Acciones de 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D3 en cáncer de mama y su relación con Pit-1

TESIS DOCTORAL ACCIONES DE 1α,25-DIHIDROXI-3-EPIVITAMINA D3 EN CÁNCER DE MAMA Y SU RELACIÓN CON PIT-1 Mª Efigenia Arias Baltar ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA ANO 2019 AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE Acciones de 1,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D 3 en cáncer de mama y su relación con Pit-1 D. Román Pérez Fernández (director) D. Manuel Macía Cortiñas (director) D Anxo Vidal Figueroa (titor) INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna.Mª Efigenia Arias Baltar, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago., 12 de abril de 2019 D. Román Pérez Fernández (director) D. Manuel Macía Cortiñas (director) D Anxo Vidal Figueroa (titor) DECLARACIÓN DO AUTOR/A DA TESE Acciones de 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D3 en cáncer de mama y su relación con Pit-1 D./Dna. Mª Efigenia Arias Baltar Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De selo caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide coa versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. En Santiago de Compostela, 12 de abril de 2019 ASDO. Mª Efigenia Arias Baltar Mª Efigenia Arias Baltar, declara que no existe ningún potencial conflicto de interés relacionado con la tesis doctoral: “Acciones de 1,α25-dihidroxi-Vitamina D3 en cáncer de mama y su relación con Pit-1”. Santiago de Compostela, abril de 2019 Fdo: Mª Efigenia Arias Baltar Agradecimientos: Al Dr. Novo y al Dr. Macía que me sugirieron que hiciese una tesis, dada su procedencia, esta sugerencia se convirtió para mí en obligación. A Carmen Segura por preocuparse, molestarse y llevarme hasta Román. A Tomás García Caballero por animarme siempre. A Román, por haber permitido que “una clínica” entrase en su laboratorio. Empleó conmigo tales dosis de paciencia y serenidad que incluso dejó de usar en las correcciones sus agudos y sarcásticos comentarios. Los eché en falta. A Isabel Ben Batalla, una persona que admiro por su vitalidad y capacidad de trabajo. Agradezco su colaboración enormemente, su compañia y su amistad. Sin su ayuda no hubiera sido posible. A Juan Sendón que siempre mostró su habilidad para dominar técnicas nuevas y para adaptarse a cualquier trabajo. Agradezco tu contagioso buen humor, tu cariño y los cientos de veces que me echaste una mano. A Samuel, una persona que discreta y elegantementemente representa una autoridad en el laboratorio. Tiene una forma de trabajar envidiablemente efectiva. Se mostró paciente y cariñoso conmigo desde el primer dia hasta hoy. Gracias por todo. Y a los compañeros de otros laboratorios: Marcos Ríos, Pablo Iglesias, Marcos Seoane a Catuxa... no importa lo atareados que estuviesen, siempre dispuestos a colaborar, a intentar solucionarme un problema, a explicarme una vía o a pasar un rato... Si no fuese por la compañía de todos vosotros en el laboratorio no hubiese invertido mi tiempo en este proyecto. Todas estas personas hicieron que la época en la que estuve en el Fisiología fuese una bonita etapa de mi vida que recuerdo nostálgicamente. A mi familia. A mis padres, siempre me sorprende lo orgullosos que están de mis logros, yo también lo estoy de ellos. A las personas a las que esta tesis les robó tiempo de estar conmigo. Especielamente a Noel que no se cansó de recordármelo. A Amil que lo perdona todo al instante. Al resto de mi familia, son muy importantes para mi. A los que no puedo evitar que sigan sigan conmigo: Otilia y Xerome. Resumen El factor de transcripción POU1F1, también conocido como Pit-1, se expresa en la glándula mamaria. Su expresión es mayor en tumores que en mama normal. La elevada expresión de Pit-1 en mama puede ser considerada como un factor pro-tumoral, correlacionándose positivamente su expresión con el desarrollo de metástasis y peor pronóstico en pacientes con cáncer de mama. La 1a,25-dihidoxivitamina D3 (1,25D) disminuye proliferación e incrementa diferenciación celular y apoptosis sobre células de cáncer de mama, por lo que se considera antitumoral. Sin embargo, su uso terapéutico está limitado por la inducción de hipercalcemia. La 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D3 (3epiVD) es un isómero óptico de la 1,25D que posee una actividad biológica semejante a 1,25D pero con menor actividad hipercalcémica. En este trabajo, utilizando líneas celulares de adenocarcinoma de mama humana con o sin sobreexpresión de Pit-1, cultivos primarios de tumores de mama humana y xenoinjertos en ratones inmunodeficientes, evaluamos el efecto de la administración de 3epiVD sola o combinada con quimioterapia sobre la progresión tumoral. Nuestros resultados demuestran que administración de 3-epiVD, tanto de forma aislada como en combinación con cisplatino, inhibe la proliferación celular y el crecimiento tumoral in vivo e in vitro sin inducir hipercalcemia. La actividad anti-tumoral es significativamente mayor en tumores con sobreexpresión de Pit-1. Nuestros datos sugirieren que el tratamiento con 3-epiVD sola o en combinación con cisplatino puede ser eficaz en tumores de mama, y que la expresión de Pit-1 en dichos tumores pudiera emplearse como factor predictor de respuesta a este fármaco. ÍNDICE ________________________________________________________________________ Índice INTRODUCCIÓN….......................................................................................... 1 1, GLÁNDULA MAMARIA Y CÁNCER DE MAMA…............................................. 1 1.1. Anatomía de la mama.......................................................................1 1.2. Cáncer de mama………………………………...............................2 1.2.1. Incidencia, prevalencia y mortalidad…………..................... 2 1.2.2. Biología molecular y oncogénesis……………..................... 3 1.2.3. Factores de riesgo.................................................................. 5 1.2.4. Histología……………………………................................... 7 1.2.5. Estadiaje tumoral………....................................................... 8 1.2.6. Subtipos de cáncer de mama…………..................................9 1.2.7. Tratamiento del cáncer de mama......................................... 12 1.2.7.1. Cirugía………………………………...............................12 1.2.7.2. Radioterapia……………………………………….…..... 13 1.2.7.3. Hormonoterapia…………………………………............ 13 1.2.7.4. Quimioterapia………………………………………....... 15 1.2.7.5. Terapias biológicas……………………………................16 2. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN HIPOFISARIO-1 (PIT-1).................................. 16 2.1. Pit-1 en neoplasias de mama…………………………………...... 17 3. VITAMINA D…………………………………………………………...... 18 3.1. Generalidades………………………………………………….....18 3.2. Vitamina D y cáncer ……………………………..........................22 3.3. Vitamina D y cáncer de mama…………………........................... 23 3.4. Problemas del tratamiento con vitamina D………...…………… 25 3.5. Análogos de vitamina D: 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D3........26 4. RELACIÓN ENTRE PIT-1 Y VITAMINA D...................................................... 28 OBJETIVOS……………………………………………………...................... 31 MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………...... 35 1. CULTIVOS CELULARES……………………..…………………………..... 37 2. PLÁSMIDOS Y TRANSFECCIONES……........................................................ 38 3. ENSAYO REPORTADOR DE LUCIFERASA…….............................................. 39 4. TRATAMIENTOS CELULARES……………………...………………........... 40 5. ESTUDIOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR POR INCORPORACIÓN DE BROMODEOXIURIDINA (BRDU)…………………......................................... 40 6. ENSAYO DE VIABILIDAD/PROLIFERACIÓN CELULAR (MTT).....….............. 41 7. EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNC……………………............. 41 8. PCR Y PCR A TIEMPO REAL (QPCR)………………………..................... 42 9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA Y WESTERN BLOT…………........................... 43 10. ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR……………………………...……......... 44 11. ANÁLISIS DE APOPTOSIS MEDIANTE ANEXINA V……………...…...........45 12. DETERMINACIÓN DE LA CALCEMIA IN VIVO …………………................. 46 13. EXPERIMENTOS DE XENOINJERTOS EN RATONES INMUNODEFICIENTES.... 46 14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO………………………………………..….......... 48 Índice RESULTADOS………………………………………………………….......... 49 1. EXPRESIÓN DE PIT-1 EN LÍNEAS CELULARES DE ADENOCARCINOMA DE MAMA HUMANA………………………………………………….................51 2. EXPRESIÓN DE VDR EN LÍNEAS CELULARES DE ADENOCARCINOMA DE MAMA HUMANA………………………………..…………….......................52 3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE 3-EPIVD CON RELACIÓN A 1,25D……………………………………………..................................... 53 4. EFECTOS DEL TRATAMIENTO CON 1,25D O 3-EPIVD SOBRE LOS NIVELES DE CALCIO EN SANGRE………………………………....................................... 53 5. EXPRESIÓN DE PIT-1 EN LÍNEAS CELULARES DE ADENOCARCINOMA DE MAMA TRAS TRATAMIENTO CON 1,25D Y 3-EPIVD…………........................ 54 6. EFECTO DE 1,25D Y 3-EPIVD SOBRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR……... 55 7. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 1,25D Y 3-EPIVD EN CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA DE MAMA CON Y SIN SOBREEXPRESIÓN DE PIT-1 IN VIVO.56 8. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 3-EPIVD Y QUIMIOTERAPIA SOBRE VIABILIDAD/PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO……………….................... 58 9. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 3-EPIVD Y CISPLATINO SOBRE VIABILIDAD/PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO…………………………....61 10. ESTUDIO DE CICLO CELULAR EN CÉLULAS MCF-7 TRAS EL TRATAMIENTO CON CISPLATINO Y 3-EPIVD. ……………………………………................ 64 11. ESTUDIO DE APOPTOSIS EN CÉLULAS MCF-7 TRAS EL TRATAMIENTO CON CISPLATINO Y 3-EPIVD…………………………………………………..... 65 12. EFECTO IN VIVO DE LOS TRATAMIENTOS CON CISPLATINO Y 3-EPIVD......66 13. ENSAYO MTT EN CULTIVOS PRIMARIOS DE TUMORES DE MAMA TRATADOS IN VITRO CON 3-EPI VD, CISPLATINO O UNA COMBINACIÓN DE AMBOS.......... 68 DISCUSIÓN.......................................................................................................71 CONCLUSIONES.............................................................................................83 BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................87 ANEXOS.......................................................................................................... 103 ANEXO I: COPIA AUTORIZACIÓN COMITÉ ÉTICO DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA....................................................................103 ANEXO II: COPIA AUTORIZACIÓN PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ANIMAL....................................................................................................105 INTRODUCCIÓN ________________________________________________________________________ Introducción 1 1. GLÁNDULA MAMARIA Y CÁNCER DE MAMA 1.1. Anatomía de la mama La mama es una glándula par, situada sobre la pared torácica entre la segunda y sexta costilla y entre el borde esternal y la línea media axilar. Está formada por tejido glandular e intersticial. Las glándulas mamarias están compuestas por 4-18 lóbulos, cada uno de los cuales desemboca en el pezón a través de un conducto galactóforo. Los lóbulos mamarios se subdividen en lobulillos, conformados por epitelio tubular que en su porción más distal forma dilataciones saculares revestidas de epitelio alveolar constituyendo los alveolos mamarios (Figura 1). El epitelio está formado por dos tipos de células: las células epiteliales y las células mioepiteliales, ambas rodeadas de una membrana basal. Las células mioepiteliales están presentes en la porción más periférica de la glándula y tienen origen ectodérmico, poseen miofibrillas y receptores de oxitocina. Durante la lactancia, en respuesta a la estimulación del pezón se libera oxitocina en la neurohipófisis, que estimula la contracción de las células mioepiteliales favoreciendo la eyección de leche. Embriológicamente, el epitelio de la glándula mamaria tiene origen ectodérmico, mientras que el tejido fibroadiposo tiene origen en el mesodermo. En la pubertad, por el efecto de los estrógenos y progesterona, se desarrolla el parénquima y el estroma de la mama, elongándose y ramificándose los ductos hasta alcanzar su estructura adulta. Durante el embarazo, los estrógenos, progesterona y lactógeno placentario estimulan el crecimiento mamario. Tras el parto el descenso hormonal facilita el inicio de la secreción láctea que se mantiene gracias a los efectos de prolactina y oxitocina (Fernández-Cid, A., 2000). Introducción 8 Histológicamente se traduce en la presencia de tres o más capas de células sobre la membrana basal. Se denomina hiperplasia atípica cuando la proliferación es clonal y asocia cambios citológicos y estructurales, como incremento de la relación núcleo-citoplasma, células más redondas y uniformes, y un patrón de crecimiento a veces papilar o cribiforme (Grases, 2003). - Carcinomas in situ: son proliferaciones clonales de células epiteliales atípicas que respetan la membrana basal. Se distinguen dos tipos: ductal y lobulillar. Clásicamente denominados así por el parecido de su patrón de crecimiento a los ductos y lobulillos normales. Los datos científicos indican que ambos tumores se originan en la unidad ductolobulillar terminal y sus patrones de crecimiento reflejan diferencias en las características biológicas de sus células (Kumar et al., 2015). - Carcinomas infiltrantes: se caracterizan por proliferaciones de células epiteliales que sobrepasan el límite de la membrana basal e infiltran los tejidos circundantes. La mayor parte corresponden a carcinomas infiltrantes sin especificación (NST, “No Special Type), que representan un grupo de tumores hetereogéneos no clasificables. El resto pueden clasificarse en subtipos histológicos según sus características morfológicas. La OMS reconoce al menos quince subtipos (lobulillar, tubular, mucinoso, medular, micropapilar, metaplásico, etc…) (Kumar et al., 2015). A los tumores infiltrantes se les asigna un grado tumoral según sus características morfológicas microscópicas. Se valora la formación de túbulos, pleomorfismo nuclear e índice mitótico y según estas características se asigna un grado histológico 1, 2 o 3 (Elston et al. 1991). 1.2.5. Estadiaje tumoral Los tumores de mama se estadifican siguiendo la exploración clínica al diagnóstico y según los hallazgos anatomopatológicos una vez intervenidos quirúrgicamente. La clasificación TNM para los tumores de mama, incluye el tamaño tumoral, la afectación ganglionar axilar y/o cadena mamaria interna y la presencia o no de metástasis a distancia. El tamaño tumoral está relacionado con la presencia de metástasis axilares y a distancia y con la supervivencia. La supervivencia a los 5 años es cerca del 99% para tumores menores Introducción 9 de 1 cm, 89% para tumores entre 1 y 3 cm y 86% para tumores entre 3 y 5 cm (Cianfrocca et al., 2004). En relación con el desarrollo de metástasis ganglionares, los tumores de mama pueden diseminarse a las cadenas linfáticas axilar (principalmente) y cadena mamaria interna. La presencia y número de metástasis axilares es un importante factor pronóstico en cáncer de mama. Así el 82 % de las pacientes sin afectación ganglionar está libre de enfermedad a los 5 años del diagnóstico, frente a un 45 % en caso de presentar entre 4 y 12 ganglios metastásicos (Cianfrocca et al., 2004). Clásicamente, el tratamiento del cáncer de mama incluía linfadenectomía axilar en todas las pacientes. Hoy en día se realiza biopsia selectiva del ganglio centinela, de modo que se extirpa solamente el ganglio o los ganglios que representan la primera estación de drenaje de la mama. Esta técnica permite estudiar con más precisión los principales ganglios de la axila y adaptar el tratamiento de la axila a los hallazgos en el estudio de estos ganglios. Esto ha permitido evitar la realización de linfadenectomías axilares en un gran porcentaje de mujeres, a las que este procedimiento no proporcionaba un mejor pronóstico, con los indeseables efectos secundarios que puede acarrear (disminución de la movilidad, linfedema, etc.). Finalmente, en relación con el desarrollo de enfermedad metastásica, la supervivencia a los 5 años en presencia de enfermedad metastásica es tan solo del 23,3% (Maugham, et al., 2010). 1.2.6. Subtipos de cáncer de mama En las últimas décadas se ha hecho patente que el cáncer de mama no es una sola entidad patológica, sino un grupo de entidades con diversos comportamientos moleculares, genéticos, pronósticos y de respuesta al tratamiento. Por esta razón se han propuesto diversas estrategias de clasificación del cáncer de mama para establecer categorías reproductibles que identifiquen algoritmos eficaces de tratamiento en base a características moleculares. En el año 2000 Perou propuso una clasificación en base a un perfil genético de los tumores de mama con implicaciones pronósticas y terapéuticas (Perou et al., 2000). Aunque los diagnósticos genéticos o moleculares son una herramienta diagnóstica elegante, predictiva y eficaz, tienen un elevado coste económico y no están disponibles en todas las instituciones. Se ha intentado, en la práctica clínica, una aproximación a dicha Introducción 10 clasificación a través de marcadores clínico-patológicos como son la expresión de receptores de estrógenos, progesterona, HER2 y Ki-67. Así, se clasifican los tumores según su perfil inmunohistoquímico en luminal A, luminal B, HER2 o triple negativo (Goldhirsch et al., 2013) (Figura 4). Esta clasificación tiene implicaciones pronósticas y se emplea para la selección del tratamiento óptimo en cada caso individual de cáncer de mama. Los subtipos luminales A y B expresan genes de un modo similar al epitelio de la mama y representan los tumores que se denominan clínicamente “receptor de estrógenos positivo”. La nomenclatura luminal se refiere a la similitud en el patrón de expresión génica entre estos tumores y el epitelio luminal de la mama. Ambos son los subtipos más frecuentes, se caracterizan por la expresión de receptores de estrógenos, progesterona y genes relacionados con la activación de los receptores de estrógenos. Sin embargo, existen importantes diferencias tanto a nivel molecular como pronósticas entre los tumores luminal A y B. Los tumores del tipo luminal A implican el 40% de los cánceres de mama, tienne alta expresión de genes relacionados con los receptores de estrógenos, baja expresión de genes relacionados con HER2 y baja expresión de genes relacionados con proliferación. Son el subtipo más frecuente y, en general, conllevan el mejor pronóstico de todos los cánceres de mama (Goldhirsch et al., 2013; Prat et al., 2013; Maisonneuve et al., 2014). Los tumores luminal B presentan una menor expresión de genes relacionados con el receptor de estrógenos, expresión variable de HER2 y mayor expresión de genes relacionados con proliferación celular. Los tumores luminal B tienen peor pronóstico y altas tasas de recurrencia, en relación a los tumores luminal A. Los tumores luminales B se subclasifican según presenten sobreexpresión o no de HER2 como “luminal B HER2 positivo” o “luminal B HER2 negativo”, puesto que los primeros se benefician de tratamientos específicos dirigidos contra esta vía de señalización (Goldhirsch et al., 2013; Prat et al., 2013; Maisonneuve et al., 2014). Los tumores HER2 positivos son tumores con sobreexpresión de genes relacionados con esta vía de señalización y baja expresión de genes relacionados con los tumores luminales y basales. Por esta razón estos tumores frecuentemente son negativos para receptores de estrógenos y progesterona, y positivos para HER2. Pero el subtipo molecular “enriquecido en HER2” no es sinónimo del subtipo inmunohistoquímico HER2. Mientras Introducción 11 que la mitad de los tumores HER2 son genéticamente tumores HER2 enriquecidos, la otra mitad puede incluir cualquier subtipo molecular, mayoritariamente luminal B HER2 positivo (Goldhirsch et al., 2013; Prat et al., 2013; Maisonneuve et al.,2014). Los tumores que no expresan receptores de estrógenos, progesterona ni HER2 se denominan triples negativos y se relacionan con carcinomas de alto grado que tienden a tener peor pronóstico que otros subtipos. Carecen de tratamiento específico, pero se caracterizan por su alta sensibilidad a la quimioterapia (Goldhirsch et al., 2013; Prat et al., 2013; Maisonneuve et al., 2014). Figura 4. Subtipos clínico-patológicos de cáncer de mama (Goldhirsch et al., 2013; Prat et al., 2013; Maisonneuve et al., 2014) Luminal A RE y RP positivos (≥20%) HER2 negativo Ki-67 bajo (menor del 14%) Bajo riesgo de recurrencia basado en perfiles de expresión genética (si disponible) Luminal B (HER2 negativo) RE positivos HER2 negativo y al menos uno de: Ki-67 alto (mayor o igual 14%) RP menor del 20% Alto riesgo de recurrencia basado en perfiles de expresión genética (si disponible) Luminal B (HER2 positivo) RE positivos Cualquier nivel de expresión de Ki-67 Cualquier nivel de expresión de RP HER2 sobreexpresado o amplificado HER2 positivo (no luminal) HER2 sobreexpresado o amplificado RE y RP ausentes Basal-like/Triple negativo (ductal) RE y RP ausentes HER2 negativo Introducción 12 1.2.7. Tratamiento del cáncer de mama El tratamiento del cáncer de mama abarca cirugía, radioterapia, hormonoterapia, quimioterapia y terapias biológicas. La selección de la combinación de estos tratamientos depende de las características del paciente, estadio y tipo tumoral. 1.2.7.1 Cirugía La cirugía clásica del cáncer de mama era la mastectomía (extirpación total de la mama) si bien en la actualidad se ha demostrado que la cirugía conservadora de la mama (extirpación del tumor con márgenes de tejido sano) seguido de irradiación tiene una supervivencia comparable a la mastectomía. Existen condiciones que indican mastectomía como son enfermedad multicéntrica, antecedente de irradiación sobre la mama (como puede ser radioterapia mediastínica por enfermedad de Hodgkin), mala relación entre el tamaño de la mama y el tumor, presencia en pruebas de imagen de microcalcificaciones en un área muy extensa de la mama o imposibilidad de administrar radioterapia (Maughan et al., 2010). Clásicamente la extirpación de los ganglios axilares (linfadenectomía axilar) se ha considerado el gold standard del manejo de la axila en el cáncer de mama. Este tratamiento permitía un buen control de la recidiva local y ofrecía información sobre el estado de los ganglios axilares, que es un importante factor pronóstico y útil para la selección de tratamientos adyuvantes. Pero la linfadenectomía axilar es un procedimiento con importantes efectos secundarios como linfedema y restricción de la movilidad del hombro. Actualmente la biopsia selectiva del ganglio centinela es el tratamiento estándar de las pacientes sin metástasis ganglionares clínicas. En estas pacientes, el análisis anatomopatológico del ganglio centinela ha demostrado ser capaz de identificar el estado de los ganglios axilares con menos complicaciones que la linfadenectomía axilar. De modo que las pacientes con ganglios centinela negativos no precisan linfadenectomía axilar. Las pacientes con dos o menos ganglios centinela positivos sin afectación extracapsular que recibirán terapia adyuvante sistémica y a las que se le ha realizado cirugía conservadora de la mama no presentan peor supervivencia si se omite la linfadenectomía axilar (estudio Introducción 13 ACOSOG Z0011, Giuliano et al., 2010). Las pacientes con ganglios axilares clínicamente positivos se benefician de la combinación de cirugía y radioterapia axilares. Las pacientes con ganglios clínicamente negativos pero positivos en biopsia de ganglio centinela no incluidos en los criterios del ACOSOG Z0011 se benefician de linfadenectomía axilar o radioterapia axilar (Zhang et al., 2016). 1.2.7.2. Radioterapia La radioterapia en cáncer de mama se emplea en distintos campos, dosis y esquemas según el tamaño del tumor y la afectación axilar. La cirugía conservadora de la mama se acompaña generalmente de irradiación de toda la mama con sobreimpresión sobre el lecho tumoral. En pacientes mastectomizadas con tumores mayores de 5 cm y/o presencia de metástasis ganglionares axilares puede estar indicada la irradiación del lecho de mastectomía (pared torácica) con o sin irradiación axilar y supraclavicular. La indicación de irradiación de la axila es clara cuando se presentan cuatro o más ganglios axilares metastatizados, y en algunos casos en que los que hay entre uno y tres ganglios afectados (Jagsi, R., 2014). 1.2.7.3. Hormonoterapia Los tumores con receptores de estrógeno (RE) positivo pueden tratarse con fármacos que inhiben esta vía de señalización. Para ello se dispone de diversos compuestos que actúan por distintos mecanismos: - Supresión de la actividad ovárica. En pacientes premenopáusicas con tumores RE positivos el bloqueo de la actividad ovárica con análogos de GnRH (también mediante ooforectomía o radioterapia) mejora la supervivencia libre de enfermedad en mujeres menores de 50 años. - Moduladores selectivos de los receptores de estrógenos. El tamoxifeno actúa como un agonista no esteroideo parcial en algunos tejidos como hígado, útero y hueso, pero es un inhibidor competitivo del receptor de estrógenos de mama y cerebro. Es el fármaco de este grupo más empleado en cáncer de mama. El tratamiento con tamoxifeno durante 5 Introducción 14 años en mujeres con cáncer de mama y RE positivos aporta una reducción de la mortalidad del 20% en la odds ratio anual. El tratamiento extendido durante 10 años ha mostrado una discreta reducción en las tasas de recurrencia y mortalidad a largo plazo, por lo que actualmente se recomienda en mujeres preo perimenopáusicas (Lumachi et al., 2015). - Reguladores selectivos del receptor de estrógenos. Fulvestrant es el principal representante de este grupo de fármacos. Es un regulador de los receptores de estrógenos, de modo que causa regulación a la baja y degradación de estos receptores. Se emplea en cáncer de mama avanzado y en segunda línea de tratamiento para tumores resistentes a tamoxifeno (Lumachi et al., 2015). - Inhibidores de aromatasa. El enzima aromatasa (CYP 450 19) cataliza la conversión de andrógenos en estrógenos. En ausencia de actividad ovárica (mujeres menopáusicas o tratadas con análogos de GnRH) la principal fuente de estrógenos es la conversión periférica de andrógenos sintetizados en ovario. Así, el boqueo de la actividad aromatasa es una forma de reducir los niveles de estrógenos en estas mujeres. De acuerdo a su mecanismo de acción hay dos tipos de inhibidores de aromatasa: tipo I o inhibidores esteroideos permanentes de la actividad aromatasa (exemestano) y tipo II o inhibidores no esteroideos que inhiben reversiblemente la actividad aromatasa (anastrozol y letrozol)(Lumachi et al., 2015). Es frecuente que los tumores RE positivos desarrollen resistencia al tratamiento hormonal. Se han estudiado diversos fármacos para tratar de revertir esta situación: - Inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas 4/6. Palbociclib es una molécula de este grupo farmacológico que mostró disminuir la progresión tumoral cuando se asociaba a letrozol en tumores de mama avanzados. Es un tratamiento aprobado como tercera línea de tratamiento en pacientes seleccionadas con tumores avanzados RE positivos. - Moduladores epigenéticos de la histona deacetilasa. Han mostrado experimentalmente inducir apoptosis en células de cáncer de mama resistentes a tamoxifeno. - Inhibidores de mTOR. Es frecuente que mutaciones en la vía PI3K/AKT/mTOR medien la resistencia a hormonoterapia en cáncer de mama. Por ello se han diseñado fármacos que tienen como diana esta vía, como el everolimus. En pacientes con cáncer de Introducción 15 mama avanzado, resistentes a inhibidores de aromatasa y tamoxifeno, everolimus puede retrasar la progresión tumoral cuando se añade a exemestano. 1.2.7.4. Quimioterapia El tratamiento citotóxico se emplea en tumores de mal pronóstico o en los que se estima ofrecerán un beneficio neto en la supervivencia de la enfermedad. Adyuvant on line es un programa informático que pretende ayudar a profesionales y pacientes a estimar el riesgo de recurrencia de la enfermedad según factores clínico-patológicos en ausencia y presencia de tratamiento quimioterápico, el beneficio en cuanto a riesgo de tratamiento de la terapia sistémica, así como la probabilidad de efectos secundarios. La edad del paciente y la presencia de comorbilidades son factores a tener en cuenta en la indicación o selección del tratamiento citotóxico. Son tratamientos no exentos de efectos secundarios, por lo que se trata de evitar el sobretratamiento. Por esto existe mucho interés en el desarrollo de herramientas que permitan conocer la tasa de respuesta de un tumor a quimioterapia o su pronóstico, evitando así tratar a pacientes con bajas tasas de recidiva con tratamientos tóxicos. Las pacientes con tumores HER2 puros generalmente recibirán quimioterapia concomitante al tratamiento anti HER2. Las pacientes con tumores triple negativos generalmente recibirán quimioterapia dado que no disponemos de otros fármacos específicos para su manejo. Son las pacientes con tumores que expresan receptores de estrógenos y que se tratarán con hormonoterapia en las que mayor interés tiene la estimación del beneficio de la quimioterapia. Estas pacientes se tratarán con hormonoterapia, con una tasa de recidiva variable, interesa estratificar por grupos de mujeres que tendrán una tasa de respuesta a hormonoterapia tan buena que la quimioterapia no añade ningún beneficio al tratamiento, mientras que otras tendrán recidiva a pesar del tratamiento hormonal por lo que el tratamiento adyuvante con quimioterapia puede disminuir sustancialmente la tasa de recidiva (Maughan et al., 2010). Múltiples agentes se emplean en los esquemas de tratamiento del cáncer de mama. Se ha demostrado un ligero beneficio de los regímenes con antraciclinas y taxanos sobre todo en tumores que sobreexpresan HER2 (Maughan et al., 2010). Introducción 16 1.2.7.5. Terapias biológicas Los tumores que expresan HER2 se benefician del tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-HER2 que actualmente se administra en la práctica clínica siempre tras la administración de quimioterapia. El fármaco más conocido y empleado es trastuzumab, ha demostrado mejorar la supervivencia en neoadyuvancia, adyuvancia y cáncer de mama avanzado. La combinación de dos agentes como son trastuzumab y pertuzumab ha mostrado prolongar la supervivencia en cáncer de mama avanzado respecto a un solo agente. TDM-1 es un conjugado de trastuzumab y emtansina de modo que el anticuerpo guía al fármaco al interior de la célula donde se libera. Se ha aprobado para el tratamiento de enfermedad metastásica en segunda y tercera línea (Vorobiof, 2016). Neratinib es un inhibidor de tirosín quinasa que tiene la ventaja de administrarse por vía oral. Se ha probado en pacientes previamente tratadas con trastuzumab en las que ha mostrado una reducción del riesgo de 50% (muerte y recurrencia) con una ventaja de dos años libres de enfermedad respecto a placebo. El inconveniente es que presenta una alta tasa de efectos secundarios (diarrea, fatiga, náuseas y vómitos). Se están estudiando formas de evitar estos efectos secundarios conservando sus efectos beneficiosos (Vorobiof, 2016). Recientemente se ha desarrollado un compuesto biosimilar a trastuzumab, MYL14010 que ha demostrado similar eficacia en cáncer de mama metastásico, efectos secundarios y biodisponibilidad con un costo económico que permitiría su acceso en países con baja renta per cápita (Vorobiof, 2016). 2. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN HIPOFISARIO-1 (Pit-1) Pit-1 es un factor de transcripción perteneciente al grupo de proteínas reguladoras del desarrollo. Consta de un dominio compartido con los factores OCT-1 y -2 y UNC-86 con los que forma el subgrupo denominado POU (Herr et al., 1988). Es un factor crucial para el desarrollo embriológico del lóbulo anterior de la hipófisis. Participa en la proliferación, diferenciación y secreción hormonal de células somatotropas y lactotropas (Lefevre et al., 1987, Nelson et al., 1988). Ratones mutantes, en los que no se expresa Pit-1, muestran Introducción 17 hipoplasia de la hipófisis anterior y enanismo (Li et al., 1990), hecho que destaca la importancia de este factor en la ontogénesis hipofisaria. Es, además, necesario para la transcripción de los genes de hormona de crecimiento (GH), prolactina (PRL) y la subunidad alfa de la hormona estimulante del tiroides (α-TSH) (Haugen et al., 1993, Mangalam et al.,1989). Algunos autores han observado mayor expresión de Pit-1 en tumores hipofisarios respecto a hipófisis normales (Asa et al., 1993, Delhase et al., 1993b, Sanno et al., 1996). Además, se ha asociado específicamente la expresión de esta proteína con mayor índice de proliferación (Castrillo et al., 1991). Activation of cell-specific expression of rat growth hormone and prolactin genes by a common transcription factor 2.1. Pit-1 en neoplasias de mama Se ha demostrado la expresión de Pit-1 en tejidos distintos a la hipófisis, como placenta y tejidos hematopoyéticos (Bamberger et al., 1995, Schanke et al., 1997, Delhase et al., 1993a), en líneas celulares de cáncer de mama (Gil-Puig et al., 2002), mama normal y adenocarcinoma de mama (Gil-Puig et al., 2005). La expresión de Pit-1 está significativamente incrementada en tumores mamarios respecto al tejido normal (Gil-Puig et al., 2002). In vitro, la sobreexpresión de Pit-1 en líneas celulares de adenocarcinoma de mama, incrementa la proliferación celular, disminuye la apoptosis e incrementa la invasión y migración celular (Gil-Puig et al., 2005, Ben-Batalla et al., 2010a). In vivo, la sobreexpresión de Pit-1 en líneas celulares de cáncer de mama inyectadas en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) favorece significativamente el crecimiento tumoral, así como el desarrollo de metástasis pulmonares (Ben-Batalla et al., 2010b). Además, se ha demostrado que Pit-1 favorece el proceso de transición epitelialmesenquimal (EMT), aumentando la expresión de Snail y de marcadores mesenquimales, como vimentina, y disminuyendo la expresión de marcadores epiteliales, como citoqueratinas AE1-AE3, 19 y E-cadherina, facilitando así el desarrollo de metástasis a distancia (Ben-Batalla et al., 2010b). Finalmente, en muestras de pacientes con cáncer de mama y metástasis ganglionares axilares, se ha demostrado una relación negativa significativa entre la expresión de Pit-1 y el intervalo de supervivencia libre de enfermedad Introducción 24 controles mientras que los meta-análisis de estudios prospectivos no se encuentra tal asociación. Puede que el déficit de vitamina D sea común en pacientes obesas y con escasa actividad física que a su vez son factores de riesgo para cáncer de mama, esto explicaría que actuasen como factores de confusión mostrando asociación en los estudios casocontroles. El único estudio prospectivo, randomizado y placebo controlado empleando 400UI diarias no ha mostrado reducción del riesgo de cáncer de mama. Un meta-análisis reciente no ha demostrado asociación entre polimorfismos de VDR e incidencia de cáncer de mama. Por todo ello parece poco probable que exista relación causal entre déficit de vitamina D y riesgo de cáncer de mama (Lu et al., 2016). En el contexto en el que sí hay una asociación sólida con niveles de vitamina D es en pronóstico de pacientes con cáncer de mama. Existe una relación clara y directa entre niveles de calcidiol, mayor supervivencia en pacientes con cáncer de mama y menor tasa de recidiva (Kim et al., 2014, Vrieling et al., 2014). En una revisión retrospectiva el tratamiento con vitamina D (10.000UI semanales) añadido a quimioterapia y trastuzumab en tumores HER2 positivos aumentó el intervalo libre de enfermedad respecto a placebo (Zeichner et al., 2015). En el contexto de tratamiento de cáncer de mama con vitamina D o sus análogos, existen varias líneas de investigación: a) En tumores de mama hormono-sensibles calcitriol ha mostrado regular la actividad aromatasa mediante regulación transcripcional. También se ha demostrado regulación a la baja de la expresión de receptor de estrógenos. El análogo de vitamina D EB1089 ha demostrado devolver la sensibilidad a tratamiento hormonal una vez desarrollada la resistencia al mismo (puede ser mediada por la vía NF-κB) (Zhang et al., 2017). Algunos estudios muestran que la expresión de aromatasa disminuye al tratar ratones portadores de xenoinjertos de MCF-7 con calcitriol, esta regulación se establece a nivel transcripcional. Estos efectos también se lograron con el análogo de vitamina D EB1089. Asimismo, se demostró que indirectamente calcitriol disminuye la transcripción del enzima aromatasa disminuyendo los niveles de prostaglandinas. Por otra parte, el calcitriol regula al receptor de estrógenos a la baja de un modo transcripcional. Calcitriol se ha demostrado actuar como un modulador selectivo de aromatasa, disminuyendo selectivamente la expresión de Introducción 25 aromatasa en cáncer de mama, pero permitiendo la síntesis de estrógenos en otros lugares en los que es deseable como es el hueso (Zhang et al., 2017). b) En tumores con sobreexpresión de HER2. Como se ha mencionado previamente, existen evidencias clínicas que apoyan el beneficio de un suplemento de vitamina D al tratamiento con trastuzumab y quimioterapia (Zeichner et al., 2015). También se ha observado, a nivel experimental que el análogo BXL0124 reduce la señalización de la cascada ErbB-2 en tumores con sobreexpresión de HER2, in vitro e in vivo. c) En tumores triple negativos. En mujeres premenopáusicas diagnosticadas de cáncer de mama los tumores triple negativos se asociaron a menores niveles de vitamina D circulante. Hay estudios que muestran respuesta a análogos de vitamina D en líneas celulares de cáncer de mama triple negativo, aunque en otros ensayos no se evidenció este efecto. Se cree que la diferencia está en la funcionalidad de P53, en células con p53 no funcionante la vitamina D puede tener efecto antiapoptótico (Stambolsky et al., 2010). Se ha evidenciado la inducción de expresión de receptor de estrógenos en líneas celulares triples negativas por lo que podríamos estar ante una nueva estrategia de tratamiento de estos tumores, induciendo sensibilidad a tratamiento hormonal (Zhang, X. et al., 2017). En carcinomas de mama, la expresión del receptor de vitamina D tiene implicaciones pronósticas, de tal modo ha sido propuesto por algunos autores como parte de una clasificación taxonómica de los tumores de mama (Santagata et al., 2014). 3.4. Problemas del tratamiento con vitamina D Con los datos preclínicos disponibles se realizaron varios estudios administrando vitamina D en mielodisplasia y leucemia aguda. Aunque algunos pacientes parecían responder al tratamiento, estos datos no fueron suficientes como para desarrollar ensayos clínicos posteriores, dado que el 20-30% de los pacientes desarrolló hipercalcemia. Por ello surgieron nuevas líneas de investigación con análogos de la vitamina D, que compartan los efectos anti-proliferativos de ésta, pero evitando sus efectos hipercalcémicos (Krishnan et al., 2010). Las manifestaciones clínicas de la hipercalcemia en humanos dependen del nivel de calcio y de la velocidad de instauración. A partir de 12 mg/dl los síntomas son confusión, Introducción 26 astenia, estreñimiento, anorexia, náuseas y vómitos asociados a poliuria y polidipsia. Si las cifras llegan a 14 mg/dl, aparece letargia, debilidad muscular, hiporreflexia y deshidratación por poliuria intensa que puede desencadenar una crisis hipercalcémica, con shock, insuficiencia renal y coma, encontrándose a partir de estas cifras alteraciones en el electrocardiograma (ensanchamiento de la onda T, acortamiento del intervalo QT, bradicardia, bloqueo auriculoventricular y arritmias malignas) que desembocan en la muerte del paciente por parada cardiaca. Otros síntomas que pueden aparecer son pancreatitis aguda, nefrolitiasis, tubulopatía, miopatía, calcificación distrófica, hipertensión arterial, ulcus péptico, depresión y psicosis (Krishnan et al., 2010). Existen estudios en los que la administración de vitamina D a dosis altas elevó las cifras de calcio en suero, aunque no se observaron efectos secundarios importantes. Se desconoce si la administración sostenida de vitamina D puede causar hipercalcemia de difícil control (Beer et al., 2006). 3.5. Análogos de Vitamina D: 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D (3-epiVD) Se han desarrollado numerosos análogos de la vitamina D, algunos de los cuales parecen ser eficaces en modelos experimentales de cáncer de mama, tanto in vivo como in vitro. Algunos de estos análogos son: EB1089, 22-Oxa-1α,25(OH)2D3, 19-nor-14-epi-23yne-1α,25(OH)2D3, 19-nor-14,20-bisepi-2323-yne-1α,25(OH)2D3, 16-ene-23-yne-26,27hexafluoro-1α,25(OH)2D3 y 1α(OH)D5 (Leyssens et al., 2014). Se han realizado hasta la fecha escasos ensayos clínicos en pacientes con cáncer, utilizando calcipotriol y seocalciferol (EB1089). Calcipotriol se utilizó tópicamente en metástasis de cáncer de mama, sin evidencia de efectividad. Los efectos de seocalciferol (EB1089) se ha estudiado en ensayos fase I y II. En el ensayo de toxicidad se trató a pacientes con cáncer de mama y colon avanzado, evidenciándose estabilización de la enfermedad en seis de 36 pacientes durante tres meses. Los ensayos de fase II se realizaron en pacientes con carcinoma hepatocelular y tumores pancreáticos, sin resultados concluyentes con las dosis empleadas. Se ha estudiado paricalcitol en dosis de entre 2 y 7 μg/día en combinación con un régimen quimioterápico basado en taxanos, mostrando buena tolerancia por parte de los pacientes (Leyssens et al., 2014). Introducción 27 La 1α,25 dihidroxi-3-epi-vitamina D3 (3-epiVD) es un isómero óptico de la 1,25D que se forma como consecuencia de un cambio de orientación del grupo hidroxilo del carbono 3, de posición β a α (Figura 8). Es un compuesto presente en el organismo en condiciones normales (Sekimoto et al., 1999). Su síntesis es específica de tejido, así, se ha evidenciado en queratinocitos humanos (Astecker et al., 2000), líneas celulares de neumocitos tipo II (Rehan et al., 2002), en células paratiroideas bovinas (Brown et al., 1999), células de osteosarcoma de rata (Siu Caldera et al., 1999) y células de carcinoma de colon humanas (Bischoff et al., 1997). La epimerización es un tipo de reacción conocida previamente en otros procesos fisiológicos, como, por ejemplo, en el catabolismo de los ácidos biliares (Hylemon et al., 1985) y en la inactivación metabólica de los andrógenos (Penning et al., 1997). Figura 8. Estructura química de la 1,25D (calcitriol) y la 1α,2-dihidroxi-3-epi-vitamina D3 (3-epiVD) Nótese la diferencia en la posición del grupo hidroxilo del carbono 3. 3-epiVD tiene capacidad para unirse al receptor de vitamina D (VDR), aunque con menor afinidad que la hormona nativa (Masuda et al., 2000; Brown et al., 1999; Harant et al., 2000). Estudios realizados en células intestinales de pollo deficiente en 1,25D han demostrado una afinidad de 3-epiVD del 24% respecto a 1,25D (Norman et al., 1993). A Introducción 28 pesar de su menor afinidad por VDR, 3-epiVD mantiene la capacidad de activar a genes regulados por 1,25D por su unión a elementos de respuesta a vitamina D (VDRE) a través de VDR (Rehan et al., 2002; Harant et al., 2000). 3-epiVD se une a la proteína transportadora de vitamina D con mayor afinidad que la propia vitamina D (Masuda et al., 2000, Norman et al., 1993). Hay evidencias de que su metabolismo a nivel celular es más lento que el de 1,25D (Astecker et al., 2000). Tanto la unión estable a la proteína transportadora, como las propiedades cinéticas de su catabolismo, hacen que 3-epiVD tenga una mayor biodisponibilidad que la 1,25D. La actividad biológica de 3-epiVD es significativamente alta a pesar de su menor afinidad por VDR (Astecker et al., 2000). Se ha observado que 3-epiVD es activa en los tejidos en los que es producida in vitro. En neumocitos tipo II estimula la síntesis de surfactante pulmonar (Rehan et al., 2002), inhibe la proliferación de cultivos de queratinocitos (Reddy et al., 2001), inhibe la proliferación de células HL60 (línea celular de leucemia promielocítica humana) (Masuda et al., 2000), induce apoptosis en células HL-60 (Nakagawa et al., 2001), estimula la diferenciación de queratinocitos (Norman et al., 1993), induce la síntesis de osteocalcina en células MG-63 (línea celular de osteosarcoma humano), estimula la absorción rápida de calcio a nivel intestinal (transcalaquia) (Norman et al., 1993), suprime la secreción de hormona paratiroidea en células paratiroideas bovinas (Brown et al., 1999), e inhibe la proliferación de células endoteliales humanas de cordón umbilical con mayor potencia que la 1,25D (Furigay et al., 2004). La 3-epiVD tiene un impacto sobre la movilización de calcio mucho menor que la 1,25D. Así se ha demostrado que estimula la absorción intestinal de calcio y la movilización de calcio desde hueso con una potencia relativa a 1,25D del 1,5 y del 2,8 %, respectivamente (Norman et al., 1993), por lo que constituye una molécula potencialmente útil en el tratamiento de procesos neoformativos. 4. Relación entre Pit-1 y VDR Se han descrito interacciones entre Pit-1 y proteínas nucleares en la regulación de la expresión génica. Por ejemplo, Pit-1 actúa sinérgicamente con el receptor de hormonas Introducción 29 tiroideas y con el receptor de ácido retinoico para incrementar el nivel de expresión de GH (Palomino et al., 1998, Schaufele et al., 1992). Además, la unión VDR/RXR y Pit-1 al promotor de PRL está implicada en la activación transcripcional del gen de PRL en células HeLa (línea celular de carcinoma de cérvix) (Castillo et al., 1999). Al contrario, se ha descrito que las hormonas tiroideas disminuyen la expresión de Pit-1 en células hipofisarias por interferencia con otros reguladores de la transcripción (Sánchez-Pacheco et al., 1995) y que VDR podría actuar como un represor de la señalización de Pit-1 en varias líneas celulares mediante interacciones proteína-proteína entre VDR y Pit-1 (Macias-Gonzalez et al., 2002). Estudios más recientes han demostrado que la administración de 1,25D a células MCF7 (línea celular de adenocarcinoma de mama humana) disminuye tanto el nivel de ARNm como de proteína de Pit-1, a través de unión directa de VDR al promotor de Pit-1 (Seoane et al., 2006). Por otro lado, Pit-1 se une, junto con otros factores de transcripción, como CBP (proteína de unión a CREB: proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc), histona H4 acetilada y la ARN polimerasa al promotor de VDR, incrementando la expresión de esta proteína (Seoane et al., 2007). Existe, por lo tanto, un mecanismo de retroalimentación negativo entre VDR y Pit-1, en el cual Pit-1 incrementa la transcripción de VDR, mientras 1,25D a través de VDR inhibe la transcripción de Pit-1. Esta relación entre VDR y Pit-1 pudiera estar implicada en fenómenos fisiológicos y/o patológicos de regulación del desarrollo mamario, dado que la sobreexpresión de Pit-1 en líneas celulares de adenocarcinoma de mama incrementa los niveles de GH y PRL, estimula la proliferación celular y reduce apoptosis. Además, la expresión de Pit-1 es significativamente mayor en carcinomas de mama respecto a tejidos normales. Por el contrario, 1,25D y sus análogos poseen efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos. Podemos hipotetizar que el equilibrio entre VDR (anti-proliferativo y pro-apoptóticos) y Pit-1 (inductor de proliferación y antiapoptótico) podría romperse en algunas circunstancias, prevaleciendo el segundo y por tanto sus efectos proliferativos y antiapoptóticos favorecedores de la progresión neoplásica (Pérez-Fernández et al., 2007). 30 31 OBJETIVOS ________________________________________________________________________ 32 Objetivos 33 Los objetivos del presente trabajo serán valorar el efecto del tratamiento de un análogo de la vitamina D con baja actividad hipercalcémica, la 1α,25-dihidroxi-3-epi-vitamina D3 (3-epiVD) administrada sola o en combinación con quimioterapia en tumores de mama. Además, se valorará si el efecto antitumoral de este compuesto se correlaciona con la expresión del factor de transcripción Pit-1 en células tumorales. Específicamente, los objetivos de este trabajo son los siguientes: 1. Valorar si 3-epiVD posee efectos antitumorales in vitro en líneas celulares de cáncer de mama 2. Valorar si 3-epiVD posee efectos antitumorales en ratones inmunodeficientes inyectados con células tumorales de mama humana in vivo. 3. Valorar el efecto del tratamiento de 3-epiVD administrada sola o en combinación con agentes quimioterápicos en cáncer de mama. 4. Correlacionar la actividad antitumoral de 3-epiVD administrada con/sin quimioterapia con la expresión de Pit-1 en células tumorales de mama. Material y métodos 40 pCYP24A1-luc (cedido por la Dra. Ana Aranda, IIB, Madrid) o su control vacío pGL2B. Este vector contiene el promotor de la 24-hidroxilasa, CYP24A1, este es un gen diana de la vitamina D. Las transfecciones se realizaron utilizando en reactivo JetPEI (PolyPlus Transfection) y 24 h después las células fueron tratadas con diferentes concentraciones (1111-10-6 M) del análogo 3-epiVD y la 1,25D usada como control positivo durante 24 h. Posteriormente las células se tratan con luciferina (100 mg/L) y se visualiza la bioluminiscencia en un IVIS (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA). Se determina el EC50 para el análogo y para la 1,25D. 4. Tratamientos celulares Para la realización de los tratamientos se emplea medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal libre de hormonas esteroideas. Los tratamientos se realizaron con 1α,25-OH2-vitamina D3 (1,25D) (Sigma-Aldrich) y 3-epivitamina D (3-epiVD) (sintetizada por el grupo del Dr. Mouriño, Departamento de Química Orgánica, Universidad de Santiago de Compostela). Se emplearon a una concentración de 10, 100, 500 o 1000 nM, o etanol absoluto como vehículo durante 48 horas. La doxorrubicina, la gemcitabina, el paclitaxel y el cisplatino (Ferrer Farma, Barcelona, España) se obtuvieron comercialmente y se diluyeron en PBS. 5. Estudios de proliferación celular por incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) Las células MCF-7 se sembraron sobre discos colocados en placas de 24 pocillos. Se transfectaron las células con el plásmido de sobreexpresión de Pit-1 o con el plásmido vacío (grupo control). A las 24 h se realizó el tratamiento con 1,25D (100nM), 3-epiVD (100nM) o excipiente como control. Trascurridas 24 h se lavaron con PBS y se incubaron con una solución 10 µM de BrdU durante 1 h. Se fijaron las células con formaldehido 4% 22 min, 5 min en PBS y toda la noche en metanol. Las células se permeabilizan en 0,07 M NaOH, y se incuban toda la noche a 4ºC con 1:100 anti-BrdU (BD Biosciences, San Diego, USA). Se lavan las muestras 3 veces con PBS y se incuban con el segundo anticuerpo F(ab)IgG FICT (Jackson Inmunoresearch, West Grove, USA) en una dilución 1:150 en PBS y DAPI Material y métodos 41 en una cámara húmeda 45 minutos. Se realiza un lavado con PBS seguido de otro lavado con etanol al 70%. Se colocan los discos en un portaobjetos y se observan en el microscopio de fluorescencia. 6. Ensayo de viabilidad/proliferación celular (MTT) El ensayo MTT es un método colorimétrico cuantitativo para valorar la capacidad de supervivencia y proliferación celular. Emplea bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolio que es reducido enzimáticamente por la succinato-deshidrogenasa mitocondrial a azul de formazán. Mediante espectrofotometría se puede cuantificar el sustrato de la reacción y así inferir la cantidad de células viables presentes en la muestra. Para llevar a cabo el ensayo se siembran 25.000 células en una placa de 24 pocillos. Se cultivan durante 12 h y se añaden los diferentes tratamientos durante 48 horas. Entonces se añade la solución de MTT (Merck, Darmstadt, Alemania) a una concentración de 5 mg/ml y se incuba durante 1 hora. Posteriormente se añaden 500 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich) y se realiza la lectura de absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm. El porcentaje de viabilidad se obtiene utilizando como referencia células control tratadas con el vehículo como valor 100% de proliferación. Cuando se emplea una combinación de dos fármacos en el tratamiento, interesa estudiar si dicha combinación presenta un efecto sinérgico, antagonista o simplemente aditivo. Para ello, se calculó el Índice de Combinación (IC), basándonos en el algoritmo descrito por Chou y Talalay (Chou, 2010). Valores de este índice menores de 1 indican sinergismo, mayores de 1 indican antagonismo y valores iguales a 1 indican un efecto aditivo. Los valores se calcularon empleando el programa informático CalcuSyn v2.0 (Biosoft, Ferguson, USA). Se calcularon los índices de combinación de tres experimentos y se calcularon los resultados como la media de los valores obtenidos. 7. Extracción de ARN y síntesis de ADNc Las células en confluencia se recogen con tripsina-EDTA diluida en PBS en relación 1:4. El precipitado obtenido tras la centrifugación de la suspensión celular durante 5 Material y métodos 42 minutos a 700 rpm, se lava con PBS y se centrifuga de nuevo bajo las mismas condiciones. El precipitado se resuspende en TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA). Se precipita con isopropanol, se lava con etanol (75%) y se resuspende en agua destilada a la que se le ha añadido dietilpirocarbonato al 0.1% (DEPC). Una vez disuelto el ARN, su pureza y concentración se determina por absorbancia en un espectrofotómetro Nanodrop (ThermoFisher Scientific, Delaware, USA). Se conserva a -80ºC hasta su posterior procesamiento. El ARN obtenido se retrotranscribe a ADN complementario (ADNc) mediante una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se lleva a cabo en un volumen total de reacción de 30 µl conteniendo 1 µg de ARN total, 6 µl de tampón (5X First Stand Buffer, Invitrogen) conteniendo 50mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 10 mM Mg Cl2, 50 mM DTT, 2 mM de cada deoxinucléotidotrifosfato (dNTP) (Invitrogen), 250 ng de random primers (Invitrogen), 20 UI de inhibidor de RNasas (RNasin, Ribonuclease Inhibitors, Promega, Fitchburg, USA) con 200 UI de transcriptasa inversa (MMLV, Invitrogen). Esta mezcla se incuba a 37ºC durante 50 min, 15 min a 42ºC y 5 min a 95ºC. 8. PCR y PCR a tiempo real (qPCR) Para realizar la PCR se amplifican 5 µl de ADNc en un volumen total de 50 µl. Se usan 2 unidades de Taq ADN Polimerasa (Invitrogen) en 5 µl de tampón, 0.2 mM de cada dNTP (Invitrogen) y 25 pM de cada uno de los 2 oligonucleótidos usados como cebadores. Tras una desnaturalización inicial de 95ºC durante 2 min, las muestras se desnaturalizan 1 min a 95ºC, hibridan 1 min a 58ºC y extienden durante 1 min. Proceso que se repite durante 32 ciclos tanto para Pit-1, VDR o 18S. La PCR a tiempo real cuantitativa (qPCR) permite medir de forma cuantitativa el ADN amplificado. Para realizarla se utilizaron oligonucleótidos específicos diseñados para amplificar Pit-1, VDR o 18S (usado como gen control normalizador). La qPCR se realiza en un termociclador (Realplex, Eppendorff, Hamburgo, Alemania) utilizando el reactivo Luminaris Color HiGreen qPCR Mastermix (Thermo Fisher Scientific). Tras una desnaturalización inicial de 95ºC durante 30 s, las condiciones de amplificación son las Material y métodos 43 siguientes: desnaturalización 15 s a 95ºC, hibridación a 58ºC para Pit-1, VDR y 18S durante 15 s, y extensión 15 s a 72ºC un total de 35 ciclos. Al término de la PCR obtenemos unas curvas de amplificación a partir de las cuales podemos calcular la cantidad de ADN sintetizado. Los niveles de Pit-1 y VDR se normalizan respecto a los niveles obtenidos de 18S usados como control. Secuencia de los oligonucleótidos Pit-1 Sentido: 5´-GTGTCTACCAGTCTCCAACC-3´ Antisentido: 5´-ACTTTTCCGCCTGAGTTCCT-3 VDR Sentido: 5´-GACTTTGACCGGAACGTGCC-3´ Antisentido: 5´- CATCATGCCGATGTCCACAC-3´ 18S Sentido: 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' Antisentido: 5'-CCATCCAATCGCTA GTAGCG-3' 9. Extracción de proteína y Western blot Para realizar la extracción de la proteína se lavan las placas de cultivo tres veces con PBS a 4ºC. Se lisan con tampón de lisis RIPA (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 1.5 mM ClMg2, 1% SDS, 10% glicerol, 1% Tritón X-100), al que se le añadió en fresco 10 mM ortovanadato sódico (NaVO4), 50 mg/ml aprotinina y 4 mM fenilmetilsulfonil fluoride (PMSF) que actúan como inhibidores de proteasas. El homogeneizado se mantiene durante 30 min en hielo, y se centrifuga a 14000 rpm durante 5 min a 4ºC. El sobrenadante que contiene el extracto proteico se cuantifica por el método Bradford. Para los ensayos de Western blot, se toman 60 µg de proteína total a los que se añade tampón de carga (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 2% de ß-mercaptoetanol y azul de bromofenol). Se desnaturaliza la proteína calentando la muestra a 95ºC durante 5 min. Se someten a electroforesis en gel de SDS-PAGE al 12% durante 2 horas a 120V en tampón de electroforesis (25 mM de trizma Base, 192 mM de glicina y 0,1% SDS). La proteína se transfiere a una membrana de nitrocelulosa en una cubeta de transferencia en tampón de Material y métodos 44 transferencia (conteniendo 25 mM Tris, 192 mM de glicina y 20% metanol) a un amperaje constante de 0.30 A durante 1 h y 30 min a 4ºC. Para evitar uniones inespecíficas entre el anticuerpo primario y las proteínas retenidas en la membrana, se incuba la misma en solución de bloqueo (0,2% I-Block y Tween 20 al 0,1% en PBS) durante una hora, en agitación y a temperatura ambiente. A continuación, se incuban con el anticuerpo correspondiente diluido en solución de bloqueo a 4ºC en agitación, durante 12 h. Se emplearon anticuerpos primarios para Pit-1 (X-7) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), VDR (clone 9A7, Millipore Corp., Bedford, USA), GADPH (clone 6C5, Santa Cruz), Bcl-2 (N-19) (Santa Cruz Biotechnology) Cleaved PARP (46D11) (CellSignaling Danvers, USA) Caspase 3 active (5A1E) (CellSignaling) CDK1/2 (AN21.2) (Santa Cruz Biotechnology), Cyclin A (BDBiosciences), Cyclin B (BDBiosciences), Cyclin D1 (clone 7213G) (Santa Cruz Biotechnology), Cyclin D1 (H-295) (Santa Cruz Biotechnology), Cyclin E (M-20) (Santa Cruz Biotechnology). La dilución empleada fue 1:10000 en el caso de GAPDH, usado como control de carga y 1:1000 para el resto de los anticuerpos. Terminada la incubación se realizaron 3 lavados de 10 min con tween-20 al 1% en PBS. Para la realización de Western blot convencional se continuó el procedimiento incubando con anticuerpo secundario 1:5000, se realizan 3 lavados de 10 min cada uno. Finalmente, las membranas fueron incubadas durante 1 min con Enhanced Chemiluminiscence (ECL) (Amersham Biosciences, UK) para luego ser expuesta ante una placa autoradiográfica y revelada. Para realizar Western blot cuantitativa fluorescente se emplearon como anticuerpo secundario anti-mouse Dylight™ 680-conjugated y anti-rabbit Dylight™ 800-conjugated (Thermo Fisher Scientific). Se realizaron 3 lavados de 10 min y se visualizó y cuantificó Pit-1 empleando Odyssey LI-COR (Hamburgo, Alemania), normalizando sus niveles respecto a GADPH. 10. Análisis del ciclo celular Para el análisis de ciclo celular, se trataron células MCF-7/Pit-1 durante 24 h con 3epiVD (100 nM), cisplatino (5 M) y 3-epiVD (100 nM) + cisplatino (5 M). se tripsinizaron las células y se fijaron con etanol al 75% en PBS durante 12 h a -20ºC. Se Material y métodos 45 centrifugaron las células y se resuspendieron en una solución con yoduro de propidio 5µg/ml y ribonucleasa (200µg/ml) en PBS, durante 30 min a temperatura ambiente. El yoduro de propidio de une al ADN celular. Cuando se excitan las moléculas de yoduro de propidio con una longitud de onda de 540 nm, emiten fluorescencia con un pico máximo a 610 nm, que puede cuantificarse en un citómetro de flujo y, de este modo cuantificar la cantidad de ADN de cada célula. Para ello se empleó un Guava EasyCyte™ (Merck Millipore). Según la cantidad de ADN que contiene cada célula, se puede determinar la fase del ciclo celular en que se encuentra. Las células en fase G0/G1 presentan un contenido de DNA de 2n. Las células en fase S tienen un contenido de DNA entre 2n y 4n. Finalmente, en fase G2/m disponen de 4n de DNA. 11. Cuantificación de apoptosis mediante Anexina V La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de calcio que se une a los restos de fosfatidilserina. En condiciones normales la membrana interna contiene abundantes fosfolípidos aniónicos como la fosfatidilserina, mientras que la externa se compone fundamentalmente de fosfolípidos neutros. Durante el proceso de apoptosis se producen cabios en la membrana celular, de modo que se produce traslocación de los residuos de fosfatidilserina a la membrana externa, quedando accesibles para su unión a la Anexina V. Las células necróticas o en apoptosis tardía presentan permeabilización de la membrana celular por lo que se tiñen con yoduro de propidio (IP) que se une al DNA de las células. De este modo, se distinguen: Células Anexina VIP-: células viables. Células Anexina V+ IP-: células en apoptosis temprana. Células Anexina V + IP+: células en apoptosis tardía. Células Anexina V– IP+: células necróticas. Material y métodos 46 Las células se cultivaron con 3-epiVD (100 nM), ciplatino (5µM) o una combinación de ambas a la misma dosis, durante 24 h y se incubaron en oscuridad con Anexin V-FITC (BD biosciences) y PI durante 48 h y se analizó en un GuayaEasyCyte (Merk Millipore). 12. Determinación de la calcemia in vivo Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Etica de Experimentación Animal (Procedimiento 15010/14/007). Se emplearon ratones machos adultos de 8 semanas de la cepa CD-1. Se trataron con 1,25D y 3-epiVD por vía intraperitoneal (i.p.) disueltos en aceite de sésamo como vehículo a dosis de 0.1, 0.3, 0.5 o 1 µg/kg de peso. Los tratamientos se realizaron cada 48 h durante 3 semanas. El grupo control se trató con excipiente (etanol disuelto en aceite de sésamo). Finalizado en tratamiento se realizó una extracción de suero y se determinaron los niveles de calcio empleando un método colorimétrico con un kit comercial (QuantiCrome Calcium Assay Kit (BioAssay Systems). 13. Experimentos de xenoinjertos en ratones inmunodeficientes Se emplearon ratones hembra con inmunodeficiencia combinada severa (CB17Prkdcscid/J, Jakson Laboratory, Bar Harbor, USA) (SCID) de 6-8 semanas de edad. El compromiso del sistema inmune de estos ratones dificulta el rechazo de las células tumorales humanas, facilitando la formación de implantes tumorales. Se emplearon para cada animal 10x106 de células MCF-7 Tet-off transfectadas establemente con el plásmido de sobreexpresión de Pit-1 (pTRE2-hPit-19 o con el plásmido vacío (pTRE2-RSV). A cada animal se le inyectaron en un lado del costado las células con sobreexpresión de Pit-1 y en el otro lado las células control. Cada uno de estos ratones fue asignado aleatoriamente a un grupo de tratamiento: 1) 1,25D (0,5µg/kg i.p. cada 48 h) 2) 3-epiVD (0,5µg/kg día i.p. cada 48 h) 3) Excipiente (etanol disuelto en aceite de sésamo) i.p. cada 48 h Material y métodos 47 Se usó como excipiente aceite de sésamo. El tamaño tumoral y el peso de los ratones se midieron cada 5 días. Se sacrificaron los ratones a los 25 días de tratamiento. Se recogieron muestras de sangre para su posterior análisis. Para evaluar el crecimiento tumoral en ratones tratados con cisplatino y 3-epiVD se empleó un método de análisis de la bioluminiscencia. Los tumores inducidos en estos animales están formados por células establemente transfectadas con un vector que codifica a la enzima luciferasa. Al inyectar al ratón D-luciferina ésta es oxidada por el enzima luciferasa expresada en las células tumorales, a oxiluciferina. Ésta emite espontánemente un fotón para volver a su estado original y posteriormente se inactiva. Una cámara de alta sensibilidad puede detectar los fotones emitidos, obteniéndose imágenes representativas de la reacción, que es proporcional al número de células tumorales presentes pudiéndose estimar el volumen tumoral mediante un software. Para evaluar los diferentes tratamientos solos y combinados sobre el crecimiento tumoral se inyectó en cada flanco de la línea mamaria 6x106 células MCF-7/Pit-1-luc. Estas células sobreexpresan Pit-1 y luciferasa. A los 15 días de la inyección se randomizaron en 4 grupos de 6 ratones cada uno y se trataron como sigue: 1) Controles, tratados con excipiente (aceite de sésamo) 2) 3-epiVD (0,5µg/kg i.p. cada 48 h disuelta en aceite de sésamo) 3) cisplatino (7 mg/kg i.p. los días 0 y 7 de tratamiento) 4) 3-epi (0,5µg/kg i.p. cada 48 h disuelto en aceite de sésamo) + cisplatino (7 mg/kg los días 0 y 7 de tratamiento). Se monitorizó el crecimiento tumoral cada 7 días desde el día 15 (día 0 de tratamiento) hasta el día 36 (21 días de tratamiento) mediante análisis de la bioluminiscencia in vivo. Tras el sacrificio, se recogió suero tras centrifugación de la muestra de sangre para su uso en estudios de calcemia. Para la obtención de las imágenes se sedó a los animales con isofluorano (2% a 2,5 l/min). Se inyectó D-luciferina (sal de potasio, Regis Technologies, Morton Grove, USA) por vía intraperitoneal a razón de 150 mg/kg de peso, diluida en PBS. Se realizó una determinación de la bioluminiscencia por medio de un IVIS y el software Living Image (Caliper Sciences). Material y métodos 48 13. Análisis estadístico Cada experimento se realizó al menos tres veces. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Las medias fueron comparadas utilizando el “t” test o el análisis de la varianza con el test de múltiples comparaciones de Tukey-Kramer o Mann-Whitney. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Para la realización de todos los cálculos se utilizó el programa PASW Statistics 18. 49 RESULTADOS ________________________________________________________________________ Resultados 56 Figura 16. Izquierda: imágenes representativas de inmunofluorescencia en el ensayo de proliferación con bromodeoxiuridina (BrdU). Células MCF-7 control y transfectadas con el plásmido de sobreexpresión de Pit1 se trataron con 1,25D, 3-epiVD o excipiente y se determinó el índice de BrdU incorporada (verde) en relación a las células totales (DAPI, azul). Derecha: porcentaje de incorporación de BrdU en células MCF-7 control (C) y con sobreexpresión de Pit-1 (Pit-1) tratadas con excipiente, con 1,25D y con 3-epiVD. 7. Efecto del tratamiento con 1,25D y 3-epiVD en células de adenocarcinoma de mama con y sin sobreexpresión de Pit-1 in vivo Para valorar el efecto del tratamiento con 1,25D o 3-epiVD sobre el crecimiento tumoral in vivo, se indujeron tumores en ratones SCID mediante la inyección subcutánea en el lomo del animal de células MCF-7 con y sin sobreexpresión de Pit-1. Se trataron con 1,25D, 3-epiVD o excipiente (grupo control) cada 48 h por vía i.p. a dosis de 0.5 g/kg peso (Figura 17). Los tumores inducidos por células que sobreexpresaban Pit-1 eran significativamente mayores que en los controles. El tratamiento con 1,25D o 3-epiVD Resultados 57 disminuyó el crecimiento tumoral de forma significativa, siendo este efecto más marcado en los tumores que sobreexpresaban Pit-1 (Figuras 18 y 19). Figura 17. Esquema del procedimiento experimental. Se inyectaron ratones SCID con células MCF-7 con y sin sobreexpresión de Pit-1 en el lomo y se trataron por vía i.p. cada 2 días con excipiente (grupo control), 1,25D (0,5 µg/kg) y 3-epiVD (0,5 µg/kg) durante 25 días, durante los que se determinó el crecimiento tumoral. Figura 18. Izquierda: representación gráfica de la evolución del tamaño de los tumores inducidos en ratones con células MCF-7 sin sobreexpresión de Pit-1. Derecha: representación del volumen tumoral al día 25 en los distintos grupos de tratamiento. MCF-7 MCF-7 + 1,25D MCF-7 + 3-epiVD 25 días 20 15 10 Volumen tumor (mm) 600 500 400 300 200 100 0 600 500 400 300 200 100 0 ** ** Volumen tumor (mm) control 1,25D 3-epiVD Resultados 58 Figura 19. Izquierda: representación gráfica de la evolución del tamaño de los tumores inducidos en ratones con células MCF-7 con sobreexpresión de Pit-1. Derecha: representación del volumen tumoral al día 25 en los distintos grupos de tratamiento. 8. Efecto del tratamiento con 3-epiVD y quimioterapia sobre viabilidad/proliferación celular in vitro Dado que 3-epiVD tiene un efecto inhibitorio sobre proliferación celular en líneas de adenocarcinoma de mama, nuestro siguiente objetivo fue valorar el efecto que sobre la viabilidad/proliferación celular tiene el tratamiento con 3-epiVD en combinación con tratamientos citotóxicos empleados en la práctica cínica, específicamente con doxorrubicina, gemcitabina, paclitaxel y cisplatino. Se emplearon células MCF-7 como modelo de cáncer de mama hormono-sensible o subtipo luminal. Dado que en los experimentos previos se había observado que 3-epiVD presenta distinta actividad sobre células con y sin sobreexpresión de Pit-1, en este experimento se emplearon células MCF7 control y con sobreexpresión de Pit-1 (MCF7/Pit-1). Se realizaron ensayos MTT en células tratadas con 3-epiVD (100 nM), 1,25D (100 nM), doxorrubicina (100 nM), gemcitabina (2 nM), paclitaxel (1 nM) y cisplatino (1 M). Estas dosis de quimioterapia MCF-7-Pit-1 MCF-7-Pit-1 + 1,25D MCF-7-Pit-1 + 3-epiVD 1200 1000 800 600 400 200 025 días 20 15 10 Volumen tumor (mm) 1200 1000 800 600 400 200 0 Volumen tumor (mm) control 1,25D 3-epiVD *** *** Resultados 59 son las utilizadas habitualmente en cultivos in vitro. El tratamiento con 1,25D y 3-epiVD potencia la acción de la quimioterapia (placitaxel, doxorrubicina, gemcitabina y cisplatino), y este efecto es más acusado en las células que sobreexpresan Pit-1 (Figuras 2023). Figura 20. Viabilidad/proliferación celular en células MCF-7 control y con sobreexpresión de Pit-1 y tratadas solo con doxorrubicina o combinada con 1,25D y 3-epiVD. Figura 21. Viabilidad/proliferación celular en células MCF-7 control y con sobreexpresión de Pit-1 y tratadas solo con gemcitabina o combinada con 1,25D y 3-epiVD. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Metabolización de MTT (A570) MCF-7 + Pit-1 MCF-7 - + - - + + - + - - + + Doxorrubicina (100nM) - - + - + - - - + - + - 3-epiVD 100 nM - - - + - + - - - + - + 1,25D 100 nM 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 MCF-7 + Pit-1 MCF-7 Metabolización de MTT (A570) - + - - + + - + - - + + Gencitabina (2nM) - - + - + - - - + - + - 3-epiVD 100nM - - - + - + - - - + - + 1,25D 100nM Resultados 60 Figura 22. Viabilidad/proliferación celular en células MCF-7 control y con sobreexpresión de Pit-1 y tratadas solo con paclitaxel o combinado con 1,25D y 3-epiVD. Figura 23. Viabilidad/proliferación celular en células MCF-7 control y con sobreexpresión de Pit-1 y tratadas solo con cisplatino o combinado con 1,25D y 3-epiVD. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Metabolización de MTT (A570) MCF-7 + Pit-1 MCF-7 - + - - + + - + - - + + Paclitaxel (1nM) - - + - + - - - + - + - 3-epiVD 100 nM - - - + - + - - - + - + 1,25D 100nM 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 MCF-7 + Pit-1 MCF-7 Metabolización de MTT (A570) - + - - + + - + - - + + Cisplatino (1 µM) - - + - + - - - + - + - 3-epiVD 100nM - - - + - + - - - + - + 1,25D 100nM Resultados 61 9. Efecto del tratamiento con 3-epiVD y cisplatino sobre viabilidad/proliferación celular in vitro El cisplatino inhibe la síntesis de ADN produciendo enlaces cruzados dentro y entre las cadenas de ADN. Es un agente quimioterápico empleado en el tratamiento del cáncer de mama triple negativo y en tumores de mama asociados a mutaciones de BRCA-1 (Saether et al., 2018). Este tipo de tumores tienen peor pronóstico que los otros subtipos. Figura 24. Immunocitoquímica de células MCF-7 y MDA-MB-231 control y con sobreexpresión (MCF-7-Pit-1) y bloqueo (MDA-MB-231 shPit-1) de Pit-1. Se determinaron marcadores de proteínas epiteliales (CK9, βcatenina y E-cadherina), mesenquimales (vimentina) y de proliferación celular (ki-67). CK19 -catenin E-cadherin Vimentin MCF-7 MCF-7-Pit-1 MDA-MB-231 Ki-67 Pit-1 Marcadores epiteliales Marcador mesenquimal Marcador de proliferación Tumorales No invasivas Tumorales Invasivas Tumorales Invasivas MDA-MB-231 sh-Pit-1 Resultados 62 La sobreexpresión de Pit-1 modifica a las células MCF-7 (modelo de tumor luminal A) hacia un fenotipo similar al triple negativo (Figura 24). Por ello, profundizamos en el estudio de la combinación de 3-epi VD con cisplatino en células con sobreexpresión de Pit-1. Se realizaron ensayos empleando 3-epiVD (100 nM) y cisplatino (5µM) en combinación en células MCF-7 control y con sobreexpresión de Pit-1 (MCF-7-Pit-1), y se procedió del mismo modo con células MDA-MB-231 control y con bloqueo de la expresión de Pit-1 utilizando un shRNA para Pit-1 (MDA-MB-231 shPit-1) (Figura 25A-F). Se calculó el índice de combinación (CI) para la combinación de cisplatino y 3-epiVD (Figura 25G). Según este índice los valores mayores de 1 indicarían antagonismo farmacológico, los valores menores de 1 indicaría sinergismo y los valores iguales a 1 efecto aditivo. El tratamiento con 3-epiVD disminuyó la viabilidad/proliferación celular en ambos tipos celulares, siendo este efecto proporcionalmente mayor cuando los niveles de Pit-1 expresados por las células eran mayores (Figura 25A y 25D). Como era de esperar, el tratamiento con cisplatino también disminuyó la viabilidad/proliferación celular en ambos tipos celulares (Figura 25B y 25E). La combinación de cisplatino y 3-epiVD indujo un significativo efecto inhibitorio sobre la viabilidad/proliferación celular mayor que el de cada una de las drogas por separado (Figuras 25C y 25F). Los índices de combinación calculados resultaron menores de 1 (Figura 25G) indicando sinergismo en la combinación de ambas drogas. Cabe destacar que estos valores fueron sustancialmente menores (indicando un sinergismo más potente) en células con mayor expresión de Pit-1. Resultados 63 Figura 25. Efecto del tratamiento con 3-epiVD y cisplatino sobre viabilidad/proliferación en células MCF-7 (barras verdes) y con sobreexpresión de Pit-1 (barras rojas) y MDA-MB-231 control (barra negra) y transfectadas con shRNA para Pit-1 (barra sepia) y tratadas con 3-epiVD (A y D), cisplatino (B y E) o una combinación de ambos (C y F). La Tabla G muestra los valores de células viables (expresados en porcentaje respecto del control tratado con PBS y etanol) tras tratamiento con cisplatino (5µM), 3-Epi-VD (100nM) o ambos. Se determinó el índice de combinación (CI) para la combinación de fármacos. - 10 100 500 - 10 100 500 (nM) 3-epiVD B C D E F 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Metabolización MTT (A570) MCF-7/Pit-1 MCF-7 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - 1 5 10 - 1 5 10 (µM) Cisplatino - - + + - - + + 5 µM Cisplatino - + - + - + - + 100 nM 3-epiVD 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Etanol 3-epiVD (100 nM)Etanol 3-epiVD (100 nM) Etanol 3-epiVD (100 nM)Etanol 3-epiVD (100 nM PBS 100 % 77.7 % 100 % 45.6 % 100% 79.9 % 100% 95.0% Cis (5 M) 60.5 % 49.6 % CI=0.26 51.6 % 24.7 % CI=0.03 68.2 % 51,6 % CI=0.12 74.8% 67.4% CI=0.39 MCF-7 MCF-7/Pit-1 MDA-MB-231 G 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - 10 100 500 - 10 100 500 (nM) 3-epiVD MDA-MB-231/shPit-1 MDA-MB-231 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - 1 5 10 - 1 5 10 (µM) Cisplatino MDA-MB-231/shPit-1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - - + + - - + + 5 µM Cisplatino - + - + - + - + 100 nM 3-epiVD A P=0.0000015 *** * P=0.000000012 *** *** P=000000047 *** *** P=0.0000078 *** ** Metabolización MTT (A570) Metabolización MTT (A570) Metabolización MTT (A570) Metabolización MTT (A570) Metabolización MTT (A570) Resultados 64 10. Estudio de ciclo celular en células MCF-7-Pit-1 tras el tratamiento con cisplatino y 3-epiVD Para investigar por qué la combinación de cisplatino y 3-epiVD reduce la proliferación en células MCF-7 con sobreexpresión de Pit-1, evaluamos en primer lugar el efecto de la administración de 3-epiVD y cisplatino en el ciclo celular. Las células se trataron durante 24 horas con 3-epiVD (100 nM), cisplatino (5 M) y 3-epi (100 nM) + cisplatino (5 M), y luego se sometieron a citometría de flujo utilizando yoduro de propidio (PI). La administración de 3-epiVD no modificó significativamente el ciclo celular, en relación con las células de control. El tratamiento con cisplatino redujo G2-M y aumentó la fase S del ciclo celular con respecto al control y las células tratadas con 3-epiVD. La combinación de ambos fármacos aumentó la fase G0-G1 en comparación con la administración de cisplatino solamente (Figura 26). Para evaluar las proteínas involucradas en el ciclo celular, también se llevó a cabo un Western blot. Los resultados demuestran que el tratamiento con 3-epiVD + cisplatino reduce la expresión de ciclina D en relación con la administración de cisplatino de forma aislada. ContenidoADN (103) 200 160 120 80 40 01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Número de células G0-G1: 62% S: 10% G2-M: 28% 200 160 120 80 40 01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 200 160 120 80 40 01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 200 160 120 80 40 0 200 160 120 80 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 G0-G1: 50% S: 10% G2-M: 40% G0-G1: 54% S: 10% G2-M: 36% G0-G1: 54% S: 30% G2-M: 16% G0-G1: 66% S: 20% G2-M: 14% Control 3-epiVD Cis 3-epiVD+Cis Control + FBS ContenidoADN(103)ContenidoADN(103)ContenidoADN(103)ContenidoADN(103) CDK1/2 Ciclina D Ciclina E Ciclina A Ciclina B GAPDH - + + + + FBS Figura 26. Estudio del ciclo celular en células MCF-7-Pit-1 tras tratamiento con 3-epiVD y cisplatino. Las células MCF-7/Pit-1 se trataron durante 24 h con 3-epiVD (100Nm), ciplatino (5µM) o una combinación de ambas a la misma dosis, y se examinó el ciclo celular con yoduro de propidio (PI). Western Blot de células MCF-7/Pit-1 sometidas a los tratamientos anteriormente mencionados para las proteínas CDK1/2, ciclina D, ciclina E, ciclina A y ciclina B. Se empleó GADPH como control de carga. Resultados 65 11. Estudio de apoptosis en células MCF-7-Pit-1 tras el tratamiento con cisplatino y 3-epiVD Para estudiar el efecto del tratamiento con 3-epiVD y cisplatino sobre la apoptosis, se cultivaron células MCF-7-Pit-1 y se trataron a las mismas dosis que las indicadas anteriormente para ciclo celular durante 48 h, posteriormente se tiñeron con Anexina VFITC y PI y se cuantificaron en un citómetro de flujo. Nuestros resultados indican tasas significativas (P <0,001) de apoptosis temprana (anexina V+/PI-) en células tratadas con cisplatino + 3-epiVD, en comparación con células tratadas solamente con cisplatino (Figura 27). Además, los niveles de expresión de proteínas involucradas en apoptosis fueron evaluadas por Western blot. Se observaron mayores niveles de PARP escindida, de caspasa 3 activa y niveles disminuidos de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 tras el tratamiento con 3-epiVD + cisplatino, en relación con la administración de cisplatino solamente (Figura 27). Figura 27. Análisis de apoptosis tras tratamiento con cisplatino y 3-epiVD en células MCF-7-Pit-1. Citometría de flujo de células MCF-7-Pit-1 tratadas durante 48 h con los fármacos mencionados y teñidos con anexina V y PI. La tabla muestra el porcentaje de celular teñidas con Anexina V y/o PI (media ±desviación estándar). Western blot de células MCF-7-Pit-1 tratadas durante 48 h con los fármacos mencionados en que se determina Bcl2 (antiapoptótica), PARP fraccionada y caspasa 3 activa (marcadores de apotosis). Se empleó GADPH como control de carga. AnexinaV-/PI+ AnexinaV+/PI+ AnexinaV+/PI80.2 + 1.1% AnexinaV-/PIControl 3-epiVD 3-epiVD+CisCis 78.6 + 0.9% 65.9 + 1.6% 56.1 + 6.7% 3.8 + 1.9% 4.4 + 2.1% 8.3 + 2.4% 17.1 + 0.1% 10.1 + 0.2% 13.3 + 5.1% 20.5 + 6.3% 20.1 + 10.1% 2.7 + 1.4% 3.6 + 2.1% 4.9 + 2.1% 6.6 + 4.5% Cleaved-PARP Caspasa3 activa Bcl-2 GAPDH * ns 72 Discusión 73 En el presente trabajo ha sido analizado el efecto de un análogo de 1,25D, la 3-epiVD, administrado de forma aislada o en combinación con quimioterapia convencional en el tratamiento de cáncer de mama, tanto en líneas celulares o cultivos primarios de tumores de mama humana in vitro, como en ratones inmunodeficientes in vivo. Nuestros resultados demuestran que 3-epiVD posee propiedades anti-proliferativas y pro-apoptóticas sobre tumores de mama a dosis en las que no produce hipercalcemia. Además, posee un efecto sinérgico cuando se combina con cisplatino en tumores con alta expresión del factor de transcripción Pit-1 en las células tumorales, sugiriendo que esta combinación farmacológica (cisplatino + 3-epiVD) podría ser útil en mujeres con tumores de mama con elevada expresión de Pit-1. Ha sido demostrado que el factor de transcripción Pit-1 está asociado con aumento de la proliferación, invasividad y disminución de la apoptosis en cáncer de mama in vitro (GilPuig et al., 2005, Ben-Batalla et al., 2010a) y con crecimiento tumoral y el desarrollo de metástasis pulmonares in vivo (Ben-Batalla et al., 2010b). En una muestra de 110 tumores de mama humana, el 80% mostró expresión de Pit-1 mediante inmunohistoquímica (BenBatalla et al., 2010b). Asimismo, en estudios clínicos en muestras de pacientes con cáncer de mama y metástasis ganglionares axilares, ha sido demostrada una relación significativamente inversa entre la expresión de Pit-1 en células tumorales y el intervalo de supervivencia libre de enfermedad (Ben-Batalla et al., 2010, Gao et al., 2016). Por ello, nuestro primer objetivo fue analizar la expresión de Pit-1 en líneas celulares de adenocarcinoma de mama humana. Se utilizaron líneas celulares con distinta agresividad, representativas de los distintos subtipos de cáncer de mama, es decir, positivas para receptores de estrógenos y en general menos agresivas (MCF-7, T47D), positivas para HER2 (BT474, SKBR3) y triples negativas, que, en general, son las más agresivas (HS578T, MDA-MB-231, HBL100, HCC1937, HCC1187) (Dai et al., 2017). Todas las líneas celulares expresan Pit-1, siendo las líneas triples negativas, es decir, las más agresivas, las de mayores niveles de Pit-1, tanto a nivel de ARNm, como a nivel proteico. Para intentar relacionar a Pit-1 como factor pro-oncogénico, con un conocido factor antitumoral como es la 1,25D (Feldman et al., 2014), analizamos la expresión de ARNm y proteína del receptor de 1,25D (VDR) en las mismas líneas celulares de cáncer de mama. Nuestros resultados demuestran que VDR se expresa en todas las líneas celulares Discusión 74 evaluadas. La expresión de VDR ya había sido previamente demostrada por otros autores en líneas celulares de tumores de mama, los cuales señalaban que VDR se expresa en niveles relativamente elevados en células bien diferenciadas (por ejemplo en MCF-7), y en bajos niveles en líneas celulares poco diferenciadas (por ejemplo en MDA-MB-231), sugiriendo que el nivel de inhibición del crecimiento o proliferación celular tras tratamiento con 1,25D es dependiente de los niveles de expresión de VDR (Buras et al., 1994). De hecho, ha sido demostrado que los niveles de expresión de VDR son más elevados en mama normal, disminuyen progresivamente en las lesiones benignas de mama, en el carcinoma ductal in situ y alcanzan su menor expresión en el carcinoma invasivo, lo cual a su vez se correlaciona con la mayor expresión del enzima encargado del catabolismo de la 1,25D, la CYP24A1, en el carcinoma invasivo (Lopes et al, 2010; Lopes et al, 2012). Nuestros datos concuerdan con los ya publicados, indicando además, y por primera vez, que la expresión de VDR está en relación inversa con la expresión de Pit-1 en líneas celulares de cáncer de mama. 1,25D tiene actividad antiproliferativa y pro-apoptótica tanto in vitro como in vivo sobre células de cáncer de mama (Feldman et al., 2014). Sin embargo, dosis altas de 1,25D pueden producir hipercalcemia que se manifiesta clínicamente por letargia, debilidad, insuficiencia renal, alteraciones cardiacas como bloqueo auriculo-ventricular, ensanchamiento de la onda T, acortamiento del intervalo QT y arritmias malignas, que pueden ocasionar paro cardiaco. Así, algunos ensayos clínicos en los que se empleó la 1,25D a dosis elevadas tuvieron que interrumpirse antes de su conclusión, al desarrollar los pacientes hipercalcemia. En otros estudios se emplearon a dosis muy inferiores a las que se cree podría generar un efecto anti-tumoral clínicamente significativo (Beer et al., 2006). La 3-epiVD es un compuesto presente en el organismo en condiciones normales. Su estructura química es un isómero óptico de la 1,25D que se forma como consecuencia de un cambio de orientación del grupo hidroxilo del carbono 3, de posición β a α (Sekimoto et al., 1999). Nuestra primera aproximación experimental fue para determinar si 3-epiVD tenía capacidad para regular genes diana de la 1,25D. Nuestros resultados demuestran que 3-epiVD regula al gen que codifica a 24α-hidroxilasa (CYP24A1), un conocido gen diana de 1,25D, que interviene de forma clave en el catabolismo de la 1,25D, y lo hace a concentraciones un poco mayores, pero del mismo orden de magnitud que 1,25D. Nuestros Discusión 75 resultados son similares a estudios previos, en los que se demuestra que 3-epiVD es ligeramente, pero no significativamente, menos activa que 1,25D en la regulación transcripcional de genes diana de 1,25D, como los implicados en la inhibición de la proliferación, regulación de la hormona paratiroidea (PTH), osteopontina, o genes relacionados con la movilización de calcio (Masuda et al., 2000, Brown et al., 1999, Harant et al., 2000, Norman et al., 1993). Dado que 3-epiVD activa a genes también regulados por 1,25D, nuestro siguiente objetivo fue determinar el efecto de la administración de 3-epiVD in vivo sobre los niveles de calcio en sangre. Mientras que la administración de 1,25D incrementó la calcemia a dosis de 0,3 µg/kg en relación a los controles, no se observó un incremento significativo con 3-epiVD incluso a dosis tres veces superiores. Nuestros resultados sugieren que 3epiVD podría emplearse como agente terapéutico in vivo evitando (o reduciendo) la hipercalcemia como efecto secundario no deseado. Nuestro siguiente objetivo fue evaluar si 3-epiVD reduce la expresión de Pit-1. Para ello, se determinaron los niveles de expresión proteica de Pit-1 tras tratamiento con 3epiVD o con 1,25D. Tanto en células MCF-7 (que expresan niveles bajos de Pit-1) como MDA-MB-231 (con elevados niveles de Pit-1), el tratamiento con 3-epiVD disminuyó los niveles de Pit-1. Estudios previos ya habían demostrado que la administración de 1,25D disminuye la expresión de Pit-1. Esta regulación se realiza a nivel transcripcional, uniéndose el complejo 1,25D-VDR al promotor de Pit-1 y reclutando a la histona deacetilasa1 (HDAC1) (Seoane et al., 2007). En este trabajo no se ha evaluado la regulación transcripcional de Pit-1 por 3-epiVD, pero dado que 3-epiVD y 1,25D parecen regular a los mismos genes, no es aventurado hipotetizar que 3-epiVD también regularía a Pit-1 a nivel transcripcional. Con el objetivo de determinar si 3-epiVD posee actividad antitumoral similar a la 1,25D, se evaluó la proliferación celular con bromodeoxiuridina en líneas tumorales de mama no invasivas (MCF-7). Dado que, tanto 3-epiVD como 1,25D inhiben a Pit-1, se utilizaron también líneas celulares con sobreexpresión de Pit-1 (MCF-7-Pit-1). Nuestros resultados demuestran que las células con sobreexpresión de Pit-1 proliferan significativamente más que las células control, datos que corroboran otros ya publicados previamente (Gil-Puig et al., 2005, Ben-Batalla et al., 2010b). El tratamiento con 3-epiVD Discusión 76 disminuye la proliferación celular tanto en células MCF-7 como en MCF-7-Pit-1 de un modo similar a la 1,25D, mostrando ambos tratamientos un mayor efecto sobre las células con sobreexpresión de Pit-1. Para confirmar los resultados obtenidos en líneas celulares, repetimos los tratamientos en ratones SCID in vivo a los que se inyectaron células MCF7 o células MCF-7-Pit-1 en el lomo. El tratamiento con 3-epiVD ralentiza el crecimiento tumoral de forma significativa a los 25 días, en comparación con los animales tratados con excipiente. Los tumores inducidos por células con sobreexpresión de Pit-1 alcanzaron mayores volúmenes, de modo similar a experimentos previamente publicados (Ben-Batalla et al., 2010b). En estos tumores, tanto 3-epiVD como 1,25D lograron una mayor reducción del tamaño tumoral que en aquellos inyectados con células MCF-7 sin sobreexpresión de Pit-1. Existen datos previos sobre la actividad antitumoral de 1,25D combinada con agentes quimioterápicos (Ma et al., 2010a). La doxorrubicina es un agente que produce daño en el ADN. Ha sido demostrado que 1,25D sensibiliza a las células de cáncer de mama al tratamiento con este fármaco a través de la inhibición de la expresión y de la actividad del enzima antioxidante Cu/Zn subperóxido dismutasa, incrementando de este modo el daño oxidativo ocasionado por el quimioterápico (Ravid et al., 1999). La gemcitabina es un análogo de los nucleósidos. Sobre líneas celulares de carcinoma vesical, 1,25D, administrado junto con gemcitabina, provoca un efecto sinérgico anti-proliferativo (Ma et al., 2010b). Paclitaxel es un fármaco que inhibe la función del microtúbulo, impidiendo por tanto la división celular. La adición de 1,25D a paclitaxel provoca un efecto aditivo in vitro (Wang et al., 2000). El cisplatino inhibe la síntesis de ADN produciendo enlaces cruzados dentro y entre las cadenas de ADN. Se ha demostrado un efecto sensibilizador al añadir 1,25D al tratamiento con cisplatino in vitro en líneas celulares de cáncer de mama (Cho et al., 1991). En este trabajo, evaluamos el efecto del tratamiento con 3-epiVD y 1,25D combinadas con doxorrubicina, gemcitabina, paclitaxel y cisplatino. La 1,25D en combinación con la quimioterapia mostró actividad inhibitoria sobre viabilidad/proliferación celular similar a la ya descrita en las publicaciones mencionadas. Esta actividad inhibitoria fue mayor en células con sobreexpresión de Pit-1. 3-epiVD disminuyó también de forma significativa la viabilidad/proliferación celular cuando se asoció a estos agentes quimioterápicos, siendo su efecto mayor, al igual que ocurre con la Discusión 77 1,25D, cuando se empleaba como tratamiento en células con sobreexpresión de Pit-1. La combinación más efectiva de 3-epiVD con quimioterapia sobre la disminución de la proliferación celular se produce con cisplatino. Por ello nos centramos en una evaluación más detallada en este compuesto. El cisplatino es un agente quimioterápico que ha suscitado interés en los últimos años en el tratamiento del cáncer de mama triple negativo y en tumores de mama asociados a mutaciones de BRCA-1 por el incremento en la supervivencia de las pacientes tratadas con este fármaco (Saether et al., 2018). Los carcinomas de mama triple negativos representan aproximadamente el 15% del total de cánceres de mama, presentando peor pronóstico, dado que tienen mayor tendencia a la recidiva local, al desarrollo de metástasis y menor supervivencia (Goldhirsch et al., 2013, Prat et al., 2013, Maisonneuve et al., 2014). Los tumores triple negativos, al contrario que los tumores luminales que pueden tratarse con hormonoterapia y los tumores HER-2 con anticuerpos monoclonales, carecen de tratamiento específico y la quimioterapia es el único tratamiento sistémico aprobado, tanto como tratamiento adyuvante como en el tratamiento de la enfermedad metastásica, con los conocidos efectos indeseables que acarrea. En este escenario, un objetivo prioritario es el encontrar terapias que mejoren el efecto de la quimioterapia o puedan emplearse como tratamiento de mantenimiento. Dado que: a) la sobreexpresión de Pit-1 modifica a las células MCF-7 (modelo de tumor luminal A) hacia un fenotipo similar al triple negativo (Figura 25), b) que los tumores de mama con mayores niveles de Pit-1 presentan un peor pronóstico (Ben Batalla et al., 2010b, Gao et al., 2016), y c) que las líneas celulares que se emplean como modelo de cáncer de mama triple negativo (Dai et al., 2017) sobreexpresan Pit-1, decidimos investigar si la combinación de cisplatino con 3-epiVD en células con sobreexpresión de Pit-1 era más efectiva que el tratamiento con cisplatino solamente. Los ensayos de proliferación celular demostraron que, tanto en células MCF-7 como en MCF-7-Pit-1, al añadir 3-epiVD a cisplatino se disminuía de forma sinérgica la proliferación celular. El cisplatino se une a las bases de purina del ADN, interfiriendo los mecanismos de reparación, produciendo daño del ADN y subsecuentemente induciendo apoptosis en las células tumorales. Nuestros datos están en relación con los obtenidos por Cho y col. (1991), en líneas celulares de cáncer de mama, demostrando que la combinación de cisplatino y 1,25D tiene un efecto Discusión 78 sinérgico, reduciendo la proliferación celular. También in vitro, los análogos de vitamina D, PRI-2191 y PRI-1906 en células T47D (Luminal A) mostraron un efecto sinérgico con cisplatino sobre la proliferación celular (Pelzynska, et al., 2006). En líneas celulares de cáncer de mama triple negativo tratadas con 1,25D y el análogo EB1089 en combinación con cisplatino, también se observó un sinergismo sobre proliferación celular (Thakkar et al., 2016), siendo el análogo EB1089 todavía más activo que 1,25D. Como cisplatino y 3-epiVD tienen un efecto sinérgico sobre viabilidad/proliferación celular, nos planteamos analizar su mecanismo de acción. Las causas más probables de disminución de la proliferación celular son a nivel del ciclo celular (parada del ciclo celular) y sobre la muerte celular (aumento de la apoptosis). Demostramos que la combinación 3-epiVD y cisplatino actúa sobre ambas. En relación al ciclo celular, esta combinación de fármacos, respecto a la administración de cisplatino solamente, aumentó significativamente el porcentaje de células en fase G0-G1 y disminuyó el porcentaje de células en fase S y en fase G2-M, provocando una clara disminución de los niveles de la proteína ciclina D, que es clave en el inicio del ciclo celular, lo cual indica que las células tratadas con 3-epiVD+ cisplatino se acumulan en la fase G0-G1, es decir, se detiene el ciclo celular. En relación con la apoptosis, nuestros datos demuestran que cuando añadimos 3epiVD a cisplatino aumentan las células en apoptosis temprana (annexinaV+ y PI-), disminuye Bcl-2 (proteína anti-apoptotica), y aumentan cleaved PARP y caspasa 3 activa (marcadores de daño apoptótico), indicando que esta combinación incrementa la apoptosis celular. La parada de ciclo celular en G0-G1 tras combinación de 1,25D o un análogo de 1,25D (Ro23-7553) y cisplatino ya había sido observada previamente por el grupo de Johnson y col. utilizando líneas de carcinoma de células escamosas de ratón, demostrando además un claro efecto antitumoral in vivo (Light et al., 1997). Posteriormente, este mismo grupo demostró en el mismo modelo celular, un incremento de la apoptosis tras administración de 1,25D con cisplatino, en relación a la administración de cisplatino solamente, a través de la vía de caspasas 8/10-caspasa 3 (Ma et al., 2008). Otros investigadores han demostrado también que 1,25D aumenta la citotoxicidad del cisplatino a través de una regulación positiva de MEKK-1, lo que genera señales pro-apoptóticas a través de la vía (SEK1)-JNKJun y las vías de estrés MKK3/MKK6-p38 MAPK y también a través de efectos Discusión 79 inhibitorios sobre la reparación del ADN celular (Hershberger et al. 2002). Aunque en nuestro estudio no hemos valorado la expresión de MEEK-1, no es descartable que 3epiVD combinada con cisplatino actúe también a través de este mecanismo. Dado que los resultados in vitro muestran un efecto antiproliferativo, de parada de ciclo celular y pro-apoptótico tras el tratamiento combinado de cisplatino y 3-epiVD, se valoró si se reproducían estos efectos in vivo en ratones inmunodeficientes (SCID) inyectados subcutáneamente con células MCF-7-Pit-1 marcadas con luciferasa. Demostramos que el tratamiento con 3-epiVD y cisplatino disminuyó el crecimiento tumoral de forma significativa en relación con el tratamiento con cisplatino solamente. Además, no se evidenció alteración en las cifras de calcio en sangre. Finalmente, y con el fin de comprobar si los resultados obtenidos utilizando líneas celulares eran trasladables a tumores de pacientes, se trataron 15 tumores de mama humana (cultivos primarios) con la misma combinación de fármacos. Nuestros resultados confirmaron, nuevamente, la eficacia de la combinación cisplatino + 3-epiVD para disminuir la proliferación celular en comparación con la administración de cisplatino de forma aislada. Dentro de la célula, el átomo de platino de la molécula de cisplatino forma enlaces covalentes con los átomos de nitrógeno de las bases de purina formando enlaces dentro de la cadena y, en menor medida, entre cadenas de ADN. Estas alteraciones interfieren la replicación y transcripción del ADN. La estructuctura de la cadena se altera, lo que reconocen las proteínas reparadoras. En este punto la célula puede detener la progresión del ciclo celular y e intentar reparar el daño inducido por el cisplatino, si no lo consigue la célula entra en apoptosis (Basu et al., 2010). BRCA1 y MRE11 son unas de las proteínas implicadas en la reparación del daño al ADN originado por el cisplatino. La proteína BRCA1 está implicada en la reparación de roturas de la doble hebra del ADN, mediante el proceso de recombinación homóloga. Este mecanismo de reparación emplea la secuencia de ADN homóloga en la cromátida hermana como patrón para corregir el daño del ADN. Se realiza durante las fases S y G2, cuando la cromátida hermana está disponible. La recombinación homóloga, al emplear la secuencia como patrón para la reparación, es un proceso conservador y eventualmente libre de errores. Cuando existe una deficiencia de BRCA1, no se puede efectuar este proceso, entonces se emplean otras formas de reparación del daño de la doble hebra de ADN. Uno de estos mecanismos es la Discusión 80 unión de extremos no homólogos, que corrige el defecto de la cadena ligando los extremos rotos del ADN, pero, dado que no emplea ningún patrón para la reparación, es proclive a generar errores en la secuencia, lo que conlleva inestabilidad genómica y favorece la tumorigénesis. Además de las portadoras de mutaciones en BRCA1, pacientes sin mutaciones somáticas pueden presentar tumores con defectos en el proceso de recombinación homóloga, fenotípica y biológicamente similares a los de las portadoras de mutaciones en BRCA 1 y que, eventualemnte, se beneficien de terapias similares (Nicolas et al., 2018). Por ejemplo, se ha observado una mejor tasa de respuesta al tratamiento con derivados del platino en pacientes con cáncer de mama con niveles bajos de BRCA1 (Byrski et al. 2012; Byrski et al., 2014; Tutt et al., 2018). Por otra parte, el tratamiento con 1,25D o análogos de vitamina D incrementa la expresión de BRCA1 en líneas celulares de cáncer de mama (Campbell et al., 1997; Campbell et al., 2000). Se ha demostrado que la asociación entre BRCA1 y VDR activa genes implicados en las acciones antitumorales de la vitamina D y que la supresión de BRCA1 anula los efectos de los análogos de vitamina D (Pickholtz et al., 2014). Aunque en este trabajo no hemos determinado los niveles de BRCA1, estos datos apoyan la eficacia de ciplatino+3-epiVD en este tipo de tumores. Otra proteína implicada en la reparación del ADN es MRE11. Se ha demostrado que Pit-1 se une e inhibe la expresión de MRE11, sensibilizando las células de cáncer de mama a los tratamientos quimioterápicos (Huang et al., 2015). Aunque en nuestro trabajo no hemos valorado los niveles de MRE11, sí hemos evidenciado que los niveles de expresión de Pit-1 en las células tumorales de cáncer de mama son predictores de respuesta a tratamiento con 3-epi y cisplatino, y por tanto nuestros resultados son concordantes con las publicaciones previas en este sentido. Como resumen, nuestros resultados indican que el análogo 3-epiVD comparte acciones antiproliferativas de la 1,25D in vitro, e in vivo posee actividad antitumoral sin producir hipercalcemia. Cisplatino y 3-epiVD es una combinación sinérgica que reduce la proliferación celular, deteniendo el ciclo e incrementando apoptosis en líneas celulares de cáncer de mama. Asimismo, reduce el crecimiento tumoral en xenoinjertos de líneas celulares y la proliferación celular en cultivos primarios de cáncer de mama. El efecto antitumoral de 3-epiVD es significativamente mayor en células con sobreexpresión de Pit-1, Discusión 81 por lo que Pit-1 pudiera emplearse como predictor de respuesta a tratamiento con 3-epiVD, sola o en combinación con cisplatino. 88 Bibliografía 89 AIHW (Australian Institute of Health and Welfare) (2009). Breast cancer in Australia: an overview, 2009. Cat. no. CAN 46. Canberra: AIHW. Revisado el 11 de junio de 2015. <http://www.aihw.gov.au/publication-detail/?id=6442468297>. Amir, E., Simmons, C.E., Freedman, O.C., Dranitsaris, G., Cole, D.E.C., Vieth, R., Ooi, W.S., Clemons, M. (2010) A phase 2 trial exploring the effects of high-dose (10.000 UI/day) vitamin D (3) in breast cancer patients with bone metastases. Cancer, 116: 284291. Asa, S.L., Puy, L.A., Lew, A.M., Sundmark, V.C., Elsholtz, H.P. (1993) Cell typespecific expression of the pituitary transcription activator Pit-1 in the human pituitary and pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab, 77: 1275–1280. 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