Procedimientos de escalado de la producción de esporas del hongo parasiticida Duddingtonia flagrans

TESIS DE DOCTORADO “PROCEDIMIENTOS DE ESCALADO DE LA PRODUCCIÓN DE ESPORAS DEL HONGO PARASITICIDA DUDDINGTONIA FLAGRANS” Diana Freiría Barreiro ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN MEDICINA E SANIDADE VETERINARIA LUGO 2020 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Procedimientos de escalado de la producción de esporas del hongo parasiticida Duddingtonia flagrans Dña. Diana Freiría Barreiro Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Lugo, a 23 de xullo de 2020. Fdo. Diana Freiría Barreiro AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES DE LA TESIS Procedimientos de escalado de la producción de esporas del hongo parasiticida Duddingtonia flagrans Los Doctores Dª. María Sol Arias Vázquez y D. José Pedreira García INFORMAN: Que la presente Tesis se corresponde con el trabajo realizado por Doña Diana Freiría Barreiro bajo nuestra dirección, y a utorizamos su presentación, considerando que reúne l o s r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. En Lugo, a 23 de xullo de 2020. María Sol Arias Vázquez José Pedreira García Financiación El presente estudio ha sido realizado con cargo a los Proyectos de Investigación:  “Incorporación de hongos parasiticidas autóctonos a piensos comerciales para prevenir la infección de animales de renta” (AGL2012-34355; Ministerio de Economía y Competitividad; FEDER).  “Formulación de esporas de hongos parasiticidas en gelatinas comestibles para prevenir las helmintozoonosis transmitidas por el suelo” (CTM2015-65954-R; Ministerio de Economía y Competitividad; FEDER).  “Investigacion orientada al diagnóstico, control y prevención de infecciones parasitarias, en especial zoonosis” (RYC-2016-21407; Ministerio de Economía, Industria y Competitividad).  “Desenrolo dun biocida sustentable de acción parasiticida no solo” - Modalidade C. Proxectos de excelencia - Consolidación e estruturación 2018 (ED431F 2018/03; Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, Xunta de Galicia). Origen de las imágenes y gráficos de la presente Memoria Las figuras, imágenes y esquemas que se presentan en esta Memoria son originales de la autora y del Grupo de Investigación COPAR (GI2120). Agradecimientos Ha sido un largo camino hasta llegar aquí, y expresar mis agradecimientos me parece casi tan obligado como referenciar fuentes bibliográficas. Un trabajo de investigación es siempre fruto de ideas, proyectos y esfuerzos previos que corresponden a otras personas. Es también nuestro caso, y es por eso que quiero expresar mi más sincero agradecimiento: A mis directores, que han sido en realidad bastante más que eso: a mi querido Dr. José Pedreira García, porque estoy convencida de que este trabajo nunca hubiese llegado a existir sin su mano guía; y a la Profesora Dra. María Sol Arias Vázquez, a la que debo agradecer toda su confianza, esfuerzo e implicación desde el inicio de este trabajo. A los Catedráticos del Departamento de Patología Animal, Profa. Dra. Mª Patrocinio Morrondo Pelayo y Prof. Dr. Pablo Díez Baños, por darme ya hace muchos años, la oportunidad única de formar parte de un grupo de investigación maravilloso. Estoy en deuda con vosotros. A los Dres. Rosario Panadero Fontán, Ceferino López Sández, Pablo Díaz Fernández y Rita Sánchez-Andrade Fernández por haberme ayudado desde mis comienzos y por todos los buenos momentos que pasamos juntos, que desde luego no han sido pocos. Habéis sido unos profesores magníficos y sois unos grandes compañeros. Dr. Adolfo Paz Silva: no hay aquí líneas suficientes que puedan contener todo mi agradecimiento. Gracias Adolfo, por tu dedicación, paciencia y tu implicación; por el respeto a mis sugerencias e ideas y por toda la supervisión que hay detrás de esta Tesis Doctoral. Sin su apoyo este trabajo nunca se habría escrito y, por eso, este trabajo es también el suyo. Medir mis agradecimientos hacia Adolfo para no ser acusada de aduladora no es sencillo… Al Dr. José Luis Suárez García de Paredes, del que guardo un recuerdo extraordinario. A mi queridísimo hijo Damián que me ha convertido en mejor persona, a mi marido Miguel que siempre está para lo bueno y lo malo; a mis padres por ser los pilares de mi vida y por toda la paciencia que han tenido conmigo. A mis hermanos Juan, Georgina y Rafael: con ellos compartí una infancia alborotada y feliz que guardo en el recuerdo. Gracias a mis amigos, que desde hace tanto tiempo me han prestado su amistad; me hacen feliz y son un gran apoyo moral y humano. Para mí son tan necesarios en los momentos difíciles de mi vida como en los buenos. Gracias Julia, Sandra, Carmencita, Marta Casal, Mónica Tel, y demás. Sois un tesoro. A todos los que, de una manera u otra, han contribuido a que esta Tesis Doctoral sea una realidad. Índice 1.- ANTECEDENTES ......................................................... 3 1.1. UTILIDAD DE HONGOS .......................................................................... 3 1.2. HONGOS CON ACTIVIDAD PARASITICIDA ............................................. 5 1.2.1. Ovicidas ........................................................................................ 7 1.2.2.- Larvicidas .................................................................................... 8 1.2.3.- Entomopatógenos .................................................................... 10 1.2.4. Transición de comportamiento saprófito a parasiticida ....... 11 1.3. ESTRUCTURA Y MORFOLOGÍA DE HONGOS ........................................ 12 1.4. METABOLISMO DE HONGOS ............................................................... 17 1.4.1. Nutrición .................................................................................... 19 1.5. MULTIPLICACIÓN DE ESTADIOS FÚNGICOS ........................................ 22 1.5.1. Factores relacionados con la esporulación de hongos ........... 28 1.6. PROPAGACIÓN DE HONGOS EN MEDIOS DE CULTIVO .......................... 29 1.6.1. Medios sólidos ........................................................................... 30 1.6.2. Medios líquidos ......................................................................... 34 1.6.3. Medios bifásicos ........................................................................ 36 1.7. LEGISLACIÓN RELACIONADA CON EL EMPLEO DE HONGOS PARA EL CONTROL PARASITARIO ............................................................................. 38 1.7.1. Biocidas ...................................................................................... 38 1.7.2. Aditivos alimentarios .................................................................. 38 1.7.3. Distribución de hongos en explotaciones agropecuarias ............ 39 2.- OBJETIVOS................................................................. 43 3.- DISEÑO DEL ESTUDIO ............................................. 47 4.- ENSAYO I: Producción de esporas en medios sólidos con agar.............................................................................. 51 4.1. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................... 51 4.1.1. Preparación de placas madre ................................................... 51 DIANA FREIRÍA BARREIRO 4 cuadra árabes que utilizaban mohos para curar llagas de caballos (Keyes et al., 2003). Desde hace algunos años, se ha impulsado la utilización de ciertas especies en la biodegradación de residuos industriales o agrícolas. Por ejemplo, se ha aconsejado el empleo de la especie Pleurotus ostreatus, aislada a partir de ostras, en la eliminación de vertidos de petróleo (Jerusik, 2010; Kulshreshtha et al., 2014). Un número importante de estos organismos son saprófitos, y se nutren a partir de materia orgánica que descomponen mediante la liberación de diferentes sustancias, motivo por el que suscitan el interés en procesos industriales (Walker y White, 2018). En la Tabla 1 se resumen las principales aplicaciones biotecnológicas de ciertas especies de hongos. Algunas resultan sobradamente conocidas, y ya desde antíguo se menciona el empleo de especies de Penicillium en la elaboración de cierto tipo de quesos, para conferirles un aroma, sabor y textura característicos. Tabla 1.- Algunas especies de hongos resulta de interés en procesos biotecnológicos. Procedimiento Especie de hongo Cita Maduración de quesos Penicillium camemberti, P. roqueforti Chávez et al. (2010) Síntesis de antibióticos P. chrysogenum, P. fuscum, P. camembertii/clavigerum Berezow (2017) Producción de enzimas Ganoderma enigmaticum, Trametes ljubarskyi Gudikandula et al. (2017) Biodegradación de residuos industriales o agrícolas Pleurotus ostreatus Jerusik (2010), Kulshreshtha et al. (2014) Blanqueo de papel Penicillium citrinum, Trichoderma reesei Sigoillot et al. (2005) Obtención de cosméticos Agaricus subrufescens, Choiromyces maeandriformis Hyde et al. (2010) Alimento para veganos (Quorn®) Fusarium venenatum Berka et al. (2004) 1. ANTECEDENTES 5 Otra aplicación prometedora de hongos es en el blanqueamiento de pasta de papel, que permitirá evitar el empleo de productos químicos altamente contaminantes (Sigoillot et al., 2005). También se ha encontrado aplicabilidad en la obtención de cosméticos (Hyde et al., 2010). Por último, resulta notable la producción de substitutos alimentarios para veganos, que se comercializan bajo el nombre de Quorn® (Tabla 1), y que se obtienen mediante la participación de Fusarium venenatum (Berka et al., 2004). Finalmente, es importante tener en cuenta que la ingesta de hongos comestibles proporciona elementos como selenio, potasio, riboflavina, niacina, vitamina D o proteínas (Sadler, 2003; Goyal et al., 2016). 1.2. HONGOS CON ACTIVIDAD PARASITICIDA Entre los hongos filamentosos del suelo, se han identificado especies saprofitas capaces de alimentarse a partir de algunos estadios parasitarios (huevos, larvas, adultos) (Tabla 2), enfocando su actividad antagonista sobre diferentes fases. Tabla 2.- En el suelo existen hongos filamentosos antagonistas de diferentes estadios parasitarios. (EP: entomatopatógeno; A: adulto). Familia Especie Parásito diana Actividad Zygomycetes Pandora neoaphidis Acyrthosiphon pisum Musca domestica EP Entomophtora spp. Aphididae Formica polyctena EP Conidiobolus spp. Calliphora spp. Musca domestica EP Mucor circinelloides Fasciola hepatica Calicophoron daubneyi Ascaris suum Toxocara canis Toxascaris leonina Toxocara vitulorum Trichuris spp. Ixodes scapularis Rhipicephalus sanguineus Ovicida DIANA FREIRÍA BARREIRO 6 Ascomycetes Beauveria bassiana Xylotrechus arvicola Acanthoscelides obtectus Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus microplus Amblyomma cajenennse EP (A) Metarhizium brunneum Rhipicephalus spp. Amblyomma spp. Ixodes scapularis Hyalomma spp. Varroa destructor EP (A) Lecanicillium lecanii Matsucoccus matsumurae Rhipicephalus microplus Ovicida Pochonia chlamydosporia Fasciola hepatica Calicophoron daubneyi Ascaris suum Toxocara canis Toxascaris leonina Toxocara vitulorum Trichuris spp. Ixodes scapularis Rhipicephalus sanguineus Ovicida Purpureocillium lilacinum B. procyonis, T. canis, T. hydatigena Ovicida Trichoderma spp. B. procyonis, T. canis Ovicida Duddingtonia flagrans Trichostrongylus, Ciatostominos, Strongylus spp. Larvicida Monacrosporium spp. Arthrobotrys spp. Prácticamente, todos los hongos antagonistas de parásitos conocidos se incluyen dentro de los Filos Ascomycetes y Zygomycetes (Hernández, 2019), y engloban a los géneros Purpureocillium, Pochonia, Arthrobotrys, Duddingtonia, Monacrosporium, Verticillium, Mucor y Trichoderma, frecuentemente empleados en el control de parásitos vegetales y de animales (Sidiqqui y Mahmood, 1996; Braga et al., 2007; Arias et al., 2011; Fitz-Aranda et al., 2015). En el presente estudio se ha considerado oportuno señalar su actividad sobre los diferentes estadios, resultando en ovicidas, larvicidas y entomopatógenos. 1. ANTECEDENTES 7 1.2.1. Ovicidas Entre los mecanismos de propagación que desarrollan los parásitos, es necesario tener en cuenta que en ocasiones se realiza mediante la liberación de ooquistes o quistes de protozoos en las heces, así como de huevos de helmintos y garrapatas. En ocasiones, la fase infectante es un huevo que contiene un estadio larvario en su interior (L2 en ascáridos, L1 en tricúridos), y en otras (garrapatas) se libera una larva, que posteriormente se transformará en ninfa y finalmente en adulto (Hernández et al., 2019). Como se representa en la figura 1, el mecanismo que desarrollan los hongos ovicidas incluye una fase de contacto, debido a que detectan la presencia de huevos de parásitos próximos. En consecuencia, desarollan hifas que se adhieren a la cubierta; cuando lo hacen en ángulo recto, son capaces de penetrar al interior, proceso favorecido por la liberación de enzimas con actividad proteolítica (Neira-Vielma et al., 2018). En la fase de penetración intervienen dos estructuras que evitan la aparición de soluciones de continuidad en la cubierta, el apresorio o extremo de la hifa que se adhiere, y el haustorio, responsable de la absorción del contenido interno (Fig. 2). Cuando el hongo ingiere todo el contenido interno a través del haustorio, ocurre la etapa de propagación, y ocurre la colonización de todo el interior, se producen esporas, que finalmente abandonan el huevo en busca de más alimento (Arroyo, 2017). Fig. 1. Fases de la actividad ovicida desarrollada por hongos. Contacto + Adhesión Penetración Propagación DIANA FREIRÍA BARREIRO 8 Fig. 2. Estructuras que participan en la penetración de huevos. Apresorio Haustorio 1.2.2.- Larvicidas Algunas especies de parásitos se propagan mediante la eliminación de huevos, y una vez en el suelo (heces, hierba) y bajo condiciones climáticas adecuadas, se origina en el interior una larva, que eclosiona y una vez fuera del huevo experimenta diferentes mudas hasta alcanzar el estadio infectante. Un ejemplo muy conocido lo constituyen los nematodos estrongílidos. Debido a que se trata de fases móviles, el empleo de hongos ovicidas resulta controvertido, especialmente en áreas con climas tropicales/subtropicales con elevado grado de humedad y temperatura, que estimulan el desarrollo y aparición de fases infectantes en periodos de tiempo más breves que el intervalo requerido 1. ANTECEDENTES 9 para la actividad fúngica. Por este motivo, se han utilizado con gran éxito especies atrapanematodos de los géneros Arthrobotrys, Duddingtonia y Monacrosporium, que se caracterizan porque elaboran trampas en las higas, que retienen los estadios larvarios cuando se mueven por el suelo (o heces). Hernández (2019) definió tres etapas en la actividad larvicida de hongos filamentosos (Fig. 3). En la primera tiene lugar la captura de las larvas cuando se desplazan, y se requiere que el micelio del hongo haya alcanzado un determinado grado de desarrollo. Posteriormente, mediante la génesis de hifas asimilativas, que penetran al interior de las larvas, y en la fase siguiente asimilan los nutrientes. Aunque estudios preliminares señalaron que las trampas se formaban en respuesta a la presencia de larvas vivas y en movimiento (Grønvold et al., 1996; Boguś et al., 2005), estudios realizados en los últimos años han descartado esta hipótesis, demostrando que los anillos aparecen incluso cuando se ponen en contacto hongos con larvas muertas, o con productos antigénicos de trematodos (Suárez, 2017; Arias et al., 2013a). Es importante destacar que las larvas de vida libre o no parásitas no son retenidas en estos anillos (Palomero, 2015; Saumell et al., 2016). Fig. 3. Fases de la actividad larvicida desarrollada por hongos. Captura Penetración Asimilación DIANA FREIRÍA BARREIRO 10 1.2.3.- Entomopatógenos Hasta el momento, algunas especies de zigomicetos entomopatógenos se utilizan en el control de parásitos de plantas, y existen algunas referencias en el control de mosquitos (Scholte et al., 2004; Pucheta et al., 2006). Cuando las esporas se adhieren a la superficie del insecto, normalmente en fase larvaria, se origina la formación de tubos germinativos, a través de los cuales se secretan proteasas, quitinasas, quitobiasas, upasas y lipooxigenasas, que degradan la cutícula y colaboran en la penetración mediante presión mecánica del apresorio (estructura especializada del tubo germinativo). En el interior del hospedador, las hifas se diseminan a través del hemocele e invaden diferentes tejidos hasta provocarle la muerte. Cuando los nutrientes se agotan, se inicia el crecimiento micelar que invade todos los órganos. Finalmente, las hifas salen a través de la cutícula, e inician la formación de esporas. Fig. 4. Fases de la actividad entomopatógena. Contacto + Adhesión Penetración Propagación 1. ANTECEDENTES 11 1.2.4. Transición de comportamiento saprófito a parasiticida En el suelo, los hongos desarrollan una función crucial debido a que se trata de los principales agentes que intervienen en la descomposición de la materia orgánica a moléculas inorgánicas (Gadd, 2007). Casi todas las especies adoptan un estilo de vida saprófito o simbionte, pero un reducido porcentaje (inferior al 0,5%) son carnívoros y tienen la capacidad de atrapar y digerir nematodos, rizópodos y rotíferos mediante la elaboración de estructuras especializadas (McInnes, 2003). El mecanismo por el que algunas especies puedan pasar de una forma saprófita a otra predadora ha suscitado gran interés científico, postulándose la carencia de carbono y nitrógeno como un estímulo, o bien la presencia de materia fecal (Dackman y Nordbring-Hertz, 1992; Anan’ko y Teplyakova, 2011). Estudios más recientes señalan la intervención de ciertas bacterias que participan en el marcado de ciertos nematodos. Wang et al. (2014) indicaron que algunos nematodos ingieren bacterias del suelo, que liberan urea, que actúa como inductor de la transformación del hongo filamentoso Arthrobotrys oligospora hasta su forma predadora de larvas de gastrointestinales que se encuentran en el suelo (estadios L2 y L3). También se ha apuntado que el origen de esta posibilidad de intercambiar forma saprófita y predadora se encuentra en las épocas en las que se produjo la extinción en masa de seres vivos, con un elevado contenido en carbono y pobre en nitrógeno, de ahí que la posibilidad de tomar el nitrógeno diractamente de organismos vivos supuso una ventaja competitiva sobre los hongos saprófitos estrictos (Yang et al., 2007; 2012). Es importante tener en cuenta que se asocia la fase predadora de estas especies de hongos con el desarrollo de diferentes elementos o estructuras, como por ejemplo anillos constrictores o trampas adhesivas en el caso de atrapanematodos (Fig. 3). Por tal motivo, algunas investigaciones señalan que las trampas se producen en presencia de nematodos vivos (con movimiento) o por péptidos o extractos de nematodos (Nordbring-Hertz, 1977; Liu et al., 2012). Otros estudios indicaron que la elaboración de trampas y la producción de clamidosporas de D. flagrans se estimula en presencia de helmintos DIANA FREIRÍA BARREIRO 12 muertos (trematodos, ascáridos y oxiúridos), y de sus productos antigénicos de excreción/secreción (Arias et al., 2013b). El concepto de nemina ha venido subrayándose desde hace décadas como un conjunto de sustancias que se encuentran en la cubierta de nematodos parásitos, que constituye una señal para la producción de trampas en hongos filamentosos (Pramer y Stoll, 1959). Al principio se estableció que podría tratarse de algún aminoácido o de un pequeño polipéptido de nematodos parásitos (Pramer y Kuyama, 1963), pero Arias et al. (2013b) comprobaron que la presencia de trematodos adultos, o de extractos metabólicos (antígenos de excreción/secreción) de Fasciola hepatica y Calicophoron daubneyi, estimulaban el desarrollo de D. flagrans; también se demostró que larvas de especies que en condiciones naturales nunca entrarían en contacto con estos hongos, como Anisakis spp., servían de estímulo para el desarrollo de micelio y producción de trampas. Hsueh et al. (2017) concluyeron que existen diferentes aminoácidos, así como extractos de nematodos, que pueden estimular la creación de trampas por hongos nematófagos. A este respecto, se ha investigado el papel de ascarósidos, una familia de moléculas de señalización sintetizadas por nematodos, en la inducción de elaboración de trampas (Choe et al., 2012; Hsueh et al., 2013). 1.3. ESTRUCTURA Y MORFOLOGÍA DE HONGOS La pared celular está formada por capas o estratos constituidos por polímeros polisacáridos como quitina, celulosa, glucanos y mananos. También se describen proteínas asociadas a polisacáridos y lípidos. Se trata de un exoesqueleto rígido que protege a la célula y condiciona su nutrición, que como ya se ha indicado,se produce por absorción de nutrientes digeridos directamente del medio o después de la participación de enzimas liberadas, dado que la estructura de la pared impide la endocitosis. Esto supone una notable diferencia con las especies vegetales, que también presentan paredes celulares de celulosa, y además son capaces de sintetizar carbohidratos mediante fotosíntesis. Atendiendo a su tamaño se distinguen dos tipos de hongos (Fig. 5), macroscópicos o macromicetos y microscópicos o micromicetos, que a 1. ANTECEDENTES 13 su vez se pueden encontrar como estructuras unicelulares (levaduras) o pluricelulares (mohos u hongos filamentosos), e incluso existen especies dimórficas que presentan las dos formaciones. Fig. 5.- Clasificación de los hongos en función del tamaño. Algunos hongos crecen de forma lineal y dan lugar a largos filamentos, las hifas, que se desarrollan en general mediante elongación del extremo distal, originando en ocasiones micelios visibles macroscópicamente, como por ejemplo en mohos o setas comestibles. Desde el punto de vista de la propagación, es importante tener en cuenta que prácticamente cada fragmento de una hifa se puede convertir en un potencial punto de crecimiento, que dará lugar a nuevos individuos. Ciertas especies de hongos no llegan a desarrollar un micelio verdadero, como en el caso de las levaduras, hongos unicelulares. En función de la presencia de hifas septadas o tabicadas, se definen micelios septados y micelios cenocíticos (Carrillo, 2003) (Fig. 6). Según la localización, se describe el micelio vegetativo o parte que se introduce en los sutratos de los que se alimenta, y el micelio aéreo o reproductor, que se ubica en la superficie y contiene las estructuras reproductoras. Hongos Macromicetos Micromicetos Levaduras Hongos filamentosos DIANA FREIRÍA BARREIRO 20 Fig. 9.- Principales rutas metabólicas de los hongos. Se trata de especies quimio-organotróficas y no-diazotróficas, lo que significa que precisan fijar formas de compuestos orgánicos para sus necesidades de energía y carbono, y que no son capaces de fijar nitrógeno (Tabla 4). Para lograr energía y carbono, se sirven de glúcidos de diferente tamaño, desde hexosas como la glucosa hasta polisacáridos como la celulosa o el almidón, y en ocasiones algunas especies pueden emplear hidrocarburos aromáticos como la lignina. En relación con los requerimientos de oxígeno, la mayoría de los hongos conocidos son aeróbicos, más bien microaerofílicos, y precisan de tensiones de oxígeno inferiores a las normales en la atmósfera. El aporte de nitrógeno lo obtienen a partir de sales de amonio o como aminoácidos. El sulfato de amonio se emplea con frecuencia 1. ANTECEDENTES 21 como fuente de nitrógeno porque proporciona además una fuente de azufre aprovechable. Existen algunas especies que pueden crecer sobre nitratos, e incluso aprovechar nitritos, debido a la presencia de nitrato y nitrito reductasas. Es importante tener en cuenta que muchas especies son capaces de obtener nitrógeno mediante la liberación de enzimas proteolíticas que hidrolizan proteínas y liberan aminoácidos a partir de sustratos como la urea. Tabla 4.- Macronutrientes y micronutrientes más frecuentemente requeridos por hongos. Elemento Fuentes más frecuentes Función celular C Glúcidos Estructural / Energía O Aire Respiración / Síntesis de ergosterol y ácidos grasos insaturados N Sales de amonio, urea, aminoácidos Estructural / Funcional como proteínas y enzimas P Fosfatos Energía / Ácidos nucleicos / Estructura K Sales de potasio Balance iónico / Enzimas Mg Sales de magnesio Enzimas / Estructural S Sulfatos, metionina Aminoácidos y vitaminas Cu Sales de cobre Transducción Mn Sales de manganeso Enzimas Fe Sales férricas Citrocromos Las fuentes más importantes de azufre incluyen sulfatos, sulfitos, tiosulfatos, metionina y glutation, así como sulfatos inorgánicos y la metionina aminoácida sulfúrica. El fósforo resulta esencial para realizar la biosíntesis de ácidos nucleicos, fosfolípidos, ATP, glicofosfatos y polifosfatos. Junto con el nitrógeno, pueden ser factores limitantes del crecimiento en el ambiente, de modo que los hongos filamentosos han desarrollado DIANA FREIRÍA BARREIRO 22 diversas estrategias bioquímicas y morfológicas para capturarlo en el ambiente. En relación con los minerales, son necesarios macronutrientes como potasio y magnesio para el crecimiento, en tanto que otros como el manganeso, calcio, hierro o cobalto se requieren a concentraciones micromolares. En ocasiones, algunas especies precisan de compuestos orgánicos como vitaminas, purinas, pirimidinas, nucleósidos, nucleótidos, aminoácidos, ácidos grasos y esteroles, que actúan como factores de crecimiento. En la figura 10 se exponen algunas de los ejemplos más característicos de rutas enzimáticas desarrolladas por hongos para la degradación de compuestos poliméricos. Fig. 10.- Rutas enzimáticas descritas en el metabolismo de hongos. 1.5. MULTIPLICACIÓN DE ESTADIOS FÚNGICOS Los hongos pueden realizar reproducción asexual o sexual, clasificándose de este modo las especies en anamorfas y teleomorfas, respectivamente. La reproducción asexual es la más frecuente, sobre todo en condiciones in vitro. Se ha demostrado que las hifas de hongos pueden extenderse casi de forma ilimitada mediante crecimiento apical, cuando disponen de nutrientes y condiciones ambientales adecuadas. 1. ANTECEDENTES 23 En laboratorio se utilizan con frecuencia medios de cultivo en agar enriquecido con compuestos ricos en carbono y pH ácido, como extractos de malta, dextrosa-patata o caldo. En condiciones industriales, es preciso optimizar la fermentación de hongos en relación con la aplicación específica a la que están destinados, y el procedimiento de producción. Por ello, resulta indispensable tener en cuenta las diferentes vías que existen para la propagación de hongos filamentosos (Fig. 11). Numerosas especies pueden hacerlo mediante la formación de esporas a través de reproducción sexual, que tiene lugar de forma infrecuente en condiciones in vitro; mediante reproducción asexual que da lugar a conidios y clamidosporas, y también por micelio. Aunque se describen mecanismos de reproducción sexual, en realidad no existen evidencias o son difíciles de encontrar cuando se procede a la propagación de hongos filamentosos en condiciones de laboratorio. No se dispone de datos relacionados con D. flagrans, pero algunas investigaciones señalan que en algunas especies la reproducción sexual Fig. 11.- Los hongos filamentosos se propagan mediante la formación de esporas que se originan a través de diferentes procesos. Esporas originadas mediante reproducción sexual Conidios: esporas resultado de reproducción asexual Clamidosporas: esporas en latencia (almacenamiento) Micelio DIANA FREIRÍA BARREIRO 24 ocurre una vez al año (Nieuwenhuis y James, 2016). Ciertos hongos patógenos se reproducen de forma asexual durante la fase de crecimiento si disponen de gran cantidad de nutrientes, pero cuando disminuyen, en condiciones ambientales desfavorables para el desarrollo, emplean la reproducción sexual (Dyer y Paoletti, 2005). Lo habitual es que se formen esporas mediante reproducción asexual, y por divisiones mitóticas se originan diferentes estadios. Los conidios tienen resistencia elevada a la desecación, y normalmente surgen a partir de células o hifas conidiógenas, que se diferencian del micelio en conidióforos (Fig. 12). Se ha descrito que ante condiciones de estrés, tiene lugar la formación de conidios mediante reproducción asexual simplificada o microcíclica, en la que los conidios originan directamente otros conidios sin formar micelio (Jung et al., 2014). Esta podría ser la explicación a la presencia de un número elevado de esporas acompañado de un reducido desarrollo de hifas vegetativas, que tiene lugar al emplear en medios de cultivo líquido (Fig. 13). Fig. 12.- Los hongos filamentosos se propagan mediante la formación de esporas que se originan a través de diferentes procesos. 1. ANTECEDENTES 25 Las clamidosporas son esporas de resistencia o latencia, con una doble pared que facilita su clasificación morfológica. Pueden ser intercalares o terminales, en función de que se originen en la parte media de las hifas o en el extremo distal (Fig. 14). Se trata de esporas de pared gruesa y morfología ovoide o elíptica, de tamaño aproximado de 25-50 µm de largo por 10-15 µm de ancho, si bien estas características varían en función de la composición de los medios en los que crecen. Una vez formadas, se separan del micelio, y en condiciones favorables, dan lugar a nuevo micelio. Se ha establecido que ante condiciones ambientales desfavorables, tiene lugar la transferencia de sustancias alimenticias de reserva desde células de hifas somáticas a otra célula, conduciendo al engrosamiento de su pared celular. Fig. 13.- Mediante reproducción asexual simplificada (microcíclica) se originan conidios sin la formación previa de micelio. DIANA FREIRÍA BARREIRO 26 Fig. 14.- Las clamidosporas son esporas que se originan de forma asexual, intercalándose en el micelio, o en la porción apical de las hifas. 1. ANTECEDENTES 27 Debido a que algunas especies son capaces de sobrevivir al tránsito por el tracto gastrointestinal, salir en las heces al exterior y desarrollar micelio en presencia de materia orgáncia en descomposición o de larvas de nematodos, se han venido empleando en pruebas de control biológico (Gronvold et al., 1993; Larsen et al., 1995; Fernández et al., 1999; Mendoza et al., 2006; Madeira de Carvalho et al., 2012; Healey et al., 2018). En la figura 15 se representan los mecanismos más habituales de esporulación en hongos Ascomycetes, Basidiomycetes o Zygomycetes, que son la formación asexual de esporas (conidios y clamidosporas) y la esporulación microcíclica. Como se puede apreciar, la diferencia fundamental consiste en la ausencia de la formación de micelio en esta última. Fig. 15.- En una gran parte de hongos filamentosos se describe la formación asexual de esporas y la esporulación microcíclica. DIANA FREIRÍA BARREIRO 28 1.5.1. Factores relacionados con la esporulación de hongos Como ya se ha indicado previamente, las esporas de hongos son células especializadas que actúan como elementos de reposo o de dispersión (Kirk et al., 2008). Estas estructuras aportan una notable información para la identificación y clasificación de especies fúngicas, pero existen algunos aislados que no esporulan en los medios empleados con frecuencia, como agar-dextrosa patata (Potato Dextrose Agar, PDA). Entre las posibles causas, se considera que la esporulación es un proceso complejo en el que participan factores ambientales y endógenos. Ciertas investigaciones señalaron que la luz puede constituir un estímulo importante para la formación de conidios, y por ello se ha expuesto el micelio de algunas especies de Ascomycetes, Basidiomycetes y Zygomycetes a luz próxima a UV y a luz azul, obteniéndose resultados muy satisfactorios (Xu et al., 2009). No se ha determinado todavía el mecanismo por el que puede suceder este fenómeno, pero se ha demostrado que las longitudes de onda de 350550 nm son más eficaces (Dahlberg y Etten, 1982). Un número importante de factores nutricionales influyen de forma significativa en la formación de esporas, como las fuentes de carbono, nitrógeno o microelementos, estableciéndose que algunos hongos presentan una elevada especificidad por algunos nutrientes (Su et al., 2012). En un experimento desarrollado con diferentes hongos empleados en control biológico, Gao et al. (2007) comprobaron que Lecanicillium lecanii, Trichoderma viridae y Metarhizium anisopliae producían las tasas más elevadas de esporas en un medio con un ratio C:N de 160:1. La formación de esporas tiene lugar cuando la tasa de crecimiento se reduce, y se dificulta bajo condiciones que favorecen el crecimiento micelial rápido. La inanición o la limitación de nutrientes suponen un estímulo para la esporulación, razón que ha llevado a la aplicación de medios con escasos nutrientes (empobrecidos) (Wulandari et al., 2009), como agar-agua o PDA a la mitad o a un cuarto. 1. ANTECEDENTES 29 Algunos suplementos químicos parecen ejercer un estímulo de la esporulación, como la biotina, que pueden incentivar la expresión selectiva de determinados genes, o el CaCO3 (Masangkay et al., 2000). La temperatura es un factor que también interviene en la esporulación microcíclica (Hanlin, 1994). 1.6. PROPAGACIÓN DE HONGOS EN MEDIOS DE CULTIVO El crecimiento de los hongos comienza con una o varias esporas que permanecen en latencia hasta que se consiguen los nutrientes necesarios para su activación (Krull et al., 2013). La germinación se inicia con un proceso de hinchazón provocado por la gran cantidad de agua que absorben, que provoca que las esporas se extiendan de forma isotrópica, después de la cual surge un tubo germinal (Osherov y May, 2001). El crecimiento de las hifas está polarizado, con una tasa de extensión lineal hacia el ápice de hifas. A lo largo de las hifas, los precursores de paredes celulares y proteínas que participan en la síntesis de pared celular son transportados en vesículas desde el retículo endoplásmico al extremo de la hifa. La elongación de hifas lleva a la formación de septos y compartimentos en las hifas, y debido a la acumulación y exceso de vesículas de transporte, tiene lugar la ramificación en compartimentos subapicales. Cuando una hifa alcanza una cierta longitud, se origina una ramificación lateralmente a la original (Barry y Williams, 2011). El ciclo típico de hongos filamentosos incluye la esporulación después de un periodo de crecimiento vegetativo. Como se ha indicado anteriormente, los hongos filamentosos producen diferentes tipos de esporas asexuales, macroconidios, microconidios y clamidosporas. La producción asexual de esporas es crítica porque contribuyen a la supervivencia de los hongos bajo condiciones ambientales desfavorables, como una medida de dispersión de un punto a otros potencialmente viables. Las esporas permanecen latentes hasta que concuren condiciones ambientales favorables, y entonces comienzan a hincharse con agua que contiene nutrientes apropiados, y se produce el crecimiento vegetativo de las hifas que dará lugar a tubos germinales. Sin embargo, algunas especies de hongos exhiben un ciclo asexual DIANA FREIRÍA BARREIRO 36 Es importante tener en cuenta que en medios líquidos, los hongos pueden mostrarse desde un punto de vista de morfología macroscópica, como una masa dispersa más o menos viscosa, a pellets esféricos formados por agregados de hifas (Krull et al., 2013; Veikeret al., 2018). En base a la interrelación que se establece entre la morfología de los pellets y los procedimientos de control y de productividad, se ha llegado a establecer que el control de los procesos en el biorreactor requiere pellets pequeños y densos; sin embargo, esta morfología podría dificultar la llegada de nutrientes al interior del pellet, de modo que se considera que la productividad óptima está asociada a un tamañao más grande y menos denso (Dynesen y Nielsen, 2003). No existen datos acerca de la formación de aglomerados en el caso de D. flagrans. 1.6.3. Medios bifásicos En algunas investigaciones se ha indicado que la mayoría de los hongos filamentosos no forman esporas en cultivos líquidos (Trinci, 1972), y aquellos que las originan, se han dividido en dos grupos; algunos como Verticillium agraricinum forman esporas incluso durante la fase de crecimiento exponencial bajo condiciones de exceso de Fig. 19.- Esporas de D. flagrans en medio líquido. 1. ANTECEDENTES 37 nutrientes, en tanto que otros como Penicillium chrysogenum solo lo hacen en ausencia de nutrientes (Righelato et al., 1968; McKoy y Trinci, 1987). En este último grupo, se puede promover la esporulación mediante sistemas de cultivo de dos fases, en los que en el primero se produce biomasa vegetativa, y en el segundo se emplean condiciones de escasez de nutrientes para inducir la formación de clamidosporas. Este procedimiento ofrece una elevada flexibilidad a un coste razonable, y contribuye a reducir el riesgo de contaminación que se produce en fermentaciones en medios sólidos (Jenkins et al., 1998). Gardner et al. (2000) cultivaron la cepa Troll A de D. flagrans en medio MYPG durante 2 días, y a continuación transfirieron la biomasa obtenida a medio Vogel-Boner suplementado con peptona, caseína, acetato sódico, almidón o glicerol. Los resultados mostraron que la adición de 5 g de peptona por litro de medio proporcionaba un rendimiento medio de 4·105 clamidosporas/mL, por 5,7·105 clamidosporas/mL si se añadían 10 g glicerol/L o 6,3·105 clamidosporas/mL al adicionar 10 g almidón/L medio. De este modo, concluyeron que no existía un beneficio obvio de la aplicación de un sistema bifásico caracterizado porque la biomasa producida bajo condiciones nutricionales idóneas se transfería a un medio empobrecido para fomentar la esporulación. Se concluyó que las clamidosporas de D. flagrans se pueden producir en medios de cultivo líquido. Después de introducir un inóculo de agar con D. flagrans en 150 mL de medio líquido Saboraud y 0,05% agar, e incubar a 25ºC durante 7 días, Santurio et al. (2009) añadieron este medio sobre 400 g de arroz y lo mantuvieron a temperatura ambiente durante 30 días. A continuación se lavaron los granos, se filtraron y centrifugaron. El pellet resultante se liofilizó, comprobándose que se obtenía un rendimiento de 1x105 clamidosporas/gramo de materia seca. El análisis de la capacidad predadora de estas clamidosporas mostró que el 69% de L3 de estrongílidos resultaban atrapadas, concluyéndose que las clamidosporas de D. flagrans permanecen intactas y viables después del proceso de liofilización. DIANA FREIRÍA BARREIRO 38 1.7. LEGISLACIÓN RELACIONADA CON EL EMPLEO DE HONGOS PARA EL CONTROL PARASITARIO El destino final de los hongos puede condicionar los métodos aplicados para su propagación, puesto que cada modo de distribución requiere de una formulación con unas características concretas. Recientemente, se ha indicado que las formulaciones más interesantes desde un punto de vista comercial para el hongo M. circinelloides resultan en biocidas o aditivos alimentarios (Hernández, 2019). 1.7.1. Biocidas Son aquellas sustancias activas, preparados (que contienen una o más sustancias activas) o microorganismos cuyo objetivo es destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo nocivo por medios químicos o biológicos. Hasta la fecha se conocen 23 productos se clasifican en cuatro grandes grupos, desinfectantes y biocidas generales, conservantes, plaguicidas y otros biocidas (Hernández, 2019). 1.7.2. Aditivos alimentarios En el Reglamento (CE) nº 1831/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de septiembre de 2003 sobre los aditivos en la alimentación animal se establece que un «aditivo para alimentación animal» comprende a todas aquellas sustancias, microorganismos y preparados distintos de las materias primas para piensos y de las premezclas, que se añaden de forma intencionada a los piensos o al agua, con el fin de realizar, en particular, una o varias de las funciones siguientes (apartado 3, artículo 5 del Reglamento (CE) nº 1831/2003): 1) influir positivamente en las características del concentrado alimentario; 2) influir positivamente en las características de los productos animales; 1. ANTECEDENTES 39 3) influir favorablemente en el color de los pájaros y peces ornamentales; 4) satisfacer las necesidades alimenticias de los animales; 5) influir positivamente en las repercusiones medioambientales de la producción animal; 6) influir positivamente en la producción, actividad o bienestar de los animales, especialmente actuando en la flora gastrointestinal o la digestibilidad de los piensos, o 7) tener un efecto coccidiostático o histomonostático 1.7.3. Distribución de hongos en explotaciones agropecuarias En relación con los hongos filamentosos, las experiencias llevadas a cabo hasta la fecha han consistido, de forma mayoritaria, en la administración de clamidosporas de Duddingtonia flagrans por vía oral, como aditivo alimentario; también se han realizado algunas en las que las clamidosporas se administraban en forma de soluciones acuosas. En ambos casos, se parte de la propagación del hongo en medios sólidos a base de agar-cereales, y las clamidosporas se disuelven en agua para proceder a la mezcla con alimento (Arias et al., 2013a; Arroyo et al., 2017; Carvalho et al., 2009a; Carvalho et al., 2009b; Cortiñas et al., 2015) o administradas directamente vía oral (Hernández et al., 2018a). Puesto que especies como M. circinelloides o D. flagrans son capaces de sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal de diferentes especies animales, esta estrategia garantiza la presencia del hongo directamente en las heces, y así el contacto directo con las formas parasitarias eliminadas por animales infectados. Recientemente, se ha demostrado que las clamidosporas resisten algunos procesos como la pelletización (Arroyo et al., 2016; Hernández et al., 2016; Voinot et al., 2020), lo que constituye un hallazgo muy interesante porque se facilita la administración de hongos parasiticidas sin incrementar las labores en las explotaciones agropecuarias (Arroyo et al., 2016; Hernández et al., 2018b; Voinot et al., 2020). DIANA FREIRÍA BARREIRO 40 2.- OBJETIVOS 2.- OBJETIVOS 43 2.- OBJETIVOS Los antecedentes expuestos previamente llevaron a considerar la necesidad de desarrollar un estudio con el objetivo general de escalar la producción de esporas de Duddingtonia flagrans, estableciéndose los siguientes objetivos concretos: 1.- Analizar la utilidad de medios de cultivo sólidos comestibles para la obtención de cantidades elevadas de esporas del hongo nematófago D. flagrans. 2.- Estudiar el desarrollo de D. flagrans en condiciones de anaerobiosis en medio líquido. 3.- Establecer el rendimiento de un medio de cultivo líquido para la producción de esporas de D. flagrans. 4.- Desarrollar y evaluar un procedimiento de obtención de esporas en dos fases. 5.- Determinar qué medios de cultivo, sólidos o líquidos, resultan más adecuados para el escalado de la producción de esporas de D. flagrans. 44 3.- DISEÑO DEL ESTUDIO DIANA FREIRÍA BARREIRO 52 4.1.2. Preparación de placas Petri con agar comestible y diferentes alimentos Para explorar la posibilidad de proporcionar gelatinas con esporas directamente a animales, se comparó el crecimiento del hongo en agarmarino. También se añadieron trigo, zanahoria y un preparado comercial de caldo de pollo para determinar su efecto sobre la producción de esporas. a) Agar-marino (1%) Se depositaron 10 g de agar comestible en polvo (Agar-Agar®, elaborado a partir de algas, Porto Muiños, A Coruña) en un matraz con 500 mL de agua destilada (Tabla 6), y la mezcla se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 15 min. Una vez que la temperatura descendió a 40-50ºC, se llevó a una cabina de flujo laminar en la que previamente se habían dispuesto placas de polivinilo. Después de añadir 40 mL del medio en cada placa, se dejó enfriar bajo luz UV durante 510 min, poniendo cuidado en que las tapas no estuviesen ajustadas y evitar así la condensación (Fig. 21). En total se prepararon 60 placas con agar-marino al 1% y otras 60 con agar bacteriológico. Tabla 6.- Composición de los medios de cultivo empleados en el ensayo. Alimento Cantidad alimento Agar-marino 1% Trigo Agua destilada Trigo 2,5% 12,5 g 5 g - 482,5 mL Zanahoria 2% 10 g 5 g 12,5 g 472,5 mL Zanahoria 4% 20 g 5 g 12,5 g 462,5 mL Caldo 2% 10 mL 5 g 12,5 g 472,5 mL Caldo 5% 25 mL 5 g 12,5 g 457,5 mL Caldo 10% 50 mL 5 g 12,5 g 432,5 mL 4. ENSAYO I: MEDIOS SÓLIDOS CON AGAR 53 b) Agar-marino-trigo (2,5%) (AMT) El medio AMT se preparó adicionando 12,5 g de trigo autóctono por cada 500 mL de medio final (Tabla 6). Después de triturar la mezcla con una batidora, y una vez que el contenido se homogeneizó, se añadieron 5 g de agar comestible (concentración final del 1%). A continuación se removió toda la mezcla durante unos segundos, y se mantuvo en autoclave a 121ºC / 15 min. Cuando la temperatura descendió de forma suficiente, se llevó el matraz a una cabina de flujo laminar,se vertieron a 40 mL del medio y se dejó gelificar bajo luz UV durante 5-10 min, observando que las placas no estuviesen tapadas para evitar la condensación. El número de placas con AMT solo fue de 60. c) Agar-marino-trigo-alimentos Para obtener agar-marino-trigo-zanahoria (AMTZ), se siguió el protocolo anteriormente citado, con la particularidad de que previamente, se lavaron las zanahorias y se cortaron en rodajas de 1 cm de espesor aproximadamente, que a su vez se dividieron en varios fragmentos, que se incorporaron a la mezcla de trigo y agua antes de someter al autoclave. Se prepararon 60 placas con zanahoria al 2% (10 g en un volumen de 500 mL) y un número idéntico al 4% (20 g en 500 mL). El medio agar-marino-trigo-caldo (AMTC) se elaboró con un preparado comercial de caldo de cocido (Hacendado®) (Tabla 6), compuesto por agua, pollo (1,5%), aromas (contienen leche y mostaza), sal, almidón modificado de maíz, hortalizas (patata, zanahoria, apio, cebolla y puerro) (0,3%), especias (ajo y pimentón), aceite de oliva, grasa de ave, maltodextrina, garbanzo, maltodextrina de patata, almidón de patata, aceite de girasol y extracto de carne. En un erlemmeyer se añadieron 12,5 g de trigo autóctono, 5 g de agar comestible, 10 mL de caldo, y se rellenó hasta 500 mL con agua destilada para preparar AMTC al 2%, en tanto que el volumen de caldo para AMTC 5% fue de 25 mL, y 50 mL para AMTC 10% (Tabla 6). Se prepararon 60 placas con cada uno de los medios de cultivo. DIANA FREIRÍA BARREIRO 54 En la Tabla 7 se resume la composición nutricional de los medios, en base a los datos recogidos en la Agencia Española de Salud y Nutrición en AESAN/BEDCA, Base de Datos Española de Composición de Alimentos v1.0 (2010). Tabla 7.- Composición nutricional de los medios empleados para el desarrollo de D. flagrans. Medio Valor energético Proteínas Hidratos de carbono Lípidos Totales Azúcares Totales Saturados Agarbacteriológico Agar-marino (100 g) 26 kcal 0,5 g 7 g 0,3 g 0 g 0 g Trigo (por 100g) 314kcal 11,7g 71,3g 61g 2g 0,37g Zanahoria (por 100 g) 34kcal 1,25g 9,6g 7g 0,3g 0,05g Caldo (por 100 mL) 10 kcal 0,4g 1,3g <0,5 g 0,3g 0,1g 4.1.3. Siembra de placas con D. flagrans En la figura 22 se muestra el procedimiento seguido para la siembra de placas con distintos medios con D. flagrans. Como se mencionó previamente, se colocaron insertos procedentes de placas cultivadas con el hongo filamentoso, que se retiraron al día siguiente. Fig. 22. Esquema de la siembra de placas Petri con agar con un inserto de placa madre de cultivo puro de D. flagrans (CECT 20825). 4. ENSAYO I: MEDIOS SÓLIDOS CON AGAR 55 En todos los casos, las placas se sellaron con parafilm para evitar la contaminación del medio, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante cuatro semanas aproximadamente, y al cabo de este periodo se observó el desarrollo de micelio (Fig. 23). 4.1.4. Desarrollo del micelio Para determinar el grado de desarrollo del micelio de D. flagrans, cada día se fue delimitando (con ayuda de un rotulador) en el fondo las placas el crecimiento de las hifas, hasta que alcanzaron el borde (Fig. 24) (Suárez, 2017). Una vez finalizado el desarrollo, se midió el desarrollo diario (expresándolo en cm) en tres puntos, se determinó el valor medio y se calculó el ratio de crecimiento, dividiendo el promedio de desarrollo entre el número de días transcurridos: Ratio de crecimiento del micelio= promedio de crecimiento (en cm) díax / X días 4.1.5. Recuento de esporas Cada dos días se tomaron, con una espátula, 0,6-1,5 g de medio de tres puntos diferentes de la placa, que se introdujeron en viales y se mantuvieron en un termoblok a 90ºC durante varias horas (hasta la Fig. 23 Crecimiento de D. flagrans en placa con agar. Fig. 24. El crecimiento del micelio de D. flagrans se midió diariamente. DIANA FREIRÍA BARREIRO 56 fusión de la gelatina). A continuación, se colocaron 25 µL del contenido de cada tubo entre porta y cubre, y se contaron las esporas de D. flagrans en un microscopio óptico a 20X. Este procedimiento se repitió tres veces con cada vial preparado a partir de cada medio. 4.1.6. Análisis estadístico Con objeto de conocer si los datos recabados se podían someter a un Análisis de Varianza, previamente se empleó la prueba de homogeneidad de varianzas o de Kolmogorov-Smirnov. En el caso de que siguiesen una distribución normal, se examinaron con Análisis de Varianza (ANOVA) a un nivel de significación de P< 0,05. Se empleó el test de Bonferroni para el análisis post-hoc de los datos, y establecer las posibles diferencias entre diferentes grupos de forma conjunta. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico IBM® SPSS® Statistics, versión 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 4.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2.1. Desarrollo del micelio de D. flagrans a) Agar bacteriológico, agar-marino y trigo En la figura 25 se muestra la formación de micelio de D. flagrans en placas con medios agar-bacteriológico (AB) y agar-marino (AM). Fig. 25. Crecimiento micelial en agar-bacteriológico (izda.) y marino (dcha.). 4. ENSAYO I: MEDIOS SÓLIDOS CON AGAR 57 En todas las placas se apreció desarrollo un día después de colocar el inserto, alcanzándose valores ligeramente superiores con agarmarino (Fig. 26) (F= 0,149, P= 0,703). Fig. 26. Crecimiento del micelio de D. flagrans en agar-bacteriológico y agarmarino. AB: agar-bacteriológico; AM: agar-marino; ABT: agar-bacteriológico-trigo; AMT: agar-marino-trigo. Con la adición de trigo, se produjo un crecimiento más rápido en los dos medios a base de agar, pero no se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos (F= 0,043, P= 0,838). En la Tabla 8 se muestran ratios de crecimiento de micelio similares al emplear medios con AB y AM (F= 1,090, P= 0,308), con valores promedio que señalan un desarrollo de alrededor de 0,6 cm / día. La presencia de trigo en los medios supuso un estímulo notable para el crecimiento de las hifas de D. flagrans, obteniéndose ratios próximos a 1 tanto en ABT como en AMT (F= 1,234, P= 0,283). Se establecieron diferencias estadísticamente significativas con la adición del cereal (F= 67,989, P= 0,001 y F= 62,275, P= 0,001, respectivamente). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 cm Día AB AM ABT AMT DIANA FREIRÍA BARREIRO 58 Tabla 8.- Ratios de crecimiento micelial en cultivos con agar y trigo. Día AB AM ABT AMT 1 0,45 0,60 1,10 1,28 2 0,36 0,41 1,19 1,28 3 0,47 0,57 1,12 1,22 4 0,53 0,63 1,00 1,08 5 0,49 0,58 0,90 0,94 6 0,62 0,58 0,89 0,95 7 0,57 0,58 0,91 0,96 8 0,61 0,66 0,89 0,95 9 0,69 0,70 0,89 0,89 10 0,70 0,73 11 0,69 0,73 12 0,67 Promedio 0,57 0,62 0,99 1,06 AB: agar-bacteriológico; AM: agar-marino; ABT: agar-bacteriológicotrigo; AMT: agar-marino-trigo. Debido a que no se detectaron diferencias entre las placas con agar bacteriológico y agar-marino, a partir de este momento se empleó agar comestible con trigo (AMT), teniendo en cuenta que además se trata de un producto que podría administrarse directamente a animales para distribuir las esporas del hongo nematófago. b) Agar-marino con trigo y zanahoria (AMTZ) En las placas que contenían agar-marino-trigo con zanahoria al 2% o 4%, se comprobó un desarrollo del micelio muy similar a aquellas con agar-marino solo (sin zanahoria) (P<0,005) (Fig. 27). 4. ENSAYO I: MEDIOS SÓLIDOS CON AGAR 59 Fig. 27. Crecimiento del micelio de D. flagrans en agar-marino-trigo y zanahoria. AMT: agar-marino-trigo; AMTZ: agar-marino-trigo-zanahoria. Tabla 9.- Ratios de crecimiento micelial en cultivos con agar-marinotrigo y zanahoria. Día AMT AMTZ 2% AMTZ 4% 1 1,28 1,25 1,34 2 1,28 1,31 1,33 3 1,22 1,25 1,28 4 1,08 1,13 1,21 5 0,94 1,00 1,04 6 0,95 0,99 1,01 7 0,96 1,01 1,04 8 0,95 0,95 0,98 9 0,89 0,89 0,89 Promedio 1,06 1,09 1,12 AMT: agar-marino-trigo; AMTZ: agar-marino-trigo-zanahoria. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 012345678910 11 12 cm Día AMT AMTZ 2% AMTZ 4% DIANA FREIRÍA BARREIRO 60 En la Tabla 9 se muestra que la incorporación de zanahoria al medio AMT prácticamente no afectó a los ratios de crecimiento de las hifas, y pese a alcanzar valores más elevados con un 4% de zanahoria, las diferencias no fueron significativas (F= 0,360, P= 0,701). c) Agar-marino con trigo y caldo En la figura 28 se representa el desarrollo del micelio en agarmarino-trigo al que se añadieron diferentes cantidades de caldo de pollo (preparado comercial). Las hifas de D. flagranscrecieron con mayor rapidez en medios con caldo, sobre todo al 10%, ocupando toda la placa en 7-8 días. Fig. 28. Crecimiento del micelio de D. flagrans en agar-marino-trigo y caldo de pollo. AMT: agar-marino-trigo; AMTC: agar-marino-trigo-caldo. Los ratios de crecimiento también resultaron superiores en los medios con caldo (Tabla 10), obteniéndose diferencias estadísticamente significativas (F= 7,297, P= 0,001); mediante la prueba de Bonferroni se establecieron diferencias entre los medios AMT y AMTC 5% y AMTC 10% (P= 0,016 y P= 0,001, respectivamente). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 cm Día AMT AMTC 2% AMTC 5% AMTC 10% 4. ENSAYO I: MEDIOS SÓLIDOS CON AGAR 61 Tabla 10.- Ratios de crecimiento micelial en cultivos con agar-marinotrigo y caldo de pollo. Día AMT AMTC 2% AMTC 5% AMTC 10% 1 1,28 1,25 1,27 1,53 2 1,28 1,40 1,50 1,70 3 1,22 1,32 1,38 1,57 4 1,08 1,18 1,28 1,50 5 0,94 1,06 1,22 1,40 6 0,95 1,03 1,13 1,25 7 0,96 1,03 1,09 1,14 8 0,95 1,00 1,00 9 0,89 Promedio 1,06 1,16 1,23 1,44 AB: agar-bacteriológico; AM: agar-marino; ABT: agar-bacteriológicotrigo; AMT: agar-marino-trigo. 4.2.2. Producción de esporas de D. flagrans Los recuentos se refieren de forma mayoritaria a las clamidosporas, puesto que la formación de conidios se observó sobre todo durante los primeros días del ensayo. a) Agar bacteriológico, agar-marino y trigo En la figura 29 se representa la producción de clamidosporas de D. flagrans en agar. A partir del día 8 se empezaron a observar clamidosporas de D. flagrans, y al final se alcazaron recuentos medios próximos a 6000 (AB) y 9000 esporas(AM) /mL; estas diferencias no resultaron significativas (F= 1,285, P= 0,266). Con la adición de trigo a los medios, se incrementó significativamente el número de clamidosporas observadas tanto en medio ABT (4 veces) (F=6,447, P= 0,017) como en AMT (3 veces) (F=4,653, P= 0,039) (Fig. 29). Los recuentos de AMT fueron ligeramente más elevados (F= 0,138, P= 0,713). 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 69 5.- ENSAYO II: Producción de esporas en medio líquido empobrecido La propagación de hongos filamentosos en cultivos a base de agar dificulta su distribución, puesto que se requiere el raspado superficial del agar y disolución en agua. Con este procedimiento se pierde un número importante de clamidosporas que se encuentran en el interior del agar, y las que se obtienen forman agregados que dificultan su distribución mediante pulverización, así como la mezcla homogénea en formulaciones alimentarias. Para solucionar estos aspectos, se consideró el empleo de un medio de cultivo líquido. 5.1. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1.1. Diseño experimental Se utilizó un medio de cultivo líquido para propagar las esporas de D. flagrans en botellas de plástico gentilmente donadas por el establecimiento “Hostal Bríos” (Lugo, España), que se reciclaron en el Laboratorio del Grupo COPAR (Facultade de Veterinaria, USC). La primera fase (F1) consistió en depositar un inserto de agar-marino-trigo con D. flagrans en botellas de 0,5 L que contenían 100 mL de medio de cultivo líquido (Fig. 34). Después de ocho semanas, las botellas se dividieron en dos lotes. En la fase F2, los 100 mL procedentes de botellas de la fase F1se transfirieron a recipientes de 1 L con 400 mL de medio líquido, haciendo un total de 500 mL; en las botellas del otro lote (fase F3), el contenido de botellas de la F1 (100 mL) se añadió a recipientes de 2 L de capacidad en los que había 900 mL de cultivo líquido, para un volumen final de 1 L. DIANA FREIRÍA BARREIRO 70 Transcurrido otro periodo de ocho semanas, se determinó el desarrollo del hongo nematófago mediante el recuento de esporas. Fig. 34. Diseño del ensayo con cultivo líquido. 5.1.2. Acondicionamiento de recipientes de plástico Cada semana durante un mes se recogieron botellas de plástico usadas (de 0,5 y 1,5 L), que en primer lugar se acondicionaron para eliminar restos de contenido y contaminación que pudiesen afectar al cultivo. El reciclado consistió en lavar con agua y jabón, aclarar, retirar las etiquetas y rellenar con hipoclorito sódico (lejía) al 10%, dejando actuar durante 1 hora (Fig. 35). A continuación, se vaciaron y se aclararon en un lavavajillas. 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 71 El paso siguiente consistió en dejar secar las botellas a temperatura ambiente, en una cámara de flujo laminar bajo luz UV (2-4 h). Finalmente, se colocaron los tapones, que se recubrieron con parafilm para asegurar la correcta conservación hasta el llenado con medio de cultivo líquido. 5.1.3. Preparación del medio de cultivo líquido Se preparó el medio de cultivo líquido empobrecido COPFr mezclando 10 g de harina de trigo autóctono(Triticum aestivum), 7,1 g NaCl, 1,6 g Na2HPO4•12 H2O, 0,423 mg FhrAPS (proteína recombinante del tegumento de Fasciola hepatica) (Paz-Silva et al., 2005),con 1 L de agua destilada(Arias et al., 2013a). Después de agitar hasta la homogeneización, la solución se hizo pasar por un colador para eliminar los restos insolubles, y se introdujo en matraces de 2 L o en bidones de nalgeno autoclavables; a continuación se colocó una gasa con algodón en la boca del recipiente, y se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 15 min. El medio esterilizado se dejó enfriar a temperatura ambiente hasta 40-50ºC, y Fig. 35. El cultivo de D. flagrans se realizó en botellas de plástico recicladas en el laboratorio. DIANA FREIRÍA BARREIRO 72 posteriormente se procedió a dispensarlo en las botellas de plástico (previamente acondicionadas) en la cámara de flujo laminar. 5.1.4. Siembra de medio de cultivo líquido con D. flagrans a) Fase 1 Teniendo en cuenta los resultados del primer ensayo, se prepararon 30 placas con agar-marino-trigo, que se cultivaron con la cepa CECT 20825 del hongo D. flagrans (placas madre, vide p. 44). Después de mantener a temperatura ambiente durante 28 días, se seleccionaron 20 placas con buen crecimiento y ausencia de contaminación, y en cabina de flujo laminar se abrieron y delimitaron insertos de 2 cm2 con ayuda de una espátula esterilizada y una plantilla de papel. Considerando que la superficie de cada placa de 8,5 cm es 56,72 cm2, en cada una se obtuvieron alrededor de 17 insertos que se podían retirar con facilidad (Fig. 36). De forma totalmente aleatoria, en cada placa se tomaron doce insertos para sembrar el medio líquido en botellas de plástico, y en los cinco insertos restantes se determinó la cantidad de clamidosporas por cm2 y placa, estableciéndose de este modo el valor medio que se depositaba en la siembra de cada botella. Para ello, se introdujeron de forma individual en un matraz con 100 mL de agua, se trituraron con una batidora, y se tomaron 8 alícuotas de 25 µL que se colocaron entre porta y cubre para el recuento bajo microscopio a 20X. Fig. 36. Se prepararon placas madre con agar-marino-trigo, en las que se delimitaron 17 insertos de 2 cm2. Doce se colocaron en botellas de plástico con medio de cultivo líquido, y cinco se emplearon para conocer el número de clamidosporas que portaban. 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 73 En total, se sembraron 240 botellas de plástico (500 mL de volumen), dispensando 100 mL de medio líquido (previamente esterilizado en autoclave) en cabina de flujo laminar, y añadiendo un inserto con D. flagrans a cada una. Finalmente, las botellas se taparon con parafilm y se mantuvieron a temperatura ambiente (16-20ºC) hasta su análisis. Las 240 botellas se dividieron en lotes de 80 para cada una de las fases F1, F2 y F3. Cada semana se analizaron ocho botellas correspondientes a cada fase, de modo que serían necesarias 64. Sin embargo, se prepararon 80 en previsión de que pudiese producirse contaminación, perderse contenido al manipularlas, etc. b) Fases2 y 3 Como se representa en la Fig. 34, el contenido (100 mL) de un total de 80 botellas de la fase F1 se transfirió a igual número de recipientes de 1 L con 400 mL de medio de cultivo líquido para desarrollar la fase F2; el contenido de otros 80 recipientes de F1 se dispensó en botellas de 2 L con 900 mL de cultivo líquido para llevar a cabo la fase F3. 5.1.5. Evaluación del desarrollo de D. flagrans en medio líquido Para determinar el grado de desarrollo durante las tres fases del proceso, se procedió a agitar vigorosamente hasta conseguir una solución homogénea, de la que se tomaron 8 muestras de 100 µL de cada botella, que se depositaron en viales. A continuación, se colocaron 25 µL entre porta y cubre, y se observaron al microscopio (20X), para proceder al recuento de esporas. Teniendo en cuenta que con elevada frecuencia aparecían pellets, agregados de micelio, etc, se decidió triturar el contenido de la botella a analizar con una batidora durante 30-60 s, antes de tomar las alícuotas. Se empleó un contador para contabilizar el número de esporas de D. flagrans en ese volumen. En la evaluación del grado de desarrollo de se consideraron los parámetros siguientes: DIANA FREIRÍA BARREIRO 74  Índice Semanal de Esporogénesis (IE): número de clamidosporas en cada semana por mL de medio de cultivo, 𝐼𝑆𝐸 = 𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑚𝐿)  Tasa Semanal de Esporogénesis (TSE): proporción de clamidosporas nuevas que se originan cada semana por mL de medio de cultivo, 𝑇𝑆𝐸 = 𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑌− 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑣𝑖𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑚𝐿)  Incremento Porcentual Relativo (IPR): porcentaje de clamidosporas que se generan cada semana, 𝐼𝑃𝑅 = [(𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑌−𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑣𝑖𝑎) 𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑌 ]x 100  Incremento Porcentual Absoluto (IPA): porcentaje de clamidosporas que se generan cada semana en relación al inicio del cultivo, 𝐼𝑃𝐴 = [(𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑌−𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 0) 𝐸𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑚𝑎𝑛𝑎 𝑌 ]x 100 5.1.6. Análisis estadístico Los datos obtenidos se analizaron con la prueba de KolmogorovSmirnov para determinar si se ajustaban a una distribución normal, en cuyo caso se examinaron con Análisis de Varianza (ANOVA) a un nivel de significación de P< 0,05. Se empleó el test de Bonferroni para el análisis post-hoc de los datos, y establecer las posibles diferencias entre diferentes grupos de forma conjunta. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico IBM® SPSS® Statistics, versión 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 75 5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis del medio líquido se basó en el recuento de clamidosporas de D. flagrans (Fig. 37). Fig. 37. En el medio líquido COPFr se originaron esporas (izda.) y clamidosporas (dcha.). 5.2.1. Fase 1: desarrollo de D. flagrans en medio líquido En la Tabla 11 se resumen los valores medios de clamidosporas presentes en los insertos que se retiraron de cada placa para la siembra de las botellas con medio líquido. Como se mencionó en el apartado 5.1.3, se realizó el recuento de un total de cinco insertos por placa con agar-marino-trigo, demostrándose que no existían diferencias estadísticamente significativas en el recuento de clamidosporas de las placas (Χ2= 1,237, P= 0,216). DIANA FREIRÍA BARREIRO 76 Tabla 11. Valores medios de clamidosporas por cm2 de agar-marino-trigo. Placa Promedio DE Placa Promedio DE 1 14550 8375 11 42120 14350 2 13780 5250 12 19600 6700 3 24120 9625 13 30800 1050 4 19630 8075 14 24060 7875 5 12280 5300 15 27480 11425 6 31150 11100 16 22450 8325 7 35750 12750 17 29340 12050 8 30840 9300 18 31250 7425 9 14220 5575 19 28080 12150 10 13750 6200 20 16860 5175 Promedio ± DE: 24105 ± 9032 Como se muestra en la figura 38, la producción de clamidosporas aumentó de forma gradual desde la primera semana después de la siembra del medio líquido. A las cuatro semanas el promedio fue de 3030 ± 1420 de clamidosporas/mL, y a las ocho semanas 4995 ± 933 clamidosporas/mL. 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 77 Fig. 38. Morfogénesis de D. flagrans en 100 mL de medio de cultivo líquido durante la fase 1. El análisis de la morfogénesis de D. flagrans mostró los valores más bajos en las dos primeras semanas, que se incrementaron hasta alcanzar los más elevados a las tres y cuatro semanas (Fig. 37). A partir de este momento, se observó un descenso en la TSE (tasa semanal de esporogénesis) hasta la semana siete, en que comenzó a aumentar de nuevo. En la Tabla 12 se muestran las variaciones porcentuales de la creación de clamidosporas. El incremento semanal (IPR) señaló que los valores más elevados aparecían en las cuatro primeras semanas, sobre todo en la tercera-cuarta, y a partir de este momento se mantienen porcentajes alrededor del 10%. Tabla 12. Valores de Incremento Porcentual Relativo (IPR) y Absoluto (IPA) en la fase 1 de escalado. Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 IPR 24 30 48 35 21 8 7 11 IPA 24 47 72 82 86 87 88 89 0 250 500 750 1000 1250 1500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 TSE ISE Semana ISE TSE DIANA FREIRÍA BARREIRO 84 Pese a que inicialmente se consideró la posible influencia del procedimiento al que se sometía al medio líquido para disgregar los posibles pellets o agregados de esporas (acción de la batidora para disgregar los pellets de esporas) antes de la observación al microscopio, resultó notable la aparición de estructuras de menor tamaño en las proximidades de clamidosporas (Fig. 43b, c, d), que llevó a considerar que en realidad otros mecanismos podrían estar involucrados en la esporogénesis, como por ejemplo la reproducción asexual simplificada o microcíclica, que se caracteriza porque se originan esporas directamente a partir de otras, sin formar micelio (Jung et al., 2014). Este aspecto aun no ha sido descrito para D. flagrans. En la figura 44 se presentan imágenes de mecanismos de esporógenesis en medios sólidos a base de agar y líquido. Fig. 44. Clamidosporas de D. flagrans en agar-marino-trigo (izda.) y medio de cultivo líquido (dcha.). a c b d 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 85 Como se expuso en el apartado de Antecedentes, en las condiciones naturales que se intentan reproducir en medios con agar, tiene lugar la formación de clamidosporas intercaladas en las hifas, así como de conidios a partir de conidióforos o en los extremos apicales de las hifas (Fig. 44a, b). Sin embargo, en medio líquido se demostró una elevada producción de esporas de estructura similar a las clamidosporas, pero de superficie lisa y menor tamaño, que parecen confirmar que en D. flagrans también ocurre reproducción microcíclica. En relación con el rendimiento observado en las diferentes fases en medio de cultivo líquido, en la figura 45 se puede comprobar que los valores más elevados del IE se consiguieron con los menores volúmenes de medio, o lo que es lo mismo, que al incrementar el volumen, disminuye el IE. Fig. 45. Morfogénesis de D. flagrans en medio de cultivo líquido. La comparación de las tasas semanales de esporogénesis (TSE) (Fig. 46) reveló que en las fases 1 y 2 (cultivo en 100 mL y 500 mL, 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Clamidospora s Semana F1 F2 F3 DIANA FREIRÍA BARREIRO 86 respectivamente) ocurrían dos etapas, una de crecimiento notable progresivo hasta la cuarta semana, y otra con un desarrollo ralentizado desde la quinta a la octava. Una explicación plausible podría radicar en que en la segunda fase en realidad se mantenga el ritmo de producción de clamidosporas, pero además tenga lugar el desarrollo de micelio a partir de estas formas de resistencia, lo que resultaría en la disminución de la TSE. En estudios de crecimiento de D. flagrans en agar-agua se definió una fase de crecimiento lineal del micelio en los cuatro primeros días, y aparición de las clamidosporas a partir de las 2 semanas, con valores máximos a las tres semanas (Grønvold et al., 1996). En la fase 3 (cultivo en 1 L) casi no se observaron diferencias, mostrándose un desarrollo gradual hasta la semana seis, que descendió levemente a continuación. Fig. 46. Valores de TSE en medio de cultivo líquido. La mayor concentración de clamidosporas se obtuvo en la fase 1 (4495) y en la fase 2 (4208), en tanto que al final de la fase 3 se contaron 2980 clamidosporas/mL de medio de cultivo líquido. En la Tabla 15 se 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Clamidosporas Semana F1 F2 F3 5. ENSAYO II: MEDIO LÍQUIDO EMPOBRECIDO 87 comparan los incrementos porcentuales entre las tres fases, resultando que en la fase 1 se alcanzan los valores de IPR e IPA más elevados, seguidos de la fase 3. Las clamidosporas son formas de resistencia, que en el suelo y ante ciertos estímulos como la presencia de materia orgánica en descomposición, o de algunos organismos (en el caso de D. flagrans larvas de nematodos parásitos), se desarrollan hasta formar una red de hifas en las que se intercalan anillos o trampas que capturan las larvas y finalmente las digieren (Larsen et al., 1995). En caso de no recibir estímulos para su desarrollo, pueden permanecer en estado de latencia hasta dos meses, puesto que se ha demostrado que una gran porporción sirve de alimento a otros organismos como bacterias, virus, ácaros e incluso otros hongos (Saumell et al., 2016). Tabla 15. Valores de incremento porcentual relativo (IPR) y absoluto (IPA) en medio de cultivo líquido. IPR IPA Semana F1 F2 F3 F1 F2 F3 1 24 12 5 24 12 5 2 30 22 18 47 31 22 3 48 26 18 72 50 36 4 35 21 25 82 60 52 5 21 12 30 86 65 66 6 8 13 28 87 70 76 7 7 12 17 88 73 80 8 11 12 16 89 76 83 La idea de escalado industrial se asocia a la optimización del proceso de crecimiento de un microorganismo desde el laboratorio hasta la planta de producción. Para ello, se definen una serie de etapas como concepción, ensayos de laboratorio, en planta piloto y producción industrial, en las que el volumen de producción aumenta de forma progresiva. Para utilizar clamidosporas de D. flagrans, resulta imprescindible producir cantidades suficientes para asegurar la obtención de los resultados esperados. En la aplicación práctica de este hongo filamentoso, parecen fundamentales dos variables, cantidad DIANA FREIRÍA BARREIRO 88 requerida y tiempo necesario para obtenerla. En relación con el número de clamidosporas obtenidas, después de ocho semanas los recuentos medios fueron de 499500/recipiente en la fase 1, de 2104000/recipiente en la fase 2 y de 2980000/recipiente en la fase 3. Esto indica que si la formulación a emplear requiere de concentraciones de clamidosporas de alrededor de 3000/mL, sería útil utilizar escalados a 1 L de medio. Si el requerimiento se sitúa entre 4000 y 5000, la elección sería escalar a 500 mL, pero si se precisan concentraciones ≥5000 clamidosporas/mL lo más apropiado sería emplear medios de 100 mL. Estos cálculos se refieren a un periodo de tiempo de ocho semanas, de modo que la modificación del intervalo también sería útil para adaptarse a las necesidades del momento. Por ejemplo, en caso de requerir 3000 clamidosporas/mL se podría recurrir a un escalado en 100 mL durante cuatro semanas, seis en 500 mL y ocho en 1 L (Fig. 44). Por último, destacar que en las fases 1 y 2 se describió una fase de incremento notable de la producción de clamidosporas, que tiene lugar en las pimeras cuatro semanas, de manera que la concentración aumenta un 82% y un 60%, respectivamente; mientras que dicho aumento es de un 52% en la fase 3. Entre las semanas cinco y ocho, los aumentos fueron del 39%, 41% y 65% en las fases 1, 2 y 3 respectivamente. 6.- ENSAYO III: PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIOS MIXTOS 6. ENSAYO III: MEDIOS MIXTOS 91 6.- ENSAYO III: Producción de esporas en medios mixtos En los ensayos anteriores se demostró la utilidad y rendimiento de cultivos a base de agar marino con trigo, y también de medio líquido, para la propagación del hongo filamentoso D. flagrans. En base a los resultados obtenidos, se planteó la posibilidad de desarrollar procedimientos mixtos, basados en el empleo secuencial de diferentes medios. En concreto, se diseñó un procedimiento con una primera fase de cultivo del hongo filamentoso en medio líquido, y transcurrido un intervalo de tiempo, se añadió sobre dos alimentos, pan rallado y pan tostado (Fig. 47), considerando la facilidad de obtención, preservación y coste económico. Fig. 47. Se prepararon cultivos mixtos a base de medio de cultivo líquido con clamidosporas de D. flagrans, a los que se añadió a pan rallado y pan tostado. Medio líquido con D. flagrans Pan rallado Pan tostado DIANA FREIRÍA BARREIRO 92 6.1. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1.1. Medio líquido + pan rallado En primer lugar se realizó una fase de propagación de las esporas de D. flagrans en el medio de cultivo líquido (COPFr). Siguiendo las instrucciones descritas previamente (cfr. 5.1.3.), se reciclaron 44 botellas de plástico de 500 mL, y se prepararon para el cultivo de D. flagrans en 100 mL de medio de cultivo COPFr/recipiente, que se realizó mediante la adición de un inserto de 2 cm2 de agar-marino-trigo extraído de placas madre en cabina de flujo laminar. Después de colocar parafilm en la boca, los recipientes se mantuvieron a temperatura ambiente durante cuatro semanas, considerando que en el Ensayo II (vide 67) se demostró que al final de este intervalo se conseguían las mayores tasas de morfogénesis. La concentración media resultó de 2988 ± 881 clamidosporas / mL (Tabla 16). 6. ENSAYO III: MEDIOS MIXTOS 93 Tabla 16. Valores medios de clamidosporas por mL COPFr. Placa Promedio DE Placa Promedio DE 1 3550 753 23 2814 610 2 2780 620 24 3220 930 3 2446 652 25 3650 990 4 3120 875 26 3140 833 5 1360 850 27 3028 770 6 1380 680 28 3475 815 7 3630 950 29 2670 624 8 2500 890 30 3630 934 9 2780 870 31 2882 710 10 1430 640 32 2944 630 11 1664 875 33 3460 890 12 4250 1150 34 2190 646 13 3380 1004 35 2960 718 14 2460 850 36 3400 1142 15 2970 1290 37 3390 1274 16 3030 1168 38 3210 986 17 3540 1970 39 3358 1010 18 1870 620 40 3600 1024 19 1910 598 41 3384 830 20 2236 740 42 3650 918 21 3542 826 43 4210 965 22 3390 820 44 3980 846 Promedio ± DE: 2988 ± 881 DIANA FREIRÍA BARREIRO 100 Fig. 53. Cinética de producción de clamidosporas de D. flagrans en pan tostado. En la Tabla 20 se muestran el incremento porcentual relativo (IPR) durante todo el ensayo, comprobándose que en las primeras cuatro semanas los valores oscilaron entre el 34 y el45%, y hacia el final de la prueba disminuyeron a 21-28%. El IPA aumentó de forma significativa en especial durante las tres primeras semanas, obteniéndose un valor del 91% al final del ensayo. Tabla 20. Valores de Incremento Porcentual Relativo (IPR) y Absoluto (IPA) en medio con pan tostado. Semana 1 2 3 4 5 6 IPR 34 37 45 31 21 28 IPA 34 59 77 84 88 91 6.2.2. Comparación de los resultados De los dos ensayos mixtos realizados con medio líquido en el que previamente se había cultivado D. flagrans, los recuentos más elevados se obtuvieron al verterlo sobre pan rallado, como se aprecia en la Figura 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 0 3000 6000 9000 12000 15000 18000 21000 24000 27000 30000 0123456 TSE ISE Semana ISE TSE 6. ENSAYO III: MEDIOS MIXTOS 101 54. Hasta la cuarta semana, se observaron valores de ISE similares, y a partir de este momento aumentaron de forma más notable en pan rallado, resultando 1,4 veces superior (F= 0,165, 0,692). La tasa semanal de esporogénesis (TSE) resultó similar en ambos ensayos hasta la cuarta semana (Fig. 54); a continuación, la TSE aumentó de forma considerable en el pan rallado y mostró valores 1,6 superiores a los obtenidos con pan tostado (F= 0,934, 0,357). Fig. 54. Cinética de producción de clamidosporas de D. flagrans en pan rallado y pan tostado. Al comparar los valores del IPR, se comprobó una notable similitud en los dos ensayos, con los porcentajes más elevados durante las tres primeras semanas y un descenso a continuación. El análisis del IPA mostró valores más elevados en medio con pan rallado. En la interpretación de los datos recabados en estos dos ensayos es necesario tener en cuenta la dificultad para realizar los recuentos de clamidosporas en medio con pan tostado, mucho más elevada que con pan rallado. Además del inconveniente ya reseñado de la coloración del medio (pardo-amarillenta), se detectó un número muy elevado de estructuras refringentes, vesículas lipídicas, diferentes estructuras 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 3000 6000 9000 12000 15000 18000 21000 24000 0 1 2 3 4 5 6 TSEISE Semana ISEpr ISEpt TSEpr TSEpt DIANA FREIRÍA BARREIRO 102 derivadas de la composición de las hogazas, que dificultaron la propia toma de alícuotas con micropipeta, e hicieron realmente tedioso el recuento bajo microscopio, prolongándolo de forma considerable. Incluso se llegó en numerosas ocasiones a diluir con agua el medio mixto, para tratar de solucionar estos problemas, pero el resultado no fue exitoso (Fig. 55). Fig. 55. Clamidosporas de D. flagrans en medio con pan rallado (izda.) y pan tostado (dcha.). a b 7.- ENSAYO III: PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIOLÍQUIDO ENRIQUECIDO 7.- ENSAYO IV: PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIO LÍQUIDO ENRIQUECIDO 105 7.- ENSAYO IV: Producción de esporas en medio líquido enriquecido Los inconvenientes señalados con el enriquecimiento de medios líquidos con pan, sobre todo en relación a la facilidad de contaminación, llevaron a considerar el empleo de medios líquidos enriquecidos con cereales. En concreto, se decidió preparar un medio compuesto por agua + fécula (almidón de maíz), y compararlo con otro a base de agua + fécula + pan rallado (Fig. 56). Fig. 56. Fundamento teórico del Ensayo IV. 7.1. MATERIAL Y MÉTODOS Con objeto de disponer de clamidosporas para sembrar el medio a base de fécula, se emplearon 10 placas con medio agar-marino-trigo, que se sembraron con insertos retirados de una placa madre, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 28 días. Transcurrido este periodo, se seleccionaron seis placas que mostraban buen crecimiento, y se procedió como se indica en el apartado 5.1.4., dividiendo el medio en cada una en 17 insertos de 2 cm2. El recuento de clamidosporas en las placas mostró un valor medio de 23926 ± 3361/cm2 (Tabla 21). Fécula (+ cereales) (+ pan) Agua Insertos con D. flagrans DIANA FREIRÍA BARREIRO 106 Tabla 21. Valores medios de clamidosporas por cm2 de agar-marinotrigo. Placa Promedio DE Placa Promedio DE 1 21560 2750 6 22080 3540 2 18800 2550 7 25430 3700 3 19350 3630 8 28320 2850 4 26680 3000 9 24060 2875 5 25500 5300 10 27480 3420 Promedio ± DE: 23926 ± 3361 7.1.1. Medio líquido + fécula Para incentivar la propagación de D. flagrans, en botellas de cristal de 500 mL se preparó un medio a base de agua (100 mL) + 6 g de fécula (almidón de maíz). En la Tabla 22 se resume la composición nutritiva de la fécula. Tabla 22.- Composición (por 100g) de los medios empleados para el desarrollo de D. flagrans. Medio Valor energético Proteínas Hidratos de carbono Lípidos Totales Azúcares Totales Saturados Fécula 355 kcal 0,5 g 86 g 0 g 0,5 g 0,1 g a) Siembra con insertos con esporas de D. flagrans Después de esterilizar las botellas con el medio (121ºC/16 min), se dejaron enfriar en una cabina de flujo laminar. El paso siguiente consistió en depositar dos insertos de agar-marino-trigo de 2 cm2 (cfr. 5.1.4.), tapar con una torunda de algodón y mantener a temperatura ambiente y ciclos naturales de luz-oscuridad durante seis semanas (Fig. 57). 7.- ENSAYO IV: PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIO LÍQUIDO ENRIQUECIDO 107 Fig. 57. Desarrollo de micelio de D. flagrans en medio líquido con fécula. b) Evaluación del desarrollo de D. flagrans en medio con fécula Se prepararon 48 botellas con medio a base de fécula, y cada semana se analizaron ocho; este procedimiento consistió en homogeneizar su contenido con una batidora, y tomar seis alícuotas de 25 µL del medio, que se observaron entre porta y cubre al microscopio (Leica DM2500) (10X), para facilitar la estimación del número de clamidosporas por mL. El análisis del desarrollo de D. flagrans en este medio se basó en el cálculo del Índice Semanal de Esporogénesis (ISE), la Tasa Semanal de Esporogénesis (TSE), el Incremento Porcentual Relativo (IPR) y el Incremento Porcentual Absoluto (IPA), según las fórmulas mostradas en el apartado 5.1.5. 7.1.2. Medio líquido + fécula + pan rallado Se preparó un medio compuesto por agua (100 mL) + 6 g de fécula (almidón de maíz) + 6 g pan rallado, cuya composición nutritiva se presenta en la Tabla 23. DIANA FREIRÍA BARREIRO 108 Tabla 23.- Composición (por 100g) de los medios empleados para el desarrollo de D. flagrans. Medio Valor energético Proteínas Hidratos de carbono Lípidos Totales Azúcares Totales Saturados Fécula 355 kcal 0,5 g 86 g 0 g 0,5 g 0,1 g Pan rallado 368,4 kcal 9,58 g 78,12 g 3,4 g 1,26 g 0,3 g a) Siembra con insertos con esporas de D. flagrans Como se mencionó en el apartado anterior (cfr. 7.1.1.), se colocaron dos insertos de agar-marino-trigo de 2 cm2 obtenidos de placas madre con D. flagrans(cfr. 5.1.4.) en botellas con 100 mL del medio que previamente habían sido esterilizadas en autoclave (121ºC/16 min). Se utilizaron 48 botellas que se mantuvieron a temperatura ambiente y ciclos naturales de luz-oscuridad durante seis semanas (Fig. 58). Fig. 58. Propagación de D. flagrans en medio a base de fécula y pan rallado. 7.- ENSAYO IV: PRODUCCIÓN DE ESPORAS EN MEDIO LÍQUIDO ENRIQUECIDO 109 b) Evaluación del desarrollo de D. flagrans en medio con fécula + pan tostado Cada semana se analizó la producción de clamidosporas de D. flagrans de ocho botellas con medio a base de fécula + pan tostado, procediendo de acuerdo a lo indicado en la sección 7.1.1. De igual modo, se calcularon los valores del Índice Semanal de Esporogénesis (ISE), la Tasa Semanal de Esporogénesis (TSE), el Incremento Porcentual Relativo (IPR) y el Incremento Porcentual Absoluto (IPA) (cfr. 5.1.5.). 7.1.3. Análisis estadístico Los datos obtenidos se analizaron con la prueba de KolmogorovSmirnov para determinar si se ajustaban a una distribución normal, en cuyo caso se examinaron con Análisis de Varianza (ANOVA) a un nivel de significación de P< 0,05. Se empleó el test de Bonferroni para el análisis post-hoc de los datos, y establecer las posibles diferencias entre diferentes grupos de forma conjunta. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico IBM® SPSS® Statistics, versión 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 7.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.2.1. Producción de clamidosporas En la figura 59 se puede observar que el Índice Semanal de Esporogénesis (ISE) de D. flagrans en medio acuoso con fécula aumentó rápidamente en las primeras semanas, mostrando un incremento gradual hasta el final del ensayo (20400 ± 3200). Los valores de la Tasa Semanal de Esporogénesis (TSE) no mostraron variaciones notables, y oscilaron entre 2656 y 3670. 8. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS 117 8.- ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS Con objeto de dirimir cuál de las opciones ensayadas en esta investigación resulta más adecuada para la propagación de clamidosporas de D. flagrans, se llevó a cabo el análisis conjunto de los resultados obtenidos con cada uno de los medios utilizados, que se sustentó en dos pilares: de un lado, el rendimiento, y de otro, la aplicación práctica. Es importante tener en cuenta que este análisis debería realizarse de forma simultánea. 8.1. RENDIMIENTO La valoración del rendimiento de los procedimientos aplicados para la propagación de clamidosporas de D. flagrans se basó en cuatro aspectos, productividad (relacionada con la cantidad de esporas), tiempo (entendido como periodo necesario para alcanzar una concentración determinada), coste (económico) y finalmente susceptibilidad de contaminación o experimentar alteraciones por otros microorganismos (Fig. 64). Debido a que la duración de los ensayos no siempre fue la misma, este análisis abarcó las primeras cuatro semanas. Fig. 64. Parámetros considerados en el análisis del rendimiento. Productividad Tiempo Coste Contaminación DIANA FREIRÍA BARREIRO 118 8.1.1. Productividad En la figura 65 se representa el orden establecido atendiendo al número de clamidosporas de D. flagranspor mL de medio de cultivo. Los recuentos más elevados en las primeras cuatro semanas se obtuvieron con medios sólidos a base de agar-marino (trigo y trigocaldo), seguidos por los mixtos y a continuación los líquidos. Fig. 65. Desarrollo de micelio de D. flagrans en pan tostado. Los recuentos de clamidosporas en medios con agar-marino-trigo resultaron dos (sin caldo) y cuatro veces (10% caldo) superiores a los mixtos (Tabla 26), y 29 y 7 veces superiores a los líquidos. Como se recoge en la Tabla 24, en los medios sólidos las concentraciones de clamidosporas aumentaron semanalmente entre 1,5 y 2,9 veces, en los mixtos entre 1,3 y 3,8, y en los líquidos de 1,1 a 1,9 veces. Estos resultados señalan que el empleo de medios compuestos por agar-marino-trigo hacen posible la obtención de grandes cantidades de esporas, que tiene lugar de forma constante a lo largo del tiempo, sin presentar variaciones importantes. Con la utilización de medios mixtos con fécula o pan rallado se consigue un buen rendimiento en cuatro semanas, mientras que los valores obtenidos con medio líquido y los AMTC 10% AMT Fécula Fécula+pan rallado Pan rallado Pan tostado Medio líquido Escalado 1 Escalado 2 8. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS 119 subsiguientes escalados no parecen sustentar la utilidad de este tipo de cultivos, para intervalos de cuatro semanas. Tabla 26. Rendimiento de diferentes medios de cultivo para la producción de clamidosporas de D. flagrans. Semana 1 2 3 4 Medio Nº Δ Nº Δ Nº Δ Nº Δ Sólido AMT 0 - 5039 - 7713 1,5 22187 2,9 AMTC 10% 8727 - 24184 2,8 41639 1,7 86996 2,1 Líquido Medio líquido 720 1,3 1030 1,4 1982 1,9 3030 1,5 Escalado 1 1130 1,1 1452 1,3 1975 1,4 2499 1,3 Escalado 2 530 1,1 646 1,2 784 1,2 1043 1,3 Mixto Fécula 3620 3,8 6210 1,7 9880 1,6 12580 1,3 Fécula+pan rallado 3070 3 5540 1,8 7785 1,4 10080 1,3 Pan rallado 2060 3,7 3850 1,9 6990 1,8 10050 1,4 Pan tostado 2270 1,5 3620 1,6 6600 1,8 9600 1,5 Nº: recuento de clamidosporas/mL de medio; Δ: incremento semanal del recuento. AMT: agar-marino-trigo; AMTC 10%: AMT 10% caldo. Existe poca información acerca del rendimiento de los cultivos preparados para la propagación de D. flagrans con objeto de obtener cantidades notables de clamidosporas. En medio agar-glucosaSabouraud suplementado con inositol ofreció un rendimiento de 51.715.000 clamidosporas por placa después de cuatro semanas a 27ºC (Sagüés et al., 2012), pero habría que tener en cuenta que la obtención de las esporas conlleva el raspado de la superficie de las placas, dado que no se considera comestible. Por el contrario, los medios con agar- DIANA FREIRÍA BARREIRO 120 marino presentan la ventaja de poder administrarse sin operaciones intermedias. 8.1.2. Tiempo requerido El interés de tener en cuenta este parámetro radica en poder llegar a determinar si se podría llegar a cubrir las necesidades de clamidosporas, en un intervalo de tiempo determinado, cuando se tome en consideración desarrollar programas de control integrado de parásitos en animales. Los datos presentados en la Tabla 27 indican que con medios líquidos es posible conseguir concentraciones alrededor de 4995 clamidosporas/mL si transcurre al menos un periodo de 6 semanas, que se convierten en 4208 después de idéntico intervalo con un escalado (de 100 a 500 mL); sin embargo, con dos escalados el recuento de esporas se reduce de forma importante (2980) al cabo de seis semanas. Estos rendimientos se alcanzarían en una semana con agar-marino-trigo 10%, dos semanas con fécula o fécula+pan rallado, tres semanas con medio mixto con pan rallado o tostado, o cuatro semanas con agar-marino-trigo sin caldo (AMT). Tabla 27. Valores de clamidosporas/mL en diferentes medios de cultivo. Medio ISE Semana TSE Semana Sólido AMT 8912 7 AMTC 10% 100088 7 Líquido Medio líquido 4995 8 1048 4 Escalado 1 4208 8 524 4 Escalado 2 2980 8 575 6 Mixto Fécula 20400 6 3670 3 Fécula+pan rallado 14510 6 2470 2 Pan rallado 23000 6 7250 6 Pan tostado 16740 6 4660 6 ISE: Índice Semanal de Esporogénesis; TSE: Tasa Semanal de Esporogénesis. AMT: agar-marino-trigo; AMTC 10%: AMT 10% caldo. 8. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS 121 8.1.3. Composición nutricional Con objeto de profundizar en el conocimiento de la utilidad de los medios testados en la presente investigación, se tuvo en cuenta su composición nutritiva en términos de valor energético, contenido en proteínas, hidratos de carbono totales y azúcares, y lípidos y ácidos grasos saturados. En la figura 66 se puede comprobar que la composición fue muy similar en todos los medios, a excepción del pan rallado y pan tostado, que arrojaron los valores más elevados, y el medio líquido, que presentó los más bajos. Si se tienen en cuenta los datos recogidos en la Tabla 27, no es posible discernir con claridad si existe relación entre la composición nutritiva y el rendimiento de los medios, puesto que las concentraciones más elevadas de clamidosporas de D. flagrans se obtuvieron en los medios con agar-marino-trigo-caldo, pero los de mayor riqueza nutritiva resultaron a base de pan rallado y pan tostado. Sin embargo, sí es preciso tener en cuenta que el medio líquido resultó un medio empobrecido, en el que se obtuvo el menor rendimiento de clamidosporas. Fig. 66. Contenido en nutrientes en los medios empleados para la propagación de D. flagrans. 0 1 2 3 4 Kcal/mL Valor energético 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 mg/mL Proteínas DIANA FREIRÍA BARREIRO 122 Para tratar de aclarar la influencia de la composición nutritiva sobre el rendimiento, se procedió a estimar el porcentaje que suponía cada nutriente (Tabla 28), observándose una composición muy similar en los medios con agar-marino-trigo, líquido y pan tostado (7% proteínas/46% hidratos de carbono/46% lípidos); en los compuestos por fécula y pan rallado disminuyó la proporción de proteínas y aumentó la de hidratos y lípidos. Asimismo, en relación con el porcentaje de azúcares sobre glúcidos totales y el de ácidos grasos saturados sobre lípidos totales, se comprobó que para los medios con agar y líquido suponían alrededor del 80% y 0,6% respectivamente, valores que disminuyeron sensiblemente en el resto de medios. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 g/mL Hidratos de carbono totales -0,005 0,005 0,015 0,025 0,035 g/mL Azúcares -1,91E-17 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 g/mL Lípidos totales 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 g/mL Ácidos grasos saturados 8. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS 123 Tabla 28. Contenido en nutrientes en los medios. Kcal % Prots % HC % Líps % Azs % AGS AMT 0,081 7,43 46,28 46,28 82,48 0,50 AMTC 10% 0,091 7,84 46,08 46,08 79,60 0,97 ML 0,031 7,58 46,21 46,21 85,55 0,52 Fécula 0,2130 0,29 49,86 49,86 0,00 0,12 Fe+Pr 0,4340 3,53 48,24 48,24 2,07 0,24 Pr 3,6800 5,78 47,11 47,11 4,35 0,38 Pt 0,7780 7,26 46,37 46,37 7,08 0,68 AMT: agar-marino-trigo; AMTC 10%: AMT 10% caldo; ML: medio líquido;FE: fécula; PR: pan rallado; PT:pan tostado. Estas diferencias en la composición nutricional tampoco esclarecen el rendimiento de los medios, de modo que se consideró interesante relacionar la composición del medio agar-marino-trigo-caldo 10% (de mayor rendimiento) y el resto (Tabla 29). Tabla 29. Relación entre la composición de AMTC 10% y los diferentes medios utilizados. Medio Kcal Proteínas HC Lípidos Totales Azúcares Totales Saturados AMT 0,9 0,9 0,9 1,0 0,6 0,5 ML 0,3 0,3 0,4 0,4 0,3 0,2 Fécula 2,3 0,1 2,6 0,0 0,4 0,3 Fe+Pr 4,8 2,1 5,0 0,1 1,3 1,2 Pr 40,4 28,4 39,4 2,2 15,8 15,6 Pt 8,5 6,8 7,4 0,7 11,5 5,2 HC: hidratos de carbono; AMT: agar-marino-trigo; AMTC 10%: AMT 10% caldo; ML: medio líquido; FE: fécula; PR: pan rallado; PT:pan tostado. En agar-marino-trigo sin caldo se apreció un menor contenido en lípidos (casi la mitad). El medio líquido presentó una reducción de 1/31/4 del valor energético, proteínico, glucídico y en lípidos totales, y 1/5 DIANA FREIRÍA BARREIRO 124 en ácidos grasos saturados. Por el contrario, la presencia de fécula se asoció a un incremento del valor energético e hidratos de carbono totales, y el pan proporcionó además proteínas y lípidos totales. Los datos anteriormente expuestos llevan a considerar la implicación de otros aspectos, como por ejemplo el contenido en micronutrientes, dado que el análisis llevado a cabo en esta investigación se basó exclusivamente en algunos macronutrientes. A tal efecto, resulta interesante tener en cuenta estudios previos en los que se señaló el efecto estimulante del inositol sobre la producción de clamidosporas de D. flagrans en placas con agar Saboraud (Sagüés et al., 2012). Ciertas investigaciones indicaron que este metabolito participa de forma activa en la reproducción sexual de Cryptococcus neoformans (Xue et al., 2010; Wang et al., 2011), aunque en actinobacterias filamentosas (Streptomyces coelicolor) se ha asociado a la formación de septos en hifas aéreas, proceso en el que las membranas dobles crecen para formar septos de esporulación (Zhang et al., 2016). Otro punto que precisa aclaración es el de la consistencia del medio. Los mejores rendimientos se alcanzaron en medios viscoelásticos, y el empleo de medios sólidos de mayor dureza (pan) no supuso un estímulo de la esporogénesis. En relación con los medios líquidos, la disparidad en los resultados conseguidos en medio líquido empobrecido y el que contenía fécula conducen a descartar la influencia de la consistencia y centrarse en la composición nutritiva. 8.1.4. Coste Un aspecto clave para la elección del medio a emplear en la propagación del hongo filamentoso lo constituye el coste aproximado, pero como se indicaba previamente, en realidad ha de analizarse teniendo en cuenta también el rendimiento del medio y el tiempo necesario para alcanzar los recuentos esperados. El coste deviene directamente de la composición del medio, específicamente de los alimentos empleados y del agar marino. Puesto que en esta investigación los cultivos se mantuvieron a temperatura ambiente, no parece necesario introducir estimaciones relacionadas con el tiempo de incubación en términos de gastos de electricidad. En la 8. ANÁLISIS CONJUNTO DE LOS RESULTADOS 125 estimación del coste se incluyó una cuantía de 1€ por L de agua destilada. El menor importe se atribuyó a la preparación de medio líquido (emprobrecido), y el mayor a los que incorporaban fécula (Tabla 30), con valores intermedios para el resto. Si se ordenan los medios en función de la producción de esporas (Fig. 67a) y del coste de elaboración (Fig. 67b), resulta que prácticamente coinciden a excepción del AMTC 10%, que proporcionó mayor rendimiento, y el mixto FE+PR, de mayor coste pero con un rendimiento intermedio-bajo. Estos datos conducen a considerar que en función de estos dos parámetros, el medio de elección sería el AMTC 10%, y a continuación el PT, siempre teniendo en cuenta las dificultades señaladas en apartados anteriores en relación con el recuento fiable de las clamidosporas de D. flagrans; con fécula se obtienen rendimientos importantes y el recuento es muy cómodo y factible, aunque se duplica el costo de producción. Tabla 30. Coste aproximado de medios de cultivo para producir clamidosporas de D. flagrans. Medio Coste/L Esporas/L AMT 1,35 8.912.000 AMTC 10% 1,45 100.088.000 ML 4.995.000 FE 3,52 20.400.000 FE + PR 3,58 14.510.000 PR 2,00 23.000.000 PT 1,52 16.740.000 AMT: agar-marino-trigo; AMTC 10%: AMT 10% caldo; ML: medio líquido; FE: fécula; PR: pan rallado; PT:pan tostado. Si además de coste, rendimiento y facilidad de recuento, se considera el tiempo requerido para alcanzar concentraciones notables de clamidosporas (Fig. 67c), se llega a la conclusión de que el AMTC 10% resultaría el más adecuado, puesto que además de un precio bajo, DIANA FREIRÍA BARREIRO 132 9.- CONCLUSIONES 9. CONCLUSIONES 135 9. CONCLUSIONES Los ensayos realizados en el presente Estudio llevaron a concluir que: 1.- El empleo de medios de cultivo sólidos comestibles enriquecidos con caldo nutritivo hace posible una notable producción de esporas de D. flagrans, al tiempo que proporciona una formulación idónea para la administración directa a los animales por su comestibilidad. 2.- El medio líquido COPFr resulta de enorme interés y aplicabilidad para la obtención de cantidades elevadas de esporas de D. flagrans, facilitando además su distribución en diferentes formulaciones como pulverización directa sobre el suelo, preparación de premezclas alimentarias o incluso elaboración de alimentos. 3.- En la esporogénesis de D. flagrans en medio líquido se describen dos fases, una de crecimiento exponencial hasta la cuarta semana, y otra de multiplicación ralentizada entre la quinta y octava. DIANA FREIRÍA BARREIRO 136 4.- La morfogénesis de D. flagrans en medio líquido incluye mecanismos de reproducción asexual en anaerobiosis, y de esporulación microcíclica, caracterizada por la aparición de esporas directamente a partir de otras esporas, sin la formación de micelio. 5.- La aplicación de procedimientos bifásicos en los que se intercalan un medio de cultivo líquido y otro sólido, puede entrañar grandes inconvenientes para el recuento de las esporas, especialmente si se emplea medios a base de pan. 6.- La producción de esporas de D. flagrans no depende de la composición en macronutrientes de los medios empleados. 7.- Con medios de cultivo sólidos, la producción de cantidades elevadas de esporas de D. flagrans es más rápida pero también más costosa, al contrario de lo que sucede con los medios líquidos. Esto ofrece la posibilidad de adaptarse a las necesidades del momento. 8.- La elección de un medio de cultivo para obtener esporas de D. flagrans ha de fundamentarse en el rendimiento, coste y vía de administración considerada. 10.- RESUMEN / RESUMO / SUMMARY 10. RESUMEN / RESUMO / SUMMARY 139 10. RESUMEN / RESUMO / SUMMARY 10.1. RESUMEN La finalidad de la evaluación de diferentes medios de cultivo para la En las últimas décadas han tenido lugar cambios sustanciales en el control de infecciones parasitarias, poniéndose especial énfasis en la prevención como medida para evitar lesiones en animales (y también personas), proteger la eficacia de los antiparasitarios convencionales limitando su aplicación a los casos necesarios, y fomentar la sostenibilidad al disminuir los posibles efectos ecotóxicos que se derivan de la utilización de fármacos. Entre las soluciones aportadas para eludir ciertas infecciones parasitarias, se ha planteado el control biológico, entendido como un método ecológico desarrollado para disminuir la población parasitaria presente en el medio a niveles no perjudiciales, usando antagonistas naturales vivos. Basándose en el descubrimiento de ciertas especies de hongos filamentosos saprófitos que se encuentran en el suelo, y que en presencia de algunos estadios parasitarios (ooquistes/quistes, metacercarias, huevos, larvas) exhiben la capacidad de alimentarse de ellos, se diseñaron algunas estrategias para evaluar la utilidad potencial de un número reducido de especies. Duddingtonia flagrans es la que ha concitado mayor interés desde el punto de vista veterinario, posiblemente por la capacidad nematófaga que despliega mediante la elaboración de anillos o trampas en el micelio, que sirven para capturar las formas inmaduras de nematodos estrongilados (L2, L3) que se desarrollan en el suelo. DIANA FREIRÍA BARREIRO 140 Uno de los inconvenientes que plantea la aplicación de hongos filamentosos reside en la posibilidad de multiplicar de forma conveniente, y obtener estadios suficientes para abordar el control parasitario en situaciones reales. La mayoría de los programas que incluyen el empleo de D. flagrans se basan en la administración de esporas, generalmente formas de resistencia denominadas clamidosporas, que se obtienen en placas Petri con medio a base de agar y cereales. Sin embargo, esta metodología no resulta útil ni asequible desde un punto de vista económico, lo que ha llevado a la investigación de diferentes procedimientos para conseguir el escalado de la producción de esporas, y proporcionar una solución que acerque esta estrategia a las situaciones reales en las que se desenvuelve la ganadería. Con tal motivo, se planteó un estudio sustentado en cuatro ensayos, que incluyeron la preparación y evaluación de diferentes medios de cultivo. En el primer ensayo se prepararon medios de cultivo sólido a base de gelatina comestible, añadiéndose diferentes aditivos (trigo, zanahoria y caldo comercial), en aras no solo de para obtener cantidades elevadas de esporas de D. flagrans, sino también de intentar fomentar la aceptación entre las diferentes especies animales a las que iban destinadas. De este modo, se comprobó que tanto el agar bacteriológico como el comestible posibilitaban la obtención de cantidades notables de clamidosporas, y se procedió a añadir diferentes alimentos al agar comestible. Con zanahoria, se observó un crecimiento superior al medio de cultivo con trigo, pero el desarrollo no resultó proporcional a la concentración de zanahoria. Al añadir caldo de pollo las hifas crecieron rápidamente, con independencia de su concentración. Estos resultados señalan la idoneidad del medio a base de agar comestible – trigo – caldo para el desarrollo de programas de control mediante esporas de D. flagrans. La administración de esporas de hongos se realiza, con elevada frecuencia, por vía oral, lo que conlleva el raspado de placas con agar y disolución en agua; el producto se puede proporcionar directamente si las especies animales lo permiten, o mezclado con alimento (concentrado, grano…). Esto supone algún que otro inconveniente, puesto que el agar que se suele utilizar no es comestible, las esporas tienden a agregarse y el resultado final no es homogéneo. Para tratar de 10. RESUMEN / RESUMO / SUMMARY 141 buscar una solución a esta situación, se llevó a cabo un segundo ensayo que consistió en analizar el desarrollo de D. flagrans en un medio de cultivo líquido, centrando la atención en dirimir si el hongo crecía en anaerobiosis, y se obtenían cantidades elevadas de esporas. Entre las razones que llevaron a considerar un medio de esta naturaleza conviene destacar la aplicabilidad para distribuir por medio de pulverizadores, preparar premezclas alimentarias, o incluso elaborar pellets nutricionales que vehiculen las esporas. La preparación del medio líquido empobrecido y posterior siembra con D. flagrans confirmó que esta especie se desarrolla en anaerobiosis, da lugar a micelio y finalmente a clamidosporas, delimitándose a este respecto dos fases, una de crecimiento exponencial hasta la cuarta semana, y otra de multiplicación ralentizada (quinta a octava). Además, también se comprobó que aparecía un número de esporas que no parecía guardar relación con el desarrollo de hifas, concluyéndose la participación de otros mecanismos como la denominada esporogénesis microcíclica, que tiene como resultado la génesis de esporas directamente desde otras esporas. En numerosos procedimientos industriales en los que se emplean levaduras, se ha demostrado que los sistemas bifásicos de producción aportan una solución idónea para producir grandes cantidades de organismos (escalado industrial). Por ello, se realizó un tercer ensayo en el que se combinaron medios de cultivo comestibles que contenían pan, y el medio de cultivo líquido empobrecido. Los recuentos fueron elevados al depositar el medio líquido sobre pan rallado y pan tostado, mejores con el primero. Sin embargo, se identificaron algunos problemas a la hora de obtener los recuentos de esporas, debidos a la composición del pan y a su coloración, que hicieron realmente complicado obtener el número de esporas que contenía cada medio. Otro inconveniente consistió en la facilidad con que tenía lugar la contaminación de los medios por otros microorganismos, sobre todo bacterias, así como diferentes especies de hongos. Teniendo en cuenta los resultados mencionados, se consideró oportuno desarrollar un cuarto ensayo en el que se enriqueció el medio de cultivo líquido con fécula (almidón de maíz), y comparar los resultados con otro medio enriquecido con fécula + pan rallado. En este caso, se