Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del petrolero “Prestige”

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Veterinaria TESIS DOCTORAL Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del petrolero “Prestige” Percy Arturo Rodríguez Ledesma UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA ANÁLISIS TOXICOLÓGICO Y ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO DE LAS AVES MUERTAS POR LA CATÁSTROFE DEL PETROLERO “PRESTIGE” Trabajo original presentado para optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela Lugo 29 de mayo de 2013 Fdo. Percy Arturo Rodríguez Ledesma Los firmantes, directores de la presente memoria de investigación, autorizan su presentación en el organismo competente para su admisión previa a trámite de su lectura y defensa. Vº Bº de los directores Fdo. Ana M. Bravo del Moral A mis padres, Víctor y Mirian A mi hermana Carla A Lucía A Artur y a nuestro pequeñ@ que viene en camino Agradecimientos Quiero expresar mi más profundo agradecimiento en primer lugar a mis directores de tesis: Dra. Ana María Bravo, Dra. María Julia Melgar y Dr. Julián Alonso, por haber depositado su confianza en mí, por haberme guiado en este camino de la investigación con tanta dedicación, esfuerzo y sabiduría, mi más profundo reconocimiento, tanto profesional como humano. A la Dra. María Ángeles García, por sus valiosos consejos y su apoyo en la realización de esta tesis. A la Xunta de Galicia por brindar el apoyo económico en los proyectos XUGAPGIDIT03RF026101PR e INCITE08PXIB261087PR, que financiaron un contrato temporal para la realización de la presente tesis. Al Dr. José Luis Cascallana, por su colaboración en la realización de las necropsias de las aves y del análisis estadístico de los datos obtenidos en Anatomía Patológica. A la Dra. Nieves Muñoz por su asesoramiento y sus aportes al tratamiento estadístico. A Virginia Santamaría, por su colaboración en la realización de las necropsias de las aves. A Javier Balado, veterinario del Centro de recuperación de aves en Santa Cruz de Oleiros, A Coruña, por el envío de los cadáveres de las aves tras el vertido del Prestige. A la Dra. Mª José Díez Enrich, por la identificación de los parásitos digestivos. Al Dr. Lucas Moya, por el estudio y clasificación de las tinciones de Perls. Y para terminar, a todos los que de una u otra forma han contribuido al desarrollo de este trabajo. iv | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” III. MATERIAL Y MÉTODOS _________________________________ 53 1. ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO _________________________________ 55 Necropsia de las aves __________________________________________________ 55 1.1. Histopatología _______________________________________________________ 57 1.2. Estudio Histoquímico __________________________________________________ 58 1.3. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) _________________________________ 58 1.4. 2. DETERMINACIONES TOXICOLÓGICAS _____________________________ 59 Material y reactivos ___________________________________________________ 59 2.1. 2.1.1. Reactivos ________________________________________________________ 59 2.1.2. Equipos instrumentales _____________________________________________ 59 2.1.3. Muestras _________________________________________________________ 59 Métodos analíticos ____________________________________________________ 60 2.2. 2.2.1. Preparación de las muestras __________________________________________ 60 2.2.2. Digestión de las muestras por microondas _______________________________ 60 2.2.3. Determinación de los metales por ICP-MS ______________________________ 62 2.2.4. Control de calidad del método ________________________________________ 62 2.2.5. Evaluación de resultados ____________________________________________ 65 3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ___________________________________________ 65 Clasificación epidemiológica del presente estudio____________________________ 65 3.1. Tratamiento estadístico de los datos anatomopatológicos y toxicológicos _________ 66 3.2. Variables utilizadas en el análisis estadístico de los datos obtenidos _____________ 67 3.3. 3.3.1. Variables categóricas _______________________________________________ 67 3.3.2. Variables numéricas ________________________________________________ 67 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN-ANATOMÍA PATOLÓGICA ____ 71 1. INSPECCIÓN EXTERNA ____________________________________________ 73 Determinación de la especie y el sexo de las aves ____________________________ 73 1.1. Impregnación de las aves por petróleo _____________________________________ 74 1.2. 2. LESIONES OBSERVADAS EN LA INSPECCIÓN INTERNA _____________ 79 Lesiones observadas tras el desollado _____________________________________ 79 2.1. Lesiones en las cavidades corporales ______________________________________ 79 2.2. Lesiones en órganos internos ____________________________________________ 83 2.3. 2.3.1. Bazo ____________________________________________________________ 83 2.3.2. Hígado __________________________________________________________ 83 2.3.3. Aparato respiratorio ________________________________________________ 85 2.3.4. Aparato digestivo __________________________________________________ 86 Parasitación digestiva en las aves objeto de estudio __________________________ 93 2.4. Sistema urinario _____________________________________________________ 100 2.5. Sistema reproductivo _________________________________________________ 101 2.6. Sistema nervioso central _______________________________________________ 103 2.7. 3. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO ____________________________________ 104 Hemosiderosis ______________________________________________________ 104 3.1. Necrosis hepática y renal ______________________________________________ 108 3.2. Ausencia de lesiones digestivas específicas asociadas al fuel __________________ 112 3.3. Lesiones asociadas a la presencia de parásitos digestivos _____________________ 113 3.4. Otras parasitaciones __________________________________________________ 117 3.5. Otras lesiones no relacionadas con la intoxicación por fuel____________________ 118 3.6. Í N D I C E G E N E R A L | v V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN-TOXICOLOGÍA _____________ 121 1. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA CONCENTRACIÓN DE ELEMENTOS QUÍMICOS ESTUDIADOS EN FUEL Y EN AVES MARINAS ________________________________________________________ 123 Relación entre las concentraciones de elementos químicos determinadas en 1.1. fuel y en aves marinas ________________________________________________ 124 Relación entre las concentraciones de los elementos químicos determinadas 1.2. en hígado y riñón de aves marinas _______________________________________ 125 2. ELEMENTOS QUÍMICOS EVALUADOS _____________________________ 128 Micronutrientes _____________________________________________________ 128 2.1. 2.1.1. Cobalto _________________________________________________________ 128 2.1.2. Cobre __________________________________________________________ 128 2.1.3. Hierro __________________________________________________________ 129 2.1.4. Manganeso ______________________________________________________ 130 2.1.5. Selenio _________________________________________________________ 130 2.1.6. Zinc ___________________________________________________________ 130 Elementos tóxicos ___________________________________________________ 131 2.2. 2.2.1. Arsénico ________________________________________________________ 131 2.2.2. Plomo __________________________________________________________ 132 2.2.3. Cadmio _________________________________________________________ 134 2.2.4. Cromo __________________________________________________________ 135 2.2.5. Mercurio ________________________________________________________ 136 2.2.6. Vanadio ________________________________________________________ 137 3. CORRELACIONES ENTRE LOS ELEMENTOS QUÍMICOS ESTUDIADOS _____________________________________________________ 138 Correlaciones entre los metales pesados y metaloides estudiados en hígado_______ 138 3.1. Correlaciones entre los metales pesados y metaloides estudiados en riñón ________ 138 3.2. Correlaciones entre los metales pesados y metaloides estudiados en hígado y 3.3. riñón ______________________________________________________________ 139 4. NIVELES DE ELEMENTOS QUÍMICOS HALLADOS EN AVES MARINAS POR ESPECIES ___________________________________________________ 142 Alca común (Alca torda) ______________________________________________ 150 4.1. Arao común (Uria aalge) ______________________________________________ 151 4.2. Cormorán moñudo (Phalachrocorax aristotelis) ____________________________ 153 4.3. Alcatraz atlántico (Morus bassanus) _____________________________________ 154 4.4. Gaviota patiamarilla (Larus michahellis) __________________________________ 155 4.5. Frailecillo (Fratercula arctica) _________________________________________ 156 4.6. 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO EN AVES CON PRESENCIA Y AUSENCIA DE FUEL EN EL APARATO DIGESTIVO ________________________________ 157 6. ESTUDIO DE METALES PESADOS CON RESPECTO A LA FECHA DE RECOGIDA DE LAS AVES MARINAS _______________________________ 163 7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO SEGÚN EL SEXO DE LAS AVES MARINAS. _ 172 8. NIVELES DE ELEMENTOS INORGÁNICOS ESTUDIADOS EN AVES MARINAS Y SU RELACIÓN CON LA PRESENCIA Y AUSENCIA DE PARÁSITOS ______________________________________________________ 178 vi | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” 9. ANÁLISIS TOXICOLÓGICO EN RELACIÓN CON EL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO ______________________________________________ 184 Relación entre el estudio toxicológico y el estudio histopatológico en hígado. _____ 184 9.1. Relación entre el estudio toxicológico y el estudio histopatológico en riñón. ______ 192 9.2. VI. CONCLUSIONES ________________________________________ 199 VII. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________ 203 VIII. ANEXO ______________________________________________ 227 Í N D I C E D E F I G U R A S Y T A B L A S | vii INDICE DE FIGURAS Y TABLAS FIGURAS Figura 1. Infografía de la tragedia del Prestige ............................................................................. 3 Figura 2. Principales rutas de transporte de petróleo .................................................................... 5 Figura 3. Mapa de los vertidos de petróleo más importantes (1965-2002). .................................. 7 Figura 4. Vertidos de petróleo en el Atlántico Norte Europeo. ..................................................... 7 Figura 5. Gráfico temporal de aves recogidas en las costas gallegas. ......................................... 16 Figura 6. Alca común (Alca torda). ............................................................................................ 30 Figura 7. Arao común (Uria aalge). ........................................................................................... 32 Figura 8. Distribución del arao en la Península Ibérica .............................................................. 33 Figura 9. Dinámica poblacional del arao en Galicia ................................................................... 34 Figura 10. Cormorán moñudo (Phalacrocorax aristotelis). ........................................................ 35 Figura 11. Alcatraz atlántico (Morus bassanus). ........................................................................ 37 Figura 12. Gaviota patiamarilla (Larus michahellis). ................................................................. 39 Figura 13. Frailecillo atlántico (Fratercula arctica). .................................................................. 41 Figura 14. Aves marinas afectadas por el fuel del petrolero Prestige ......................................... 55 Figura 15. Inspección externa de un ave marina afectada por el petróleo .................................. 56 Figura 16. Equipo de Microondas ............................................................................................... 61 Figura 17. Espectrómetro ICP-MS .............................................................................................. 62 Figura 18. Impregnación de fuel en aves .................................................................................... 74 Figura 19. Relación entre especies estudiadas y el tipo de impregnación externa de fuel .................................................................................................................................. 75 Figura 20. Hemorragia subcutánea en alca común. ..................................................................... 76 Figura 21. Lesiones observadas tras el desollado........................................................................ 79 Figura 22. Condición corporal de las aves .................................................................................. 80 Figura 23. Aerosaculitis y perihepatitis en alca común ............................................................... 82 Figura 24. Aerosaculitis fibrinoso purulenta en un arao asociada a enteritis .............................. 82 Figura 25. Dos casos de esplenomegalia en gaviotas. ................................................................. 83 Figura 26. Coloración pálida del hígado ..................................................................................... 83 Figura 27. Hígado de arao con pseudomelanosis. ....................................................................... 84 Figura 28. Necrosis hepática en una gaviota. .............................................................................. 84 Figura 29. Alca común mostrando impregnación de petróleo .................................................... 85 Figura 30. Cuadro hemorrágico generalizado en gaviota ............................................................ 85 Figura 31. Aparato digestivo de aves marinas abierto longitudinalmente .................................. 86 Figura 32. Aparato digestivo de Alca torda mostrando la presencia de restos de petróleo ........................................................................................................................... 86 Figura 33. Aparato digestivo de gaviotas abierto longitudinalmente .......................................... 87 Figura 34. Aparato digestivo de alcas ......................................................................................... 87 Figura 35. Restos de fuel en todo el aparato ............................................................................... 88 Figura 36. Presencia o ausencia de fuel en el tubo digestivo según la especie ........................... 88 Figura 37. Relación entre la impregnación externa de fuel y el contenido de fuel en el aparato digestivo............................................................................................................. 91 Figura 38. Hemorragias difusas en el proventrículo y en la molleja ........................................... 92 Figura 39. Nematodosis intestinal ............................................................................................... 93 Figura 40. Nematodosis intestinal ............................................................................................... 94 Figura 41. Parasitosis intestinal por especie de ave .................................................................... 95 viii | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Figura 42. Ejemplares adultos de Contracaecum rudolphii ........................................................ 96 Figura 43. Rasgos morfológicos identificativos de Contracaecum sp ........................................ 96 Figura 44. Identificación ultraestructural de Contracaecum ....................................................... 97 Figura 45. Ciclo biológico de Contracaecum rudolphii .............................................................. 99 Figura 46. Lesiones macroscópicas del aparato urinario .......................................................... 101 Figura 47. Depósitos blanquecinos de uratos en ambos riñones en un arao. ............................ 101 Figura 48. Especies de aves divididas por sexos ....................................................................... 102 Figura 49. Cerebro y cerebelo de un alca .................................................................................. 103 Figura 50. Hemosiderosis esplénica en un alca ......................................................................... 104 Figura 51. Hemosiderosis hepática ........................................................................................... 105 Figura 52. Hemosiderosis renal ................................................................................................. 106 Figura 53. Necrosis hepática multifocal .................................................................................... 108 Figura 54. Necrosis hepática subcapsular en un alca ................................................................ 109 Figura 55. Necrosis tubular renal. ............................................................................................. 109 Figura 56. Gráfico de evolución de las lesiones histopatológicas ............................................. 111 Figura 57. Ausencia de lesiones específicas en tubo digestivo por la presencia de fuel. .......... 113 Figura 58. Larva juvenil de nematodo invadiendo la mucosa del proventrículo ...................... 114 Figura 59. Lesiones leves frente a la presencia de nematodos en el proventrículo ................... 114 Figura 60. Invasión del proventrículo por los nematodos ......................................................... 115 Figura 61. Bacterias asociadas a la parasitación digestiva por nematodos ............................... 115 Figura 62. Aspecto microscópico de las úlceras de proventrículo ............................................ 116 Figura 63. Parasitación digestiva por Tetrameres sp. ............................................................. 117 Figura 64. Trematodo marino Renicola roscovita. .................................................................... 117 Figura 65. Neumonía congestivo-hemorrágica por Aspergillus sp. .......................................... 118 Figura 66. Arteriosclerosis ........................................................................................................ 119 Figura 67. Esclerosis glomerular. .............................................................................................. 120 Figura 68. Enfermedad del músculo blanco .............................................................................. 120 Figura 69. Transformación de datos de As en hígado y riñón de aves marinas ........................ 124 Figura 70. Representación gráficas de las concentraciones de los elementos químicos en hígado y riñón de las aves respecto a la concentración en fuel ............................... 126 Figura 71. Representaciones gráficas de los niveles de los elementos químicos estudiados en aves marinas ........................................................................................... 147 Figura 72. Representaciones gráficas de los niveles de los elementos químicos estudiados en aves marinas con presencia y ausencia de fuel en aparato digestivo ....................................................................................................................... 159 Figura 73. Representaciones gráficas de las concentraciones medias de los elementos químicos estudiados por quincenas .............................................................................. 167 Figura 74. Representaciones gráficas de las concentraciones medias de los elementos estudiados en aves marinas de acuerdo con el sexo. .................................................... 174 Figura 75. Representaciones gráficas de los niveles de elementos químicos con respecto a la presencia o ausencia de parásitos ............................................................ 180 Figura 76. Representaciones gráficas de medias de las concentraciones de elementos químicos en relación con la presencia o ausencia de necrosis hepática ....................... 186 Figura 77. Representaciones gráficas de las concentraciones medias de elementos químicos estudiados respecto a de tinción de Perls en hígado. .................................... 190 Figura 78. Representaciones gráficas de medias de las concentraciones de elementos químicos en presencia o ausencia de necrosis tubular renal ......................................... 194 Í N D I C E D E F I G U R A S Y T A B L A S | ix TABLAS Tabla 1. Vertidos de petróleo más importantes en el período 1967-2010. .................................... 6 Tabla 2. Especies de aves marinas afectadas por el vertido del Prestige. ................................... 17 Tabla 3. Muestras de especies y órganos para el análisis toxicológico. ...................................... 60 Tabla 4. Protocolo de proceso de digestión por microondas. ...................................................... 61 Tabla 5. Límites de detección de los elementos químicos estudiados ........................................ 63 Tabla 6. Nivel mínimo detectado de los elementos químicos evaluados .................................... 63 Tabla 7. Coeficiente de variación (%) ......................................................................................... 64 Tabla 8. Control de calidad del método ...................................................................................... 64 Tabla 9. Variables utilizadas para el análisis estadístico ............................................................. 68 Tabla 10. Especies y sexo de las aves marinas analizadas. ......................................................... 73 Tabla 11. Presencia y grado de hemosiderosis observada en hígado y riñón según la especie. ......................................................................................................................... 106 Tabla 12. Estudio de las aves petroleadas con necrosis hepática y tinción de Perls positiva en hígado y riñón. ........................................................................................... 110 Tabla 13. Concentración de elementos químicos en el fuel del Prestige. ................................. 123 Tabla 14. Parámetros estadísticos de los elementos químicos analizados en hígado y riñón de aves marinas. .................................................................................................. 123 Tabla 15. Prueba de t-student de una sola muestra para la comparación de los niveles de los elementos químicos obtenidos en fuel, y en hígado y riñón .............................. 125 Tabla 16. Comparación de las concentraciones de elementos químicos en hígado y riñón de un mismo individuo ........................................................................................ 125 Tabla 17. Correlaciones entre las concentraciones de los elementos químicos analizados en hígado .................................................................................................... 138 Tabla 18. Correlaciones entre las concentraciones de los elementos químicos analizados en riñón ....................................................................................................... 139 Tabla 19. Correlaciones entre las concentraciones de los elementos químicos analizados en hígado y riñón ....................................................................................... 139 Tabla 20. Tabla de contingencia entre especie y sexo de las aves. ........................................... 142 Tabla 21. Tabla de contingencia entre especies divididas en cuatro categorías y el sexo de las aves marinas. ...................................................................................................... 142 Tabla 22. Concentraciones y parámetros estadísticos de los oligoelementos químicos estudiados en hígado y riñón ........................................................................................ 143 Tabla 23. Concentraciones y parámetros estadísticos de los elementos químicos tóxicos estudiados en hígado y riñón............................................................................ 144 Tabla 24. Comparación de las concentraciones y parámetros estadísticos de los elementos químicos por especie ................................................................................... 145 Tabla 25. Especies de aves marinas afectadas por el petrolero Prestige, agrupadas de acuerdo con la presencia o ausencia (control) de fuel en el aparato digestivo. ............ 157 Tabla 26. Concentraciones medias de los elementos químicos estudiados en hígado de aves que ingirieron petróleo y en aves control. ............................................................ 157 Tabla 27. Concentraciones medias de los elementos químicos estudiados en riñón de aves que ingirieron petróleo y en aves control. ............................................................ 157 x | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 28. Resultados de la comparación en hígado de las concentraciones medias de los elementos químicos estudiados en aves que ingirieron petróleo y en aves control. .......................................................................................................................... 158 Tabla 29. Resultados de la comparación en riñón de las concentraciones medias de los elementos químicos estudiados en aves que ingirieron petróleo y en aves control. .......................................................................................................................... 158 Tabla 30. Tabla de contingencia que muestra el número de aves recolectadas por quincenas entre diciembre de 2002 y febrero de 2003. ................................................ 163 Tabla 31. Concentraciones de elementos químicos en hígado de acuerdo con la fecha de recepción de las aves marinas muertas. ................................................................... 164 Tabla 32. Concentraciones de elementos químicos en riñón de acuerdo con la fecha de recepción de las aves marinas muertas. ........................................................................ 165 Tabla 33. Análisis estadístico de las concentraciones de elementos químicos en hígado y riñón de las diferentes especies de aves marinas. ...................................................... 166 Tabla 34. Aves marinas estudiadas de acuerdo con la especie y el sexo. ................................. 172 Tabla 35. Concentraciones de los elementos químicos evaluados en hígado de acuerdo con el sexo. ................................................................................................................... 172 Tabla 36. Concentraciones de los elementos químicos evaluados en riñón de acuerdo con el sexo. ................................................................................................................... 172 Tabla 37. Análisis estadístico de los niveles de elementos químicos evaluados de acuerdo con el sexo de las aves, en hígado y riñón. ..................................................... 173 Tabla 38. Especies de aves y parasitación interna ..................................................................... 178 Tabla 39. Concentraciones de los elementos químicos evaluados en hígado de acuerdo con la presencia o ausencia de parásitos. ...................................................................... 178 Tabla 40. Concentraciones de los elementos químicos evaluados en riñón de acuerdo con la presencia o ausencia de parásitos. ...................................................................... 179 Tabla 41. Comparación entre los niveles de elementos químicos estudiados en Alca torda de acuerdo con la presencia o ausencia de parásitos. .......................................... 179 Tabla 42. Aves marinas con necrosis hepática. ......................................................................... 184 Tabla 43. Concentraciones de los elementos químicos obtenidos en las aves con y sin necrosis hepática........................................................................................................... 184 Tabla 44. Prueba estadística para la comparación entre los grupos de aves con presencia y ausencia de necrosis hepática. ................................................................... 185 Tabla 45. Tabla de contingencia que muestra la frecuencia de aves de acuerdo con los grados de tinción de Perls de los cortes histológicos de hígado. .................................. 188 Tabla 46.Concentraciones de los elementos químicos estudiados de acuerdo con el grado de tinción de Perls observada en hígado. ........................................................... 189 Tabla 47. Pruebas estadísticas de comparación que evalúan las diferencias entre los niveles de tinción de Perls en hígado. .......................................................................... 189 Tabla 48. Aves marinas con necrosis tubular renal. .................................................................. 192 Tabla 49. Concentraciones de los elementos químicos obtenidos en las aves con y sin necrosis tubular renal. ................................................................................................... 192 Tabla 50. Prueba estadística para la comparación entre los grupos de aves con presencia y ausencia de necrosis tubular renal. ............................................................ 193 Tabla 51. Tabla de contingencia que muestra la frecuencia de aves de acuerdo con los grados de tinción de Perls de los cortes histológicos de riñón. .................................... 196 Tabla 52. Concentraciones de los elementos químicos estudiados de acuerdo con el grado de tinción de Perls observada en riñón. .............................................................. 196 Í N D I C E D E F I G U R A S Y T A B L A S | xi Tabla 53. Concentraciones de arsénico en otros estudios. ........................................................ 229 Tabla 54. Concentraciones de cadmio en otros estudios. .......................................................... 230 Tabla 55. Concentraciones de cobalto en otros estudios. .......................................................... 233 Tabla 56. Concentraciones de cobre en otros estudios. ............................................................. 234 Tabla 57. Concentraciones de cromo en otros estudios. ........................................................... 236 Tabla 58. Concentraciones de hierro en otros estudios. ............................................................ 237 Tabla 59. Concentraciones de manganeso en otros estudios. .................................................... 238 Tabla 60. Concentraciones de mercurio en otros estudios. ....................................................... 239 Tabla 61. Concentraciones de plomo en otros estudios. ........................................................... 241 Tabla 62. Concentraciones de selenio en otros estudios. .......................................................... 243 Tabla 63. Concentraciones de vanadio en otros estudios. ......................................................... 244 Tabla 64. Concentraciones de zinc en otros estudios. ............................................................... 245 xii | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” I N T R O D U C C I Ó N | 1 I. INTRODUCCIÓN 8 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” En la Figura 4 2 se puede apreciar la distribución de los principales vertidos de petróleo en aguas de las costas atlánticas europeas; el canal inglés y las aguas de Galicia (en gris oscuro) concentran la mayoría de los accidentes. El número indica el navío y entre paréntesis la cantidad expresada en miles de toneladas: 1 Betelgeuse (44); 2 Universe Leader (2.2); 3 Christos Bitas (3.7); Sea Empress (74.4); 5 Torrey Canyon (119); 6 Gino (41.8); 7 Amocco Cádiz (233); 8 Olympic Bravery (0.7); 9 Bohlen (7); 10 Amazzone (2); 11 Erika (19.7); 12 Tanio (17); 13 Mt Rose Bay (1); 14 Pacific Glory (3); 15 Olympic Alliance (11.8); 16 Andros Patria (47); 17 Urquiola (100); 18 Aegen sea (74); 19 Polycommander (16); Jakob Maersk (86,7); 21 Cercal (1); 22 Prestige (60). Accidente del Prestige 1.2. 1.2.1. Características del petrolero El Prestige era un petrolero convencional de casco sencillo, con un peso muerto de 81 564 toneladas, construido en el año 1976 por Hitachi Shipbuilding & Engineering Co. de Japón. Cuando partió de Riga (Letonia), el buque llevaba a bordo 76 973 toneladas de fuel pesado (M100). Según el ABS (American Bureau of Shipping), la posible causa iniciadora de la avería del Prestige pudo ser algún impacto con alguna estructura sólida en el mar, ya que se constató que al menos 3 buques perdieron parte de su carga en fechas previas al accidente. También pudo existir un fallo estructural que causó la inundación de los tanques del buque (Montes, 2006). 1.2.2. Hundimiento del Prestige Después de la avería del petrolero, el capitán realizó maniobras para adrizar 3 el buque, sin embargo el agua que inundaba el petrolero desestabilizaba el mismo; a partir de ese momento realizó maniobras erráticas, acercándose a la Ensenada de Finisterre; posteriormente se enmendó el rumbo hacia el Nordeste (NE), quizás con la intención de llevarlo al puerto de A Coruña, pero cuando estaba tan sólo a unas 3 ó 5 millas de la costa de Muxía, se le ordenó que se alejara de la costa de forma inmediata; el SASEMAR (Sociedad de Salvamento y Seguridad Marítima) y la Xunta de Galicia desalojaron a todos los tripulantes del buque, no registrándose pérdidas humanas en dicha operación. El Prestige se alejó finalmente de la costa de Muxía siguiendo rumbo Nor-noroeste (NNW) primero, para cambiar más tarde a Noroeste (NW). Llegó un momento en que cambió a rumbo Sudoeste (SW), quizás porque las autoridades francesas alertaron a las españolas de que si el viento reinante en ese momento (del Sur) rolaba a Oeste y después al Noroeste, los derrames que el 2 Elaborada por la Administración Nacional Oceánica y de la Atmósfera del Departamento de Comercio de Estados Unidos (NOAA). 3 Mar. Poner derecho o vertical lo que está inclinado, y especialmente la nave. I N T R O D U C C I Ó N | 9 Prestige fuera dejando, terminarían llegando a sus costas. Más tarde cambió a un rumbo casi al Sur, quizás con la intención de buscar abrigo en algún lugar de Portugal. Pero finalmente, cambió de nuevo al Oeste-sudoeste (WSW), pues al parecer se había llegado a un acuerdo para conducirlo a las Islas de Cabo Verde. Nunca alcanzó ese destino pues a las 08:00 horas del día 19 de noviembre de 2002 se partió en dos y, finalmente, se hundió en el Atlántico a casi 4 000 metros de profundidad (Montes, 2006). Posteriormente, y hasta la semana del 25 al 30 de noviembre de 2002, la marea negra llegó a las costas de Galicia, Asturias, Cantabria, Santander y País Vasco (ÁlvarezSalgado et al., 2006). 1.2.3. Lecciones y consecuencias del accidente El accidente del Prestige permitió realizar diversos estudios que simulan el comportamiento del petróleo en accidentes marinos, observando las influencias que tienen las corrientes marinas y la temperatura del mar, dando lugar al sistema METEOMOHID (Carracedo et al., 2006). También se realizaron modelos de simulación de recorrido del fuel en aguas marinas y se llevaron a cabo estudios de riesgo para la evaluación de las consecuencias (Montero et al., 2003; Solana-Ortega and Solana, 2007). Este accidente dejó un saldo económico, social, sanitario y ecológico enormemente negativo (Bohannon et al., 2002; Montes, 2006), estimándose que hasta diciembre de 2003 la industria pesquera de Galicia perdió alrededor de 76 millones de euros (Suris-Regueiro et al., 2007), afectando principalmente a la zona de la Costa da Morte. Sin embargo, aún están haciéndose estudios para medir con precisión los efectos del vertido, ya que se observó una disminución de la cantidad total de peces capturados y también una alteración de la diversidad de especies, disminuyendo unas variedades y aumentando otras (García Negro et al., 2009). El petróleo del Prestige: Características físicas y químicas 1.3. El petróleo es el resultado de una mezcla muy compleja de sustancias. La composición de cada tipo de fuel es muy diferente en función de la fuente natural de donde se extrae, así como de los tratamientos industriales que se aplican para su obtención. La carga del Prestige estaba constituida por un fuel pesado de mala calidad, procedente de la antigua URSS, que se corresponde con un fuel nº 2 en la escala francesa y un fuel nº 6 (o también bunker oil C) o tipo M-100 en la denominación inglesa e internacional. Se trata de un producto muy viscoso, inmiscible en agua, con un olor típico a petróleo (CSIC, 2003a). Entre las sustancias más nocivas que se encuentra en el petróleo están los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs o PAH´s, por sus siglas en inglés). Son compuestos químicos cuya estructura contiene anillos aromáticos simples que se han unido, sin heteroátomos ni sustituyentes. 10 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Los HAPs se encuentran en el petróleo, el carbón y en depósitos de alquitrán y también, como subproductos de la utilización de combustibles (ya sean fósiles o biomasa). Como contaminantes han despertado gran preocupación debido a que algunos compuestos han sido identificados como carcinógenos, mutágenos y teratógenos, siendo perjudiciales para poblaciones silvestres de aves (Poppenga, 2007). Como consecuencia del accidente del Prestige, se evaluaron los niveles de HAPs en agua en el mes de diciembre de 2002 estando comprendidos entre 19 y 28 µg/L. Estas concentraciones no fueron tan elevadas como las registradas en accidentes como el Exxon Valdez debido a la naturaleza pesada del petróleo del Prestige; los naftalenos y alquil-naftalenos fueron los HAPs más predominantes. Sin embargo, los muestreos realizados tres meses después muestran un descenso de hasta el 50% de los HAPs, siendo útiles en el diagnóstico de contaminación por petróleo del agua y pudiendo ver el recorrido del petróleo en el mar (González et al., 2006). También se evaluaron los niveles de HAPs en la biota afectada por el Prestige, observándose en la Costa de la Muerte niveles más elevados (Franco et al., 2006). Estudios de poblaciones de gaviotas expuestas y no expuestas al petrolero Prestige, demuestran que las mediciones de HAPs en aves expuestas variaba con respecto a las no expuestas, asimismo, diversos parámetros bioquímicos como AST, GGT, glucosa y fósforo inorgánico muestran una alteración de los órganos vitales como hígado y riñón, obteniéndose los mismos resultados de forma experimental (Alonso-Álvarez et al., 2007a; Alonso-Álvarez et al., 2007b). Otros elementos tóxicos que afectan a las aves son los PCBs y pesticidas organoclorados, en estudios realizados con huevos de la gaviota de Audouín (Larus audouinii) mostraron que existe una correlación temporal en los niveles de estos xenobióticos debido a contaminación antropogénica (Goutner et al., 2001). El fuel M-100 es un producto residual de la destilación del petróleo, sometido a tratamiento térmico (visbreaking) y mezclado posterior con sustancias de destilación más ligeras (cuttre stock) para reducir su viscosidad; de este modo se convierte en un residuo peligroso por la elevada proporción de hidrocarburos aromáticos que contiene, entre los que cabe destacar los HAPs cuyos efectos cancerígenos y mutagénicos son conocidos desde hace años (Pashin and Bakhitova, 1979). Este tipo de fueles pesados contienen asfaltenos (compuestos aromáticos de peso molecular entre 2000-5000 g/mol), hidrocarburos saturados y heteromoléculas con átomos de azufre, oxígeno, nitrógeno y metales. Además de estos, los fueles contienen hidrocarburos aromáticos volátiles como el benceno, tolueno y xileno, estando estos en baja proporción en los residuos vertidos en las costas gallegas, tanto por las propiedades del fuel original como por los procesos de evaporación posteriores al vertido y su transporte en el mar. Entre los HAPs mayoritarios presentes en este fuel, I N T R O D U C C I Ó N | 11 cabe señalar el naftaleno, fenantreno, dibenzotiofeno, fluoranteno, criseno y los alquil-derivados de todos ellos (Franco et al., 2006). Además de estos, también se encuentran concentraciones bajas de hidrocarburos aromáticos de mayor peso molecular como benzo[a]antraceno, benzofluorantenos, benzo[e]pireno, benzo[a]pireno, perileno, indeno[1,2,3-cd]pireno, benzo[ghi]perileno y dibenzoantracenos (CSIC, 2003a). Según algunos autores (Bernabeu et al., 2006), el fuel transportado por el Prestige contenía niveles elevados de níquel y vanadio, y presentaba una capacidad de evaporación muy pobre, lo que al mezclarse con el agua y el sedimento marino dio lugar a una mezcla que ayudó a enterrarlo en las costas, pudiendo contaminar la capa freática de ciertas zonas. Por sus características físicas y químicas, el fuel M-100 no se comercializa en la UE ya que se trata de un fuel altamente contaminante que no cumple los requisitos mínimos exigidos en las directivas comunitarias; sin embargo, sí está permitido en países en vías de desarrollo (África o Asia) con legislaciones menos estrictas (Varela, 2003). La concentración de los 16 HAPs definidos por la EPA (Enviromental Protection Agency, EEUU) del fuel del Prestige fue de 1264 mg/kg, lo que suponía un 0.1% del producto; además, un 3% de sus componentes eran derivados alquilados de los hidrocarburos, igualmente peligrosos; finalmente, hubo que tener en cuenta también, la presencia de metales pesados, resinas y asfaltenos en la valoración de los riesgos toxicológicos por exposición a su vertido. Los residuos que llegaron a las costas gallegas tenían cantidades variables de estos compuestos. Su composición relativa cambiaba según el grado de transformación de las mezclas desde el punto de vertido hasta la llegada a la costa. En general, se produjo una pérdida de los compuestos más volátiles y más solubles en el agua, resultando un fuel que adquirió una consistencia más viscosa (CSIC, 2003a). La biodegradabilidad en el medio del fuel M-100 todavía es desconocida, si bien, los estudios realizados por el CSIC y el CEDRE (Centre de Documentation de Recherche et d’Expérimentations sur les pollutions accidentelles des eaux), indican que es baja, posiblemente inferior al 10%. Por ello no es de esperar la degradación natural del residuo del Prestige (Maneiro, 2003). Los análisis de las muestras de agua, recogidas a diferentes profundidades en la columna de agua que reposa sobre el área del hundimiento del Prestige, indicaron unos niveles de cadmio que están dentro del rango de concentración propio de esa zona (<200 pM); en cambio, los niveles de plomo en superficie experimentaron un incremento de su concentración de hasta un orden de magnitud respecto a los valores normales oceánicos (<200 pM); lo mismo se puede indicar del cobre (concentraciones naturales <2 nM), aunque este incremento se determinó hasta los 50 metros de 12 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” profundidad. Las concentraciones de zinc eran muy superiores (2-3 órdenes de magnitud) a las naturales (<1 nM) en los 20 primeros metros y, de entre 1 y 2 órdenes de magnitud, hasta el límite de los muestreos (190 metros de profundidad). En los análisis de agua junto al pecio, también se observó un incremento en la concentración de zinc (CSIC, 2003b). Las muestras de fuel emulsionado recogidas en la costa contenían una proporción de agua de entre el 54 y el 59%, calculado en base a su contenido en azufre. En estas mismas muestras se determinó el siguiente rango de concentración en metales (ppm): 104 < sodio > 103 < aluminio, calcio, hierro, potasio, magnesio, titanio > 102 < bromo, níquel, vanadio > 10 < boro, bario, manganeso, molibdeno, estroncio, zinc > 1 < arsénico, cobalto, cromo, cobre, litio, selenio > 0.1 (CSIC, 2003a). Finalmente, los suelos que estuvieron contaminados por el fuel del Prestige, presentaron una menor porosidad, además de presentar niveles de metales pesados muy elevados (Andrade et al., 2004). 2. REPERCUSIÓN DE LOS VERTIDOS DE PETRÓLEO EN SERES VIVOS Los hidrocarburos son contaminantes que afectan de manera importante a la calidad del agua; su presencia es cada día más frecuente, sobre todo en los océanos, dejando estelas de contaminación que forman una película impermeable sobre el agua, perjudicando inicialmente a las aves y mamíferos acuáticos, mediante la obstrucción del intercambio gaseoso y la desviación de los rayos luminosos necesarios para que el fitoplancton lleve a cabo la fotosíntesis. Entre los diferentes aspectos del petróleo, cabe destacar lo siguiente (Shigenaka, 2011):  No es un compuesto único, sino que es una mezcla de diversos componentes químicos con diferentes toxicidades y mecanismos de acción.  Los vertidos de petróleo van cambiando su composición constantemente, y su toxicidad también varía con el tiempo.  Los organismos afectados por el petróleo pueden estar en diferentes estadios, por lo que los efectos tóxicos van a variar de acuerdo con el organismo afectado.  Las dosis subletales de petróleo van a afectar, también, a largo plazo a diferentes organismos, poblaciones y comunidades vivientes.  La toxicidad del petróleo como compuesto complejo es aún difícil de comprender. I N T R O D U C C I Ó N | 13 Consecuencias de los vertidos de petróleo en el ecosistema 2.1. A corto plazo, una marea negra puede provocar una reducción inmediata de la población de todas aquellas especies marinas sedentarias, o de escasa movilidad, cuyos hábitats típicos se ven más afectados directamente por la presencia de los hidrocarburos, debido a la mortalidad directa inducida, como es el caso del percebe, el erizo o los bivalvos (Celis, 2009). Existen estudios que demuestran los efectos genotóxicos y citotóxicos en mejillones de áreas afectadas por petróleo (Barsiene et al., 2012). Aquellas especies móviles, que pueden desplazarse a otras zonas menos afectadas, o de hábitats oceánicos que están expuestas a concentraciones ambientales menores de contaminantes, muy probablemente sufren una escasa mortalidad directa, por lo cual no se producirían reducciones bruscas en sus poblaciones, a corto plazo, tras los vertidos. Este sería el caso de los crustáceos, decápodos, cefalópodos y peces (Greenpeace, 2003). En estudios recientemente realizados en peces de agua dulce (Abremis brama) afectados por petróleo (Lombardía, 2010), en etapa aguda se observaron inflamaciones a nivel tisular y de branquias; sin embargo, en los órganos internos como riñón o hígado no se apreciaron alteraciones mayores; así, en el estudio histológico se observó un incremento de células rodlet en tejidos renales como posible manifestación de una respuesta al estrés químico provocado por el fuel (Giari et al., 2012). Así mismo, exposiciones de petróleo en arenques del Pacífico (Clupea pallasi), produjeron arritmias cardíacas en los peces afectados (Incardona et al., 2009). Si bien los efectos a corto plazo de los vertidos son los más llamativos y los más fácilmente detectables, quizás no sean los más preocupantes en cuanto a su repercusión sobre la dinámica de población de los recursos vivos, dado que son puntuales tanto en el tiempo como en el espacio (Khan, 1995). En este sentido, pueden ser mucho más relevantes los efectos subletales derivados de la contaminación por HAPs, a medio y largo plazo, que alteran los diferentes procesos reproductivos en muchas especies, con la consecuencia final de la reducción de la tasa reproductiva y, por lo tanto, del tamaño poblacional y de la biomasa explotable (Freire et al., 2003). La contaminación marina provoca daños también a largo plazo, como lo demuestran los estudios realizados 10 años después del derrame del Exxon Valdez, en los cuales todavía se observa exposición a contaminantes persistentes en los peces de las zonas afectadas (Jewett et al., 2002; Rice et al., 2007). También se han observado efectos adversos en poblaciones de iguanas marinas a largo plazo en el accidente del petrolero Jessica en las costas de Galápagos en 2001, determinando la importancia de los efectos crónicos del petróleo (Edgar et al., 2003). Las aves marinas figuran entre las especies más afectadas por los vertidos, como se demostró en las tragedias del Erika en las costas francesas, del Prestige, o del Deep Water Horizon en el golfo de 14 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” México, que provocaron la muerte de muchas aves marinas y la contaminación de las playas (Fodrie and Heck, 2011; García et al., 2003). Una vez producido el vertido, queda esperar y vigilar los efectos del petróleo o sus derivados sobre el ecosistema, destacando que su retirada del agua requiere de mecanismos complejos de eliminación, biodegradación y foto-oxidación (Jezequel et al., 2003). En cuanto a los efectos sobre la salud pública, en la tragedia del Prestige, aquellas personas que tuvieron contacto con el fuel en los trabajos de limpieza, sufrieron una intoxicación cutánea aguda que provocó dermatitis y lesiones oculares; así mismo, las sustancias que contenía el petróleo fuel M-100 del Prestige podrían provocar cáncer, sobre todo por su contenido en HAPs (Baars, 2002; CEDRE, 2012; Porta et al., 2004). Experimentalmente se ha demostrado que estos HAPs tenían capacidad para producir alteraciones de tipo reproductivo (alteraciones del ciclo estral y en las glándulas prostáticas) en roedores (Nishimoto et al., 2009). Recientemente, un equipo de investigadores de la Universidad de A Coruña observó daños en el ADN de ratas tras la exposición al fuel del Prestige por inhalación (Valdiglesias et al., 2012). Asimismo, se ha demostrado genotoxicidad asociada a la exposición humana al fuel del Prestige tras la manipulación de aves contaminadas, para su lavado o durante la realización de necropsias (Aguilera et al., 2010; Ha et al., 2008; Laffon et al., 2006). Los estudios realizados después del hundimiento del Prestige, mostraron que el primer año fue el que más afectó a los organismos del entorno, principalmente, de la zona inter-mareal, así como los recursos acuícolas de la zona, sin embargo aún continúan realizándose estudios para evaluar el verdadero impacto del vertido de petróleo (Penela-Arenaz et al., 2009). Según los cálculos estimados, todo el fuel del Prestige, contenía 220 kg de cobre, 6200 kg de níquel y 24 400 kg de vanadio; sin embargo, en los estudios realizados en la columna de aguas contaminadas por el Prestige, se observó que el cobre y el níquel tuvieron niveles más elevados comparados con los estándares en otras regiones marinas (Santos-Echeandía et al., 2008). Los organismos marinos bioacumulan ciertos elementos químicos inorgánicos como el arsénico, cadmio, mercurio, cobre, plomo y zinc (Neff, 2002), por eso, los niveles de estos elementos en organismos marinos son utilizados como indicadores de la calidad del agua (Nageeb, 2001). En conclusión, la evaluación de los impactos provocados por la contaminación de los océanos debería investigarse desde una perspectiva multidisciplinar y conjunta, ya que el petróleo y sus derivados son compuestos complejos que provocan daños a diferentes niveles de organización I N T R O D U C C I Ó N | 15 (Harding, 1992). La toxicología acuática determina la contaminación y los riesgos provocados por los materiales tóxicos que se encuentran en los medios acuáticos y también evalúa el daño provocado en poblaciones humanas, desde el nivel subcelular hasta el de las poblaciones y ecosistemas (Degernes, 2007; Jones, 2009). Consecuencias del vertido del Prestige en aves marinas de Galicia 2.2. Aplicando estudios analíticos por cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama (CGFID), y el método de reconocimiento de patrones multivariados (Componentes principales, Clusters y Redes neuronales), es posible identificar y cuantificar componentes orgánicos de los vertidos de petróleo para determinar su origen (Fernández-Varela et al., 2008; Fernández-Varela et al., 2005). Las costas gallegas, por su proximidad a la ruta de transporte de petróleo y sus derivados, están expuestas a diario a diferentes vertidos que se producen de forma ilegal (Fernández-Varela et al., 2006). En ellas se reconocen dos tipos de contaminación, una de ellas como consecuencia de accidentes durante el transporte de hidrocarburos o porque las embarcaciones liberan petróleo al mar (sentinazos), y la otra de origen antropogénico proveniente de residuos de la propia costa (Grueiro-Noche et al., 2010). En Galicia existen 94 089 hectáreas protegidas para las aves, denominadas Zona Especial de Protección de Aves (ZEPA) distribuidas en 15 espacios (Xunta de Galicia, 2008). La tragedia del Prestige afectó de manera significativa a aves marinas residentes en Galicia, como el cormorán moñudo y la gaviota patiamarilla (SGO, 2005), y se estima que los efectos de la contaminación acuática por petróleo pueden persistir durante años (Peterson, 2001). La recuperación de las aves marinas petroleadas depende de varios factores como la especie, grado de impregnación, edad, etc., aunque en especies como el arao, se observa que el éxito de supervivencia después de un accidente de este tipo, es muy bajo (Mead, 1997); se estima que la tasa de mortalidad de aves marinas tras un vertido es más alta de lo que se menciona, ya que muchos de los cadáveres no llegan nunca a aparecer (Michel, 2001). En estudios realizados en 45 accidentes petroleros para la evaluación de la mortalidad provocada por derrames de petróleo, se calcula que el número de aves que en realidad mueren es unas 10 veces superior al de los cuerpos que son encontrados en las costas. Además, los indicadores que mencionan el impacto ambiental del petróleo no son muy precisos, ya que muchas veces utilizan sistemas simples que son muy confusos. Es mejor, por tanto, el análisis de cada caso particular para evaluar la mortalidad producida (Burger, 1993). 16 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” La Dirección Xeral de Conservación da Natureza de la Xunta de Galicia realizó un seguimiento del número de aves recogidas, vivas y muertas, en las costas de Galicia, desde el 15 de noviembre de 2002 hasta el 31 de mayo de 2003, dando como resultado un total de 12 211 aves, de las cuales 2469 (20.2%) se recogieron vivas y 9472 (77.6%) muertas (Figura 5). Figura 5. Gráfico temporal de aves recogidas en las costas gallegas. Entre las aves marinas más afectadas se encontraban tres especies de álcidos – alca común (Alca torda), arao común (Uria aalge) y frailecillo atlántico (Fratercula arctica) – que sumaban el 80.5% del total de aves recogidas. El arao común, con 4492 individuos recogidos (1140 vivos y 3352 muertos) fue la especie más afectada (36.8%). Al centro de rehabilitación de O Campiño (Pontevedra) llegaron un total de 1786 aves para su tratamiento, 476 de la costa de Pontevedra, 948 de la costa de A Coruña, 199 de la costa de Lugo y 131 de origen gallego no determinado, así como 14 de Asturias y 18 de Portugal. La instalación se mantuvo operativa hasta el 20 de marzo de 2003, llegando a liberarse un total de 275 aves tras el tratamiento. Posteriormente, se liberaron otras 26 aves desde el Centro de Recuperación de Fauna Silvestre de Santa Cruz (Oleiros, A Coruña), lo que supuso la recuperación de tan solo 301 aves en total, el 12.2% de las aves recogidas vivas. Las tasas de recuperación (aves liberadas en relación a las aves recogidas vivas) están influidas por diferentes variables, como son la geográfica, ambientales, tipo de fuel, centros de rescate, etc. De acuerdo con la especie, se puede considerar como buena tasa de recuperación la del cormorán grande (42.9%), negrón común (30%), alcatraz atlántico (26.2%), colimbo grande (19.4%) y frailecillo atlántico (12.5%), y como aceptables, dadas las características del vertido, las obtenidas para el arao común (9.8%), cormorán moñudo (9.6%) y alca común (7.6%), tal como se refleja en la Tabla 2. I N T R O D U C C I Ó N | 17 Especie de aves Recogidas vivas Recogidas muertas Total Aves liberadas Colimbo chico (Gavia stellata) 1 6 7 0 Colimbo ártico (Gavia arctica) 0 5 5 0 Colimbo grande (Gavia immer) 31 20 51 6 Zampullín chico (Tachybaptus ruficollis) 1 0 1 0 Zampullín cuellinegro (Podiceps nigricollis) 1 0 1 1 Fulmar boreal (Fulmarus glacialis) 3 8 11 1 Pardela cenicienta (Calonectris diomedea) 0 3 3 0 Pardela capirotada (Puffinus gravis) 0 5 5 0 Pardela balear (Puffinus mauretanicus) 1 2 3 0 Pardela chica (Puffinus assimilis) 0 1 1 0 Pardela indeterminada 0 6 6 0 Paíño europeo (Hydrobates pelagicus) 4 10 14 1 Paíño boreal (Oceanodroma leucorhoa) 0 4 4 0 Alcatraz atlántico (Morus bassanus) 187 245 432 49 Cormorán grande (Phalacrocorax carbo) 21 37 58 9 Cormorán moñudo (Phalacrocorax aristotelis) 146 234 380 14 Cormorán indeterminado 1 50 51 0 Garceta común (Egretta garzetta) 2 3 5 1 Garza real (Ardea cinerea) 1 5 6 1 Ánade azulón (Anas platyrhynchos) 1 4 5 0 Negrón común (Melanitta nigra) 20 31 51 6 Focha común (Fulica atra) 0 1 1 0 Ostrero euroasiático (Haematopus ostralegus) 0 2 2 0 Chorlitejo grande (Charadrius hiaticula) 2 0 2 2 Chorlitejo patinegro (Charadrius alexandrinus) 1 0 1 1 Chorlito dorado (Piuvialis apricaria) 0 2 2 0 Chorlito gris (Piuvialis squatarola) 0 4 4 0 Chorlito indeterminado 0 2 2 0 Correlimos tridáctilo (Calidris alba) 1 0 1 1 Correlimos común (Calidris alpina) 2 0 2 1 Aguja colipinta (Limosa lapponica) 1 2 3 0 Zarapito trinador (Numenius phaeopus) 1 5 6 0 Zarapito real (Numenius arquata) 0 1 1 0 Andarríos chico (Actitis hypoleucos) 0 2 2 0 Vuelvepiedras (Arenaria interpres) 0 6 6 0 Falaropo picogrueso (Phalaropus fulicarius) 0 2 2 0 Págalo grande (Catharacta skua) 1 11 12 0 Gaviota tridáctila (Rissa tridactila) 9 46 55 3 Gaviota reidora (Larus ridibundus) 3 42 45 0 Gaviota sombría (Larus graellsii) 3 31 34 1 Gaviota argéntea (Larus argentatus) 0 7 7 0 Gaviota patiamarilla (Larus michahellis) 103 531 634 16 Gaviota indeterminada 10 200 210 8 Gavión atlántico (Larus marinus) 1 8 9 0 Charrán patinegro (Thalasseus sandvicensis ) 0 2 2 0 Charrán indeterminado 1 3 4 0 Alca común (Alca torda) 589 2272 2861 45 Arao común (Uria aalge) 1140 3352 4492 112 Frailecillo atlántico (Fratercula arctica) 168 2305 2473 21 Mergullo atlántico (Aile aile) 8 37 45 0 Martín pescador (Aicedo atthis) 2 2 4 1 Otras aves 2 185 187 0 Total 2469 9742 12 211 301 Tabla 2. Especies de aves marinas afectadas por el vertido del Prestige. 24 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tanto el exceso, como el defecto, de hierro pueden provocar problemas en el organismo. El defecto de hierro se ha demostrado que puede provocar apoptosis, mientras que una ingesta exagerada de este, especialmente cuando se utiliza como suplemento en el tratamiento de anemias, puede provocar una intoxicación. Así, el exceso de hierro (hemocromatosis) provoca fibrosis hepática y como consecuencia causa una cirrosis; también está relacionado con la diabetes ya que hace que las células beta del páncreas tengan una sobrecarga de actividad; por otra parte, el corazón, también se ve afectado manifestando insuficiencias cardíacas. Los signos clínicos que produce son dificultad respiratoria, distensión abdominal y parálisis (Le and Richardson, 2002; Ma et al., 2012; Pérez López et al., 2005). Manganeso (Mn) 3.7. El manganeso es uno de los metales más abundantes de la tierra, representando aproximadamente el 0.1% de la corteza terrestre no encontrándose en estado puro (elemental), sino formando más de 100 minerales. En el agua de mar, las concentraciones normales están entre 0.4 y 10 g/L, con un promedio de 2 g/L (EPA, 2004). El Mn es un micronutriente esencial que interviene como cofactor de procesos metabólicos. Su exceso se relaciona con alteraciones nerviosas (efectos neurotóxicos) similares a las provocadas por el exceso de plomo (Burger, 2002). En humanos la ingesta diaria recomendada (RDA) se situaría entre 2.3 mg/día para hombres adultos y 1.8 mg/día para mujeres adultas. El nivel máximo de ingesta tolerable (UL) de manganeso sería de 11 mg/día (IOM, 2001). Más del 95% del Mn es eliminado por las vías biliares, en cuyo proceso puede asociarse al hierro, zinc, aluminio y cobre (Burger, 2002). Se ha demostrado que la acumulación de manganeso en neuronas puede provocar una destrucción de estas células causando síntomas de la enfermedad de Parkinson (Olanow, 2004). La intoxicación por Mn, conocida como manganismo, fue descrita por Couper en 1837 en trabajadores expuestos a un exceso de Mn por vía oral; en ellos se observaron signos clínicos similares al Parkinson que afecta a las funciones motoras de los seres humanos (Santos et al., 2012). Puede afectar también a las funciones hepáticas, pero los umbrales tóxicos son relativamente altos. Además, se ha observado que el aumento de Mn provoca una sobreacumulación de este mineral en los órganos del sistema inmune (bazo, bolsa de Fabricio y timo) alterando el equilibrio de otros micronutrientes y resultando alterada la respuesta inmune de gallinas (Liu et al., 2012; Roels et al., 2012). I N T R O D U C C I Ó N | 25 Mercurio (Hg) 3.8. El Hg no tiene función metabólica conocida. Se considera que su presencia en los organismos vivos es consecuencia de la contaminación. Ha sido utilizado para la extracción de oro, en la manufactura de sombreros de fieltro y espejos, en la producción de instrumentos eléctricos, fungicidas, y en la industria del papel y los plásticos (Ahmad et al., 2012). El mercurio es el único metal en estado líquido a temperatura ambiente; aparece, principalmente, combinado con el azufre, y se encuentra en todos los ecosistemas; así, el agua dulce contiene un promedio de 0.1 µg/L, el agua de mar 0.3 µg/L y el aire 0.005-0.06 ng/m3. La corteza terrestre presenta un promedio 0.02 ppm (EPA, 1997). El Hg es un elemento indeseable y de alto riesgo toxicológico para los organismos, en los que puede bioconcentrarse y biomagnificarse a través de la cadena trófica; las formas de mercurio metálico, poco tóxicas, pueden transformarse en orgánicas altamente tóxicas como el metilmercurio, producido por la metilación del mercurio inorgánico. En el medio ambiente tiene un comportamiento muy complejo, pudiendo dispersarse a lugares alejados de su origen, por lo que es importante el uso controlado de este elemento (Eisler, 1987). Son muy conocidos los efectos neurotóxicos, mutagénicos, carcinogénicos y teratogénicos del Hg (EPA, 1997; Furness and Camphuysen, 1997; Kojadinovic et al., 2007a). La Organización Mundial de la Salud propone en humanos una ingesta provisional semanal (PTWI) de mercurio total de 5 µg/kg peso/semana (WHO, 1978, 2011). En roedores se ha demostrado experimentalmente que el mercurio tiende a acumularse en riñón (Lin et al., 2012; Yorifuji et al., 2010), y que en peces (Sparus aurata), el incremento de la temperatura influye considerablemente en la acumulación de mercurio (Guinot et al., 2012). Asimismo, algunos investigadores han demostrado que el mercurio en humanos, a dosis bajas pero en periodos de exposición prolongados, causaba fatiga, anorexia, pérdida de memoria, eretismo, visión borrosa y problemas dentales (Holmes et al., 2009; Neghab et al., 2012). La forma más nociva del mercurio es el metilmercurio (Li et al., 2010; Murata et al., 2011), observándose en peces la producción de embriones anormales (efectos teratogénicos), debido probablemente a que el mercurio es responsable de inhibir el ciclo celular y, por tanto, de disminuir la multiplicación celular (Crespo-López et al., 2011). 26 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Plomo (Pb) 3.9. En los últimos 5000 años la utilización de plomo por el hombre ha liberado cantidades elevadas de este metal tóxico, estimándose que alrededor de la mitad de lo que se produce se libera como contaminante (1.6 de los 3.4 millones de toneladas). Las principales fuentes de exposición al plomo son la gasolina, barro vidriado, pinturas, juguetes, alimentos enlatados, vidrios de alto índice de refracción, insecticidas, baterías, municiones, plomadas para pesca, pinturas navales antiincrustaciones, etc. (EPA, 2006). En humanos la Organización Mundial de la Salud propone una ingesta provisional tolerable semanal (PTWI) para el plomo de 25 µg/kg peso/semana (WHO, 2011). En España, el uso de perdigones de plomo durante la cacería es un factor importante de contaminación ambiental, lo que provoca no sólo la contaminación de los animales (muchas aves confunden semillas con perdigones, ingiriéndolos), sino también del medio ambiente. Actualmente se reemplazan por acero, estando prohibido el uso de perdigones de plomo en las zonas de humedales de España (AESAN, 2012; Guitart et al., 2010; INAC, 2010; Suárez and Urios, 1999). En los vertebrados, la intoxicación crónica por Pb recibe el nombre de saturnismo, y afecta tanto a aves como a carnívoros, rumiantes y seres humanos. El plomo se acumula en hígado, corazón, cerebro o huesos y provoca anemia debido a que bloquea la síntesis de hemoglobina. La absorción digestiva del Pb es pobre, del orden del 2% para el Pb metálico (presente en las pinturas, vitrificados, etc.), siendo más elevada para las sales como el acetato de plomo, especialmente en los animales más jóvenes. Una carencia de calcio, o de proteínas, aumentará la absorción del elemento, mientras que un exceso de Zn o de calcio la disminuirá. La absorción del Pb por vía pulmonar es más elevada, de hasta un 30%. Además, las formas como el tetraetil plomo pueden atravesar la piel con facilidad (Carbonell et al., 2007). Selenio (Se) 3.10. El Se es un elemento esencial en la dieta de las aves, estando relacionado con la vitamina E. Está ligado a las proteínas, principalmente globulinas y se distribuye por todo el organismo, aun cuando se deposita en mayor proporción en el hígado, riñones, bazo y corazón (Anzola, 1999). El Se tiene 3 niveles de actividad biológica: el primero, como elemento traza, siendo necesario para el crecimiento y desarrollo normales; el segundo, en concentraciones moderadas, para mantener las funciones homeostáticas; y el tercero, en concentraciones elevadas, con efectos tóxicos (Hamilton, 2004). La ingestión del selenio a través del agua o de la dieta, se bioacumula enlazándose a grupos sulfhidrilos (-SH) hasta llegar a provocar efectos nocivos (Eisler, 1988). En humanos la ingesta I N T R O D U C C I Ó N | 27 diaria recomendada (RDA) se situaría en 55 µg/día y el nivel máximo de ingesta tolerable (UL) sería de 400 µg/día (IOM, 2000 ). Como consecuencia de la contaminación de las aguas con niveles altos de este elemento, casi siempre por tratamientos utilizados en la agricultura, se han observado efectos adversos en aves acuáticas silvestres, tales como aumento de la mortalidad, trastornos en la reproducción incluyendo teratogénesis, reducción del crecimiento, necrosis hepática, disminución del tamaño del riñón, atrofia del bazo y tejido muscular, además de alteración del metabolismo del glutatión hepático (Hoffman, 2002). Vanadio (V) 3.11. En la corteza terrestre, el V ocupa el lugar 22 entre los elementos más abundantes, constituyendo de un 0.014 a un 0.02% de su composición. Participa en la síntesis de clorofila en los organismos fotosintéticos y se considera un micronutriente para varias especies marinas y terrestres. Se utiliza en la terapia contra la diabetes y la obesidad. Además, por sus propiedades moduladoras de la expresión de diversos genes, se emplea como agente anticarcinogénico en modelos experimentales (García, 2006). El pentóxido de V (V2O5) se utiliza, principalmente, en la fabricación de acero y, en menor proporción, en la fabricación de plásticos, cerámica, caucho y otros productos químicos. Se encuentra, también de forma natural, en los combustibles derivados del petróleo y del carbón. Los combustibles crudos contienen trazas detectables de V (desde menos de 1 a 1600 mg/kg) y las cenizas de la combustión del petróleo contienen más de un 80% de V2O5 (ATSDR, 1996). Las concentraciones de V en el agua del mar habitualmente están en un rango de 1 a 3 μg/L, mientras que en sedimentos costeros los valores oscilan entre 7 μg/L y 200 μg/L de peso seco. El desgaste de las rocas oceánicas y de los minerales terrestres libera V al agua y al aire. Se considera que la concentración promedio de este metal en el suelo es de unos 100 μg/g de peso seco, aunque en suelos cercanos a plantas metalúrgicas, los valores pueden superar los 400 μg/g (RodríguezMercado and Altamirano-Lozano, 2006). En humanos se considera que el nivel máximo de ingesta tolerable (UL) para el Vanadio es de 1.8 mg/día en adultos (IOM, 2001). En general, respecto a la toxicidad de elementos inorgánicos, está siendo probado que partículas en suspensión provocan toxicidad pulmonar potenciada por los contenidos de hierro, níquel y vanadio (Campen et al., 2002); así, en estudios recientes se ha puesto de manifiesto que la concentración de partículas en suspensión, asociadas sobre todo al vanadio, está relacionada con el daño ocasionado en mitocondrias miocárdicas en roedores, además de provocar una alteración de la función respiratoria (Golomb et al., 2012). En una intoxicación por metavanadato de amonio 28 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” (NH4VO3), la paciente presentó signos de dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, hipoglucemia y fallo renal. El análisis de sangre mostró niveles de 6.22 ml/L de vanadio, es decir, 600 veces más de la cantidad de un individuo normal (Boulassel et al., 2011). Zinc (Zn) 3.12. El Zn se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y constituye aproximadamente un 0.02% de la corteza terrestre. Adopta la forma de sulfuro (esfalerita), carbonato, óxido o silicato (calamina) de zinc. La esfalerita, el principal mineral de Zn y fuente de, al menos, el 90% del Zn metálico, contiene hierro y cadmio como impurezas. El Zn metálico se puede troquelar para la fabricación de piezas de automóviles, equipos eléctricos, herramientas de maquinaria ligera, equipos informáticos, juguetes y artículos ornamentales. También puede laminarse para la obtención de planchas destinadas a tejados y cubiertas, forros de pilas secas, placas de fotograbado, etc. Además, puede alearse con cobre, níquel, aluminio y magnesio; cuando se alea con cobre, se obtiene el importante grupo de aleaciones denominadas bronces (OIT, 2011). El Zn tiene una función importante en la fisiología, ya que interviene en el metabolismo, tanto como cofactor de las reacciones, como estabilizador de las enzimas. También interviene en el crecimiento y la proliferación celular, la respuesta inmune, los procesos reproductivos, el metabolismo hormonal y la protección frente a los radicales libres. Por el contrario, el exceso de Zn intracelular es potencialmente neurotóxico, debido a que promueve la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS) intra y extra mitocondriales, que inducen apoptosis y/o necrosis (Nzengue et al., 2011). Para humanos la ingesta diaria recomendada (RDA) se estima en 11 mg/día en hombres adultos y 8 mg/día en mujeres adultas y el nivel máximo de ingesta tolerable (UL) diaria para adultos es de 40 mg (IOM, 2001). La función de las metalotioneínas y los metales pesados Las MTs constituyen una familia de proteínas ricas en cisteína, de bajo peso molecular (entre 6000 y 7000 Da) que se localizan en el aparato de Golgi de las células. Las MTs tienen la capacidad de unirse tanto a los metales pesados endógenos (zinc, cobre, selenio, cromo) como xenobióticos (cadmio, mercurio, plata y arsénico), a través de los grupos tiol (-SH) de sus restos de cisteína, que representan casi el 30% de su composición aminoacídica (Duncan, 2009). Las MTs fueron aisladas por primera vez por Margoshes y Vallee (1957) a partir de riñón de caballo, siendo caracterizadas después por Kägi y Vallee (1960), quienes lograron purificar una I N T R O D U C C I Ó N | 29 proteína con alto contenido de cadmio, zinc y azufre. Estas proteínas representaron el 1% del peso total de la corteza renal de equino, a las cuales estaban unidos todo el Cd y el 60 % del Zn (GarcíaRico et al., 1999). Posteriormente, estas proteínas se han aislado de tejidos de mamíferos, plantas y levaduras, observándose gran variedad de funciones en cada especie, lo que ha hecho difícil establecer su papel biológico específico. En estudios experimentales con mamíferos se demostró que dosis repetidas de Cd provocaban, no solo la acumulación del metal, sino también el incremento de la concentración de las MTs a la cuales se enlaza. Asimismo, en trabajos experimentales in vitro con cultivos de hepatocitos de rata (HPC) y co-cultivos de dichos hepatocitos con una línea de células epiteliales de hígado de rata (COC), se demostró que el proceso de detoxificación fue dependiente del complejo Cd-MT formado, siendo más eficiente el co-cultivo que el cultivo puro (Carrera et al., 1992). Estos resultados demostraron que la síntesis de estas proteínas se estimula como consecuencia de una respuesta celular ante la presencia de Cd y que, la unión del metal a las proteínas, podría ser un mecanismo de defensa y desintoxicación (Nordberg, 2009). Clasificación de las MTs Las MTs se clasifican y nombran en base al metal que ligan. Así, una MT que contiene un solo metal, por ej. Cd, se denomina cadmiometalotioneína (CdMT) o Cdtioneína. En base a sus características estructurales, las MTs se subdividen en las siguientes clases:  Clase I: Polipéptidos con estructura primaria muy relacionada con las MTs renales de equino.  Clase II: Polipéptidos en los cuales la localización de las cisteínas es muy distinta a la metalotioneína renal de equino.  Clase III: Polipéptidos atípicos que no son traduccionalmente 6 sintetizados como metaltiol. La principal función que se ha encontrado para las MTs es el mantenimiento de la homeostasis del Zn y Cu durante el desarrollo embrionario y en la edad temprana. Cuando se expone el organismo a metales pesados no esenciales, como el Cd, se produce el desplazamiento de los elementos esenciales, formando complejos CdMT nefrotóxicos. Estos llegan a provocar daños tubulares de diferente magnitud, dependiendo de su concentración, de la vía de entrada al organismo, así como de la especie, la edad y el sexo del individuo; las investigaciones al respecto deben tener en cuenta estos factores para llegar a esclarecer el mecanismo mediante el cual se produce el efecto desintoxicador de esta proteína (García-Rico et al., 1999). 6 En genética: paso de ARN a proteína 30 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” 4. ETOLOGÍA GENERAL DE LAS AVES MARINAS AFECTADAS POR EL PETRÓLEO DEL PRESTIGE EVALUADAS EN EL PRESENTE ESTUDIO Entre las aves marinas más afectadas, se encuentran tres especies de álcidos – alca común (Alca torda), arao común (Uria aalge) y frailecillo atlántico (Fratercula arctica) – que aportan el 80.5% del total de aves recogidas. El arao común con 4492 (36.8%) individuos recogidos (1140 vivos y 3352 muertos) es la especie más afectada. Estas 3 especies constituyen el material principal objeto de este estudio, en el cual también se han evaluado en menor proporción muestras de cormorán gigante (Phalacrocorax aristotelis), cormorán moñudo (Morus bassanus) y gaviota patiamarilla (Larus michahellis). A continuación se resume la descripción, hábitat y etología de estas 6 especies de aves marinas. Alca común (Alca torda) 4.1. Nombre en inglés: Razorbill Orden: CHARIDRIIFORMES Familia: ALCIDAE Género: Alca Descripción Miden entre 38 y 43 cm de longitud y de 60 a 69 cm de envergadura, pueden llegar a pesar 800 g (Svensson et al., 2000) (Figura 6). Está clasificada por la IUCN como especie no amenazada (Stattersfield et al., 2000). No presentan dimorfismo sexual. El cuello es corto y grueso, el pico es grande, ancho y aplanado verticalmente, está algo curvado en su extremo y es de color negro (Wagner, 1999). Los ojos son pequeños y de color negro, la cola es corta y puntiaguda, alas cortas, patas también cortas, de color gris muy oscuro y con los dedos palmeados; tienden a nadar de forma más oblicua (Watanuki et al., 2006). También se han encontrado individuos con líneas verticales en el pico, similares a las del alca gigante (Pinguinus impennis), demostrando un ancestro común para las alcas comunes (Lavers et al., 2005). Figura 6. Alca común (Alca torda). I N T R O D U C C I Ó N | 31 Hábitat Esta especie está presente en Islandia, en las costas atlánticas de América del Norte y de Europa, así como en las costas del Norte de Europa y Asia (Domínguez Conde, 2003). En la Península Ibérica, es un invernante habitual; se pueden ver ejemplares durante el invierno en las costas del Cantábrico y de Galicia, y en menor número en las costas del Mediterráneo. Se encuentran en grandes bandadas en alta mar durante el invierno y se acercan en verano para reproducirse en las costas rocosas, acantilados, islas, islotes, estuarios y bahías resguardadas, prefiriendo los huecos más que las repisas abiertas (QN, 2012). Alimentación Son unas excelentes buceadoras especializadas en capturar peces aunque también se alimentan de moluscos, crustáceos y gusanos marinos. En un estudio realizado en Portugal durante el invierno, se observó que su dieta consistía en: sardina común (Sardina pilchardus) 66%, anchoveta (Engraulis encrasicolus) 7%, pejerrey (Atherina presbyter) 2%, aguacioso (Ammodytes tobianus) 2%, especies de Ammodytes no identificados 22% y especies no identificadas 1%. Según este estudio, la dieta de las alcas está compuesta de peces que son aprovechados para el consumo humano o la industria, por lo que la sobrepesca puede ser la causa del descenso de la población del Alca torda (Rui, 1989). Reproducción Se realiza entre mayo y junio. Crían en colonias, muchas veces cerca de los araos y, generalmente, depositan su huevo en alguna cavidad de las rocas de los acantilados. La puesta se compone normalmente de 1 huevo cuyo color es muy variado, yendo desde el blanco al verdoso, con manchas y puntos de color marrón y negro. La incubación dura unos 35 días. Las crías permanecen en el nido alrededor de 18 días. En estudios llevados a cabo en Gales-Reino Unido, se demostró que la mayor parte retornaba a la misma colonia para reproducirse, siendo la edad de la primera reproducción entre los 4 y 5 años (Perrins and Lloyd, 1977). En estudios realizados en Noruega, entre los años 1980-2000, se observó que las alcas ponían sus huevos entre el 13 y 30 de mayo en los primeros dos años y luego cada vez con más retraso, entre el 21 de mayo y 2 de junio, comprobándose que tenía una relación directa con la temperatura del entorno. Por otro lado, con los años, el tamaño de los huevos tendía a una disminución (Barrett, 2001). 32 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” En otro estudio realizado en Canadá, se observó que las aves jóvenes retornaban a los nidos para buscar pareja el primer o segundo año, siendo más tardío con respecto a las alcas europeas, probablemente por la baja densidad poblacional y la afinidad a su lugar de origen (Lavers et al., 2008a). Además, se observó que el 83% de los ejemplares juveniles regresaban a su colonia para reproducirse y el 97% de los adultos, también. La mayoría de aves que emigra lejos de su colonia, lo hace cuando son expulsadas del grupo siendo juveniles, pudiendo llegar a emigrar incluso desde Escocia hasta Norte América (3210 km) (Lavers et al., 2007). Arao común (Uria aalge) 4.2. Nombre en inglés: Common Guillemot Orden: CHARADRIIFORMES Familia: ALCIDAE Género: Uria Descripción Miden entre 38 y 46 cm con una envergadura de 61 a 73 cm. Pueden llegar a pesar 1000 g (Svensson et al., 2000) (Figura 7). Se asemeja al alca común pero es un poco más grande, tiene la cabeza menos robusta y más puntiaguda, y su pico es más fino, de forma cónica y puntiaguda. No presentan dimorfismo sexual. El cuello es corto y grueso, su pico es cónico y acaba en una punta afilada; los ojos son pequeños y de color negro, la cola es corta y redondeada. Las alas son cortas; las patas también son cortas de color gris muy oscuro y con los dedos palmeados. Se localiza en la zona circumpolar ártica, Pacífico y Atlántico norte. En la Península Ibérica es un invernante habitual. Se pueden ver ejemplares durante el invierno en las costas del Cantábrico y de Galicia, y muy raramente en las costas del Mediterráneo. Se les ve, en mayor número, durante los pasos migratorios de octubre a diciembre y de febrero a abril (QN, 2012). Los araos ibéricos podrían pertenecer a otra subespecie, Uria aalge ibericus, aunque es preferible incluirlos dentro de la subespecie Uria aalge albionus, cuya población mundial se estima en unos 9 millones de parejas. Figura 7. Arao común (Uria aalge). I N T R O D U C C I Ó N | 33 En España solamente se distribuye por Galicia. Los últimos núcleos residen en las Islas Sisargas (3 parejas) y en los islotes del Cabo Vilán (9 parejas), ambos en A Coruña (Figura 8). Así mismo, en la parte central de Portugal existe una zona de nidificación en la Isla Berlenga (Peniche). El descenso de la población en Galicia ha sido muy notable; en los años sesenta la población de araos era de unas 1000-1500 parejas, mientras que en el censo realizado en el año 2003 quedaban solamente entre 3 y 11 parejas (Figura 9). En España, la especie se encuentra en peligro de extinción, debido a la actividad antropogénica (caza, pesca, vertido del petrolero del Prestige) y sobre todo al desplazamiento de algunas especies de peces; los araos, al quedarse sin el alimento que más aprecian, se marchan a otras zonas. Asimismo, en un estudio realizado en 1987, se documentó la desaparición nidificante del arao en la costa suroeste de Galicia (Islas Cíes), manteniéndose solamente una población estival no reproductora de aves inmaduras. Como causas de la desaparición de las aves se han considerado principalmente los derrames de petróleo (56% de las aves recogidas en playa), y las artes de pesca y caza furtiva (Arcos et al., 1995). Figura 8. Distribución del arao en la Península Ibérica (Arcos et. al., 1995). 40 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” conocen casos de hibridación con gaviota sombría, gaviota cáspica y gaviota argéntea. Construye el nido a base de ramitas, hierbas, plumas y detritos, donde pone de 1 a 4 huevos de color marrón a verde azulado con manchas oscuras (dimensiones medias de 70 x 48 mm) y 92g de peso, que serán incubados durante 25-33 días. Los pollos volarán al cabo de 40-45 días desde la eclosión. Alcanzan la madurez sexual en su cuarto año de vida. En 2009, la población invernante en España fue estimada en 228 599 individuos, repartidos por las costas ibéricas y ambos archipiélagos, siendo muy escasa en zonas del interior. Se trata de una especie paleártica sur-occidental cuya población se estima en unas 250 000 parejas, de las cuales 15 000 pertenecen a la subespecie atlantis que ocupa los archipiélagos de Macaronesia; unas 25 000 pertenecen a la subespecie armenicus que cría en Armenia y Turquía central, y el resto a la michahellis que ocupa la cuenca Mediterránea, las costas atlánticas francesas, portuguesas, marroquíes y españolas. Desde mediados del siglo pasado, se encuentra en expansión colonizando distintos lugares del centro de Europa. En el año 2009, la población reproductora española era de un mínimo de 126 449 parejas, de las cuales 7000 lo hacían en Canarias perteneciendo a la subespecie atlantis, y el resto a la subespecie michahellis, que se repartía de forma equitativa entre las costas Mediterránea y Atlántica, siendo el contingente del interior peninsular anecdótico, no llegando a las 100 parejas. A nivel global, atendiendo a los criterios de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), se considera una especie de “preocupación menor”, debido a su amplia distribución y a la tendencia positiva de su población. Esta misma consideración se aplica en España, debido al tamaño de su población, a la tendencia positiva de la misma y a su extensa distribución. Está estrechamente relacionada con L. argentatus, con la cual en ocasiones fue considerada coespecífica. Estudios moleculares han permitido separarla de L. argentatus, L. fuscus y L. cachinnans. Existe una sistemática muy compleja en cuanto a sus subespecies, de forma que hasta el año 2009, la armenicus había sido considerada como una especie distinta. La forma “lusitanius” descrita para las poblaciones del Norte y Noroeste de la Península Ibérica, aún no está aceptada, siendo necesarios estudios más específicos (QN, 2012). I N T R O D U C C I Ó N | 41 Frailecillo atlántico (Fratercula arctica) 4.6. Nombre en inglés: Puffin Orden: CHARADRIIFORMES Familia: ALCIDAE Género: Fratercula Descripción Especie protegida, catalogada en el Real Decreto 439/1990 - Anexo II. Los machos suelen ser algo más grandes que las hembras. Miden unos 30 cm de longitud. La envergadura puede alcanzar los 60 cm. El peso puede llegar a los 390 g (Svensson et al., 2000) (Figura 13). Por la parte superior son de color pardo negro, incluyendo la frente, el píleo y la nuca. Tienen una especie de collar negro en la zona delantera con forma de V invertida en su parte inferior. La cara es de color blanco o grisácea y en ella se encuentra un pequeño ojo negro con un anillo periocular de color naranja intenso, el cual a su vez está metido dentro de un dibujo azul oscuro con forma de triángulo isósceles cuya base está por debajo del ojo. Desde el vértice de ese triángulo más alejado del pico, parte una delgada línea oblicua negra que se dirige hacia la nuca. Por la parte inferior son de color blanco. El cuello es corto y grueso (Prado Comesaña, 2007). El pico es ancho, tiene forma triangular y está aplanado lateralmente. En verano le crece una capa córnea y sus colores se hacen más intensos. Es de color naranja intenso, con un dibujo en forma de triángulo en su base de color azul oscuro rodeado de una franja amarilla. Tiene, también, unas líneas verticales de color rojo y amarillo, y con forma de paréntesis. En las comisuras tiene unas excrecencias carnosas de color naranja. La cola es corta y redondeada. Las alas son cortas, y de color negro por arriba y grises por debajo. Las patas son cortas, de color naranja y con los dedos palmeados y las uñas negras. Los jóvenes tienen el pico pequeño y de color gris oscuro con rayas rojas. Es una especie migratoria que se localiza en las costas europeas y americanas del Océano Ártico y del Atlántico Norte. En la Península Ibérica se puede ver algún ejemplar durante el invierno en las costas del Cantábrico y de Galicia, siendo escasa en las costas andaluzas y en el Mediterráneo. Es más abundante durante los pasos migratorios de octubre a diciembre y de marzo a abril, siendo raro verla en verano. Figura 13. Frailecillo atlántico (Fratercula arctica). 42 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Los frailecillos tienen rutas migratorias que no son estables de una población a otra. Estudios recientes suponen que existe una migración individual probablemente adquirida por los individuos como experiencia de migraciones anteriores con los progenitores. Sin embargo, no existen patrones definitivos de migración de estas aves. Los frailecillos son capaces de descansar en alta mar y de alimentarse de los peces que estén a su disposición, siendo considerada por ello un ave pelágica (Guilford et al., 2011). Hábitat En invierno se encuentran en alta mar y salen poco a tierra, pero cuando lo hacen es para criar en los acantilados más escarpados de las costas e islas con hierba. Alimentación Se alimentan de peces, moluscos y crustáceos. Es muy común verlos durante la época de cría con un montón de pequeños peces colgando a los lados del pico. Reproducción Esta ave se reproduce de mayo a agosto y cría en colonias, para lo que cava con su pico un túnel que acaba en una madriguera bajo tierra, que a su vez cubre con hierbas. En ocasiones utiliza las madrigueras de los conejos o de las pardelas. La edad de inicio del período reproductivo es a los 5 años (Perrins and Lloyd, 1977). La puesta se compone de 1 huevo de color blanco sucio o grisáceo con un punteado de color negro o morado. La incubación dura unos 40 días. Las crías permanecen en el nido alrededor de 40 días, hasta que los padres dejan de alimentarlos y los abandonan, momento en el cual salen de la madriguera y se lanzan al mar (QN, 2012). Los estudios realizados en Noruega indican que los frailecillos han retrasado la puesta de huevos en ese país incluso hasta en 2 semanas, lo que podría estar relacionado con los cambios de temperatura que se han registrado en los últimos años, (Barrett, 2001). I N T R O D U C C I Ó N | 43 5. TOXICIDAD DEL FUEL EN AVES MARINAS Los efectos nocivos ocasionados en la intoxicación por fuel en aves marinas se pueden clasificar en: 1. Efectos inmediatos externos. 2. Toxicidad por la ingestión de fuel. 3. Efectos a largo plazo. Efectos inmediatos externos 5.1. La contaminación con fuel del plumaje de las aves supone la pérdida de la capacidad de aislarse del agua, de la flotabilidad y de la habilidad para volar y buscar comida. Además, el plumaje sucio y mojado produce un incremento de los requisitos termorreguladores, con el consecuente incremento de la tasa metabólica basal. Para varios autores, la impregnación externa con fuel y, como consecuencia, la hipotermia, el agotamiento y la inanición, suelen causar el mayor porcentaje de bajas tras un vertido (Fry and Lowenstine, 1985; USGS, 1999). Sin embargo, existen evidencias de que las gaviotas tienen una habilidad para digerir alimentos no usuales en sus dietas y tener un grado de resistencia en sus sistemas digestivos mayor a los de otras aves marinas; estas características son importantes en la limpieza de petróleo del plumaje. En observaciones realizadas en gaviotas durante 30 años, se pudo comprobar que casi la totalidad de las gaviotas que se limpiaron por sí mismas del petróleo del plumaje lograron sobrevivir y ser exitosamente reproductivas (Camphuysen, 2011). El petróleo, inclusive en pequeñas cantidades apreciables en agua de mar provoca una alteración de la microestructura del plumaje, poniendo en evidencia una relación entre las descargas realizadas por las plataformas petroleras y la mortalidad de aves marinas (O'Hara and Morandin, 2010). Toxicidad por la ingestión de fuel 5.2. La ingestión de fuel al intentar limpiarse el plumaje produce irritación intestinal, e incluso hemorragias con sangrado dentro de la luz intestinal. Dependiendo de la composición química del fuel ingerido, se han descrito distintas alteraciones a nivel digestivo. Así, por ejemplo, vertidos con alto contenido en naftalenos e hidrocarburos aromáticos (como el vertido del Prestige) producen deterioro de la mucosa intestinal, incluyendo una alteración en el transporte sodio-agua que provoca deshidratación y estrés hídrico (Fry and Lowenstine, 1985). El deterioro en el 44 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” funcionamiento de la glándula de la sal 7 contribuiría a la alteración de la función osmorreguladora (USGS, 1999). Diversos estudios que evalúan la toxicidad del petróleo en el sistema inmune demostraron que el número de leucocitos (especialmente linfocitos) están disminuidos en la circulación y en los principales órganos linfoides (bazo y bolsa de Fabricio); a su vez, la hipercelularidad de la médula ósea junto con el aumento de la eritropoyesis demuestran una respuesta celular (producción de eritrocitos) a la anemia hemolítica. Las infecciones bacterianas y fúngicas frecuentes en los centros de rescate sugieren alteraciones del sistema inmune; de hecho, la mala absorción de nutrientes y el daño de la mucosa intestinal determinan por si mismas una inmunosupresión. También se observó que los elementos químicos del petróleo provocan concentraciones anómalas y aceleración del metabolismo de los corticosteroides adrenales (Briggs et al., 1997; Briggs et al., 1996; Rattner et al., 1984). En un estudio llevado a cabo tras la realización de la necropsia en 67 ejemplares de arao común recogidos en las costas de Bélgica y Holanda durante el invierno de 1993-1994 (zona de alta contaminación por petróleo proveniente de la industria), las observaciones más frecuentes fueron gastroenteropatía aguda hemorrágica y caquexia, y en un 36% de las aves recogidas se halló fuel en el intestino. También se observaron úlceras gástricas agudas y depósitos de uratos (Jauniaux et al., 1998). En cuanto a los hallazgos macroscópicos asociados a la ingestión de crudo, Fry y Lowenstine (1985) observaron múltiples focos de necrosis e inflamación en la parte superior del tubo digestivo en siete ejemplares de arao común que procedían de un vertido accidental de fuel con las mismas características que el vertido del Prestige (Bunker C oil). Describen también depósitos renales de uratos característicos de la gota visceral y signos de necrosis renal. La absorción de fuel con gran cantidad de hidrocarburos aromáticos produce también anemia hemolítica con formación de cuerpos de Heinz (Leighton, 1985, 1986). En estudios experimentales, el grupo de Leighton indujo la aparición de anemia hemolítica en aves marinas a los 4-5 días del comienzo de la ingestión de crudo concluyendo que, la presencia de cuerpos de Heinz, es una evidencia clara de toxicidad primaria del fuel sobre los hematíes, producida por un mecanismo intravascular de hemólisis por oxidación. Otros autores también confirman que los hematíes son el primer objetivo de la toxicidad del crudo (Yamato et al., 1996). Tras el vertido accidental de 180 toneladas de crudo procedente de Kuwait, ocurrido en Portland, Victoria (EE.UU.), McOrist y Lenghaus (1992) realizaron la necropsia de veintidós pingüinos 7 Se encuentran en aves y reptiles y se encargan de secretar un líquido muy concentrado en sales. Ocupa depresiones superficiales en el cráneo por encima de los ojos. I N T R O D U C C I Ó N | 45 expuestos al fuel, encontrando un moteado marrón-rojizo y pequeños focos puntuales blanquecinos en el hígado (McOrist and Lenghaus, 1992). Tras la necropsia de 27 patos muertos como consecuencia del vertido causado por la colisión de un petrolero en el puerto de Tomakomai (Japón), no se observaron hallazgos significativos, ni evidencias de hemorragia interna o externa; tan sólo tres de los 27 patos presentaban una coloración hepática verde oscura (Yamato et al., 1996). Tras el examen postmortem de 11 aves (gallinas de agua) contaminadas con crudo en el río San Gabriel en Huntington Beach, California, por la rotura de un oleoducto, se observó enteritis, hepatitis, necrosis hepática y un pigmento sugestivo de neumoconiosis en el pulmón (Newman et al., 2000). En el hígado de aves marinas afectadas por vertidos, también se ha observado la presencia de degeneración hepática e infiltración grasa con incremento de actividad de las enzimas hepáticas. En cuanto a las lesiones en riñón, se ha descrito gota visceral y necrosis renal focal tras la contaminación por fuel (Szaro et al., 1978; Szaro et al., 1981). Los efectos sub-agudos provocados por el petróleo del Prestige en gaviotas patiamarillas expuestas durante 17 meses después del accidente, ponen de manifiesto la correlación con los niveles más elevados de HAPs frente a las gaviotas de zonas no afectadas por el petróleo; además, en estas gaviotas afectadas, se observaron mayores actividades enzimáticas AST y GGT, siendo indicadores de daño renal y hepático (Alonso-Álvarez et al., 2007a). Para comprobar estos resultados, se administró a las aves, de forma experimental, fuel proveniente del Prestige y a un grupo control, aceite vegetal, coincidiendo los resultados obtenidos, de forma general, con los evaluados en el estudio anteriormente citado; sin embargo la actividad de la GGT fue opuesta; estos resultados demuestran que las actividades de estas enzimas varían según se trate de formas de intoxicación sub-aguda o aguda (Alonso-Álvarez et al., 2007b). Los estudios llevados a cabo en peces después de los vertidos, ponen de manifiesto en muchos casos el aumento de la actividad enzimática del citocromo p-450, p-4501A (CYP1A) y los compuestos aromáticos fluorescentes biliares (CAB); todos ellos indican un daño debido al petróleo; sin embargo la mayoría de los HAPs encontrados en petróleo son de 2 o 3 anillos, y estos no afectan de manera severa al citocromo p-450. Los HAPs al cabo de un año ya no son apreciables en el medio ambiente debido a su evaporación, pudiendo tener resultados falsos de desintoxicación; así muchos autores sugieren el análisis de los niveles de citocromo p-450, CYO1A y CAB de forma rutinaria para poder compararlos con los niveles posteriores a derrames de petróleo (Lee and Anderson, 2005). 46 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Efectos a largo plazo 5.3. Los efectos de los derrames de petróleo dependen de varios factores, tales como parámetros físicoquímicos del petróleo, características del medio afectado (procesos físicos, químicos y biológicos), evaporación, disolución, dispersión, emulsión, foto-oxidación, biodegradación y sedimentación; la relación de todos estos fenómenos va a ser importante en el estudio del daño a los organismos marinos, en especial a las aves, que por estar en la parte superior de la cadena trófica van a bioacumular, y debido a la ingesta de organismos del medio, van a biomagnificar los contaminantes del petróleo (Rogowska and Namieśnik, 2010). Las aves marinas adultas expuestas directamente al fuel pueden sufrir efectos residuales a largo plazo. El estudio de las aves marinas como bioindicadores debe de realizarse conjuntamente entre varios especialistas, y debe afrontarse con una metodología de investigación minuciosa para la obtención de mejores resultados de investigación (Mallory et al., 2010). Se considera que el daño hepático puede ser permanente, o de recuperación muy lenta, y que lesiones renales como la necrosis tubular, podrían ocasionar un desequilibrio hidroelectrolítico también permanente (Fry and Lowenstine, 1985). En Sudáfrica, se rehabilitaron pingüinos afectados por un vertido en 1981, observándose que sólo el 20% de ellos tuvo éxito reproductivo, lo que indica que los problemas a largo plazo de la contaminación en aves marinas son de difícil pronóstico (Fry and Lowenstine, 1985). Entre otros, se ha descrito una disminución en la puesta de huevos, una reducción de la fertilidad, una disminución en la producción de esperma y efectos embriotóxicos tales como la disminución del crecimiento embrionario, malformaciones y un menor número de crías viables (USGS, 1999). Asimismo, las aves expuestas a la contaminación durante la temporada reproductiva, pueden transferir dosis letales del contaminante de su plumaje a los huevos durante la incubación (Fry and Lowenstine, 1985). En varios estudios experimentales en embriones de pollo para demostrar la embriotoxicidad del crudo procedente de la Prudhoe Bay, tras aplicar pequeñas cantidades de crudo en la superficie de los huevos en distintos días de incubación, los embriones podían aparecer muertos, o con lesiones graves tales como necrosis hepática, mineralización renal y edema subcutáneo (Albers, 1978; Couillard and Leighton, 1989, 1990a, b). Los estudios poblacionales realizados en la isla Príncipe William Sound en Alaska, en una zona afectada por el vertido del petrolero Exxon Valdez, mostraron que la población de aves afectada no solo no se había recuperado 9 años después del accidente, sino que seguía disminuyendo (Lance et al., 2001; Peterson, 2001). En una revisión bibliográfica llevada a cabo en 2006 (17 años después I N T R O D U C C I Ó N | 47 del accidente), se mostró que los ecosistemas estaban recuperados de los impactos del petróleo (Harwell and Gentile, 2006); no obstante, recientes estudios han puesto de manifiesto el aumento de la actividad del CYP1A en patos arlequines (Histrionicus histrionicus), concluyendo que aún 20 años después del accidente se observaron las consecuencias (Esler et al., 2010); de igual manera se hizo una observación similar en porrones islándicos de la misma zona (Bucephala islandica) (Esler et al., 2011). En estudios realizados en el golfo de Nueva York, una zona que ha sido importante puerto naval durante la Segunda Guerra Mundial, se observaron gaviotas y charranes que presentaban niveles tóxicos de cadmio, plomo y mercurio (Burger and Gochfeld, 2000a; Burger et al., 1992), concluyendo que en aves marinas existe una contaminación ambiental por estos metales (contaminación de origen antropogénico); estos mismos autores también estudiaron los niveles de metales pesados en las costas de Hawai concluyendo que pueden existir diferencias entre las distintas especies estudiadas, como el caso del charrán blanco y albatros de patas negras. Las especies de aves más afectadas por el vertido del Prestige han sido el arao común (Uria aalge) (52%), frailecillo atlántico (Fratercula arctica) (17%), alca común (Alca torda) (16%), gaviota patiamarilla (Larus cachinnans) (3%), alcatraz atlántico (Morus bassanus) (3%), cormorán moñudo (Phalacrocorax aristotelis) (2%) y otras especies (7%) (SEO/BirdLife, 2003). Las especies de arao común, frailecillo atlántico y alca común, pertenecientes a la familia Alcidae (álcidos), tienen sus mayores colonias de reproducción en el norte de Europa. Cuando finaliza la época de cría, emigran hacia el sur para invernar. La costa atlántica ibérica y el mar Cantábrico son lugares de paso de estas aves durante su migración, aunque algunas de ellas se pueden quedar a pasar el invierno. Los efectos negativos de la intoxicación por fuel sobre la reproducción, pueden afectar gravemente a la recuperación de las poblaciones de aves marinas con un bajo potencial reproductivo, como es el grupo de los álcidos, cuyas especies tan sólo ponen un huevo al año (Svensson et al., 2000; Votier et al., 2005). Por otra parte, estudios realizados en paíños europeos (Hydrobates pelagicus) afectados por el Prestige probaron que estas aves evitan el proceso reproductivo como respuesta para la supervivencia (Zabala et al., 2011). Respecto a las aves marinas en Galicia, existen estudios sobre la contaminación de aguas marinas por metales pesados en las Rías gallegas (Cobelo-García and Prego, 2003; Pérez-López et al., 2003; Pérez-López et al., 2006; Pérez López et al., 2004; Pérez López et al., 2003), pero son pocos los llevados a cabo sobre la contaminación de estos metales procedentes del petróleo y ninguno que demuestre la relación entre su presencia y posibles lesiones histopatológicas. Los metales pesados presentes en el medio marino, tales como cadmio, mercurio y plomo, han demostrado su toxicidad a bajas concentraciones. En cambio, otros como el cromo, hierro, 48 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” manganeso, zinc, etc. a pesar de ser biológicamente esenciales, pueden llegar a ser tóxicos a concentraciones elevadas (Burger et al., 2007b; Coppock and Dziwenka, 2011; Overgaardnielsen and Runedietz, 1989). Algunos investigadores han tratado el impacto de la contaminación marina por metales sobre aves marinas (Otero Pérez, 1998), concretamente el mercurio sobre gaviotas patiamarillas en las Islas Cíes. Las aves marinas constituyen el grupo de vertebrados más afectados por los vertidos de petróleo, presentando diversas patologías ligadas a la pérdida de la capacidad repelente de sus plumas al agua tras la impregnación, lo cual se agrava por la ingestión-inhalación de fuel, dada la elevada toxicidad de sus componentes, entre ellos de los metales pesados. Otros autores estudiaron la bioacumulación de dichos metales en el hígado y riñón de aves marinas del Océano Atlántico canadiense, llegando a asociar histológicamente el daño tisular en estos órganos con los niveles elevados de metales pesados (Elliott and Scheuhammer, 1992). Sobre esos mismos órganos, también se ha estudiado el contenido de vanadio en aves marinas petroleadas en la Costa Atlántica francesa por el accidente del Erika, determinando que las concentraciones en hígado y riñón de este elemento no son biomarcadores apropiados para la determinación de contaminación de vanadio (Kammerer et al., 2004). Los protocolos para evaluar la calidad sanitaria del pescado están diseñados desde la perspectiva de los HAPs, sin embargo, el contenido de metales pesados también debería tenerse en cuenta para hacer una evaluación real del riesgo toxicológico de ingerir alimentos contaminados y evaluar la mejora del medio ambiente (Gohlke et al., 2011). Así pues, el mundo científico es consciente de que la contaminación ambiental por metales pesados constituye una amenaza para la supervivencia y reproducción de las poblaciones de aves marinas. A través del estudio de los cadáveres de aves petroleadas se puede obtener una gran cantidad de información que permite profundizar en el conocimiento y el desarrollo de medidas más eficaces para mejorar su conservación. O B J E T I V O S | 49 II. OBJETIVOS 56 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” A los cadáveres se les practicó una necropsia reglada que comenzaba con la inspección externa, determinación del desarrollo músculo-esquelético y reserva de grasa, características del plumaje y grado de impregnación externa con fuel, examen de las alteraciones en la piel y de las alteraciones presentes en los orificios naturales: ojos, boca, opérculo auditivo, narinas y cloaca, y examen de la mucosa oral y paladar (Figura 15). Tras la apertura de las cavidades internas, se llevó a cabo la inspección sistemática de todos los órganos internos, describiendo todas las lesiones macroscópicas observadas, anotando especialmente la presencia o ausencia de fuel en el tubo digestivo y el sexo de las aves. Se tomaron fotografías digitales de todas las lesiones observadas mediante una cámara digital Olympus E-20p. Durante el examen postmortem se determinó la especie, para lo cual se tuvieron en cuenta características fenotípicas como el tamaño de las aves y de las alas, el color y la forma del pico, el color del plumaje y de las patas, etc. Para clasificar el grado de impregnación externa con fuel, se establecieron 3 categorías de aves considerando como criterio la extensión de superficie corporal impregnada. Así, se clasificaron como:  Aves limpias o poco manchadas: aquellas que presentaban un aspecto externo del plumaje aparentemente normal, con la presencia de manchas muy pequeñas.  Aves manchadas: aquellas que presentaban manchas de fuel más grandes, pero que todavía mantenían la mayoría de la superficie corporal libre de fuel.  Aves muy manchadas: aquellas que presentaban fuel en la mayor parte de la superficie corporal, pudiendo incluso estar totalmente cubiertas. Figura 15. Inspección externa de un ave marina afectada por el petróleo, observándose la impregnación en una de las patas. M A T E R I A L Y M É T O D O S | 57 Durante la necropsia de las aves marinas petroleadas, se observó que gran cantidad de ellas estaban parasitadas, procediendo a la evaluación de la incidencia de la parasitación por los nematodos intestinales detectados, puesto que hay pocas ocasiones en las cuales un equipo de investigación puede disponer de un número tan elevado de aves salvajes para estos estudios (429 aves de diferentes especies). Los parásitos encontrados en las aves se aislaron y procesaron para determinar su especie. Histopatología 1.2. En el servicio de Anatomía Patológica se llevó a cabo el estudio histopatológico de las muestras de tejidos recogidas durante la necropsia, con el objetivo de determinar la causa de la muerte así como las implicaciones etiopatogénicas de la ingesta masiva de fuel en la mayoría de aves, aplicando la siguiente metodología: Durante la necropsia de las aves marinas se recogieron muestras de diversos órganos: hígado, riñón proventrículo, molleja, intestino delgado, ovario, músculo pectoral, pulmón y bazo para su posterior estudio. Una proporción importante de los cadáveres mostraron signos de autolisis muy avanzada que, si bien permitían un estudio macroscópico de lesiones, la identificación de la especie, la determinación de sexo, la presencia/ausencia de fuel en el aparato digestivo o el grado de contaminación externa, etc., no eran viables para el estudio microscópico; por ello, de las 429 aves recibidas sólo se consideraron para el estudio histopatológico las muestras de 148 aves que se encontraron en buen estado de conservación y sin signos macroscópicos de autolisis. Una vez realizado el procesado histológico, que se describe más adelante, los tejidos de 18 aves mostraron lesiones autolíticas microscópicas que imposibilitaron su estudio adecuado, por lo que tuvieron que ser descartadas, quedando al final disponibles muestras de tejidos de 127 aves de diferentes especies. Para los estudios de microscopía óptica, las muestras recogidas en la necropsia se fijaron en solución de Bouin alcohólico durante 24 horas y a continuación se mantuvieron en alcohol de 70º hasta su inclusión en parafina, para extraer el ácido pícrico de la solución fijadora. La inclusión en parafina se llevó a cabo en un inclusor automático ThermoShandon CITADEL 2000. Para esta inclusión, las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (70º a 100º), se incubaron en dos soluciones de xileno (100%) y se embebieron en parafina Gurr o Vogel con punto de fusión 56-57 ºC. Los bloques de parafina se confeccionaron en un centro de inclusión de tejidos Leica EG 1150H. Los bloques de parafina con las muestras se cortaron en un micrótomo Leica RM 2115 en secciones de 4-5 micras de grosor. Tras desparafinar en xileno e 58 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” hidratar las secciones en concentraciones decrecientes de etanol, estas se tiñeron con HematoxilinaEosina (Hematoxilina de Harris) para el estudio histopatológico de rutina. Las muestras de tubo digestivo (proventrículo, molleja e intestino) también se tiñeron con la técnica de Gram, para la identificación de bacterias en la luz intestinal. Estudio Histoquímico 1.3. Las muestras de bazo, hígado y riñón de las aves se tiñeron con la tinción histoquímica de Perls 8 . Esta técnica se utiliza para detectar el hierro que se localiza en las células en forma de gránulos de hemosiderina que es insoluble, pero no detecta el hierro contenido en la ferritina que es hidrosoluble. La tinción de Perls (o reacción del azul de Prusia) se basa en la liberación de los iones férricos asociados a proteínas mediante la acción del ácido clorhídrico; a su vez, los iones férricos liberados reaccionan con el ferrocianuro potásico formando un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico o azul de Prusia. Tras la reacción, los núcleos se contrastan con rojo neutro, así se permite reconocer la posible existencia de depósitos de hierro, como un signo de diagnóstico característico de la anemia hemolítica. Las secciones de tubo digestivo (proventrículo, molleja e intestino) y pulmón se tiñeron con la técnica de PAS-Azul Alcián, para resaltar la posible presencia de parásitos u hongos en los tejidos. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) 1.4. Para su estudio e identificación mediante SEM, los parásitos aislados del tubo digestivo de las aves se fijaron con glutaraldehído al 2.5%. Con el fin de llevar a cabo una primera identificación mediante estereomicroscopía y microscopía óptica, los parásitos fueron aclarados con lactofenol siguiendo los protocolos estándar (Berland, 1982). Para su observación con el microscopio electrónico de barrido, los parásitos fueron lavados en etanol 70º mediante sonicación 9 para eliminar restos de suciedad; posteriormente, se sometieron a una deshidratación gradual en concentraciones crecientes de etanol y, tras alcanzar el punto crítico (Balzers CPD 020), se metalizaron con oro-paladio en un sombreador Jeol JFC-11000, y se 8 Max Perls (1843-1881), patólogo alemán. 9 La sonicación es el acto de aplicación de la energía del sonido (generalmente ultrasonidos) para agitar las partículas de una muestra, con diversos fines científicos o industriales. M A T E R I A L Y M É T O D O S | 59 examinaron y fotografiaron en el microscopio electrónico de barrido JSM-T220A del Servicio de Investigación Agrobiológica del Campus de Lugo-USC. 2. DETERMINACIONES TOXICOLÓGICAS Material y reactivos 2.1. 2.1.1. Reactivos  Agua ultrapura milli-Q, proporcionada por el sistema de purificación por ósmosis inversaMillipore  Ácido nítrico Suprapur®65 %. Merck  Peróxido de hidrógeno Suprapur® 30 %. Merck.  Materiales de referencia: o Músculo bovino: Reference material 8414 Bovine Muscle Powder o Hígado bovino: Certified reference material BCR – 185 – R 2.1.2. Equipos instrumentales  Equipo de purificación de agua milli-Q. Millipore.  Balanza analítica. Modelo: Basic series B 220S. Precisión 0.0001 g. Sartorius.  Estufa para desecación. Modelo: Conterum. Serie 2000. Selecta.  Estación microondas. Modelo: ETHOS Plus 20. Milestone.  ICP – MS (Espectrometría de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo) Varian 820-MS de interfaz de reacción de colisión (CRI). Se empleó también, diverso material de uso habitual en el laboratorio, como son matraces aforados, micropipetas, vasos de precipitados, crisoles de porcelana, embudos, etc. 2.1.3. Muestras Se trabajó con muestras de 6 especies (Tabla 3). La población total de aves fue de 429 animales y debido al estado de autolisis de los cadáveres, se seleccionó una muestra significativa de 148 individuos. Durante la realización de la necropsia de las aves marinas, se tomaron muestras en fresco de hígado y riñón, debido a que son tejidos blandos que disponen de mecanismos específicos para acumular elementos inorgánicos como los metales pesados. Estas muestras se congelaron a -20 ºC en tubos de microcentrífuga (Eppendorf®), hasta su procesado. 60 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 3. Muestras de especies y órganos para el análisis toxicológico. Métodos analíticos 2.2. 2.2.1. Preparación de las muestras En el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Veterinaria (USC-Campus de Lugo), las muestras de órganos se descongelaron en el frigorífico (4 ºC) durante un período de 12 horas para evitar la pérdida de humedad. A continuación, se procedió a un troceado de las mismas lo más fino posible mediante un bisturí, y posteriormente al homogeneizado, con un homogeneizador de vidrio borosilicatado con émbolo-pistón en teflón (PTFE) estriado. Seguidamente, en una balanza de precisión, se procedió al pesado exacto de una porción de homogeneizado (duplicado), en un rango de peso entre 0.4 y 0.5 g, en los vasos de teflón, previamente tarados, que se habrían de emplear para la mineralización-digestión en una estación microondas. De forma paralela se preparó, también, una tercera muestra de cada porción de homogeneizado, que se pesó en un crisol de porcelana y posteriormente se desecó en estufa de aire (70 ºC) hasta peso constante, para así determinar el peso seco de las muestras. 2.2.2. Digestión de las muestras por microondas La digestión de las muestras se llevó a cabo en una estación microondas de laboratorio, modelo ETHOS Plus 20 Milestone®, equipada con vasos cerrados de teflón TFM (Figura 16) capaces de resistir presiones de hasta 100 bar y temperaturas de hasta 280 °C. Especie Muestras Órgano Alca común (Alca torda) 64 Hígado Riñón Arao común (Uria aalge) 56 Hígado Riñón Frailecillo atlántico (Fratercula árctica) 8 Hígado Riñón Gaviota patiamarilla (Larus michahellis) 14 Hígado Riñón Alcatraz atlántico (Morus bassanus) 2 Hígado Riñón Cormorán moñudo (Phalacrocorax aristotelis) 4 Hígado Riñón Total de muestras 148 de Hígado y Riñón M A T E R I A L Y M É T O D O S | 61 Para la mineralización de las muestras, se procedió a la digestión por vía húmeda con mezcla de ácidos suprapuros utilizando una variante del método EPA 3052 (EPA, 1996). En cada vaso de teflón se introdujo una cantidad de aproximadamente 0.5 g de submuestra (para cada muestra el proceso se realizó por duplicado), pesada exactamente mediante balanza analítica de precisión. Posteriormente se añadió una mezcla de 7 mL de ácido nítrico suprapur al 65% y 1 mL de peróxido de hidrógeno suprapur al 30%, alcanzando de este modo el volumen mínimo necesario de 8 mL. Después los vasos se cerraron con una llave dinamométrica ajustada a una fuerza de 25 newtons y se introdujeron en el microondas. Tal como se muestra en la Tabla 4, el proceso de digestión de las muestras tuvo una duración total de 18 minutos y medio, divididos en 3 etapas, de distinta duración e intensidad. Tabla 4. Protocolo de proceso de digestión por microondas. Duración (min) Potencia (W) Temperatura (ºC) 2´30” 250 150 4´30¨ 450 170 11´30¨ 650 185 Una vez completadas las etapas correspondientes a la digestión, tuvo lugar un proceso de ventilación, dentro del propio microondas, de 25 minutos de duración, tras el cual pudieron ser extraídos los vasos y abiertos con precaución, siempre y cuando la temperatura del sensor no superara los 30 ºC, a fin de no perder volátiles y por seguridad, empleando una llave dinamométrica. Figura 16. Equipo de Microondas del Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela – Campus Lugo. 62 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Las disoluciones obtenidas se enrasaron a 50 mL con agua milli-Q en matraces aforado y finalmente se transfirieron a frascos de polietileno, guardándose en refrigeración hasta su análisis por ICP-MS. Paralelamente se procesaron blancos y muestras de material de referencia para comprobación de la precisión y exactitud del método. 2.2.3. Determinación de los metales por ICP-MS Todas las muestras preparadas se remitieron al Servicio de la Red de Infraestructuras de Apoyo a la Investigación y al Desarrollo Tecnológico (RIAIDT) - Edificio CACTUS (Campus de Lugo - USC), para ser analizadas mediante la técnica de ICP-MS (Figura 17). El equipo empleado fue el espectrómetro ICP-Masas Varian 820. La gestión del instrumental se realizó bajo el programa ICP-MS Expert siguiendo el protocolo establecido por el servicio universitario, comprendiendo la determinación de los 12 elementos correspondientes al estudio específico solicitado. Todos los datos obtenidos están expresados en ppm p.s. de muestra. 2.2.4. Control de calidad del método Sensibilidad y límites de detección La sensibilidad del método se determina en función de los límites de detección establecidos para el espectrómetro ICP-MS Varian 820 del servicio del RIADT-CACTUS-Lugo (USC, 2012). El límite de detección se define como el mínimo resultado a partir del cual resulta posible determinar la presencia del analito con una seguridad estadística razonable (Tabla 5). Figura 17. Espectrómetro ICP-MS-Edificio CACTUS-Lugo. M A T E R I A L Y M É T O D O S | 63 Tabla 5. Límites de detección de los elementos químicos estudiados. Los datos están expresados en ng/L o ppt (Se muestran los isótopos para cada elemento). 75As 111Cd 59Co 63Cu 52Cr 57Fe 55Mn 202Hg 206Pb 78Se 51V 68Zn 0.6 0.2 0.2 1 0.6 44 0.44 S.D. 0.1 2 0.2 1 Los niveles mínimos hallados en el presente estudio se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Nivel mínimo detectado de los elementos químicos evaluados en las muestras del presente estudio con la técnica de ICP-MS. Elementos analizados Nivel mínimo de detección (Concentración expresada en ppm p.s.) Hígado Riñón Arsénico 12.3820 0.5334 Cadmio 0.7312 0.9229 Cobalto 0.0897 0.1451 Cobre 0.1155 0.0838 Cromo 0.0503 0.0542 Hierro 7526.1000 2401.0430 Manganeso 106.0890 79.0680 Mercurio 0.8691 16.4730 Plomo N.D. N.D. Selenio 33.6720 68.6810 Vanadio 0.2216 0.1866 Zinc 1059.8900 992.0140 *N.D.: No detectado Precisión del método La precisión se define como la diferencia entre los resultados obtenidos aplicando quince veces el procedimiento experimental en las mismas condiciones establecidas (DOUE, 2002). Para poder valorar la precisión se calculó el coeficiente de variación (CV) de la media de varias réplicas de una misma disolución de una muestra, teniendo en cuenta la ecuación: = Desviación estándar de N muestras = Media de las muestras Los coeficientes de variación obtenidos en el presente estudio se muestran en la Tabla 7, estos coeficientes bajos permiten considerar que el método analítico es reproducible y preciso, además para el presente estudio se realizaron dos repeticiones para cada muestra estudiada. 0N   X 0100 N CV X    64 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 7. Coeficiente de variación (%) de la media de 15 réplicas de una misma muestra 75As 111Cd 59Co 63Cu 52Cr 57Fe 55Mn 202Hg 206Pb 78Se 51V 68Zn 4.72 4.55 6.80 2.59 3.93 5.94 4.26 3.46 1.44 4.36 1.36 3.41 Exactitud del método La exactitud se define como la diferencia entre el valor certificado y el resultado medio que se obtendría aplicando el procedimiento experimental sucesivamente (DOUE, 2002). La forma más adecuada de investigar la exactitud del método es utilizar un material de referencia con un contenido certificado de los elementos a estudiar. Como materiales de referencia se utilizaron: músculo bovino (Reference Material 8414 Bovine Muscle Powder Agriculture Canada from National Institute of Standards and Technology) e hígado bovino (Certified Reference Material BCR - 185R). En el caso de análisis repetidos de un material de referencia certificado, la diferencia entre la media y el valor certificado, expresada como porcentaje del valor certificado, no deberá superar un límite de ±10 %. Los resultados recogidos en la Tabla 8 fueron calculados empleando la ecuación: Así en la Tabla 8, para el control de la calidad del método, se muestran los resultados obtenidos en el análisis de las concentraciones de los 2 materiales de referencia utilizados. Las concentraciones están expresadas en ppm p.s. Tabla 8. Control de calidad del método utilizando como material de referencia músculo bovino e hígado bovino. Elemento químico Músculo Bovino Concentración determinada Porcentaje de recuperación Hígado Bovino Concentración determinada Porcentaje de recuperación Arsénico 0.009 ± 0.003 0.0093 ± 0.0012 103.88 ± 13.59 0.0330 ± 0.002 0.0326 ± 0.0047 98.84 ± 14.32 Cadmio 0.013 ± 0.011 0.0126 ± 0.0023 97.18 ± 17.76 0.544 ± 0.017 0.6049 ± 0.0433 111.20 ± 7.97 Cobalto 0.007 ± 0.003 0.0062 ± 0.0006 89.79 ± 9.40 Cobre 2.84 ± 0.45 3.1620 ± 0.3218 111.34 ± 11.33 277 ± 5 298.382 ± 20.09 107.71 ± 7.25 Cromo 0.007 ± 0.003 0.0062 ± 0.0006 89.79 ± 9.40 Hierro 71.2 ± 9.2 78.115 ± 6.386 109.71 ± 8.97 Manganeso 0.37 ± 0.09 0.327 ± 0.033 88.58 ± 9.08 11.07 ± 0.29 12.147 ± 0.547 109.73 ± 4.94 Mercurio 0.005 ± 0.003 0.0065 ± 0.0003 130.52 ± 6.70 Plomo 0.38 ± 0.24 0.3408 ± 0.034 89.70 ± 9.15 0.172 ± 0.009 0.1562 ± 0.011 90.84 ± 6.50 Selenio 0.076 ± 0.010 0.0719 ± 0.0069 94.66 ± 9.18 1.68 ± 0.14 1.791 ± 0.085 106.61 ± 5.07 Vanadio 0.005 0.0058 ± 0.0008 116.50 ± 16.09 Zinc 142 ± 14 152.67 ± 7.85 107.51 ± 5.53 138.6 ± 2.1 146.771 ± 8.16 105.90 ± 5.88 Concentración obtenida Recuperación 100 Concentración del Material de Referencia Certificado  M A T E R I A L Y M É T O D O S | 65 2.2.5. Evaluación de resultados Cálculo de las concentraciones de los metales en las muestras Para el cálculo de las concentraciones de cadmio y mercurio en las muestras y expresarlas en µg/g o ppm peso fresco como se indica en la reglamentación (EPA 3052), es necesario realizar la conversión de los resultados obtenidos de los análisis, en función del peso fresco de la muestra y del volumen utilizado para diluirla según la ecuación: Dónde: X = Concentración de metal en peso fresco de muestra (µg/g, mg/kg o ppm) C = Concentración de metal en la disolución (µg/L) V = Volumen de dilución de la muestra (50 mL) P = Peso fresco de la muestra (g) Cálculo de peso seco en las muestras Se tomó una alícuota de hígado y riñón para someterla a calentamiento a 80 ºC en estufa de aire durante un período de 48 horas para calcular la cantidad de materia seca de cada muestra, obteniéndose porcentajes de 65% de materia seca para el riñón y 75% para el hígado, coincidiendo con los valores obtenidos por otros autores (Elliott and Scheuhammer, 1992). 3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO La obtención de cadáveres de aves marinas debido al accidente del petrolero, nos ha dado la oportunidad de realizar estudios en especies silvestres con un enfoque multidisciplinar utilizando animales que habitualmente son escasos en las costas de Galicia. También la determinación y evaluación de las concentraciones de elementos químicos en algunos de sus órganos, puede ser de utilidad como indicador de la calidad de la alimentación de estas aves, o del estado de contaminación de su entorno. Clasificación epidemiológica del presente estudio 3.1. Existen diversos criterios para la clasificación de los estudios epidemiológicos (MacMahon and Trichopoulos, 1996; Rothman, 2002; Webb and Bain, 2011); en el presente estudio se utilizaron los siguientes criterios: P VC X  72 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 73 1. INSPECCIÓN EXTERNA Determinación de la especie y el sexo de las aves 1.1. En la inspección externa determinamos la especie de las aves recibidas (Tabla 10), siendo identificados 220 ejemplares de alca común, 103 de arao común, 51 de frailecillo atlántico, 43 de gaviota patiamarilla, 6 de alcatraz atlántico y 4 ejemplares de cormorán moñudo, además de dos aves de especie no reconocida. Tabla 10. Especies y sexo de las aves marinas analizadas en el presente estudio. Familia Especie Sexo Total Macho Hembra Sin determinar ALCIDAE Alca común Alca torda 58 129 33 220 Arao común Uria aalge 28 74 1 103 Frailecillo atlántico Fratercula arctica 11 34 6 51 LARIDAE Gaviota patiamarilla Larus michahellis 4 20 19 43 SULIDAE Alcatraz atlántico Morus bassanus 3 2 1 6 PHALACROCORACIDAE Cormorán moñudo Phalacrocorax aristotelis 3 1 4 Total 107 260 60 427 (2 aves no reconocidas) La Dirección Xeral de Conservación da Natureza de la Xunta de Galicia realizó un seguimiento del número de aves recogidas vivas y muertas en las costas de Galicia, desde el 15 de noviembre de 2002 hasta el 31 de agosto de 2003, obteniéndose un total de 12 211 aves, de las cuales 2 469 (20.2%) se recogieron vivas y 9 472 (77.6%) se recogieron muertas (Xunta de Galicia, 2003). Entre las especies de aves marinas más afectadas se encontraron tres especies de álcidos: alca común (Alca torda), arao común (Uria aalge) y frailecillo atlántico (Fratercula arctica) que constituyeron el 80.5% del total de aves recogidas. El arao común, con 4 492 (36.8%) individuos recogidos (1 140 vivos y 3 352 muertos), fue la especie más afectada, seguida del alca común con un total de 2 861 individuos (589 vivos y 2 272 aves muertas), el frailecillo con 2 473 (168 vivas y 2 305 muertos), el cormorán con 380 individuos (146 vivos y 234 muertos) y el alcatraz atlántico con 432 animales (187 vivos y 245 muertos). La especie de gaviota más afectada fue la patiamarilla con 634 animales (103 vivos y 531 muertos). Teniendo en cuenta estos datos consideramos que el presente estudio es una muestra muy representativa de las aves marinas muertas durante la tragedia del Prestige. 74 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Impregnación de las aves por petróleo 1.2. Teniendo en cuenta el grado de impregnación externa con fuel, se observó que 228 aves (53.38%) de las aves pertenecían a la categoría de aves limpias o poco manchadas, 151 aves (37.43%) a la categoría de aves manchadas y 38 aves (9.17%) a la categoría de aves muy manchadas o cubiertas de fuel (Figura 18). Con los datos de la impregnación externa se realizó una tabla de contingencia para poner de manifiesto el tipo de impregnación en relación a la especie. En el grupo de las alcas, 97 aves (46%) se consideraron limpias, mientras que en 93 aves (44%) se observaron manchas dispersas, y 22 aves (10%) estaban completamente cubiertas de fuel. Los araos, en su mayoría (72 aves, 70%) no presentaban impregnación de fuel; en 24 de ellos (23%) se apreciaron restos de fuel externo y 7 aves (7%) estaban cubiertas de fuel. En el grupo de frailecillos 20 aves (40%) se encontaron limpias, mientras que en 22 aves (44%) se observaron manchas externas y ocho aves (16%) estuvieron completamente impregnadas por fuel. En las gaviotas evaluadas, 27 (68%) no presentaban restos de fuel, 12 aves (30%) mostraban manchas dispersas y tan sólo 1 ave (3%) estaba cubierta de fuel. La gráfica de las relaciones entre la impregnación externa y las especies se muestra en la Figura 19. A B C Figura 18. Impregnación de fuel en aves. (A) Limpia/poco manchada. (B) Ave manchada. (C) Ave muy manchada/cubierta de fuel. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 75 En la relación entre la impregnación externa por fuel y la especie de ave marina se obtiene un Chicuadrado de Pearson de 23.65, siendo el valor de p<0.001. El grupo de los araos y gaviotas presentaban casi un 70% de ejemplares limpios o poco manchados, mientras que en el grupo de las alcas y frailecillos la mayoría de los ejemplares aparecían manchados o muy manchados. El hecho de que los araos aparecieran más limpios, lo atribuimos a que la migración de esta especie llegó a las costas de Galicia unos días más tarde que la de alcas y frailecillos, cuando el mar ya no estaba tan contaminado y el fuel estaba más deshidratado y espeso, haciendo más dificil la impregnación. En el caso de la gaviota, la menor impregnación externa puede atribuirse al comportamiento etológico de esta especie, que se alimenta de restos de pescado en los puertos y que cuando pesca, lo hace muy superficialmente, al contrario que la familia buceadora de los álcidos. Asimismo, no hay que descartar que la impregnación externa por petróleo podría ser un evento posterior a la muerte del ave marina y no necesariamente la causa de esta (Bouquegneau et al., 2001). Además de la impregnación externa por petróleo, durante la inspección externa de las aves observamos algunos ejemplares con fracturas de las alas, de la columna, de la cola, sin patas y con hemorragias (Figura 20) y/o traumatismos en la región del cuello y la cabeza. En los últimos años, las poblaciones de aves marinas se han visto afectadas negativamente. Entre los principales motivos se encuentra el cambio climático del último siglo (Noyes et al., 2009), la Figura 19. Relación entre especies estudiadas y el tipo de impregnación externa de fuel. En las casillas se muestra el porcentaje y el número de aves afectadas (parte inferior). 76 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” sobrepesca (ICES, 2009) y la contaminación de las aguas por el petróleo o sus derivados (White and Wolfe, 1997). Desde los años 60, el museo de Estocolmo está evaluando el impacto medioambiental producido por el hombre o la naturaleza. En este museo se constituyó un banco de especies cuyo propósito es evaluar los niveles de contaminación medioambiental en el tiempo; en este tipo de estudios retrospectivos, los huevos de los araos (Uria aalge) han resultado ser buenos indicadores de la contaminación en el mar báltico (Odsjo et al., 1997). También en Galicia se ha planteado un proyecto para la elaboración de un banco de especies (Carballeira Ocaña and Aboal Viñas, 2000). Existen diversos organismos, desde insectos a roedores, que se consideran buenos bioindicadores del estado del medio ambiente (Kolf-Claw et al., 2007). Las aves marinas también se utilizan como bioindicadores del estado de las aguas, ya que por el nivel que ocupan en la cadena trófica, pueden acumular y ser biovectores de diferentes elementos químicos, tales como metales (Michelutti et al., 2010), algunos de ellos muy tóxicos (S&E, 2002). Durante muchos años, las aves también se han utilizado como indicadores de contaminación de las aguas por derivados de petróleo, especialmente en el Mar del Norte, de hecho, el análisis del petróleo de las aves se está utilizando para la trazabilidad del origen de la contaminación con fines legales (Furness and Camphuysen, 1997). Figura 20. Hemorragia subcutánea en alca común. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 77 La industria petrolera provoca un impacto negativo directo en las aves marinas, como se ha demostrado en Newfoundland (Canadá), un hábitat donde viven millones de aves (Wiese and Ryan, 2003), en el que hasta el 74% de las aves muertas presenta contaminación externa con petróleo. Está considerada una de las zonas del mundo con la mayor contaminación crónica por derivados del petróleo, ya que presenta mucho tráfico de barcos, al igual que Galicia. La mortalidad de las aves marinas por vertidos de petróleo es difícil de evaluar, aunque es bien conocido que el número de aves que se llegan a recoger, vivas o muertas, es solo un pequeño porcentaje de los ejemplares realmente afectados (García et al., 2003). Diversos estudios han demostrado que sólo una cuarta parte o menos de las aves marinas afectadas por vertidos de petróleo aparecen muertas en las costas, ya que el resto desaparece en el mar o se hunden porque no pueden volar (Michel, 2001). Entre los factores que determinan la probabilidad de que el ave sea encontrada destacan: la distancia desde el punto de impregnación hasta la costa, el grado de impregnación del plumaje, la composición y toxicidad del fuel, la dirección e intensidad del viento, la velocidad y dirección de las corrientes marinas, el tipo de costa y su accesibilidad, la predación de los cadáveres además de la época del año y la intensidad de la búsqueda de las aves, todos ellos factores que pueden variar con cada vertido. En experimentos de liberación de bloques de madera de distintos tamaños y pesos simulando diferentes especies de aves, se ha estimado una recuperación de aves de entre un 0.7%, cuando los bloques se liberaron con viento en alta mar, y de un 61% cuando se liberaron con viento en tierra (Flint and Fowler, 1998). En otro experimento realizado en las costas de Alaska se encontraron sólo un 16% de los bloques (Piatt et al., 1990). En cuanto a la evaluación en Galicia de la cantidad de aves que pudieron haber muerto después de la tragedia del Prestige, el uso de bloques pintados de amarillo dio un 16% de recuperación (Munilla et al., 2011), siendo todavía inferior el porcentaje obtenido en Asturias. En el caso del vertido del Prestige, los factores que determinan la probabilidad de recuperación de las aves han sido muy negativos, tales como la distancia considerable del punto de hundimiento del petrolero hasta la costa, el flujo continuo de fuel del pecio, los vientos y corrientes marinas en la época del invierno que empujaron a muchas aves mar adentro, la escasa accesibilidad de las costas de Galicia, de morfología muy indentada y rocosa que solamente permitió el trabajo de los voluntarios en las playas y áreas accesibles (aproximadamente 1/3 del total de costa afectada) y el importante flujo migratorio de aves marinas en el momento del vertido, de noviembre a diciembre, entre otros (García et al., 2003). Las aves son muy sensibles a los vertidos de petróleo, porque provocan en estas una pérdida de la impermeabilidad del plumaje y problemas de termorregulación y flotabilidad (Briggs et al., 1996). Entre los trastornos más frecuentes observados como consecuencia de los vertidos se encuentran la 78 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” hipotermia, deshidratación, pérdida de peso, malnutrición, trastornos intestinales, neumonía, lesiones hepáticas y renales (Kammerer et al., 2004), así como inmunodeficiencia por disminución en el recuento de leucocitos (Briggs et al., 1997). En cuanto a las aves que se recogen vivas en las costas después de un vertido, el éxito de supervivencia es muy variable y, en la mayoría de los casos, no muy alentador, ni a corto ni a largo plazo. Su recuperación va a depender de factores como la especie, el grado de impregnación externa con petróleo o la edad. En especies como el arao (Uria aalge) el grado de supervivencia es muy bajo, ya que son proclives a la impregnación externa debido a su continuo ejercicio de buceo en superficie, estimándose una supervivencia entre el 1 y 20% de los ejemplares recuperados un año después de su liberación (Mead, 1997). En el caso del Prestige, el porcentaje de rehabilitación de las aves recogidas fue del 10%, similar a otras catástrofes de este tipo (García et al., 2003). El mecanismo por el cual el petróleo afecta a las aves marinas impregnadas se inicia con la pérdida del aislamiento entre las plumas y la capa de aire que existe entre éstas y la piel, por lo que el agua moja el plumaje, provocando hipotermia y muerte del animal. Las aves semi-acuáticas o terrestres como las gaviotas, tienen mayores posibilidades de éxito de sobrevivir (Jenssen, 1994). R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 79 2. LESIONES OBSERVADAS EN LA INSPECCIÓN INTERNA Lesiones observadas tras el desollado 2.1. Tras el desollado, se observaron hemorragias en la musculatura de la región pectoral en 4 aves (1%) y edema subcutáneo en 3 aves (0.8%) (Figura 21). Lesiones en las cavidades corporales 2.2. Tan sólo 7 aves (2%) presentaron abundante grasa en la cavidad abdominal y alrededor del surco coronario; en las otras 420 restantes (98%) se observó una ausencia casi total de grasa corporal (Figura 22). De estas 7 aves, 5 pertenecían al grupo de las gaviotas, una era un frailecillo y otra un alcatraz; ninguna de estas aves presentaba fuel en el tracto digestivo; externamente tenían pocas manchas en su mayoría a excepción del frailecillo que estaba cubierto de fuel. Estas manchas A B C Figura 21. Lesiones observadas tras el desollado. (A) Hemorragia muscular en la región pectoral en un alca común. (B) Edema subcutáneo en un cormorán moñudo. (C) Edema subcutáneo en la región pectoral en un arao común. 80 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” externas de fuel, pueden ser debidas a un proceso de impregnación posterior a la muerte de estas aves. Son varios los estudios que señalan una baja condición corporal de las aves, vivas o muertas, encontradas tras un vertido, en coincidencia con nuestros datos. En Japón, en alca rinoceronte (Cerorhinca monocerata) se realizó un estudio de comparación entre aves petroleadas y otras muertas de forma accidental, observando que todas las aves petroleadas tenían una condición corporal baja, habiendo perdido el 60% del peso del hígado y un tercio de su peso corporal. Además, habían consumido el 90% de sus reservas de grasa y la médula ósea estaba reemplazada por líquido de edema (atrofia serosa). Estas aves petroleadas no murieron instantáneamente sino después de unos días, debido a las bajas temperaturas del agua y a la hipotermia secundaria, al no poder aislar el cuerpo con las plumas. Se estima que las aves consumieron sus reservas en dos días y luego murieron (Oka and Okuyama, 2000). En general, se considera que las aves moribundas permanecen en la costa durante un período de 5.3 a 13.3 días antes de morir. En el caso de los araos, la mayoría de los que se recuperan en las costas tienen una condición corporal muy baja y ausencia de grasa subcutánea (caquécticos), lo que indica que utilizan sus reservas de proteínas como último recurso energético junto con las reservas de grasa del hígado; en estas aves tan debilitadas también se observa con frecuencia gastroenteritis hemorrágica aguda (Bouquegneau et al., 2001). En un estudio realizado sobre un total de 67 araos recogidos entre noviembre de 1993 y marzo de 1994 en las costas de Bélgica, se encontró en el 70% de los individuos emaciación y B A Figura 22. Condición corporal de las aves. (A) Frailecillo bastante impregnado externamente con fuel mostrando abundante grasa en la cavidad abdominal. (B) Alca torda con ausencia de grasa abdominal, presencia de fuel en intestino y palidez del hígado y los riñones. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 81 gastroenteropatía hemorrágica aguda; la mayoría de las aves también presentaron impregnación de petróleo, quizás como consecuencia de las descargas de los sentinazos de los barcos en las aguas. En este estudio en concreto, no se relacionaron las lesiones con el grado de impregnación de petróleo, presentando además estas aves unos niveles de metales pesados y mercurio inferiores a los considerados como tóxicos (Jauniaux et al., 1998). En otro caso de mortalidad espontánea en el que aparecieron 3500 araos muertos en las costas de Alaska durante los seis primeros meses de 1993 se encontró que hasta un 60% de las aves recogidas presentaban signos de emaciación; en este caso se consideró que la causa de muerte fue principalmente la falta de alimentos derivada de las condiciones climáticas especialmente adversas (Piatt and Van Pelt, 1997). Como consecuencia del accidente del Prestige el Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario (SERIDA) de Gijón, Asturias, evaluó un total de 2465 aves muertas, describiendo como especies más afectadas el arao, el alca y el frailecillo. Al igual que en nuestro estudio, los hallazgos macroscópicos más frecuentes fueron la caquexia y emaciación en la mayoría de las aves; microscópicamente, la presencia de depósitos de hemosiderina, es compatible con un estado de caquexia asociada a anemia hemolítica. El grupo de animales que no sobrevivió al tratamiento en los centros de recuperación, presentó aspergilosis y ulceraciones que se consideraron provocadas por el estrés del tratamiento, concluyéndose como causa de muerte la deshidratación y el agotamiento de las aves, sobre todo de ejemplares juveniles (Balseiro et al., 2005). En nuestro estudio consideramos que en las aves provenientes de migraciones lejanas, como el frailecillo, sería esperable una baja condición corporal en el momento de la tragedia del Prestige, ya que el propio viaje de migración supone un consumo importante de las reservas grasas; aunque, también se observó un cadáver de frailecillo con abundante grasa (Figura 22-A), las otras 6 aves en las que observamos abundante grasa en su mayoría pertenecían al grupo de gaviotas; en ninguna de las 7 aves con buena condición corporal se observó la presencia de fuel en el intestino (Figura 22B), lo que indica que la ingestión de fuel pudo haber sido una causa importante de la emaciación de las aves en nuestro estudio, y no solamente el consumo de las reservas durante el viaje migratorio. 88 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Con los datos de la presencia o ausencia de fuel en el tubo digestivo realizamos una tabla de contingencia para poner de manifiesto las posibles diferencias en relación a la especie. Los resultados, altamente significativos, se muestran en la Figura 36. A B Figura 35. Restos de fuel en todo el aparato digestivo (A) Arao común, o solamente en intestino (B) Alca común. Figura 36. Presencia o ausencia de fuel en el tubo digestivo según la especie. En las casillas se muestra el porcentaje y el número de aves afectadas (parte inferior). R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 89 La relación entre la presencia de fuel en el aparato digestivo y la especie de ave arroja un valor de la prueba de Chi-cuadrado de 73.594 (razón de verisimilitud), siendo el valor de p <0.001. Comprobamos que las gaviotas apenas ingieren fuel en comparación con el grupo de los álcidos. Esto se explica por el comportamiento etológico de la gaviota que se alimenta de restos y pesca muy superficialmente, en comparación con alcas, araos y frailecillos que se sumergen, en ocasiones a grandes profundidades para conseguir el alimento. Diversos hallazgos sugieren que las aves marinas pueden consumir de forma intencionada, elementos extraños a su dieta normal, por ejemplo, los paíños de la familia de los hidrobátidos tienden a consumir ciertos desechos de petróleo que se pueden encontrar en el proventrículo y molleja una vez muertos, pudiendo llegar a regurgitarlos (Boersma, 1986). En otro estudio llevado a cabo durante varios años en las costas de Alemania, se propuso como la causa de muerte de los araos la ingestión de petróleo (Petermann et al., 1989). También en Japón, se han encontrado aves marinas capaces de ingerir grandes cantidades de residuos plásticos (Baba, 1994). En aves petroleadas arao aliblanco (Cepphus grylle) y gaviotas argénteas (Larus argentatus), se observó aumento en los niveles séricos de tirosina y corticosterona, incluso hasta 2 semanas después de la ingestión, interpretándose este desequilibrio hormonal como una de las causas del menor crecimiento asociado a la exposición de las aves marinas al crudo (Peakall et al., 1981). También en patos salvajes (Anas platyrhychos) a los que se administró petróleo mezclado con alimento se observó que después de los primeros dos días perdían hasta un 3.5% de su peso. No obstante, después de una semana ya no se observaron diferencias con el grupo control. Tampoco se observaron alteraciones en los niveles de corticosterona, glucosa, tiroxina, proteínas totales y ácido úrico ni en la actividad de las enzimas aminotransferasa (AST), alaninaminotransferasa (ALT) y butirilcolinesterasa (BCHE), pudiendo indicar que los patos resisten la ingesta de altas dosis de petróleo, 25 mL diarios durante una semana, sin que se observen signos de estrés (Rattner, 1981). En coincidencia con nuestros resultados, algunos estudios muestran que en araos (Uria aalge) sin impregnación externa de fuel, hasta un 83.6% de las aves estudiadas en las costas del Mar del Norte de Alemania presentaba fuel en el intestino (Bouquegneau et al., 2001), proventrículo y molleja, lo cual indica que la presencia de fuel en el tubo digestivo no se debe a la ingestión accidental durante la limpieza del plumaje, sino que realmente existe una atracción de las aves marinas hacia su consumo, probablemente favorecido por el olor o la forma de éste. Otra consideración interesante, que señalan diversos autores, es que la presencia externa de fuel en aves marinas no necesariamente indica que éstas hayan muerto a consecuencia del petróleo externo si no que pueden haberse impregnado después de la muerte (Arcos et al., 1995). 90 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” En experimentos realizados en ánades reales o azulones (Anas platyrynchos), se demostró que aceptan la ingestión de petróleo proveniente de diferentes lugares junto con el alimento, sin mostrar rechazo, en algunos casos llegando a consumir hasta el 50% de su peso en petróleo después de 100 días. Se observó que estas aves, en condiciones normales de temperatura y disponibilidad de alimento, podían sobrevivir varios días al igual que los animales del grupo control, aunque su ganancia de peso era inferior a la de las aves del grupo control, a pesar de que las aves que consumían petróleo mostraban hiperfagia. En cambio, en cuanto las aves se sometieron a condiciones de estrés como la disminución de la temperatura a 3ºC de forma crónica, se demostró que la ingestión de derivados de petróleo hacía a ese grupo de aves más sensibles a la muerte, ya que morían antes y en mayor número que el grupo control, mostrando en la autopsia hiperplasia adrenal y disminución grave de los tejidos linfoepiteliales (Holmes et al., 1978), lo que sugiere un efecto tóxico inmunosupresor de los derivados del petróleo. Posteriormente, en esta misma especie, se determinó que la mayor concentración de hidrocarburos provenientes del petróleo se acumulan en la grasa (Gay et al., 1980). Otro indicio, observado en los centros de recuperación de aves, que sugiere un efecto inmunosupresor en las aves marinas afectadas por petróleo, es su predisposición a padecer infecciones secundarias por bacterias y hongos. A ello habría que sumar otros factores de estrés, como la inflamación del tracto digestivo como consecuencia de la ingestión de fuel, que provoca una mala absorción de nutrientes y empeora el efecto inmunosupresor. Los animales que han ingerido derivados de petróleo presentan una disminución de la capacidad de fagocitar o destruir bacterias patógenas, siendo la inmunidad mediada por células la más afectada (Briggs et al., 1997). En ánades reales (Anas platyrhynchos) a los que se administró 3% de petróleo por vía oral, se observaron niveles menores de corticosterona en plasma hasta 500 días del experimento; estos niveles se estabilizaron a partir de ese momento por compensación metabólica de la vía hepática del naftaleno (Gorsline and Holmes, 1981). Esta relación entre la ingestión de fuel y un metabolismo acelerado de los corticoides de la corteza suprarrenal se ha puesto en entredicho por otros autores en estudios posteriores (Briggs et al., 1997), ya que este efecto también se observa en aves salvajes sometidas a cualquier estudio experimental, por lo cual parece estar más relacionado con el estrés en la manipulación de las aves en el experimento, o durante la limpieza y tratamientos en el centro de recuperación, que con la ingestión de derivados del petróleo. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 91 En nuestro estudio, con el fin de relacionar la ingestión de fuel con el tipo de impregnación externa, realizamos una tabla de contingencia de 2x3 variables, cuyos resultados quedan reflejados en la Figura 37. Para conocer la relación entre la presencia de fuel en el tubo digestivo y el tipo de impregnación externa de las aves llevamos a cabo la determinación de Chi-cuadrado utilizando el método de la razón de verosimilitud (χ2 = 7.717; p = 0.021). En la comparación por pares aparecieron diferencias significativas solamente entre el grupo de aves manchadas y cubiertas (χ2 = 6.329; p = 0.011). Se aplicó la corrección Bonferroni: alfa = 0.05/3 = 0.0167, lo cual implica el considerar un valor estadísticamente significativo por debajo de 0.0167. De la interpretación de la Figura 37 se puede concluir que en los grupos de aves limpias y manchadas hay una ingestión de fuel muy elevada y, aunque es mayor el número de aves que han ingerido fuel en el grupo de aves manchadas, esas diferencias no son significativas en comparación con el grupo de aves limpias. Esto implica que las aves no han ingerido accidentalmente el fuel para limpiarse el plumaje, como se ha sugerido en otros trabajos de investigación de otros vertidos, sino que lo han ingerido porque lo han consumido como un alimento y, posiblemente, agradable. Así mismo, que el grupo de aves muy manchadas o cubiertas tenga un número significativamente menor de animales que hayan ingerido petróleo en comparación con el grupo de aves manchadas posiblemente pueda deberse a la muerte muy rápida con la imposibilidad de abrir el pico, o de volar, en las aves más cubiertas. Figura 37. Relación entre la impregnación externa de fuel y el contenido de fuel en el aparato digestivo. En las casillas se muestra el porcentaje y el número de aves afectadas (parte inferior). 92 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Sólo una de las aves que ingirió fuel presentaba áreas de necrosis en la molleja tras retirarle la capa de queilina, mientras que en 12 aves (3%), observamos hemorragias en el tubo digestivo, de forma difusa o en forma de petequias, en 6 de las cuales las hemorragias se acompañaban de fuel (Figura 38). Debido al escaso porcentaje de animales que presentaron estas lesiones, no podemos considerarlas como un efecto específico de la ingestión de fuel. En un estudio realizado en gaviotas y frailecillos a los que se les administró fuel de forma experimental se observó que defecaban cantidades importantes de fuel a los 10 o 15 minutos después de recibir la dosis. Las gaviotas, en comparación con los frailecillos, consumieron menos alimento y perdieron más peso. Se observaron lesiones y signos clínicos en aquellas aves que ingirieron al menos 10 mL de fuel por kg de peso vivo y día, durante 4-5 días, que se clasificaron en dos grandes grupos: 1) lesiones compatibles con un proceso hemolítico consistentes en presencia de formas de eritrocitos anormales (anisocitosis, poiquilocitosis, reticulocitosis, cuerpos de Heinz), aumento de la hemocatéresis o destrucción de eritrocitos en hígado y bazo, reabsorción de pequeñas gotas de hemoglobina en las células de los túbulos proximales del riñón e hiperplasia eritroidea en la médula ósea, lo que sugiere un efecto oxidativo tóxico primario del fuel sobre los eritrocitos (Leighton, 1985, 1986) y 2) un grupo de lesiones inespecíficas relacionadas con el estrés: depleción de linfocitos en la bolsa de Fabricio, aumento de la relación heterófilos: linfocitos en sangre periférica, depleción lipídica y necrosis de las células esteroidogénicas adrenales. C A B C Figura 38. (A) Hemorragias difusas en el proventrículo y en la molleja bajo la capa de queilina en un arao. (B) Presencia de petequias en duodeno en un alca. (C) Hemorragia intestinal difusa en un alca. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 93 En otro estudio realizado con alcas rinoceronte (Cerrorhinca monocerata) a las que se les administró fuel por vía oral, se observó anemia hemolítica durante toda la duración del experimento, tanto en las aves que ingirieron el petróleo, como en las aves del grupo control, lo que sugiere que la anemia hemolítica tradicionalmente considerada como un efecto tóxico directo oxidativo del fuel sobre los hematíes, puede ser provocada por causas multifactoriales como la edad, el estrés de cautividad, etc. (Newman et al., 1999). Parasitación digestiva en las aves objeto de estudio 2.4. En un número importante de individuos, 115 animales, que representan un 27.8% del total de aves estudiadas, se observó parasitación por Ascáridos en el esófago y proventrículo; parásitos que en estudios posteriores fueron identificados como especies de Contracaecum (Figura 39). Figura 39. Nematodosis intestinal. (A) Alca con multitud de ejemplares de Contracaecum sp y fuel en proventrículo y esófago. (B) Dos larvas adultas y varias larvas juveniles en la mucosa del proventrículo en un cormorán, sin lesiones macroscópicas asociadas a la presencia de los nematodos. (C) Úlcera fibrinonecrótica en la mucosa del proventrículo en un alca asociada a la presencia de parásitos nematodos. C A B 94 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” De estas aves parasitadas un 43.1% no presentaba lesiones macroscópicas asociadas a la presencia de los nematodos (Figura 39 B) frente al 56.9% restante que sí presentaba lesiones tales como hemorragia en un porcentaje pequeño de animales (2.9% de las aves parasitadas) y desarrollo de úlceras digestivas en el 50% de las aves parasitadas; se trataba de úlceras fibrinonecróticas, de consistencia firme y color marrón amarillento que hacían prominencia sobre la mucosa del proventrículo (Figura 39 C). Sólo 7 aves (1.9%) presentaron inflamación asociada a engrosamiento de la mucosa del proventrículo en respuesta a la presencia de los nematodos (Figura 40). La presencia de larvas y ascáridos adultos en el tubo digestivo de diversas especies de aves marinas ha sido descrita por otros autores, siendo considerado el proventrículo como el lugar natural de infección parasitaria en aves salvajes (Abollo et al., 2001); en nuestro estudio, la presencia de nematodos parásitos en el esófago podría ser debida a una migración postmortem desde el proventrículo. A Figura 40. Nematodosis intestinal. Cormorán con inflamación severa, engrosamiento de la mucosa y hemorragias del proventrículo asociadas a la presencia de nematodos. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 95 En nuestro estudio, el mayor porcentaje de parasitación por especies correspondía a las alcas (89 de 131 aves, 40.5%), seguidas de los frailecillos (9 de 42 aves, 17.6%) y araos (4 de 99 aves, 3.9%), siendo nula la parasitación por ascáridos en gaviotas (0 de 43 aves), tal y como se aprecia en la Figura 41. Dada la dificultad para la identificación de los parásitos a partir de secciones histológicas, llevamos a cabo la recogida de ejemplares de los nematodos intestinales durante la necropsia de las aves, los cuales se fijaron, incluyeron y seccionaron en parafina, a diferentes niveles y en distintos planos, siguiendo las técnicas histológicas de rutina, con objeto de reproducir las múltiples posibilidades que después hallaríamos en las secciones histológicas del tubo digestivo de las aves, para así facilitar su identificación. Los nematodos aislados y recogidos directamente del tubo digestivo de las distintas especies de aves objeto de este estudio presentaban una coloración blanco amarillenta a lo largo del cuerpo, el cual era alargado, sin segmentación y puntiagudo en sus extremos; las hembras mostraron un mayor desarrollo que los machos (Figura 42). Figura 41. Parasitosis intestinal por especie de ave. En las casillas se muestra el porcentaje y el número de aves afectadas (parte inferior). 96 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” La observación de los parásitos con el estereomicroscopio y el microscopio óptico mostró rasgos característicos de nematodos del grupo de los ascáridos pertenecientes al género Contracaecum, en concordancia con los rasgos morfológicos identificadores descritos por otros autores (Gibbons, 1974); tales como el poro excretor abriéndose, inmediatamente por debajo de la base del interlabio (Pe en Figura 43A), el tubo digestivo presente en la región media y caudal constituido por un ventrículo pequeño y esférico (V en Figura 43B) seguido del apéndice ventricular (Av en Figura 43B) y el intestino que, en este género, presenta un ciego intestinal (Ci en Figura 43C). El esófago de los nematodos de las aves que habían ingerido fuel, también aparecía lleno de fuel (Figura 43D). Los nematodos machos presentaban un extremo posterior de forma curva y con dos espículas saliendo del orificio cloacal (Figura 43E), que los diferenciaba claramente de las hembras, cuyo extremo posterior cónico carecía de espículas (Figura 43F). ♀ A A ♂ B A Figura 42. Ejemplares adultos de Contracaecum rudolphii obtenidos del tubo digestivo de aves petroleadas tras el accidente del Prestige. (A) Hembra. (B) Macho. Figura 43. Rasgos morfológicos identificativos de Contracaecum sp. (A) Poro excretor (Pe). (B) Ventrículo (V) y Apéndice ventricular (Av). (C) Ciego intestinal (Ci). (D) Esófago lleno de fuel. (E) Extremo posterior de un macho. (F) Extremo posterior de una hembra. A A B A C A D A E A F A Pe V Av Ci R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 97 Con el Microscopio Electrónico de Barrido pudimos identificar la especie de Contracaecum teniendo en cuenta la morfología del extremo anterior y la presencia y distribución de las papilas anales del extremo posterior (Fagerholm, 1988; Shamsi et al., 2011) (Figura 44). A A B A C A D A E A F A G A Figura 44. Identificación ultraestructural de Contracaecum rudolphii con el Microscopio Electrónico de Barrido. (A, B) Extremo anterior cerrado (A) y abierto (B). (C, D) Extremo anal en una hembra (C) y un macho (D). (E) Papilas precloacales. (F) Papilas paracloacales. (G) Papilas distales. 104 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” 3. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO Hemosiderosis 3.1. El examen histopatológico de los órganos y tejidos reveló una deposición importante de hierro en forma de hemosiderina en los macrófagos y células reticuloendoteliales de la pulpa roja del bazo (Figura 50), en las células de Kupffer del hígado, e incluso en los hepatocitos (Figura 51). Figura 50. Hemosiderosis esplénica en un alca. Tinción de Perls. 400X. Observar los precipitados de hemosiderida, de color azul intenso, en el citoplasma de los macrófagos, y más tenue en el citoplasma de las células retículoendoteliales de la pulpa roja del bazo. También se observaron estos depósitos de hierro en las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales del riñón (Figura 52). La presencia de depósitos de hemosiderina en los órganos estudiados se reveló en forma de precipitados permanentes de color azul, tras la tinción histoquímica sistemática del hígado, riñón y bazo, de las aves objeto de estudio, con el método de Perls (Azul de Prusia). La presencia de depósitos de hierro en las células del sistema retículoendotelial y, con menor frecuencia, en las células parenquimatosas del hígado y riñón, se relaciona con la destrucción 50μm R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 105 excesiva de eritrocitos tras una hemorragia, un proceso hemolítico infeccioso, infección con parásitos hematófagos o la exposición a sustancias tóxicas hemolíticas (Khan and Nag, 1993). La anemia hemolítica en aves marinas inducida por la ingestión de crudo se ha demostrado a partir de los 4 a 5 días de la ingestión (Leighton et al., 1983), llegando a ser visibles los depósitos de hemosiderina en el hígado de araos hasta 42 días después de la contaminación con fuel (Khan and Ryan, 1991). De hecho, en aves marinas se considera que la presencia de depósitos masivos de Figura 51. Hemosiderosis hepática. Tinción de Perls. (A) Hígado de alca, 400X. Abundantes precipitados de hierro de color azul intenso en el citoplasma de las células de Kupffer. (B) Hígado de arao, 600X. Severa hemosiderosis en la cual los precipitados no solamente se observan en las células de Kupffer, sino también en el citoplasma de los hepatocitos. A B 25μm 50μm 106 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” hemosiderina en los tejidos es un indicador muy útil de hemorragia y/o anemia hemolítica tras la exposición al fuel (Khan and Nag, 1993). Para algunos autores (Khan and Nag, 1993; Leighton et al., 1983), a mayor consumo de petróleo, más grave es la anemia inducida. En gaviotas y frailecillos se indujo experimentalmente anemia hemolítica primaria tras la administración de petróleo crudo, a partir de 10 mL/kg/día, durante 4 ó 5 días (Leighton et al., 1983); secundariamente en estas aves, se observó un aumento de la hemocatéresis de los hematíes rotos en el hígado y el bazo, asociada a hemosiderosis, así como reabsorción masiva de hemoglobina en los túbulos contorneados proximales del riñón. Tabla 11. Presencia y grado de hemosiderosis observada en hígado y riñón según la especie. Especie Alca Arao Frailecillo Gaviota Total Hemosiderosis en hígado Negativo 3 (4.5%) 0 4 (50%) 9 (64.3%) 16 (11.2%) Leve 32 (47.8%) 21 (38.9%) 1 (12.5%) 4 (28.6%) 58 (40.6%) Moderada 8 (11.9%) 7 (13%) 1 (12.5%) 1 (7.1%) 17 (11.9%) Severa 24 (35.8%) 26 (48.1%) 2 (25%) 0 52 (36.4%) Hemosiderosis en riñón Negativo 53 (79.1%) 36 (66.7%) 8 (100%) 14 (100%) 111 (77.6%) Leve 14 (20.9%) 15 (27.8%) 0 0 29 (20.3%) Severa 0 3 (5.6%) 0 0 3 (2.1%) Total 67 54 8 14 143 Figura 52. Hemosiderosis renal. Alca. Tinción de Perls. 600X. Observar los precipitados azules de hemosiderina en el citoplasma de las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales. G, glomérulo. 25μm G G G R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 107 En patos negrones especulados (Melanitta fusca) de Japón con sospecha de intoxicación por petróleo, los valores de eritrocitos y hemoglobina resultaron ser más bajos de lo normal. Tras realizar la necropsia y el estudio histopatológico, se observó hemosiderosis constante en el hígado, bazo y riñón y, ocasionalmente, en pulmón, interpretándose como lesiones secundarias a una anemia hemolítica (Yamato et al., 1996). Otros estudios sobre los efectos de la ingestión de crudo a largo plazo en focha americana (Fulica americana), tras su tratamiento y rehabilitación, indican que hasta los 3.5 meses después de la ingestión no se normaliza el metabolismo del hierro ni los depósitos de hemosiderina y se mantienen niveles elevados de leucocitos, como signo de inflamación crónica reactiva (Newman et al., 2000). Según algunos autores (Leighton, 1985), la toxicidad por administración experimental de fuel oil a gaviotas argénteas (Larus argentatus) y frailecillos (Fratercula arctica) a dosis de 10 mL/kg/día, se debe a los compuestos químicos oxidantes del crudo que provocan la oxidación de los hematíes dando lugar a anemia hemolítica con reticulocitosis y formación de cuerpos de Heinz intranucleares e intracitoplasmáticos. Los córpusculos de Heinz son precipitados que se forman por oxidación de la hemoglobina del eritrocito por los oxidantes presentes en el fuel (Nagel and Ranney, 1973). Cuando se forman en gran cantidad dentro del hematíe, alteran su deformabilidad, convirtiéndose en células muy rígidas que no son capaces de sortear el filtro de los sinusoides esplénicos, por lo que se eliminan de la circulación en el bazo (Reinhart et al., 1986). En aves marinas petroleadas capaces de sobrevivir a la contaminación, se observó una disminución en los leucocitos, principalmente linfocitos, periféricos y de los órganos linfoides (bazo y bolsa de Fabricio), así como una desviación en la formación de leucocitos en la médula ósea hacia la formación de eritrocitos para incrementar la eritropoyesis y compensar así la anemia hemolítica (Briggs et al., 1997). Esta disminución en los glóbulos blancos se sugiere como la base del efecto inmunosupresor a medio y largo plazo de la contaminación por petróleo. En nuestro estudio, llevado a cabo en las aves marinas muertas como consecuencia del vertido del Prestige, no podemos conocer los efectos tóxicos sobre el sistema inmune, a medio y largo plazo, tras la rehabilitación y supervivencia de las aves, pero sí que podemos aportan datos de gran valor sobre la toxicidad aguda y subaguda de la ingestión de fuel. Es imposible conocer la cantidad de fuel ingerida por las aves salvajes en el accidente del Prestige; sin embargo, en nuestro estudio (Tabla 11), consideramos que las aves con precipitados abundantes de hemosiderina (69/143, que representan el 48.3%) murieron, probablemente, por consumo repetido de dosis de fuel no demasiado altas, pero suficientes como para provocar un proceso hemolítico subagudo, que dio tiempo a que se instaurasen depósitos secundarios de hierro en el hígado, bazo y riñón, órganos encargados de la metabolización de la hemoglobina liberada de 108 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” forma masiva tras la rotura de los hematíes. En las aves con menores depósitos de hemosiderina (58/143 que representan el 40.6%), la muerte pudo ocurrir también por anemia hemolítica, pero por un cuadro más agudo, tras ingerir cantidades mayores de fuel, sin dar tiempo (4-5 días) a que se produjera la hemosiderosis secundaria masiva en los principales órganos de metabolización del pigmento de los hematíes. Necrosis hepática y renal 3.2. En el 40.38% de las aves que presentaban fuel en el digestivo (n=104) diagnosticamos congestión hepática y necrosis multifocal de hepatocitos. Esta necrosis hepática no se acompañaba de ningún tipo de infiltrado de células inflamatorias. En los focos de necrosis, los hepatocitos mostraban diversos grados de cariolisis y citoplasmolisis, apareciendo borrosos los perfiles del núcleo y citoplasma, respectivamente (Figura 53). En estos focos, los hepatocitos necróticos comienzan a disgregarse y a desorganizar las hileras de células entre los sinusoides hepáticos (Figura 53). Desde el punto de vista histopatológico, estos focos se consideran áreas de necrosis por coagulación típica de los procesos isquémicos y/o tóxicos agudos. En una de las alcas con abundante fuel en el tubo digestivo, la necrosis hepática se extendía por la región subcapsular del hígado (Figura 54A); en esta zona de necrosis subcapsular se acumulaban 25μm Figura 53. Necrosis hepática multifocal. Alca. Hematoxilina-Eosina. 600X. Las flechas indican múltiples focos de hepatocitos con diversos grados de cariolisis y citoplasmolisis que comienzan a disgregarse, rodeados de hepatocitos normales. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 109 abundantes células de Kuppfer y macrófagos cargados de hierro, positivos a la tinción de Perls (Figura 54B). Esto indica que la necrosis no era consecuencia de la autolisis postmortem sino antemortem y que posiblemente, las áreas subcapsulares del hígado sean más sensibles a la hipoxia por anemia hemolítica, sobre todo en las zonas de inserción de los ligamentos. El 63.46% de las aves que presentaban fuel en el intestino (n=104) mostraron congestión renal y necrosis tubular multifocal en el riñón, que afectaba a las células epiteliales principalmente de los túbulos contorneados proximales y, en menor proporción, también de los túbulos contorneados distales y colectores, sin asociarse en ningún caso a reacción inflamatoria (Figura 55). 25μm A B Figura 54. Necrosis hepática subcapsular en un alca. A. Hematoxilina-Eosina. 200X. B. Tinción de Perls. 200X, observar el acúmulo de células de Kupffer y macrófagos de color azul, positivos a la presencia de hierro, en el área de necrosis. Figura 55. Necrosis tubular renal. Gaviota patiamarilla. Hematoxilina-Eosina. 600X. Las flechas indican múltiples focos de necrosis de las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales. 110 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Los focos de necrosis tubular presentaban a las células epiteliales mostrando diversos grados de vacuolización del citoplasma, cariolisis y descamación en la luz de los túbulos, rodeados de secciones tubulares histológicamente normales (Figura 55). En nuestro estudio hemos encontrado una relación directa entre la necrosis renal y el grado de deposición de hemosiderina en el sistema retículo endotelial. Estos hallazgos coinciden con otros estudios realizados en patos a los que se administró fuel de forma experimental (Fry and Lowenstine, 1985; Szaro et al., 1981) que describen degeneración y necrosis de túbulos renales, la mayoría de las veces asociadas a inflamación intersticial. La Tabla 12 muestra un resumen porcentual de las lesiones descritas anteriormente con relación a la presencia o ausencia de fuel en el tubo digestivo. Aunque 23 aves no presentaron fuel en el tubo digestivo, comprobamos que la mayoría de ellas (17 aves, 73%) presentaron una reacción positiva leve a la tinción de Perls en el hígado, pero no en el riñón, lo cual nos induce a pensar que los depósitos hepáticos de hierro se produjeron en episodios previos de ingestión de derivados de petróleo. Tabla 12. Estudio de las aves petroleadas con necrosis hepática y tinción de Perls positiva en hígado y riñón. Hallazgos histopatológicos Aves estudiadas histopatológicamente (n=127) Fuel presente en el aparato digestivo (n=104) Fuel ausente en el aparato digestivo (n=23) Anemia hemolítica Hígado Perls + 101 (97.11%) 17 (73.91%) Riñón Perls + 30 (29.70%) 0 Necrosis hepatica 42 (40.38%) 0 Necrosis tubular 66 (63.46%) 0 En cuanto al grupo mayoritario de aves con fuel presente en el tubo digestivo, parece claro que la hemólisis masiva fue determinante en la muerte de estas aves, ya que el 97.11% de ellas presentaban depósitos considerables de hemosiderina en el hígado y el 29.70% en el riñón. La necrosis multifocal de hepatocitos observada en el 40.38% de las aves estudiadas sugiere una relación clara con la ingesta de fuel ya que esta lesión solo aparece en animales con fuel presente en el tubo digestivo, si bien, esta lesión no se observó en el 59.62% del resto de aves que presentaron fuel en digestivo, en las cuales también observamos importantes depósitos de hemosiderina en el hígado. Sugerimos que, tal vez, estas aves murieron muy rápidamente, por un proceso de anemia hemolítica aguda, sin que hubiera tiempo para el desarrollo de las lesiones hepáticas. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 111 Así mismo, la necrosis túbular renal observada presenta una relación directa con la ingesta de fuel, ya que solo los animales con fuel en el tubo digestivo presentaron dicha lesión. Todas las aves con necrosis de túbulos renales presentaron al mismo tiempo acúmulos de hierro en el hígado, aunque, al igual que ocurría con la necrosis hepática, el 36.54% de las aves sin tubulonecrosis fueron también positivas a la tinción de Perls en el hígado, lo cual nos lleva de nuevo a considerar la muerte rápida de estas aves por la hemólisis, sin tiempo para el desarrollo de las lesiones renales. El que casi dos tercios de las aves afectadas presentasen necrosis de túbulos renales y las devastadoras consecuencias clínicas que ello pudo desencadenar en cuanto al desequilibrio hidroelectrolítico nos hace pensar que esta lesión pudo acelerar la muerte de muchas de las aves estudiadas. De hecho, la necrosis renal afectó a un mayor porcentaje de las aves que ingirieron fuel (63.46%) en comparación con la necrosis hepática (40.38%), lo que sugiere que, además del daño renal directo como consecuencia de la ingestión de componentes nefrotóxicos en el fuel, tales como el arsénico (Feng et al., 2013) o el cadmio (Binkowski et al., 2013), se produjo un mayor grado de isquemia en el riñón como consecuencia de la anemia hemolítica, ya que la vascularización renal, mucho más deficiente que la hepática, hace a este órgano mucho más sensible a la hipoxia. Cuando analizamos los cuadros histopatológicos presentados por las aves marinas a lo largo de los casi tres meses de recepción de cadáveres, observamos cómo estas alteraciones aparecían o se agravaban con el paso de las semanas (Figura 56). Así, observamos cómo durante el primer mes (diciembre, 2002) solo el 33.53% de las aves presentaron una tinción positiva para los depósitos de hierro en el hígado, signo inequívoco de hemólisis aguda y como este porcentaje aumentó durante el segundo mes (enero, 2003) al 44.18%, y continuó incrementándose hasta el 76% de las aves en el tercer mes de recepción de las aves (febrero, 2003). Figura 56. Gráfico de evolución de las lesiones histopatológicas observadas con respecto al tiempo. Estudio histopatológico a través del tiempo 40 63.95 0 45.45 76 44.18 33.33 36.36 65.45 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Diciembre Enero Febrero % Aves afectadas Necrosis hepática Acumulación de hemosiderina Necrosis renal 112 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Como existen suficientes evidencias científicas de que el fuel vertido por el petrolero Prestige presentaba una alta densidad y viscosidad y, lo más importante, una baja solubilidad y volatilidad que determinaba muy pocos cambios en su composición a través del tiempo (CSIC, 2003b), concluimos que el incremento de aves marinas afectadas por anemia hemolítica severa, a medida que transcurrían los meses tras el vertido en las costas, puede ser debido a una mayor probabilidad de ingestión repetida de fuel. A favor de esta teoría está la aparición de infinitas galletas de crudo sobre el mar, originadas a partir de la emulsión de las grandes manchas de petróleo por el fuerte oleaje, de pequeño tamaño, y fáciles de ingerir de forma voluntaria o accidental por las aves. Durante el mes de diciembre, y hasta el 10 de enero, no encontramos ningún ave con necrosis de hepatocitos (hasta ese momento se habían analizado 43 animales). A partir de esa fecha, y durante el mes siguiente, casi la mitad de los animales estudiados (40-44%) presentaron lesión hepática. En el caso de la túbulonecrosis renal, las lesiones empezaron a encontrarse desde el principio (33.36% en diciembre), para incrementarse este porcentaje en enero y febrero hasta casi el 65% de las aves analizadas. El hecho de que las lesiones renales y hepáticas se hayan observado exclusivamente en aves con fuel en el tubo digestivo, y que dichas lesiones se incrementen con el paso de las semanas tras el vertido, confirma que el hígado y riñón son los órganos diana más importantes de los efectos tóxicos tras la ingestión del fuel del Prestige, los cuales se vieron afectados de forma más grave en aquellas aves que tuvieron mayores probabilidades de ingerir fuel repetidamente. Ausencia de lesiones digestivas específicas asociadas al fuel 3.3. El estudio histopatológico de las secciones de proventrículo y la molleja en las aves que ingirieron fuel mostró la ausencia de lesiones histológicas (Figura 57A y B, respectivamente). En el caso del intestino delgado (Figura 57C) y grueso (Figura 57D), además de la presencia de fuel, era evidente la desestructuración y degeneración de la mucosa intestinal, si bien estos cambios también se observaron en aves sin fuel en el digestivo, por lo cual interpretamos que se trataba de lesiones autolíticas, que se observan mucho más precozmente en el intestino que en el proventrículo o la molleja, no pudiendo relacionar dichas lesiones con la ingestión de fuel. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - A N A T O M Í A P A T O L Ó G I C A | 113 Lesiones asociadas a la presencia de parásitos digestivos 3.4. Como las alcas fueron la especie más parasitada por Contracaecum rudolphii, llevamos a cabo el estudio histopatológico del esófago y proventrículo en todas las alcas con parásitos, aún cuando no presentasen lesiones macroscópicas visibles en la mucosa digestiva, para llegar a conocer en detalle las consecuencias de la parasitación. El estudio histopatológico demostró que un 44.71% de las alcas parasitadas no presentaba lesiones relevantes asociadas a la presencia de nematodos, mientras que el 55.29% restante desarrollaron úlceras digestivas de diverso grado, provocadas por la invasión de la mucosa por las larvas juveniles. A B C D Figura 57. Ausencia de lesiones específicas en tubo digestivo por la presencia de fuel. (A) PAS-Azul Alcian. Sección de proventrículo con fuel en la superficie sobre la capa PAS+ de secreción, sin alteraciones, 100X. (B) H-E. Sección de molleja con fuel sobre la capa de queilina y ausencia de lesiones histológicas. 100X (C) H-E. Sección de intestino delgado con abundante fuel y signos de autolisis de la mucosa. 100X (D) H-E. Sección de intestino grueso con fuel en la superficie y signos de autolisis de la mucosa. 100X. 120 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Figura 67. Esclerosis glomerular. H-E. Sección histológica del riñón en una gaviota en la que se observa engrosamiento fibroso de la cápsula de Bowman y atrofia de los glomérulos (flechas). 400X. Figura 68. Enfermedad del músculo blanco. H-E. Sección histológica del corazón en una gaviota en la que se observan múltiples focos de degeneración hialina de las fibras miocárdicas (flechas). 200X. R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - T O X I C O L O G Í A | 121 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Toxicología 122 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - T O X I C O L O G Í A | 123 1. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA CONCENTRACIÓN DE ELEMENTOS QUÍMICOS ESTUDIADOS EN FUEL Y EN AVES MARINAS En la Tabla 13, se muestran las concentraciones de los elementos químicos obtenidos en el análisis del fuel proveniente del petrolero Prestige, destacando el hierro como el más elevado con 1659.56 ppm p.s., seguido del vanadio con 262.4 ppm p.s., por el contrario, el cadmio presentó las concentraciones más bajas (0.095 ppm) en el fuel analizado. Tabla 13. Concentración (ppm p.s.) de elementos químicos en el fuel del Prestige. As Cd Co Cu Cr Fe Mn Hg Pb Se V Zn 1.19 0.09 0.50 12.90 5.13 1659.56 44.55 0.30 1.02 0.36 262.41 1.44 La determinación de la concentración de los 12 elementos químicos en las aves marinas, se efectuó sobre muestras de hígado y riñón. En la Tabla 14, se presentan los parámetros estadísticos de los elementos químicos analizados; los rangos de valores para cada elemento son amplios, habiendo datos que son considerados como extremos u outliers. Asimismo, para el plomo, se obtuvieron datos por debajo del límite de detección, procediéndose a reemplazar estos valores nulos, tal como se explica en el apartado metodológico del análisis estadístico, por uno equivalente a la mitad del valor mínimo detectado para no incrementar el error estadístico tipo I, evitando un falso negativo. Tabla 14. Parámetros estadísticos de los elementos químicos analizados en hígado y riñón de aves marinas. Elemento químico Órgano N Media (ppm p.s.) Desviación típica Error típico Intervalo de confianza para la media al 95% (ppm p.s.) Mínimo (ppm p.s.) Máximo (ppm p.s.) Límite inferior Límite superior Arsénico Hígado 147 42.85 48.94 4.04 34.88 50.83 0.16 275.15 Riñón 146 26.17 34.69 2.87 20.49 31.84 0.16 332.70 Cadmio Hígado 147 7.71 19.12 1.58 4.59 10.83 0.37 152.77 Riñón 146 25.74 50.60 4.19 17.46 34.01 0.92 370.93 Cobalto Hígado 147 0.35 0.60 0.05 0.25 0.45 0.02 5.86 Riñón 146 0.42 0.52 0.04 0.33 0.51 0.01 4.60 Cobre Hígado 147 116.17 72.56 5.98 104.34 128.00 0.12 350.68 Riñón 146 57.65 37.22 3.08 51.56 63.74 0.08 227.39 Cromo Hígado 147 1.50 3.02 0.25 1.01 2.00 0.02 22.57 Riñón 146 2.21 3.14 0.26 1.70 2.72 0.01 20.89 Hierro Hígado 147 4831.76 3681.79 303.67 4231.60 5431.91 227.74 19742.01 Riñón 146 994.77 616.29 51.00 893.96 1095.58 208.65 4857.56 Manganeso Hígado 147 19.43 14.44 1.19 17.08 21.79 0.38 113.33 Riñón 146 19.29 15.07 1.25 16.82 21.75 0.53 136.62 Mercurio Hígado 147 6.10 3.63 0.30 5.50 6.69 0.54 25.99 Riñón 146 5.36 3.09 0.26 4.86 5.87 0.87 25.03 Plomo Hígado 147 0.31 2.18 0.18 -0.05 0.66 0.00 26.33 Riñón 146 0.67 2.84 0.24 0.20 1.13 0.00 25.06 Selenio Hígado 147 29.05 19.06 1.57 25.94 32.16 2.20 85.89 Riñón 146 49.33 34.79 2.88 43.64 55.02 4.98 184.42 Vanadio Hígado 147 0.78 0.35 0.03 0.72 0.83 0.22 1.95 Riñón 146 1.07 0.50 0.04 0.99 1.15 0.19 2.66 Zinc Hígado 147 286.92 158.99 13.11 261.00 312.83 83.70 1181.33 Riñón 146 313.98 183.69 15.20 283.93 344.02 73.61 1332.23 124 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Debido a esta gran dispersión de los datos, se hizo necesario realizar una transformación de estos aplicando la técnica de Box-Cox, por ser robusta y estar recomendada por varios investigadores (Osborne, 2010; Zhang and Zhang, 1996) en estudios relativos a metales pesados y metaloides; así, como ejemplo en la Figura 69, para el estudio del arsénico tanto en hígado como en riñón, se presenta el histograma que tiende a una distribución normal después de la transformación. Relación entre las concentraciones de elementos químicos determinadas en fuel 1.1. y en aves marinas De acuerdo con las concentraciones de los 12 elementos químicos determinadas en fuel, y en las muestras de hígado y riñón de las aves marinas estudiadas (Tabla 13 y Tabla 14), cabe destacar que el fuel tenía concentraciones más elevadas de cobalto, cromo, manganeso, plomo y vanadio que los niveles promedios obtenidos en hígado y riñón. El hierro presentaba concentraciones más elevadas en hígado que en el fuel, aunque en este último eran más elevadas que las observadas en el riñón de las aves. Una vez que todos los datos fueron normalizados con la técnica Box-Cox, se procedió a realizar la prueba t-student para una sola muestra, entre los niveles determinados en hígado y riñón comparados con los del fuel. Según este tratamiento, los resultados mostraron diferencias significativas (p<0.01) para todos los casos tal como se detalla en la Tabla 15. Con estos resultados se procedió a realizar la representación gráfica de caja y bigotes para las muestras evaluadas, como puede observarse en la Figura 70. Figura 69. Transformación de datos de As en hígado y riñón de aves marinas (técnica de Box-Cox). R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - T O X I C O L O G Í A | 125 Tabla 15. Prueba de t-student de una sola muestra para la comparación de los niveles de los elementos químicos obtenidos en fuel, y en hígado y riñón, de las aves marinas afectadas por el Prestige. Elemento Hígado Riñón Prueba T p-valor Prueba T p-valor Arsénico 20.16 <0.01 19.68 <0.01 Cadmio 69.68 <0.01 90.95 <0.01 Cobalto -11.49 <0.01 -7.680 <0.01 Cobre 20.69 <0.01 16.18 <0.01 Cromo -19.09 <0.01 -15.17 <0.01 Hierro 11.77 <0.01 -14.91 <0.01 Manganeso -18.35 <0.01 -18.52 <0.01 Mercurio 37.02 <0.01 43.00 <0.01 Plomo -20.76 <0.01 -14.70 <0.01 Selenio 32.10 <0.01 40.87 <0.01 Vanadio -137.4 <0.01 -141.8 <0.01 Zinc 111.7 <0.01 95.91 <0.01 Relación entre las concentraciones de los elementos químicos determinadas en 1.2. hígado y riñón de aves marinas Para estudiar si existía alguna diferencia estadística entre las concentraciones de los elementos químicos tratados con respecto a los órganos, se realizó un test t-student para muestras pareadas, debido a que ambas muestras procedían del mismo animal y estaban relacionadas, obteniéndose como resultado diferencias estadísticamente significativas (p<0.01) en la mayoría de los elementos a excepción del manganeso, plomo y zinc (Tabla 16). En la Figura 70 se representan las gráficas de caja y bigotes para todos los metales en hígado y riñón, observándose en qué órgano se presentaban los niveles más elevados. El hígado, frente al riñón, contenía los niveles más elevados de los siguientes elementos: arsénico, cobre, hierro y mercurio, siendo las concentraciones más elevadas en riñón para cadmio, cobalto, cromo, selenio y vanadio. Tabla 16. Comparación de las concentraciones de elementos químicos en hígado y riñón de un mismo individuo, mediante la prueba de t-student para muestras relacionadas. Comparación por parejas Media Des. típ. Error típ. media Intervalo de confianza 95% t gl Sig. Inferior Superior Par 1 As hígado vs. As riñón 16.17 29.75 2.47 11.29 21.06 6.55 144 <0.01 Par 2 Cd hígado vs. Cd riñón -18.20 37.44 3.11 -24.35 -12.05 -5.85 144 <0.01 Par 3 Co hígado vs. Co riñón -0.11 0.64 0.05 -0.21 0.00 -2.02 144 <0.04 Par 4 Cu hígado vs. Cu riñón 57.67 68.51 5.69 46.43 68.92 10.14 144 <0.01 Par 5 Cr hígado vs. Cr riñón -0.71 2.75 0.23 -1.16 -0.26 -3.11 144 <0.01 Par 6 Fe hígado vs. Fe riñón 3865.15 3523.94 292.65 3286.71 4443.59 13.21 144 <0.01 Par 7 Mn hígado vs. Mn riñón -0.21 11.03 0.92 -2.02 1.61 -0.22 144 0.82 Par 8 Hg hígado vs. Hg riñón 0.73 2.48 0.21 0.32 1.14 3.54 144 <0.01 Par 9 Pb hígado vs. Pb riñón -0.36 3.49 0.29 -0.94 0.21 -1.25 144 0.21 Par 10 Se hígado vs. Se riñón -20.75 24.16 2.01 -24.71 -16.78 -10.34 144 <0.01 Par 11 V hígado vs. V riñón -0.30 0.47 0.04 -0.38 -0.23 -7.76 144 <0.01 Par 12 Zn hígado vs. Zn riñón -28.03 226.68 18.82 -65.24 9.18 -1.49 144 0.14 126 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Figura 70. Representación gráfica de caja y bigotes de las concentraciones de los elementos químicos en hígado y riñón de las aves respecto a la concentración en fuel (línea horizontal). Arsénico Cadmio Cobalto Cromo Cobre Hierro R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - T O X I C O L O G Í A | 127 Figura 70 (cont.). Representación gráfica de caja y bigotes de las concentraciones de los elementos químicos en hígado y riñón de las aves respecto a la concentración en fuel (línea horizontal). . Manganeso Mercurio Plomo Selenio Vanadio Zinc 128 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” 2. ELEMENTOS QUÍMICOS EVALUADOS Los elementos químicos estudiados se pueden agrupar en dos categorías, la primera compuesta por los micronutrientes que cumplen una clara función fisiológica en las aves tales como el cobalto, cobre, hierro, manganeso, selenio y zinc. Un segundo grupo formado por aquellos que son tóxicos a dosis muy pequeñas para las aves: arsénico, cadmio, cromo, mercurio, plomo y vanadio. Micronutrientes 2.1. 2.1.1. Cobalto El cobalto es un elemento esencial en animales, estando implicado en la síntesis de la vitamina B12 (Okamoto and Eltis, 2011), según la National Research Council – Canadá (NRC), en aves de producción avícola, no tiene niveles mínimos en cuanto a sus requerimientos en la dieta, mientras que el nivel máximo es de 10 ppm (NRC, 1994). En animales de experimentación, la DL50 del cobalto es 6170 ppm per os (FDRL, 1984). Experimentalmente en conejos expuestos al cobalto, se observó que este tiende a acumularse en hígado, riñón, páncreas y corazón, al mismo tiempo que los macrófagos alveolares presentaron un incremento de tamaño (Johansson et al., 1986). El mecanismo de toxicidad celular del Co consiste en la inhibición de la respiración celular y de las enzimas del ciclo del ácido cítrico (Pourkhabbaz et al., 2011; Simonsen et al., 2012). En el presente estudio, se determinaron en el fuel concentraciones de cobalto de 0.50 ppm p.s., nivel superior al obtenido tanto en hígado como en riñón de las aves (0.35 y 0.42 ppm de promedio, respectivamente). Estas concentraciones respecto a las encontradas en otras publicaciones (Tabla 55) fueron más elevadas; además, diversos estudios mostraron que la concentración de este elemento en tejidos de aves no excedió de 0.25 ppm p.s. (Eisler, 2010). 2.1.2. Cobre En estudios que analizaron los sedimentos de las islas de Galicia afectadas por el petrolero Prestige, se mostraron niveles altos de cobre (Andrade et al., 2004; Santos-Echeandía et al., 2008). Sin embargo, estos niveles fueron más bajos que los obtenidos en la bahía de Algeciras (Andalucía-España) que tiene una contaminación crónica (Morales-Caselles et al., 2007). No obstante, según el presente estudio, el fuel del buque no contenía niveles elevados de cobre (12.51 ppm p.s.), por lo que se atribuye que, la alta presencia de este elemento en las costas gallegas puede ser de origen geológico. En la evaluación de plumas de gaviotas recogidas en zonas afectadas por el Prestige, se observó que los niveles de cobre y plomo en los polluelos aumentaron entre 3 y 5 veces después de 3 años R E S U L T A D O S Y D I S C U S I Ó N - T O X I C O L O G Í A | 129 del accidente. Posteriormente, volvieron a niveles previos al accidente, aunque estas concentraciones siguieron siendo elevadas en comparación con los datos de otras publicaciones (Moreno et al., 2011). Según la NRC los requerimientos mínimos de Cu son de 8 ppm y los máximos de 300 ppm en dietas de aves de producción (NRC, 1994); las aves marinas, en general, retienen una pequeña parte del cobre que ingieren con la dieta puesto que es un oligoelemento necesario para su fisiología. La mayoría de casos de intoxicación recogidos en la literatura han sido consecuencia de una ingestión de desperdicios, determinándose incluso niveles de 4970 ppm p.s., observándose, además la influencia de la edad ya que mostraron mayores niveles los ejemplares juveniles que los adultos (Eisler, 1998, 2010); sin embargo, en estudios de araos de Escocia, no se observaron estas diferencias entre animales jóvenes y adultos (Stewart et al., 1994). En investigaciones realizadas en araos (Uria aalge), se demostró que las aves producían metalotioneínas en respuesta a situaciones de estrés (Debacker et al., 2001b) y también, como efecto citoprotector contra el exceso de cobre en forma de iones libres (Bouquegneau et al., 2001); por ello, pudo comprobarse que las metalotioneínas se encuentraban en mayor cantidad en aves más contaminadas (Bouquegneau et al., 1996). Según los datos analíticos toxicológicos obtenidos en el presente estudio, el fuel contiene niveles inferiores de cobre (12.90 ppm) que los observados en el hígado de las aves marinas (166.17 ppm) y en el riñón (57.56 ppm). En la Tabla 56 (anexos) se muestran los niveles de cobre en otros trabajos publicados. 2.1.3. Hierro El hierro es un elemento esencial para el funcionamiento fisiológico del organismo teniendo una función vital en el crecimiento siendo necesario para la oxigenación tisular y para mantener el metabolismo celular, hallándose la principal fracción de este en el eritrocito (Jarup, 2003). Según la NRC los requerimientos mínimos son de 80 ppm y los máximos de 1000 ppm (NRC, 1994). Los niveles más elevados de hierro se encuentran en hígado, seguido de riñón, músculo y huevo (Eisler, 2010), coincidiendo con el presente estudio. La especie que tiene mayor concentración de hierro es el arao, sin embargo, existen muy pocos estudios realizados en aves acerca de este metal (Tabla 58 de anexos). El petróleo analizado tenía valores de hierro (1659.56 ppm p.s.) más elevados significativamente que los obtenidos en riñón; sin embargo, en hígado los niveles encontrados en las aves fueron superiores a los del fuel. 232 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 54 (cont.). Concentraciones de cadmio en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps Argentina Hígado 1.6 (Gil et al., 2006)18 Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps , Argentina Riñón 2.4 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi , Argentina Hígado 1.7 (Gil et al., 2006) Pardela oscura Puffinus griseus Argentina Hígado 3.2 (Gil et al., 2006) Pardela oscura Puffinus griseus Argentina Riñón 24 (Gil et al., 2006) Varias especies Estados Unidos Riñón 2.8 – 95.3 (Henny et al., 1995)19 Varias especies Doñana, España Hígado ND. – 10.78 (Hernández et al., 1999)20 Varias especies Doñana, España Hígado ND. – 20.4 (Gómez et al., 2004) Varias especies Doñana, España Riñón ND. – 60.7 (Gómez et al., 2004) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Japón Hígado 0.126 – 2.2 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Japón Riñón 0.195 – 6.29 (Nam et al., 2005b) Gaviota argéntea Larus argentatus Inglaterra Hígado 1.86 (Nicholson, 1981) Gaviota argéntea Larus argentatus Inglaterra Riñón 13.7 (Nicholson, 1981) Varias especies Varias especies Inglaterra Riñón Max: 480 ppm ps (Osborn et al., 1979) Arao Uria aalge Alemania 0.004 – 88.28 (Wenzel and Adelung, 1996) Varias especies Japón Hígado 1.22 - 22 (Honda et al., 1990) Varias especies Japón Riñón 2.27 – 66.4 (Honda et al., 1990) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 3.29 – 66.8 (Kojadinovic et al., 2007d) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 12.6 - 147 (Kojadinovic et al., 2007d) Varias especies Noruega Hígado 0.53 - 109 (Savinov et al., 2003) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Japón Hígado 0.126 – 2.2 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Japón Riñón 0.195 – 6.29 (Nam et al., 2005b) Gaviota argéntea Larus argentatus Inglaterra Hígado 1.86 (Nicholson, 1981) Gaviota argéntea Larus argentatus Inglaterra Riñón 13.7 (Nicholson, 1981) Varias especies Inglaterra Riñón Max: 480 ppm ps (Osborn et al., 1979) Arao Uria aalge Alemania 0.004 – 88.28 (Wenzel and Adelung, 1996) Varias especies Japón Hígado 1.22 - 22 (Honda et al., 1990) Varias especies Japón Riñón 2.27 – 66.4 (Honda et al., 1990) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 3.29 – 66.8 (Kojadinovic et al., 2007d) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 12.6 - 147 (Kojadinovic et al., 2007d) Varias especies Noruega Hígado 0.53 - 109 (Savinov et al., 2003) 18 Datos expresados en peso húmedo 19 Se han considerado promedios 20 Estudio temporal, se han considerado valores mínimos y máximos A N E X O S | 233 Tabla 55. Concentraciones de cobalto en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 0.43 0.12 - 4.39 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 0.43 0.16 - 2.29 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado 0.068 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 0.085 (Ribeiro et al., 2009) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 0.47 0.11 - 5.86 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 0.53 0.15 - 4.60 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 0.17 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 0.82 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 0.034 - 0.059 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 0.059 - 0.109 (Mendes et al., 2008) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 0.69 0.23 - 1.32 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 0.93 0.29 - 2.86 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristoteslis Galicia, España Hígado 0.32 0.15 - 0.43 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristoteslis Galicia, España Riñón 0.95 0.24 - 1.37 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 0.23 0.09 - 0.38 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 0.52 0.16 - 1.32 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Hígado 0,09 - 0,18 (Nam et al., 2005b) 234 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 56. Concentraciones de cobre en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 156.23 66.2 - 298.79 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 59.8 25.52 - 146.18 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado 23.306 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 18.487 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Galicia, España Hígado 0.993 ND. - 3.234 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 146.92 41.41 - 302.06 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 88.34 38.53 - 227.39 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 1.54 0.257 - 4.115 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 55,675 (Debacker et al., 2000) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 31.45 (Debacker et al., 2000) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 52 10 - 152 (Debacker et al., 1997) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 29.5 1.1 – 76.3 (Debacker et al., 1997) Arao Uria aalge Escocia Hígado 14.5 12.9 – 16.1 (Stewart et al., 1994) Arao Uria aalge Escocia Riñón 13.75 12.3 – 15.2 (Stewart et al., 1994) Arao Uria aalge Hornoya, Noruega Hígado 20 (Wenzel and Adelung, 1996) Arao Uria aalge Hornoya, Noruega Riñón 14.4 (Wenzel and Adelung, 1996) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 44.75 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 80.82 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 17.623 - 25.528 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 15.826 - 23.612 (Mendes et al., 2008) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 139.61 101.32 - 188.76 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 51.96 30.34 - 86.96 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 1.062 0.285 - 2.152 (Pérez-López et al., 2006) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 83.99 33.56 - 115.62 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 49.93 20 - 90.90 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 36.44 (Sanpera et al., 2008) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 23.17 (Sanpera et al., 2008) Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps Patagonia, Argentina Hígado 14.7 (Gil et al., 2006)21 Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps Patagonia, Argentina Riñón 4.2 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Hígado 6.3 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Riñón 4.1 (Gil et al., 2006) 21 Expresado en peso húmedo A N E X O S | 235 Tabla 56 (cont.): Concentraciones de cobre en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 134.52 25.05 - 350.68 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 62.1 38.61 - 80.90 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota cocinera Larus dominicanus Patagonia, Argentina Hígado 3.65 - 8.47 (Gil et al., 2006)22 Gaviota cocinera Larus dominicanus Patagonia, Argentina Riñón 4.34 - 10.20 (Gil et al., 2006) Pelícano marron Pelecanus occidentalis Florida, Estados Unidos Hígado 26.3 18.6 - 48 (Connors et al., 1972) Pelícano blanco Pelecanus erythrorynchos California, Estados Unidos Hígado 50.5 17.8 - 98 (Connors et al., 1972) Pelícano marron Pelecanus occidentalis California, Estados Unidos Hígado 20.1 (Connors et al., 1972) Varias especies Costa occidental de Canadá Hígado 22.48 (Elliott and Scheuhammer, 1992)23 Pingüino de Magallanes Spheniscus magellanicus Golfo San Jorge, Argentina Hígado 5.38 5.38 ± 2.08 (Gil et al., 2006) Pingüino de Magallanes Spheniscus magellanicus Golfo San Jorge, Argentina Riñón 5.92 5.92 ± 2.30 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto deseado Hígado 7 7 ± 1.13 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto deseado Riñón 6.83 6.83 ± 2.89 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto Madryn Hígado 3.65 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto Madryn Riñón 6.06 (Gil et al., 2006) Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps Patagonia, Argentina Hígado 14.7 (Gil et al., 2006) Cormorán imperial Phalacrocorax atriceps Patagonia, Argentina Riñón 4.02 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Hígado 6.3 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Riñón 4.1 (Gil et al., 2006) Pardela oscura Puffinus griseus Golfo San Jorge, Argentina Hígado 6.3 (Gil et al., 2006) Pardela oscura Puffinus griseus Golfo San Jorge, Argentina Riñón 5.1 (Gil et al., 2006) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 12 - 345 (Henny et al., 1995) Varias especies Doñana, España Hígado 13.6 – 498.3 (Hernández et al., 1999) Varias especies Doñana, España Hígado 2.1 - 1300 (Gómez et al., 2004) Varias especies Doñana, España Riñón 6.82 - 138 (Gómez et al., 2004) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Hígado 14.3 – 94.1 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Riñón 8.6 - 139 (Nam et al., 2005b) Cerceta padilla Marmaronetta angustirostris El hondo, España Hígado 41.9 3.3 – 105.4 (Taggart et al., 2009) Malvacía común Oxyura leucocephala El hondo, España Hígado 156.5 14.1 - 751 (Taggart et al., 2009) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 12 - 345 (Henny et al., 1995) Varias especies Japón Hígado 4.14 – 7.65 (Honda et al., 1990) Varias especies Japón Riñón 1.66 -6.10 (Honda et al., 1990) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 11.1 – 31.5 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 8.55 – 24.2 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Mar de Barents, Noruega Hígado 15.6 - 446 (Savinov et al., 2003) 22 Expresado en peso húmedo 23 Se han considerado los promedios 236 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 57. Concentraciones de cromo en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 2.62 0.11 - 23.70 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 2.27 0.15 - 17.08 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado 1.809 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 1.846 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Galicia, España Hígado 0.013 0.001 - 0.075 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 2.28 0.06 - 28.74 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 2.86 0.08 - 20.89 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 0.103 ND. - 0.438 (Pérez-López et al., 2006) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 0.49 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 1.12 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 3.175 - 3.544 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 3.231 - 3.781 (Mendes et al., 2008) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 0.82 0.38 - 1.75 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 2.59 0.14 - 9.50 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 0.011 ND. - 0.102 (Pérez-López et al., 2006) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 1.71 0.47 - 3.03 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 1.09 0.05 - 2.40 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado ND. (Sanpera et al., 2008) Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 3.71 0.10 - 13.73 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 1.61 0.48 - 3.90 Rodríguez Ledesma, 2013 Pelícano marron Pelecanus occidentalis Florida, Estados Unidos Hígado 0.92 0.8 – 1.2 (Connors et al., 1972) Pelícano blanco Pelecanus erythrorynchos California, Estados Unidos Hígado 1.37 0.7 – 1.8 (Connors et al., 1972) Pelícano marron Pelecanus occidentalis California, Estados Unidos Hígado 0.7 (Connors et al., 1972) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Hígado 0.13 – 1.1 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Riñón 0.06 – 2.3 (Nam et al., 2005b) A N E X O S | 237 Tabla 58. Concentraciones de hierro en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 4873.95 1584 - 11029.21 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 1043.95 530.78 - 2785.92 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 6987.54 818.93 - 19742.01 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 1191 461.86 - 4230.80 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 3227.5 (Debacker et al., 2000) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 683 (Debacker et al., 2000) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 3053 393 - 7946 (Debacker et al., 1997) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 656 122 - 1759 (Debacker et al., 1997) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 5736.55 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 814 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 5468.64 752.61 - 12089.25 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 789.01 240.10 - 1299.44 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 5742.67 2441.46 - 10100.80 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 1221.85 796.07 - 1807.51 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 3496.58 2071.64 - 4356.65 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 1161.36 545.95 - 2065.94 Rodríguez Ledesma, 2013 Varias especies Costa occidental de Canadá Hígado 759.4 (Elliott and Scheuhammer, 1992) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 1040 - 20600 (Henny et al., 1995) Varias especies Pacífico norte, Japón Hígado 144 - 411 (Honda et al., 1990) Varias especies Pacífico norte, Japón Riñón 107 - (Honda et al., 1990) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 1040 - 20600 (Henny et al., 1995) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 1240 - 4050 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 327 - 539 (Kojadinovic et al., 2007c) 238 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 59. Concentraciones de manganeso en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 24.79 14.88 - 43.33 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 23.14 9.86 - 46.82 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado 8.562 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 6.291 (Ribeiro et al., 2009) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 23.01 10.61 - 44.35 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 25.18 8.04 - 49.55 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 17.96 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 26.04 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 11,022 10.208 -11.837 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 5.99 5.379 – 6.606 (Mendes et al., 2008) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 39.29 20.14 - 54.83 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 13.02 7.91 - 21.53 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 24.92 18.06 - 29.67 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 20.93 15.40 - 27.64 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 20.33 15.02 - 27.95 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 20.82 13.22 - 27.79 Rodríguez Ledesma, 2013 Varias especies Costa occidental de Canadá Hígado 10.83 12.9 ± 2.09 (Elliott and Scheuhammer, 1992) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 10. 0 - 21 (Henny et al., 1995) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Hígado 7.65 – 23.9 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Riñón 5.44 – 13.6 (Nam et al., 2005b) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado Min.10 - Max.23 (Henny et al., 1995) Varias especies Japón Hígado 2.03 -5.12 (Honda et al., 1990) Varias especies Japón Riñón 1.14 – 3.79 (Honda et al., 1990) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 7.37 – 27.9 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 6.26 - 733 (Kojadinovic et al., 2007c) A N E X O S | 239 Tabla 60. Concentraciones de mercurio en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 8.08 3.31 - 19.53 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 6.3 2.53 - 15.64 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado 6.094 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 3.939 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Galicia, España Hígado 2.275 ND. - 12.803 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 5.93 2.69 - 11.49 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 5.72 2.46 - 11.85 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 1.208 0.106 - 3.084 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 6.9 0.8 – 35.8 (Debacker et al., 1997) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 5.15 1 – 23.8 (Debacker et al., 1997) Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Hígado 7.2 ND. - 35 (Delbeke et al., 1984)24 Arao Uria aalge Costa belga, Bélgica Riñón 4.4 (Delbeke et al., 1984) Arao Uria aalge Escocia Hígado 2.3 0.9 – 3.7 (Stewart et al., 1994) Arao Uria aalge Escocia Riñón 2.35 0.8 – 3.9 (Stewart et al., 1994) Arao Uria aalge Hornoya, Noruega Hígado 1.9 (Wenzel and Adelung, 1996) Arao Uria aalge Hornoya, Noruega Riñón 1.5 (Wenzel and Adelung, 1996) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 6.26 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 10.02 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 1.291 - 2.603 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 0.952 - 3.423 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 1.613 - 1.888 0.619 - 7.096 (Carbonell et al., 2007) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 9.04 7.17 - 9.85 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 5.32 4.38 - 7.05 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 1.774 ND. - 3.687 (Pérez-López et al., 2006) Cormorán Phalachrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 13.69 6.12 - 25.99 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalachrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 8.92 5.45 - 12.43 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 24,365 (Sanpera et al., 2008) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 5.36 (Sanpera et al., 2008) Cormorán Phalachrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 4.246 -7.688 0.854 - 21.029 (Carbonell et al., 2007) Cormorán imperial Phalachrocorax atriceps Patagonia, Argentina Hígado 1 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalachrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Hígado 0.9 (Gil et al., 2006) Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 6.94 0.87 - 15.63 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 6.05 1.65 - 10.05 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota cocinera Larus dominicanus Patagonia, Argentina Hígado 0.30 - 1.23 (Gil et al., 2006) 24 Datos expresados en peso húmedo 240 | Análisis toxicológico y estudio histopatológico de las aves muertas por la catástrofe del “Prestige” Tabla 60 (cont.). Concentraciones de mercurio en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Pelícano marron Pelecanus occidentalis Florida, Estados Unidos Hígado 9.74 5.14 – 17.36 (Connors et al., 1972)25 Pelícano blanco Pelecanus erythrorynchos California, Estados Unidos Hígado 1.54 1.20 – 1.88 (Connors et al., 1972) Pelícano marron Pelecanus occidentalis California, Estados Unidos Hígado 4.13 (Connors et al., 1972) Varias especies Costa occidental de Canadá Hígado 4.06 0.69 – 9.63 (Elliott and Scheuhammer, 1992)26 Pingüino de Magallanes Spheniscus magellanicus Golfo San Jorge, Argentina Hígado 1.16 1.16 ± 0.68 (Gil et al., 2006) Pingüino de Magallanes Spheniscus magellanicus Golfo San Jorge, Argentina Riñón 0.36 0.36 ± 0.07 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto deseado Hígado 0.89 0.89 ± 0.21 (Gil et al., 2006) Gaviota cocinera Larus dominicanus Puerto Madryn Hígado 0.3 (Gil et al., 2006) Cormorán gris Phalacrocorax gaimardi Patagonia, Argentina Hígado 0.9 (Gil et al., 2006) Pardela oscura Puffinus griseus Golfo San Jorge, Argentina Hígado 0.3 (Gil et al., 2006) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 0.4 - 12 (Henny et al., 1995) Varias especies Pacífico norte, Japón Hígado 0.53 - 723 (Kim et al., 1996b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Hígado 1.3 - 33 (Nam et al., 2005b) Cormorán gigante Phalacrocorax carbo Pacífico norte, Japón Riñón 0.7 - 39 (Nam et al., 2005b) Varias especies Inglaterra Riñón Max: 45 ppm p.s. (Osborn et al., 1979) Arao Uria aalge Alemania Hígado 0.81 – 20.87 (Wenzel and Adelung, 1996) Pato joyuyo Aix sponsa Tennesse, Estados Unidos Hígado 0.1-1.1 (Lindsay and Dimmick, 1983) Garza ceniza Ardea herodius Ontario, Canadá Hígado 97 14.6 - 175 (Jenkins, 1980) Varias especies Antártida Hígado 0.5 – 2.9 (Norheim, 1987) Gaviota argéntarea Larus argentatus Dinamarca Hígado 0.65 0.08 – 2.34 (Elvestad et al., 1982) Pelícano marron Pelecanus occidentalis Florida, Estados Unidos Hígado 0.75 (Ohlendorf and Harrison, 1986) Pelícano marron Pelecanus occidentalis Florida, Estados Unidos Riñón 0.68 (Ohlendorf and Harrison, 1986) Huilota Zenaida macroura Estados Unidos oriental Hígado 0.7 – 0.67 (Jenkins, 1980) Varias especies Alaska, Estados Unidos Hígado 0.4 - 12 (Henny et al., 1995) Varias especies Japón Hígado 0.07 – 95.4 (Honda et al., 1990) Varias especies Japón Riñón 0.11 – 8.81 (Honda et al., 1990) Varias especies Isla Reunión, Francia Hígado 0.26 – 24.3 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Isla Reunión, Francia Riñón 0.17 – 24.2 (Kojadinovic et al., 2007c) Varias especies Mar de Barents, Noruega Hígado 0.24 – 5.72 (Savinov et al., 2003) 25 Datos expresados en peso húmedo 26 Se han considerado promedios A N E X O S | 241 Tabla 61. Concentraciones de plomo en otros estudios. Especie Nombre científico Lugar Órgano Media D.S. ó min-max Autor Alca Alca torda Galicia, España Hígado 0.99 ND. - 26.33 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Galicia, España Riñón 0.16 ND. - 1.40 Rodríguez Ledesma, 2013 Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Hígado ND. (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Aveiro y Peniche, Portugal Riñón 0.254 (Ribeiro et al., 2009) Alca Alca torda Galicia, España Hígado 1.451 ND. - 13.520 (Pérez-López et al., 2006) Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 0.07 ND. - 0.46 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Riñón 0.21 ND. - 1.47 Rodríguez Ledesma, 2013 Arao Uria aalge Galicia, España Hígado 4.06 0.014 - 18.76 (Pérez-López et al., 2006) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 0.2 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Riñón 0.57 Rodríguez Ledesma, 2013 Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Hígado 0.102 - 1.09 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Ovar y Peniche, Portugal Riñón 0.145 - 0.266 (Mendes et al., 2008) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado .036 0,009 - 0,037 (Gallego Rodríguez et al., 2007) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado .033 0,008 - 0,110 (Gallego Rodríguez et al., 2007) Alcatraz Morus bassanus Galicia, España Hígado 0.008 - 0.009 0.002 - 0.039 (Carbonell et al., 2007) Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 0.2 0.11 - 0.29 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Riñón 5.14 0.06 - 25.06 Rodríguez Ledesma, 2013 Frailecillo Fratercula arctica Galicia, España Hígado 1.433 0.022 - 7.433 (Pérez-López et al., 2006) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 0.16 0.13 - 0.18 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Riñón 0.1 0.03 - 0.13 Rodríguez Ledesma, 2013 Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado ND. (Sanpera et al., 2008) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado .012 ND. - 0,031 (Gallego Rodríguez et al., 2007) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado .016 ND. - 0,032 (Gallego Rodríguez et al., 2007) Cormorán Phalacrocorax aristotelis Galicia, España Hígado 0.005 - 0.006 ND. - 0.022 (Carbonell et al., 2007) Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Hígado 0.46 0.04 - 1.92 Rodríguez Ledesma, 2013 Gaviota Larus cachinnans Galicia, España Riñón 2.82 ND. - 11.36 Rodríguez Ledesma, 2013