 2x Green Master Mix) (12.5 µl) Cebador svg (0.5 µl) Agua MilliQ hasta completar el volumen final de 25 µl Una vez obtenidos los resultados, con las cepas positivas y que por tanto pertenecen al ST95, realizamos otra PCR para identificar el subgrupo. Debemos preparar dos mezclas ya que no conseguimos amplificar gpE por multiplex. Mezcla 1 (PCR múltiple para gpA, gpB, gpC, gpD,) ADN de las muestras positivas para svg (5 µl) Cebadores gpA (0.2 µl), gpB (0.5µl), gpC (0.5 µl), gpD(0.5µl) Master Mix para multiplex (Multiplex PCR NZYTaq 2x Colourless Master Mix) (12.5 µl) Agua MilliQ hasta completar el volumen final de 25 µl Mezcla 2 (detección de gpE) ADN de las muestras positivas para svg (5 µl) Cebadores gpE (0.5 µl) Master Mix coloreadas (marca) (12.5 µl) Agua MilliQ hasta completar el volumen final de 25 µl 7.5.2 AMPLIFICACIÓN Las mezclas fueron sometidas a: Un ciclo de des naturalización inicial (94ºC/ 4 min) Seguido de 30 ciclos de 94ºC/ 5 seg de desnaturalización, temperatura (Tabla 6) de hibridación del cebador de 20 seg y 72ºC/ 5 min de polimerización. Un ciclo de polimerización final de 72ºC/ 3 min. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 8.1.3 GRUPOS FILOGENÉTICOS El filogrupo B2 fue el más frecuente (79,2%) entre las 53 cepas incluidas en este estudio (Tabla 11Tabla 11). A este filogrupo pertenecieron el 60% de los aislados del serogrupo O1 y el 91% de las cepas O2. El segundo filogrupo más frecuente fue el F, al que pertenecen el 11,3% de las cepas analizadas. Este filogrupo fue especialmente prevalente entre las cepas del serogrupo O1 (25%). En cambio, apenas encontramos representación de los filogrupos A, E u otros desconocidos (U), siendo nula la detección de cepas pertenecientes a los filogrupos C y D. Tabla 11. Pertenencia a los grupos filogenéticos de las cepas de los serogrupos O1 y O2 (Lugo, 2020-2022). Número (%) de cepas de E.coli Grupo filogenético Total (n=53) O1 (n=20) O2 (n=33) A 1 (1,9) 0 1 (3) B1 2 (3,8) 2 (10) 0 B2 42 (79,2) 12 (60) 30 (91) C 0 0 0 D 0 0 0 E 1 (1,9) 0 1 (3) F 6 (11,3) 5 (25) 1 (3) U 1 (1,9) 1 (5) 0 Estudios realizados con cepas de E. coli de origen humano han puesto de manifiesto que las cepas comensales usualmente derivan de los grupos filogenéticos C, A y B1, mientras que la mayoría de las cepas ExPEC derivan de los grupos B2, F y D (Beghain et al., 2018; Clermont et al., 2019), concordando con los resultados obtenidos en nuestro estudio. 8.2 GRUPO CLONAL ST95 El 45,3% de las cepas analizadas en este estudio pertenecen a la ST95. Esta secuencia tipo se ha encontrado con mayor incidencia entre las cepas del serogrupo O1 (65%) que entre las del serogrupo O2 (33,3%) (Tabla 12). Tabla 12.Distribución de las cepas ST95 por serogrupos (Lugo, 2020-2022). Secuencia tipo Número (%) de cepas de E.coli Total (n=53) O1 (n=20) O2 (n=33) ST95 24 (45,3) 13 (65) 11 (33,3) ST95 se encuentra entre los denominados linajes ExPEC pandémicos (Riley, 2014b). A este conjunto de linajes ExPEC pandémicos pertenecen los genotipos de E. coli ST10, ST69, ST73, ST95, ST127 y ST131, que representan más del 50% de las infecciones extraintestinales patógenas por E. coli a nivel mundial (Adams-Sapper et al., 2013; Kallonen et al., 2017). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 Existen diversos estudios sobre la prevalencia de distintas ST de aislados de bacteriemia causadas por E. coli. Así, Adams-Sapper et al. (2013), analizando 220 aislados del torrente sanguíneo obtenidos en San Francisco entre 2007 y 2010, encontraron solo cinco ST prevalentes y complejos clonales, que representaban el 65% de los aislados. Se trataba de ST131 (23%), ST95 (18%), ST73 (8%), ST69 (9%) y ST12 (6%). Por su parte, Cole et al. (2019), estudiando 43 aislamientos de E. coli bacteriémicos de recién nacidos obtenidos entre 2006 y 2016 en Oklahoma, encontraron que ST95 era la ST más prevalente (11,3%), seguida de ST131 (9,2%) y ST1193 (3,7%). Cole et al., (2019) observaron que los aislados ST95 y ST131 estuvieron presentes durante todos los años estudiados, mientras que ST1193 solo se observó en los últimos años. Fibke et al. (2019) analizaron el genoma de aislados de E. coli responsables de ITU en Canadá, en 385 mujeres entre 2012 y 2015. Los principales ST incluyeron ST95 (18,4%), ST73 (10,1%), ST127 (9,1%), ST131 (8,8%) y ST69 (7,5%). En otros estudios realizados por Banerjee et al. (2013) en EE.UU., estudiaron 299 aislados clínicos extraintestinales de E. coli (90% procedentes de ITU) obtenidos durante 2011 en Minnesota, e identificaron los cinco ST más prevalentes, que fueron ST131 (27%), ST95 (11%), ST73 (8%), ST127 (6%) y ST69 (5%). Por su parte, Yamaji et al., 2018), que estudiaron 233 E. coli aislados de ITU en California durante 2016 y 2017, y 225 aislados recogidos de forma similar entre 1999 y 2000, mostraron que los aislados ST131 se identificaron con menor frecuencia que los ST95, ST127, ST73 y ST69 en estos dos periodos. En cuanto al perfil de resistencia. Cabe destacar que la gran mayoría de las cepas de nuestra colección que presentaban resistencias a antimicrobianos pertenecían a ST95. De las seis cepas multirresistentes encontradas, cinco pertenecen a esta secuencia tipo. Pese a ello, sigue siendo un número bajo de aislados MDR en comparación con otros linajes ExPEC predominantes (Tabla 13). En un estudio realizado por Yamaji et al. en 2018 analizaron las resistencias adquiridas a diversos antimicrobianos (ampicilina, trimetoprima-sulfametoxazol y ciprofloxacina) en cepas pertenecientes a la secuencia tipo ST95 y otros linajes dominantes durante dos períodos de tiempo. En dicho estudio, ST95 pese a ser la secuencia tipo más prevalente en ambos cribados, resultó ser el grupo que menos resistencia a los antibióticos mostraba de entre todos los linajes. Además, tampoco presentaron capacidad de producción de ningún tipo de betalactamasas de espectro extendido. De entre los tres antimicrobianos enfrentados a ST95 con una diferencia de tiempo de 17 años, únicamente aumentó la resistencia a la ampicilina del 2,9% al 20,5%. En otro estudio realizado en 2016por Flament-Simon et al. (2020) se describe a ST95 como uno de los grupos clonales con menor número de MDR entre una amplia variedad de cepas de E. coli aisladas de infecciones extraintestinales causadas en pacientes procedentes de Lugo y de París lo cual coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Sin embrago, la comunidad investigadora señala que existen un incremento alarmante de cepas de E. coli MDR. Otras secuencias tipo como ST131 son bien reconocidas como MDR y están ampliamente extendidas por el mundo (Petty et al., 2014; Rogers et al., 2011) . Pese a ello, llama la atención como estas secuencias tipo multirresistentes no logran desplazar a ST95, ya que la frecuencia con la que las cepas ST95 son responsables de infecciones extraintestinales parece haberse mantenido estable durante los últimos 15 años a nivel mundial (Flament-Simon et al., 2020; Gordon et al., 2017a). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34 Tabla 13. Resistencias de las cepas ST95 y de otras secuencias tipo (Lugo, 2020-2022). Antimicrobianos Número (%) de cepas ST95 (n=24) No ST95 (n=29) Ampicilina 11 (45,8) 7 (24,1) Piperacilina 7 (29,2) 11 (37,9) PiperacilinaTazobactam 1 (4,2) 0 Amoxicilina-Clavulánico 2 (8,3) 2 (6,9) Cefuroxima 0 2 (6,9) Cefotaxima 0 0 Ceftazidima 0 0 Cefepime 0 0 Cefoxitin 1 (4,2) 0 Aztreonam 0 2 (6,9) Gentamicina 1 (4,2) 0 Tobramicina 1 (4,2) 0 Ácido Nalidíxico 9 (37,5) 0 Ciprofloxacina 2 (8,3) 0 Levofloxacina 0 2 (6,9 Trimethoprim-Sulfamethoxazol 5 (20,8) 2 (6,9) Resistencia múltiple 3 (12,5) 3 (10,3) Productoras de ESBL 0 0 Con todo, se puede concluir que la resistencia a los antibióticos no es el mecanismo responsable del éxito evolutivo del grupo clonal ST95, secuencia tipo que se encuentra entre las más prevalentes a nivel global. Numerosas investigaciones apoyan que el dominio comunitario de este clon pueda deberse a su aptitud biológica intrínseca junto a otros factores epidemiológicos que contribuyen a su difusión global (Yamaji et al., 2018). Por otra parte, analizamos la presencia de 17 genes que codifican para factores de virulencia típicos de cepas ExPEC, tres de estos genes de virulencia (papC, papEF, iss) fueron asociados de manera estadísticamente significativa con las cepas ST95 y dos con las cepas de otras secuencias tipo (sfa/focDE, hlyA) (Tabla 14). Además, las cepas ST95 se asociaron significativamente con el estatus ExPEC, ya que las 24 cepas de esta secuencia tipo cumplían los requisitos de esta clasificación frente al 75,9% de las de otras secuencias tipo. Asimismo, cerca de la totalidad de las cepas ST95 alcanzaron el estatus UPEC (95,8%) y el 70,8% el estatus APEC (Tabla 14). Los porcentajes de cepas no ST95 con el estatus UPEC (80,2%) y APEC (48,3%) fueron bastante inferiores, pero las diferencias no son estadísticamente significativas. Precisamente, en la literatura, a menudo se asocian estos patotipos con las cepas ST95 (Flament-Simon et al., 2020; Gordon et al., 2017a). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35 Tabla 14. Genes virulencia y estatus de las cepas ST95 y de otras secuencias tipo (Lugo, 2020-2022). Genes de virulencia Número (%) de cepas E.coli ST95 (n=24) No ST95 (n=29) P-valor Adhesinas afa/draBC 1 (4,2) 3 (10,3) papC 24 (100) 14 (48,3) <0,001 papEF 22 (91,7) 15 (51,7) 0,002 sfa/focDE 1 (4,2) 14 (48,3) <0,001 yfcV 22 (91,7) 24 (82,8) Toxinas hlyA 1 (4,2) 10 (34,5) 0,008 hlyF 24 (100) 29 (100) tsh 3 (12,5) 0 vat 20 (83,3) 18 (60,1) Sideroforos chuA 24 (100) 25 (86,2) fyuA 24 (100) 27 (93,1) iroN 18 (75) 17 (58,6) iucD 18 (75) 14 (48,3) iuTA 19 (79,2) 21 (72,4) Cápsula KpsM-II 23 (95,8) 27 (93,1) Misceláneos iss 17 (70,8) 6 (20,6) <0,001 ompT 23 (95,8) 29 (100) Estatus ExPEC 24 (100) 22 (75,9) 0,012 Estatus UPEC 23 (95,8) 25 (80,2) Estatus APEC 17 (70,8) 14 (48,3) El valor de P fue obtenido mediante la prueba exacta de Fisher bilateral. Únicamente se muestran si son estadísticamente significativos (P≤0,05) En un estudio anterior, realizado en 2016 en Lugo (Flament-Simon et al., 2020), ST95 resultó ser una de las secuencias tipo más frecuentes (6%) entre cepas causantes de diferentes tipos de infecciones extraintestinales, mostrando un perfil de virulencia muy similar al encontrado en este trabajo. En este trabajo hemos encontrado una asociación positiva entre varios de los genes de virulencia analizados y ST95. Por ejemplo, papC o papEF, genes que además han sido a menudo asociados con pielonefritis (Vigil, Alteri, et al., 2011).Sin embargo, para sfa/focDE, que codifica para una fimbria asociada con pielonefritis, obtuvimos RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 una correlación negativa (p< 0,001)(Tarchouna et al., 2013). Por otra parte, el gen Iss, que codifica para una proteína de resistencia al sistema del complemento que consigue aumentar la supervivencia sérica, también se asoció significativamente con ST95 (p< 0,001)(Nolan et al., 2003). En el estudio realizado por Flament-Simon et al. (2020) analizaron la media de genes de virulencia detectados en cepas aisladas de infecciones extraintestinales pertenecientes a distintas secuencias tipo, encontrando que la media de las cepas ST95 era de las más elevadas. Esto podría explicar la exitosa expansión de ST95 pese a su gran sensibilidad a los distintos antibióticos. En cuanto a la determinación de los grupos filogenéticos, observamos que tanto si pertenecen al serogrupo O1 como O2, la inmensa mayoría de las cepas de ST95 se engloban en el grupo filogenético B2 (Tabla 15). Tabla 15. Análisis filogenético de las cepas pertenecientes a ST95 (Lugo, 2020-2022). Número (%) de cepas E.coli Grupo filogenético Total ST95 (n=24) O1ST95 (n=13) O2-ST95 (n=11) A 0 0 0 B1 0 0 0 B2 21 (87,5) 11 (84,6) 10 (90,9) C 0 0 0 D 0 0 0 E 0 0 0 F 2 (8,3) 1 (7,7) 1 (9,1) U 1 (4,2) 1 (7,7) 0 En general, una gran parte de las cepas de ST95 pertenecen al grupo filogenético B2, al igual que la mayoría de aislados de E. coli responsables de patologías extraintestinales, como han demostrado diversos estudios (Flament-Simon et al., 2020; Gordon et al., 2017a; Xia et al., 2022). Esta relación se ve reflejada en nuestros resultados, donde 21 de las 24 cepas ST95 pertenecen al grupo filogenético B2; seguido de lejos del filogrupo F, también a menudo asociado con ExPEC. Tras realizar la PCR descrita por Gordon et al. (2017a) para clasificar los distintos aislados del complejo clonal ST95 dentro de distintos subgrupos obtuvimos los resultados mostrados en la Tabla 16. Observamos que la mayoría de las cepas ST95 del serogrupo O1 pertenecían a los subgrupos A, C y D, mientras que la mayoría de las cepas del serogrupo O2 se englobaban en el subgrupo E, estando estadísticamente asociado el subgrupo D a las cepas O1 y el subgrupo E a las cepas O2. Nuestros resultados están en la línea de los obtenidos en estudios previos (Gordon et al., 2017a). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37 Tabla 16. Distribución de las cepas de ST95 en los distintos subgrupos Complejo clonal 95, subgrupos Número (%) de cepas E.coli ST95 (n=24) O1-ST95 (n=13) O2-ST95 (n=11) p-valor Subgrupo A 5 (20,8) 4 (30,8) 1 (9,1) Subgrupo B 0 0 0 Subgrupo C* 7 (29,2) 5 (38,5) 2 (18,2) Subgrupo D* 7 (29,2) 7 (53,8) 0 0,0059 Subgrupo E 8 (33,3) 0 8 (72,7) 0,0002 *tres de las cepas ST95 fueron positivos tanto para el subgrupo C como D Con el fin de conocer mejor la estructura clonal de las cepas ST95 realizamos la secuenciación del alelo fimH de las cepas positivas para el gen svg (Gordon et al., 2017a): • Nuestras cinco cepas pertenecientes al subgrupo A presentaron fimH41, variante alélica típicamente asociada a ese subgrupo. • Cuatro de las siete cepas asignadas al subgrupo C presentaron la variante alélica típica correspondiente, fimH27. De las tres cepas restantes de este subgrupo, dos, también positivas para el gen gpD, presentaron el fimH30 típica del subgrupo D. Por último, una única cepa presentó la secuencia fimH3251 no descrita anteriormente como representativa de este subgrupo. • De las siete cepas positivas para el subgrupo D, cinco presentaron el fimH30 característico dicho grupo. Una de ellas, que presentó tanto el gen gpC como gpD en la PCR, exhibió el gen fimH27 relacionado con el subgrupo C. • Del subgrupo E tres de las ocho cepas mostraron el fimH27 característico del grupo y un total de cuatro el fimH2431, no calificado como peculiar de este subgrupo. El restante presentó el fimH32. A la vista de estos resultados realizamos un árbol UPGMA seleccionando una cepa representante de cada alel fimH (Ilustración 2). Con este método se agrupan las secuencias con menor distancia filogenética. Ilustración 2. Distribución de los alelos fimH de 23 cepas ST95. Este árbol fue realizado en MEGA 11. Método estadístico UPGMA (método Bootstrap). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 38 Atendiendo a la abundancia relativa de estos subgrupos en colecciones de aislados ST95 provenientes de hemocultivos de Australia y Francia, observamos que efectivamente la distribución de los subgrupos difiere geográficamente (Gordon et al., 2017a). En nuestro estudio 17 (70,8) de las 24 cepas ST95 de los serogrupos O1 y O2 presentaron el estatus APEC pudiendo por lo tanto un posible potencial zoonótico. Recientemente, varios estudios epidemiológicos han dado como resultado informes de que la E. coli uropatógena puede transmitirse a través de productos alimenticios contaminados(J. R. Johnson, Delavari, et al., 2005; T. J. Johnson et al., 2009; Manges et al., 2015). Al igual que los patógenos entéricos de E. coli, las cepas ExPEC también pueden colonizar el intestino antes de causar enfermedades como ITU y BSI (Riley, 2014a). Durante mucho tiempo ha existido especulación sobre el origen alimentario de las cepas patógenas extraintestinales de E. coli. Aunque se ha asumido ampliamente que la mayoría de las cepas de APEC no poseen potencial zoonótico, estudios recientes sugieren los APEC (particularmente los aislados que pertenecen a los tipos de secuencia ST95 y ST131 o a los serogrupos O1, O2 y O18 como posibles patógenos zoonóticos transmitidos por los alimentos, así como un reservorio de infecciones extraintestinales en humanos (Bélanger et al., 2011; Liu et al., 2018; Markland et al., 2015; Mellata, 2013). En particular, APEC comparte similitud genética tanto como con UPEC como con NMEC y posee genes de virulencia que definen a estos dos patotipos con la capacidad de causar infecciones del tracto urinario (ITU) y meningitis en modelos de ratones y ratas (Mellata, 2013; Tivendale et al., 2010). Además, la detección de plásmidos colicina V específicos de APEC en aislados de ExPEC humanos sugiere una posible transmisión zoonótica de APEC de aves de corral a humanos (Liu et al., 2018; Tivendale et al., 2010). Si bien existen datos que apoyan la idea de que dichas cepas pueden representar una amenaza para la salud humana y animal, se requiere más trabajo para determinar el verdadero potencial zoonótico de estas cepas (T. J. Johnson, Wannemuehler, Johnson, et al., 2008). CONCLUSIONES 39 9. CONCLUSIONES 1. Los serogrupos O1 y O2 se encuentran entre los TOP5 más frecuentes entre las cepas de E. coli bacteriémicos de nuestra área sanitaria, estando por lo tanto totalmente justificada su inclusión en una vacuna contra las cepas ExPEC. 2. El éxito de las cepas de estos dos serogrupos posiblemente es debido al gran arsenal de genes de virulencia a poseen, presentando la gran mayoría los estatus ExPEC y UPEC. 3. Al ser la mayoría susceptibles a numerosos antimicrobianos se descarta que la resistencia a los antibióticos contribuya a su éxito expansivo. 4. La secuencia tipo ST95 asociada con el grupo filogenético B2 es la más extendida en nuestro estudio como ocurre a nivel mundial. 5. Dentro de las cepas ST95 se observa una amplia variedad clones asociados con diferentes alelos fimH, estando asociado el subgrupo genético D con las cepas del serogrupo O1 y el subgrupo genético E con las cepas del serogrupo O2. 6. Es posible que algunas de las cepas ST95 de los serogrupos O1 y O2 con el estatus APEC posean potencial zoonótico. BIBLIOGRAFÍA 40 10. BIBLIOGRAFÍA Adams-Sapper, S., Diep, B. A., PerdreauRemington, F., & Riley, L. W. (2013). Clonal composition and community clustering of drug-susceptible and -resistant Escherichia coli isolates from bloodstream infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57(1), 490–497. https://doi.org/10.1128/AAC.01025-12 Balado Dacosta, Miguel. (2009). Caracterización de un nuevo sistema de asimilación de hierro mediante sideróforos en “Vibrio anguillarum.” https://minerva.usc.es/xmlui/handle/10347/ 2575 Banerjee, R., Johnston, B., Lohse, C., Chattopadhyay, S., Tchesnokova, V., Sokurenko, E. V., & Johnson, J. R. (2013). The clonal distribution and diversity of extraintestinal Escherichia coli isolates vary according to patient characteristics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57(12), 5912–5917. https://doi.org/10.1128/AAC.01065-13 Barnich, N., & Darfeuille-Michaud, A. (2007). Adherent-invasive Escherichia coli and Crohn’s disease. Current Opinion in Gastroenterology, 23(1), 16–20. https://doi.org/10.1097/MOG.0B013E32801 05A38 Beghain, J., Bridier-Nahmias, A., Nagard, H. Le, Denamur, E., & Clermont, O. (2018). ClermonTyping: an easy-to-use and accurate in silico method for Escherichia genus strain phylotyping. Microbial Genomics, 4(7). https://doi.org/10.1099/MGEN.0.000192 Bélanger, L., Garenaux, A., Harel, J., Boulianne, M., Nadeau, E., & Dozois, C. M. (2011). Escherichia coli from animal reservoirs as a potential source of human extraintestinal pathogenic E. coli. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 62(1), 1–10. https://doi.org/10.1111/J.1574695X.2011.00797.X Ben Zakour, N. L., Alsheikh-Hussain, A. S., Ashcroft, M. M., Khanh Nhu, N. T., Roberts, L. W., Stanton-Cook, M., Schembri, M. A., & Beatsona, S. A. (2016). Sequential Acquisition of Virulence and Fluoroquinolone Resistance Has Shaped the Evolution of Escherichia coli ST131. MBio, 7(2). https://doi.org/10.1128/MBIO.00347-16 Bidet, P., Mahjoub-Messai, F., Blanco, J., Blanco, J., Dehem, M., Aujard, Y., Bingen, E., & Bonacorsi, S. (2007). Combined multilocus sequence typing and O serogrouping distinguishes Escherichia coli subtypes associated with infant urosepsis and/or meningitis. The Journal of Infectious Diseases, 196(2), 297–303. https://doi.org/10.1086/518897 Blanco, J., Blanco, J. E., Alonso, M. P., Blanco, M., Garabal, J. I., Gonzalez, E. A., Blanco, J., Blanco, J. E., Alonso, M. P., Blanco, M., Garabal, J. I., & Gonzalez, E. A. (1992). FACTORES DE VIRULENCIA DE ESCHERICHIA COLI CAUSANTES DE PERITONITIS, APENDICITIS Y OTRAS INFECCIONES EXTRAINTESTINALES. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica, 10(7), 393–398. Blanco, M., Blanco, J. E., Alonso, M. P., & Blanco, J. (1996). Virulence factors and O groups of Escherichia coli isolates from patients with acute pyelonephritis, cystitis and asymptomatic bacteriuria. European Journal of Epidemiology, 12(2), 191–198. https://doi.org/10.1007/BF00145506 Blanco, M., Blanco, J. E., Alonso, M. P., Mora, A., Balsalobre, C., Muñoa, F., Juárez, A., & Blanco, J. (1997). Detection of pap, sfa and afa adhesin-encoding operons in uropathogenic Escherichia coli strains: BIBLIOGRAFÍA 41 Relationship with expression of adhesins and production of toxins. Research in Microbiology, 148(9), 745–755. https://doi.org/10.1016/S09232508(97)82450-3 Blum-Oehler, G., Heesemann, J., Kranzfelder, D., Scheutz, F., & Hacker, J. (1997). Characterization of Escherichia coli serotype O12:K1:H7 isolates from an immunocompetent carrier with a history of spontaneous abortion and septicemia. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases : Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology, 16(2), 153–155. https://doi.org/10.1007/BF01709475 Bonacorsi, S., Clermont, O., Houdouin, V., Cordevant, C., Brahimi, N., Marecat, A., Tinsley, C., Nassif, X., Lange, M., & Bingen, E. (2003). Molecular analysis and experimental virulence of French and North American Escherichia coli neonatal meningitis isolates: identification of a new virulent clone. The Journal of Infectious Diseases, 187(12), 1895–1906. https://doi.org/10.1086/375347 Bundy, L. M., Rajnik, M., & Noor, A. (2023). Neonatal Meningitis. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53 2264/ Chaudhuri, R. R., & Henderson, I. R. (2012). The evolution of the Escherichia coli phylogeny. Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 12(2), 214– 226. https://doi.org/10.1016/J.MEEGID.2012.01.0 05 Clermont, O., Bonacorsi, S., & Bingen, E. (2000a). Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Applied and Environmental Microbiology, 66(10), 4555–4558. https://doi.org/10.1128/AEM.66.10.45554558.2000 Clermont, O., Bonacorsi, S., & Bingen, E. (2000b). Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Applied and Environmental Microbiology, 66(10), 4555–4558. https://doi.org/10.1128/AEM.66.10.45554558.2000 Clermont, O., Christenson, J. K., Denamur, E., & Gordon, D. M. (2013a). The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited: improvement of specificity and detection of new phylo-groups. Environmental Microbiology Reports, 5(1), 58–65. https://doi.org/10.1111/17582229.12019 Clermont, O., Christenson, J. K., Denamur, E., & Gordon, D. M. (2013b). The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited: Improvement of specificity and detection of new phylo-groups. Environmental Microbiology Reports, 5(1), 58–65. https://doi.org/10.1111/17582229.12019 Clermont, O., Dixit, O. V. A., Vangchhia, B., Condamine, B., Dion, S., Bridier-Nahmias, A., Denamur, E., & Gordon, D. (2019). Characterization and rapid identification of phylogroup G in Escherichia coli, a lineage with high virulence and antibiotic resistance potential. Environmental Microbiology, 21(8), 3107–3117. https://doi.org/10.1111/1462-2920.14713 Clermont, O., Gordon, D. M., Brisse, S., Walk, S. T., & Denamur, E. (2011). Characterization of the cryptic Escherichia lineages: rapid identification and prevalence. Environmental Microbiology, 13(9), 2468–2477. https://doi.org/10.1111/J.14622920.2011.02519.X Clermont, O., Lescat, M., O’Brien, C. L., Gordon, D. M., Tenaillon, O., & Denamur, E. (2008). Evidence for a human-specific Escherichia coli clone. Environmental Microbiology, 10(4), 1000–1006. https://doi.org/10.1111/J.14622920.2007.01520.X BIBLIOGRAFÍA 48 de virulencia y de resistencia. http://hdl.handle.net/10347/13047 Manges, A. R., Geum, H. M., Guo, A., Edens, T. J., Fibke, C. D., & Pitout, J. D. D. (2019). Global Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli (ExPEC) Lineages. Clinical Microbiology Reviews, 32(3). https://doi.org/10.1128/CMR.00135-18 Manges, A. R., Harel, J., Masson, L., Edens, T. J., Portt, A., Reid-Smith, R. J., Zhanel, G. G., Kropinski, A. M., & Boerlin, P. (2015). Multilocus sequence typing and virulence gene profiles associated with Escherichia coli from human and animal sources. Foodborne Pathogens and Disease, 12(4), 302–310. https://doi.org/10.1089/FPD.2014.1860 Markland, S. M., Lestrange, K. J., Sharma, M., & Kniel, K. E. (2015). Old Friends in New Places: Exploring the Role of Extraintestinal E. coli in Intestinal Disease and Foodborne Illness. Zoonoses and Public Health, 62(7), 491–496. https://doi.org/10.1111/ZPH.12194 Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., & Hultgren, S. J. (2000). Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal, 19(12), 2803–2812. https://doi.org/10.1093/EMBOJ/19.12.2803 Martinez-Medina, M., Mora, A., Blanco, M., López, C., Alonso, M. P., Bonacorsi, S., NicolasChanoine, M. H., Darfeuille-Michaud, A., Garcia-Gil, J., & Blanco, J. (2009). Similarity and Divergence among Adherent-Invasive Escherichia coli and Extraintestinal Pathogenic E. coli Strains. Journal of Clinical Microbiology, 47(12), 3968. https://doi.org/10.1128/JCM.01484-09 Massella, E., Reid, C. J., Cummins, M. L., Anantanawat, K., Zingali, T., Serraino, A., Piva, S., Giacometti, F., & Djordjevic, S. P. (2020). Snapshot Study of Whole Genome Sequences of Escherichia coli from Healthy Companion Animals, Livestock, Wildlife, Humans and Food in Italy. Antibiotics (Basel, Switzerland), 9(11), 1–22. https://doi.org/10.3390/ANTIBIOTICS911078 2 Matsumoto, T., Mikamo, H., Ohge, H., Yanagihara, K., Weerdenburg, E., Go, O., Spiessens, B., van Geet, G., van den Hoven, T., Momose, A., Hagiwara, Y., Nakayama, Y., Poolman, J., Geurtsen, J., & Kaku, M. (2022). Distribution of extraintestinal pathogenic Escherichia coli O-serotypes and antibiotic resistance in blood isolates collected from patients in a surveillance study in Japan. Journal of Infection and Chemotherapy : Official Journal of the Japan Society of Chemotherapy, 28(11), 1445–1451. https://doi.org/10.1016/J.JIAC.2022.07.001 McNally, A., Oren, Y., Kelly, D., Pascoe, B., Dunn, S., Sreecharan, T., Vehkala, M., Välimäki, N., Prentice, M. B., Ashour, A., Avram, O., Pupko, T., Dobrindt, U., Literak, I., Guenther, S., Schaufler, K., Wieler, L. H., Zhiyong, Z., Sheppard, S. K., … Corander, J. (2016). Combined Analysis of Variation in Core, Accessory and Regulatory Genome Regions Provides a Super-Resolution View into the Evolution of Bacterial Populations. PLoS Genetics, 12(9). https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PGEN.100 6280 Mellata, M. (2013). Human and avian extraintestinal pathogenic Escherichia coli: infections, zoonotic risks, and antibiotic resistance trends. Foodborne Pathogens and Disease, 10(11), 916–932. https://doi.org/10.1089/FPD.2013.1533 Méric, G., Hitchings, M. D., Pascoe, B., & Sheppard, S. K. (2016). From Escherich to the Escherichia coli genome. The Lancet. Infectious Diseases, 16(6), 634–636. https://doi.org/10.1016/S14733099(16)30066-4 Methods in Microbiology - Google Libros. (n.d.). Retrieved June 15, 2024, from https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id =xQv3AD4sOXAC&oi=fnd&pg=PP1&ots=Sz8wtDPWQ&sig=04VMBK1WkylCyA_Z8RGvSj H7aTk&redir_esc=y#v=onepage&q&f=false BIBLIOGRAFÍA 49 Microbiología Parasitología Bacteriología, de. (n.d.). Programa académico de la asignatura Manuales Departamentales. Morales, C., Lee, M. D., Hofacre, C., & Maurer, J. J. (2004). Detection of a Novel Virulence Gene and a Salmonella Virulence Homologue Among Escherichia coli Isolated from Broiler Chickens. Https://Home.Liebertpub.Com/Fpd, 1(3), 160–165. https://doi.org/10.1089/FPD.2004.1.160 Moran, R. A., & Hall, R. M. (2018). Evolution of Regions Containing Antibiotic Resistance Genes in FII-2-FIB-1 ColV-Colla Virulence Plasmids. Microbial Drug Resistance (Larchmont, N.Y.), 24(4), 411–421. https://doi.org/10.1089/MDR.2017.0177 Moriel, D. G., Tan, L., Goh, K. G. K., Phan, M.-D., Ipe, D. S., Lo, A. W., Peters, K. M., Ulett, G. C., Beatson, S. A., & Schembri, M. A. (2016). A Novel Protective Vaccine Antigen from the Core Escherichia coli Genome. MSphere, 1(6). https://doi.org/10.1128/MSPHERE.00326-16 Moulin-Schouleur, M., Schouler, C., Tailliez, P., Kao, M. R., Brée, A., Germon, P., Oswald, E., Mainil, J., Blanco, M., & Blanco, J. (2006). Common virulence factors and genetic relationships between O18:K1:H7 Escherichia coli isolates of human and avian origin. Journal of Clinical Microbiology, 44(10), 3484–3492. https://doi.org/10.1128/JCM.0054806/ASSET/F46B4A3D-0775-4061-8EAECD9BFC30C647/ASSETS/GRAPHIC/ZJM01006 67760003.JPEG Mulvey, M. A. (2002). Adhesion and entry of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology, 4(5), 257–271. https://doi.org/10.1046/J.14625822.2002.00193.X Nielsen, K. L., Dynesen, P., Larsen, P., & FrimodtMøller, N. (2014). Faecal Escherichia coli from patients with E. coli urinary tract infection and healthy controls who have never had a urinary tract infection. Journal of Medical Microbiology, 63(Pt 4), 582–589. https://doi.org/10.1099/JMM.0.068783-0 Nogueira, T., Rankin, D. J., Touchon, M., Taddei, F., Brown, S. P., & Rocha, E. P. C. (2009). Horizontal gene transfer of the secretome drives the evolution of bacterial cooperation and virulence. Current Biology : CB, 19(20), 1683–1691. https://doi.org/10.1016/J.CUB.2009.08.056 Nolan, L. K., Horne, S. M., Giddings, C. W., Foley, S. L., Johnson, T. J., Lynne, A. M., & Skyberg, J. (2003). Resistance to serum complement, iss, and virulence of avian Escherichia coli. Veterinary Research Communications, 27(2), 101–110. https://doi.org/10.1023/A:1022854902700 Nowicki, B., Selvarangan, R., & Nowicki, S. (2001). Family of Escherichia coli Dr adhesins: decayaccelerating factor receptor recognition and invasiveness. The Journal of Infectious Diseases, 183 Suppl 1, S24–S27. https://doi.org/10.1086/318846 Nowrouzian, F., Adlerberth, I., & Wold, A. E. (2001). P fimbriae, capsule and aerobactin characterize colonic resident Escherichia coli. Epidemiology and Infection, 126(1), 11–18. https://doi.org/10.1017/S095026880100511 8 Nowrouzian, F., Hesselmar, B., Saalman, R., Strannegård, I. L., Åberg, N., Wold, A. E., & Adlerberth, I. (2003). Escherichia coli in infants’ intestinal microflora: colonization rate, strain turnover, and virulence gene carriage. Pediatric Research, 54(1), 8–14. https://doi.org/10.1203/01.PDR.0000069843 .20655.EE Olesen, B., Kolmos, H. J., Ørskov, F., & Ørskov, I. (1995). A comparative study of nosocomial and community-acquired strains of Escherichia coli causing bacteraemia in a Danish University Hospital. Journal of Hospital Infection, 31(4), 295–304. https://doi.org/10.1016/01956701(95)90208-2 BIBLIOGRAFÍA 50 Orskov, F., & Orskov, I. (2011a). Escherichia coli serotyping and disease in man and animals. Https://Doi.Org/10.1139/M92-115, 38(7), 699–704. https://doi.org/10.1139/M92-115 Orskov, F., & Orskov, I. (2011b). Escherichia coli serotyping and disease in man and animals. Https://Doi.Org/10.1139/M92-115, 38(7), 699–704. https://doi.org/10.1139/M92-115 Ørskov, I., & Ørskov, F. (1985). Escherichia coli in extra-intestinal infections. The Journal of Hygiene, 95(3), 551. https://doi.org/10.1017/S002217240006067 8 Orskov, I., Orskov, F., Jann, B., & Jann, K. (1977). Serology, chemistry, and genetics of O and K antigens of Escherichia coli. Bacteriological Reviews, 41(3), 667. https://doi.org/10.1128/BR.41.3.667710.1977 Peigne, C., Bidet, P., Mahjoub-Messai, F., Plainvert, C., Barbe, V., Médigue, C., Frapy, E., Nassif, X., Denamur, E., Bingen, E., & Bonacorsi, S. (2009). The plasmid of Escherichia coli strain S88 (O45:K1:H7) that causes neonatal meningitis is closely related to avian pathogenic E. coli plasmids and is associated with high-level bacteremia in a neonatal rat meningitis model. Infection and Immunity, 77(6), 2272–2284. https://doi.org/10.1128/IAI.01333-08 Petty, N. K., Zakour, N. L. B., Stanton-Cook, M., Skippington, E., Totsika, M., Forde, B. M., Phan, M. D., Moriel, D. G., Peters, K. M., Davies, M., Rogers, B. A., Dougan, G., Rodriguez-Baño, J., Pascual, A., Pitout, J. D. D., Upton, M., Paterson, D. L., Walsh, T. R., Schembri, M. A., & Beatson, S. A. (2014). Global dissemination of a multidrug resistant Escherichia coli clone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(15), 5694–5699. https://doi.org/10.1073/PNAS.1322678111/- /DCSUPPLEMENTAL/SD02.XLSX Picard, B., Garcia, J. S., Gouriou, S., Duriez, P., Brahimi, N., Bingen, E., Elion, J., & Denamur, E. (1999). The link between phylogeny and virulence in Escherichia coli extraintestinal infection. Infection and Immunity, 67(2), 546–553. https://doi.org/10.1128/IAI.67.2.546553.1999 Pons Ximénez, J. Ignacio., Juárez Giménez, A., & Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia. (2006). Familia de proteínas Hha/YmoA: estudios estructurales y papel regulador en “Y. enterocolitica”, La. Tesis Doctorals - Departament - Microbiologia. https://diposit.ub.edu/dspace/handle/2445/ 42400 Poolman, J. T., & Anderson, A. S. (2018). Escherichia coli and Staphylococcus aureus: leading bacterial pathogens of healthcare associated infections and bacteremia in older-age populations. Expert Review of Vaccines, 17(7), 607–618. https://doi.org/10.1080/14760584.2018.148 8590 Prats, G., Navarro, F., Mirelis, B., Dalmau, D., Margall, N., Coll, P., Stell, A., & Johnson, J. R. (2000). Escherichia coli Serotype O15:K52:H1 as a Uropathogenic Clone. Journal of Clinical Microbiology, 38(1), 201. https://doi.org/10.1128/JCM.38.1.201209.2000 Raetz, C. R. H., & Whitfield, C. (2002). Lipopolysaccharide endotoxins. Annual Review of Biochemistry, 71, 635–700. https://doi.org/10.1146/ANNUREV.BIOCHE M.71.110601.135414 Rasko, D. A., Rosovitz, M. J., Myers, G. S. A., Mongodin, E. F., Fricke, W. F., Gajer, P., Crabtree, J., Sebaihia, M., Thomson, N. R., Chaudhuri, R., Henderson, I. R., Sperandio, V., & Ravel, J. (2008). The pangenome structure of Escherichia coli: comparative genomic analysis of E. coli commensal and pathogenic isolates. Journal of Bacteriology, 190(20), 6881–6893. https://doi.org/10.1128/JB.00619-08 BIBLIOGRAFÍA 51 Rhee, C., Kadri, S. S., Dekker, J. P., Danner, R. L., Chen, H. C., Fram, D., Zhang, F., Wang, R., & Klompas, M. (2020). Prevalence of AntibioticResistant Pathogens in Culture-Proven Sepsis and Outcomes Associated With Inadequate and Broad-Spectrum Empiric Antibiotic Use. JAMA Network Open, 3(4), e202899. https://doi.org/10.1001/JAMANETWORKOPE N.2020.2899 Riley, L. W. (2014a). Pandemic lineages of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology and Infection : The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 20(5), 380–390. https://doi.org/10.1111/1469-0691.12646 Riley, L. W. (2014b). Pandemic lineages of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology and Infection : The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 20(5), 380–390. https://doi.org/10.1111/1469-0691.12646 Roberts, I. S. (1996). The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annual Review of Microbiology, 50, 285–315. https://doi.org/10.1146/ANNUREV.MICRO.5 0.1.285 Rogers, B. A., Sidjabat, H. E., & Paterson, D. L. (2011). Escherichia coli O25b-ST131: a pandemic, multiresistant, communityassociated strain. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 66(1), 1–14. https://doi.org/10.1093/JAC/DKQ415 Romero, S., Carlos, H. /, & Iregui, A. (2010). El Lipopolisacárido. Revista de Medicina Veterinaria, ISSN 0122-9354, No. 19, 2010, Págs. 37-45, 19, 37–45. https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?c odigo=4943924&info=resumen&idioma=EN G Rouli, L., Merhej, V., Fournier, P. E., & Raoult, D. (2015). The bacterial pangenome as a new tool for analysing pathogenic bacteria. New Microbes and New Infections, 7, 72–85. https://doi.org/10.1016/J.NMNI.2015.06.005 Royer, G., Clermont, O., Condamine, B., MercierDarty, M. D. S., Laouénan, C., Lefort, A., Denamur, E., De Lastours, V., Wolff, M., Alavoine, L., Duval, X., Skurnik, D., Woerther, P. L., Andremont, A., Carbonnelle, E., Lortholary, O., Nassif, X., Abgrall, S., Jaureguy, F., … Basse, B. (2022). O-Antigen Targeted Vaccines Against Escherichia coli May Be Useful in Reducing Morbidity, Mortality, and Antimicrobial Resistance. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 74(2), 364–366. https://doi.org/10.1093/CID/CIAB458 Russo, T. A., & Johnson, J. R. (2003). Medical and economic impact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: Focus on an increasingly important endemic problem. Microbes and Infection, 5(5), 449–456. https://doi.org/10.1016/S12864579(03)00049-2 Sarkar, S., Ulett, G. C., Totsika, M., Phan, M. D., & Schembri, M. A. (2014). Role of capsule and O antigen in the virulence of uropathogenic Escherichia coli. PloS One, 9(4). https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.009 4786 Scaletsky, I. C. A., Fabbricotti, S. H., Carvalho, R. L. B., Nunes, C. R., Maranhão, H. S., Morais, M. B., & Fagundes-Neto, U. (2002). Diffusely adherent Escherichia coli as a cause of acute diarrhea in young children in Northeast Brazil: a case-control study. Journal of Clinical Microbiology, 40(2), 645–648. https://doi.org/10.1128/JCM.40.2.645648.2002 Schilling, J. D., Mulvey, M. A., & Hultgren, S. J. (2001). Structure and function of Escherichia coli type 1 pili: new insight into the pathogenesis of urinary tract infections. The Journal of Infectious Diseases, 183 Suppl 1(SUPPL. 1). https://doi.org/10.1086/318855 BIBLIOGRAFÍA 52 Smith, J. L., Fratamico, P. M., & Gunther, N. W. (2007). Extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Foodborne Pathogens and Disease, 4(2), 134–163. https://doi.org/10.1089/FPD.2007.0087 Smithson Amat, Alejandro., Vila Estapé, J., Lozano Soto, F., & Universitat de Barcelona. Departament de Medicina. (2009). Factores dependientes del microorganismo y del huésped en la patogenia de las infecciones urinarias. Tesis Doctorals - Departament - Medicina. https://diposit.ub.edu/dspace/handle/2445/ 42270 Spurbeck, R. R., Dinh, P. C., Walk, S. T., Stapleton, A. E., Hooton, T. M., Nolan, L. K., Kim, K. S., Johnson, J. R., & Mobley, H. L. T. (2012). Escherichia coli Isolates That Carry vat, fyuA, chuA, and yfcV Efficiently Colonize the Urinary Tract. Infection and Immunity, 80(12), 4115. https://doi.org/10.1128/IAI.00752-12 Spurbeck, R. R., Stapleton, A. E., Johnson, J. R., Walk, S. T., Hooton, T. M., & Mobley, H. L. T. (2011). Fimbrial Profiles Predict Virulence of Uropathogenic Escherichia coli Strains: Contribution of Ygi and Yad Fimbriae. Infection and Immunity, 79(12), 4753. https://doi.org/10.1128/IAI.05621-11 Stenutz, R., Weintraub, A., & Widmalm, G. (2006). The structures of Escherichia coli Opolysaccharide antigens. FEMS Microbiology Reviews, 30(3), 382–403. https://doi.org/10.1111/J.15746976.2006.00016.X Stephens, C. M., Adams-Sapper, S., Sekhon, M., Johnson, J. R., & Riley, L. W. (2017). Genomic Analysis of Factors Associated with Low Prevalence of Antibiotic Resistance in Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli Sequence Type 95 Strains. MSphere, 2(2). https://doi.org/10.1128/MSPHERE.00390-16 Stoesser, N., Sheppard, A. E., Pankhurst, L., de Maio, N., Moore, C. E., Sebra, R., Turner, P., Anson, L. W., Kasarskis, A., Batty, E. M., Kos, V., Wilson, D. J., Phetsouvanh, R., Wyllie, D., Sokurenko, E., Manges, A. R., Johnson, T. J., Price, L. B., Peto, T. E. A., … Crook, D. W. (2016). Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio, 7(2). https://doi.org/10.1128/MBIO.02162-15 Tarchouna, M., Ferjani, A., Ben-Selma, W., & Boukadida, J. (2013). Distribution of uropathogenic virulence genes in Escherichia coli isolated from patients with urinary tract infection. International Journal of Infectious Diseases, 17(6), e450–e453. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2013.01.025 Tenaillon, O., Skurnik, D., Picard, B., & Denamur, E. (2010a). The population genetics of commensal Escherichia coli. Nature Reviews. Microbiology, 8(3), 207–217. https://doi.org/10.1038/NRMICRO2298 Tenaillon, O., Skurnik, D., Picard, B., & Denamur, E. (2010b). The population genetics of commensal Escherichia coli. Nature Reviews. Microbiology, 8(3), 207–217. https://doi.org/10.1038/NRMICRO2298 Thompson, M. F., Litster, A. L., Platell, J. L., & Trott, D. J. (2011). Canine bacterial urinary tract infections: new developments in old pathogens. Veterinary Journal (London, England : 1997), 190(1), 22–27. https://doi.org/10.1016/J.TVJL.2010.11.013 Tivendale, K. A., Logue, C. M., Kariyawasam, S., Jordan, D., Hussein, A., Li, G., Wannemuehler, Y., & Nolan, L. K. (2010). Avian-pathogenic Escherichia coli strains are similar to neonatal meningitis E. coli strains and are able to cause meningitis in the rat model of human disease. Infection and Immunity, 78(8), 3412–3419. https://doi.org/10.1128/IAI.00347-10 Van Den Bosch, J. F., Postma, P., Koopman, P. A. R., Graaff, J., Maclaren, D. M., Van Brenk, D. G., & Guinée, P. A. M. (1982). Virulence of urinary and faecal Escherichia coli in relation to serotype, haemolysis and haemagglutination. The Journal of Hygiene, BIBLIOGRAFÍA 53 88(3), 567–577. https://doi.org/10.1017/S002217240007042 X Vigil, P. D., Alteri, C. J., & Mobley, H. L. T. (2011). Identification of In Vivo-Induced Antigens Including an RTX Family Exoprotein Required for Uropathogenic Escherichia coli Virulence. Infection and Immunity, 79(6), 2335. https://doi.org/10.1128/IAI.00110-11 Vigil, P. D., Stapleton, A. E., Johnson, J. R., Hooton, T. M., Hodges, A. P., He, Y., & Mobley, H. L. T. (2011). Presence of putative repeat-in-toxin gene tosA in Escherichia coli predicts successful colonization of the urinary tract. MBio, 2(3). https://doi.org/10.1128/MBIO.00066-11 Wang, L., Rothemund, D., Curd, H., & Reeves, P. R. (2003). Species-wide variation in the Escherichia coli flagellin (H-antigen) gene. Journal of Bacteriology, 185(9), 2936–2943. https://doi.org/10.1128/JB.185.9.29362943.2003 Wang, S., Zhao, S. Y., Xiao, S. Z., Gu, F. F., Liu, Q. Z., Tang, J., Guo, X. K., Ni, Y. X., & Han, L. Z. (2016). Antimicrobial Resistance and Molecular Epidemiology of Escherichia coli Causing Bloodstream Infections in Three Hospitals in Shanghai, China. PloS One, 11(1). https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.014 7740 Weerdenburg, E., Davies, T., Morrow, B., Zomer, A. L., Hermans, P., Go, O., Spiessens, B., Van Den Hoven, T., Van Geet, G., Aitabi, M., Debroy, C., Dudley, E. G., Bonten, M., Poolman, J., & Geurtsen, J. (2023). Global Distribution of O Serotypes and Antibiotic Resistance in Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli Collected From the Blood of Patients With Bacteremia Across Multiple Surveillance Studies. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 76(3), E1236–E1243. https://doi.org/10.1093/CID/CIAC421 Weissman, S. J., Johnson, J. R., Tchesnokova, V., Billig, M., Dykhuizen, D., Riddell, K., Rogers, P., Qin, X., Butler-Wu, S., Cookson, B. T., Fang, F. C., Scholes, D., Chattopadhyay, S., & Sokurenko, E. (2012). High-resolution twolocus clonal typing of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 78(5), 1353– 1360. https://doi.org/10.1128/AEM.0666311 Whitfield, C. (2006). Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annual Review of Biochemistry, 75, 39–68. https://doi.org/10.1146/ANNUREV.BIOCHE M.75.103004.142545 Whittam, T. S., Wolfe, M. L., & Wilson, R. A. (1989). Genetic relationships among Escherichia coli isolates causing urinary tract infections in humans and animals. Epidemiology and Infection, 102(1), 37–46. https://doi.org/10.1017/S095026880002966 6 Wiles, T. J., Kulesus, R. R., & Mulvey, M. A. (2008). Origins and virulence mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. Experimental and Molecular Pathology, 85(1), 11–19. https://doi.org/10.1016/J.YEXMP.2008.03.00 7 Wirth, T., Falush, D., Lan, R., Colles, F., Mensa, P., Wieler, L. H., Karch, H., Reeves, P. R., Maiden, M. C. J., Ochman, H., & Achtman, M. (2006). Sex and virulence in Escherichia coli: an evolutionary perspective. Molecular Microbiology, 60(5), 1136–1151. https://doi.org/10.1111/J.13652958.2006.05172.X Xia, F., Cheng, J., Jiang, M., Wang, Z., Wen, Z., Wang, M., Ren, J., & Zhuge, X. (2022). Genomics Analysis to Identify Multiple Genetic Determinants That Drive the Global Transmission of the Pandemic ST95 Lineage of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli (ExPEC). Pathogens, 11(12). https://doi.org/10.3390/PATHOGENS111214 89/S1 BIBLIOGRAFÍA 54 Yamaji, R., Rubin, J., Thys, E., Friedman, C. R., & Riley, L. W. (2018). Persistent Pandemic Lineages of Uropathogenic Escherichia coli in a College Community from 1999 to 2017. Journal of Clinical Microbiology, 56(4). https://doi.org/10.1128/JCM.01834-17 Yamamoto A-B, S., Terai, A., Yuri ’, K., Kurazono, H., Takeda B-D, Y., & Yoshida, O. (1995). Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 12(2), 85–90. https://doi.org/10.1111/J.1574695X.1995.TB00179.X Yu, D., Banting, G., & Neumann, N. F. (2021). A review of the taxonomy, genetics, and biology of the genus escherichia and the type species escherichia coli. Canadian Journal of Microbiology, 67(8), 553–571. https://doi.org/10.1139/CJM-20200508/ASSET/IMAGES/LARGE/CJM-20200508F2.JPEG ANEXO 55 11. ANEXO: CONTROLES POSITIVOS Todas las cepas utilizadas como control positivo han sido obtenidas de la colección del Laboratorio de Referencia de Escherichia coli de la USC. MÚLTIPLEX GRUPO FILOGENÉTICO • FV14067 • FV14087 • O157.807 • O157.1103 PCR GRUPO FILOGENÉTICO E • O157.807 • O157.1103 PCR GRUPO FILOGENÉTICO C • FV 19459 • FV19460 PCRS GENES DE VIRULENCIA • FV17090 (CV15A) • CV15D, FV17132 • FV17133 • FV17134 • FV17159. PCR ST95 • B2-CH38-15-ST95 • B2-CH38-18-ST1231 • B2-CH38-27-ST95 • B2-CH38-30-ST95 • B2-CH38-41-ST95 • B2-CH38-54-ST95 • B2-CH38-92-ST421)