Amidas de hexosas y del ácido (-)-shikímico: síntesis y estudio de sus propiedades de inhibición de la recristalización del hielo, gelificación e inhibición de neuraminidasas

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Pablo López Carracedo Tesis doctoral Amidas de hexosas y del ácido (-)-shikímico: síntesis y estudio de sus propiedades de inhibición de la recristalización del hielo, geli昀椀cación e inhibición de neuraminidasas Santiago de Compostela, 2024 Programa de doctorado en Ciencia y Tecnología Química TESIS DOCTORAL AMIDAS DE HEXOSAS Y DEL ÁCIDO (-) -SHIKÍMICO: SÍNTESIS Y ESTUDIO DE SUS PROPIEDADES DE INHIBICIÓN DE LA RECRISTALIZACIÓN DEL HIELO, GELIFICACIÓN E INHIBICIÓN DE NEURAMINIDASAS Autor: Pablo López Carracedo Directores: Juan Carlos Estévez Cabanas y Ramón Estévez Cabanas Tutor: Juan Carlos Estévez Cabanas PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA SANTIAGO DE COMPOSTELA JULIO 2024 AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer, en primer lugar, a mis directores de tesis: el Prof. Dr. D. Juan Carlos Estévez Cabanas y el Prof. Dr. D. Ramón Estévez Cabanas por ofrecerme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación y por sus enseñanzas, dedicación, confianza, paciencia, esfuerzo, y especialmente, por el apoyo a lo largo del proceso de investigación y redacción de esta tesis. Al Prof. Dr. D. Eddy Sotelo, por su ayuda y enseñanzas en el campo de la farmacología, así como por las oportunidades que me ha brindado. Al Prof. Dr. D. Víctor Sánchez Pedregal por su ayuda y enseñanzas en el campo de la RMN. A los técnicos del CIQUS y del CACTUS, especialmente a Arcadio Guerra, Mª Carmen Mosquera, Manuel Martín y Raquel Antón, por su apoyo y horas compartidas, y todo lo que me han enseñado sobre diferentes técnicas y equipos. Y en especial a la Dra. Paula Munín, por todo el tiempo que te has tomado conmigo para enseñarme acerca de la técnica de RMN y, sobre todo, de la vida. También quería agradecer a las empresas Galchimia y a Landsteiner por el apoyo económico brindado durante el desarrollo de esta tesis doctoral. A todos mis compañeros y amigos del P2L2, con los que he compartido largas horas de trabajo, alegrías y decepciones: A mis tres mentores dentro del laboratorio: El Dr. Lino Balo, uno de los mejores químicos que he conocido hasta ahora, y que en el poco tiempo que compartimos en el laboratorio me enseñó muchísimo sobre química. La Dra. María Campos, que me ha aguantado como su pupilo durante los años del trabajo de fin de grado y de fin de máster, y que me ha enseñado prácticamente todo lo que sé de síntesis. Al Dr. Alberto Fernández, con el que he compartido el viaje más largo y me ha enseñado que siempre hay algo nuevo que aprender, después de darme una paliza al baloncesto. A mis compañeros de laboratorio con los que he compartido la mayoría de las jornadas de trabajo y estudio: A David, puesto que hemos vivido paralelamente este viaje, y aún después de siete años, no sé cuándo está hablando en serio y cuando en broma. A Capi, que es un excelente químico y luchador, pero aún más excelente simio, te echo de menos tío. A Antonio, que a pesar de ser el último en llegar ya es uno más de la familia, cuidado con la música que pones. Y sobre todo a Sara, mi primera pupila, por aguantar todas mis idas y venidas en el laboratorio durante cuatro largos años, por apoyarme en los momentos más complicados en el laboratorio y por celebrar conmigo las pequeñas victorias, eres la mejor compañera de laboratorio que alguien pueda desear. Pablo López Carracedo A los compañeros más volátiles: A María, gracias por hacer del laboratorio un lugar más ameno con tus bromas y tu buena cultura de trabajo. A Jorge, nunca olvidaré las sonrisas que nos sacabas con tus idas de olla. A Fernán, por controlar tus pensamientos intrusivos en el laboratorio y no comerte una vitrina. A todos los amigos que he hecho en el CiQUS durante este período, en especial a mis “compañeros” de laboratorio del P2L1 y del P2L6, muchísimas gracias por los buenos momentos que hemos pasado y por el apoyo que me habéis dado en los momentos complicados, sois unos grandes chic@s. A mis amigos de toda la vida: Samu, Juanma, Pedro, Tejo, Jorge, Manu, Marcos y María, muchas gracias por aguantarme y por apoyarme en los momentos complicados, y por darme siempre alegrías y buenos recuerdos. A mi familia: mi abuela Pilarín, gracias por preguntarme siempre que tal el cole; a todas mis tías, muchas gracias por el apoyo y los ánimos; a mi padrino y a mi madrina, por estar siempre ahí. A mi padre Pablo y a mi madre Rosa, por apoyarme siempre en las decisiones que tomo y animarme a no dejar de luchar por lo que quiero, muchísimas gracias por enseñarme los valores de la vida, la cultura del esfuerzo y la curiosidad por aprender. A mis hermanos Yago y Carlota, por ayudarme siempre que os necesito, aunque sea con una colleja de vez en cuando, que, si no me la dais vosotros, no me la da nadie. Muchísimas gracias por todo el apoyo que me habéis dado y por ayudarme a desconectar a través del deporte, aunque os sigo ganando un 1vs1. Y sobre todo a Marina, por iniciar este viaje conmigo y compartir cada detalle del mismo, por animarme en cada momento, bueno o malo, por ayudarme a combatir el estrés y la ansiedad, por celebrar cada logro con una buena cena, por las risas y los lloros, por todo el cariño que me has dado durante los últimos cinco años, pero por encima de todo, por ser la mejor madre que Ratón podría tener. Te quiero. “Every choice you have made, has led you to this moment” -D.M.- Índice Abreviaturas .............................................................................................................. 15 Resumen ..................................................................................................................... 19 1 Introducción ..................................................................................................... 31 1.1 Amidas ....................................................................................................... 33 1.2 Amidas polihidroxiladas ............................................................................ 35 1.3 Inhibición de la recristalización del hielo .................................................. 37 1.4 Gelificación ................................................................................................ 42 1.4.1 LMOGs: consideraciones generales ...................................................... 44 1.4.2 LMOGs: clasificación ............................................................................ 45 1.4.2.1 Organogeles ..................................................................................... 45 1.4.2.2 Hidrogeles ........................................................................................ 47 1.4.3 Caracterización de LMOGs ................................................................... 48 1.4.4 Aplicaciones ........................................................................................... 50 1.5 Diseño y síntesis de fármacos .................................................................... 51 1.5.1 Reacciones multicomponente en la síntesis de fármacos ...................... 56 2 Objetivos y plan de trabajo ............................................................................. 59 2.1 Objetivo 1. Síntesis y estudio de la actividad de inhibición de la recristalización del hielo de amidas, bisamidas y poliamidas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico ................................................................................................. 61 2.1.1 Subobjetivo 1.1. Amidas, bisamidas y poliamidas derivadas de hexosas ............................................................................................... 61 2.1.1.1 Amidas polihidroxiladas alquílicas .................................................. 61 2.1.1.2 Bisamidas polihidroxiladas alquílicas. ............................................ 62 2.1.1.3 Poliamidas polihidroxiladas alquílicas ............................................ 63 2.1.1.4 Amidas y bisamidas alquílicas derivadas de hexosas parcialmente deshidratadas ......................................................................................................... 63 2.1.1.5 Amidas polihidroxiladas arílicas ..................................................... 64 2.1.1.6 Bisamidas polihidroxiladas arílicas ................................................. 65 2.1.1.7 Poliamidas polihidroxiladas arílicas ................................................ 66 2.1.2 Subobjetivo 1.2. Amidas y bisamidas derivadas del ácido (-)- shikímico… ...................................................................................................67 2.1.2.1 Amidas polihidroxiladas alquílicas anfifílicas ................................. 67 2.1.2.2 Bisamidas polihidroxiladas alquílicas bolanfifílicas ....................... 67 2.1.3 Subobjetivo 1.3. Ensayo de inhibición de la recristalización del hielo . 68 15 Abreviaturas Abreviaturas y acrónimos 17 Abreviaturas y acrónimos 4-MUNANA Ácido 2’-(4-metilumberiferil)-α-D-acetil neuramínico AcOEt Acetato de etilo ADN Ácido desoxirribonucleico AFGPs Glicoproteínas anticongelantes AFM Microscopía de fuerza atómica AFPs Proteínas anticongelantes Arg Arginina ARN Ácido ribonucleico BA Anticongelantes biológicos Boc terc-Butoxicarbonilo Cbz Benciloxicarbonilo ccf Cromatografía en capa fina CD Dicroísmo circular cmg Concentración mínima de gelificación d Doblete DCM Diclorometano DIC N,N-Diisopropilcarbodiimida DIPEA Diisopropiletilamina DIS Modulación dinámica del hielo DLS Dispersión dinámica de la luz DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DRX Difracción de rayos X EM Microscopía electrónica GP Grado de polimerización HATU Hexafluorofosfato de 3-oxido-1-[Bis(dimetilamino)metilen]- 1H-1,2,3-triazol[4,5-b]piridinio HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia IC50 Concentración inhibitoria media IR Infrarrojo IRI Inhibición de la recristalización del hielo Pablo López Carracedo 18 LMOGs Gelificantes orgánicos de bajo peso molecular m multiplete m/z Relación masa/carga MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico mM Concentración milimolar Ms Metilsulfonato MS Espectrometría de masas NOE Efecto nuclear Overhauser PBS Tampón fosfato salino PEG Polietilenglicol ppm Partes por millón PVA Polivinilalcohol PVC Cloruro de polivinilo PyBOP Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio q Cuartete Rf Factor de retención RMN Resonancia magnética nuclear SEM Microscopía electrónica de barrido T Temperatura t Triplete TEM Microscopía electrónica de transmisión Tf Trifluorometilsulfonato TFA Ácido trifluoroacético TH Histéresis térmica THF Tetrahidrofurano Ts para-Toluensulfonato UV Ultravioleta 19 Resumen Resumen 21 Esta tesis doctoral abarca las posibilidades que ofrecen las amidas polihidroxiladas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico (24) como inhibidores de la recristalización del hielo y como agentes gelificantes, así como las amidas derivadas del oseltamivir (34) como inhibidores de neuraminidasas. Inhibidores de la recristalización del hielo: La contribución más relevante en el campo de los inhibidores de la recristalización del hielo (IRI) de bajo peso molecular lo constituye la N-octil-D-gluconamida (9b) con la inhibición más baja reportada para este tipo de moléculas (10% a 0.5 mM). Basándonos en la estructura de esta molécula diseñamos en el primer capítulo de esta Tesis Doctoral una quimioteca de moléculas variando su parte hidrofílica y su parte hidrofóbica, con la intención de obtener información sobre la relación entre la estructura de estas moléculas y su actividad IRI, así como para poder obtener moléculas una actividad IRI mayor. La síntesis de estas moléculas se llevó a cabo mediante una reacción de amidación entre las lactonas XX y una amida, bisamida o poliamida, permitiéndonos obtener la quimioteca de forma sencilla y económica. El estudio de la actividad IRI de las moléculas sintetizadas nos condujo a los siguientes resultados: - La actividad IRI de la N-octil-D-gluconamida (9b) es altamente dependiente de la estereoquímica de D-glucosa que presenta su parte hidrocarbonada, toda vez que la sustitución de ésta por otras estereoquímicas (D-galacto, D-gulo y L-ido) conduce a una disminución drástica de esta actividad. Pablo López Carracedo 22 % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 92 (Gulo-C8) 23,20 22 mM 93 (Ido-C8) 54,79 22 mM 121 (Gal-C8) 70,00 0,5 mM - La actividad IRI de la N-octil-D-gluconamida (9b) es también altamente dependiente de la longitud de su cadena alquílica ya que una disminución o un incremento de la misma conduce a una disminución de su actividad. % Crecimiento mM 9a (Glu-C4) 66,36 22 mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 9c (Glu-C12) 84,21 1 mM 9d (Glu-C16) - i - La modificación de la estructura de la N-octil-D-gluconamida (9b) uniendo mediante enlaces amida dos unidades de D-glucosa a los extremos de una cadena hidrocarbonada de longitud variable es sin embargo favorable, dando lugar a la molécula con la menor actividad IRI reportada hasta la fecha (8,15%, a 2 mM), para el caso de la cadena de octano 94b, y mejorándose la actividad en todos los demás casos, observándose por primera vez que este tipo de moléculas bolaanfifílicas presentan mejores propiedades IRI que su correspondientes anfifílicas. Resumen 23 % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 94a (Glu-C4-Glu) 55,64 22 mM 94b (Glu-C8-Glu) 8,15 2 mM 94c (Glu-C12-Glu) 36,81 1,8 mM 94d (Glu-C16-Glu) 71,98 0,8 mM - Las estructuras derivadas de N-octil-D-gluconamida (9b) del tipo poliamida (triamida y tetramida) en las que tres o cuatro unidades de D-glucosa están unidas por medio de enlace amida a una parte central hidrocarbonada, demostraron que este tipo de disposición presenta una baja actividad IRI. % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 135 (Glu-X3-CH3) 69,74 22 mM 139 (Glu-X4) 58,17 22 mM - También exploramos la posibilidad de sustituir la parte hidrocarbonada de la N-octilD-gluconamida (9b) por una unidad hidrocarbonada que alterne metilenos entre los carbonos sustituidos con hidroxilos, por su mimetismo con el PVA, tanto en su versión anfifilica como bolaanfifílica, pero esta variante estructural también mostró baja actividad IRI. Pablo López Carracedo 30 - Las amidas 167 a 178 son amidas primarias y han sido sintetizada a partir de oseltamivir (34) mediante una reacción de Strecker, ante la imposibilidad de hacerlo mediante una reacción de Ugi. - Las lactamas 111 y112 han sido sintetizada a partir de oseltamivir (34) mediante una reacción de adición de Michael. - Los ensayos de la actividad de estas amidas derivadas de oseltamivir (34) como inhibidores de neuraminidasas están en fase de realización. 31 1 Introducción Introducción 33 1.1 Amidas Las amidas son uno de los tipos más importantes de compuestos orgánicos que desde el punto de vista de su estructura se caracterizan por presentar como grupo funcional un carbonilo terminal unido a un átomo de nitrógeno. Este átomo de nitrógeno puede estar a su vez unido a dos átomos de hidrógeno (amidas primarias), a un átomo de hidrógeno y uno de carbono (amidas secundarias) o a dos átomos de carbono (amidas terciarias).1 Esta estructura confiere a las amidas propiedades particulares y una amplia gama de aplicaciones. Figura 1. Estructura general de las amidas primarias, secundarias y terciarias. Desde el punto de vista de sus propiedades, las amidas son compuestos de gran interés especialmente debido a que: - Presentan puntos de fusión y ebullición más altos que los hidrocarburos y los alcoholes de masa molecular similar, debido a los enlaces de hidrógeno que pueden formarse entre las moléculas. - Son solubles en agua y en muchos disolventes orgánicos, debido a la polaridad del grupo carbonilo y a su capacidad para formar enlaces de hidrógeno con el disolvente. - Son débilmente ácidas. - Pueden mostrar propiedades básicas débiles, especialmente cuando están fuertemente solvatadas o en presencia de ácidos fuertes. - Pueden reaccionar con ácidos fuertes para formar sales y con bases fuertes para formar amiduros. - Muestran resonancia entre los pares de electrones no compartidos en el átomo de nitrógeno y el enlace doble carbono-oxígeno, lo que les confiere unas propiedades conformacionales especiales.2 - Pueden actuar como ligandos en complejos metálicos, formando enlaces coordinados con iones metálicos. - Por último, son moléculas muy estables, aunque en ciertas condiciones pueden hidrolizarse para dar lugar a sus constituyentes: ácido carboxílico y amina. Figura 2. a) Formación de enlaces de hidrógeno entre pares amida. b) formación de enlace de hidrógeno con el agua. c) Resonancia del grupo amida. En cuanto a su incidencia, las amidas se encuentran ampliamente distribuidas en la Naturaleza, estando presentes en una amplia variedad de compuestos biológicos, como: Pablo López Carracedo 34 - Péptidos y proteínas: el enlace peptídico, mediante el cual los aminoácidos se unen consecutivamente para formar estructuras tridimensionales, es un enlace de tipo amida. - Ácidos nucleicos: tanto en el ADN como en el ARN existen enlaces de tipo amida que confieren rigidez estructural a estos compuestos y la posibilidad de interacciones por enlace de hidrógeno intere intra-moleculares. - Enzimas: muchas enzimas presentan grupos amida en sus sitios activos, lo que les permite formar enlaces de hidrógeno con las moléculas diana. - Metabolitos: un gran número de moléculas pequeñas con grupos amida son metabolitos en muchas rutas metabólicas en organismos, siendo precursores de moléculas más complejas. Figura 3. Cotinina (1), un metabolito de la nicotina del tabaco. Uridina (2), un nucleósido con enlace amida. Romidepsina (3), un anticancerígeno con estructura peptídica. Pero las amidas no naturales también tienen una gran relevancia en varios campos científicos y muchas aplicaciones industriales, destacando: - Materiales poliméricos, conocidos como poliamidas, obtenidas por polimerización de monómeros a través de enlaces amida, como los nailon, las aramidas o los poliaspartatos. Se utilizan habitualmente en productos textiles, de automoción, utensilios de cocina y ropa deportiva por su gran durabilidad y resistencia.3 - Productos farmacéuticos. Una gran cantidad y variedad de estructuras farmacológicamente activas son también amidas. - Otros productos de interés industrial como aditivos alimentarios, herbicidas,4 lubricantes o gelificantes tienen también estructura de amida. Figura 4. Poliaspartato potásico (4), un edulcorante empleado en viticultura. Paracetamol (5), un conocido fármaco. Aspartame (6), un edulcorante de uso habitual en la industria alimentaria. 7, Un agente herbicida recientemente descubierto. Desde el punto de vista de sintético, las amidas se obtienen por condensación de ácidos carboxílicos con aminas. Este proceso es endotérmico y requiere de un aporte de energía, generalmente en forma de calor, por lo que no es factible en la mayoría de los casos.5 Por lo tanto, suele ser necesario transformar el ácido carboxílico en un derivado con el grupo carbonilo activado y llevar a cabo sobre él la reacción con la amina (ver Esquema 1) Introducción 35 Esquema 1. Esquema del mecanismo de acoplamiento entre un ácido carboxílico activado con un grupo saliente genérico (GS) y una amina primaria. Este proceso, por su enorme importancia sintética ha sido profusamente estudiado y son muchísimos los métodos de formación de enlaces amida publicados, desde los primeros basados en la transformación del ácido carboxílico en uno de sus derivados (cloruro de ácido, anhídrido de ácido o éster) hasta los más sofisticados que utilizan agentes activantes como diimidas (DIC), derivados de éstas (HATU), fosfonatos (PyBOP), etc.6 Sin embargo, el estudio de la formación de enlaces amida continúa siendo un tema de investigación actual, porque los métodos existentes están llegando a sus límites y la preocupación por los elevados precios de algunos de los reactivos usados, así como por los residuos que éstos generan es cada vez mayor.7 1.2 Amidas polihidroxiladas De todos los compuestos que presentan grupos amida, cabe destacar en esta tesis doctoral las amidas polihidroxiladas, moléculas bifuncionales que presentan un grupo amida y al menos dos grupos hidroxilo en su estructura. La presencia de estos grupos funcionales otorga a este tipo de moléculas un extraordinario potencial en el ámbito científico. Desde el punto de vista biológico, la capacidad de asociación intere intra-molecular por fuerzas de enlace débil se ve enormemente acrecentada, lo que les confiere un gran potencial de estructuración macromolecular.8 Desde el punto de vista químico, la gran versatilidad del grupo funcional amida y la posibilidad de funcionalización de los grupos hidroxilos que hace que estas moléculas sean muy atractivas en síntesis orgánica.9 Las amidas polihidroxiladas se suelen asociar a productos naturales, puesto que se encuentran presentes en numerosos organismos tanto vegetales como animales, como es el caso del ácido N-acetil-neuramínico (8). Figura 5. Ácido N-acetil-neuramínico (8), una amida polihidroxilada que interviene en muchos procesos biológicos. Por lo tanto, la obtención de amidas polihidroxiladas a partir de productos naturales es una posibilidad interesante, que se ha explorado en el pasado. Pero se ha encontrado con la dificultad de que la mayoría de los productos naturales son difíciles de obtener a gran escala y de forma económica. Sin embargo, la preparación de amidas polihidroxiladas sintéticas ha ganado peso en los últimos años, empleando productos naturales de bajo coste y fácil obtención para sintetizar compuestos complejos de manera económica. Pablo López Carracedo 36 La síntesis de amidas polihidroxiladas se puede llevar a cabo de diferentes formas: por procesos de oxidación de amidas insaturadas, procesos de reducción de amidas con grupos carbonilo presentes o procesos de acoplamiento entre ácidos y aminas hidroxilados, siendo este último el más versátil y empleado. En efecto, el uso de ácidos polihidroxilados y aminas no hidroxiladas, ácidos no hidroxilados y aminas polihidroxiladas o bien ácidos polihidroxilados y aminas polihidroxiladas, mediante una reacción de acoplamiento, es uno de los métodos más sencillos para la obtención de amidas polihidroxiladas. Esto es debido a la gran variedad de ácidos y aminas, naturales o sintéticos, disponibles y la versatilidad que conlleva este acoplamiento. Un ejemplo de ello puede ser la N-octil-D-gluconamida (9b), que puede obtenerse fácilmente, con buen rendimiento y en un solo paso por reacción de la Dgluconolactona con n-octilamina. Figura 6. N-Octil-D-gluconamida (9b), ejemplo de amida polihidroxilada sintética. Como ya hemos dicho, las amidas polihidroxiladas presentan una elevada capacidad de estructuración macromolecular, debido al gran número de enlaces de hidrógeno que se pueden formar tanto a través de sus grupos amida como de sus grupos hidroxilo.10, 11 Esto se ve acrecentado en aquellas que son de naturaleza anfifílica, en las que las diversas fuerzas de enlaces débiles que pueden formar (enlace de hidrógeno, -stacking,12 fuerzas de Van der Waals13) se suman con las interacciones anfifílico/anfipático, lo que permite que generen estructuras macromoleculares ordenadas o interacciones con otras moléculas o con receptores biológicos, de donde viene su potencial en campos como la medicina, la gelificación de disolventes o la inhibición de la recristalización del hielo, que destacamos por ser objeto de estudio en esta Tesis Doctoral, pero también en muchos otros. Introducción 37 1.3 Inhibición de la recristalización del hielo La recristalización del hielo, como todas las recristalizaciones, es un proceso termodinámicamente favorable, mediante el cual los cristales grandes de hielo, con menor grado de curvatura y por lo tanto menor energía de superficie, crecen a expensas de cristales más pequeños, con mayor grado de curvatura y por lo tanto mayor energía de superficie (Figura 7).14 Este fenómeno se conoce como maduración de Ostwald y como consecuencia de él, en el caso del hielo, se forman cristales cada vez más grandes durante el proceso de congelación, lo que repercute en un deterioro de los materiales congelados.15 Figura 7. Esquema de la maduración de Ostwald (figura adaptada de la referencia 14 de acuerdo con la licencia CC BY 4.0). Es, por lo tanto, fundamental poder influir en la recristalización del hielo inhibiéndola, y así evitar el deterioro de los materiales congelados, ya que éste es un problema de extraordinaria relevancia debido a sus importantes implicaciones en varios campos científicos y tecnológicos: - En la Medicina, para la crioconservación de células, tejidos y órganos. - En la Agricultura, para la conservación de alimentos.16 - En la Industria, para evitar la adherencia del hielo a las superficies o aumentar la resistencia a las heladas de los materiales (metales, hormigón, etc.). - En el Medio Ambiente, para evitar la nucleación de hielo en las nubes, impidiendo así la formación de granizo.17 La posibilidad de interferir en el proceso termodinámicamente favorable de recristalización del hielo, para inhibirlo, se descubrió a partir del estudio de los organismos extremófilos, capaces de vivir en condiciones extremas de temperatura y/o humedad en las que la mayoría de los organismos no podrían sobrevivir. Es el caso de los peces blénidos antárticos que viven en el Mar Antártico y son capaces de resistir temperaturas por debajo de los cero grados Celsius sin congelarse. El estudio de estos peces permitió descubrir que su resistencia en condiciones extremas se debe al hecho de que poseen unas proteínas llamadas anticongelantes biológicos,18 las cuales les permiten resistir temperaturas bajo cero sin que su sangre se congele, ni sus células se dañen por la formación de cristales de hielo. Pablo López Carracedo 38 Estos anticongelantes biológicos se pueden dividir en dos grandes grupos: proteínas anticongelantes (AFPs) y glicoproteínas anticongelantes (AFGPs).19 Figura 8. Izquierda: fotografía de un pez blénido antártico sumergido en agua y hielo. Derecha: I, estructura general de AFGPs, aisladas por primera vez de un pez blénido antártico. Las glicoproteínas anticongelantes presentan tres propiedades que son importantes para el proceso de la inhibición de la recristalización del hielo. La primera de ellas es la histéresis térmica (TH) que provoca que el punto de congelación de los organismos que las presentan esté por debajo del punto de congelación del agua. Esto se debe a la adhesión de estas glicoproteínas a las caras laterales de los cristales de hielo, como propuso DeVries en 1991 con su Modelo del Colchón, y demostró el mismo autor en 2018 utilizando glicoproteínas anticongelantes fluorescentes (Figura 9).20, 21 A diferencia del etilenglicol, uno de los compuestos más usados como anticongelantes actualmente, estas glicoproteínas no bajan el punto de congelación en función de la concentración, sino que lo hacen de manera no coligativa, a escalas de concentraciones de 300 a 500 veces inferiores a las moléculas pequeñas como el etilenglicol.20 Figura 9. Izquierda: Modelo de Colchón propuesto por DeVries. Derecha: imágenes obtenidas por el mismo autor usando glicoproteínas anticongelantes fluorescentes (figuras adaptadas de la referencia 21) La segunda propiedad que presentan estas glicoproteínas es formación dinámica del hielo (DIS) y está íntimamente relacionada con la primera (TH). Esto es debido a que, al estar la TH provocada por la unión irreversible de los BA a las caras laterales de los cristales de hielo durante su formación,22 presenta un proceso asociado que hace que los cristales de hielo crezcan en forma de bipirámides hexagonales (o espículas) en lugar de prismas hexagonales,23, 24 . Este es un proceso indeseable que genera cristales de hielo mucho más afilados y dañinos para el material congelado (Figura 10). Introducción 39 Figura 10. Efecto de la modulación dinámica del hielo en cristales de hielo. Figura adaptada de la referencia 25.25 La tercera de las propiedades de estas glicoproteínas es la inhibición de la recristalización del hielo (IRI) que evita que los cristales pequeños de hielo formados al iniciarse la cristalización crezcan durante el proceso de almacenaje y descongelación. Todavía no se conoce el mecanismo de la IRI y existen al menos dos interpretaciones, pero parece que no está relacionado con la adhesión de los anticongelantes biológicos a las caras de los prismas de cristales de hielo, sino con la capacidad de estas moléculas para estabilizarse en la interfaz entre los cristales de hielo (Figura 11), impidiendo la migración de las moléculas de agua de los cristales más pequeños a los más grandes. Figura 11. Modelo propuesto de mecanismo de inhibición de recristalización del hielo (figura adaptada de la referencia 27). Esta interpretación mecanística está respaldada por el descubrimiento de moléculas sintéticas que presentan propiedades de inhibición de la recristalización del hielo (IRI), pero no histéresis térmica (TH) y por lo tanto tampoco formación dinámica del hielo (DIS). A pesar de la alta eficacia de los anticongelantes biológicos y de que sus estructuras químicas son bastantes sencillas, como es el caso de la molécula I (Figura 8), su aplicación comercial no es posible debido a: la dificultad y el alto costo de su obtención a partir de organismos vivos y la complejidad que entraña su síntesis. Por ello, en los últimos años se han explorado alternativas, basadas en miméticos de éstos, que reduzcan el coste de producción y faciliten la síntesis. Pablo López Carracedo 46 de la cadena hidrocarbonada en la actividad de estas moléculas como geladores,44 lo que llevó a comprender que las moléculas con esta propiedad no solo deben presentar al menos una parte hidrofílica y otra hidrofóbica, sino que éstas deben estar compensadas en sus proporciones, ejemplo de ello son los ésteres tipo III o las hidroxilamidas tipo IV.45 Figura 21. LMOGs derivados de ácidos grasos. También se han descrito LMOGs derivados de azúcares donde la parte polar corresponde al azúcar y la parte apolar a cadenas hidrocarbonadas unidas a través de un conector o “linker”. Las estructuras descritas son en este caso muy variadas y van desde bencilidenmonosacáridos V46 hasta ésteres VI47 o amidas VII48 derivadas de monosacáridos. Figura 22. LMOGs derivados de azúcares. El estudio de los agentes gelificantes derivados de azucares puso de nuevo de manifiesto la importancia que tienen las propiedades dipolares en estas moléculas, ya que, como veremos más adelante, los derivados de azúcares con momentos dipolares altos (grupos hidroxilos libres) no gelifican disolventes orgánicos. Algunos derivados de aminoácidos y algunos péptidos también han mostrado actividad como LMOGs de disolventes orgánicos. Sus estructuras son también muy variadas y van desde surfactantes de aminoácidos, como los surfactantes catiónicos de L-leucina VIII,49 hasta los derivados de fenilalanina IX50 o los dipéptidos X.51 Figura 23. LMOGs derivados de aminoácidos y péptidos. Por último, están las ureas y tioureas, que no pueden clasificarse en ninguno de los grupos anteriores y que han sido estudiadas por Feringa52 dada su relación estructural con la funcionalidad amida, presente en la mayor parte de los LMOGs expuestos anteriormente. En este grupo podemos destacar las ureas XI y XIII y las tioureas XII. Introducción 47 Figura 24. LMOGs con estructura de urea o tiourea. 1.4.2.2 Hidrogeles El primer estudio racional sobre hidrogeles es debido a Hamilton y se basa en la modificación de una familia de LMOGs derivados de urea, que transformó en hidrogeles por introducción de grupos hidroxilo en sus estructuras.53 Como continuación de este trabajo, el propio Hamilton publicó en 2003 una revisión extensa sobre hidrogeles.37 La clasificación pretende una racionalización de la estructura de los hidrogeles conocidos hasta entonces, basada en sus estructuras y por lo tanto sigue una lógica muy similar a la clasificación expuesta anteriormente para los organogeles. Desde el siglo XIX se conoció la tendencia de los aminoácidos a formar hidrogeles, si bien éstos nunca resultaron ser excelentes agentes gelificantes del agua. Sin embargo, si se han publicado derivados de los aminoácidos con muy buenas propiedades hidrogelantes, como las ureas XIV, derivadas de serina.53 También se han publicado hidrogeles con estructura peptídica, fundamentalmente dipéptidos. De ellos podemos destacar el derivado de fenilalanina 13 escrito como un hidrogel sensible al pH y que ha sido objeto de numerosos estudios para comprender la relación de su estructura con sus propiedades hidrogelantes.54 Más recientemente Feringa ha publicado un interesantísimo trabajo en el que describe un nuevo tipo de agentes hidrogelantes basados en un esqueleto central de ácido cis-1,3,5-ciclohexanotri-carboxílico unido a aminoácidos XV, con excelente capacidad para formar hidrogeles termorreversibles.55 Figura 25. Estructuras de hidrogelantes con esqueleto de tipo peptídico. Los primeros compuestos hidrogelantes derivados de azúcares fueron publicados por Shinkai y consistían en monosacáridos unidos a cadenas hidrocarbonadas lineales por medio de un enlazador amida, como el compuesto 14.56 Más tarde se publicaron hidrogeles con estructura de piranosa derivados de azabenceno, como XVI, que resultaron muy interesantes porque gelifican agua con concentraciones espectacularmente bajas (0.005 % Pablo López Carracedo 48 en peso). Recientemente también se han publicado hidrogeles derivados de glucosa con propiedades fluorescentes XVII, debidas a la presencia de naftaleno en su estructura.57 Figura 26. Estructuras de agentes gelificantes derivados de azúcares. También se han descrito agentes hidrogelantes derivados de ácidos nucleicos que son nucleótidos naturales, como el guanosilmonofosfato 15, derivados de nucleósidos sintéticos, como los benzotriazoles XVIII, o también moléculas bolaanfifílicas formadas por dos nucleótidos unidos a una cadena hidrocarbonada lineal, como XIX. Figura 27. Estructuras de agentes gelificantes derivados de ácidos nucleicos. 1.4.3 Caracterización de LMOGs La naturaleza dinámica de las interacciones no covalentes que conectan las moléculas geladoras para la formación de estructuras supramoleculares o geles en el caso de los LMOGs hace que resulte difícil caracterizarlas. Para investigar completamente estos materiales blandos disponemos de un gran número de técnicas: - Técnicas físicas: test de inversión, reología. - Técnicas espectroscópicas: dispersión dinámica de la luz (DLS), dicroísmo circular (CD), espectroscopia de Infrarrojo (IR), espectroscopia ultravioleta-visible (UV), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). - Técnicas microscópicas: microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM). - Rayos-X. - Técnicas computacionales. Cada una de estas técnicas puede darnos información muy valiosa sobre el gel y debemos utilizar en cada caso aquellas que resulten más adecuadas a las características del gel que queramos estudiar: Mecanismo de gelificación, propiedades del gel o aplicaciones de éste. Introducción 49 El test de inversión o prueba de inversión de tubo es el método más sencillo y el más usado como prueba de diagnóstico inicial para determinar si una sustancia gelifica en un determinado disolvente. Está basado en provocar la disolución en caliente del agente gelificante en un determinado disolvente y esperar a que enfríe. Se considera que se ha formado un gel si pasado un tiempo se invierte el tubo y la disolución inicial tiene aspecto sólido (no fluye). El estudio de la dispersión dinámica de la luz (DLS) para estructuras de tamaño submicrométrico permite la determinación de características críticas de éstas. Es una técnica especialmente útil en la determinación del perfil de distribución de tamaño, forma e interacciones de pequeñas partículas en suspensión, así como de polímeros y sistemas supramoleculares. Por lo tanto, la DLS es un método eficiente en la caracterización de geles supramoleculares, porque el coeficiente de difusión cambia dramáticamente al formarse las estructuras tridimensionales de éstos. La espectroscopia de infrarrojo (IR), como técnica que permite ver las transiciones de los electrones involucrados en los enlaces químicos, es una técnica adecuada para observar el proceso de gelificación. Debido a que durante el mismo se producen interacciones ente las moléculas del agente gelificante y/o de las moléculas del disolvente que implican cambios en sus enlaces. Es una herramienta especialmente útil para confirmar la presencia de enlaces de hidrógeno, así como para proporcionar información sobre el papel que desempeña el enlace de hidrógeno durante el proceso de gelificación. Con frecuencia, las señales de interés (por ejemplo, el tramo de señales de los enlaces NH) aparecen solapados por el tramo de señales de los enlaces OH del agua, por lo que la caracterización por IR generalmente se lleva a cabo en muestras deshidratadas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) tanto en disolución como en fase sólida58 se utiliza como una herramienta complementaria para investigar los LMOG. Permite obtener información útil, como el tipo de interacciones intermoleculares, los valores de concentración críticos o los parámetros termodinámicos asociados con la formación de geles. Puede hacerse estudios de los efectos espaciales (NOE), de la variación de los desplazamientos químicos, de los tiempos de relajación o los cambios con la temperatura que permiten medir fácilmente la temperatura de transición del gel (Tgel).59 La microscopía óptica proporciona información sobre la estructura del gel60 pero es menos utilizada que otras técnicas debido a su baja resolución espacial, que tiene su límite en el índice de difracción. Los métodos de imagen más ampliamente utilizados incluyen técnicas de microscopía electrónica (EM). Concretamente la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Estas técnicas de alta resolución (0,2 nm) ofrecen una perspectiva de la micro y nanoestructura de gel que proporciona una vista detallada de la morfología de los agregados unidireccionales que resultan de la gelificación. Bajo las condiciones de operación estándar tanto de SEM como de TEM, se requiere que la muestra esté deshidratada (xerogel), lo que en el caso de un LMOG puede acarrear un colapso de la estructura antes de la obtención de imágenes61. La criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) es otra técnica desarrollada recientemente, idónea por sus características para la caracterización de los geles. Esto se debe principalmente al procedimiento de preparación de la muestra, que en vez de ser deshidratada y sometida a un alto vacío o a un recubrimiento metálico, se criogeniza en nitrógeno líquido, permitiendo al gel mantener totalmente su estructura sin riesgo de colapso durante el procedimiento de obtención de las imágenes.62 Pablo López Carracedo 50 Los avances significativos en las técnicas de Rayos X surgidos en las últimas dos décadas han transformado completamente las posibilidades que para los científicos ofrece esta técnica. Esto es particularmente importante en el campo de la química supramolecular, donde la resolución de las estructuras de los cristales moleculares es crucial para comprender las fuerzas de enlace débil implicadas en la formación de macroestructuras.63 También es muy importante el estudio de difracción de rayos X de polvo cristalino obtenido a partir de xerogeles. Dónde, a partir de los ángulos e intensidades de estos haces difractados, se puede producir una imagen tridimensional de la densidad de los electrones dentro del cristal. A partir de esta densidad electrónica, se pueden determinar las posiciones medias de los átomos en el cristal, así como sus enlaces químicos, su desorden y otras informaciones. Las estructuras cristalinas de rayos X también pueden explicar las propiedades electrónicas o elásticas inusuales de un material y arrojar luz sobre las interacciones de éste.64 1.4.4 Aplicaciones Un gran número de nanopartículas orgánicas (micelas, vesículas, etc) han sido ampliamente estudiadas como macroestructuras con potencial biomédico. Pero, la inclusión de especies bioactivas en estas presenta problemas como: baja solubilidad, inestabilidad química o rápida degradación. Los geles tienen ciertas ventajas respecto a las nanopartículas orgánicas, como una mayor flexibilidad y biocompatibilidad.65 De ellos, los que presentan una mayor biocompatibilidad son los hidrogeles, debido a su gran contenido de agua y a su baja tensión superficial, lo que los convierte en el biomaterial más parecido al tejido vivo natural.66 Una de las características más atractivas que presentan es la reversibilidad en el ordenamiento supramolecular, lo que permite que su estructura se desmorone dando lugar a las moléculas originales, liberando la sustancia retenida y degradándose posteriormente en el medio celular. Esta reversibilidad puede conseguirse realizando cambios en la temperatura, el pH, o mediante un estímulo fisicoquímico (luz, ultrasonidos, reacciones redox, etc.).65, 67 Algunos hidrogeles presentan una gran capacidad para almacenar compuestos bioactivos, y son capaces de liberarlos de manera controlada, lo que los convierte en excelentes “drug-carriers”. Además, algunas células son capaces de internalizar nanohidrogeles, por lo que estos pueden actuar también como “drug-deliverers” intracelulares.68 La capacidad de los hidrogeles para crear estructuras auto ensamblables, y que estas se comporten como matrices inertes en el medio celular, es de por si un gran atractivo y enormemente útil en medicina regenerativa. A mayores, estas estructuras se pueden modificar para que contengan sitios activos, como adhesivos celulares o secuencias sensibles a enzimas o proteínas. Las matrices inertes actúan llenando huecos en el tejido dañado, facilitando el contacto entre células y permitiendo así una mejor regeneración.69 Los hidrogeles sustituidos con grupos carboxilo, fosfonio, sulfonilo o amino se pueden emplear como adsorbentes de átomos metálicos o de sustancias con grupos catiónicos o aniónicos. Gracias a esta característica, algunos hidrogeles son excelentes para purificar aguas contaminadas con metales pesados, tintes, o iones tóxicos. Otras aplicaciones destacables y más concretas que presentan los hidrogeles son el uso como material para lentes de contacto, sensores de pH, biosensores, supercondensadores o regeneradores del tejido neuronal.70 Introducción 51 1.5 Diseño y síntesis de fármacos Desde la Prehistoria existieron prácticas de curación que se basaban en la experiencia directa de las personas y en el conocimiento de la Naturaleza, sobre todo del Mundo Vegetal. Las herramientas de la medicina prehistórica variaban en función del lugar, el momento y el pueblo. Incluían fundamentalmente plantas medicinales y hierbas, pero también minerales y algunas técnicas quirúrgicas primitivas; sin olvidar la motivación espiritual. Pero no fue hasta hace poco más de 2000 años en la Antigua Grecia, con la introducción de la teoría hipocrática, cuando surgió un enfoque renovado del tratamiento de las enfermedades. Según esta teoría el uso de sustancias con actividad probada se fundamentaba en teorías empíricas relacionadas con el equilibrio de los "humores" del cuerpo en: sanguíneo, melancólico, flemático y colérico. La salud y la enfermedad se consideraban una cuestión de equilibrio o desequilibrio, y los alimentos y hierbas se clasificaban según su capacidad para influir en la homeostasis natural. Más tarde, durante la Edad Media, fue el Mundo Musulmán el único que hizo importantes avances en la medicina, uno de los principales fue la fundación de hospitales y facultades de medicina universitarias. Pero el conocimiento de los medicamentos seguía siendo empírico y basado en sustancias naturales. Y así, hasta finales del siglo XVIII y principios del XIX el mundo de la farmacia seguía siendo una ciencia empírica, guiada por la medicina tradicional, heredada de antiguos medicamentos, la mayoría preparados con extractos de plantas, ninguno de los cuales respondía a una definición química de lo que hoy llamamos droga, excepto las que se aislaban como sustancias puras del Reino Mineral. La tecnología de fabricación de medicamentos era, en el mejor de los casos, rudimentaria: tinturas, cataplasmas, sopas e infusiones se hacían con extractos acuosos o alcohólicos de plantas frescas, hierbas recién molidas o secas, productos animales como huesos, grasa o incluso perlas.71 Esto último puede ilustrase con el ejemplo del extracto de hojas de la mora blanca (morus alba), comercializado desde hace más de 400 años como antidiabético, sin que se conociese hasta hace pocos años la causa de su efecto, cuando se aisló de este extracto la 1-deoxinonojirimicina (16), un potente inhibidor de la enzima glucógeno fosforilasa.72 El mundo de la farmacia y de los medicamentos cambió radicalmente a partir del desarrollo alcanzado por la Química durante la época de La Ilustración, con el descubrimiento de un gran número de sustancias, la purificación de otras y sobre todo la posibilidad de crear sustancias nuevas, con el descubrimiento de la reactividad química. Todo este conocimiento dio un nuevo giro pocas décadas después al cruzar el camino de la química a la biología e incluir, además de estas dos ciencias fundamentales, la fisiología, la bioquímica o la microbiología, afluentes naturales de la farmacología. Por lo tanto, podemos decir que a finales del siglo XIX todo este conocimiento integrado permitió el nacimiento de la farmacia y el medicamento como lo conocemos hoy en día. Quizás el ejemplo más importante y representativo de todo esto sea el descubrimiento por parte de Fleming de la penicilina 17 en la primera mitad del siglo XX, a partir del moho staphylococcus aureus, y todo el desarrollo científico posterior que dio lugar al mundo de los antibióticos y los bactericidas, prácticamente hasta nuestros días.73 Pablo López Carracedo 52 Figura 28. Ejemplos de fármacos aislados de fuente natural, 1-deoxinojirimicina (16) y penicilina (17), junto con la fuente de la que proceden, Morus alba y Stapylococus aureus, respectivamente. Sin embargo, la aparición de las superbacterias,74 resistentes a los antibióticos y bactericidas conocidos, la aparición de nuevas cepas de los virus ya conocidos, así como de nuevos virus, todo ello amplificado por la pandemia del Covid-19, ha mostrado: - La urgente necesidad de encontrar nuevos bactericidas capaces de actuar sobre las superbacterias. - También de nuevos antivirales para tratar las nuevas cepas de los virus ya conocidos, así como de los nuevos virus. Todo lo cual supone un reto multidisciplinar en el que colaboran químicos y farmacéuticos (en el diseño y síntesis de estos nuevos fármacos), farmacólogos (especialistas en el ensayo de estos nuevos fármacos sobre sus dianas terapéuticas), tecnólogos farmacéuticos (en el estudio de la administración de los fármacos) y empresas que permitan el ensayo en las varias fases del desarrollo de los nuevos fármacos y su salida al mercado. Dentro de la síntesis y el desarrollo de nuevos fármacos, el grupo funcional amida es uno de los grupos más comunes, ejemplarizado por la gran variedad de fármacos que presentan este grupo funcional, como es el caso del paracetamol (18), la moclobemida (19) o el levetiracetam (20), representadas a continuación.75,76 Figura 29. Ejemplos de fármacos con grupo amida en su estructura: el analgésico paracetamol (18), el antidepresivo moclobemida (19) o el antiepiléptico levetiracetam (20). Esto es debido al gran número de interacciones mediante enlace de hidrógeno que el grupo funcional amida puede establecer con los aminoácidos y nucleótidos que conforman la mayor parte de las dianas terapéuticas. Un mayor número de enlaces de hidrógeno en un centro activo implica mayor estabilidad en ese centro activo, lo que conlleva a una mayor actividad en la gran mayoría de casos. Pero el uso de las amidas como fármacos es también debido a la gran estabilidad de este grupo funcional. Los grupos hidroxilo también juegan un papel muy importante en el diseño de nuevos fármacos, al tratarse de un grupo funcional que también permite la formación de un elevado número de interacciones por enlace de hidrógeno. Además, el grupo hidroxilo es mucho más versátil desde el punto de vista de su reactividad química que el grupo amida. Introducción 53 Por esta razón, los compuestos que presentan ambos grupos funcionales, las amidas polihidroxiladas, son excelentes candidatos para ser empleadas como sustratos en la síntesis de fármacos. Pero, a pesar del interés anteriormente expuesto son pocos los ejemplos de fármacos que presenten un grupo amida y varios grupos hidroxilo en su estructura77, posiblemente debido a la complejidad estructural de estos fármacos. Ejemplos de ello son la pochonicina (21), la nagstatina (22) o la siastatina (23), representadas a continuación. Figura 30. Ejemplos de fármacos con estructura de amidas polihidroxiladas: pochonicina (21), nagstatina (22) y siastatina (23), inhibidoras de la N-acetil-β-D-glucosaminidasa. Otro ejemplo de un fármaco con estructura de amida, de especial interés para esta Tesis Doctoral, es el fosfato de oseltamivir (34) (conocido comercialmente como tamiflú). Una molécula que fue sintetizada, patentada y comercializada como antigripal por la empresa Gilead Science a partir del ácido (-)-shikímico (24) comercial,78 como se ilustra en el siguiente esquema. Esquema 2. Esquema de síntesis total del Oseltamivir a partir del ácido (-)-shikímico. i) 1: EtOH, SOCl2, reflujo, 3h. 2: Me2C(OMe)2, TsOH, AcOEt, 150-200 mbar, <35 °C, 4h. 3: MsCl, Et3N, AcOEt. ii) 3-pentanona, TfOH, AcOEt, 40 °C, 100 mbar. iii) TiCl4, Et3SiH, DCM, -34 °C, 6h. iv) NaHCO3, EtOH/H2O, 60 °C, 1.5h. v) NaN3, NH4Cl, EtOH/H2O, 60 °C. vi) PPh3, Et3N, MsOH, DMSO, 50 °C, 1h. vii) NaN3, H2SO4, DMSO, 35 °C, 4h. viii) Ac2O, Bu2O, 0 °C. ix) Bu3P, AcOH, EtOH/H2O, 5-20 °C. x) H3PO4, EtOH, 50-20 °C, crist. Pablo López Carracedo 54 El fosfato de oseltamivir (34) es un fármaco empleado en el tratamiento de la gripe A y B en niños y adultos desde 1999. Su mecanismo de acción puede explicarse teniendo en cuenta que en la cápsula de los virus de la influenza se encuentran entre otros componentes las neuraminidasas (enzimas) y las hemaglutininas (glicoproteínas), que son clave para la replicación vírica. Durante el proceso de replicación las hemaglutininas reconocen un receptor de ácido siálico y se une a él, mientras que las neuraminidasas rompen este enlace de ácido siálico con las hemaglutininas, promoviendo la replicación vírica.79 El oseltamivir actúa como inhibidor de este proceso, uniéndose al sitio activo de las neuraminidasas y disminuyendo la actividad de éste.80,81 Figura 31. Mecanismo de acción de la neuraminidasa y hemaglutinina en la pared celular (figura adaptada de la referencia 79). Aunque el oseltamivir es uno de los pocos antivirales conocidos para el tratamiento del virus de la influenza, tanto sus efectos secundarios, como la aparición de nuevas cepas de influenza resistentes y la creciente virulencia de las mismas, han supuesto la necesidad de buscar nuevos fármacos que puedan mejorar y/o sustituir al oseltamivir. Con este fin se han desarrollados moléculas similares al oseltamivir como los compuestos 35 y 36 descritos por el Prof. Peng Zhan y sus colaboradores, que reportaron actividades 15 y 53 veces mayores que el oseltamivir, respectivamente.82 Figura 32. Estructura de los compuestos 35 y 36 descritos por el Prof. P. Zhan. El desarrollo de estos derivados más activos se basó en modelos computacionales que partieron del estudio topológico del centro activo de la enzima Neuraminidasa tipo 1 (Figura 33, A) y de su interacción con el oseltamivir (Figura 33, B). Introducción 55 Como puede verse en la Figura 33, tanto la enzima libre como la enzima interaccionando con el oseltamivir presentan un bolsillo vacío apolar denominado cavidad 150 en el que podrían encajar distintos sustituyentes unidos al oseltamivir que podrían dar lugar a fármacos con propiedades mejoradas.83 Figura 33. Representación tridimensional del sitio activo de la enzima Neuraminidasa de tipo: A: vacía y B: con el oseltamivir estabilizado dentro de la cavidad (figura adaptada de la referencia 83). Para ello, propusieron la unión al grupo amina libre del oseltamivir de grupos aromáticos voluminosos del tipo bencilo con diversa funcionalidad, estudiando cuáles de ellos eran capaces de estabilizarse en la cavidad 150, aumentando así la afinidad del fármaco por el sitio activo de la enzima y por tanto aumentando su efectividad. Como puede apreciarse en la figura siguiente, extraída del trabajo publicado por el Prof. Peng Zhan,83 para el caso del grupo dibenzo[b,d]tiofen-2-il. Figura 34. Modelizaciones moleculares de la unión de la molécula 35 propuesta por P. Zhan al sitio activo de las neuraminidasas de A: H1N1 y B: H5N1 (figura adaptada de la referencia 83). Como puede apreciarse la modificación introducida en la estructura del oseltamivir para dar la molécula 35 hace que ésta encaje a la perfección en la cavidad 150 (inexplorada Pablo López Carracedo 62 Planteamos con este fin preparar y estudiar la actividad IRI de N-octilamidas con estereoquímica de D-gulosa y L-idosa, cuya síntesis llevaremos a cabo mediante una reacción de amidación de la n-octilamina (40) con lactonas derivadas de D-gulosa y L-idosa, preparadas a partir de diaceton-D-glucuronolactona comercial siguiendo una ruta descrita en la bibliografía. Estudiaremos a continuación la influencia que tiene en la actividad IRI de la amida 9b de referencia la modificación de la cadena alquílica, para lo que planteamos preparar alquilamidas que mantengan la sustitución y estereoquímica de la cadena polihidroxilada que resulte más activa en los experimentos anteriores (D-gluco, D-gulo o L-ido) e introducir cadenas alquílicas de 4, 12 y 16 átomos de carbono. Esquema 6. Esquema general de síntesis de amidas polihidroxiladas alquílicas XXII, cambiando la longitud de su cadena alquílica. La síntesis de estas amidas se llevará a cabo por reacción de amidación de la Lactona XX con n-butilamina (41), n-dodecilamina (42) y n-hexadecilamina (43). 2.1.1.2 Bisamidas polihidroxiladas alquílicas. Continuaremos los cambios estructurales sobre la amida polihidroxilada 9b contemplando la posibilidad basada en bisamidas bolaanfifílicas constituidas por dos unidades de la Lactona XX unidas por una cadena alquílica de distinta longitud (4, 8, 12 y 16 átomos de carbono). Esquema 7. Esquema general de síntesis de bisamidas polihidroxiladas alquílicas XXIII. Para obtener dichos compuestos, proponemos llevar a cabo una reacción de doble amidación simultánea de dos unidades de la Lactona XX con 1,8-octildiamina (45), 1,12 - dodecildiamina (46), 1,16-hexadecildiamina (47), empleando las diaminas 45 y 46 comerciales, y preparando la diamina 47 a partir del 1,16-hexadecanodiol comercial mediante una ruta descrita en la bibliografía.105 La amida con longitud de cadena de 4 carbonos será necesario prepararla a partir del 4-aminobutilcarbamato de terc-butilo comercial realizando un primer acoplamiento seguido de una hidrolisis y un segundo acoplamiento, para evitar así trabajar con la 1,4-butildiamina (44), conocida comúnmente como putrescina. Objetivos y plan de trabajo 63 2.1.1.3 Poliamidas polihidroxiladas alquílicas Contemplamos también el estudio de amidas polihidroxiladas alquílicas que incluyan en su estructura más de dos unidades de la Lactona XX (tres o cuatro) unidas a un conector alquílico en diferentes disposiciones espaciales, para poder conocer también el comportamiento IRI de este tipo de estructuras, no necesariamente anfifílicas ni bolaanfifílicas. Esquema 8. Esquema general de síntesis de poliamidas polihidroxiladas alquílicas XXV. Para ello proponemos la reacción de amidación de la Lactona XX con el hidrocloruro de la 2-(aminometil)-2-metilpropano-1,3-diamina, que será necesario preparar a partir del 2 - (hidroximetil)-2-metilpropano-1,3-diol comercial. Y también la reacción de amidación de la Lactona XX con la 2,2-bis(aminometil)propan-1,3-diamina, obtenida a partir del 2,2 - bis(hidroximetil)propan-1,3-diol comercial. 2.1.1.4 Amidas y bisamidas alquílicas derivadas de hexosas parcialmente deshidratadas Planteamos también la síntesis de amidas y bisamidas alquílicas polihidroxiladas en las que los grupos hidroxilo estén alternados con grupos metileno, dado el parecido estructural que esta sustitución tiene con el PVA, uno de los polímeros con mayor actividad IRI. Esquema 9. Esquema general de síntesis de la amida 50 y bisamida 51 derivadas de hexosas parcialmente deshidratadas. Pablo López Carracedo 64 Con este fin proponemos transformar el aldehído comercial 48 en la lactona 49, mediante una reacción de reducción de su aldehído terminal y la desprotección del acetónido mediante una reacción de hidrólisis ácida que inducirá al mismo tiempo la lactonización. Las amidas 50 y 51 se obtendrán respectivamente a partir de la lactona 49 mediante una reacción de amidación con la n-octilamina (40) y la 1,8-octildiamina (45), ambas comerciales. 2.1.1.5 Amidas polihidroxiladas arílicas Basándonos ahora en las moléculas 52 y 53, cuya síntesis y estudio de su capacidad IRI llevó a cabo el Prof. Robert Ben,29 encontrando que la arilamida polihidroxilada 52 presentaba una actividad IRI muy baja (66% a 22 mM) mientras que su derivado fluorado 53 mejoraba mucho esta actividad (10% a 11 mM). Decidimos estudiar el efecto que sobre la actividad IRI de la arilamida 52 pueden tener otros cambios en su estructura, manteniendo para ello la unidad polihidroxilada con la esteroquímica de la D-glucosa y variando la parte aromática. Figura 37. N-Fenil-D-gluconamida (52) y 4-flúor-N-fenil-D-gluconamida (53), moléculas modelo para este estudio En primer lugar, planteamos una modificación de la estructura de 52 introduciendo un espaciador de uno o dos carbonos (con las dos regioquímicas posibles) entre el anillo aromático y la cadena polihidroxilada. Esquema 10. Esquema general de síntesis de amidas polihidroxiladas arílicas (58, 59 y 60), variando el espaciador. La síntesis de las amidas 58, 59 y 60 la planteamos por reacción de amidación de la D-gluconolactona (57) con la bencilamina (54), la 1-feniletil-1-amina (55) y la 2-feniletil-1amina (56), respectivamente, todas ellas aminas comerciales. Continuaremos el estudio introduciendo sustituyentes halogenados y oxigenados en el anillo aromático de las amidas 58 y 60 estudiadas anteriormente, para conocer cómo afectan estas modificaciones a la actividad IRI. Objetivos y plan de trabajo 65 Esquema 11. Esquema general de síntesis de amidas polihidroxiladas arílicas (64, 65 y 66), introduciendo sustituyentes halogenados. Para ello planteamos la síntesis de las amidas 64, 65 y 66 derivadas de bencilamida por reacción de amidación de la D-gluconolactona (57) con las bencilaminas: 2-fluorobencilamina (61), 4-fluorobencilamina (62) y 2,4-fluorobencilamina (63), todas ellas aminas comerciales. Esquema 12. Esquema general de síntesis de amidas polihidroxiladas arílicas (73, 74, 75, 76, 77 y 78), introduciendo sustituyentes halogenados y oxigenados. También planteamos la síntesis de las amidas 73, 74, 75, 76, 77 y 78 derivadas de feniletilamida por reacción de amidación de la D-gluconolactona (57) con las feniletilaminas: 2-fluorofeniletilamina (67), 3-fluorofeniletilamina (68), 4-fluorofeniletilamina (69), 4-clorofeniletilamina (70), 4-bromofeniletilamina (71) y 3,4-dimetoxifeniletilamina (72), que también son aminas comerciales. 2.1.1.6 Bisamidas polihidroxiladas arílicas Estudiaremos en este caso las bisamidas polihidroxiladas arílicas constituidas por dos unidades de la D-gluconolactona (57) acopladas a una unidad de dibencilamina en todas las posibles orientaciones: 1,2, 1,3 y 1,4. Esquema 13. Esquema general de síntesis de bisamidas polihidroxiladas bencílicas (82, 83 y 84). Para ello llevaremos a cabo la reacción de amidación de dos unidades de la D-gluconolactona (57) con las 1,2, 1,3 y 1,4-dibencilaminas comerciales: 79, 80 y 81. Pablo López Carracedo 66 También el caso de las bisamidas polihidroxiladas arílicas constituidas por dos unidades de la D-gluconolactona (57) y fenildietilamina, ahora solo con la orientación que presente mayor actividad IRI en el caso anterior. Esquema 14. Esquema general de síntesis de la bisamida polihidroxilada fenildietílica 86. Para ello planteamos la obtención de la diamina 85 a partir del teraftaldehído comercial, mediante una reacción de adición de nitrometano y la consiguiente reducción del nitroestireno formado. A continuación, se realizará una reacción de amidación entre la amina 85 y la D-gluconolactona (57) para obtener la amida 86. 2.1.1.7 Poliamidas polihidroxiladas arílicas También planteamos el caso de poliamidas constituidas por tres unidades de la D-gluconolactona (57) unidas a una unidad de 1,3,5-benciltriamina. Esquema 15. Esquema general de síntesis de la poliamida polihidroxilada arílica 89. Para obtener la amida 89 llevaremos a cabo una reacción de amidación entre la D-gluconolactona (57) y el 1,3,5-trimetilaminobenceno (88), que se obtendrá a partir del 1,3,5trimetilhidroxibenceno (87) comercial mediante una ruta descrita en la bibliografía.106 Objetivos y plan de trabajo 67 2.1.2 Subobjetivo 1.2. Amidas y bisamidas derivadas del ácido (-)-shikímico Teniendo en cuenta que el ácido (-)-shikímico (24) es una molécula que, por su estructura, un anillo ciclohexénico polihidroxilado unido a un grupo ácido carboxílico, puede dar lugar a amidas y bisamidas polihidroxiladas mediante síntesis sencillas, con buen rendimiento y económicas, decidimos explorar también la síntesis y el estudio de la actividad IRI de amidas y bisamidas polihidroxiladas derivadas del ácido (-)-shikímico (24). Figura 38. Estructura del ácido (-)-shikímico (24). Lo que desarrollaremos en los dos subobjetivos específicos siguientes. 2.1.2.1 Amidas polihidroxiladas alquílicas anfifílicas En primer lugar, planteamos la síntesis y el estudio IRI de amidas polihidroxiladas anfifílicas, constituidas por una unidad de ácido (-)-shikímico (24) unida a una amina alquílica de 4, 8, 12 y 16 átomos de carbono. Esquema 16. Esquema general de síntesis de amidas polihidroxiladas alquílicas anfifílicas (90a, 90b, 90c y 90d), derivadas del ácido (-)-shikímico (24). La síntesis de estas amidas (90a, 90b, 90c y 90d) se llevará a cabo por reacción de amidación del ácido (-)-shikímico (24) con n-butilamina (41), n-octilamina (40), n-dodecilamina (42) y n-hexadecilamina (43). 2.1.2.2 Bisamidas polihidroxiladas alquílicas bolanfifílicas También exploraremos las bisamidas polihidroxiladas constituidas por dos unidades de ácido (-)-shikímico (24) unido a diaminas alquílicas de 4, 8, 12 y 16 átomos de carbono. Pablo López Carracedo 68 Esquema 17. Esquema general de síntesis de bisamidas polihidroxiladas alquílicas bolanfifílicas (91a, 91b, 91c y 91d). La síntesis de estas amidas (91a, 91b, 91c y 91d) se llevará a cabo a cabo por reacción de doble amidación de dos unidades de ácido (-)-shikímico (24) con la 1,4-butildiamina (44), 1,8octildiamina (45), 1,12-dodecildiamina (46) y 1,16-hexadecildiamina (47). 2.1.3 Subobjetivo 1.3. Ensayo de inhibición de la recristalización del hielo Todas las amidas sintetizadas de acuerdo con los subobjetivos específicos anteriores (2.1.1.1 a 2.2.2.2) serán sometidas al estudio de su actividad de inhibición de la recristalización del hielo mediante el test de Splat-Cooling, el cual será descrito en detalle en el apartado 3.1. El análisis de los datos obtenidos mediante este ensayo debería permitirnos establecer una relación estructura-actividad, con el fin de arrojar más luz al mecanismo por el cual transcurre el proceso de inhibición de la recristalización del hielo. Objetivos y plan de trabajo 69 2.2 Objetivo 2. Síntesis y estudio de la capacidad de gelificación de alquilamidas y alquilbisamidas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico La gran capacidad de estructuración en disolución que presentan las moléculas anfifílicas y bolaanfifílicas, como es el caso de las amidas y bisamidas polihidroxiladas, sumada al gran número de sus potenciales aplicaciones,107, 108 hizo que nos planteáramos como segundo objetivo de esta Tesis Doctoral la síntesis y el estudio de la capacidad de gelificación de alquilamidas y alquilbisamidas obtenidas a partir de hexosas y del ácido (-)-shikímico (24). Estas moléculas han sido seleccionadas por su potencial alta capacidad de estructuración, pero también por la facilidad que plantea su síntesis y lo económicos que resultan sus precursores, lo que desarrollaremos en cuatro subobjetivos siguientes. 2.2.1 Subobjetivo 2.1. Estudio de gelificación de alquilamidas y alquilbisamidas simétricas derivadas de hexosas Basándonos la N-octil-D-gluconamida (9b), molécula que, además de presentar la mejor actividad IRI reportada hasta la fecha para una molécula de bajo peso molecular, presenta una buena capacidad de gelificación de agua, con una cmg de 20 mg/mL. Decidimos estudiar exhaustivamente el efecto que sobre su capacidad gelificante tienen los cambios en las dos partes bien diferenciadas de su estructura, la parte polihidroxilada derivada de la hexosa D-glucosa y la cadena alquílica. Para ello, en este subobjetivo de la Tesis, aprovecharemos las moléculas sintetizadas en los subobjetivos específicos 2.1.1.1 y 2.1.1.2, concretamente estudiaremos la capacidad de gelificación de: - las alquilamidas 92 y 93, en las que cambiamos la estereoquímica de la parte polihidroxilada de la molécula modelo 9b. - las alquilamidas 9a, 9c y 9d, en las que cambiamos la longitud de la cadena hidrocarbonada de la molécula modelo 9b. - las alquilbisamidas 94a, 94b, 94c y 94d en las que, manteniendo la parte polihidroxilada de la molécula modelo 9b, cambiamos la longitud la cadena hidrocarbonada central. Figura 39. Estructuras generales de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas de hexosas. Para todas estas moléculas el estudio de gelificación se llevará a cabo mediante el método del test de inversión en 14 disolventes: hexano, 1,4-dioxano, tolueno, éter dietílico, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, isopropanol, acetona, etanol, metanol, Pablo López Carracedo 70 acetonitrilo y agua, ordenados por orden creciente de su constante dieléctrica, así como en disolución PBS. 2.2.2 Subobjetivo 2.2. Estudio de gelificación de amidas y bisamidas simétricas derivadas del ácido (-)-shikímico La estructura del ácido (-)-shikímico (24), que presenta como indicamos anteriormente un grupo ácido carboxílico -insaturado, un anillo ciclohexénico y 3 grupos hidroxilos con estereoquímica perfectamente definida (ver Figura 38), proporciona también una interesante plataforma para obtener compuestos de naturaleza anfifílica y bolaanfifílica con capacidad de auto-estructurarse formando geles. Por lo tanto, en este subobjetivo de la Tesis, estudiaremos amidas y bisamidas derivadas del ácido (-)-shikímico (24), en las que cambiaremos únicamente longitud de la cadena hidrocarbonada. Figura 40. Estructuras generales de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico. Para ello, de manera similar al estudio del apartado anterior, aprovecharemos las moléculas sintetizadas en los subapartados 2.1.2.1 y 2.1.2.2, concretamente estudiaremos la capacidad de gelificación de: - las alquilamidas 90a, 90b, 90c y 90d, en las que sustituiremos la parte polihidroxilada de la molécula modelo 9b por una unidad de ácido (-)-shikímico (24) y cambiamos la longitud de la cadena hidrocarbonada. - Las alquilbisamidas 91a, 91b, 91c y 91d, en las que sustituiremos la parte polihidroxilada de la molécula modelo 9b por dos unidades de ácido (-)-shikímico (24) y cambiamos la longitud de la cadena hidrocarbonada central. También ahora el estudio de gelificación se llevará a cabo mediante el método del test de inversión en 14 disolventes: hexano, 1,4-dioxano, tolueno, éter dietílico, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, isopropanol, acetona, etanol, metanol, acetonitrilo y agua, ordenados por orden creciente de su constante dieléctrica, y en disolución PBS. 2.2.3 Subobjetivo 2.3. Síntesis y estudio de gelificación de bisamidas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico Para completar el estudio sobre la capacidad de gelificación de las amidas y bisamidas derivadas del ácido (-)-shikímico (24) planteamos un segundo tipo de amidas bolaanfifílicas, Objetivos y plan de trabajo 71 en este caso asimétricas, constituidas por una unidad de ácido (-)-shikímico (24) unida a una cadena alquílica de 4, 8 o 12 átomos de carbono, sustituida en uno de sus extremos por un grupo polar (éster, ácido carboxílico, carbamato o amina). Esquema 18. Esquema general de síntesis de alquilamidas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico (24) con un extremo éster o ácido carboxílico. La preparación de las amidas (98a, 98b y 98c), con un extremo polar éster, se llevará a cabo por reacción de amidación del ácido (-)-shikímico (24) con el 4-aminobutanoato de metilo (95), 8-aminooctanoato de metilo (96) y 12-aminododecanoato de metilo (97) respectivamente, que son productos comerciales. La síntesis de las amidas 99a, 99b y 99c, con un extremo polar ácido carboxílico, se llevará a cabo empleando las amidas 98a, 98b y 98c, obtenidas como se explicó anteriormente, sometiéndolas a una reacción de hidrólisis de su grupo éster en medio básico. Esquema 19. Esquema general de síntesis de alquilamidas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico (24) con un extremo carbamato o amina. Para el caso de las amidas 103a, 103b y 103c, con un extremo polar carbamato de tercbutilo, su síntesis se llevará a cabo por reacción de amidación del ácido (-)-shikímico (24) con el (4-aminobutil)carbamato de terc-butilo (100) que es comercial. Y del (8-aminooctil)carbamato de terc-butilo (101) y el (12-aminododecil)carbamato de terc-butilo (102) respectivamente, que se prepararán a partir de sus diaminas comerciales precursoras 1,8octildiamina (45) y 1,12-dodecildiamina (46). Las síntesis de las amidas 104a, 104b y 104c con un extremo polar amina se llevará a cabo empleando las amidas 103a, 103b y 103c obtenidas anteriormente y sometiéndolas a una reacción de hidrólisis de su grupo terc-butilo en medio ácido. Resultados 79 3.1 Síntesis y estudio de la actividad de inhibición de la recristalización del hielo de amidas, bisamidas y poliamidas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico De acuerdo con el plan de trabajo establecido en el primero de los objetivos generales de esta tesis doctoral, llevamos a cabo la síntesis y estudio de la actividad de inhibición de la recristalización del hielo de varias series de amidas, bisamidas y poliamidas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico (24), tomando como referencia para el estudio la actividad IRI la N-octil-D-gluconamida (9b) (que abreviaremos como Glu-C8), por ser el compuesto de bajo peso molecular con mayor actividad IRI conocido hasta la fecha (crecimiento relativo del 10% a concentración de 0.5 mM). Esquema 23. Síntesis de la N-octil-D-gluconamida (9b). Por lo tanto, comenzamos sintetizando la amida 9b de acuerdo con el procedimiento establecido en la bibliografía111 basado en la apertura de la D-gluconolactona (57) comercial haciéndola reaccionar con n-octilamina (40) también comercial en metanol a reflujo durante 2 h. Una vez obtenida la amida esperada procedimos a medir su actividad de inhibición de recristalización de hielo, empleando el método más habitual en estos casos, conocido como ensayo de splat-cooling.112 El ensayo de splat-cooling consiste en preparar una disolución a una concentración de 22 mM del producto a estudiar en una disolución de PBS (pH 7.4). El fenómeno no se estudia a concentraciones superiores porque se considera que a partir de esta concentración las propiedades coligativas de la disolución interfieren sobre los resultados de la actividad IRI. Esta disolución se observa durante 30 minutos para comprobar que no se forman precitados. Si se forman precipitados o el compuesto no se disuelve a esta concentración debe prepararse una disolución de concentración inferior hasta encontrar la concentración máxima a la que se consigue una disolución homogénea y estable durante 30 minutos. A continuación, se deja caer una gota de 10 µL de la disolución del producto en PBS, preparada como se indicó anteriormente, sobre un portaobjetos colocado sobre un disco de aluminio enfriado a -78 °C a través de un tubo de PVC de dos metros de altura (para evitar turbulencias debido a corrientes de aire), con la intención de que la gota se congele al momento del impacto y de lugar a una monocapa de cristales de hielo (puede ser necesario repetir el experimento hasta conseguir una monocapa de cristales). Tras ello, el portaobjetos con la gota congelada se coloca en una caja criogénica enfriada a -8 °C mediante vapor de nitrógeno líquido. Una vez colocado el portaobjetos con la gota congelada en la cámara criogénica, se espera a que la temperatura se estabilice a -8 °C y se observa durante 30 minutos en el microscopio óptico con aumento 10X (0.5). Tras 30 minutos se toma una foto de los cristales formados, tratando de enfocar la imagen para que los bordes de los cristales se vean lo más nítidos posibles. Pablo López Carracedo 80 La medida para cada muestra se repite tres veces empleando 3 gotas diferentes y se calcula el área de los 10 cristales más grandes en cada imagen, usando el programa ImageJ, obteniendo un área en unidades arbitrarias. Se realiza el mismo experimento con la disolución PBS. Se miden 3 gotas diferentes de la disolución PBS y se calcula el área de los 10 cristales más grandes en cada imagen, usando el programa ImageJ, el área así obtenida se considera como crecimiento 100%, es decir, la ausencia de inhibidor, y este dato se utiliza como referencia para calcular el porcentaje de inhibición de las demás moléculas objeto de estudio. Si se observa actividad IRI el experimento debe repetirse disminuyendo la concentración de la disolución hasta encontrar la concentración mínima a la cual la actividad se mantiene. Si la inhibición es menor del 20% estamos ante un buen inhibidor. Si está entre el 20 y 50% es un inhibidor medio. Por encima del 50% se considera que el inhibidor es malo y a partir del 70% que no hay inhibición. De acuerdo con esto, realizamos las medidas de la actividad IRI para nuestra molécula modelo, N-octil-D-gluconamida (9b), hasta que obtuvimos los mismos datos que proporciona la bibliografía (crecimiento relativo 10% a 0.5 mM). En este momento consideramos optimizado el experimento y que estábamos en condiciones de estudiar la actividad de nuestras amidas. (Figura 43). Figura 43. A) Imagen de microscopía óptica de cristales de hielo de un blanco de PBS y B) imagen de cristales de hielo de Noctil-D-gluconamida (9b) a 0.5 mM, tomadas ambas a t:30 min. 3.1.1 Amidas, bisamidas y poliamidas derivadas de hexosas 3.1.1.1 Amidas polihidroxiladas alquílicas De acuerdo con el subobjetivo específico 2.1.1.1 de esta tesis doctoral, procedimos primero a sintetizar las amidas 92 y 93 propuestas, cambiando la estereoquímica de la parte hidrocarbonada y manteniendo la misma cadena alquílica que en la molécula de referencia 9b. Para la síntesis de las dos amidas 92 y 93 partimos de la D-glucuronolactona (113) comercial, que fue transformada en las lactonas 114, 115 y 116 de acuerdo con un procedimiento descrito en la bibliografía.113 La lactona 115 se sometió a un proceso de apertura con n-octilamina (40), empleando metanol como disolvente y a temperatura ambiente, que condujo a la amida 117, con un rendimiento del 58%. Posterior desprotección del grupo acetónido de Resultados 81 117 tratando con TFA/H2O y reducción del hemiacetal así formado con NaBH4 dio lugar a la amida final deseada 92, con un rendimiento del 22% en los dos últimos pasos. Esquema 24. Esquema general de síntesis de las amidas anfifílicas 92 y 93. La amida 92 fue caracterizada de acuerdo con sus propiedades espectroscópica y espectrométricas, entre las que destacan: en su espectro de RMN-1H, un cuartete de 2 protones a 3.06 ppm que corresponde al CH2 contiguo al grupo amida, un triplete de 1 protón a 7.85 correspondiente al NH de la amida, así como las señales a 1.24 ppm correspondientes a la cadena hidrocarbonada y las señales entre 3.38 y 5.52 correspondientes a los OCH y OH de la parte hidroxilada de la molécula. Su espectro de RMN-13C muestra señales características a 64.0, 70.9, 73.3, 74.5 y 74.6 correspondientes a los carbonos alfa a hidroxilo y la señal a 175.7 correspondiente al carbonilo del grupo amida. Su espectro de IR muestra bandas características a 1637 (CO) y 3351 (NH y OH). Por último, su fórmula molecular C14H30NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 308.2068 (m/z teórico =308.2068) correspondiente al ion [M+H]+. De una forma totalmente análoga la lactona 114 fue transformada en la amida deseada 93, a través de sus intermedios 116 (67%), 118 (99%) y 120 (70% en los dos últimos pasos), y también caracterizada de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, entre las que destacan: en su espectro de RMN-1H, un multiplete de 2 protones a 2.99-3.14 ppm que corresponde al CH2 contiguo al grupo amida, un triplete de 1 protón a 7.53 correspondiente al NH de la amida, así como las señales a 1.24 ppm correspondientes a la cadena hidrocarbonada y las señales entre 3.56 y 5.41 correspondientes a los OCH y OH de la parte hidroxilada de la molécula. Su espectro de RMN-13C muestra señales características a 64.3, 72.7, 72.8, 73.3 y 73.4 correspondientes a los carbonos alfa a hidroxilo y la señal a 175.0 correspondiente al carbonilo del grupo amida. Su espectro de IR muestra bandas características a 1654 (CO) y 3363 (NH y OH). Finalmente, la fórmula molecular C14H30NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 308.2068 (m/z teórico = 308.2068) correspondiente al ion [M+H]+. Una vez que obtuvimos los compuestos deseados 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8), procedimos a realizar los estudios de inhibición de recristalización del hielo, de acuerdo con el ensayo de splat-Cooling descrito anteriormente, para compararlos con la molécula modelo 9b (Glu-C8) y la molécula 121 (Gal-C8) con la estereoquímica de la D-galactosa, cuya actividad IRI ya fue descrita también por el Prof. Robert Ben. Pablo López Carracedo 82 Tabla 1. Datos de actividad IRI para las moléculas 9b, 92, 93 y 121. % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 92 (Gulo-C8) 23,20 22 mM 93 (Ido-C8) 54,79 22 mM 121 (Gal-C8) 70,00 0,5 mM Figura 44. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 9b, 92, 93 y 121. Como puede observarse en la Figura 44, las moléculas 92, 93 y 121 presentan una actividad menor que la molécula modelo 9b. La molécula 121 (Gal-C8), que presenta la estereoquímica de la D-galactosa, estudiada por el Prof. Robert Ben, presenta una actividad del 70% a 0.5 mM. La molécula 92 (Gulo-C8), que presenta la estereoquímica de la D-gulosa, es la que mejor actividad tiene de las dos, con un porcentaje de crecimiento relativo del 23.20% a una concentración de 22 mM. Esta actividad disminuye a 11 mM sustancialmente, y se hace prácticamente nula a por debajo de esa concentración. La molécula 93 (Ido-C8), que presenta la estereoquímica de la L-idosa, tiene una actividad muy por debajo de sus análogas, con un crecimiento relativo del 54.70% a una concentración de 22 mM. Por debajo de esta concentración, la actividad se vuelve prácticamente nula. De los datos obtenidos podemos concluir que la amida con una mayor actividad IRI es la que presenta la estereoquímica de la D-glucosa, por lo que esta será la estereoquímica empleada a partir de ahora para continuar con nuestros estudios de nuevos agentes inhibidores de la recristalización del hielo. Continuamos nuestro trabajo con la síntesis de las amidas 9a, 9c y 9d, manteniendo la estereoquímica de la D-glucosa y cambiando la longitud de la cadena alquílica. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Glu-C8 Gulo-C8 Ido-C8 Gal-C8 % Crecimiento Resultados 83 Esquema 25. Esquema general de síntesis de las amidas anfifílicas 9a, 9b, 9c y 9d. La síntesis de las amidas 9a, 9c y 9d, se llevó a cabo empleando el mismo método utilizado para la N-Octil-D-gluconamida 9b, consistente en realizar una apertura de la D-gluconolactona (57) con la alquilamina correspondiente, calentando a reflujo en metanol seco (es un método sencillo que permite obtener los productos deseados sin necesidad de una compleja elaboración, ya que la mayoría de ellos precipita en el propio disolvente empleado). Para ello se hizo reaccionar la D-glucolactona (57) con un exceso de la n-butilamina (41), n-dodecilamina (42) y n-hexadecilamina (43), lo que condujo a las amidas esperadas 9a, 9c y 9d con rendimientos del 49%, 89% y 96% respectivamente. Estas amidas fueron caracterizadas de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas comparándolas con la reportadas en la bibliografía y comprobando que eran idénticas.114, 115, 116 Una vez que obtuvimos los compuestos deseados 9a (Glu-C4), 9c (Glu-C12) y 9d (GluC16), procedimos a realizar los estudios de su capacidad inhibición de recristalización del hielo mediante el ensayo de Splat-Cooling, que reportaron los siguientes resultados. Tabla 2. Datos de actividad IRI para las moléculas 9a, 9b, 9c y 9d. % Crecimiento mM 9a (Glu-C4) 66,36 22 mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 9c (Glu-C12) 84,21 1 mM 9d (Glu-C16) - i Figura 45. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 9a, 9b, 9c y 9d. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Glu-C4 Glu-C8 Glu-C12 Glu-C16 % Crecimiento Pablo López Carracedo 84 Como se puede observar, tan solo la molécula 9a (Glu-C4) se pudo medir a 22 mM, concentración a la que presentó un crecimiento relativo del 66.36%. La molécula 9c (Glu-C12) se midió a una concentración de 1 mM debido a su baja solubilidad en agua, y presentó un crecimiento relativo del 84.21%, actividad que puede considerarse nula, mientras que la molécula 9d (Glu-C16) no se pudo medir debido a su baja solubilidad en agua. Todas las moléculas presentan una actividad muy por debajo de la reportada para la molécula modelo 9b (Glu-C8, 10% a concentración 0.5 mM), por lo que podemos concluir de forma general que la longitud de cadena idónea para conseguir una alta actividad IRI está en el entorno de 8 carbonos. 3.1.1.2 Bisamidas polihidroxiladas alquílicas Continuando con el siguiente subobjetivo específico 2.1.1.2, llevamos a cabo la síntesis de las bisamidas bolaanfifílicas 94a, 94b, 94c, 94d y 123, uniendo a una cadena alquílica de diferente longitud dos unidades de D-glucosa en los extremos a través de enlaces amida. Para el caso de las amidas 94b y 94c seguimos un procedimiento similar al empleado en el apartado anterior haciendo reaccionar ahora dos equivalentes de D-gluconolactona (57) con el 1,8-octildiamina (45) y 1,12-dodecildiamina (46) comerciales, empleando metanol seco como disolvente y calentando a reflujo. Esto permitió obtener las amidas 94b y 94c con rendimientos del 90% y 80% respectivamente. Esquema 26. Esquema general de síntesis de las bisamidas bolaanfifílicas 94b y 94c. Estas amidas fueron caracterizadas de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas de las que cabe destacar: Para la bisamida 94b un multiplete de 4 protones en su espectro de RMN-1H entre 2.97-3.14 ppm, que corresponde a los dos grupos metileno contiguos a los dos nitrógenos de amida. La fórmula molecular C20H41N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 501.2653 (m/z teórico = 501.2654) correspondiente al ion [M+H]+. Para la bisamida 94c un multiplete de 4 protones en su espectro de RMN-1H entre 2.95-3.10 ppm, que corresponde a los dos grupos metileno contiguos a los dos nitrógenos de amida. La fórmula molecular C24H49N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 557.3280 (m/z teórico = 557.3280) correspondiente al ion [M+H]+. La tercera de las bisamidas de este apartado, 123, se sintetizó mediante la misma reacción de amidación anteriormente empleada, partiendo de la 2-hidroxi-1,3-propanodiamina (122) comercial y haciéndola reaccionar con un exceso de D-gluconolactona, empleando también metanol como disolvente y DIPEA como base, lo que permitió obtener la bisamida esperada 123 con un 92% de rendimiento. Resultados 85 Esquema 27. Esquema general de síntesis de la bisamida bolaanfifílica 123. Esta bisamida 123 fue caracterizada a partir de su espectro de RMN-1H, que muestra un triplete de 4 protones a 3.13 ppm que corresponde a los dos grupos metileno contiguos a los dos nitrógenos de amida. La fórmula molecular C15H31N2O13 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 447,1748 (m/z teórico = 447,1748) correspondiente al ion [M+H]+. Sin embargo, la síntesis de la bisamida 94a no pudo realizarse de la misma manera debido a que el 1,4-butildiamina (44) conocido vulgarmente como putrescina, es una molécula muy desagradable para manipular. Fue necesario entonces hacerlo de una manera indirecta partiendo del N-Cbz-1,4-butildiamina (124) comercial, que se hizo reaccionar con la D-gluconolactona (57) en una reacción de amidación, empleando metanol como disolvente y calentando a reflujo para dar el compuesto 125 con un rendimiento del 90%. La monoamida así obtenida 125 se sometió a una reacción de hidrogenación para desproteger el grupo Cbz de su grupo amino terminal. Para ello se empleó Pd/C en presencia de hidrógeno, empleando metanol como disolvente, lo que permitió obtener la amina 126 que se hizo reaccionar directamente con un exceso de D-gluconolactona (57), empleando metanol como disolvente, DIPEA como base y calentando a reflujo, para obtener así la bisamida deseada 94a, con un rendimiento del 90% (en los dos últimos pasos). Esquema 28. Esquema general de síntesis de la bisamida bolaanfifílica 94a. La bisamida 94a fue también caracterizada a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, presentando un doblete de 4 protones en su espectro de RMN-1H a 3.11 ppm, que corresponde a los dos grupos metileno contiguos a los dos nitrógenos de amida. La fórmula molecular C16H33N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 445.2033 (m/z teórico = 445.2038) correspondiente al ion [M+H]+. Pablo López Carracedo 86 Por último, para el caso de la bisamida 94d tuvimos que sintetizar el 1,16-hexadecildiamina (47), al no ser comercial. Para ello partimos del ácido 1,16-hexadecanodioico (127) comercial que sometimos a una reducción con LiAlH4, empleando THF como disolvente y controlando la temperatura de la reacción con ayuda de un baño de agua-hielo para que esta no superase los 0 °C. Esto nos permitió obtener el diol correspondiente 128 con un rendimiento del 95%, que se sometió a una reacción modificada de Appel empleando I2, PPh3 e Imidazol en una mezcla de THF/DMF y controlando de nuevo la temperatura para que esta no supere los 0 °C. Obtuvimos de esta forma el diyoduro 129 (92% de rendimiento) que, mediante una sustitución nucleófila con NaN3, empleando DMF como disolvente y calentando a 60 °C, se convirtió en la diazida 130, con un rendimiento del 82%. Por último, la diazida 130 se sometió a una reacción de reducción con PPh3 en una mezcla de THF/H2O para obtener el 1,16-hexadecildiamina (47) deseado con un rendimiento moderado del 32%. Esta diamina 47 se hizo reaccionar con un exceso de D-gluconolactona (57) empleando metanol como disolvente, DIPEA como base y calentando a reflujo para finalmente obtener la bisamida 94d objetivo con un rendimiento del 27%. Esquema 29. Esquema general de síntesis de la bisamida bolaanfifílica 94d. La bisamida 94d fue caracterizada a partir de su espectro de RMN-1H, que muestra un triplete de 4 protones a 3.08 ppm, que corresponde a los dos grupos metileno contiguos a los dos nitrógenos de amida. La fórmula molecular C28H57N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 613.3922 (m/z teórico = 613.3906) correspondiente al ion [M+H]+. Una vez sintetizadas las cinco bisamidas objetivo de este apartado 94a (Glu-C4-Glu), 94b (Glu-C8-Glu), 94c (Glu-C12-Glu), 94d (Glu-C16-Glu) y 124 (Glu-C3OH-Glu), procedimos a medir su capacidad de inhibición de la recristalización del hielo (ensayo Splat-Cooling), obteniendo los siguientes resultados. Resultados 87 Tabla 3. Datos de la actividad IRI para las moléculas 94a, 94b, 94c, 94d y 123. % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 94a (Glu-C4-Glu) 55,64 22 mM 94b (Glu-C8-Glu) 8,15 2 mM 94c (Glu-C12-Glu) 36,81 1,8 mM 94d (Glu-C16-Glu) 71,98 0,8 mM 123 (Glu-C3OH-Glu) 53,81 22 mM Figura 46. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 94a, 94b, 94c, 94d y 123, y para la molécula de referencia 9b. Se obtuvieron excelentes resultados para la bisamida 94b (Glu-C8-Glu) (Figura 46), que presentó un crecimiento relativo del 8.15% a 2 mM, resultados buenos para 94c (Glu-C12-Glu), con un crecimiento del 36.81% a 1.8 mM, y peores para 94a (Glu-C4-Glu) con un crecimiento del 55.64% y 123 (Glu-C3OH-Glu) con un crecimiento del 53.81% ambas a 22 mM. La bisamida 94d (Glu-C16-Glu) no presento actividad (71.98%), seguramente por su baja solubilidad en agua (solo fue posible disolverla a 0.8 mM). De nuevo, la longitud de cadena que presenta la mayor actividad IRI es la longitud de 8 carbonos, corroborando los resultados que obtuvimos en el apartado anterior. Es importante destacar que todas las bisamidas 94a, 94b, 94c y 94d probadas mostraron mejores resultados de Inhibición de la recristalización del hielo que sus monoamidas análogas 9a, 9b, 9c y 9d estudiadas en el apartado anterior. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Glu-C8 Glu-C4-Glu Glu-C8-Glu Glu-C12-Glu Glu-C16-Glu Glu-C3OH-Glu % Crecimiento Pablo López Carracedo 94 Por lo tanto, empezamos con el subobjetivo 2.1.1.5 estudiando la modificación del espaciador de unión entre la unidad hidrocarbonada de D-glucosa y el anillo aromático, introduciendo los grupos (-CH2-) 58, (-CH(CH3)-) 59 y (-CH2-CH2-) 60. Su síntesis se llevó a cabo haciendo reaccionar un exceso de D-gluconolactona (57) con bencilamina (54), 1-feniletilamina (55) y 2-feniletilamina (56) comerciales, empleando DIPEA como base, metanol como disolvente y calentando a reflujo, lo que condujo a las arilamidas esperadas 58, 59 y 60 con rendimientos de 96%, 60% y 49% respectivamente. Esquema 34. Esquema de síntesis de las amidas arílicas 58, 59 y 60. La arilamida 58 se caracterizó por comparación de sus datos espectroscópicos con los de la bibliografía que resultaron idénticos.117 Las dos arilamidas 59 y 60 fueron caracterizadas de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que podemos destacar: Para la amida 59 un doblete de 3 protones que aparecen a 1.39 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus tres protones metílicos en el sustituyente del espaciador. La fórmula molecular C14H21NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 300.1445 (m/z teórico = 300.1445) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 60) un multiplete de 2 protones que aparecen entre 3.33 y 3.44 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno del grupo amida. La fórmula molecular C14H21NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 300.1444 (m/z teórico = 300.1444) correspondiente al ion [M+H]+. A continuación, procedimos a realizar el ensayo de inhibición de la recristalización del hielo de las amidas anteriormente sintetizadas: 58 (Bn-Glu), 59 (1-Bn-1-Me-Glu) y 60 (PhEt-Glu) y compararlas con la amida de referencia en este caso 52 (Ph-Glu), obteniendo los siguientes resultados: Resultados 95 Tabla 6. Datos de actividad IRI de las moléculas 52, 58, 59 y 60. % Crecimiento mM 52 (Ph-Glu) 66,00 22 mM 58 (Bn-Glu) 40,00 22 mM 59 (1-Bn-1-Me-Glu) 94,03 22 mM 60 (PhEt-Glu) 50,18 22 mM Figura 51. Representación gráfica de los datos de actividad IRI de las moléculas 52, 58, 59 y 60. Como podemos observar, la introducción de un grupo metileno y de un grupo etileno entre el anillo aromático y la cadena hidrocarbonada de la amida de referencia 52 (Ph-Glu) mejora la actividad IRI, que pasa de 66% a 22 mM en la molécula modelo a un 40% a 22mM para la amida 58 y 50,18% a 22mM para la amida 60. Sin embargo, la introducción de un grupo metileno sustituido hace que la actividad IRI se pierda totalmente, siendo de 94% a 22 mM para la amida 59. Continuamos dentro del mismo subobjetivo, estudiando cómo afecta la introducción de sustituyentes en el anillo aromáticos de las dos amidas anteriormente estudiadas en las que observamos aumento de la actividad IRI: 58 y 60. Para ello empezamos estudiando el efecto de la introducción de uno o dos átomos de flúor en el anillo aromático de la benzamida 58, sintetizando las arilamidas 64, 65, y 66, con sustituyente flúor en orto, para y orto-para respectivamente. Estas amidas se sintetizaron haciendo reaccionar un exceso de Dgluconolactona con la 2-fluorbencilamina (61), la 4-fluorbencilamina (62) y la 2,4difluorbencilamina (63) comerciales, empleando metanol como disolvente y calentando a reflujo. Se obtuvieron de esta forma las arilamidas fluoradas 64, 65, y 66 con rendimientos del 55%, 76% y 77% respectivamente. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ph-Glu Bn-Glu 1-Bn-1-Me-Glu PhEt-Glu % Crecimiento Pablo López Carracedo 96 Esquema 35. Esquema general de síntesis de las amidas anfifílicas 64, 65 y 66. Las tres arilamidas fluoradas 64, 65 y 66 fueron caracterizadas de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que podemos destacar: Para la amida 64 un singlete de 2 protones que aparece a 3.50 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones bencílicos. La fórmula molecular C13H19FNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 304.1188 (m/z teórico = 304.1191) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 65 un doblete de 2 protones que aparece a 3.50 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones bencílicos. La fórmula molecular C13H19FNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 304.1188 (m/z teórico = 304.1191) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 66 un multiplete de 3 protones que aparece a 3.57 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones bencílicos y a uno de los protones alfa a un hidroxilo de la cadena hidrocarbonada. La fórmula molecular C13H18F2NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 322.1097 (m/z teórico = 322.1097) correspondiente al ion [M+H]+. Como en los demás casos una vez sintetizadas las amidas objetivo 64 (2-F-Bn-Glu), 65 (4-F-Bn-Glu) y 66 (2,4-F-Bn-Glu) pasamos a estudiar su capacidad de inhibición de la recristalización del hielo, obteniendo los siguientes resultados: Tabla 7. Datos de actividad IRI para las moléculas 58, 64, 65 y 66. % Crecimiento mM 58 (Bn-Glu) 40,00 22 mM 64 (2-F-Bn-Glu) 26,58 22 mM 65 (4-F-Bn-Glu) 30,28 22 mM 66 (2,4-F-Bn-Glu) 32,21 22 mM Resultados 97 Figura 52. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 58, 64, 65 y 66. Como podemos observar en el gráfico, las tres amidas fluoradas mejoran la actividad IRI respecto a la bencilamida 58 sin sustitución en el anillo aromático, con actividades inferiores en todos los casos: de 30.28% para 65 (4-F-Bn-Glu), 32.21% para 66 (2,4-F-Bn-Glu) y 26.58% para 64 (2-F-Bn-Glu), siendo la sustitución con flúor en la posición orto la que más hace mejorar el resultado. Continuamos nuestro trabajo estudiando cómo afectan los sustituyentes en el anillo aromático de feniletilamida 60, para lo que preparamos las arilamidas 73, 74, 75, 76, 77 y 78, sustituidas por un átomo de flúor en posición orto, meta y para, un átomo de cloro y un átomo de bromo en posición para y también dos átomos de oxígeno en posiciones meta y para, respectivamente. Para su síntesis, hicimos reaccionar un exceso de D-gluconolactona (57) con la 2fluorofeniletilamina (67), la 3-fluorofeniletilamina (68), la 4-fluorofeniletilamina (69), la 4clorofeniletilamina (70), la 4-bromofeniletilamina (71) y la 3,4-dimetoxifeniletilamina (72) comerciales, empleando metanol como disolvente y calentando a reflujo. Esto nos permitió obtener las arilamidas esperadas 73, 74, 75, 76, 77 y 78 con rendimientos del 60%, 40%, 86%, 69%, 87% y 85% respectivamente. Esquema 36. Esquema general de síntesis de las amidas anfifílicas 73, 74, 75, 76, 77 y 78. Todas ellas fueron caracterizadas a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que destacan. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bn-Glu 2-F-Bn-Glu 4-F-Bn-Glu 2,4-F-Bn-Glu % Crecimiento Pablo López Carracedo 98 La amida 73 presenta un singlete de 2 protones que aparecen a 3.45 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C14H21FNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 318.1349 (m/z teórico = 318.1347) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 74 presenta un multiplete de 2 protones que aparecen entre 3.32 y 3.40 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C14H21FNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 318.1349 (m/z teórico = 318.1347) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 75 presenta un singlete de 2 protones que aparecen a 3.47 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C14H21FNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 318.1349 (m/z teórico = 318.1347) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 76 presenta un singlete de 2 protones que aparecen a 3.47 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C14H21ClNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 334.1043 (m/z teórico = 334.1052) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 77 presenta un doblete de 2 protones que aparecen a 3.47 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C14H21BrNO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 378.0545 (m/z teórico = 378.0547) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 78 presenta un multiplete de 2 protones que aparecen entre 3.35 y 3.41 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a sus dos protones contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C16H25NO8 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 360.1653 (m/z teórico = 360.1580) correspondiente al ion [M+H]+. Una vez obtenidas las amidas anteriormente descritas: 73 (2-F-PhEt-Glu), 74 (3-F-PhEtGlu), 75 (4-F-PhEt-Glu), 76 (4-Cl-PhEt-Glu), 77 (4-Br-PhEt-Glu), y 78 (3,4-OMe-PhEtGlu), procedimos a realizar el ensayo de su capacidad para inhibir la recristalización del hielo, obteniendo los siguientes resultados. Resultados 99 Tabla 8. Datos de actividad IRI para las moléculas 60, 73, 74 y 75. % Crecimiento mM 60 (PhEt-Glu) 50,18 22 mM 73 (2-F-PhEt-Glu) 45,55 22 mM 74 (3-F-PhEt-Glu) 52,57 22 mM 75 (4-F-PhEt-Glu) 48,85 22 mM Figura 53. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 60, 73, 74 y 75. La introducción de un átomo de flúor en el anillo aromático de la molécula de referencia 60 (50,18% a 22 mM) no parece tener una influencia notable en la actividad IRI, ya que la mejora levemente para el caso de la sustitución en orto 73 (45.55% a 22 mM) y para 75 (48.85% a 22 mM) y la empeora también levemente en el caso de la sustitución en meta 74 (52.57% a 22 mM). Tabla 9. Datos de actividad IRI para las moléculas 60, 75, 76, 77 y 78. % Crecimiento mM 60 (PhEt-Glu) 50,18 22 mM 75 (4-F-PhEt-Glu) 48,85 22 mM 76 (4-Cl-PhEt-Glu) 70,45 11 mM 77 (4-Br-PhEt-Glu) 71,40 11 mM 78 (3,4-OMe-PhEt-Glu) 84,17 22 mM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 PhEt-Glu 2-F-PhEt-Glu 3-F-PhEt-Glu 4-F-PhEt-Glu % Crecimiento Pablo López Carracedo 100 Figura 54. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 60, 75, 76, 77 y 78. Sin embargo, la introducción de otros sustituyentes distintos del flúor tiene un efecto claramente disruptor sobre la actividad IRI de la molécula de referencia 60 (50,18% a 22 mM), disminuyéndola enormemente hasta casi hacerla desaparecer para el caso de un átomo de cloro posición para 76 (70,45% a 22 mM) o de un átomo de bromo posición para 77 (71.40% a 22 mM). Siendo este efecto todavía más negativo para el caso de la introducción de dos átomos de oxígeno en las posiciones meta y para 78 (84.17% a 22 mM). De manera general podemos concluir que la decoración en el anillo aromático con sustituyente halógeno y oxígeno tiene influencia en la actividad IRI de las moléculas objeto de estudio, siendo los sustituyentes flúor los únicos que contribuyen positivamente a esta actividad, mejorándola en casi todos los casos, mientras que los sustituyentes cloro y bromo contribuyen negativamente a la actividad IRI, disminuyéndola en todos los casos, e incluso haciéndola desaparecer por completo en el caso de los sustituyentes oxigenados. 3.1.1.6 Bisamidas polihidroxiladas arílicas Continuando con el siguiente subobjetivo 2.1.1.6 planteamos la síntesis y estudio de la actividad IRI de las bisamidas polihidroxiladas dibencilarílicas 82, 83 y 84, para lo que tomamos como base la estructura de la amida polihidroxilada bencilarílica 58, estudiada anteriormente, e introducimos ahora dos unidades de la misma cadena polihidroxilada derivada de D-Glucosa unidas a un espaciador arílico de dibencilamina, en las tres orientaciones posible orto, meta y para. La síntesis de estas bisamidas se llevó a cabo haciendo reaccionar un exceso de Dgluconolactona (57) con 1,2-dibencilamina (79), 1,3-dibencilamina (80), 1,4-dibencilamina (81) comerciales, empleando metanol como disolvente, DIPEA como catalizador básico y calentando a reflujo, lo que nos permitió obtener las amidas deseadas 82, 83 y 84 con rendimientos del 91%, 30% y 64% respectivamente. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 PhEt-Glu 4-F-PhEt-Glu 4-Cl-PhEt-Glu 4-Br-PhEt-Glu 3,4-OMe-PhEt-Glu % Crecimiento Resultados 101 Esquema 37. Esquema general de síntesis de las bisamidas bolaanfifílicas 82, 83 y 84. Las tres amidas así sintetizadas fueron caracterizadas a partir de sus propiedades espectroscópica y espectrométricas, entre las que destacamos: La bisamida 82 presenta en su espectro de RMN-1H un multiplete de 4 protones entre 3.33 y 3.43 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno contiguos al nitrógeno del grupo amida. La fórmula molecular C20H32N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 493.2028 (m/z teórico = 493.1955) correspondiente al ion [M+H]+. La bisamida 83 presenta en su espectro de RMN-1H un multiplete de 4 protones entre 3.36 y 3.43 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno contiguos al nitrógeno del grupo amida. La fórmula molecular C20H32N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 493.2031 (m/z teórico = 493.1955) correspondiente al ion [M+H]+. La bisamida 84 presenta en su espectro de RMN-1H un multiplete de 4 protones entre 3.36 y 3.43 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno contiguos al nitrógeno del grupo amida. La fórmula molecular C20H32N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 493.2027 (m/z teórico = 493.1955) correspondiente al ion [M+H]+. Como en los casos anteriores una vez sintetizadas las amidas objeto de estudio 82 (1,2-BnGlu) 83 (1,3-Bn-Glu) y 84 (1,4-Bn-Glu), procedimos a realizar el ensayo de su capacidad de inhibición de la recristalización del hielo, obteniendo los siguientes resultados. Tabla 10. Datos de actividad IRI para las moléculas 58, 82, 83 y 84. % Crecimiento mM 58 (Bn-Glu) 40,00 22 mM 82 (1,2-Bn-Glu) 59,14 22 mM 83 (1,3-Bn-Glu) 58,49 22 mM 84 (1,4-Bn-Glu) 29,16 11 mM Pablo López Carracedo 102 Figura 55. Representación gráfica de los datos de actividad IRI para las moléculas 58, 82, 83 y 84. En este caso observamos que solo la bisamida 84, con disposición para de sus unidades hidroxiladas, presenta una actividad IRI (29,16%, 11 mM) que aumenta considerablemente la capacidad de inhibición de la amida polihidroxilada arílica 58 (40%, 22 mM). Sin embargo, para el caso de las otras dos disposiciones espaciales tanto la bisamida 83, con disposición meta de sus unidades hidroxiladas, como la bisamida 82, con disposición orto de sus unidades hidroxiladas, diminuyen de una forma notable la capacidad de inhibición de la amida 58, presentando actividades IRI de (58,49%, 22 mM) y (59,14%, 22 mM) respectivamente. Hemos observado que la influencia en la actividad IRI de dos sustituyentes polares, en el caso de estas arilamidas, depende en gran medida de la posición de estos, puesto que las posiciones orto y meta hacen disminuir la actividad, mientras que la posición para la aumenta notablemente. Nuestro siguiente objetivo es estudiar también el caso de las bisamidas con dos unidades de la cadena polihidroxilada derivada de D-glucosa unidas por un espaciador arílico de dibenciletilamina, en lugar de un espaciador arílico de dibencilamina, pero en este caso, a la vista de los resultados anteriores, solo estudiamos el caso de la bisamida 86 con disposición para de sus unidades polihidroxiladas. Para la síntesis de la bisamida 86 partimos de la diamina 85 que preparamos a partir del teraphtaldehído 141 comercial como se indica en el Esquema 38 siguiendo un procedimiento descrito en la bibliografía.118 Esta amina se hizo reaccionar con un exceso de D-glucolactona en DMF, empleando DIPEA como base y calentando a 80 °C, lo que condujo a la bisamida esperada 86 con un rendimiento del 30%. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bn-Glu 1,2-Bn-Glu 1,3-Bn-Glu 1,4-Bn-Glu % Crecimiento Resultados 103 Esquema 38. Esquema general de síntesis de la bisamida bolaanfifílica 86. La bisamida 86 pudo ser caracterizado de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que destacamos: en su espectro de RMN-1H, un singlete de 4 protones a 3.57 ppm que corresponde a los dos grupos metileno contiguos al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C22H37N2O12 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 521.2307 (m/z teórico = 521.2302) correspondiente al ion [M+H]+. Los resultados del estudio de la actividad IRI de la bisamida 86 (1,4-PhEt-Glu) aparecen reflejados a continuación. Tabla 11. Datos de actividad IRI para las moléculas 60 y 86. % Crecimiento mM 60 (PhEt-Glu) 50,18 22 mM 86 (1,4-PhEt-Glu) 63,60 11 mM Pablo López Carracedo 110 La bisamida 91c muestra en su espectro de RMN-1H, un cuartete de 4 protones a 3.06 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno unido al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C26H45N2O8 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 513.3170 (m/z teórico = 513.3170) correspondiente al ion [M+H]+. La bisamida 91d muestra en su espectro de RMN-1H, un triplete de 4 protones a 3.22 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno unido al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C30H53N2O8 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 569,3733 (m/z teórico = 569,3731) correspondiente al ion [M+H]+. Sin embargo, la síntesis de la bisamida 91a no pudo realizarse de la misma manera debido a que el 1,4-butildiamina 44 es un compuesto indeseable para el trabajo, como ya se comentó anteriormente. Fue necesario entonces hacerlo de una manera indirecta partiendo del N-Boc1,4-butildiamina (100) comercial, que se acopló con el ácido (-)-shikímico (24) comercial empleando PyBOP como agente acoplante, DIPEA como base y DMF como disolvente, a temperatura ambiente para dar el uretano 103a con un rendimiento del 48%. La monoamida así obtenida se sometió a una reacción de hidrólisis para desproteger el grupo carbamato de tercbutilo de su grupo amino terminal. Para ello se empleó TFA, empleando diclorometano como disolvente, lo que permitió obtener la amina 104a con un rendimiento del 99%. Esta amina se acopló con ácido (-)-shikímico (24), en las condiciones anteriores, para obtener así la bisamida deseada 91a, con un rendimiento del 31%. Esquema 42. Síntesis de la bisamida bolaanfifílica 91a. La bisamida 91a se caracterizó por comparación de sus datos espectroscópicos con los de la bibliografía que resultaron idénticos.120 Las amidas intermedias 103a y 104a se caracterizaron a partir sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, entre las que destacamos que: La amida 103a muestra en su espectro de RMN-1H, un triplete de 2 protones a 3.05 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno unido al nitrógeno de amida, además de un singlete de 9 protones a 1.43 ppm correspondiente a los tres metilos del grupo uretano. La fórmula molecular C16H29N2O6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 345.2021 (m/z teórico = 345.2020) correspondiente al ion [M+H]+. La amida 104a muestra en su espectro de RMN-1H, un doblete de 2 protones a 3.22 ppm que corresponde a sus dos grupos metileno unido al nitrógeno de amida. La fórmula molecular Resultados 111 C11H21N2O4 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 245.1494 (m/z teórico = 245.1496) correspondiente al ion [M+H]+. Una vez obtenidas las bisamidas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi), y 91d (Shi-C16-Shi) procedimos a realizar el ensayo de inhibición de la recristalización del hielo (ensayo de Splat-cooling), obteniendo los siguientes resultados. Tabla 14. Datos de la actividad IRI de las moléculas 91a, 91b, 91c y 91d, y para la molécula de referencia 9b. % Crecimiento mM 9b (Glu-C8) 10,00 0,5 mM 91a (Shi-C4-Shi) 61,87 22 mM 91b (Shi-C8-Shi) 68,16 11 mM 91c (Shi-C12-Shi) 49,74 2 mM 91d (Shi-C16-Shi) - - Figura 61. Representación gráfica de los datos de la actividad IRI de las moléculas 91a, 91b, 91c y 91d, y para la molécula de referencia 9b. Las bisamidas bolaanfifílicas estudiadas ahora, al igual que las amidas anfifílicas estudiadas en el apartado anterior, mostraron un patrón de solubilidad similar. De nuevo la bisamida con cadena alquílica de cuatro átomos de carbono Shi-C4-Shi fue soluble y mostró una actividad IRI baja (61.87%, 22 mM) y la amida con cadena de dieciséis átomos de carbono Shi-C16-Shi resultó insoluble y por lo tanto no fue posible su estudio. Por su parte, las bisamidas Shi-C8-Shi y Shi-C12-Shi mostraron actividades IRI también relativamente bajas (68,16%, 11mM) y (49,74%, 2m M) respectivamente. De todas ellas es destacable la actividad IRI de la amida con cadena alquílica de doce átomos de carbono Shi-C12-Shi que muestra una actividad moderada, pero a concentración muy baja. Observamos nuevamente que la longitud de cadena influye enormemente en la actividad IRI de las moléculas, y que de forma general las moléculas bolaanfifílicas tienden a presentar una actividad IRI mayor que sus análogas anfifílicas, como en los casos estudiados anteriormente. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Glu-C8 Shi-C4-Shi Shi-C8-Shi Shi-C12-Shi Shi-C16-Shi % Crecimiento Pablo López Carracedo 112 Como reflexión general de los resultados de IRI anteriormente mostrados, tomado como referencia la N-octil-D-gluconamida (9b), la molécula de bajo peso molecular con menor actividad IRI reportada hasta que empezamos esta Tesis (10% a 0.5 mM), hemos sintetizado un total de 40 moléculas con 16 estructuras diferentes. Los resultados de actividad IRI encontrados para estas moléculas han sido muy variados y como recapitulación de todos ellos hemos encontrado una molécula que presenta actividad IRI más baja que la molécula modelo, 94b (8.15% a 2 mM), que pasa por lo tanto a ser la molécula de bajo peso molecular con mayor actividad IRI descrita hasta la fecha. En el aspecto estructural lo más relevante que hemos observado es que las estructuras de tipo bolaanfifílico presentan siempre mejores propiedades IRI que sus análogas anfifílicas, como puede observarse para el caso de la molécula modelo 9b comparándola con la molécula 94b o el de la molécula 58 comparándola con la molécula 84 (ver Figura 62). También que las estructuras angulares o ramificadas no favorecen esta actividad. Figura 62. Estructuras de las moléculas 9b, 94b, 58, 84, 135 y 139 y datos de su actividad IRI. Esto podría interpretarse como que la estructuración de estas moléculas, en la superficie de los cristales de hielo o en la interfase entre los mismos, para interferir el libre tránsito de las moléculas de agua entre ellos, es similar y que las estructuras de tipo monoamida tienen más dificultades para estructurarse o bien que su estructuración es menos eficaz que las de tipo diamida, como se esquematiza a continuación. Resultados 113 Figura 63. Representación de la hipótesis de estructuración y unión a las caras del cristal de hielo de las moléculas 9b y 94b. Esta hipótesis debe ser estudiada con más detalle y en este momento estamos trabajando en ello mediante modelizaciones de la estructuración de estos compuestos en modelo de agua/hielo, lo que esperamos pueda abrir luz sobre el mecanismo de la inhibición de la recristalización del hielo. Pablo López Carracedo 114 3.2 Síntesis y estudio de la capacidad de gelificación de alquilamidas y alquilbisamidas derivadas de hexosas y del ácido (-)-shikímico De acuerdo con el plan de trabajo establecido en el segundo objetivo de esta tesis doctoral, llevaremos a cabo la síntesis y el estudio de la capacidad de gelificación de tres series de amidas y bisamidas. En la primera serie estudiaremos la capacidad de gelificación de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas de hexosas (constituidas por una o dos cabezas polares derivada de hexosas unida a una cadena apolar hidrocarbonada), cuya síntesis se describió en los apartados 3.1.1.1 y 3.1.1.2. Figura 64. Estructuras de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas de hexosas. En la segunda serie estudiaremos la capacidad de gelificación de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico (24) (constituidas por una o dos cabezas polares derivadas de ácido (-)-shikímico (24) unidas a los extremos de una cadena hidrocarbonada), cuya síntesis se describió en los apartados 3.1.2.1 y 3.1.2.2. Figura 65. Estructuras de las amidas anfifílicas y bisamidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico (24). En la tercera y última serie de este apartado, estudiaremos la síntesis y la capacidad de gelificación de las amidas bolaanfifílicas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico (24) (constituidas por una cabeza polar derivada del ácido (-)-shikímico (24) y otra cabeza polar de tipo éster, ácido carboxílico, uretano o amina, unidas a los extremos de una cadena hidrocarbonada). Resultados 115 Figura 66. Estructuras de las bolaanfifílicas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico (24). Una vez obtenidos los compuestos planteados como objetivo, procedimos a realizar los ensayos de su capacidad de gelificación en 14 disolventes que cubren un rango amplio de polaridades: hexano, 1,4-dioxano, tolueno, éter dietílico, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, isopropanol, acetona, etanol, metanol, acetonitrilo y agua, ordenados por orden creciente de su constante dieléctrica, así como de disolución PBS. El método experimental llevado a cabo para estudiar las propiedades gelificantes de las moléculas sintetizadas es el ‘‘test de inversión de vial’’. Para ello partimos de 5 mg de cada uno de los compuestos y 0.1 mL de disolvente. (La razón de empezar con estas cantidades es que está comúnmente aceptado que una sustancia es un agente gelificante si forma un gel a concentraciones inferiores a 50 mg/mL, un buen gelificante si los forma por debajo de 20 mg/mL y un supergelificante si los forma a concentraciones inferiores a 2 mg/mL). A continuación, mezclamos la amida y el disolvente y si se disuelven fácilmente se considera que la amida no forma el gel, por lo que no es un agente gelificante de ese disolvente. Si la amida y el disolvente no se disuelven, calentamos hasta ebullición, y si en estas condiciones no se disuelve se considera que la amida es insoluble en ese disolvente. Si al calentar hasta ebullición la amida se disuelve, sometemos el vial a sonicación durante un minuto y después observamos si se formó un gel, invirtiendo el vial con la mezcla y comprobando que no fluye (test de inversión). En el caso de que fluya, pero lo haga con dificultad, se considera que se ha formado un gel parcial. Figura 67. Representación gráfica del cambio entre el estado sol y gel de un agente gelificante en agua. Si al someter la mezcla a sonicación no observamos la formación de un gel, se calienta de nuevo hasta ebullición, la disolución obtenida se deja enfriar a temperatura ambiente y al cabo de 10 minutos observamos si se formó el gel. Una vez comprobado que la amida forma un gel en un determinado disolvente, a la concentración de 50 mg/mL, procedemos a diluir la mezcla hasta encontrar la concentración Pablo López Carracedo 116 mínima a la que la amida gelifica ese disolvente, lo que se conoce como concentración mínima de gelificación (cmg). Para aquellos casos en los que la amida no se disuelva a 50 mg/mL buscamos la concentración a la que se disuelve y si a esa concentración gelifica, vamos disminuyendo la concentración hasta encontrar la cmg. Una vez encontrada la concentración mínima de gelificación se almacena el gel durante tres meses y al cabo de este tiempo de comprueba si se mantiene estable, de nuevo mediante la inversión de vial. 3.2.1 Estudio de gelificación de amidas y bisamidas derivadas de hexosas De acuerdo con el subobjetivo 2.1 de este capítulo de la Tesis comenzamos el estudio de gelificación con las amidas anfifílicas 9b (Glu-C8); 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8), constituidas por una cadena alquílica de n-octano unida mediante un enlace amida a una unidad de hexosa con estereoquímica de D-glucosa, D-gulosa y L-idosa respectivamente, cuya síntesis se llevó a cabo como se indicó en el capítulo anterior (apartado 3.1.1.1). Figura 68. Estructuras de las amidas anfifílicas 9b (Glu-C8), 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8). Los disolventes empleados para el estudio de gelificación fueron: hexano, 1,4-dioxano, tolueno, éter dietílico, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, isopropanol, acetona, etanol, metanol, acetonitrilo y agua, ordenados por orden creciente de su constante dieléctrica, y también una disolución PBS. Los resultados obtenidos aparecen representados en la siguiente tabla y también en forma de diagrama de barras. Resultados 117 Tabla 15. Datos del estudio de gelificación para las moléculas 9b (Glu-C8), 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Producto Glu-C8 Gulo-C8 Ido-C8 hexano i i i 1,4-dioxano pg i i tolueno i i i Et2O i i i CHCl3 i i i AcOEt pg s i THF s s s DCM i i i iPr-OH s s s acetona 20 i i EtOH s s s MeOH s s s CH3CN 20 s s H2O 25 pg 25 PBS 30 pg pg Figura 69. Representación gráfica de los datos del estudio de gelificación para las moléculas 9b (Glu-C8), 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Como era de esperar para esta serie de compuestos en los que modificamos la estereoquímica de los grupos hidroxilos, el comportamiento es muy similar entre las tres moléculas, siendo la capacidad de solubilización casi idéntica en todos los casos, exceptuando: el acetato de etilo, donde 9b (Glu-C8) forma un gel parcial, 93 (Ido-C8) es insoluble y 92 (Gulo-C8) es soluble; la acetona, en donde 9b (Glu-C8) forma un gel a 20 mg/mL mientras que 93 (Ido-C8) y 92 (Gulo-C8) son insolubles; y el acetonitrilo, en el que 9b (Glu-C8) forma un gel a 20 mg/mL y de nuevo tanto 93 (Ido-C8) como 92 (Gulo-C8) son totalmente solubles. Pablo López Carracedo 118 Por lo que respecta a su comportamiento como gelificantes del agua, es similar en los tres casos: 9b (Glu-C8) forma un gel a concentración de 25 mg/mL, 93 (Ido-C8) forma un gel a concentración de 25 mg/mL y 92 (Gulo-C8) solo forma geles parciales. También probamos el comportamiento de estas moléculas en mezclas de agua/etanol, con proporciones de etanol menores del 50% (2:1, 3:1 y 4:1), ya que, si se formasen geles, estos podrían considerarse hidrogeles. Tabla 16. Datos de gelificación en mezclas de agua/etanol para las moléculas 9b (Glu-C8), 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. H2O/EtOH Glu-C8 Gulo-C8 Ido-C8 2:1 s s s 3:1 s s s 4:1 s s s Figura 70. Representación gráfica de los datos de gelificación en mezclas de agua/etanol para las moléculas 9b (Glu-C8), 92 (Gulo-C8) y 93 (Ido-C8). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. El comportamiento observado, como puede verse en la Figura 70 y la Tabla 16, es idéntico en todos los casos, resultando ser las tres moléculas solubles para cualquier proporción de agua/etanol empleadas. Resultados 119 Continuamos nuestro estudio con las amidas anfifílicas 9a (Glu-C4), 9b (Glu-C8), 9c (Glu-C12) y 9d (Glu-C16), constituidas por una unidad de D-glucosa unida mediante un enlace amida a cadenas alquílicas de n-butano, n-octano, n-dodecano y n-hexadecano respectivamente, cuya síntesis se llevó a cabo como se indicó en el capítulo anterior (apartado 3.1.1.2). Figura 71. Estructuras de las amidas anfifílicas moléculas 9a (Glu-C4), 9b (Glu-C8), 9c (Glu-C12) y 9d (Glu-C16). Los disolventes empleados, ordenados de menor polaridad a mayor, son los mismos que en el caso anterior: hexano, 1,4-dioxano, tolueno, éter dietílico, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, isopropanol, acetona, etanol, metanol, acetonitrilo, agua y también en disolución PBS. Los resultados obtenidos puedes verse en la Tabla 17 y la Figura 72: Tabla 17. Datos del estudio de gelificación para las moléculas moléculas 9a (Glu-C4), 9b (Glu-C8), 9c (Glu-C12) y 9d (GluC16). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Producto Glu-C4 Glu-C8 Glu-C12 Glu-C16 hexano i i i i 1,4-dioxano s pg 13 i tolueno s i 14 i Et2O i i i i CHCl3 i i i i AcOEt i pg i i THF s s pg i DCM i i i i iPr-OH s s pg 50 acetona i 20 pg i EtOH s s pg 25 MeOH s s 35 15 CH3CN i 20 s i H2O s 25 25 i PBS s 30 pg i Pablo López Carracedo 126 En cuanto a su capacidad de gelificación, tan solo la molécula 90d (Shi-C16) es capaz gelificar dos disolventes apolares y con una cmg alta: cloroformo (25 mg/mL) y acetona (20 mg/mL). Sin embargo, la molécula 90b (Shi-C8) mostró un comportamiento más interesante siendo capaz de formar hidrogeles en agua y en disolución PBS con cmg buenas: H2O (14 mg/mL) y PBS (20 mg/mL). También en el caso de estas moléculas estudiamos su capacidad para formar hidrogeles en en mezclas de agua/etanol, con proporciones de etanol menores del 50% (2:1, 3:1 y 4:1). Los resultados obtenidos aparecer recogidos en la tabla y los gráficos de barrras siguientes, siendo de nuevo bastante satisfactorios con respecto a los resultados de gelificación de las mismas moléculas en agua pura. Tabla 22. Estudio de gelificación en agua/etanol de las amidas anfifílicas 90a (Shi-C4), 90b (Shi-C8), 90c (Shi-C12) y 90d (ShiC16) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. H2O/EtOH Shi-C4 Shi-C8 Shi-C12 Shi-C16 2:1 s s pg pg 3:1 s s 15 20 4:1 s s pg i Figura 79. Representación gráfica de los datos de gelificación en agua/etanol para las moléculas 90a (Shi-C4), 90b (Shi-C8), 90c (Shi-C12) y 90d (Shi-C16). S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. En estas mezclas de agua y etanol la molécula 90b (Shi-C8) pierde la capacidad de gelificación que presentaba en agua y disolución PBS en todas las proporciones ensayadas, haciéndose soluble. Sin embargo, se consiguió que las moléculas 90c (Shi-C12), y 90d (Shi-C16) formen hidrogeles en mezclas de agua y etanol 3:1 con cmg aceptables, de (15 mg/mL) y (20 mg/mL) respectivamente. Adicionalmente estas moléculas también forman geles parciales en mezclas de agua y etanol del 2:1 y 4:1 para 90c (Shi-C12) y 2:1 para 90d (Shi-C16). Continuamos con el estudio de la capacidad de gelificación de las moléculas bolaanfifílicas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi) y 91d (Shi-C16-Shi), constituidas ahora por dos unidades de ácido (-)-shikímico (24) unidas por medio de dos enlaces amida a los extremos de cadenas alquílicas de diferente longitud. Resultados 127 Figura 80. Estructuras de las bisamidas bolaanfifílicas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi) y 91d (Shi-C16-Shi). El estudio de gelificación para estas cuatro bisamidas se llevó a cabo también mediante el test de inversión y en los mismos disolventes que en los casos anteriores. Los resultados obtenidos aparecen reflejados en la tabla y figura siguientes. Tabla 23. Estudio de gelificación de bisamidas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi) y 91d (Shi-C16-Shi) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Producto Shi-C4-Shi Shi-C8-Shi Shi-C12-Shi Shi-C16-Shi hexano i i i i 1,4-dioxano i i i i tolueno i i i i Et2O i i i i CHCl3 i i i i AcOEt i i i i THF i i i i DCM i i i i iPr-OH s s 40 s acetona i i i i EtOH s s s s MeOH s s s s CH3CN i i i s H2O s s 1,8 20 PBS s s 5 25 Pablo López Carracedo 128 Figura 81. Estudio de gelificación de bisamidas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi) y 91d (Shi-C16-Shi) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. La solubilidad de las cuatro bisamidas en disolventes polares aumenta al disminuir el tamaño de la cadena, mientras que en disolventes apolares, no se aprecia ningún cambio significativo. Solamente la bisamida 91c (Shi-C12-Shi) es capaz de formar un gel en isopropanol y con una cmg muy alta (40 mg/mL). Sin embargo, obtuvimos resultados excelentes en cuanto a la capacidad de estos compuestos para dar lugar a hidrogeles, tanto 91c (Shi-C12-Shi) como 91d (Shi-C16-Shi) formaron hidrogeles en agua y en disolución PBS. Esto geles presentaron una cmg modesta para el caso de 91d (Shi-C16-Shi): agua (20 mg/mL) y PBS (25 mg/mL). Siendo lo más destacable el comportamiento de gelificación de 91c (Shi-C12-Shi) que resulto ser muy bueno para la disolución PBS (5 mg/mL) y excelente para el agua (1.8 mg/mL), pudiendo considerarse este compuesto el primero de los agentes supergelantes de esta Tesis. Esto resultados nos animaron a probar también la capacidad de gelificación de estas bisamidas en mezclas de agua/etanol, con proporciones de etanol menores del 50% (2:1, 3:1 y 4:1). Sin embargo, los resultados obtenidos que aparecen recogidos en la tabla y la figura siguientes, fueron totalmente insatisfactorios ya que los cuatro compuestos resultaron ser solubles en todas las proporciones de agua y etanol ensayadas Resultados 129 Tabla 24. Estudio de gelificación de bisamidas 91a (Shi-C4-Shi), 91b (Shi-C8-Shi), 91c (Shi-C12-Shi) y 91d (Shi-C16-Shi) derivadas del ácido (-)-shikímico (24) en mezclas de agua/etanol. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. H2O/EtOH Shi-C4-Shi Shi-C8-Shi Shi-C12-Shi Shi-C16-Shi 2:1 s s s s 3:1 s s s s 4:1 s s s s Figura 82. Representación gráfica de los datos de gelificación en agua/etanol para las moléculas 91a, 91b, 91c y 91d. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. 3.2.3 Síntesis de amidas bolaanfifílicas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico De acuerdo con el subobjetivo 2.2.3 de esta Tesis Doctoral continuamos nuestro trabajo con la síntesis y el estudio de la capacidad de gelificación de las doce amidas bolaanfifílicas asimétricas 98a-c, 99a-c, 103a-c y 104a-c. Su estructura mantiene, como en el caso de las amidas bolaanfifílicas simétricas anteriormente estudiadas, una unidad de ácido (-)-shikimico (24) unida por medio de un enlace amida a una cadena alquílica de distinta longitud e introducimos como novedad un grupo polar en el otro extremo da la cadena alquílica, que puede ser: éster, ácido carboxílico, carbamato de terc-butilo o amina. Pablo López Carracedo 130 Figura 83. Amidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico con extremo éster metílico, ácido carboxílico, carbamato de terc-butilo y amina. Para sintetizar las amidas bolaanfifílicas con un residuo éster metílico, llevamos a cabo un acoplamiento entre el ácido (-)-shikímico (24) y 3 alquilaminas comerciales de diferente longitud de cadena: 4-aminobutanoato de metilo (95), 8-aminooctanoato de metilo (96) y 12aminododecanoato de metilo (97). El acoplamiento se llevó a cabo empleando PyBOP como agente acoplante, DIPEA como base y DMF como disolvente, a temperatura ambiente. Esto nos permitió obtener las correspondientes amidas con rendimientos moderados: 98a (40%), 98b (40%), 99c (43%). Esquema 43. Síntesis de amidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico (98a, 98b y 98c) con extremo éster metílico. Las amidas así sintetizadas pudieron ser caracterizadas a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que cabe destacar: Para la amida 98a un cuartete de 2 protones que aparecen a 3.24 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C12H20NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 274.1213 (m/z teórico = 274.1212) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 98b un cuartete de 2 protones que aparecen a 3.06 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C16H28NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 330.1911 (m/z teórico = 330.1910) correspondiente al ion [M+H]+. Resultados 131 Para la amida 98c un triplete de 2 protones que aparecen a 3.22 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C20H36NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 386.2542 (m/z teórico = 386.2537) correspondiente al ion [M+H]+. Las amidas bolaanfifílicas con un extremo ácido carboxílico 99a, 99b y 99c se obtuvieron a partir de las anteriormente descritas 98a, 98b y 98c mediante una reacción de hidrólisis básica. Esta se llevó a cabo utilizando NaOH como base en una mezcla de agua/metanol 1:1 a una temperatura de 60 °C. Esto nos permitió obtener los ácidos carboxílicos deseados 99a, 99b y 99c con rendimientos del 80%, 98% y 87% respectivamente. Esquema 44. Síntesis de amidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico (99a, 99b y 99c) con extremo ácido carboxílico. Las amidas 99a, 99b y 99c así sintetizadas pudieron ser caracterizadas también a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que cabe destacar: Para la amida 99a un cuartete de 2 protones que aparecen a 3.23 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C11H17NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 282.1062 (m/z teórico = 259.1056) correspondiente al ion [M+23 Na]+. Para la amida 99b un multiplete de 2 protones que aparecen entre 3.15 y 3.37 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C15H26NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 316.1752 (m/z teórico = 316.1755) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 99c un doblete de 2 protones que aparecen a 3.06 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C19H34NO6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 372.2381 (m/z teórico = 372.2377) correspondiente al ion [M+H]+. La síntesis del siguiente grupo de amidas bolaanfifílicas 103a, 103b y 103c, con un grupo terminal carbamato de terc-butilo, se llevó a cabo mediante un acoplamiento entre el ácido (-)- shikímico y tres carbamatos de diferente longitud de cadena: (4-aminobutil) carbamato de tercbutilo (100), (8-aminooctil) carbamato de terc-butilo (101) y (12-aminododecil) carbamato de terc-butilo (102), el primero de ellos comercial y los dos siguientes preparados por reacción de la 1,8-octanodiamina (45) y la 1,12-dodecildiamina (46) comerciales con di-terc-butil dicarbonato, con buenos rendimientos: 101 (58%) y 102 (59%) como se muestra en el Esquema 45. Pablo López Carracedo 132 La síntesis de la amida 103a se describió en la sección anterior (apartado 3.1.2.2). La síntesis de las amidas 103b y 103c se llevó a cabo acoplando el ácido (-)-shikímico (24) con los aminouretanos 101 y 102, empleando PyBOP como agente acoplante, DIPEA como base y DMF como disolvente, a temperatura ambiente. Esto condujo las amidas esperadas con rendimientos moderados: 103b (48%) y 103c (40%) respectivamente. Esquema 45. Síntesis de amidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico con extremo carbamato de terc-butilo 103b y 103c. El aminouretano 101 se caracterizó por comparación de sus datos espectroscópicos con los de la bibliografía que resultaron idénticos.121 El aminouretano 102 y las amidas 103b y 103c pudieron ser caracterizadas a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que cabe destacar: Para el aminouretano 102 un doblete de 13 protones que aparecen a 1.43 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde a los 9 protones de los tres metilos del uretano, y a 2 metilenos de la cadena hidrocarbonada. La fórmula molecular C17H36N2O2 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 300.2822 (m/z teórico = 300.2819) correspondiente al ion [M]+. Para la amida 103b un multiplete de 2 protones que aparecen entre 2.99 y 3.11 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C20H37N2O6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 401.2651 (m/z teórico = 401.2646) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 103c un triplete de 2 protones que aparecen entre 3.22 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C24H45N2O6 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 457.3220 (m/z teórico = 457.3211) correspondiente al ion [M+H]+. El último grupo de amidas de amidas bolaanfifílicas asimétricas 104a, 104b y 104c se preparó por reacción de hidrolisis ácida del grupo carbamato de terc-butilo de las amidas 103a, 103b y 103c respectivamente. La síntesis de la amida 104a se describe en el apartado 3.1.2.1 y la de las amidas 104b y 104c se llevó a cabo sometiendo los carbamatos 103b y 103c a una reacción de hidrólisis ácida, utilizando TFA como ácido, diclorometano como disolvente y a temperatura ambiente. Esto nos condujo a las amidas 104b y 104c esperadas con rendimientos variables: 99% y 50% respectivamente. Resultados 133 Esquema 46. Síntesis de amidas bolaanfifílicas derivadas del ácido (-)-shikímico con extremo amina 104b y 104c. Las amidas 104b y 104c pudieron ser caracterizadas a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, de las que cabe destacar: Para la amida 104b un triplete de 2 protones que aparecen entre 3.18 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C15H29N2O4 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 301.2124 (m/z teórico = 301.2119) correspondiente al ion [M+H]+. Para la amida 104c un triplete de 2 protones que aparecen entre 3.11 ppm en su espectro de RMN-1H y que corresponde al grupo metileno contiguo al nitrógeno de amida. La fórmula molecular C19H37N2O4 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 357.2714 (m/z teórico = 357.2706) correspondiente al ion [M+H]+. 3.2.4 Estudio de gelificación de amidas bolaanfifílicas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico Una vez obtenidas las 12 amidas bolaanfifílicas asimétricas derivadas del ácido (-)-shikímico (24), tal y como acabamos de describir, se realizó un estudio de gelificación en los 14 disolventes utilizados en todos los casos anteriores, con el objetivo de establecer una relación entre su capacidad de gelificación, la longitud de su cadena alquílica y la funcionalización en el extremo terminal de ésta. Los resultados de este estudio para las amidas 98a (Shi-C3-COOMe), 98b (Shi-C7COOMe) y 98c (Shi-C11-COOMe), con longitudes de cadena de 4, 8 y 12 átomos de carbono y un grupo éster metílico en su extremo terminal, están recogidos en la Tabla y la figura siguientes. Pablo López Carracedo 134 Tabla 25. Estudio de gelificación de amidas bolaanfifílicas 98a (Shi-C3-COOMe), 98b (Shi-C7-COOMe) y 98c (Shi-C11-COOMe) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Producto Shi-C3-COOMe Shi-C7-COOMe Shi-C11-COOMe hexano i i i 1,4-dioxano i i 50 tolueno i i s Et2O i i i CHCl3 i s s AcOEt i s 40 THF i s s DCM i s s iPr-OH s s s acetona i s s EtOH s s s MeOH s s s CH3CN s s 50 H2O s s i PBS s s i Figura 84. Representación gráfica del estudio de gelificación de las amidas 98a (Shi-C3-COOMe), 98b (Shi-C7-COOMe) y 98c (Shi-C11-COOMe) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. También en este caso la solubilidad en disolventes polares aumenta al disminuir el tamaño de la cadena, mientras que, en disolventes menos polares, la solubilidad aumenta al aumentar la longitud de cadena. Resultados 135 Estas amidas presentaron malas propiedades gelificantes y solo la amida 98c (Shi-C11COOMe) presentó capacidad de gelificar 1,4-dioxano, acetato de etilo y acetonitrilo con unas cmg demasiado altas: (50 mg/mL), (40 mg/mL) y (50 mg/mL) respectivamente. Continuamos con el estudio para las amidas 99a (Shi-C3-COOH), 99b (Shi-C7-COOH) y 99c (Shi-C11-COOH), con longitudes de cadena de 4, 8 y 12 átomos de carbono y un grupo ácido carboxílico en su extremo terminal. Los resultados obtenidos pueden verse en la Tabla y la figura siguientes. Tabla 26. Estudio de gelificación de amidas bolaanfifílicas 99a (Shi-C3-COOH), 99b (Shi-C7-COOH) y 99c (Shi-C11-COOH) derivadas del ácido (-)-shikímico. S: soluble, i: insoluble, pg: gel parcial, cmg (concentración mínima de gelificación) en mg/mL. Producto Shi-C3-COOH Shi-C7-COOH Shi-C11-COOH hexano i i i 1,4-dioxano i i pg tolueno i i i Et2O i i i CHCl3 i i i AcOEt i i pg THF i i pg DCM i i i iPr-OH s s s acetona i i i EtOH s s s MeOH s s s CH3CN s i i H2O s s 20 PBS s s i Pablo López Carracedo 142 En una ampliación de la imagen anterior podemos observar como las fibrillas conformadas por unidades estructurales de nuestra molécula empiezan a agregarse para formar fibras más grandes. De lo cual podemos concluir que nuestro agente gelificante, de forma similar a como lo hacen otros agentes gelificantes bolaanfifílicos, se ordena en agregados supramoleculares que se asocian entre si dando lugar a fibrillas. Éstas continúan el proceso de agregación para dar lugar a las fibras, las cuales se entrecruzan y a partir de una concentración determinada (cmg) son capaces de inmovilizar el líquido de la disolución dando lugar al gel. Resultados 143 3.2.6 Estudio de absorción y liberación de tintes El estudio de la capacidad de los hidrogeles de 91c (Shi-C12-Shi) para absorber y liberar tintes lo hicimos con geles de concentración 10 mg/mL en agua pura, lo que conduce a un gel de alta estabilidad, que resulta sencillo de manejar y no se desmorona al depositar disoluciones sobre el mismo. Los tintes empleados son el azul de metileno (145) y el naranja de metilo (146) (Figura 91). La razón de uso de estos tintes es tanto su buena señal de absorbancia en ultravioleta, como su estructura, siendo el azul de metileno un colorante catiónico y el naranja de metilo un colorante aniónico, lo que permite comparar la diferencia de absorción para compuestos con diferente carga electrónica. Las concentraciones empleadas para el estudio de absorción y liberación de azul de metileno y naranja de metilo se decidieron tras hacer una recta de calibrado con ambos tintes, escogiendo la concentración más alta sin llegar a superar el límite establecido por la ley de Lambert-Beer, siendo 2.5 mg/mL para el azul de metileno y 5 mg/mL para el naranja de metilo. Figura 91. Estructura del Azul de metileno (145) y del Naranja de metilo (146), tintes empleados en este estudio. 3.2.6.1 Estudio de absorción de azul de metileno y naranja de metilo Para realizar el experimento de absorción de tintes, se formó un gel de 91c (Shi-C12-Shi) en H2O con un volumen de 0.5 mL, disolviendo 5 mg de 91c (Shi-C12-Shi) en 0.5 mL de H2O destilada, calentando hasta total disolución de la mezcla y sonicando para obtener un gel estable. Esto se repitió 2 veces y sobre los geles formados se depositaron 0.5 mL de una disolución de azul de metileno a 2.5 mg/mL o una disolución de naranja de metilo a 5 mg/mL, todas ellas en H2O destilada. Tras dejarlas reposar y observar que el gel no se desmoronaba, se procedió a tomar una alícuota de 10 µL del sobrenadante a diferentes tiempos (1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 168 horas (7 días)), se diluyó en 1 mL de H2O destilada, y se midió su absorbancia por ultravioleta. Los datos obtenidos para la absorción del azul de metileno se recogen en las siguientes gráficas. Figura 92. Izquierda: Gráficas de absorbancia del sobrenadante en función del tiempo para el tinte azul de metileno (145); Derecha: Gráfica de porcentaje de absorción en función del tiempo para el tinte azul de metileno (145). Como puede observarse en las gráficas, la absorción es muy rápida al principio, llegando a un 50% de absorción en las primeras 10 horas, punto tras el cual se empieza a alcanzar el Pablo López Carracedo 144 equilibrio y se hace más lenta. El gel llega a su máxima capacidad de absorción a las 48 h, tiempo tras el cual se alcanza el equilibrio y la concentración en el sobrenadante se mantiene constante, con una absorción final del 67%. Los datos obtenidos para la absorción del naranja de metilo se recogen en las siguientes gráficas. Figura 93. Izquierda: Gráficas de absorbancia del sobrenadante en función del tiempo para el tinte naranja de metilo (146); Derecha: Gráfica de porcentaje de absorción en función del tiempo para el tinte naranja de metilo (146). De nuevo la absorción del tinte por parte del gel es rápida en las primeras horas tras la deposición del tinte sobre el gel y comienza a estabilizarse a partir de las 10h. El máximo de absorción se alcanza a las 48h, tiempo a partir del cual se establece un equilibrio y la concentración de tinte en el sobrenadante se mantiene constante. La capacidad máxima de absorción del gel de la molécula 91c (Shi-C12-Shi) para naranja de metilo es de 70%. De estos resultados podemos concluir que la capacidad de absorción de la molécula 91c para los dos tintes empleados es excelente, con una absorción muy rápida en las 10 primeras horas que empieza a decrecer al cabo de 24 horas, y termina por estabilizarse al cabo de 48 horas. 3.2.6.2 Estudio de liberación de azul de metileno y naranja de metilo El estudio de la capacidad de liberación de los hidrogeles de 91c (Shi-C12-Shi) en agua se realizó de forma análoga al experimento de absorción, empleando un gel de 10 mg/mL, como explicamos anteriormente, debido a la alta estabilidad que presenta y lo sencillo que resulta para manejarlo. Para realizar este estudio, se formó un gel de 91c (Shi-C12-Shi) en H2O con un volumen de 0.5 mL, disolviendo 5 mg de 91c en 0.5 mL de una disolución de 2.5 mg/mL de azul de metileno 5 mg/mL de naranja de metilo en H2O, calentando hasta total disolución de la mezcla y sonicando para obtener un gel estable. Esto se repitió empleando una disolución de 5 mg/mL de naranja de metilo. Sobre los geles formados se depositaron 0.5 mL de H2O destilada. Tras dejarlas reposar y observar que el gel no se desmoronaba, se procedió a tomar una alícuota de 10 µL del sobrenadante a diferentes tiempos (1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 horas), se diluyó en 1 mL de H2O destilada, y se midió la absorbancia por ultravioleta. Los datos de liberación del azul de metileno se recogen en las siguientes gráficas. Resultados 145 Figura 94. Izquierda: Gráficas de absorbancia del sobrenadante en función del tiempo para el tinte azul de metileno (145); Derecha: Gráfica de porcentaje de liberación en función del tiempo para el tinte azul de metileno (145). Se puede observar como la liberación del azul de metileno al sobrenadante es rápida al principio, pero va disminuyendo con el tiempo, debido a dos factores: la saturación del sobrenadante y la disminución de concentración en el gel. El máximo de liberación se consigue a las 48 h, a partir del cual la concentración de azul de metileno en el sobrenadante se mantiene constante. El porcentaje de liberación obtenido es de un 77%. Los datos de liberación del naranja de metilo se recogen en las siguientes gráficas. Figura 95. Izquierda: Gráfica de absorbancia del sobrenadante en función del tiempo para el tinte naranja de metilo (146); Derecha: Gráfica de porcentaje de liberación en función del tiempo para el tinte naranja de metilo (146). En el estudio de liberación de naranja de metilo observamos un patrón similar al de la liberación de azul de metileno, obteniendo una liberación rápida en las primeras horas que se estabiliza con el tiempo. El máximo de liberación en este estudio se obtuvo a 24 h, a partir del cual se mantiene constante. El porcentaje de liberación obtenido para el naranja de metilo es de un 34%. De estos resultados podemos concluir que la capacidad de liberación de la molécula 91c es excelente para el tinte azul de metileno, con una liberación máxima del 77% al cabo de 48 h, mientras que la liberación del naranja de metilo es menor, con una liberación máxima del 34% al cabo de 24 horas. Esto puede ser debido a la mayor afinidad de nuestra molécula 91c por el naranja de metilo, debido a su naturaleza aniónica, que establece unas interacciones más fuertes con nuestro gel y por lo tanto queda más retenido. Pablo López Carracedo 146 3.3 Síntesis y estudios de inhibición de las neuraminidasas de amidas derivadas del oseltamivir De acuerdo con el plan de trabajo establecido en el tercer objetivo de esta tesis doctoral, planteamos la síntesis y el estudio de inhibición de neuraminidasas de una biblioteca de amidas primarias, secundarias y lactamas derivadas del oseltamivir (34). Para ello, decidimos utilizar la ventaja que ofrecen las reacciones multicomponente, capaces de generar múltiples enlaces en un único paso de reacción y la posibilidad de obtener un gran número de compuestos variando únicamente un reactivo de partida. Con la amina de partida, fosfato de oseltamivir (34), y el ácido de partida, ácido 2- (hidroximetil)benzoico (106) fijados, procedimos a seleccionar los aldehídos e isonitrilos que emplearemos en la reacción multicomponente, cuyas varias posibles combinaciones nos llevarán a nuestra biblioteca de compuestos. Seleccionamos para ello tres isonitrilos (ver Figura 96). La razón de la selección de estos 3 isonitrilos es que tanto el terc-butilisonitrilo (147) como el bencilisonitrilo (148) dan lugar a amidas secundarias muy voluminosas, siendo la derivada del terc-butilisonitrilo muy rígida y la derivada del bencilisonitrilo más flexible. El último isonitrilo (2,4-dimetoxibencilisonitrilo (107)) se seleccionó debido a que es conocido como un isonitrilo convertible, el cual permite una fácil transformación de su producto de reacción de amida secundaria a amida primaria tras tratarlo con medio ácido. Figura 96. Estructura de los isonitrilos seleccionados para la reacción multicomponente de UGI. A continuación, seleccionamos seis aldehídos (ver Figura 97). Estos aldehídos fueron seleccionados basándonos en los estudios previos mencionados anteriormente (ver página 56), puesto que varios ya se han incorporado a la estructura del oseltamivir y probado con resultados satisfactorios, mientras que otros son aldehídos con pequeñas variaciones sobre los ya mencionados. Figura 97. Estructura de los aldehídos seleccionados para la reacción multicomponente de UGI. Resultados 147 Las amidas que obtendremos a partir de estos reactivos se pueden dividir en dos series. En la primera de ellas mantendremos una amida secundaria en su estructura, con un sustituyente de terc-butilo o de bencilo, y variaremos los sustituyentes aromáticos derivados de los aldehídos descritos en la Figura 97. Figura 98. Amidas secundarias derivadas del oseltamivir (34) propuestas para la primera parte de este estudio. En la segunda serie emplearemos el isonitrilo 107 para conseguir una estructura de amina primaria (Figura 99), y solo variaremos el sustituyente aromático empleando de nuevo todos los aldehídos descritos en la Figura 97. Figura 99. Amidas primarias derivadas del oseltamivir (34) propuestas para la segunda parte de este estudio. Para finalizar, planteamos también la síntesis de dos lactamas (179 y 180) derivadas del Oseltamivir (34), empleando química similar a la descrita por nuestro grupo de investigación para el ácido (-)-shikímico (24) en publicaciones anteriores (Figura 100).122 Pablo López Carracedo 148 Figura 100. Lactamas bicíclicas derivavas del oseltamivir (34) propuestas para la tercera parte de este estudio. 3.3.1 Síntesis de amidas secundarias derivadas del oseltamivir De acuerdo con el subobjetivo 2.3.1 comenzamos realizando la síntesis de la primera serie de amidas secundarias derivadas de oseltamivir: 155 y 156, 157 y 158, 159 y 160, 161 y 162, 163 y 164, 165 y 166, mostradas en la Figura 101. Figura 101. Estructuras de las amidas secundarias derivadas del oseltamivir (34). De acuerdo con el plan de trabajo establecido fue necesario en primer lugar preparar los precursores no comerciales necesarios para las reacciones multicomponente. Teniendo en cuenta que el fosfato de oseltamivir (34), el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106), los isonitrilos de terc-butilo 147 y de bencilo 148 y los aldehídos 149 y 150 (Figura 97) son productos comerciales, solo fue necesario preparar los aldehídos 151, 152, 153 y 154. Esquema 47. Esquema general de síntesis de los aldehídos 151, 152, 153 y 154. La síntesis de estos aldehídos se llevó a cabo siguiendo el método ilustrado en el esquema general de síntesis anterior, empleando el aldehído correspondiente (179 o 180) y el ácido Resultados 149 borónico deseado (181 o 182), realizando una reacción de Suzuki entre ambos empleando K2CO3 como base, Pd(PPh3)4 como catalizador y DMSO como disolvente, calentando a reflujo en una atmósfera inerte y desgasificada. Este procedimiento nos permitió obtener los aldehídos 151 (78%), 152 (80%), 153 (91%) y 154 (92%) tras una purificación cromatográfica. Los aldehídos 151 y 152 se caracterizaron comparando sus propiedades espectroscópicas con las descritas en la bibliografía.123, 124 Los aldehídos 153 y 154 se caracterizaron de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas, entre las que destacan: Para el aldehído 152 un singlete de 1 protón que aparece a 10.44 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponde al protón del grupo aldehído. La fórmula molecular C12H11O2S fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 219.0434 (m/z teórico = 219.0435) correspondiente al ion [M+H]+. Para el aldehído 153 un singlete de 1 protón que aparece a 10.48 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponde al protón del grupo aldehído. La fórmula molecular C12H11O2S fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 219.0434 (m/z teórico = 219.0435) correspondiente al ion [M+H]+. A continuación, se llevó a cabo síntesis de los compuestos derivados de oseltamivir con una amida secundaria como grupo funcional siguiendo un procedimiento general común consistente en dos pasos: - Una reacción multicomponente de UGI, empleando el fosfato de oseltamivir (34), el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106), el isonitrilo (147 o 148) y el aldehído (149, 150, 151 o 152, ver Figura 97), para generar los productos de UGI correspondientes en cada caso en forma de un par de diasteroisómeros. - Una hidrólisis básica del grupo éster de este par de diasteroisómeros para obtener los correspondientes ácidos carboxílicos, también como un par de diasteroisómeros (ver Tabla 29). Esquema 48. Esquema general de síntesis vía reacción de Ugi de los compuestos 155 a 166. Pablo López Carracedo 150 Tabla 29. Compuestos obtenidos en las reacciones descritas en el Esquema 48. Compuesto R1 R2 Rendimiento 183 y 184 terc-butil [1,1'-bifenil]-4-il 48% 185 y 186 bencil [1,1'-bifenil]-4-il 46% 187 y 188 terc-butil dibenzo[b,d]tiofen-2-il 36% 189 y 190 bencil dibenzo[b,d]tiofen-2-il 35% 191 y 192 bencil 4-(tiofen-2-il)-il 42% 193 y 194 bencil 4-(tiofen-3-il)-il 38% 155 y 156 terc-butil [1,1'-bifenil]-4-il 96% 157 y 158 bencil [1,1'-bifenil]-4-il 89% 159 y 160 terc-butil dibenzo[b,d]tiofen-2-il 79% 161 y 162 bencil dibenzo[b,d]tiofen-2-il 73% 163 y 164 bencil 4-(tiofen-2-il)-il 82% 165 y 166 bencil 4-(tiofen-3-il)-il 77% Para ello se mezclaron los 4 compuestos de partida empleando un equivalente de cada uno de ellos, excepto para el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106) del que se emplearon 0.9 equivalentes. Se utilizó metanol o una mezcla de metanol/tetrahidrofurano 1:1 como disolvente, dependiendo de la solubilidad de los reactivos, y la reacción se dejó bajo agitación a temperatura ambiente en un agitador orbital durante 3 días. Tras la elaboración y purificación por columna cromatográfica, se aislaron las mezclas de diateroisómeros 183 a 194 y se procedió a realizar la hidrólisis básica del grupo éster de éstas, empleando hidróxido de litio en una mezcla de tetrahidrofurano/agua 5:1 y calentando a 50 °C. Tras esta reacción fue necesaria otra purificación por cromatografía que nos permitió obtener los 12 compuestos: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 y 166 puros (ver Tabla 29). Todos los compuestos obtenidos se caracterizaron de acuerdo con sus propiedades espectroscópicas (RMN-1H, RMN-13C y DEPT) y espectrométricas, de las que destacamos: Para los compuestos 155 y 156: ambos diasteroisómeros muestran un singlete de 1 protón que aparece a 4.35 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponde al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina. La fórmula molecular C32H44N3O5 fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = 550.32 (m/z teórico = 550.32) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 6.112 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 7.322 min. Para los compuestos 157 y 158: un diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.50 ppm y el otro diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.48 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponden al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina. La fórmula molecular C35H42N3O5 fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = 584.30 (m/z teórico = 584.30) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 6.126 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 7.288 min. Para los compuestos 159 y 160: un diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.48 ppm y el otro diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.52 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponden al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina.. La fórmula molecular C32H42N3O5S fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = Resultados 151 580.28 (m/z teórico = 580.28) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 6.192 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 6.238 min. Para los compuestos 161 y 162: un diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.65 ppm y el otro diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.64 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponden al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina. La fórmula molecular C35H40N3O5S fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = 614.26 (m/z teórico = 614.26) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 6.343 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 7.221 min. Para los compuestos 163 y 164: un diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.46 ppm y el otro diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.45 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponden al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina. La fórmula molecular C33H40N3O5S fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = 590.26 (m/z teórico = 590.26) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 5.747 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 6.081 min. Para los compuestos 165 y 166: un diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.46 ppm y el otro diasteroisómero muestra un singlete de 1 protón que aparece a 4.45 ppm en sus espectros de RMN-1H y que corresponden al protón contiguo al carbonilo de la amida y al nitrógeno de la amina. La fórmula molecular C33H40N3O5S fue confirmada mediante su espectro de masas (HPLC-MS), que muestra una señal con una relación m/z = 590.26 (m/z teórico = 590.26) correspondiente al ion [M+H]+. El tiempo de retención de un diasteroisómero es 5.768 min. y el tiempo de retención del otro diasteroisómero es 7.291 min. 3.3.2 Síntesis de amidas primarias derivadas del oseltamivir Abordamos a continuación el segundo de los subobjetivos de este capítulo de la Tesis doctoral 2.3.2 planteado la síntesis de amidas primarias derivadas de oseltamivir: 167 y 168, 169 y 170, 171 y 172, 173 y 174, 175 y 176, 177 y 178, mostradas en la Figura 102. Figura 102. Estructuras de las amidas primarias derivadas del oseltamivir. Pablo López Carracedo 254 5.3.2 Síntesis de la (3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxi-N-octilciclohex-1-eno-1-carboxamida (90b) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve 24 (500 mg, 2.87 mmol) en 20 ml de DMF seca. Se añaden PyBOP (2.24 g, 4.3 mmol) y DIPEA (1.5 mL, 8.61 mmol) y se agita a t.a. durante 20 minutos. Se añade la n-octilamina (40) (0.98 mL, 5.74 mmol) y se agita a t.a. durante 24 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (CH2Cl2/MeOH 90:10) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.6. Se elimina el disolvente a vacío. Se tritura el producto con diclorometano y se obtiene 90b como un sólido blanco amorfo, con un rendimiento del 30%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 0.78 – 0.91 (m, 3H, CH3), 1.23 (s, 10H, 5xCH2), 1.39 (t, J = 5.2 Hz, 2H, CH2), 1.95 (dd, J = 17.7, 4.8 Hz, 1H, CH), 3.05 (dt, J = 7.7, 5.0 Hz, 2H, NCH2), 3.47 (dd, J = 7.2, 3.9 Hz, 1H, OCH), 3.78 (dt, J = 8.6, 4.3 Hz, 1H, OCH), 4.15 (s, 1H, OCH), 4.50 (d, J = 4.4 Hz, 1H, OH), 4.65 (d, J = 6.8 Hz, 1H, OH), 4.74 (d, J = 3.8 Hz, 1H, OH), 6.24 (d, J = 3.2 Hz, 1H, CH), 7.77 (t, J = 5.7 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 14.43 (CH3), 23.71 (CH2), 28.05 (CH2), 30.43 (CH2), 32.21 (CH2), 32.99 (CH2), 40.67 (CH2), 67.40 (OCH), 68.27 (OCH), 73.12 (OCH), 132.42 (C=C). IR (υ, cm-1): 3323 (OH y NH) 1609 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C15H28NO4, 286.2010; encontrado, 286.2013. []D22: -71.20 (c 1.1, MeOH) Metodología 255 Pablo López Carracedo 256 5.3.3 Síntesis de la (3R,4S,5R)-N-dodecil-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamida (90c) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve el compuesto 24 (100 mg, 0.57 mmol) en 5 ml de DMF seca. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol) y DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se agita a t.a. durante 20 minutos. Se añade la n-docecilamina (42) (210 mg, 1.14 mmol) y se agita a t.a. durante 18 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (CH2Cl2/MeOH 90:10) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.8. Se elimina el disolvente a vacío. Se tritura el producto con diclorometano y se obtiene 90c como un sólido blanco, con un rendimiento del 60%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 0.78 – 0.87 (m, 3H, CH3), 1.11 – 1.29 (m, 18H, 9xCH2), 1.36 (d, J = 5.9 Hz, 2H, CH2), 1.88 – 1.99 (m, 1H, CH), 2.98 – 3.09 (m, 2H, NCH2), 3.41 – 3.51 (m, 1H, OCH), 3.71 – 3.83 (m, 1H, OCH), 4.14 (s, 1H, OCH), 4.50 (dd, J = 4.5, 1.1 Hz, 1H, OH), 4.64 (dd, J = 6.9, 1.1 Hz, 1H, OH), 4.73 (dd, J = 3.8, 1.1 Hz, 1H, OH), 6.17 – 6.30 (m, 1H, CH), 7.76 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 14.47 (CH3), 23.72 (CH2), 28.04 (CH2), 30.45 (CH2), 30.73 (CH2), 32.23 (CH2), 33.05 (CH2), 40.68 (CH2), 67.38 (OCH), 68.21 (OCH), 73.11 (OCH), 132.35 (C=C), 134.36 (C=C), 170.34 (C=O). IR (υ, cm-1): 3323 (OH y NH) 1607 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C19H36NO4, 342.2636; encontrado, 342.2639. []D22: -59.40 (c 1.0, MeOH) Metodología 257 Pablo López Carracedo 258 5.3.4 Síntesis de la (3R,4S,5R)-N-hexadecil-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1carboxamida (90d) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve el compuesto 24 (100 mg, 0.57 mmol) en 5 ml de DMF seca. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol) y DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se agita a t.a. durante 20 minutos. Se añade la n-hexadecilamina (43) (275 mg, 1.14 mmol) y se agita a t.a. durante 12 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (CH2Cl2/MeOH 85:15) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.8. Se elimina el disolvente a vacío. Se tritura el producto con diclorometano y se obtiene 90d como un sólido blanco, con un rendimiento del 31%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 0.75 – 0.87 (m, 3H, CH3), 1.10 – 1.28 (m, 26H, 13xCH2), 1.37 (s, 2H, CH2), 1.93 (dd, J = 17.8, 4.8 Hz, 1H, CH), 3.03 (d, J = 6.7 Hz, 2H, NCH2), 3.45 (d, J = 5.3 Hz, 1H, OCH), 3.78 (d, J = 6.8 Hz, 1H, OCH), 4.13 (s, 1H, OCH), 4.49 (dd, J = 4.5, 1.0 Hz, 1H, OH), 4.64 (dd, J = 6.9, 1.0 Hz, 1H, OH), 4.73 (dd, J = 3.8, 1.0 Hz, 1H, OH), 6.22 (s, 1H, CH), 7.76 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 13.88 (CH3), 22.03 (CH2), 26.42 (CH2), 28.64 (CH2), 28.74 (CH2), 28.98 (CH2), 29.06 (CH2), 30.59 (CH2), 31.23 (CH2), 65.53 (OCH), 66.68 (OCH), 70.92 (OCH), 131.75 (C=C), 166.86 (C=O). IR (υ, cm-1): 3328 (OH y NH), 1619 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C23H44NO4, 398.3267; encontrado, 398.3265. []D22: -137.20 (c 0.5, MeOH) Metodología 259 Pablo López Carracedo 260 5.3.5 Síntesis del (4-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamido) butil)carbamato de terc-butilo (103a) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve el compuesto 24 (200 mg, 1.14 mmol) en 8 ml de DMF seca. Se añade PyBOP (890 mg, 1.71 mmol) y DIPEA (0.6 mL, 3.42 mmol) y se agita a t.a. durante 30 minutos. Se añade 100 (216 mg, 1.14 mmol) y se agita a t.a. durante 20 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.7. Se elimina el disolvente a vacío, se tritura el producto con diclorometano y se obtiene 103a como un sólido blanco amorfo, con un rendimiento del 45%. RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 1.43 (s, 9H, C(CH3)3), 1.47 – 1.57 (m, 4H, 2xCH2), 2.15 (dd, J = 17.8, 6.2 Hz, 1H, CH), 2.73 (dd, J = 17.8, 5.1 Hz, 1H, CH), 3.05 (t, J = 6.4 Hz, 2H, NCH2), 3.24 (t, J = 6.6 Hz, 2H, NCH2), 3.63 (dd, J = 7.8, 4.2 Hz, 1H, OCH), 3.98 (dt, J = 7.7, 5.7 Hz, 1H, OCH), 4.34 (t, J = 4.1 Hz, 1H, OCH), 6.39 (dt, J = 3.8, 1.8 Hz, 1H, CH). RMN-13C (75 MHz, D2O): δ 25.73 (CH2), 26.47 (CH2), 27.76 (C(CH3)3), 31.17 (CH2), 39.26 (CH2), 39.71 (CH2), 65.84 (OCH), 66.41 (OCH), 71.54 (OCH), 80.82 (Cc), 130.68 (C=C), 133.35 (C=C), 158.29 (C=O), 170.15 (C=O). IR (υ, cm-1): 3327 (OH y NH), 1689 (CO), 1531 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C16H29N2O6, 345.2020; encontrado, 345.2021. []D22: -98.26 (c 1.0, MeOH) Metodología 261 Pablo López Carracedo 262 5.3.6 Síntesis de la (3R,4S,5R)-N-(4-aminobutil)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1carboxamida (104a) En un matraz de fondo redondo se disuelve 103a (60mg, 0.174 mmol) en CH2Cl2. Se añade gota a gota TFA (8 mL) y se deja agitando a t.a. Al cabo de una hora se observa la completa desaparición del producto de partida (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1, Rf: 0.7) y la aparición de un nuevo producto de Rf: 0.1. Se elimina el disolvente a vacío, se añade tolueno y se concentra a sequedad. Se obtiene el producto 104a como sal de TFA, con rendimiento cuantitativo (>99%). RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 1.45 – 1.63 (m, 4H, 2xCH2), 2.12 (dd, J = 17.8, 6.2 Hz, 1H, CH), 2.61 – 2.79 (m, 3H, CH2 + CH), 3.22 (d, J = 6.5 Hz, 2H, NCH2), 3.60 (dd, J = 7.9, 4.2 Hz, 1H, OCH), 3.95 (q, J = 6.3 Hz, 1H, OCH), 4.30 (d, J = 4.3 Hz, 1H, OCH), 6.37 (d, J = 3.8 Hz, 1H, CH). RMN-13C (75 MHz, D2O): δ 24.12 (CH2), 25.39 (CH2), 31.00 (CH2), 38.77 (CH2), 39.10 (CH2), 65.77 (OCH), 66.37 (OCH), 71.42 (OCH), 130.83 (C=C), 133.12 (C=C), 170.16 (C=O). IR (υ, cm-1): 3331 (OH y NH) 1635 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C11H21N2O4, 245.1496; encontrado, 245.1494. []D22: -101.37 (c 1,0, MeOH) Metodología 263 Pablo López Carracedo 270 5.3.11 Síntesis del (8-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamido) octil)carbamato de terc-butilo (103b) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera inerte de argón se disuelve 24 (70 mg, 0.40 mmol) en 4 mL de DMF. Se añaden PyBOP (312 mg, 0.60 mmol) y DIPEA (0.1 mL, cat) y se deja activando durante 30 minutos. Se añade 101 (100 mg, 0.40 mmol) y se deja reaccionando a t.a. Al cabo de 24 horas se observa la desaparición de los productos de partida y la aparición de un nuevo producto de reacción (CH2Cl2/MeOH 90:10, Rf: 0.2). Se concentra el disolvente a vacío y el crudo resultante se purifica por cromatografía en columna (CH2Cl2/MeOH 90:10). Se obtiene 103b como un sólido blanco amorfo, con un rendimiento del 63%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.22 (s, 10H, 5xCH2), 1.35 (d, J = 3.3 Hz, 16H, C(CH3)3 + 2xCH2), 1.95 (dd, J = 17.6, 4.9 Hz, 1H, CH), 2.43 (s, 1H, CH), 2.86 (q, J = 6.4 Hz, 2H, NCH2), 2.99 – 3.11 (m, 2H, NCH2), 3.46 (q, J = 4.9 Hz, 1H, OCH), 3.79 (dq, J = 8.5, 4.8 Hz, 1H, OCH), 4.15 (s, 1H, OCH), 4.48 (d, J = 4.6 Hz, 1H, OH), 4.63 (d, J = 6.7 Hz, 1H, OH), 4.72 (d, J = 3.9 Hz, 1H, OH), 6.24 (d, J = 3.5 Hz, 1H, CH), 6.67 – 6.79 (m, 1H, NH), 7.68 – 7.85 (m, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 26.29 (CH2), 26.44 (CH2), 28.30 (CH2), 28.73 (C(CH3)3), 28.80 (CH2), 29.13 (CH2), 29.49 (CH2), 30.59 (CH2), 38.78 (CH2), 65.59 (OCH), 66.76 (OCH), 70.90 (OCH), 77.30 (Cc), 131.72 (C=C), 131.93 (C=C), 155.59 (C=O), 166.92 (C=C). IR (υ, cm-1): 3325 (OH y NH), 1687 (CO), 1534 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C20H37N2O6, 401.2646; encontrado, 401.2651. []D22: -112.02 (c 1.0, MeOH) Metodología 271 Pablo López Carracedo 272 5.3.12 Síntesis de la (3R,4S,5R)-N-(8-aminooctil)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1carboxamida (104b) En un matraz de fondo redondo se suspende 103b (42 mg, 0.11 mmol) en 2 mL de CH2Cl2, se añaden gota a gota 2 mL de TFA y se deja reaccionando a t.a. Al cabo de 2 horas se observa la desaparición del producto de partida y la aparición de un nuevo producto de reacción de Rf: 0.1 (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1). Se concentra el disolvente a vacío, se añade tolueno y se concentra a sequedad. Se obtiene 104b como sal de TFA con rendimiento cuantitativo, como un sólido blanco. RMN-1H (300 MHz, D2O): δ 1.27 (s, 10H, 5xCH2), 1.47 (t, J = 6.7 Hz, 2H, CH2), 1.53 – 1.67 (m, 2H, CH2), 2.15 (dd, J = 17.7, 7.1 Hz, 1H, CH), 2.68 (dd, J = 17.7, 5.3 Hz, 1H, CH), 2.92 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NCH2), 3.18 (t, J = 6.7 Hz, 2H, NCH2), 3.68 (dd, J = 8.7, 4.3 Hz, 1H, OCH), 3.97 (q, J = 7.0 Hz, 1H, OCH), 4.36 (t, J = 4.1 Hz, 1H, OCH), 6.32 (d, J = 4.2 Hz, 1H, CH). RMN-13C (75 MHz, D2O): δ 25.34 (CH2), 25.77 (CH2), 26.55 (CH2), 27.92 (CH2), 27.95 (CH2), 28.09 (CH2), 31.00 (CH2), 39.39 (CH2), 39.49 (CH2), 65.71 (OCH), 66.29 (OCH), 71.36 (OCH), 130.47 (C=C), 133.26 (C=C), 170.05 (C=O). IR (υ, cm-1): 3326 (OH y NH), 1631 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C15H29N2O4, 301.2119; encontrado, 301.2124. []D22: -107.78 (c 1.0, MeOH) Metodología 273 Pablo López Carracedo 274 5.3.13 Síntesis de la (3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R)-N,N'-(octano-1,8-diil)bis(3,4,5trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamida) (91b) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve el compuesto 24 (100 mg, 0.57 mmol) en 5 ml de DMF seca. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol) y DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se agita a TA durante 20 minutos. Se añade la 1,8octildiamina (45) (42 mg, 0.28 mmol) y se agita a TA durante 24 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.3. Se elimina el disolvente a vacío, se purifica por cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1) y se obtiene 91b como un sólido blanco amorfo, con un rendimiento del 94%. RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 1.38 (s, 10H, 5xCH2), 1.53 (t, J = 7.1 Hz, 4H, 2xCH2), 2.15 (dd, J = 17.8, 6.2 Hz, 2H, 2xCH), 2.73 (dd, J = 17.9, 5.1 Hz, 2H, 2xCH), 3.23 (q, J = 6.7 Hz, 4H, 2xNCH2), 3.63 (dd, J = 7.9, 4.3 Hz, 2H, 2xOCH), 3.98 (q, J = 6.3 Hz, 2H, 2xOCH), 4.33 (d, J = 4.3 Hz, 2H, 2xOCH), 6.38 (d, J = 3.9 Hz, 2H, 2xCH), 7.95 (d, J = 6.0 Hz, 2H, 2xNH). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 27.89 (CH2), 30.26 (CH2), 30.34 (CH2), 32.25 (CH2), 40.63 (CH2), 67.39 (OCH), 68.26 (OCH), 73.14 (OCH), 132.36 (C=C), 134.37 (C=C), 170.33 (C=O). IR (υ, cm-1): 3335 (OH y NH), 1621 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C22H37N2O8, 457.2537; encontrado, 457.2537. []D22: -51.8 (c 0.9, MeOH) Metodología 275 Pablo López Carracedo 276 5.3.14 Síntesis del 8-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamido) octanoato de metilo (98b) En un matraz de fondo redondo, purgado y bajo atmósfera inerte de argón se disuelve 24 (100 mg, 0,57 mmol) en 3 mL de DMF seca. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol) y DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se deja agitando durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añade 96 (120 mg, 0.70 mmol) y se deja agitando a t.a. Tras 22 horas de reacción se observa por ccf la desaparición del producto de partida (CH2Cl2/MeOH 93:7, Rf: 0.3) y la aparición de un nuevo producto de reacción (Rf: 0.2). Se concentra el disolvente a vacío y se el crudo obtenido se purifica por columna (CH2Cl2/MeOH 93:7) para obtener 98b como un aceite transparente con un rendimiento del 40%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.24 (s, 6H, 3xCH2), 1.40 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH2), 1.50 (t, J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 1.97 (dd, J = 17.7, 4.9 Hz, 1H, CH), 2.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2), 2.44 (d, J = 4.2 Hz, 1H, CH), 3.06 (q, J = 7.0 Hz, 2H, NCH2), 3.48 (dt, J = 7.2, 4.3 Hz, 1H, OCH), 3.57 (s, 3H, OCH3), 3.80 (dt, J = 8.9, 4.2 Hz, 1H, OCH), 4.16 (s, 1H, OCH), 4.50 (d, J = 4.4 Hz, 1H, OH), 4.65 (d, J = 6.8 Hz, 1H, OH), 4.74 (d, J = 3.8 Hz, 1H, OH), 6.21 – 6.30 (m, 1H, CH), 7.78 (t, J = 5.7 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 24.43 (CH2), 26.32 (CH2), 28.46 (CH2), 29.08 (CH2), 30.59 (CH2), 33.28 (CH2), 38.74 (CH2), 51.21 (CH3), 65.59 (OCH), 66.76 (OCH), 70.90 (OCH), 131.72 (C=C), 131.96 (C=C), 166.94 (C=O), 173.42 (C=O). IR (υ, cm-1): 3323 (OH y NH), 1736 (CO), 1618 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C16H28NO6, 330.1911; encontrado, 330.1910. []D22: -74.2 (c 1.2, MeOH) Metodología 277 Pablo López Carracedo 278 5.3.15 Síntesis del ácido 8-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1carboxamido)octanoico (99b) En un matraz de fondo redondo se disuelve 98b (48 mg, 0.15 mmol) en 5 mL de H2O, se añade NaOH (50 mg, 1.25 mmol) y se deja agitando a 60 ºC. Tras 1 hora de reacción se observa por ccf la desaparición del producto de partida (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1, Rf: 0.4) y la aparición de un nuevo producto de reacción (Rf: 0). Se añade Amberlita H-100 ácida, se deja agitando durante 30 minutos, se filtra la mezcla y se lava con metanol. Se concentran los filtrados a sequedad para obtener 99b como un sólido aceitoso con un rendimiento del 98%. RMN-1H (300 MHz, D2O): δ 1.30 (s, 8H, 4x), 1.54 (dd, J = 14.4, 7.3 Hz, 4H, 2xCH2), 2.26 (m, 3H, CH2 + CH), 2.71 (dd, J = 17.7, 5.5 Hz, 1H, CH), 3.15 – 3.37 (m, 2H, NCH2), 3.64 – 3.80 (m, 1H, OCH), 4.00 (q, J = 7.5, 7.1 Hz, 1H, OCH), 4.33 – 4.47 (m, 1H, OCH), 6.31 – 6.46 (m, 1H, CH). RMN-13C (75 MHz, D2O): δ 24.39 (CH2), 25.74 (CH2), 27.88 (CH2), 28.05 (CH2), 28.08 (CH2), 31.09 (CH2), 34.39 (CH2), 39.52 (CH2), 65.73 (OCH), 66.28 (OCH), 71.43 (OCH), 130.45 (C=C), 133.32 (C=C), 170.06 (C=O), 180.10 (C=O). IR (υ, cm-1): 3324 (OH y NH), 1728 (CO), 1620 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C15H26NO6, 316.1755; encontrado, 316.1752. []D22: -81.83 (c 1.0, MeOH) Metodología 279 Pablo López Carracedo 286 5.3.19 Síntesis de la (3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R)-N,N'-(dodecano-1,12-diil)bis(3,4,5trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamida) (91c) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera de argón se disuelve el compuesto 24 (100 mg, 0.57 mmol) en 5 ml de DMF seca. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol) y DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se agita a t.a. durante 20 minutos. Se añade la 1,12-dodecildiamina (46)(57 mg, 0.28 mmol) y se agita a t.a. durante 24 horas. Al cabo de este tiempo se observa por ccf (CH2Cl2/MeOH 90:10) la desaparición del producto de partida y la aparición de un producto nuevo de Rf: 0.2. Se elimina el disolvente a vacío. Se tritura el producto con diclorometano y se obtiene 91c como un sólido blanco, con un rendimiento del 93%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.24 (s, 16H, 8xCH2), 1.40 (p, J = 7.0 Hz, 4H, 2xCH2), 1.97 (dd, J = 17.9, 4.9 Hz, 2H, 2xCH), 2.37 – 2.52 (m, 2H, 2xCH), 3.06 (q, J = 6.9 Hz, 4H, 2xNCH2), 3.48 (p, J = 2.9 Hz, 2H, 2xOCH), 3.80 (d, J = 5.7 Hz, 2H, 2xOCH), 4.16 (s, 2H, 2xOCH), 4.50 (d, J = 4.3 Hz, 2H, 2xOH), 4.65 (d, J = 6.6 Hz, 2H, 2xOH), 4.74 (s, 2H, 2xOH), 6.26 (d, J = 3.3 Hz, 2H, 2xCH), 7.77 (t, J = 5.7 Hz, 2H, 2xNH). RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 26.47 (CH2), 28.82 (CH2), 29.04 (CH2), 29.12 (CH2), 30.60 (CH2), 38.77 (CH2), 65.58 (OCH), 66.74 (OCH), 70.93 (OCH), 131.74 (C=C), 131.88 (C=C), 166.92 (C=O). IR (υ, cm-1): 3335 (OH y NH) 1621 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C26H45N2O8, 513.3170; encontrado, 513.3170. []D22: -49.6 (c 1.0, MeOH) Metodología 287 Pablo López Carracedo 288 5.3.20 Síntesis del 12-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamido) dodecanoato de metilo (98c) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera inerte de argón se disuelve 24 (100 mg, 0.57 mmol) en 6 mL de DMF. Se añaden PyBOP (445 mg, 0.85 mmol), DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) y se deja activando durante 30 minutos. Se añade 97 (156 mg, 0,68 mmol) y se deja reaccionando a t.a. Al cabo de 24 horas se observa la desaparición de los productos de partida y la aparición de un nuevo producto de reacción (CH2Cl2/MeOH 90:10, Rf: 0.2). Se concentra el disolvente a vacío y el crudo resultante se purifica por cromatografía en columna (CH2Cl2/MeOH 90:10). Se obtiene 98c como un sólido blanco amorfo, con un rendimiento del 43%. RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 1.31 (s, 13H, 7xCH2), 1.45 – 1.67 (m, 2H, CH2), 2.15 (dd, J = 17.5, 6.3 Hz, 1H, CH), 2.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.73 (dd, J = 17.8, 5.0 Hz, 1H, CH), 3.22 (t, J = 7.1 Hz, 2H, NCH2), 3.65 (s, 4H, OCH + OCH3), 3.98 (q, J = 6.2 Hz, 1H, OCH), 4.34 (s, 1H, OCH), 6.38 (d, J = 3.6 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 26.00 (CH2), 28.01 (CH2), 30.15 (CH2), 30.32 (CH2), 30.41 (CH2), 30.51 (CH2), 30.58 (CH2), 30.62 (CH2), 32.25 (CH2), 34.80 (CH2), 40.67 (CH2), 51.94 (CH3), 67.39 (OCH), 68.25 (OCH), 73.16 (OCH), 132.33 (C=C), 134.39 (C=C), 170.31 (C=O), 176.00 (C=O). IR (υ, cm-1): 3302 (OH y NH), 1757 (CO), 1648 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C20H36NO6, 386.2537; encontrado, 386.2542. []D22: -49.47 (c 0.9, MeOH) Metodología 289 Pablo López Carracedo 290 5.3.21 Síntesis del ácido 12-((3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxiciclohex-1-eno-1carboxamido)dodecanoico (99c) En un matraz de fondo redondo se disuelve 98c (100 mg, 0.26 mmol) en 5 mL de una mezcla de THF/H2O 5:1, se añade LiOH (44 mg, 1.04 mmol) y se deja reaccionando a t.a. Al cabo de 16 horas se observa la desaparición del producto de partida (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1, Rf: 0.5) y la aparición de un nuevo producto de Rf: 0.3. Se añade Amberlita H-100 ácida y se deja agitando 20 minutos. Se filtra y se concentra a sequedad y el crudo obtenido se somete a cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1) para obtener 99c como un sólido blanco amorfo con un rendimiento del 87%. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.24 (s, 12H, 6xCH2), 1.34 – 1.54 (m, 2H, CH2), 1.89 – 2.04 (m, 1H, CH), 2.14 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2), 2.44 (s, 1H, CH), 3.06 (d, J = 6.7 Hz, 2H, NCH2), 3.48 (dd, J = 6.8, 4.0 Hz, 2H, OCH), 3.75 – 3.86 (m, 1H, OCH), 4.16 (s, 1H, OCH), 6.25 (s, 1H, CH), 7.78 (d, J = 5.9 Hz, 1H, NH). RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 24.77 (CH2), 26.52 (CH2), 28.70 (CH2), 28.85 (CH2), 28.99 (CH2), 29.03 (CH2), 29.06 (CH2), 29.15 (CH2), 30.70 (CH2), 34.23 (CH2), 38.87 (CH2), 65.65 (OCH), 66.79 (OCH), 71.04 (OCH), 131.87 (C=C), 131.92 (C=C), 167.10 (C=O), 175.01 (C=O). IR (υ, cm-1): 3307 (OH y NH), 1739 (CO), 1635 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C19H34NO6, 372.2377; encontrado, 372.2381. []D22: -11.73 (c 0.8, MeOH) Metodología 291 Pablo López Carracedo 292 5.3.22 Síntesis de la (3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R)-N,N'-(hexadecano-1,16-diil)bis(3,4,5trihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxamida) (91d) En un matraz de fondo redondo se disuelve 24 (168 mg, 0.97 mmol) en 5 mL de DMF. Se añaden PyBOP (650 mg, 1.25 mmol) y DIPEA (0.4 mL, 2.34 mmol) y se deja activando 30 minutos. Tras este tiempo se añade 47 (100 mg, 0.39 mmol) y se deja reaccionando a t.a. Tras 24 h de reacción se observa la desaparición del producto de partida (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1, Rf: 0.1) y la aparición de un nuevo producto de reacción (Rf: 0.2). Se concentra el disolvente a vacío y el crudo obtenido se purifica por cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:2:1), para obtener 91d como un sólido blanco amorfo con un rendimiento del 20%. RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 1.30 (s, 24H, 12xCH2), 1.53 (m, 4H, 2xCH2), 2.17 (dt, J = 17.7, 8.4 Hz, 2H, 2xCH), 2.73 (dd, J = 17.8, 5.2 Hz, 2H, 2xCH), 3.22 (t, J = 7.1 Hz, 4H, 2xNCH2), 3.63 (dd, J = 7.9, 4.2 Hz, 2H, 2xOCH), 3.98 (q, J = 6.3 Hz, 2H, 2xOCH), 4.35 (q, J = 6.9, 4.2 Hz, 2H, 2xOCH), 4.53 (s, 2H, 2xOH), 6.33 – 6.44 (m, 2H, 2xCH). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 28.03 (CH2), 30.43 (CH2), 30.67 (CH2), 30.72 (CH2), 32.26 (CH2), 40.69 (CH2), 67.41 (OCH), 68.27 (OCH), 73.17 (OCH), 132.34 (C=C), 134.42 (C=C), 170.38 (C=O). IR (υ, cm-1): 3332 (OH y NH), 1622 (CO) EMAR (ESI+): calculado para C30H53N2O8, 569,3731; encontrado, 569,3733. []D22: -28.8 (c 0.2, MeOH) Metodología 293 Pablo López Carracedo 294 5.4 Síntesis de amidas derivadas del oseltamivir 5.4.1 Procedimientos generales Procedimiento general A: Síntesis de los aldehídos precursores 151, 152, 153 y 154. En un matraz de fondo redondo se disuelve el aldehído correspondiente en DMSO, se añade K2CO3 (4.5 eq) y se desgasifica a 50 ºC. Se añade el ácido borónico correspondiente (1 eq) y se desgasifica de nuevo. Se añade Pd(PPh3)4 (0.01 eq) y se desgasifica de nuevo. Se deja reaccionando a 120 ºC hasta observar por ccf la desaparición del aldehído de partida. Se deja enfriar a t.a. y se diluye la mezcla de reacción con H2O, se extrae con AcOEt y se concentra la fase orgánica. El crudo obtenido se somete a cromatografía en columna para obtener el correspondiente aldehído. Procedimiento general B: Síntesis de derivados de oseltamivir vía reacción de Ugi. En un matraz de fondo redondo se disuelve fosfato de oseltamivir (34) (1 eq), ácido 2- (hidroximetil) benzoico (106) (0.9 eq), el correspondiente aldehído (1 eq) y el correspondiente isonitrilo (1 eq) en 5 mL de MeOH. La mezcla se agita a t.a. hasta la desaparición total del ácido 2-(hidroximetil) benzoico. Pasado este tiempo el disolvente se concentra a sequedad y el crudo obtenido se somete a cromatografía en columna para obtener el correspondiente éster. Procedimiento general C: Síntesis de derivados de oseltamivir vía reacción de Strecker. En un matraz de fondo redondo se disuelve fosfato de oseltamivir (34) (1 eq), el correspondiente aldehído (0.9 eq) y cianuro potásico (1 eq) en 5 mL de MeOH y se agita a t.a. hasta la desaparición total del aldehído. Pasado este tiempo se concentra el disolvente a vacío y el crudo obtenido se redisuelve en 10 mL de acetato de etilo y se lava con 10 mL de NaOH 1M y salmuera. La fase orgánica se concentra a vacío y el crudo obtenido se somete a cromatografía en columna para obtener el correspondiente éster. Procedimiento general D: Oxidación del grupo nitrilo. En un matraz de fondo redondo se disuelve el correspondiente nitrilo (1 eq) y K2CO3 (0.3 eq) en una mezcla 3:1 de DMSO y H2O2 y se deja reaccionando a t.a. Si se observa la aparición de un precipitado blanco se añade MeOH gota a gota hasta total disolución. Una vez se observa la desaparición del nitrilo de partida por ccf se añaden 5 mL de una disolución de Na2S2O3 gota a gota y se extrae con 10 mL de AcOEt tres veces, se seca la fase orgánica con sulfato sódico anhidro y se concentra a sequedad. El crudo obtenido se somete a cromatografía en columna para obtener la correspondiente amida. Procedimiento general E: Hidrólisis del grupo éster. En un matraz de fondo redondo se disuelve el correspondiente éster en 5 mL de una mezcla de THF/H2O (5:1), se añade LiOH (4 eq) y se deja reaccionando a t.a. hasta observar por ccf la desaparición total del éster de partida. Pasado este tiempo se añaden 5 mL de metanol y sílica y el disolvente se concentra a sequedad. El residuo obtenido se somete a cromatografía en columna para dar lugar a los correspondientes ácidos. Metodología 295 5.4.2 Síntesis del 4-(tiofen-2-il)benzaldehído (151) Se preparó siguiendo el procedimiento general A, usando el aldehído 179 (287 mg, 1.56 mmol), el ácido borónico 181 (200 mg, 1.56 mmol), K2CO3 (950 mg, 7 eq), Pd(PPh3)4 (20 mg, 0.015 mmol) y DMSO (5 mL). La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:5) permitió aislar el producto 151 (Rf: 0.4) como un sólido amarillento, con un rendimiento del 78%. Los datos espectroscópicos coinciden con los de la bibliografía.Error! Bookmark not defined. 5.4.3 Síntesis del 4-(tiofen-3-il)benzaldehído (152) Se preparó siguiendo el procedimiento general A, usando el aldehído 179 (287 mg, 1.56 mmol), el ácido borónico 182 (200 mg, 1.56 mmol), K2CO3 (950 mg, 7 eq), Pd(PPh3)4 (20 mg, 0.015 mmol) y DMSO (5 mL). La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:5) permitió aislar el producto 152 (Rf: 0.4) como un sólido amarillento, con un rendimiento del 80%. Los datos espectroscópicos coinciden con los de la bibliografía.125 Pablo López Carracedo 302 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 303 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 304 5.4.8 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-(terc-butilamino)-1- (dibenzo[b,d]tiophen-2-il)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1carboxilato de etilo (187) y del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-(terc-butilamino)- 1-(dibenzo[b,d]tiophen-2-il)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1carboxilato de etilo (188) Se preparó siguiendo el procedimiento general B, usando fosfato de oseltamivir (34) (100 mg, 0.25 mmol), el aldehído 150 (53 mg, 0.25 mmol), el isonitrilo 147 (20 mg, 0.25 mmol) y el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106) (33 mg, 0.23 mmol) en 1.5 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:1) permitió aislar los productos 187+188 (Rf: 0.4) como mezcla diastereoisomérica, con un rendimiento del 36%. Metodología 305 5.4.9 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-(terc-butilamino)-1- (dibenzo[b,d]tiophen-2-il)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1carboxílico (159) y del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-(terc-butilamino)-1- (dibenzo[b,d]tiophen-2-il)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1carboxílico (160) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 187+188 (40 mg, 0.06 mmol), LiOH (25 mg, 0.62 mmol) en 4 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 159 y 160 como productos puros, con rendimientos del 46% (D1) y 43% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.84 (td, J = 7.4, 4.8 Hz, 6H), 1.35 (s, 9H), 1.45 (s, 4H), 1.97 (s, 3H), 2.18 – 2.37 (m, 1H), 2.82 (dd, J = 15.5, 9.7 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 4.01 (s, 1H), 4.48 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.42 – 7.55 (m, 3H), 7.88 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.26 (t, J = 3.5 Hz, 2H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.91 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.37 (s, 8H), 1.46 – 1.60 (m, 4H), 2.02 (d, J = 5.5 Hz, 3H), 2.85 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 2.90 – 3.01 (m, 1H), 3.41 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.10 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 7.88 (dd, J = 8.6, 4.9 Hz, 2H), 8.25 (d, J = 8.9 Hz, 2H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 9.58, 9.82, 23.12, 26.71, 27.19, 28.85, 32.49, 48.15, 48.43, 48.72, 49.00, 49.28, 49.57, 49.85, 52.08, 55.65, 56.58, 66.42, 76.65, 83.33, 121.82, 122.79, 123.87, 124.09, 125.68, 127.01, 128.16, 131.33, 136.54, 137.06, 137.16, 137.70, 140.40, 141.12, 174.06. Pablo López Carracedo 306 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 307 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 308 5.4.10 Síntesis del (3R,4R,5S)-5-(((S)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-(bencilamino)-2oxoetil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (185) y del (3R,4R,5S)-5-(((S)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-(bencilamino)-2oxoetil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (186) Se prepararon siguiendo el procedimiento general B, usando fosfato de oseltamivir (34) (100 mg, 0.25 mmol), el aldehído 149 (44 mg, 0.25 mmol), el isonitrilo 148 (29 mg, 0.25 mmol) y el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106) (33 mg, 0.23 mmol) en 1.5 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:1) permitió aislar los productos 185+186 (Rf: 0.4) como mezcla diastereoisomérica, con un rendimiento del 46%. Metodología 309 5.4.11 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-5-(((S)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-(bencilamino)-2oxoetil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (157) y del ácido (3R,4R,5S)-5-(((R)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-(bencilamino)-2oxoetil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (158) Se preparó siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 185+186 (15 mg, 0.025 mmol), LiOH (10 mg, 0.25 mmol) en 1 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 157 y 158 como productos puros, con rendimientos del 41% (D1) y 38% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ 0.90 (q, J = 7.7 Hz, 8H), 1.52 (dd, J = 10.6, 5.3 Hz, 5H), 1.96 (s, 4H), 2.09 – 2.26 (m, 2H), 2.85 (td, J = 14.4, 5.4 Hz, 2H), 3.40 (p, J = 5.6 Hz, 1H), 3.67 – 3.76 (m, 3H), 3.93 (t, J = 9.4 Hz, 2H), 4.06 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 14.0 Hz, 2H), 6.72 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 7.16 – 7.39 (m, 7H), 7.39 – 7.53 (m, 5H), 7.54 – 7.65 (m, 5H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.86 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 1.46 (d, J = 9.3 Hz, 4H), 1.98 (s, 4H), 2.76 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 3.57 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.87 (t, J = 9.5 Hz, 2H), 4.01 (s, 1H), 4.39 (s, 2H), 4.48 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 7.22 (q, J = 7.3, 6.7 Hz, 5H), 7.35 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 13.6, 7.5 Hz, 4H), 7.61 (d, J = 7.7 Hz, 5H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (100 MHz, CD3OD): δ 9.63, 9.90, 23.10, 26.49, 26.75, 27.23, 32.06, 44.10, 48.36, 48.57, 48.79, 49.00, 49.21, 49.43, 49.64, 55.57, 56.43, 64.36, 68.86, 77.25, 83.37, 127.95, 128.22, 128.30, 128.49, 128.98, 129.60, 129.88, 137.00, 139.92, 142.26, 174.01, 174.85. Pablo López Carracedo 310 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 311 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 318 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 319 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 320 5.4.16 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-(bencilamino)-2-oxo-1-(4-(tiofen-3il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (193) y del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-(bencilamino)-2-oxo-1-(4-(tiofen-3-il)fenil) etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (194) Se prepararon siguiendo el procedimiento general B, usando fosfato de oseltamivir (34) (100 mg, 0.25 mmol), el aldehído 152 (46 mg, 0.25 mmol), el isonitrilo 148 (29 mg, 0.25 mmol) y el ácido 2-(hidroximetil)benzoico (106) (33 mg, 0.23 mmol) en 1.5 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:1) permitió aislar los productos 193+194 (Rf: 0.4) como mezcla diastereoisomérica, con un rendimiento del 38%. Metodología 321 5.4.17 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-(bencilamino)-2-oxo-1-(4- (tiofen-3-il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (165) y del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-(bencilamino)-2-oxo-1-(4-(tiofen-3il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (166) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 193+194 (33 mg, 0.053 mmol), LiOH (20 mg, 0.5 mmol) en 3 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 165 y 166 como productos puros, con rendimientos del 38% (D1) y 39% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.88 (q, J = 7.0 Hz, 7H), 1.48 (tdd, J = 10.1, 8.4, 7.6, 4.3 Hz, 5H), 1.97 (s, 4H), 2.14 – 2.32 (m, 1H), 2.71 – 2.86 (m, 2H), 3.37 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 3.82 – 3.94 (m, 1H), 4.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.32 – 4.51 (m, 3H), 6.75 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.23 (q, J = 7.3, 6.6 Hz, 5H), 7.38 – 7.52 (m, 4H), 7.58 – 7.71 (m, 3H). Compuesto D2 RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ 0.87 (dt, J = 8.9, 7.4 Hz, 7H), 1.40 – 1.55 (m, 5H), 1.93 (s, 4H), 2.08 – 2.23 (m, 1H), 2.73 – 2.90 (m, 2H), 3.36 (p, J = 5.6 Hz, 1H), 3.84 – 3.95 (m, 1H), 3.98 – 4.07 (m, 1H), 4.30 – 4.40 (m, 2H), 4.45 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.69 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 7.14 – 7.33 (m, 6H), 7.37 – 7.50 (m, 4H), 7.54 – 7.66 (m, 3H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (100 MHz, CD3OD): δ 9.63, 9.90, 23.10, 26.74, 27.22, 32.00, 44.08, 48.36, 48.57, 48.79, 49.00, 49.21, 49.43, 49.64, 55.57, 56.38, 64.35, 77.22, 83.38, 121.50, 127.08, 127.37, 127.52, 128.30, 128.47, 128.61, 128.99, 129.59, 137.00, 137.18, 139.52, 139.78, 142.97, 174.01, 174.78. Pablo López Carracedo 322 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 323 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 324 5.4.18 Síntesis del (3R,4R,5S)-5-(((S)-bifenil-4-il(ciano)metil)amino)-4-acetamido-3- (pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (221) y del (3R,4R,5S)-5-(((R)- bifenil-4-il(ciano)metil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1carboxilato de etilo (222) Se prepararon siguiendo el procedimiento general C, usando fosfato de oseltamivir (34) (300 mg, 0.72 mmol), el aldehído 149 (132 mg, 0.72 mmol) y KCN (48 mg, 0.72 mmol) en MeOH (6 mL). La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:2) permitió aislar los productos 221+222 (Rf: 0.3) como mezcla diastereoisomérica con un rendimiento del 71%. Metodología 325 5.4.19 Síntesis del (3R,4R,5S)-5-(((S)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-amino-2-oxoetil)amino)-4acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (209) y del (3R,4R,5S)-5-(((R)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-amino-2-oxoetil)amino)-4-acetamido3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (210) Se prepararon empleando el procedimiento general D, usando la mezcla de diasteroisómeros 221+222 (130 mg, 0.26 mmol), K2CO3 (12 mg, 0.08 mmol) y H2O2 (0.33 mL) en DMSO (1 mL). Fue necesario añadir 1 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH 96:4) permitió aislar los productos 209+210 (Rf: 0.5) como mezcla diastereoisómerica con un rendimiento del 41%. Pablo López Carracedo 326 5.4.20 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-5-(((S)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-amino-2oxoetil)amino)-4-acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (167) y del ácido (3R,4R,5S)-5-(((R)-1-([1,1'-bifenilo]-4-il)-2-amino-2-oxoetil)amino)-4acetamido-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (168) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 209+210 (48 mg, 0.1 mmol), LiOH (33 mg, 0.8 mmol) en 2 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 167 y 168 como productos puros, con rendimientos del 42% (D1) y 41% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.81 (dt, J = 15.1, 7.4 Hz, 7H), 1.41 (dq, J = 14.5, 7.4 Hz, 4H), 1.87 (s, 4H), 2.67 (ddd, J = 21.2, 13.3, 4.9 Hz, 2H), 3.34 (p, J = 6.6, 5.8 Hz, 3H), 3.66 (q, J = 9.2 Hz, 4H), 4.01 (dd, J = 14.5, 7.7 Hz, 2H), 4.33 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.35 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 5H), 7.62 (dd, J = 17.1, 7.8 Hz, 5H), 7.85 (d, J = 9.1 Hz, 1H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.89 (dtd, J = 12.5, 7.3, 4.1 Hz, 6H), 1.50 (dt, J = 14.5, 8.2 Hz, 5H), 1.94 (s, 3H), 1.99 (s, 2H), 2.80 (dd, J = 23.4, 9.4 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.81 – 3.97 (m, 3H), 3.97 – 4.14 (m, 3H), 4.44 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39 – 7.55 (m, 4H), 7.56 – 7.69 (m, 4H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (101 MHz, DMSO-d6): δ 8.99, 9.49, 14.09, 20.77, 23.03, 25.18, 25.74, 31.91, 34.72, 54.23, 55.04, 59.76, 62.11, 75.63, 80.64, 126.39, 126.62, 127.32, 127.67, 128.90, 138.97, 140.01, 140.33, 169.71, 174.14. Metodología 327 Compuesto D1 Compuesto D2 Pablo López Carracedo 334 5.4.24 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-ciano(4-(tiofen-2-il)fenil)metil)amino)- 3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (225) y del (3R,4R,5S)-4acetamido-5-(((R)-ciano(4-(tiofen-2-il)fenil)metil)amino)-3-(pentan-3iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (226) Se prepararon siguiendo el procedimiento general C, usando fosfato de oseltamivir (34) (218 mg, 0.53 mmol), el aldehído 151 (100 mg, 0.53 mmol) y KCN (35 mg, 0.53 mmol) en MeOH (5 mL). La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:2) permitió aislar los productos 225+226 (Rf: 0.3) como mezcla diastereoisomérica con un rendimiento del 74%. Metodología 335 5.4.25 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-2il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (213) y del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-2-il)fenil)etil) amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (214) Se preparó empleando el procedimiento general D, usando la mezcla de diasteroisómeros 225+226 (130 mg, 0.22 mmol), K2CO3 (13 mg, 0.07 mmol) y H2O2 (1 mL) en DMSO (3 mL). Fue necesario añadir 2 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH 96:4) permitió aislar los productos 213+214 (Rf: 0.5) como mezcla diastereoisómerica con un rendimiento del 43%. Pablo López Carracedo 336 5.4.26 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-2il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (171) y del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-2-il)fenil) etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (172) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 213+214 (35 mg, 0.066 mmol), LiOH (25 mg, 0.63 mmol) en 3 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 171 y 172 como productos puros, con rendimientos del 37% (D1) y 39% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ 0.90 (td, J = 7.4, 1.6 Hz, 7H), 1.47 – 1.60 (m, 5H), 2.02 (s, 3H), 2.19 (ddt, J = 17.6, 9.1, 2.8 Hz, 1H), 2.79 (dd, J = 17.5, 5.3 Hz, 1H), 2.90 (td, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 3.41 (p, J = 5.7 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 10.2, 8.0 Hz, 1H), 4.10 (dq, J = 7.3, 2.5 Hz, 1H), 4.41 (s, 1H), 6.74 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 5.1, 3.6 Hz, 1H), 7.32 – 7.37 (m, 2H), 7.41 – 7.46 (m, 2H), 7.57 – 7.63 (m, 2H), 7.88 (dd, J = 6.0, 3.3 Hz, 2H), 8.20 (dd, J = 6.0, 3.3 Hz, 2H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.87 (q, J = 6.8 Hz, 7H), 1.48 (p, J = 7.0 Hz, 5H), 1.98 (s, 3H), 2.21 (s, 1H), 2.78 (d, J = 13.8 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.40 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 7.08 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 7.33 – 7.50 (m, 4H), 7.63 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.4 Hz, 1H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (101 MHz, CD3OD): δ 9.60, 9.78, 23.12, 26.45, 26.85, 27.26, 32.09, 55.69, 56.50, 64.62, 68.83, 77.18, 83.37, 124.40, 125.93, 126.58, 126.98, 128.71, 129.06, 129.15, 131.82, 133.92, 135.59, 137.44, 140.35, 144.99, 157.67, 173.93, 177.70. Metodología 337 Compuesto D1 Compuesto D2 Pablo López Carracedo 338 Compuesto D1 y D2 Metodología 339 5.4.27 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-ciano(4-(tiofen-3-il)fenil)metil)amino)- 3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (227) y del (3R,4R,5S)-4acetamido-5-(((R)-ciano(4-(tiofen-3-il)fenil)metil)amino)-3-(pentan-3iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (228) Se prepararon siguiendo el procedimiento general C, usando fosfato de oseltamivir (34) (172 mg, 0.42 mmol), el aldehído 152 (78 mg, 0.42 mmol) y KCN (27 mg, 0.42 mmol) en MeOH (4 mL). La cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:2) permitió aislar los productos 227+228 (Rf: 0.3) como mezcla diastereoisomérica con un rendimiento del 65%. Pablo López Carracedo 340 5.4.28 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-3il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (215) y del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-3-il)fenil)etil) amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (216) Se prepararon empleando el procedimiento general D, usando la mezcla de diasteroisómeros 227+228 (150 mg, 0.29 mmol), K2CO3 (14 mg, 0.09 mmol) y H2O2 (1 mL) en DMSO (3 mL). Fue necesario añadir 2 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH 96:4) permitió aislar los productos 215+216 (Rf: 0.5) como mezcla diastereoisómerica con un rendimiento del 41%. Metodología 341 5.4.29 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-3il)fenil)etil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (173) y del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-amino-2-oxo-1-(4-(tiofen-3-il)fenil)etil)amino)- 3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (174) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 215+216 (25 mg, 0.047 mmol), LiOH (18 mg, 0.45 mmol) en 2 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 173 y 174 como productos puros, con rendimientos del 41% (D1) y 39% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.91 (qd, J = 6.7, 3.1 Hz, 7H), 1.51 (q, J = 7.0 Hz, 5H), 2.03 (dd, J = 7.7, 1.1 Hz, 4H), 2.17 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 2.85 (td, J = 16.7, 15.2, 7.3 Hz, 2H), 3.41 (p, J = 5.7 Hz, 2H), 3.92 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 4.09 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.42 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 7.46 (tdd, J = 5.2, 4.3, 3.6, 2.0 Hz, 4H), 7.59 – 7.70 (m, 3H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.86 (tt, J = 7.4, 4.4 Hz, 8H), 1.48 (h, J = 7.3 Hz, 5H), 2.01 (d, J = 17.2 Hz, 4H), 2.16 – 2.31 (m, 2H), 2.82 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 3.87 (t, J = 9.1 Hz, 2H), 4.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 7.45 (td, J = 8.1, 4.2 Hz, 4H), 7.57 – 7.68 (m, 3H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (101 MHz, CD3OD): δ 9.61, 9.79, 23.15, 26.44, 26.81, 27.27, 32.74, 35.45, 55.91, 56.74, 64.68, 68.83, 77.54, 83.23, 121.40, 127.10, 127.26, 127.52, 129.01, 134.53, 134.79, 136.96, 139.95, 143.09, 173.92, 177.95. Pablo López Carracedo 342 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 343 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 350 5.4.34 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-1-(2-metoxi-4-(tiofen-3il)fenil)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (219) y del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-1-(2-metoxi-4-(tiofen-3il)fenil)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (220) Se prepararon empleando el procedimiento general D, usando la mezcla de diasteroisómeros 231+232 (260 mg, 0.48 mmol), K2CO3 (21 mg, 0.15 mmol) y H2O2 (1.5 mL) en DMSO (4.5 mL). Fue necesario añadir 3 mL de MeOH. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH 4%) permitió aislar los productos 219+220 (Rf: 0.5) como mezcla diastereoisómerica con un rendimiento del 39%. Metodología 351 5.4.35 Síntesis del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((S)-2-amino-1-(2-metoxi-4-(tiofen-3il)fenil)-2-oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (177) y del ácido (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-(((R)-2-amino-1-(2-metoxi-4-(tiofen-3-il)fenil)-2oxoetil)amino)-3-(pentan-3-iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxílico (178) Se prepararon siguiendo el procedimiento general E, usando la mezcla de diasteroisómeros 219+220 (80 mg, 0.14 mmol), LiOH (55 mg, 1.38 mmol) en 6 mL de una mezcla THF/H2O 5:1. La cromatografía en columna (AcOEt/MeOH/H2O 10:1:0.5) permitió separar los dos diasteroisómeros 177 y 178 como productos puros, con rendimientos del 40% (D1) y 38% (D2). Compuesto D1 RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ 0.90 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.47 – 1.59 (m, 4H), 2.04 (s, 3H), 2.14 (ddt, J = 17.6, 9.1, 2.8 Hz, 1H), 2.71 (dd, J = 17.7, 5.3 Hz, 1H), 2.90 – 2.99 (m, 1H), 3.41 (p, J = 5.7 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 10.2, 7.9 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 4.07 – 4.14 (m, 1H), 4.62 (s, 1H), 6.70 – 6.77 (m, 1H), 7.21 – 7.26 (m, 2H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43 – 7.46 (m, 2H), 7.62 (dd, J = 2.6, 1.6 Hz, 1H). Compuesto D2 RMN-1H (300 MHz, CD3OD): δ 0.87 (dt, J = 14.8, 7.3 Hz, 7H), 1.48 (s, 5H), 1.95 (s, 3H), 2.17 (s, 2H), 2.68 (s, 1H), 2.91 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.59 (s, 1H), 3.82 – 4.03 (m, 5H), 4.49 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.26 (s, 3H), 7.47 (s, 2H), 7.65 (s, 1H). Compuesto D1 y D2 RMN-13C (100 MHz, CD3OD): δ 9.62, 9.77, 23.15, 26.88, 27.27, 31.92, 42.62, 56.20, 56.66, 56.84, 61.14, 77.03, 83.41, 110.50, 119.90, 127.25, 127.89, 130.54, 131.61, 137.50, 138.72, 143.27, 158.86, 170.50, 173.95, 177.73. Pablo López Carracedo 352 Compuesto D1 Compuesto D2 Metodología 353 Compuesto D1 y D2 Pablo López Carracedo 354 5.4.36 Síntesis del (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(pentan-3iloxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato de etilo (108) En un matraz de fondo redondo se disuelve 34 (1.0 g, 2.4 mmol) en 20 mL de CH2Cl2, se añade DIPEA (1.2 mL, 3 eq) y se deja agitando durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo se observa la total disolución del producto de partida, se añade Boc2O (570 mg, 2.64 mmol) y se deja agitando a t.a. Tras 12 h de reacción se observa la desaparición del producto de partida (AcOEt/Hex 1:1, Rf: 0.1) y la aparición de un nuevo producto de reacción (Rf: 0.7). Se lava con H2O, se seca la fase orgánica con Na2SO4 y se concentra a vacío. El crudo obtenido se purifica por cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:1) para obtener 108 como un sólido banco amorfo con un rendimiento del 93%. Los datos espectroscópicos coinciden con los de la bibliografía.139 Metodología 355 5.4.37 Síntesis del (1R,2R,3R,4R,5S)-4-acetamido-5-((terc-butoxicarbonil)-amino)-2- (nitrometil)-3-(pentan-3-yloxi)ciclohexano-1-carboxilato del etilo (109) y (1S,2R,3R,4R,5S)-4-acetamido-5-((terc-butoxicarbonil)-amino)-2-(nitrometil)-3- (pentan-3-yloxi)ciclohexano-1-carboxilato de etilo (110) En un matraz de fondo redondo purgado y bajo atmósfera inerte de argón se disuelve 108 (930 mg, 2.25 mmol) en 30 mL de THF. Se añade CH3NO2 (0.25 mL, 4.50 mmol) y TBAF (3.37 mL, 1,5 eq, 1M en THF) y se deja reaccionando a reflujo. Tras 12 h de reacción se observa la desaparición del producto de partida (AcOEt/Hex 1:2, Rf: 0.4) y la aparición de dos nuevos productos de reacción (Rf: 0.50 y 0.55). Se concentra el disolvente a vacío, se redisuelve el crudo en 20 mL de AcOEt y se lava con 15 mL HCl 1M, 15 mL de H2O y 15 mL de salmuera. Se seca la fase orgánica, se concentra a vacío y se purifica el crudo obtenido por cromatografía en columna (AcOEt/Hex 1:2) para obtener 109 como un sólido blanco amorfo con un rendimiento del 32%, y 110 como un sólido blanco amorfo con un rendimiento del 34%. Compuesto 109: RMN-1H (300 MHz, CDCl3): δ 0.84 (q, J = 7.2 Hz, 6H), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.41 (s, 10H), 1.58 (dd, J = 41.5, 6.0 Hz, 3H), 1.96 (s, 3H), 2.27 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.58 (s, 1H), 2.92 (s, 1H), 3.35 (s, 1H), 3.66 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 3.85 (dt, J = 31.9, 9.8 Hz, 2H), 4.13 – 4.24 (m, 2H), 4.48 – 4.62 (m, 1H), 4.74 – 4.91 (m, 2H), 5.86 (d, J = 9.7 Hz, 1H). RMN-13C (75 MHz, CDCl3): δ 9.36, 9.57, 14.24, 23.66, 25.03, 25.79, 28.48, 33.12, 39.55, 42.89, 49.66, 59.68, 61.45, 73.93, 75.73, 79.90, 83.16, 156.30, 170.88, 172.78. EMAR (ESI+): calculado para C22H40N3O8, 474.2771; encontrado, 474.2770. Compuesto 110 RMN-1H (300 MHz, CDCl3): δ 0.81 (t, J = 7.3 Hz, 6H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 1.46 (d, J = 10.5 Hz, 14H), 1.57 (d, J = 13.1 Hz, 4H), 1.85 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H), 2.23 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 2.51 – 2.66 (m, 1H), 3.45 – 3.55 (m, 2H), 3.59 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 10.2 Hz, 1H), 4.13 (q, J = 7.3 Hz, 3H), 4.49 – 4.61 (m, 1H), 4.76 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 9.9 Hz, 1H). RMN-13C (75 MHz CDCl3): δ 9.22, 9.27, 14.14, 23.61, 24.53, 25.67, 28.45, 34.69, 41.58, 43.65, 51.61, 59.35, 61.44, 73.13, 75.16, 80.01, 82.54, 156.40, 170.95, 172.50. EMAR (ESI+): calculado para C22H40N3O8, 474.2771; encontrado, 474.2770. Pablo López Carracedo 356 Compuesto 109 Metodología 357 Compuesto 110 Pablo López Carracedo 358 5.4.38 Síntesis del ((3aR,5S,6R,7R,7aR)-6-acetamido-3-oxo-7-(pentan-3-iloxi)octahidro1H-isoindol-5-il)carbamato de terc-butilo (233) En un matraz de fondo redondo se disuelve 109 (180 mg, 0.38 mmol) en 15 mL de MeOH, se desoxigena bajo argón y se añade Ni-Raney (1.8 mL). Se desoxigena nuevamente y se deja reaccionando bajo atmósfera de H2. Tras 24 h de reacción se observa la desaparición del producto de partida (AcOEt/Hex 1:1, Rf: 0.5) y la aparición de un nuevo producto de reacción (Rf: 0.1). Se filtra sobre celita, se lava con MeOH y se concentra el filtrado a sequedad. El crudo obtenido se purifica por cromatografía en columna eluyendo con una mezcla de CH2Cl2/MeOH (95:5) para obtener 233 como un sólido blanco amorfo con un rendimiento del 60%. RMN-1H (300 MHz, CDCl3): δ 0.83 (q, J = 7.1 Hz, 7H), 1.25 – 1.51 (m, 18H), 1.75 (s, 1H), 1.96 (s, 4H), 1.97 – 2.12 (m, 2H), 2.32 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 3.10 – 3.36 (m, 4H), 3.43 – 3.65 (m, 4H), 3.83 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 6.00 (d, J = 9.7 Hz, 1H). RMN-13C (75 MHz, CD3OD): δ 9.46, 9.57, 23.24, 26.43, 26.73, 28.77, 31.51, 43.45, 45.80, 50.08, 54.43, 60.36, 79.06, 79.99, 82.95, 157.88, 173.40, 179.17. EMAR (ESI+): calculado para C20H36N3O5, 398.2610; encontrado, 398.2611. Metodología 359 367 6 Bibliografía: Bibliografía 369 1 Fletcher, John H. (1974). "Chapter 21: Amides and Imides". Nomenclature of Organic Compounds: Principles and Practice. Vol. 126. Washington, DC: American Chemical Society. pp. 166–173. doi:10.1021/ba-1974-0126.ch021 2 Kemnitz, Carl R.; Loewen, Mark J. (2007). ""Amide Resonance" Correlates with a Breadth of C−N Rotation Barriers". Journal of the American Chemical Society. 129 (9): 2521–8. doi:10.1021/ja0663024. 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Pablo López Carracedo 382 Anexos 383 Pablo López Carracedo 384 Anexos 385 Pablo López Carracedo 386 Anexos 387 Permiso de reproducción de la Figura 11, Referencia 27 Pablo López Carracedo 388 Anexos 389 Pablo López Carracedo 390 Anexos 391 Pablo López Carracedo 398 Anexos 399 Pablo López Carracedo 400 Anexos 401 Permiso de reproducción de la Figura 33 y Figura 34, Referencia 83 La presente tesis doctoral aborda la síntesis de amidas polihidroxiladas, utilizando materiales de partida asequibles y métodos sencillos, así como el estudio de sus propiedades. Concretamente, partiendo de hexosas y del ácido (-)-shikímico para estudiar sus propiedades como inhibidores de la recristalización del hielo y como agentes geli昀椀cantes, y partiendo de oseltamivir para estudiar sus propiedades como inhibidores de neuraminidasas.