Influencia del nitrato, ácido abscísico (ABA) y giberelinas (GA) en la transición dormición-germinación de semillas de Sisymbrium officinale (L.) Scop. sometidas a “post-maduración”

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA VEGETAL Influencia del nitrato, ácido abscísico (ABA) y giberelinas (GA) en la transición dormicióngerminación de semillas de Sisymbrium officinale (L.) Scop. sometidas a “post-maduración” TESIS DOCTORAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA Néstor Carrillo Barral Licenciado en Biología 2016 La Dra. Raquel Iglesias Fernández y la Dra. Mª del Carmen Rodríguez Gacio, como Directoras de la Tesis de Doctorado titulada: «Influencia del nitrato, ácido abscísico (ABA) y giberelinas (GA) en la transición dormicióngerminación de semillas de Sisymbrium officinale (L.) Scop. sometidas a “post-maduración”» Presentada por D. Néstor Carrillo Barral Alumno del Programa de Doctorado en Ingeniería Biotecnológica Autorizan la presentación de la tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorado, y que como Directoras de la misma no incurre en las causas de abstención establecidas en la ley 30/1992. LAS DIRECTORAS Dra. Raquel Iglesias Fernández Dra. Mª del Carmen Rodríguez Gacio EL DOCTORANDO Néstor Carrillo Barral La Dra. Raquel Iglesias Fernández y la Dra. Mª del Carmen Rodríguez Gacio, como Directoras de la tesis titulada: «Influencia del nitrato, ácido abscísico (ABA) y giberelinas (GA) en la transición dormición germinación de semillas de Sisymbrium officinale (L.) Scop. sometidas a “postmaduración”». Por la presente DECLARO: Que la tesis presentada por D. Néstor Carrillo Barral es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudios de Doctorado, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS, en los que el doctorando ha tenido participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Santiago de Compostela, a de de 2016 Dra. Raquel Iglesias Fernández Dra. Mª del Carmen Rodríguez Gacio RECONOCIMIENTOS El presente trabajo ha sido realizado en el departamento de Fisiología Vegetal de la Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, en el marco de un proyecto dirigido por el Prof. Ángel Jesús Matilla Carro, catedrático de Fisiología Vegetal, financiado por el Ministerio de de Ciencia e Innovación titulado “La eliminación de la dormición mediante after-ripening: efecto del nitrato y el ABA sobre el cross-talk etileno/GA y la expresión de genes DELLA (CGL2009-11425)”, y ha sido dirigido por la Dra. Raquel Iglesias Fernández y la Dra. Mª del Carmen Rodríguez Gacio. El autor, Néstor Carrillo Barral, ha sido beneficiario de un contrato predoctoral de la Xunta de Galicia (PRE/2012/323; diciembre 2012 – noviembre 2015). En primer lugar me gustaría agradecer sinceramente al Prof. Ángel Jesús Matilla Carro el haberme acogido en su grupo de investigación para la realización de una Colaboración, un Proyecto Fin de Máster y, finalmente, la Tesis Doctoral que ve la luz en esta memoria. Su amor y dedicación por el trabajo han supuesto un referente para mí desde el primer día, y su respaldo ha sido fundamental para llegar al momento en el que ahora me encuentro. Quisiera agradecer también el trabajo de dirección realizado por las Doctoras Mª del Carmen Rodríguez Gacio y Raquel Iglesias Fernández, así como la formación que me han dado en las diferentes técnicas experimentales y su ayuda en la redacción de esta memoria. Su paciencia y dedicación son uno de los ingredientes principales de este trabajo. Por último, quisiera mostrar mi agradecimiento a la Prof.ª Pilar Carbonero Zalduegui, catedrática de la Universidad Politécnica de Madrid. El tiempo que he pasado en su laboratorio en el Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, su amplia experiencia en la Biotecnología de las semillas, y en la investigación en general, han sido de inestimable ayuda. AGRADECIMIENTOS Cuando miro hacia atrás en el tiempo puedo ver que el camino que me ha conducido hasta este momento no comienza con mi matrícula en la etapa de Tesis, ni con los primeros días de trabajo en el laboratorio, sino que se extiende mucho más atrás y abarca gran parte de mi vida. A lo largo de este trayecto son numerosas las personas que me han ayudado de una u otra manera, pero solamente dos lo han hecho todos y cada uno de los días. Muchas gracias a mi padre y a mi madre. Me gustaría mostrar también mi sincera gratitud a varias personas que se lo han ganado con creces: A Ángel, Victoria, Manuel, Mª Ángeles, Mª del Carmen, Teresa y a todas las personas que han pasado por el Departamento de Fisiología Vegetal de la Facultad de Farmacia, por haber puesto color a mi día a día. Gracias a Begoña, por esa extraña cualidad de ser como es, y a Yolanda, por haber sido una gran amiga en las duras y en las maduras. A Elena, Vicky, Fátima, Nuria, María y Patri, por haber mantenido viva la lumbre del hogar, esa que le permite a uno recobrar fuerzas para afrontar un nuevo día. A toda la gente del CBGP que me acogió con calidez cuando me encontraba lejos de mi tierra, y especialmente a Raquel, cuya sincera preocupación por mí fue más allá de sus funciones. A Rosa, por entenderme mejor de lo que yo mismo me entiendo. A mi hermana, que es y siempre será la mujer de mi vida. A Tañia, que ha luchado mis batallas, sufrido mis derrotas y disfrutado mis victorias. Solo aspiro a lograr darte tanto como he recibido. iii ABREVIATURAS 8’-OH-ABA ABA 8’-hidroxilasa α-XIL α-xilosidasas β-CYC Licopeno β-ciclasa AAO ABA Aldehido Oxidasa ABA Ácido abscísico ABA-GE Glucosil éster de ABA ABC ATP Binding Cassette ABI ABA INSENSITIVE ACO ACC Oxidasa AIP2 ABI3 INTERACTING PROTEIN 2 ale aleurona AMP1 ALTERED MERISTEM PROGRAM 1 AR After-Ripening AREB3 Abscisic acid Responsive Element Binding Protein 3 BR Brasinoesteroides C Cotiledones CDS Secuencia codificante CK Citoquininas Col Columbia Cvi Cape verde islands CWMEs Enzimas hidrolíticas o modificadoras de la pared celular CYP707A Citocromo P450 monooxigenasa (ABA 8’-hidroxilasa) CZ Zona chalazal CZE Endospermo chalazal DAG DOF AFECTING GERMINATION DAP Días tras la polinización DEP DESPIERTO DMAPP Dimetilallil difofato DOF DNA binding with One zinc Finger iv DOG1 Delay Of Germination 1 DPA Ácido dihidrofaseico DZ Diniconazole e Embrión Ed Epidermis ET Etileno EXPA α-expansina EXPs Expansinas FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura FTs Factores Transcripcionales FUS3 FUSCA3 GA2ox GA2-oxidasa GA3ox GA3-oxidasa GA20ox GA20-oxidasa GAI Gibberellic Acid Insensitive GAs Giberelinas GGPP Geranil-geranil difosfato GID1 GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF 1 Gm Meristemo inferior HR Humedad Relativa Hs Hipófisis HSP Heat Shock Proteins IDPs Proteínas intrínsecamente desordenadas IEF Isoelectroenfoque IPP Isopentenil difosfato JA Ácido jasmónico KO Knock Out LEA Late Embryogenesis Abundant LEC LEAFY COTYLEDON Ler Landsberg erecta v MANs Endo-β-mananasas me Embrión maduro MEP 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato MCE Endospermo micropilar MVA Mevalonato NCED 9’-Cis-Epoxicarotenoide Dioxigenasa ND No Durmiente NERP N-End Rule Pathway NiR Nitrito Reductasa NIS Señal de importación al núcleo NLS Señal de localización al núcleo NO Óxido nitrico NO3Nitrato NR Nitrato Reductasa P Parénquima de reserva PAC Proantocianidinas PA Ácido faseico PB Paclobutrazol PBZ Paclobutrazol PC Pared Celular Pc Procambium PCD Muerte celular programada PD Dormición fisiológica Pd Prodermis PDS Fitoeno desaturasa PEN Endospermo periférico PHS Pre-Harvest Sprouting Phy Fitocromo PIF PHYTOCROME INTERACTING FACTOR PIL5 PHYTOCROME INTERACTING FACTOR3-LIKE5 PIPs Proteínas intrínsecas de la membrana plasmática PLA3/GO PLASTOCHRON3/GOLIATH vi PP2C Proteín-fosfatasa tipo 2C PSY Fitoeno sintasa QTL Quantitative Trait Locus RACE Amplificación rápida de los extremos del cDNA RE Rotura del endospermo RGA Repressor of GA RGL RGA Like RM Meristemo apical de la raiz ROS Especies reactivas de oxígeno RT-qPCR PCR semicuantitativa en tiempo real S Suspensor SDR Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta SM Meristemo apical del brote SNF1 Sucrose-Nonfermenting kinase 1 SnRK2 Proteín-quinasa tipo SNF1 SPT SPATULA TIPs Proteínas intrínsecas del tonoplasto V Tejido vascular VP8 VIVIPAROUS8 XTH Xiloglucano-endotransglicosilasa/hidrolasa Y2H Yeast two Hybrid ZEP Zeaxantina Epoxidasa 1. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3 1.1. LA SEMILLA La semilla es el propágulo utilizado por las plantas Espermatófitas para perpetuarse, y constituye un hito trascendental en la historia evolutiva de las especies vegetales. Su éxito evolutivo radica en la adquisición de la tolerancia a la desecación y de un período de inactividad metabólica como fase final de su desarrollo. Esta ventaja adaptativa denominada dormición es un hecho relativamente reciente en la escala evolutiva (Willis et al., 2014), y le permite asegurar la dispersión y la supervivencia de la descendencia durante largos períodos de tiempo (Linkies et al., 2010; Weitbrecht et al., 2011). De los dos grandes grupos de Espermatófitas, Gimnospermas y Angiospermas, éstas últimas son las que han logrado una mayor diversidad y expansión de sus semillas, lo cual está asociado a la rápida diversificación de las Angiospermas durante el Cretácico y su prevalencia posterior (Vicente-Carbajosa y Carbonero, 2005; Linkies et al., 2010, Weitbrecht et al., 2011). Las semillas desempeñan un papel fundamental en la agricultura ya que una rápida y uniforme germinación garantiza la óptima productividad de las cosechas. Además, las semillas son una fuente primaria de alimento, especialmente las de cereales y leguminosas (Finch-Savage y Bassel, 2015). Según datos de la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura; http://www.fao.org), las semillas de tan solo cinco cereales (arroz, trigo, maíz, mijo y sorgo) constituyen el 60% del aporte calórico de la población mundial, hecho que demuestra la importancia socio-económica de este recurso natural. Existen numerosos productos alimentarios derivados de las semillas, como las harinas, los aceites vegetales, el café, la cerveza o el chocolate. Además, los aceites vegetales, obtenidos a partir del procesamiento de diversas semillas oleaginosas, son utilizados en la fabricación de multitud de productos como jabones, lubricantes, tintas, plásticos y como base para perfumes (Walker, 2004). 1.1.1. La estructura de la semilla La semilla está formada por un embrión diploide y por tejidos de origen embrionario (endospermo triploide) y materno (cubierta seminal o testa, nucela, etc.). El embrión maduro está formado comúnmente por el eje embrionario (radícula e hipocótilo) y el/los cotiledón/es (morfológicamente similares a las hojas). El eje embrionario presenta una polaridad apical- INTRODUCCIÓN 4 basal: en el extremo apical (plúmula) se encuentra el meristemo caulinar y en el extremo basal (radícula) el meristemo primario de la raíz (De Smet et al., 2010; Fig. 1a-d). Se diferencian dos tipos de Angiospermas en función del número de cotiledones: Dicotiledóneas (ej. Brasicáceas, Solanáceas, etc.) y Monocotiledóneas (ej. Gramíneas). Las semillas de Dicotiledóneas contienen dos cotiledones (Fig. 1b, c) que suelen actuar como tejidos de reserva de nutrientes. Durante la embriogénesis y la maduración de estas semillas, los nutrientes almacenados en el endospermo son movilizados a los cotiledones y este tejido es parcial o totalmente reabsorbido por el embrión. En algunas especies, como las Brasicáceas Sisymbrium officinale y Arabidopsis thaliana, el endospermo no es completamente reabsorbido por el embrión en formación, sino que es reducido a una monocapa celular externa denominada capa de aleurona (Ingram, 2010; Sun et al., 2010). Las semillas de Monocotiledóneas presentan un único cotiledón, modificado en dos estructuras diferentes: el escutelo y el coleóptilo (Fig. 1d). La función principal del escutelo es movilizar y absorber las sustancias de reserva almacenadas en el endospermo (tejido triploide de origen embrionario; semillas endospérmicas; Yu et al., 2015). El coleóptilo cumple una función protectora de la plúmula. Además, la raíz también está cubierta por una estructura de origen embrionario en forma de vaina, denominada coleorriza (Xi y Zheng, 2011). La testa o cubierta seminal es la envoltura más externa de la semilla y tiene un origen materno ya que se desarrolla a partir de los tegumentos del óvulo (Linkies et al., 2010). Las capas celulares que conforman la cubierta seminal sufren un proceso de “muerte celular programada” durante la maduración, siendo por tanto un tejido inerte en la semilla madura. Clásicamente, se ha considerado a la testa como un tejido protector del embrión frente a alteraciones mecánicas y químicas y también se ha relacionado con distintas estrategias de dispersión de la semilla. Actualmente, se ha enfatizado en la importancia de este tejido como mediador de señales medioambientales, controlando procesos tan importantes como la dormición y germinación (Finch-Savage y Leubner-Metzger, 2006; Huang et al., 2008). INTRODUCCIÓN 5 1.2. DESARROLLO DE LA SEMILLA: EMBRIOGÉNESIS ZIGÓTICA Y MADURACIÓN El desarrollo de la semilla se divide en dos grandes fases: la embriogénesis zigótica, en la que se produce la formación del embrión, y la maduración, en la cual la semilla almacena sustancias de reserva y finalmente adquiere un estado de quiescencia (De Smet et al., 2010). Figura 1: Estructura de la semilla madura en diferentes especies. (a) Pinus sp., Gimnosperma. (b) Nicotiana bentamiana, Angiosperma dicotiledónea con abundante endospermo. (c) Sisymbrium officinale, Angiosperma dicotiledónea con endospermo monoestratificado. (d) Zea mays, Angiosperma monocotiledónea. Elaboración propia. INTRODUCCIÓN 12 tipos: no profunda (dormición primaria) y profunda (dormición secundaria). La PD profunda no puede eliminarse mediante el tratamiento con GAs, y cuando el embrión se separa de la semilla no es capaz de generar plántulas normales. Estas semillas requieren varios meses de estratificación en frío antes de poder germinar. La PD no profunda es reversible por un tratamiento con GAs y en algunas semillas también puede eliminarse mediante estratificación o almacenamiento en seco (post-maduración o After-Ripening, AR). En este tipo de PD, cuando el embrión es separado del resto de la semilla es capaz de generar plántulas viables. La PD no profunda está determinada por factores fisiológicos del embrión y/o de los tejidos que lo rodean (Baskin y Baskin, 2004; Zhou et al., 2015). La dormición primaria se establece durante la maduración de la semilla. Si la dormición es demasiado leve la semilla puede germinar antes del momento propicio, causando la muerte de la plántula. Una dormición demasiado profunda provoca un retraso de la germinación, de forma que la planta resultante no aprovechará completamente la estación del crecimiento. En el caso de una dormición excepcionalmente profunda, la semilla puede incluso llegar a perder viabilidad (Fenner y Thompson, 2005; Donohue et al., 2010). Una vez se ha superada la dormición primaria, si no se dan las condiciones necesarias para la germinación, la semilla puede entrar en un estado de dormición secundaria. En la naturaleza la dormición secundaria permite a la semilla sobrevivir hasta que las condiciones ambientales sean de nuevo propicias (Finch-Savage y LeubnerMetzger, 2006; Footitt et al., 2011). De este modo, las semillas pueden permanecer largo tiempo en el suelo (“banco de semillas”) disminuyendo y aumentando su estatus de dormición para adaptarse a las condiciones ambientales y germinar en el momento más propicio (Cadman et al., 2006). 1.3.1. Regulación hormonal de la dormición La regulación hormonal de la dormición y la germinación está determinada principalmente por la relación ABA/GAs (Nambara et al., 2010). Mientras que las GAs promueven la germinación, el ABA actúa como hormona clave en el establecimiento y mantenimiento de la dormición (Finkelstein et al., 2008; Finkelstein, 2013). INTRODUCCIÓN 13 1.3.1.1. ABA y dormición El contenido de ABA de la semilla está determinado por su biosíntesis y su catabolismo (Fig. 3a). Químicamente, el ABA es un isoprenoide que contiene 15 átomos de carbono y que no deriva directamente de un sesquiterpeno (C15), sino de la modificación y escisión de la zeaxantina, un caroteno de 40 carbonos. La zeaxantina es convertida a transviolaxantina mediante la Zeaxantina Epoxidasa (ZEP), y ésta a un 9’-cis-epoxicarotenoide que puede ser 9’-cis-neoxantina o 9’-cis-violaxantina. El siguiente paso de la ruta lo lleva a cabo la 9’-Cis-Epoxicarotenoide Dioxigenasa (NCED), que cataliza la escisión del 9’-cisepoxicarotenoide (C40) en cis-xantosina (C15) y un subproducto de 25 carbonos. Mediante la acción de una deshidrogenasa y una oxidasa, la cis-xantosina es transformada en cis(+)-SABA, la forma bioactiva de la hormona (Fig. 3a; Nambara y Marion-Poll, 2005). La reacción catalizada por NCED es el principal paso limitante en la ruta biosintética de ABA, por lo que esta actividad enzimática tiene un papel clave en del contenido de ABA presente en un momento y tejido concreto de la planta (Matilla et al., 2015). En Arabidopsis, la familia NCED está formada por nueve miembros, de los cuales solamente cinco (AtNCED2, 3, 5, 6 y 9) participan en la biosíntesis de ABA. Los cinco miembros de la familia muestran distintos patrones y lugares de expresión en la planta, así como diferentes funciones en el desarrollo y en las respuestas a factores externos. Tres de estos genes AtNCED6, 9 y en menor medida AtNCED5, se expresan en la semilla durante el desarrollo y son importantes para el establecimiento y mantenimiento de la dormición (Lefebvre et al., 2006; Frey et al., 2012). Los mutantes Knock Out (KO) de los genes AtNCED6, 9 y en menor medida AtNCED5, así como los del gen ABA1 que codifica el enzima ZEP, muestran alteraciones fenotípicas derivadas de la disminución de los niveles de ABA tanto en la dormición como en la germinación (Barrero et al., 2005, 2008). El catabolismo de ABA comienza con una hidroxilación de cis(+)-S-ABA en las posiciones C-7’, C-8’ o C-9’, siendo la de C-8’ la vía predominante catabolizada por la ABA 8’-hidroxilasa (8´-OH-ABA), una citocromo P450, enzima codificada por cuatro INTRODUCCIÓN 14 miembros de la familia génica CYP707A en Arabidopsis (Fig 3b). Aunque el 8’-OH-ABA retiene cierta actividad, esta molécula se transforma rápidamente a ácido faseico y ácido dihidrofaseico, que son formas inactivas de ABA (Nambara y Marion-Poll, 2005). Los cuatro Figura 3: (a): Representación esquemática de la ruta de biosíntesis de ABA; NCED, 9Cis-Epoxicarotenoide Oxidasa; ZEP, Zeaxantina Epoxidasa. (b) Ruta de degradación de ABA; CYP707A, ABA 8’-hidroxilasa. (c): Ruta de señalización de ABA, incluyendo los receptores PYR/PYL/RCAR, las proteín-fosfatasas PP2C, las quinasas SnRK2, SNF1-Related protein Kinase 2, y factores de transcripción regulados por ABA. Elaboración propia. INTRODUCCIÓN 15 miembros de la familia CYP707A en Arabidopsis, al igual que ocurre con la familia NCED, se expresan diferencialmente en las plantas y participan en diferentes procesos (RodríguezGacio et al., 2009). CYP707A1 es la principal proteína implicada en el catabolismo de ABA durante la maduración de las semillas, mientras que CYP707A2 asume este papel en la fase final de la maduración y durante la germinación (Okamoto et al., 2006). Aunque se conoce muy poco acerca de los mecanismos de transporte de ABA entre diferentes células, se ha observado que durante la imbibición de semillas durmientes, el endospemo produce y libera ABA hacia el embrión impidiendo así la germinación (Lee et al., 2010). Se han descrito recientemente cuatro transportadores tipo ATP Binding Cassette (ABC) implicados en la movilización de ABA en las células del endospermo del embrión. Dos de ellos actúan exportando ABA desde el endospermo (AtABC-G25 y AtABC-G31) y otros dos importándolo a las células del endospermo (AtABC-G30 y AtABC-G40; Kang et al., 2015). La acción de cualquier fitohormona está determinada no solo por sus niveles bioactivos, sino también por su ruta de señalización celular. La señalización del ABA en la célula comienza por un grupo de proteínas de la familia PYR/PYL/RCAR que actúan como receptores (Fig. 3c). El complejo hormona-receptor se une a un grupo de proteín-fosfatasas tipo 2C (PP2C), reguladoras negativas de la respuesta a ABA, y las inactiva. En ausencia de ABA, PP2C inactiva a SnRK2s, un grupo de proteín-quinasas tipo Sucrose-Nonfermenting kinase 1 (SNF1) que actúan como efectores positivos de la respuesta a ABA. La inactivación de PP2C por el complejo hormona-receptor permite la activación de SnRK2s, que actúan desencadenando numerosas respuestas asociadas a ABA (Hauster et al., 2011; Hubbard et al., 2011). Entre las principales dianas de SnRK2s se encuentra un grupo de FT tipo bZIP que incluye a ABI5 y Abscisic acid Responsive Elements Binding protein 3 (AREB3). Estos factores se unen a los elementos ABRE (5´-ACGTGTC-3´) presentes en los promotores de genes regulados por ABA (Raghavendra et al, 2010; Graeber et al., 2012). 1.3.1.2. Otras hormonas implicadas en la dormición Aunque el ABA es la hormona más importante en el establecimiento y mantenimiento de la dormición de las semillas (Finkelstein, 2013), no es la única implicada. La importancia INTRODUCCIÓN 16 de las GAs es innegable ya que la transición dormición-germinación radica en una relación ABA/GAs. No obstante, las GAs actúan principalmente como promotores de la germinación, por lo que se hablará detalladamente de su papel más adelante. Se ha observado que la sobreacumulación de auxinas en la semilla aumenta los niveles de dormición, mientras que la sobreexpresión de genes implicados en su catabolismo provoca una inducción de la germinación. El ABA inhibe la elongación del embrión durante la germinación, en parte mediante la inducción de la señalización de auxinas (Belin et al., 2009; Liu et al., 2015). La reducción de la dormición mediada por AR está asociada a una disminución de la sensibilidad a auxinas y estas hormonas podrían afectar a la señalización de ABA durante la regulación de la dormición y la germinación (Liu X et al., 2013). El ácido jasmónico aplicado exógenamente retrasa la germinación, pero por el momento su papel en la germinación es poco claro (Shu et al., 2015b). La influencia de las especies reactivas de oxígeno (ROS) sobre las principales hormonas implicadas en la transición dormición-germinación (ABA/ GAs) se ha estudiado en algunas especies. En cebada, la interacción de ROS con las enzimas del metabolismo y señalización de ABA y GAs controlan el nivel de dormición de las semillas (Bahin et al., 2011). En Arabidopsis, la adición exógena de H2O2 incrementa la expresión de genes implicados en el catabolismo de ABA y en la biosíntesis de GAs, aunque dicha influencia parece ser dependiente de óxido nítrico (NO; Liu et al., 2010). 1.3.2. Regulación ambiental y genética de la dormición En muchas especies la dormición de la semilla puede eliminarse mediante un almacenamiento a bajas temperaturas y alta humedad relativa (estratificación en frío), o baja humedad y temperaturas medio-altas (AR). Aunque la temperatura parece ser el factor ambiental más importante en la regulación de la dormición, se ha demostrado que otros factores como la luz o el nitrato pueden tener un papel relevante (Fig. 4; Finch-Savage y LeubnerMetzger, 2006). Al mismo tiempo que la exposición a determinadas temperaturas altera el nivel de dormición de la semilla, el nitrato determina el rango de temperatura que resulta favorable para la germinación. Cuando la temperatura no se encuentra dentro del rango INTRODUCCIÓN 17 requerido se produce una termoinhibición de la germinación y la posible entrada en un estado de dormición secundaria. Este proceso está relacionado con un incremento en el contenido de ABA de la semilla, en el que están implicados NCED9 y, en menor medida, NCED5 y NCED2 (Toh et al., 2008). Figura 4: Representación esquemática de los procesos moleculares que regulan la inducción, mantenimiento y liberación de la dormición. Los símbolos (+) ó (-) indican un efecto regulador positivo o negativo, respectivamente. En la inducción de la dormición participan factores de origen materno y embrionario. Los factores implicados en la liberación de la dormición actúan fundamentalmente regulando el balance y la señalización de ABA y GAs. ABI, ABA INSENSITIVE; CYP707As, Citocromo P450; DAG, DOF: DNA binding with One zinc Finger AFFECTING GERMINATION; DEP, DESPIERTO; DOG1, Delay Of Germination 1; ET, etileno; EXP, expansina; FUS3, FUSCA 3; GA2ox, GA2-oxidasa; GA3ox, GA3-oxidasa; GA20ox, GA20-oxidasa; GID1, GIBERELLIN-INSENSITIVE DWARF 1; LEC, LEAFY COTYLEDON; MAN, endo-β-mananasas; NCEDs, 9’-Cis-Epoxicarotenoide Dioxigenasas; NO, óxido nítrico; PIL5, PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 3-LIKE 5; PP2C, proteína fosfatasas tipo 2C; ROS, especies reactivas de oxígeno; SnRK2, SNF1-Related protein Kinase 2; SPT, SPATULA; XTH, xiloglucano endotransglucosilasa/hidrolasa; VP8, VIVIPAROUS8; ZEP, Zeaxantina Epoxidasa. Adaptado de Finkelstein et al. (2008). INTRODUCCIÓN 18 Las proteínas DELLA, reguladores negativos de la respuesta a GAs, junto con los FTs ABI3 y ABI5, reguladores positivos de la respuesta a ABA, son necesarios para el mantenimiento de la dormición (López-Molina et al., 2001; Penfield et al., 2006a, b; Penfield y King, 2010). Las proteínas DELLA también pueden promover el aumento de los niveles de ABA en semillas (Piskurewicz et al., 2008). Por otra parte, las semillas con alto grado de pigmentación en sus cubiertas presentan elevados niveles de dormición y alteraciones en su longevidad. La pigmentación de las semillas depende del contenido en proantocianidinas (PAC; compuestos flavonoides), presentes en sus cubiertas seminales o en otras estructuras envolventes (pericarpo, etc.). Durante la maduración de la semilla, las PAC interaccionan con distintos elementos de las paredes celulares, provocando un engrosamiento de las distintas capas celulares de la testa, proporcionando así una mayor resistencia mecánica y reduciendo la permeabilidad al agua, a los gases y a las hormonas. Además, la naturaleza antioxidante de las PAC favorece la inhibición de la degradación oxidativa del ABA (Groos et al., 2002; Sweeney et al., 2006; Debeaujon et al., 2000, 2007; Wada et al., 2011). Como ya se ha mencionado, la dormición primaria se establece durante la maduración de la semilla y la mutación de los genes que codifican los FTs ABI3, FUS3, LEC1 y LEC2, provoca graves alteraciones en el grado de dormición de las mismas (Fig. 4). Se han descrito varios factores que regulan la dormición a través de estos cuatro reguladores transcripcionales (Graeber et al., 2012). Uno de los ejemplos mejor estudiados es el gen VIVIPAROUS8 (VP8) de maíz, que codifica el FT VP8, y que a su vez regula al gen ABI3, cuya mutación causa también viviparismo (Suzuki et al., 2008). Sus FTs ortólogos en arroz (PLASTOCHRON3/GOLIATH, PLA3/GO) y en A. thaliana (ALTERED MERISTEM PROGRAM1, AMP1) también afectan a la dormición, por lo que dicho mecanismo parece estar conservado a lo largo de la evolución en plantas (Kawakatsu et al., 2009; Griffiths et al., 2011). La expresión de ABI3 está también regulada por DESPIERTO (DEP), que influencia la señalización de ABA durante el desarrollo. Recientemente se ha descrito que WRKY41 controla directamente la transcripción de ABI3 durante la maduración y la germinación. Tanto DEP como WRKY41 son reguladores de la dormición y germinación en Arabidopsis (Barrero et al., 2010b; Ding et al., 2014). Los genes DAG1 y DAG2 (DOF: DNA binding with One zinc Finger AFFECTING GERMINATION) codifican FT parálogos que se expresan en el tejido materno durante el INTRODUCCIÓN 19 desarrollo de la semilla y que tienen un efecto opuesto sobre el potencial germinativo de la descendencia (Fig. 4). DAG1 activa la expresión de genes maternos que favorecen la dormición, mientras que DAG2 reprime esta activación mediante su unión al mismo elemento en cis-, o interaccionando directamente con DAG1 (Gualberti et al., 2002; Papi et al., 2002). Mediante el estudio de las variaciones naturales en el grado de dormición en distintos ecotipos de Arabidopsis se identificó el gen Delay Of Germination1 (DOG1) como un locus de carácter cuantitativo (QTL: Quantitative Trait Locus) asociado con el nivel de dormición de las semillas. El gen DOG1 se transcribe durante la maduración de la semilla (Bentsink et al., 2006), y disminuye progresivamente hasta la fase de semilla seca desapareciendo finalmente a lo largo de la imbibición (Nakabayashi et al., 2012). Las semillas durmientes contienen una elevada cantidad de la proteína DOG1, que no disminuye después de un tratamiento de AR. Se ha propuesto que el AR podría actuar mediante la inactivación de la proteína DOG1, y no mediante su degradación, basándose en el hecho de que DOG1 cambia su punto isoeléctrico cuando la semilla es sometida a AR (Nakabayashi et al., 2012). Mediante estudios de doble híbrido en levaduras (Yeast two Hybrid, Y2H) se han identificado varias proteínas que interaccionan físicamente con DOG1. Una de estas proteínas es PDF1, una proteín-fosfatasa tipo 2A. Los mutantes pdf1 muestran un incremento de los niveles de dormición, al contrario de lo que ocurre con los mutantes dog1 (Miatton, 2012). Los autores de dicho estudio han sugerido que DOG1 en su estado activo está fosforilada, siendo desactivada mediante la desfoforilación catalizada por PDF1. Así mismo, se ha descrito que las semillas cuya proteína DOG1 es incapaz de unirse consigo misma presentan un menor nivel de dormición. También se ha propuesto que el AR está asociado con modificaciones de DOG1, la cuales podrían alterar dicha capacidad de la proteína para unirse consigo misma, inhibiendo así su función (Nakabayashi et al., 2015). Por otro lado, la funcionalidad de DOG1 es dependiente de ABA (Bentsink et al., 2006). Por ello, se ha propuesto que DOG1 influye en la dormición al afectar a los niveles de ABA durante el desarrollo de la semilla, siendo residuales los niveles de DOG1 en semilla seca (Nakabayashi et al., 2012; Vaistij et al., 2013). Recientemente, se han descrito varios mecanismos epigenéticos relacionados con la regulación de la dormición. Entre ellos se incluyen factores relacionados con la metilación del DNA, y la ubiquitinación y deacetilación de histonas (Nonogaki, 2014). INTRODUCCIÓN 20 1.4. AFTER-RIPENING (AR; POST-MADURACIÓN) Se conocen diversas formas por las que se pueden reducir el grado de dormición de la semilla. El almacenamiento de las semillas en condiciones de baja humedad y temperaturas medio-altas (AR) provoca una pérdida de dormición lenta y gradual. La capacidad de la semilla para responder a las diferentes condiciones que reducen la dormición varía en función de la especie (Finch-Savage et al., 2007). La necesidad de AR, en semillas cuya dispersión ocurre en primavera-verano, retrasa su germinación hasta otoño; de modo que las plántulas no se ven sometidas a las condiciones de alta temperatura y baja humedad características del verano, como ocurre en S. officinale (Iglesias-Fernández y Matilla, 2009; Weitbrecht et al., 2011). El AR no provoca una pérdida absoluta de la dormición sino que aumenta progresivamente la capacidad de la semilla para responder a condiciones que favorecen la germinación. El tiempo necesario para completar este proceso es muy variable en función de la especie, la profundidad de la dormición de la semilla y las condiciones del almacenamiento (Finch-Savage y Leubner-Metzger, 2006; Iglesias-Fernández et al., 2011a). Los principales efectos del AR son: - Aumento del rango de temperatura para germinar (Oracz et al., 2007; IglesiasFernández y Matilla, 2009). - Disminución de los niveles y sensibilidad al ABA (Grappin et al., 2000; AliRachedi et al., 2004; Cadman et al., 2006). - Aumento de los niveles y sensibilidad a GAs o disminución de su requerimiento (Cadman et al., 2006). - Pérdida de requerimientos lumínicos para la germinación en semillas que no germinan en oscuridad, y aumento en la sensibilidad a la luz en semillas que no germinan incluso en su presencia (Battla y Benech-Arnold, 2005). - Pérdida del requerimiento de nitrato (NO3-) en el medio de germinación en semillas de plantas nitrófilas (Alboresi et al., 2005). - Aumento de la velocidad de germinación (Finch-Savage y Leubner-Metzger, 2006; Holdsworth et al., 2008a; Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). INTRODUCCIÓN 21 1.4.1. Regulación hormonal del AR Aunque se han estudiado en detalle las consecuencias fisiológicas del AR, los mecanismos moleculares que lo gobiernan son todavía muy poco conocidos. En general, el AR está asociado a una disminución en el contenido de ABA, aunque su magnitud varía en función de la especie. En tabaco, Arabidopsis y cebada, el AR provoca la disminución en el contenido de ABA en la semilla seca debido al aumento de la expresión de genes implicados en su catabolismo (Fig. 4; AtCYP707A2 en Arabidopsis y HvABA8´OH-1 en cebada; Millar et al., 2006; Liu A et al., 2013). La pérdida de dormición debida al AR suele asociarse también a un incremento en los niveles de GAs en dicotiledóneas; no obstante, esta relación no parece darse en cereales (Liu A et al., 2013; Hauvermale et al., 2015). En S. officinale, se ha descrito que el AR aumenta la expresión de los genes SoGA3ox2 y SoGA20ox2, implicados en la biosíntesis de GAs, durante la imbibición temprana de las semillas (Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). Durante el AR, existe una regulación cruzada de los niveles de ABA y GAs. El ABA actúa como represor de genes implicados en la biosíntesis de GAs (Seo et al., 2006), mientras que las GAs reprimen aquellos implicados en la biosíntesis de ABA (Shu et al., 2013). La sensibilidad de la semilla a ABA y GAs también se altera durante el proceso de AR debido a numerosos factores tales como la luz o la temperatura (Penfield y King, 2010; Hauvermale et al., 2015). La pérdida de dormición está asociada a una disminución de la sensibilidad a ABA en Arabidopsis. En esta especie el AR provoca una disminución de la expresión del gen que codifica el receptor de ABA PYR1, así como la de otros genes implicados en la señalización del ABA tales como SnRK2.1, SnRK2.4 y, en menor medida, ABI3 y ABI5 (Footitt et al., 2011). En cebada, el AR provoca una disminución en la expresión de HvAIP2 (ABI3-INTERACTING PROTEIN 2), regulador positivo de la respuesta a ABA (Barrero et al., 2009). Resultados similares se han observado en trigo (Liu A et al., 2013). En Arabidopsis, el AR incrementa la expresión del gen que codifica el receptor citoplasmático de GAs GID1 (GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF 1; Hauvermale et al., 2015). A este puzle se suman varios FTs con dominio AP2 capaces de alterar el metabolismo de ABA y GA (Shu et al., 2015b). Uno de estos factores es ABI4, cuyo gen se expresa principalmente durante el desarrollo y germinación de semillas. ABI4 actúa como regulador positivo de la dormición primaria, provocando un incremento en el contenido de ABA y una INTRODUCCIÓN 28 1.5.1. Regulación hormonal de la germinación Al igual que ocurre con la dormición (ap. 1.3), las dos fitohormonas clave en el control de la germinación son el ABA y las GAs y más concretamente la relación GAs/ABA. Dicha relación se incrementa aproximadamente diez veces durante la Fase II de la germinación de A. thaliana (Piskurewicz et al., 2008; Nonogaki et al., 2010; Miransari y Smith, 2014). El contenido de ABA en semillas secas es relativamente alto y disminuye rápidamente durante la imbibición, independientemente del grado de dormición de la semilla. En semillas en dormición secundaria (ej.: termoinhibición), los niveles de ABA aumentan durante la imbibición a causa de la síntesis de novo de esta hormona. La germinación se ve notablemente inhibida por la presencia de ABA exógeno en el medio de imbibición, por lo que la reducción de los niveles de esta hormona parece ser un prerrequisito importante para la germinación (Nambara et al., 2010). Las GAs contrarrestan el papel inhibitorio del ABA y, aunque se encuentran en niveles fisiológicamente relevantes en la semilla seca sometida a AR (no durmiente), su síntesis se incrementa notablemente durante la imbibición (Fase II; Shu et al., 2015b). La biosíntesis y señalización de ABA están localizadas en el endospermo de las semillas. Recientemente, se ha descrito el transporte de ABA desde el endospermo al embrión mediado por proteínas tipo ABC (Piskurewicz et al., 2009; Lee et al., 2010; Linkies et al., 2010; Kang et al., 2015). La biosíntesis de GAs durante la germinación está localizada principalmente en el hipocótilo, la radícula y el endospermo micropilar (Ogawa et al., 2003). De forma general, se considera que las GAs controlan la expansión celular que ocurre en el eje radicular durante la germinación de Arabidopsis, controlando la ruptura tanto de la cubierta seminal como la del endospermo micropilar. Además, el ABA dificulta el debilitamiento del endospermo micropilar controlando los procesos moleculares implicados en este debilitamiento (Piskurewicz et al., 2009; Gazzarrini y Tsai, 2015). 1.5.1.1. Giberelinas (GAs) y germinación Existen más de 130 GAs descubiertas en plantas y hongos pero muy pocas son formas bioactivas, como GA1, GA3 o GA4. El resto son en gran parte intermediarios biosintéticos o INTRODUCCIÓN 29 productos del catabolismo de las GAs bioactivas (Sreepriya et al., 2014). Todas las formas bioactivas de GAs son diterpenoides ácidos derivados del ent-kaureno, el cual se sintetiza en proplastidios y es exportado al citoplasma. Mediante la acción de varias citocromo P450 monooxigenasas, el ent-kaureno se tranforma en GA12, la primera GA de la ruta. La GA12 sufre diversas oxidaciones por dos rutas paralelas dando lugar a varias GAs intermedias y, finalmente, a las formas bioactivas. En el caso de las GAs activas (GA1, y GA4), las reacciones enzimáticas clave de la ruta son catalizadas por GA20-oxidasas (GA20ox) y GA3oxidasas (GA3ox; Fig. 6). La inactivación de GAs puede producirse mediante una 2βhidroxidación catalizada por GA2-oxidasas (GA2ox; Yamaguchi, 2008). Tanto la estratificación en frío como la luz roja, ambos factores inductores de la germinación, provocan un aumento en los niveles de GAs bioactivas mediante el incremento en la expresión de los genes que codifican GA3ox y GA20ox (Fig. 5; Kucera et al., 2005). Por el contrario, los genes que codifican GA2ox se expresan en semillas durmientes y son estimulados por factores ambientales inhibidores de la germinación, como la oscuridad o las altas temperaturas (Ogawa et al., 2003; Yamauchi et al., 2004; Sun, 2008; Penfield y King, 2010). La señalización de las GAs en la célula comienza con el grupo de proteínas GID1 (GAINSENSITIVE DWARF1), que funcionan como receptores solubles de GAs (Fig. 6; Nakijama et al., 2006). GID1 se une a las formas bioactivas de GAs con una gran afinidad, lo cual provoca un cambio conformacional en la región N-terminal del receptor (Murase et al., 2008). El complejo GA-GID interactúa con las proteínas DELLA, reguladores negativos de la respuesta a GAs, promoviendo su ubiquitinación para ser degradada por el complejo proteosomal 26S. De las cinco proteínas DELLA descritas en Arabidopsis (Repressor of GA, RGA; Gibberellic Acid Insensitive, GAI; RGA-like1-3, RGL1-3), RGL2 es la que tiene una mayor influencia como represor de la germinación siendo degradada en presencia de GAs, y estimulando la síntesis de ABA y la actividad de ABI3 y ABI5 (Piskurewicz et al., 2008; Gallego-Bartolomé et al., 2010; Hauvermale et al., 2012; Gazzarrini y Tsai, 2015). INTRODUCCIÓN 30 1.5.1.2. Otras hormonas implicadas en la germinación El etileno es una hormona gaseosa. La aplicación exógena de etileno promueve la germinación en diferentes tipos de semillas en dormición primaria y secundaria. Algunos Figura 6: (a): Representación esquemática de las rutas de biosíntesis e inactivación de giberelinas (GAs) bioactivas, incluyendo las enzimas consideradas como las principales reguladoras de estas rutas. GA2ox, GA2-oxidasa; GA3ox, GA3-oxidasa; GA20ox, GA20-oxidasa. Adaptado de Fagoaga et al. (2007). (b): Ruta de señalización de GAs. En presencia de la hormona, el receptor GID1, GIBERELLININSENSITIVE DWARF 1, promueve la poliubiquitinación y posterior degradación proteosómica de las proteínas DELLA, reguladoras negativas de la respuesta a GAs. Elaboración propia. INTRODUCCIÓN 31 tratamientos capaces de eliminar la dormición provocan un incremento en la producción de etileno (Gallardo et al., 1991; Matilla y Matilla-Vázquez, 2008; Corbineau et al., 2015). La concentración de etileno en la semilla aumenta durante el transcurso de la germinación de varias especias, entre ellas el trigo, el maíz, la soja o el arroz (Arc et al., 2013). En especies como A. thaliana, L. sativum, S. officinale o Brassica rapa se ha descrito un incremento de la expresión de los genes implicados en la síntesis de etileno durante la germinación (Rodríguez-Gacio et al., 2004; Linkies et al., 2009; Iglesias-Fernández y Matilla, 2010). Las semillas de mutantes de Arabidopsis insensibles a etileno muestran elevados niveles de ABA y germinan más lentamente que el fenotipo silvestre. Dichos mutantes muestran alteraciones en la expresión de genes implicados en las rutas de síntesis y catabolismo de ABA (Fig. 5). En L. sativum y A. thaliana el etileno promueve el debilitamiento del endospermo micropilar al actuar como regulador negativo de la señalización de ABA (Cheng et al., 2009; Linkies et al., 2009; Arc et al., 2013). El NO· es un radical libre inorgánico y gaseoso, que debido a su naturaleza puede difundir a través de las membranas celulares y actuar sobre un amplio rango de dianas; actualmente su estatus como fitohormona está siendo considerado. El principal lugar de síntesis de NO· parece ser el endospermo ya que el NO· no tiene efecto sobre el crecimiento de embriones aislados (Bethke et al., 2007a). El NO· disminuye la sensibilidad a ABA en semillas durmientes y provoca un incremento en la expresión de CYP707A2 durante la germinación (Fig. 6), lo cual reduce los niveles de ABA activo rompiendo la dormición (Bethke et al., 2007a; Liu et al., 2007). Se ha postulado que las modificaciones posttraduccionales de proteínas, tales como la S-nitrosilación de cisteínas y la nitración de tirosinas, son una de las principales dianas del NO· (Arc et al., 2013). Recientemente, se ha descubierto que la S-nitrosilación de la cisteína-153 de ABI5, mediada por el NO·, provoca su degradación durante la imbibición de las semillas de Arabidopsis, reduciendo así la señalización del ABA y facilitando la germinación (Albertos et al., 2015). Tanto las citoquininas como los brasinoesteroides actúan favoreciendo la germinación, aunque su efecto es mucho menor que el de las GAs. El mecanismo de acción de ambas hormonas se ha vinculado con la regulación negativa de la señalización del ABA (Xi y Yu, 2010; Wang et al., 2011; Shu et al., 2015b). INTRODUCCIÓN 32 1.5.2. Nitrato (NO3-) y germinación El NO3representa una fuente de N muy importante para la planta, pero también actúa como molécula señalizadora en diferentes procesos del desarrollo. En el caso de la transición dormición-germinación, el NO3actúa disminuyendo el nivel de dormición y favoreciendo la germinación (Finch-Savage et al., 2007). La adición de NO3al medio de imbibición incrementa la germinación tanto en Arabidopsis como en S. officinale (Alboresi et al., 2005; Iglesias-Fernández et al., 2007). Dicho efecto se observa también cuando el NO3es suministrado a la planta madre durante el desarrollo de las flores y frutos (Alboresi et al., 2005). Se ha evaluado si el efecto del NO3sobre la germinación podría ser nutricional; no obstante la adición de otras fuentes de nitrógeno al medio de germinación no genera el mismo efecto. La asimilación de nitrato como nutriente depende de su reducción mediante las actividades Nitrato Reductasa (NR) y Nitrito Reductasa (NiR). En Arabidopsis la mutación de NIA1 y NIA2, genes que codifican NRs, reduce la actividad NR en el tallo a un 0,5% y provoca un incremento considerable de los niveles de NO3en la planta. Aunque dichos mutantes tienen un crecimiento más lento, asociado seguramente a la limitación nutricional de N, el nivel de dormición de sus semillas es generalmente menor que el de las no mutantes y responde de forma similar a la presencia de NO3tanto en el medio de imbibición como en la planta madre. Estos datos parecen descartar que los efectos del NO3o de alguno de sus derivados sean meramente nutricionales (Alboresi et al., 2005). Los mecanismos por los que el NO3altera la transición dormición-germinación son poco conocidos. En estudios transcriptómicos las alteraciones transcripcionales provocadas por elevados niveles de NO3en la planta madre se parecen a las asociadas con la estratificación o el AR, produciéndose una reducción en los niveles de ABA en la semilla, asociado a un aumento de la expresión génica de CYP707A2 (Fig. 5; Matakiadis et al., 2009). Otros experimentos sugieren que el NO3podría disminuir también el requerimiento de GAs durante la germinación. Aunque este hecho podría estar también relacionado con la reducción del contenido de ABA en la semilla (Alboresi et al., 2005). En Arabidopsis y S. officinale, la sensibilidad de las semillas al NO3varía cuando son sometidas a AR (Finch-Savage et al., 2007; Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). Estos datos sugieren una interacción molecular entre el AR y el NO3como reguladores de la transición dormición-germinación (IglesiasFernández et al., 2011a) INTRODUCCIÓN 33 1.5.3. Regulación ambiental y genética de la germinación La influencia de la luz en los procesos de dormición y germinación está mediada por la acción de los fitocromos. En semillas embebidas, los fitocromos A y B (PhyA y PhyB) activados por la luz transmiten su señal al núcleo, a través de la desestabilización de PHYTOCROME INTERACTING FACTOR3-LIKE5 (PIL5), un FT del tipo PIF (subgrupo de la familia bHLH) que actúa como regulador negativo de la germinación. En oscuridad, PIL5 incrementa la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ABA y en el catabolismo de GAs, mientras que reduce la de los genes relacionados con el catabolismo de ABA y síntesis de GAs (Gabriele et al., 2005). Además, PIL5 induce la expresión del gen que codifica la proteína DELLA RGL2 en el eje radicular y de genes que codifican FTs que median la señalización de ABA en el endospermo micropilar (ABI3 y ABI5; Piskurewicz et al., 2008, 2009; Oh et al., 2007, 2009). Recientemente, se ha descrito que existe una interacción directa entre PIL5 y el promotor de SOMNUS, gen que codifica un FT con dedo de zinc (tipo CCCH) que controla el metabolismo del ABA y GAs (Kim et al., 2008; Park et al., 2011; Lim et al., 2013). PIL5 también se ha relacionado con el control transcripcional de genes implicados en el metabolismo de otras hormonas, como auxinas, brasinoesteroides o jasmonatos, y con la represión de la expresión de genes que codifican enzimas modificadoras de la pared celular, como EXPs, XTHs (Oh et al., 2009). Otro FT de tipo PIF, SPATULA (SPT), también es un regulador negativo de la germinación, mediando principalmente la respuesta de la semilla a bajas temperaturas (Penfield et al., 2005). SPT inhibe la germinación disminuyendo la sensibilidad de las semillas a GAs, posiblemente mediante la interacción con proteínas DELLA, y alterando el contenido de GAs, mediante la represión transcripcional de los genes GA3ox1 y GA3ox2 (Fig. 5). En condiciones de baja temperatura, SPT desaparece, lo cual desencadena un aumento del contenido y la sensibilidad a GA (Oh et al., 2006, 2007; Feng et al., 2008; Holdsworth et al., 2008a). Tanto el debilitamiento del endospermo como la expansión de las células de eje embrionario (hipocótilo+radícula) son procesos clave en el control de la germinación por GAs, las cuales inducen la expresión de genes que codifican enzimas remodeladoras de la pared celular (Fig. 5; Weitbrecht et al., 2011). Algunos ejemplos son: INTRODUCCIÓN 34  Expansinas: las α-expansinas (EXPA) son un grupo de proteínas que facilitan la expansión de las paredes celulares. Los genes que codifican estas proteínas se expresan tanto en el endospermo como en el eje embrionario durante la germinación (Nonogaki et al., 2007; Bassel et al., 2014). En tomate, se ha observado que LeEXPA4 se expresa en el endospermo micropilar coincidiendo con el debilitamiento del mismo (Chen y Bradford, 2000). En Arabidopsis, AtEXP2 se expresa exclusivamente durante la germinación en el endospermo micropilar y su expresión está inducida por GAs y no por ABA (Ogawa et al., 2003; Yan et al., 2014). Sin embargo, AtEXPA5, AtEXPA8 y AtEXPA15 se expresan fundamentalmente en el eje embrionario durante la germinación de las semillas de Arabidopsis (Bassel et al., 2014).  Xiloglucano-endotransglicosilasas/hidrolasas (XTHs): estas enzimas actúan hidrolizando las cadenas de xiloglucano, una de las hemicelulosas más abundantes de la pared celular. En tomate, LeXET4 se expresa exclusivamente en el endospermo micropilar contribuyendo al debilitamiento del mismo y su expresión está inducida por GAs y no por ABA (Nonogaki et al., 2007). En Arabidopsis, AtXTH9 y AtXTH19 se expresan fundamentalmente en el eje embrionario en expansión durante la imbibición (Bassel et al., 2014).  Endo-β-mananasas (MANs): estas enzimas participan en la degradación de mananos presentes en el endospermo. La expresión de genes que codifican MANs ocurre durante la germinación de diversas especies, como A. thaliana, L. sativum, Lycopersicum sculentum y Brachypodium distachyon (Iglesias-Fernández et al., 2011b, c; Morris et al., 2011; Rodríguez-Gacio et al., 2012; González-Calle et al., 2015). En Arabidopsis, los genes AtMAN2, 5, 6 y 7 se expresan abundantemente durante la imbibición; y los mutantes con pérdida de función man6 y man7 germinan más lentamente que el fenotipo silvestre. Además, la expresión de AtMAN2, 5, 6 y 7 está restringida al endospermo micropilar y al ápice radicular durante la germinación (Iglesias-Fernández et al., 2011b, c). La expresión de AtMAN7 está inducida por GAs, pero permanece inalterada por ABA (Iglesias-Fernández et al., 2013). En tomate, se ha localizado la expresión de LeMAN2 en la zona micropilar justo antes de la emergencia radicular INTRODUCCIÓN 35 (Gong y Bewley, 2007). En semillas de L. sativum, se demostró la importancia de LesaMAN7 en la germinación (Morris et al., 2011). Recientemente, se ha anotado la familia génica de las MANs en Brachypodium distachyon, la planta modelo para las Poaceae; se ha observado que BdMAN2, BdMAN4 y BdMAN6 se expresan durante la imbibición y sus transcritos se encuentran localizados en la coleoriza y en el ápice radicular durante la germinación. Estos datos sugieren que las MANs podrían tener un papel importante en el debilitamiento de la coleorriza, así como en el crecimiento por expansión de la raíz en monocotiledóneas (González-Calle et al., 2015).  Celulasas: las celulasas o endo-β-1,4-glucanasas, son enzimas clave en la degradación de la celulosa y se expresan durante la germinación. En Coffea arabica dicha actividad se incrementa notablemente durante el inicio del ablandamiento del endospermo (da Silva et al., 2004). En tomate la expresión de LeCel55 aumenta en la zona micropilar justo antes de la protrusión radicular (Bradford et al., 2000). 1.6. Sisymbrium officinale (L.) Scop Sisymbrium officinale (L.) Scop., la especie objeto de este estudio, es una planta herbácea anual perteneciente a la familia Brassicaceae. Esta planta es oriunda de Europa, del norte de África y de Oriente Próximo y se encuentra representada en toda la Península Ibérica, donde recibe el nombre común de erísimo o hierba de los cantores. Su tamaño oscila entre los 50 y los 90 cm, sus flores son de color amarillo pálido (Fig. 7a) y sus frutos son silicuas constituidas de valva y rostro, que alcanzan los 13-19 mm en la maduración (Fig. 7b; Castroviejo et al., 2003). Sus semillas tienen forma irregular, con un embrión completamente desarrollado. El tamaño de la semilla oscila entre 0.5 y 1 mm aproximadamente, y su color varía entre el amarillo y el marrón (Fig. 7c; Iglesias-Fernández et al., 2007; Iglesias Fernández, 2009). Dichas diferencias están asociadas a su posición en la silicua y posiblemente a la disponibilidad de nutrientes provenientes de la planta madre (Luzuriaga et al., 2006). La capacidad germinativa está directamente relacionada con el grado de coloración de la semilla, de tal forma que las semillas más oscuras presentan una mayor capacidad germinativa. En S. officinale, al igual que en otras Brasicáceas, existe un desfase temporal entre la rotura de la testa y la subsiguiente ruptura del endospermo que en esta especie es INTRODUCCIÓN 36 monoestratificado (Iglesias-Fernández et al., 2007; Iglesias Fernández, 2009; IglesiasFernández y Matilla, 2010). En el momento de la dispersión, las semillas de S. officinale se encuentran en dormición primaria y al permanecer en el suelo pueden presentan ciclos de dormición secundaria anuales. La dormición disminuye en otoño e invierno, y aumenta de nuevo en verano, estando dichos cambios asociados a alteraciones en la sensibilidad a la luz, a la temperatura y el nitrato (Bouwmeester y Karseen, 1993; Derk y Karssen, 1993). La dormición primaria de S. officinale es intensa, necesita ser sometida a AR durante varios meses para eliminarla por completo, característica que hace a esta especie interesante para abordar el estudio fisiológico-molecular del AR. El AR en esta especie altera los patrones de expresión de varios genes que codifican oxidasas implicadas en el metabolismo de GAs (GA3ox y GA20ox) y de etileno (ACC Oxidasa, ACO), siendo ambas hormonas inductoras de la germinación (Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). No obstante, se conoce muy poco acerca del papel del AR sobre el metabolismo y señalización de ABA, la principal hormona implicada en el mantenimiento de la dormición. La germinación de S. officinale depende fuertemente del contenido de nitrato en la semilla. La presencia de nitrato en el medio de imbibición estimula notablemente la germinación; esta Figura 7: (a): Planta adulta de Sisymbrium officnale (L.) Scop. (b): Silicuas en distintas fases del desarrollo. (c) Dos poblaciones de semillas con diferencias en el color de su cubierta seminal. Las imágenes (a) y (c) han sido adaptadas de Iglesias-Fernández et al. (2007). INTRODUCCIÓN 37 dependencia es atenuada por el AR. La luz roja estimula la germinación de las semillas en presencia de nitrato, y la acción el nitrato parece ser dependiente, al menos en parte, de la biosíntesis y señalización de GAs (Hilhorst et al., 1986; Hilhorst, 1990; Iglesias Fernández, 2009; Iglesias-Fernández y Matilla, 2010). OBJETIVOS 63 El trabajo presentado en esta Memoria ha sido financiado por el proyecto CGL200911425 (MICINN; IP Prof. A.J. Matilla Carro). En investigaciones previas de nuestro Grupo se determinó la influencia del after-ripening (AR) sobre el metabolismo del etileno y GAs durante la germinación de semillas de Sisymbrium officinale, las cuales tienen carácter nitrófilo. Las conclusiones derivadas de estos estudios previos nos condujeron a profundizar en la influencia del nitrato y GAs durante el proceso de AR y también a explorar la participación del ABA debido a su papel clave en la dormición de semillas (revisado en Matilla et al., 2015; Anexo I en la Introducción General). Teniendo en cuenta estos antecedentes, se plantearon los Objetivos principales que se exponen a continuación: 1Caracterización de la influencia del nitrato, ABA y GAs en la germinación de semillas de S. officinale no sometidas a AR (durmientes). Para ello: (i) se realizaron ensayos de germinación con ABA, GAs e inhibidores de la síntesis de los mismos, así como en presencia de NO3- (KNO3); (ii) se analizó la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo y la señalización de ABA y GAs (SoNCED, SoCYP707A, SoABI5, SoGA2ox, SoGA3ox, SoGA20ox y SoRGL2), durante la germinación en presencia/ausencia de ABA, GAs y NO3-; (iii) se evaluaron las alteraciones histológicas que sufren las semillas durante la germinación. Estos resultados han sido publicados en: “Nitrate ‐ induced early transcriptional changes during imbibition in non ‐ after ‐ ripened Sisymbrium officinale seeds” (2013) Physiologia Plantarum 148: 560-573 (Capítulo 1). 2Caracterización de la influencia del NO3-, ABA y GAs en la germinación de semillas de S. officinale sometidas a AR (no durmientes). Para ello: (i) se realizaron ensayos de germinación añadiendo al medio de imbibición ABA, GAs e inhibidores de la síntesis de los mismos, así como también NO3- (KNO3); y (ii) se analizó la expresión de genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo y la señalización de ABA y GAs (SoNCED, SoCYP707A, SoABI5, SoGA2ox, SoGA3ox, SoGA20ox y SoRGL2), durante el desarrollo y germinación en presencia/ausencia de ABA, GAs y NO3-. Estos resultados han sido publicados en: “Nitrate affects sensu-stricto germination of after-ripened Sisymbrium officinale seeds by modifying expression of SoNCED5, SoCYP707A2 and SoGA3ox2 genes” (2014) Plant Science 217: 99-108 (Capítulo 2). OBJETIVOS 64 3Caracterización de SoDOG1 en la germinación de semillas de S. officinale. Para ello: (i) se aisló la secuencia codificante SoDOG1 y se analizó utilizando herramientas bioinformáticas con el fin de confirmar su identidad; y (ii) se evaluó la expresión de SoDOG1 durante el desarrollo y germinación de semillas sometidas a distintos regímenes de AR, así como en presencia/ausencia de ABA, GAs y NO3en el medio de imbibición. Estos resultados han sido publicados en: “ABA ‐ stimulated SoDOG1 expression is after ‐ ripening inhibited during early imbibition of germinating Sisymbrium officinale seeds” (2015) Physiologia Plantarum 155: 457-471 (Capítulo 3). 3. CAPÍTULO 1: “Nitrate-induced early transcriptional changes during imbibition in non-after-ripened Sisymbrium officinale seeds” (2013) Physiologia Plantarum 148: 560-573. CAPÍTULO 1 67 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.2012.01720.x/full 4. CAPÍTULO 2: “Nitrate affects sensu-stricto germination of afterripened Sisymbrium officinale seeds by modifying expression of SoNCED5, SoCYP707A2 and SoGA3ox2 genes” (2014) Plant Science 217: 99-108. CAPÍTULO 2 83 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945213002707 5. CAPÍTULO 3: “ABA‐stimulated SoDOG1 expression is after‐ ripening inhibited during early imbibition of germinating Sisymbrium officinale seeds” (2015) Physiologia Plantarum 155: 457-471. DISCUSIÓN GENERAL 121 embriogénico), y en menor intensidad en el estadio 5 (maduración), sugiriendo una relación directa con la inducción de la dormición y la tolerancia a la desecación. Estos datos de expresión coinciden con los patrones de acumulación de ABA en las silicuas en desarrollo previamente descritos en Arabidopsis (Finkelstein et al., 2008; Kanno et al., 2010; Sun et al., 2010; Martínez-Andújar et al., 2011). Los mutantes deficientes en AtNCED6 y AtNCED9 contienen bajos niveles de ABA en semilla seca comparados con los del fenotipo silvestre (Lefebvre et al., 2006). En S. officinale, la expresión de SoNCED6 en semilla seca no sometida a AR (AR0; semilla durmiente) y en el estadío 5 del desarrollo es cuantitativamente similar. Estos resultados apuntan a un papel principal de SoNCED6 en la inducción y en el mantenimiento de la dormición, al igual que ocurre con AtNCED6 en Arabidopsis (MartínezAndújar et al., 2011). La familia génica CYP707A2 incluye genes que codifican enzimas ABA-8´- hidroxilasas, piezas fundamentales en el catabolismo del ABA (Kushiro et al., 2004; Nambara y Marion-Poll, 2005; Nambara et al., 2010; referencias en Tabla Suplementaria S1 en Carrillo-Barral et al., 2014). La expresión de SoCYP707A2 durante el desarrollo de la semilla de S. officinale, presenta dos máximos: el primero tras la polinización y el segundo en el estadío 5 (al igual que ocurre con AtNCED5, 6 y 9). El primer máximo, justo después de la polinización, indica una relación con la eliminación del ABA residual proveniente del proceso de fecundación, facilitando así el desarrollo temprano del embrión. Como ya se indicó anteriormente, la homeostasis de ABA en los órganos vegetales es dependiente del balance entre su biosíntesis y su catabolismo, por lo que la acumulación de SoCYP707A2 en el estadío 5 del desarrollo no entra en conflicto con la expresión de SoNCED5, 6 y 9. Además, su ortólogo en Arabidopsis (CYP707A2) se expresa abundantemente en las etapas finales del desarrollo de la semilla y su silenciamiento provoca un incremento en el contenido de ABA en estas etapas (Okamoto et al., 2006). ABI5 es un FT que regula la repuesta a ABA, y RGL2 un regulador negativo de la respuesta a GAs (Holdsworth et al., 2008a; Piskurewicz et al., 2009; Graeber et al., 2012). Durante el desarrollo de la semilla, la expresión del SoABI5 y SoRGL2 describe una curva bimodal similar a la observada en SoNCED5, 6 y 9, alcanzado uno de los máximos durante la maduración. En su conjunto, estos resultados sugieren un bloqueo de la señalización de GAs y una estimulación de la de ABA durante la maduración de la semilla de S. officinale. DISCUSIÓN GENERAL 122 El gen DOG1 fue el primer locus asociado al control de la dormición en las semillas de A. thaliana (Bentsink et al., 2006). En los mutantes Knock-Out dog1, el contenido de ABA de sus semillas es bajo, mientras que el de GAs es elevado. Además, el grado de dormición y la longevidad de estas semillas es menor que las del fenotipo silvestre (Nakabayashi et al., 2012). Sin embargo, aunque el gen BnaDOG1 de Brassica napus se induce durante el desarrollo, el grado de dormición de estas semillas es poco profundo (Née et al., 2015); indicando que la expresión de DOG1 no es suficiente para inducir la dormición. En esta Memoria se demuestra que: (i) el gen SoDOG1 se induce durante el desarrollo de las semillas de S. officinale, alcanzando un máximo en los estadios finales de la maduración, y (ii) sus transcritos son abundantes en semilla seca durmiente (AR0; Carrillo-Barral et al., 2015). La acumulación de SoDOG1 en semilla seca y su perfil de expresión durante el desarrollo son similares a los de SoABI5 y SoRGL2 y sugieren una relación con la inducción y el mantenimiento de la dormición de la semilla, como ocurre en A. thaliana (Bentsink et al., 2006; Chiang et al., 2011; Nakabayashi et al., 2012; Finkelstein et al., 2013; Carrillo-Barral et al., 2014; Nonogaki, 2014). Muy recientemente, se ha demostrado que la proteína DOG1 debe unirse consigo misma para que sea funcional “in vivo”. Asimismo, se ha observado en distintas accesiones de Arabidopsis diferentes capacidades de DOG1 para formar homodímeros, lo que parece contribuir a las variaciones en la intensidad de dormición de las semillas (Nakabayashi et al., 2015). Influencia del NO3-en la ruptura de la cubierta seminal de las semillas de Sisymbrium officinale L. durante la germinación sensu stricto La germinación de S. officinale es dependiente del contenido de NO3de sus semillas, de sus niveles en el medio de imbibición y del suministrado por la planta madre durante el desarrollo (Hilhorst, 1990; Iglesias-Fernández y Matilla, 2009, 2010). En la germinación de S. officinale, al igual que en otras Brasicáceas, la rotura de la testa y endospermo son dos procesos separados temporalmente (Müller et al., 2006; Iglesias-Fernández y Matilla, 2010). Generalmente, se asume que la ruptura de la cubierta seminal es consecuencia de la fuerza producida por el eje embrionario en expansión promovida por GAs (Holdsworth et al., 2008a; Piskurewicz et al., 2009). En esta Memoria, se demuestra que la presencia de NO3- (KNO3) en el medio de imbibición, tanto en semillas durmientes (AR0) como sometidas a AR (AR7: DISCUSIÓN GENERAL 123 siete meses de AR), estimula la ruptura de la testa y en menor medida la del endospermo (Carrillo-Barral et al., 2013, 2014). Estos hallazgos confirman que el efecto del NO3no es dependiente, al menos totalmente, del AR (Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). En semillas imbibidas de S. officinale, el NO3es capaz de sobrellevar la inhibición de la ruptura de la cubierta seminal en ausencia de GAs (ej.: paclobutrazol), tanto en semillas con AR0 como AR7. Estos resultados indican que el NO3estimula la ruptura de la cubierta seminal a través de una vía independiente de GAs. Sin embargo, esta hipótesis requiere un estudio más pormenorizado. En Arabidopsis, ls presencia de NO3en el medio de imbibición disminuye el contenido de ABA y reduce el grado de dormición de las semillas (Ali-Rachedi et al., 2004; Matakiadis et al., 2009). Se ha descrito que el endospermo en Dicotiledóneas y la coleorriza en Monocotiledóneas son tejidos que responden a ABA durante la germinación (Piskurewicz et al., 2008, 2009; Barrero et al., 2009; Lee et al., 2010; Kang et al., 2015). En S. officinale, el ABA es incapaz de inhibir la ruptura de la cubierta seminal, en presencia o ausencia de NO3-, en semillas AR0 y no durmientes (AR7 y AR20). Sin embargo, el ABA inhibe la ruptura del endospermo (RE), al igual que ocurre en Lepidium sativum o A. thaliana siendo este efecto revertido por GAs (Yamaguchi y Kamiya, 2001; Koornneef et al., 2002; Kucera et al., 2005; Müller et al., 2006; Carrillo-Barral et al., 2013, 2014). La RE micropilar no se ve afectada por la presencia de ABA en el medio de germinación en semillas AR7 (AR óptimo), pero sí en semillas AR0 y AR20 (Carrillo-Barral et al., 2014). Por el contrario, el efecto del ABA sobre la RE es independiente de la presencia de nitrato. Estos datos sugieren que el AR (óptimo) altera negativamente la sensibilidad al ABA del endospermo micropilar de las semillas imbibidas de S. officinale. Por otro lado, se ha sugerido que las enzimas modificadoras de la pared celular facilitan la ruptura de la cubierta seminal al ser liberadas desde el endospermo y/o la radícula (Hilhorst et al., 2010). En A. thaliana, al igual que en otras especies, las endo-β-mananansas (MANs) se han relacionado con la germinación (Queiroz et al., 2012; Rodríguez-Gacio et al., 2012). AtMAN5, AtMAN6 y AtMAN7, genes que codifican MANs en Arabidopsis, promueven la emergencia radicular mediante el debilitamiento de las paredes celulares del endospermo micropilar (Iglesias-Fernández et al., 2011b, c). Durante la germinación, Lee et al., (2012) describen que las MANs hidrolizarían el heteromanano presente en el mucílago de la semilla DISCUSIÓN GENERAL 124 de A. thaliana puediendo generar oligosacáridos señalizadores, los cuales tendrían un efecto promotor de la germinación. En Brachypodium distachyon, los mananos presentes en la coleorriza de la semilla son degradados en el transcurso de la germinación, indicando una relación con su debilitamiento y facilitando así la emergencia radicular (González-Calle et al., 2015). En S. officinale, la actividad MAN es abundante en semilla seca AR7, y escasa en AR0, aumentando progresivamente en el transcurso de la imbibición en ambas poblaciones (Iglesias-Fernández y Matilla, 2009). La expresión de SoMAN7 y SoMAN6 aumenta concomitantemente con la germinación; y el NO3únicamente estimula la acumulación de transcritos de SoMAN6. Estos datos sugieren que el NO3participa en el debilitamiento de la cubierta seminal durante la germinación de S.officinale y que la actividad MAN es una diana de la señalización del NO3-. Influencia del NO3-, ABA y GAs en la transición dormición-germinación de semillas de S. officinale L. sometidas a AR El mantenimiento de la dormición durante la imbibición de semillas de A. thaliana requiere de la síntesis de novo de ABA. Aunque por el momento este proceso ha sido poco estudiado (Nambara et al., 2010; Dekkers et al., 2015). Uno de los propósitos de este trabajo ha sido determinar la influencia del NO3-, durante la imbibición de las semillas de S. officinale AR0 y AR7, en la expresión de genes que codifican enzimas relevantes en las síntesis o degradación de ABA (SoNCED5, SoNCED6, SoNCED9 y SoCYP707A2). En semillas AR0 la expresión de SoNCED6 y especialmente la de SoNCED9 se incrementan en las primeras horas de imbibición en agua ó NO3-. Además, la transcripción de estos genes es menor en presencia de NO3que en agua durante la imbibición tardía. Durante la imbibición de semillas AR7, la transcripción de SoNCED5, SoNCED6 y SoNCED9 disminuye respecto a semilla seca, aunque mantiene ciertos niveles de transcripción. NCED5, 6 y 9 han sido relacionados con la inducción de la dormición secundaria (termoinhibición) durante los períodos de imbibición temprana (Lefebvre et al., 2006; Toh et al., 2012; Referencias en Tabla Suplementaria S2 en Carrillo-Barral et al., 2014). En Arabidopsis, el gen CYP707A2 es el principal responsable de la eliminación de ABA durante la imbibición temprana de la semilla, y participa en la respuesta a NO3- (Kushiro DISCUSIÓN GENERAL 125 et al., 2004; Okamoto et al., 2006; Matakiadis et al., 2009). Se ha propuesto que el NO3disminuye el estatus de la dormición de las semillas de A. thaliana ecotipo Cvi (Cape verde islands) mediante la disminución del contenido de ABA (Ali-Rachedi et al., 2004). Además, Matakiadis et al. (2009) indicaron que CYP707A2 es el principal responsable de la disminución del contenido de ABA en respuesta al NO3endógeno. En semillas AR7 de S. officinale, la acumulación de los transcritos de SoCYP707A2 es escasa durante la imbibición en agua, pero aumenta en presencia de NO3-. Sin embargo, en semillas AR0 la expresión de este gen es elevada en todos los estadíos analizados, y también es inducida por NO3-. En Hordeum vulgare, el AR no altera la expresión de genes implicados en el anabolismo de ABA, pero sí lo hace de HvGA3ox2, HvGA2ox3 y HvCYP707A1 durante la imbibición de las semillas (Millar et al., 2006; Gubler et al., 2008). Estos resultados indican que el NO3promueve la degradación del ABA durante la imbibición de las semillas de S. officinale AR0 y AR7, y que el AR disminuye su biosíntesis, mediante alteraciones en la expresión de SoCYP707A2, SoNCED6 y SoNCED9, respectivamente. En A. thaliana, la ruptura del endospermo está mediada por la señalización del ABA y no por su metabolismo (Bethke et al., 2006a, 2006b, 2007a). Los FTs ABI3 y ABI5 son importantes reguladores de la respuesta a ABA durante la germinación de las semillas de A. thaliana (López-Molina et al., 2001, 2002; Piskurewicz et al., 2008; Lee et al., 2010). El ABA estimula la acumulación de ABI5 y su fosforilación, lo que provoca la activación de la proteína (Raghavendra et al., 2010). En semillas AR0 de S. officinale, el NO3disminuye la expresión de SoABI5 durante las últimas horas de imbibición, al igual que ocurre con los genes implicados en el metabolismo de ABA (SoNCED6 y 9). Estos resultados están en concordancia también con los obtenidos para SoCYP707A2, y sugieren, además de un efecto del NO3y del AR en el metabolismo del ABA, también un efecto sobre su señalización. De forma similar, durante la germinación de Arabidopsis, uno de los derivados de nitrato (NO·) promueve la degradación de ABI5 a través de la S-nitrosilación de la cisteína153, facilitando así la germinación de las semillas (Albertos et al., 2015). A diferencia del ABA, el contenido de GAs en la semilla es bajo durante la imbibición temprana y aumenta a medida que la germinación progresa. La relación GAs/ABA determina la capacidad germinativa de la semilla (Yamaguchi y Nambara, 2006). En las semillas de S. officinale, la adición de GAs al medio de imbibición tiene un efecto positivo sobre la rotura de DISCUSIÓN GENERAL 126 la testa. En estas semillas, la transcripción de SoGA3ox2, SoGA20ox2 incrementa durante el proceso de imbibición con respecto a la semilla seca; mientras que la expresión de SoGA2ox6 tiende a disminuir. Durante la imbibición de las semillas AR0, el NO3reduce la expresión SoGA3ox2, SoGA20ox2 y SoGA2ox6 sugiriendo que el efecto positivo del NO3en la germinación no está causado por un incremento en el contenido de GAs. El efecto contario es observado en semillas AR7, en donde el NO3incrementa principalmente la expresión de SoGA3ox2. En semillas de Dicotiledóneas, el aumento del contenido de GAs, así como su señalización, participa en la pérdida de la dormición a través del AR. Sin embargo, en Monocotiledóneas como Triticum aestivum, el AR está asociado a una disminución en la señalización del ABA (Corbineau et al., 2000; Kucera et al., 2005; Holdsworth et al., 2008a; Barrero et al., 2012; Linkies y Leubner-Metzger, 2012; Liu et al., 2013). En Arabidopsis, la proteína DELLA RGL2 se ha descrito como el principal regulador de la germinación en respuesta a GAs. RGL2 regula positivamente el contenido de ABA en la semilla y la función de ABI5. Además, el ABA induce tanto la expresión de RGL2 como la de ABI5 (Lee et al., 2002; 2010). Durante la germinación de A. thaliana, las GAs provocan la degradación de RGL2, eliminando así la represión que ejerce sobre la germinación (Piskurewicz et al., 2008, 2009; Lee et al., 2010). En semillas de S. officinale (durmientes y no durmientes), el NO3altera negativamente la expresión de SoRGL2 durante la imbibición, indicando que modifica positivamente la señalización de GAs durante la germinación de las semillas de S. officinale. La función de DOG1 durante la germinación de las semillas es un elemento poco estudiado. En L. sativum, se ha propuesto que LesaDOG1 no sólo participa en la inducción de la dormición, sino también en la germinación sensu stricto (Graeber et al., 2010). En esta Memoria se evalúa el efecto del AR, el NO3-, el ABA y las GAs en la expresión de SoDOG1 durante la germinación sensu stricto de S. officinale y se demuestra que sus transcritos se acumulan en semilla seca y disminuyen durante la imbibición en semillas AR0, AR7 y AR27. En Arabidospsis, los transcritos de AtDOG1 están presentes tanto en semillas no durmientes como durmientes y su expresión disminuye rápidamente durante la imbibición temprana (Nakabayashi et al., 2012). La presencia de NO3en el medio de imbibición reduce la expresión de SoDOG1 en semillas AR0 y AR27. Curiosamente, la adición exógena de ABA y NO3estimula la transcripción de SoDOG1 durante las 6 primeras horas de imbibición en semillas AR0. En L. sativum, se ha propuesto que el ABA reprime la germinación aumentando la expresión de LesaDOG1 via ABI3 y ABI5 (Graeber et al., 2010). DISCUSIÓN GENERAL 127 Considerando que en las semillas de S. officinale AR7 el catabolismo de ABA está estimulado y su señalización reducida (Carrillo-Barral et al., 2014), estos datos sugieren que la señalización del ABA es una de las vías a través de la cual se induce SoDOG1. Recientemente, se ha descrito que DOG1 controla la dormición en Brasicáceas mediante la represión de enzimas modificadoras de la pared celular inducidas por GAs (Graeber et al., 2014). Sin embargo, en S. officinale, la adición de GAs al medio de imbibición no altera el patrón de expresión de SoDOG1 en ninguno de los regímenes de AR estudiados (AR0 y AR7). Figura 1: Modelo de la influencia del NO3-, el ABA y las GAs en la germinación de las semillas de S. officinale AR0 y AR7. El modelo está basado en los resultados expuestos en esta Tesis Doctoral y los artículos que contiene (Carrillo-Barral et al., 2013, 2014, 2015). DISCUSIÓN GENERAL 128 En resumen (Fig. 1), el NO3principalmente aumenta la expresión de SoGA3ox2 y SoCYP707A2 durante la imbibición de las semillas AR7 de S. officinale, mientras que altera negativamente la expresión de SoRGL2. Durante la imbibición de semillas AR0, el NO3disminuye la expresión de SoNCED6, SoNCED9, SoRGL2 y SoABI5 y aumenta la de SoCYP707A2. Además, el ABA estimula la expresión de SoDOG1 durante la imbibición en NO3de semillas AR0. Todo ello indica que las semillas AR7 son más sensibles a la influencia del NO3que las semillas AR0 y que esta diferencia radica principalmente en la capacidad de síntesis de GAs bioactivas y no tanto en el metabolismo del ABA o en la señalización de ambas hormonas. De esta forma, se justifica que la germinación de semillas AR0 sea más lenta que las de AR7 aún en presencia de NO3-, ya que la capacidad de síntesis de GAs en semillas AR0 es inferior a la de AR7, aunque el catabolismo de ABA está activo en ambas poblaciones. 7. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA GENERAL 137 regulatory genes controlling dormancy and ABA sensitivity in Arabidopsis seeds. The Plant Journal 61: 611-622. Barrero, J.M., Jacobsen, J.V., Talbot, M.J., White, R.G., Swain, S.M., Garvin, D.F. y Gubler, F. (2012) Grain dormancy and light quality effects on germination in the model grass Brachypodium distachyon. New Phytologist 193: 376-386. Barrero, J.M., Cavanagh, C. y Gubler, F. (2013) High-throughput genetic dissection of seed dormancy. En Becraft, P.W. (Ed.) Seed Genomics. Oxford: Wiley Inc. Basbouss-Serhal, I., Leymarie, J. y Bailly, C. (2015) Fluctuation of Arabidopsis seed dormancy with relative humidity and temperature during dry storage. Journal of Experimental Botany 10.1093/jxb/erv439. Baskin, J.M. y Baskin, C.C. (2004) A classification system for seed dormancy. Seed Science Research 14: 1-16. Bassel, G.W., Fung, P., Chow, T.F.F., Foong, J.A., Provart, N.J. y Cutler, S.R. 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