Caracterización molecular y genética de la proteína P47 de "Neisseria meningitidis" : una alternativa para el desarrollo de una vacuna antimeningocócica universal

-IUniversidad de Santiago de Compostela Departamento de Microbiología y Parasitología CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y GENÉTICA DE LA PROTEÍNA P47 DE NEISSERIA MENINGITIDIS: UNA ALTERNATIVA PARA EL DESARROLLO DE UNA VACUNA ANTIMENINGOCÓCICA UNIVERSAL Memoria presentada por Jesús A. Arenas Busto Para optar al Grado de Doctor en Biología Santiago de Compostela, marzo 2006 -I ID. Carlos Ferreirós Domínguez , Profesor Titular de Microbiología de la Universidad de Santiago de Compostela y D a Sandra Sánchez Poza , Dra. en Biología por la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMAN : Que la presente tesis doctoral, titulada “ Caracterización molecular y genética de la proteína P47 de Neisseria meningitidis una alternativa para el desarrollo de una vacuna antimeningocócica universal ”, que para optar al grado de Doctor en Biología presenta D. Jesús A. Arenas Busto, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Microbiología y Parasitología de esta universidad y, hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Santiago de Compostela, marzo 2006 Carlos Ferreirós Domínguez Sandra Sánchez Poza : -IIIAGRADECIMIENTOS Necesitaría más que esta hoja para expresar mi agradecimiento a todas las personas que han hecho posible este trabajo. Sin embargo, continuando las formas preestablecidas lo abrevio del siguiente modo: A mis directores, Dr. Sandra Sánchez Poza y Prf. Carlos Ferreirós Domínguez, por comprometerse conmigo en este proyecto, su constante dedicación y los continuos y enriquecedores debates sobre los resultados o el curso de las investigaciones. A la Profesora M a Teresa Criado Álvarez (principal motor de nuestro laboratorio), por su constante y continua contribución en las labores de dirección y en la corrección de esta memoria, además de sus consejos, ánimos, simpatía … que ha mostrado conmigo todo este tiempo. Al Profesor Ernesto Cano Rubio del Departamento de Farmacología por sus instrucciones y consejos en los estudios realizados en citometría de flujo. Al Departamento de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III por su colaboración en el tipado de las cepas y también a Juan Carlos por la secuenciación desinteresada de ciertos fragmentos. Al Dr. Pizza Mariagrazia, por el envío de material biológico utilizado en nuestros ensayos. Sin restar ni una pizca de importancia, además: A mis compañeros de laboratorio Ana, Sandra y Javier por su apoyo humano, las horas compartidas y sus ayudas en el laboratorio. A Soly, Manuel, Hipólito, Fito o Miguel Ángel, entre otros ya que son muchos, compañeros de estudio y pasillos, que sencillamente han hecho más ameno muchas horas de laboratorio. Como no, a mis padres, igual que tantos otros verdaderos impulsores de la investigación en nuestro país, pero en mi caso: por su amor, sacrificio, confianza, proporcionarme el tiempo necesario que el trabajo me requería, así como por su apoyo económico en ciertos momentos. A Fátima, también por esto último, además de la paciencia y el cariño que ha tenido conmigo en los momentos difíciles. Ah!, también a mi hermano. Sinceramente, a todos Gracias . -IVLa realización de este trabajo fue posible gracias a: o La concesión de una Beca Predoctoral de la Xunta de Galicia o Las subvenciones obtenidas de la Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento. Xunta de Galicia (cod. PGIDT 01B1020301PR) -VRelación de artículos publicados y en proceso de publicación como resultado del desarrollo de esta tesis doctoral: Sandra Sánchez, Ana Abel, Jesús Arenas, María Teresa Criado, Carlos M. Ferrerirós. 2006. Cross-linking analysis of antigenic outer membrane protein complexes of Neisseria meningitidis. Research in Microbiology, 157: 136-142 Jesús Arenas, Ana Abel, Sandra Sánchez, Belén Alcalá, María Teresa Criado y Carlos Ferreirós. 2006. Flow cytometry analysis of the cross-reactivity and surface accessibility of a conserved 47 kDa antigen in Neisseria meningitidis and commensal Neisseria. Research in Microbiology. Sometida Jesús Arenas, Ana Abel, Sandra Sánchez, María Teresa Criado y Carlos Ferreirós. Analysis of the genetic and molecular diversity of the P47 lipoprotein of Neisseria: correlation with antigenic variability. En preparación Las secuencias nucleotídicas obtenidas en esta Tesis serán depositadas en las bases de datos universales del “GenBank” Índice -4Página………….. 3. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN Y ANTIGENICIDAD DE LA PROTEÍNA P47 3.1 Reactividad contra las proteínas de la membrana externa desnaturalizadas.................. 3.2 Reactividad contra las proteínas de la membrana externa en condiciones nativas........ 3.3 Ensayos de accesibilidad de la proteína P47 en dot blotting.......................................... 4. ANÁLISIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO 4.1 Optimización del ensayo................................................................................................. 4.2 Distribución de las poblaciones del meningococo con los sueros inmunes.................... 4.3 Respuesta cualitativa de las poblaciones a los sueros de conejo..................................... 4.4 Cuantificación de la reactividad de la totalidad de la población..................................... 4.5 Análisis de la accesibilidad a la proteína P47 en FCM.................................................... 5. ENSAYOS DE “CROSSLINKING” CON FORMALDEHÍDO .................................... 6. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN p47 6.1 Detección del gen............................................................................................................ 6.2 Optimización del ensayo de secuenciación………………………………..................... 6.3 Análisis de la microheterogeneidad genética.................................................................. 7. PREDICCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE LA PROTEÍNA P47 7.1 Estructura primaria: análisis de microheterogeneidad …………………………....... … 7.2 Estructura secundaria y patrones de reconocimiento ………………………………….. 7.3 Modelos y deducciones de estructuras superiores …………………………………...... 7.4 Predicción de epítopos lineales……………………………………………………........ 7.5 Correlación entre la divergencia molecular y antigénica y la unión del suero anti-P47 a la célula entera mediante FCM…………………………………………………………… 8. ACTIVIDAD BACTERICIDA.......................................................................................... DISCUSIÓN.............................................................................................................................................................. 187 CONCLUSIONES…………………………………………………………............................................…………. 225 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................................... 229 129 132 134 136 139 141 144 146 151 153 155 167 171 175 181 181 184 185 Índice de Figuras - 5 - ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1.- Diferentes técnicas empleadas para el diseño de vacunas............................................................. 30 Figura 2.- Patrón antigénico con suero de ratón ho mólogo anti-OMVs de la cepa Nm30 de las fases obtenidas tras la extracción con Tritón X-114 de OMPs de la misma cepa.......................... 118 Figura 3.- Patrón antigénico con suero de ratón homólogo anti-OMVs de la cepa B16B6 de las fases obtenidas tras la extracción con Tritón X-114 de OMPs de la misma cepa.............................. 119 Figura 4.- Western blot, con suero de ratón homólogo anti-OMVs de la cepa Nm30, de diferentes diluciones de la fase detergente extraída con Tritón X-114, del antígeno de 47 kDa purificado y OMVs obtenidas de la cepa N m30........................................................................... 120 Figura 5.- Reacción antigénica del suero de conejo específico anti-P47 con las fases obtenidas tras la extra cc ió n c o n Tr itó n X-114 de OM Ps d e la ce pa Nm 3 0.. ...................... ................... .................. .. 121 Figura 6.- Espectro y cota de masas obtenidas por MALDI-TOF de los frag mentos peptídicos resultantes de la digestión tríptica del antígeno de 47 kDa………………………………………………….. 122 Figura 7.- Ubicación del gen p47 según el mapa genómico de la cepa Neisseria meningitidis Z2491 disponible en el “ GenBank ”........................................................................................................... 125 Figura 8.- Titulación en dot-blotting de los sueros de conejo anti-P47 y anti-OMVs de la cepa N m30 correspondientes a la tercera y última extracción de sangre......................................................... 127 Figura 9.- Determinación de la dilución de trabajo de los sueros de conejo anti-P47 y anti-OMVs de la ce pa N m 3 0 obt e n i d o s d es p ués d el san grad o fina l...... .................... ............................ .................. .. 128 Figura 10.- Especificidad de la unión del suero de conejo anti-P47 en western blotting frente a células enteras de N. meningitidis , N. sicca , N. subflava y N. lactamica ................................................... 130 Figura 11.- Reactividad cruzada del suero anti-OMVs de la cepa Nm30 con células enteras formalinizadas de cepas invasivas y aisladas de portadores de N. meningitidis ............................. 131 Figura 12.- Detección mediante in mu noensayo en fase sólida de la unión de los sueros de conejo anti-P47 y anti-O M Vs d e la ce pa Nm 3 0 fren te a cél u las e nt eras f orma li n izadas d e d i fer e n te s Neisserias .. 133 Figura 13.- Ensayos de accesibilidad por dot blotting de la hipotética lipoproteína P47 en células enteras formalinizadas, permeabilizadas o no, de N. meningitidis , N. sicca , N. subflava y N lactamica ..... 135 Figura 14.- Especificidad del suero anti-OMVs de la cepa Nm30 frente a células de N. meningitidis B16B6 fijadas con formaldehído o con glutaraldehído bloqueadas con Blotto® mediante ensayos en FCM.............................................................................................................................................. 137 Figura 15.- Reactividad de diferentes diluciones de los sueros inm unes de conejo anti-OMVs de la cepa N m 30 y antiP47 c o n cél u las fija das co n for m ald eh íd o o g lutaral de hí do ................ ................... ....... 137 Figura 16.- Com paración de la reactividad del suero anti-P47 en ensayos en FCM con células de la cepa N. meningitidis N m 3 0 si n fijar, fi ja das con for mal de hí do y m u e rtas p or calor y lu e g o fijadas …….. 138 Figura 17.- Modelos de distribución de poblaciones de N. meningitidis tras la reacción con los sueros de conejo en función de la fluorescencia emitida y el ángulo de refracción SSC.................................... 140 Figura 18 y 18bisReactividad de los sueros de conejo anti-P47, anti-OMVs de la cepa N m30 y suero no inmune frente a diferentes células fijadas con formaldehído de diferentes Neisserias en FCM......... 142-143 Índice de Figuras -6Página Figura 19.- Promedio de la intensidad de fluorescencia emitida por las poblaciones celulares fijadas con formaldehído de diferentes Neisserias con los sueros inmunes de conejo analizada por FCM... 144 Figura 20.- Variabilidad interpoblacional en la reactividad de los sueros anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 a células enteras fijadas con formaldehido de diferentes Neisserias en FCM............ 148 Figura 21.- Variabilidad intrapoblacional en la reactividad de los sueros anti-P47 y anti-OMVs a células enteras fijadas con formaldehído de diferentes Neisserias en FCM.............................................. 149 Figura 22.- Efecto de la fijación o no con formaldehído tras la permeabilización de las células de N. meningitidis en la unión de los sueros anti P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 en FCM......... 150 Figura 23.- Diferencias en la accesibilidad del antígeno entre células enteras permeabilizadas o no con etanol y posteriormente fijadas con formaldehído en FCM............................................................ 150 Figura 24.- Patrón electroforético y revelado con suero anti-P47 de células formalinizadas, células sin formalinizar y OMVs formalinizadas de la cepa Nm30 tratadas a 37ºC y a 95ºC durante 20 minutos ........................................................................................................................................ 152 Figura 25.- Detección del gen p47 en todas las cepas mediante amplificación por PCR…………………….. 154 Figura 26.- Lugar de hibridación de los distintos cebadores según los locus NMA0280, NMA0281, región no codificante y NMA0282…………………………………………………….............................. 157 Figura 27.- Perfil electroforético del producto del PCR de los fragmentos P47.1, P47.1-2, P47.3…………. 160 Figura 28.- Perfil electroforético del producto del PCR de los fragmentos P47.4 ……………….…………. 161 Figura 29 y 29 bis.- Secuencia completa del gen p47 en distintas cepas …………………………....……… 162-167 Figura 30.- Similitud del gen p47 secuenciado en distintas cepas…………………………………………... 170 Figura 31.- Similitud de las variantes deducidas de la proteína P47 en distintas cepas……………………... 172 Figura 32 y 32 bis.- Secuencia completa de la proteína P47 en distintas cepas ………………………….…. 173-174 Figura 33 y 33 bis.- Predicción de la estructura secundaria a partir de la secuencia de aminoácidos………... 177-178 Figura 34.- Perfil de hidrofobicidad de diferentes secuencias aminoacídicas y predicción de segmentos transmembrana…………………………………………………………………………………….. 179 Figura 35.- Patrón de reconocimiento de dominios de la variante V de la proteína P47 y predicción del tipo de péptido señal y la región de corte para lipoproteínas ………………………………….…......... 180 Figura 36.- Modelos estructurales deducidos para distintas variantes de P47………………………………... 182 Figura 37.- Expresión de la lipoproteína P47 en células resistentes a la acción bactericida del suero anti-P47 evaluada mediante dot blotting …………………………………………………………………… 186 Índice de Tablas - 7 - Página Tabla 1.- Vacunas disponibles en la actualidad contra los diferentes serogrupos de N. meningitidis .................................................................................................................................. 21 Tabla 2 .- Ventajas e inconvenientes de las vacunas recombinantes.................................................................. 33 Tabla 3.- Características de la vacunología convencional y reversa en el desarrollo de vacunas.................... 36 Tabla 4.- Características de distintas estructuras subcapsulares de N. meningitidis para su inclusión en una vacuna anti-meningocócica..................................................................................................................... Tabla 5.- Características de las cepas incluidas en el presente estudio.............................................................. 83 Tabla 6.- Condiciones del proceso de PCR utilizadas para la detección y secuenciación del gen p47.. ........... Tabla 7.- Condiciones del proceso de amplificación/marcaje de diferentes productos de PCR para su secuenciación…………………………………………………………………………………….... Tabla 8.- Servidores utilizados para el reconocimiento de diversas estructuras y características moleculares del antígeno de 47 kDa……………………………………………………………………………...... Tabla 9.- Semejanza entre proteínas identificadas, secuenciadas y anotadas en el “GenBank”y los péptidos digeridos del antígeno de 47 kDa …………………………………………………………………… 123 Tabla 10.- Titulación por dot blotting de los sueros de conejo anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30........ 127 Tabla 11.- Características de los cebadores utilizados para la detección y secuenciación del gen p47 ……… 156 Tabla 12.- Combinación de cebadores y temperatura óptimas de anillamiento para la amplificación específica de frag mentos del gen p47 …………………………………………………………………….......... 158 Tabla 13.- Relación de cepas portadoras de los distintos alelos del gen p47 , grupos alélicos y variantes proteicas……………………………………………………………………………………………… 169 Tabla 14. - Epítopos lineales comu nes a la variante V de la proteína P47 en diferentes variantes…………… 183 Tabla 15. - Actividad bactericida de los sueros in munes anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 contra cepas N. meningitidis ……………………………………………………………………………….... 186 59 102 104 106 ÍNDICE DE TABLAS Lista de Abreviaturas -8LISTA DE ABREVIATURAS ELISA Enzyme linked inmunosorbent assay FACS F luorescence actived cell sorting FCM F low cytometry (citometría de flujo) FetA F erric enterobactin A (receptor de la enterobactina férrica A) GAMBIT G enome analysis and mapping by in vitro transposition (análisis y mapeo del genoma por transposición in vitro) GNA G enome-derived neisserial antigens (antigenos derivados del genoma) IVET i n vitro expresión technology (tecnología de expresión in vivo) IVIAT i n vivo induced antigen technology (tecnología de antígenos inducidos in vivo) LbpA L actoferrin binding protein A (proteína de unión a lactoferrina A) LbpB L actoferrin binding protein B (proteína de unión a lactoferrina B) LCR Líquido cefalorraquídeo LOS Lipooligosacáridos LPS Lipopolisacáridos MH Medio líquido Mueller-Hinton MH/Desferal Medio líquido Mueller-Hinton con Desferal MLEE M ulti Locus Enzyme Electrophoresis MLST M ulti Locus Sequence Typing NadA Neisseria adhesin antigen NhhA Neisseria hia homologue antigen NspA N eisserial surface protein A (proteína de superficie de Neisseria) OMPs O uter membrana proteins (proteínas de la membrana externa) OMVs O uter membrana vesicle (vesículas de membrana externa) Opa Opacity protein (proteína de opacidad) Opc Opacity protein (proteína de opacidad) ORF O pen Reading Frame (marco de lectura abierta) PBS P hosphate buffer saline (tampón fosfato salino) PMSF P henylmethanesulfonyl fluoride (fluoruro fenilmetanosulfónico) PorA Porin A (porina A) PorB Porin B (porina B) PVDF Polyvinilidene difluoride (difluoro de polivinilideno) RIVET Recombination based in vivo expresión technology (recombinación basada en la tecnología de expresión in vivo) RmpM R eduction modifiable protein M (proteína modificable por reducción) SBA S erum bactericidal activity (actividad bactericida del suero) SDS-PAGE S odium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en geles de archilamida en presencia de dodecilsulfato sódico) SNC Sistema nervioso central STM S ignature-tagged mutagenesis TBS Tris buffer saline (tampón tris salino) TbpA T ransferrin binding protein A TbpB T ransferrin binding protein B TCA Tricloroacetic acid (ácido tricloroacético) TEMED N, N, N´,N´-tetrametilendiamina TraSH Transposon site hybridization sueros SNI Suero no inmune Suero anti-P47 Suero obtenido contra la proteína P47 de la cepa N. meningitidis Nm30 Suero anti-OMVs de la cepa Nm30 Suero obtenido contra OMVs de la cepa N. meningitidis Nm30 Suero anti-OMVs de la cepa B16B6 Suero obtenido contra OMVs de la cepa N. meningitidis B16B6 Caracterización Molecular y Genética de la proteína P47 de Neisseria meningitidis INTRODUCCIÓN Introducción -111. ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA 1.1 Características diferenciales del agente causal: Neisseria meningitidis En 1887 el anatomo-patólogo Anton Weichselbaum1 realizó el primer aislamiento del agente causal de la enfermedad meningócocica denominándolo Diplokokkus intracellularis meningitidis, más tarde renombrado como Neisseria meningitidis. Desde el punto de vista taxonómico, la primera edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology2 lo ubicó en el género Neisseria situado en la sección IV, constituida por cocos y bacilos gram negativos aerobios. La nueva tendencia en clasificación de microorganismos basada en las secuencias genéticas del ARN ribosómico 16S, que recoge la segunda edición del manual, sitúa este género en la clase β del phylum proteobacterias. Las bacterias incluidas en este phylum se caracterizan por una morfología, fisiología y metabolismo muy variable. Las especies del género Neisseria colonizan las membranas mucosas de los mamíferos y solamente dos son patógenas para el hombre: N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Todas las especies presentan morfología cocoide con un diámetro de 0,6-1 µm formando con mayor frecuencia parejas con el lugar de adhesión más achatado y, en algunas especies, agrupándose en cadenas cortas o tétradas. Características fisiológicas y bioquímicas como la degradación de carbohidratos facilitan su diferenciación. La temperatura óptima de crecimiento oscila entre 35°C-37ºC y el pH entre 7,4 –7,6. En todas las especies el crecimiento se favorece con una humedad relativa del 50% y, en N. gonorrhoeae y N. meningitidis con una concentración de dióxido de carbono entre 3-10%. 1 Weichselbaum A. 1887. Ueber die aetiologie der akuten meninigitis cerebror spinalis. Fortschr Med, 5: 573583 2 Vedros NA. 1984. Genus I. Neisseria Trevisan 1885, 105AL. Krieg RN y Holt GJ (eds). En: Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, p 290. Williams and Wilkins, Baltimore, London Introducción -12La cantidad de guanina y citosina (G+C) oscila entre 50-52% en N. meningitidis, 48-51% en N. subflava y 49-51% en N. sicca. N. lactamica contiene un 51,7%. La caracterización de cepas del meningococo es crucial para analizar los factores que regulan su comportamiento epidémico y ha ido acompañado del desarrollo, primero, de técnicas inmunológicas y, más tarde, de técnicas genéticomoleculares. La divergencia antigénica del polisacárido capsular, las proteínas mayoritarias de Clase, PorB y PorA (detalladas en el apdo. 2.2.b) y los lipooligosacáridos (LOS) facilitaron su caracterización en serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipo, respectivamente. Los nuevos métodos de clasificación permiten un análisis más acertado de la naturaleza de los cambios evolutivos que ha sufrido el microorganismo: la movilidad electroforética de diferentes enzimas citoplasmáticas (MLEE), la comparación de secuencias multilocus (MLST) o la electroforesis de campo pulsado (PFGE). En este caso los aislados son agrupados en complejos de clones, constituidos por cepas muy próximas genéticamente con un probable origen común. Cada complejo incluye diferentes linajes que agrupan los aislados con un perfil similar3. 1.2 Características de la enfermedad y su epidemiología 1.2.a Desarrollo de la infección N. meningitidis es una especie comensal del tracto respiratorio superior del hombre. La bacteria coloniza la nasofaringe de una parte de la población transmitiéndose por contagio directo mediante aerosoles. La colonización no es en sí misma peligrosa (hasta un 10% de la población es portadora en épocas 3 Maiden MC y Frosch M. 2001. Molecular techniques for the investigation of meningococcal disease epidemiology. Mol Biotechnol, 18: 119-134 Introducción -13interepidémicas sin llegar a padecer la enfermedad 4 ). Esta relación comensal se establece por la actuación conjunta de las estructuras antigénicas de superficie de la bacteria y el sistema inmune del hospedador. Sin embargo, por razones no del todo claras, tras su adherencia a las células no ciliadas (facilitada por diferentes moléculas 5,6 , y seguida de una fase de adaptación y proliferación local) el meningococo atraviesa las células de la faringe accediendo al torrente sanguíneo. Una vez que se produce la bacteriemia, son varios los mecanismos intrínsecos al microorganismo que pueden facilitar la evasión de la respuesta inmune: la producción de determinadas estructuras (cápsula, adhesinas, proteínas implicadas en la adquisición del hierro, vesículas de membrana externa (OMVs)), la variabilidad antigénica y de fase de las estructuras externas, el enmascaramiento de antígenos o la inhibición de la acción del complemento 7 . N. meningitidis tiene capacidad para provocar autolisis, liberar ADN y diversos componentes de la pared celular que inducen una serie de reacciones inflamatorias favoreciendo la evolución de la enfermedad. En otros casos la invasión y el progreso de la enfermedad se debe a una predisposición del hospedador 8 . Durante la bacteriemia, en el 80% de los casos el patógeno accede al sistema nervioso central (SNC), aunque no se conoce con exactitud por donde traspasa la barrera hematoencefálica (el plexo coroideo, que presenta un elevado flujo de sangre, parece ser la puerta de entrada). En esta zona diversos mediadores inflamatorios, inducidos principalmente por lipopolisacaridos (LPS), juegan un papel importante al incrementar la permeabilidad. Estudios realizados in vivo 4 Cartwright C. 1995. Meningococcal carriage and disease. Cartwright, K. (ed). En: Meningococcal Disease , p 115 5 Virji M, Alexandrescu C, Ferguson DJP y col . 1992. Variations in the expression of pili: the effect on adherence of Neisseria meningitidis to human epithelial and endothelial cells. Mol Microbiol , 6: 1271-1279 6 Merz AJ y So M . 2000. Interactions of pathogenic Neisseriae with epithelial cell membranes. Annu Rev Cell D Bio , 16: 423-457 7 Vogel U y Frosch M. 1999. Mechanisms of Neisserial serum resistance. Mol Microbiol, 32: 1133-1139 8 Stephen C, Ross MD y Densen PM. 1984. Complement deficiency states and infection: epidemiology, pathogenesis and consequences of Neisserial and other infections in an immune deficiency. Medicine , 63: 243267 Introducción -201.3.c Inmunoprofilaxis: vacunas disponibles La vacunación en N. meningitidis se inició en base a la buena respuesta serológica de las vacunas polisacarídicas del neumococo. Los primeros intentos frente al meningococo no fueron óptimos pero posteriores mejoras en la purificación del polisacárido, permitieron las primeras preparaciones vacunales inmunogénicas contra la cápsula A y C. Posteriormente, se obtuvieron preparaciones contra el resto de polisacáridos capsulares implicados en la enfermedad meningocócica, excepto para el B. El α-2-8 N-acetilneuramínico, constituyente de la cápsula del serogrupo B, es estructural e inmunológicamente idéntico a los glicopéptidos de una molécula de adhesión celular 30 . Este mimetismo molecular se cree que impide el reconocimiento de la cápsula B debido a un mecanismo de tolerancia inmunológica que, junto con sus posibles efectos autoreactivos, han impedido el desarrollo de una vacuna contra esta estructura. La importancia de esta teoría se ha puesto en entredicho 31 , pero la dificultad para demostrarlo ha bloqueado la investigación de la vacuna polisacarídica contra el meningococo B y en la actualidad no está disponible ninguna vacuna eficaz frente a este serogrupo. Se han realizado ensayos modificando el polisacárido B químicamente y conjugándolo a una proteína transportadora o “ carrier ”. Cuando se utilizó como tal la PorB recombinante (detallado en apdo. 2.2.b) se obtuvo una respuesta funcional en primates no humanos sin efectos autoreactivos 32 , actualmente en estudios preclínicos. En base a esta buena respuesta, recientemente 30 Finne J, Bitter-Suerman D, Goridis C y col. 1987. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis: impl ications for vaccine development and pathogenesis. Lancet , 2: 355-357 31 Lifely MR y Morero C. 1986. Vaccine against meningococcal group B disease. Lancet , 1: 214-215 32 Fusco PC, Michon F, Tae JY y col . 1997. Preclinical evaluation of a novel group B meningococcal conjugate vaccine that elicits bactericidal activity in both mice and nonhuman primates. J. Infect Dis , 175: 364372 Introducción -21Bruge y colaboradores 33 conjugaron el polisacárido al toxoide tetánico, pero esta formula no generó la actividad funcional deseada. Se han estudiado de manera exhaustiva otras estructuras antigénicas alternativas como proteínas de membrana externa (OMPs) o OMVs de N. meningitidis entre otras 34 , sin conseguir una fórmula eficaz contra este serogrupo; las disponibles en la actualidad se recogen en la siguiente tabla. Tabla 1.- Vacunas disponibles en la actualidad contra los diferentes serogrupos de Neisseria meningitidis * Solamente disponible en algunos países. **Tomada y modificada de: Zimmer MS y Stephens DS. 2004. Meningococcal conjugate vaccines. Expert Opin Pharm , 5: 855-863 33 Bruge J, Cam NB, Damve B y col . 2004. Clinical evaluation of a group B meningococcal N-propionilated polysaccharide conjugate vaccine in adult, male volunteers. Vaccine , 22: 1087-1096 34 Jódar L, Feavers IM, Salisbury D y col . 2002. Development of vaccines against meningococcal disease . Lancet , 359: 1499-1508 Vacunas Serogupos Polisacarídicas Menomune® (Aventis Pasteur)* A C Y W135 ACWY Vax® (GlaxoSmithKline) A C Y W135 Mengivac A+C® (Aventis Pasteur) A C AC Vax® (GlaxoSmithKline) A C Trivalente ACW® Vaccine (GlaxoSmithKline)* A C W135 Polisacarídicas conjugadas Meningitec® (Wyeth) C conjugada a CRM 197 Menjugate® (Chiron) C conjugada a CRM 197 NeisVac-C® (Baxter) C conjugada al toxoide tetánico Menactra® (Aventis Pasterur)* A C Y W135 conjugada a CRM 197 Vesículas de membrana externa VA-MENGOC-BC®* OMVs de cepa B:4:P1.19,15 + C + OMPs MeNZ B® (Chiron)* OMVs de cepa B: 4: P1.7 b,4 Introducción -22- * Vacunas polisacarídicas simples Como se indica en la tabla anterior, dos vacunas polisacarídicas están en uso en este momento: la bivalente A/C y la tetravalente A/C/Y/W135. Ambas son utilizadas para el control de brotes y epidemias y su administración está limitada a viajeros a áreas endémicas e inmunodeprimidos, debido a una inmunogenicidad baja y de duración corta en niños de poca edad. La eficacia de ambas vacunas no fue similar frente a todos los serogrupos a los cuales estaba dirigida. En el primer caso, generó una eficacia contra el serogrupo A del 78,5% (95%CI, 67-90%) en niños mayores de cuatro años sin mostrar protección en menores al año de la vacunación35; contra el serogrupo C la eficacia fue inferior (52%)36 y tuvo poco efecto sobre el estado de portador de dicho serogrupo seis meses después37. En nuestro país su éxito se asoció con un acusado descenso de casos tres años después de la vacunación, pero su efectividad se puso en entredicho posteriormente38. En el segundo caso, su eficacia contra los serogrupos A y C fue muy reducida en niños menores de dos años y en algunos adultos al cabo de tres39. La protección ejercida contra los serogrupos W135 e Y no ha sido todavía demostrada. Además, también ha sido desarrollada una vacuna trivalente A C Y para controlar determinadas epidemias en África40. En España están disponibles dos: la polisacarídica bivalente Mengivac AC® (Aventis Pasteur) y la tetravalente ACWY Vax® (GlaxoSmithKline). 35 Reingold AL, Broome CV y Hightower AW. 1985. Age-specific differences in duration of clinical protection after vaccination with meningococcal polysaccharide A vaccine. Lancet, 2: 114-118 36 Amato NV, Finger H, Gotschlich EC y col. 1974. Serologic response to serogroup C meningococcal vaccine in Brazilian preschool children. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 16: 149-153 37 Hassan-king MK, Wall RA y Greenwood BM. 1998. Meningococcal carriage, meningococcal disease and vaccination. J Infect, 16: 55-59 38 Cano R, Larrauri A, Mateo S y col. 2004. Impact of the meningococcal C conjugate vaccine in Spain: an epidemiological and microbiological decision. Surv Rep, 9: 5 39 Zangwill KM, Stout RW y Carlone GM. 1994. Duration of antibody response after meningococcal polysaccharide vaccination in US Air Force personnel. J Infect Dis, 169: 847-852 40 Zimmer MS y Stephens DS. 2004. Meningococcal conjugate vaccines. Expert Opin Pharm, 5: 855-863 Introducción -23- * Vacuna polisacarídica conjugada La respuesta a los antígenos polisacarídicos resultó exitosa tras la conjugación del polisacárido a una proteína, favoreciendo así una respuesta timo-dependiente y, además, memoria inmunológica. Esta mejora sustancial propició que un gran número de compañías farmacéuticas desarrollaran estas vacunas contra el serogrupo C. Los estudios de inmunogenicidad indicaron que se inducen niveles de anticuerpos protectivos tanto en lactantes como en niños 41 . Los principales problemas son la necesidad de administrar dosis de recuerdo, el descenso de anticuerpos en niños de corta edad y su ineficacia contra otros serogrupos. Esta vacuna puede generar una espectacular inmunidad de grupo que disminuye la transmisión y el consecuente estado de portador 42 . La cantidad de IgG en saliva tras la vacunación con el polisacárido C conjugado es superior a la inducida por el polisacárido sin conjugar tanto en niños como en adultos 43 . Las vacunas actualmente disponibles tienen conjugados o toxoides tetánicos o un mutante no tóxico de la toxina diftérica (CRM 197 ), también empleados para vacunas de H. influenzae tipo b mostrando una inmunogenicidad equivalente y nula reactogenicidad. En la actualidad en España existen 3 vacunas conjugadas disponibles contra el meningococo C: - Meningitec® desarrollada WyethVaccines, compuesta de 10µg de oligosacáridos del serogrupo C acoplados a 25 µg de CMR197 con AlPO 4 como adyuvante. - Menjugate® desarrollada por ChironVaccines, compuesta de 10 µg de oligosacáridos del serogrupo C unidos a 15-33 µg del CMR197 en AlOH 3 . 41 Granoff DM, Maslanka SE y Carlone FM .1998. A modified enzyme-linked-immunosorvented assay for measurement of antibody responses to meningococcal C polysaccharide that correlate with bactericidal responses. Clin Diag Lab Immunol , 5: 479-485 42 Klugman KP . 2001. Efficacy of pneumococcal conjugate vaccines and their effect on carriage and antimicrobial resistance. Lancet Infect Dis , 1: 85-91 43 Zhang Q, Pettit E, Burkinshaw R y col . 2002. Mucosal immune responses to meningococcal conjugate polysaccharide vaccines in infants. Pediatr Infect Dis J , 21: 209-213 Introducción -24- - Neiss-Vac® desarrollada por Baxter, compuesta de 10 µg de oligosacáridos del serogrupo C acoplados a 15-33 µg del toxoide tetánico en AlOH3 En el Reino Unido la vacunación sistemática se inicio en noviembre de 1999 con un régimen de dos dosis a los 2 y 4 meses de edad. Con esta medida la enfermedad ha decrecido en más del 85% en varios grupos de edad y con la inmunidad de grupo alcanzada se ha reducido en un 67% entre los niños no vacunados44. La vacuna fue incluida en el calendario vacunal infantil en nuestro país en Octubre del 2000, descendiendo la enfermedad en todos los grupos de edad y con una efectividad superior al 95% en niños inmunizados45. La pauta de administración varía en la primovacunación entre las Comunidades Autónomas según el preparado comercial utilizado. El toxóide tetánico utilizado en la vacuna Neiss-Vac® como una proteína transportadora se ha comportado como más inmunógeno respecto que la que contiene CRM19746, motivo por el que en el primer caso, se continuó a priori una pauta de dos dosis a los 2 y 4 meses y en el otro una dosis adicional a los 6 meses. La efectividad de la vacuna parece estar relacionada con una dosis de recuerdo a los 18 meses de edad. En España entre el 2001 y 2004 se han confirmado un total de 32 fallos vacúnales en niños, inferior que en Reino Unido47. Esta disminución de la eficacia vacunal propició que en 2003 se incorporase esta dosis de recuerdo tras la primovacunacion. Los motivos aducidos han sido de diversa índole: 44 Maiden MC, y Stuart JM. 2002. Carriage of serogroup C meningococci 1 year after meningococcal C conjugate polysaccharide vaccination. Lancet, 359: 1829-1831 45 Cano R, Larrauri A, Mateo S y col. 2004. Impact of the meningococcal C conjugate vaccine in Spain: an epidemiological and microbiological decision. Surv Rep, 9: 5 46 Borrow R, Goldblatt D, Finn A y col. 2003. Immunogenicity of, and immunologic memory to, a reduced primary schedule of meningococcal C-tetanus toxoid conjugate vaccine in infants of the United Kingdom. Infect Immunol, 71: 5549-5555 47 Trotter CL, Andrews NJ, Kaczmarski EB y col. 2004. Effectiveness of meningococcal serogroup C conjugate vaccine 4 years after introduction. Lancet, 364: 365-367 Introducción -25utilización simultanea de la vacuna difteria-tétanos-pertursis acelular (DTPa), persistencia de portadores nasofaríngeos de Haemophilus influenzae Tipo b o una reducción de la inmunización natural o memoria inmunológica imperfecta. No obstante, el aumento de casos durante estos últimos meses en ciertos grupos vacunados propiciará nuevas modificaciones de la pauta de vacunación. El éxito de estas vacunas ha extendido su uso a países de Latinoamérica y Canadá donde la mayoría de casos de enfermedad son atribuibles al serogrupo C. Algunos autores han afirmado que el meningococo es capaz de promover el cambio en la composición de cápsula por intercambio genético48. Es posible que la vacunación induzca una presión inmune sobre clones virulentos del serogrupo C favoreciendo su desplazamiento hacia otros serogrupos. Recientemente, el Grupo Sanofi Pasteur ha desarrollado una vacuna tetravalente A C Y W135 conjugada al toxoide diftérico (MCV4 o Menactra®), basándose en la vacuna polisacarídica Menomune®. Aunque su eficacia en adultos y adolescentes es elevada49, su protección es modesta en niños menores de dos años50. Hasta el momento, esta nueva fórmula prácticamente solo se comercializa en EEUU, e indicada únicamente en los grupos de edad citados. * Vacunas basadas en OMVs Las primeras vacunas y las más exhaustivamente estudiadas fueron desarrolladas sobre los años 80 en respuesta a brotes de la enfermedad del serogrupo B en Cuba y Noruega. Durante varios años la fórmula cubana fue la 48 Stwartlwey J, Marfin A, Edupuganti S y col. 1999. Capsule switching of Neisseria meningitidis in children. Infect. Immune, 94: 271-276 49 Campbell J, Edelman R, King J y col. 2002. Safety, reactogenicity and immunogenicity of a tetravalent meningococcal polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine given to healthy adults. Pediatr Infect Dis J, 21: 978-979 50 Rennels M, King JJ, Ryall R y col. 2004. Dosage escalation, safety and immunogenicity study of four dosages of a tetravalent meningococcal polysaccharide diphtheria toxoid conjugate vaccine in infants. Pediatr Infect Dis J, 23: 429-435 Introducción -26única disponible, aunque su comercialización está restringida a algunos países de América Latina. Esta vacuna es producida, a partir de la cepa B:4:P1.19, 15, con los polisacáridos del serogrupo C y una preparación de OMPs de alto peso molecular absorbidas con AlOH 2 . Una eficacia estimada del 83% en adolescentes justificó una campaña de vacunación masiva, que contribuyó al declive de la enfermedad. Su protección, posteriormente evaluada en Brasil, tras su uso en una epidemia causada por cepas del serogrupo B y C, fue similar en adolescentes pero menor en niños y nula en lactantes 51 . La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública Noruego fue desarrollada para ser utilizada durante un periodo hiperendémico causado por la cepa B:15:P1.7,16 del clon ET-5 52 . Los estudios de su eficacia en adolescentes mostraron solamente una respuesta del 57%, pero hay datos que apuntan a que un mayor número de dosis podría incrementar su eficacia. En 2004, los laboratorios Chiron han comercializado en Nueva Zelanda una vacuna constituida de 25 microgramos de OMVs de la cepa B: 4:P1.7 b,4 absorbidas con AlOH 2 , para controlar un brote epidémico causado por una cepa del subtipo P1.7b,4 53 . La protección estimada contra la cepa epidémica fue de un 96% en adultos y del 75% en adolescentes y niños, y su reactogenicidad similar a las vacunas cubana y noruega 54 . El principal problema que presentan las vacunas basadas en OMVs es su limitado grado de inmunogenicidad contra cepas que no han sido incluidas en la 51 Noronha CP, Struchiner CJ y Halloran ME. 1995. Assessment of the direct effectiveness of BC meningococcal vaccine in Rio de Janeiro. Brazil: a case-control study. Int J. Epidemiol, 24: 1050-1057 52 Bjune G, Hoiby EA, Gronnesby JK y col. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet, 338: 1093-1096 53 O´Halllaban J, Lennon D, Oster P y col . 2005. From secondary prevention to primary prevention: a unique strategy that gives hope to a country ravaged by meningococcal disease. Vaccine , 23: 2197-2201 54 Oster P, Lennon D, O´Hallahan J y col . 2005. MeNZB™: a safe and highly i m munogenic Taylor-made vaccine against the New Zealand Neisseria meningitidis serogroup B disease epidemic strain. Vaccine , 23, 2191-2196 Introducción -27misma. Los niveles de reactividad cruzada parecen variar entre cepas y ser dependientes de la edad. Aunque su protección puede ser inducida por diferentes antígenos, la proteína mayoritaria de Clase 1 o PorA (ver apdo. 2.2.b) parece predominante, ocasionando una inmunidad dependiente del subtipo. Con objeto de eliminar este problema, se desarrolló en Holanda una vacuna con seis variedades antigénicas de PorA, que indujo protección únicamente contra las cepas portadoras de una de las variantes 55 . Las vacunas OMVs se han estudiado en mayor medida que otras fórmulas, no obstante, su uso se ha limitado a brotes epidémicos causados por una única cepa. En los lugares endémicos de serogrupo B, la vacunación con OMVs tendría un beneficio limitado debido a la rápida evolución de los tipos antigénicos entre las poblaciones de meningococos, presumiblemente por la presión inmunológica que se ejerce sobre estos. 2. NUEVAS APROXIMACIONES EN EL DESARROLLO DE VACUNAS: FUTURO DE LAS VACUNAS ANTIMENINGOCÓCICAS 2.1 Papel de la genómica en el diseño vacunal Las vacunas disponibles o en desarrollo se basan bien en microorganismos vivos atenuados, microorganismos inactivados o bien en subunidades. Estas últimas emplean determinados componentes antigénicos que dirigen la respuesta inmune hacia estructuras específicas pero adecuadas para alcanzar la protección. En estos casos la fórmula vacunal está claramente definida, siendo de interés en términos de seguridad y reactogenicidad con respecto a otros diseños. Por el 55 Martín SL, Borrow R, Van der Ley P D y col . 2000. Effect of sequence variation in meningococcal PorA outer membrane protein on the effectiveness of a hexavalent PorA on outer membrane vesicles vaccine. Vaccine , 18: 2476-2481 Introducción -28contrario, es indispensable complementar su administración con adyuvantes y con varias dosis para alcanzar una respuesta inmune eficaz. Algunas de las vacunas desarrolladas durante las últimas décadas se basan mayormente en el uso exclusivo de determinados componentes antigénicos, como la vacuna Td (tétano-difteria). Una variante de las vacunas basadas en sub-unidades son las vacunas conjugadas en las que una estructura bacteriana de débil inmunogenicidad, como el polisacárido capsular, se acopla químicamente a una proteína transportadora para generar una respuesta timo-dependiente. Ejemplos de este tipo de vacunas son la vacuna conjugada contra el meningococo C o la vacuna conjugada del neumococo heptavalente. Hasta hace unos años, para analizar los componentes antigénicos era necesario cultivar el patógeno en condiciones in vitro , purificar los posibles candidatos y analizar su capacidad inmunogénica y protectora. Esta estrategia, ahora denominada como “vacunología convencional”, requiere mucho tiempo y únicamente identifica y evalúa los antígenos expresados en grandes cantidades. En muchos casos, estos antígenos mayoritarios no son los candidatos más adecuados, e identificar y evaluar proteínas minoritarias con esta tecnología no es factible. Además, las condiciones de cultivo no son similares a las que se producen durante la infección, y por tanto los antígenos expresados y posteriormente analizados pueden ser diferentes. Gran parte de estos inconvenientes se han solventado con el desarrollo, primero, de la tecnología del ADN recombinante y, posteriormente, con la tecnología genómica. La tecnología del ADN recombinante permite, una vez identificado y secuenciado el gen responsable, producir a gran escala el candidato antigénico en un hospedador heterólogo o en microorganismos vivos atenuados. Con estas técnicas se desarrollaron dos vacunas muy eficaces: la vacuna acelular contra Introducción -29Bordetella pertussis y la vacuna de la hepatitis B 56 . Aunque ambas son seguras, inmunogénicas y bien toleradas, su eficacia protectora tiene un periodo de tiempo limitado y son necesarias dosis de recuerdo 57 . La tecnología genómica reduce en gran medida el tiempo empleado en la búsqueda de candidatos vacunales, aunque todavía no permitió el desarrollo de ninguna vacuna que esté disponible en la actualidad. Esta estrategia de búsqueda posibilita la investigación en patógenos no cultivables y hace posible determinar las proteínas que se expresan exclusivamente in vivo . La secuenciación del genoma de gran número de microorganismos permite disponer de información en poco tiempo para iniciar la búsqueda de candidatos con una poderosa tecnología que ha variado el sentido clásico de la búsqueda. En la Figura 1 se sintetizan diferentes técnicas empleadas en el diseño vacunal. 2.1.a La tecnología del ADN recombinante Durante bastantes años los componentes inmunogénicos de las vacunas basadas en subunidades eran aislados directamente del patógeno, y, su producción requería grandes cantidades del mismo con el consecuente riesgo y coste. El posterior desarrollo de la tecnología del ADN recombinante solventó en un principio esta dificultad, y más tarde se ha extendido su aplicación con el desarrollo de otras estrategias que facilitaron sistemas de producción eficientes en vehículos de expresión no patogénicos. La técnica de fusión de proteínas ha permitido mejorar la purificación de inmunógenos, su localización y su fusión a proteínas transportadoras sin necesidad de conjugarlas químicamente. Además esta estrategia ofrece la posibilidad de presentar las subunidades en sistemas vivos de expresión o incluso en vectores de ADN que incorporen el gen que codifica para el antígeno. 56 Andre FE . 1990. Overview of a 5-year clin ical experience with a yeast-derived hepatitis B vaccine. Vaccine , 8: 74-80 57 Ryan ET y Calderwood SB . 2000. Cholera vaccines. Clin Infect Dis . 31: 561-565 Introducción -36Esta técnica empleada en N. meningitidis también fue utilizada durante los últimos años para identificar otros candidatos en distintos patógenos bacterianos74,75,76. En virus, el concepto de vacunología reversa es nuevo. Recientemente, se analizó mediante esta tecnología la información genómica de antígenos que no forman parte de la cápsula viral o están presentes en baja cantidad y que no pudieron ser purificados y analizados por las técnicas convencionales. Estos antígenos ya están mostrando resultados prometedores77, 78. Tabla 3.- Características de la vacunología convencional y reversa en el desarrollo de vacunas * Tomada de: Adu-Bobie J, Capecchi B, Serruto D y col. 2003. Two years into reverse vaccinology. Vaccine, 21: 605-610. 74 Wizemann TM, Heinrichs JH, Adamou JE y col. 2001. Use of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against Streptococcus pneumoniae infection. Infect Immun; 69: 15931598 75 Ross BC, Czajkowski L, Hocking D y col. 2001. Identification of vaccine candidate antigens from a genomic analysis of Porphyromonas gingivalis. Vaccine, 19: 4135-4142 76 Montigiani S, Falugi F, Scarselli M y col. 2002. Genomic approach for analysis of surface proteins in Chlamydia pneumoniae. Infect Immun, 70: 368-379 77 Pauza CD, Trivedi P, Wallace M y col. 2000. Vaccination with tat toxoid attenuates disease in simian/HIV-challenged macaques. Proc Natl Acad Sci USA, 97: 3515-3519 78 Osterhaus AD, van Baalen CA, Gruters RA y col. 1999. Vaccination with Rev and Tat against AIDS. Vaccine, 17: 2713-2714 Vacunología convencional Vacunología reversa - Análisis de los antígenos más abundantes durante la enfermedad - Análisis de todos los antígenos durante la enfermedad - Identificación de antígenos expresados in vitro - Identificación de antígenos expresados in vitro e in vivo - Aplicable únicamente a microorganismos cultivables - Aplicable a microorganismos cultivables y no cultivables - Imprescindible el estudio de protección en modelos animales - Imprescindible el estudio de protección en modelos animales - Basada en componentes estructurales del microorganismo - Basada en componentes no estructurales, incluyendo proteínas tempranas de virus - Precisa de una correcta conformación de las proteínas recombinantes expresadas - Los polisacáridos, lipooligosacáridos o glicolípidos pueden ser analizados - No permite analizar antígenos no proteicos Introducción -37En conclusión, la vacunología reversa ha reducido el tiempo de identificación de componentes inmunológicamente activos solventado gran parte de los problemas de las vacunas difíciles de desarrollar con la estrategia empleada en la vacunología convencional. No obstante y pese a dichas mejoras, esta tecnología dificulta el conocimiento de la eficacia protectora inducida por el inmunógeno, la cual debe ser valorada por diferentes patrones subrogados de protección (actividad bactericida del suero, opsonofagocitosis, entre otros). * Genómica comparativa La secuenciación de más de 200 genomas en bacterias y más de 400 en virus ha aportado una cantidad de información que permite tanto la identificación de candidatos vacunales como de posibles dianas para antibióticos. El desarrollo de la informática facilita la comparación del genoma entre dos o más microorganismos en pocos segundos. El análisis de toda la información de la secuencia del genoma es esencial para predecir e identificar posibles dianas con un mínimo grado de incertidumbre. En particular, el análisis de la variabilidad genética entre patógenos o microorganismos no patogénicos relacionados, facilita la rápida identificación de fragmentos de ADN que codifican para factores relacionados con la virulencia, denominados también “islas de patogenicidad”, que son adquiridas por transferencia horizontal de genes y están ausentes en microorganismos no patógenos. Además, esta técnica es utilizada para seleccionar epítopos reconocidos por células B y T, acercándose al emergente campo de la inmunología computacional79. Otra nueva tecnología parece revolucionar el campo de la hasta ahora olvidada inmunización pasiva, utilizando los clones de células B de memoria que son más eficientes en personas inmunizadas o infectadas. Esta técnica permite analizar 79 Groot AS y Rappuoli R. 2004. Genome-derived vaccines. Expert Rev Vaccines, 3: 59-76 Introducción -38anticuerpos monoclonales de muy alta afinidad contra microorganismos, así como el aislamiento de clones celulares que pueden ser terapéuticamente muy efectivos. La terapia podría utilizarse para dar solución a algunas enfermedades de las que no se dispone de vacuna en la actualidad. Los resultados recientes de García-Suárez y colaboradores 80 han demostrado que la protección pasiva puede ser aplicada contra la enfermedad neumocócica puesto que la inmunización de ratones con anticuerpos monoclonales ha impedido el desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, el perfeccionamiento de terapias basadas en anticuerpos puede ser extremadamente útil para promover el desarrollo de vacunas frente a otras enfermedades. * Genómica funcional La genómica funcional ofrece una nueva perspectiva para la producción de mutantes atenuados que podrían utilizarse como vacunas vivas o en sistemas para la producción de antígenos heterólogos. Estas técnicas se basan en establecer una correlación funcional entre genes/proteínas con el fenotipo, así como con la expresión de la patogenicidad. - Tecnología del ADN en microarrays La tecnología de microarrays o microchips de ADN es una poderosa herramienta que permite el estudio del transcriptoma. La técnica se basa en hacer hibridar el ARN, sintetizado por la bacteria en unas determinadas condiciones, con fragmentos de ADN específicos fijados sobre la superficie de un chip. La expresión génica puede estudiarse bien para examinar cada gen de forma aislada y valorar su comportamiento diferencial al modificar las condiciones externas, o bien, para analizar el comportamiento conjunto de varios genes que constituyen un “ cluster ” o agrupamiento de genes en términos de funcionalidad, interacción o 80 García-Suarez M, Cima-Cabal MD, Florez N y col . 2004. Protection against pneumococcal pneumonia in mice by monoclonal antibodies to pneumolysin. Infect Immun , 72: 4534-4540 Introducción -39regulación cruzada. Su aplicación a la vacunologia está centrada en analizar genes implicados en la virulencia 81,82 , y consecuentemente, identificar nuevos candidatos vacunales. En N. meningitidis se estudió la interacción del microorganismo con células epiteliales tanto en bacterias adherentes como no adherentes. Después de la adhesión bacteriana se observaron alteraciones en la expresión de 350 genes que se agruparon en cinco categorías 83 . Con estas observaciones se pudieron identificar 12 antígenos expuestos en superficie. En un estudio más reciente se reconocieron nuevos candidatos proteicos al analizar la expresión génica en bacterias incubadas en suero humano y en células epiteliales y endoteliales 84 . El conocimiento de los mecanismos de protección que emplea cada vacuna es un requisito esencial para diseñar nuevas formulas vacunales. El perfil de expresión génica y el análisis immunohistoquímico pueden revelar estos mecanismos de protección 85 . En los últimos años se han publicado enormes avances en la tecnología del ADN en “ microarrays ” tanto en el descubrimiento de nuevos genes como en el desarrollo de vacunas o antibióticos. Sin embargo, esta herramienta está limitada: a) porque los resultados de la expresión génica están sometidos al modelo utilizado y, b), porque los niveles de ARNm no reflejan exactamente la cantidad de proteína, y su expresión no implica necesariamente una consecuencia patológica. Consecuentemente, continúan siendo necesarios los estudios tradicionales de biología, patología y toxicidad. 81 Cohen P, Bouaboula M, Bellis M y col . 2000. Monitoring cellular responses to Listeria monocytogenes with oligonucleotide arrays. J Biol Chem , 275: 11181-11190 82 Mills JC, Syder A, Hong CV y col. 2001. Molecular profile of the mouse gastric parietal cell with and without exposure to Helicobacter pylori . Proc Natl Acad Sci U S A , 98:13687-13692 83 Grifantini R, Bartolini E, Muzzi A y col. 2002. Previously unrecognized vaccine candidates against group B meningococcus identified by DNA microarrays. Nat Biotechnol , 20: 914-921 84 Kurz S, Hubner C, Aepinus C y col . 2003. Transcriptome-based antigen identification for Neisseria meningitidis . Vaccine , 21: 768-75 85 Mueller A, O´Rourke J, Chu P y col. 2003. Protective im munity against Helicobacter is characterized by a unique transcriptional signature. Proc Natl Acad Sci U S A ., 100: 12289-12294 Introducción -40Algunas enfermedades infecciosas como el caso que nos ocupa, todavía carecen de una vacuna efectiva. La publicación del genoma completo de algunos patógenos puede proporcionar un acercamiento a su desarrollo. El avance de la tecnología genética permite identificar un gran número de antígenos de los que se evaluará sus características inmunológicas, acortando de este modo el tiempo de búsqueda de candidatos y aumentando las probabilidades de hallar el más adecuado. - Tecnologías de investigación de la expresión genética in vivo El reconocimiento de antígenos a partir de genes que se expresan específicamente cuando la bacteria infecta al hospedador se ha realizado por varias tecnologías, como las denominadas “in vivo induced antigen technology” (IVIAT), “in vitro expresión technology” (IVET) o “recombination based in vivo expresión technology” (RIVET). La primera de las tecnologías citadas permite identificar productos génicos que son reconocidos por el sistema inmune del hospedador86. Para ello, es necesario disponer y seleccionar anticuerpos de pacientes que reconocen antígenos expresados “in vivo”. Su ventaja sobre otras es que no requiere la manipulación genética del patógeno o de animales de experimentación. Mahan y colaboradores87 diseñaron la técnica IVET para identificar promotores de genes inducidos exclusivamente en los tejidos del hospedador, lo que ha permitido reconocer genes de virulencia en especies patógenas88,89. Más recientemente, la tecnología RIVET está facilitando la detección de genes de 86 Handfield M, Brady JF, Progulske FA y col. 2000. IVIAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections. Trends Microbiol, 8: 336-839 87 Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJ. 1993. Bacteriophage P22 transduction of integrated plasmids: single-step cloning of Salmonella typhimurium gene fusions. J Bacteriol, 175: 7086-7091 88 Young GM y Miller VL. 1997. Identification of novel chromosomal loci affecting Yersinia enterocolitica pathogenesis. Mol Microbiol, 25: 319-328 89 Lowe AM, Beattie DT y Deresiewicz RL. 1998. Identification of novel Staphylococcal virulence genes by in vivo expression technology. Mol Microbiol, 27: 967-976 Introducción -41expresión variable temporalmente durante la adaptación a un nuevo medio90. Otras utilidades de estas técnicas implican las librerías de expresión del genoma, vacunación con ADN o librerías péptido-genomas. - Tecnologías de inhibición funcional de genes Son varias las técnicas que han sido desarrolladas con el fin de eliminar la función de determinados genes para obtener o detectar mutantes. Entre estas, la denominada “signature-tagged mutagenesis” (STM) permite identificar genes microbianos necesarios para la infección en un hospedador animal o en células de hospedadores91. Al mismo tiempo, facilita la identificación de proteínas esenciales para la infección o enfermedad, que podrían ser candidatos vacunales. Su aplicación en N. meningitidis permitió identificar 73 genes con un papel esencial en la bacteriemia y 16 candidatos vacunales que actualmente se están estudiando92. Esta tecnología también ha sido utilizada con éxito en otras bacterias patógenas93. También han sido desarrolladas otros técnicas con el mismo objetivo, como la denominada “transposon site hybridization” (TraSH), aplicada a la identificación de genes expresados bajo condiciones especificas94, o la “genome analysis and mapping by in vitro transposition” (GAMBIT), para inducir mutagénesis en regiones restringidas del genoma95. 90 Slauch JM y Camilli A. 2000. IVET and RIVET: use of gene fusions to identify bacterial virulence factors specifically induced in host tissues. Methods Enzymol, 326: 73-96 91 Shea JE, Santangelo JD y Feldman RG. 2000. Signature-tagged mutagenesis in the identification of virulence genes in pathogens. Curr Opp Microbiol, 3: 451-458 92 Sun YH, Bakshi S, Chalmers R y col. 2000. Functional genomics of Neisseria meningitidis pathogenesis. Nat Med, 6: 1269-1273 93 Coulter SN, Schwan WR, Ng EY y col. 1998. Staphylococcus aureus genetic loci impacting growth and survival in multiple infection environments. Mol Microbiol, 30: 393-404 94 Sassetti CM, Boyd DH y Rubin EJ. 2001. Comprehensive identification of condicionally essential genes in mycobacteria. Proc Natl Acad. Sci USA, 98: 12712-12717 95 Sassetti CM, Boyd DH y Rubin EJ. 2003. Genes requiered for mycobacterial growth defined by hight density mutagenesis. Mol Microbiol, 48: 77-84 Introducción -422.2 La búsqueda del antígeno universal: N. meningitidis Como ya se ha indicado anteriormente en el apdo. 1.3.c, las vacunas basadas en OMVs contra el serogrupo B de N. meningitidis han demostrado que son seguras pero solamente eficaces contra algunas cepas (ver apdo. 1.3). En general, los anticuerpos funcionales obtenidos después de la inmunización no reaccionan de forma cruzada contra todas las cepas debido, sobre todo, a que la acción bactericida del suero es dirigida predominantemente contra la variante antigénica de la proteína PorA (ver siguiente apdo.) introducida en la vacuna96,97. La escasa reactividad cruzada de estas vacunas y la inmunotolerancia al polisacárido capsular del serogrupo B han obligado a buscar otros candidatos conservados en la especie que, independientemente del serogrupo, sean capaces de inducir anticuerpos que provoquen la bacteriolisis y opsonofagocitosis. Estas estructuras supondrían la base de una vacuna polivalente que eliminaría el posible problema del cambio de cápsula (ver apdo. 1.3.c, sbapdo. vacuna polisacarídica conjugada). Diversos antígenos no capsulares se han caracterizado por presentar una variabilidad antigénica menor que la proteína PorA y capacidad para estimular la generación de anticuerpos funcionales y están ya en avanzado estado de desarrollo algunas vacunas basadas en dichos antígenos98. Actualmente, parece que las proteínas de membrana externa o los LOS, por sus características moleculares y antigénicas, son la principal alternativa para eliminar los inconvenientes de las vacunas hasta ahora desarrolladas contra la enfermedad meningocócica. 96 Clark S, Borrow R, Sadler F y col. 1998. Immunoblotting investigation of UK infants sera collected during a phase 2 study of a PorA recombinant meningococal vaccine. Nassif, X (ed). En: 11th International Pathogenic Neisseria Conference, p 798, EDK, París 97 Tappero JW, Lagos R, Ballesteros AM y col. 1999. Immunogenicity of 2 serogroup B outer-membrane protein meningococal vaccines: a randomized controlled trial in Chile. J Am Med Assoc, 281: 1520-1527 98 Findlow J, Lowe A, Deane S y col. 2005. Effect of sequence variation in meningococcal PorA outer membrane protein on the effectiveness of a hexavalent PorA outer membrane vesicle vaccine in toddlers and school children. Vaccine, 23: 2623-2627 Introducción -432.2.a Características generales del antígeno ideal Los antígenos adecuados para incorporar en una vacuna universal frente a la enfermedad meningocócica deben cumplir diferentes requisitos fundamentales: Características genéticas y moleculares - Conservación en la especie y carencia de variabilidad antigénica en los principales clones causantes de la enfermedad. - Expresión en la superficie externa del patógeno, tanto in vitro como in vivo, y tanto en la fase de portador como durante todo el proceso infeccioso. - Exposición en la superficie en todas las cepas de la especie durante la invasión e infección. - Ausencia de toxicidad o reactogenicidad, o en caso contrario poder eliminarla sin alterar su inmunogenicidad de forma negativa. Capacidad inmunogénica - Antigenicidad e inducción de respuesta timo-dependiente y por lo tanto capacidad para generar memoria inmunológica duradera, tanto en adultos como en niños de corta edad, y sin necesidad de sucesivas administraciones. - Generación de anticuerpos protectivos contra la invasión por cualquier cepa de la especie independientemente de sus características genéticas o su serogrupo, primero, en los modelos de animales de experimentación y, posteriormente, en humanos durante los ensayos clínicos. Producción y estabilidad - Facilidad para su purificación y producción sin variar su estructura molecular mediante las técnicas actuales. - Estabilidad en los preparados vacunales durante largos periodos de tiempo y no alteración ante variaciones de temperatura. Introducción -442.2.b Variabilidad genética y molecular de los candidatos: relación con su antigenicidad La variabilidad antigénica de las OMPs y LOS ha impedido, hasta el momento, el uso de una formula vacunal que resuelva el problema del serogrupo B. En la superficie del meningococo, así como en otros patógenos, se han estudiado gran número de candidatos vacunales, que pese inducir una respuesta inmune prometedora contra determinadas cepas, su variabilidad antigénica ha reducido sus posibilidades para su inclusión en una formula vacunal universal (ver apdo. 2.2.b). La importancia de este mecanismo radica en que la respuesta funcional se reduce a un número limitado de cepas con características moleculares similares, lo que dejaría a los individuos vacunados expuestos a la invasión por otras cepas molecularmente divergentes. En este aspecto, es interesante que en el estudio de la candidatura de ciertas moléculas se incluyan análisis exhaustivos acerca de su variabilidad molecular y antigénica. Para conocer y cuantificar dichos parámetros, considerados como fundamentales en el estudio de OMPs de N. meningitidis , las últimas tendencias en vacunología se dirigen hacia el uso combinado de la bioinformática y los datos aportados por las técnicas inmunológicas, moleculares y genéticas tradicionales 99,100 . Esta fusión de herramientas permite, en gran medida, analizar la divergencia genética y predecir su implicación estructural o antigénica 101 , basándose en la comparación con otras ya conocidas. La generación de mapas de epítopos puede proporcionar información útil sobre la ubicación de las zonas de unión de los anticuerpos. No obstante, es fundamental conocer la estructura de dicha región en relación con la del resto de la molécula y de regiones próximas, ya que pequeñas variaciones en la conformación de la 99 Petrovsky N y Brusic V. 2002. Computational immunology: the coming of age. Immunol Cell Biol ., 80: 248-254 100 Zagursky RJ y Rusell D . 2001. Bioinformatics: use in bacterial vaccine discovery. Biotechniques , 31: 636640 101 Doytchinova IA y Flower DR. 2002. Quantitative approaches to computational vaccinology. Immunol Cell Biol , 80: 270-279 Introducción -45proteína pueden inducir a la variabilidad antigénica sin necesidad de alterar los epítopos lineales. En este sentido, la adquisición de datos a partir de la secuenciación del gen codificante, y su análisis posterior mediante algoritmos proporcionan información útil acerca del beneficio del antígeno, así como de la posible elección de las variantes antigénicas más adecuadas. El desarrollo de ciertos programas informáticos especializados permite reconocer varias características de las proteínas en base a su secuencia aminoacídica (hidrofobicidad, regiones expuestas, etc.), y predecir su estructura tridimensional o, incluso, los lugares de unión de los anticuerpos o los epítopos lineales por el complejo MHC, sin necesidad de realizar previos estudios inmunológicos 102,103,104,105 . La inmunoinformática también puede ser muy útil para buscar regiones conservadas que mantengan epítopos entre cepas, lo cual permitiría la síntesis de péptidos mediante la tecnología del ADN recombinante. Dichos epítopos, pese a estar conservados, además deben unirse a múltiples alelos MHC para establecer una respuesta T en la mayoría de la población. Encontrar epítopos que cumplan ambos requisitos resulta una práctica bastante difícil y laboriosa mediante la vacunología convencional, donde las herramientas computacionales podrían reducir enormemente el tiempo de búsqueda. En resumen, toda esta tecnología informática apoyada en el conocimiento de los genomas está sirviendo para estudiar varias OMPs y analizar la variabilidad 102 Kolaskar AS y Tongaonkar PC . 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein Antigens. FEBS , 276: 172-174 103 Alix AJ . 1999. Predictive estimation of protein linear epitopes by using the program PEOPLE. Vaccine , 18: 311-314 104 Yu K, Petrovsky YK, Schönbach C y col . 2002. Methods for prediction of peptide binding to MHC molecules: a comparative study. Mol Med , 8: 137-148 105 Zhang C, Anderson A y DeLisi C . 1998. Structural principles that govern the peptide-binding m otifs of class I MHC molecules. J Mol Biol , 281: 929-947 Introducción -52inmunógeno más efectivo que la TbpB130. West y colaboradores131 demostraron en ratones una mayor protección contra la septicemia meningococal cuando se inmunizan con TbpA-recombinante o con complejos de TbpA/B que cuando se inmuniza únicamente con la TbpB. El receptor exógeno de sideróforos denominado FetA (anteriormente FrpbB), ha sido objeto de estudio al estimular la generación de anticuerpos específicos en pacientes convalecientes y porque induce anticuerpos bactericidas en animales de experimentación132. Al igual que la proteína PorA, la existencia de una región inmunodominante133 y muy variable134, justifica que los anticuerpos policlonales anti-FetA no reaccionen ni sean funcionales con otras cepas de la especie. Pese a esto, la proteína parece estimular una respuesta inmune en vacunados135. Las proteínas LbpA y la LbpB constituyen las proteínas del complejo de unión a lactoferrina. Ambas, de igual modo que la TbpB y FetA, son imunogénicas en humanos tras la infección, pero exhiben heterogeneidad antigénica. Aunque algunos pacientes convalecientes tienen anticuerpos contra LbpB, muchos no presentan actividad contra LbpA136, probablemente por una nula exposición, y por ello no son adecuadas para la vacunación. 130 Pintor M, Gómez JA, Ferrón L y col 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbiol, 47: 757-760 131 West D, Reddin K, Matheson M y col. 2001. Recombinant Neisseria meningitidis transferrin binding protein a protects against experimental meningococcal infection. Infect Immun, 69: 1561-1567 132 Pettersson A, Kuipers B, Pelzer M y col. 1990. Monoclonal antibodies against the 70-kilodalton ironregulated protein of Neisseria meningitidis are bactericidal and strains specific. Infect Immun, 58: 3036-3041 133 Van der Ley, Van der Viesen, J Sutmuller R y col 1996. Sequence variability of FrpB, a major ironregulated outer-membrane protein in the pathogenic Neisseriae. Microbiology, 142: 3269-3274 134 Thompson EA, Feavers IM y Maiden CJ. 2003. Antigenic diversity of meningococcal enterobactin receptor FetA, a vaccine component. Microbiology, 149: 1849-1858 135 Wedege E, Hoiby EA, Rosenqvist E y col. 1998. Immune responses against major outer membrane antigens of Neisseria meningitidis in vaccines and controls who contracted meningococcal disease during the Norwegian serogroup B protection trial. Infect Immun, 66: 3223-3231 136 Jonhson AS, Gorringe AR, Mackinnon FG y col. 1999. Analysis of the human Ig Isotype response to lactoferrin binding protein A from Neisseria meningitidis. FEMS Immunol Med Microbiol, 25: 349-354 Introducción -53- * Antígenos derivados del genoma Como ya hemos comentado anteriormente en el apdo. 2.1.b., la tecnología genómica ha sido utilizada desde hace pocos años para identificar candidatos vacunales diferentes a los propuestos por la vacunología convencional. Tanto la vacunología reversa como la tecnología del ADN en microarrays han identificado genes que codifican probables OMPs137. La clonación de estos genes y su expresión en E. coli ha permitido obtener los denominados “Genome-derived Neisserial Antigens” (GNA)138. Estos antígenos han sido analizados para determinar su potencial vacunal y, algunos de ellos, fueron caracterizados bioquímica y funcionalmente. En general, las ventajas de los antígenos que han sido propuestos como candidatos vacunales se basan en su conservación en la especie o en el género, su exposición en la membrana externa y su capacidad para inducir anticuerpos funcionales. Pese a estas virtudes, la mayoría presenta variabilidad antigénica o de expresión, lo que genera una respuesta inmune disfuncional contra otras cepas de la especie. Los candidatos más relevantes han sido: GNA33, GNA2132, App, NhhA, NadA y GNA1870. Brevemente, a continuación se detallan sus características específicas: Con respecto al antígeno GNA33, se corresponde con una lipoproteína con una importante función metabólica, estructural e implicada en la virulencia de la bacteria139. Está presente en el meningococo y gonococo y posee capacidad para inducir protección en animales de experimentación. No obstante, su potencial 137 Grifantini R, Bartolini E, Muzzi A y col. 2002. Previously unrecognized vaccine candidates against group B meningococcus identified by DNA microarrays. Nat Biotechnol, 20: 914-921 138 Pizza M, Scarlato V, Masignani V y col. 2000. Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science, 287: 1816-1820 139 Adu-Bobie J, Lupetti P, Brunelli B y col. 2004. GNA33 of Neisseria meningitidis is a lipoprotein requeried for cell separation, membrane architecture and virulence. FEMS Immunol Med Microbiol, 28: 329334 Introducción -54vacunal resulta dudoso ya que la protección parece producirse por mimetismo molecular con la proteína PorA140. El antígeno GNA2132 es codificado por un gen conservado en diferentes Neisserias. El potencial de este candidato fue analizado por Welchs y colaboradores141. Los autores resaltaron su importancia por la protección pasiva contra la enfermedad que ofrecía en ratones, probablemente mediada por opsonofagocitosis. Tres de los antígenos identificados se han correspondido con potenciales adhesinas: 1) NhhA (también denominada GNA992), conservada en la especie y con una expresión variable142. Se ha observado que es accesible y capaz de generar títulos altos de anticuerpos bactericidas contra la cepa homóloga, aunque dicha actividad no se ha detectado en suero y muestras de pulmón tras una inmunización intranasal murina. 2) App (anteriormente GNA1985), conservada en cepas asociadas a la enfermedad143 y reacciona con sueros de pacientes convalecientes y portadores del meningococo, indicando expresión in vivo y antigenicidad en humanos. 3) NadA, la cual ha sido considerada como uno de los candidatos más prometedores por estimular la síntesis de anticuerpos específicos en pacientes convalecientes, y, además, por intervenir en la adquisición de la inmunidad 140 Granoff DM, Moe GR, Giuliani MM y col. 2002. A novel mimetic antigen eliciting protective antibody to Neisseria meningitidis. J. Immunol, 167: 6487-6496 141 Welsch AJ, Moe G, Rossi R y col. 2003. Antibody to genome-derived neisserial antigen 2132, a Neisseria meningitidis candidate vaccine, confers protection against bacteremia in the absence of complement-mediated bactericidal activity. J. Infect Dis, 183: 1730-1739 142 Peak IR, Srikhanta Y, Dieckelmann M y col. 2002. Identification and characterisation of a novel conserved outer membrane protein from Neisseria meningitides. Infect Immun, 70: 6021-6031 143 Serruto DJ, Adu-Bobie, Scarselli M y col. 2003. Neisseria meningitidis App, a new adhesin with autoclatalytic serine portease activity. Mol Microbiol, 48: 323-334 Introducción -55natural144. Dicha proteína es codificada por cuatro alelos, y aunque varios estudios revelaron su capacidad para generar anticuerpos bactericidas contra cepas heterólogas, lamentablemente la respuesta no ha sido efectiva contra la totalidad145,146,147. El interés por estas proteínas radica en que su unión a anticuerpos podría generar un importante efecto inhibidor en la adhesión de la bacteria, paso imprescindible para que se inicie la infección. Masigani y colaboradores148, identificaron recientemente una lipoproteína que han denominado GNA1870. En base a su caracterización, los autores consideraron dos limitaciones principales para su uso vacunal: su expresión variable y la divergencia de la secuencia del gen entre cepas del meningococo, estableciendo tres subgrupos o variantes alélicas. Su eficacia protectora se restringe a cepas que expresan la misma variante149. * Vacunas basadas en OMVs de N. lactamica La flora saprófita existente en la orofaringe está constituida por diferentes especies comensales y patógenas pertenecientes al genero Neisseria (como N. lactamica, N. sicca, etc…) o a otros géneros bacterianos (como Moraxella catarrhalis). Dichas especies pueden presentar antígenos comunes con el 144 Litt DJ, Savino SS, Beddek A, y col. 2004. Putative vaccine antigens from Neisseria meningitidis recognized by serum antibodies of young children convalescing after meningococcal disease. J Infect Dis, 190: 1488-1496 145 Bowe F, Lavelle EC, McNeela NE y col. 2004. Mucosal vaccination against serogroup B meningococci: induction of bactericidal antibodies and cellular immunity following intranasal immunization with NadA of Neisseria meningitidis and mutants of Escherichia coli heat labile enterotoxin. Infect Immun, 72: 4052-4060 146 Comanducci M, Bambini S, Brunelli B y col. 2002. NadA, a novel vaccine candidate of Neisseria meningitidis. J Exp Med, 195: 1445-1454 147 Comanducci M, Bambini S, Caugant y col. 2004. NadA diversity and carriage in Neisseria meningitidis. Infect Immun, 72: 4217-4223 148 Masignani V, Comanducci M, Giuliani S y col. 2003. Vaccination against Neisseria meningitidis using three variants of the liporpotein GNA 1870. J Exp. Med, 197: 789-795 149 Welsch AJ, Rossi R, Comanducci M y col. 2004. Protective activity of monoclonal antibodies to genome derived neisserial antigen 1870, a Neisseria meningitidis candidate vaccine. J Immunnol, 172: 5606-5615 Introducción -56meningococo, favoreciendo el desarrollo de anticuerpos funcionales y la consiguiente protección contra la enfermedad meningocócica. En este sentido, estudios realizados en nuestro laboratorio 150 han puesto de manifiesto que N. meningitidis y N. lactamica comparten gran número de antígenos comunes a nivel de la superficie de la membrana. Algunos de estos antígenos, son capaces de estimular anticuerpos bactericidas frente al meningococo en modelos experimentales 151 , demostrando que, la colonización por N. lactamica podría ser uno de los mecanismos de adquisición y maduración de la inmunidad natural frente a N. meningitidis , y por tanto, varios investigadores han considerado la posibilidad de la vacunación masiva con algunas de sus estructuras externas. La ausencia de cápsula en N. lactamica indica que OMPs y LOS son los principales causantes de dicha actividad inmunológica 152 . Actualmente, está en desarrollo una vacuna inglesa basada en OMVs de dicha especie 153 , la cual se encuentra en un estado muy avanzado de su desarrollo (comunicación personal). Por el contrario hay que considerar que tal medida podría alterar el estado de portador de esta especie y en consecuencia el equilibrio ecológico que presenta y su papel como comensal en la mucosa, favoreciendo, posiblemente, la colonización de la misma por otros patógenos. * Otras bases vacunales Una de las proteínas hasta ahora más estudiadas ha sido la denominada proteína de superficie de Neisseria NspA. Aunque todavía se desconoce su función está muy conservada en cepas de N. meningitidis . La inmunización de distintos 150 Troncoso G, Sánchez S, Moreda M y col . 2000. antigenic cross-reactivity between outer membrane proteins of Neisseria meningitidis and comensal Neisseria species. Immunol Med Microbiol , 27: 103-109 151 Sánchez S, Troncoso G, Ferreirós CM y col . 2001. Evaluation of cross-reactive antigens as determinants of cross-bactericidal activity in pathogenic and comensal Neisseria . Vaccine , 19: 3390-3398 152 Sánchez S, Troncoso G, Criado MT y col . 2002. In vitro induction of memory-driven responses against Neisseria meningitidis by priming with Neisseria lactamica . Vaccine , 20: 2957-2963 153 Gorringe A, Halliwell D, Matheson M y col . 2005. The development of a meningococcal disease vaccine based on Neisseria lactamica outer membrane vesicles. Vaccine , 23: 2210-2213 Introducción -57animales de experimentación con una NspA recombinante generó anticuerpos bactericidas contra varias cepas del meningococo y protección pasiva contra la infección154. Estudios posteriores indicaron que la proteína no era accesible en gran número de cepas de N. meningitidis155, lo que redujo en gran medida sus expectativas para la inclusión en la vacuna universal. En estudios más recientes se ha visto que el sistema de expresión de la proteína era fundamental para inducir protección156, probablemente al preservarse determinados epítopos conformacionales. Estas premisas encaminaron a Dweyer y colaboradores157 a obtener OMVs enriquecidas en NspA en N. flavescens, que indujeron protección contra la enfermedad en ratones. En la actualidad la proteína se considera un candidato vacunal muy prometedor. Recientemente, Fletcher y colaboradores158 han descrito las características y utilidad como base vacunal de una nueva lipoproteína denominada LP2086. Esta molécula está expuesta en la membrana externa de N. meningitidis, N. gonorrhoeae y N. lactamica, con un nivel de expresión y exposición variable. En las cepas del meningococo la proteína es codificada por dos variantes alélicas. La inmunización de ratones con una combinación de dos variantes de la proteína LP2086recombinante y de otras dos de PorA-recombinante estimuló la generación de anticuerpos bactericidas contra cepas homólogas y heterólogas. 154 Martín D, Cadieux N, Hamel J y col. 1997. Highly conserved Neisseria meningitidis surface protein confers protection against experimental infection. J Exp Med, 185:1173-1183 155 Moe GR, Tan S y Granoff DM. 1999. Differences in surface expression of NspA among Neisseria meningitidis group B strains. Infect Immun, 67: 5664-5675 156 Moe GR, Zuno-Mitchell P, Hammond SN y col. 2002. Sequential immunization with vesicles prepared from heterologous Neisseria meningitidis strains elicits broadly protective serum antibodies to group B strains. Infect Immun, 70: 6021-6031 157 Dweyer CA, Reddin K, Martin D y col. 2004. Expression of heterologous antigens in commensal Neisseria spp,: preservation of conformational epitopes with vaccine potential. Infect Immun, 72: 6511-6518 158 Fletcher LD, Bernfield L, Barniak V y col. 2004. Vaccine potential of the Neisseria meningitidis 2086 lipoprotein. Infect Immun, 47: 2088-2100 Introducción -58Los lipopolisacaridos meningococales o lipooligosacáridos también están considerados como un importante candidato vacunal. Su posible aportación está basada en diferentes características inmunogénicas. En el suero de pacientes de adultos y niños que padecieron la enfermedad meningocócica se detectaron anticuerpos contra estas moléculas, y algunos de ellos inducen bacteriolisis mediada por el complemento. Se ha observado también que participan en la inmunidad natural adquirida contra el meningococo durante la colonización de especies comensales 159 . En estudios recientes 160 se señaló que varias partes internas de los LOS contienen residuos de glucosa y glicina unidos a fosfoetanolamida y hepII, estructuras que representan epítopos inmunodominantes que son estudiados como futuros candidatos vacunales. Aunque los LOS están sujetos a variación antigénica y de fase, estos datos parecen indicar que una vacuna basada en LOS bien conjugados o detoxificados puede ser efectiva contra la enfermedad. Las características de los candidatos descritos parecen indicar en muchos casos que las partes más conservadas, aún siendo antigénicas, no están sujetas a presión inmunológica por falta de exposición al sistema inmune. Su escasa variabilidad las hace a priori atractivas para su estudio pero, su uso puede estar limitado por la exposición en la superficie de la célula. Estas limitaciones han llevado diferentes autores a sugerir que la base vacunal esté constituida de un conjunto de proteínas con diferentes variantes antigénicas. En la Tabla 4 se resumen las características de diferentes candidatos vacunales no capsulares contra la meningitidis meningocócica. 159 Braum JM, Beuth J, BrlackBraun JM y col . 2004. Neisseria meningitidis , Neisseria lactamica and Moraxella catarrhalis share cross-reactive carbohydrate antigens. Vaccine , 22: 898-908 160 Kahler CM, Datta A, Tzeng YL y col . 2005. Inner core assembly and structure of lipooligosaccharide of Neisseria meningitidis : capacity of strain NMB to express all known immunotype epitopes. Glycobiology , 15: 409-419 Introducción -59Tabla 4.- Características de distintas estructuras subcapsulares de N. meningitidis para su inclusión en una vacuna anti-meningocócica Estructura Pm (kDa) Función Potencial vacunal - Proteínas de Clase PorA 44-47 Porina catiónica Componente mayoritario de la vacunas holandesa y noruega basadas en OMVs. Es Inmunogénica pero presenta heterogeneidad antigénica PorB 37-42 Porina aniónica Proteína inm unogénica pero muestra heterogeneidad antigénica y reducida exposición de algunos epítopos RmpM 37-42 Estabil ización d e c om p l ej o s de la membrana. Anclaje de OMP al péptidoglicano Puede inducir anticuerpos con capacidad de bloquear l a acción bactericida Opa 26-30 Adhesión, invasión Variabilidad antigénica, pero los anticuerpos tienen potencial para bloquear la adhesión de la bacteria Opc 25 Invasión, adhesión I n cl u i da e n l a va c u na n or u e ga basada e n OM Vs , induce anticuerpos bactericidas tras la vacunación. - Proteínas de restricción de hierro TbpA 98 Unión a transferrina In munogénica pero muestra heterogeneidad antigénica TbpB 65-90 Unión a transferrina In munogénica y con limitada heterogeneidad antigénica Fet A 77 Receptor férrico enterobactina Heterogeneidad antigénica - Antígenos derivados del genoma GNA33 Metabólica, estructural y d e v ir ul e n cia Induce respuesta inmune funcional. Posible actividad inducida por mi metismo con un epitopo de PorA GNA 2132 Desconocida Heterogeneidad antigénica pero muestra protección pasiva contra la enfermedad App Adhesión a células epiteliales antigénica NhhA Adhesión a nivel neuronal Antigénica y accesible. Genera altos títulos de anticuerpos bactericidas contra la cepa homologa. Actividad no observada tras la inmunización intranasal NadA Invasión y patogénesis Heterogeneidad antigénica pero Respuesta inmune eficaz GNA 1870 Desconocida Expresión variable, variabilidad antigénica - OMVs de N. lactamica Presencia de estructuras comu nes (OMPs y LOS) con N. meningitidis , inmu nogénicas y con respuesta funcional - Otras estructuras NspA 18-22 Desconocida In munogénica e induce protección en animales LP 2086 Desconocida Conservada en la especie, variabilidad antigénica limitada y actividad funcional Mimetismo antigénico, reduce la deposición de C3 y C9 e inhibe la vía alternativa del co mplemento Induce respuesta inmune tras la vacunación. Los detoxificados están bajo consideración como antígenos va c u nal es LOS LOS Introducción -603. IMPORTANCIA DE LA PRESENTACIÓN DE LOS ANTÍGENOS EN EL DISEÑO DE UNA VACUNA EFECTIVA 3.1 Exposición de antígenos: Papel de las estructuras externas La exposición de los epítopos situados en la superficie de los patógenos es de una importancia crucial para que se unan los anticuerpos específicos y así iniciar la activación del complemento por la vía clásica. Uno de los mecanismos de defensa con los que cuenta el agente externo es reducir cuantitativamente el grado de exposición de estos epítopos, así como los lugares de unión de otras moléculas del complemento. Varios autores han demostrado que esta función es realizada por varias estructuras de la envuelta como la cápsula, los lipopolisacáridos o incluso determinadas proteínas. La cápsula posee un importante papel protector contra varias moléculas del sistema inmune161,162 y reduce la accesibilidad de proteínas de la membrana externa163. No obstante, no existen muchos trabajos en los que se le asigne de forma inequívoca este papel; probablemente debido a la capacidad de algunas especies de secretar o no esta estructura, las diferencias de expresión y composición dentro de la misma especie o también posiblemente por la actuación conjunta de otras moléculas. En la especie que nos ocupa, las cápsulas de los meningococos invasivos contienen ácidos siálicos, excepto las del serogrupo A. Como ocurre en otras moléculas de la membrana externa, la sialización facilita el enmascaramiento de epítopos, pudiendo tener el mismo efecto en la cápsula, aunque este mecanismo no se ha estudiado todavía con detenimiento. 161 Ram S, Mackinnon FG, Gulati S y col. 1999. The contrasting mechanisms of serum resistence of Neisseria gonorrhoeae and group B Neisseria meningitidis. Mol Immunol, 36: 915-928 162 Pangburn MK. 1997. Alternative pathway: activation and regulation. En The complement system. Rother K, Till GO Hansch GM (eds), p 23, Springer, Berlín 163 Moe GR, Tan S y Granoff DM. 1999. Differences in surface expression of NspA among Neisseria meningitidis group B strains. Infect Immun, 67: 5664-5675 Introducción -61Las moléculas de LPS también condicionan directamente la exposición de varias proteínas de la membrana externa164,165. En algunas bacterias166,167 la longitud de las cadenas de sus carbohidratos juega una labor importante en el enmascaramiento de lugares antigénicos, efecto dependiente de la cantidad y estructura de las cadenas polisacarídicas. Otros microorganismos como N. meningitidis carecen de LPS, y consecuentemente de largas cadenas como la Oespecífica, conteniendo LOS. Pese a que las cadenas de carbohidratos de estas últimas son más cortas que los LPS, también se ha observado una inhibición estérica de estas estructuras sobre diversos antígenos proteicos y lipídicos de esta especie168,169,170. La enorme diversidad de estas moléculas y la variabilidad de fase a la que están sometidas, provocan que sus relaciones topológicas con las estructuras antigénicas varíen en la mima especie y en determinadas etapas del crecimiento del microorganismo. Las proteínas de la superficie celular bacteriana son más variables en su secuencia que el resto de proteínas, mecanismo de evasión al sistema inmune que ha sido exhaustivamente analizado en la mayor parte de patógenos bacterianos humanos. Sin embargo, el fenómeno de enmascaramiento de antígenos por 164 Bowen RA, Cloeckaert A, Zygmunt M y col. 1995. Surface exposure of outer membrane protein and lipopolysaccharide epitopes in Brucella species studied by enzyme-linked immunosorbent assay and flow cytometry. Infect Immun, 63: 3945-3952 165 Vretou E, Psarrou E y Spiliopoulou D. 1992. The role of lipopolysaccharide in the exposure of protective antigenic sites on the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J. Gen Microbiol, 138: 12211227 166 Grossman N., Svenson SB, Leive L y col. 1990. Salmonella O antigen-specific oligosaccharide-octyl conjugates activate complement via the alternative pathway at different rates depending on the structure of the O antigen. Mol Immunol, 27: 859-865 167 Bryrd DW, Roop RM, Veit PH y col. 1991. Serum sensitivy and lipopolysaccharide characteristics in Bordetella bronchiseptica, B. pertursis and B parapertussis. J Med Microbiol, 34: 159-165 168 Michaelsen TE, Aase A, Kolberg J y col. 2001. PorB3 outer membrane protein or Neisseria meningitidis is poorly accessible for antibody binding on live bacteria. Vaccine, 19: 1526-33 169 Poolman JT, Wientjes FB, Hopman CTP y col. 1985. Influence of the length of lipopolysaccharide molecules on suerface exposure of class 1 and 2 outer membrane proteins of Neisseria meningitidis 2996 (B: 2b:P1.2). En: The Pathogenic Neisseria. Schoolnik GK, Broks GF, Falkow S y col (eds). p 562. DC: American Society for Microbiology, Washington 170 Plested JS, Makepeace K, Jennings MP y col. 1999. Conservation and accessibility of an inner core lipopolysaccharide epitope of Neisseria meningitidis. Infect Immun, 67: 5417-5426 Introducción -68En algunas ocasiones los agregados pueden diferenciarse de las células simples mediante los ángulos de refracción de luz, lo cual se convierte en una ventaja respecto a otras técnicas, permitiendo estudiar sus características de forma independiente. iii. Tamaño de las partículas. La entrada de las partículas al punto de interrogación está limitada por el tamaño de las mismas. Dicha limitación, dependiente de las características técnicas del citómetro, puede impedir el estudio de bacterias filamentosas en su hábitat natural, microorganismos que crecen formando biopelículas o grandes agrupaciones. iv. Solapamiento de fluorescencia. Un fluorocromo excitado puede emitir en un amplio rango de longitudes de onda. La mayoría de los citómetros de flujo recogen la luz emitida por un fluorocromo en una longitud de onda determinada (canal). En algunos casos, cuando se emplean varios fluorocromos, la fluorescencia recogida en un canal se corresponde a dos fluorocromos por un fenómeno de solapamiento del espectro de emisión, atribuyendo a un evento una característica que no es propia (falsos positivos). En la actualidad existen citómetros que evitan el solapamiento de fluorocromos y programas disponibles para eliminar este efecto durante el análisis de los datos. v. Elevado coste. El alto coste de los citómetros, del material que precisan y del mantenimiento o reparación, sobre todo por la escasez de empresas especializadas, hacen que estos instrumentos de medida no estén al alcance de todos los laboratorios. Introducción -693.2 La conformación del antígeno: Implicación en la inducción de la protección La adecuada conformación de los epítopos es un aspecto fundamental para generar una respuesta inmune funcional. Varios investigadores han observado una clara relación entre la conformación de antígenos en las vacunas y la generación de anticuerpos bactericidas o activadores de la opsonofagocitosis. La alteración o desnaturalización de las proteínas provoca un cambio en su conformación respecto a la nativa que influye enormemente en su antigenicidad; esto ha sugerido que, en gran parte de los casos, los epítopos lineales sean menos importantes para la protección que los epítopos conformacionales183,184. Esta escasa protección puede ser causada por que los epítopos lineales, formados por pequeñas secuencias, solamente permiten la unión de una baja cantidad de anticuerpos en la misma zona. En otras ocasiones estos anticuerpos se dirigen hacia regiones variables entre cepas, o que en condiciones nativas se ubican en partes que están enmascaradas por otras estructuras u ocultas por la propia molécula185, impidiendo la activación de la respuesta. Así, estas observaciones parecen indicar que los anticuerpos producidos contra antígenos naturales pueden resultar más adecuados para conferir protección por varias razones. Su ubicación puede facilitar la deposición de los componentes del complemento o la opsonofagocitosis y, su conformación, igual que la de otras moléculas, puede estimular isotipos de IgG (IgG1 y IgG3) activadores del complemento. Sin embargo, la principal limitación con la que se encuentran los investigadores es la de conservar esta configuración antes y durante la inmunización. Los anticuerpos generados por el sistema inmune pueden no 183 Ulbrandt ND, Cassat DR, Patel NK y col. 2001. Conformational nature of the Borrelia burgdorferi decorin binding protein A epitopes that elicit protective antibodies. Infect Immun, 69: 4799-4807 184 Sánchez S, Troncoso G, Ferreirós CM y col. 2001. Evaluation of cross-reactive antigens as determinants of cross-bactericidal activity in pathogenic and commensal Neisseria. Vaccine, 19: 3390-3398 185 Rosenqvist NE, Musacchio A, Aae A y col. 1999. Functional activities and epitope specificity of human and murine antibodies against the class 4 outer membrane protein (Rmp) of Neisseria meningitidis. Infect Immun, 67: 1267-1276 Introducción -70reconocer pequeñas diferencias en estos epítopos sobre la superficie de la bacteria, no unirse y por lo tanto no generar la respuesta deseada. El principal desafío al que se enfrentan es mantener dicha condición utilizando diferentes estructuras o agentes que faciliten su solubilidad y conformación natural. La purificación del antígeno a partir del cultivo del microorganismo es un proceso tedioso y requiere mucho tiempo. El uso de otros sistemas vivos como E. coli, permite obtener la proteína recombinante en cuerpos de inclusión en grandes cantidades, reduciendo esta limitación. Sin embargo la efectividad del antígeno puede verse reducida, el compartimento subcelular donde se renaturaliza o las condiciones de purificación influyen en su antigenicidad, pudiendo alterar los epítopos protectivos más importantes. Las condiciones del citosol y la oxidación parcial de las proteínas durante su purificación facilitan la formación de posibles puentes disulfuros, lo que explicaría en algunos casos su reducida eficacia186, aunque otras proteínas recombinantes han presentado efectividad como antígenos después de su purificación187. En otros casos los vectores utilizados introducen pequeños péptidos para facilitar su expresión y purificación. La presencia de estas secuencias en la zona N-terminal puede limitar su potencial, resultando ser zonas inmunogénicas o induciendo respuestas inmunes no características o no deseadas por alterar su conformación. Recientemente, Humphries y colaboradores188 han demostrado que la PorA recombinante (detallada en apdo. 2.2.b) induce una respuesta protectiva diferente según el vector utilizado. 186 Exner MM, Wu S, Blanco DR y col. 2000. Protection elicited by native outer membrane protein Oms66 (P66) against host adapted Borrelia burgdorferi: conformational nature of bactericidal epitopes. Infect Immun, 68: 2647-2654 187 Fikrig E, Feng W, Barthold SW y col. 2000. Arthropod and host specific Borrelia burgdorferi bbk32 expression and the inhibition of spirochete transmission. J Immunol, 164: 5344-5351 188 Humphries HE, Williams JN, Christodoulides M y col. 2004. Recombinant meningococcal PorA protein, expressed using a vector system with potential for human vaccination induces a bactericidal immune response. Vaccine, 22: 1564-1569 Introducción -71Tras la purificación, la proteína debe solubilizarse en sustancias que aseguren una conformación terciaria similar a la nativa como han demostrado los liposomas o determinados detergentes, entre otros. El tratamiento con diversos agentes como SDS o deoxycolato ayuda a que las OMPs adopten determinadas estructuras terciarias que mejoran favorablemente la exposición de las regiones antigénicas inmunodominantes, induciendo anticuerpos bactericidas o activadores de la opsonofagocitosis189. Esta práctica supone un bajo rendimiento de la proteína renaturalizada y el inconveniente inherente de su producción a gran escala. Los liposomas utilizados como vehículo de antígenos tiene algunas propiedades ventajosas como la carencia de toxicidad, el ser biodegradables y no inmunogénicos, e inducir una respuesta humoral y celular específicas contra las proteínas embebidas190. Su similitud con las membranas biológicas proporciona una forma admisible para la preparación de formulaciones que contengan las proteínas en su forma natural. Su uso con proteínas recombinantes de N. meningitidis coadministrado con distintos adyuvantes estimuló anticuerpos bactericidas191, no observados cuando se inmunizó solamente con las proteínas. Trabajos previos con las proteínas recombinantes de N. meningitidis Opc y PorB192,193 (detallado en apdo. 2.2.b), demostraron que dichos antígenos inducen niveles más altos de anticuerpos funcionales cuando están solubilizados en liposomas que en detergentes, quizás debido a un efecto adyuvante natural. 189 Niebla O, Alvarez A, Martín A y col. 2001. Immunogenicity of recombinant class 1 protein from Neisseria meningitidis refolded into phospholipid vesicles and detergent. Vaccine, 19: 3568-3574 190 Gregoriadis G. 1995. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems. Trends Biotechnol, 13: 527-537 191 Jonge MI, Hamstra HJ, Jiskoot W y col. 2004. Intranasal immunisation of mice with liposomes containing recombinant meningococcal OpaB and OpaJ proteins. Vaccine, 22: 4021-4028 192 Wright JC, Williams JN, Christodoulide M y col. 2002. Immunisation with recombinat Opc outer membrane protein induces a bactericidal immune response against Neisseria meningitidis. Infect Immun, 70:4028-4034 193 Jolley K, Appleby L, Wright JC y col. 2001. Immunisation with recombinant Opc outer membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of sequence variation and levels of expression on the bactericidal immune response against meningococci. Infect Immun, 69: 3809-3916 Introducción -72Las OMVs son estructuras derivadas de la membrana externa que también pueden conservar la naturaleza de los inmunógenos de la superficie externa. La importancia de estas estructuras para mantener la conformación natural de los epítopos protectores fue puesta de manifiesto con la proteín a de N. meningitidis NspA, que logró alcanzar anticuerpos protectores en OMVs de Neisseria comensales, no así cuando se utilizó únicamente la proteína recombinante producida en E. coli 194 . La presencia de cápsula o LPS, si bien puede restringir la accesibilidad de los epítopos, podría contribuir al mantenimiento de la naturaleza de los mismos u otros antígenos. Los lípidos actúan como activadores de la respuesta inmune o como adyuvante integral 195 . La mayor desventaja de las OMVs es su composición heterogénea, con moléculas no deseadas como LPS tóxicos, proteínas inmunodominantes o bloqueantes de anticuerpos funcionales. La capacidad de obtener mutantes que secretan OMV S sin componentes no deseados o con un exceso de determinadas proteínas ha mejorado su eficacia; sin embargo, hay que tener en cuenta que el isotipo estimulado de IgG y la magnitud y cinética de la respuesta a los antígenos meningococales es dependiente, entre otros factores, de la naturaleza de las OMVs 196 . En cualquier caso la inmunización con múltiples dosis puede contribuir a alcanzar una respuesta contra epítopos relativamente poco inmunogénicos de Neisseria meningitidis , pero capaces de alcanzar protección. La inmunización secuencial con vesículas obtenidas en especies heterólogas promete 194 O´Dwyer CA, Reddin K, Martin D y col . 2004. Expresión of heterologous antigens in comensal Neisseria spp.: preservation of conformational epitopes with vaccine potential. Infect Immun , 72: 6511-6518 195 Steeghs L, Kuipers B, Hamstra HJ y col . 1999. Immunogenicity of outer membrane proteins in a lipopolysaccharide-deficient mutant of Neisseria meningitidis : inf luence of adjuvants on the immune response. Infect Immun , 67: 4988-4993 196 Guthrie T, Wong SY, Liang B y col . 2004. Local and systemic antibody responses in mice immunized intranasally with native and detergent-extracted outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis . Infect Immun , 72: 2528-2537 Introducción -73un acercamiento para alcanzar una inmunidad eficaz contra la meningitis meningocócica197. Otra línea de investigación sugiere la posibilidad de utilizar la tecnología de fagos para la presentación de epítopos, consiguiendo una adecuada conformación antigénica para activar una respuesta funcional. El beneficio de utilizar fagos filamentosos está en la capacidad de obtener anticuerpos dirigidos contra epítopos menos inmunogénicos. Esta metodología es mucho mas simple que la ruta convencional de síntesis de péptidos y acoplamiento a proteínas transportadoras y, ha sido capaz de inducir anticuerpos bactericidas contra una región variable de la proteína PorA (apdo. 2.2.b) de N. meningitidis198. Si bien la generación de una respuesta adecuada no depende exclusivamente de la conformación del antígeno sino que intervienen otros parámetros (características de los anticuerpos generados, la especie animal, adyuvantes, proceso de inmunización)199,200,201, dicha conformación juega un papel primordial en la misma. 197 Moe GR, Zuno-Mitchell P, Samantha NH y col. 2002. Sequential immunization with vesicles prepared from heterologous Neisseria meningitidis strains elicits broadly protective serum antibodies to group B strains. Infect Immun, 70: 6021-6031 198 Menéndez T, Haz I, Delgado M y col. 2001. Immunisation with phage-displayed variable region 2 from meningococcal PorA outer membrane protein induces bactericidal antibodies against Neisseria meningitidis. Immunol Lett, 39: 143-148 199 Wang J, Jarvis GA, Achtman M y col. 2000. Functional activities and immunoglobulin variable regions of human and murine monoclonal antibodies specific for the P1.7 Por A protein loop of Neisseria meningitidis. Infect Immunol, 68: 1871-1878 200 Christodoulides M, Brooks JL, Rattue E. y col. 1998. Immunization with recombinant class 1 outer membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology, 144: 3027-3037 201 Moe GR, Zuno-Mitchell P, Samantha NH y col. 2002. Sequential immunization with vesicles prepared from heterologous Neisseria meningitidis strains elicits broadly protective serum antibodies to group B strains. Infect Immun, 70: 6021-6031 Introducción -74En resumen, las diferentes investigaciones realizadas con distintos candidatos vacunales contra la enfermedad meningocócica indican que son varios los factores que influyen y que pueden modificar el potencial de un candidato. En este aspecto, han sido varios los antígenos, considerados a priori como buenos candidatos, que posteriormente fueron excluidos por no cumplir ciertas características, probablemente, no consideradas inicialmente como fundamentales. La vacunología reversa así como otras tecnologías, comentadas en el apdo. 2.1, complementariamente con los avances de la biotecnología o la inmunología computacional, podrían reducir el tiempo de búsqueda y análisis de diferentes moléculas. No obstante, la naturaleza del patógeno o la ausencia de un patrón animal adecuado exige estudios más amplios y exhaustivos que analicen en mayor profundidad tanto diferentes características moleculares, inmunogénicas o de expresión, como de la disposición del mismo en la envuelta celular o la naturaleza de sus epítopos bactericidas. Caracterización Molecular y Genética de la proteína P47 de Neisseria meningitidis OBJETIVOS Objetivos e Interés del Trabajo - 77El principal problema en la prevención de la meningitis meningocócica sigue siendo el desarrollo de una vacuna eficaz contra el serogrupo B. Debido a la naturaleza de su polisacárido, el éxito de las vacunas conjugadas no ha podido extenderse a la prevención de la enfermedad causada por el meningococo B, por lo que en la actualidad las investigaciones se centran en el estudio de otras moléculas de la superficie celular como las proteínas de membrana externa. Sin embargo, las exigentes características que debe cumplir un antígeno ideal son requerimientos difíciles de cubrir por un único antígeno. De hecho, uno de los principales problemas ha sido la elevada variab ili da d a nt igénic a de las proteí n as estu di ad as h ast a el momento (Por A, proteín as de Clase 2/3, Opc, Tbps, Fbp, NspA,….) que, aun q ue en m uc h os casos son altamente inmunogénicas y abundantes en la envuelta celular, requieren el desarrollo de una vacuna multivalente, implicando un elevado coste de producción y una protección limitada a un reducido número de serotipos. El estudio mediante diferentes técnicas electroforéticas de antígenos comunes entre Neisseria meningitidis y especies comensales como Neisseria lactamica q ue se h a llevado a cab o duran te los últ imos a ños en n ues tro laboratorio, nos ha permitido detectar la presencia en las vesículas de membrana externa de un proteína de 47 kDa altamente inmunogénica y expresada de manera generalizada por todas las cepas de Neisseria estudiadas. La presencia de una proteína de tamaño similar en complejos purificados, como el de las Tbps o aquellos en los que las porinas se encuentran asociadas, parecía indicarnos que podría tratarse de una molécula con un importante pa pel en el meta bolismo de adq u isi ción de hierro o en la estruct ura de la envuelta celular. Además, se han detectado anticuerpos contra esta proteína en sueros de pacientes que padecieron la enfermedad meningocócica. Todos estos datos nos han sugerido su posible implicación en el metabolismo bacteriano y su probable relevancia en la virulencia del patógeno y por lo Material y Métodos - 8 4 - 2. OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS COMPLETOS DE MEMBRANA EXTERNA 2.1 Extracción de vesículas de membrana externa y fijación Las vesículas de membrana externa se obtuvieron mediante extracción con cloruro de litio y rotura con prensa de French, siguiendo el protocolo descrito previamente por Gómez y col203. La suspensión bacteriana, obtenida tras el crecimiento en medio MH/Desferal, se mantuvo durante 90 minutos a 56ºC para provocar la muerte celular. A continuación, se recogieron las células por centrifugación a 10000 x g, durante 10 minutos, a 4ºC y se resuspendieron en tampón acetato 0,1 M, pH 5,8, conteniendo cloruro de litio 0,2 M (apéndice 3) (cinco mililitros de tampón por gramo de sedimento). La rotura celular se realizó pasando la suspensión de células tres veces a través de la prensa de French® a una presión no inferior a 1,1 x 108 kPa. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación de 10 000 x g durante 10 minutos a 4ºC y, posteriormente, el sobrenadante se centrifugó a 200 000 x g durante 10 minutos a la misma temperatura, para obtener el extracto de membrana externa. Dicho sedimento se sometió a dos pulsos de ultrasonidos de 5 segundos. La determinación proteica de las OMVs obtenidas se realizó por el método de BCA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BCA Protein Assay Reagent, Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos)204. Una parte de las OMVs se solubilizaron en agua destilada conteniendo formaldehído al 1% (v/v) a razón de 4 mg/ml de proteína. La suspensión se mantuvo durante 30 minutos a temperatura ambiente para favorecer los enlaces entre proteínas contiguas y posteriormente se centrifugó (200 000 x g durante 10 minutos a 4ºC) para retirar el exceso de formaldehído. 203 Gómez JA, Criado MT y Ferreirós CM. 1997. Bactericidal activity of antibodies elicited against the Neisseria meningitidis 37-kDa ferric binding protein (FbpA) with different adjuvants. FEMS immunol Med Microbiol, 20: 79-86 204 Smith PK, Krohn RI, Hermason GT y col. 1985. Measurement of protein using bicinchononic acid. Anal Biochem, 150:76-85 Material y Métodos -85Todas las suspensiones de OMVs se resuspendieron en agua bidestilada con azida sódica al 0,02% (v/v) y un inhibidor de proteasas (phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF) a 0,5 mM, manteniendose a 4ºC hasta su uso. 2.2 Fijación celular Al medio de cultivo bacteriano se le adicionó formaldehído (Sigma Co, Estados Unidos) hasta alcanzar el 1% (v/v), y se mantuvo a temperatura ambiente, en agitación constante a 100 rpm durante 30 minutos. Posteriormente, las células bacterianas se separaron por centrifugación a 10 000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El extracto celular obtenido se lavó dos veces con tampón fosfato salino (cloruro sódico 0,19 M, fosfato sódico anhidro, 8,4 mM y fosfato sódico monobásico dihidratado 0,01 mM, pH 7,2; PBS) (apéndice 3), recogiéndolas por centrifugación (10 000 x g 10 minutos). Para op tim izar las con dic iones del inmunoens ayo medido en FCM las células vivas bien, se fijaron con glutaraldehído al 0,25%, continuando el mismo proceso empleado en la fijación anterior, o bien, se inactivaron por calor manteniendo los matraces con medio líquido dos horas a 56ºC y luego se fijaron con formaldehído. 2.3 Permeabilización con etanol Las células bacterianas se permeabilizaron por la adicción de etanol al medio de cultivo hasta alcanzar el 70% (v/v), manteniéndose a temperatura ambiente durante 30 minutos y a 100 rpm . Posteriormente, las células se separaron del medio por centrifugación a 10 000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El extracto celular resultante se lavó dos veces con PBS por centrifugación en las mismas condiciones. Una parte de la suspensión celular se fijó adicionando formaldehído hasta alcanzar el 1% (v/v) y se incubó posteriormente como se describió con anterioridad. Todas las suspensiones de las bacterias fijadas o no y/o permeabilizadas se ajustaron a una absorbancia de 1,1 a 540 nm (1 x 10 9 bacterias/ml) y se le añadió Material y Métodos - 8 6 - PMSF a 0,5 mM y azida sódica al 0,02% (v/v) manteniéndolas a 4ºC hasta su utilización. Las suspensiones que presentaron alteraciones en las características morfológicas de las células fueron desechadas. 3. TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS Y DE ELECTROTRANSFERENCIA 3.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Las proteínas de la membrana externa de las distintas cepas evaluadas se separaron por electroforesis en geles verticales de poliacrilamida en presencia del detergente aniónico dodecil–sulfato sódico (SDS), empleando el sistema de tampón discontinuo diseñado por Laemli 205 . La electroforesis se realizó en una cubeta Mini-Protean 3 Cell (BioRad Laboratories, Richmon d, CA, Estados Unidos). En este caso todos los reactivos empleados fueron suministrados por BioRad Laboratories (Richmond, CA, Estados Unidos). Para el desarrollo de la técnica se utilizaron geles concentradores y separadores. El gel concentrador estaba compuesto por poliacrilamida al 4% (p/v), con una relación de acrilamida/N,N´metilenbisacrilamida de 36,5 (p/p) y SDS al 0,1% (p/v) en tampón Tris (hidroximetil) aminometano-HCl (Tris-HCl) 0,125 M, pH 6,8 (apéndice 3). El gel separador se utilizó bien al 12%, o bien, en gradiente lineal del 4-5 al 15% de poliacrilamida en tampón Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8, con SDS al 0,1% (p/v) (apéndice 3). En ambos geles se empleó como sistema catalizador de la polimerización el persulfato amónico al 0,05% (p/v) y TEMED al 0,0 5% (v/v). Los geles con gradiente lineal de poliacrilamida se elaboraron con el sistema de Gradient Former Model 395 (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos) en una Mini Protean ® II Multi-Casting Chamber (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos). 205 Laemli UK . 1970. Cleavage of structural protei ns dur ing the asse mb l y of the head of the bacterip hage T4. Nature , 227: 680-685 Material y Métodos -87Las muestras de electroforesis se prepararon diluyendo las alícuotas 1:1 en tampón de muestra [glicerol al 10% (v/v), SDS al 2% (p/v), 2-β-mercaptoetanol 0,7 M y azul de bromofenol al 1,25 x 10 -3 % (v/v)] (apéndice 3) y se calentaron a 95ºC o a 37ºC entre 10 o 30 minutos, según el ensayo correspondiente. Una vez realizada la electroforesis a 200 V, los geles se tiñeron con Coomassie ® Brillant Blue 206 , tinción de cobre 207 o con tinción de plata 208 (apéndice 2). En otras ocasiones, los geles se emplearon para realizar electrotransferencia a membranas de PVDF, como se describe en el siguiente apdo. 3.2 Electrotransferencia a membranas de PVDF Las proteínas previamente sometidas a SDS-PAGE se electrotransferieron a membranas de PVDF (difluoro de polivinilideno) Immobilon TM -P con un tamaño de poro de 0,45 µm (Millipore Co., Bedford, Estados Unidos) utilizando el sistema de electro-transferencia Mini Trans-Blot ® (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos), tal y como sugiere el fabricante. Previamente, se cortaron por cada gel una membrana de PVDF y dos piezas de papel Whatman nº3 del mismo tamaño que el gel separador. La membrana PVDF se equilibró tras sumergirla en metanol 15 segundos, en agua destilada 2 minutos y, finalmente, en tampón de transferencia [Tris 48 mM, glicina 39 mM, 20% (v/v) metanol, pH 9,2] (apéndice 3) durante 15 minutos. El papel Whatman, junto con las almohadillas de fibra suministradas, se equilibraron únicamente en tampón de transferencia durante 15 minutos. Estos componentes se depositaron en el soporte de electrotransferencia a modo de “sándwich”, con las almohadillas y el papel Whatman en la parte exterior, para mantener en su interior el contacto entre el gel y 206 Bollag DM, Rozycki MD y Edelstein SJ. 1996. Briedfly noted: Dot Filter Binding Assay. Bollag DM, Rozycki MD y Edelstein SJ (eds) En: Protein Methods . p 75, Willey-Liss Inc, New York 207 Lee C, Levin A y Branton D . 1987. Cooper staining: a five m inute protein satín for sodium dodecyl sulphate polyacrilamide gels. Anal Biochem , 166: 508-510 208 Heukeshoven DC y Dernick R . 1985. Simplified method for silver staining of proteins in polyacrilam ide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis, 6: 103-112 Material y Métodos - 8 8 - la membrana PVDF. La transferencia se realizó a 350 mA durante 1 hora empleando únicamente el tampón de transferencia. 3.3 Inmunoblotting Con el objeto de identificar las proteínas antigénicas electrotransferidas, las membranas se lavaron con agua destilada y se bloquearon en tampón TBS (TrisHCl 20 mM, cloruro sódico 5 00 m M, pH 7,5) (apéndi ce 3) con 5% de Blotto (p/v) (Sigma Co) durante 90 minutos a temperatura ambiente y en agitación constante. Posteriormente, se lavaron tres veces con TBS conteniendo Tween 20 al 0,05% (v/v; Sigma Co.;TBS-Tween) (apéndice 3) y se incubaron toda la noche a 37ºC y en agitación, con el suero primario diluido en TBS-Tween con Blotto al 1% (v/v) a la dilución de trabajo. El exceso de anticuerpo fue retirado con 3 lavados con TBSTween. A continuación se añadió una solución con suero anti-Ig totales de ratón o anti IgG de conejo y avidina conjugados a peroxidasa (Sigma Co.), ambos diluidos 1x10 -3 en TBS-Tween con Blotto al 1% (p/v), e incubándose a 37ºC y en agitación para detectar la unión del anticuerpo primario y los estándares de peso molecular unidos a la membrana. Transcurridos 90 minutos, las membranas se sumergieron en una solución sustrato-indicador compuesta de 4-cloro-naftol y H 2 O 2 al 0,04% (v/v) en PBS (apéndice 3) que se mantuvo en agitación const ante a temperatura ambiente. La reacción enzimática se detuvo al cabo de 20 minutos, tras añadirle agua destilada en exceso. En algunas ocasiones, tras revelar la membrana, esta se lavó con agua destilada y se volvió a incubar con otro suero primario continuando el proceso de incubación descrito (inmunobloting secuencial). El análisis de los antígenos y estándares de peso molecular se llevó a cabo con el programa Quantity One® (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos). La dilución de trabajo para los antisueros primarios fue determinada mediante diluciones seriadas, sometiendo una cantidad conocida de la muestra de interés a SDS-PAGE y western blotting. La mayor dilución del suero que detectó los . Material y Métodos -89antígenos de interés en todas las muestras de distinto origen fue considerada como dilución de trabajo. 4. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO DE 47 kDa 4.1 Extracción mediante Tritón X-114 Con la finalidad de purificar el antígeno de 47 kDa, se realizó una primera separación/extracción de las proteínas de la membrana externa del microorganismo en base a su hidrofobicidad neta, tal y como sugirió Kittelberger R y col 209 y que se describe brevemente a continuación. Las células de las cepas Nm30 y B16B6 se hicieron crecer en 50 ml de medio líquido MH (condiciones no restrictivas), MH/Desferal (condiciones de restricción de hierro) y en medio Choc Iso (condiciones de suficiencia de hierro). Las células crecidas en medio líquido se separaron del mismo por centrifugación (10 000 x g durante 10 minutos a 4ºC) y, de igual modo que las crecidas en medio sólido, se resuspendieron a razón de 1 gramo de extracto celular por 10 ml de tampón TBS conteniendo azida sódica al 0,02% y Tritón X-114 al 4% (v/v). Esta mezcla se mantuvo en agitación constante (200 rpm ) toda la noche a 4ºC y luego se centrifugó a 10 000 x g durante 30 minutos a 4ºC, para retirar las células enteras y restos celulares. El sobrenadante se incubó durante 3 horas a 37 , lo cual permitió la formación de dos fases: una fase rica en detergente (ubicada en la parte inferior del tubo) y una fase acuosa, aproximadamente el 87% del volumen total de la extracción. Ambas fases se separaron cuidadosamente, eliminando la zona de contacto para evitar contaminaciones. 209 Kittelberger R, Hansen MF, Hilbink F y col. 1995. Selective extraction of bacterial macromolecules by temperature-induced phase separation in Triton X-114 solution. J Microbiol Meth , 24:81-92 ºC Material y Métodos - 9 0 - 4.2 Separación y detección de las proteínas extraídas con Tritón X-114 Las proteínas presentes en las fases detergente y acuosa fueron separadas mediante SDS-PAGE, electrotransferidas y enfrentadas a los sueros inmunes de ratones y conejos en un inmunoblotting, tal y como se describe en el apdo. 3. Previamente al SDS-PAGE, 3,5 µl de cada fase, diluidas en tampón de muestra de electroforesis, se calentaron a 95ºC durante 10 minutos. La electroforesis se realizó en geles del 12% los cuales fueron bien teñidos con tinción de cobre, o bien, transferidos a membranas de PVDF que se incubaron con el suero de ratón homologo a la cepa empleada. El antígeno de 47 kDa fue detectado en las membranas y en los geles teñidos tomando como referencia un patrón de masas de bajo peso molecular (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos). Con la finalidad de analizar la solubilidad del antígeno de 47 kDa en ambas fases, una vez obtenido un suero inmune especifico contra este, se realizó SDSPAGE y western blotting de ambas fases extraídas de los cultivos en restricción de hierro y Choc Iso, en las condiciones indicadas anteriormente. 4.3 Elucción a partir de geles de poliacrilamida y concentración del eluato El antígeno de 47 kDa presente en la fase detergente del cultivo en MH/Desferal de la cepa Nm30 fue seleccionado para ser purificada tras SDSPAGE. La porción del gel donde se situó la proteína tras la electroforesis fue extraída del mismo, desteñida y eluida según la metodología descrita previamente 210 . El desteñido se realizó mediante tres inmersiones continuadas en tampón TrisHCl 0,25 M, pH 9,0 con EDTA 0,25 M durante 10 minutos a temperatura ambiente y en agitación constante y una inmersión en una solución de Tris 20 mM, glicina 150 mM y SDS al 0,01% (p/v) durante 10 minutos. La elucción de las proteínas se 210 Hager DA y Burgess RR . 1980. Elution of proteins from dodecyl sulfate-polyacrilam ide gels, removal of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic activity: results with sigma suunit of Escherichia coli RNA polymerase, wheat germ DNA topoisomerase and other enzymes . Anal Biochem , 109: 76-86 ´ ´ Material y Métodos -91realizó sumergiendo el gel, previamente homogenizado, en Tris 20 mM, Glicina 0,19 mM y SDS al 0,01% (p/v) durante 12 horas a 25ºC. Los restos del gel se retiraron con una centrifugación a 13 000 x g durante 5 minutos. La concentración del antígeno de 47 kDa eluido, se realizó según el método de precipitación de proteínas con ácido tricloracético (TCA) 211 . Al tampón de elucción se le añadió TCA hasta alcanzar el 10% (v/v), se agitó enérgicamente y se congeló a –20ºC. Transcurridos 15 minutos, el vial se centrifugó a 13000 x g durante 5 minutos y el precipitado se ajustó a pH 7,0 con hidróxido sódico 0,1 M. La eficacia de la purificación se evaluó sometiendo el eluato a una electroforesis y posterior detección mediante inmunoblotting con suero de ratón anti-OMVs de la cepa Nm30. El concentrado se mantuvo a 4ºC hasta su uso. 4.4 Identificación del antígeno de 47 kDa: Análisis por MALDI-TOF y reconocimiento de su contexto genómico Las OMPs de la fase detergente extraídas del cultivo en medio MH/Desferal de la cepa Nm30 fueron separadas mediante SDS-PAGE en geles comerciales del 4 al 15% de acrilamida Tris-HCl (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos), como se indicó en el apdo. 4.2. Las proteínas se tiñeron continuando el protocolo de tinción de plata (apéndice 2), y el antígeno de 47 kDa fue detectado por su peso molecular mediante el patrón estándar. La porción del gel que ocupaba el antígeno se cortó y se introdujo en un vial Eppendorff estéril manteniéndose a 4ºC hasta su análisis posterior. El antígeno de 47 kDa purificado fue sometido a digestión tríptica y posteriormente se obtuvo su huella peptídica por espectrometría de masas mediante la técnica de MALDI-TOF. La secuencia de los péptidos resultantes se comparó con la de otras proteínas disponibles en las bases de datos del “ GenBank ” (www.pubmed.com). La semejanza de dichas proteínas con los fragmentos 211 Bollag DM, Rozycki MD y Edelstein SJ . 1996. Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation. Bollag, DM, Rozycki MD y Edelstein SJ (eds) En: Protein Methods, p 84. Willey-Lyss INC. New York Material y Métodos - 9 2 - peptídicos se analizó mediante probabilidad utilizando el método “Mowse Score”. El antígeno se identificó con la proteína que mostró un grado de similitud significativamente mayor (p>0.05), y que hemos denominado como proteína P47. Estos análisis se realizaron en el Laboratorio de Proteómica del Centro Nacional de Biotecnología de Madrid del CSIC. A partir de las secuencia aminoacídica de la proteína identificada se obtuvo en el “GenBank” el gen que la codifica, que hemos denominado gen p47 , y su contexto genómico en la cepa N. meningitidis Z2491. La correspondencia de los genes que flanquean el gen p47 en otras especies de Neisseria presentes en la base de datos del “GenBank” o en el Sanger´s Institute se realizó mediante el alineamiento de secuencias con la herramienta BLASTn. 5. OBTENCIÓN DE SUEROS INMUNES 5.1 Obtención de sueros en ratón Las OMVs extraídas de los cultivos en condiciones de restricción de hierro de las cepas Nm30 y B16B6 fueron utilizadas para inmunizar ratones Balb/c de un mes de edad, siguiendo lo descrito anteriormente 212 . La inmunización siguió una pauta de tres dosis con un intervalo de 2 semanas entre cada una. Las dosis, compuestas de 20 µg de OMVs resuspendidos en 100 µl de adyuvante de Freund (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, Estados Unidos), se administraron por vía intraperitoneal. En la primera dosis el antígeno se emulsionó en adyuvante completo, mientras que en las siguientes se utilizó el adyuvante incompleto. La extracción de la sangre se realizó a los cinco días de la última inmunización a través del plexo orbital del ojo. La sangre se dejó coagular durante 1 hora a temperatura ambiente y, tras un periodo de 12 horas a 4ºC para retraer el coagulo, 212 Sánchez S, Troncoso G, Criado MT y col . 2002. In vitro induction of memory-driven responses against Neisseria meningitidis b y pri mi n g with Neisseria lactamica . Vaccine , 20: 2957-63 Material y Métodos - 9 3 - se retiró el suero y se centrifugó a 2000 x g durante 10 minutos a la misma temperatura. Los antisueros se mantuvieron 30 minutos a 56ºC para inactivar el complemento. A continuación, se les añadió azida sódica al 0,02%, se distribuyeron en alícuotas de 250 µl y se congelaron a –20ºC hasta su uso. 5.2 Obtención de sueros en conejo Los sueros policlonales contra la proteína P47 purificada (apdo. 4.3) y contra OMVs de la cepa Nm30 se obtuvieron en conejos de raza NeoZelandesa de 2-3 kg de peso, inmunizándolos continuando una modificación de la metodología descrita por Vaitukaitis213. Antes de iniciar la inmunización, se les extrajo sangre de la vena marginal de la oreja, cuyo suero fue considerado como suero no inmune (SNI). A continuación, se le administró a cada lote de conejos 500 µg de OMVs de la cepa Nm30 o 13 mg de P47 purificada, emulsionados en 500 µl de adyuvante completo de Freund. La dosis se administró por vía subdérmica en 50 pinchazos en la parte dorsal de los animales. Transcurridos 54 días después de la primera inmunización se le administró por vía intramuscular al lote correspondiente, tres dosis de recuerdo cada 8 días. Las dosis estaban compuestas de 62,3 mg de proteína purificada o 500 µg de OMVs de la cepa Nm30 resuspendidas en 100 µl de PBS, pero en este caso sin adyuvante de Freund. Transcurridos doce días de la última inmunización se extrajo la sangre por punción cardiaca, se dejó coagular y se retiró el suero. El complemento se inactivó por calor y se distribuyó en alícuotas, de igual modo que los sueros de ratón precedentes. Para valorar la eficacia de la inmunización, durante este proceso se extrajo sangre a través de la vena marginal de la oreja. La primera comprobación se realizó 213 Vaitukaitis JL. 1981. Production of antisera with samall doses of immunogen: multiple intradermal injections. Langone JJ, van Vunakis H (eds). En: Methods Enzymol, 73: p 46, Academic Press, New York Material y Métodos - 1 00 - Después de detectar la unión del suero anti-P47, el resto de proteínas antigénicas se revelaron mediante un inmunoblotting secuencial con el suero de conejo antiOMVs de la cepa Nm30 diluido 1x10 -3 y 1x10 -4 . 9. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN p47 La detección del gen p47 en todas las cepas utilizadas en el presente estudio se realizó mediante una amplificación específica por PCR. Para su secuenciación completa, se amplificaron varios fragmentos solapados entre sí que, tras ser purificados y secuenciados como se describe en el apdo. 9.2 y 9.3, fueron ensamblados para obtener la secuencia completa. Los cebadores óptimos para la reacción se diseñaron con el programa Primer3 (http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca/cgi-bin/primer3_www.cgi) basándose en la secuencia del gen p47 de la cepa N. meningitidis Z2941 (NMA0281), disponible en la base de datos del “GenBank “, y de una cep a de N. lactamica que está siendo secuenciada por el Sanger´s Institute, y también disponible en Internet. Todos ellos fueron sintetizados y suministrados por Sigma-Aldrich Co. 9.1 Preparación del ADN El ADN de las cepas se extrajo resuspendiendo en agua desionizada libre de proteasas y nucleasas (Sigma-Aldrich C) la mitad de un cultivo en césped en medio de cultivo sólido Choc Iso. La suspensión se trató a 100°C durante 20 minutos y posteriormente a –20ºC durante 2 minutos. Tras centrifugar a 10 000 x g durante 5 minutos se recogió el sobrenadante, conteniendo el ADN, y se distr ibuyó en alícuotas que se conservaron a –20ºC. Material y Métodos -1019.2 Reacción de amplificación La amplificación de los fragmentos de ADN se realizó en un termociclador MyCycler™ versión 1.06 (BioRad Laboratories Richmond, CA, Estados Unidos). Excepto los cebadores, todos los reactivos empleados fueron suministrados por el mismo proveedor y en todos los ensayos se empleó agua desionizada libre de proteasas y nucleasas. Las condiciones óptimas de la reacción (temperaturas y concentración de reactivos) fueron determinadas utilizando un control positivo (todos los reactivos de la mezcla y ADN de la cepa Nm30) y un control negativo (todos los reactivos de la mezcla sin ADN), tal y como se describe a continuación. Para cada reacción, las concentraciones óptimas de Cl 2 Mg (1-4 mM) y dNTPs (5-20µM), las unidades de BioTaq polimerasa (1-3), el volumen de ADN (0,5-2,5 µl) y la concentración de cebador (4-12 µM) se determinaron conjuntamente con diferentes temperaturas de anillamiento (56°C-67°C). La mezcla de la reacción, con un volumen final de 20 µl, contenía además (NH 4 ) 2 SO 4 16 mM, Tris-Cl 67 mM (pH 8,8) y Tween 20 al 0,01% (v/v). El proceso de amplificación está recogido en la Tabla 6 . Los productos de la reacción se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% o al 2% (p/v), según el tamaño esperado del oligonucleotido, y empleando el programa GelDoc® 2000. El tamaño de los fragmentos amplificados se calculó utilizando un patrón de oligonucleótidos estándar (BioRad Laboratories Richmond, CA, Estados Unidos). En algunos casos una vez purificado el fragmento de interés, fue necesario realizar una segunda amplificación para obtener una mayor cantidad de producto para la secuenciación. Material y Métodos - 1 02 - Tabla 6.- Condiciones del proceso de PCR utilizadas para la detección y secuenciación del gen p47 en diferentes cepas de N. meningitidis , N. sicca, N. subflava y N. lactamica utilizadas en el presente estudio * Dependiente de cada cebador y cepa bacteriana 9.3 Purificación del producto amplificado Con el objeto de eliminar de los productos de la reacción de amplificación las sales, enzimas, nucleótidos y oligonucleótidos de pequeño tamaño que pudiesen interferir en las reacciones de secuenciación, se utilizaron los kits de limpieza “Quick-clean® “(BioRad Lab) o “QIAquick Gel Extration Kit®” (QIAgen Lab), siguiendo los protocolos establecidos por los fabricantes. El primero se empleó cuando se obtuvieron productos específicos en la reacción de PCR. Para ello, se mezcló el mismo volumen del producto de reacción con la solución de lavado, agitando vigorosamente y se mantuvo la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se centrifugó (13 000 x g durante 15 min y al sedimento resultante se le añadió etanol al 70% (v/v), agitando vigorosamente durante 30 segundos para precipitar el ADN. La suspensión se centrifugó en las mismas condiciones, y tras desechar el sobrenadante, el sedimento se mantuvo a temperatura ambiente hasta eliminar los restos de etanol. El kit “QIAquick Gel Extration Kit®” se utilizó cuando fue necesario purificar el fragmento de interés a partir del gel. En estos casos, el producto se extrajo de la Proceso Tiempo Temperatura Ciclos Desnaturalización 5 minutos 94ºC 1 Amplificación desnaturalización 30 segundos 94ºC anillamiento de cebadores 30 segundos V* 27 síntesis 1 minuto 72ºC Síntesis final 4 minutos 72ºC 1 ) Material y Métodos -103zona del correspondiente al fragmento deseado, añadiendo 3 volúmenes de tampón QC por volumen de gel e incubándose a 50°C durante 10 minutos hasta solubilizar la agarosa. Posteriormente, se adicionó un volumen de isopropanol, se mezcló, y se hizo pasar por una “QIA spin column“ mediante centrifugación, para unir el ADN. A continuación, a la columna se le añadieron 0,5 mL de tampón QG, se centrifugó y se le adicionó 0,75 mL de tampón PE que se mantuvo durante 5 minutos. Después de dos centrifugaciones sucesivas para retirar los restos de etanol, el ADN unido a la columna se eluyó mediante la de 30 µl de agua desioinizada. En todos los casos el ADN se mantuvo a 4ºC o -20ºC hasta su secuenciación. Todas las centrifugaciones realizadas se hicieron en una centrifuga Biofuge 13 (Heraeus) a 17900 x g durante 1 minuto 9.4. Reacciones de secuenciación La secuenciación de los productos de amplificación purificados se realizó en el Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Pública Carlos III (Majadahonda, Madrid) y en la empresa sistemasgenómicos (Valencia). En algunas ocasiones, las reacciones de marcaje/amplificación de los fragmentos purificados fueron realizadas en nuestro laboratorio empleando el kit de secuenciación “Cycle DNA sequencing Kit®” (sequencing RR-100 v3.1, AB, Foster). Para ello se mezclaron 4 µL de producto amplificado y purificado, 3 µL de solución BigDye Terminador™, 1 µL de cada primer a 5 µM y 2 µL de H 2 O. En la Tabla 7 se recogen las condiciones del proceso de marcaje utilizado. Las reacciones de amplificación/marcaje se realizaron de forma independiente para cada cadena y se repitieron al menos dos veces. adición Material y Métodos - 1 04 - Tabla 7.- Condiciones del proceso de amplificación/marcaje de diferentes productos de PCR para su secuenciación 9.5 Reconstrucción y análisis de las secuencias nucleotídicas del gen p47 Para cada cepa, las secuencias de cada fragmento se editaron con el programa Chromax (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) y se ensamblaron con el programa SeqMan v.II (DNAStart, Inc, Madison, Wis). Las ORFs se determinaron a partir de las definidas para las cepas N. meningitidis Z2491 y MC58, disponibles en el “GenBank”. Todas las secuencias de los genes completos, así como las disponibles en el “GenBank” (N. meningitidis Z2491 y MC58 y N. gonorrhoeae NG1090) y la de N. lactamica depositada por el Sanger´s Institute, se alinearon por el programa CLUSTALW217 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y MEGA3.v1 (http://www.megasoftware.net/). El grado de similitud entre los alelos identificados se representó mediante la construcción de árboles filogenéticos utilizando el método de Neighbor-joining 218. 217 Higgins D y Sharp R. 1989. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput. Appl. Biosci, 5: 151-153 218 Saitou N y Nei M. 1987. Neighborg-joining method: a new method for constructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol, 4: 406-425. Proceso Tiempo Temperatura Ciclos Desnaturalización 3 minutos 94ºC 1 Amplificación Desnaturalización 10 segundos 96ºC Anillamiento de cebadores 5 segundos 50ºC 25 Síntesis 4 minutos 60ºC Material y Métodos - 1 05 - 10. PREDICCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE LA PROTEÍNA P47 10.1 Estructura primaria La estructura primaria de la proteína fue obtenida a partir de las secuencias nucleotídicas de los distintos alelos identificados del gen p47, mediante el programa Gentle (http://GENtle/.htm) y utilizando el mismo patrón de traducción que el utilizado en las bases de datos del “GenBank” para el gen NMA0281. Las secuencias proteicas obtenidas a partir de cada alelo fueron alineadas y analizadas con los programas citados en el apdo. 9.5. De igual modo que con las secuencias nucleotídicas, el grado de similitud entre las variantes proteicas identificadas se representó mediante árboles filogenéticos. 10.2 Reconocimiento de estructuras superiores Algunas características estructurales de la proteína P47 (estructura secundaria, motivos, dominios, lugares de unión, localización, regiones transmembrana o hidrofobicidad) fueron deducidas a partir de la secuencia primaria de las distintas variantes identificadas para la proteína P47. Para ello, se han utilizado diversos servidores de acceso libre vía Internet, basados en patrones de reconocimiento de estructuras ya conocidas en otras proteínas o de diferentes algoritmos que reconocen regiones internas en la secuencia facilitada (Tabla 8). 10.3 Predicción de epítopos lineales Los epítopos lineales de las distintas variantes proteicas fueron calculados utilizando el algoritmo de Kolaskar y Prasad219 introduciendo las diferentes secuencias en el servidor disponible en Internet (http://www.mifoundation.org/). 219 Kolaskar AS y Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett, 276: 172-174 Material y Métodos - 1 06 - Tabla 8.- Servidores utilizados para el reconocimiento de diversas estructuras y características moleculares del antígeno de 47 kDa 220 Combet C, Blanchet C, Geourjon C y col . 2000. NPS@: Network Protein Sequence Analysis. TIBS , 3: 147-150 221 Falquet L, Pagni M, Bucher P, y col . 2002. The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Res . 30: 235-238 222 Sierakowska A, WillenbrickH, Heijne G y col . 2003. Prediction of lipoprotein signal peptides in grannegative bacteria. Protein Sci ., 12: 1652-1662 Servidor/programa Utilidades Dirección en Internet NPS@: Network Protein Sequence Analysis 220 Predicción de la estructura secundaria mediante diferentes algoritmos (DSC, HNNC, MLRC, PHD, PREDATOR) http://pbil.ibcp.fr/ Gentle Patrón de hidrofobicidad http://GENtle/.htm DAS Transme mbrane Prediction Server Predicción de segmentos transmembrana http://www.sbc.su.se Pubmed http://www.ncbi.nlm.nih/htm l PROSITE 221 Identificación de dominios, motivos y lugares de unión http://myhits.isb-sib.ch/html Lipo 1.0 server 222 Predicción de lipoproteínas y péptidos señal http://www.cbs.dtu.dk/servic es/LipoP1.0/LipoP1.0server.html Signal IP3.0 Predicción de distintos tipos señales en lipoproteínas http://www.cbs.dtu.dk/servic es/SignalP/ PSORT Predicción de los lugares de localización de proteínas http://psort.nibb.ac.www.htm l PHYRE Predicción de estructuras terciarias y lugares reactivos http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~ phyre/ Multicoil v.1.0 Predicción de conformaciones superhelicoidales http://theory.lcs.mit.edu/~elw olf/multicoil.html Material y Métodos -10711. ENSAYO DE ACTIVIDAD BACTERICIDA El ensayo de actividad bactericida se realizó con los sueros de conejo anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 frente a las cepas Nm30, B16B6, NMB, Nm9, Nm62, Nm63, Nm68 y NmP19, según describe Sánchez y col 223 . Un mililitro de suspensión bacteriana ajustada a una DO 540 de 1,6–1,8 nm se inoculó en 20 ml de medio MH/Desferal. Dicho matraz se incubó durant e 10-12 horas a 37ºC en agitación (110 rpm ). Parte de la suspensión bacteriana se transfirió a un segundo matraz con 20 ml del mismo medio hasta alcanzar una DO 540 de 0,16. Este subcultivo se incubó durante 3 horas en las mismas condiciones que las anteriores hasta alcanzar la fase exponencial del crecimiento. Posteriormente, las células se separaron del medio mediante centrifugación (2 000 x g 10 min) y se preparó una suspensión con 1,6x10 4 bacterias/ml en tampón GBSS [glucosa 5,5 mM, fosfato monopotásico 0,44 mM, fosfato disódico 1,3 mM, cloruro cálcico 1,3 mM, cloruro potásico 5,4 mM, cloruro sódico 137 mM, cloruro magnésico 1 mM, sulfato amnésico 0,81 mM y gelatina al 0,1% (p/v)] (apéndi ce 3). En una placa de microtitulación estéril de fondo en U se mezclaron, por triplicado, 25 µl de suspensión bacteriana, 50 µl de suero diluido 2,5x10 -1 en GBSS y 25 µl de complemento de conejo de 3-4 semanas (Pel-Freez CS). Después de una incubación de 30 minutos a 37ºC, se depositaron 25 µl de la mezcla y extendieron sobre placas de medio GC agar base suplementado con Biovitex al 1% (v/v) manteniéndolas a 37ºC con atmósfera de CO 2 del 5%. El recuento de unidades formadoras de colonias se determinó a las 12 horas. 223 Sánchez S, Troncoso G, Ferreirós CM y col. 2001. Evaluation of cross-reactive antigens as determinants of cross-bactericidal activity in pathogenic and comensal Neisseria . Vaccine , 19:3390-3398 Material y Métodos - 1 08 - Por cada experimento se incluyeron, también por triplicado, los siguientes controles negativos: 1 - suspensión bacteriana, complemento y suero no inmune 2 - suspensión bacteriana, GBSS y suero inmune Todos los experimentos se realizaron en tres días diferentes. La actividad bactericida se expresó en términos de porcentaje de reducción en el número de células viables con respecto al suero no inmune y la variación interensayo como el error estándar. La tasa de mortalidad para cada suero se determinó según las siguientes expresiones: * Unidades formadoras de colonia El suero fue considerado bactericida cuando alcanzo una tasa de mortalidad superior al 50%. La expresión de la proteína P47 en las colonias viables se determinó resuspendiendo las colonias en 100 µl de agua destilada y desarrollando un inmunoensayo dot blotting, como se indica en el apdo. 6.2. Tasa Mortalidad = 100 – Tasa de Viabilidad Media de CFU* del suero x 100 Tasa de Viabilidad = Media de CFU del control 1 ´ Material y Métodos -10912. APÉNDICES 12.1 Medios de cultivo * Medi o sól id o Choc Iso El medio sólido Choc-Iso se prepara tras la mezcla de dos soluciones de igual volumen y esterilizadas de forma independiente a 121ºC 10 min:  Medio GC agar base 2X suplementado con agar hasta alcanzar 30 (g/l)  Hemoglobina al 2% (p/v) en agua destilada. Cuando ambas soluciones enfrían hasta alcanzar 50ºC, se le añade a la solución de hemoglobina Biovitex al 1% y se mezclan convenientemente. Esta solución se vierte sobre placas Petri estériles desechables y se deja solidificar a temperatura ambiente. * Medio líquido Mueller Hinton De forma general, el medio MH se prepara tras solubilizar 21 g de medio MH en 1000 ml de agua destilada y esterilizarlo a 121ºC durante 10 minutos. Para establecer las condiciones de restricción de hierro, el Desferal esterilizado por filtración debe añadirse 30 minutos antes de realizar el cultivo. 12.2 Tinciones de proteínas separadas por SDS-PAGE * Tinción Coomassie Brillant Blue G-250 Una vez retirado el gel de la carcasa de electroforesis, se lava durante unos segundos con agua destilada y se fija n las proteínas con TCA al 12% (p/v) a temperatura ambiente y en agitación suave. Al cabo de una hora se retira el TCA y se lava el gel para eliminar los restos de solución, sumergiéndolo a continuación en solución Coomasie al 0.1% (p/v) y sulfato amónico al 6% (p/v) durante aproximadamente 10-12 horas. El exceso de colorante se retira mediante lavados sucesivos en agua destilada. Resultados -117 - 1. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO DE 47kDa 1.1 Extracción de OMPs mediante Tritón X-114 y purificación por elucción a partir de geles de poliacrilamida La purificación del antígeno de 47 kDa se llevó a cabo con el fin de su posterior identificación y caracterización molecular y genética que permitió la obtención de un suero policlonal específico contra el mismo y que se utilizó como herramienta para determinar su expresión, antigenicidad y accesibilidad en un amplio número de cepas. Permitió además, valorar su potencial como candidato vacunal contra la meningitis meningocócica. Como se observa en la Figura 2 y 3, la expresión del antígeno de 47 kDa fue inversamente proporcional a la concentración de hierro existente en el medio de cultivo utilizado, carácter mostrado en las dos cepas analizadas (ver Mat y Met. apdo. 4.1 y 4.2) pero fundamentalmente en la Nm30. Como indican los experimentos realizados con esta cepa, cuando se cultivó en medio MH/Desferal (condiciones de restricción de hierro), su expresión fue mucho más intensa que cuando se cultivó en un medio enriquecido en hierro como el Choc Iso (ver Figura 2, línea 4 y 6). Al comparar el perfil antigénico de ambas cepas se observó que la expresión de dicho antígeno fue considerablemente mayor en la cepa Nm30. Además, tras su solubilización, el antígeno fue localizado en la fase detergente, lo cual define a priori su carácter hidrófobo. En lo que respecta al resto de antígenos extraídos, en los distintos cultivos de la cepa Nm30 se detectaron antígenos mayoritarios con masas comprendidas entre 67 y 31 kDa, de expresión y solubilidad variable. Algunos de ellos se expresaron mayoritariamente en condiciones de suficiencia de hierro. Al comparar el patrón antigénico de esta cepa con la cepa B16B6 se detectaron antígenos comunes y Resultados - 118antígenos propios de esta última cepa. No obstante, las mayores diferencias corresponden a antígenos localizados en la región de alto peso molecular de la cepa B16B6. Los antígenos de esta última cepa también se caracterizaron por una expresión variable según el medio de cultivo, sin embargo, a diferencia de la cepa Nm30, su solubilización fue esencialmente en la fase detergente. Figura 2.- Patrón antigénico con suero de ratón homólogo anti-OMVs de la cepa Nm30 de las fases acuosa ( lín ea 1, 2 y 3 ) y detergente (l í nea 4, 5 y 6) obtenidas tras la extracc ión con Tritón X114 de OMPs cultivadas en condiciones en medio sólido Choc Iso (Fe ++ ), medio MH (Fe + ) y medio MH y MH/Desferal (Fe - ), respectivamente. Pm, estándar de peso molecular. Fe ++ Fe + Fe - Fe ++ Fe + Fe - Pm 1 2 3 4 5 6  97 kDa 66 kDa 31 kDa 45 kDa 67 kDa 53 kDa 47 kDa 34 kDa 36 kDa 31 kDa        47 kDa Resultados - 119 - Figura 3.- Patrón antigénico con suero de ratón homólogo anti-OMVs de la cepa B16B6 de las fases acuosa (línea 1 y 2) y detergente (línea 3 y 4) obtenidas tras la extracción con Tritón X-114 de OMPs de la misma cepa cultivada en medio sólido Choc Iso (Fe ++ ) y en MH/Desferal ( Fe - ). Pm, estándar de peso molecular. El análisis del revelado de diferentes diluciones de la fase detergente obtenida en los cultivos de restricción de hierro de la cepa Nm30 (ver Figura 4 , 1 ), indicó que la banda de 47 kDa observada tras la reacción con el suero homólogo antiOMVs de la cepa Nm30 se corresponde con un único antígeno, mientras que por ejemplo, la banda de 34 kDa se corresponde con al menos dos. Estos resultados se confirmaro n al someter dicha alícuota y OMVs obtenidas de la misma cepa y en las mismas condiciones a SDS-PAGE, en geles con un gradiente de acrilamida diferente (ver Figura 4 , 2 ). Además, la posterior purificación del antígeno a partir de di ch a alíc uot a y su revelado con suero de ratón anti-O MVs de la misma cepa, puso de manifiesto la ausencia de otros antígenos contaminantes que se pudiesen copurificar durante el proceso (ver Figura 4 , 1 línea 4). Pm 1 2 3 4 Fe ++ Fe - Fe ++ Fe -   97 kDa 66 kDa 31 kDa 45 kDa 139 kDa,128 kDa 112 kDa 104kDa, 101 kDa 67 kDa 47 kDa 39 kDa, 38 kDa 37 kDa, 35 kDa 36 kDa              34 kDa  47 kDa Resultados - 120F i g u r a 4 . - ( 1 ) W e s t e r n b l o t , c o n s u e r o d e r a t ó n h o m ó l o g o a n t i - O M V s d e l a c e p a N m 3 0 , d e d i f e r e n t e s d i l u c i o n e s d e l a f a s e d e t e r g e n t e e x t r a í d a c o n T r i t ó n X - 1 1 4 a p a r t i r d e c u l t i v o s e n M H / D e s f e r a l y s e p a r a d a s e n g e l e s e n g r a d i e n t e d e a c r i l a m i d a d e l 4 a l 1 5 % ( l í n e a 1 : 5 x 1 0 - 2 , l í n e a 2 : 2 x 1 0 - 2 , l í n e a 3 : 1 , 4 x 1 0 - 2 ) ; L í n e a 4 : a n t í g e n o d e 4 7 k D a p u r i f i c a d o . ( 2 ) O M V s o b t e n i d a s d e l a c e p a N m 3 0 c u l t i v a d a e n M H / D e s f e r a l ( l í n e a 1 ) y O M V s o b t e n i d a s d e l a f a s e d e t e r g e n t e ( l í n e a 2 ) r e v e l a d a s c o n u n s u e r o d e r a t ó n h o m ó l o g o a n t i - O M V s d e l a c e p a N m 3 0 y s e p a r a d a s e n g e l e s c o n u n g r a d i e n t e d e a c r i l a m i d a d e l 6 a l 9 % . P m , e s t á n d a r d e p e s o m o l e c u l a r 1 2 P m 1 2 3 4 9 7 k D a 6 6 k D a 4 5 k D a 3 1 k D a 2 1 k D a 3 4 k D a  9 7 k D a 6 6 k D a 4 5 k D a 3 1 k D a 2 1 k D a 3 4 k D a   [ ^ G  k  [ ^ G  k  [ ^ G  k  [ ^ G  k  9 7 k D a 4 5 k D a P m 1 2 6 6 k D a  [ ^ G  k  [ ^ G  k  [ ^ G  k  [ ^ G  k  Resultados - 121 - Una vez obtenido el suero inmune específico contra el antígeno purificado, éste se utilizó para analizar si el antígeno de 47 kDa detectado en las fases acuosa y detergente se correspondían con la misma proteína. Estos análisis indicaron que ambos fueron reconocidos por el suero anti-P47, y por tanto, se demostró su solubilización parcial, aunque minoritaria, en la fase acuosa de los cultivos en restricció n de h ierro (ver Figura 5 ). Figura 5.- Reacción antigénica del suero de conejo específico anti-P47 con las fases acuosa (línea 1 y 2) y detergente (línea 3 y 4) obtenidas tras la extracción con Tritón X-114 de OMPs de la cepa Nm30 cultivada en medio sólido Choc Iso (Fe ++ ) y en MH/Desferal (Fe - ) Pm 1 2 3 4 97 kDa 66 kDa 45 kDa 31 kDa 47 kD a  97 kDa 66 kDa 45 kDa 31 kDa 47 kD a  47 kD a  Fe ++ Fe - Fe ++ Fe -  G GG G [^Gk [^Gk[^Gk [^Gk G GG G Resultados - 1221.2 Identificación del antígeno de 47 kDa La identificación del antígeno de 47 kDa se realizó mediante la huella molecular de fragmentos peptídicos procedentes de su digestión con tripsina, y posterior análisis por MALDI-TOF (ver Figura 6). La comparación de la secuencia de dichos fragmentos con la de otras proteí nas de secuencia conocida estableció una relación de 10 proteínas similares, cuya semejanza se analizó mediante probabilidad “Mowse Score”. La semejanza de estas proteínas con el antígeno se resume en la Tabla 9 . Figura 6 . Espectro y cota de masas obtenidas por MALDI-TOF de los fragmentos peptídicos resultantes de la digestión tríptica del antígeno de 47 kDa purificado Observado Mr (exp) Mr (calc) Delta Inic-Fin Miss Péptido 1034.60 1033.59 1033.54 0.05 145-153 0 LSQPLADYK 1058.68 1057.67 1057.62 0.05 77-84 1 KLWEILK 1150.64 1149.63 1149.64 -0.00 124-134 1 GKLVVTDSGFK 1157.65 1156.64 1156.61 0.03 262-272 0 EIDALAFPPGK 1203.59 1202.59 1202.55 0.04 349-358 1 TKDGFETYDK 1413.87 1412,87 1412,84 0,03 314-325 0 IVDLFRPLIEAK 1441,96 1540,95 1540,93 0,02 313-325 1 IVDLFRPLIEAK 1544,84 1543,84 1543,81 0,03 273-288 0 VVGGASELIEEVAGSK 1735,93 1794,92 1734,92 0,00 232-246 1 IEYALWVEKDVSGVK 1797,00 1795,99 1795,98 0,01 366-382 0 ALQASINALAEDLAQLR 1883,88 1882,87 1882,83 0,04 296-312 0 YSH TD L SD FQ AN VDG SK 1928,98 1927,97 1927,97 0,01 85-102 1 GVMVVDERENIAPGLSDK 1944,99 1943,98 1943,96 0,02 85-102 1 GVMVVDERENIAPGLSDKM 2027,05 2026,04 2026,06 -0,02 196-213 0 IEPIAELFSELDPVIDAR 2052,01 2051,01 2051,01 0,00 126-144 1 LVVTDSGFKDTANEADLEK 2670,25 2669,24 2669,18 0,06 289-312 1 I SGEED RYS H TD LSDF Q ANVDG SK - Resultados - 123 - Tabla 9.- Semejanza entre proteínas identificadas, secuenciadas y anotadas en el “ GenBank ” y los péptidos digeridos del antígeno de 47 kDa de la cepa N. meningitidis Nm30 Nº identificativo Masa (kDa) Puntuación Descripción / especie 01. gi |15675975 42,3 203 proteína hipotéticamente conservada ( N. meningitidis ) 02. gi |15793298 42,4 168 probable lipoproteína ( N. meningitidis) 03. gi |11877796 10,4 55 maturasa ( Voyriella parviflora ) 04. gi |15232144 16,0 54 proteína de expresión (A rabidopsis thaliana ) 05. gi |18977088 31,4 51 3-hydroxyisobutyrate dehidrogenase ( Pyrococcus sp ) 06. gi |28378220 7,5 50 probable regulador de la transcipción ( Lactobacillus p ) 07. gi |45515464 10,2 50 COG2924 proteína protectora de cluster ( Ralstoni sp ) 08. gi |19076014 78,2 50 probable metalopeptidasa ( Schizosaccharomyces sp ) 09. gi |38346484 122,8 49 OSJNBa0021f22.17 ( Oriza sativa ) 10. gi | 18655670 169,4 48 Cadena A de Desoxy hemoglobina Las características de las dos proteínas con mayor similitud con el antígeno de 47 kDa, según la información actualmente disponible en las bases de datos del “GenBank”, son las siguientes: » gi|1567 5 9 75: proteína h ipo tétic amen t e conservada presente en la cepa Neisseria meningitidis MC58 (serogrupo B). Locus= NP_ 273101; NMB0035; codificada por NC003112.1:33283..34449 Gen = 902138 Resultados -124 - » gi|15793298: probable lipoproteína presente en la cepa Neisseria meningitidis Z2491 (serogrupo A) Locus=NP_283120; NMA0281; codificada por NC_003116.1:266408. 267574 Gen= 906289 La proteína designada como gi:|15675975 mostró un grado de similitud significativamente mayor con el antígeno de 47 kDa (p<0,05) que la proteína gi: |15793298. Sin embargo, la equivalencia de la secuencia aminoacídica de ambas proteínas y su correspondencia en peso molecular indican que se trata de la misma molécula, correspondiéndose con el antígeno de 47 kDa. La información disponible para esta molécula en la citada base de datos señala que se trata de una proteína periplasmática implicada en el transporte de hierro (COG 2822), perteneciente al grupo de proteínas metabólicas y de transporte de iones inorgánicos. 1.3 Contexto genómico de la proteína P47 El gen p47 se ubica en la cepa N. meningitidis Z2491 (denominado NMA0281) entre los nucleótidos 266408 y 267574 y se encuentra flanqueado por los genes denominados NMA0280, extremo 3´, y NMA0282, extremo 5´ (ver Figura 7). El primero codifica para una proteína integral de 279 aminoácidos perteneciente a la familia de proteínas FTR1, implicadas en el metabolismo del hierro (COG 4280), y con dominios similares a una permeasa con elevada afinidad por iones Fe+2 y Pb+2. El gen NMA0282, separado del gen p47 por una región no codificante compuesta por 262 pb, codifica para una proteína hipotéticamente conservada de 421 aminoácidos, perteneciente a la familia de las peroxidasas tipo Dyp (COG 2837). La disposición de los tres genes es similar en la cepa N. meningitidis MC58 también disponible en el “GenBanK” (denominados como NMB0034-NMB0035- Resultados - 125 - NMB0036, respectivamente) y en la cepa de N. lactamica secuenciada por el Sanger´s Institute. La cepa N. gonorrhoeae FA1090 presenta la misma disposición para los genes p47 y NMA0282 igual que N. meningitidis y N. lactamica ( denominados NG02050 y NG02051, respectivamente), aunque carece del gen correspondiente al NMA0280. La comparación de la secuencia nucleotídica de los genes indicados mediante alineamientos indica un alto grado de similitud entre ellos y entre las proteínas resultantes. Figura 7 .- Ubicación del gen p47 (denominado NMA0281) según el mapa genómico de la cepa Neisseria meningitidis Z2491 disponible en el “ GenBank ” p47 Mapa genómico de la cepa Z2491 Disposición de los locus situados entre los nucleótidos 245297-283827 Resultados -132 - 3.2 Reactividad contra proteínas de la membrana externa en condiciones nativas La reactividad del suero anti-P47 con la proteína en condiciones nativas en dot blotting se realizó utilizando diferentes diluciones del mismo con el fin de determinar las diferencias de antigenicidad entre las cepas. Como indica la Figura 12,1, se observa una mayor heterogeneidad entre las distintas cepas de N. meningitidis con respecto a la obtenida frente a la proteína desnaturalizada (ver Figura 10), pero no así entre las Neisserias comensales. Estas diferencias de reactividad fueron observadas independientemente de la dilución del suero utilizada, mostrando cepas muy reactivas (N. meningitidis M7, Nm9 o Nm63, entre otras) y otras muy poco reactivas (N. meningitidis Nm62, Nm70 y NmP19). En los ensayos realizados con el suero de conejo anti-OMVs de la cepa Nm30 (Figura 12,2) se observa una mayor homogeneidad con todas las cepas de N. meningitidis, excepto con las cepas NmP19 y Nm70, cuya reacción con las mismas al igual que con el suero anti-P47 es más débil. Al contrario de lo que ocurrió con el suero anti-P47, se observó una mayor heterogeneidad en la respuesta de las Neisserias comensales. Resultados -133 - $  01   01 .!/    +*     -           $()(*+   Resultados -134 - 3.3 Ensayos de accesibilidad de la proteína P47 en dot blotting Con el fin de analizar si la heterogeneidad del suero anti-P47 observada en dot blotting era producto de la exposición diferencial de la proteína en la superficie del microorganismo, se realizaron ensayos utilizando cepas con distinta intensidad de reacción (ver Mat y Met. apdo. 6.2). Para valorar dicha exposición se enfrentó el suero con las células sometidas previamente a diferentes tratamientos: ØFijación con formaldehído ØPermeabilización con etanol y posterior fijación con formaldehído ØFijación con formaldehído y posterior permeabilización con vapores de cloroformo En la Figura 13 se exponen las diferencias en la reactividad de las células permeabilizadas con etanol o vapores de cloroformo en relación con la observada con las células enteras formalinizadas. La permeabilización celular con cloroformo (Figura 13,1) no incrementó significativamente la reactividad de los sueros. Tras la permeabilización celular con etanol (Figura 13,2) se observó una reducción en la reactividad del suero con la cepa N. meningitidis NMB y M7 y con las dos cepas de Neisseria lactamica estudiadas NlP3 y NlP9, y un ligero incremento en las cepas N. meningitidis B16B6 y Nm17. Resultados -135 -            &     --         011  1-011  1-  a b  a b Resultados - 136 - 4. ANÁLISIS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO 4.1 Optimización del ensayo La puesta a punto del inmunoensayo de fluorescencia indirecto para analizar la reactividad del suero anti-P47, frente a células individuales de poblaciones de N. meningitidis y Neisserias comensales por FCM, se ha realizado evaluando previamente diferentes tratamientos celulares. Inicialmente se valoró el efecto de la composición de las soluciones de bloqueo y diluyente en los inmunoensayos. La solución con Blotto®, pese a evitar las uniones inespecíficas, favoreció la formación de agregados y el crecimiento de otras especies bacterianas, por lo que se utilizó BSA como agente de bloqueo alternativo. Aún así, dicha contaminación permitió valorar la capacidad del suero anti-OMVs de la cepa Nm30 para unirse específicamente a especies del genero Neisseria . El suero, utilizado como control, discriminó correctamente las cepas de N. meningitidis de las otras especies bacterianas contaminantes. Su unión a las células de Neisseria se contrastó por microscopía de fluorescencia. El análisis en FCM se muestra en la Figura 14 . Los dos agentes fijadores valorados en los ensayos mostraron, tal como se observa en la Figura 15 , que la reacción del suero anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 con estos difirió a diferentes concentraciones de células y en todas las diluciones del suero ensayadas. Se observa una mayor intensidad en las células fijadas con formaldehído que en las fijadas con glutaraldehído de la misma cepa y con ambos sueros. Además, la fijación con este último agente indujo la formación de grandes agregados celulares y, en consecuencia, fue excluida para posteriores ensayos. Resultados - 137 - Figura 14.- Especificidad del suero anti-OMVs de la cepa Nm30 frente a células de N. meningitidis B16B6 fijadas con formaldehído o con glutaraldehído bloqueadas con Blotto® mediante ensayos en FCM.  Poblaciones bacterianas contaminantes;  población bacteriana de Neisseria meningitidis 1 2 3 4 5 N° de células N° de células N° de células Intensidad Relativa de Fluorescencia Intensidad Relativa de Fluorescencia Fijación con formaldehido Fijación con glutaraldehido s u ero no inmune s uero anti - O MVs s u ero no inmune s uero anti - O MVs Figura 15.- Reactividad de diferentes diluciones de los sueros inmunes de conejo anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 con células fijadas con formaldehído (color granate) o glutaraldehído (color verde) de la cepa N. meningitidis Nm30 en ensayos en FCM. ( 1 ) suero no inmune diluido a 1x10 -3 (línea 1, color gris); suero anti-OMVs de la cepa Nm30 diluido 1x10 -3 (línea 2 y 3), 1x10 -4 (línea 4 y 5), 5x10 -5 (línea 6 y 7) 2x10 -5 (línea 8 y 9). ( 2 ), suero no inmune 1x10 -3 (línea 1, color gris); suero anti-P47 diluido 1x10 -3 (línea 2 y 3), 1x10 -4 (línea 4 y 5). La población bacteriana de ensayo fue de 10 7 células 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N° de células Intensidad Relativa de Fluorescencia N° de células Intensidad Relativa de Fluorescencia 1 2 N° de células Resultados - 138 - Los ensayos posteriores realizados para comparar la reactividad de las células sometidas a diferentes tratamientos (ver Mat y Met apdo. 7.1) se indican en la Figura 16 . Se puede observar que la reactividad de las células formalinizadas no varia substancialmente respecto a las células sin fijar o inactivadas por calor y, por lo tanto, dicho tratamiento parece adecuado para medir la reactividad del suero con el resto de las cepas del estudio. Figura 16.- Comparación de la reactividad del suero anti-P47 en ensayos en FCM con células de la cepa N. meningitidis Nm30 sin fijar (color verde), fijadas con formaldehído (color negro) e inactivadas por calor y luego formalinizadas (color azul).La reactividad del suero no inmune (color gris sólido) y anti-OMVs de la cepa Nm30 (color rojo) se determinó con células fijadas con formaldehído. Dilución de los sueros 1x10 -3 . ( 1 ) comparación de células formalinizadas con células sin fijar; ( 2 ) comparación de células formalinizadas con células inactivadas por calor y luego formalinizadas N° de células N° de células Intensidad Relativa de Fluorescencia Intensidad Relativa de Fluorescencia 1 2 Resultados - 139 - Las diferentes condiciones ensayadas para establecer la concentración de células, dilución de los sueros primario y secundario, y la concentración de tinción celular “BacLight TM Bacterial Strains” para los ensayos en FCM, fueron las siguientes: 1x10 7 , 1x10 -3 y 1x10 -3 , respectivamente. No se observaron globalmente diferencias significativas en la reactividad con diluciones menores del suero antiP47 (p<0,05; Mann Withney Tests). 4.2 Distribución de las poblaciones del meningococo con los sueros inmunes La reacción de los sueros anti-P47 y anti-OMVs de la cepa Nm30 dio lugar a diferentes variaciones en los ángulos de refracción (FSC y SSC) en las poblaciones evaluadas respecto a la del suero no inmune. Los tres modelos de distribución poblacional observados se muestran en la Figura 17 con las cepas N. meningitidis Nm30, NMB, Nm62 y Nm9. Se pudieron observar con ambos sueros, bien la formación de agregados celulares debido a la intensa reacción antígeno-anticuerpo (Ejs.: cepa Nm30 y NMB, Figura 17,1 ) o bien, en la mayoría de las cepas una distribución homogénea (Ej.: cepa Nm9, Figura 17,2 ). Además, con una mayor dilución a 1x10 -4 el suero anti-OMVs de la cepa Nm30 se observó un tercer tipo de distribución, en el cual se apreciaron subpoblaciones celulares en función de su reactividad (Ej.: cepa Nm62, Figura 17,3 ). Resultados - 140 - Figura 17.- Modelos de distribución de poblaciones de N. meningitidis tras la reacción con los sueros de conejo en función de la fluorescencia emitida y el ángulo de refracción SSC. ( 1 ) Formación de agregados celulares tras la reacción de la cepa Nm30 con el suero anti-OMVs de dicha cepa y de la cepa NMB con el suero anti-P47 diluidos a 1x10 -3 ; células individuales (flecha granate ) ; agregados celular es (flecha a zul). poblaciones homog éneas tras la re acción de la cepa Nm9 con los sueros anti-OMVs de la cepa Nm30 y anti-P47 diluidos 1x10 -3 .( 3 ) subpoblaciones celulares de diferente reactividad tras la reacción de la cepa Nm62 con el suero anti-OMVs de la cepa Nm30 a dilución 1x10 -4 . Ubicación de las subpoblaciones (flecha negra) 1 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Suero no inmune Suero anti-OMVs Suero anti-P47 SSC (Log) Intensidad Relativa de Fluorescencia SSC (Log) Intensidad Relativa de Fluorescencia Intensidad Relativa de Fluorescencia SSC (Log) SSC (Log) Intensidad Relativa de Fluorescencia Intensidad Relativa de Fluorescencia SSC (Log) Intensidad Relativa de Fluorescencia Intensidad Relativa de Fluorescencia Suero no inmune Suero anti-OMVs 0 1 2 3 4 Intensidad Relativa de Fluorescencia 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 SSC (Log) SSC (Log) 100 101 102 103 104 2 SSC (Log) 3 (2) Resultados - 141 - 4.3 Respuesta cualitativa de las poblaciones a los sueros de conejo La unión específica a las poblaciones celulares se determinó evaluando la reactividad de ambos sueros respecto al suero no inmune a la misma dilución de trabajo, y se expresó en forma de desplazamiento de picos de fluorescencia representándose en gráficos biparamétricos. En la Figura 18 se recogen los casos más representativos. Como puede observarse, al igual que en dot blotting, la reactividad del suero anti-P47 fue diferente en las cepas de N. meningitidis y en las especies comensales. Estos ensayos también indicaron la existencia de heterogeneidad en la unión del suero dentro de las poblaciones y similar entre las cepas analizadas con algunas excepciones, aunque independientemente de su intensidad de reacción. Las cepas N. meningitidis Nm9 y NmP5 mostraron menor variabilidad respecto al resto de cepas y las cepas N. meningitidis Nm30, GLD y Nm22 una variabilidad superior. Como ya habían señalado los resultados del dot blotting, la reactividad del suero anti-OMVs de la cepa Nm30 fue superior a la del anti-P47 en la totalidad de las cepas analizadas, resultante de una mayor cantidad de anticuerpos unidos por unidad celular. No obstante, las características cualitativas de tal reactividad fueron similares a las mostradas por el suero anti-P47, a excepción de un porcentaje minoritario de cepas, como la B16B6 o Nm22 entre otras, en las cuales difirió considerablemente con la del suero anti-P47. También se observó heterogeneidad intrapoblacional pero, a diferencia del suero anti-P47, prácticamente la totalidad de los componentes de cada población de N. meningitidis reaccionaron con el suero. Referencias Bibliográficas -244 - West D, Reddin K, Matheson M y col. 2001. Recombinant Neisseria meningitidis transferrin binding protein a protects against experimental meningococcal infection. Infect Immun, 69 : 1561-1567 Winson MK y Davey MH. 2000. Flow cytometric analysis of microrganisms. Methods, 21:231-240 Wizemann TM, Heinrichs JH, Adamou JE y col. 2001. Use of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against Streptococcus pneumoniae infection. 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