Consumo de algas marinas: su influencia en el valor nutritivo de la dieta y en diversos parámetros fisiológicos

TESIS DOCTORAL Rosendo Millán Lence Santiago de Compostela, 2015 Departamento de Fisioloxía FACULTADE DE BIOLOXÍA Consumo de algas marinas: su influencia en el valor nutritivo de la dieta y en diversos parámetros fisiológicos Consumo de algas marinas: su influencia en el valor nutritivo de la dieta y en diversos parámetros fisiológicos Rosendo Millán Lence Departamento de Fisioloxía FACULTADE DE BIOLOXÍA UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA TESIS DOCTORAL Memoria presentada por: ROSENDO MILLÁN LENCE para optar al Grado de Doctor en Biología. Santiago de Compostela 6 de Noviembre de 2015 Consumo de algas marinas: su influencia en el valor nutritivo de la dieta y en diversos parámetros fisiológicos DOÑA CRISTINA TABOADA MONTERO y DOÑA ISABEL MÍGUEZ BESADA PROFESORAS TITULARES DE FISIOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA. INFORMAN: Que la memoria experimental titulada "Consumo de algas marinas: su influencia en el valor nutritivo de la dieta y en diversos parámetros fisiológicos" ha sido elaborada bajo su dirección por Don Rosendo Millán Lence para optar al grado de Doctor y considerando que se halla concluida, autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste, y surta los efectos oportunos, firman el presente informe en Santiago de Compostela a 6 de Noviembre de 2015 Fdo. Dra. Cristina Taboada Montero Fdo. Dra. Isabel Míguez Besada La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en el Departamento de Fisiología (Facultad de Farmacia) de la Universidad de Santiago de Compostela y fue parcialmente financiada en base a los proyectos de la Xunta de Galicia PGIDIT06TAL060E y PGIDIT08TAL004E. Resumen Consumo de algas mariñas: a súa influencia no valor nutritivo da dieta e en diversos parámetros fisiolóxicos RESUMO En xeral, as algas mariñas son unha boa fonte de fibra ó mesmo tempo que proporcionan vitaminas, minerais e nutracéuticos de interese para a alimentación humana. Por iso, neste estudo se analiza cómo inflúe a inxesta das algas mariñas Porphyra purpurea, Undaria pinnatifida, Himanthalia elongata, Ulva rigida e Codium tomentosum na calidade nutritiva do alimento e en diversos parámetros hemáticos. Debido a que as enzimas implicadas nos procesos dixestivos se adaptan á dieta, analízase o efecto do consumo dunha alga verde, unha parda e outra vermella na actividade das enzimas disacaridasas: maltasa, sacarasa e lactasa; así como na actividade enzimática de leucino aminopeptidasa e gamma-glutamil transpeptidasa na mucosa intestinal, fígado e ril, órganos fundamentais no metabolismo. Tendo en conta que a composición das algas incluídas na dieta pode modular a produción de radicais libres, valórase, nos órganos antes mencionados, a súa influencia sobre a peroxidación lipídica e sobre a actividade de enzimas antioxidantes tales como superóxido dismutasa, catalasa e glutatión peroxidasa, como mecanismo endóxeno que protexe do dano oxidativo. PALABRAS CHAVE Algas comestibles, composición, parámetros nutricionais, parámetros séricos, antioxidantes. Resumen Seaweed consumption: its influence in the nutritional value of the diet and in various physiological parameters SUMMARY In general, seaweeds are a good source of fiber in addition to providing vitamins, minerals and nutraceuticals interesting for human consumption. Therefore, this paper analyzes how influences the intake of Porphyra purpurea, Undaria pinnatifida, Himanthalia elongata, Ulva rigida and Codium tomentosum seaweeds in the nutritional quality of the food and various blood parameters. Since the enzymes are involved in digestive processes adapt to the diet, the effect of consuming of a green, a brown and a red seaweed in the disaccharidase enzyme activity maltase, sucrase and lactase and as well as in the enzymatic activity of leucine aminopeptidase and gamma-glutamyl transpeptidase in intestinal mucosa, liver and kidney, fundamental organs in the metabolism, are analyzed. Given that the composition of seaweed included in the diet can modulate the production of free radicals, their influence is studied, in the aforementioned organs, on lipid peroxidation and on the antioxidant enzymes activity, such as superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase, as endogenous mechanism that protects against oxidative damage. KEYWORDS Seaweeds, composition, nutritional value, serum parameters, antioxidants. ÍNDICE 1 INTRODUCCIÓN ................................................................................. 3 NECESIDADES NUTRICIONALES ................................................................. 3 1.1 ALIMENTOS FUNCIONALESNUTRACÉUTICOS-COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS-1.2 NUEVOS ALIMENTOS .............................................................................. 7 LAS ALGAS ........................................................................................... 9 1.3 Tipos de algas ....................................................................... 10 1.3.1 Composición de las algas...................................................... 19 1.3.2 La explotación de las algas ................................................... 23 1.3.3 Las algas en la alimentación ................................................ 25 1.3.4 Producción de algas alimentarias......................................... 26 1.3.5 QUÍMICA DE LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO (EROS) ........................ 27 1.4 EFECTOS DE LAS EROS SOBRE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS .............................. 32 1.5 Peroxidación lipídica ............................................................. 32 1.5.1 Oxidación de azúcares .......................................................... 33 1.5.2 Oxidación de proteínas ......................................................... 36 1.5.3 Oxidación de ácidos nucleicos .............................................. 37 1.5.4 DEFENSA ANTIOXIDANTE ...................................................................... 39 1.6 ANTIOXIDANTES Y SALUD ...................................................................... 48 1.7 2 OBJETIVOS ...................................................................................... 55 3 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................... 59 ALGAS OBJETO DE ESTUDIO ................................................................... 59 3.1 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN LAS ALGAS ........................................... 60 3.2 Humedad .............................................................................. 60 3.2.1 Vitaminas y minerales .......................................................... 60 3.2.2 Glúcidos, fibra cruda, fibra alimentaria y cenizas ................ 61 3.2.3 Grasa .................................................................................... 62 3.2.4 Esteroles ............................................................................... 63 3.2.5 Proteína ................................................................................ 64 3.2.6 Aminoácidos ......................................................................... 65 3.2.7 ANIMALES Y DIETAS DE EXPERIMENTACIÓN .............................................. 69 3.3 PARÁMETROS NUTRITIVOS .................................................................... 72 3.4 Determinación del valor nutritivo de las proteínas .............. 74 3.4.1 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS HEMÁTICOS ......................................... 79 3.5 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE TEJIDOS ............................................... 80 3.6 DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA EN TEJIDOS ........................................... 81 3.7 DETERMINACIONES ENZIMÁTICAS ........................................................... 81 3.8 Disacaridasas ........................................................................ 81 3.8.1 Leucino aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) ................................. 86 3.8.2 Índice Gamma glutamil transpeptidasa (EC 2.3.2.2) ...................... 87 3.8.3 DETERMINACIÓN DE LAS SUSTANCIAS REACTIVAS AL ÁCIDO TIOBARBITÚRICO ... 91 3.9 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES ................... 94 3.10 Superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) ..................................... 95 3.10.1 Glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.9) ....................................... 97 3.10.2 Catalasa (EC 1.11.1.6) .......................................................... 99 3.10.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS ............................................ 101 3.11 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 105 COMPOSICIÓN DE LAS HARINAS ............................................................ 105 4.1 VALORACIÓN DE LA CALIDAD DE LA PROTEÍNA ......................................... 117 4.2 Métodos químicos .............................................................. 117 4.2.1 Métodos biológicos ............................................................ 126 4.2.2 PESO RELATIVO DE LOS ÓRGANOS ......................................................... 132 4.3 VALORES HEMÁTICOS......................................................................... 133 4.4 Parámetros séricos que valoran la función cardiovascular 133 4.4.1 Parámetros séricos que valoran la función renal. .............. 136 4.4.2 Parámetros séricos que valoran la función hepática.......... 138 4.4.3 Niveles séricos de glucosa .................................................. 139 4.4.4 Minerales séricos ................................................................ 139 4.4.5 Aminoácidos en sueros sanguíneos .................................... 140 4.4.6 DETERMINACIONES NUTRICIONALES ENZIMÁTICAS ................................... 143 4.5 Disacaridasas ...................................................................... 144 4.5.1 Leucino aminopeptidasa (LAP) ........................................... 146 4.5.2 Gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) ............................. 149 4.5.3 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .................................. 151 4.6 Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) ......... 152 4.6.1 Superóxido dismutasa (SOD) .............................................. 153 4.6.2 Glutatión peroxidasa (GPx) ................................................ 155 4.6.3 Catalasa (CAT) .................................................................... 158 4.6.4 5 CONCLUSIONES ............................................................................. 163 6 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 169 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS AAE: Aminoácidos esenciales AANE: Aminoácidos no esenciales ADN: Ácido desoxirribonucleico ALA: Alanina ALB: Albúmina AOAC: Association of Official Agricultural Chemists AQC: 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinidil-carbamato ARG: Arginina ARN: Ácido ribonucleico ASP: Ácido aspártico BN: Balance nitrogenado BUN: Nitrógeno ureico en sangre CAPS: Acido N-clohexil-3-aminopropanesulfónico CAT: Catalasa CDA: Coeficiente de digestibilidad aparente CDR: Coeficiente de digestibilidad real CIS: Cisteína COL: Colesterol DMBA: 7,12-dimethylbenz[a]anthracene EAA: Espectrofotometría de absorción atómica ECP-OES: Espectrofotometría de emisión atómica-plasma de acoplamiento inductivo EO: Estrés oxidativo EROs: Especies reactivas del oxígeno FEN: Fenilalanina GGT: Gammaglutamil transpeptidasa GLI: Glicina GLU: Ácido glutámico Glu: Glucosa GOT: Glutamato oxalacetato transaminasa GPT: Glutamato Piruvato transaminasa GPx: Glutatión peroxidasa GR: Glutatión reductasa GSH: Glutatión reducido GSSG: Glutatión oxidado HDL: Lipoproteínas de alta densidad HIS: Histidina HPLC: Cromatografía líquida de alta eficacia HTB: Hidroxitolueno butilado Abreviaturas y acrónimos IAA: Índice de aminoácidos ILE: Isoleucina IM: Índice de Mitchel INT: 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-fenil tetrazolio IP: Índice de proteínas IQ: Índice químico IT: Índice de transformación del alimento LAP: Leucinoaminopeptidasa LDL: Lipoproteínas de baja densidad LEU: Leucina LIS: Lisina MDA: Malondialdehído MET: Metionina NADP+: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido NHS: N-Hidroxisuccinimida NO: Óxido nítrico NORLEU: Norleucina PER: Coeficiente de eficacia proteica PGAs: Protuctos de glicación avanzada PKC: Proteína quinasa dependiente del calcio PRO: Prolina PROT: Proteína R•: Radical de ácido graso RH: Ácido poliinsaturado ROO•: Radical lipoperóxido ROOH: Hidroperóxido ROOOOR: Tretóxido SER: Serina SOD: Superóxido dismutasa TBA: Ácido tiobarbitúrico TBARS: Sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico TCA: Ácido tricloroacético TIR: Tirosina TRE: Treonina UPN: Utilización de la proteína neta VAL: Valina VB: Valor biológico VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad INTRODUCCIOÓ N 3 1 Introducción Necesidades nutricionales 1.1 La alimentación ocupa actualmente un lugar destacado en la atención mundial. Su implicación directa en la salud radica, no sólo en los aspectos cualitativos y cuantitativos de la ingesta, sino también en su influencia en la prevención de ciertas enfermedades (Lozano y cols. 2005). Los alimentos deben aportar una serie de nutrientes que no son sintetizados en cantidades suficientes por el organismo. Para una buena salud, el ser humano necesita nutrientes que le proporcionen cantidades adecuadas de proteínas que incluyan todos los aminoácidos esenciales, glúcidos, ácidos grasos esenciales, vitaminas, minerales y agua (Dwyer 2012). Los productos alimenticios pueden ejercer diversos efectos sobre la salud, que dependen de su procedencia, si son de origen animal o vegetal, de su composición, procesado, cantidad ingerida, ecosistema del que provienen, etc. Así, por ejemplo, mientras que la fibra de los alimentos resulta beneficiosa para la función gastrointestinal, un exceso puede interferir en la absorción de otros compuestos (Dwyer 2012). Las proteínas, cuya función es fundamentalmente plástica, proporcionan el material nitrogenado que, en forma de aminoácidos, se necesita para la síntesis de las proteínas características de cada célula del cuerpo humano y demás sustancias nitrogenadas (Krause 1995). Introducción 10 fotosintéticos están dispersos en el contenido celular y, organismos eucariotas, con el núcleo separado del resto de la célula mediante una membrana y en la que los pigmentos fotosintéticos están contenidos en los plastos. Las algas planctónicas (en su mayoría unicelulares móviles o que flotan libremente) constituyen una parte esencial de la cadena alimentaria de todos los seres acuáticos, mientras que las algas bentónicas, en su mayoría macroscópicas, suelen fijarse a una superficie firme mediante un aparato vegetativo compuesto por un disco o rizoma del que sale un “talo” (Talófitas, carecen de verdaderas raíces, tallos y hojas). Las algas marinas crecen en abundancia en las zonas intermareal y submareal, a una profundidad de hasta unos 200 m, según la penetración de la luz solar (Bárbara y Cremades 1987). Tipos de algas 1.3.1 La clasificación en grupos se realiza atendiendo a caracteres taxonómicos como: morfología y reproducción, pigmentos fotosintéticos, productos de reserva, composición de la pared celular, flagelos de las células móviles, estructura del núcleo, cloroplasto, pirenoide (zona del cloroplasto que participa en la formación de almidón) y mancha ocular (orgánulo constituido por una gran concentración de lípidos). Así se pueden distinguir fundamentalmente cuatro grandes grupos: Cianófitos (Cyanophyta; algas azules) 1.3.1.1 Es el grupo que presenta menor número de especies. Son microscópicos procariotas con pigmentos verde-azulados, carecen de almidón y no poseen células flageladas. Entre las que tienen uso biotecnológico destaca la Spirulina con un alto contenido proteico. Introducción 11 Rodófitos (Rhodophita; algas rojas) 1.3.1.2 Algas uni o pluricelulares, en su mayoría macroscópicas que viven fijadas a las rocas u otros sustratos y que por su especial composición en pigmentos son capaces de ocupar ambientes poco iluminados. Su color rojizo se debe a la existencia de biliproteínas (ficoeritrina y ficocianina principalmente) que enmascaran el color verde de la clorofila. Los ficocoloides (agar y carragenatos) son los principales productos de interés industrial en estas algas. Las especies más explotadas de este grupo son: Gelidium sesquipedale y Gracilaria spp (obtención de agar-agar); Kappaphycus alvarezii (Cottonii), Eucheuma denticulatum (Spinosum), Gigartina spp y Chondrus spp, que se utilizan para la obtención industrial de carragenatos; Porphira spp (Nori), Palmaria palmata (Dulse) y Chondrus crispus (Musgo de Irlanda) que se emplean en la elaboración de productos destinados a la alimentación. Porphyra purpurea (Roth) Agardth, que pertenece a la familia de algas rojas Bangiaceae, conocida en Galicia como “Touca” y en todo el mundo como Nori , es un alga que forma láminas de hasta 30 cm de diámetro, de color violáceo y su fijación al sustrato es mediante un disco basal (Cabioc'h y cols. 2007; Castiñeira 2011). Es el producto alimentario más importante en la cultura oriental, con el que se realiza el plato típico “sushi maki” (Figura 1.1). El cultivo industrial tradicional de Nori se realiza principalmente en Japón, Corea y China. En el año 2008 se extrajeron 1,4 millones de toneladas, lo que la sitúa como tercera alga alimentaria mundial, pero debido a su alto valor económico (6 veces más que Kombu y el doble que Wakame), hizo que Japón fuese el segundo mayor productor de algas del mundo en cuanto a dicho valor (FAO 2004; FAO. Departamento de Pesca y Acuicultura 2010). En los años 2009 y 2011 se recolectaron en Galicia 0,7 y 2,5 toneladas respectivamente, para volver a descender a 0,6 toneladas en el año 2013 (Tabla 1.1) Introducción 12 Figura 1.1.- Alga Nori Tabla 1.1.- Algas recogidas en Galicia (Toneladas) Año 2009* 2011** 2013*** Wakame 14,0 47,4 93,7 Nori 0,7 2,5 0,6 Lechuga de mar 6,9 12,8 5,7 Espagueti de mar 86,3 25,1 31,8 Ramallo de mar - 0,7 2,2 * García Tasende (2011). ** García Tasende (2012). Foro dos Recursos Algales de Galicia. Tecnopeixe-Plataforma Tecnolóxica CETMAR, Vigo. *** García Tasende y Peteiro (2015) Introducción 13 El alga Nori suele venderse en hojas dobladas y prensadas de 20 cm, presentando un aspecto de hojas de papel oscuro o morado, cortadas en rectángulos. Se consume en platos orientales muy populares como el sushi, tostadas sobre el fuego y desmenuzadas sobre ensaladas, platos de arroz, pastas o sopas. En las costas de País de Gales preparan un plato tradicional a base de esta alga, el “laverbread”. Es apreciada por sus propiedades nutritivas, especialmente en proteínas, minerales y vitaminas (Ferreiro y cols. 1993; Cremades y cols. 1998), lo que hace que sea un excelente complemento en la alimentación (MacArtain y cols. 2007). Cromófitos (Pyrrophyta, Chrysophyta y 1.3.1.3 Phaeophyta; algas pardo-doradas) Son algas pluricelulares en su mayoría macroscópicas, aunque incluyen menos especies que las rojas son más aparentes debido al mayor tamaño de muchas de ellas. La coloración parda se debe a que contienen ciertos pigmentos carotenoides llamados fucoxantinas. La presencia de alginato en este tipo de algas (en mayor medida en las que crecen en aguas frías) propicia su explotación comercial. Las principales especies que se utilizan para este fin son: Ascophyllum spp y Laminaria spp (en Europa y Asia), Lessonia spp (América del Sur), Ecklonia spp (Sudáfrica), Durvillaea spp (Australia y Chile) y Macrocystis spp (California y Baja California) mientras que las más utilizadas en la alimentación son: Laminaria spp (Kombu), Undaria pinnatifida (Wakame), Hizikia fusiforme (Hiziki), Eisenia bicdyclis (Arame), Saccharina latissima (Kombu de azúcar) e Himanthalia elongata (Espagueti de mar). Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar, pertenece a la Familia Alariaceae que habitualmente se conoce por su nombre asiático, Wakame, aunque en Galicia también se puede escuchar “Golfo” o “Carballa” para referirse a esta alga (Figura 1.2). Tiene un talo que puede alcanzar 1,5 m de largo y se fija al sustrato mediante un rizoide del que parte un estipe aplanado y lobulado que se ensancha dando lugar a una gran lámina de aspecto pinnado. Es una especie anual que Introducción 14 se encuentra en sustratos rocosos a nivel infralitoral de costas expuestas y semiexpuestas. (Cabioc'h y cols. 2007; Castiñeira 2011). Figura 1.2.- Alga Wakame Con un origen oriental conquistó mares como el Mediterráneo o Atlántico de manera accidental. En Galicia está presente desde el año 1988 (Santiago Caamaño y cols. 1990) introducida, de forma muy probable, con la importación de ostras desde Francia. Se puede encontrar adherida a las bateas hasta una profundidad de 10 m y debido a sus características de fácil cultivo fue una de las primeras macroalgas utilizadas para experiencias de cultivo en nuestras costas (Ferreiro y cols. 1993; Pérez-Cirera y cols. 1996). A nivel mundial Wakame es la segunda alga alimentaria de mayor producción. En el año 2012 se recolectaron más de 2 millones de toneladas procedentes sobre todo de la República de Corea, Japón y China (FAO 2014). Según datos presentados en el “Foro dos Recursos Introducción 15 Algales de Galicia (Tecnopeixe-Plataforma Tecnolóxica CETMAR)” en Galicia en los años 2009 y 2011 se extrajeron 14 y 47,4 toneladas de dicha alga respectivamente, hasta llegar a 93,7 toneladas en el 2013 (Tabla 1.1). Como alga alóctona se permite e incluso se recomienda la extracción de Wakame en el Parque Nacional Marítimo Terrestre das Illas Atlánticas de Galicia. Una vez recogida se seca directamente o con un previo escaldado adquiriendo un color verde oscuro o verde brillante. En fresco es de suave y peculiar aroma, su sabor puede recordar al de la ostra. Se utiliza de diferentes formas, tanto cruda en ensaladas como cocinada en sopas o acompañando a carnes o pescados, lo que hace que sea ideal para iniciarse en el consumo de algas. Por su riqueza en ácido glutámico potencia mucho el sabor de los alimentos a los que acompaña. Se puede usar como otras algas para ablandar y acelerar la cocción de las legumbres secas. En polvo se emplea como condimento en arroces o guarniciones. Puede ser útil como apoyo nutricional sobre todo en dietas en la que se quiere aumentar el consumo de minerales y vitaminas (Burtin 2003; Kolb y cols. 2004). Espagueti de mar, Himanthalia elongata (Linneo) S.F.Gray, conocida en Galicia como “Cinta” o “Correa” (Figura 1.3) es un alga parda perteneciente a la familia Himanthaliaceae, de color oliváceo y consistencia coriácea, conocida como “Espagueti de mar” o “Judía de mar” por su característica forma de cinta con ramificación dicotómica que parte de un disco basal con el que se sujeta a las rocas del mesolitoral inferior e infralitoral de costas expuestas o semiexpuestas (González y cols. 1998; Castiñeira 2011). En el año 2009 se recolectaron en Galicia 86,3 toneladas lo que la situó en el primer lugar de las algas alimentarias, pero en 2011 y 2013 con 25,1 y 31,8 toneladas respectivamente, descendió al tercer lugar por detrás de Laminaria spp y Undaria pinnatifida (Tabla 1.1). Suele ser localmente muy abundante, llegando a formar grandes extensiones que cubren a otras algas en marea baja y forma bosques de algas cuando la marea está alta. Con la llegada de los temporales de otoño las correas se desprenden y aparecen grandes cantidades arrojadas a las playas. Introducción 16 Figura 1.3.- Alga Espagueti de mar Aunque es una especie rica en alginatos no se extraen para su obtención de forma industrial, pero sí se utiliza para abonar cultivos como el de la alcachofa. Desde el punto de vista alimentario se comercializa de forma individual o junto a otros productos marinos como pueden ser erizo de mar o navajas (Cremades y cols. 1998). Clorófitos (Euglenophyta, Charophyta y 1.3.1.4 Chlorophyta; algas verdes). Es un grupo muy heterogéneo de algas uni o pluricelulares en su mayoría macroscópicas con menor número de especies que las pardas, que usan como pigmentos fotosintéticos preponderantes las clorofilas y presentan verdadero almidón dentro de los plastos. La utilización de algas verdes en la industria no está muy extendida, pero sí su empleo en la alimentación humana. Las especies más representativas son la Introducción 17 Lechuga de mar (Ulva spp) y el Ramallo de mar (Codium spp) (Bárbara y Cremades 1987; Cabioc'h y cols. 2007; Castiñeira 2011). Lechuga de mar, Ulva rigida C. Agardh (Figura 1.4), pertenece a las algas verdes de la familia Ulvaceae y su nombre vulgar se debe a su color y forma característica. Es un alga laminar de hasta 20 cm de longitud, que se estrecha en la base formando un pequeño disco por el que se sujeta a rocas o epífita sobre otras algas (González y cols. 1998). A nivel mundial se recogen alrededor de 100.000 toneladas de algas verdes, en su mayoría pertenecientes a los géneros Monostroma, Enteromorpha y Ulva (Rajadurai 1990; Barsanti y Gualtieri 2014). Figura 1.4.- Alga Lechuga de mar En el año 2009, 2011 y 2013 se extrajeron en Galicia 6,9; 12,8 y 5,7 toneladas respectivamente de Lechuga de mar (Tabla 1.1). Se puede ver en la zona litoral e infralitoral de todo tipo de costas, tanto protegidas como expuestas, con mayor presencia en las primeras. Se emplea tanto en alimentación humana como animal, también es muy utilizada en experimentos de biorremediación, como producción de Introducción 18 biomasa y energía y además posee cualidades como bioindicador de contaminación (O'Shanahan y Vela 2003; Hasan y Chakrabarti 2009; Nielsen y cols. 2012). Ramallo de mar, Codium tomentosum (Hudson) Stackhouse, familia Codiaceae, también conocida como Fideo de mar y en Galicia como “Carrasca brava” (Figura 1.5), es un alga verde oscura de hasta 30 cm, con talo de consistencia esponjosa, cilíndrico, tacto suave (con mucha vellosidad en su superficie) y con ramificación dicotómica. Especie perenne que se fija mediante un disco basal sobre rocas en el nivel mesolitoral medio e inferior de costas expuestas o protegidas (González y cols. 1998; Castiñeira 2011). De ella, en 2011 y 2013 se recogieron en nuestras costas 0,7 y 2,2 toneladas respectivamente (Tabla 1.1). Figura 1.5.- Alga Ramallo de mar En países como Japón se consume directamente en fresco o cocida formando parte de sopas o guarnición. Es un alga que la Introducción 19 industria ha utilizado como antihelmíntico y para obtención de productos farmacéuticos como pueden ser las lectinas (Bárbara y Cremades 1987; Cremades y cols. 1998). Composición de las algas 1.3.2 Una de las características principales de las “verduras del mar” son sus considerables cantidades de minerales: potasio, cloro, sodio, calcio, magnesio, azufre, fósforo, iodo, hierro, cobre y manganeso, y oligoelementos como flúor, litio, selenio, cobalto y zinc. Por esta razón pueden ser usadas para suplementar la dieta y así alcanzar más fácilmente la cantidad diaria recomendada de muchos de ellos (González y cols. 1998). Su alto contenido en vitaminas E, A, C y vitaminas del complejo B, imprescindibles para el metabolismo, entre las que destacan la Vit. B3 (niacina) y Vit. B6 (piridoxina) junto con la Vit. B12 (cianocobalamina), escasa en vegetales terrestres, hace que el consumo de algas, posiblemente sea importante en aquellos individuos que utilizan dietas vegetarianas (Watanabe 2007). La composición en glúcidos varía según los diferentes grupos de algas, pero en ellos se pueden encontrar ácido algínico, fucosanos, carragenatos, laminarina, manitol y celulosa. La digestibilidad de todos ellos es variable, aunque todos entrarían dentro de la categoría de fibra alimentaria (González y cols. 1998). Este alto porcentaje de fibra podría conllevar efectos beneficiosos al contrarrestar muchas “enfermedades de la opulencia” propias del mundo occidental, como pueden ser: enfermedades del tracto digestivo, obesidad, enfermedades cardiovasculares o diabetes, así como, también podrían implementar la actividad anticancerígena, antioxidante, antihipertensiva y una mejora de la microbiota y el tránsito intestinal (Jiménez-Escrig y Goñi 1999; Zarzuelo y Gálvez 2010; Kumar y cols. 2015). El hábitat y especialmente la época del año influyen en las características de las proteínas, péptidos y aminoácidos en las algas. Introducción 26 Producción de algas alimentarias 1.3.5 Hoy en día más del 90 % de la producción mundial de algas procede de la acuicultura. El mayor productor mundial de algas alimentarias es China, seguido a cierta distancia de República de Corea y Japón. Corresponde a Kombu (Laminaria japonica) la mayor producción con 5,5 millones de toneladas en peso fresco, cultivada en su mayoría en China, en cuerdas suspendidas ocupan cientos de hectáreas en el océano (McHugh 2002, FAO 2014). En Galicia, en el año 2013, se recogieron 713,2 toneladas de algas, de las que el 35,3 % se destinaron a alimentación (García Tasende y Peteiro 2015). El cultivo de algas puede realizarse de forma extensiva, cultivo en el mar, con especies con propagación vegetativa en las que se realiza una fragmentación y una resiembra de los fragmentos; un cultivo mixto mar-planta de procesado, en el que la obtención de la semilla y el sembrado se realiza en el laboratorio en condiciones controladas; y una tercera opción, en la que el cultivo se hace exclusivamente en tierra adentro, con sistemas altamente mecanizados y con mano de obra cualificada (Cremades 1997). En España existen diferentes empresas que se dedican a la extracción y comercialización de algas tanto procedentes de la recolección del medio natural como de cultivos de especies con un cierto valor comercial. En los últimos tiempos se están llevando a cabo experimentos en los que se integra el cultivo de algas con el de distintos tipos de animales como pueden ser peces, moluscos, equinodermos o crustáceos, en lo que se denomina acuicultura multitrófica integrada (AMTI) (Figura 1.6). Este procedimiento llevaría a un sistema equilibrado de producción acuícola, con un mejor aprovechamiento de los diferentes niveles tróficos, lo que redundaría en una mayor calidad de las aguas, tanto en el medio marino como en los sistemas de producción de circuito abierto o cerrado (García 2012). Introducción 27 Figura 1.6.- Algas en la acuicultura multitrófica integrada Química de las especies 1.4 reactivas del oxígeno (EROs) En un principio Lavoisier consideró la oxidación como el proceso por el cual el oxígeno es agregado a una sustancia, siendo la reducción el fenómeno opuesto. Posteriormente Wieland denominó oxidación a la pérdida de hidrógeno, o lo que es lo mismo una deshidrogenación. Hoy en día, la oxidación equivale a la pérdida de electrones y la reducción al proceso opuesto, ganancia de electrones. O dicho de otro modo, un compuesto en proceso de reducción implica un descenso del número de oxidación (valencia) y, por el contrario, un aumento de dicho número implica una oxidación (Figura 1.7). Introducción 28 La intensidad de la oxidación está íntimamente ligada a muchos factores: presión de oxígeno, superficie expuesta, temperatura, pH, presencia de enzimas oxidantes, aw (actividad de agua), presencia de sustancias prooxidantes o antioxidantes, etc. Los sustratos más sensibles a la oxidación son los ácidos grasos insaturados, debido a sus enlaces C=C con alta intensidad electrónica. El oxígeno es esencial para la vida de los organismos aerobios, y su mayor parte (98 % o más) se utiliza para la generación intracelular de energía, la cual se libera durante las oxidaciones biológicas y se almacena en las células en forma de ATP. Actúa como aceptor final de electrones liberados durante la oxidación de nutrientes, al adquirir un total de cuatro electrones por molécula con producción de dos moléculas de agua. Esta reacción está catalizada por la enzima citocromo C oxidasa, localizada al término de la cadena respiratoria mitocondrial. Figura 1.7.- Índice de oxidación y porcentaje de oxígeno (%) Introducción 29 La oxidación de nutrientes (glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos) tiene lugar, de forma controlada, en diferentes etapas, de tal manera que se aprovecha con mayor eficacia la energía liberada. Una consecuencia directa de este mecanismo es que, entre los nutrientes iniciales y la generación de energía al final del proceso, se forman varias moléculas con diferentes grados de oxidación. Algunas de ellas pueden ceder uno o dos electrones al oxígeno y producir intermediarios parcialmente reducidos, que se denominan especies reactivas del oxígeno (EROs o también conocidas por sus siglas en inglés, ROS), tales como el anión superóxido (O2-•), el radical hidroxilo (OH•) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Figura 1.8). Figura 1.8.- La estructura electrónica del oxígeno hace que sea susceptible de reducciones parciales, produciéndose Especies Reactivas de Oxígeno Introducción 30 O 2 -• + H 2 O 2 OH• + OH- + O 2 Fe3+ + O 2 -• Fe2+ + O 2 Reac. de Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH• + OHSuma O2-• + H2O2 OH• + OH- + O2 Las especies reactivas O2-• y H2O2 pueden combinarse mediante la reacción de Haber-Weiss originando el radical OH•, según la siguiente reacción: Esta reacción, aunque termodinámicamente favorable, es cinéticamente muy lenta y necesita la presencia de metales de transición, como hierro o cobre (Halliwell y Gutteridge 1990). Un mecanismo propuesto para la reacción de Haber-Weiss es el siguiente: La presencia de uno o varios electrones desapareados hace que estas especies sean paramagnéticas y, a veces, las convierte en altamente reactivas. Sería deseable que el oxígeno tomase de una vez cuatro electrones y generase directamente agua, pero dada la estructura electrónica del oxígeno, la mayoría de las reacciones de óxidoreducción dentro de la célula involucran como máximo dos electrones que la molécula no puede aceptar a la vez, convirtiéndose en H2O2 , o si acepta un único electrón, produciendo O2-•. Sólo la enzima citocromo oxidasa puede transferir los cuatro electrones de forma casi simultánea para generar agua. La fuente intracelular más importante de O2-• y H2O2 es la mitocondria, seguida de los peroxisomas (Boveris y cols. 1972). Otra Introducción 31 fuente de O2-• son los leucocitos polimorfonucleares, cuya función involucra específicamente la generación de estos oxidantes, por el sistema NADPH oxidasa, como primera línea de defensa contra posibles patógenos (Babior y cols. 1973; Markert y cols. 1984). En este caso, las especies oxidantes cumplen un papel beneficioso ya que impiden la proliferación de tales agentes. Se ha identificado una nueva especie oxidante llamada peroxinitrito (ONOO•) (Radi y cols. 1991; Beckman y cols. 1993) que se produce habitualmente como consecuencia de la reacción entre el O2-• y el óxido nítrico (NO). El NO es un metabolito normal en el metabolismo celular producido por la acción de la enzima óxido nítrico sintetasa sobre el aminoácido arginina. Fisiológicamente, el NO es un vasodilatador generado por las células endoteliales y macrófagos (Palmer y cols. 1987), pero el producto de la reacción con el O2-• es un oxidante casi tan poderoso como el OH•. La reacción del radical OH• con iones carbonato (CO3-2) da lugar al radical carbonato (CO3-•.), que es una especie bastante reactiva pero con una vida media más larga que OH•. OH• + CO3-2 OH- + CO3-• Existe una clara relación entre la vida media de las EROs y la especificidad de su reactividad. Algunas especies reactivas del oxígeno, como es el caso de H2O2, son muy estables, pueden difundir a grandes distancias y son capaces de elegir la molécula sobre la que actúan. Otras, en cambio, como el radical OH•, tienen una vida muy corta (10-9 sg) y presentan una reactividad tan alta que su rango de actuación se encuentra entre 1 y 5 diámetros moleculares de su lugar de formación, por lo que son capaces de interactuar con todo tipo de sustratos, presentando por ello una mayor toxicidad. Asimismo, los radicales libres pueden actuar sobre moléculas presentes en el citosol Introducción 32 tales como los nucleótidos y los grupos tioles (Halliwell y Gutteridge 1988; Dizdaroglu 1991). Una estructura celular especialmente susceptible al ataque de los radicales libres es la membrana, cuyos distintos componentes (enzimas, proteínas receptoras, canales iónicos y cadenas lipídicas) pueden ser dañados por los radicales libres conduciendo a la muerte celular (Halliwell y Gutteridge 2007). Efectos de las EROs sobre 1.5 moléculas biológicas Peroxidación lipídica 1.5.1 La peroxidación lipídica o lipoperoxidación es una reacción autocatalítica en la que las especies reactivas del oxígeno o los radicales libres sustraen átomos de hidrógeno a las moléculas de ácido grasos poliinsaturados. La reacción termina cuando dos moléculas de peróxidos colisionan entre sí o cuando reaccionan con algún antioxidante disponible (Figura 1.9). Los ácidos grasos insaturados son las moléculas más sensibles al daño oxidativo. Animales con baja tasa de ácidos grasos insaturados tienen un menor grado de peroxidación lipídica y su envejecimiento es más lento (Barja 2002). Algunos metales sin capacidad redox como el Sc3+, Ga3+, In3+, Be3+, Y3+ y La3+ estimulan la oxidación lipídica iniciada por el Fe2+ y en particular la mielina es especialmente susceptible a la oxidación en presencia de estos cationes (Verstraeten y cols. 1997; Verstraeten y cols. 1998). Introducción 33 Figura 1.9.- Evolución de la lipoperoxidación Entre los productos finales del proceso de peroxidación lipídica se encuentra el malondialdehído (MDA), que se utiliza como marcador de dicha reacción. Los productos de degradación pueden difundir lejos del lugar de su formación provocando lesiones como pérdida de la permeabilidad celular y ruptura de gradientes iónicos transmembrana, entre otras. Asimismo, pueden alterar la actividad de fosfolipasas e inducir la liberación de ácido araquidónico, implicados en el proceso inflamatorio (Davies y cols. 1984). Oxidación de azúcares 1.5.2 La glicación es la oxidación no enzimática de azúcares reductores que se combinan mediante su grupo aldehído con el grupo Introducción 34 amino de proteínas y en menor medida de lípidos o ácidos nucleicos (Bucala y cols. 1984; Bucala y cols. 1993). En una primera etapa de esta unión se forman aldiminas o bases de Schiff, moléculas inestables que con el tiempo se transforman en compuestos de Amadori o fructosaminas. En una segunda etapa, estos compuestos se transforman mediante la reacción de Maillard, que incluye múltiples reacciones como deshidratación, condensación cíclica, entrecruzamientos intermoleculares y oxidación por EROs. Los compuestos finales obtenidos se conocen como productos de la glicación avanzada (PGAs, o AGEs por su denominación inglesa “advanced glycation end products”) (Figura 1.10). La reacción de Maillard se utiliza en la industria alimentaria para dar color, olor y sabor a los alimentos, pero también puede alterar la función de la proteína involucrada o incluso dar lugar a productos cancerígenos (Valenzuela y Ronco 2007). En condiciones fisiológicas, la glicación se ve favorecida por una alta concentración de azúcar (diabéticos) y/o un entorno oxidativo elevado (por ejemplo, presencia de metales). Los PGAs tienen un amplio espectro de efectos patológicos, como pueden ser alteraciones en la permeabilidad vascular debido a su reacción con el óxido nítrico y la inducción a la secreción de citoquinas que aumentan el estrés oxidativo (Bucala y cols. 1991; Bucala y cols. 1993). La combinación de reacciones de glicación y oxidación, que se conoce como glicoxidación, genera productos altamente aterogénicos (Actis Dato y Rebolledo 2000) y está asociada con procesos relacionados con el envejecimiento, la diabetes, las cataratas, el Alzheimer, la aterosclerosis, las nefropatías o las alteraciones vasculares periféricas, entre otras (Sakurai y Tsuchiya 1988; Miyata y cols. 1993; Ramasamy y cols. 2007; Glenn y Stitt 2009; PertyńskaMarczewska y cols. 2009). La incubación de azúcares con lípidos con grupos amino libres da lugar a productos liposolubles con propiedades características de PGAs. Estos productos están relacionados con la oxidación de ácidos grasos. Por otro lado, la glucosa es capaz de formar PGAs con las Introducción 35 lipoproteínas, tanto con su parte proteica como lipídica (Bucala y cols. 1993). Así lo hace con lipoproteínas de baja densidad (LDL) aisladas de pacientes diabéticos, lo que podría indicar que la glicación juega un papel importante en la aterogénesis in vivo (Picard y cols. 1992; Pamplona y cols. 1993). Figura 1.10.- Reacciones oxidantes Aunque los grupos amino primarios de los ácidos nucleicos con los glúcidos reductores son menos reactivos que los proteicos, se ha observado glicación de nucleótidos, lo que provoca anormalidades en el patrón del ADN. En condiciones de hiperglucemia estos procesos pueden acelerarse y dar como resultado un “envejecimiento celular” temprano (Méndez 2003). Introducción 42 estas sustancias, ya sea directamente o restaurando sistemas con capacidad antioxidante (Tabla 1.3). Tabla 1.3. Antioxidantes no enzimáticos Compuesto Acción Ascorbato Vitamina C Secuestrante de radicales hidrofílicos Inhibición de la peroxidación lipídica Urato Secuestrante de radicales hidrofílicos Glutatión (GHS) Ligado a sistemas enzimáticos Compuestos tiol (Captopril, N-acetil cisteína) Precursores del glutatión Tocoferoles y tocotrienoles Vitamina E Secuestrante de radicales lipofílicos Polifenoles Compuestos fenólicos Secuestrante de radicales lipofílicos Carotenoides Vitamina A Secuestrante de radicales lipofílicos Ubiquinol Secuestrante de radicales lipofílicos Selenio Ligado a sistemas enzimáticos Bilirrubina Inhibe peroxidación lipídica Introducción 43 Las enzimas antioxidantes son esenciales para la vida de las células aerobias, puesto que mantienen, dentro de unos niveles aceptables, las concentraciones de especies reactivas del oxígeno producidas en diversos procesos celulares (Tabla 1.4). El hecho de que la célula disponga de un dispositivo de defensa tan abundante, pone en evidencia el importante grado de toxicidad que poseen los radicales libres. Tabla 1.4. Antioxidantes enzimáticos Compuesto Acción Superóxido dismutasa (SOD) Cataliza la dismutación del O2-• a H2O2. Catalasa (CAT) Transforma el peróxido de hidrógeno en agua Glutatión peroxidasa (GPx) Convierte los hidroperóxidos en agua Glutatión reductasa (GR) Reduce antioxidantes Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa Mantiene entorno reductor Introducción 44 2O 2 -• + 2H+ H 2 O 2 + O 2 Constante de velocidad = 5 x 105 M-1s-1 SOD La superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1), descubierta por McCord y Fridovich (1969), cataliza la conversión del anión superóxido (O2-•) a peróxido de hidrógeno (H2O2), de acuerdo con la siguiente fórmula: Existen 3 tipos de SOD diferentes que catalizan la misma reacción pero que difieren en el metal que contienen en su centro activo. La metaloenzima CuZnSOD, presente sobre todo en el citosol, pero también en los lisosomas, núcleo, mitocondria y peroxisomas y en cuyo sitio activo contiene cobre, que por mecanismo redox, participa en las reacciones de dismutación (Halliwell y Gutteridge 2007). El zinc por su parte, actuaría como estabilizador de la enzima. Se ha descrito otra CuZnSOD presente en el líquido extracelular que podría estar implicada en procesos inflamatorios (Karlsson y Marklund 1988). La variedad de SOD que contiene manganeso en su sitio activo (MnSOD) se localiza en la matriz mitocondrial de células eucariotas como un tetrámero, y en procariotas en formas de monómero, dímero, trímero o tetrámero. Llama la atención la similitud de secuencia de aminoácidos de esta enzima, independientemente de que sea de animales, plantas o bacterias y diferente en dicha secuencia a la enzima que lleva Cu en su molécula. A su vez, resulta muy similar a la SOD que contiene hierro (FeSOD) y que se encuentra casi exclusivamente en procariotas y algas (Halliwell y Gutteridge 1990). La Catalasa (CAT) (EC 1.11.1.6) es una enzima que se ubica preferentemente en los peroxisomas, cataliza la inactivación de dos Introducción 45 moléculas de H2O2 convirtiéndolas en agua y oxígeno, o de una, con la transformación de una molécula donadora de electrones. La constante de velocidad de la reacción peroxidativa es muy inferior a la reacción catalítica y varía según el sustrato, que pueden ser desde compuestos fenólicos o alcoholes hasta nitritos y aminas primarias. La mayor velocidad de reacción del proceso catalítico hace que a concentraciones altas de H2O2 predomine sobre el proceso peroxidativo que además necesita una concentración suficiente de la molécula donadora (AH2) (Chance y cols. 1979). La catalasa se encarga de la eliminación del H2O2 que se encuentra en los peroxisomas de muchos tejidos, sobre todo en hígado y riñón. El sitio activo de la enzima es un grupo hemo (Somani y cols. 1997). La glutatión peroxidasa (GPx) (EC 1.11.1.9) cataliza la reducción de peróxidos inorgánicos, hidroperóxidos orgánicos y peróxidos lipídicos, utilizando como sustrato el glutatión (GSH), que es transformado en glutatión oxidado (GSSG). Esta enzima junto con la glutatión reductasa (que regenera el GSH a partir del GSSG producido), 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (Reacción Catalítica) Constante de velocidad = 1,7 x 107 M-1s-1 CAT H 2 O 2 + AH 2 2H 2 O + A (Reacción Peroxidativa) CAT Introducción 46 H 2 O 2 + 2GSH GSSG + 2H 2 O Constante de velocidad = 5 x 107 M-1s-1 GPx juega un papel primordial en la regulación del H2O2 de las células animales (Halliwell 1981). Es una metaloproteína tretramérica que contiene 4 átomos de selenio por molécula, aunque en mamíferos existe una variedad dimérica sin selenio que no puede descomponer el peróxido de hidrógeno (Lawrence y Burk 1976). El H2O2 presente en el citosol o procedente de orgánulos como mitocondrias y retículo endoplásmico, es eliminado fundamentalmente por GPx presente mayoritariamente en el citosol y en menor cuantía en la mitocondria (López Torres 2002). La síntesis de estos componentes debe estar muy bien regulada, ya que las defensas antioxidantes ante un estrés oxidativo inducido por un metal pesado, son diferentes a aquellas que responden a un estrés producido por el anión superóxido o el peróxido de hidrógeno. Componentes diferentes deberán ser activados en proporciones diferentes. Así por ejemplo, si se induce un alto nivel de SOD, puede llegar a generarse demasiado peróxido de hidrógeno lo que origina un estrés debido a la elevada presencia de este oxidante. Por lo tanto, es deseable que la expresión de SOD se acompañe de la inducción de un gen que codifique una enzima capaz de remover el peróxido de hidrógeno, como podría ser la catalasa o una peroxidasa. Finalmente, los sistemas de reparación representan la tercera y última línea de defensa antioxidante. Estos sistemas corrigen las lesiones producidas en las biomoléculas dañadas por las EROs (Tabla 1.5) mediante mecanismos celulares específicos. Si no se recupera el equilibrio se producirán disfunciones que pueden desembocar en la muerte celular. Introducción 47 Tabla 1.5.- Sistema de reparación de daños Aunque se ha demostrado que individualmente algunos aminoácidos son más susceptibles a la oxidación que otros, una proteína, dependiendo de su conformación tridimensional, puede exponer o no esos aminoácidos a la oxidación. La enzima metionin sulfóxido reductasa repara las metioninas oxidadas que se encuentran protegiendo la zona catalítica de la proteína, evitando que las EROs puedan dañarla (Levine y cols. 1996). Sin embargo los radicales libres no siempre son perjudiciales para el organismo. A concentraciones bajas pueden tener una función reguladora. Así, actuando como segundo mensajero que regula la expresión de citoquinas, el peróxido de hidrógeno estimula factores que intervienen en procesos inmunes o que pueden controlar las células inflamatorias implicadas en procesos agudos de inflamación (Murray y Nathan 1999; Babior 2000). Sistema de reparación Acción Puntos de control del ciclo celular Reparación de ADN y ARN Metionina sulfóxido reductasa Reparación de proteínas y lípidos Tioredoxin reductasa Mantenimiento de proteínas tiólicas Glutatión peroxidasa Reparación de lípidos Introducción 48 DEFENSA ANTIOXIDANTE Antioxidantes y salud 1.7 Como ya se comentó anteriormente, algunas vitaminas y minerales que se encuentran en los alimentos son sustancias antioxidantes que previenen o disminuyen la oxidación, por lo tanto es conveniente su consumo para proteger nuestro organismo de la oxidación. El zinc induce la síntesis de la metalotioneína, una proteína que actúa como agente quelante de metales con capacidad redox (Fe2+ y Cu2+) y atrapa radicales hidroxilo. Además, es un constituyente de la Introducción 49 enzima antioxidante CuZnSOD (Olin y cols. 1993). Por otro lado, también podría unirse a macromoléculas (lípidos, proteínas, ácidos nucleicos), en sitios que, de otra manera, estarían ocupados por metales prooxidantes. Por ello, el zinc parece tener una función fisiológica como parte de las defensas antioxidantes del organismo, puesto que su deficiencia está asociada a una situación de estrés oxidativo (Sullivan y cols. 1980; Tate Jr y cols. 1999). Estudios realizados en una población a diferentes edades (de 2 a 70 años) indican que con la edad se produce un aumento del estrés oxidativo como consecuencia, entre otras causas, de alteraciones en las enzimas antioxidantes (İnal y cols. 2001). La utilización de miméticos de las enzimas SOD y CAT muestra un aumento en los niveles de estas enzimas tanto en el nematodo Caenorhabditis elegans (Melov y cols. 2000) como en animales transgénicos de Drosophila melanogaster (Orr y Sohal 1994) en los cuales la esperanza de vida se incrementa. Además, estos miméticos también se utilizan para prevenir el daño neuronal en ratas con neuropatologías inducidas (Rong y cols. 1999). Se sabe que el daño producido por la liberación de radicales libres juega un papel importante en ciertas patologías relacionas con el envejecimiento (Droy-Lefaix 1997; Marcus y cols. 1998). La administración de compuestos antioxidantes podría tener un efecto restaurador del estado fisiológico y concretamente de la función inmune durante la vejez, momento de la vida en el cual este sistema defensivo se altera, deprimiéndose en muchos de sus aspectos fundamentales (Miller 1996), y en el que los niveles de defensas antioxidantes parecen disminuir (Leibovitz y Siegel 1980). Ya que en el sistema inmune la función celular está particularmente ligada a la liberación de radicales de oxígeno, es necesario disponer de defensas antioxidantes que protejan la vida de estas células y mantengan su actividad normal. En personas mayores de 55 años con propensión a desarrollar degeneración macular senil, la suplementación de la dieta con Introducción 50 antioxidantes reduce la probabilidad de desarrollarla (Age-Related Eye Disease Study Research Group 2001; Falsini y cols. 2003). En general, en la mayoría de individuos con cáncer los niveles de antioxidantes se encuentran por debajo de lo normal, lo que parece indicar un importante papel de la modulación redox celular en esta enfermedad (Oberley y Oberley 1997). En pacientes con carcinoma cervical, existe un aumento de la peroxidación lipídica, así como niveles significativamente bajos de GSH, GPx, SOD, glutatión-S-transferasa, vitamina C y vitamina E (Manju y cols. 2002). También en la leucemia linfocítica crónica se observa una disminución de la activad de la SOD y de la GPx y, a pesar de que la relación GSSG/GSH no se modifica, la oxidación lipídica y el daño en el ADN aumentan (Oltra y cols. 2001). Aunque parezca paradójico, algunos estudios muestran como una posible terapia anticancerígena la inhibición de la SOD, a fin de aumentar los niveles del anión superóxido, ya que éste es un importante activador de la apoptosis (Huang y cols. 2000). En individuos sanos, la óxido nítrico sintetasa endotelial produce óxido nítrico que atrapa el anión superóxido; sin embargo, en las arterias de los diabéticos el endotelio es una fuente adicional de superóxido debido al mal funcionamiento de la óxido nítrico sintetasa endotelial (Guzik y cols. 2002). Además, en estos pacientes el estrés oxidativo de los monocitos está significativamente aumentado debido al incremento de la actividad de la NADPH oxidasa (Yasunari y cols. 2002). La mayoría de los antioxidantes, en individuos con daño cerebrovascular, se reducen inmediatamente después del episodio isquémico y van aumentando en los días siguientes, lo que sugiere la presencia de estrés oxidativo (Cherubini y cols. 2000). Este incremento del estrés oxidativo también se observa en pacientes sometidos a diálisis renal (Clermont y cols. 2000). Introducción 51 Estudios realizados en personas que sufren enfermedad coronaria, ponen de manifiesto que la actividad de la SOD extracelular ligada al endotelio se encuentra disminuida, lo que determina una mayor actividad del anión superóxido y, por tanto, una menor disponibilidad de NO. Así mismo, se observa un aumento de la xantina oxidasa ligada al endotelio (Landmesser y cols. 2000; Landmesser y cols. 2002). Por tanto, existe una correlación inversa entre los niveles plasmáticos de antioxidantes y el riesgo de enfermedad coronaria o muerte por infarto de miocardio (Riemersma y cols. 1991; Kritchevsky y cols. 1995) y la suplementación de la dieta con antioxidantes, particularmente con vitamina E, parece prevenir estos procesos (Hodis y cols. 1995; Takamatsu y cols. 1995). Los polifenoles son los antioxidantes más importantes que se encuentran en las plantas. Asimismo, aquellos que están presentes en el vino desempeñan una importante acción protectora en las alteraciones cardiovasculares al regular la actividad de las enzimas antioxidantes (Parks y Booyse 2002). 59 3 Material y métodos Algas objeto de estudio 3.1 Para la realización de este trabajo se analizan un total de cinco algas, dos pardas (Wakame y Espagueti de mar), dos verdes (Lechuga de mar y Ramallo de mar) y una roja (Nori) proporcionadas por la empresa Porto-Muiños situada en la localidad de Cambre (A Coruña, España). La recogida de las algas se lleva a cabo principalmente en primavera y verano, se limpian y se secan en corriente de aire, a una temperatura inferior a 50 ºC para evitar su deterioro a la vez que se facilita la eliminación de la mayor parte de agua. A continuación, se trocean, muelen, homogeneizan y guardan en bolsas de plástico selladas lo que permite que se conserven y almacenen hasta 3 años sin pérdidas significativas de sus propiedades. Para llevar a cabo los estudios enzimáticos se escoge el alga más consumida de cada tipo, entre aquellas que forman parte de este trabajo, Wakame, Nori y Lechuga de mar. Material y métodos 60 Determinaciones analíticas en 3.2 las algas Una vez que llegan a nuestro laboratorio las harinas de las distintas algas se procede al análisis de sus características y composición básica. Se toman partes alícuotas y en todos los casos las determinaciones se llevan a cabo por triplicado. Humedad 3.2.1 La humedad se determina mediante el analizador electrónico SCALTEC SMO 01. Se realiza teniendo en cuenta la pérdida de peso sufrida durante la desecación a la que se someten las muestras. Con los datos obtenidos se calcula el porcentaje de humedad. Vitaminas y minerales 3.2.2 El contenido en minerales se determina mediante las técnicas de espectrometría de emisión óptica ICP-OES en un espectrofotómetro Perkin Elmer 4300DV y por Espectrometría de Absorción Atómica en Horno de Grafito. Se realizan varias pruebas diluyendo con ácido nítrico y con una mezcla de ácido ascórbico, tritón y antiespumante, también se usan diferentes modificadores de matriz. Se toman los valores en los cuales se obtienen mejores recuperaciones del material certificado que se usa. Para la preparación de los blancos y de las muestras de las especies marinas ensayadas, se sigue el método de Förster y Wittmann (1983) modificado. Para ello, se sitúan las muestras en recipientes con H2O2 al 30 % (Merck Suprapur) y se calientan progresivamente hasta que se vuelven transparentes. Los residuos así obtenidos tras la Material y métodos 61 evaporación se disuelven en HNO3-HCl (1:3) (Merck Supapur), se someten a digestión a 110 ºC y se filtran a través de una membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro. Todo el material en contacto con la muestra debe ser descontaminado, para lo cual se mantiene durante 24 horas en ácido nítrico, se lava con agua desionizada y se pasa por agua MilliQ. Para la cuantificación de minerales en suero sanguíneo se añade HNO3 en la proporción 1:1, se calienta 10 minutos a 110 ºC y se diluye con agua MilliQ hasta 10 ml. Para establecer la composición en vitaminas, se requiere una manipulación adecuada, con un ambiente poco oxidativo y baja temperatura para la correcta conservación de las vitaminas y su posterior análisis. La vitamina B12 se cuantifica por el método microbiológico, la biotina mediante el procedimiento turbidimétrico y en cuanto a las demás vitaminas analizadas, su determinación se realiza mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (AOAC 1995) Glúcidos, fibra cruda, fibra alimentaria 3.2.3 y cenizas La fibra cruda se determina gravimétricamente después de una digestión ácida con ácido sulfúrico y otra básica con hidróxido sódico y posterior calcinación a 600 ºC (Figura 3.1). En cuanto a la fibra alimentaria se utiliza el método enzimático-gravimétrico AOAC 985.29, en el que se pesa el precipitado después de una digestión con alfa-amilasa, proteasa y amiloglucosidasa (AOAC 1995). La cuantificación de los gúcidos se calcula “por diferencia” mediante el análisis proximal de Weende, después de conocer la humedad, proteína, grasa y fibra cruda. Para la determinación de las cenizas se utiliza una mufla a 600 ºC durante 12 h en la que se calcina la muestra. Material y métodos 62 2-3g muestra + 200ml de H2SO4(0,255N) hirviendo Filtrar en caliente con vacío Residuo + 200 ml NaOH (0,313N) hirviendo Lavar con sol. HCl 1% Filtrar en caliente con vacío Ebullición suave 30’ Agitación suave Lavar con agua caliente Ebullición 30’ Lavar con agua caliente Lavar con alcohol etílico 95% Lavar con agua caliente Pesar residuo Secar 105 o C Pesar cenizas Calcinar 600 o C Figura 3.1.- Esquema de la determinación de fibra cruda Grasa 3.2.4 La grasa se extrae de las muestras en un Soxhlet con éter dietílico durante cinco horas. Una vez eliminado el disolvente, se deseca el extracto etéreo hasta un peso constante, lo que indica su evaporación total. La diferencia de peso del matraz antes y después de la extracción, permite calcular el contenido de grasa. Los distintos tipos de ácidos grasos se determinan mediante cromatografía de gases, cuantificando sus derivados metil ésteres. Para ello, las muestras se tratan con tolueno, ácido sulfúrico y metanol, esta Material y métodos 63 mezcla se incuba en un baño de agua a 50 ºC durante 2 horas. A continuación, se añade una solución de NaCl 5 %, y por último, se extraen los ésteres con hexano. La composición de ácidos grasos metil ésteres se determina con un detector de ionización de llama con un programa de temperatura entre 160 y 230 ºC, con un gradiente de temperatura de 2 ºC por minuto. Los picos fueron comparados con sus correspondientes patrones (Christie 1989). Esteroles 3.2.5 Generalmente los esteroles se aíslan de la fracción lipídica no saponificable después de su extracción (Wrolstad y cols. 2005). La saponificación de las grasas consiste en una hidrolización básica o ácida que da como resultado alcohol (glicerol) y ácidos grasos. Dentro de estos lípidos se encuentran triacilglicéridos, fosfolípidos, glucolípidos, esfingolípidos y ceras (O'Keefe 2008). Los lípidos no saponificables incluyen esteroles, alcoholes grasos, vitaminas liposolubles como los carotenos y las vitaminas A, D, E y K, alcoholes grasos y otras sustancias (Holdt y Kraan 2011). Se emplea el método de saponificación directa descrito por Kovacs y cols. (1979) en el que se utiliza KOH y etanol. Para la extracción de lípidos totales se utiliza el método Folch y cols. (1957), con las modificaciones propuestas por Bligh y Dyer (1959) y Beninger y Lucas (1984), en las que se utiliza una mezcla extractora de cloroformo y metanol (Boulom y cols. 2014). En la determinación de los esteroles se utiliza el método de cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-FID) (Boulom y cols. 2014). Material y métodos 64 Proteína 3.2.6 La cantidad de proteína se valora mediante la determinación del nitrógeno total, por el método de Kjeldahl, por ser el más apropiado y con un alto grado de fiabilidad (coeficiente de variación <1 por ciento) en muestras de alto contenido proteico (AOAC 1995). El principio básico de este método es la conversión del nitrógeno de las sustancias nitrogenadas en amonio, atacándolas con ácido sulfúrico concentrado. El material orgánico se oxida a dióxido de carbono y agua; el ácido sulfúrico se convierte en dióxido sulfúrico y el nitrógeno se fija en forma de sulfato amónico. La oxidación del material orgánico se acelera añadiendo sulfato potásico para elevar la temperatura y como catalizadores se utilizan cobre y selenio (tabletas Kjeldahl). Posteriormente, la cantidad de sulfato de amonio se determina añadiendo un exceso de hidróxido sódico y sometiendo la mezcla a un proceso de destilación y titulación. Digestión 3.2.6.1 El proceso se realiza en un digestor Büchi B-426. Las muestras exactamente pesadas se depositan en los tubos de digestión, en los que anteriormente se han introducido dos pastillas de catalizador Kjeldahl y cuatro perlitas de vidrio, para evitar retrasos en la ebullición e impedir explosiones suaves del sulfúrico. A continuación, se añaden 20 ml H2SO4 concentrado. Se considera finalizada la digestión cuando han transcurrido 15 minutos después de haber cambiado el color de las muestras a verde claro. Destilación 3.2.6.2 Esta fase del proceso se lleva a cabo en una unidad de destilación Büchi B-316. Para prevenir una reacción violenta excesiva durante la fase de neutralización, previamente a la destilación, se diluye Material y métodos 65 la mezcla digerida con 100 ml H2O destilada, para ello el tubo de digestión ha de estar frío. Se neutraliza el ácido y se libera amoníaco a partir del sulfato amónico utilizando 80 ml NaOH 40 %. Se pone en marcha el destilador y se recogen 120 ml de destilado en 100 ml de ácido bórico con un indicador formado por verde de bromocresol y rojo de metilo. Titulación 3.2.6.3 El exceso de amoníaco se valora con HCl 0,1 N de factor conocido, produciéndose cloruro amónico que mantiene el pH elevado. La adición de clorhídrico debe ser lenta y la cantidad necesaria para producir de nuevo un cambio de pH, paso de color verde a rojo, se utiliza para la cuantificación del contenido total de nitrógeno. Cálculos para la determinación de la proteína 3.2.6.4 Los cálculos se basan en el hecho de que un átomo gramo de nitrógeno da lugar a la formación de un mol de amoníaco, que a su vez requiere para neutralizarlo un mol de ácido. Los resultados se multiplican por 6,25 para transformarlos en proteína. Aminoácidos 3.2.7 La composición aminoacídica de las proteínas de las algas se determina por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). Se valoran los siguientes aminoácidos: ácido aspártico (ASP), serina (SER), ácido glutámico (GLU), glicina (GLI), histidina (HIS), arginina (ARG), treonina (TRE), alanina (ALA), prolina (PRO), metionina (MET), cisteína (CIS), valina (VAL), lisina (LIS), isoleucina (ILE), leucina (LEU), fenilalanina (FEN), norleucina (NORLEU) y tirosina (TIR). Material y métodos 66 Las muestras (0,1 g) se colocan en un recipiente con 50 ml de HCl 6 M. El contenido se hidroliza a 110 ºC durante 20-24 h, y esta solución se seca en un rotavapor. El residuo se disuelve en HCl 20 mM y finalmente se filtra a través de una membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro. El hidrolizado obtenido de esta manera junto con los estándares se derivatizan usando el sistema AccQ Tag para el análisis de aminoácidos (Waters, Milford, MA) (Figura 3.2) y se analizan mediante una modificación del sistema de HPLC de fase inversa. Este sistema HPLC consiste en una bomba de HPLC binario (Waters 1525), un módulo de desgasificación (Waters desgasificador In-line AF), un inyector automático (Waters 717 plus) y un detector de fluorescencia (Waters 2475) con los parámetros indicados en la Tabla 3.1. Tabla 3.1. Parámetros aplicados en el detector de fluorescencia Waters 470 Longitud de onda de excitación 250 nm Longitud de onda de emisión 395 nm Filtro 0,5 Ganancia 8 Figura 3.2. Derivatización de los Aminoácidos Material y métodos 67 Los cromatogramas se registran usando el programa de software Breeze, un ejemplo de cromatograma se puede ver en la Figura 3.3. Las soluciones estándar de aminoácidos, excepto norleucina, se obtienen de Waters (estándar de aminoácidos, WAT 088.122). La norleucina se prepara en agua MilliQ de forma individual (Sigma Chemicals Co., EE.UU., ref. N-8513) para proporcionar concentraciones de trabajo de 12, 30, 40, 60, 80, 120 pmol/L. El gradiente se realiza con tampón A (200 ml de eluyente A concentrado, Waters Ref. WAT 05890 y 800 ml de agua MilliQ) y tampón B (600 ml de acetonitrilo grado gradiente, Merk Ref. 1.00030.2500 y 400 ml de agua MilliQ). Para separar los aminoácidos se utiliza una columna de fase inversa (AccQ Tag, 150 mm de largo, 3,9 mm de diámetro). La columna se equilibra con tampón A a un caudal de 1 ml por min a 20 ºC durante toda la medición. El gradiente se produce por los cambios de concentración en la fase móvil indicados en laTabla 3.2. Tabla 3.2. Evolución del gradiente cromatográfico Se inyectan diez microlitros de cada una de las muestras mediante un inyector automático, los productos eluidos se miden con un detector de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 250 y 395 nm, respectivamente (Cohen y Michaud 1993; Cohen y De Antonis 1994). Minuto % Fase móvil A % Fase móvil B Curva 0.5 6 94 6 19 11 89 6 25 13 87 6 25 13 87 6 36 33 67 10 37 33 67 6 47 100 0 6 Material y métodos 74 mg del aminoácido en la proteína test/g de proteína IQ = mg del aminoácido en la proteína patrón/g de proteína x 100 Determinación del valor nutritivo de las 3.4.1 proteínas Métodos químicos 3.4.1.1 En primer lugar, mediante HPLC se obtiene el perfil aminoacídico de las proteínas objeto de estudio y se compara con una proteína de referencia “ideal” de valor biológico conocido (caseína). Posteriormente, se calculan el Índice Químico, el Índice de Mitchell, el Índice de Proteínas, el Índice de Aminoácidos y el Índice de Aminoácidos corregido. El Índice Químico fue propuesto por Mitchell y Block (1946), y se basa en expresar el valor de cada aminoácido esencial de la proteína test como porcentaje del contenido del mismo aminoácido en una proteína patrón (proteína de huevo, caseína,...), tomada como referencia para asegurar un crecimiento óptimo en ratas (Hegedus 1989). A partir de estos resultados se puede indicar el aminoácido limitante, como aquel en que es más deficiente la proteína problema con respecto a la proteína patrón. Este índice se basa en relaciones estrictamente numéricas de composición de aminoácidos, por lo tanto, únicamente indica el aminoácido esencial limitante y no tiene en cuenta la disponibilidad de ese aminoácido. Por otra parte, el Índice Químico muestra una baja correlación con el valor biológico determinado en animales (Hansen y Eggum 1973). Material y métodos 75 media geométrica de los valores de cada aminoácido esencial de la proteína test IM = media geométrica de los valores de cada aminoácido esencial de la proteína patrón El Índice de Mitchell, establecido por Mitchell (1954), es una modificación del Índice de Oser. En este índice se calcula la media geométrica de los valores de cada aminoácido esencial de la proteína test, respecto a su valor correspondiente con la proteína patrón (Hernández y cols. 1996). Se omite el aminoácido arginina por no ser esencial, y se calcula como si fuese un solo aminoácido la suma de, por un lado la metionina y la cisteína, y por otro, la fenilalanina y la tirosina. Esto se debe a la dependencia biosintética que tienen los segundos con respecto a los primeros. Para realizar su cálculo, se considera que una cantidad superior en aminoácidos de la muestra, con respecto a la de la proteína patrón, es irrelevante, de esta forma, las relaciones superiores a uno se consideran como la unidad. El Índice de Proteínas lo propone un grupo de expertos de la FAO en 1957. Debido a que uno de los principales problemas de los índices químicos es la elección de la proteína de referencia, estableció un patrón de proteína teórico, calculado en base a los requerimientos de aminoácidos en humanos. En dicho patrón los niveles de aminoácidos azufrados son menores que en la proteína de huevo utilizada mayoritariamente como referencia, por lo que se obtenía una mejor correlación con la determinación biológica (Pellett 1978). Material y métodos 76 media geométrica de los valores de cada aminoácido esencial de la proteína test IP = media geométrica de los valores de cada aminoácido esencial requerido en humanos Índice de Aminoácidos: El comité de expertos de la FAO/OMS en 1973 sugiere un nuevo patrón de proteína, basado en la evaluación de requerimientos de aminoácidos en humanos. Este índice relaciona cada uno de los aminoácidos esenciales con el valor requerido de los mismos en el hombre. aminoácido esencial IAA = requerimiento en humanos del aminoácido esencial El Índice de Aminoácidos Corregido constituye el método más adecuado para evaluar la calidad proteica (Pellett 1978). Se calcula como el producto de la digestibilidad verdadera por el índice del aminoácido más deficitario. Métodos biológicos 3.4.1.2 Para evaluar la calidad nutritiva de las proteínas procedentes de las harinas que contienen algas con respecto al pienso estándar, se calculan una serie de índices nutritivos biológicos a partir de los datos obtenidos de las tasas de nitrógeno que se ingieren y se excretan (Figura 3.6). Material y métodos 77 Figura 3.6.- Relaciones entre parámetros nutritivos Valor Biológico (VB). Fue definido por Thomas (1909) y modificado por Mitchell (1924) para tener en cuenta la pérdida de nitrógeno de origen endógeno. Este índice se determina midiendo la cantidad de nitrógeno ingerido en la dieta así como la eliminada por heces y orina. El nitrógeno urinario es el que proviene del metabolismo de los aminoácidos que se absorben, mientras que el fecal procede de la Material y métodos 78 suma del material nitrogenado de la dieta que no se absorbe y el que tiene su origen en la descamación del tejido intestinal y enzimas digestivas. El VB es el porcentaje de nitrógeno retenido en función del total absorbido. Este dato proporciona información de en qué medida la proteína ingerida cubre los requerimientos de aminoácidos esenciales. La deficiencia de cualquiera de estos aminoácidos impide la correcta síntesis de proteínas, lo que provoca una inadecuada retención de nitrógeno. Cuando el VB es superior al 70 % se considera que la proteína cubre la demanda de nitrógeno durante el período de crecimiento, siempre que la energía que aporte la dieta sea la adecuada. Digestibilidad. Se define como la proporción de nitrógeno ingerido que se absorbe (Bressani 1977). Se puede diferenciar el Coeficiente de Digestibilidad Aparente (CDA) del Coeficiente de Digestibilidad Real (CDR), en el primero no se tiene en cuenta el nitrógeno endógeno de heces que se determina utilizando una dieta con bajo contenido proteico (4 %). El CDR puede oscilar entre el 74-80 por ciento en proteínas vegetales hasta 97 por ciento de las proteínas de la carne y el huevo (Santidrián 1988). Balance Nitrogenado (BN). Es la diferencia entre el nitrógeno ingerido y el eliminado, en gramos por día. Un equilibrio nitrogenado o un BN positivo con una ingesta de nitrógeno superior a la pérdida por vías de excreción son imprescindibles en periodos de crecimiento como pueden ser la infancia, adolescencia o embarazo. Un BN negativo provoca la degeneración o pérdida de tejidos (Santidrián 1988). Utilización Proteica Neta (UPN). Este parámetro indica la cantidad de proteína que realmente utiliza el organismo, es decir, la proporción de proteína de la dieta que es retenida por el cuerpo. La UPN incluye el Valor Biológico y la Digestibilidad, de esta forma se tienen en cuenta las pérdidas endógenas fecales y urinarias de nitrógeno (Miller y Bender 1955; Hernández y cols. 1996). Material y métodos 79 Incremento de peso corporal (g) PER = Proteína ingerida (g) Cantidad de pienso consumido (g) IT = Ganancia de peso total (g) Coeficiente de Eficacia Proteica (PER). El coeficiente de eficacia proteica, que relaciona el incremento del peso corporal con la cantidad de proteína ingerida (Osborne y cols. 1919), indica en qué medida la proteína ingerida es adecuada para cubrir las necesidades proteicas de los individuos en crecimiento. Índice de Transformación del Alimento (IT). El índice de transformación del alimento relaciona la cantidad de alimento ingerido con la ganancia de peso (Barber y cols. 1953). Determinación de parámetros 3.5 hemáticos Una vez finalizado el periodo en el que se recogen las muestras para el estudio nutricional (16 días), se continúa alimentando a los animales con la misma dieta utilizada en el período principal durante 14 días más. Finalizado este tiempo, se mantienen las ratas en ayunas Material y métodos 80 durante 12 horas. A continuación, se sacrifica al animal y se realiza un corte en la yugular para su desangrado. La sangre se recoge en tubos para su centrifugación a 1.000 g durante diez minutos; en el suero sanguíneo así obtenido, se analizan los siguientes parámetros: colesterol-total, colesterol-HDL, colesterol-LDL, triglicéridos, nitrógeno ureico, proteína total, albúmina, glutámico oxalacético transaminasa, glutámico pirúvico transaminasa y glucosa. Para estas determinaciones se utiliza un autoanalizador Spotchem, modelo SP-4410 (Menarini). Es un sistema automático de análisis bioquímicos que emplea la técnica de química seca. Obtención de las muestras de 3.6 tejidos Después de sacrificar el animal y proceder a su desangrado, se realiza una laparotomía y se extrae el intestino delgado, se lava con suero fisiológico frío hasta dejarlo completamente libre de contenido intestinal, se abre longitudinalmente, se raspa la mucosa intestinal con una espátula y se pesa. Así mismo, se extraen hígado, riñones y corazón, se introducen en suero fisiológico frío para lavarlos, se pesan, se trituran y se separan en alícuotas de 1 gramo del total para proceder a las determinaciones enzimáticas correspondientes. Material y métodos 81 Determinación de la proteína 3.7 en tejidos El método elegido para la cuantificación de la proteína de los homogeneizados ha sido el de Lowry y cols. (1951), se utiliza una curva patrón de seroalbúmina bovina a concentraciones entre 120 y 600 microgramos/ml. El color final desarrollado se debe a dos reacciones: la primera a causa del complejo formado por la proteína con el cobre en medio álcali, la segunda es una reacción de reducción del agente fosfomolíbdico-fosfotúngstico por la tirosina y el triptófano presentes en la proteína. La lectura de la reacción colorimétrica se realiza en un espectrofotómetro Beckman Du-50 a 750nm. Determinaciones enzimáticas 3.8 Disacaridasas 3.8.1 Para la valoración de las actividades de las enzimas maltasa (α - glucosidasa, EC 3.2.1.20), sacarasa (β - fluctofuranosidasa, EC 3.2.1.48) y lactasa (β - galactosidasa, EC 3.2.1.23) se mide la liberación de la glucosa después de la hidrólisis de los respectivos disacáridos utilizando el reactivo TGO (glucosa - oxidasa, peroxidasa y o - dianisidina) (Dahlqvist 1968; Miller 1981) (Figura 3.6). Material y métodos 82 Figura 3.6.- Reacciones para la determinación de disacaridasas La mucosa intestinal se procesa según el método de Kessler y cols. (1978). Para ello, se homogeniza la muestra en Tris-HCl-manitol 50 mM (pH=7,1) en una proporción 1:10, mediante un potter ultraturrax T25 a 11.000 rpm, a 4 ºC; a continuación, se añade MgCl2 10 mM, se esperan 10 minutos manteniendo los homogeneizados en frío con agitación esporádica, se centrifuga en frío a 4.200 g durante 10 minutos y el sobrenadante obtenido se congela en alícuotas a -80 ºC hasta su procesado (Figura 3.7). Material y métodos 83 Figura 3.7.- Preparación de tejido para disacaridasas, GGT y LAP Para la determinación de las disacaridasas, se coge 0,1 ml del disacárido correspondiente diluido en tampón maleato (0,1 M a pH=6), se le añade la muestra y se mantiene en un baño con agitación a 37 ºC, a continuación se vuelve a incubar después de completar la reacción con TGO, lo que permite la inhibición de la reacción enzimática debido al cambio de pH y a la dilución de la muestra. La glucosa liberada reacciona con la glucosa oxidasa, liberando una molécula de peróxido de hidrógeno que a su vez reacciona con la ortodianisidina (cromógeno) y, con la mediación de la peroxidasa, se puede determinar colorimétricamente el compuesto resultante (Figura 3.8). Al reactivo TGO se le añade un detergente no iónico, Triton X-100, para controlar el enturbiamiento y se utiliza como disolvente Material y métodos 90 el exceso de nitrito sódico y para finalizar, N-naftiletilendiamina dihidrocloruro 0,05 % en agua, para teñir el compuesto final resultante de la reacción cuya coloración depende de la cantidad de p-nitroanilina que se produzca (Figura 3.12). Figura 3.12.- Determinación de la actividad de la gamma glutamil transpeptidasa Material y métodos 91 Como blanco de la reacción se utiliza agua destilada en lugar de muestra y se procesa con un protocolo similar. Los resultados se comparan con los de una recta patrón realizada a partir de una disolución de p-nitroanilina 0,138 g/l. La actividad de la gammaglutamil transpeptidasa se expresa en nanomoles de paranitroanilina/g de proteína/minuto. Determinación de las 3.9 sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico El método más rápido y sencillo para cuantificar esta peroxidación es mediante la determinación colorimétrica de las sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS). Esta técnica mide un cromógeno formado con el ácido tiobartitúrico (TBA) y el malondialdehído (MDA) (Esterbauer y Cheeseman 1990). La muestra de tejido se homogeneiza en NaCl 0,9 % (pH=7,2), se centrifuga y se recoge el sobrenadante (Figura 3.13). Posteriormente a 0,5 ml de homogeneizado se le añade 1 ml de ácido tricloroácetico (TCA) al 10 % para desnaturalizar las proteínas y se centrifuga a 13.000 g durante 5 minutos. A 0,5 ml del sobrenadante se le añaden 0,025 ml de butil hidroxitolueno (BHT) al 1 % (p/v en ácido acético glaciar) para evitar la posible oxidación lipídica que conlleva un incremento indeseable del MDA final. A continuación se mezclan 0,2 ml de laurilsulfato sódico al 8 % (p/v), 1 ml de ácido acético al 20 % (p/v) a pH=3,5 y 1 ml de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) al 0,8 % (p/v) a pH=3,5. Esta mezcla se calienta a 95 ºC durante 30 minutos, así reaccionará una molécula de MDA, resultante de la oxidación lipídica, con dos moléculas de TBA. Una vez finalizado el tiempo establecido, se frena el proceso en frío. Material y métodos 92 A continuación se añaden 3 ml de n-butanol como fase orgánica y se mezcla por inversión durante 4 minutos. Se centrifuga a 1.000 g durante 10 minutos para diferenciar la fase acuosa de la orgánica, y es en esta última donde se mide la absorbancia a 535 nm (Figura 3.14). Figura 3.13.- Preparación de tejido para TBARS Material y métodos 93 Figura 3.14.- Protocolo en la determinación de TBARS Material y métodos 94 Para el cálculo de la concentración de MDA se utiliza una recta patrón que se realiza con concentraciones de 3, 6, 12, 24 y 36 nanomoles/ml, partiendo de una solución madre de 0,04 ml de MDA (1,1,3,3-Tetraetoxipropano, 97 %, Sigma T9889-25 ml) en 100 ml de ácido sulfúrico al 1 % y utilizando como blanco agua destilada. Determinación de la 3.10 actividad de enzimas antioxidantes La determinación de enzimas antioxidantes se lleva a cabo de acuerdo con la técnica de Mahfouz y Kummerow (2000). Para ello, se homogeneiza, mediante un potter ultraturrax T-25, 1 g de muestra de tejido (hígado, riñón, corazón y mucosa intestinal) en sacarosa 0,25 M en la proporción 1:4 (p/v). A continuación, 3 ml de la muestra homogeneizada se ultracentrífuga a 100.000 g durante sesenta minutos. En la fracción sobrenadante se determina la actividad de las enzimas superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. Al resto del homogeneizado de hígado, riñón y corazón se le añade 1 ml de colato de sodio 0,25 % y se centrifuga a 700 g durante diez minutos. En el sobrenadante obtenido se valora la actividad de la catalasa (Figura 3.15). Durante todo el proceso se mantiene una temperatura en torno a 4 ºC con el fin de evitar la posible degradación enzimática. Material y métodos 95 Figura 3.15.- Preparación de la muestra de tejido para la determinación de enzimas antioxidantes Superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) 3.10.1 Para determinar la actividad superóxido dismutasa (SOD) se utiliza el kit RANSOD (Laboratorios RANDOX) que se basa en el método desarrollado por Beauchamp y Fridovich (1971). Material y métodos 96 Este método emplea como generador de radicales superóxido la reacción de la xantina con xantina oxidasa, estos radicales reaccionan con 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-fenil tetrazolio (INT) para dar un compuesto rojo denominado formazán, cuyo color se valora espectrofotométricamente. La inhibición de esta última reacción, debido al secuestro de los radicales superóxido que son utilizados como sustrato por la SOD, es indicativa de su actividad enzimática (Figura 3.16). Figura 3.16.- Reacciones en la determinación de SOD La SOD inhibe la formación del formazán rojo y su actividad se mide como porcentaje de inhibición comparándolo con una curva de calibración preparada con SOD purificada contenida en el kit. Material y métodos 97 La muestra se diluye con tampón fosfato 10 mM (pH=7,0). A 0,05 ml de la muestra diluida se le añaden 1,7 ml de sustrato (xantina 0,05 M + INT 0,025 mM en tampón CAPS conteniendo EDTA 0,94 mM (pH=10,2) y 0,25 ml de xantina oxidasa (80 U/L), se incuba a 37 ºC y la absorbancia se mide a 505 nm frente al aire a los 30 y 210 segundos después de la adición de la enzima. Paralelamente se procesa un blanco que se corresponde con el 100 % de inhibición. La actividad de la SOD se expresa en U/mg de proteína. Siendo la unidad de SOD la cantidad de enzima que inhibe el 50 % de la tasa de formación del formazán rojo. El ensayo es lineal desde el 30 al 60 % de inhibición. Glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.9) 3.10.2 Para medir la actividad de la glutatión peroxidasa (GPx) se utiliza el kit RANSEL (Laboratorios RANDOX) que se basa en el método desarrollado por Paglia y Valentine (1967). El fundamento del método radica en una reacción colorimétrica, originada por la transformación del glutatión (GSH) a su forma oxidada (GSSG) por el hidroperóxido de cumeno (ROOH), que tiene como catalizador a la glutatión peroxidasa. En presencia de glutatión reductasa (GR) y NADPH, el glutatión oxidado se convierte a la forma reducida con una oxidación, en paralelo, del NADPH a NADP+. El consumo de NADPH se mide espectrofotométricamente a 340 nm a 37 ºC. Para llevar a cabo las reacciones, a 0,02 ml de muestra se le añade 1 ml de la solución que contiene glutatión 4 mM, glutatión reductasa 0,5 U/L, NADPH 0,34 mM, tampón fosfato 0,05 M (pH=7,2) y EDTA 4,3 mmol/l. A continuación se le adicionan 0,04 ml de hidróxido de cumeno 4,86 mM, se incuba a 37 ºC y se mide la absorbancia a 340 nm frente a aire durante 3 minutos. Paralelamente se procesa un blanco en el que se sustituyen los 0,02 ml de muestra por tampón fosfato 0,05 M. Material y métodos 98 Si el cambio de absorbancia por minuto excede de 0,1 hay que diluir la muestra y multiplicar el resultado por el factor de dilución. Los datos de la actividad de la GPx obtenidos utilizando la ecuación de Lambert Beer se expresan en nanomomoles de NADPH consumidos/minuto/mg de proteína. Material y métodos 99 Catalasa (EC 1.11.1.6) 3.10.3 La actividad de la catalasa (CAT) se cuantifica utilizando el kit CAT100 de Sigma siguiendo el método de Aebi (1984) que se basa en la descomposición, a lo largo del tiempo, del peróxido de hidrógeno debido a la acción de la catalasa, de acuerdo con la reacción: La reacción enzimática se detiene con azida sódica, que inhibe a la catalasa, al cabo de 3 minutos en el caso del riñón y de 1 minuto para el hígado y corazón. De esta manera se cumple la recomendación de disminución de la concentración inicial de H2O2 del 30 al 50 % en 1-5 minutos. Este procedimiento utiliza el ácido 3,5-dicloro–2– hidroxibenceno-sulfónico asociado oxidativamente con 4-aminoantipirina, que en presencia de peróxido de hidrógeno y peroxidasa dan una quinona-imina roja (N-(4-antipyril)-3-cloro-5-sulfonato-pbenzoquinona-monoimina) que absorbe la luz a 520 nm. La concentración de peróxido de hidrógeno usada en este ensayo (50 mM) se puede medir espectrofotométricamente, pero no es una concentración suficiente para causar la inactivación de la enzima. En una alícuota de la mezcla de reacción se mide colorimétricamente el H2O2 residual y la actividad de la catalasa se expresa como micromoles de H2O2 descompuestos/minuto/mg de proteína (Figura 3.17). Resultados y discusión 106 Glúcidos 4.1.1.1 Los resultados obtenidos indican que en todas las algas analizadas los glúcidos son los componentes mayoritarios, y dentro de éstos, la fibra dietética es preponderante. Esto es una característica general en la mayoría de las macroalgas (MacArtain y cols. 2007). En general, se recomienda que los glúcidos, preferentemente de bajo índice glucémico, supongan entre un 55 y un 60% del consumo energético total (Mann y cols. 2007) y para una función intestinal normal, el consumo diario de fibra dietética en adultos debería estar entre 25 y 30 g (14 g/1.000 Kcal) procedente de diversos alimentos y no de suplementos (Gray 2006). En concreto en España por término medio se considera que existe un déficit de consumo de fibra dietética de 10 g al día/persona y en especial la fracción insoluble es en la que la deficiencia es mayor (Ruiz-Roso 2013). El alga Ramallo de mar, con un 44 %, es la que mayor porcentaje de glúcidos tiene de todas las algas analizadas, sin embargo el contenido más elevado en fibra dietética corresponde a Lechuga de mar con un 40,8 %. Además se puede apreciar que Nori es la que presenta el menor porcentaje de fibra dietética (22,9 %) con respecto al resto de algas, resultado que coincide con Cofrades y cols. (2010) cuando comparan Wakame, Nori y Espagueti de mar. El estudio llevado a cabo por Pádua y cols. (2004) para el género Ulva (Lechuga de mar) pone de manifiesto variaciones de fibra dietética del 46,5 al 72,28 % en función del lugar y de la época del año. Plaza y cols. (2008) y Rodrigues y cols. (2015), entre otros, obtuvieron valores similares a los de este estudio. La fibra disminuye el tiempo del tránsito intestinal y tiene efectos hipocolesterolémicos y de prevención de diabetes tipo II (Cáceres y cols. 2004; Slavin 2013). El contenido de fibra de las algas podría ser una característica importante a la hora de llevar a cabo su incorporación a las dietas occidentales, que generalmente presentan un contenido elevado en productos refinados pobres en fibra, de tal forma que la ingesta de fibra es, en general, insuficiente para tener una buena Resultados y discusión 107 salud. Por ello, el consumo de algas podría ser una buena opción para alcanzar los valores diarios aconsejados por la OMS. Grasa y ácidos grasos 4.1.1.2 En general, las algas tienen un contenido de grasa bajo, que en este estudio se encuentra en valores que van desde los 0,9 y 1 % en materia seca de Lechuga de mar y Nori, respectivamente, hasta los 4,4 % de Espagueti de mar. Los valores intermedios fueron de 2,8 % para Wakame y Ramallo de mar. Las proporciones de ácidos grasos con respecto a la grasa total analizados en estas algas se muestran en la Figura 4.1. Como se puede observar, los ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados se corresponden aproximadamente con el 25 y el 30 % del total, respectivamente, lo que supone que más de la mitad del total de ácidos grasos no son saturados. Estos porcentajes de los diferentes ácidos grasos concuerdan con los datos mencionados por otros autores (Sánchez-Machado y cols. 2004a; Ortiz y cols. 2006; Ortiz y cols. 2009; Cofrades y cols. 2010). Además, Espagueti de mar es el alga que más grasa contiene, pero también es la que tiene mayor proporción de ácidos grasos poliinsaturados (37,53 %) y monoinsaturados (30,2 %). El elevado contenido en ácidos grasos insaturados de las algas hace que su consumo pueda contribuir a incrementar la ingesta de este tipo de grasa y de esta manera acercarse a una nutrición más equilibrada con una proporción de ácidos grasos saturados:monoinsaturados:poliinsaturados de 25:60:15. La cantidad de ácidos grasos poliinsaturados es similar a la de otros vegetales terrestres (Matanjun y cols. 2008). La proporción entre los ácidos grasos ω-6 y ω-3 varía no sólo de unas algas a otras, sino también dentro de la misma alga si las condiciones ambientales son diferentes, de modo que incluso puede que la cantidad de ω-6 sea superior a la de ω-3 en determinadas circunstancias pero inferior si éstas cambian (Dawczynski y cols. 2007). En nuestro caso, otro punto a favor de la composición lipídica de estas algas es la relación entre los Resultados y discusión 108 ácidos grasos ω-3 y ω-6, dado que hay entre 2 y 7 veces más ω-3 que ω-6. Aunque las recomendaciones son que la relación entre los ácidos grasos ω-3 y ω-6 sea de alrededor de 1:5 (Urrialde de Andrés 2003), en España, habitualmente la dieta es deficitaria en ω-3 (Mataix 2004). De estos datos se puede deducir que el bajo contenido lipídico y la distribución de los diferentes tipos de ácidos grasos de las algas, hace que puedan encajar dentro de una dieta saludable. Figura 4.1.-Proporción de ácidos grasos en las algas Esteroles 4.1.1.3 Los esteroles de la dieta reducen la absorción de colesterol a nivel intestinal y aunque su consumo podría disminuir los niveles en Resultados y discusión 109 suero sanguíneo de alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno, siempre se sitúan dentro de niveles considerados normales (Ikeda y cols. 1988; Plat y Mensink 2005). El consumo de 2 g/día de esteroles reduce los niveles de LDL en sangre en un 10 %, por lo que su ingesta prolongada es probable que reduzca el riesgo de enfermedad coronaria entre un 12% y un 20% en los primeros 5 años y en un 20 % a lo largo de toda la vida (Katan y cols. 2003). El pienso estándar utilizado como base para la elaboración de los piensos tiene más esteroles que las algas incorporadas a los piensos, concretamente 2, 4 y 5 veces más que Lechuga de mar, Nori y Wakame, respectivamente (Tabla 4.2). La lechuga de mar es el alga que más esteroles totales tiene de las 3 algas analizadas, con 333 mg/kg en peso seco, pero se quedaría por debajo del contenido en esteroles de algunos vegetales terrestres (ej. tomate 1167 mg/kg y brócoli 3408 mg/kg) (Piironen y cols. 2003). Tabla 4.2. Esteroles totales en el pienso estándar, Lechuga de mar, Wakame y Nori (mg/kg peso seco) Control Lechuga de mar Wakame Nori Esteroles totales 697 333 136 178 Los diferentes tipos de esteroles que contienen los piensos se pueden ver en la Tabla 4.3. Aunque el aporte de esteroles de las algas a los piensos no es importante desde el punto de vista cuantitativo, añaden diferentes tipos que el pienso estándar no posee, como es el caso del fucosterol en Wakame y Lechuga de mar o el desmosterol en Resultados y discusión 110 Nori, datos que coinciden con los encontrados en la bibliografía (Sánchez-Machado y cols. 2004b). Tabla 4.3.- Composición en los diferentes tipos de esteroles (% de esteroles totales) Control Lechuga de mar Wakame Nori Colesterol 16,15 16,24 16,02 24,18 Campestorol 17,27 - - - Stigmasterol 4,61 - - - β Sitosterol 49,96 - 6,76 - D-5-avenasterol 11,98 79,14 - - Fucosterol - 4,63 77,22 - Desmosterol - - - 75,82 Resultados y discusión 111 Vitaminas 4.1.1.4 El elevado contenido en vitaminas es otra característica de las algas, sobre todo en vitamina A y en las vitaminas antioxidantes E y C. Los resultados de este estudio muestran que Nori destaca sobre las demás por su riqueza en vitamina A y B12, aunque también hay que resaltar los valores de las vitaminas C y B6. La Lechuga de mar presenta el mayor contenido en vitamina B1 y la segunda en vitamina E, después de Espagueti de mar, y en vitamina C, después de Nori. Por último, la vitamina B6, es especialmente abundante en Wakame (Tabla 4.4). Datos similares son los mencionados por Mabeau y cols. (1992), MacArtain y cols. (2007) y Bocanegra y cols. (2009). Una de las consecuencias más frecuentes de las dietas vegetarianas es el riesgo de deficiencia de vitamina B12 y por tanto de anemia perniciosa. Existe controversia acerca del aprovechamiento de la vitamina B12 de las algas, especialmente abundante en Nori, como factor antianémico en el consumidor. Así, Dagnelie y cols. (1991) en estudios realizados con Nori y con Spirulina, concluyen que las algas producen análogos no cobalamínicos de la vitamina B12 que no son aprovechables en humanos, por lo que la biodisponibilidad de esta vitamina cuando la fuente son algas es cuestionable. Por el contrario, Rauma y cols. (1995) señalan que el consumo de altas cantidades de Chlorella o de Nori, al margen de otros efectos adversos que puedan derivar de dosis excesivas, se refleja en niveles séricos de vitamina B12 muy superiores a los de los individuos del grupo control, lo que indicaría que ambas algas aportan un suplemento disponible de vitamina B12, extremo del que se podría deducir la conveniencia de la inclusión de algas en la dieta de vegetarianos. Resultados y discusión 112 Tabla 4.4. Contenido en Vitaminas de las algas (mg/kg p.s.). Lechuga de mar Wakame Nori Espagueti de mar Vitamina A (Retinol) 9,58 4,73 23,83 6,69 Vitamina E (α-Tocoferol) 19,7 6,3 9,3 27,1 Vitamina C (Ác. Ascorbico) 94,2 31,0 97,3 61,9 Vitamina B 5 (Ac. Pantoténico) 1,7 2,0 2,7 2,0 Vitamina B6 (Piridoxina) ˂ 0,1 1,5 0,9 ˂ 0,1 Vitamina B 2 (Riboflavina) 2,0 0,7 1,89 0,5 Vitamina B1 (Tiamina) 4,7 0,3 0,4 4,1 Vitamina B 12 (Cobalamina) 0,60 0,16 2,90 0,04 Vitamina B9 (Ác. fólico) 1,08 0,79 ˂ 0,02 1,09 Vitamina B 8 (Biotina) 0,12 0,22 0,10 0,17 Resultados y discusión 113 Minerales 4.1.1.5 Los minerales, al igual que las vitaminas, no tienen una función energética en sí mismos, pero sí están implicados en las reacciones químicas que tienen lugar en la obtención de energía. Participan en el metabolismo de glúcidos, proteínas y grasas, o bien forman parte de vitaminas, hormonas, células sanguíneas, enzimas, etc. Muchos también intervienen a nivel estructural formando parte de huesos, dientes, etc. De los elementos minerales analizados que se muestran en la Tabla 4.5 cabe destacar las cantidades de sodio y potasio, macrominerales muy abundantes junto con calcio, magnesio, yodo y fósforo en comparación con los vegetales terrestres (Bocanegra y cols. 2009; Paiva y cols. 2014). Asimismo es importante la presencia de microminerales como hierro, zinc y manganeso. Estos resultados son similares a los observados por Cofrades y cols. (2010) y Paiva y cols. (2014). Tabla 4.5.- Contenido mineral de las algas (mg/kg) Lechuga de mar Wakame Nori Ramallo de mar Espagueti de mar Calcio 5245 6932 3592 13262 6558 Potasio 15610 56790 16020 7775 80490 Sodio 15950 35110 7282 11350 33720 Magnesio 20940 6302 2339 20275 7323 Hierro 283 79 105 445 41 Zinc 7 39 33 26 21 Iodo 9 96 5 - 92 Manganeso 16 7 25 47 - Fósforo 9 47 32 - 23 Cobre 5 2 6 - 2 Resultados y discusión 114 Los altos niveles de potasio, observados en las algas estudiadas, podrían desempeñar un efecto beneficioso en el organismo ya que se ha demostrado que elevadas dosis de potasio ejercen un efecto protector contra la hipertensión y otros desórdenes cardiovasculares (Preuss y Clouatre 2003). De hecho, a pesar de ser también muy ricas en sodio la relación sodio/potasio es muy baja en la mayoría de las algas estudiadas (1,02 en Lechuga de mar; 0,62 en Wakame; 0,46 en Nori; 1,46 en Ramallo de mar y 0,42 en Espagueti de mar), lo que reduce la retención de fluidos y el incremento de la presión sanguínea sin riesgo de alterar el balance del potasio. Además, se ha demostrado que la fibra de las algas podría retener sodio y ser así excretado con las heces (Ruperez y Saura-Calixto 2001). Por lo tanto, parece que el consumo de algas podría resultar beneficioso en el control de la presión sanguínea (Houston 2014). El hierro es esencial en la nutrición humana y el mineral que con mayor frecuencia es deficitario en todos los grupos de población, culturas y condiciones socioeconómicas. El alto contenido en hierro de las algas, acompañado de una buena biodisponibilidad, podría ayudar a mejorar esta deficiencia tan extendida (García-Casal y cols. 2007; García-Casal y cols. 2009). En general, las algas son ricas en calcio, con mayor presencia en las verdes y pardas en comparación con las rojas. En concreto, Wakame, Espagueti de mar, Lechuga de mar y Ramallo de mar contienen entre cinco y once veces más calcio que la leche, por lo que su consumo podría suponer una muy buena fuente de este mineral. Aunque hay que tener en cuenta que en los derivados lácteos, la presencia en ellos de lactosa y de algunos aminoácidos favorece su absorción intestinal. En las algas también se detecta una elevada presencia de magnesio, especialmente en las pardas y verdes. Concretamente, es en estas últimas donde el porcentaje de magnesio es mayor, hasta diez veces superior a la del alga roja y tres más elevada que en las algas pardas. El magnesio, que contribuye a mantener el potencial eléctrico de las células excitables, es necesario para la síntesis de sustancias Resultados y discusión 115 proteicas, interviene en el control del latido cardíaco y su carencia puede conllevar un incremento de la presión sanguínea. Además, es un importante regulador del nivel de calcio en sangre, de tal manera que la hipomagnesemia es una de las causas de hipocalcemia (Torres y Cannata 2003). Por lo tanto, es importante mantener un cierto balance entre magnesio y calcio, los cuales son especialmente abundantes en las algas objeto de estudio, sobre todo en las verdes y pardas. Las algas han sido descritas como una importante fuente de iodo (Küpper 2015), elemento esencial en la regulación metabólica y el crecimiento. Aunque el consumo excesivo de iodo puede tener efectos tóxicos, esos niveles son difíciles de alcanzar en una alimentación equilibrada. En general los minerales son más abundantes en las algas que en las plantas terrestres (Ito y Hori 1989; Ortega-Calvo y cols. 1993), por lo que diez gramos de alga pueden cubrir hasta un 40 % de las necesidades diarias de minerales dependiendo del mineral y del alga considerada (Rodrigues y cols. 2015). Este alto contenido mineral propio de las algas ya se ve reflejado en los resultados del porcentaje en cenizas mostrado en la Tabla 4.1. Aunque las algas son ricas en una amplia variedad de minerales, también lo son en fibra dietética y en proteínas resistentes a la hidrólisis, que pueden pasar a través del intestino sin ser digeridos y absorbidos, lo que puede causar un descenso en la biodisponibilidad de los minerales al formar una barrera física o constituir quelatos o complejos que dificulten su absorción (Holland y cols. 1991). Por lo tanto, parece que la ingestión de algunas algas como Wakame y Nori podrían influir en la biodisponibilidad de los minerales (Urbano y Goñi 2002). Proteínas 4.1.1.6 La mayoría de las algas pardas tienen menos proteínas que las verdes o rojas, pero, como ya se indicó anteriormente, la composición proteica varía, para una misma alga, según las condiciones ambientales Resultados y discusión 122 Figura 4.4.- Índice de Mitchel En el Índice de Aminoácidos (IAA) y el Índice de Proteínas (IP) se comparan los aminoácidos esenciales con el patrón de proteína basado en los requerimientos indispensables de aminoácidos en adultos establecidos por la FAO/OMS/ONU en 2007. En el IAA, el aminoácido limitante en Lechuga de mar y Nori es la lisina, para Wakame sería la suma de metionina+cisteína, en Espagueti de mar el mayor déficit es para la valina y, por último, en Ramallo de mar ningún aminoácido tiene un IAA inferior a 1,00 (Figura 4.5). El IP se emplea para comparar las proteínas en su conjunto en lugar de los aminoácidos esenciales de forma independiente. Dentro de las algas estudiadas la que mayor IP tiene es Ramallo de mar (1,00) seguido de Lechuga de mar con 0,97; a Nori y Espagueti de mar les corresponde un valor de 0,92 que se sitúa cerca del que tiene el pienso estándar (0,96) y el último corresponde a Wakame con 0,81 (Figura 4.6). 0% 20% 40% 60% 80% 100% Espagueti de mar Ramallo de mar Nori Wakame Lechuga de mar Pienso estándar Resultados y discusión 123 Figura 4.5.- Índice de aminoácidos de las algas con respecto al pienso estándar 0% 50% 100% 150% Histidina Treonina Metionina + Cisteina Valina Lisina Isoleucina Leucina Fenilalanina + Tirosina Espagueti de mar Ramallo de mar Nori Wakame Lechuga de mar Pienso estándar Caseína Resultados y discusión 124 Figura 4.6.- Índice proteico de las algas y pienso estándar Para calcular el valor del Índice de Aminoácidos Corregido (IAA corregido) se utiliza la composición de aminoácidos de las harinas teniendo en cuenta la proporción de alga que contiene cada una de ellas y el resultado de la digestibilidad de las proteínas estudiadas (Coeficiente de Digestibilidad Real). El CDR se muestra en la Figura 4.13. El dato de digestibilidad de la caseína fue extraído de estudios previos realizados en nuestro laboratorio (Taboada y cols. 2006). Como se podía prever, como consecuencia de la mayoritaria proporción de pienso estándar en todos los grupos, el IAA corregido varía poco entre los distintos grupos, con cifras que oscilan entre el 57,43 del grupo de Espagueti de mar y el 68,23 de Wakame. El pienso estándar tiene un valor de IAA corregido de 63,64 (Figura 4.7). En general, en todos los índices evaluados por el método químico estas algas tienen valores muy aceptables. En el índice de 00,5 11,5 Espagueti de mar Ramallo de mar Nori Wakame Lechuga de mar Pienso estándar Caseína Resultados y discusión 125 Mitchel la peor valorada es Ramallo de mar y la mejor es Espagueti de mar, sin embargo si lo que se considera es el índice proteico, en última posición se sitúa Wakame y en cabeza Ramallo de mar. Al tener en cuenta la digestibilidad de la proteína contenida en los diferentes grupos cuando se utiliza el índice de aminoácidos corregido, los valores ya no son tan altos como en los índices anteriormente citados, pero si son muy similares al valor obtenido para el pienso estándar. Figura 4.7.- Índice de aminoácidos corregidos de las algas y pienso estándar con respecto a la caseína En general, las algas que se utilizan en la alimentación poseen una calidad proteica aceptable, un ejemplo de ello es Nori con una composición proteica cercana a la proteína de huevo (Mabeau y Fleurence 1993). 050 100 150 Espagueti de mar Ramallo de mar Nori Wakame Lechuga de mar Pienso estándar Caseína Resultados y discusión 126 Métodos biológicos 4.2.2 Como ya se indicó en el apartado “Dietas y animales de experimentación” de “Material y métodos”, la alimentación de los animales se realiza en dos etapas, una primera en la que se evalúan Lechuga de mar, Wakame y Nori, y una segunda con Espagueti de mar y Ramallo de mar. En cada periodo se incluye un control de pienso estándar (Control I y Control II respectivamente). A efectos de análisis estadísticos cada grupo de algas se enfrenta a su grupo control correspondiente. Cada animal del grupo control que se utiliza en la primera etapa ingiere por término medio 23,41 gramos diarios, y mientras que en la segunda, realizada con animales más pequeños, consumen una media de 16,84 gramos/día. De todas las algas, el grupo en cuya alimentación se incluye Lechuga de mar, con 25,68 gramos diarios de alimento ingerido, es el único que se diferencia significativamente de su grupo control (Figura 4.8). La ganancia diaria de peso no se ve modificada con ninguna de las dietas utilizadas (Figura 4.8). La mayor ingesta del pienso elaborado con Lechuga de mar no se ve reflejada de forma significativa en el peso corporal. La cantidad de nitrógeno ingerido por los animales, que forman parte tanto de los grupos control como de los grupos alimentados con algas se muestra en la Figura 4.9. Como se puede observar, el consumo de nitrógeno es mayor cuando el pienso contiene Nori, Wakame o Lechuga de mar, aunque sólo para esta última lo hace de forma significativa, sin duda debido a un aumento de la ingesta, puesto que los niveles de proteína son muy similares. En el caso de Ramallo y Espagueti de mar, el ligero descenso del nitrógeno ingerido con respecto a su control no es significativo. Resultados y discusión 127 Figura 4.8.- Alimento ingerido y ganancia de peso Figura 4.9.- Nitrógeno ingerido en el período principal Resultados y discusión 128 Los valores de nitrógeno ingerido en el período principal, el nitrógeno eliminado por la orina y el eliminado por la heces junto con los valores del nitrógeno absorbido, se utilizan para determinar los parámetros nutritivos por métodos biológicos. El nitrógeno fecal eliminado durante el período endógeno del grupo que ingiere Nori es de 16,24 mg/día, superior a 10,36 mg/día que se elimina con el pienso estándar, lo que supone un valor de nitrógeno retenido de 392,98 mg/día, también mayor comparado con el del grupo control (325,80 mg/día). En los animales que consumen Espagueti de mar los valores de nitrógeno urinario endógeno y los de nitrógeno absorbido (aparente, real y retenido) son significativamente inferiores a los de sus respectivos controles (Figura 4.10, Figura 4.11, Figura 4.12). Figura 4.10.- Nitrógeno fecal excretado Resultados y discusión 129 Figura 4.11.- Nitrógeno urinario excretado Figura 4.12.-Nitrógeno absorbido Resultados y discusión 130 Entre todos los índices nutritivos determinados: coeficiente de digestibilidad aparente (CDA), coeficiente de digestibilidad real (CDR), índice de utilización proteica neta (UPN), balance nitrogenado (BN) y valor biológico (VB), cabe destacar el parámetro que relaciona el nitrógeno retenido con el nitrógeno absorbido real, esto es el VB, del grupo experimental que ingiere el alga Nori, con un valor de 79,00 frente a un 71,36 del control, quizás debido a un mayor nitrógeno retenido (Figura 4.13). El caso contrario lo presenta el grupo de Espagueti de mar, en el que los valores de nitrógeno absorbido aparente, real y retenido son significativamente más bajos que sus respectivos controles, lo que implica unos índices nutricionales también inferiores (Figura 4.13), agravado por un menor nitrógeno ingerido aunque en este caso la diferencia no es significativa. Todo esto implica un peor aprovechamiento de la proteína dietaria para el grupo en cuya dieta se incluye esta alga. Figura 4.13.- Índices nutricionales Resultados y discusión 131 Otro índice utilizado para la evaluación nutritiva de las proteínas es el coeficiente de eficacia proteica (PER), que relaciona el incremento de peso corporal con la cantidad de proteína ingerida. Salvo para Espagueti de mar, el resto de grupos tienen una menor relación crecimiento/proteína ingerida con respecto a su control, aunque la diferencia sólo es significativa en el caso de Ramallo de mar con una media de 1,81 frente al grupo alimentado con pienso estándar al que le corresponde un valor de 2,26 (Figura 4.14). Figura 4.14.- Coeficiente de eficacia proteica (PER) e Índice de conversión de alimento (IT) Se calcula también el índice de conversión del alimento (IT), que relaciona la cantidad de alimento ingerido con la ganancia de peso de los animales. La consecuencia de la ingesta de harinas que contienen algas se refleja en un valor superior al de sus respectivos controles,