Determinación de resíduos de hidrocarburos aromáticos policíclicos (benzo[a]pireno) en: I. Alimentos ahumados. II. Aditivos para ahumado (aromas de humo)

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (BENZO[a]PIRENO) EN: l. ALIMENTOS AHUMADOS 11. ADITIVOS PARA AHUMADO (AROMAS DE HUMO) MERCEDES SONIA GARCÍA FALCÓN 1996 ----- ----------------- UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (BENZO[a]PIRENO) EN: l. ALIMENTOS AHUMADOS 11. ADITIVOS PARA AHUMADO (AROMAS DE HUMO) MERCEDES SONIA GARCÍA FALCÓN 1996 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (BENZO[a]PIRENO) EN: I. ALIMENTOS AHUMADOS II. ADITIVOS PARA AHUMADO (AROMAS DE HUMO) Memoria presentada por Mercedes Sonia García Falcón en la Universidad de Santiago de Compostela para optar al Grado de Doctor Santiago de Compostela, Diciembre de 1996 RAFAEL CELA TORRIJOS, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA AUTORIZA a Dña. Mercedes Sonia García Falcón a presentar el trabajo titulado "DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE HIDROCARBUROS AROMATICOS POLICÍCLICOS (BENZO[a}PIRENO) EN: l. ALIMENTOS AHUMADOS, II. ADITIVOS PARA AHUMADO (AROMAS DE HUMO)" realizado bajo la dirección de los Dres. D. Jesús Simal Lozano y Dña. ~Asunción Lage Yusty, en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela, en Diciembre de mil novecientos noventa y seis. Fdo. Dr. D. Raf~ Cela Torrijos JESÚS SIMAL LOZANO Y Ma ASUNCIÓN LAGE YUSTY, CATEDRÁTICOS DEL ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA HACEN CONSTAR que la Tesis titulada "DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE HIDROCARBUROS AROMATICOS POLICÍCLICOS (BENZO[a]PIRENO) EN: l. ALIMENTOS AHUMADOS, 11. ADITIVOS PARA AHUMADO (AROMAS DE HUMO)" presentada por la Licenciada en Farmacia Dña. Mercedes Sonia García Falcón, para optar al Grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizada bajo nuestra dirección en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela, en Diciembre de mil novecientos noventa y seis. Fdo: Prof Dr. J. Simal Lozano Fdo: Prof Dra. M.A. Lage Yusty ---"··-------- Deseo expresar mi agradecimiento: A los directores de este trabajo, Dra. Dña. María Asunción Lage Yusty y Dr. D. Jesús Simal Lozano, por la orientación y el apoyo prestados para la realización del nusmo. A todos los profesores y compañeros de este Departamento, especialmente a Dña. Susana González Amigo y a la Dra. Dña. Susana Carril González -Barros, por su dedicación y constante ayuda. Al Departamento de Farmacia Galénica, y en especial a D. Álvaro Ganza González y a Dña. Marta Casalderrey López por su desinteresada colaboración. A la Consellería de Educación e Ordenación Universitaria, por la financiación del proyecto "Investigación de Residuos de Hidrocarburos Áromáticos Policíclicos en Alimentos", que permitió la realización de este estudio, y por la concesión de una beca de Tercer Ciclo durante el bienio 92-94, y de una beca predoctoral desde 1995. Y por último, y muy especialmente, a D. Julio González González por su incondicional apoyo y confianza. A mi Familia ÍNDICES ÍNDICE 1 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS VI ÍNDICE DE TABLAS XI ABREVIATURAS XIV INTRODUCCIÓN 1 l. EL BENZO(A)PIRENO Y LOS HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS 2 1.1 ESTRUCTURA 3 1.2. PROPIEDADES QUÍMICAS 3 1.3. ETIOLOGÍA DE LOS HAP 7 1.3.1. FUENTES NATURALES 7 1.3.2. FUENTES ANTROPOGÉNICAS 7 1.4. PRESENCIA DE LOS HAP EN LOS ALIJMENTOS 8 1.4.1. POLUCIÓN EN ORIGEN 8 1.4.2. POLUCIÓN CAUSADA POR MANIPULACIÓN 9 Y TRATAMIENTO 1.5. TOXICOLOGÍA 22 l. 5 .l. REVISIÓN HISTÓRICA 22 1.5.2. RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD Y JMET ABOLISMO 24 1.5.3. SIGNIFICACIÓN TOXICOLÓGICA PARA EL HOMBRE 1.5.4. EXPOSICIÓN HUMANA A LOS HAP 1.6 LEGISLACIÓN 25 27 29 ÍNDICE DE FIGURAS VIII Figura 25.- Cromatogramas de 0.5 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN (A exc = 296 nm, A em.= 426 nm (verde oscuro)) (A exc = 296 nm, A em = 406 nm (verde claro)); y de la muestra n° 9 (A exc. = 296 nm, A em = 426 nm (azul claro)) (A exc. = 296 nm, A em.= 406 nm (azul oscuro)) 87 Figura 26.- Cromatograma de la muestra n° 20 (Aexc = 296 nm, Aem. = 406 nm) 88 Figura 27.- Cromatograma de la muestra n° 24 (Aexc.= 296 nm, Aem.= 406 nm) 90 Figura 28.- Cromatograma de la muestra n° 48 (Aexc.= 296 nm, Aem.= 406 nm) 91 Figura 29.- Espectros sincrónicos de 2 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra no 20 (azul), realizados mediante HPLC-FL Figura 30.- Espectros de emisión y sincrónicos de 8 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 24 (azul), realizados mediante 93 HPLC-FL 94 Figura 31.- Espectros de emisión y sincrónicos de 16 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 48 (azul), realizados mediante HPLC-FL 95 Figura 32.- Cromatogramas de 10 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN (verde), de la muestra de humo líquido liposoluble (azul) y de la misma muestra sobrecargada con 5 !J.g/kg de benzo(a)pireno (A exc.=296 nm, A em.=406nm) 103 Figura 33.- Espectros de emisión y sincrónicos de 3 !J.g/L de benzo(a)pireno en ACN y de la muestra de humo líquido liposoluble, realizados mediante HPLC-FL 104 Figura 34.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno del DMSO 109 Figura 35.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno del ACN 110 Figura 36.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno del n-hexano 111 ÍNDICE DE FIGURAS IX Figura 37.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en DMSO 114 Figura 38.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en ACN 115 Figura 39.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en nhexano Figura 40.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en DMSO (AA. = 20 nm) (verde), acetona (AA. = 20 nm) (azul) y metanol (AA. = 25 nm) (amarillo), antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno Figura 41.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en DMSO (verde), acetona (azul) y metano} (amarillo), antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno (AA.= 110 nm) Figura 42.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde), benceno (azul) y diclorometano (amarillo), antes 116 117 118 (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno (AA.= 20 nm) 119 Figura 43.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde), benceno (azul) y diclorometano (amarillo), antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno (AA.= 110 nm) 120 Figura 44.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en cloroformo (verde), tolueno (azul) y n-hexano (amarillo), antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno (AA.= 20 nm) 121 Figura 45.- Espectros de fluorescencia sincrónicos de 8 Jlg/L de benzo(a)pireno en cloroformo (AA.= 110 nm) (verde), tolueno (AA.= 100 nm) (azul) y n-hexano (AA.= 110 nm) (amarillo), antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno Figura 46.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en 122 n-hexano, ACN y benceno 128 ÍNDICE DE FIGURAS X Figura 47.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en tolueno, metanol y DMSO 129 Figura 48.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en acetona, cloroformo y diclorometano Figura 49.- Optimización de la proporción de ACN:agua para la retención del 130 benzo(a)pireno en la minicolumna Sep-pack C-18 Plus 137 Figura 50.- A: Espectros de fluorescencia sincrónica de la muestra n° 7 en nhexano antes (verde) y después (azul) del borboteo con nitrógeno (L\A. = 20 nm) B: Espectros de fluorescencia sincrónica de la muestra n° 7 en nhexano antes (verde) y después (azul) del borboteo con nitrógeno (L\A. = 110 nm) 138 Figura 51.- Espectros de fluorescencia sincrónica de 4 Jlg/L de benzo(a)pireno (verde), de la muestra no 2 (azul), de la muestra n° 3 (amarillo) y de la muestra n° 7 (rojo) en n-hexano, antes (A) y después (B) del borboteo con nitrógeno (L\A. = 20 nm) 139 Figura 52.- Derivada de segundo orden de la zona marcada en la figura 51 (B) 140 Figura 53.- Espectros de fluorescencia sincrónica de la muestra no 5 en n-hexano antes (verde) y después (azul) del borboteo con nitrógeno y en DMSO antes (amarillo) y después (rojo) del borboteo con nitrógeno (L\A. = 20 nm) 142 Tabla I.- Tabla 11.- Tabla ID.- Tabla IV.- Tabla V.- Tabla VI.- Tabla VII.- Tabla VIII.- Tabla IX.- Tabla X.- Tabla XI.- ÍNDICE DE TABLAS XI ÍNDICE DE TABLAS Estructura de algunos P AH identificados en los alimentos y su actividad cancerígena Niveles de P AH (J.lg) encontrados en bistec a la parrilla Formación de benzo(a)pireno al freir un alimento en aceite de palma (200 -225°C) durante diferentes periodos de tiempo Efecto de los diferentes modos de cocinado en la formación de benzo( a )piren o Niveles de P AH en diferentes productos ahumados (J.lg/Kg.) Características de las muestras de alimentos analizadas RSD y % R obtenidos en la elución con n-hexano de diferentes cantidades de benzo(a)pireno retenidas en la minicolumna Sep-pack sílica Plus al repetir cada ensayo por sextuplicado RSD y % R obtenidos en el estudio de la extracción de diferentes cantidades de benzo(a)pireno en n-hexano con dimetilsulfóxido al repetir cada ensayo por sextuplicado RSD y % R obtenidos en la elución con n-hexano de diferentes cantidades de benzo(a)pireno retenidas en la minicolumna Sep-pack C-18 Plus al repetir cada ensayo por sextuplicado Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) del benzo(a)pireno en n-hexano obtenidos por espectrofluorimetría sincrónica 4 11 12 12 16 58 67 68 69 (~A. 110 nm) con aplicación de segunda derivada 73 Recta de calibrado del benzo(a)pireno en n-hexano obtenida por espectrofluorimetría sincrónica (~A. 110 nm) con aplicación de segunda derivada 73 Tabla XII.- TablaXID.- Tabla XIV.- Tabla XV.- Tabla XVI.- ÍNDICE DE TABLAS XII Optimización de la eficacia de la columna en función del flujo Características del pico cromatrográfico de benzo(a)pireno según la Farmacopea Europea (EP) Características del pico cromatográfico de benzo(a)pireno según la Farmacopea Americana (USP) Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) del benzo(a)pireno en ACN obtenidos por HPLC-FL O--exc.= 296 y Aem= 406) Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) del benzo(a)pireno en función del % Humedad (p/p) de las muestras 75 77 77 78 79 Tabla XVII.- RSD del método obtenida para la muestra n° 9 (salchicha ''jrankfurt") 83 TablaXVID.- RSD y % R obtenidas al someter seis veces al procedimiento experimental descrito una muestra de salchicha sobrecargada con benzo( a )piren o 8 5 Tabla XIX.- RSD y % R obtenidas al someter seis veces al procedimiento experimental descrito una muestra de palometa sobrecargada con benzo(a)pireno 85 Tabla XX.- Tabla XXI.- Contenido de benzo(a)pireno (Jlg/Kg) y porcentaje de humedad (% p/p) en las muestras de alimentos analizadas RSD y % R obtenidas al someter seis veces al procedimiento experimental descrito una muestra de aroma de humo lipofilico sobrecargada con benzo(a)pireno Tabla XXII.- Espectros sincrónicos óptimos y longitudes de onda de excitación máxima, obtenidos para el benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio 96 105 113 ÍNDICE DE TABLAS XIII Tabla XXIII.- Límites de detección y de cuantificación del benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio, en cada uno de los espectros sincrónicos óptimos antes (LDa y LDa) y después (LDb y LQb) del borboteo con nitrógeno Tabla XXIV.- Rectas de calibrado del benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio correspondientes a cada uno de los espectros sincrónicos 124 óptimos, antes (a) y después (b) del borboteo con nitrógeno 125 Tabla XXV.- Pendientes y coeficientes de regresión (r) obtenidos al representar la variación de la intensidad de fluorescencia (UF) del benzo(a)pireno en los diferentes solventes, frente al tiempo 126 Tabla XXVI.- Características de las muestras de aroma de humo hidrofilico n° 3, 5, 6 y 7. 133 Tabla XXVII.- Recta de calibrado del benzo(a)pireno en n-hexano obtenida por espectrofluorimetría sincrónica (AA. 20 nm) con aplicación de segunda derivada, tras el borboteo con nitrógeno Tabla XVIII.- RSD y % R obtenidas al someter seis veces al procedimiento experimental descrito una muestra de aroma de humo hidrofilico 141 (n° 8) sobrecargada con benzo(a)pireno 143 Tabla XXIX.- Contenido de benzo(a)pireno (Jlg/Kg) en las muestras de aroma de humo hidrofilico analizadas 144 LISTA DE ABREVIATURAS AA.: Intervalo de longitud de onda 1..: Longitud de onda A.em.: Longitud de onda de emisión A.exc.: Longitud de onda de excitación A.max.: Longitud de onda máxima % R: Recuperación por cien []: Concentración ACN: Acetonitrilo ADN: Ácido desoxirribonucleico AHHL: Aroma de humo hidrofílico líquido AHHS: Aroma de humo hidrofílico sólido AHLL: Aroma de humo líquido lipofílico ARN: Ácido ribonucleico B(a)P: Benzo(a)pireno CAT N°: Número en catálogo col.: Colaboradores CPU: Central processing unit DL50: Dosis letal 50 % DMSO: Dimetilsulfóxido FID: Flame Ionization Detector FL: Fluorescencia FLDM: Fluorescence Data Manager GC: Gas Chromatography GPC: Gel Permeation Chromatography HPLC: High Performance Liquid Chromatography IDA: Ingesta diaria admisible LC: Liquid Chromatography LD: Límite de detección LQ: Límite de cuantificación m.h.: Materia húmeda m.s.: Materia seca MFS: Micro Filtration Systems mín: Mínimo MS: Mass Spectrometry ND: No detectable NM: No medible ABREVIATURAS XIV P: Probabilidad PAH: Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PC: Paper chromatography PM: Peso molecular psi: Pound square inches r: Coeficiente de correlación RAM: Random Access Memory RSD: Relative standard desviation SD: Standard desviation SFE: Supercritical Fluids Extraction SRM: Standard Reference Materials SST: System Suitability Test TLC: Thin Layer Chromatography Tr: Tiempo de retención UF: Unidades de fluorescencia UV: Ultravioleta Vis.: Visible WOW: Winner on Windows X: Media (ORGANISMOS) ABREVIATURAS XV ACGm: American Conference of Governmental Industrial Hygienist ACS: American Chemical Society AOAC: Association of Official Analytical Chemists APHA: American Public Health Association ASTM: American Society for Testing Materials A WW A: American Water Association BCR: Bureau de Communauté de Référencia CAS: Chemical Abstract Service CEE: Comunidad Económica Europea EP: European Pharmacopeia EPA: Environmental Protection Agency FAO: Food and Agriculture Organization IARC: International Agency for Reseach on Cancer IUPAC: International Union ofPure and Applied Chemistry NBS: National Bureau of Standards NIOSH: National Institute for Occupational Safety and Health NIST: National Institute of Standards and Technology OMS: Organización Mundial de la Salud OPS: Organización Panamericana de la Salud OSHA: Occupational Safety and Health Administration SEO: Sociedad Española de Oxigeno UE: Unión Europea U SEPA: United States Environmental Protection Agency USP: United States Pharmacopeia WHO: World Health Organization WPCF: Water Pollution Control Federation ABREVIATURAS XVI INTRODUCCIÓN Introducción 8 La mayoría de los P AH se originan en: -Industria: producción de alúmina, acero, asfalto, hierro, ruptura catalítica del petróleo crudo, producción de coque y hollín, etc. -Calefacciones: calderas de calefacción central, chimeneas, estufas de carbón, madera, gas, fuel-oil, etc. -Incineraciones: municipales e industriales, combustión de residuos, quema de rastrojos, praderas, etc. -Transporte: vehículos de gasolina y diesel, abrasión de las llantas de los coches, etc. -Accidentes: de especial importancia los de buques petroleros, en los que, además del gran impacto ambiental que suponen, pueden producirse incendios en los que se generan cantidades elevadas de P AH, como ocurrió con el buque "Aegean Sea", que naufragó en la ciudad de La Coruña, próximo a la Torre de Hércules en diciembre de 1992. -Humo de tabaco. 1.4. PRESENCIA DE LOS PAH EN LOS ALIMENTOS La polución de los alimentos puede producirse tanto en origen (procesos de deposición atmosférica), como durante su manipulación y procesado. 1.4.1. POLUCIÓN EN ORIGEN Todos los procesos de combustión espontáneos, y/o provocados de forma intencionada liberan grandes cargas de P AH a la atmósfera, dispersándose en el medio ambiente. Como consecuencia pueden ser introducidos en la cadena alimentaria. La deposición atmosférica esta considerada como la principal fuente de contaminación de vegetales. Evidencia de ello es que las plantas de hoja ancha y gran superficie (espinacas, lechugas, coles ... ), contienen mayores cantidades de P AH que los vegetales de hoja estrecha, lo que indica una correlación entre la superficie de la planta y la absorción de P AH atmosféricos. Este fenómeno resulta mucho más importante en las grandes zonas industriales y a lo largo de las autopistas, donde la contaminación de los vegetales puede llegar a ser diez veces superior a la de las zonas rurales (DERACHE, 1990; MENZIE y col., 1992). Estudios realizados en moluscos, encuentran variaciones considerables en los niveles de P AH en función del grado de contaminación del lugar del muestreo; así, las concentraciones de P AH en mejillones recogidos en áreas crónicamente contaminadas, llegan a ser de seis a cincuenta veces superiores a los recogidos en zonas más limpias. (SCHEKATURINAy col., 1995). Los masivos vertidos de petroleo al mar durante la denominada "Guerra del Golfo" en 1991, provocaron considerables incrementos en el contenido de estos residuos en los organismos de la zona, evaluándose la media total de P AH en diferentes muestras de pescados, en 112.72 Jlg/Kg (expresado en materia seca), siendo los hidrocarburos más frecuentemente detectados el pireno y fenantreno. (FOOD RESEARCH INSTITUTE, 1995). 1.4.2. POLUCIÓN CAUSADA POR MANIPULACIÓN Y TRATAMIENTO Frecuentemente se someten los alimentos a una serie de tratamientos, tanto fisicos (mecánicos y/o térmicos) como químicos. Además pueden sufrir, como última transformación, preparaciones culinarias más o menos elaboradas, que implican un tratamiento térmico severo. Estos procesos pueden añadir una polución suplementaria, en ocasiones importante, a la preexistente en el alimento bruto. Hay tres grandes fuentes responsables de la presencia de P AH en los alimentos por causa de las manipulaciones a que son sometidos: los tratamientos térmicos, las sustancias derivadas del petróleo utilizadas en tecnología alimentaria y el ahumado (DERACHE, 1990). 1) Tratamientos térmicos Distintos trabajos experimentales han estudiado la formación de P AH durante la pirólisis de glúcidos, lípidos y proteínas, así como de aminoácidos y J3-caroteno. Los principios inmediatos cuando se calientan a 300 oc no producen PAH, pero a 500-700 oc se detecta benzo( a )piren o entre otros 19 P AH identificados. Otros autores detectan la presencia de concentraciones bajas de P AH durante el calentamiento del almidón en presencia de aire a 370 °C, y más elevadas a temperaturas de 650 oc (GUNTHER y BUZZETTI, 1965). En los lípidos calentados a 400 oc se detectan cantidades traza de Introducción 1 O P AH, pero a 700 oc se obtienen hasta 100 ¡.tg/Kg de P AH. En cambio, el colesterol produce cantidades de P AH 1 O veces superiores en las mismas condiciones; la hipótesis de la intervención de su estructura cíclica podría explicar este fenómeno. Finalmente el 13-caroteno solo genera cantidades mínimas de estos P AH. Es decir, que la temperatura de piró lisis tiene una función determinante en la pirosíntesis de los P AH y los mejores precursores son los lípidos. Por otro lado, los P AH se pueden formar durante la combustión del carburante usado y quizá más importante, se forman también cuando la grasa fundida gotea sobre el mismo. Los PAH formados en la pirólisis de la grasa son difundidos a la atmósfera y parcialmente depositados en la superficie del alimento (DERACHE, 1990; MILLER, 1987). La industria alimentaria utiliza diversos tratamientos térmicos en ooeraciones de transformación de materias primas como atomización, hidrogenación de grasas, torrefacción del café, tostado ... Los métodos culinarios utilizan técnicas de calentamiento poco controladas: grill, horno, asado, fritura, barbacoa, cocción con una fase lipídica ... La incidencia de estas prácticas sobre la aparición de P AH ha sido estudiada por numerosos autores (LIJINSKY y SHUBIK, 1964, 1965; LIJINSKY y ROSS, 1967; HOWARD Y FAZIO, 1980; LAWRENZE, 1984; MAGA, 1986; LIJINSKY, 1991; SIVASWAMY y NAGARAJAN, 1991 b; SAINT-AUBERT y col, 1992), concluyendo que son tres los factores que condicionan principalmente el grado de contaminación: -La naturaleza de la fuente de energía utilizada. Si la fuente consiste en un proceso de combustión, como ocurre en hornos de gas, carbón, barbacoa, se produce humo que entra en contacto con los alimentos y puede dar lugar a la aparición de P AH. El calentamiento eléctrico es una técnica más limpia. De entre los combustibles usados normalmente en la parrilla, el carbón vegetal produce sólo pequeñas cantidades de P AH (0-1 ¡.tg/Kg), mientras que cuando el fuego se hace con maderas de abeto o de pino, se encuentran niveles algo más elevados. Distintos autores identificaron P AH en carne asada a la parrilla (Tabla 11). Introducción 11 TABLA 11. -Niveles de P AH (~g) encontrados en bistec a la parrilla (LIJINSKY y SHUBIK, 1964) Compuesto Por bistec PorKg {p.g) (J.12) Antraceno 5 4.5 Benzo( a )antraceno 5 4.5 Benzo( a )pireno 9 8 Criseno 1.5 1.4 Fluoranteno 21 20 Fenantreno 12 11 Piren o 19 18 -El contacto más o menos directo con la fuente de calor. Se ha comprobado que cuando la carne se pone en contacto directo con la llama de fuego de leña se forman cantidades significativas de PAH (entre 6 y 212 ~g benzo(a)pireno/Kg), teniendo en cuenta que el rescoldo del fuego emite solo moderadas cantidades, 1-25 ~g benzo(a)pireno/Kg. El contenido en grasa de la carne parece ser de gran importancia. Esto es puesto en evidencia cuando se utiliza un combustible "limpio", tal como el carbón vegetal. Cuanto más gotee la grasa sobre el combustible, más P AH pueden formarse y depositarse en la carne. Incrementando el contenido de grasa, se observa un claro incremento de los P AH formados. Esto se puede minimizar usando parrillas especiales que eviten el goteo de la grasa o evitando la llama directa. SAINT -AUBERT (1992) evalúa la formación de P AH en alimentos cocinados en dos tipos de barbacoas geométricamente distintas, una horizontal convencional y otra vertical, en la que se evita el goteo de la grasa sobre la fuente de calor, siendo la producción de hidrocarburos de 1 O a 30 veces más grande en la primera que en la segunda. También el tiempo de exposición del alimento al fuego y la proximidad de la fuente de calor son factores a tener en cuenta (Tabla Ill y IV). Introducción 12 TABLA 111Formación de Benzo(a)pireno al freír un alimento en aceite de palma (200225 °C) durante diferentes periodos de tiempo (SIV ASW AMY y col, 1991 ). Tiempo Carne de carnero Carne de pollo (min) (J.Lg/Kg) ~ 10 102 ND 15 195 118 20 332 192 25 471 272 TABLA IV -Efecto de los diferentes modos de cocinado en la formación de Benzo(a)pireno (SIVASW AMY y col, 1991 a). Carne de camero Carne de ollo * Durante 4 minutos **Durante 15 mina 121 oc -El control de la temperatura. Microondas* A presión** 63 17 47 7 Cuando en los procedimientos habituales de preparación de los alimentos se aplican temperaturas de 300-350 °C, sin riesgo de destrucción del producto, no hay producción de P AH; pero cuando no se controlan los parámetros de cocinado, son frecuentes carbonizaciones superficiales y se alcanzan localmente temperaturas que favorecen la formación de P AH. 2) Sustancias derivadas del petróleo utilizadas en la tecnología alimentaria Cantidades importantes de parafinas y aceites minerales se utilizan para la lubricación de piezas mecánicas (que pueden ser puestas en contacto con los alimentos) y para el revestimiento interno de sistemas de empaquetamiento de cartón y polietileno, así como para desmoldar pasta de pan, galletas, o para proteger fruta y huevos contra la desecación, recubrimiento de depósitos de agua, tuberías, etc. Estos derivados pueden estar polucionados con P AH (HAENNI, 1968). Introducción 13 3)Ahumado El hombre aprendió pronto a usar la madera para calentarse y para cocinar los alimentos, y utilizó el humo de su combustión para la conservación de los mismos. El consumo de alimentos ahumados crece día a día, ya no sólo por motivos de conservacion, sino porque las características organolépticas de estos productos son muy apreciadas por los consumidores. El humo se sabe que contiene cantidades apreciables de los diferentes P AH, habiéndose realizado numerosos trabajos con el objeto de controlar las condiciones de producción del mismo, de forma que la formación simultánea de estos hidrocarburos sea mínima. Últimamente han surgido nuevas técnicas de ahumado, como el ahumado líquido, cuyo efecto conservador dista mucho de aquel que poseían los productos ahumados en la antigüedad. -Ahumado natural El humo se produce por combustión de la madera, que puede ser de distintos tipos. Se admite que las maderas duras son mejores que las blandas, ya que éstas últimas parece ser que generan más cantidad de hollín e imparten sabores resinosos. Las maderas duras producen más cantidad de ácidos por su mayor contenido en hemicelulosas, bajando el pH y obteniendo así productos bacteriológicamente más estables, factor que podría explicar su uso tradicional, aunque la situación es compleja y las opiniones no son unánimes. Las maderas más utilizadas son el haya, el pino, el roble, la encina, el enebro. La forma como arde la madera y el tamaño de partícula de la misma tienen influencia sobre la temperatura de combustión y consecuentemente en la composición del humo. El humo contiene hasta un millar de compuestos de los cuales sólo un tercio han sido identificados. La combustión completa de la madera conduce a anhídrido carbónico, y la incompleta lleva a la formación de humo, como resultado de reacciones de descomposición (oxidación, polimerización, condensación) muy complejas a partir de los constituyentes esenciales de la madera : celulosa, hemicelulosa y lignina (GILBERT y KNOWLES, 1975). Introducción 14 La pirólisis de la celulosa, se inicia con una hidrólisis ácida a glucosa seguida de deshidratación a (3-glucosano. En la pirólisis se produce ácido acético y sus homólogos y ocasionalmente pequeñas cantidades de furanos y fenoles. La estructura de la hemicelulosa depende de su fuente, las maderas duras son ricas en pentosanas, mientras que en las blandas predominan las hexosanas. Las hemicelulosas son las menos estables al calor de los componentes de la madera y se descomponen hasta furano y ácidos carboxílicos. De la fracción de la lignina dependen los componentes más importantes del ahumado, en particular los fenoles y ésteres fenólicos, tipificados como guayacol (en maderas blandas) y siringol (en maderas duras). Entre los constituyentes del humo se pueden citar: -fenoles (unos 50 identificados) -carbonilos (cetonas y aldehidos, unos 70) -ácidos (unos 20) -furanos (unos 10) -alcoholes y ésteres (unos 10) -lacto nas (más de 1 O) -hidrocarburos aromáticos policíclicos (unos 30) En la Figura 4, se muestra un hipotético esquema para la formación de benzo(a)pireno. La inicial rotura de sustancias volátiles que se originan en la descomposición de la celulosa, hemicelulosa y lignina, bajo condiciones de pirólisis da radicales metileno e hidrógeno. La dimerización de dichos radicales a etileno y sustancias de polimerización, delación y deshidrogenación, produce el benzo(a)pireno. También los otros P AH pueden formarse por extensión de esta hipótesis, en base al ataque del naftaleno por los radicales mencionados, seguido de ciclodeshidrogenación (Figura 5) (TILGNER,1968 y 1969; MULTON, 1987). En 1954 se detectó por primera vez la presencia de benzo(a)pireno en productos ahumados, realizándose desde entonces numerosos trabajos en los que se estudia la contaminación de estos alimentos por los diferentes P AH (BAILE Y Y DUNGAL, 1958; HOWARD y col., 1966 ayb; MASUDAyKURATSUNE, 1971; TOTH, 1971 y 1972; Benzo(a)pireno Introducción 15 00 / Figura 4.- Formación del benzo(a)pireno a partir de productos de descomposición de la celulosa, hemicelulosa y lignina Naftaleno / \ Fluoranteno Fenantreno Figura 5.- Formación de hidrocarburos aromáticos policíclicos a partir del naftaleno Introducción 16 POTTHAST y EIGNER, 1975; FRETHEIM, 1976; SAGREDOS y col., 1981; JOE y col., 1984; ALONGUE, 1988; HANSEN y col., 1992; YUCO YABICU y col., 1993; GOMAA y col., 1993; AKPAN y col., 1994). En los alimentos ahumados se identificaron unos 27 P AH, algunos de los cuales se recogen en la tabla V. Usualmente los compuestos de 3 anillos ( antraceno y fenantreno) son productos muy comunes, presentándose en concentraciones más altas que los de 4 (benzo(a)antraceno y criseno). Afortunadamente, los PAH con 5 y 6 anillos, entre los que se encuentran los más potentes carcinógenos, se forman en muy baja cantidad. El coroneno, de 7 anillos bencénicos, a menudo se encuentra en altas concentraciones, pero no es carcinógeno ( LIJINSKY, 1991). Tabla V - Niveles de P AH en diferentes productos ahumados (J.lg/Kg) PAH Queso Pollo Jamón Bacon Salchichas SemiOstras Pescado Chedder ahumado blanco Fenantreno 10.1 1.3 - - 1.7 1.9 14.5 - Fluoranteno 3.5 1.0 1.2 1.1 0.2 0.2 15.4 3.2 Pireno 7.0 1.1 1.7 1.1 0.3 0.3 11.0 2.8 Benzo( a)antraceno 0.8 -0.6 0.4 - - 5.9 - Benzo(b )fluoranteno 0.4 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 3.2 0.3 Benzo( e )pireno 4.8 0.8 1.4 0.5 -0.2 36.6 3.5 benzo( a )pireno 0.5 0.1 0.2 0.1 - - 1.9 - Dibenzo( a, h)antraceno 0.1 0.1 - - - - 0.7 0.5 Indeno( 1, 2, 3cd)pireno 0.3 -0.2 -0.2 - 1.3 0.7 Benzo(g, h, i )perileno 0.4 - 0.1 -0.2 0.3 2.0 - dibenzo( a,i)pireno - - - - 0.4 - - - Coroneno 0.5 - - - 0.4 -- - El benzo(a)pireno se ha utilizado históricamente como representante de todo el grupo de PAH debido a que presenta un gran potencial carcinogénico. A excepción del dibenzo(a,h) antraceno (BORGET y col., 1993), todos los demás PAH carcinógenos son mucho menos potentes que el benzo( a )piren o. Salmón - 1.3 1.1 - 0.3 2.5 - - - - - - Introducción 17 Condiciones de generación del humo: En las generaciones convencionales (Figura 6), el humo se produce por combustión lenta de virutas de madera secas o húmedas sobre un suelo cuya temperatura es generalmente muy elevada (700-800 °C). Este humo es rico en alquitrán y P AH. Refrigerante Carretilla Resistencia e 1 éctrica ---+.1:_:.:.:._ 1 Tabique~- ~--:iit-:--~"""*___,í:-1 1 ~~~~---- Serrín Aire Regulador de humedad~~--------~~~----~~--~ Resistencia eléctrica Figura 6.- Generador de humo convencional acoplado a un ahumadero tradicional Se ha comprobado que la temperatura de generación del humo influye en su composición, incrementándose los PAH linealmente en el rango de 400 a 1000°C. De manera que cuando se obtiene el humo a temperaturas más bajas, de 300 a 400°C, se consigue una mínima producción de PAH (MILLER,1987). Con el fin de proporcionar humos de mejor calidad y a temperaturas más bajas, se han puesto a punto técnicas más satisfactorias, entre ellas: -Producción de humo húmedo (envío de vapor bajo una débil presión) Introducción 24 Si bien la actividad cancerígena no es patrimonio exclusivo de los compuestos del grupo de los hidrocarburos aromáticos altamente condensados, hay que hacer resaltar que es precisamente en este grupo en el que se encuentran los agentes cancerígenos más activos (FABRE y TRUHAUT, 1976). 1.5.2. RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD Y METABOLISMO Las características estructurales críticas que se relacionan con el potencial carcinogénico de los P AH son la forma y tamaño molecular y la presencia o ausencia de sustituyentes en determinadas regiones del anillo bencénico. En la Tabla 1 se recogen la actividad carcinogénica de algunos P AH en relación con su estructura . Los P AH son muy solubles en lípidos y se absorben con rapidez a nivel del intestino y los pulmones de los mamíferos, distribuyéndose posteriormente por vía sanguínea a una gran variedad de tejidos, con una particualar implicación a localizarse en el tejido adiposo. De todas formas esta tendencia no es muy manifiesta debido a su rápido metabolismo a nivel de los microsomas, como consecuencia del cual se generan productos de excreción urinaria y sobre todo biliar y fecal como son dihidroles, fenoles y quinonas libres y conjugadas, los cuales pueden ser mutagénicos y carcinogénicos (DERACHE, 1990). El metabolismo de los PAH se produce vía citocromo P-450 dependiente del sistema enzimático presente en el retículo endoplasmático de las células de los mamíferos y más abundantemente en el hígado, e incluye como primeras etapas la oxidación o la hidroxilación (SHAW y col., 1994). Los epóxidos o fenoles resultantes pueden sufrir detoxificación y producir glucurónidos, sulfatos o conjugados con el glutation. Algunos de los epóxidos formados, pueden a su vez, ser metabolizados a dihidrodioles, los cuales pueden experimentar conjugación para formar productos de detoxificación solubles, o bien oxidación dando diol-epóxidos. Estos compuestos son considerados los carcinógenos últimos en los casos en los que se observa carcinogenicidad (WHO, 1984). Los carcinógenos últimos son los metabolitos reactivos con capacidad para construir enlaces covalentes con macromoléculas e iniciar la respuesta carcinogénica. Sus precursores metabólicos inmediatos se denominan carcinógenos próximos. La mayoría de los carcinógenos, especialmente los del tipo de los P AH, son en sí mismos químicamente inertes; en su estructura está presente la información de la actividad carcinogénica, pero para llegar a ser reactivos, deben ser activados metabólicamente. La relación estructura-actividad de los carcinógenos órgano-químicos está basada en la Introducción 25 naturaleza electrofilica de los mtsmos, o bien, de alguno de sus metabolitos. La formación de enlaces covalentes con centros nucleofilicos de macromoléculas biológicas, como el ARN, las proteínas, y especialmente el ADN, es el proceso llave de la carcinogénesis química (BORGERT y col., 1993; KATIY AR y col., 1993) 1.5.3. SIGNIFICACIÓN TOXICOLÓGICA PARA EL HOMBRE El riesgo para la salud que provoca la presencia de P AH en los alimentos, está relacionado básicamente con la posibilidad de que estas sustancias causen efectos negativos después de periodos prolongados de exposición, ya que.. salvo en circunstancias excepcionales, como puede ser una polución a gran escala, es muy poco probable que smjan cuadros agudos por estas sustancias a los niveles en que se encuentran en los alimentos. El establecimiento de valores guía, por debajo de los cuales no tengan acción, es complicado, debido fundamentalmente al desacuerdo en cuanto a la relevancia, validez y aceptabilidad de los datos científicos y, especialmente , a los problemas que plantea la extrapolación de datos toxicológicos de los animales al hombre. Para evaluar los riesgos de la exposición humana a los P AH, la USEP A categoriza estos compuestos en carcinogénicos y no-carcinogénicos, y el procedimiento a seguir en cada caso es distinto (BORGERT y col., 1993). Los efectos no-carcinogénicos se estiman mediante el llamado "indice de peligrosidad", que corresponde a la relación existente entre la ingesta media diaria y la ingesta diaria admisible para cada compuesto químico. La dosis diaria admisible para el hombre se calcula dividiendo la dosis sin efectos negativos en los animales (o en el hombre, cuando se dispone de datos) por un factor de seguridad llamado factor de incentidumbre. Este factor de seguridad responde a la incertidumbre asociada a la extrapolación de los datos animales al hombre (BORGERT y col., 1993), pero su empleo no tiene en cuenta la pendiente de la curva dosis-respuesta y, además, asume la existencia de una dosis umbral por debajo de la cual no se presentan efectos negativos, razones por las que su uso ha sido muy criticado (OPS, 1985). Introducción 26 La presencia de este umbral para los efectos tóxicos se ha discutido muchísimo (OPS, 1985). En algunos casos, la presencia de desintoxicaión metabólica, mecanismos de restauración y procesos de eliminación indica que tal vez exista un nivel umbral, mientras que en otros casos parece que una sola molécula de una sustancia química puede iniciar un proceso que quizás lleve progresivamente al efecto nocivo observado, es decir no hay un nivel umbral cuando la molécula puede llegar al receptor apropiado. Esto último, es especialmente cierto en el caso de los P AH potencialmente carcinógenos y mutágenos, para cuya evaluación de riesgos para la salud humana se asume que solo es posible garantizar seguridad cuando el grado de exposición equivale a cero, aceptándose por tanto, la imposibilidad de fijar un nivel umbral, una dosis sin efecto, debido a los diversos factores que intervienen y que son poco conocidos (DERACHE, 1990): 1) las causas multifactoriales de los cánceres humanos, 2) los fenómenos de co-cancerogenicidad o incluso de la inducción debida a sustancias no cancerígenas, 3) las dificultades de extrapolación del animal al hombre. Por ello y debido a la falta de metodologías que permitan una evaluación más precisa de los riesgos, los Organismos Internacionales han adoptado una actitud prudente frente a los P AH, tanto de los cancerígeno efectivos, activos por vía oral u otras vías, como de los que no son activos por ellos mismos pero pueden actuar como cocancerígenos, estos últimos más frecuentes. El 3 7° Comité Mixto F AO/OMS de Expertos en aditivos alimentarios ( 1991) en la evaluación del benzo(a)pireno, reconoció que éste era sólo uno más de los 100 compuestos pertenecientes a la familia de los P AH encontrados en los alimentos y que éstos se debían considerar como grupo. Dicho producto administrado por vía oral a ratones, ocasionó tumores del cardias y pulmones, y en ratas, los pocos estudios realizados mostraron tumores de esófago, cardias y glándula mamaria. Se han observado tumores a nivel del tracto digestivo en roedores, por administración de varias dosis que en conjunto representan unos 40 mg/Kg de P AH cancerígenos. Aunque dichas dosis son prácticamente inalcanzables teniendo en cuenta la esperanza de vida actual, si hay que considerar la posible presencia de "promotores" y factores nutricionales que pueden incrementar los efectos tóxicos. Introducción 27 El Comité señaló, que el Organismo Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer había encontrado pruebas poco fehacientes de la carcinogenicidad de esta sustancia en el ser humano, pero suficientes para comprobar su carcinogenicidad en animales y su actividad en pruebas breves de genotoxicidad. El Comité estimó la ingesta diaria de benzo(a)pireno, mediante datos de otros estudios sobre la concentración presente en los alimentos. Esos datos demostraron que existen amplias concentraciones de dicha sustancia en los alimentos y que éstas dependen de factores tales como el lugar en el que se produjeron (zona industrializada o no), el método de elaboración (ahumado o secado) y la forma en que se cocinaron (asados con carbón). A su vez, la ingesta dietética varió mucho y algunos consumidores estuvieron expuestos a altas concentraciones de estos productos. Se debe por tanto reducir la exposición al benzo(a)pireno y otros PAH. Además la exposición al primero constituye sólo una mínima parte de la exposición de los consumidores a los segundos y, otros compuestos de esta clase tienen propiedades toxicológicas similares a las del benzo(a)pireno, y por tanto pueden contribuir al riesgo carcinógeno en general. Las medidas a tomar a nivel individual serían: -lavado de fiutas y verduras, para retirar cualquier polución de la superficie. -retirar el exceso de grasa de la carne para asar -evitar en la preparación de los alimentos su contacto directo con la llama Las industrias pueden tomar otras medidas como: -conversión a calentamiento indirecto para el secado de los alimentos -uso de tostadores con combustible distinto de carbón -uso de envolturas protectoras cuando se ahuman los alimentos -observación de los límites de las concentraciones de P AH en los aditivos alimentarios. 1.5.4. EXPOSICIÓN HUMANA A LOS PAH La exposición del hombre a los P AH se produce en forma muy variada, dada la ubicuidad de estos compuestos en el medio ambiente en general, ubicuidad que es debida fundamentalmente a un fenómeno de diseminación que tiene lugar a partir de un foco principal: el aire. Los PAH liberados en la atmósfera, como consecuencia de los distintos Introducción 28 procesos de combustión expontanea o provocada, sufren deposición atmosférica y entran en contacto con el agua, suelos y plantas, introduciendo así en la cadena alimentaria. Así pues, la exposición del hombre a los PAH en general y al benzo(a)pireno en particular, se produce basicamente por medio de los alimentos, el agua y el aire (OPS, 1985). En todos los casos, la contribución relativa del agua potable a esta exposición se ha estimado entre el 0.1 y el 0.3% del total de los PAH ingeridos. Se ha calculado que la exposición a los PAH en el aire constituye el 0.9 % de la exposición total. En consecuencia los alimentos contribuyen en casi el 99 % de toda la exposición a P AH. Los niveles de contaminación medidos en los diferentes tipos de alimentos pueden determinar una sobrestimación de la contaminación real de nuestra alimentación, debido a que siempre se consideran las situaciones más desfavorables: ahumado y tratamiento térmicos severos, alimentos producidos en zonas contaminadas ... MENZIE y col. (1992) evaluaron la dosis potencial de PAH cancerígenos en tres dietas tipo estadounidenses, entendiendo por dosis potencial la cantidad ingerida y absorbida asumiendo una biodisponibilidad del 100 %. -Dieta media: La ingesta de P AH cancerígenos se estima entre 1-5 f.lg/día, siendo los cereales no refinados y las carnes cocinadas los alimentos que más contribuyen. -Dieta rica en carne: La dosis potencial de P AH en este tipo de dieta es mayor, del orden de 6 a 9 f.1g/día, siendo en este caso las carnes ahumadas o a la parrilla, y los pescados, las mayores fuentes de contribución. -Dieta vegetariana: Pueden llegar a contener mayores cantidades de hidrocarburos que las dietas medias siempre que incluyan vegetales con grandes hojas (espinacas, acelgas, lechugas, coles ... ) y cereales no refinados. Este hecho se debe, como se ha explicado anteriormente, a la contaminación de los vegetales debido a la deposición atmosférica. Los cereales contribuyen en gran medida a la ingesta de P AH en cualquiera de las tres dietas estudiadas, observándose que este aporte es mayor cuando los cereales no sufrieron refinado. De todas formas, no quiere decir ésto que contengan grandes cantidades potenciales P AH, sino que los cereales constituyen el componente mayoritario del total de la dieta. Introducción 29 En cuanto a la dosis potencial global de P AH carcinógenos (considerando las diferentes vías de entrada), según estos autores, se estima en una media de 3f..lg/día y un máximo de 15 J..lg/día para varones adultos no fumadores, dosis que puede verse aumentada considerablemente, llegando incluso a duplicarse. en el caso de fumadores sin filtro. LODOVICI y col. (1995) evalúan las dosis medias diarias de PAH ingeridas por un consumidor italiano, estimando en este caso que la ingesta diaria de P AH totales debida a los alimentos es de 3 J..lg/día, contribuyendo los cancerígenos en 1.4 f..lg/día. Los resultados confirman que al igual que en la dieta estadounidense, son los cereales y los vegetales los que aportan mayores concentraciones de estos tóxicos a la dieta. Por el contrario alimentos que contienen altas dosis potenciales de P AH, como son las carnes cocinadas a la barbacoa o a la parrilla y los ahumados, solo contribuyen marginalmente al total ingerido,por el bajo consumo de estos alimentos en Italia. También es interesante resaltar que en la dieta italiana, las bebidas constituyen un aporte importante, debido al considerable consumo de café. 1.6 LEGISLACIÓN Los P AH son objeto de disposiciones específicas en algunos países, mientras que en otros están incluidos en el grupo particular de sustancias cancerígenas o dentro del grupo de sustancias de riesgo. El Comité Mixto F AO/OMS de Expertos en Aditivos alimentarios en su 31 o Informe (1987) consideró el uso de aromas de humo de forma genérica, teniendo en cuenta que reemplazan las técnicas tradicionales de ahumado y que ello presenta una mejora definitiva, puesto que durante la producción de sabores se elimina un gran número de compuestos potencialmente tóxicos. El Comité consideró así mismo que quizá no sea posible asignar un IDA a tan complejo grupo de productos, y concluyó que los sabores de humo para los que existen normas apropiadas 1se podrían emplear provísionalmente para dar sabor a los alimentos sometidos tradicionalmente a ahumado. En la CEE (actualmente la UE), la Directiva 88/388 del Consejo de 22 de junio de 1988 referida a los aromas que se utilizan en los productos alimenticios, entiende por aroma de humo, un extracto de humo utilizado en los procedimientos tradicionales de ahumado, y establece los contenidos máximos de determinadas sustancias indeseables Introducción 30 presentes en los productos alimenticios consumidos sin preparac10n y debidos a la utilización de aromas, limitando el benzo(a)pireno a un máximo de 0.03 J.lg/Kg en productos alimenticios y bebidas. Esta normativa ha sido adoptada con posterioridad en España, en el Real Decreto 1477/1990 de 2 de noviembre, por el que se aprueba la Reglamentación TécnicoSanitaria de los aromas que se utilizan en los productos alimenticios y de los materiales de base para su producción. En España está permitido el uso de 2 aditivos: 41700000 (humo natural extracto) y 4170000 1 (humo artificial) que pueden ser utilizados en determinados derivados cárnicos y quesos (MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO, 1987). En estos últimos.la Norma de calidad para quesos y quesos fundidos destinados al mercado interior (ORDEN de 29 de noviembre de 1985 y 3 de mayo de 1988) y, exclusivamente; para quesos curados, admite dentro de los coadyuvantes tecnológicos el proceso de ahumado1 indicando que el humo puede ser aplicado directamente a la corteza en el proceso de ahumado sin que la concentración de 3,4-benzopireno sea superior a 0.01 ppm en la misma,,y siempre que no se utilice para enmascarar defectos. La Directiva 91/493/CEE de 22 de julio por la que se fijan las normas sanitarias aplicables a la producción y puesta en el mercado de los productos pesqueros establece, dentro de los requisitos para productos transformados que "las operaciones de ahumado deberán realizarse en un local separado o emplazamiento destinado al efecto que, en caso necesario, estará provisto de un sistema de ventilación que impida que los humos y el calor de la combustión afecten a los demás locales y emplazamientos en los que se preparen, transformen o almacenen los productos pesqueros. a) Los materiales empleados para la producción de humo para el ahumado de pescado1deberán almacenarse apartados de la zona de ahumado y utilizarse de forma que no contaminen los productos. b) Deberán prohibirse los materiales empleados para la producción de humo por combustión de madera que haya sido pintada, barnizada, encolada o que haya sufrido cualquier tratamiento químico para su conservación. e) Tras ser ahumados, los productos deberán enfriarse rápidamente a la temperatura necesaria para su conservación antes de su embalaje." Introducción 31 La presencia de estos compuestos en el resto de los alimentos no está sometida en nuestro país a ninguna reglamentación, si bien en la CEE se proyecta fijar como Límite Máximo Residual (LMR} para el benzo(a)pireno, un máximo de 1 f.1g/Kg y prohibir prácticas drásticas como el calentamiento directo a la llama; este mismo requisito ya ha sido establecido por otros países como la República Federal Alemana y Austria (DERACHE, 1990). 1.7. FICHA TÉCNICA DEL BENZO(a)PIRENO"' SINÓNIMOS: Benzo(d,e,f)criseno; 1,2-benzopireno; 3,4-benzopireno; 6,7-benzopireno; 3, 4-benz( a )piren e; benz( a )piren o. CATNO. F73 CAS NO. 50-32-8 ESTRUCTURA, FÓRMULA EMPÍRICA Y PESO MOLECULAR PM:252 ESPECTRO DE UV ESPECTROS DE FLUORESCENCIA e.-,- 150 8.58M ABS INT 8.- 8.111811 0.0 Zll8.88 258.80 3811.88 200 500 nm nm DATOS DE TOXICIDAD Dosis letal 50 vía oral en ratas o ratones:4095 mg/Kg Ligeramente tóxico+ Introducción 32 Carcinogenicidad: Occupational Safety and Health Administration (OSHA): (NO); Intemational Agency for Reseach on Cancer (IARC): (NO); American Conference of Govermental Industrial Hygienist (ACGIH): (YES); National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH): (NO); OTROS: (NO) DATOS FÍSICOS Punto de fusión: 176.6-177.5 oc Punto de ebullición: 488-495 oc Densidad: no disponible Presión de vapor: no disponible Densidad de vapor: no disponible Velocidad de evaporación (acetato de bu tilo= 1): no disponible Olor: no disponible Color: amarillento Fase: sólido cristalino Solubilidad en agua: insoluble (inmiscible) PELIGRO DE EXPLOSIÓN E INCENDIO Punto de inflamación: dato no disponible Medio de extinción: dióxido de carbono, polvo seco o spray. No se disponen de límites de explosión para este compuesto. PELIGROSIDAD PARA LA SALUD No se deben llevar lentes de contacto en el laboratorio. Se deben considerar peligrosos todos los productos químicosEvítar el contacto fisico directo. Carcinógeno sospechosoPuede producir cáncer. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede ser perjudicial si se inhala. Puede ser perjudicial si se traga. Puede causar irritación en los ojos. Puede causar irritación en la piel. Polvo y/o Introducción 33 vapores pueden causar irritación en el tracto respiratorio. Puede ser irritante para las membranas mucosas. Se puede absorber rápidamente a través de la piel con efectos potencialmente adversos para la salud. DATOS DE REACTIVIDAD Se absorbe y retiene con facilidad en ropas y/o calzado. Incompatible con agentes oxidantes fuertes. La descomposición libera vapores tóxicos. * Datos extraídos de la documentación aportada por la casa comercial suministradora de los reactivos químicos CHEM SERVICE, Inc. PO BOX 3108, WEST CHESTER, PA; 19381 (215) 692-3206, que incluye certificado de análisis y hoja de datos de seguridad del material. + Esta declaración está basada en la DL50 = fijada por la OSHA Antecedentes bibliográficos 40 SIV ASW AMY y col. en 1991 (a) determinan P AH en alimentos sometidos a combustión, mediante extracción con diclorometano, desecación con sulfato sódico, evaporación y posterior disolución en ciclohexano, purificación a través de sílica, evaporación a sequedad, disolución en ACN y análisis por HPLC, detectando criseno, • dibenzoantraceno y benzo(a)pireno, con recuperaciones del 89.75, 90.30 y 92.07 % respectivamente. Este método es utilizado por los mismos autores (b) para estudiar los P AH que se forman en las carnes de cordero y pollo en función del tratamiento culinario, y para identificar y cuantificar los P AH en alguno de los platos alimenticios comunmente consumidos en el sur de la India. SAINT-AUBERT y col. en 1992, investigan niveles de sets PAH y particularmente benzo(a)pireno, por HPLC-FL en muestras de carne y pescado asadas a la parrilla. El procedimiento consiste en saponificación, extracción con ciclohexano, purificación por florisil y elución con tolueno. El extracto se disuelve en n-hexano y extrae con DMSO. El residuo disuelto en metanol se inyecta. La recuperación es de 80 ± 1 O % y el límite de detección O .1 ¡.tg/Kg. El análisis de P AH en aceites vegetales, ha sido objeto de gran atención en los últimos años, empleándose diferentes métodos para este estudio. KOLAROVIC Y TRAITLER (1982) extraen P AH de grasas y aceites vegetales, mediante complejación con cafeína en ácido fórmico, de manera similar a la propuesta por SAGREDOS y col., en 1981 para el análisis de estos residuos en alimentos ahumados. El método propuesto por MENICHINI y col., (1991 a y b), incluye, disolución de 10 g de aceite en n-pentano, extracción con DMSO, partición líquido-líquido con ciclohexano tras adición de agua, purificación a través de sílica gel, separación mediante cromatografia en capa fina, y, finalmente análisis por cromatografia de gases. VREULS y col. (1991 ), tras disolución de 1 g de aceite en 1 O mL de n-pentano utilizan, para la identificación y cuantificación de nueve PAH, una combinación en serie de LC, GC y MS. A su vez, GERTZ (1994) realiza un tratamiento alcalino de la muestra y extrae los hidrocarburos mediante distribución en diclorometano, ciclohexano y agua, analizándolos por HPLC-FL. La presencia de P AH, también ha sido muy estudiada en una gran variedad de organismos marinos. W ARNER (1976), describe un método apropiado para el análisis simultaneo de hidrocarburos aromáticos y alifáticos, que consiste en, una digestión alcalina de la muestra, extracción con eter y cromatografia con sílica gel. Un método alternativo, fue propuesto por VASSILAROS y col. (1982a), la muestra se somete a saponificación con potasa y se extrae con diclorometano (según estos autores solvente de gran efectividad para disolver mezclas de compuestos aromáticos y alifáticos ), el Antecedentes bibliográficos 41 eluato obtenido se lava con agua y potasa al 1 O % (p/v) y se pasa a través de columna cromatográfica de alúmina, eluyendo los compuestos alifáticos con n-hexano, los P AH/P AHS con benceno y los P AHN con cloroformo; realizando el análisis mediante GC-FID, y confirmación por GC-MS. TAKATSUK.I y col. (1985), determinan PAH en moluscos y pescados; prestando gran atención a las posibles degradaciones de los hidrocarburos más lábiles. La muestra es saponificada mediante potasa etonólica y extraída con n-hexano, purificando el eluato obtenido con sílica. Como solvente de elución utiliza una mezcla de etil-eter y n-hexano, analizando los hidrocarburos mediante HPLC-FL. Las precauciones a tener en cuenta para obtener recuperaciones satisfactorias son: protección de la luz a lo largo de todo el proceso analítico, adición de un antioxidante (sulfuro de sodio) durante la digestión alcalina, eliminación de los posibles peróxidos en el etil-éter inmediatamente antes de su uso y rápida elución de los analitos adsorbidos en la columna cromatográfica de sílica. KRAHN y col. (1988) y MOTHERSHEAD y HALE (1992) analizan moluscos, utilizando diclorometano como solvente extracción al igual que VASSILAROS y col., (1982a) pero en este caso sin saponificación previa de la muestra. El extracto obtenido es purificado mediante columna de sílica gel/alúmina y posterior GPC. BIRKHOLZ (1988) también desechan el método de la hidrólisis alcalina por ser largo y complicado, especialmente el aquellos pescados con alto contenido en lípidos, y sugieren la extracción de la muestra con diclorometano en Soxhlet, seguido de purificación por GPC. A finales de la década de los 80, fueron publicados los resultados obtenidos por diferentes laboratorios experimentados, en un estudio comparativo sobre la determinación de P AH en organismos marinos (UTHE y MUSIAL, 1988). Para tal estudio se utilizaron crustaceos, que fueron extraídos con acetona; extracto y residuQ,.. fue analizado por los diferentes laboratorios, usando para ello distintos métodos de extracción y purificación. Los resultados obtenidos, ponen de manifiesto que el 99 % de los P AH estudiados, están presentes en el extracto de acetona obtenido por simple maceración de la muestra, no siendo por tanto necesaria la hidrólisis alcalina de las muestras insolubles (como carnes y pescados) para una completa extracción de estos residuos, como se había sugerido en anteriores estudios (GRIMMER y BÓHNKE, 1975). Aún así, en recientes publicaciones, continúa utilizándose la saponificación para este tipo de muestras. Antecedentes bibliográficos 42 COCCHIERI y col. en 1990 investigan 16 P AH en organismos marinos en la costa mediterránea de Italia, por HPLC con detector ultravioleta, encontrando una media en mariscos de 217 ~g/Kg (en peso húmedo) y en pescados entre 94 y 1930 ~g/Kg (en peso húmedo). La recuperación media es del 90% y los límites de detección varian entre 1 ~g/Kg para el antraceno y 20 ~g/Kg para el acenaftileno. LEBO y col. (1991) analiza hidrocarburos aromáticos mono y policíclicos en pescados, por GC-FID. Tras saponificación con potasa, la muestra es extraída con ciclopentano/diclorometano y purificada mediante sílica gel y silicato de potasio, seguido de GPC. PERFETTI y col. (1992) también utilizan un previo tratamiento alcalino de la muestra y partición líquido líquido con 1, 1,2-triclorotrifluoroetano. SHCEKATURINA y col. en 1995, determinan la presencia de P AH carcinógenos en mejillones de las bahías de Sebastopol (cronicamente polucionada) y de Karadag (relativamente limpia) en el mar Negro. El método se basa en una hidrólisis alcalina, seguida de extracción con n-hexano. Los PAH se separan por TLC y se identifican y cuantifican mediante espectrofluorescencia (efecto Shpol'skii). Todos los PAH son encontrados en la bahía polucionada, con una concentración 6-50 veces más alta que en la limpia. El procedimiento de GRIMMER y BOHNKE (1975), ya explicado anteriormente, fue muy utilizado para el análisis de P AH en productos vegetales, aunque tambien se desarrollaron nuevos métodos posteriormente. COATES y col. (1986) compara cuatro procedimientos de extracción para tejidos de plantas: baño ultrasonidos (sonicación), Soxhlet, extracción sólido líquido y extracción en baño. Como solvente de extracción se utilizó el ACN, el cual fue purificado mediante partición liquído-líquido con pentano y paso a través de columnas de ácido micro silícico, analizándose los P AH mediante GC-FID. La sonicación resultó ser el método más conveniente y simple con el que se obtenían porcentajes de recuperación más elevados. Un procedimiento similar, utilizando la sonicación como técnica de extracción, fue usado en 1992 por HECHLER y col., para la separación de PAH en plantas, en este caso usando tetrahidrofurano como solvente de extracción. WILD y col en 1992 estudian el arrastre desde el suelo de P AH en zanahoria, mediante extracción con diclorometano en soxhlet, concentración bajo corriente de nitrógeno y purificación a través de florisil, elución con diclorometano, concentración y análisis por HPLC con detector de fluorescencia. Las recuperaciones encontradas oscilan entre 80 y 100% y el límite de detección entre 0.11 y 2.83 f..lg/Kg. Antecedentes bibliográficos 44 YUCO YABIKU y col. (1993) analizan cincuenta y cinco muestras de aromas de humo y alimentos ahumados para investigar los niveles de PAR, principalmente B(a)P. Para ello utilizan una adaptación del método desarrollado por JOE y col. (1984) para el análisis de alimentos ahumados, ya explicado anteriormente. En el 73 % de las muestras de aroma de humo encontraron B(a)P, en niveles de 0.1 a 336.6 ~g/Kg, así como en el 52% de las muestras de ahumados, en concentraciones de 0.1 a 5.9 ~g/Kg. SIMKO y col. (1994) realizan un estudio sobrecargando un aroma de humo líquido con una mezcla de P AH de concentración total de 91.1 ~g/Kg, envasándolo en frascos de polietileno de baja densidad. Mediante HPLC con detección de fluorecencia, siguieron los cambios en los niveles de los P AH durante 164 horas, observándose una disminución de los mismos hasta valores próximos a cero. El método utilizado para tal estudio consiste en, extracción de la muestra con n-hexano tras diluición de la misma con una solución de sosa al20% (p/v). El eluato obtenido, tras ser lavado con agua destilada y secado con sulfato sódico anhidro, se concentra a sequedad, y se redisuelve en 3 mL de metano l. En los últimos años se ha venido observando un creciente interés por los llamados fluí dos supercriticos ( etileno, dióxido de carbono, etano, óxido nitroso, propileno ... ) como técnica de extracción. Estos solventes se caracterizan por tener baja viscosidad, tensión superficial prácticamente nula, elevada difusividad y gran poder solvente. Esta combinación de propiedades permite a los fluídos supercriticos penetrar en un material de igual forma que los gases, pero con la diferencia importante de que poseen propiedades solventes similares a las de los líquidos. Todo ello, unido a la posibilidad de modificar selectivamente su capacidad de extracción mediante la presión y la temperatura aplicada al sistema, los convierte en candidatos interesantes para la extracción de muestras (WRIGHT y col., 1989; TANG y col., 1993). Para algunas extracciones, el poder solvente del fluído utilizado no es suficiente aunque se fijen las condiciones de presión y temperatura adecuadas. En estos casos, se pueden utilizar modificadores (acetona, metanol, cloroformo, etanol, dietilamina, diclorometano, clorobenceno ... ) consiguiéndose de esta forma combinar el poder solvente del fluído supercritico de elevada densidad, con la naturaleza polar del modificador añadido. Estos cosolventes modificadores pueden ser incluídos en el proceso de extracción mezclados con el extractante o bien con las muestras. Cada uno de estos procedimientos presenta sus ventajas. Para la elección del modo de adición hay que tener en cuenta el mecanismo modificador, la instrumentación disponible y el coste del fluído (TENA y col., 1994). Antecedentes bibliográficos 45 La extracción mediante SFE (supercritical fluid extraction) presenta además la ventaja de poder ser utilizada en conexión (on-line) con las técnicas cromatográficas, o bien de forma independiente al análisis instrumental posterior ( off-line ), siendo esta última, la forma más comunmente empleada. Ambas posibilidades tienen, no obstante, sus ventajas, que hacen referencia sobre todo, a la sensibilidad y a la exactitud en el primer caso, y a una mayor flexibilidad experimental en el segundo (FURTON y col., 1993). Recientemente, la aplicación de la extracción mediante fluídos supercríticos para la determinación de P AH en diferentes matrices como suelos, sedimentos y lodos ha sido demostrada (ISCO INC, 1991; PORTER y col., 1992; DANKERS y col., 1993; HILLS, y col., 1993; GERE y col., 1994; REINDL Y HÓFLER, 1994; TENA y col., 1994; BARNABAS y col., 1995; EZZEL, 1995); no habiendo encontrado en la bibliografia ninguna aplicación para la extracción en alimentos. En un trabajo reciente realizado en este departamento por LAFFON (1996) (dirigida por LAGE y SIMAL ), se aplicó la extracción mediante fluídos supercríticos para determinar B(a)P y antraceno en aromas de humo hidrosolubles. Para la preparación de la muestra se toman 4 g de alúmina, y sobre ellos se pesan aproximadamente 2 g de aroma de humo. Se homogeneíza la mezcla removiendo, y se introduce en el vaso de extracción utilizando como modificador 200 JJ.L de metano!. La muestra fue extraída con co2 supercrítico a 256 bares (3717 psi) y un flujo de 1.5 mL/min durante 60 minutos (10 minutos extracción estática y 50 minutos extracción dinámica) siendo la temperatura de la cámara 100 °C. Al final de la extracción el "trap" fue enfriado a 50 oc antes de la elución del B(a)P con n-hexano. Cabe reseñar, por último, algunas de la conclusiones a las que se ha llegado en un reciente estudio realizado por TENA y col. (1994) en el que se pone de manifiesto la distinta capacidad de extracción que exhiben las técnicas, según se aplican a compuestos que se encuentran presentes de forma natural en las muestras, o a compuestos que han sido añadidos a éstas con objeto de calcular la recuperación. Las técnicas de sobrecarga habitualmente requieren un solvente orgánico como vehículo para depositar el analito en la matriz, y este solvente puede afectar a la integridad química de la muestra y producir diferentes condiciones de deposición en comparación con los analitos ya presentes en ella. La competición entre moléculas de solvente y analito por los lugares de adsorción presentes en la matriz cuando el analito es Antecedentes bibliográficos 46 depositado desde una solución líquida, puede impedir recuperaciones elevadas. Se ha propuesto la deposición del analito desde una fase de vapor para eliminar esta competencia. 2. MÉTODOS DE MEDIDA Los métodos de análisis estudiados para la determinación de P AH en alimentos y aromas de humo son muy variados, recogen muy diversas técnicas y afectan a muy distintas mezclas de hidrocarburos. Los primeros métodos analíticos utilizados para el análisis de P AH a niveles traza en los alimentos fueron la espectrometría de absorción UV Nis y la fluorescencia, con una separación previa mediante cromatografia de papel (PC) (LIJINSKY y SHUBIK, 1964 y 1965) o capa fina (TLC) (HOWARD y col., 1968; MASUDA, 1971; WHITE y col., 1971; SAGREDOS y col., 1981; SHCEKATURINA y col., 1995; POTTHAST Y EIGNER, 1975; ALONGE, 1988). En comparación a la espectrometría de absorción UV Nis, la fluorescencia es una técnica menos universal, pero también más sensible (para este tipo de sustancias su sensibilidad es, frecuentemente de 1 O a 1000 veces mayor que la de la espectrofotometría de absorción) (MOREL y col., 1991). Mientras que la absorción en el ultravioleta próximo y en el visible, es una propiedad general de los analitos con grupos cromóforos, muchos de estos compuestos son malos fluoróforos, sin embargo, los P AH son los que presentan mayor fluorescencia natural. Una selectividad adicional es también conseguida en la espectrofluorimetría ya que son dos (en vez de una como en las medidas de absorción) las longitudes de onda que se pueden seleccionar para la determinación de un compuesto, longitud de onda de excitación y de emisión. Con respecto a las técnicas cromatográficas, aporta importantes ventajas como son un análisis directo, frente a los 20-45 minutos de una inyección cromatográfica, lo que permite la monitorización de un gran volumen de muestras; un consumo mínimo de reactivos que queda reducido al estrictamente necesario para la preparación de la muestra para el análisis y límites de detección y cuantificación muy bajos, del orden de ng/L e incluso pg/L, que no llegan a alcanzarse con otras técnicas como la cromatografia gaseosa. De todas formas, estas técnicas presentan limitaciones para el análisis de estos analitos en matrices complejas como son los alimentos y los aromas de humo, debido por una parte a la incapacidad de resolver mezclas complejas de P AH y por otra, a las interferencias provocadas por sustancias que coextraen junto a estos residuos, Antecedentes bibliográficos 47 provocándose solapamientos entre las bandas espectrales. Este problema puede ser solventado mediante la espectrofluorimetría sincrónica, técnica primeramente utilizada por LLOYD (1971) que ha experimentado en los últimos años grandes avances dadas las múltiples posibilidades que ofrece. Además de una mayor selectividad, inferida por la posibilidad de poder variar ambas longitudes de onda durante el análisis, la espectrofluorimetría sincrónica permite, respecto a la convencional, reducir la complejidad espectral, los anchos de banda espectrales con el consiguiente aumento de resolución, y las interferencias Rayleigh scatter (ANDRE y col., 1977 (a y b); ANDRE y col., 1979; INMAN y col., 1982 (a); BAUDOT y col., 1991), sin que ello afecte a la sensibilidad. La primera de las modalidades sincrónicas descritas, y la más comunmente usada, es la de la espectrofluorimetría sincrónica a intervalos de longitud de onda constante (LLOYD, 1971), en la que el espectro de fluorecencia se obtiene manteniendo constante la diferencia entre las longitudes de onda de excitación y de emisión (VODINH y col., 1978; ABBOTT y col., 1986; BAUDOT y col., 1991). Otra modalidad es la espectrofluorimetría sincrónica a intervalos de energía constante en la que lo que se mantiene invariable es la diferencia de energía entre ambas longitudes de onda. Esta técnica desarrollada por INMAN y col. en 1982 (a y b ), ha sido mucho menos utilizada que la anterior (ANDRE y col., 1986; FILES y col., 1986; LI y col., 1992), posiblemente por razones instrumentales (CABANNIS, 1987). Para incrementar la selectividad de los procedimientos sincrónicos ordinarios se ha propuesto la combinación de los mismos con la técnica de derivadas. El principal efecto que se consigue es una intensificación de las bandas agudas y una apreciable disminución o dasaparición de las anchas, aunque eso lleve consigo también un incremento del ruido de fondo (SALGADO y col., 1986). Esta técnica ha sido utilizada con frecuencia en el análisis de multicomponentes orgánicos (GUTIERREZ y col., 1987; IZQUIERDO y col., 1990; MUÑOZ DE LA PEÑA y col., 1991). Cabe señalar, que la mayor parte de los artículos publicados sobre la determinación de P AH mediante la espectrofluorimetría sincrónica en sus diversas modalidades como técnica de análisis básica, se encuentra aplicados a muy diversas matrices y combinaciones de PAR (LAW y ANDRULEWICZ, 1983; GARCÍA Y POSSIDONI, 1987; T ANAKA y col., 1987; T ANAKA y SAlTO, 1988; ZHENHUA y WENYI, 1989; SANTANA y col., 1993; LÓPEZ DE ALDA y col., 1995 a, b y 1996; Antecedentes bibliográficos 48 SIMAL y col., 1992), no habiéndose encontrado en la bibliografia manejada, ninguna aplicación a alimentos ni aromas de humo. Con la introducción de la cromatografia de gases y líquida, las metodologías se simplificaron, realizándose el análisis de manera más rápida y sencilla, ganando también en sensibilidad y/o especificidad gracias al desarrollo de nuevos sistemas de detección. La gran capacidad de resolución que presenta la cromatografía de gases, ha hecho que haya sido durante mucho tiempo la técnica de elección para análisis de mezclas de hidrocarburos aromáticos policíclicos, utilizando como sistemas de detección, el FID (GRIMMER Y BONKE, 1975; FRETHEIM, 1976; SAlTO, 1978; VASSILAROS, 1982a; COATES y ELZERMAN, (1986); BIRKHOLZ, 1988; UTHE y MUSIAL, 1988; VAESSEN y col, 1990; MENICHINI y col., 1991 a y b; MOTHERSHEAD y HALE, 1992; NOLL y TOLEDO, 1995) o MS (V ASSILAROS, 1982a; SPEER y col., 1990 b; VREULS y col., 1991; WISE y col., 1991; ALYAKOOB y col., 1994). En los años 70 surge la cromatografía líquida de alta resolución, no dejando desde entonces de ser utilizada para la separación y aislamiento de estos residuos debido a su alta eficiencia, facilidad de automatización, y posibilidad de utilizar en una fase posterior otras técnicas de análisis, incluyendo la cromatografia gaseosa y la espectrometría UVNis (JOE y col., 1984; COCCHIERI y col., 1990), aunque la mayor selectividad y sensibilidad se consigue con la detección mediante FL, utilizando longitudes de onda de excitación y emisión específicas (DENNIS y col., 1984; TAKATSUK.I y col., 1985; WILD y JONES, 1991, 1992; WISE y col., 1991; PERFETTI y col., 1992; SAINT-AUBERT y col., 1992; ALPENDURADA, 1993; FURTON y JOLLY, 1993;; GOMAAy col, 1993; SETO y col., 1993; YUCO YABIKU y col., 1993; AKPAN, 1994; SIMKO y col., 1994; MÁKELAy PYY, 1995). Por ello, esta técnica de HPLC con detección UV y/o FL es la propuesta en diferentes métodos oficiales para análisis de P AH: -El método apuntado en la sección 6440 de la APHA (1992), aprobado igualmente en 1987 por el Standard Methods Committee y aceptado por la USEP A como equivalente al Método 61 O de la EPA, apunta dos posibles técnicas para el análisis de 16 P AH: una basada en la cromatografia gaseosa con detector de ionización de llama (Método 61 Od de la EPA), para el que no se han reportado límites de detección; y otra basada en la cromatografia líquida de alta resolución con detectores de UV y FL Antecedentes bibliográficos 49 (Método 61 O de la EPA), con la que se consiguen límites de detección mejores que los del método gas-cromatográfico anterior, que oscilan entre 17 y 21 O ng/L, para el benzo(k)fluoranteno y el fluoranteno respectivamente. -El procedimiento propuesto, a su vez, por el ASTM (1989) para la determinación de los mismos compuestos en aguas (incluyendo aguas superficiales y potables) coincide básicamente con el anteriormente descrito método 61 O de la EPA. -Para aguas potables, el método 550.1 de la USEPA, se basa también en la cromatografía líquida de alta resolución con detectores de UV y fluorescencia, bien por la inyección directa de la muestra filtrada o mediante el uso previo de discos de extracción en fase sólida (PERKIN ELMER, 1993). OBJETIVO Alimentos ahumados 58 Tabla VICaracterísticas de las muestras de alimentos analizadas N° de Producto Envasado Ahumado muestra 1 Jamón cocido A _granel Extracto 2 Paleta cocida A granel Extracto 3 Paleta cocida A granel Extracto 4 salchicha cocida Plastico a vacío Extracto 5 Salchicha cocida frankfi!,rt Plastico a vacío Extracto 6 Salchicha cocida fran/ifurt Plastico a vacío Extracto 7 Salchichafran/dilrt Plastico a vacío Ahumada 8 Salchicha_fran/dilrt Plastico a vacío Ahumada 9 Salchicha_frankfurt Plastico a vacío Humo natural 10 Salchicha fran/ifurt Plastico a vacío Humo natural 11 Salchicha fran/ifurt bacon-queso Plastico a vacío Ahumada 12 Salchicha _fran/dilrt chorizo Plastico a vacío Ahumada 13 Salchicha viena Plastico a vacío Ahumada 14 Salchicha viena bacon queso Plastico a vacío Ahumada 15 Salchichas aperitivo Tarro de cristal Humo 16 Salchichas aperitivo Plastico a vacío Humo natural 17 Salchichas parmesán Plastico a vacío Ahumada 18 Salchichas snackis Plastico a vacío Humo natural 19 Bacon A granel Ahumado 20 Chorizo A granel Ahumado 21 Chorizo A granel Ahumado 22 Lomo Plastico a vacío Humo natural de leña de roble 23 Mortadela Boloñesa A granel Humo natural 24 Queso ahumado A granel Ahumado 25 Queso ahumado con jamón A granel Ahumado 26 Queso ahumado conjamón Enlatado Ahumado Tabla VI.- Características de las muestras analizadas (continúa) N° de Producto Envasado Ahumado muestra 27 Patatas barbacoa Bolsa de aluminio Sabor a carne ahumada 28 Anchoa Plástico a vacío Humo de madera de haya 29 Anchoa Plástico a vacío Humo natural 30 Arenque A granel Humo natural 31 Arengue Plástico a vacío Humo de madera de haya 32 Arenque fileteado Plástico a vacío Humo de madera de haya 33 Atún en lonchas A granel Humo natural 34 Atún en lonchas Plástico a vacío Humo de madera de haya 35 Atún en lonchas Plástico a vacío Humo de maderas nobles 36 Bacalao en lonchas Plástico a vacío Humo natural 37 Caballa Plástico a vacío Humo de maderas nobles 38 Caballa Plástico a vacío Humo de laurel 39 Palometa en lonchas Plástico a vacío Humo de madera de haya 40 Palometa en lonchas Plástico a vacío Humo de maderas nobles 41 Pez espada en lonchas Plástico a vacío Humo de madera de haya 42 Pez espada en lonchas A granel Humo natural 43 Salmón en aceite enlatado Enlatado Ahumado con madera de haya 44 Salmón en lonchas Plástico a vacío Humo natural 45 Salmón en lonchas A granel Humo natural 46 Salmón en lonchas Plástico a vacío Humo de maderas nobles 47 Paté de salmón Plástico Salmón ahumado 48 Sardina Plástico a vacío Humo de laurel 49 Trucha en lonchas Plástico a vacío Humo de madera de haya 50 Trucha en lonchas Plástico a vacío Humo natural 51 Trucha en lonchas Plástico a vacío Humo de madera de haya Alimentos ahumados 60 Figura 10.- Esquema del método utilizado para el análisis de benzo(a)pireno en alimentos ahumados Alimentos ahumados 61 El eluato de n-hexano recogido (15 mL) es extraído a continuación con dimetilsulfóxido, (previamente saturado con n-hexano) con el fin de separar el benzo(a)piren<t de la grasa existente. Para ello se realizan tres extracciones en ampolla de separación durante 5 minutos cada una, con 15, 10 y 5 mL de DMSO. Si hay formación de emulsiones, éstas se rompen por adición de solución de cloruro sódico al 2 % (p/v). El extracto de aproximadamente 30 mL de dimetilsulfóxido obtenido se lava con 10 mL de n-hexano. La solución de DMSO fue diluída con 72 mL de agua MILLI-Q y pasada a través de una minicolumna Sep Pak Plus C-18 (previamente activada con 5 mL de ACN seguidos de 10 mL de agua MILLI-Q) con el fin de purificar y concentrar el extracto. Las paredes del recipiente que contiene la solución, fueron lavadas con 1 O mL de agua y pasadas también por la minicolumna. La Sep-pak C-18, en la que está retenido el B(a)P, se seca bajo corriente de nitrógeno, eluyéndose el analito con 5 mL de n-hexano. Este eluato fue finalmente concentrado a sequedad bajo corriente de nitrógeno, y redisuelto en 1 mL de ACN, que tras ser filtrado (filtros MFS-25, con tamaño de poro 0.5 11m) fue analizado por HPLC-FL. 1.3.3. ANÁLISIS 1.3.3.1. ESPECTROFLUORIMETRÍA Para la optimización de las diferentes etapas de purificación se utilizó el método espectrofluorimétrico con aplicación de segunda derivada puesto a punto por LOPEZ de ALDA y col. (1995 a y b ), con las siguientes condiciones de trabajo: -rango espectral O"excJ 200-500 nm -rendija de excitación: 5 nm -rendija de emisión: 5 nm -velocidad de barrido: 240 nm/minuto -intervalo de longitud de onda (~A.): 110 nm La segunda derivadb se obtiene mediante la aplicación del software FLUORESCENCE DATA MANAGER, utilizando el factor 2/9. Para la cuantificación, se utiliza la distancia máximo-mínimo, en unidades de intensidad, entre 290-296 nm. Alimentos ahumados 62 1.3.3.2. HPLC-FL Una alicuota (20 ~L) de la solución de ACN, fue inyectada en HPLC utilizando como fase móvil ACN-agua (85:15) a flujo constante de 0.5 mL/min. Para la cuantificación del B(a)P se utilizaron longitudes de onda de excitación (J .. exc.) y de emisión (A.em.), de 296 y 406 nm respectivamente, y un "range" de 0.05. La temperatura de la columna se mantuvo a 38 °C. 1.3.4. CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS La presencia de B(a)P, identificado mediante HPLC-FL con longitudes de onda de excitación y emisión 296 y 406 nm respectivamente, fue confirmado de las siguientes formas: 1) Por HPLC-FL, en idénticas condiciones de trabajo, pero con las longitudes de onda de 296 nm para la excitación y 426 nm para la emisión, ya que en estas condiciones la señal del benzo(a)pireno presenta una intensidad menor que con las longitudes de onda utilizadas para la cuantificación (Figura 1 ). 2) Mediante la realización en HPLC-FL de espectros de emisión y espectros en modo sincron sobre el pico que eluye, sin parar el barrido. Las condiciones de trabajo usadas fueron: -Espectros de emisión: longitud de onda de excitación: 296 nm; inicio de la longitud de onda de emisión: 350 nm; rango espectral: 100 nm; intervalo de lectura: 2f nm. -Espectros sincron (~/..: 11 O nm): inicio de la longitud de onda de excitación: 250 nm; inicio de la longitud de onda de emisión: 360 nm; rango espectral: 100 nm; intervalo de lectura: 2 nm. 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2.1. EXTRACCIÓN El marcado caracter lipofilico de los P AH hace que estos compuestos se acumulen mayoritariamente en la grasa de los alimentos, por ello, y con el fin de facilitar su separación de estos componentes lipídicos, inicialmente se pensó en someter las muestras a saponificación con potasa, de acuerdo con el método propuesto por distintos investigadores (DENNIS y col., 1984; TAKATSUKI y col. 1985; SPEER y col. 1990 b; LEBO y col. 1991; PERFETTI y col. 1992; SETO y col. 1993; SHCEKATURINA y col., 1995). Sin embargo, después de varias pruebas realizadas con muestras sobrecargadas, la formación de emulsiones al extraer posteriormente con n-hexano, daban lugar a pérdidas importantes, lo que hizo que este método fuera desechado. Se pasó entonces a la extracción de la grasa directamente de la muestra, dónde están depositados los P AH. Para ello se procedió previamente al desecado de la misma por liofilización, ya que el secado en estufa a temperaturas próximas a 100 oc produce una disgregación de la grasa y no permite tomar una alícuota homogenea representativa de la muestra. Como técnica de extracción se eligió la sonicación, ya utilizada para la obtención de PAH de diferentes matrices como plantas, suelos, sedimentos, corales ... (COATES y ELZERMAN, 1986; MORSELLI y ZAPPOLI., 1988; HECHLER y col., 1995; AAMOT y col., 1996; READMAN y col., 1996), no habiéndose encontrado sin embargo en la bibliografia ninguna referencia a su aplicación sobre alimentos. Esta técnica permite extraer la grasa y los P AH conjuntamente en menos tiempo (3 horas) que mediante el método tradicional del soxhlet, que es utilizado. entre otros, por BIRKHOLZ (1988), WILD y JONES (1991) y MOTHERSHEAD y col. (1992), para analizar tejidos de pescado, zanahorias y cangrejos, mediante extracción con diclorometano durante 7, 6 y 48 horas respectivamente; por su parte BRAVO y SALAZAR (1978) extraen ostras durante 12 horas con ciclohexano. Como solvente se eligió el n-hexano por las siguientes razones: -Es uno de los solventes más utilizados para la extracción de compuestos orgánicos (entre ellos los PAH) a partir de diferentes matrices (GUILLÉN, 1994). -Es el recomendado por las legislaciones europea y española para la determinación de P AH en aguas (Directiva del Consejo 80/778/CEE, Real Decreto 1138/1990). -Ha sido utilizado por nosotros en un proyecto realizado con la Conselleria de Sanidade de la Xunta de Galicia, para el análisis de P AH en aguas por ~----------------------------------------------~~~~~~~~~~~~======================~ \.__, v \.__, V "'--' '-' "'--' "- '-...-- -e '-· \...· '-...-- ~ ~ '-' '-.-· ~ ~· '-- '-· -._... -.._... \_. \._. "-.... \._. \._. '-' '-...-- '-' '~ -._... \._. \_. v \_. \._. \....· \._. '- '---' v v Alimentos ahumados 64 espectrofluorimetría sincrónica, con un porcentage de recuperación del 94 % (LÓPEZ DE ALDAy col., 1995 b). -Sus características espectrofluorimétricas, libres de interferencias tipo Raman básicamente permiten tener una amplia zona dónde es posible detectar y cuantificar de manera precisa el benzo(a)pireno (LÓPEZ DE ALDA y col., 1994 a). En nuestro trabajo, la muestra liofilizada, fue entonces sometida a extracción por ultrasonidos con n-hexano, realizándose tres particiones sucesivas con 25, 15 y 1 O mL, durante una hora cada una. Para facilitar la posterior separaración de solvente y residuo, la muestra liofilizada fue finamente pulverizada e introducida en bolsitas elaboradas con papel de filtro (Figura 11 ). J 1 1 1 '" 1 ' 1 ' Figura 11.- Envases de papel de filtro utilizados para la extracción de las muestras de alimentos El extracto recogido ·(aproximadamente 50 mL) se centrifuga para eliminar las partículas en suspensión, y se evapora a sequedad en baño María a 35 oc bajo corriente de nitrógeno, redisolviendo el residuo en 5 mL de n-hexano. Alimentos ahumados 65 2.2. PURIFICACIÓN El eluato hexánico obtenido se ha sometido a varias etapas de purificación y concentración con el fin de poder llegar a detectar los niveles de benzo(a)pireno requeridos por la legislación (0.03 Jlg/Kg). Esto incluye: -Paso a través de minicolumnas Sep Pak de sílica Plus, y elución con n-hexano -Extracción del n-hexano con dimetilsulfóxido -Dilución del dimetilsulfóxido con agua y paso por minicolumna Sep Pak C-18 Plus y, elución con n-hexano -Evaporación a sequedad con nitrógeno En la optimización de cada una de estas etapas, se ha utilizado la espectrofluorimetría sincrónica (AA-=110 nm) para la determinación del B(a)P. Este método, aunque da lugar a precisiones (RSD) más elevados que los· obtenidos por cromatografia, es mucho más rápido y los resultados son igualmente satisfactorios. El principal objetivo de la purificación va a ser separar los compuestos grasos, del analito objeto de estudio, ya que representan una gran interferencia en el tipo de muestras analizadas. Para ello se efectuaron diferentes ensayos: -Centrifugación tras haber sometido el extracto hexánico a bajas temperaturas (- 22 °C). Al mantener el extracto durante aproximadamente media hora en estas condiciones, la grasa se solidifica y sedimenta, pudiendo ser separadas posteriormente por centrifugación. Pero, al realizar la experiencia con patrones de B(a)P, se observó que el analito tenia más afinidad por el material lipídico que por el n-hexano, debiendo por ello desechar este método. -Purificación del extracto mediante minicolumnas Sep Pak Florisil Plus: Se estudió por separado el comportamiento de patrones de B( a )P en n-hexano y de grasa en n-hexano, cuando eran pasados a través de estos cartuchos. Se observó que el B(a)P quedaba fuertemente retenido, pudiendo ser eluído posteriormente con una mezcla de nhexano/eter 85: 15 (1 O mL ). Por otra parte, los componentes lipídicos no quedaban retenidos por la minicolumna, sino que eran eluídos con el n-hexano; pudiendo ser factible, por tanto, la separación de ambos componentes. Sin embargo al realizar la Alimentos ahumados 66 -Extracción del residuo graso con ACN mediante sonicación, tras eliminar el nhexano bajo corriente de nitrógeno: aparte de la dificultad para separar posteriormente las dos fases, los porcentajes de recuperación fueron igualmente insuficientes, debido de nuevo, a la mayor afinidad del B(a)P por los lípidos que por el ACN. -Finalmente, se ensayó la partición líquido-líquido del extracto hexánico con dimetilsulfóxido, solvente ya utilizado por otros autores (JOE y col., 1984; MENICHINI y col. 1991 a y b) y por el que los PAH presentan mayor afinidad; permitiendo de forma satisfactoria separar el benzo(a)pireno de los componentes grasos, que quedan retenidos por el n-hexano. Debido a la formación de grandes emulsiones dificiles de romper cuando se extrae directamente la muestra disuelta en hexano después de la centrifugación, fue necesaria una previa purificación a través de minicolumnas Sep Pak de sílica. 2.2.1. PURIFICACIÓN MEDIANTE SEP PAK DE SÍLICA PLUS El extracto de n-hexano concentrado a 5 mL obtenido tras la centrifugación, se pasa por minicolumna Sep Pak de sílica Plus para la purificación de alguno de los compuestos grasos presentes en las muestras. La elución del B(a)P se completa con 10 mL adicionales de n-hexano. Para la optimización del volumen de n-hexano necesario para arrastrar todo el benzo(a)pireno de la minicolumna, se hicieron ensayos pasando 5 mL de una solución patrón de 8 IJ.g/L, y eluyendo con distintos volúmenes crecientes de n-hexano (Figura 12). Alimentos ahumados 67 % recuperación 100 80 60 40 ? 8 9 10 11 12 1.8 14 Ul mLn-hoxano Figura 12.- Optimización del volumen de n-hexano necesario para la elución del benzo(a)pireno retenido en la minicolumna Sep-pak sílica Plus Como se observa en la figura, a partir de 6 mL la recuperación ya es satisfactoria, aunque se decidió usar un volumen de 1 O mL para mayor seguridad. Una vez fijado el volumen de eluyente en 1 O mL (obteniendo un volumen final de 15 mL), se hicieron ensayos variando la concentración de patrón y, repitiendo cada ensayo 6 veces (TABLA VII). Tabla VII.- RSD y% R obtenidos en la elución con n-hexano de diferentes cantidades de benzo(a)pireno retenidas en la minicolumna Sep-pack sílica Plus al repetir cada ensayo por sextuplicado Patrón X encontrada Precisión Recuperación (n2) (n2) (RSD) (o/oR) 5.0 5.0 5.3 100 20.0 19.5 4.1 97.3 2.2.2. EXTRACCIÓN DEL N-HEXANO CON DIMETILSULFÓXIDO La partición líquido-líquido del extracto hexánico con 15, 10 y 5 mL de DMSO, solvente por el que los P AH presentan mayor afinidad, permite la eliminación de los compuestos grasos no eliminados en el procedimiento anterior. Alimentos ahumados 75 Para evitar oscilaciones en el tiempo de retención, debido a variaciones de la temperatura ambiental a lo largo del día, fue necesaria la estabilización de la temperatura de la columna, eligiéndose 38 oc (WISE y col., 1993; MÁKELA y PYY, 1995). El mantenimiento de la temperatura se consiguió haciendo recircular con un baño, agua a 38 oc a través de un serpentín de cobre que recubría la columna (Figura18). Una vez fijada la temperatura, y con una fase móvil de ACN:agua (85: 15), se procedió a optimizar el flujo con el fin de obtener una buena resolución de los picos. Para ello, y valiéndonos del software System Suitability Test (SST), se determinó la eficacia de la columna a diferentes flujos, obteniéndose los siguientes resultados: Tabla XII Flow (mL/min) Retention time (mio) Tb. Plate Number 1.5 8.16 4417 1 11.65 5834 0.75 15.13 6235 0.5 22.49 7313 0.4 27.91 7452 0.3 37.49 7440 Como se puede observar, el número de platos teóricos aumenta dede 4417 hasta 7452 al disminuir el flujo de 1.5 a 0.4 mL/min, llegado este punto, mayores disminuciones del flujo, no mejoran la eficacia de la columna. Finalmente, y llegando a un compromiso entre tiempo y eficacia, el flujo elegido fue 0.5 mL/min. En las tablas XIII y XIV y en la figura 19, se recogen las características del pico cromatográfico del benzo(a)pireno obtenido con estas condiciones. 2.4. Límites de detección y cuantificación Los límites de detección y cuantificación para el B(a)P en ACN, se han calculado según las normas de la ACS (1980). A continuación se expone el esquema de trabajo seguido: ( 1) Se hicieron diez lecturas de un blanco de ACN en las condiciones cromatográficas previamente seleccionadas. Alimentos ahumados 76 Figura 18.- Sistema de mantenimiento de la temperatura de la columna de HPLC Alimentos ahumados 77 TABLA XIII.- Características del p1co cromatográfico del benzo(a)pireno según la Farmacopea Europea (EP) EP Peak Retention time Th. Plate Number Tailin~ Factor Capacity Factor B(a)P 22.79 7632 1.26 10.28 TABLA XIV.- Características del p1co cromatográfico del benzo(a)pireno según la Farmacopea Americana (USP) U SP Peak Retention time Th. Plate Number B(a)P 22.79 7624 Tailin~ Factor Capacity Factor 1.26 m in 10.28 Peak: B[a)P Width at 50 %: 0.6414 min. Widfh at 5%: 1.466 min. Base width: 1.044 min. Figura 19.- Anchuras características del pico cromatográfico del benzo( a )pireno Alimentos ahumados 78 (2) Se midieron, en mV, la altura máxima y mínima de los blancos durante el tiempo en el que sale el pico del B(a)P (21-24 min), y se determinó la altura total en valor absoluto. (3) Con estos datos se calcula la media (X) y la desviación estandard (SD), y a partir de ellos el límite de detección y cuantificación en mV, 882 y 1610 respectivamente (Tabla XV) . ( 4) Conocido el LQ, se obtuvo la recta de calibrado calculada por análisis de regresión de las concentraciones 0.25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 Jlg de benzo(a)pireno por Litro de acetonitrilo, medidas por triplicado, frente a las alturas, en mV, calculadas en las condiciones de trabajo (ACS, 1980). Altura= 18117 [] + 0.0523 (r = 0.9997) (rango 0.25-16 Jlg/L) ( 5) Mediante la recta de calibrado en alturas, es posible determinar el LD y el LQ del benzo(a)pireno en Jlg/L, siendo en este caso 0.049 y 0.089 Jlg/L, respectivamente (Tabla XV) . Tabla XV.- Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) del benzo(a)pireno en ACN obtenidos por HPLC-FL (A-exc .= 296 y A.em .= 406) X blanco SD LD LQ LQ 570 104 882 1610 0.049 0.089 Los límites de detección y de cuantificación expresados en Jlg de B(a)P por Kg de materia húmeda, se calculan dividiendo los valores correspondientes en Jlg/L, por la cantidad de muestra, en materia húmeda, analizada (asumiendo que en el método se concentra hasta un volumen final de ACN de 1 mL). Cómo el análisis se ha realizado en todas la muestras partiendo de 5 g de sustancia liofilizada (materia seca), el límite de detección y de cuantificación alcanzado, varia en función de la humedad, permitiendo en todas las muestras, la determinación de benzo(a)pireno a los niveles requeridos por la legislación (0. 03 Jlg/Kg) (Tabla XVI). Alimentos ahumados 79 Tabla XVI.- Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) del benzo(a)pireno en función del % Humedad (p/p) de las muestras Muestra Humedad Muestra LD LQ 5.00 o 5.00 0.018 5.00 30 7.14 6.7 X 10 -3 0.012 5.00 40 8.33 5.9 X 10-3 0.011 5.00 50 10.0 4.9 X 10 -3 8.9 x w-3 5.00 60 12 .5 3.9 X 10 -3 7.1 X 10 -3 5.00 70 16.7 2.9 X 10 -3 5.3 X 10 -3 5.00 80 25.0 1.9x1o-3 3.6 X 10 -3 * Expresado en materia húmeda 2.5. CUANTIFICACIÓN Y LINEARIDAD DE LA RESPUESTA DEL DETECTOR La concentración del B(a)P en las muestras se determina a partir de la recta de calibrado obtenida por análisis de regresión de las concentraciones 0.25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 Jlg de benzo(a)pireno por litro de acetonitrilo, medidas por triplicado, frente a las areas de los picos (ACS, 1980): Area = 1572819 []- 0.0333 (r = 0.9999) (rango 0.25-16 Jlg/L) La recta encontrada es lineal en el rango de las concentraciones experimentales estudiadas, tal y corno se demuestra en la figura 20. La concentración de B(a)P expresada en Jlg/Kg de producto en muestra húmeda, se calcula dividiendo su concentración en Jlg/L en el eluato de ACN1 por la cantidad de muestra en materia húmeda. 2.6. CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS Aunque inicialmente se pensó confirmar la presencia de B( a )P mediante HPLCUV, las pruebas realizadas con este último demostraron que sólo es sensible para concentraciones mucho más elevadas que las que se obtienen en las muestras analizadas. <X 1E7) • • lo. • . 3 2.5 2 o 1.5 ..J o. J: w 0:: 1 e.5 e e Ragr•••ian a~ REHPLC.•r•• an REHPLC.cancan 4 8 REHPLC.cancan 12 80 Figura 20.- Recta de calibrado del benzo(a)pireno ·~~ ACN obtenida mediante HPLC-FL con Aexc.= 296 nm, Aem.= 406 nm (rango 0.25-16 ~giL) 16 Alimentos ahumados 81 Finalmente, la confirmación se realizó de las siguientes formas: -Mediante la técnica de HPLC-FL utilizando 426 nm para la longitud de onda de emisión: La relación de areas obtenidas en las condiciones de cuantificación y en éstas de confirmación, es constante e independiente de la concentración de B(a)P presente (X= 1.33; Cv %= 7.9). (Figuras 21 y 22) Los límites de detección y cuantificación encontrados con estas longitudes de onda son O. 051 y O .1 00 Jlg/L, respectivamente, y han sido calculados de la misma forma que anteriormente se cita. -Mediante la realización de espectros de emisión y espectros en modo sincron sin parar el barrido: Una vez realizados los espectros de emisión y en modo sincron en las condiciones de trabajo citadas en la parte experimental, éstos quedan almacenados momentaneamente en el detector de fluorescencia hasta la próxima inyección, debiendo ser recuperados como archivo con extensión "raw" mediante la opción "replay". La velocidad con la que el detector envía al integrador estos espectros, puede ser controlada, fijándose en nuestro caso a 20 nm/seg. Estos archivos son visualizados mediante el software WOW como un cromatograma convencional, es decir en el eje de las abcisas los tiempos de retención en segundos y en las ordenadas la intensidad en m V. Mediante el cursor podemos determinar el tiempo al que sale el máximo de intensidad, y al conocer el rango espectral (1 00 nm) y la velocidad de envío (20 nm/seg) podemos calcular la longitud de onda de excitación correspondiente a dicho máximo, que es, en el caso del B(a)P, 406 nm en el espectro de emisión y 296 nm en el espectro sincrónico. Posteriormente, fue necesaria la manipulación de dichos espectros mediante el software P AINTBRUSH para transformar el eje de las abcisas en unidades de longitud de onda (nm). m V 80.00 -~------------------- 0.00~------~--------~------~------~------~-------- o.oo 5.00 ~0.00 ~5.00 20.00 25.00 min Figura 21: Cromatogramas de benzo(a)pireno en ACN (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 Jtg/L) (A.exc.= 296, A.em.= 406) m V 70.00 0.00~------~------~--------r-------.-------~------- 0.00 5.00 J.O.OO J.5.00 20.00 as.oo min Figura 22: Cromatogramas de benzo(a)pireno en ACN (0.5, 1, 2, 4, 8 y 16 Jtg/L) (Aexc.= 296, A.em.= 426) Alimentos ahumados 83 Para que la confirmación mediante esta técnica sea totalmente fiable, se necesitan concentraciones de benzo(a)pireno superiores a 1 ~giL y 2 ~giL, para el modo sincrónico y para la emisión respectivamente, ya que cantidades más bajas no son detectables (Figuras 23 y 24). En caso de que dichos espectros no sean fiables por bajas concentraciones de B(a)P en la muestra, se debe concentrar la solución de ACN previamente a la realización de los mismos. 2.7. PRECISIÓN La precisión del método se ha calculado sometiendo al procedimiento experimental descrito seis muestras de la misma salchicha (muestra 9), en cuya etiqueta se indica que ha sido sometida a ahumado tradicional (Tabla XVII). Tabla XVII.- RSD del método obtenida para la muestra n° 9 (salchicha ''franlifurt") Benzo( a )piren o Muestra (~g/Kg)* 6 0.043 6 0.050 6 0.056 6 0.053 6 0.050 6 0.056 - X= 0.051 RSD = 9.6 * expresado en materia húmeda 2.8. RECUPERACIÓN La recuperación del método, se ha calculado como la media de las recuperaciones obtenidas al someter las siguientes muestras al procedimiento de análisis descrito: a) Seis muestras de un mismo tipo de salchicha ''franlifurt" (63 % (p/p) agua), que, según el etiquetado, no han sido sometidas a ahumado tradicional ni adicionadas de extracto de humo. Una vez chequeadas para comprobar que el benzo(a)pireno se encuentra por debajo de los límites de detección del método, fueron sobrecargadas con este PAH a dos niveles, 0.03 ~g/Kg (cantidad máxima permitida por la legislación para alimentos y bebidas adicionadas de aromas de humo) y 0.44 ~g/Kg. Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla XVIII. Alimentos ahumados 84 UF 350 406 450 nm Figura 23: Espectros de emisión de benzo(a)pireno en ACN ( 2, 4, 8 y16 ~giL), realizados mediante HPLC-FL UF nm 250 296 350 Figura 24: Espectros sincrónicos de benzo(a)pireno en ACN (1, 2, 4, 8 y 16 ~giL), realizados mediante HPLC-FL ""' Alimentos ahumados 91 ,-.. ,.... ,-.. "' ,...._ ,.... ,...._ ,... SARDINA MUESTRA N° 48 ,.... r ,.._ m V ,..... 1200 ,... '"' 1000 ,..... 800 ,.... ,...... 600 ("! 1'1 o ~ t"'i 400 ('>¡ ,_ 200 ,- o ,...... 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 m in Figura 28: Cromatograma de la muestra n° 48 (A. exc.= 296, A. em.= 406) Alimentos ahumados 92 De todas las muestras estudiadas, se observa por tanto y como era de esperar, que los resultados más elevados corresponden a aquellas sometidas a ahumado natural, mientras que las muestras adicionadas de extractos de humo presentan los valores más bajos y siempre dentro del límite establecido por la legislación, aunque son pocos los productos comercializados actualmente sometidos a este tipo de tecnología. Además nuestra legislación como ya se ha indicado, sólo permite la adición de aroma de humo a derivados cárnicos y quesos. Los ensayos de confirmación han sido realizados en todas las muestras, observándose en la figura 25 los cromatogramas con longitudes de onda de emisión 406 y 426 nm respectivamente, para la muestra n° 9, con su relación de areas. En las figuras 29 a 31 , se recogen los los espectros sincrónicos y de emisión realizados mediante HPLC-FL correspondientes a las muestras n° 20, 24 y 48, y su comparación con patrones de benzo(a)pireno. r'- , ,-... (".. (".. r- ,...._ .--.. r. ,..., r-. r-- ,-... ,.., r ~ = ,.,_ A ""' -=: p. 1'4 G' (:':: Po ~ ~ Alimentos ahumados 93 CHORIZO MUESTRA No 20 UF 250 296 350 nm Espectros sincrónicos de 2 J..lg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 20 (azul}, realizados mediante HPLC-FL Figura 29 ,.... Alimentos ahumados 94 QUESO MUESTRA No 24 Uf 350 406 450 nm Espectros de emisión de 8 J.lg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 24 (azul), realizados mediante HPLC-FL Uf 250 296 350 nm Espectros sincrónicos de 8 J.lg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 24 (azul), realizados mediante HPLCFL Figura30 Alimentos ahumados 95 SARDINA MUESTRA N° 48 UF 350 406 450 nm Espectros de emisión de 16 J.lg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 48 (azul), realizados mediante HPLC-FL UF 250 296 350 nm Espectros sincrónicos de 16 J.lg/L de benzo(a)pireno en ACN (verde) y de la muestra n° 48 (azul), realizados mediante HPLC-FL Fifrura 31 Alimentos ahumados 96 TABLA XX.- Contenido en benzo(a)pireno (J.Lg/Kg) y pocentaje de humedad (p/p) en las muestras analizadas PRODUCTOS CON EXTRACTO DE HUMO No de muestra Producto %Humedad B(a)P (p/pl Ó!glkg)* 1 Jamón cocido 65.24 ND 2 Paleta cocida 71.08 0.014 3 Paleta cocida 72.39 ND 4 Salchicha cocida 59.64 0.021 5 Salchicha cocida jranlifurt 58.71 0.026 6 Salchicha cocida.franlifurt 58.10 0.021 - X= 0.014 * Resultados expresados en materia húmeda. SALCHICHAS COCIDAS Y AHUMADAS N° muestra Producto %Humedad B(a)P (p/p) (p,g/Kg)* 7 Salchichas Franlifurt 54.97 NM 8 Salchichas Franlifurt 62.97 0.021 9 Salchichas Franlifurt 66.90 0.051 10 Salchichas Franlifurt 58.15 0.027 11 Sachicha.fran/ifurtbacon-queso 62.16 0.016 12 Salchicha.franlifurt chorizo 46.66 0.027 13 Salchicha viena 52.82 0.030 14 Salchicha viena bacon-queso 63.97 0.0080 15 Salchichas aperitivo 66.95 ND 16 Salchichas aperitivo 58.17 0.020 17 Salchicha parmesan 49.91 0.040 18 Salchicha snackis 59.52 0.025 0.022 * Resultados expresados en materia húmeda. Alimentos ahumados 97 TABLA XX.- Contenido en benzo(a)pireno (¡.tg/Kg) y pocentaje de humedad (p/p) en las muestras analizadas (continúa) DERIVADOS CÁRNICOS AHUMADOS N° muestra Producto %Humedad B(a)P (p/p) (pg/Kg)* 19 Bacon 45.28 0.011 20 Chorizo 18.24 0.34 21 Chorizo 14.14 0.12 22 Lomo 74.24 0.0090 23 Mortadela Boloñesa 60.03 0.017 0.099 * Resultados expresados en materia húmeda. QUESOS AHUMADOS No muestra Producto %Humedad B(a)P (p/p) (pg/Kg)* 24 Queso ahumado 21.44 0.91 25 Queso ahumado con jamón 38.88 NM 26 Queso ahumado con jamón 51.63 0.13 * Resultados expresados en materia húmeda. APERITIVOS FRITOS CON SABOR A CARNE AHUMADA No muestra Producto B(a)P (pg/Kg)* 27 Patatas barbacoa 0.13 * Resultados expresados en materia húmeda. Alimentos ahumados 98 TABLA XX.- Contenido en benzo(a)pireno (J..Lg/Kg) y pocentaje de humedad (p/p) en las muestras analizadas (continúa) PESCADOS AHUMADOS No muestra Producto %Humedad B(a)P (p/p) (Jtg/kg)* 28 Anchoa 63.75 0.019 29 Anchoa 61.44 0.013 30 Arenque 43.94 0.040 31 Arenque 49.04 0.071 32 Arenque fileteado 56.97 0.040 33 Atún en lonchas 56.71 NM 34 Atún en lonchas 52.74 0.023 35 Atún en lonchas 57.86 0.022 36 Bacalao en lonchas 73.03 0.018 37 Caballa 40.41 0.087 38 Caballa 34.44 0.83 39 Palometa en lonchas 69.94 ND 40 Palometa en lonchas 67.77 NM 41 Pez Espada en lonchas 60.44 0.035 42 Pez Espada en lonchas 56.56 NM 43 Salmón en aceite enlatado 63.16 0.045 43 Aceite del salmón enlatado 0.93 44 Salmón en lonchas 53.44 ND 45 Salmón en lonchas 59.51 0.040 46 Salmón en lonchas 52.93 ND 47 Paté de salmón 57.08 0.13 48 Sardina 36.93 2.46 49 Trucha en lonchas 65.47 0.057 50 Trucha en lonchas 58.46 ND 51 Trucha en lonchas 62.05 0.032 - X= 0.20 * Resultados expresados en materia húmeda. DETERMINACIÓN DE BENZO(a)PIRENO EN AROMAS DE HUMO LIPOSOLUBLES MEDIANTE HPLC-FL Aromas de humo líquido liposoluble 100 l. PROTOCOLO ANALÍTICO 1.1. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA La muestra analizada es un aroma de humo líquido liposoluble (AHLL), donada por una casa comercial. Está contenida en frasco de vidrio color topacio. La cantidad a añadir recomendada por los fabricantes es 2 g/Kg de producto. 1.2. PROCEDIMIENTO (GARCÍAFALCÓNy col., 1996 b) 1.2.1. EXTRACCIÓN 2 g de AHLL fueron disueltos en 5 mL de n-hexano y transferidos a una ampolla de separación. Esta solución fue extraída con 5, 3 y 2 mL de DMSO (previamente saturado con n-hexano) durante 5 min cada vez. Si hay formación de emulsiones, éstas se rompen por adición de solución de cloruro sódico al2% (p/v). 1.2.2. PURIFICACIÓN El extracto de DMSO (10 mL) se mezcla con 24 mL de agua MILLI-Q, y se pasa a través de un cartucho Sep Pak Plus C-18, previamente activado con 5 mL de ACN seguidos de 10 mL de agua MILLI-Q. Las paredes del recipiente que contenían la solución, fueron lavadas con 1 O mL de agua y pasadas también por la mini columna. El eluato acuoso de DMSO se rechaza. La Sep Pak C-18, en la que está retenido el B(a)P, se seca bajo corriente de nitrógeno y se une en serie con una Sep Pak sílica Plus, eluyéndose el B(a)P de la C18 con 5 mL de n-hexano, quedando ahora el analito retenido en la minicolumna de sílica. Se desecha el cartucho C-18 y se pasan finalmente 1 O mL de n-hexano a través de la sílica para completar la elución, recogiéndose un volumen final de 15 mL, que se evapora a sequedad bajo corriente de nitrógeno y se redisuelve en 1 mL de ACN para ser analizado por HPLC-FL. 1.2.3. ANÁLISIS Y CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS El análisis de B(a)P en el eluato de ACN se hizo mediante cromatografia líquida de alta resolución con detección de fluorescencia, con las mismas condiciones de trabajo utilizadas en la sección 1.3.3.2 (pag. 62). Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 107 l. PROTOCOLO ANALÍTICO 1.1. EFECTO DEL SOLVENTE Se han analizado los efectos que los siguientes solventes provocan sobre la fluorescencia del B(a)P: acetona, ACN, benceno, cloroformo, diclorometano, DMSO, metanol, n-hexano y tolueno. Para cada uno de éstos y para las soluciones estándar de B(a)P 8 !lg/L en los mismos, se han ensayado 50 intervalos de longitud de onda (~A.) diferentes, en las siguientes condiciones espectrofluorimétricas: -rango espectral: 200-500 nm -velocidad de barrido: 240 nm/min -rendija de excitación: 5 nm -rendija de emisión: 5 nm -intervalo de longitud de onda inicial: 10 nm -incremento: 5 nm - n° de registros: 50 Posteriormente se seleccionaron los intervalos de longitud de onda más adecuados para la determinación del B(a)P en cada uno de los solventes, usando para ello gráficas tridimensionales y mapas de contorno. Para la construcción de estas gráficas, se han utilizado dos programas en TURBO-BASIC diseñados en este departamento, que permiten al SURFER (programa comercial creado para la construcción de las representaciones citadas) interpretar los datos procedentes de los ficheros espectrales en ASCII obtenidos con el espectrofluorímetro (LÓPEZ DE ALDA y col., 1994 b). 1.2. EFECTO DEL OXÍGENO DISUELTO Para los estudios de desoxigenación, cada una de las soluciones anteriores es transferida a la cubeta espectrofluorimétrica y borboteada con nitrógeno gas con un flujo de 0.83 mL/seg durante dos minutos. Inmediatamente después, y con la cubeta perfectamente cerrada se realizan los espectros de fluorescencia óptimos, previamente determinados, para cada una de las soluciones estándar de B(a)P en los diferentes solventes. Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 108 1.3. ESTUDIO DE LA FOTODEGRADACIÓN DEL B(A)P EN SOLUCIÓN Se prepararon soluciones estándar de B(a)P 4 J..Lg/L en los nueve solventes objeto de estudio, realizando inmediatamente después de su elaboración, los espectros de fluorescencia previamente seleccionados para cada uno de ellos. Estas soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente y sin proteger de la luz, estudiando las variaciones de la fluorescencia a diferentes intervalos de tiempo (0, 2, 5, 14, 20 y 26 horas). 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2.1. EFECTO DEL SOLVENTE Uno de los inconvenientes que presenta la espectrofluorimetria en relación con su gran sensibilidad, es el de las impurezas (APHA, 1992). El empleo de solventes con un grado de pureza baja, conduce a espectros no planares con bandas Raman más acentuadas, y picos más o menos anchos de identidad desconocida que dificultan la obtención de datos precisos y exactos (LLOYD, 1977). Por ello, inicialmente se comprobó la transparencia y ausencia de interferencias de cada uno de los solventes estudiados mediante la realización de espectros tridimensionales y mapas de contorno; algunos de estos solventes ( dimetilsulfóxido, n-hexano y metanol) ya habían sido estudiados anteriormente (LÓPEZ DE ALDA y col., 1994 a). En las figuras 34, 35 y 36 se muestran los espectros tridimensionales y los mapas de contorno del DMSO, ACN y n-hexano. La validez o satisfactoriedad de cualquier método analítico que incluya la espectrofluorimetría como técnica de identificación y cuantificación, depende en gran medida del solvente utilizado (ACREE y col., 1990 a; T ACHIBANA y col., 1988), debiendo éste cumplir una serie de requisitos como son: grado de pureza, transparencia o ausencia de interferencias de tipo bandas Raman o Rayleigh, etc y aportar, dentro de lo posible, ciertas ventajas como son: mantener estable al analito, incrementar su fluorescencia, etc. Muchos han sido los trabajos publicados en los que se estudia el efecto de la polaridad del solvente sobre la fluorescencia de diferentes P AH (especialmente el pireno y sus derivados). Los espectros de emisión de los PAR, están compuestos de diferentes bandas de vibración, denominadas I, II, III ... , en orden progresivo. La intensidad de :\ ~ ~ ~ ~ ¡ 11 H ~ ' ~ ~ ~ ~ () ~ ~ ' 'i ~ ~' ~ K: ~ ~ ,Jb;,;e P" p..~ ~ c._."-c:J~· ::,.,. ~"' ~+c.-"'-"""' ~ -->'a¡ o«..-- , # ,.,_.JI' .#f" o~ o""<;>""' .-,#" 0 "'--<_ ~ '-'o-2" 48 46 44 42 40 38 36 34 32 21 11 1 200 224 248 272 295 319 343 367 J91 416 438 462 486 LONGITUD DE ONDA DE EXCITACION Figura 34.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno del DMSO "" 48 460 44U 42 z 400 380::: 36~ 34 H J2(f) ""o 2B[t 26fzs¡¡j 23(L ~ 21 (1) 19w (') 17 w e 15 o "' 13 o 1%- 11 ct 9 ~ - 7 ::J ¡:¡ 5 z 3 :e (1) ::S ~ '-.:: 1%- - ~ I)'Q' (1) ::S e S: ¡:¡ ~ e .._ ~ ~ ~ ~ ' ~ >\ ~ ~ g d ~ ~ #~- d' (>o.~ c...-""-0~ ' --$1"'~' ¡:,;: c.,."'-"""-~ ,ao ;,t' <;;>""-' «-----+' .-,_8''75>., ~~<V"' ' '2--.-§b ....:;;,00 #'-'~e:;,""-" 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 25 23 21 19 17 11 1 230 224 248 272 295 31 9 343 367 391 415 438 462 486 LONGITUD DE ONDA DE EXCITACION Figura 35Diagrama tridimensional y mapa de contorno del ACN 17 w 15 o 13 o 110é 9 w 7 5 5 z ~ ~ () ~ ~ - [:5 ~ ;:: ~ '<:: ~ - ~ clQ' ~ e ~ ~ - e- ..._ ..._ e ~ ~ ~ ' ~. ~' S~ n ~ ~ (\ ' ~ ~ 'i !o ' ~ ~ ~ ~ #~ f>,q§'l "'.-§!>--<..."?'-G~o..,¿;... ;y.er ""!:>"~c::t <¿...-t-e...""' . # _,, .. c::<2Q ....... & /-' ""'~ Q~ #..,_ 0.._,_-<..v<:> '-'o"" 48 46 44 a ~ t, \L¿~ 3~ ~. ·········· 1 200 Figura 36.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno del n-hexano 3 ',., S: n> ~ í} - ~ :;: n> ::S ~ 'e í} - ~ ~- n> ::S e ~ n> - e- ...... ...... ...... Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 112 cada una de estas bandas depende considerablemente del solvente en el que se encuentre el analito. Se observó, que en determinados PAH como el pireno, ovaleno, benzo(g,h,i) perileno, coroneno, benzo(a)coroneno, dibenzo(a,j)coroneno, nafto(2,3, a)coroneno y benzo( e )pireno, la intensidad de la banda de vibración I del espectro de emisión aumentaba, en función de la polaridad del solvente, permaneciendo en cambio constante la intensidad de la banda III (o banda IV en el caso del benzo( e )pireno y banda I en el dibenzo(a,j)coroneno). Esta propiedad de los PAH denominados "no alternantes" ha sido utilizada como medida cuantitativa de la polaridad de diferentes solventes 0N ARIS y col., 1988; ACREE y col., 1990 a y b; TUCKER y col., 1989, 1990 y 1991). En el caso del B(a)P, y del resto de los PAH incluídos en el grupo de "alternantes", la relación entre las bandas I y IV, permanece constante independientemente del solvente. Por otro lado, la selección del intervalo de longitud de onda (L\A.) es, probablemente el parámetro más importante para la aplicación con éxito de la espectrofluorimetría sincrónica (INMAN y col., 1982 b). El espectro tipo sincron presenta, en general, una mayor simplicidad que el espectro normal, con bandas más estrechas y mejor definidas. Sin embargo, la amplitud de las mismas está determinada en gran medida por el valor que toma el intervalo. En la elección del L\A, óptimo para el análisis del B(a)P con cada uno de los solventes (Tabla XXII), han resultado de gran utilidad, tal y como se ha apuntado en numerosas ocasiones en la literatura (VO-DINH, 1978; WEINER, 1978; INMAN y col., 1982 a y b; WEI-XI y col., 1993), las gráficas tridimensionales y, fundamentalmente, los mapas de contorno (Figuras 37, 38 y 39). En la tabla XXII se observa que los L\A. óptimos son 20 y 11 O nm para la mayor parte de los disolventes, excepto para el metano! que son 25 y 11 O nm y para el tolueno que son 20 y 100 nm. En el caso de la acetona sólo se encontró una respuesta óptima con un L\A. de 20 nm, ya que este solvente es opaco en la zona ultravioleta. La longitud de onda de excitación a la que se obtiene la máxima respuesta, para un mismo L\A. varía en función del disolvente (Tabla XXII), observándose desplazamientos de hasta S nm (384/389) cuando el L\A. es 20 y de 4 nm (295/299) para un L\A. de 110 nm (Figuras 40 a 45). Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 113 Tabla XXII.- Espectros sincrónicos óptimos y longitudes de onda de excitación máxima obtenidos para el benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio Solvente AA. 'A.exc. de máxima respuesta (nm) DMSO 20 389 110 299 Acetona 20 385 M etanol 25 380.5 110 295.5 Acetonitrilo 20 386 110 297 Benceno 20 387.5 110 298.5 Diclorometano 20 387 110 298 Cloroformo 20 387.5 110 298.5 Tolueno 20 387.5 lOO 301.5 n-Hexano 20 384 110 295 p.,Jb # gf't p...-§!> c.,..--<-,_0~ ~ _., .. ~~-t-e-""-<--'"' ' --::."a, Q~ - "'""'-'#'"--e:"""'~ #~(::>-<._~<::! '-'o"" 48 46 44 42 40 38 J6 34 32 30 28 26 25 23 2\ \\ \ 200 224 248 272 295 319 343 367 391 415 4J8 462 486 LONGITUD DE ONDA DE EXCITACION Figura 37.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en DMSO \30 \\[lé 9 ~ 7 :::J 5 z ~ ~ (') §' ~ - ~ ~ ~ :S ~ '<: ~ - ~ ¡)Q' ~ :S e ~ ~ - e ..._ ..._ ""' ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ::¡ ' ~ ~ ~ ~ e¡ ~ i'S , ~ ~ ~ ' ~ < ' " ~ r;....láb t><c:;f<!> -<....'1?-c...~o~ ::,y. ~ «..-+e,"- # ..,.~q 0.,_ Q«-- <""t-db ~o~ -#" "-:e:)'" -<..':::o <::5 --.,_..CJ 4B 46 44 42 40 3B 36 34 32 21 ,! ( 1 ( ( f ( ( ( ( ~~-( ( ~~~ 1 :.~~ 1!:. ~..! 1 !:.~~ 1\Ff.J 1 :.'; 1 ~~ 1 ~-~~ 1 ~:.,' 1 Figura 38.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en ACN 4B 460 44U 42 z ""O :Eil: 36~ 34 H J2(}) ""o 2BQé 26f25~ 23Q_ 21 ~ 19 17 w 15 o 13 o 110::: 9 ~ 7 ::J 5 z ~ (1> ("") e "' ~ - ~ ~ § ~ '<:: ~ - ~ ~}(¡' § e ~ "' ~ (1> - e .._ .._ Vt ~. ~ ~ ~' !'Í ' l<j ' ~ ~ :J n ~ ~ C) ' ~ ~ 'i Í!) ~ ~ ' >:: ~ ~ #,# ,._~ c_:"-~o~ «.-+c....""--.-<..~ ~ -->"'""' -Q<¿., ' ..,_.¿o;,¡;tf".¿i<--0+"'"" ~--tft'0..,_-<..00 "'o""" 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 25 23 2\ \9 \7 \5 \3 \\ 9 7 _,, -,~ _,I-117Íil~,l-ll~;¡lll,ll~'l'lll"l-lllilllii 111-0: o 0 1 1 1 I;IAlEI/h' 4 4 U 1 h 11111111 ,)]), 111111111111 ¡ ¡ ,1JII;p)h, 11 !~ 200 224 248 272 295 ]19 343 367 J91 415 438 462 486 LONGITUD DE ONDA DE EXCITACION 42 z ""O 380::: 36~ 34 H ]2(/) ""o 280::: 26128~ 23 o_ 2\ ¡;} 19 \7 w \5o 13 o 110::: 9 ~ 7 ~ 5 z Figura 39.- Diagrama tridimensional y mapa de contorno de benzo(a)pireno en n-hexano Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 123 Los límites de detección (LD) y cuantificación (LQ), calculados de acuerdo con las normas de la ACS (1980), se recogen en la Tabla XXIII. Se calcularon las rectas de calibrado del B(a)P en cada uno de los /1./.., óptimos seleccionados (Tabla XXIV), mediante análisis de regresión de las concentraciones de los patrones de B(a)P, medidas por triplicado, frente a las alturas de los picos con linea base (ACS, 1980). Bajo cualquiera de las condiciones ensayadas la respuesta instrumental es lineal. 2.2. EFECTO DEL OXÍGENO DISUELTO Tal vez uno de los más comunes "quenchadores" de la fluorescencia y fosforescencia sea el oxígeno molecular. En soluciones líquidas el "quenching" de moléculas orgánicas por el 02 disuelto es muy eficaz, y dependiendo del solvente del que se trate, el "quenching" puede llegar a constituir un serio problema análitico (TUCKER, 1990). Se determinó el tiempo y el flujo de borboteo con nitrógeno necesario para la eliminación total del oxígeno de la solución, realizando barridos a cortos intervalos de tiempo hasta que no se observaron incrementos en la intensidad de fluorescencia, comprobándose que la desoxigenación es completa con un flujo de 0.83 mL/seg durante 2 min. Se comprobó asimismo, que en estas condiciones no se concentraban las soluciones por evaporación del solvente, ya que al oxigenarse nuevamente la muestra, la intensidad de fluorescencia obtenida volvía a ser exactamente igual que antes del borboteo con nitrógeno. Se calcularon los LD, LQ y las rectas de calibrado, para el B(a)P en cada uno de los solventes previamente desoxigenados con nitrógeno de la misma forma que anteriormente (Tablas XXIII y XXIV). Cumpliéndose, igualmente, que bajo cualquiera de las condiciones ensayadas la respuesta instrumental es lineal. Al someter a borboteo las soluciones de B(a)P en benceno (/1./.., 110) y tolueno (/lA. 100 nm), se observó la aparición de bandas de naturaleza desconocida que se solapaban con la señal del B(a)P, haciendo imposible su correcta cuantificación. Estas interferencias probablemente se deban a impurezas del solvente, cuya fluorescencia pasa desapercibida si la solución no es sometida a desoxigenación. Este problema se podría soluccionar restando a estos espectros, los obtenidos tras someter a borboteo el propio solvente. Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 124 TABLA XXIII.- Límites de detección y de cuantificación del benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio, en cada uno de los espectros sincrónicos óptimos antes (Loa y LDa) y después (LDb y LQb) del borboteo con nitrógeno Solvente .1.1.. nm DMSO 20 110 Acetona 20 M etanol 25 110 Acetonitrilo 20 110 Benceno 20 110 Diclorometano 20 110 Cloroformo 20 110 Tolueno 20 100 n-Hexano 20 110 a)Solución oxigenada b)Solución desoxigenada LDa l121L 0.027 0.03 0.032 0.043 0.044 0.039 0.058 0.04 0.03 0.053 0.086 0.12 0.13 0.14 0.78 0.20 0.07 LQa LDh LQh LQafLQb l121L l121L l121L 0.09 0.02 0.08 1.13 0.12 0.02 0.10 1.20 0.12 0.008 0.03 4.00 0.14 0.014 0.05 2.80 0.17 0.013 0.05 3.40 0.16 0.01 0.05 3.20 0.19 0.02 0.05 3.80 0.17 0.04 0.14 1.21 0.13 0.18 0.02 0.08 2.25 0.29 0.04 0.15 1.93 0.38 0.061 0.18 2.11 0.44 0.060 0.20 2.20 0.49 0.066 0.22 2.23 1.99 0.65 0.03 0.08 8.10 0.23 0.009 0.03 7.67 Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 125 TABLA XXIV.- Rectas de calibrado del benzo(a)pireno en los nueve solventes objeto de estudio correspondientes a cada uno de los espectros sincrónicos óptimos, antes (a) y después (b) del borboteo con nitrógeno Solvente AA. Recta de calibradoa r Recta de calibradob r UF=A[] +B UF=A[] +B A B A B DMSO 20 21.59 0.079 0.9999 23.56 0.067 0.9999 llO 22.85 -0.455 0.9999 26.81 -0.561 0.9999 Acetona 20 6.24 0.189 0.9999 24.12 -1.007 0.9999 M etanol 25 9.ll -0.432 0.9997 28.19 -0.333 0.9999 llO 10.8 -0.096 0.9996 34.61 -1.402 0.9999 Acetonitrilo 20 7.07 -0.236 0.9998 24.72 -0.849 0.9999 llO 8.77 0.098 0.9997 30.70 -0.869 0.9999 Benceno 20 10.6 0.152 0.9999 25.71 2.127 0.9997 llO 10.2 -0.645 0.9999 Diclorometano 20 8.55 0.910 0.9990 19.02 0.262 0.9990 llO 10.1 0.913 0.9998 19.96 2.535 Cloroformo 20 8.48 -0.577 0.9999 18.01 -1.730 0.9996 llO 9.29 -0.395 0.9999 19.92 -2.665 0.9993 Tolueno 20 6.40 -1.251 0.9998 16.4 -1.201 0.9999 100 5.06 -0.043 0.9999 N-hexano 20 3.79 0.219 0.9999 29.2 0.967 0.9999 llO 4.08 0.342 0.9999 32.1 -0.707 0.9999 a) Solución oxigenada b) Solución desoxigenada Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 126 A la vista de los resultados se puede concluir que la inhibición de la fluorescencia provocada por el oxígeno disuelto, varía en función del solvente en el que se encuentre el B(a)P, observándose que los LD y LQ llegan a incrementarse hasta prácticamente 8 veces en el caso del B(a)P en n-hexano manteniendo éstos practicamente constantes en el caso del benceno y del DMSO (Figuras 40 a 45). 2.3. DEGRADACIÓN DEL B(A)P Es conocido que los PAH (y especialmente el B(a)P) son rapidamente degradados fotoquímicamente, siendo fuertemente reactivos al oxígeno y a la luz (LEBO y col., 1991; TAKATSUKI y col., 1985; THOMAS y col., 1985) . Durante el transcurso de este estudio pudimos observar que la sensibilidad del B( a )P a la luz se incrementaba considerablemente cuando el analito se encontraba en solución en determinados solventes. Para estudiar este fenómeno en detalle, se examinó cómo se modificaba la fluorescencia del B(a)P en función del tiempo, manteniendo las soluciones a temperatura ambiente y expuestas a la luz. Se comprobó así que la fotolabilidad del B(a)P es dependiente del solvente en el que se encuentre. Si se representa mediante rectas de regresión (Figuras 46, 47 y 48) la variación de la fluorescencia del B(a)P frente al tiempo en los solventes estudiados, se obtienen tres tendencias diferentes que se recogen en la siguiente Tabla : TABLA XXV.- Pendientes y coeficientes de regresión (r) obtenidos al representar la variación de la intensidad de fluorescencia (UF) del benzo(a)pireno en los diferentes solventes, frente al tiempo Solvente Pendiente r n-Hexano -0.01 -0.055 ACN -0.04 -0.247 Benceno -0.06 -0.465 Tolueno -0.07 -0.180 --~- ------- ---------- Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 127 TABLA XXV (Continúa) Solvente Pendiente r M etanol -0.16 -0.649 DMSO -0.26 -0.776 TABLA XXV (Continúa) Solvente Pendiente r Acetona -0.67 -0.977 Cloroformo -0.93 -0.952 Diclorometano -1.06 -0.948 A la vista de los resultados se observa que cuando el B(a)P se encuentra en solución en n-hexano, ACN, benceno o tolueno, las pendientes aunque negativas, son próximas a cero; lo cual indica que la degradación del analito es practicamente nula. En el caso del metanol y del DMSO, las pendientes se incrementan con respecto a las anteriores, poniendo de manifiesto un aumento en la degradación del B( a )P en función del tiempo. Por último, cuando el analito se encuentra en acetona, cloroformo o diclorometano, las pendientes son mucho mayores, lo que significa una significativa disminución de la fluorescencia en periodos de tiempo cortos. Para demostrar que realmente este fenómeno era debido a la luz, se repitió la experiencia pero esta vez manteniendo las soluciones en la oscuridad, permaneciendo en este caso las soluciones inalterables. Este hecho tiene especial relevancia considerando que estos solventes se utilizan comunmente en los largos métodos analíticos de P AH sin tomar ningún tipo de precaución en la mayor parte de los casos, así por ejemplo los métodos propuestos por WILD y col. (1991) y MOTHERSHEAD y col (1992) analizan zanahorias y cangrejos incluyendo ambos una extracción con diclorometano durante 19 y 48 horas respectivamente; SANDELL y col. (1993) y LARSSON y col. (1988) extraen durante varias horas usando el primero una mezcla de acetona:tolueno 1 : 1 en lodos, y acetona el segundo en alimentos ahumados y cocinados a la parrilla. AL Y AKOOB y col. (1994) extraen pescados con metanol:cloroformo (2:3) durante 3 horas ... Slope: -9.985535 Intercept: 14.36 15.98 + y Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 128 N-HEXANO Standard Deviation: 1.976 Correlation Coefficient: -9.05483 + + 13.32~ ____ + ______ ~--------------------------------+------------~ 8 U Slope: -9.83494 Intercept: 26.99 28.37 + + ACETONITRILO Standard Deviation: 1.442 Correlation Coefficient: -8.2468 y¡---~--------~----------------~+~------------------------~+ + 24.5~--~~--------------------~--------------------------~ 8 26 Slope: -9.86361 Intarcept: 49.92 41.78 + + y BENCENO Standard Deviation: 1.273 Correlation Coefficient: -9.465 + + + 38.8~------------------------------------------~----------~ 8 U Figura 46.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en n-hexano, ACN y benceno Slope: -8.96896 Intercept: 43.51 48.4 + + Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 129 TOLUENO Standard Deviation: 3.954 Correlation CoeFFicient: -9.1894 + y¡-------------------------------~+ + 37.81~--~~----------------------~--------------------------~~ 9 26 Slope: -9. 1579 Intercept : 28. 19 31 .11 + y METANOL Standard Deviation : 1 . 945 Correlation CoeFFicient: -9.6491 23.29~--------------------------------------------~~----------~ 9 u Slope: -9.2696 Intercept: 89.95 84.42 + y DIMETILSULFÓXIDO Standard Deviat ion: 2. 231 Correlation Coefficient: -8.7755 + 75.17~------------------------------~~----------~----~------~ 9 26 Figura 47.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en tolueno, metanol y DMSO Slope: -9.6722 Intercept : 27 . 46 29.8 + y Slope: --8.9392 Int8J'cept: 28.27 31.81 + Slope: -1.964 Intercept: 48.53 45.22 + Efectos del solvente y del oxígeno disuelto 130 ACETONA Standard Deyiation: 1 .534 Correlation CoeFficient: -9.9773 CLOROFORMO Standard DeYiation: 3.142 Correlation Coefficient: -9.9521 DICLOROMETANO Standard DeYiation: 3.773 Correlation Coefficient: -9.9475 Figura 48.- Variación de la fluorescencia del benzo(a)pireno frente al tiempo en acetona, cloroformo y diclorometano DETERMINACIÓN DE BENZO(a)PIRENO EN AROMAS DE HUMO HIDROSOLUBLE MEDIANTE ESPECTROFLUORIMETRÍA SINCRÓNICA CON APLICACIÓN DE SEGUNDA DERIVADA Aromas de humo hidrosolubles 132 l. PROTOCOLO ANALÍTICO 1.1. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de aroma de humo analizadas fueron facilitadas por gentileza de distintas casas comerciales. Con algunas de las muestras se recibió la información adjunta que se transcribe a continuación: -Muestra no 1: "Emulsión marrón clara. Humo clarificado, concentrado y emulsificado en agua. Composición: agua 97%, humo concentrado 90/10 ~,?'%,cloruro ~·--·-· sódico 1.5% y gelatina 0.5 %. La dosis máxima es de 6.0 g/Kg, siendo la recomendada de 1.0-3.0 g/Kg de producto. Está contenida en frasco de plástico opaco". -Muestra no 2: "Extracto natural de humo de madera. Su empleo, oficialmente autorizado, da los mismos resultados de sabor, olor y conservación que el humo clásico. Su forma líquida permite la dosificación con precisión y la regulación de la intensidad de ahumado. Se añade en una proporción de 0.5-4 %. Está constituído por esencia vegetal aromática y extracto natural concentrado de jugo piroleñoso de maderas duras exceptuando las resinosas. Obtenido por destilaciones fraccionadas según las leyes fisicas normales. Lavado en columnas de extracción mediante vacío sin adición de productos químicos. Su densidad a 20 oc es 1180 giL. Está envasado en frasco de plástico opaco". -Muestras no 3, 5, 6 y 7: "Humos naturales para uso alimentario, obtenidos por combustión de virutas frescas de nogal, condensados al estado líquido y altamente purificados, de forma que su contenido en benzopirenos se estima inferior a 2 fJ.g/Kg. Se ha controlado asimismo la presencia de carbonilos y fenoles. Pueden sustituír perfectamente al ahumado tradicional en todos los tipos de elaborados, proporcionando el color, aroma y sabor típicos de "ahumado" y simplificando los procesos de elaboración, reduciendo los tiempos y el coste. Están envasados en frascos de plástico opaco" (Tabla XXVI). -Muestra no 3: Aconsejado para aplicarlo en forma de ducha o en baño de inmersión, bien puro o diluí do en agua hasta una relación máxima 1 :5 (lo más recomendable es 1: 1 ). Lógicamente la intensidad de sabor a humo que tomará el elaborado dependerá del tiempo de inmersión o ducha (desde unos segundos a unos minutos) y de la concentración de la solución de humo. La dosis será de 2-2.5 g/Kg de embutido.