Regulación y modulación de la osteoblastogénesis

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Ana Alonso Pérez Tesis doctoral Regulación y modulación de la osteoblastogénesis Santiago de Compostela, 2022 Programa de doctorado en Medicina Molecular TESIS DE DOCTORADO REGULACIÓN Y MODULACIÓN DE LA OSTEOBLASTOGÉNESIS Ana Alonso Pérez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Ana Alonso Pérez Título da tese: Regulación y modulación de la osteoblastogénesis Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compsotela, 18 de mayo de 2022. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D./Dña. Rodolfo Gómez Vaamonde En condición de: Tutor/a y director/a Título de la tesis: Regulación y modulación de la osteoblastogénesis INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dña Ana Alonso Pérez, bajo mi dirección/tutorización, y autorizo su presentación, considerando que reúne l os requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 18 de mayo de 2022 Firma electrónica DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES Y FINANCIACIÓN La autora Ana Alonso Pérez declara no tener ningún conflicto de interés en la realización de esta tesis doctoral. El trabajo de esta tesis doctoral ha recibido financiación del Instituto de Salud Carlos III confinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) (CP15/00007, PI16/01870, PI19/01446), la Fundación Mutua Madrileña (MMA2018-2), y la Fundación IDIS (Axudas predoutorais 2019). Así consta en Santiago de Compostela, a 03 de junio de 2022. que isto é un traballo colectivo e ten por seguro que sen a túa axuda hoxe non sería posible. Cando empecei a tese non tiña moi claro que era o que iba ser, implicar ou supoñer na miña vida. Unha vez pasado este trámite, podo concluir que tiven a enorme sorte de atopar neste proceso a miña vocación, de poder desfrutar do proceso, e sobre todo, da compañía durante este tempo. Moitísimas gracias! En Foz, o 03 de xuño de 2022. RESUMEN/ABSTRACT RESUMEN Las patologías musculoesqueléticas son un denominador común en las sociedades actuales. Su incremento en los países desarrollados implica una gran carga social, sanitaria y económica. Las alteraciones óseas están presentes en múltiples patologías musculoesqueléticas, siendo frecuente una disminución de la calidad ósea y una reducción indirecta de la esperanza de vida Los osteoblastos son las células a cargo de la formación de hueso. Estas células comparten un origen mesenquimal con los adipocitos. Esto significa que una formación óptima de hueso depende del correcto balance entre la diferenciación de células madre mesenquimales a osteoblasto y adipocito. No obstante, los protocolos actuales para diferenciar células madre mesenquimales humanas son caros y no reproducibles. La escasez y variabilidad intrínseca de este tipo celular dificulta el establecimiento de un método económico y fiable para estudiar el equilibrio osteoblasto-adipocito. La ruptura del balance osteoblastogénesis-adipogénesis es frecuente en múltiples enfermedades reumáticas. En este contexto, existen numerosas vías de señalización (WNT, BMPs) que trabajan en red para recibir la información y estímulos del ambiente de las células mesenquimales. Seguidamente, esta información se integra a través de factores de transcripción (FTx) que controlan los procesos osteoblastogénico y adipogénico. Su actividad está regulada epigenéticamente, siendo la metilación del ADN el mecanismo más común para ejercer estos efectos moduladores. Consecuentemente, los FTx adquieren un papel principal en la regulación de la osteoblastogénesis y la adipogénesis, convirtiéndose así en potenciales dianas terapéuticas o marcadores de enfermedad. Una de las enfermedades que se podría abordar a través de la modulación de los FTx es la osificación heterotópica (OH). Esta patología consiste en el crecimiento anormal del hueso en tejidos blandos, en un ambiente no-proosteoblastogénico. Las terapias disponibles actualmente son agresivas, se asocian a numerosos efectos adversos, y no son adecuadas para todas las poblaciones. Por ello, se necesitan nuevas herramientas terapéuticas. Los objetivos de esta tesis doctoral son los siguientes: - Determinar los medios de diferenciación consenso, mejorarlos y compararlos con los comerciales. Identificar también una línea celular que permita evaluar simultáneamente la osteoblastogénesis y la adipogénesis. - Estudiar los FTx más relevantes asociados a cambios de metilación durante la osteoblastogénesis en un contexto de diferenciación osteoblástica y adipocítica. - Estudiar la expresión y/o actividad de los FTx relacionados con la osteoblastogénesis o adipogénesis en alteraciones óseas presentes en las patologías musculoesqueléticas con más prevalencia. - Identificar potenciales tratamientos para la OH a través de la modulación de los FTx. La determinación de los medios se realizó en células madre mesenquimales (MSCs) humanas primarias, células tipo osteoblasto humanas primarias, y las líneas de MSCs C3H10T1/2, y hMSC-TERT. Estas células se diferenciaron a osteoblasto y adipocito, siendo estos procesos evaluados mediante la expresión de genes marcadores de osteoblasto y adipocito (RT-PCR), rojo de aceite O y rojo de alizarina. La expresión de los FTx se midió en muestras de tejido óseo y graso maduros, y se correlacionó consigo misma y con la expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis y adipogénesis. Seguidamente se silenció una selección de FTx potencialmente implicados en la osteoblastogénesis (nodo) en los procesos del equilibrio osteoblasto-adipocito. También se midió la expresión de este nodo de FTx en situaciones fisiopatológicas como el sexo, la edad, o la obesidad. El siguiente paso fue la identificación de una triterapia para la OH. Los efectos de la triterapia en el equilibrio osteoblasto-adipocito se midieron en C3H10T1/2, SaOS2 y células tipo preosteoblasto primarias humanas midiendo la expresión de los genes marcadores de estos destinos celulares mediante RT-PCR. Interesantemente, fuimos capaces de biovalidar el efecto de esta triterapia en células de OH adquirida y células de un caso raro de OH congénita, realizando los mismos análisis previamente hechos. La triterapia además se administró sistémicamente a un paciente de OH congénita tras exéresis de una placa de OH para prevenir recidivas. La línea celular C3H10T1/2 se evidenció como el modelo celular más adecuado para estudiar el equilibrio osteoblastogénico-adipogénico, combinado con el medio adipogénico consenso suplementado con IGF1 para inducir adipogénesis, y con el medio consenso para inducir osteoblastogénesis. El estado de metilación de los FTx correlacionó con su expresión en hueso, pero no en grasa infrapatelar, y, dentro de aquellos cuyos lugares de unión se encontraban hipermetilados, NRF1, SAP30, SETDB1, SP4, SUZ12 y ZEB1 se identificaron como un nodo de FTx potencialmente reguladores del equilibrio osteoblasto-adipocito. Cuando este nodo se silenció de forma conjunta, la expresión de genes marcadores de adipogénesis disminuyó en un proceso adipogénico. Es más, la relación entre su expresión y la edad se evidenció significativamente ligada al sexo, y su expresión también se relacionó significativamente con un aumento del índice de masa corporal al compararlo con el resto de FTx. Se demostró que una asociación de dexametasona, indometacina y tiazolidinedionas aumentaba de forma sinérgica y significativa la expresión de los genes marcadores de adipogénesis en C3H10T1/2 y células tipo preosteoblasto primarias humanas. También disminuyó la expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis en SaOS2 y células tipo preosteoblasto primarias humanas, y aumentó en estas últimas la expresión de los FTx del nodo. Adicionalmente, en células de OH adquirida y congénita se obtuvieron unos resultados similares. Al administrar la triterapia a un paciente con OH congénita de forma sistémica, se rompió el equilibrio del remodelado óseo empujándolo hacia la resorción. Afrontando la ausencia de un protocolo optimizado para estudiar el balance osteoblastogénesis-adipogénesis desde un origen mesenquimal común, se estableció un modelo in vitro con C3H10T1/2. Este modelo permitió identificar el mecanismo a través del cual un nodo de FTx está implicado en el balance osteoblasto-adipocito. Este nodo también se relacionó con el envejecimiento y la obesidad, situaciones fisiopatológicas relacionadas con la adiposidad ósea. La modulación de la expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis y adipogénesis, así como la expresión del nodo, permitieron identificar una triterapia para prevenir y tratar el crecimiento anormal del hueso. Esta triterapia se biovalidó in vitro y en un caso clínico con resultados prometedores. ABSTRACT Musculoskeletal pathologies are a common denominator in current societies. Their increase along developed countries involves a huge social, sanitary, and economic burden. Bone alterations are present in several of these pathologies, being common lower bone quality, and an indirect reduction of the life expectancy. Osteoblasts are the cells that perform bone formation. These cells share a mesenchymal origin with adipocytes. This means that an optimal bone formation depends on a right balance between the mesenchymal stem cells differentiation to osteoblast and adipocytes. However, current human mesenchymal stem cells (hMSCs) in vitro differentiation protocols are expensive and hardly reproducible. These cells scarcity and intrinsic variability difficult the development of affordable and reliable method to study osteoblast-adipocyte equilibrium. Osteoblastogenesis-adipogenesis balance rupture is relevant in multiple rheumatic diseases. In this context several signalling pathways (WNT, BMP) web work to sum up the information from the environment and stimuli of mesenchymal cells. Then, they integrate it through transcription factors (TFx) that control the adipogenic or osteoblastogenic process. Their activity is regulated through epigenetics, being DNA methylation the most common mechanism to these modulatory effects. Consequently, TFx acquire a main role in the regulation of osteoblastogenesis and adipogenesis, becoming potential therapeutic targets, or illness markers. One of the diseases that can be approached through TFx modulation is heterotopic ossification (HO). This pathology consists of abnormal bone growth in soft tissues, in a non-proosteoblastogenic environment. The currently available therapies are aggressive, associated to multiple adverse effects, and not suitable for every population. Therefore, new therapeutic tools are needed. This thesis objectives are the following: - To determine consensus differentiation media, to improve and compare them with commercial ones, also to identify a cell line to evaluate simultaneously osteoblastogenesis and adipogenesis. - The study of the most relevant TFx, related to methylation changes in the DNA along the osteoblastogenesis. All of these, in the context of the osteoblastogenic or adipogenic differentiation. - To study the expression and/or activity of the TFx related to osteoblastogenesis or adipogenesis, in bone alterations due to the musculoskeletal pathologies with higher prevalence. - Identify potential treatments for HO through TFx modulation. Media determination was made in primary mesenchymal stem cells (MSCs), primary osteoblast-like cells, and MSCs lines C3H10T1/2, and hMSC-TERT. They were differentiated to osteoblast and adipocyte, being these processes assessed by osteoblastic and adipocytic marker genes expression (RT-PCR) and Oil Red O and Alizarin Red staining. TFx expression was measured in tissue (bone and hoffa) samples, and corelated with themselves, osteoblastogenic and adopogenic marker genes expression. Following a selection of potentially osteoblastogenesis-implicated TFx, the effect of their silencing on osteoblastadipocyte balance was determined in the differentiation model previously stablished. The next step was to evaluate TFx effects in pathological tissue samples. Tritherapy effects on osteoblast-adipocyte balance were assessed in C3H10T1/2, SaOS2, and pre-osteoblast-like cells by measuring with RT-PCR the expression of osteoblastogenic and adipogenic marker genes. Interestingly, we were able to biovalidate this tritherapy effect in cells from acquired HO and a rare case of congenital HO, performing the same analysis made previously. Tritherapy was administered systemically to a patient of congenital HO after HO bone surgical removal to prevent recurrences. C3H10T1/2 arose as the most adequate cell model to study osteoblastogenic-adipogenic balance, combined with consensus adipogenic medium supplemented with IGF1 to induce adipogenesis, and with consensus medium to promote osteoblastogenesis. Regarding TFx, methylation correlated with TFx expression in bone but not in hoffa, and between the TFx whose binding sites were hypermethylated, NRF1, SAP30, SETDB1, SP4, SUZ12, and ZEB1 were identified as a node of genes that can potentially be regulators of osteoblastadipocyte differentiation equilibrium. When these TFx were silenced simultaneously adipogenesis marker genes expression diminished in an adipogenic differentiation. Moreover, their expression trough age was significantly sex-related, as well as their expression with IMC, when compared to the rest of TFx. An association of dexamethasone, indomethacin and tiazolidinediones was proven to synergistically augment adipogenic marker genes expression in C3H10T1/2 and preosteoblastic-like cells, decrease osteoblastic marker genes expression in SaOS2 and preosteoblastic-like cells, and augment the expression of node of TFx expression. Moreover, in HO primary osteoblastic cells the results were almost replicated. When administered this tritherapy to a patient of congenital HO, tritherapy altered the relation between remodelling markers serum concentrations, balancing the equilibrium towards bone resorption. Facing the absence of an optimised protocol to study osteoblastogenesis-adipogenesis balance from a mesenchymal common origin, it was stablished an in vitro model with C3H10T1/2. This model allowed us to identify the mechanism by which a node of TFx is implied in osteoblast-adipocyte balance control. This node was also related with ageing, obesity and these physiopathological situations related-bone adiposity. Osteoblastogenesis and adipogenesis marker genes expression modulation, as well as node expression, allowed to identify a tritherapy to prevent and treat abnormal bone growth. This tritherapy was biovalidated in vitro and in a clinical case with promising results. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 5 Fisiología del hueso .....................................................................................................7 1. Definición del hueso ............................................................................................ 7 2. Origen embrionario del hueso ..............................................................................7 3. Hueso laminar ......................................................................................................9 3.1 Periostio y endostio ...................................................................................... 10 4. Osificación ......................................................................................................... 10 4.1. Osificación intramembranosa ...................................................................... 10 4.2. Osificación endocondral .............................................................................. 11 4.3. Crecimiento radial del hueso ........................................................................ 11 5. Componentes óseos ........................................................................................... 11 5.1. Matriz ósea .................................................................................................. 11 5.2. Componente celular .................................................................................... 12 6. Metabolismo óseo .............................................................................................. 16 6.1. Remodelado y modelado óseos .................................................................... 16 6.2. El hueso como órgano endocrino ................................................................ 19 6.3. Metabolismo del calcio y el fosfato .............................................................. 21 Patología del hueso .................................................................................................... 23 1. La inflamación y el hueso ................................................................................... 23 1.1. Inflamación crónica ..................................................................................... 23 1.2. Inflamación aguda ....................................................................................... 26 1.3. Fármacos antiinflamatorios .......................................................................... 28 2. Ruptura de los equilibrios del hueso ................................................................... 29 2.1. Alteraciones del equilibrio osteoblástico-adipocítico .................................... 29 2.2. Alteraciones del remodelado óseo ............................................................... 31 2.3. Crecimiento anormal del hueso ................................................................... 34 Regulación de la osteoblastogénesis a través de factores de transcripción ................... 38 1. Factores de transcripción ................................................................................... 38 OBJETIVOS ............................................................................................................. 41 MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 45 1. Cultivos celulares ............................................................................................... 47 1.1. Línea celular C3H10T1/2 ............................................................................ 47 1.2. Línea celular hMSC-TERT .......................................................................... 47 1.3. Línea celular SaOS2 ..................................................................................... 48 1.4. Línea celular ATDC5 .................................................................................. 48 1.5. Células madre mesenquimales de médula ósea humanas .............................. 49 1.6. Aislamiento y cultivo primario de osteoblastos ............................................ 49 2. Diferenciación celular ........................................................................................ 51 3. Tratamientos ...................................................................................................... 52 4. Silenciamiento de genes ...................................................................................... 53 5. Técnicas colorimétricas ...................................................................................... 53 5.1. Rojo de alizarina .......................................................................................... 53 5.2. Rojo de aceite O .......................................................................................... 54 6. Extracción de ARN ........................................................................................... 54 7. RT-PCR ............................................................................................................. 55 7.1. RT ............................................................................................................... 55 7.2. PCR ............................................................................................................ 56 8. Análisis estadístico ............................................................................................. 60 9. Revisión de literatura .......................................................................................... 61 10. Lista de reactivos .............................................................................................. 62 RESULTADOS ......................................................................................................... 65 Establecimiento de un protocolo estandarizado para el estudio del balance osteoblastoadipocito ........................................................................................................................... 67 1. Medios de diferenciación consenso .................................................................... 67 1.1. Medio de diferenciación adipogénico ........................................................... 67 1.2. Medio de diferenciación osteoblastogénico .................................................. 71 2. Evaluación de los medios de diferenciación en células mesenquimales ............... 72 2.1. Comparación con medios comerciales en células mesenquimales primarias 72 2.2. Evaluación de la predisposición de células primarias tipo-osteoblasto de pacientes envejecidos a diferenciarse a osteoblasto y adipocito .................................. 75 2.3. Líneas de MSCs ........................................................................................... 78 Identificación de factores de transcripción implicados en la osteoblastogénesis en un contexto articular y patológico .......................................................................................... 84 1. Identificación de factores de transcripción implicados en la diferenciación osteoblástica ................................................................................................................. 84 2. Factores de transcripción moduladores de la osteoblastogénesis en tejido óseo y graso articular sano y patológico .................................................................................... 87 2.1. Expresión de los factores de transcripción en hueso articular y grasa infrapatelar ................................................................................................................ 87 2.2. Correlación entre la expresión de los factores de transcripción y los marcadores de destino celular ...................................................................................................... 91 2.3. Selección de los factores de transcripción objeto de estudio ........................ 93 3. Expresión de los factores de transcripción durante la osteoblastogénesis y la adipogénesis.................................................................................................................. 94 4. Silenciamiento del nodo ..................................................................................... 96 4.1. Silenciamiento de NRF1 .............................................................................. 96 4.2. Silenciamiento de SAP30 ............................................................................. 99 4.3. Silenciamiento de SETDB1 ....................................................................... 102 4 .4. Silenciamiento de SP4 .............................................................................. 105 4.5. Silenciamiento de SUZ12 .......................................................................... 108 4.6. Silenciamiento de ZEB1 ............................................................................ 111 4.7. Silenciamiento conjunto del nodo.............................................................. 114 5. Estudio del nodo en un contexto fisiológico y patológico ................................. 119 5.1. NRF1 ........................................................................................................ 120 5.2. SAP30 ....................................................................................................... 122 5.3. SETDB1 ................................................................................................... 125 5.4. SP4 ............................................................................................................ 127 5.5. SUZ12 ...................................................................................................... 130 5.6. ZEB1 ........................................................................................................ 132 5.7. Nodo ........................................................................................................ 135 Nueva terapia moduladora del metabolismo óseo para el crecimiento anormal de hueso ......................................................................................................................................................... 137 1. Modulación del crecimiento celular de osteoblastos primarios .......................... 137 2. Las tiazolidinedionas inhiben la vía WNT de señalización ................................ 139 3. Modulación del balance osteoblasto-adipocito en líneas celulares ..................... 141 3.1. Modulación del equilibrio en MSCs (C3H10T1/2)..................................... 141 3.2. Modulación de la osteoblastogénesis en células preosteoblásticas (SaOS2) 146 A NA A LONSO P ÉREZ 3. H UESO LAMINAR El hueso maduro o hueso laminar, al contrario de lo que sucede en el reticular, es un tejido altamente organizado, donde las fibrillas de colágeno se encuentran empaquetadas. Este hueso sustituye al hueso reticular durante el crecimiento y las fases tardías de curación de fracturas. Dentro del hueso maduro se diferencian dos tipos de hueso: □ Hueso cortical: representa el 80% del peso del hueso y se caracteriza por una baja porosidad y una alta resistencia a las fuerzas compresivas o de torsión. Las osteonas son la unidad estructural de este tipo de hueso, y forman cilindros longitudinales en las diáfisis, paralelos al eje largo del hueso (Figura 2.). □ Hueso esponjoso: representa el 20% del hueso y posee una porosidad del 50-90%. Se caracteriza por una alta actividad metabólica y una elevada tasa de remodelado. Ante fuerzas mecánicas es capaz de responder permitiendo la absorción de las cargas y la deformación del hueso. En el hueso trabecular las láminas se distribuyen en paquetes de hojas semicirculares. En este tejido hay más células, más vascularización, más actividad metabólica y, en lugar de los canales Haversianos, existen sinusoides que conectan las estructuras óseas con la médula. 9 Figura 2. Estructura de una osteona Introducción 3.1 Periostio y endostio Como ya se ha descrito, el hueso laminar está formado por hueso compacto y hueso trabecular. El hueso compacto se sitúa en el exterior protegiendo así al trabecular y a la médula ósea. En la zona externa del hueso compacto se encuentra el periostio, que recubre la superficie externa. Este tejido está formado por dos finas capas, siendo la externa prácticamente acelular. Esta capa recubre el hueso y la cápsula articular sirviendo así de nexo entre los diferentes huesos. Aquí se insertan los tendones y ligamentos. En la segunda capa más interna se encuentra el cambium, donde se encuentran las células osteoprogenitoras y el plexo vascular periosteal. En el hueso adulto el cambium propiamente dicho, así como su capacidad osteoprogenitora, son prácticamente indetectables. En el periostio existen células capaces de resorber y formar hueso, necesarias para la formación y estabilidad del callo óseo cuando tiene lugar una fractura. El periostio se comunica con la superficie del hueso través de las fibras de Sharpey, formadas por colágeno I (Col I). El endostio está conectado con el periostio a través de los canales de Volkman. Este tejido cubre las superficies internas y los canales de Volkman. En el endostio se encuentran células osteoprogenitoras y vasculares. 4. O SIFICACIÓN El paso de hueso reticular a hueso laminar se realiza a través del proceso de osificación, el cuál es diferente en huesos planos y en huesos largos. Los huesos planos son el cráneo, las costillas y los omóplatos, siendo el resto huesos largos. 4.1. Osificación intramembranosa Es la osificación que tiene lugar en los huesos planos. Es una osificación espontánea a partir de un centro de osificación en la matriz extracelular que acaba por dar lugar al hueso. También ocurre en fases tempranas de curado de fracturas o en casos de osteogénesis por distracción. 10 A NA A LONSO P ÉREZ 4.2. Osificación endocondral Esta osificación tiene lugar en la metáfisis de los huesos largos, en la placa de crecimiento, y en general en el curado natural de las fracturas óseas (5). La osificación endocondral se genera a partir de un tejido cartilaginoso previamente establecido. En ella se distinguen varios pasos: - Fase proliferativa: existe una proliferación de condrocitos en el cartílago hialino. - Fase hipertrófica: aumenta la expresión de fosfatasa alcalina (ALPL). - Fase apoptótica: en la zona calcificada se produce la apoptosis de los condrocitos y aumenta la expresión de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, por sus siglas en inglés). - Migración de los osteoprogenitores y formación de hueso por parte de los osteoblastos. 4.3. Crecimiento radial del hueso Es el crecimiento del hueso sobre su eje transversal, a nivel del periostio. Suele ir acompañado de resorción en el endostio y lo llevan a cabo los osteoprogenitores presentes en el cambium . 5. C OMPONENTES ÓSEOS 5.1. Matriz ósea La matriz ósea supone la mayor parte del tejido óseo. Está compuesta por un elemento orgánico (osteoide) y por un elemento inorgánico. Dentro del componente orgánico responsable de la forma del hueso y de su resistencia a fuerzas de tensión, el 90% es Col I (6), siendo el 10% restante otros colágenos (III o V), proteoglicanos, glucoproteínas y otros factores. Dentro de estos factores se encuentran las proteínas morfogénicas del hueso (BMPs, por sus siglas en inglés), el factor de crecimiento transformante-β (TFGβ, por sus siglas en inglés), las interleucinas 1 y 6 (IL1 e IL6), la osteocalcina (BGLAP), la osteoactivina (GPNMB) y la osteopontina (SPP1) (1,7). 11 Introducción Dentro del componente inorgánico de la matriz los elementos más presentes son Ca (99%) (1) y P (en la forma PO4) (85%) (1) que forman una estructura cristalina semejante a la hidroxiapatita, [Ca10(PO4)66(OH)2] (7). Esta estructura confiere fortaleza y resistencia al hueso, así como rigidez y resistencia a fuerzas de compresión. Otros elementos del componente inorgánico son el Mg y el Na, que representan entre un 40 y un 60% del total (1). La matriz madura durante el crecimiento del hueso. Este proceso se relaciona con un aumento de algunos de los factores de crecimiento citados previamente (ALPL, BGLAP, SPP1) que regulan la formación y disposición de los cristales de hidroxiapatita. Esta formación tiene lugar en el interior de vesículas extracelulares producidas por condrocitos y osteoblastos, donde se generan altas concentraciones de Ca y PO4 que permiten su cristalización (8). 5.2. Componente celular Existen cuatro tipos celulares propiamente óseos. Los osteoblastos, los osteoclastos, los osteocitos, y células de revestimiento óseo. El tipo celular más común, que representa el 95% de la celularidad del hueso, son los osteocitos. No obstante, los osteoblastos y los osteoclastos tienen más implicación en el metabolismo óseo. 5.2.1. Osteoblastos Los osteoblastos son las células formadoras de hueso, controlan la osteoclastogénesis y su función, así como la formación de matriz mineral ósea (9), siendo las células más metabólicamente activas del hueso. Los osteoblastos son células planas, cuboides al activarse, y mononucleares que, en estadios tardíos de maduración, se alinean sobre las superficies del hueso. Derivan de MSCs de la médula ósea, aunque también pueden proceder de los osteoprogenitores del endostio o los canales óseos. Estas células reciben señales para migrar, proliferar, y diferenciarse a osteoblastos. Interesantemente, estas señales pueden proceder de los propios osteocitos. Una de las vías de señalización implicadas en este proceso es la vía WNT/β-catenina (Wingless/INT) (10) que puede estimular o inhibir diferentes pasos de la diferenciación osteoblástica (11,12). 12 A NA A LONSO P ÉREZ 5.2.1.1. Equilibrio osteoblástico-adipocítico La mayoría de los osteoblastos presentes en el hueso derivan de la diferenciación de MSCs a este destino celular. Estas células no solo se pueden diferenciar a osteoblasto, sino que también lo pueden hacer a adipocito, condrocito, miocito u otros tipos celulares. Interesantemente, la diferenciación osteoblástica y la adipocítica son procesos opuestos e íntimamente relacionados. Esto implica que la formación de hueso depende del correcto equilibrio entre la osteoblastogénesis y la adipogénesis de MSCs. Consecuentemente, un aumento de la adiposidad ósea se ha relacionado con la pérdida ósea descrita en numerosas situaciones fisiopatológicas como la osteoporosis, la osteopenia, la obesidad o el envejecimiento (13–16). Actualmente se sabe que la adipogénesis y la osteoblastogénesis son procesos competitivos y mutuamente controlados (17). Por ello, la mayoría de factores proadipogénicos actúan como inhibidores de la osteoblastogénesis y viceversa (18). La diferenciación de MSCs a osteoblasto y adipocito se ve controlada por numerosos factores y vías de señalización. Estas vías pueden afectar a uno u otro destino celular, a ambos, o a la pérdida de mesenquimalidad necesaria para el éxito de los procesos de diferenciación. - Vía BMPs: BMP4 promueve la adipogénesis de las MSCs (19) de forma individual. BMP2 es un factor anabólico del hueso que, en determinadas situaciones, induce adipogénesis asociado a agonistas del receptor γ activante de la proliferación de peroxisomas (PPARG) (20). Se ha visto que esta última en función de su concentración puede promover ambas diferenciaciones en células de ratón (21). De hecho, esta vía puede regular factores de transcripción proosteoblásticos (factor de transcripción relacionado con RUNT tipo 2 (RUNX2)) y proadipogénicos (PPARG) (22,23). - Vía WNT: está ampliamente demostrada su capacidad promotora de la osteoblastogénesis (3,24) e inhibidora de la adipogénesis (24,25). Se ha relacionado una reducción de su agonista Wnt10b con el aumento de la edad, que podría explicar el aumento de adipogénesis asociada (26). También se ha visto en los preadipocitos 3T3-L1 que existe una regulación recíproca entre la vía WNT y PPARG a la hora de controlar la adipogénesis (27). Adicionalmente, 13 Introducción se ha descrito que la activación de la vía WNT también inhibe la osteoclastogénesis alterando el ratio entre el ligando del factor nuclear κβ y la osteoprotegerina (RANKL/OPG) (24) - Vía Notch: su expresión se ve bloqueada por PPARG (28), siendo esencial para la correcta adipogénesis. Su efecto sobre la osteoblastogénesis no es consistente por lo que se debe investigar más a fondo. Se ha descrito un papel inhibidor de este proceso a través de la inhibición de la vía WNT, así como un papel promotor de la osteoclastogénesis (29). No obstante, también se ha estudiado su potencial inducción de la osteoblastogénesis a través de las BMPs (30). - Hedgehogs: aumentan durante la diferenciación osteoblastogénica (31) y disminuyen durante la adipogénica (32). Se ha descrito recientemente su implicación en la consolidación de fracturas a través de osificación endocondral (33). No solo vías de señalización pueden afectar a la regulación de la diferenciación de MSCs. Los propios procesos se pueden regular entre ellos. La expresión de SPP1 por parte de los propios osteoblastos aumenta la osteoblastogénesis e inhibe la adipogénesis y su expresión se ha relacionado inversamente con la adiposidad in vivo (34). La matriz extracelular también afecta a este proceso. Sus alteraciones pueden controlar los cambios celulares necesarios para ambos procesos de diferenciación (35). 5.2.2. Osteocitos Los osteocitos representan el 95% de las células del hueso y se encuentran embebidos en la matriz de este tejido (1). Durante el proceso de síntesis de la matriz ósea, entre el 50 y el 70% de los osteoblastos sufre apoptosis. Sin embargo, otro porcentaje importante se diferencia a osteocitos. Éstos son células planas con múltiples prolongaciones. Los osteocitos son células mecanosensibles (36) y sus mecanoreceptores responden a microdistorsiones de la matriz por diferencias de carga mecánica (7). Así, los osteocitos indican a los osteoclastos dónde y cuándo resorber hueso, y a los osteoblastos dónde y cuándo formarlo. Para completar esta función forman una red (7) metabólica y 14 A NA A LONSO P ÉREZ eléctrica a través de los canalículos óseos donde sus prolongaciones citoplasmáticas se tocan formando uniones tipo gap (37,38). Regulando de esta forma el remodelado óseo los osteocitos conservan la matriz ósea y controlan la homeostasis del Ca (1). 5.2.3. Células de revestimiento óseo Aquellos osteoblastos que ni continúan su diferenciación a osteocito ni entran en apoptosis se convierten en células de revestimiento óseo (39,40). Son células planas, largas y estrechas. Estas células están al mismo tiempo separadas y en contacto con el hueso mineralizado. Están separadas del hueso mineralizado por las líneas de cemento que marcan los límites de trabajo de los osteoclastos y los osteoblastos (7), y están en contacto con los osteoblastos y osteocitos por uniones adherentes y de tipo gap respectivamente (8,41). Las células de revestimiento óseo son capaces de secretar colagenasas que destruyen la capa de tejido fibroso con el fin de aumentar la resorción ósea (7). También están implicadas en la diferenciación de células madre hematopoiéticas, sirviéndoles de anclaje y participando en el mantenimiento de su mesenquimalidad (41). 5.2.4. Osteoclastos Los osteoclastos son células polinucleares (con más de 3 núcleos) formadas por la fusión de monocitos/células de la estirpe de los macrófagos (42) de la médula ósea. Estas células se caracterizan por poseer un borde en cepillo a través del cual realizan su función resortiva ósea. La osteoclastogénesis está regulada por numerosos factores, entre los que destacan los producidos por los osteoblastos, capaces de controlar estrechamente la diferenciación de osteoclastos (43). Uno de ellos es RANKL. En presencia del factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés) este factor aumenta la osteoclastogénesis (44,45). La situación opuesta se da con la OPG, un factor que bloquea este proceso (44). Se acostumbra a emplear la ratio entre estes dos factores como marcador del remodelado óseo. Los osteoclastos se encuentran en la superficie ósea, en las lagunas óseas donde ejercen su efecto de resorción del hueso durante el remodelado del mismo. 15 Introducción 6. M ETABOLISMO ÓSEO 6.1. Remodelado y modelado óseos El remodelado óseo es el proceso por el cual el esqueleto humano se renueva completamente cada siete años. El hueso es un tejido vivo y dinámico que se encuentra en constante remodelación. Esta renovación la realizan las unidades de remodelado óseo, formadas por osteoclastos y osteoblastos. La diferencia entre el remodelado y el modelado es que en el primero los osteoclastos y osteoblastos trabajan en una misma localización y de forma concatenada, causando de esta forma una renovación del hueso. En cambio, en el modelado óseo el trabajo de ambos tipos celulares es simultáneo y en diferentes localizaciones del hueso. Este proceso da lugar al crecimiento del hueso y tiene lugar como respuesta a las diferentes cargas mecánicas ejercidas sobre el hueso (ley de Wolff) (7). El remodelado óseo comienza antes del nacimiento y continúa hasta la muerte. No obstante, la dirección de este equilibrio varía a lo largo de la vida (8). Las fases del remodelado óseo son las siguientes (46,47) (Figura 3.): □ Una vez iniciado el proceso de remodelado por el estímulo pertinente, las células de revestimiento óseo se separan de la superficie del hueso y forman un espacio llamado dosel óseo (48,49) donde tiene lugar el remodelado. Estas células secretan colagenasas y metaloproteinasas (MMPs) y provocan la exposición de la matriz mineral ósea eliminando fibrillas de colágeno no mineralizadas (39,40,50). En la región del dosel existe un ambiente controlado con las concentraciones de factores y citoquinas necesarias para atraer a precursores osteoblasto y osteoclásticos (49,51). □ Este estímulo provoca la fusión de células mononucleares para diferenciarse a osteoclasto. Este proceso dura entre 2 y 4 semanas y está regulado por la ratio RANKL/OPG, así como citoquinas como la IL1, IL6, por el M-CSF, la hormona paratiroidea (PTH), la 1,25OH vitamina D, y la calcitonina (52,53). □ El osteoclasto libera iones H+ a través de su borde en cepillo acidificando así el pH de la laguna de resorción (54). También libera 16 A NA A LONSO P ÉREZ fosfatasa ácida resistente al tartrato, catepsina K, MMP9 y gelatinasa (55). De esta forma se produce la descalcificación del hueso y se digieren los colágenos de la matriz (7), liberándose en este paso el telopéptido reticulante C-terminal del Col I (CTX-I por sus siglas en inglés) (56). □ La acidificación provoca la liberación de citoquinas y otras moléculas que se encontraban embebidas en la matriz. Las citoquinas liberadas inhiben la osteoclastogénesis posterior y actúan como señales para la actividad de los osteoblastos. □ Tras la apoptosis de los osteoclastos las células mononucleares terminan la fase de resorción y comienza la de formación ósea (57,58). Se han propuesto varias señales acopladoras de estos dos procesos entre las que se encuentran el TGFβ, los factores de crecimiento insulínicos 1 y 2 (IGF1 e IGF2), las BMPs, y los propios osteoclastos (59–61). □ Los osteoblastos forman nueva matriz ósea en la laguna generada por los osteoclastos en el caso del remodelado. Este proceso dura entre 4 y 6 meses. En él los osteoblastos sintetizan colágenos y otras proteínas no colaginosas, organizan sus fibrillas y se encargan de mineralizar el osteoide liberando vesículas con Ca y PO4 (7,8). Durante la organización de las fibrillas de Col I se libera al suero el propéptido de extensión N-terminal del Col I (PNPI por sus siglas en inglés) (56). □ Una vez terminado el remodelado, las células de revestimiento cubren la superficie ósea con una fina capa de colágeno (39,40,50). 17 Introducción No obstante, el remodelado óseo no es igual en todas las zonas del hueso. Por ejemplo, en el hueso del periostio existe más formación que destrucción de hueso, ocurriendo lo contrario en el endostio y en el hueso trabecular. Esto último sugiere una mayor actividad metabólica en el hueso trabecular que en otras zonas del hueso (8). De la misma forma, la formación de hueso puede tener lugar en regiones externas al esqueleto en situaciones patológicas. Es lo que se llama osificación heterotópica (OH). Reguladores del remodelado óseo a nivel local Factores de crecimiento Proteínas de matriz (62) Citoquinas IGF1 y 2 (63) TGFβ (64) BMPs (65) Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (66) Factor de crecimiento fibroblástico (FGF) (67) VEGF M-CSF Factor de necrosis tumoral (TNF) IL1 (68) IL6 (42) IL11 Prostaglandinas (69) Leucotrienos Tabla 1. Reguladores del remodelado óseo a nivel local 18 Figura 3. Fases del remodelado óseo A NA A LONSO P ÉREZ 1.1.1. La artrosis Actualmente la artrosis es la enfermedad reumática más prevalente en el mundo, siendo una causa principal de dolor e incapacidad. Esta enfermedad se caracteriza por el estrechamiento del espacio articular como consecuencia la degradación del cartílago en este área (152). No obstante, el cartílago no es el único tejido afectado, sino que toda la articulación se ve afectada. En la artrosis se pierde la arquitectura articular (153), y la integridad del hueso se ve comprometida (154). En esta enfermedad se observa una inflamación crónica local afectando a una o varias articulaciones simultáneamente. El componente inflamatorio de esta patología ha sido ampliamente descrito, y citoquinas como la IL1β son juegan un papel determinante en su etiología (155). Estas moléculas afectan a la unidad funcional formada por el cartílago articular y el hueso subcondral (155,156), provocando cambios en el metabolismo osteoblástico y en la relación entre ambos tejidos (155). La expresión de IL1β se ve mediada por las alteraciones bioquímicas y de carga mecánica que tienen lugar en la articulación artrósica. Estas modificaciones no solo afectan a la expresión de mediadores inflamatorios, sino que también inducen la expresión de factores catabólicos (157,158). De hecho, los mediadores inflamatorios y catabólicos expresados en el cartílago pueden ejercer su efecto en el hueso subcondral y viceversa (156,159,160). La unidad funcional cartílago-hueso subcondral ejerce una acción conjunta para controlar las diferencias de carga mecánica que surgen con el movimiento (normal o anormal) de la articulación, provocando cambios bioquímicos y estructurales en el hueso subcondral que, simultáneamente, afectan a la homeostasis del cartílago (158,161–163). Por ello, la vía WNT, estrechamente vinculada a la carga mecánica, juega un papel importante en esta patología y, como se ha visto previamente, también puede verse afectada por las respuestas inflamatorias (144,145). Las disrupciones metabólicas causadas por esto afectan al remodelado del hueso subcondral (157,158), que puede mostrar zonas escleróticas y osteoporóticas en una misma articulación (154,164) 25 Introducción Otra de las patologías inflamatorias íntimamente relacionada con la artrosis es la obesidad. La artrosis es un factor determinante para el aumento de peso, puesto que el dolor e incapacidad causados por la enfermedad desembocan en un estilo de vida sedentario, factor de riesgo para la obesidad (153,165). Interesantemente, la relación entre ambas patologías es circular, puesto que el aumento de peso y el síndrome metabólico asociado a la obesidad contribuyen al aumento de carga mecánica y a alteraciones bioquímicas típicas de la artrosis (166), con los correspondientes efectos deletéreos asociados al hueso. 1.2. Inflamación aguda La inflamación aguda y controlada tiene lugar, principalmente, durante la primera fase de la consolidación de fracturas. Este proceso consta de varias fases: fase inflamatoria, fase de reparación, y fase de remodelado óseo (167). Durante la fase inflamatoria, se distinguen dos procesos principales, la fase aguda y la fase de resolución de la inflamación. □ Fase aguda: se inicia justo después de la fractura. o Tras una factura se rompen los vasos sanguíneos y se produce un hematoma. Éste se caracteriza principalmente por la presencia de fibrina, que servirá en fases posteriores como andamiaje para la reparación del tejido óseo (168). o En esta fase se liberan quimioquinas y citoquinas inflamatorias con el fin de reclutar células inflamatorias al lugar de la lesión (169). Este proceso favorece la diferenciación de monocitos a macrófagos y la liberación de moléculas proinflamatorias como IL1 o TNFα (170). □ Fase de resolución de la inflamación: tiene lugar inmediatamente después de la fase aguda para asegurar un ambiente proosteogénico. Los niveles de la mayoría de los mediadores inflamatorios disminuyen a niveles basales en esta fase (171,172). o Las células y moléculas proinflamatorias presentes en la lesión inician esta fase (173). La IL6 induce la secreción de IL10 (174), una citoquina antiinflamatoria que actúa sobre los 26 A NA A LONSO P ÉREZ macrófagos (175), y de TGFβ1 (176). Los factores de crecimiento también tienen un papel relevante en esta fase. En concreto, TGFβ1 y 3 o IGF1 regulan la inflamación en el tejido óseo (177–180). o TNFα e IL6 promueven la migración de MSCs al lugar de la lesión (181,182). De hecho, en ratones que no expresan alguna de estas citoquinas la consolidación ósea se encuentra disminuida (183). Curiosamente, el inflamasoma tiene un papel fundamental en la resolución de fracturas y la formación de hueso (184). Esto coincide con el hecho de que el control de la inflamación es vital para el correcto funcionamiento de este proceso, siendo igual de perjudiciales el exceso y el defecto de activación inflamatoria (183,185). En concreto, varias citoquinas inflamatorias promueven la expresión de marcadores osteogénicos o activan la señalización de rutas que promueven este proceso. Se ha demostrado que tanto TNFα como IL17 inducen la expresión génica de BMP2 y RUNX2, y aumentan la señalización de la vía WNT (186). Particularmente, esta vía de señalización, así como la vía de las BMPs, se activa bien por procesos inflamatorios, bien por activación mecánica (187). En el caso del TNFα existe una hipótesis que relaciona su expresión con el efecto de la inflamación en el hueso, la hipótesis de freno de TNFα. Esta hipótesis plantea que el efecto negativo del TNFα sobre el hueso es debido a que aumenta la expresión de dickkopf1 (DKK1), un inhibidor específico de la vía WNT, y, curiosamente, el tratamiento con anti-TNF reduce la formación de hueso (188). No obstante, Li et al (189) demostraron que el efecto del TNFα en el hueso depende de su concentración, así como de la duración de su acción. Así, una dosis baja de esta citoquina activó la señalización de la vía WNT sin afectar a la expresión de DKK1, ocurriendo lo opuesto con dosis elevadas o con tratamientos de corta duración (189). 27 Introducción 1.3. Fármacos antiinflamatorios 1.3.1. Antiinflamatorios esteroideos (corticoides) En la práctica clínica los antiinflamatorios corticoides no se prescriben en pacientes con patologías óseas (190). De hecho, están indicados para el tratamiento de la FOP (191). Los efectos perjudiciales sobre el hueso de este grupo terapéutico se han evidenciado tanto en humanos (menor densidad mineral ósea, necrosis de cabeza de fémur) (192,193) como en ratones (menor osteogénesis y fuerza mecánica en el lugar de fractura) (194–196). 1.3.2. Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Los AINEs son fármacos inhibidores de la enzima ciclooxigenasa (COX), y pueden ser específicos de COX2 (celecoxib) o inespecíficos, e inhibir COX1 y 2 (ibuprofeno, indometacina). Zhang et al. demostraron que COX2 es necesaria tanto para la correcta función de los osteoblastos, como para la diferenciación de MSCs a este tipo celular (197). Este efecto se ve mediado por las prostaglandinas producidas por COX2. Estas moléculas se ven implicadas en procesos de osificación endocondral y en caso de fractura dirigen las MSCs al sitio de fractura y favorecen la angiogénesis. (198–200) Asimismo, las prostaglandinas producidas por COX2 también participan en la osificación intramembranosa (promueven la actividad de osteoblastos y osteoclastos in vivo e in vitro) (69,201–203). De esta forma, la inhibición farmacológica de la acción 28 Figura 4. Estructura molecular de un corticosteroide A NA A LONSO P ÉREZ de esta enzima puede afectar al crecimiento óseo y a la correcta consolidación de fracturas (204,205). No obstante, se han observado diferencias entre aquellos AINEs específicos e inespecíficos. Los no específicos no llegan a parar la formación del hueso, sino que frenan este proceso, puesto que su inhibición de COX2 es de menor magnitud (206). Considerando lo expuesto, los AINEs se han usado en el tratamiento y prevención de la formación excesiva de hueso ectópico (191), como puede ser la OH tras cirugía de cadera (207). En concreto, la indometacina es el fármaco más empleado para este tratamiento. Su efecto sobre el crecimiento anómalo de hueso se comparó con la radioterapia, otra de las herramientas terapéuticas disponibles. Los resultados sugirieron efectos comparables tras 6 semanas de tratamiento con indometacina. No obstante, se observaron efectos adversos sobre la consolidación de la fractura de cadera (208,209). 2. R UPTURA DE LOS EQUILIBRIOS DEL HUESO Como se ha descrito previamente, el correcto funcionamiento del hueso depende del correcto control de varios equilibrios, siendo el remodelado óseo y el equilibrio osteoblasto-adipocito los más determinantes para la fisiología ósea. 2.1. Alteraciones del equilibrio osteoblástico-adipocítico La ruptura del balance osteoblasto-adipocito hacia cualquiera de los lados del equilibrio resulta en una situación patológica. Un aumento de la adiposidad ósea se ha relacionado con la pérdida de hueso descrita en numerosas patologías como la osteoporosis, la osteopenia, la obesidad o el envejecimiento, entre otros (13–16). El papel del tejido adiposo como órgano endocrino se ha estudiado ampliamente en los últimos años y se ha visto cómo puede afectar al remodelado óseo. Es interesante el hecho de que el perfil de expresión génica de los osteoblastos se haya visto modificado en presencia de factores secretados por adipocitos, disminuyendo en esta situación la expresión de genes 29 Introducción proosteoblásticos y aumentando la expresión de genes adipogénicos (210). Algunas adipoquinas (hormonas secretadas por el tejido adiposo) ejercen parte de su efecto en el tejido óseo. La leptina producida en la médula ósea y el tejido adiposo (211) afecta al metabolismo y remodelado óseos (212,213). In vivo se ha relacionado de forma diferente la falta de esta hormona con la adiposidad ósea en función de la región del esqueleto (214). La adiponectina es otra de las adipoquinas que pueden afectar al hueso. Sus niveles en plasma se han correlacionado de forma negativa con el IMC (215) así como con un aumento de la osteoblastogénesis, mostrando un efecto contrario en la osteoclastogénesis in vivo (216). No obstante, existe aún controversia respecto a al efecto directo de las adipoquinas en el hueso. No solo las hormonas secretadas por los adipocitos pueden afectar al hueso. Estas células son también productoras de IL6 y TNFα, que como se ha visto previamente crónicamente inclinan el remodelado óseo hacia la resorción (217). Teniendo en cuenta la actividad oxidativa de los adipocitos, cabe destacar que el estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) pueden alterar el equilibrio osteoblasto-adipocito (218). A lo largo de la vida se produce un aumento de este estrés que se ha relacionado con el aumento de la adiposidad ósea (218). No obstante, no sólo los adipocitos per se, los propios lípidos y su metabolismo pueden afectar a la osteoblastogénesis. La lipolisis y la consecuente liberación de ácidos grasos libres pueden alterar la expresión de RUNX2 frenando la osteoblastogénesis (219,220) provocando así la pérdida del hueso. La edad es el factor más determinante para las alteraciones del equilibrio osteoblástico-adipocítico. Se ha descrito en numerosas ocasiones como durante el envejecimiento el equilibrio osteoblasto-adipocito se rompe (221,222). Como consecuencia de esta ruptura aumenta la adiposidad del hueso (223) aumentando de esta forma el riesgo de fractura ósea (13,14). Varios mecanismos se han propuesto como explicación de este proceso. Uno de los sugeridos ha sido la disminución de la expresión de deacetilasas de histonas (Hdac3) con la edad (224). 30 A NA A LONSO P ÉREZ 2.1.1. Estudio del equilibrio osteoblástico-adipocítico Como se ha explicado previamente, la adipogénesis y la osteoblastogénesis son procesos opuestos pero regulados mutuamente (25) actuando los factores proadipogénicos como inhibidores de la osteoblastogénesis y viceversa (18). No obstante, hoy en día no se dispone de un protocolo estandarizado para estudiar in vitro ambos procesos simultáneamente en el mismo contexto celular. La mayoría de los experimentos llevados a cabo para evaluar estas diferenciaciones se realizan en la línea celular de preadipocitos 3T3-L1 (225), o en las líneas preosteoblásticas MC3T3-E1, SaOS2, o MG-63 (226). Aunque estas líneas celulares ofrecen diferenciaciones adecuadas, no mimetizan completamente los procesos desde su origen mesenquimal y no son capaces de diferenciarse a ambos destinos celulares. Este hecho limita el estudio de factores moduladores y nuevas herramientas terapéuticas que actúen sobre la decisión de las MSCs de diferenciarse a osteoblasto o adipocito, o sobre los primeros pasos del proceso de diferenciación. Considerando lo anterior, es necesario un protocolo de diferenciación fiable, así como un modelo de MSCs adecuado, que reduzca la variabilidad debida a las condiciones celulares, ambientales o de cultivo. 2.2. Alteraciones del remodelado óseo El equilibrio entre la diferenciación osteoblástica y la adipogénica de MSCs no es el único que se puede ver alterado. El remodelado óseo es otro balance susceptible de desregulaciones que puedan provocar situaciones patológicas en el hueso. Algunas de las situaciones que afectan al equilibrio entre diferenciaciones (osteoblástica y adipogénica) también pueden modificar el equilibrio osteoblasto-osteoclasto: los adipocitos presentes en la médula ósea también ejercen efectos paracrinos sobre las células adyacentes, pudiendo afectar al remodelado óseo (227). Se ha descrito que PPARG promueve la osteoclastogénesis a partir de células hematopoiéticas a través de c-fos (228). De la misma forma, el remodelado óseo también se puede ver afectado por el estrés oxidativo y la liberación de ROS asociada. Se ha relacionado esta situación con un descenso en la cantidad de osteoblastos y, por tanto, menor formación de hueso (229,230). Peng et al. determinaron que el estrés oxidativo 31 Introducción en MSCs aumenta con la edad (231). Aquellas situaciones donde falla la diferenciación osteoblástica de las MSCs pueden causar una ruptura del equilibrio osteoblasto-osteoclasto, que afectará al remodelado óseo y, por ende, provocará una menor calidad del tejido óseo (232). 2.2.1. Osteoporosis La osteoporosis es la patología ósea más frecuente y se caracteriza por una pérdida de la densidad mineral ósea y de la arquitectura del hueso debido, principalmente, a alteraciones en el remodelado óseo. Está altamente relacionada con la edad y el sexo, siendo más alta en mujeres que en hombres (233,234). La osteoporosis se clasifica en osteoporosis primaria o secundaria y su fase temprana se denomina osteopenia. □ Osteoporosis primaria: es la osteoporosis asociada a la menopausia (Tipo I) o al envejecimiento (tipo II). Esta osteoporosis se debe principalmente a una disminución del nivel de estrógenos. Esta alteración hormonal provoca un aumento de la resorción ósea, aunque también ejerce efectos en la formación de este tejido, inclinando el balance neto hacia la destrucción de hueso (235,236). Los estrógenos controlan la expresión de IL1, TNFα e IL6 (237,238), regulación que desaparece en mujeres postmenopáusicas (239). En estas mujeres también se ha observado un aumento de RANKL que correlaciona de forma significativa con el aumento de la resorción ósea (240–242). Igualmente, se sabe que los estrógenos aumentan la expresión de OPG por parte de los osteoblastos (243). Interesantemente, estas hormonas no solo controlan la actividad de los osteoclastos, sino que afectan a su tiempo de vida a través de TGFβ (244). La osteoporosis asociada a la edad está relacionada con varios factores que se sabe que se ven alterados durante el envejecimiento. Uno de ellos es el estrés oxidativo y sus efectos sobre la vía WNT (245,246) o la menor biodisponibilidad del Ca (247,248). De la misma forma, se han establecido correlaciones entre la densidad mineral ósea y los niveles séricos de IGF1 (249,250). La disminución de vitamina D observada en 32 A NA A LONSO P ÉREZ los pacientes de edad avanzada resulta en un aumento de PTH mantenido en el tiempo, lo que tiene efectos deletéreos para el hueso (251). Aunque la prevalencia de la osteoporosis en mujeres es marcadamente mayor que en hombres, en este sexo no es inexistente. Interesantemente, las variaciones en los niveles de andrógenos también se han relacionado con una pérdida de la integridad ósea. No obstante, esta disminución es más gradual que en el caso de los estrógenos en mujeres (252). □ Osteoporosis secundaria: osteoporosis provocada por efectos adversos de determinados fármacos (como lo corticoides) o por otras patologías. Los corticoides alteran la expresión de RANKL/OPG resultando en un aumento de la resorción ósea (253), y, al igual que los estrógenos, alteran la esperanza de vida de los osteoclastos (254). En situaciones de ausencia de carga mecánica también se observa una osteoporosis secundaria (255). 2.2.2. Obesidad La obesidad y el síndrome metabólico asociado se han relacionado con numerosas patologías musculoesqueléticas (256). Se ha descrito que en la obesidad existe un componente inflamatorio de bajo grado donde se observan niveles aumentados de TNFα en los individuos que la sufren (217). Esta patología también se asocia con cambios en los niveles de las adipoquinas leptina y adiponectina, aumentada la primera (257) y disminuida la segunda (215). No obstante, existe una corriente de pensamiento que sugiere que la obesidad es un factor protector frente a la osteoporosis (258–260). No obstante, esta interpretación errónea se debe que al aumento de carga mecánica que supone el exceso de peso en estos pacientes aumenta la densidad mineral ósea a través de la activación de la vía WNT (261–263). Además, la obesidad durante el desarrollo disminuye el pico de masa ósea correspondiente a esta etapa (264). Asimismo, en humanos y ratones obesos se relacionó el aumento de masa grasa con una peor calidad ósea (214,265–267). La obesidad afecta al remodelado óseo por la alta expresión de citoquinas inflamatorias asociadas y su modulación de la ratio RANKL/OPG (124,147). No solo a nivel del propio osteoclasto, la 33 Introducción adiposidad ósea observada en esta patología también controla la diferenciación osteoclástica de manera indirecta a partir de células hematopoiéticas (268). 2.2.3. Otras patologías del remodelado óseo □ Enfermedad de Paget: en esta patología existe un remodelado ineficiente e ineficaz que resulta en una gran formación de hueso reticular (1), con zonas escleróticas y/o hipertróficas (269). Se caracteriza por la presencia de osteoclastos hiperreactivos (270). Al igual que las anteriores, su prevalencia aumenta al aumentar la edad de la población (271). Su origen puede ser genético y relacionado con la inflamación, aunque también se ha relacionado con una infección viral crónica (272,273). Después de la osteoporosis es la enfermedad ósea más común. □ Osteopetrosis: esta patología se caracteriza por una resorción ósea no efectiva que resulta en la excesiva formación de hueso. Esta enfermedad tiene un origen genético, y las mutaciones que la ocasionan afectan al borde en cepillo (274), alterando a estructuras como las bombas de protones, los canales de cloro y la catepsina K que son fatores claves en la creación de dicha laguna (1). También se puede originar debido a mutaciones en el receptor LRP-5 o 6 de la vía WNT (275,276). □ Raquitismo: enfermedad provocada por una deficiencia de vitamina D, la osteoblastogénesis no se lleva a cabo de forma correcta y el remodelado óseo se ve aumentado e inclinado hacia la resorción ósea (277). □ Osteogénesis imperfecta: la formación del hueso se ve alterada resultando en un osteopenia y fragilidad ósea (278,279). La práctica totalidad de los casos se deben a mutaciones en los genes de Col IA1 y Col IA2 (279). 2.3. Crecimiento anormal del hueso El crecimiento anormal del hueso es una condición patológica que puede ocurrir en diferentes situaciones. En concreto, el hueso anormal se puede 34 OBJETIVOS OBJETIVOS □ Establecer un nuevo y mejorado protocolo de diferenciación de MSCs para el estudio del equilibrio entre osteoblastogénesis y adipogénesis. □ Estudiar el papel de los factores de transcripción más relevantes asociados a los cambios de metilación del ADN durante la osteoblastogénesis en los procesos de diferenciación osteoblástica y adipocítica. □ Estudiar la expresión y/o la actividad de los factores de transcripción implicados en la osteoblastogénesis o en la adipogénesis en las alteraciones óseas asociadas a las patologías musculoesqueléticas con más prevalencia. □ Evaluar el impacto de los factores moduladores del balance osteoblasto-adipocito en la expresión y/o actividad de los factores de transcripción implicados en la osteoblastogénesis o en la adipogénesis. □ Identificar una nueva terapia para prevenir y tratar el crecimiento anormal del hueso. 43 MATERIAL Y MÉTODOS Ana Alonso Pérez MATERIAL Y MÉTODOS 1. C ULTIVOS CELULARES 1.1. Línea celular C3H10T1/2 La línea C3H10T1/2 es una línea mesenquimal obtenida a partir del clon 8 de células embrionarias del ratón C3H en 1973 (307). Dado su origen de célula madre mesenquimal presenta características fibroblásticas. En presencia de los factores correctos es capaz de diferenciarse a adipocito (19), a condrocito (308) y a osteoblasto (308). Aunque el modelo celular ideal sean las células madre mesenquimales humanas de origen primario, éstas son escasas y difíciles de conseguir. Se ha demostrado la comparabilidad entre la diferenciación a los tres destinos celulares de las C3H10T1/2 con la de células madre mesenquimales humanas de origen primario (308). El cultivo celular de esta línea se ha mantenido con medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM por sus siglas en inglés) con alta concentración de glucosa (4.5mg/ml), suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, antibiótico al 1% (penicilina/estreptomicina), y glutamina 4mM. Para mantener las células en cultivo se realizaron pases celulares cada 2-3 días, una vez las células alcanzaron el 80% de confluencia. Tras la retirada del medio presente se procedió al lavado con tampón fosfato salino 1x (PBS: NaCl 0,137M, KCl 2,7mM, Na2HPO4 1,44g/L, KH2PO4 0,24g/L) y al despegue de las células con 2ml de Tripsina/0,5% EDTA por placa de cultivo de 100mm. Tras 7 minutos a 37ºC, se añadieron 7ml de medio de cultivo y se sembraron a una densidad de 5x106 por placa de cultivo. 1.2. Línea celular hMSC-TERT La línea celular humana hMSC-TERT de células madre mesenquimales de médula ósea fue donada por el Dr. Campana (Universidad Nacional de Singapur). Esta línea se obtuvo a partir de la inmortalización, de células madre mesenquimales de un hombre de 33 años. Dicha inmortalización se realizó mediante la sobreexpresión de la transcriptasa reversa de la telomerasa humana (TERT, por sus siglas en inglés). Al igual que la línea C3H10T1/2, estas células 47 Material y métodos poseen la capacidad de diferenciarse tanto a osteoblasto (309) como a adipocito (310). Interesantemente, su potencial de diferenciación es comparable al de células mesenquimales humanas de origen primario (311). El medio de cultivo de esta línea celular consiste en DMEM:Hams F12, 10% de FBS con las proteínas del complemento inactivadas (incubación a 56ºC durante 1 hora), antibiótico al 2% (penicilina/estreptomicina) y glutamina 4mM. Para mantener las células en cultivo se realizaron pases en el momento en que los cultivos alcanzaron el 80% de confluencia, cada 2-3 días aproximadamente. Tras un lavado con 3ml de PBS 1x, se añadieron 4ml de tripsina/0,5%EDTA al matraz de cultivo de 75cm2 en el que se cultivaron las células, y se mantuvieron durante 5 minutos a 37ºC. Pasado este tiempo, se inactivó la tripsina con 9ml de medio, se centrifugaron las células a 1400rpm durante 6 minutos, y se sembraron en un nuevo matraz de cultivo a una densidad de 106 células por ml. 1.3. Línea celular SaOS2 La línea celular SaOS2 fue generada a partir de células de osteosarcoma de una mujer de 11 años en 1977 (312). Estas células tienen características osteoblásticas (313) y han sido descritas como una de las líneas celulares más semejante a osteoblastos primarios (314). El medio de cultivo para estas células consiste en DMEM:Hams F12, 5% FBS, 10% de antibiótico (penicilina/estreptomicina) y glutamina 2mM. Para mantener la línea SaOS2 en cultivo, se realizaron pases de igual manera que los descritos previamente para las células hMSC-TERT. 1.4. Línea celular ATDC5 La línea de ratón ATDC5 es una línea embrionaria de cartílago aislada en 1990 a partir de un cultivo de teratocarcinoma con características fenotípicas fibroblásticas durante su fase de crecimiento (315). En presencia de insulina 10µg/ml esta línea puede mantener su crecimiento más allá de la confluencia formando agregados semejantes a los nódulos formados por los condrocitos. 48 Ana Alonso Pérez Tiñendo estas células con azul alcián se comprobó la síntesis de proteoglicano y colágeno II, marcadores específicos de diferenciación condrogénica (315). Las características intrínsecas de la línea ATDC5 permiten estudiar los procesos fisiológicos del cartílago y de la placa de crecimiento puesto que nos permite trabajar en tres estados distintos de diferenciación: condrogénico, condrocito maduro y condrocito hipertrófico. De esta forma, se puede considerar como una línea celular óptima para mimetizar las primeras fases de la osificación endocondral. El mantenimiento celular de estas células requiere de medio DMEM:Hams F12 suplementado con el 5% de FBS, 2% de antibiótico (penicilina/estreptomicina), 5µg/ml de apo-transferrina y 30nM de selenito sódico. 1.5. Células madre mesenquimales de médula ósea humanas Las células madre mesenquimales de médula ósea humanas (hMSC) son células pluripotentes con la capacidad de diferenciarse a diversos destinos celulares como condrocito, osteoblasto o adipocito. El uso de este tipo celular permite estudiar el balance entre osteoblastogénesis y adipogénesis en el contexto del hueso, así como su posible modulación. Las hMSC fueron adquiridas a Thermo Fisher Scientific (MA, USA) y su mantenimiento y manejo se realizaron acordes a las instrucciones del proveedor. El medio MesenPro RS Medium suplementado con MesenPRO RS Growth Supplement fue el empleado para el mantenimiento de estas células en cultivo. Los pases se realizaron de igual manera que en el caso de la línea hMSCTERT, y no se utilizaron células con más de 5 pases para evitar la pérdida del fenotipo y de su capacidad de diferenciación. 1.6. Aislamiento y cultivo primario de osteoblastos Los osteoblastos primarios humanos se obtuvieron de cirugías de reemplazo articular o de exéresis de placas óseas procedentes de osificaciones ectópicas. El Comité Ético de Investigación del Área de Santiago y Lugo aprobó este procedimiento en el protocolo CAEIG-2016/258. Todos los pacientes 49 Material y métodos firmaron un consentimiento informado acerca del tratamiento de las muestras y del fin de la investigación, de acuerdo con la declaración de Helsinki. Todos los procesos se realizaron como se describe en las guías y regulaciones vigentes. Se accedió al historial clínico de los pacientes para identificar comorbilidades, tratamientos farmacológicos vigentes y otras situaciones fisiopatológicas que pudiesen afectar al metabolismo óseo. Todas las muestras fueron correctamente anonimizadas. Una vez realizada la cirugía, y en condiciones de esterilidad, se extrajo el hueso identificando y separando según la zona de la que provenía, el tipo de hueso (cortical o trabecular), su patología, u otras condiciones que pudiesen afectar al proceso normal de osteoblastogénesis. Una vez clasificado el hueso, se lavó con PBS 1x un mínimo de 5 veces hasta eliminar completamente restos grasos o hemáticos que pudiesen interferir con los resultados esperados. Seguidamente, se congeló a -80ºC una parte de cada una de las muestras para la posterior extracción de su ARN. La muestra restante, previamente fragmentada se colocó en una placa de cultivo de 100mm de forma que los fragmentos de hueso estuviesen separados y con la máxima superficie posible en contacto con la base de la placa. Una vez dispuestos, se añadieron 7ml de medio de cultivo (DMEM:Hams F12, 10% FBS, penicilina/estreptomicina al 2% y glutamina 4mM) gota a gota sobre cada uno de los fragmentos. Transcurridos 10 días del procesado de hueso, se procedió a realizar cambios de medio cada 2 días según el mismo procedimiento. Una vez alcanzada una confluencia del 70%, los fragmentos de hueso se transfirieron a una nueva placa para repetir el protocolo hasta 3 veces más. Las células obtenidas de los explantes óseos se pasaron tras alcanzar el 85% de confluencia, una vez retirado el medio de cultivo y realizado un lavado con PBS 1x, se emplearon 3ml de tripsina/0,5% EDTA durante 7 minutos para despegar las células. Transcurrido este tiempo, se bloqueó la tripsina con 7ml de medio fresco, y se dividió la suspensión celular en 3 nuevas placas, añadiendo el medio necesario para un volumen final de 7ml por placa. Los osteoblastos primarios de hueso no se utilizaron nunca más allá del quinto pase para evitar la pérdida de fenotipo o de la capacidad de diferenciación osteoblástica. 50 Ana Alonso Pérez Antígeno 2 relacionado con FOS FOSL2 AAGAAAAACACCCTGTTTCC TATCTACCCGGAATTTCTGC Osteoactivinia GPNMB CAGATCAGATTCCTGTGTTTG ACAGTATGATTGGTGGAAAC Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa HPRT ATAAGCCAGACTTTGTTGG ATAGGACTCCAGATGTTTCC Factor de transcripción de choque térmico 1 HSF1 AACAGAAAGTCGTCAACAAG CTATACTTGGGCATGGAATG Factor 3 regulador del interferón IRF3 ATTCTGGATGAGTTACTGGG AAGGTAATCAGATCTTCCCC Factor de transcripción Jun JUN AAAGGATAGTGCGATGTTTC TAAAATCTGCCACCAATTCC Factor de transcripción Jun-b JUNB TACTGTGGAAAAGAAACACG GAACAAACACACACAAACAC Subunidad α del factor de transcripción nuclear Y NFYA CAAGTTACAGTCCCTGTTTC CTCCTGAATTGACCACATTG Receptor de glucocorticoides NR3C1 ACTGCTTCTCTCTTCAGTTC GATTTTCAACCACTTCATGC Factor de respiración nuclear 1 NRF1 CCACACATAGTATAGCTCATC TACCAACCTGGATAAGTGAG Homeobox 3 PBX PBX3 CAGGTATCCAATTGGTTTGG GAATTGGTCTGGTTGTTCTG Perilipina 2 PLIN2 GTTCACCTGATTGAATTTGC GAGGTAGAGCTTATCCTGAG Receptor de proliferador de peroxisoma activado γ PPARG AAAGAAGCCAACACTAAACC TGGTCATTTCGTTAAAGGC Factor regulador X5 RFX5 GATCTTCCCTGACATCAAAG GGACTCTCAGAACCCTTTAG Factor de transcripción relacionado con RUNT, 2 RUNX2 AAGCTTGATGACTCTAAACC TCTGTAATCTGACTCTGTCC Proteína de 30kDa asociada a SIN3A SAP30 ACCCCAGAGGTTGATTTATAC GTGCTTTATTAAGTCCTGGTC Histona-lisina Nmetiltransferasa SETDB1 SETDB1 AAAACAAGCTCAGGTTTCTC GAGATGTCTTCTATGTCCTCC Miembro A de la familia de factores de transcripción SIN SIN3A CAGAAAGAGCAGAGAAATGC GTAGGAATTGTCCAAACTCTG Activador de transcripción BRG1 SMARCA4 GATGTCGATGATGAATATGGC ATCTGGTACTGTTTGAGGAC Subunidad SMARCC1 del complejo SWI/SNF SMARCC1 AAAGATCAAGTCCCTGGTAG TAGAGCTTCTTTCTCTCTGTC Factor de transcripción SP4 SP4 TCATTTACGAGCACATCTTC TTCACCTGTATGGGTTCTTC 57 Material y métodos Osteopontina SPP1 GACCAAGGAAAACTCACTAC CTGTTTAACTGGTATGGCAC Transductor de señal y activador de la transcripción 3 STAT3 GGTACATCATGGGCTTTATC TTTGCTGCTTTCACTGAATC Subunidad SUZ12 del complejo de represión del polycomb SUZ12 GGATGTAAGTTGTCCAATAAGG GTTTGATTGAGGTCAGGATTC Factor de transcripción 7 semejante a 2 TCF7L2 AAGAGCAAGCGAAATACTAC CTTCTTTCCATAGTTATCCCG Proteína 1 que contiene el dominio THAP THAP1 AAGTTTCCTCTTACTCGACC CAAATACTGCTATACTTGGTGG Homeobox 1 de unión al E-boxing ZEB1 AAAGATGATGAATGCGAGTC TCCATTTTCATCATGACCAC Dedo de Zn 143 ZNF143 TGCTAAATCTCAACAGAGTG ATGGACCTTGAGATGATGAG Tabla 5. Referencia de los cebadores de humano usados para PCR en tiempo real Descripción Símbolo Secuencia (5’-3’) cebador delantero Secuencia (5’-3’) cebador inverso Adiponectina ADIPOQ CCACTTTCTCCTCATTTCTG CTAGCTCTTCAGTTGTAGTAAC Fosfatasa alcalina ALPL ATTCCCACTATGTCTGGAAC CTCAAAGAGACCTAAGAGGTAG Proteína ligante a ácidos grasos FABP4 GTAAATGGGGATTTGGTCAC TATGATGCTCTTCACCTTCC Osteoactivinia GPNMB CTCTTTAATGCCTACTGGTTAC GCCATATCTGTTTATTCGGC Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa HPRT AGGGATTTGAATCACGTTTG TTTACTGGCAACATCAACAG Factor de respiración nuclear 1 NRF1 AAACAAAGGGTTTCATGGAC GGTACGAGATGAGCTATACTG Perilipina 2 PLIN2 ATAAGCTCTATGTCTCGTGG GCCTGATCTTGAATGTTCTG Receptor de proliferador de peroxisoma activado γ PPARG AAAGACAACGGACAAATCAC GGGATATTTTTGGCATACTCTG Factor de transcripción relacionado con RUNT, 2 RUNX2 ACAAGGACAGAGTCAGATTAC CAGTGTCATCATCTGAAATACG Proteína de 30kDa asociada a SIN3A SAP30 TTGTTGAGATAGTTGGTTGC TAGTGTGAACAGCATCTCTC Histona-lisina Nmetiltransferasa SETDB1 SETDB1 CTTGGGAGGACATAGAAGATAG TTTTGTCATCCAGAAAGAGG Factor de transcripción SP4 SP4 AAGAAGAAGCAGCATGTTTG AATCTCTTTTCACCTGTGTG 58 Ana Alonso Pérez Osteopontina SPP1 GGATGAATCTGACGAATCTC GCATCAGGATACTGTTCATC Subunidad SUZ12 del complejo de represión del polycomb SUZ12 ATATGGTGAAGTCCTACTCG GGAAGTTCTTCACTGACATC Homeobox 1 de unión al E-boxing ZEB1 ATATGAGCACACAGGTAAGAG TTCATGTGTTGAGAGTAGGAG Tabla 6. Referencia de los cebadores de ratón usados para PCR en tiempo real El programa de PCR fue común para todas las PCRs independientemente del tipo de cebador usado. El perfil térmico fue el siguiente: 1 minuto a 95ºC, 45 ciclos de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC, 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 55ºC, 30 segundos a 95ºC de nuevo. 7.2.1. Cuantificación relativa El equipo de PCR a tiempo real QuantStudio 3® fue el utilizado para realizar las amplificaciones y cuantificaciones relativas. El papel de calibrador se le asignó al ADNc de la muestra control, para el cual se asignó el valor de 1. Todos los resultados obtenidos en las diferentes muestras se refirieron a este valor, determinando así que la cuantificación fuese relativa al valor del calibrador. Cada ADNc se amplificó dos veces, una con los cebadores del gen de interés y otra con los cebadores del gen normalizador. Este gen (HPRT) no varía su expresión como consecuencia de los tratamientos o procesos de diferenciación, lo que permite su uso como control de carga. Para realizar la cuantificación relativa el programa utiliza el método ΔΔCt. Ct se refiere al ciclo a partir del cual la amplificación empieza a ser estadísticamente significativa respecto al ruido de fondo. Considerando que la relación entre Ct y la concentración de ADNc es inversamente proporcional, y que en cada uno de los 45 ciclos de la PCR se duplican las copias, el nivel de expresión de cada gen (L) se puede representar como: = 2 Como para cada gen el nivel de carga entre las muestras puede sufrir pequeñas variaciones, éstas se minimizan indicando la expresión de cada gen 59 Material y métodos respecto a la expresión de un gen normalizador. Su representación sería la siguiente: 2 ( ) [ ( ) ( )] 2 ( ) = 2 = 2 Tras la normalización de la expresión del gen de interés se procede a la cuantificación relativa de cada una de las muestras respecto al calibrador. Con esta operación se determina la variación de expresión del gen de interés en una muestra respecto al control. Esta cuantificación relativa se calcula dividiendo la expresión normalizada del gen de interés en la muestra problema entre la expresión del gen de interés en el control (calibrador). Su representación es la siguiente: 2 ( ) 2 ( ) = 2 ( ) − ( ) 7.2.2. Controles de calidad En todas las reacciones de PCR llevadas a cabo se realizó un control negativo de calidad en el cual no se incluyó ADNc. Esto permite discernir si el resultado obtenido se debe a la hibridación de los cebadores con el ADNc problema, o a la formación de dímeros entre ellos. Esta última situación daría lugar a un falso positivo. De igual forma, se realizó un control de especificidad ulterior con la realización de una curva de disociación. Esta curva permite determinar la temperatura de fusión específica para el fragmento amplificado en cada gen y para cada par de cebadores, confirmando así la ausencia de dímeros de cebadores que puedan resultar en un falso positivo. 8. A NÁLISIS ESTADÍSTICO Todos los resultados obtenidos en este trabajo se han expresado como la media ± la desviación estándar de la media (SEM) de, como mínimo, tres experimentos o muestras independientes. Los resultados estadísticos fueron analizados con dos programas de análisis estadístico: GraphPad Software Inc. 60 Ana Alonso Pérez y R. En ambos se empleó un análisis de Student paramétrico o no-paramétrico según correspondiese al tipo de muestra. Un valor de p menor de 0,05 (p<0,05) se consideró significativo. En la representación gráfica de los resultados p<0,05 se indicó como *, p<0,01 como **, p<0,001 como ***, y p<0,0001 como ****. El mismo criterio se siguió para los símbolos # y $. Para las correlaciones, se emplearon los análisis de Spearman y Pearson según el requerimiento de cada muestra. 9. R EVISIÓN DE LITERATURA Con el fin de determinar un protocolo consenso para el medio adipogénico, se realizó la búsqueda del término “ adipogenesis protocol” en la base de datos PubMed . Tras la selección de una muestra representativa de artículos (el 10% de los artículos ordenados por “mejor opción”), se estableció un medio de diferenciación adipogénica consenso (Medio consenso). Adicionalmente, buscando confirmar la adición de IGF1 al medio de diferenciación adipogénico, se realizó la búsqueda del término “adipogenesis IGF1” en la base de datos de PubMed. Se estudiaron todos los resultados obtenidos sin limitación de fechas. Todos los protocolos analizados en ambas búsquedas bibliográficas se tuvieron en cuenta para elaborar un medio adipogénico consenso. Buscando establecer un medio osteoblastogénico consenso, se buscó el término “osteoblastogenesis protocol” en la base de daros de PubMed. Todos los resultados obtenidos fueron analizados para concretar los reactivos óptimos para el medio osteoblastogénico consenso. 61 Material y métodos 10. L ISTA DE REACTIVOS □ Ácido ascórbico-2-fosfato – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ ACTRAPID 100 UI/ML □ Agua ultrapura libre de ARNasas y ADNasas – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ Apo-transferrina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ ATDC5 línea celular condrogénica de ratón – Riken cell bank, Japan □ C3H10 línea celular mesenquimal de ratón – Dr. Pardo, Instituto IDIS, Santiago, ES □ Cebadores – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Células madre mesenquimales de médula ósea humana – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ Cloroformo – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Dexametasona – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ E.Z.N.A. Total RNA Kit I – Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA □ EtOH □ Factor de crecimiento insulínico I – Tebu-Bio □ Formol 4% - Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ GraphPad prism: programa de análisis estadístico – GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA □ High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kit – Applied Biosystems, Life Technolgies, Grand Island, NY, USA □ hMSC-TERT human mesenchymal cell line – Dr. Campana, Singapur University □ Indometacina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Isobutilmetilxantina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Kit de digestión – Lucigen, WI, USA □ LiCl – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ LPS – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 62 Ana Alonso Pérez □ Mezcla maestra para PCR – BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA □ Medio DMEM High Glucose – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Medio DMEM:Hams F12 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ MesenPro RS Kit Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ Oligonucleótidos para siRNA – Integrated DNA Technologies, Coralville, IO, USA □ OptiMEM – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ PBS – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ Penicilina/Estreptomicina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Pioglitazona – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Rojo de aceite O – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Rojo de alizarina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Rosiglitazona – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ SaOS2 – CLS, Eppelheim, Alemania □ Selenito sódico – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ SiLentFect Lipid Reagent for RNAi – BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA □ Sistema de PCR en tiempo real (Quant Studio 3) – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ StemPro Adipogenesis Differentiation Kit – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ StemPro Osteogenesis Differentiation Kit – Thermo Fisher Scientific, Wlatham, MA, USA □ Suero fetal bovino – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ Tripsina/EDTA 0,5% – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ TriReagent – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA □ β Glicerol fosfato – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 63 Material y métodos RESULTADOS Ana Alonso Pérez A SPP1 Día 14 73 1,5 #### 1,0 **** 0,5 0,0 **** **** Resultados 74 Figura 7. Comparación entre medios de diferenciación comerciales y medios propios de diferenciación. A) Expresión de los marcadores de diferenciación osteoblastogénica ALPL, SPP2, GPNMB, RUNX2 y BMP2 medida mediante RT-PCR tras 14 días de diferenciación osteoblastogénica con el medio comercial o el medio propio en hMSCs. B) Expresión de los marcadores de diferenciación adipogénica FABP4, PLIN2, ADIPOQ, y PPARG medida mediante RT-PCR tras 7 días de diferenciación adipogénica con el medio comercial o el medio propio en hMSCs. Estadística * respecto al día 0, # respecto al medio comercial. ** **** * **** B **** *** Ana Alonso Pérez 2.2. Evaluación de la predisposición de células primarias tipoosteoblasto de pacientes envejecidos a diferenciarse a osteoblasto y adipocito La ruptura del equilibrio entre osteoblasto y adipocito se ha asociado con varias patologías y condiciones fisiológicas (como el envejecimiento (16) o la menopausia (326), entre otras). Acorde a esto, se decidió determinar si el Medio propio propuesto permitió evaluar la predisposición de células hOB obtenidas a partir de huesos de mujeres con artrosis envejecidas a osteoblasto y adipocito. Como se muestra en la figura 8A, entre los genes marcadores osteoblásticos, solo la expresión de ALPL aumentó de forma significativa a lo largo del proceso de diferenciación osteoblástica. Esto sugiere un peor proceso de diferenciación para estas células. De forma contraria, los genes marcadores adipogénicos FABP4, CEBPA, ADIPOQ y PPARG aumentaron su expresión de forma significativa a partir del día 14 de diferenciación (Figura 8B). 75 Resultados ALPL SPP1 10 3 * 8 2 6 ** 4 1 * 2 0 0 GPNMB RUNX2 2,5 1,5 2,0 1,5 * 1,0 0,5 1,0 0,5 0,0 0,0 BMP2 76 A ** **** ** 1,5 1,0 ** 0,5 **** *** 0,0 Ana Alonso Pérez PLIN2 8 6 4 2 0 77 Figura 8. Diferenciación osteoblástica y adipogénica de células preosteoblásticas. A) Expresión de los marcadores de diferenciación osteoblastogénica ALPL, SPP1, GPNMB, RUNX2 y BMP2 medida mediante RT-PCR tras 21 días de diferenciación osteoblastogénica con el medio propio en hOB. B) Expresión de los marcadores de diferenciación adipogénica FABP4, PLIN2, ADIPOQ, y PPARG medida mediante RT-PCR tras 21 días de diferenciación adipogénica con el medio propio en hOB. Estadística respecto al día 0. B **** *** **** ** * ** N ú m e r o de v e c e s N ú m e r o de v e c e s N ú m e r o de v e c e s Resultados 2.3. Líneas de MSCs El estudio del equilibrio osteoblasto-adipocito en cultivos de MSCs primarias es el escenario ideal. No obstante, estos cultivos son caros y la variabilidad entre donantes puede dificultar la identificación de cambios en el balance osteoblastoadipogénico. Así pues, se seleccionaron dos líneas de células mesenquimales con demostrada capacidad de diferenciación a ambos destinos celulares (C3H10T1/2 de ratón y hMSC-TERT de humano). La capacidad inductora de diferenciación de los medios propuestos se estudió a lo largo de los 21 días de diferenciación. Se empleó la expresión de ARNm de genes marcadores de ambos destinos celulares (osteoblasto y adipocito) para confirmar que los procesos de diferenciación se completaron de forma correcta. En cultivos confluentes de células C3H10T1/2 el medio propio consensuado con la literatura (medio propio) indujo la osteoblastogénesis. Los datos obtenidos demostraron que en C3H10T1/2 los genes marcadores de osteoblasto (ALPL, SPP1, GPNMB, RUNX2) aumentaron de forma significativa a lo largo del proceso de diferenciación (Figura 9A). La tinción con rojo de alizarina reveló un aumento significativo de la mineralización del cultivo celular en esta línea celular (Figura 9B). Interesantemente, un patrón de expresión génica semejante se observó en hMSC-TERT, aunque la expresión de SPP1 disminuyó y la de RUNX2 se mantuvo casi inalterada (Figura 9C). Apoyando estas diferenciaciones osteoblásticas, la tinción con rojo de alizarina reveló un aumento significativo de la mineralización de las células en cultivo en ambas líneas celulares, siendo más evidente en hMSC-TERT (Figura 9A). Igual que en la osteoblastogénesis, se estudió la adipogénesis en ambas líneas celulares mesenquimales con un medio propio AD. Este medio indujo de forma significativa la expresión de genes marcadores adipogénicos en C3H10T1/2 (Figura 10A). La tinción celular con rojo de aceite O evidenció una acumulación lipídica intracelular progresiva desde el día 7 al día 21 (Figura 10B). Como se observó en las células C3H10T1/2, el efecto del medio propio AD en las células hMSC-TERT indujo de forma significativa la expresión de los genes marcadores FABP4, ADIPOQ y PPARG, aunque la inducción de 78 Ana Alonso Pérez PPARG no fue constante a lo largo del proceso de diferenciación (Figura 10C). Es curioso como la expresión del gen marcador PLIN2 disminuyó a día 21 en esta línea celular (Figura 10C). De acuerdo con el incremento en la expresión de genes marcadores de adipogénesis a día 21, la tinción con rojo de aceite evidenció a este día un aumento significativo de la acumulación lipídica intracelular en las células hMSC-TERT (Figura 10B). No obstante, la acumulación total de lípidos, así como el tamaño de las gotas lipídicas fue mayor en las células C3H10T1/2. 79 Resultados ALPL GPNMB 80 60 40 20 0 80 ** ** *** A 30 ** 20 ** 10 * 0 ** * * * * Día 21 B Día 14 Día 7 Día 0 h M SC-TE R T C 3 H 10 T 1 / 2 Ana Alonso Pérez 81 Figura 9. Diferenciación osteoblástica de líneas celulares de MSC. A) Expresión de los marcadores de diferenciación osteoblastogénica ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2 medida mediante RT-PCR tras 21 días de diferenciación osteoblastogénica con el medio propio en C3H10T1/2. B) Tinción de depósitos de calcio con rojo de alizarina en una diferenciación osteoblastogénica durante 21 días en células C3H10T1/2 y hMSC-TERT. C) Expresión de los marcadores de diferenciación osteoblastogénica ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2 medida mediante RT-PCR tras 21 días de diferenciación osteoblastogénica con el medio propio en hMSC-TERT. Estadística respecto al día 0. ** **** ** **** C Resultados 2 / 1 82 Día 0 Día 14 Día 7 * * * * ** * A ** * * * B Día 21 h M SC-TE R T C 3 H 10 T Ana Alonso Pérez 89 A B Figura 12. Mapa de calor de la expresión de los factores de transcripción seleccionados, marcadores de diferenciación osteoblástica y adipocítica en muestras humanas de hueso. A) Expresión medida por RT-PCR de los FTx y genes marcadores de diferenciación (ALPL, SPP1, GPNMB, RUNX2, BMP2, FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) en muestras de hueso obtenidas de pacientes. B) Análisis de Fisher de la relación entre el estado de metilación de los lugares de unión de un FTx y el hecho de expresarse más o menos en las muestras de hueso analizadas. Resultados 90 Figura 13. Mapa de calor de la expresión de los factores de transcripción seleccionados, marcadores de diferenciación osteoblástica y adipocítica en muestras humanas de grasa infrapatelar. A) Expresión medida por RT-PCR de los FTx y genes marcadores de diferenciación (ALPL, SPP1, GPNMB, RUNX2, BMP2, FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) en muestras de grasa infrapatelar obtenidas de pacientes. B) Análisis de Fisher de la relación entre el estado de metilación de los lugares de unión de un FTx y el hecho de expresarse más o menos en las muestras de grasa infrapatelar analizadas. A B Ana Alonso Pérez 2.2. Correlación entre la expresión de los factores de transcripción y los marcadores de destino celular Una vez conocidos los niveles de expresión de cada FTx en los diferentes tejidos y situaciones patológicas, mediante un análisis estadístico con R, se estudió como sus expresiones correlacionaban entre sí y con los genes marcadores de diferenciación osteoblástica y adipocítica. En la figura 14A se observa la existencia de una asociación altamente significativa (p>0,0001) entre la variable signo de la correlación y el hecho de correlacionar con los marcadores de diferenciación de un destino celular u otro (osteoblastos o adipocito). Tras la identificación del potencial efecto perjudicial de alguna de las actividades de los FTX hipermetilados en el hueso representamos de forma gráfica las correlaciones de estos FTx entre sí y con los marcadores de diferenciación de ambas estirpes celulares. Dentro de las correlaciones significativas estadísticamente (p<0,05) se estableció un límite en el coeficiente de correlación (r>0,5, r<-0,5) para identificar aquellas con una relevancia biológica real. En la figura 10B se observan varios nodos de FTx y genes marcadores de diferenciación que correlacionan positivamente entre sí. Es de interés que los genes marcadores de osteoblastogénesis RUNX2, BMP2, SPP1 y ALPL correlacionan entre si formando un nodo solo conectado con los FTx por las correlaciones de SPP1 y RUNX2 con el factor 1 de choque térmico (HSF1). En la situación contraria, los marcadores de diferenciación adipogénica (ADIPOQ, PPARG, FABP4 y PLIN2) forman un nodo de correlación entre sí, pero altamente correlacionado con otros FTx como el FTx SP4. Es de relevancia como existe una agrupación de varios FTx formando un nodo de fuertes correlaciones entre sí donde se incluyen: el miembro A de la familia de FTx SIN3 (SIN3A), la proteína asociada a SIN3A de 30kDA (SAP30), la histona lisina-metiltransferasa 1 con el dominio SET bifurcado (SETDB1), la homeobox 1 de unión al E-boxing (ZEB1), la homeobox 3 PBX (PBX3), la subunidad SUZ12 del complejo represor del Polycomb (SUZ12), la subunidad α del FTx nuclear Y (NFYA), el factor respiratorio nuclear 1 (NRF1) y el FTx SP4. 91 Resultados Osteoblastogenesis Adipogenesis B 92 Figura 14. Correlaciones entre los FTx y los marcadores de diferenciación osteoblástica y adipocítica. A) Análisis de Fisher de la relación entre el signo de las correlaciones de los FTx y el hecho de correlacionar más o menos con marcadores de osteoblastogénesis (ALPL, SPP1, GPNMB, RUNX2 y BMP2) o de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG). B) Correlaciones con p<0,5 y coeficiente de correlación (r) >|0,5| entre los FTx con sus lugares de unión hipermetilados, marcadores de diferenciación osteoblsatogénica y adipogénica. A 250 **** 200 150 100 50 0 Ana Alonso Pérez 2.3. Selección de los factores de transcripción objeto de estudio Con el fin de determinar aquellos FTx más implicados en la osteoblastogénesis desde una óptica de modulación del balance osteoblástico-adipocítico, se buscaron aquellos con mayor variabilidad en su expresión entre tejidos. Examinando la figura 14B se evidenció la existencia de un nodo de FTx que correlacionaban entre sí con un alto coeficiente de correlación (r > 0,5) y suficiente potencia estadística (p < 0,05) como para suponer un trabajo coordinado entre ellos. Para determinar su potencial implicación en el equilibrio osteoblasto-adipocito y sus diferencias de expresión entre tejido óseo y graso se relacionó su expresión en ambos tejidos (Figura 15). Concordando con lo observado en la figura 14B donde el conjunto de FTx tiene varias correlaciones con la agrupación de marcadores de adipogénesis, su expresión en grasa es mayor que en hueso (Figura 15). Examinando las figuras 12A y 13A se observa que las expresiones de SETDB1, SAP30 y SP4 a lo largo de las diferentes muestras de tejido aparecen agrupadas según el dendograma. En los extremos de las diferencias entre tejidos se sitúan SUZ12 y ZEB1 como los FTx con mayor diferencia, y NFYA y PBX3 como los FTx con una menor diferencia, siendo su expresión en ambos tejidos prácticamente igual. Se sabe que SIN3A y SAP30 pertenecen al complejo histona deacetilasa. La RRF de SIN3A es menor que la de SAP30 (Figura 11) y su evidencia de asociación con otros de los FTx estudiados es menor (Figuras 12A y 13A). Teniendo en cuenta estos antecedentes seleccionamos 6 FTx: NRF1, SAP30, SETDB1, SP4, SUZ12 y ZEB1 (de aquí en adelante se empleará el término nodo para referirse al conjunto de estos 6 FTx) para examinar su efecto sobre la osteoblastogénesis y sobre el balance osteoblasto-adipocito. 93 Resultados 3. E XPRESIÓN DE LOS FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DURANTE LA OSTEOBLASTOGÉNESIS Y LA ADIPOGÉNESIS . Con el fin de establecer un papel en la regulación de la osteoblastogénesis a través de la regulación de su equilibrio con la adipogénesis se empleó el modelo in vitro descrito y optimizado en la primera sección de resultados. De esta forma, se midió la expresión de los FTx NRF1, SAP 30, SETDB1, SP4, SUZ12 y ZEB1 a los días 0, 7, 14 y 21 de diferenciación osteoblástica y adipocítica de C3H10T1/2 (Figura 16). Como se observa en la figura 16, todos los FTx pertenecientes al nodo, excepto NRF1, aumentan su expresión tras 7 de osteoblastogénesis. En la adipogénesis NRF1, SETDB1, SUZ12 y ZEB1 ven reducida su expresión a días tardíos (14 y 21 días). 94 Figura 15. Relación de la expresión de una selección de FTx en hueso y grasa. Log 2 de la ratio entre la expresión medida por RT-PCR en hueso y grasa infrapatelar de los FTx. Ana Alonso Pérez 95 Figura 16. Expresión de los factores de transcripción del nodo en la osteoblastogénesis y la adipogénesis. Expresión medida mediante RT-PCR de los FTx del nodo a días 0, 7, 14 y 21 de diferenciación osteoblástica y adipogénica de C3H10T1/2. Estadística respecto al día 0. Resultados 4. S ILENCIAMIENTO DEL NODO Buscando esclarecer el mecanismo de acción de los FTx del nodo en la osteoblastogénesis y la adipogénesis se llevó a cabo un silenciamiento de cada uno de los genes en ambos procesos. Como se ha visto en las figuras 9A y 8A a día 7 existen resultados significativos (p<0,05) de la modulación de los genes marcadores tanto de osteoblastogénesis como de adipogénesis. Por ello, y sabiendo que el efecto del silenciamiento no es estable más allá de las 96 primeras horas, se realizaron los experimentos durante los primeros 7 días de diferenciación. 4.1. Silenciamiento de NRF1 Como se muestra en la figura 17A se confirmó la eficacia del silenciamiento del gen NRF1 mediante la técnica del siRNA en el momento de inicio del experimento (día 0), reduciendo su expresión en un 63%. En el punto de control a día 7 se observó un aumento en la expresión de ALPL (Figura 18A). Al contrario, en la adipogénesis no se observó modulación de la expresión de los marcadores adipogénicos (Figura 18B). 96 Figura 17. Silenciamiento de NRF1 en C3H10T1/2. Expresión de NRF1 medida mediante RT-PCR a día 0 de diferenciación. ** N ú m e r o d e v e c e s Ana Alonso Pérez ALPL 3 # 2 1 ** 0 97 A Resultados n t n t C o C o ADIPOQ PPARG 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 98 B Figura 18. Silenciamiento de NRF1 en C3H10T1/2. A) Expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis (ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2) medida mediante RT-PCR en una diferenciación osteoblástica de C3H10T1/2 durante 7 días. B) Expresión de genes marcadores de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) medida mediante RT-PCR en una diferenciación adipocítica de C3H10T1/2 durante 7 días. Estadística * respecto al control de diferenciación. Estadística # respecto al control negativo de silenciamiento. Ana Alonso Pérez 4 .4. Silenciamiento de SP4 La expresión de SP4 disminuyó un 72% en el inicio del experimento al realizar la técnica de siRNA (Figura 23). Tras 7 días de diferenciación osteoblástica la expresión de los marcadores osteoblastogénicos no se vio modificada (Figura 24). En la adipogénesis, las expresiones de FABP4, ADIPOQ y PPARG se vieron disminuidas tras el silenciamiento del FTx SP4 (Figura 24B). Figura 23. Silenciamiento de SP4 en C3H10T1/2. Expresión de SP4 medida mediante RT-PCR a día 0. 105 **** N ú m e r o d e v e c e s Resultados ALPL SPP1 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 RUNX2 GPNMB 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 ## ** 1,0 0,5 0,0 106 A Ana Alonso Pérez FABP4 PLIN2 1,5 1,0 0,5 0,0 ## *** 1,5 1,0 0,5 0,0 ADIPOQ PPARY 1,5 1,0 0,5 0,0 # *** 1,5 1,0 0,5 0,0 Figura 24. Silenciamiento de SP4 en C3H10T1/2. A) Expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis (ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2) medida mediante RT-PCR en una diferenciación osteoblástica de C3H10T1/2 durante 7 días. B) Expresión de genes marcadores de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) medida mediante RT-PCR en una diferenciación adipocítica de C3H10T1/2 durante 7 días. Estadística * respecto al control de diferenciación. Estadística # respecto al control negativo de silenciamiento. 107 B # Resultados 4.5. Silenciamiento de SUZ12 En la figura 25 se observa el silenciamiento del gen SUZ12 con una eficacia del 70%. Transcurridos 7 días de osteoblastogénesis se observó un aumento de la expresión de RUNX2 (Figura 26A). Sin embargo, en la diferenciación adipogénica no se observaron diferencias respecto al control (Figura 26B). Figura 25. Silenciamiento de SUZ12 en C3H10T1/2. Expresión de SUZ12 medida mediante RT-PCR a día 0 de diferenciación. 108 * **** Ana Alonso Pérez ALPL SPP1 3 1,5 2 1,0 1 0,5 0 0,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 RUNX2 ### ** GPNMB 109 A 2,5 2,0 1,5 1,0 * 0,5 0,0 Resultados FABP4 PLIN2 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ADIPOQ PPARY 1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 1,0 ** 0,5 0,0 Figura 26. Silenciamiento de SUZ12 en C3H10T1/2. A) Expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis (ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2) medida mediante RT-PCR en una diferenciación osteoblástica de C3H10T1/2 durante 7 días. B) Expresión de genes marcadores de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) medida mediante RT-PCR en una diferenciación adipocítica de C3H10T1/2 durante 7 días. Estadística * respecto al control de diferenciación. Estadística # respecto al control negativo de silenciamiento. 110 B Ana Alonso Pérez 4.6. Silenciamiento de ZEB1 Una vez confirmado el silenciamiento de la expresión del gen ZEB1 (62%) en el punto inicial del experimento (Figura 27), se determinaron las modificaciones de la expresión de los marcadores osteoblásticos y adipocíticos durante una diferenciación a estos destinos celulares. La expresión de los marcadores génicos de osteoblastogénesis no se vio modificada (Figura 28A). FABP4 y PPARG fueron los marcadores adipogénicos cuya expresión se moduló con el silenciamiento de ZEB1 (Figura 28B). Figura 27. Silenciamiento de ZEB1 en C3H10T1/2. Expresión de ZEB1 medida mediante RTPCR a día 0 de diferenciación. 111 *** Resultados 112 A Ana Alonso Pérez FABP4 PLIN2 1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 ## **** 1,0 0,5 0,0 ADIPOQ PPARG 1,5 1,0 0,5 0,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Figura 28. Silenciamiento de ZEB1 en C3H10T1/2. A) Expresión de genes marcadores de osteoblastogénesis (ALPL, SPP1, GPNMB y RUNX2) medida mediante RT-PCR en una diferenciación osteoblástica de C3H10T1/2 durante 7 días. B) Expresión de genes marcadores de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ y PPARG) medida mediante RT-PCR en una diferenciación adipocítica de C3H10T1/2 durante 7 días. Estadística * respecto al control de diferenciación. Estadística # respecto al control negativo de silenciamiento. 113 B ## *** Resultados 4.7. Silenciamiento conjunto del nodo Observando los resultados de los silenciamientos de cada FTx del nodo de forma individual se aprecia una tendencia a aumentar la osteoblastogénesis y a disminuir la adipogénesis en las condiciones silenciadas. No obstante, considerando los resultados de correlación y de diferentes perfiles de expresión obtenidos en las muestras de tejido, buscamos un resultado más robusto de la implicación de estos FTx en la diferenciación de células madre mesenquimales. Sabiendo que los FTx pertenecientes al nodo correlacionan de forma positiva entre ellos, nos planteamos la hipótesis de que pudiesen realizar un trabajo colaborativo entre ellos. Con el fin de determinar esta cooperación, realizamos un silenciamiento conjunto de los FTx del nodo. En la figura 29 se observa la eficacia del silenciamiento simultáneo de todos los FTx en el punto inicial del experimento (día 0). Aunque la expresión de los genes marcadores de osteoblastogénesis no se vio modificada durante esta diferenciación (Figura 30A) sí que se observó una tendencia al alza en la expresión de todos ellos. En la diferenciación adipogénica disminuyó la expresión de todos los genes marcadores de adipogénesis (FABP4, PLIN2, ADIPOQ, PPARG) (Figura 30B). A pesar de que los genes estudiados se consideren genes específicos de osteoblastogénesis o adipogénesis, su expresión no se circunscribe únicamente a uno u otro proceso de diferenciación (210,335). Es por eso por lo que, como herramienta de validación, se decidió estudiar también la expresión de los genes marcadores de adipogénesis en las células diferenciadas a osteoblasto (Figura 30C). Interesantemente, en los puntos donde se silenció el nodo, se observó la disminución de la expresión de FABP4 de forma significativa (p<0,05) y de ADIPOQ acercándose a la significancia estadística (p=0,0596). El hecho de afectar a la expresión de un mismo gen marcador en ambas estirpes celulares sugiere su implicación en la modulación del equilibrio osteoblasto-adipocito. No solo a nivel genético, el silenciamiento del nodo también afectó a la acumulación celular lipídica evidenciada con rojo de aceite O, reduciéndose de forma dramática en este proceso (Figura 30D). Estos resultados indican la implicación del nodo en la regulación de la adipogénesis, siendo de esta forma 114 Ana Alonso Pérez 5.1. NRF1 La expresión de NRF1 en hueso articular (cadera y rodilla) no guardó relación con el sexo de los pacientes (Figura 31A). No obstante, cuando estudiamos la correlación entre su expresión y la edad de los pacientes si se observaron divergencias en función del sexo. La expresión de NRF1 en mujeres se mantuvo constante independientemente de la edad (Figura 31B) y correlacionó positivamente (r = 0,5045558) en hombres (Figura 31C) no siendo estadísticamente significativa esta correlación. La correlación entre la expresión de NRF1 y el aumento del IMC no tuvo un coeficiente de correlación alto ni suficiente potencia estadística (Figura 31D). 120 A Resultados 121 Ana Alonso Pérez Figura 31. Expresión de NRF1 en hueso en diferentes condiciones fisiopatológicas. A) Expresión de NRF1 en hueso de hombres y mujeres medida por RT-PCR. B) Correlación de la expresión de NRF1 en hueso con la edad en hombres. C) Correlación de la expresión de NRF1 en hueso con la edad en mujeres. D) Correlación de la expresión de NRF1 con el IMC. 5.2. SAP30 SAP30 es un FTx cuya expresión se mantuvo constante en hueso articular independientemente del sexo y la edad de los pacientes (Figura 32A-C). Se apreció una ligera correlación negativa con la edad en mujeres que no se observó en hombres, aunque el coeficiente de correlación no fue destacable. Interesantemente, respecto a la obesidad, el aumento del IMC correlacionó (r = 0,5775103) con la expresión de SAP30 (Figura 32D) pero no presentó una potencia significativa suficiente. 122 Resultados 123 A Ana Alonso Pérez Figura 32. Expresión de SAP30 en hueso en diferentes condiciones fisiopatológicas. A) Expresión de SAP30 en hueso de hombres y mujeres medida por RT-PCR. B) Correlación de la expresión de SAP30 en hueso con la edad en hombres. C) Correlación de la expresión de SAP30 en hueso con la edad en mujeres. D) Correlación de la expresión de SAP30 con el IMC. 124 Resultados 5.3. SETDB1 No se evidenciaron diferencias en la expresión de SETDB1 en hueso articular en lo que a sexo se refiere (Figura 33A). Si existían, al contrario, diferencias en su correlación con la edad al separar entre hombres y mujeres (Figura 33B-C). Aunque la magnitud de la correlación no fue la suficiente, si existía diferencia en su signo, negativo en el caso de las mujeres y positivo en el caso de los hombres. En lo que al aumento de IMC se refiere, la expresión de SETDB1 en las muestras óseas correlacionó fuerte (r = 0,6861985) y significativamente (p<0,05) con esta variable, confirmando así su relación con la obesidad (Figura 33D). 125 A Ana Alonso Pérez 126 Resultados Figura 33. Expresión de SETDB1 en hueso en diferentes condiciones fisiopatológicas. A) Expresión de SETDB1 en hueso de hombres y mujeres medida por RT-PCR. B) Correlación de la expresión de SETDB1 en hueso con la edad en hombres. C) Correlación de la expresión de SETDB1 en hueso con la edad en mujeres. D) Correlación de la expresión de SETDB1 con el IMC. 5.4. SP4 Aunque en principio no se apreciaron diferencias en la expresión de SP4 según sexos (Figura 34A), al estudiar la correlación con la edad en función del sexo si se vieron estas divergencias. En el caso de las mujeres no existía relación entre la edad y la expresión de este FTx (Figura 34B), pero en el caso de los hombres esta correlación no solo fue intensa (r=0,6834694) si no que fue estadísticamente significativa (p<0,05) (Figura 34C). La relación de la expresión de SP4 y el aumento del IMC no fue estadísticamente significativa (Figura 34D). 127 Ana Alonso Pérez 128 A Resultados Figura 34. Expresión de SP4 en hueso en diferentes condiciones fisiopatológicas. A) Expresión de SP4 en hueso de hombres y mujeres medida por RT-PCR. B) Correlación de la expresión de SP4 en hueso con la edad en hombres. C) Correlación de la expresión de SP4 en hueso con la edad en mujeres. D) Correlación de la expresión de SP4 con el IMC. 129