Avances da bioloxía molecular e celular na aplicación biomédica: edición xenómica, terapia xénica e inmunoterapia

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA TRABALLO FIN DE GRAO DE MEDICINA Avances da bioloxía molecular e celular na aplicación biomédica: Edición xenómica, terapia xénica e inmunoterapia Loureiro Veira, Martiño Titor: Dr. Ángel María Carracedo Álvarez Cotitora: Dra. Catarina Allegue Toscano Departamento: Medicina Xenómica Curso 2020 Convocatoria: Xullo 2020 1 Índice 1. Resumo ............................................................................................................................... 3 2. Introdución ......................................................................................................................... 4 3. Obxectivos e metodoloxía .................................................................................................. 6 4. Edición xenómica ............................................................................................................... 7 4.1 Roturas de dobre cadea ..................................................................................................... 7 4.2 Sistemas de edición xenómica .......................................................................................... 9 4.2.1 ZFNs e TALENs ........................................................................................................ 9 4.2.2 CRISPR-Cas9 .......................................................................................................... 10 4.2.3 Ferramentas emerxentes .......................................................................................... 15 4.2.4 Outras técnicas de edición xenómica....................................................................... 16 4.3 O transporte nos sistemas de edición .............................................................................. 17 4.3.1 Métodos físicos ........................................................................................................ 17 4.3.2 Métodos químicos ................................................................................................... 17 4.3.3 Vectores virais e non virais, transporte in vivo ........................................................ 18 4.4 Aplicacións preclínicas ................................................................................................... 20 5. Terapia xénica................................................................................................................... 21 5.1 Estratexias e fármacos aprobados ................................................................................... 21 5.2 Edición xenética en terapia xénica ................................................................................. 27 6. Inmunoterapia ................................................................................................................... 30 6.1 Neoplasia e resposta inmune .......................................................................................... 30 6.2 Estratexias de inmunoterapia .......................................................................................... 30 6.3 Células CAR T ............................................................................................................... 32 6.3.1 Concepto. CAR Ts aprobadas ................................................................................. 32 6.3.2 Universalidade e efectos adversos ........................................................................... 35 6.3.3 Novas xeracións de CAR T ..................................................................................... 36 6.3.4 CAR T e inhibidores de checkpoints ....................................................................... 39 6.3.5 Papel de CRISPR-Cas9 nas novas CAR T .............................................................. 39 7. Abreviacións ..................................................................................................................... 41 8. Bibliografía ....................................................................................................................... 42 2 Índice de táboas - Táboa 1: Ortólogos de Cas9 e PAMs .............................................13 - Táboa 2: Tecnoloxías CRISPR........................................................15 - Táboa 3: Fármacos aprobados para terapia xénica..........................27 - Táboa 4: Ensaios con CAR Ts aprobadas.......................................34 - Táboa 5: Estratexias na cuarta xeración de CAR Ts.......................38 Índice de figuras - Figura 1: Rutas de reparación de roturas de dobre cadea................8 - Figura 2: Representación comparativa das endonucleases..............9 - Figura 3: Representación do sistema CRISPR ..............................11 - Figura 4: Estrutura de CRISPR-Cas9............................................12 - Figura 5: Sinais TCR e coestimuladoras. Esquema dun CAR.......33 3 1. Resumo Nos últimos anos describíronse distintas ferramentas de edición xenómica, e novas están a emerxer baseadas no sistema CRISPR-Cas9. Este, que emprega á proteína Cas9 cun sgRNA como guía, destaca pola súa eficiencia, accesibilidade e versatilidade, sendo aplicado en campos diversos. Con todo, presenta algúns inconvenientes, como os efectos off-target, que teñen que ser tidos en conta na súa aplicación. Na clínica, as ferramentas de edición xenómica empréngase experimentalmente para tratar enfermidades xenéticas in vivo e ex vivo, modificando células do paciente como proxenitores hematopoéticos. Nesta revisión estudaremos o funcionamento destas ferramentas, as técnicas de transporte e, a través dunha visión de conxunto da terapia xénica e a inmunoterapia contra o cancro, a súa aplicación ao tratamento de enfermidades xenéticas e o seu papel no desenvolvemento de novas células CAR T. 4 2. Introdución Os avances en bioloxía molecular dos últimos tempos teñen o potencial para cambiar a forma na que se manexa a enfermidade xenética no campo da biomedicina. Se hai só trinta anos se estaba a buscar coñecer a secuencia do noso xenoma, hoxe non só temos medios técnicos para poder coñecer a secuencia dun individuo en concreto con certa facilidade, senón que dispoñemos de ferramentas para cambiala. Con elas, entramos nunha nova era na que se poderá ofrecer tratamentos curativos para pacientes con enfermidades xenéticas baseados na edición dos xenes causais (1). A edición xenómica consiste en cambiar o ADN dunha célula cunha precisión tal que se pode lograr unha especificidade dun só nucleótido. Para iso, dispoñemos dunha serie de sistemas baseados en endonucleases programables, entre as que destaca polas súas vantaxes o sistema CRISPR-Cas9. Estas enzimas permiten facer cortes no ADN e causar delecións, alteracións do marco de lectura e insercións de novo material xenético. Tamén están a emerxer novas estratexias de edición xenómica, que expoñeremos brevemente, como o base editing ou o prime editing. Os primeiros avances na tecnoloxía de edición xenética remóntanse a 1994, cando se describiu que roturas de dobre cadea estimulaban a recombinación homóloga, permitindo a inserción de novas secuencias no ADN. Dous anos máis tarde, en 1996, deséñase a primeira nuclease con dedos de zinc (ZFN), que se emprega durante a primeira década dos anos 2000, conseguíndose en 2008 o knockout (KO) de CCR5 en linfocitos T humanos. Ao ano seguinte, 2009, descríbese o código das TAL, que leva ao deseño en 2010 das primeiras TALENs, que son empregadas aínda hoxe en día. Pero foi en 2012 cando se desenvolve o sistema CRISPR-Cas9, baseándose nos CRISPR bacterianos, que ata os nosos días demostrou gran utilidade tanto in vitro coma in vivo na edición de células humanas (2). Entendemos o concepto de terapia xénica como a indución da expresión dunha secuencia de material xenético (secuencia terapéutica) en células ou tecidos para a regulación, reparación, substitución, adición ou deleción dunha secuencia xenética (3), para curar ou aliviar a sintomatoloxía dunha enfermidade cos mínimos efectos adverso. As ferramentas de edición xenómica permítennos facer cambios na secuencia de ADN de células humanas para terapia xénica tanto ex vivo como in vivo, con limitacións que veremos máis adiante. As enfermidades monoxénicas, ou de herdanza mendeliana, son posiblemente a aplicación máis evidente. Son aquelas enfermidades cuxa causa é unha mutación nun xene, e que se herda segundo patróns mendelianos, en contraposición ás enfermidades complexas onde a carga xenética supón unha parte da causa, combinándose con factores ambientais. Son na súa maioría enfermidades raras, considerando a definición europea (4), cunha frecuencia inferior a menos de 5 casos por cada 10000 persoas, pero que se estima que en conxunto poderían afectar a un total de 350 millóns de persoas no mundo . Ademais de seren dificilmente diagnosticadas na clínica pola súa baixa frecuencia e o descoñecemento das mesmas, o seu tratamento tamén é unha barreira: distintas administracións tratan de facilitar o desenvolvemento de novos “fármacos orfos” para estas enfermidades que tradicionalmente non estaban na diana da investigación farmacolóxica. Por un lado, a xenética resulta unha ferramenta indispensable hoxe en día no diagnóstico e caracterización destas patoloxías. Por outro, a terapia xénica abriu unha nova vía de tratamento para estes pacientes, e hai xa fármacos aprobados para algunhas enfermidades, coma a distrofia 5 muscular espiñal (nusinerseen), a inmunodeficiencia severa combinada por déficit de ADA (strimvelis) ou a distrofia muscular de Duchenne (eteplirsen) (5,6). Mais a edición xenética ten aplicacións clínicas máis alá da terapia xénica. A inmunoterapia é unha forma de tratamento que ten como obxectivo desencadear, modular ou dirixir a resposta inmune do suxeito, e no cancro trata de desencadeala fronte á neoplasia. Unha forma de inmunoterapia son as CAR T, linfocitos T do paciente modificados para recoñecer antíxenos do tumor e activarse contra el. Como veremos, a edición xenética xoga un papel fundamental no desenvolvemento de novas CAR T (7). Para o desenvolvemento desta clase de avances na biomedicina son necesarios equipos multidisciplinares, debido ao carácter transversal dos problemas que se presentan. Dende a bioinformática, que é vital non xa para facer modelos in sílico de terapias ou técnicas, senón para algo tan básico como poder procesar, analizar e interpretar a inxente cantidade de datos que se obteñen no cribado xenético. Datos que tamén teñen que ser interpretados dende o punto de vista biolóxico para finalmente asociar a variación xenética co desenvolvemento da patoloxía en cuestión. Pero tamén a bioquímica, viroloxía, inmunoloxía... por citar algunhas disciplinas cuxo ámbito está directamente relacionado, e por suposto, a xenética e a bioloxía molecular e celular. O obxectivo será a translación dos descubrimentos na investigación básica aos estudos clínicos. O médico, pertencendo a un equipo clínico, debe servir de eixo entre o paciente e o investigador, para que poidan facer entre todos dita translación. E para isto, é imprescindible que coñeza os avances que acontecen na investigación. Nesta revisión preténdese ofrecer unha visión de conxunto por un lado sobre as ferramentas de edición xenómica, centrándonos no sistema CRISPR-Cas9, e por outro nos ámbitos de aplicación na clínica, a terapia xénica e a inmunoterapia, camiñando cada vez máis cara a unha medicina personalizada. 6 3. Obxectivos e metodoloxía Co seguinte traballo preténdese revisar a bibliografía sobre as técnicas de edición xenética existentes, prestando especial atención ao sistema CRISPR-Cas9, e a súa aplicación na clínica. Para isto, ofrecerase unha visión de conxunto dos eidos da terapia xénica e a inmunoterapia, revisando as distintas estratexias terapéuticas empregadas actualmente que se encadran neles, e explorando máis exhaustivamente aquelas onde a edición xenética ten maior relevancia. Para a busca de información, empregouse a base de datos PubMed da U.S. National Library of Medicine (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), tratando de incluír publicacións o máis recentes posible, coa fin de reflexar na revisión os últimos avances nestes campos. Para a busca de ensaios clínicos empregouse o rexistro ClinicalTrials da U.S. National Library of Medicine (https://clinicaltrials.gov/). As buscas foron guiadas pola patoloxía ou pola intervención terapéutica (“Fabry disease”, “nusinersen” ou “thalassemia; gene therapy OR biologic”). Os resultados foron filtrados segundo a adecuación á busca realizada e o estado do ensaio clínico, excluíndo aqueles cuxos resultados xa foran consultados a través doutra fonte, así como aqueles que foran cancelados antes de comezar ou cuxo estado fose descoñecido. Tamén se consultaron as páxinas da Axencia Europea do Medicamento (EMA) (https://www.ema.europa.eu/en), da Food and Drug Administration (FDA) (https://www.fda.gov/), da Axencia Española do Medicamento (AEMPS) (https://www.aemps.gob.es/), así como as páxinas dos proxectos OMIM (https://omim.org/) e Orphanet (https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php). 7 4. Edición xenómica Antes de comezar a desenvolver as diferentes ferramentas de edición xenética, e debido a que a maioría delas se basean en provocar roturas de dobre cadea no ADN da célula, exporemos os dous mecanismos principais de reparación: a recombinación non homóloga ou NHEJ, (do ingés nonhomologous end joining) e a recombinación homóloga (HR). 4.1 ROTURAS DE DOBRE CADEA Segundo que mecanismo de reparación vaia a darse na célula, os extremos das cadeas adxacentes ao corte sufrirán uns procesos ou outros (Figura 1). Os extremos atoparanse conservados como romos, feito promovido pola unión aos mesmos da proteína Ku, cando se produza a NHEJ. Nesta interveñen nucleases, polimerases e ligases ademais de outras moléculas que actúan como cofactores. De entre as nucleases destaca a Artemis, que actúa en complexo con protein quinases dependentes de ADN, evita que se formen estruturas aberrantes (hairpins) no extremo romo do ADN e semella imprescindible para a posterior formación dunha unión estable. De entre as polimerases podemos enumerar as Pol mu e Pol lambda, capaces de interactuar con Ku e xerar homoloxías entre os extremos mediante a adición sen moldes de nucleótidos. A ligases como o complexo Lig4-XRCC4 serían as moléculas encargadas de estabilizar definitivamente a reparación do fragmento. Estes complexos moleculares son moi flexibles á hora de actuar, sendo este mecanismo o máis utilizado polas nosas células, pero tamén producen resultados heteroxéneos. De feito, o máis frecuente neste tipo de reparación é que se produzan erros. As actividades de Artemis e as polimerases poden causar microdelecións e microinsercións respectivamente, o que altera o marco de lectura (8). Para que se produza a recombinación homóloga é necesaria unha secuencia de ADN homóloga á secuencia que se repara (en azul na figura). Esta secuencia adoita provir da cromátide irmá, pois existen mecanismos que evitan o uso do cromosoma homólogo. Deste xeito, a recombinación homóloga só é posible en fases do ciclo celular onde existe dita cromátide, fases S e G2. Ao comezo actúa sobre a secuencia o complexo MRN, que produce unha resección nunha das febras dos extremos da rotura, convertendo ditos extremos en cohesivos. Posteriormente únese a proteína RPA, que permite á súa vez a participación de outras (como a RAD51 ou as BRCA) e catalízase un armazón filamentoso sobre o extremo. Este vai levar á invasión dunha dobre febra de ADN (en azul na figura) que se estabiliza nun bucle D (D-loop formation) en presenza dun nivel de homoloxía elevado, proceso que leva á formación dun heterodímero. A secuencia homóloga dirixirá a síntese da cadea cortada, que posteriormente será estabilizada a través de ligases, resultando na reparación do dano. Estes procesos están influenciados polo grado de pregamento do ADN, e vense influídos por topoisomerases que alteran a conformación do mesmo. Ademais, tamén está descrita outra estrutura chamada double Holiday junction, na que se produce unha invasión mutua das febras, pero que é menos importante cuantitativamente falando. Finalmente, existen outras rutas secundarias, pero que non abordaremos por seren menos relevantes (9). 8 Figura 1: principais rutas de reparación das roturas de dobre cadea e enzimas implicadas, segundo a homoloxía necesaria. Figura adaptada de (8) Estes procesos son clave para os métodos de edición xenética que veremos a continuación. A recombinación non homóloga (NHEJ) tende a desprazar o marco de lectura dentro dun xene: unha deleción dun só nucleótido altera o agrupamento de nucleótidos a partires del (tres nucleótidos, un códon, un aminoácido) polo que alterará todos eses codóns, con probablidades de xerar un codón de parada prematuro. Deste xeito, a reparación por este método facilita a obtención de KOs, ou sexa células ou organismos modificados para perder a expresión dun xene. Doutro banda, a recombinación homóloga (HDR) é o procedemento polo que unha célula pode introducir un transxene nunha rexión concreta, se lle subministramos un fragmento de ADN cunha secuencia homóloga en torno á rotura. Polo tanto, tamén se fai importante poder modular a resposta celular segundo os nosos intereses. Por exemplo, a HDR só é posible durante certas fases do ciclo celular (S e G2) nas que a replicación do ADN está completa e as cromátides irmás están dispoñibles para servir de molde (10). Así que técnicas coma a sincronización do ciclo celular con nocodazol e ABT-751 son especialmente útiles para minimizar reparacións polo proceso non desexado. Sería idóneo poder inhibir as moléculas que producen a NHEJ cando se pretende facer unha HDR, xa que se pensa que este induce insercións aleatorias cando se subministra ADN foráneo a unha célula, con consecuencias imprevisibles (11). 15 secuencias. Amosamos unha táboa (Táboa 2) con algunhas das diferentes tecnoloxías baseadas en CRISPR. Táboa 2: tecnoloxías CRISPR Nome Cas Moléculas asociadas Función Ref CRISPRa d - Cas factores de transcrición activación dun xene (1) CRISPRi d - Cas inhibición da RNA - pol represión dun xene (1) CRISPR - X d - Cas Citidina - deaminase xerar diversidade xenética dirixida (36) EvolvR nickase ADN polimerase IV xerar diversidade xenética dirixida (1) Editor de bases d - Cas nucleótido desaminase cambio de bases (37) Cascade Cas3 delecións de ata 100kb (1) LiveFISH Cas9/Cas13 oligonucleótidos fluorescentes visualizar secuencias en vivo e en tempo real (38) Transposase asociada a CRISPR Cas3 ou Cas12 Tnt7 - like transposase insercións (39) Prime editing nickase Retrotranscriptase insercións, delecións e correccións (40) 4.2.3 Ferramentas emerxentes 4.2.3.1 Editores de bases Malia as súas vantaxes, o sistema CRISPR-Cas9 segue a basearse en roturas de dobre cadea e a corrección das mutacións a través de HDR. Por isto, pode producir microinsercións e delecións (indels) por activación dos fenómenos de NHEJ, con certa heteroxeneidade nos produtos da edición, o que motiva o deseño de variantes baseadas noutros principios: os editores de bases (base editing, BE). O BE permite producir mutacións de transición sobre un só nucleótido, cambiando C a T(CBE, APOBEC1) ou A a G (ABE, TadA), e tamén T a C e G a A se a que editamos é a cadea complementaria. Consiste na asociación dunha dCas9 cunha desaminase que actúa sobre a cadea de ADN que non se une ao sgRNA no bucle R. Nesta cadea prodúcese unha pequena fiestra de catro ou cinco pares de bases (variable segundo a proteína usada, pero en torno á posición 6 contando o PAM en 21-23) sobre as que pode actuar a enzima. Aínda que hai diferenzas entre CBE e ABE, presentan impurezas na edición, xeran indels, teñen actividade off-target, producen edicións “colaterais” (bystander edits, cambios en nucleótidos adxacentes á diana) así como outras limitacións (37). 4.2.3.2 Prime editing Recentemente describiuse o prime editing (PE), que consiste na asociación dunha nickase cunha retrotranscriptase empregando como guía e molde un pegRNA (prime editing guide RNA) (40). Este RNA posúe, como os outros, dominios complementarios ao ADN diana e dominios de unión a Cas9, pero ademais inclúe unha transcrición a RNA da secuencia que se 16 pretende editar. Deste xeito, ao cortar unha febra de ADN exponse un extremo 3’ a partir do cal se retrotranscribe a información contida no noso pegRNA a ADN cromosómico. Isto deixa dous flaps, un 5’ coa secuencia orixinal e un 3’ coa secuencia editada, dos cales o 5’ ten máis probabilidades de ser degradado por enzimas celulares, resultando na incorporación da secuencia modificada. A disparidade entre secuencia editada e salvaxe pode resolverse a favor de calquera das dúas, pero se diriximos unha nickase que corte a salvaxe, a célula tenderá a utilizar a editada como molde para reparar a outra e non ao revés. Esta segunda nickase deberá ter unha diana diferente á primeira (PE3), ou empregar como tal a secuencia xa modificada (PE3b), para evitar roturas de dobre cadea. O prime editing permite editar SNPs, realizando calquera cambio de base, con menor eficiencia que BE na fiestra de edición, pero maior fora dela. Tamén permite insercións e delecións pequenas, e delecións de gran tamaño, demostrándose como unha ferramenta versátil. Mostra menor actividade nos efectos off-target coñecidos da Cas9-sgRNA convencional e unha menor taxa de insercións e delecións indesexables. Permite a elección de diferentes secuencias diana, dianas da nickase secundaria, pegRNAs e cal das febras editar, o que leva a dispoñer de diversas posibilidades de optimización (40). Trátase dunha técnica nova e prometedora, pero polo momento só foi empregada in vitro en algunhas liñas celulares de laboratorio, polo que require de maior desenvolvemento, sendo a transporte unha das principais dificultades que se presentan (1). 4.2.4 Outras técnicas de edición xenómica Ademais das endonucleases xa expostas, existen outras ferramentas de edición xenómica anteriormente descritas, e que serán brevemente cometadas. É o caso dos sistemas de recombinases especificas Cre-loxP e Flp-FRT, que proveñen do bacteriófago P1 e de Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. Trátase de enzimas da clase tirosina kinase capaces de recoñecer secuencias de nucleótidos no ADN (os loci loxP e FRT) e catalizar un intercambio entre ambas cadeas. Se as dúas secuencias se atopan nunha mesma cadea pode conseguirse a exclusión da secuencia que se atopa no medio, sendo unha ferramenta útil para xerar KOs. Unha das principais desvantaxe é que as recombinacións son reversibles, polo que se desenvolveu un terceiro sistema, a ΦC31, que só recombina nunha dirección. Estas ferramentas foron empregadas en animais e células humanas para modelar enfermidades, desenvolvéndose técnicas para obter especificidade de tecido, KOs inducibles (tetraciclinas e tamoxifeno), ou as trampas xénicas (gene trapping), baseadas na inversión da secuencia, invalidando a súa función de xeito reversible. Estas técnicas están limitadas porque soamente poden actuar sobre os lugares que recoñecen, ademais de que producen altas taxas de letalidade nas células (41). As nanopartículas de PNA son análogos de ácidos nucleicos estruturadas en esqueletos peptídicos que lles confiren resistencia á degradación. Poden recoñecer secuencias concretas e invadilas formando distintas estruturas segundo o tipo de PNA (bis-PNA, tail clamp (tcPNA), pseudo complementary (pcPNA), e gammaPNA). O seu mecanismo de acción está baseado na indución da reparación do ADN mediante escisión de nucleótidos (NER), reparando o mutante grazas a unha secuencia homóloga. Poden ser transportadas ao interior das células acompañadas por distintas partículas, como os CPPs e outros vectores químicos. Ofrecen a vantaxe de evitar as roturas de dobre cadea das endonucleases, sendo en principio máis seguras, pero a súa eficiencia é da orde de 0’5 a 5%. Foron emrpegadas para corrixir mutacións patóxenas en liñas celulares hematopoéticas humanas (42). 17 4.3 O TRANSPORTE NOS SISTEMAS DE EDICIÓN A edición do ADN dunha célula mediante CRISPR-Cas9, ou calquera outro método, require de que transportemos certas moléculas ao seu interior. O proceso de transporte adoita conceptuarse con dous elementos: a carga e o medio de transporte. A carga pode ser un fragmento de ADN que codifique Cas9 e o sgRNA, mRNA para traducilo a Cas9 e sgRNA ou ben a proteína Cas9 directamente co sgRNA (ribonucleoproteína, ou RNP). Con este último método, se ben non logramos unha expresión duradeira de Cas9 que pode ser desexable en algúns casos, podemos controlar mellor a cantidade de Cas9 que hai na célula nun momento dado reducindo os efectos off-target. Os medios de transporte podemos clasificalos en tres grandes grupos segundo a súa natureza: medios físicos, químicos e biolóxicos (vectores virais e vectores non virais) (43). Neste traballo farase unha distinción entre os métodos de aplicación física e química, de uso in vitro ou ex vivo, e os métodos con vectores, que ademais diso poden ser empregados tamén in vivo. 4.3.1 Métodos físicos Dentro dos métodos empregados in vitro destaca a microinxección, un método físico considerado gold standard. A microinxección permite evitar barreiras ao transporte como pode ser a matriz extracelular, non está limitada polo peso molecular da carga e permite o control das cantidades introducidas. Pero ten limitacións, xa que as células unicamente adoitan tolerar unha soa inxección, e é un proceso laborioso e complexo. Habitualmente faise unha inxección citoplasmática de mRNA de Cas9 e dos sgRNA, o que permite unha expresión da molécula ata que o mRNA se degrada no citoplasma. Isto permite que se produzan menos efectos adversos que coa inxección intranuclear de ADN, que da lugar a unha expresión de Cas9 máis duradeira e menos controlada, con maior probabilidade de efectos off-target (43). A electroporación é outro método frecuente, baseado na utilización de pulsos eléctricos de alto voltaxe para abrir canais nanométricos a través da membrana celular polos que poden entrar os compoñentes ao citoplasma. Emprégase en cubetas ou cámaras específicas, nas que as células se atopan bañadas nun medio onde están presentes as moléculas que desexamos transportar (43). Aínda que tamén está descrito o seu uso en embrións de rato intra-útero, non é habitual que se empregue desta forma (44). 4.3.2 Métodos químicos O fosfato cálcico é un medio químico que forma complexos ADN-Ca2+ que precipitan, únense a cargas negativas da membrana e inducen endocitose. O FuGENE-6 é outro método químico, unha solución comercial con lípidos non liposomais entre outros compoñentes, empregada para transportar secuencias xénicas ao interior das células. Os CPPs son pequenas cadeas de aminoácidos con características de polaridade variables, que permiten recubrir diferentes moléculas e introducilas en distintos tipos celulares, segundo o deseño de CPP empregado (43). Os nobelos de ADN (DNA nanoclews) son unha nova tecnoloxía deseñada para transportar CRISPR-Cas9 ao interior da célula. Consiste en estruturas formadas por este ácido nucleico que se autoensamblan en formas esféricas, por estaren formadas por secuencias palindrómicas, quedando ocas no interior. Poden transportar unha carga e, baixo certas condicións biolóxicas, por exemplo o pH, cambiar de conformación e liberalas. Resultan altamente eficaces e poden 18 ser empregadas en combinación con outros métodos, como por exemplo a polietilenimina (PEI) un polímero que permite amortecer o pH dos endosomas, facilitando o escape das moléculas transportadas (43,45). Ningún destes métodos químicos se emprega in vivo. 4.3.3 Vectores virais e non virais, transporte in vivo 4.3.3.1 Vectores virais Os vectores virais baséanse na utilización do virus, que aporta especificidade de tecido e a capacidade de atravesar a membrana plasmática, como contedor para a carga desexada, podendo ser usados tanto in vitro coma in vivo. Empréganse tres familias, os AAV (asociados a adenovirus), os LV (lentivirus) e os AdV (adenovirus). AAV non integra o material xenético no ADN da célula senón que se mantentén independente do cromosoma, reducindo o risco de que se produzan aberracións xenéticas no proceso de integración. AdV integra no xenoma, así como LV, o cal ten unha alta eficacia, ocasionando unha expresión máis prolongada pero incotrolada e que comporta o risco de mutacións potencialmente perigosas. Existen variantes de LV que non integran, pero perden a súa maior eficacia. Segundo o efecto desexado pode escollerse un ou outro vehículo: a expresión mantida de Cas9 leva a unha maior efectividade, pero a costa de aumentar os efectos off-target, e non sempre tería por que ser desexable. Os máis axeitados para a utilización terapéutica in vivo semellan ser os AAVs (1,43,45). Os AAV son virus ADN de cadea única, versátiles en canto a serotipo e especificidade e provocan pouca resposta inmune, non sendo patóxenos humanos coñecidos. O maior problema radica na capacidade da partícula viral, que ten pouca máis capacidade que o ADN imprescindible para Cas9 e o sgRNA, o que deixa pouca marxe para introducir outros elementos para optimizar o proceso. Para solucionalo intentouse optimizar o pregamento do ADN, editar as células previamente para expresar Cas9 por outro método empregando o virus para transportar so sgRNA, coinfectar as células con dúas partículas distintas ou buscar alternativas con outras Cas9 ortólogas máis pequenas. Os lentivirus e adenovirus (LV e AdV) úsanse de forma semellante. AdV está amplamente estudado, e presenta múltiples serotipos con distintos tropismos entre os que podemos escoller o máis axeitado, pero resulta significativamente inmunoxénico, o que non o fai axeitado para o seu uso in vivo. LV pode ser pseudotipado con partículas doutros virus, obtendo especificidade tisular. A principal vantaxe respecto aos AAV é o maior tamaño, en vez de 20 nm, 80 a 100 nm, permitindo o transporte de moita máis carga (43,45). Un problema que presenta a utilización in vivo de CRISPR-Cas9 é a resposta inmune do suxeito. Por unha parte, especialmente co uso de vectores virais, podemos obter unha resposta inmune contra o medio de transporte. Como exemplo, coñécese que os AdV son altamente inmunoxénicos e están descritos casos de inflamacións agudas dos órganos editados en animais de experimentación (46), coma se dun rexeitamento de transplante se tratase. Estes problemas redúcense empregando vectores non virais, como se expón a continuación. Ademais, aínda que o seu impacto sobre a eficacia clínica aínda non se coñece, demostrouse a presenza na poboación de anticorpos contra Cas9 (47,48), o que podería provocar respostas fronte ás células editadas. Nestes estudos tamén se demostrou a presenza de Treg reactivas á Cas9, que poderían mitigar unha hipotética reacción contra as células modificadas sen necesidade de que se tivese que tratar aos pacientes con fármacos inmunosupresores, que serían unha alternativa. Algúns ortólogos de Cas9 son máis inmunoxénicos que outros, por exemplo, a Cas9 de S. aureus máis 19 que a de S. pyogenes. Con todo, este fenómeno sería de menor importancia en casos de edición ex vivo, como as aplicacións sobre CAR-T ou sobre proxenitores hematopoéticos. 4.3.3.2 Vectores non virais Coa principal vantaxe fronte aos vectores virais de produciren unha resposta inmune moito menor, os vectores non virais son unha alternativa moi interesante á hora de explorar o transporte de CRISPR-Cas9. As partículas liposomais permiten o transporte de ADN e RNPs, e poden ser decoradas con diferentes moléculas na súa membrana que permitan especificidade na diana, evitar máis eficazmente a resposta inmune e non ser degradadas nos lisosomas celulares unha vez atravesan a membrana plasmática. Estes procedementos teñen boa eficiencia, pero presenta inconvenientes como a toxicidade das partículas ou efectos sobre células distintas do tecido diana (1,43). Os amino-lípdidos zwitterionicos (ZAL) están formados por unha cabeza lipídica cunha rexión intermedia rica en amina. Os mRNAs necesarios para codificar CRISPR-Cas9 únense á estrutura a través de colas hidrofóbicas, e os ZAL transpórtanos a través da membrana (45). As nanopartículas de ouro (AuNP) poden ser conxugadas con ADN tiolado (con grupos de xofre) ou cadeas de aminoácidos (arxinina e glutamato) para á súa vez transportar RNPs de Cas9 e sgRNA no interior das células. As vantaxes que ofrecen as nanopartículas de ouro son unha elevada eficiencia e o feito de que sexan inertes e non desencadeen resposta inmune. Foron empregadas con ADN tiolado (CRISPR-Gold) para a corrección de mutacións en Dmd en ratos e para o knock-down do Grm5 (síndrome X fráxil), e estase a estudar o transporte en células endoteliais para acceder a outros órganos, como os pulmóns, polo que resultan un método prometedor (1,45). Finalmente, comentar o transporte hidrodinámico. Trátase da inxección da carga desexada cun gran volume de líquido no torrente vascular do individuo, de xeito que aumente bruscamente a presión hidrostática intravascular, co que a carga entra nas células circundantes impulsada pola diferenza de presión. É un método de baixa eficiencia e só permite acceder ao endotelio ou órganos moi vascularizados como o fígado, pero pode resultar de utilidade en enfermidades onde a edición supoña unha selección positiva das células corrixidas. Resulta un método atractivo pola súa sinxeleza, que permite a administración in vivo sen necesidade de empregar vectores, aínda que pode ter repercusións sobre a estabilidade hemodinámica do suxeito (43,49). Foi empregado ex vivo sobre segmentos de fígado para transplante en seres humanos, administrando a infusión cun catéter na vena hepática (50), e pode aplicarse sobre músculo esquelético nunha extremidade mediante o uso de torniquetes (51). 20 4.4 APLICACIÓNS PRECLÍNICAS Estas ferramentas poden utilizarse para a investigación básica, facer modelos de enfermidades, desenvolver fármacos ou con fins terapéuticos. Para iso, poden empregarse sobre modelos celulares e seres humanos, pasando por organismos e modelos organoides. A continuación, expoñeremos brevemente distintos modelos para centrarnos máis adiante nos usos terapéuticos da edición xenética. As liñas celulares son un elemento fundamental en investigación básica ou desenvolvemento de novos fármacos. Células de pacientes con enfermidades concretas supoñen un modelo básico de dita enfermidade, e quizais o exemplo paradigmático sexan as liñas de células canceríxenas (52). As iPSCs son células somáticas diferenciadas sometidas a un proceso polo cal recuperan a súa pluripotencialidade, de xeito que poden reproducirse e rediferenciarse, e son modelos útiles en multitude de enfermidades, dende hematolóxicas (53) ou cardiovasculares(54), a hepáticas (55) ou neurolóxicas (56) por citar algúns exemplos. Os organoides son estruturas tridimensionais obtidas mediante o cultivo de células nai diferenciándoas nunha estrutura análoga á do órgano que simulan. Por exemplo, un modelo intestinal contén unha capa de epitelio cos distintos tipos celulares intestinais e cunha arquitectura en criptas e villi. Presentan unha serie de vantaxes fronte aos cultivos, como a estrutura tridimensional, a maior semellanza no ambiente ao órgano real, o teren un desenvolvemento máis estable, ou mesmo reducir os efectos off-target do sistema CRISPRCas9 en comparación cos cultivos. Entre outras, teñen aplicacións en descubrimento de fármacos e estudo da enfermidade inflamatoria intestinal, cancro ou fibrose quística (57). Os estudos en organismos permiten un enfoque diferente, permitíndonos comprender mellor o mecanismo e as interaccións entre xenes nas enfermidades xenéticas. Son modelos habituais a Saccharomyces cerevisiae, pola súa capacidade de medrar en estado haploide e diploide; Caenorhabditis elegans, pluricelular e cun sistema nervioso moi simple; Drosophila, coa que xa temos unha maior proporción de xenes ortólogos, ou o peixe cebra, que proporciona unha alta complexidade xenética semellante á nosa, e máis facilidades que os modelos con mamíferos, que tamén se empregan. Este último en concreto, o peixe cebra, é empregado en múltiples traballos para o estudo do cancro, trastornos da conducta e do desenvolvemento ou do metabolismo por citar algúns (58). Os modelos murinos son uns dos máis empregados entre os mamíferos, aínda que tamén se empregan outros coma cánidos ou primates. Poden ser humanizados, ratos inmunodeprimidos que aloxan células ou tecidos humanos, e empregados para estudar diferentes enfermidades infecciosas, metabólicas, neoplasias ou para investigar novos fármacos (59). 21 5. Terapia xénica A terapia xénica consiste en facer chegar a unha poboación celular diana unha secuencia de material xenético para que regule, elimine, repare, engada ou substitúa un produto xénico desa célula que causa unha patoloxía. Dito material xenético pode ser de diversas características, dende unha secuencia que codifique unha proteína, ata un oligonucleótido antisentido ou un RNA de interferencia, pasando por un sistema de edición xenómica como CRISPR-Cas9. Para isto, é necesario vehicular dito material ata o interior da célula, podendo empregarse métodos físico-químicos, vectores virais e vectores non virais, como xa se expuxo (60). Neste apartado repasaranse as terapias xénicas aprobadas ata a actualidade pola EMA e a FDA, analizarase a investigación coas mesmas en enfermidades de especial relevancia e veranse os principais ensaios clínicos en fases avanzadas que se están a levar a cabo. Finalmente abordarase máis polo miúdo o papel da edición xenética e de CRISPR-Cas9 neste tipo de terapias. As células CAR T e os virus oncolíticos, que tamén se poden incluír dentro do concepto de terapia xénica, serán desenvolvidos nun apartado específico dentro da inmunoterapia. 5.1 ESTRATEXIAS E FÁRMACOS APROBADOS Un oligonucleótido anti sentido (ASO) é unha cadea curta de ADN ou RNA con especificidade por un transcrito, cuxa unión pode desencadear a degradación de dito RNA ou, en mRNA inmaturo, alterar o proceso de splicing. Deste xeito, con eles podemos silenciar un xene ou excluír un exón mutado permitindo a síntese dunha proteína máis curta pero funcional (6,60). Fomivirsen era un ASO empregado para o tratamento da retinite por citomegalovirus (CMV) en infectados polo VIH. O CMV é un patóxeno oportunista causante de infección en pacientes con recontos baixos de CD4, e se o paciente non recibe tratamento evoluciona progresivamente chegando a causar cegueira. Fomivirsen é complementario ao mRNA que codifica a IE2, proteína do virus indispensable para a replicación. Hoxe os fármacos de uso habitual nesta patoloxía son o valganciclovir e o foscarnet, e fomivirsen, que era empregado como seguinte liña de tratamento, xa non está comercializado. Coa mellora dos tratamentos antirretrovirais para o VIH, esta infección xa non é tan común como foi noutro tempo (60). Kynamro, nome comercial do mipomersen, é un ASO aprobado pola FDA para o tratamento da hipercolesterolemia familiar homocigota. Estes pacientes, na súa maioría por mutacións no receptor de LDL, non poden internar as partículas de LDL nas células, aumentando considerablemente a súa concentración en sangue (ata máis de 500 mg/dl) e causando ateroesclerose prematura e grave. O fármaco bloquea a expresión da apolipoproteína B, necesaria para a síntese de VLDL, e consegue descender os niveis de LDL e de colesterol non-HDL en torno a un 30 % (aproximadamente 100mg/dl), sen afectar aos niveis de HDL. Pode ser combinado con outros tratamentos como a aférese, reducindo as necesidades da 22 mesma, e é aplicable a máis pacientes que os inhibidores da PCKS9, que non son útiles se a actividade do LDLR é menor do 2%. Con todo, nos estudos a taxa de permanencia no tratamento a longo prazo foi moi baixa, en parte por mor de efectos adversos, fundamentalmente esteatose hepática, cuxa evolución non se puido demostrar como benigna. Ademais, non probou clara eficacia na diminución do risco cardiovascular a longo prazo, quizais pola toxicidade hepática ou por reactividade inmunolóxica que tamén foi descrita. Por estes motivos, a EMA non lle concedeu a súa aprobación e non é un fármaco dispoñible en Europa (61,62). O xene DMD, situado no brazo curto do cromosoma X, codifica cos seus máis de dous millóns de pares de bases e 89 exóns a distrofina, proteína estrutural das células musculares. A distrofia muscular de Duchenne prodúcese cando unha mutación neste xen, xeralmente un desprazamento do marco de lectura, ocasiona unha perda importante da función. A distrofia de Becker é unha forma más benigna de enfermidade que acontece cando a perda funcional non é tan grande. Evitando a transcrición do exón mutado evítase o desprazamento do marco de lectura, e prodúcese unha proteína máis curta, pero máis funcional, convertendo unha distrofia severa de Duchenne nunha de Becker. A maioría das mutacións concéntranse entre os exóns 45 e 55, sendo o 51 o que concentra maior proporción delas, o 14%. Eteplirsen é un ASO que altera o splicing e evita a transcrición do exón 51. En estudos preliminares demostrou aumentar a produción de distrofina acurtada en algúns pacientes, mais non se conseguiu probar que se traducise nun beneficio clínico ao non ser concluíntes os datos sobre a eficacia, segundo a EMA. Por isto e por dispoñerse de poucos datos sobre a súa seguridade, o fármaco non está comercializado en Europa, pero si nos Estados Unidos (63–65). Recentemente a FDA aprobou o uso en distrofia muscular de Duchenne do golodirsen, un ASO que exclúe o exón 53, en vez do 51 do eteplirsen. Demostrou aumento de distrofina en ensaios de fase I e II, sen efectos adversos graves polo momento (cefalea, pirexia, gastrointestinais) (66). Actualmente temos constancia de estarse a levar a cabo con Eteplirsen un ensaio fase III en Canadá (NCT03992430), dous en fase II en Europa (NCT03985878, NCT03218995) e un en Estados Unidos en fase II con eteplirsen e golodirsen (NCT04179409). Con golodirsen estanse a levar a cabo ensaios en fase III (NCT03532542, NCT02500381) para avaliar a súa eficacia. Nusinersen (Spinraza) é un ASO de 18 nucleótidos de lonxitude complementarios a unha rexión reguladora do splicing do intrón 7 do xen SMN2. Ao interactuar con ela fai que se exprese o exón 7 deste xen, normalmente silenciado, producindo unha proteína SMN funcional, que substitúe á proteína asociada a RNA defectuosa que codifica o xene SMN1 e que causa a atrofia muscular espiñal. Esta enfermidade de herdanza autosómica recesiva está producida por un defecto na axonoxénese, relacionada coa produción de microtúbulos, o transcrito de miRNA183 e a vía mTor, nas neuronas da hasta frontal da médula ocasionando un déficit motor. Clinicamente presenta diversas formas, e distínguense catro tipos de atrofia muscular espiñal: o tipo 1 é o máis frecuente e grave, maniféstase nos primeiros seis meses de vida en lactantes que non acadan fitos básicos como o sostén da cabeza ou a sedestación, e falecen en torno aos dous anos por complicacións respiratorias. Os tipo 2 e 3 comezan en nenos máis maiores e diferéncianse segundo chegan a andar ou non, representando distintas esperanzas de vida. O tipo catro, finalmente, comeza clinicamente na idade adulta, sendo a forma máis benigna pero tamén máis infrecuente. A forma clínica de presentación está relacionada co número de copias 23 que presente o suxeito do xene SMN2, que oscilan de 2 (formas graves) a 4 ou máis (formas leves). O nusinersen está aprobado pola FDA e a EMA, emprégase en inxección intratecal, xa que non atravesa a barreira hematoencefálica, de 12 mg e require de varias doses de carga iniciais con mantemento cada catro meses (67,68). Nunha revisión sistemática recente (69) atopáronse catro ensaios feitos con este fármaco. En todos eles os resultados foron positivos tanto para recuperación de forza (escalas clínicas) como para supervivencia, ademais de atoparse diminución das necesidades de ventilación mecánica en comparación con cohorte histórica nun estudo. Con todo, existen posibles nesgos de selección e observación, así como posible heteroxeneidade coas poboacións das cohortes históricas, o que pode nesgar a comparación, e tamén entre os estudos, non sendo axeitados para metaanálise. Por isto, pode que os resultados destes estudos non sexan representativos dos que se obterían no tratamento da poboación xeral con atrofia muscular espiñal. En canto á seguridade, todos os efectos adversos atopados tiñan relación coa evolución da enfermidade ou coa punción lumbar, se ben as poboacións dos estudos son pequenas. Actualmente están activos cinco ensaios clínicos con nusinersen, dous deles en fase III, un para participantes en estudos previos e outro para probar doses maiores (NCT02594124 e NCT04089566 respectivamente). Un ensaio en fase II pretende avaliar o inicio do tratamento en nenos asintomáticos e estudar a mortalidade e a necesidade de ventilación a longo prazo (NCT02386553). Outro estudo en fase I pretende avaliar o impacto sobre a función respiratoria do tratamento (NCT04050852). Finalmente, atopouse rexistrado un estudo de vixilancia postcomercialización na República de Corea (NCT04317794) Ademais, na busca apareceron outros protocolos pertencentes a cohortes observacionais de adultos a tratamento con nusinersen (NCT03878030, NCT03709784, NCT04159987). Outra estratexia para o tratamento da AME é a introdución dunha copia do xene SMN1 nas células nerviosas do suxeito, para que exprese a proteína de forma normal. Zolgensma é o nome comercial do onasemnogene abeparvovec, un fármaco composto por unha copia do xene SMN dirixido por un promotor quimérico. Está vehiculado nun AAV9 sen capacidade replicativa, un serotipo de AAV con tropismo polo sistema nervioso central. Atravesa a barreira hematoencefálica, polo que pode ser administrado por vía intratecal e intravenosa, e só require dunha dose de tratamento. Estudos sobre mostras de pacientes falecidos tratados demostraron a expresión de proteína SMN non mutada en diversos tecidos do organismo, incluíndo motoneuronas espiñais e cerebrais. O primeiro ensaio, START , feito para demostrar a seguridade do fármaco, atopou grandes melloras na supervivencia ou dependencia de ventilación mecánica en comparación con cohortes históricas. Tamén se atopou melloría en escalas clínicas (CHOP-INTEND) e en fitos do desenvolvemento motor, chegando un 92% de pacientes a controlar o movemento da cabeza e un 17% a gatear ao final do período de seguimento. STRIVE é un estudo en fase III que se está a levar a cabo para valorar a eficacia, e cuxos datos preliminares corroboran os achados de START. O principal efecto adverso é a elevación de transaminases de ata 15-30 veces por enriba dos valores normais, polo que se incluíu a administración de glucocorticoides no protocolo de tratamento, conseguindo controlar o efecto adverso. Tamén son relativamente comúns os vómitos (6’8%). Outros ensaios están a probar o fármaco en pacientes con EMA tipo 2, e en bebés aínda asintomáticos, xa que o estudo START orientaba a que os pacientes que recibían máis precozmente o tratamento conseguían mellores resultados, así como ensaios en fase III e de seguimento a longo prazo (NCT03381729, NCT03505099, NCT03837184, NCT03306277, NCT03461289, NCT03421977). Ademais destes estudos, na data de redacción deste traballo estábanse a levar a cabo un ensaio en fase 24 IV de seguimento a longo prazo dos pacientes tratados (NCT04042025). O fármaco está actualmente aprobado pola FDA, e a EMA emitiu un informe de autorización inicial o 27 de marzo deste mesmo 2020 (70,71). A inmunodeficiencia combinada severa asociada a déficit de ADA é unha enfermidade grave, que adoita resultar letal nos primeiros anos de vida con fracaso no desenvolvemento e infeccións oportunistas recorrentes. O déficit desta enzima bloquea a síntese de ADN ao alterar o metabolismo da adenosina, causando deficiencia no desenvolvemento e función do tecido linfoide, pero tamén afectando a outros órganos (esqueleto, riles, fígado, pulmóns...). A terapia de substitución enzimática é unha opción terapéutica que mellora a función do sistema inmune así como de outros órganos, pero que presentou problemas de seguridade a longo prazo. Hoxe, recoméndase o seu uso como terapia ponte a outros tratamentos, por un período non superior a 5-8 anos (72). Estes tratamentos definitivos serían como primeira opción, o transplante de proxenitores, coa limitación de dispoñibilidade: menos do 25% de pacientes dispoñen de doante cun HLA compatible. A alternativa de tratamento con terapia xénica para pacientes sen acceso a transplante comezou a propoñerse na década de 1990, e os primeiros ensaios comezaron nos anos 2000. Strimvelis foi aprobado en 2016, despois de analizar os datos deses primeiros estudos (73). Trátase dun produto celular de precursores hematopoéticos CD34 + do propio paciente transducidos cun vector retroviral coa secuencia para expresar a ADA humana. Tamén existen alternativas en experimentación que empregan vectores lentivirais (NCT02999984). Os precursores son extraídos e transducidos en laboratorio mentres o paciente recibe un ciclo de acondicionamento con busulfán, debendo permanecer en illamento ata a recuperación do reconto de células T. Os efectos adversos que máis frecuentemente se presentan son a pirexia, citopenias, fenómenos autoinmunes e o síndrome de reconstitución inmune. Na actualidade esta terapia só se leva a cabo no hospital San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy de Milán, onde se están a levar a cabo dous ensaios con este fármaco (NCT03478670, NCT03232203). A transtirretina (TTR, cromosoma 18) é unha proteína homotetramérica transportadora de RBP e tiroxina que se atopa en sangue e líquido cefalorraquídeo. Certas mutacións no TTR (substitución V30M frecuentemente) causan un cadro de amiloidose hereditaria de carácter dominante, por acumulación de transtirretina nos tecidos, en forma de substancia amiloide. Tipicamente estes pacientes presentan polineuropatía (debut no tipo I) con insuficiencia autonómica, síndrome do túnel carpiano (debut no tipo II), cardiomiopatía e insuficencia renal, síntomas gastrointestinais e opacidades no humor vítreo. Se ben a presentación, penetrancia e expresividade son variables, a enfermidade tende a comezar a dar clínica en adultos novos, en torno á terceira e cuarta décadas da vida. Tafamidis e diflunisal son moléculas pequenas que aumentan a estabilidade da proteína circulante e enlentecen a progresión da enfermidade. Inotersen é un ASO que bloquea a expresión do TTR, tanto mutado coma salvaxe, que demostrou frear ou mellorar a polineuropatía asociada á enfermidade fronte a placebo de xeito global e por subgrupos de pacientes en distintas fases da enfermidade (74). En canto a efectos adversos perigosos, rexistráronse tres casos de trombocitopenia (menos de 25000 plaquetas/ml) e tres de glomerulonefrite sobre un total de 112 pacientes tratados co fármaco, dos cales catro faleceron po progresión da enfermidade e un por unha hemorraxia intracraneal asociada á trombocitopenia. Inotersen adminístrase por vía subcutánea semanalmente e está aprobado pola FDA e pola EMA para o tratamento da amiloidose familiar por TTR en estadíos 1 e 2 (75,76). 31 resposta inmune contra o tumor. Para isto existen dous fármacos, ipilimumab e tremelimumab, cuxo uso está aprobado para melanoma, cancro colorrectal e carcinoma de células renais (100). Por outro lado, o PD-1 é un receptor presente en linfocitos xa activados, da mesma familia que o CTLA-4. Cando se une aos seus ligandos, PDL-1 e PDL-2, moi expresados en tumores, inhíbese a proliferación, expresión de IL-2, IFN-γ e redúcese a supervivencia da célula. Bloqueando PD-1 ou o seu ligando PDL-1 evitamos este freo á actividade do linfocito e favorecemos a resposta inmune contra o tumor. Nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab avelumab e cepmiplimab son os fármacos con esa función cuxo uso está aprobado para múltiples cancros como melanoma metastático, carcinoma de pulmón, de células renais, de células de Merkel, gástrico ou linfoma de Hodgkin. A principal diferencia entre ambos sistemas é que con PD-1 intervimos a nivel periférico, sobre linfocitos que experimentaron o proceso de extenuación, volvendo a activalos, mentres que o CTLA-4 funciona a un nivel máis primordial ao afectar á propia maduración. Ademais, ao estar PDL-1 tipicamente sobreexpresado no tumor, o sistema antiPD-1 tería maior especificidade, sendo interesante o seu bloqueo xa que os niveis altos de PDL-1 están relacionados en algunhas neoplasias cunha alta agresividade e mal prognóstico cos tratamentos habituais (100,101). Aínda que menos importantes que os da quimioterapia convencional, presentan tamén efectos adversos a nivel hematolóxico, endocrinolóxico, respiratorio e gastrointestinal entre outros, ademais da activación ou reactivación de procesos autoinmunes. Mogamulizumab é un anticorpo aprobado para o tratamento de linfomas cutáneos refractarios (síndrome de Sèzary e micose fungoide) cuxa diana é o receptor de citocinas CCR4 dos linfocitos. Este receptor permite a migración dos linfocitos á pel e está expresado en aproximadamente o 40% destas patoloxías. Mogamulizumab únese a CCR4 e induce citotoxicidade sobre os linfocitos tumorais. Os efectos adversos máis comúns que produce son linfopenia e neutropenia (de grao catro ata no 70% dos pacientes), reaccións transfusionais e pirexia. Tamén se describiu polimiosite, retinite por CMV e sepse (102). Outra estratexia que pretende tanto estimular respostas preexistentes como xerar novas é a utilización de virus oncolíticos, virus atenuados naturais ou editados xeneticamente que infectan selectivamente as células tumorais. Os máis estudados son os herpes virus, sendo talimogene laherparepvec (T-Vec ou Imlygic) un HSV xeneticamente modificado aprobado para o tratamento do melanoma metastático, que non só actúa a nivel local senón que presenta efecto abscopal estimulando o recrutamento de linfocitos T en lesións metastáticas. Pero tamén está descrito o uso de vaccinia virus, Newcastle disease virus (NDV), coxsackie, reovirus, sarampelo e adenovirus para estes fins. O mecanismo antitumoral dos virus oncolíticos baséase en producir efectos citotóxicos de xeito directo e indicrecto, a través de estimular a autolise, a resposta inmune mediante anticorpos, citotoxicidade celular e mediada por complemento e a destrución do aporte vascular. Serven como adxuvante de outras formas de inmunoterapia como os inhibidores de checkpoints, onde se atopa que a combinación destes con virus é superior á monoterapia, postulándose ademais que poden servir para evitar algúns mecanismos de resistencia aos mesmos que acaba por desenvolver o tumor. O efecto directo consiste na detección de PAMPs nas células infectadas, o que leva á expresión de TNF e IFN, estimulando unha cascada de acontecementos que culminan cunha apoptose inmunoxénica, expresándose citoquinas proinflamatorias. O efecto citotóxico directo dos virus é dose dependente, e resulta moi ben tolerado polos pacientes incluso a altas doses. Algúns virus en concreto, como o coxsackie, afectan directamente a rutas esenciais para a supervivencia celular (ERK/MEK). Ademais, os virus presentan un efecto de “vacinación” contra o tumor, existindo a posibilidade 32 de empregarse o virus como vector de antíxenos tumorais. O ambiente inflamatorio que se produce en torno ás células tumorais infectadas leva a unha maduración de células presentadoras de antíxenos, coa consecuente activación de linfocitos CD4 e CD8, pero tamén á reactivación de linfocitos T de memoria residentes no tecido. Así, xeramos unha resposta inmune fronte á neoplasia. Con todo, polo momento este mecanismo non semella ter un gran impacto la clínica. Comprobouse que a eficacia desta resposta é distinta segundo o grao de exposición a antíxenos do tecido diana: o fígado responde máis intensamente que por exemplo o músculo estriado ou o pulmón, probablemente debido a unha maior activación basal das células inmunes residentes do fígado fronte a estes outros tecidos. O principal inconveniente que presentan é que teñen unha biodipoñibilidade a nivel sistémico moi baixa, xa que son rapidamente opsonificados por anticorpos e complemento, soamente resultando eficaces polo momento en inxeccións locais (96). Existen outras técnicas que, á marxe da radioterapia, pretenden destruír con métodos físicos o tumor coa fin de estimular a inmunidade contra el. Os métodos hipertérmicos, coma o láser, a ablación con microondas ou con radiofrecuencia, producen necrose coagulativa que orixina unha área inflamatoria de penumbra ao redor, particularmente importante para a resposta inmune. A crioablación resulta máis inmunoxénica probablemente por producir unha menor desnaturalización das proteínas, acontecendo de novo unha inflamación en torno á lesión. A electroporación irreversible consiste na aplicación de pulsos de alto voltaxe que producen oncolise sen unha alteración estrutural tan grande como os métodos térmicos, potencialmente cambiando o microambiente tumoral e rematando coa tolerancia inmunolóxica. O uso de citostáticos seguidos da aplicación de pulsos eléctricos permite mellorar a penetración dos mesmos, e no caso do cisplatino, estimular a invasión do tumor por linfocitos CD8 citotóxicos. A terapia fotodinámica baséase na sensibilización con axentes químicos que, ao seren estimulados con láser, producen radicais libres que causan apoptose e necrose; o seu uso está aprobado no linfoma cutáneo de células T e no Síndrome de Sézary. Estas estratexias permiten a combinación con outras formas de inmunoterapia local ou sistémica, coma os inhibidores de checkpoints, para potenciar os seus efectos (93). 6.3 CÉLULAS CAR T 6.3.1 Concepto. CAR Ts aprobadas As células CAR T son linfocitos modificados xeneticamente para expresar na súa membrana plasmática un receptor CAR (receptor quimérico de antíxenos) que se infunden aos pacientes como terapia para neoplasias fundamentalmente hematolóxicas. Este receptor confírelles especificidade contra as células tumorais, activando ao linfocito T fronte á neoplasia. CAR é unha molécula transmembrana quimérica, que consta de tres rexións. Unha primeira porción extracelular, análoga á rexión variable dos anticorpos, con capacidade de recoñecemento antixénico. Unha segunda porción transmembrana, que cumpre funcións estruturais, xa que a distancia á que se produce a interacción entre células é clave na acción citotóxica do linfocito. E unha terceira porción intracelular, que transduce sinais de activación, xeralmente análoga á porción intracelular de sinalización do TCR CD3-ζ (cadea zeta do receptor de células T ; pero tamén pode empregarse o FcεR1). Isto permite que o recoñecemento 33 do antíxeno por parte do linfocito T sexa independente dos CMH (complexo maior de histocompatibilidade) (Figura 4), aínda que se poden deseñar anticorpos que recoñezan o CMH unido a certos péptidos para permitir a detección de antíxenos intracelulares. CAR é funcional en células T KO para TCR, así como para outras células sen TCR coma os linfocitos NK (103), polo que é suficiente para activar á célula sen necesidade da presenza desta molécula. Figura 4: A) TCR e coestimuladores dun linfocito T normal. B e C) CAR coas porcións extracelular de recoñecemento (scFv de inmunoglobulina) e intracelular de activación (sinal 1), asociada a sinal coestimulador (sinal 2a e 2b; segunda xeración de CAR Ts, ver apartado 6.3.3). Figura obtida de (104) Actualmente hai aprobados en Europa e Estados Unidos dous fármacos que conteñen linfocitos CAR T: Kymriah (tysagenlecleucel) e Yescarta (axicabtagene ciloleucel). Kymriah é un preparado de CAR T autólogos modificados cun vector lentiviral que codifica un CARCD19. Ten dúas indicacións en ficha técnica: leucemia linfoblástica aguda en recaída post transplante ou en segunda liña en menores de 25 anos, e linfoma B difuso de célula grande en recaída ou refractario tras dúas liñas de tratamento en pacientes adultos. Yescarta comparte esta última indicación, e pode ser empregado tamén para linfoma B primario mediastínico de células grandes. Neste caso, os linfocitos son tamén CAR-CD19, pero neste caso emprégase un vector retroviral. Actualmente estanse a facer ensaios clínicos comparando ambos fármacos (NCT03642626), así como para explorar novas indicacións, combinacións con outros fármacos biolóxicos e formas de previr a súa toxicidade. A continuación axúntase unha táboa (Táboa 4) cos ensaios clínicos que se están a levar a cabo con estes dous fármacos. 34 Táboa 4: Ensaios clínicos en desenvolvemento con CAR T aprobadas. a) Ensaio con fármaco para previr neurotoxicidade por CAR T; b) Ensaio con fármaco para previr o CRS por CAR T; c) quimioterapia estándar para NHL, a base de platino; NHL: linfoma non Hodgkin. LLA: leucemia linfoide aguda. DLBCL: linfoma difuso de células B grandes. FL: linfoma folicular. TFL: linfoma folicular transformado. HGBCL: linfoma B de alto grado. PMBCL: linfoma B mediastínico primario. PCNSL: linfoma primario de sistema nervioso central. (rr): enfermidade refractaria ou recorrencia. (mer): mínima enfermidade residual. (p): pacientes en idade pediátrica) Fármaco Combinación Indicación a estudo Fase NCT Yescarta citostáticos Linfoma células B (primeira liña) 2 NCT03761056 Yescarta citostáticos e utomilumab DLBCL (rr) 1, 2 NCT03704298 Yescarta citostáticos FL, Linfoma zona marxinal, NHL indolente (rr) 2 NCT03105336 Yescarta citostáticos DLBCL (rr), TFL, PMBCL, HGBCL 1, 2 NCT02348216 Yescarta citostáticos e lenzilumab DLBCL (rr) 1, 2 NCT04314843 Yescarta citostáticos e rituximab DLBCL (rr) 2 NCT04002401 Defibrotide (a) yescarta DLBCL (rr), síndromes de neurotoxicidade 2 NCT03954106 Yescarta vs Kymriah citostáticos ALL, DLBCL NCT03642626 Yescarta acalabrutinib NHL, DLBCL, HGBCL, PMBCL, TFL 1, 2 NCT04257578 Anakinra (b) yescarta DLBCL (rr), HGBCL (rr), PMBCL (rr), TFL (rr), 2 NCT04205838 Kymriah non NHL 2 NCT04161118 Kymriah non PCNSL 1 NCT04134117 Kymriah vs blinatumomab e inotuzumab non ALL 3 NCT03628053 Kymriah citostáticos LLA, NHL, CLL E III e IV 1 NCT02529813 Kymriah non ALL (p) 2 NCT04225676 Kymriah non ALL (mer) 2 NCT03876769 Kymriah vs QMT (c) non NHL 3 NCT03570892 As CAR T, malia que poderían constituír un bo tratamento para os tumores sólidos metastáticos polo seu efecto sistémico dirixido, aínda non amosan tan bos resultados coma nas neoplasias hematolóxicas. Con todo, é unha liña na que se está a investigar, habendo ensaios en fases iniciais en curso para glioblastoma, colon, páncreas, próstata, ril, ovario, mama e pulmón. Son importantes retos a superar o optimizar a accesibilidade das CAR T ás células neoplásicas, sobrepoñerse ao microambiente de inhibición inmune ou resistir o estrés oxidativo derivado do metabolismo tumoral. Unha das principais dificultades é a escaseza de dianas apropiadas, xa 35 que normalmente non expresan un antíxeno específico, senón multitude deles que tamén están presentes en tecidos normais, como o CEA (colorrectal), ERBB2 (glioblastoma), mesotelina (mesotelioma, páncreas) ou o PSMA (próstata). Así, en moitos ensaios preliminares obtivéronse toxicidades on-target off-tumor, en algúns casos non asumibles. Para remedialas, estanse a probar novas estratexias, que se expoñen máis adiante, entre as que destacamos o uso de receptores TGFβ dominantes negativos por primeira vez en humanos, sen problemas de toxicidade polo momento. Outra consideración a ter en conta coas dianas é a necesidade de que estas se expresen na membrana, xa que maior parte das proteínas da célula estarán ocultas ao CAR. Unha estratexia que permite evitar este problema é o emprego de CAR T baseadas en nanobodies dirixidas a moléculas do microambiente (como PD-L1) en vez de antíxenos na superficie da células tumorais (105). Tamén se emprega a expresión de receptores de citocinas para mellorar o acceso ao tumor, ou de interleucinas para mellorar a proliferación das CAR Ts como se recolle na táboa nº 5 (103,106). 6.3.2 Universalidade e efectos adversos A estratexia inicial no uso das CAR T consiste en extraer mediante aférese e modificar os linfocitos do propio paciente para posteriormente inxectarllos, un proceso custoso, suxeito a erros nos procedementos e longo no tempo, do que pode non dispoñerse en algúns pacientes. Ademais, nalgúns casos os linfocitos do suxeito sofren de disfunción por mor da enfermidade, e non resultan axeitados. Para evitar isto, xorde a alternativa de empregar CAR T de doantes autólogos, obtidos de sangue periférico, cordón umbilical e, teoricamente, iPSCs, se ben estas aínda non foron empregadas en clínica. O uso destas células permite abaratar custos, dispoñer do tratamento en canto é necesario e facer múltiples modificacións sobre elas de xeito máis sinxelo. Pero presentan dous problemas fundamentais: por un lado, o rexeitamento por parte do sistema inmune do suxeito, e polo outro unha enfermidade de enxerto contra hóspede (GVHD). Para evitar que as células T do paciente reaccionen fronte ás CAR T é necesario producir unha depleción linfoide mediante quimioterapia (ciclofosfamida e fludarabina normalmente). Existe a posibilidade de empregar alemtuzumab (antiCD52) xunto con CAR T KO para o CD52, causando depleción linfoide que pode ser mantida no tempo sen afectar á función das CAR T. Tamén se poden buscar doantes cun CMH compatible ou modificar as CAR T para non presentar CMH-I (knock out para a β2-microglobulina) e expresar (HLA-E, HLA-G) ou sobreexpresar (ligandos de siglec7 ou siglec 9) inhibidores da acción dos NKs, que actúan fronte a células que non expresan o CMH-I. As células con dobre KO para β2-microglobulina e a subunidade α do TRC (TRAC) denomínanse Universal-CARTs ou UCARTs (7,107). A GVHD acontece cando os TCR das CAR T son reactivos aos complexos CMH-péptido do hóspede, causando dano tisular. En casos onde o paciente fose tratado cun transplante de proxenitores hematopoéticos, pode evitarse a GVHD empregando como donante ao mesmo suxeito. Pero fora destas situacións, preséntanse dúas alternativas: o emprego de linfocitos doutra clase (NK ou Tγδ) e a edición xenética. As células NK son linfocitos citolíticos que se activan segundo o balance entre os sinais inhibitorios e activadores que reciban. Modificados cun CAR, empréganse en ensaios clínicos dirixidos fronte a dianas tumorais como EGFR ou CD19, portando outras modificacións como IL-15 para aumentar a actividade, previr a extenuación e aumentar a supervivencia in vivo (108). Outras subpoboacións de NKs, como os iNKT, linfocitos cun TCR que só recoñece antíxenos presentados por CD1d resultan tamén alternativas prometedoras. En experimentación clínica e preclínica respectivamente, esta clase 36 de linfocitos demostrou actividade protectora fronte a GVHD en transplante e actividade fronte a linfomas ao seren modificados con CAR-CD19. Finalmente, os linfocitos Tγδ son unha subpoboación circulante e residente en tecidos epiteliais, con pouca tendencia a acceder a rexións non inflamadas, cuxo TCR non se restrinxe ao recoñecemento de antíxenos mediante CMH. Por este motivo, non induce GVHD coma os Tαβ, mantendo a actividade antitumoral ao ser modificados con CAR (107). A enfermidade de enxerto contra hóspede que acabamos de expoñer é un dos grandes efectos adversos, pero non o único. As CAR tamén teñen como diana células sas, xa que estas proteínas non son exclusivas do tumor, no que se chama efecto “on-target off tumor”. As CARCD19, as máis empregadas, causan importante depleción linfoide B, mentres que por exemplo as CAR-ErB2 causan unha insuficiencia cardiopulmonar letal ao afectar aos pulmóns sans. O síndrome de liberación de citocinas (CRS) é unha activación aguda do sistema inmune resultado da liberación masiva por parte dos CAR T e do sistema inmune do propio suxeito de factores entre os que destacan IFN-γ, TNF-α, IL-10 e particularmente IL-6. Pode desencadear activación sistémica do sistema mononuclear (resposta inflamatoria sistémica con febre alta, hepatoesplenomegalia, linfadenopatías, coagulación intravascular diseminada (109)), aumento de permeabilidade vascular (vascular leakage syndrome, causando anasarca, edema de pulmón, derrame pericárdico e potencialmente fallo multiorgánico (110)), que pode poñer en perigo a vida do paciente. Un CRS grave require dun diagnóstico precoz, que esixe un diagnóstico diferencial cunha sepse, e tratamento precoz con esteroides, mesmo bloqueo do eixo IL-6 con tocilizumab. As CAR T tamén poden causar neurotoxicidade con alteración do nivel de conciencia, alucinacións, delirium, afasia e mioclonías, de mecanismo incerto. Pénsase que se pode producir unha infiltración difusa do sistema nervioso central polas CAR T, que podería estar relacionado coa afectación da barreira hematoencefálica polo CRS. Entre os efectos adversos máis graves tamén está descrito o síndrome de lise tumoral tras a infusión de CAR Ts (103,111). Finalmente, comentar un caso descrito no que se produciu unha complicación graves e totalmente inesperada. Induciuse resistencia á terapia por introducir inadvertidamente o CAR nunha célula maligna, de xeito que o CAR cubría os epítopos do propio CD19 da membrana facéndoos irrecoñecibles polas CAR T (112). 6.3.3 Novas xeracións de CAR T Para mellorar os resultados das primeiras CAR T fixéronse novas modificacións en sucesivas xeracións. Primeiro, na segunda xeración, engadiuse un sinal coestimulador a través de algúnha das moléculas CD28, 4-1BB (CD137), OX40, ICOS ou CD27, obténdose un aumento da actividade antitumoral, supervivencia e activación dos linfocitos. CD28 activa a vía PI3K/Akt/mTOR, estimulando a captación de glicosa, metabolismo anaeróbico da mesma e produción de ATP. Mentres que 4-1BB estimula a vía Wnt/β-catenina primando a oxidación de ácidos graxos e a capacidade respiratoria celular. Semella que a coactivación con CD28 favorece a formación de células efectoras (CCR7-), mentres que a vía Wnt/β-catenina favorecería un fenotipo máis persistente en sangue periférica (células CCR7+). Na terceira xeración combinouse a acción das vías anteriores, pero non resultaron superiores á segunda xeración. Actualmente trabállase nunha “cuarta xeración” de CAR T que, ademais dun coestimulador, expresen outros elementos funcionais, como a liberación de interleucinas, 37 receptores de citocinas, sistemas de on-off ou xenes suicidas. As TRUCKs serían células CAR T de cuarta xeración modificadas cun casete de expresión constitutiva ou inducible dun polipéptido transxénico, cuxa liberación está condicionada á activación do CAR (promotor NFAT6-IL-2). Deste xeito, ademais do efecto das anteriores xeracións, obtemos a vantaxe de liberar de xeito local moléculas coma as interleucinas IL-12 ou IL-18, que activan a resposta inmune e reducen a supresión mediada por linfocitos Treg (7,103). Nesta cuarta xeracón de CAR Ts preténdense superar moitas destas barreiras descritas, e algunhas que se expoñen máis adiante. Explóranse estratexias diferentes, coma os linfocitos iCAR, que proveen sinais inhibitorias e que se poderían utilizar contra antíxenos secundarios para evitar a actividade fora do tumor doutros CAR T e polo tanto toxicidades (113). Os CAR condicionais son receptores formados por dúas cadeas que precisan dimerizar para formaren o CAR activo, pero para isto precisan da presenza dunha terceira molécula que nós administraríamos ao paciente, empregándoa como interruptor e regulador da actividade dos CAR T (114). Deseñáronse novos CAR (CD19-BBz(86)) que inducen menor secreción de citocinas, e polo tanto reducirían os casos de toxicidade por CRS, mantendo a súa potencia antitumoral (115). Por outro lado, o emprego de CARs que recoñezan o segmento Fc das inmunoglobulinas permite dirixir aos linfocitos contra diversos antíxenos simultánea ou secuencialmente administrando ao paciente anticorpos contra eles (116). Tamén se traballou no deseño de CAR Ts con múltiples especificidades. Unha estratexia consiste nos chamados TanCAR, armados con cúas porcións scFV cada unha das cales recoñece un antíxeno, sendo un só recoñecemento suficiente para a activación (operador booleano OR), de xeito que permite eliminar subclonas tumorais que perdan a expresión dun dos antíxenos, tendo maior especificidade por células que presenten ámbolos dous (117). A outra consiste en co-expresar dous CAR diferentes, un convencional coa porción activadora de CD3 e outro que transmite o sinal de CD28, sendo necesaria a activación simultánea de ambos para obter a activación linfocitaria (operador booleano AND) de xeito que permite reducir a toxicidade (118). Os switch-CAR T son linfocitos equipados con correceptores quiméricos, que recoñecen unha molécula na porción extracelular pero posúen a porción intracelular dun receptor distinto, de xeito que poden converter un sinal inhibidor en activador, ou viceversa. Por outro lado, unha estratexia para obter especificidade tumoral, deseñada para tumores sólidos, é a incorporación dun péptido que bloquee a actividade do CAR ata alcanzar o microambiente tumoral, onde as condicións ambientais desactiven esta inhibición (119). Finalmente, enumerar os TRUCKs, capaces de liberar péptidos coma citocinas ou anticorpos no leito tumoral, ou os CAR T con transxéns codificantes de receptores ou enzimas que melloren a súa supervivencia, replicación ou mobilidade na matriz extracelular. Elaborouse unha táboa (Táboa 5) para resumir as diferentes modificacións externas ao CAR que se exploraron nos últimos anos. 38 Táboa 5: estratexias alleas ao CAR na cuarta xeración. Vía molecular Modificación Obxectivo Técnica empregada Ano Ref. CD7 KO evitar fratricidio en CAR - CD7 Edición con CRISPR - Cas9 201 8 (120) Casp ase 9 KI transx e n e inducible farmacoloxicamente eliminar as CAR T en caso de efectos adversos Transdución viral 2017 (121) IL - 15 KI IL - 15; TRUCK aumentar supervivencia e actividade COMPROBAR Transdución viral 2010 (122) IL - 12 KI IL - 12; TRUCK evitar evasion inmune Transdución viral 2013 (123) IL - 18 KI IL - 18; TRUCK evitar evasion inmune Transdución viral 2017 (124) GM - CSF KO reducir expresión de ILs e o CRS Edición con CRISPR - Cas9 2019 (125) TGFb KI scFv - antiTGFb; TRUCK neutralizar TGFb extracelular Transdución viral 2018 (126) TGFb KI dnTGF - βRII - (en membrana) reducir sinal de TGFb cun receptor sen actividade Transdución viral 2018 (127) FAS KO evitar a toxicidade Fas - FasL sobre as CART Edición con CRISPR - Cas9 2017 (128) CMH - I KO de b2microglobulina evitar rexeitamento das CAR T vía CMH - I Edición con CRISPR - Cas9 2017 (128) TCR KO da TACR evitar GVHD suprimindo o TCR das CAR T Edición con CRISPR - Cas9 2017 (128) TCR KI de CAR expresión de CAR no locus de TCR, mellor actividade Edición con CRISPR - Cas9 2017 (129) PD1 KO evitar a vía inhibitoria efectora PD1 - PDL1 Edición con CRISPR - Cas9 2017 (128) PD1 KI transx e n e antiPD1; TRUCK bloquear PD - 1 aumentando a supervivencia Transdución viral 2017 (130) CTLA - 4 KO evitara vía de inhibición da activación CD28; CTLA4 - B7 Edición con CRISPR - Cas9 2017 (128) CCR5 KO resistencia ao VIH, para pacientes xa infectados TALEN 2017 (131) Catal ase KI catal ase ; TRUCK aumentar supervivencia CAR T reducindo estrés oxidativo Transdución viral 2016 (132) HVEM KI HVEM; TRUCK recuperar mecanismo de supresión tumoral en linfomas (HVEM; BTLA) Transdución viral 2016 (133) CD28 KI switch - receptor (PD1 - CD28) convertir o sinal inhibitorio de PD1 en activador CD28 Transdución viral 2016 (134) IL - 7 KI transxén cadea alfa IL7R restaurar resposta a IL7 e promover a diferenzación a Th1 Transdución viral 2014 (135) IL - 7 KI transx ene switch - receptor (IL4R - IL7R) Convertir sinal inhibidor de IL4 en sinal activador IL7 T ransdución viral 2017 (136) Heparan ase KI heparan ase Degradar a matriz extracelular aumentando a movilidade Transdución viral 2015 (137) 39 6.3.4 CAR T e inhibidores de checkpoints Sendo o PD1 unha importante vía de escape da resposta inmune para as neoplasias, causa de anerxia sobre os linfocitos e probable causa do acurtamento da supervivencia das CAR T, semella lóxico facer terapia combinada con inhibidores de checkpoints. TRUCKs portadoras de anti-PD-1 e CAR T KO para PD1 resultaron máis efectivas que CAR T convencionais en modelos de cancro de pulmón e hepatocarcinoma, respectivamente. Así mesmo, hai evidencia sobre a eficacia de rescates con anti-PD1, cun caso de mantemento da resposta con doses baixas repetidas de nivolumab, en pacientes que recaen tras resposta a tratamento con CAR T. Estudos de laboratorio propoñen sinerxia entre a estimulación do CAR e a inhibición do sinal de PD1, aumentando a potencia e capacidade de expansión das células (111). Emporiso, algúns estudos suxiren que o mantemento do bloqueo da vía PD1 pode inducir sobreexpresión de TIM-3 e LAG-3, e ter de xeito paradoxal consecuencias negativas sobre a actividade e persistencia dos linfocitos, inducindo extenuación. Tamén se describen casos de reactivacións agresivas da enfermidade inducidas por tratamento anti-PD1. Ademais, o KO de PD1 nas CAR T reduce a longo prazo a actividade antitumoral, por un exceso de diferenciación prematura dos linfocitos (138), o que por outro lado podería xustificar os efectos de sinerxia iniciais ao aumentar os linfocitos activos. Así, posiblemente PD1 xogue un papel na maduración linfocitaria, e non constitúa só no freo da súa activación, polo que se require investigación sobre a combinación de CAR T e inhibidores de checkpoints. Por outro lado, está descrita a combinación de CAR T con vacinación tumoral, con virus recombinantes que expresan proteínas tumorais. Trátase dunha investigación preclínica en modelos animais con resultados prometedores, pero emprega CAR Ts con TCR, fora da liña da obtención de células universais (139). 6.3.5 Papel de CRISPR-Cas9 nas novas CAR T As estratexias das novas xeracións de CAR T requiren de múltiples cambios sobre os linfocitos de forma simultánea, con KO dalgúns xenes e inducindo a expresión doutros. Os vectores virais son un mecanismo efectivo e ata agora seguro de transdución do CAR e de outros xenes. Pero tanto os lentivirus como os retrovirus integran a súa carga no ADN de xeito aleatorio, de feito que os efectos son imprevisibles, co risco potencial de que estes cambios resulten oncoxénicos ou alteren a función do linfocito. Por outro lado, as ferramentas tipo TALENs e ZFNs, se ben foron utilizadas en clínica, requiren dun longo proceso de deseño e validación, e a edición múltiple é moi complexa. CRISPR-Cas9 consigue unha alta eficiencia, conseguindo bos resultados en edición múltiple (multiplex editing), e ofrece a posibilidade de dirixir a integración do materal xenético introducido a través de recombinación homóloga. Permite solucionar os problemas que se presentaban coas outras ferramentas e facilita enormemente problemas como o da universalidade ou a mellora da supervivencia en ambientes tumorais (7,140). CRISPR-Cas9 xa foi empregada en diversas ocasións no deseño de novas CAR T (ver táboa 5). Empregouse para eliminar o CD7 (marcador de células T) en CAR T dirixidas contra neoplasias de linfocitos T e evitar así o fratricidio entre células T. Tamén foi empregada para o KO de distintos xenes bloqueando diversas vías de anerxia dos linfocitos: FAS, que induce toxicidade pola interacción FAS-FASL; o PD1 ou o CTLA-4, xa comentados. Tamén se conseguiu evitar a formación do CMH-I mediante o KO da β2-microglobulina, necesaria para 40 a presencia na membrana deste, o que evita que as CAR T sexan rexeitadas polo sistema inmune do paciente por esta vía. Para reducir a GVHD e o CRS, conseguiuse o KO de TCR, evitando a activación non mediada por CAR, e do GM-CSF, reducindo a cantidade de citocinas liberadas polas CAR T sen perda de eficacia. Finalmente, CRISPR-Cas9 permitiu a inserción dirixida do CAR dentro da rexión TCAR, permitindo unha expresión máis fisiolóxica do CAR, mediada polo promotor do TCR, cun KO simultáneo deste. Con todo, existen algúns inconvenientes referentes á seguridade no uso de CRISPR-Cas9 que deben ser controlados. En primeiro lugar, os efectos off-target poden producir mutacións aleatorias que poderían afectar a xenes supresores de tumores ou protooncoxenes. Por isto, deberían estudarse os posibles efectos off-target que se dan coas secuencias diana escollidas para poder avaliar o perfil de seguridade (140). Dispoñemos de estratexias para abordar estes problemas, optimizando o sgRNA (lonxitude do mesmo e elección de dianas) e a Cas9: moléculas con diferentes PAMs, nickases, e variantes con menos tendencia a erros. En segundo lugar, aínda que con baixa probabilidade, coa edición múltiple poden ocorrer translocacións debido ás múltiples roturas de dobre cadea que se producen. A análise sistemática dos produtos de edición mediante técnicas como a citoxenética ou a secuenciación combinados con predicións in silico permiten minimizar os riscos á hora de infundir as células nos pacientes (140–142). En canto ao transporte de CRISPR-Cas9, é preciso un método que resulte o menos tóxico posible para os linfocitos. Os de vectores virais teñen de novo o risco potencial de mutaxénese e a presenza mantida de Cas9 na célula aumenta os efectos off-target, pero presentan unha elevada eficiencia e son moi empregados para o transporte do ADN exóxeno. A electroporación tamén é un método empregado frecuentemente pola súa sinxeleza e seguridade, con pouca toxicidade para as células e que, en combinación con técnicas de edición múltiple permite someter aos linfocitos a un único proceso de transporte (o que reduce a toxicidade), conseguindo con el todas as modificacións necesarias (7,141). En resumo, as novas CAR T baséanse en múltiples edicións xenéticas que permitan ben a súa universalidade, ben a introdución de mecanismos de control e redución de efectos adversos, así como mellorar a súa eficacia mediante o aumento da supervivencia e a evitación dos mecanismos de anerxia do tumor. CRISPR-Cas9 postúlase como ferramenta de referencia para o deseño de novas CAR T que sexan seguras e poidan acadar mellores resultados clínicos, e poidan chegar a revolucionar o tratamento dos tumores sólidos. Así mesmo, deberase probar en futuras investigacións a utilidade das ferramentas emerxentes, como o prime editing, nestes campos. 47 https://omim.org/entry/253300?search=sma 1&highlight=1 sma 69. Meylemans A, De Bleecker J. Current evidence for treatment with nusinersen for spinal muscular atrophy: a systematic review [Internet]. Vol. 119, Acta Neurologica Belgica. 2019 [cited 2020 Mar 31]. p. 523–33. Available from: https://doi.org/10.1007/s13760-019-01199-z 70. Hoy SM. Onasemnogene Abeparvovec: First Global Approval. Drugs [Internet]. 2019;79(11):1255–62. Available from: https://doi.org/10.1007/s40265-019-01162-5 71. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) [Internet]. 2020 [cited 2020 Apr 6]. Available from: www.ema.europa.eu/contact 72. Kohn DB, Hershfield MS, Puck JM, Aiuti A, Blincoe A, Gaspar HB, et al. Consensus approach for the management of severe combined immune deficiency caused by adenosine deaminase deficiency. J Allergy Clin Immunol. 2019;143(3):852–63. 73. Aiuti A, Roncarolo MG, Naldini L. Gene therapy for ADA‐SCID, the first marketing approval of an ex vivo gene therapy in Europe: paving the road for the next generation of advanced therapy medicinal products . EMBO Mol Med. 2017;9(6):737–40. 74. Benson MD, Waddington-Cruz M, Berk JL, Polydefkis M, Dyck PJ, Wang AK, et al. Inotersen treatment for patients with Hereditary transthyretin amyloidosis. N Engl J Med [Internet]. 2018 Jul 5 [cited 2020 Mar 31];379(1):22–31. Available from: http://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa1716793 75. Agencia Europea de Medicamentos. Anexo I: Ficha tecnica o resumen de las caracteristicas del producto MEPACT [Internet]. Agencia Europea de Medicamentos. 2018 [cited 2020 Mar 31]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/caelyx-epar-productinformation_es.pdf 76. OMIM Entry - # 105210 - AMYLOIDOSIS, HEREDITARY, TRANSTHYRETINRELATED [Internet]. [cited 2020 Mar 31]. Available from: https://www.omim.org/entry/105210 77. Mickle K, Lasser KE, Hoch JS, Cipriano LE, Dreitlein WB, Pearson SD. The effectiveness and value of patisiran and inotersen for hereditary transthyretin amyloidosis: A summary from the Institute for Clinical and Economic Review’s Midwest Comparative Effectiveness Public Advisory Council [Internet]. Vol. 25, Journal of Managed Care and Specialty Pharmacy. 2019 [cited 2020 Apr 6]. p. 10–5. Available from: www.jmcp.org 78. Orphanet: Beta talasemia [Internet]. [cited 2020 Apr 8]. Available from: https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?Lng=ES&Expert=848 79. Orphanet: Anemia falciforme [Internet]. [cited 2020 Apr 8]. Available from: https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=ES&Expert=232 80. Thompson AA, Walters MC, Kwiatkowski J, Rasko JEJ, Ribeil JA, Hongeng S, et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent β-thalassemia. N Engl J Med. 2018;378(16):1479–93. 81. Orphanet: Amaurosis congénita de Leber [Internet]. [cited 2020 Apr 8]. Available 48 from: https://www.orpha.net/consor/cgibin/Disease_Search.php?lng=ES&data_id=3243&MISSING CONTENT=Amaurosiscongenita-de-Leber&search=Disease_Search_Simple&title=Amaurosis cong%E9nita de Leber 82. Statement of the DOG, the RG, and the BVA on the therapeutic use of voretigene neparvovec (LuxturnaTM) in ophthalmology. English version: January 2019. Ophthalmologe [Internet]. 2020 [cited 2020 Apr 8];117:16–24. Available from: https://doi.org/10.1007/s00347-019-0906-2 83. Maguire AM, Russell S, Wellman JA, Chung DC, Yu ZF, Tillman A, et al. Efficacy, Safety, and Durability of Voretigene Neparvovec-rzyl in RPE65 Mutation–Associated Inherited Retinal Dystrophy: Results of Phase 1 and 3 Trials. Ophthalmology [Internet]. 2019 [cited 2020 Apr 8];126(9):1273–85. Available from: https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2019.06.017 84. Nguyen CL, Oh LJ, Wong E, Wei J, Chilov M. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration: A meta-analysis of randomized controlled trials. BMC Ophthalmol [Internet]. 2018 [cited 2020 Apr 6];18(1). Available from: https://doi.org/10.1186/s12886-018-0785-3 85. Xie X, Zhang Y, Ma W, Shao X, Zhan Y, Mao C, et al. Potent anti-angiogenesis and anti-tumour activity of pegaptanib-loaded tetrahedral DNA nanostructure. Cell Prolif. 2019 Sep 1;52(5). 86. Poletto E, Baldo G, Gomez-Ospina N. Genome editing for mucopolysaccharidoses. Vol. 21, International Journal of Molecular Sciences. MDPI AG; 2020. 87. Wang D, Zhang F, Gao G. CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors [Internet]. Vol. 181, Cell. 2020 [cited 2020 Apr 13]. p. 136–50. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.023 88. Zhang HX, Zhang Y, Yin H. Genome Editing with mRNA Encoding ZFN, TALEN, and Cas9. Vol. 27, Molecular Therapy. Cell Press; 2019. p. 735–46. 89. Ryu SM, Koo T, Kim K, Lim K, Baek G, Kim ST, et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol. 2018 Jul 1;36(6):536–9. 90. Liao HK, Hatanaka F, Araoka T, Reddy P, Wu MZ, Sui Y, et al. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell. 2017 Dec 14;171(7):1495-1507.e15. 91. Cappella M, Ciotti C, Cohen-Tannoudji M, Biferi MG. Gene therapy for ALS-A perspective [Internet]. Vol. 20, International Journal of Molecular Sciences. 2019 [cited 2020 Apr 6]. Available from: http://alsod.iop.kcl.ac.uk 92. Yang S, Chang R, Yang H, Zhao T, Hong Y, Kong HE, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease. J Clin Invest. 2017 Jun 30;127(7):2719–24. 93. Kepp O, Marabelle A, Zitvogel L, Kroemer G. Oncolysis without viruses — inducing systemic anticancer immune responses with local therapies. Nat Rev Clin Oncol 49 [Internet]. 2020;17(1):49–64. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41571-0190272-7 94. Disis ML. Immune regulation of cancer [Internet]. Vol. 28, Journal of Clinical Oncology. 2010 [cited 2020 Feb 24]. p. 4531–8. Available from: http://ascopubs.org/doi/10.1200/JCO.2009.27.2146 95. Gorbet MJ, Ranjan A. Cancer immunotherapy with immunoadjuvants, nanoparticles, and checkpoint inhibitors: Recent progress and challenges in treatment and tracking response to immunotherapy. Pharmacol Ther [Internet]. 2019;107456. Available from: https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2019.107456 96. Raja J, Ludwig JM, Gettinger SN, Schalper KA, Kim HS. Oncolytic virus immunotherapy: Future prospects for oncology 11 Medical and Health Sciences 1107 Immunology 11 Medical and Health Sciences 1112 Oncology and Carcinogenesis. Vol. 6, Journal for ImmunoTherapy of Cancer. BioMed Central Ltd.; 2018. 97. Liu Y, Dong Y, Kong L, Shi F, Zhu H, Yu J. Abscopal effect of radiotherapy combined with immune checkpoint inhibitors. Vol. 11, Journal of Hematology and Oncology. BioMed Central Ltd.; 2018. 98. Ngwa W, Irabor OC, Schoenfeld JD, Hesser J, Demaria S, Formenti SC. Using immunotherapy to boost the abscopal effect. Vol. 18, Nature Reviews Cancer. Nature Publishing Group; 2018. p. 313–22. 99. Ingles Garces AH, Au L, Mason R, Thomas J, Larkin J. Building on the anti-PD1/PDL1 backbone: combination immunotherapy for cancer. Expert Opin Investig Drugs [Internet]. 2019;28(8):695–708. Available from: https://doi.org/10.1080/13543784.2019.1649657 100. Moreira RS, Bicker J, Musicco F, Persichetti A, Pereira AMPTPT. Anti-PD-1 immunotherapy in advanced metastatic melanoma: State of the art and future challenges. Life Sci. 2020 Jan 1;240:117093. 101. FDA Approval Timeline of Active Immunotherapies - Cancer Research Institute (CRI) [Internet]. [cited 2020 Feb 25]. Available from: http://www.cancerresearch.org/scientists/immuno-oncology-landscape/fda-approvaltimeline-of-active-immunotherapies 102. Van-de-Velde V, Zhou Y. Existing and Emerging Therapies for Cutaneous T-Cell Lymphoma. J Cutan Med Surg. 2019;23(3):319–27. 103. Theobald M, Schlag P-M, Senn H-J. Current Immunotherapeutic Strategies in Cancer. Vol. 16, Surgical Oncology Clinics of North America. 2020. 873–900 p. 104. Salter AI, Pont MJ, Riddell SR. Chimeric antigen receptor-modified T cells: CD19 and the road beyond. Vol. 131, Blood. American Society of Hematology; 2018. p. 2621–9. 105. Xie YJ, Dougan M, Jailkhani N, Ingram J, Fang T, Kummer L, et al. Nanobody-based CAR T cells that target the tumor microenvironment inhibit the growth of solid tumors in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2019 [cited 2020 Mar 26];116(16):7624–31. Available from: www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1817147116 50 106. Bagley SJ, O’Rourke DM. Clinical investigation of CAR T cells for solid tumors: Lessons learned and future directions. Pharmacol Ther. 2020 Jan 1;205:107419. 107. Depil S, Duchateau P, Grupp SA, Mufti G, Poirot L. ‘Off-the-shelf’ allogeneic CAR T cells: development and challenges [Internet]. Vol. 19, Nature Reviews Drug Discovery. 2020 [cited 2020 Mar 16]. p. 185–99. Available from: https://doi.org/10.1038/ 108. Liu E, Marin D, Banerjee P, MacApinlac HA, Thompson P, Basar R, et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 2020;382(6):545–53. 109. Lerkvaleekul B, Vilaiyuk S. Macrophage activation syndrome: Early diagnosis is key. Vol. 10, Open Access Rheumatology: Research and Reviews. Dove Medical Press Ltd; 2018. p. 117–28. 110. Baluna R, Vitetta ES. Vascular leak syndrome: A side effect of immunotherapy. Vol. 37, Immunopharmacology. Elsevier; 1997. p. 117–32. 111. Song W, Zhang M. Use of CAR-T cell therapy, PD-1 blockade, and their combination for the treatment of hematological malignancies [Internet]. Vol. 214, Clinical Immunology. 2020 [cited 2020 Mar 17]. p. 108382. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1521661619307119 112. Ruella M, Xu J, Barrett DM, Fraietta JA, Reich TJ, Ambrose DE, et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell. Nat Med. 2018 Oct 1;24(10):1499–503. 113. Fedorov VD, Themeli M, Sadelain M. PD-1and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Sci Transl Med. 2013 Dec 11;5(215). 114. Rodgers DT, Mazagova M, Hampton EN, Cao Y, Ramadoss NS, Hardy IR, et al. Switch-mediated activation and retargeting of CAR-T cells for B-cell malignancies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jan 26;113(4):E459–68. 115. Ying Z, Huang XF, Xiang X, Liu Y, Kang X, Song Y, et al. A safe and potent antiCD19 CAR T cell therapy. Nat Med [Internet]. 2019 [cited 2020 Mar 18];25(6):947– 53. Available from: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0421-7 116. Kudo K, Imai C, Lorenzini P, Kamiya T, Kono K, Davidoff AM, et al. T lymphocytes expressing a CD16 signaling receptor exert antibody-dependent cancer cell killing. Cancer Res. 2014 Jan 1;74(1):93–102. 117. Zah E, Lin MY, Anne SB, Jensen MC, Chen YY. T cells expressing CD19/CD20 bispecific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunol Res. 2016 Jun 1;4(6):498–508. 118. Lanitis E, Poussin M, Klattenhoff AW, Song D, Sandaltzopoulos R, June CH, et al. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo. Cancer Immunol Res. 2013 Jul 1;1(1):43–53. 119. Labanieh L, Majzner RG, Mackall CL. Programming CAR-T cells to kill cancer. Vol. 2, Nature Biomedical Engineering. Nature Publishing Group; 2018. p. 377–91. 51 120. Cooper ML, Choi J, Staser K, Ritchey JK, Devenport JM, Eckardt K, et al. An “offthe-shelf” fratricide-resistant CAR-T for the treatment of T cell hematologic malignancies. Leukemia. 2018 Sep 1;32(9):1970–83. 121. Diaconu I, Ballard B, Zhang M, Chen Y, West J, Dotti G, et al. Inducible Caspase-9 Selectively Modulates the Toxicities of CD19-Specific Chimeric Antigen ReceptorModified T Cells. Mol Ther. 2017 Mar 1;25(3):580–92. 122. Hoyos V, Savoldo B, Quintarelli C, Mahendravada A, Zhang M, Vera J, et al. Engineering CD19-specific T lymphocytes with interleukin-15 and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemia effects and safety. Leukemia. 2010 Jun 29;24(6):1160–70. 123. Chmielewski M, Hombach AA, Abken H. Of CARs and TRUCKs: Chimeric antigen receptor (CAR) T cells engineered with an inducible cytokine to modulate the tumor stroma. Immunol Rev. 2014;257(1):83–90. 124. Kunert A, Chmielewski M, Wijers R, Berrevoets C, Abken H, Debets R. Intra-tumoral production of IL18, but not IL12, by TCR-engineered T cells is non-toxic and counteracts immune evasion of solid tumors. Oncoimmunology [Internet]. 2017 Sep 28 [cited 2020 Apr 9];7(1):e1378842. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/2162402X.2017.1378842 125. Sterner RM, Cox MJ, Sakemura R, Kenderian SS. Using crispr/cas9 to knock out gmcsf in car-t cells. J Vis Exp. 2019 Jul 1;2019(149):e59629. 126. Chang ZL, Lorenzini MH, Chen X, Tran U, Bangayan NJ, Chen YY. Rewiring T-cell responses to soluble factors with chimeric antigen receptors. Nat Chem Biol. 2018 Mar 1;14(3):317–24. 127. Kloss CC, Lee J, Zhang A, Chen F, Melenhorst JJ, Lacey SF, et al. Dominant-Negative TGF-β Receptor Enhances PSMA-Targeted Human CAR T Cell Proliferation And Augments Prostate Cancer Eradication. Mol Ther. 2018 Jul 5;26(7):1855–66. 128. Ren J, Zhang X, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, et al. A versatile system for rapid multiplex genome-edited CAR T cell generation. Oncotarget. 2017 Feb 9;8(10):17002– 11. 129. Eyquem J, Mansilla-Soto J, Giavridis T, Van Der Stegen SJC, Hamieh M, Cunanan KM, et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature [Internet]. 2017 [cited 2020 Mar 24];543(7643):113–7. Available from: www.nature.com/reprints. 130. Li S, Siriwon N, Zhang X, Yang S, Jin T, He F, et al. Enhanced cancer immunotherapy by chimeric antigen receptor–modified T cells engineered to secrete checkpoint inhibitors. Clin Cancer Res. 2017 Nov 15;23(22):6982–92. 131. Hale M, Lee B, Honaker Y, Leung WH, Grier AE, Jacobs HM, et al. HomologyDirected Recombination for Enhanced Engineering of Chimeric Antigen Receptor T Cells. Mol Ther - Methods Clin Dev. 2017 Mar 17;4:192–203. 132. Ligtenberg MA, Mougiakakos D, Mukhopadhyay M, Witt K, Lladser A, Chmielewski M, et al. Coexpressed Catalase Protects Chimeric Antigen Receptor–Redirected T Cells 52 as well as Bystander Cells from Oxidative Stress–Induced Loss of Antitumor Activity. J Immunol. 2016 Jan 15;196(2):759–66. 133. Boice M, Salloum D, Mourcin F, Sanghvi V, Amin R, Oricchio E, et al. Loss of the HVEM Tumor Suppressor in Lymphoma and Restoration by Modified CAR-T Cells. Cell. 2016 Oct 6;167(2):405-418.e13. 134. Liu X, Ranganathan R, Jiang S, Fang C, Sun J, Kim S, et al. A chimeric switchreceptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors. Cancer Res. 2016 Mar 15;76(6):1578–90. 135. Perna SK, Pagliara D, Mahendravada A, Liu H, Brenner MK, Savoldo B, et al. Interleukin-7 mediates selective expansion of tumor-redirected cytotoxic T lymphocytes (CTLs) without enhancement of regulatory T-cell inhibition. Clin Cancer Res. 2014 Jan 1;20(1):131–9. 136. Mohammed S, Sukumaran S, Bajgain P, Watanabe N, Heslop HE, Rooney CM, et al. Improving Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cell Function by Reversing the Immunosuppressive Tumor Microenvironment of Pancreatic Cancer. Mol Ther. 2017 Jan 4;25(1):249–58. 137. Caruana I, Savoldo B, Hoyos V, Weber G, Liu H, Kim ES, et al. Heparanase promotes tumor infiltration and antitumor activity of CAR-redirected T lymphocytes. Nat Med. 2015 May 1;21(5):524–9. 138. Wei J, Luo C, Wang Y, Guo Y, Dai H, Tong C, et al. PD-1 silencing impairs the antitumor function of chimeric antigen receptor modified T cells by inhibiting proliferation activity. J Immunother Cancer [Internet]. 2019 [cited 2020 Mar 18];7(1). Available from: https://doi.org/10.1186/s40425-019-0685-y 139. Slaney CY, Von Scheidt B, Davenport AJ, Beavis PA, Westwood JA, Mardiana S, et al. Dual-specific chimeric antigen receptor T cells and an indirect vaccine eradicate a variety of large solid tumors in an immunocompetent, self-antigen setting. Clin Cancer Res [Internet]. 2017 [cited 2020 Mar 20];23(10):2478–90. Available from: http://clincancerres.aacrjournals.org/ 140. Liu J, Zhou G, Zhang L, Zhao Q. Building potent chimeric antigen receptor T cells with CRISPR genome editing [Internet]. Vol. 10, Frontiers in Immunology. 2019 [cited 2020 Apr 8]. p. 456. Available from: www.frontiersin.org 141. Salas-Mckee J, Kong W, Gladney WL, Jadlowsky JK, Plesa G, Davis MM, et al. CRISPR/Cas9-based genome editing in the era of CAR T cell immunotherapy. Hum Vaccines Immunother. 2019 May 4;15(5):1126–32. 142. Mollanoori H, Shahraki H, Rahmati Y, Teimourian S. CRISPR/Cas9 and CAR-T cell, collaboration of two revolutionary technologies in cancer immunotherapy, an instruction for successful cancer treatment. Vol. 79, Human Immunology. Elsevier Inc.; 2018. p. 876–82.