Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero

Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero Marta Conde Fontenla Facultad de Veterinaria Trabajo de Fin de Grado Grado en Veterinaria Año 2017/18 Modalidad del trabajo: Experimental Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 2 Licencia Esta obra pertenece a Marta Conde Fontenla, y está sujeta a la licencia ReconocimientoCompartir Igual 4.0 Internacional de Creative Commons. Para ver una copia de esta licenci a, visite http://creativecommons.org/licenses/by -sa/4.0/ Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 3 RESUMEN Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero. Las diarreas neonatales constituyen un problema grave y muy frecuente en los terneros lactantes. Se trata de un proceso multifactorial, causado por enteropatógenos bacterianos, víricos o parasitarios, que origina cuantiosas pérdidas económicas directas e indirectas en las explotaciones. Además de las repercusiones sobre la salud de los animales, algunos de los agentes implicados pueden provocar también problemas de Salud Pública. Los objetivos de este trabajo fueron determinar la prevalencia de varios agentes parasitarios (Cryptosporidium spp., Giardia spp y Eimeria spp.) en terneros lactantes con diarrea y establecer la posible influencia de dos variables intrínsecas (edad y consistencia de las heces) sobre el porcentaje de infección y la eliminación media de quistes/ooquistes. Para ello se recogieron 84 muestras fecales de terneros menores de 30 días de edad con diarrea pertenecientes a 48 explotaciones de Galicia. La presencia de coccidios eiméridos se realizó mediante el método McMaster, mientras que la identificación de quistes de Giardia spp. y ooquistes de Cryptosporidium spp. se realizó con una técnica de inmunofluorescencia directa comercial (Aqua Glo G/C), aunque en este caso las formas parasitarias se concentraron previamente mediante una técnica de sedimentación difásica. Además, la presencia de Cryptosporidium spp. se detectó también mediante la tinción negativa de Heine, más rápida y sencilla, y los resultados se compararon con los obtenidos con inmunofluorescencia. En el 64,3% (54/84) de los animales se detectó al menos uno de los parásitos estudiados; Cryptosporidium spp. fue el protozoo más prevalente (54,8%), seguido por Giardia spp. (19,1%) y Eimeria spp. (11,9%). Las infecciones simples fueron más frecuentes (72,2%) que las dobles (22,2%) y las triples (5,6%). La prevalencia de infección por Giardia spp. y Eimeria spp. se incrementó significativamente con la edad de los animales; los porcentajes de infección por Cryptosporidium spp. fueron más elevados en la segunda y tercera semana de vida, pero las diferencias no fueron significativas. El porcentaje de muestras positivas a Cryptosporidium spp. fue superior en las heces líquidas, al contrario que en Giardia spp. y Eimeria spp., pero estas diferencias no fueron significativas. Por último la concordancia entre los resultados de la tinción negativa de Heine y la inmunofluorescencia para la detección de Cryptosporidium spp. puede considerarse débilmoderada; sin embargo, cuando las heces son líquidas, la tinción de Heine presenta una mejor sensibilidad, pues la concordancia es buena. Palabras clave: Cryptosporidium, Giardia, Eimeria, Terneros, Diarrea neonatal, Galicia Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 4 RESUMO Enteropatóxenos parasitarios implicados na diarrea neonatal do tenreiro As diarreas neonatales constitúen un problema grave e frecuente nos tenreiros lactantes. Trátase dun proceso multifactorial, causado por enteropatóxenos bacterianos, víricos ou parasitarios, que orixinan cuantiosas perdas económicas directas e indirectas nas explotacións. Ademais das repercusións sobre a saúde dos animais, algúns dos axentes implicados poden provocar tamén problemas de Saúde Publica. Os obxetivos deste traballo foron determinar a prevalencia de varios axentes parasitarios (Cryptosporidium spp., Giardia spp y Eimeria spp.) en tenreiros lactantes con diarrea e establecer a posíbel influenza de dúas variábeis intrínsecas (idade e consistencia das feces) sobre a porcentaxe de infección e a eliminación media de quistes/ooquistes. Para elo recolléronse 84 mostras fecais de tenreiros menores de 30 días de idade con diarrea pertencentes a 48 explotacións de Galicia. A presenza de coccidios eiméridos realizouse mediante o método McMaster, mentras a identificación de quistes de Giardia spp. e ooquistes de Cryptosporidium spp. realizouse cunha técnica de inmunofluorescenza directa comercial (Aqua Glo G/C), aínda que neste caso as formas parasitarias concentráronse previamente mediante unha técnica de sedimentación difásica. Ademais, a presenza de Cryptosporidium spp. detectouse tamén mediante a tinguidura negativa de Heine, máis rápida e sinxela, e os resultados comparáronse cos obtidos coa inmunofluorescencia. No 64,3% (54/84) dos animais detectouse alomenos un dos parásitos estudados; Cryptosporidium spp. foi o protozoo máis prevalente (54,8%), seguido por Giardia spp. (19,1%) e Eimeria spp. (11,9%). As infeccións simples foron máis frecuentes (72,2%) cas dobres (22,2%) e as triples (5,6%). A prevalencia de infección por Giardia spp. e Eimeria spp. incrementouse significativamente coa idade dos animais; as porcentaxes de infección por Cryptosporidium spp. foron máis elevadas na segunda e terceira semana de vida, mais as diferenzas non foron significativas. A porcentaxe de mostras positivas a Cryptosporidium spp. foi superior nas feces líquidas, ao contrario que en Giardia spp. e Eimeria spp., mais estas diferenzas non foron significativas. Por último, a concordancia entre os resultados da tinguidura negativa de Heine e a inmunofluorescencia para a detección de Cryptosporidium spp. pódese considerar débilmoderada; sen embargo, cando as feces son líquidas, a tinguidura de Heine presenta unha mellor sensibilidade, pois a concordancia é boa. Palabras chave: Cryptosporidium, Giardia, Eimeria, Tenreiros, Diarrea neonatal, Galicia Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 5 ABSTRACT Parasitic enteropathogens causing neonatal calf diarrhoea Neonatal diarrhoea is a serious and very common problem in nursing calves. This is a multifactorial process, caused by bacterial, viral or parasitic enteropathogens, which results in substantial direct and indirect economic losses in farms. In addition to their impact on animal health, some of the agents involved may cause public health problems. The aim of this work is twofold: first, to determine the prevalence of various parasitic agents, i.e., Cryptosporidium spp., Giardia spp., and Eimeria spp. in nursing calves with diarrhoea, and second, to assess the potential influence that two intrinsic variables, i.e., age and consistency of faeces, may have on the percentage of infection and the average elimination of cysts/oocysts. To this aim, 84 faecal samples were collected from calves with diarrhoea, younger than 30 days of age, from 48 farms in Galicia, Spain. The presence of eimeriid coccidia was determined by means of the McMaster method, while the identification of Giardia spp. cysts and of Cryptosporidium spp. oocysts was carried out with a commercial direct immunofluorescence technique, i.e., Aqua Glo G/C, although in this latter case, parasitic forms were previously concentrated by means of a diphasic sedimentation technique. In addition, the presence of Cryptosporidium spp. was detected by Heine's negative stain, a quicker and easier technique, and the results thereof were compared against those obtained by immunofluorescence. At least one of the parasites studied was detected in 64,3% (54/84) of the animals; specifically, Cryptosporidium spp. was the most prevalent protozoan (54,8%), followed by Giardia spp. (19,1%) and Eimeria spp. (11,9%). Simple infections were more frequent (72,2%) than double (22,2%) and triple (5,6%) infections. The prevalence of infections with Giardia spp. and Eimeria spp. increased significantly with the age of the animals; the percentage of infection with Cryptosporidium spp. was higher in the second and third week of life, but differences were not significant. Unlike Giardia spp. and Eimeria spp., the percentage of samples positive for Cryptosporidium spp. was higher in the liquid faeces, but these differences were not significant. Finally, the concordance between the results for the detection of Cryptosporidium spp of Heine's negative staining and those of immunofluorescence can be considered weak to moderate; when the stools are liquid, however, Heine’s staining is more sensitive, given that the concordance between results is good. Keywords: Cryptosporidium, Giardia, Eimeria, Calves, Neonatal diarrhoea, Galicia Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 6 ÍNDICE 1. Revisión bibliográfica ................................................................................................... 7 1.1. Diarreas neonatales del ternero ............................................................................. 7 1.1.1. Prevalencia e importancia ................................................................................. 7 1.1.2. Agentes etiológicos implicados ......................................................................... 8 1.2. Enteropatógenos estudiados ................................................................................ 10 1.2.1. Cryptosporidium spp. ...................................................................................... 10 1.2.2. Giardia spp. ..................................................................................................... 14 1.2.3. Eimeria spp. .................................................................................................... 18 2. Objetivos ...................................................................................................................... 21 3. Materiales y métodos .................................................................................................. 21 3.1. Toma de muestras ................................................................................................ 21 3.2. Técnicas empleadas ............................................................................................. 21 3.2.1. Tinción negativa de Heine ............................................................................... 22 3.2.2. Técnica de flotación ........................................................................................ 22 3.2.2.1. Identificación específica de ooquistes de Eimeria spp............................... 23 3.2.3. Inmunofluorescencia directa (IFAT) ............................................................... 24 3.3. Análisis de los factores de riesgo ........................................................................ 26 4. Resultados y discusión ................................................................................................ 27 4.1. Prevalencias e intensidad de eliminación ............................................................ 27 4.2. Asociaciones entre los distintos patógenos ......................................................... 31 4.3. Factores estudiados ............................................................................................. 32 4.3.1. Edad de los animales ....................................................................................... 33 4.3.2. Estado de las heces .......................................................................................... 38 4.4. Comparación entre las técnicas empleadas para la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. .............................................................................................................. 42 5. Conclusiones ................................................................................................................ 43 6. Bibliografía .................................................................................................................. 44 Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 7 1. Revisión bibliográfica 1.1. Diarreas neonatales del ternero 1.1.1. Prevalencia e importancia El sector ganadero, como aquellos otros que integran el sector primario, es uno de los pilares fundamentales de la economía de España. En este sentido, en 2017 el sector bovino en nuestro país estaba integrado por 6.727.696 animales, siendo España el sexto país europeo con mayor censo tras Francia, Alemania, Reino Unido, Irlanda e Italia (MAPAMA, 2017). En 2017 había censadas en nuestra comunidad 946.353 cabezas de vacuno, ocupando la segunda posición solo por detrás de Castilla y León. Por tanto, en cuanto a producción lechera, Galicia tiene un importante peso, representando un 42,8% del total de la producción española (MAPAMA, 2017). Desde el punto de vista productivo, es esencial que los ganaderos inviertan en una buena genética, aunque sin descuidar la sanidad y el bienestar, porque de nada sirve poseer animales potencialmente muy productivos si están enfermos. Por ello es especialmente importante que las explotaciones de ganado vacuno presenten unos estándares de sanidad y bienestar elevados para poder competir en el mercado europeo. En este sentido, se ha señalado que la causa que produce mayores pérdidas económicas a las explotaciones de ganado vacuno en la etapa que va desde el nacimiento hasta el destete son los procesos diarreicos (Torsein et al., 2011). Las diarreas neonatales son un problema frecuente y de gran importancia para las ganaderías, pues conllevan notables mermas económicas indirectas derivadas del retraso en el crecimiento y menor ganancia de peso diaria; se estima que los animales que han sufrido un proceso diarreico nunca alcanzarán su máximo productivo, estimándose este retraso del crecimiento en un 18% (García Meniño et al., 2014). Otro aspecto a considerar es la mayor susceptibilidad de padecer otras patologías, como neumonías, que muestran los animales que superan la enfermedad (García-Meniño et al., 2014). Además, también supone ciertos costes directos, que son consecuencia de la administración de tratamientos y, especialmente, de la mortalidad juvenil, pues estos procesos se consideran la principal causa de mortalidad en terneros de menos de un año de edad, pudiendo alcanzar el 75% en animales menores de 3 semanas (González y Astiz, 2005; de la Fuente et al., 1998; Silverlås et al., 2010; García-Meniño et al., 2014). Numerosos estudios realizados en España demuestran la importancia de este síndrome diarreico en el ganado vacuno, con prevalencias muy elevadas que oscilan entre el 57,8% y el 82% (de la Fuente et al., 1998; Quílez et al., 2008; García-Meniño et al., 2014). Además estos procesos pueden tener repercusiones en materia de Salud Pública, pues gran parte de los patógenos relacionados con la aparición de diarrea en terneros neonatos son zoonóticos, Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 8 pudiendo provocar la enfermedad también a los seres humanos (Šlapeta, 2013; Chako et al., 2010; Feng y Xiao, 2011). 1.1.2. Agentes etiológicos implicados La etiología de la diarrea neonatal del ternero es compleja, y sus causas se suelen clasificar como infecciosas o específicas y no infecciosas o inespecíficas. Las primeras, son aquellas producidas por la acción de enteropatógenos bacterianos, víricos o parasitarios, que pueden actuar aisladamente o combinados. Por el contrario, las no infecciosas son consecuencia de errores de manejo, principalmente de carácter nutricional (Tabla 1). Tabla 1. Tipos de diarrea neonatales según su etiología Infecciosas Bacteriana E.coli Salmonella C. perfringens Vírica Rotavirus Coronavirus Torovirus Nebovirus Norovirus Astrovirus Parasitaria Cryptosporidium Coccidiosis (género Eimeria) Giardia Toxocara vitulorum No infecciosas Nutricional Cambio brusco en la cantidad de leche (empachos) Fallo-deficiencia en cantidad-calidad del lactorreemplazante Fallo de manejo en la administración del lactoreemplazante Fallo en el destete Motora Diarreas leves y benignas Intolerancia a la leche Déficit parcial o total de lactasa Disbiosis yatrogénica: infecciosa secundaria Hipersensibilidad a la proteína de soja en sustitutivos lácteos Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 9 En este trabajo nos centraremos en las diarreas infecciosas, que se consideran enfermedades multifactoriales, pues su aparición depende de la presencia de diferentes variables, que comprenden desde el estado inmunológico hasta el manejo del rebaño. Por este motivo, los agentes patógenos causantes de diarreas en el ganado vacuno se han identificado tanto en animales con signos clínicos como en aquellos sintomatológicamente sanos (CastroHermida et al., 2002; Silverlås et al., 2010), observándose también variaciones entre la duración y momento de aparición de la diarrea en los animales (Fayer et al., 1998). Todo ello complica notablemente el diagnóstico del agente etiológico primario en la práctica clínica, siendo necesario remitir muestras al Laboratorio para identificar el/los enteropatógeno/s implicados. Pueden diferenciarse tres factores implicados en el desarrollo de la enfermedad y que condicionan el curso del síndrome diarreico:  Estado inmunitario La aparición de diarreas se relaciona con un deficiente estado inmunitario del animal (Svensson et al., 2003). Posiblemente, el factor que más influye en la adquisición de una adecuada inmunidad de los terneros es la correcta toma de calostro en las primeras horas de vida, siendo especialmente importantes el manejo durante el encalostrado, así como la cantidad, calidad, tiempo y vía de administración (artificial o natural) (Reschke et al., 2017). En este sentido, adquiere gran importancia el manejo de las madres, pues si se vacunan frente a rotavirus, coronavirus y Escherichia coli, los terneros recibirán una buena inmunidad pasiva frente a estos patógenos, reduciendo la aparición y/o gravedad de los signos clínicos (Svensson et al., 2003; Torsein et al., 2011). Además, ciertas condiciones en los establos, como una inadecuada temperatura, humedad o ventilación, y un mal manejo (hacinamiento, mezcla de lotes de diferentes edades) constituyen factores estresantes para los animales, lo que genera una cierta inmunodepresión y reduce la respuesta del animal frente a las infecciones, y por tanto, favorece la aparición de signos clínicos (Díaz et al., 2014; García-Meniño et al., 2014; Daugschies y Najdrowski, 2005).  Presión de infección La ingestión de un elevado número de patógenos en un periodo corto de tiempo se relaciona con la aparición de diarreas neonatales; por ello, estos procesos son más frecuentes en lugares con limpieza e higiene deficientes (Díaz et al., 2014). La implantación de unas buenas medidas higiénicas, incluyendo un correcto plan de limpieza y desinfección, es esencial a la hora de reducir la contaminación ambiental. La zona de paridera se considera un punto crítico, ya que las madres presentan un incremento de la tasa de eliminación de formas infectantes durante el periparto, favoreciendo la infección de los terneros al poco de nacer (Svensson, 1993; García-Meniño et al., 2014). La desinfección de materiales como camas, cubos, tetinas, etc., y Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 16 explotaciones (García-Presedo, 2012). Por el contrario parecen presentar una cierta sensibilidad a la congelación (Plutzer et al., 2010). Hay distintos factores que influyen en el curso y presentación clínica de la enfermedad (Thompson y Monis, 2012), entre los que destacan la especie y genotipo del protozoo y el estado inmunitario del hospedador, muy relacionado con la nutrición, presencia de infecciones concomitantes y edad de los animales (Castro-Hermida et al., 2007). Tabla 4. Prevalencia de infección por Giardia duodenalis en ganado vacuno en España Zona Prevalencia Autores Galicia 26,6% a 33,3% b (zona costera) 37,8% b (zona interior) (Castro-Hermida et al., 2007) (Castro-Hermida et al., 2011) Aragón 11,7% b (Quílez et al., 1996) País Vasco 1,76-5,29% b (Cardona et al., 2011) Granada 0,2% a (Díaz et al., 1996) a animales > 12 meses b animales < 12 meses Signos clínicos La giardiosis puede cursar con signos clínicos o resultar asintomática; generalmente los animales adultos actúan como reservorios subclínicos para los más jóvenes y ayudan a perpetuar la infección en las explotaciones (Castro-Hermida et al., 2007; Thompson et al., 2008). En terneros está asociada con una diarrea crónica, que presenta una gran morbilidad pero escasa mortalidad (Bowman, 2009). El signo clínico más evidente es la presencia de heces más o menos formadas, de color claro y olor fétido, brillantes por la presencia de grasa y con mucosidad. Es característica la alternancia de períodos de diarrea con defecaciones normales. Además puede observarse deshidratación, apatía, pérdida de peso, anorexia, y retraso en el crecimiento. Carácter zoonótico G. duodenalis es el protozoo intestinal mas común relacionado con enteropatías en humanos, tanto en países subdesarrollados como desarrollados. A nivel mundial se diagnostican alrededor de 280 millones de casos anualmente (Cacciò y Sprong, 2001). Las principales vías de transmisión son la ingestión de agua o comida con quistes, la transmisión directa persona a Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 17 persona, el contacto con ambientes contaminados con quistes, y en menor medida, el contacto con animales (Thompson y Monis, 2012). Las dosis infectivas mínimas son bajas, de entorno a unos 10-100 quistes (Cacciò y Sprong, 2001). Los grupos de riesgo, como en la mayoría de procesos gastrointestinales causados por protozoos, son niños, ancianos y personas con un sistema inmunitario deprimido, como personas positas al virus de la inmunodeficiencia humana, malnutridas o en tratamientos quimioterapeúticos (Soilán, 2014). Por su gran importancia para la salud humana, su genoma se ha estudiado ampliamente, lo que ha permitido detectar 7 genotipos diferentes (A-G) (Tabla 5.). Los genotipos responsables de la mayoría de casos de giardiosis en humanos son el A y el B, aislados también en ganado vacuno. Además, dentro del genotipo A, se han descrito tres subtipos: los subtipos AI y A-II se consideran zoonóticos, mientras que el subtipo A-III, recientemente aislado en terneros lactantes, no parece estar relacionado con infecciones en personas (Feng y Xiao, 2011). En ganado vacuno, además de los genotipos A y B, se ha aislado el genotipo E, exclusivo de diferentes especies de animales domésticos. Tabla 5. Genotipos de G. duodenalis, principal hospedador y carácter zoonótico Genotipo Hospedador Carácter zoonótico A Hombre, primates, roedores, perro, gato, rumiantes domésticos, mamíferos silvestres Si B Rumiantes domésticos, hombre, primates, équidos, perro Si C-D Cánidos Casos puntuales E Rumiantes domésticos, équidos, suidos Casos puntuales F Gato Casos puntuales G Roedores No Múltiples estudios han puesto de manifiesto que el genotipo más frecuente en ganado vacuno es el E: al no considerarse zoonótico, el ganado vacuno no parece constituir una de las principales fuentes de infección para el hombre (Berrilli et al., 2004; Castro-Hermida et al., 2007; Gillhuber et al., 2014). Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 18 1.2.3. Eimeria spp. Este protozoo se clasifica dentro del Phylum Apicomplexa, Clase Sporozoa, Familia Eimeriidae, Género Eimeria. Las especies de este género presentan una distribución mundial, con un elevado grado de especificidad de hospedador, que incluye mamíferos, aves, peces o reptiles (Daugschies y Najdrowski, 2005). Está considerado un parásito intracelular obligado de ciclo biológico directo, con una fase endógena y otra exógena, necesaria para que los ooquistes resulten infectantes; en condiciones de humedad y temperatura adecuadas (18-27ºC) los ooquistes esporulan en el medio. Su principal vía de transmisión es la fecal-oral; cuando un hospedador adecuado ingiere los ooquistes esporulados, éstos se desenquistan en el tracto intestinal, liberándose los esporozoítos que invaden las células epiteliales intestinales. Tras varios ciclos de reproducción asexual o merogonia, el parásito comienza la fase de reproducción sexual o gametogonia. Durante estas fases de multiplicación, Eimeria spp. causa daños importantes en la mucosa intestinal, destruyendo gran parte de los enterocitos, produciendo enteritis a nivel de ciego, colon y partes distales del íleon. Los enterocitos destruidos serán reemplazados por otras células menos especializadas, lo que se traducirá en una menor capacidad para digerir y absorber entre otros, nutrientes, minerales y agua (Daugschies y Najdrowski, 2005; Díaz et al., 2014). La unión de los gametos femenino y masculino resultará en un cigoto, que tras recubrirse con una potente cubierta dará lugar al ooquiste, que saldrá con las heces. Hasta el momento se han identificado en Europa 13 especies de Eimeria que afectan al ganado vacuno (Díaz et al., 2014; Enemark et al., 2015). Todas ellas pueden diferenciarse por la forma y el tamaño de sus ooquistes, que varía mucho; así se han observado ooquistes ovalados, en forma de huevo, redondeados, etc, y los tamaños van desde 49 µm de longitud las más grandes a 11 µm las más pequeñas. Es necesario señalar que no todas tienen una capacidad patógena suficiente para producir coccidiosis clínica. Tan solo cuatro de ellas tienen poder patógeno: E. bovis, E. zuernii, E. ellipsoidalis y E. alabamensis. E. zuernii y E. bovis están consideradas como especies altamente patógenas, provocando signos clínicos a dosis muy bajas, experimentalmente se observó que la dosis mínima para producir signos clínicos tras la exposición a E. bovis era tan solo de 50.000 ooquistes, y se comprobó que al duplicar esta cifra los signos se agravaban considerablemente (Daugschies y Najdrowski, 2005). Por el contrario, E. ellipsoidalis y E. alabamensis son mucho menos patógenas, en el caso de la última son necesarias infecciones con 10-400 millones de ooquistes para que aparezcan signos clínicos El periodo de prepatencia varía entre las diferentes especies de Eimeria. Así E. bovis, E. zuernii y E. auburnensis tienen periodos de prepatencia de hasta 17 días; por el contrario E. Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 19 ellipsoidalis presenta periodos más cortos, de entre 8-10 días (Faber et al., 2002) y E. alabamensis entre 6-10 días (von Samson-Himmelstjerna et al., 2006). Epidemiología Las coccidiosis provocadas por Eimeria están ampliamente extendidas en las explotaciones de ganado vacuno, observándose tasas de morbilidad muy elevadas. Esto puede deberse a que los ooquistes son muy resistentes, rodeados por una gruesa cubierta que les protege de las condiciones adversas del medio; pueden resistir temperaturas de hasta -8ºC y sobrevivir más de un año a 4ºC y en condiciones óptimas hasta 8 meses en el heno, aunque son muy sensibles al calor y a la sequía (Díaz et al., 2014; Daugschies y Najdrowski, 2005). En Galicia se ha observado que las coccidiosis son muy prevalentes en bovinos, encontrándose cifras de entre el 76 y el 81%. En cuanto a las prevalencias individuales encontradas fueron moderadas-altas, oscilando entre el 18% y el 56% (Díaz et al., 2013). En Europa la morbilidad que presenta este parásito es alta, las prevalencias de infección a nivel de explotación oscilan entorno al 78-100% (Klockiewicz et al., 2007; Lassen et al., 2009; Koutny et al., 2012; Enemark et al., 2013; Forslid et al., 2015), mientras que las prevalencias observadas a nivel individual oscilan entre 7-83,67% (Klockiewicz et al., 2007; Stewart et al., 2008; Lassen et al., 2009; Bangoura et al., 2011; Koutny et al., 2012; Enemark et al., 2013; Forslid et al., 2015). Las infecciones en la mayoría de los casos son producidas por varias especies, siendo las más comunes las de 5-6 especies; por el contrario, las monoinfecciones son muy escasas (Enemark et al., 2013). Eimeria spp. parasita bovinos a partir de las 2 semanas de vida hasta adultos, siendo los animales de entre 3 semanas y 6 meses más susceptibles de padecer coccidiosis clínica. Una de las características de este parásito es que los animales que superan la enfermedad desarrollan una cierta inmunidad protectora, que no les deja exentos de volver a padecer coccidiosis, pero les ayuda a disminuir la cantidad de ooquistes presentes en el tracto intestinal (Díaz et al., 2014). Estos animales que adquieren la inmunidad van a excretar una pequeña cantidad de ooquistes a lo largo de su vida, perpetuando las reinfecciones en los rebaños y generando lo que se conoce como estabilidad endémica. Hay varios factores que predisponen a un animal a padecer coccidiosis, destacando el estado inmunitario y nutricional del animal, la presencia de infecciones concomitantes y situaciones estresantes, como el transporte, el cambio de dieta, condiciones ambientales adversas, etc. Otros factores suponen un mayor riesgo de infección, como las condiciones ambientales, temperaturas moderadas-elevadas y humedad alta o precipitaciones abundantes parecen estar íntimamente relacionadas con una mayor excreción de ooquistes por gramo (opg) (Matjila y Penzhorn, 2002). Además, en granjas intensivas, donde es frecuente el hacinamiento Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 20 y la aplicación de medidas higiénico-sanitarias no adecuadas, la presión de infección aumenta considerablemente (Daugschies y Najdrowski, 2005). Con respecto a las infecciones por Eimeria spp. hay que tener en cuenta que no todos los animales que eliminen ooquistes en heces se consideran con coccidiosis; para ello tienen que darse una serie de características, como una presión de infección elevada, presencia de signos clínicos, que los animales no hayan desarrollado todavía una inmunidad protectora y que las especies implicadas tengan carácter patógeno; hay estudios en los que se observaron especies patógenas en animales que no presentaban signos clínicos (Fayer et al., 2000), por tanto, por si solo, este requisito no producirá coccidiosis. Signos clínicos Las infecciones por coccidios del género Eimeria son autolimitantes y generalmente los signos desaparecen cuando cesa la excreción de ooquistes. La coccidiosis subclínica se presenta cuando el animal se infecta con especies poco patógenas, o cuando ingiere dosis bajas de especies con elevada patogenicidad, como E. zuernii y E. bovis; estos procesos pueden ser asintomáticos o caracterizarse por una diarrea leve/moderada. E. zuernii y E. bovis son las especies responsables de provocar coccidiosis aguda, caracterizada por la presencia de diarrea hemorrágica profusa, junto con fiebre, dolor abdominal, tenesmo, deshidratación, anorexia, pérdida de peso, y a veces anemia; se han descrito la aparición de signos nerviosos en infecciones por E. zuernii (Bowman, 2009). Los terneros que sobreviven a una coccidiosis aguda son más susceptibles a padecer otros procesos, y la recuperación puede, en ocasiones, no llegar a ser completa. E. alabamensis, al presentar menor capacidad patógena, provoca una diarrea acuosa sin sangre, deshidratación, debilidad, y pérdida de peso; las tasas de mortalidad son menores y raras en monoinfecciones. Carácter zoonótico Debido a que todas las especies de Eimeria presentan una elevada especificidad de hospedador, este parásito no se considera zoonótico y por tanto no representa ningún peligro para la Salud Pública. Aún así, los daños que ocasiona y la consecuente inmunodepresión que genera, predispone a los animales a otras infecciones, pudiendo tener éstas potencial zoonótico. Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 21 2. Objetivos 1. Determianar la prevalencia de Cryptosporidium spp., Giardia spp., y Eimeria spp. en terneros menores de un mes de edad con diarrea. 2. Identificar las distintas especies de Eimeria implicadas en terneros lactantes con diarrea neonatal. 3. Estudiar la posible relación entre la prevalencia de infección y varios factores intrínsecos como la edad de los animales y la consistencia de las heces. 4. Comparar la sensibilidad entre la tinción negativa de Heine y la inmunofluorescencia directa para la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. 3. Materiales y métodos En este apartado se señala el número y procedencia de las muestras recogidas, así como las técnicas utilizadas para la identificación de las diferentes formas parasitarias y las técnicas estadísticas empleadas. 3.1. Toma de muestras Se recogieron un total de 84 muestras de heces de terneros menores de un mes de edad, procedentes de 48 explotaciones ubicadas en distintos ayuntamientos de la provincia de Lugo (A Fonsagrada, Castroverde, Chantada, Guntín, Monterroso, O Corgo, Ribadeo, Taboada), A Coruña (Cesuras, Mazaricos) y Pontevedra (Rodeiro). Todos los animales incluídos en el estudio eliminaban heces no formadas, que se clasificaron, dependiendo de su consistencia, en pastosas o líquidas. Las heces se recogieron directamente del recto y se transportaron al laboratorio en botes de plástico estéril con tapa de rosca, conservándose a 4ºC hasta su procesado. 3.2. Técnicas empleadas Los objetivos del presente estudio incluyen la detección de los enteropatógenos de etiología parasitaria implicados en los procesos diarreicos de los terneros neonatos, donde se incluyen principalmente Cryptosporidium spp., coccidios del género Eimeria y Giardia spp. Debido a Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 22 que no existe una técnica que permita la identificación de todos estos parásitos y que presente elevados valores de sensibilidad y especificidad, se llevaron a cabo diferentes métodos orientados a la detección de cada patógeno. Así, para la detección de ooquistes de coccidios eiméridos se empleó la técnica de flotación, que también permite identificar otros patógenos menos frecuentes, como Toxocara vitulorum. La presencia de quistes de Giardia spp. se determinó mediante un test comercial de inmunofluorescencia directa (IFAT), mientras que la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. se realizó con dos técnicas: la tinción negativa de Heine y la IFAT, que presenta una sensibilidad mucho mayor que la primera. 3.2.1. Tinción negativa de Heine Esta técnica, descrita por Heine en 1982, es muy empleada para la visualización de ooquistes de Cryptosporidium spp. por su sencillez, rapidez y bajo coste. Para su realización se necesita fucsina básica fenicada, un colorante que teñirá los detritus fecales de rosa sobre los que resaltarán los ooquistes sin teñir, observándose como formas redondeadas de entre 3-6 µm refringentes con una sombra oscura central correspondiente a su cuerpo residual. Un inconveniente de esta técnica es que no es permanete, ya que pasados unos 15 minutos la preparación se deteriora, los ooquistes se secan y se vuelven menos visibles, lo que puede dar lugar a falsos negativos (Potters y Esbroeck, 2010). Para la realización de la técnica se deposita una pequeña gota de heces en un portaobjetos y una cantidad similar de fucsina, se mezclan y se realiza una extensión muy fina, para que la mezcla seque rápido, evitando así que la fucsina tiña los ooquistes; una vez seca se observa al microscopio con aceite de inmersión con el objetivo de 100x. Se contabilizaron todos los ooquistes observados en 20 campos elegidos al azar para realizar una estimación semicuantitativa de la intensidad de eliminación de ooquistes de este protozoo; el recuento medio se expresó en ooquistes por campo (opc). 3.2.2. Técnica de flotación La técnica de flotación es un método que permite concentrar quistes y ooquistes de protozoos, así como huevos de algunos helmintos. Estas formas parasitarias tienen menor densidad que los detritus fecales, por lo que al añadir a la muestra una solución de flotación, se desplazan hacia la parte superior del tubo, concentrándose y separándose de los restos fecales. En este trabajo se empleó la técnica modificada de McMaster, que permite, además, realizar un análisis cuantitativo del número de ooquistes. Para la realización de la técnica se pesaron 3 gramos de heces y se le añadieron 42 ml de agua; tras homogeneizar bien la muestra fecal, se filtró por una malla de 150 µm de diámetro de poro, con el objetivo de eliminar los restos de heces más groseros. El líquido filtrado se Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 23 recogió en tubos, que se centrifugaron a 380 x g durante 10 minutos. Posteriormente se desechó el sobrenadante, se desprendió el sedimento y se le añadió solución salina saturada (densidad=1,19); tras homogeneizar bien el sedimento con la solución de flotación con la ayuda de una pipeta, se llenaron las dos celdillas de la cámara de McMaster para proceder al recuento mediante visualización al microscopio con el objetivo de 100 aumentos. Una vez realizado el recuento de los ooquistes, se empleó la fórmula que se muestra la Figura 1 para obtener los ooquistes por gramo de heces (opg). 𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂 𝑝𝑝𝑂𝑂𝑝𝑝 𝑔𝑔𝑝𝑝𝑔𝑔𝑔𝑔𝑂𝑂 𝑑𝑑𝑂𝑂 ℎ𝑂𝑂𝑒𝑒𝑂𝑂𝑂𝑂 (𝑂𝑂𝑝𝑝𝑔𝑔)=� (𝑛𝑛º 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜)𝑥𝑥 45 𝑚𝑚𝑚𝑚 0,30 𝑚𝑚𝑚𝑚 �/ 3g Figura 1. Ecuación mediante la cual se obtienen los OPG de la muestra estudiada 3.2.3. Identificación específica de ooquistes de Eimeria spp. Todas aquellas muestras que resultaron positivas a coccidios eiméridos mediante flotación, se seleccionaron para su posterior identificación específica de forma individual. Para ello, es necesario realizar un estudio morfométrico de los ooquistes esporulados, que se llevó a cabo siguiendo la técnica descrita por Hendrix en 1999; las heces se depositaron en una placa de Petri y posteriormente se añadió una solución de dicromato potásico al 2,5%. La mezcla se incubó a 20ºC durante al menos 5 días, ya que en este periodo todas las especies de Eimeria que afectan al ganado vacuno suelen haber completado su esporulación; la mezcla se homogeneizó diariamente con una pipeta pasteur, con el objetivo de oxigenarla y permitir así la esporulación de los ooquistes. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, la muestra se introdujo en tubos de 12 ml y se centrifugó a 380 x g durante 5 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el sedimento se homogeneizó con solución de sacarosa de Sheather (densidad=1,27); el tubo se rellenó hasta formar un menisco en la parte superior del mismo, se colocó un cubreobjetos y se centrifugó de nuevo a 380 x g durante 5 minutos. Por último, el cubreobjetos se depositó en un portaobjetos y los ooquistes se observaron al microscopio a 400 aumentos. Para identificar las especies de Eimeria se tuvieron en cuenta una serie de características de los ooquistes, como su tamaño, color, o presencia de diferentes estructuras, descritos en la Tabla 6. Para realizar el análisis morfométrico de los ooquistes es necesario un ocular micrométrico, que permite medir su longitud y su anchura. En este trabajo se identificaron al menos 100 ooquistes por muestra. Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 24 Tabla 6. Características morfológicas de los ooquistes al considerar la especie de Eimeria Especie Forma Tamaño medio (µm) Micrópilo Gránulo polar y/o residuos del ooquiste E. alabamensis Ovoide 19x13 No No E. auburnensis Elongado u ovoide 38x23 Si Si (residuos no) E. bovis Ovoide o subesférica 28x20 Si No E.brasiliensis Elipsoidal 37x27 Si Si (residuos no) E. bukidnonensis Ovoide o con forma de pera 49x35 Si Si (residuos no) E.canadensis Ovoide o elipsoidal 33x23 Variable Si E. cylindrica Cilíndrico o elongada 23x12 No No E. ellipsoidalis Elipsoidal u ovoide 23x16 No No Eimeria pellita Forma de huevo 40x28 Si Si (residuos no) E.subspherica Resdondeada o subesférica 11x10 No No E. wyomingensis Ovoide 40x28 Si No E. zuernii Subesférica 18x16 No No 3.2.4. Inmunofluorescencia directa (IFAT) En el presente estudio se realizó la técnica de la IFAT para la identificación de quistes de Giardia spp. y como test de referencia o Gold Standard para el recuento de ooquistes de Cryptosporidium spp. Las técnicas inmunológicas presentan una alta sensibilidad y especificidad, con valores muy superiores a los descritos en otras técnicas basadas en la observación de muestras teñidas. La inmunofluorescencia se basa en una reacción antígenoanticuerpo; en este caso el anticuerpo, que se unirá con antígenos de superficie de la pared de la Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 25 forma parasitaria, está marcado con un fluorocromo, que emitirá luz fluorescente al ser estimulado con luz ultravioleta. En la actualidad existe una gran variedad de kits comerciales que emplean anticuerpos monoclonales específicos frente a determinados patógenos para evitar reacciones cruzadas. En este trabajo se empleó un kit comercial (Aqua -Glo™ G/C, Waterborne Inc., EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit contiene anticuerpos anti-Giardia y anti-Cryptosporidium, por lo que permite detectar quistes y ooquistes de ambos parásitos en la misma muestra. Una vez realizada la técnica, la muestra se tiene que observar con un microscopio de fluorescencia; los ooquistes de Cryptosporidium spp. se observan como formas redondeadas de aproximadamente 5 µm de color verde manzana intenso con una zona más oscura en su parte central, mientras que los quistes de Giardia spp. son ovalados y de mayor tamaño (aproximadamente 10 µm), también de color verde intenso. Antes de realizar la IFAT, y con objeto de incrementar aún más la sensibilidad de la técnica, se realizó una concentración de las formas parasitarias empleando una técnica de sedimentación difásica con agua destilada y acetato de etilo. Se pesaron 2 gramos de heces en una báscula de precisión, que se homogeneizaron con 20 ml de agua destilada. La mezcla se filtró por una malla de 50 µm de diámetro de poro, y con el filtrado se llenó un tubo de 15 ml, que se centrifugó a 380 x g durante 5 minutos. Posteriormente se eliminó el sobrenadante y el sedimento se homogeneizó con 8 ml de agua destilada y 2 ml de acetato de etilo mediante vórtex. La muestra se centrifugó de nuevo a 380 x g durante 5 minutos, apareciendo cuatro fases: el sedimento en la parte inferior, una capa con restos solubles en agua, una capa de grasa más o menos espesa dependiendo de la muestra, y en la parte superior restos solubles en acetato de etilo. Tras eliminar las tres capas superiores, el sedimento, que contiene las formas parasitarias, se homogenizó bien con 1 ml de agua destilada y se pipeteó a un tubo eppendorf de 2 ml, que se rotuló con lápiz y bolígrafo. Las muestras se conservaron a 4ºC hasta su utilización. Para realizar la técnica IFAT, primeramente las muestras se redujeron a un volumen de 250 µl y se pipetearon 10 µl en un portaobjetos; con un rotulador de silicona se realizó un círculo alrededor de la gota a modo de barrera, permitiendo utilizar un menor volumen de anticuerpo. Una vez seca la muestra, se fijó con 45 µl de metanol y se dejaron secar al aire. Posteriormente se pipetearon 45 µl del reactivo que contiene el anticuerpo marcado con el fluorocromo; es importante extender el anticuerpo con cuidado, y que cubra toda la superficie de la muestra. Por otro lado se prepararon unas cámaras húmedas con placas de Petri, forrándolas con papel humedecido, para evitar la desecación completa de las muestras una vez introducidas en la estufa. Las muestras se depositaron en una estufa a 37ºC durante 30-35 minutos. Una vez trascurrido el tiempo se lavaron con unos 50-100 µl de solución tampón Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 32 Tabla 12. Asociaciones encontradas en los animales estudiados y su prevalencia (%) Tipo de asociación Prevalencia (%) Simple 72,22% Cryptosporidium spp. 87,18% Giardia spp. 7,69% Eimeria spp. 5,13% Doble 22,22% Cryptosporidium spp. + Giardia spp. 58,33% Giardia spp. + Eimeria spp. 25% Cryptosporidium spp. + Eimeria spp. 16,67% Triple 5,56% Cryptosporidium spp. + Giardia spp. + Eimeria spp. 100% Quílez et al. (1996), observaron un menor porcentaje de patógenos en asociación. A pesar de ello, coinciden con este estudio en que Cryptosporidium spp. fue el agente más frecuente en monoinfecciones, y que tanto Giardia spp. como Eimeria spp. presentaron una mayor prevalencia en sinergia con otro patógeno; en el caso de Giardia spp. la mayor prevalencia encontrada fue junto con Cryptosporidium spp., resultado que se explica teniendo en cuenta la edad de los animales. En un estudio realizado con animales más mayores (< 12 meses) la asociación más común resultó la de Giardia spp. con Eimeria spp. (Gillhuber et al., 2014). Los resultados observados para Giardia spp., que son más frecuentes en combinación con otros patógenos, sugieren que la eliminación de un elevado número de quistes, detectables mediante estas técnicas, depende de la presencia conjunta de otro enteropatógeno. Esto podría estar relacionado con el estado inmunitario del animal, de modo que este protozoo necesitaría de la existencia de otro agente que produzca una cierta inmunosupresión en el hospedador para poder multiplicarse. Los reducidos porcentajes de la asociación entre Cryptosporidium spp. y Eimeria spp. puede deberse a un diferente patrón de distribución de la prevalencia al considerar la edad; el porcentaje de infección por Eimeria spp. aumenta considerablemente a partir del día 20 de edad, mientras que el de Cryptosporidium spp. presenta un pico a los 14 días de edad para disminuir paulatinamente hasta llegar a prevalencias muy bajas entorno al día 30 (Gillhuber et al., 2014). 4.3. Factores estudiados En este estudio se analizó la posible asociación de algunas variables intrínsecas (edad y consistencia de las heces) con la presencia e intensidad de eliminación de los protozoos identificados. La existencia de asociaciones estadísticamente significativas entre las variables Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 33 podría resultar orientativo para realizar un primer diagnóstico de campo, permitiendo asociar ciertos patógenos parasitarios con la edad y la consistencia de las heces de los animales. 4.3.1. Edad de los animales Se analizó la posible influencia de la edad sobre la prevalencia y la intensidad de eliminación de quistes/ooquistes de los tres géneros de protozoos detectados en el presente estudio. Para ello se dividieron los animales en cuatro grupos considerando las semanas de vida, quedando un total de 41, 13, 6 y 10 animales respectivamente en cada uno. Cryptosporidium spp. Como se observa en la Figura 4, los porcentajes de infección por Cryptosporidium spp fueron elevados y siempre superiores al 40% en todos los rangos de edad estudiados, aunque las más reducidas se observaron en los animales de menos de una semana de vida. Posteriormente, los porcentajes se incrementaron, observándose el pico de prevalencia en la segunda y tercera semanas de vida. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2= 3,145; p= 0,370). Figura 4. Prevalencias de Cryptosporidium spp. al considerar las semanas de vida de los terneros Estos resultados son similares a los encontrados en diferentes estudios, en los que también se observaron las prevalencias más altas en la segunda y tercera semanas de vida. Quílez et al. (1996) también apreció las mayores prevalencias en animales de 6-15 días de edad (76,7%). La menor prevalencia observada en la cuarta semana de vida coincide con lo observado en otros estudios, y confirma que a medida que los animales crecen y son expuestos a continuas reinfecciones, éstos presenten una menor importancia clínica en los animales. Aunque estos animales mostraron porcentajes inferiores a los de los animales de 7-21 días, estos valores Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 34 fueron superiores a los descritos por otros autores, donde solo el 6,9-11,5% fueron positivos (de la Fuente et al., 1999; Soilán, 2014). Esto puede deberse al escaso número de muestras analizadas en esta franja de edad (n=10). En este trabajo no se encontraron diferencias estadísticas significativas, al contrario que en los estudios anteriormente citados, lo que posiblemente se deba a un escaso número de muestras analizadas y a la falta de homogeneidad entre el número de animales muestreados en cada uno de los grupos. Además, al considerar cada uno de los días de vida de los animales, se observó que el ternero más joven infectado tenía 3 días de edad, lo que, teniendo en cuenta el periodo de prepatencia del parásito, indica que se infectó nada más nacer, dato que coincide con otros estudios (Quílez et al., 1996; Castro-Hermida et al., 2002a). Para estudiar la posible relación entre la edad y la intensidad de eliminación de Cryptosporidium spp., se emplearon tanto los resultados de ooquistes por campo obtenidos mediante la tinción negativa de Heine, como la valoración semicuantitativa tras inmunofluorescencia de muestras concentradas. Los valores de eliminación media de ooquistes y desviación estándar, así como los recuentos máximos y mínimos obtenidos con las dos técnicas se recogen en la Tabla 13. Tabla 13. Intensidad de eliminación de ooquistes de Cryptosporidium spp al considerar la edad, en semanas, de los terneros, mediante tinción de Heine e IFAT Edad Eliminación media Desviación estándar Mínimo (opc) Máximo (opc) Tinción negativa de Heine (opc) 1ª semana de vida 2,99 3,32 0,05 10,4 2ª semana de vida 1,72 1,91 0,05 5,70 3ª semana de vida 0,85 1,021 0,05 2,00 4ª semana de vida 2,10 3,55 0,05 6,20 IFAT (valoración semicuantitativa) 1ª semana de vida 2,944 1,21 2ª semana de vida 3,60 0,5164 3ª semana de vida 3,50 0,577 4ª semana de vida 2,60 0,8944 Al analizar los resultados obtenidos mediante la tinción negativa de Heine, se observó que los animales más jóvenes presentaron la mayor intensidad de eliminación, que disminuyó progresivamente para aumentar de nuevo en la 4ª semana de vida, aunque no se encontraron Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 35 diferencias significativas (χ2= 2,286; p= 0,515). Mediante IFAT se apreció un patrón de eliminación diferente y similar al observado en las prevalencias, pues la intensidad de excreción fue máxima entre la segunda y tercera semana de vida (χ2= 4,052; p= 0,256). En un estudio experimental Castro-Hermida et al. (2002a), observaron que las tasas de eliminación media de ooquistes de Cryptosporidium spp. más altas se encontraban en los primeros 23 días de vida de los animales, y que era entre los días 1-10 donde se registraban las eliminaciones más elevadas. Por otro lado, Soilán (2014), encontró unas tasas similares de eliminación media de ooquistes, en terneros de menos de 21 días con respecto a las observadas en este trabajo mediante IFAT. Otros estudios sitúan también un pico de eliminación a los 10 días de edad (Gillhuber et al., 2014), coincidiendo con los resultados obtenidos con la técnica de referencia (IFAT). Giardia spp. Como se observa en la Figura 5, el porcentaje de animales que eliminaron quistes de Giardia spp. se incrementó progresivamente con la edad de los terneros, siendo la prevalencia significativamente más elevada en los de mayor edad (χ 2 = 10,154; p=0,017). Figura 5. Prevalencia de Giardia spp. en terneros con diarrea al considerar la edad de los animales Los resultados obtenidos coinciden con los observados por la mayoría de autores, que observan un incremento paulatino de la prevalencia de Giardia spp. desde la primera semana de vida hasta los 60-90 días de vida, y una disminución a partir de esa edad (Quílez et al., 1996; Gillhuber et al., 2014). Castro-Hermida et al. (2011) comprobaron que la prevalencia de infección disminuía con la edad, obteniendo las prevalencias más bajas en animales adultos. Al contrario que Huetink et al. (2001) que obtuvieron prevalencias muy reducidas en el primer mes de vida de los terneros estudiados, donde solo un animal resultó positivo (1/112). Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 36 Es necesario señalar que el animal más joven en el que se identificaron quistes tenía tan solo 5 días de edad. Se ha descrito que los animales pueden excretar quistes 3 días tras la ingestión de formas parasitarias (Thompson y Monis, 2012). Además, en un estudio realizado por Guillhuber et al. (2014) el ternero más joven positivo tenía tan solo 3 días. Todo ello implicaría que, en nuestro estudio, el ternero que eliminó quistes con 5 días se infectó durante los dos primeros días de vida. Al estudiar la posible asociación entre la edad y la intensidad de eliminación de quistes de Giardia spp. (Tabla 14) no se apreció un patrón definido, y las diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2= 3,263; ρ=0,353). Tabla 14. Relación entre la intensidad de eliminación de Giardia spp. y la edad, mediante IFAT (valoración semicuantitativa) Edad Eliminación media Desviación estándar 1ª semana de vida 3,0 1,41 2ª semana de vida 1,5 0,71 3ª semana de vida 3,0 1,41 4ª semana de vida 1,750 0,95 Los resultados de eliminación contrastan con los hallados en otros estudios que muestran una eliminación muy reducida en la primera semana, que va incrementándose hasta alcanzar un pico máximo en la segunda semana, para después comenzar a descender (Xiao, 1994); estos animales de mayor edad presentarían prevalencias de infección altas, de en torno al 40-90%, y tasas de eliminación mucho más bajas. La eliminación tan dispar observada en este trabajo puede deberse a la diferencia en el número de animales muestreados para cada grupo de edad, y al patrón de eliminación intermitente de quistes que sigue este protozoo, pudiendo haber obtenido falsos negativos y un sesgo en la intensidad de eliminación. Eimeria spp. Como se observa en la Figura 6, el porcentaje de animales infectados por este coccidio aumentó, por lo general, con la edad, observándose los valores más elevados en los animales de 4 semanas de vida, al igual que en Giardia spp. Estas diferencias fueron significativas (χ2 = 21,26; p < 0,001). La ausencia de animales positivos hallado en los terneros de tres semanas de vida puede deberse al escaso número de muestras obtenidas en este grupo de edad, tan solo seis. Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 37 Figura 6. Prevalencia de Eimeria spp. en terneros con diarrea de Galicia al considerar la edad Los resultados observados concuerdan con los que cabría esperar, ya que las infecciones por coccidios eiméridos son más frecuentes entre las 3 semanas y 6 meses de vida (Díaz et al. 2013) y es normal observar prevalencias elevadas en la cuarta semana de vida. Un hecho difícil de explicar es que el animal positivo más joven tenía tan solo 7 días, se ha registrado un periodo de prepatencia para E. alabamensis de entre 6-10 días (von Samson-Himmelstjerna et al., 2006), lo que podría explicar este hallazgo. Al analizar la influencia de la edad sobre la intensidad de eliminación de ooquistes de Eimeria spp., se observó que, al igual que la prevalencia, los recuentos de ooquistes por gramo de heces aumentaban con la edad (Tabla 15), aunque no se hallaron diferencias estadísticamente significativas (χ2= 1,029; p= 0,598). Los valores de eliminación observados en la primera y segunda semanas de vida corresponden a un único ternero en cada grupo. Tabla 15. Relación entre la intensidad de eliminación (opg) y la edad, mediante la técnica de MacMaster Edad Eliminación media (opg) Desviación estándar Mínimo (opg) Máximo (opg) 1ª semana de vida 450 0 450 450 2ª semana de vida 2.333 0 2.333 2.333 3ª semana de vida 0 4ª semana de vida 6.775 8.498,86 100 21.100 Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 38 Lassen et al. (2009), observaron en terneros menores de 3 meses una eliminación media de 1.119 opg. Otros estudios realizados por Enemark et al. (2013) mostraron una eliminación media de 2.040 opg en animales con edades comprendidas entre 3 semanas y 6 meses de vida. En otros estudios si se observaron diferencias significativas entre la edad y la eliminación media de ooquistes por gramo (Lassen et al., 2009); Koutny et al. (2012) demostraron una asociación negativa entre la edad de los animales y la eliminación media de ooquistes por gramo, pero también observaron que a medida que los animales crecían aumentaba el número de animales que excretaban ooquistes. 4.3.2. Estado de las heces Según los resultados obtenidos de los 84 animales muestreados, 44 presentaban heces líquidas frente a los 40 que presentaron heces pastosas. La relación entre la consistencia de las heces y cada agente estudiado se realizó por separado. Cryptosporidium spp. El porcentaje de muestras positivas a Cryptosporidium spp. fue superior en aquellas de consistencia líquida que en las pastosas (Figura 7). Sin embargo estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2 = 0,158; ρ=0,691). Figura 7. Prevalencia (%) de Cryptosporidium spp. según la consistencia de las heces En numerosos estudios se establecen relaciones estadísticas significativas entre la consistencia de las heces y la prevalencia de infección por Cryptosporidiumm spp. (GarcíaMeniño, 2013; Soilán, 2014); siendo la prevalencia significativamente más elevada en animales Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 39 con heces líquidas. Que no se hayan encontrado diferencias significativas puede deberse al bajo número de muestras analizadas. Sin embargo, las prevalencias observadas en ambos grupos son muy superiores a las encontradas en otros estudios donde se analizaron muestras de terneros lactantes sin diarrea (García-Meniño, 2013; Valderrey, 2017). Al considerar el efecto de la consistencia de las heces sobre la intensidad de eliminación de ooquistes de Cryptosporidium spp., se observó que los recuentos de ooquistes fueron más elevados en las heces pastosas cuando se usó la tinción negativa de Heine, mientras que con IFAT se observó lo contrario (Tabla 16). Estas diferencias no fueron significativas en ninguno de los dos casos (χ2= 0,488; p= 0,485 Heine; χ2= 2,868; p= 0,090 IFAT). Tabla 16. Intensidad de eliminación de ooquistes de Cryptosporidium spp. en terneros con diarrea en Galicia al considerar la consistencia de las heces Consistencia heces Eliminación media Desviación estándar Mínimo Máximo Tinción negativa de Heine (opc) Pastosas 3,01 3,423 0,05 10,4 Líquidas 1,32 1,51 0,05 6,3 IFAT (valoración semicuantitativa) Pastosas 2,727 1,2025 Líquidas 3,280 1,021 La intensidad de eliminación calculada mediante la tinción negativa de Heine fue superior en las heces pastosas, lo que puede deberse a que las heces diarreicas tienen un mayor porcentaje de agua que las pastosas, pudiendo actuar ésta como diluyente, subestimando así el número de ooquistes observados en cada campo. Los resultados obtenidos con la IFAT muestran una mayor eliminación media en animales con diarrea; estas discrepancias pueden estar relacionadas con el proceso de concentración, que aumenta la sensibilidad de la técnica, y a la clasificación semicuantitativa que se realizó. Giardia spp. Se halló un mayor porcentaje de muestras positivas a Giardia spp. entre las heces de consistencia pastosa (25,0%) que en las líquidas (13,6%) (Figura 8), aunque con Chi cuadrado se constató que estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2= 1,755; p= 0,185). Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 40 Figura 8. Prevalencia (%) de Giardia spp. según la consistencia de las heces Los resultados obtenidos concuerdan con el patrón de este agente, ya que es más característica la eliminación de heces más o menos pastosas, así como la alternancia con heces líquidas. Estos resultados coinciden con los descritos por Quílez et al. (1996), donde observaron tasas de infección mayores en animales sin diarrea. Aunque la eliminación media de quistes de Giardia spp. fue moderada independientemente de la consistencia de las heces, la eliminación media fue ligeramente superior en las muestras líquidas (Tabla 17). Con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis se constató que las diferencias no eran estadísticamente significativas (χ2= 0,465; p= 0,496). Tabla 17. Intensidad de eliminación de quistes de Giardia spp., obtenidos mediante IFAT (valoración semicuantitativa), en terneros con diarrea en Galicia al considerar la consistencia de las heces Consistencia heces Eliminación media Desviación estándar Pastosas 2 1,05 Líquidas 2,33 1,03 Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 41 Eimeria spp. Los resultados muestran (Figura 9) que la presencia de ooquistes de Eimeria spp. es más frecuente en heces pastosas (6/40) que en las de consistencia líquida (4/44), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2 = 0,698; ρ=0,404). Figura 9. Prevalencia (%) de Eimeria spp. según la consistencia de las heces Para que un animal qué excrete coccidios tenga diarrea las especeis implicadas tienen que ser patógenas; si por el contrario son especies apatógenas, la eliminación de ooquistes tendría que ser muy elevada y padecer una infección mixta con especies patógenas para observar signos clínicos. Los resultados obtenidos coinciden con lo observado en la mayoría de estudios, en los que los porcentajes de animales que no presentan diarrea son superiores con respecto a los que si la padecen (Lassen et al., 2009; Enemark et al., 2013; Daugschies y Najdrowski, 2005; Forslid et al., 2015). Los recuentos de ooquistes por gramo más elevados se detectaron en las muestras de heces líquidas (Tabla 18), pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (χ2= 0,182; p=0,670). Estos resultados coinciden con los señalados por Enemark et al. (2013), que observó que la presencia de heces líquidas suele estar significativamente relacionado con una mayor eliminación media de opg; además otros autores identificaron una mayor eliminación de opg en heces diarreicas (Bangoura et al., 2011; Koutny et al., 2012; Enemark et al., 2013). Enteropatógenos parasitarios implicados en la diarrea neonatal del ternero 48 ganaderas/#para4 > [consulta: 28 Noviembre 2017] Matjila, P.T.; Penzhorn, B.L. (2002) ‘Occurrence and diversity of bovine coccidia at three localities in South Africa’, Veterinary Parasitology, 104 (2): 93-102. Mendonça, C.; Almeida, A.; Castro, A.; de Lurdes Delgado, M.; Soares, S.; Correia da Costa, J. M.; Canada, N. (2007) ‘Molecular characterization of Cryptosporidium and Giardia isolates from cattle from Portugal’, Veterinary Parasitology, 147(1–2): 47–50. Olson, M. E.; O'Handley, R. M.; Ralston, B. J.; McAllister, T. A.; Andrew Thompson, R.C. 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