Cambios en la expresión de neurotransmisores inhibidores en respuesta a la lesión y durante la regeneración espinal en la lamprea de mar

CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE NEUROTRANSMISORES INHIBIDORES EN RESPUESTA A LA LESIÓN Y DURANTE LA REGENERACIÓN ESPINAL EN LA LAMPREA DE MAR Tesis Doctoral SILVIA M. VALLE MAROTO Santiago de Compostela, 2017 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL ÁREA DE BIOLOGÍA CELULAR Universidad de Santiago de Compostela DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL FACULTAD DE BIOLOGÍA PROGRAMA DE DOCTORADO EN NEUROCIENCIA (UNIVERISDAD DE VIGO, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y UNIVERSIDAD DE A CORUÑA) Cambios en neurotransmisores inhibidores durante regeneración espinal en lampreas MEMORIA Que para optar al Grado de Doctor presenta SILVIA M. VALLE MAROTO Santiago de Compostela, 2017 MARÍA CELINA RODICIO RODICIO, CATEDRÁTICA DE BIOLOGÍA CELULAR DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y ECOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y BLANCA FERNÁNDEZ LÓPEZ, INVESTIGADORA POSTDOCTORAL EN EL INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY DE LA UNIVERSITY OF HELSINKI CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada “Cambios en la expresión de neurotransmisores inhibidores en respuesta a la lesión y durante la regeneración espinal en la lamprea de mar”, que para optar al Grado de Doctor presenta Dña. SILVIA M. VALLE MAROTO, ha sido realizada bajo su dirección, y considerando que constituye trabajo de TESIS DOCTORAL, autorizan su presentación a la Comisión Académica correspondiente. Y para que así conste expide el presente certificado en Santiago de Compostela, a 27 de febrero de 2017 Las Directoras de Tesis La Doctoranda Silvia M. Valle Maroto Blanca Fernández López M. Celina Rodicio Rodicio La investigación realizada ha sido financiada con los siguientes proyectos: Estudio Inmunohistoquímico de los sistemas aminoacidérgicos durante el desarrollo del sistema nervioso central de la lamprea de mar. Referencia BFU2007-61056 Financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología y fondos FEDER. Consolidación e Estruturación de Unidades de Investigación Competitivas GI-1256 Referencias INCITE09ENA200036ES y GPC2014/030 Financiados por la Xunta de Galicia. Estudio de los cambios en los sistemas de neurotransmisores durante la regeneración espinal en lampreas. Referencia BFU2010-17174 Financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología y fondos FEDER. Me gustaría comenzar estas líneas poniendo en valor el trabajo de todas las personas que se dedican a la búsqueda del conocimiento, cualquiera que sea su función dentro de esta. Considero que sólo desde el conocimiento se pueden desarrollar las personas y como consecuencia la sociedad. Mis primeros agradecimientos van dirigidos hacia mis directoras, M. Celina Rodicio Rodicio y Blanca Fernández López. En primer lugar, Celina, gracias por darme la oportunidad de realizar los estudios de posgrado, gracias por aceptarme en tu grupo de investigación y por facilitarme poder terminar este proyecto. Blanca, amiga, sin ti nunca podría haber terminado este trabajo. Fuiste la primera persona que conocí en este viaje y has terminado siendo mi guía. Gracias a mis compañeros de laboratorio Antón, Dani S., Dani R., Pablo, Blanca y Maru, buena amiga durante el tiempo que viví en Santiago y que ocupó un puesto importantísimo en mis principios en el laboratorio y que lo va a ocupar en el final de este trabajo. Me hubiera gustado compartir más tiempo con vosotros, pero las circunstancias no me lo permitieron, sin embargo haya sido éste mayor o menor, siempre ha sido un placer y a pesar de la distancia, os considero mis compañeros. Aprovechando este momento para agradecer toda la ayuda que me habéis brindado. Gracias a mis amigas y amigos, siempre pendientes de mi progreso, ofreciéndome ayuda técnica, alojamiento o simplemente aguantando mis monólogos interminables sobre la tesis y las lampreas. Y sobre todo gracias por lo bien que nos lo hemos pasado, nos lo pasamos y, aunque intentemos remediarlo, lo pasaremos… Los últimos agradecimientos y más importantes son para mi familia. Por apoyarme no sólo durante este proceso, sino durante toda la vida y en todo lo que concierne a la misma, da igual lo que pasé porque sé que estáis a mi lado. Esta tesis está dedicada a mi sobrina Ani porque ha crecido viéndome estudiar lampreas sin comprender muy bien lo que hacía y que tras años y años de trabajo me ayudado a darle las últimas pinceladas. No se puede querer más. Introducción general Página 13 INTRODUCCIÓN GENERAL Lesión medular En España, se estima que la incidencia anual de daño por traumatismo en la médula espinal es de 30 casos por cada millón de habitantes, lo que supone unos 1000 nuevos casos cada año, con aproximadamente el 80 % de las lesiones en personas cuya edad está comprendida entre los 16 y 45 años (datos del Servicio de Información sobre Discapacidad, Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad). En los mamíferos (y, por tanto, en los seres humanos), las lesiones medulares causan daños permanentes e irreversibles, debido, principalmente, a la ausencia de regeneración de las conexiones neuronales que se ven interrumpidas tras la lesión. La baja capacidad regenerativa se debe a factores extrínsecos, como la liberación de moléculas inhibidoras del crecimiento axónico tras la lesión y a factores intrínsecos, como la baja capacidad de regeneración de los axones de las neuronas del sistema nervioso central (SNC). Además, tras una lesión medular, debido a procesos inflamatorios, se produce una muerte masiva de neuronas y células gliales que no son reemplazadas (revisado en Rodicio y Barreiro-Iglesias, 2012). Dado que las lesiones medulares constituyen un grave problema personal, social y económico es necesario avanzar en el conocimiento de los factores que impiden o promueven la regeneración con el fin de aportar datos que a la larga permitan el diseño de terapias efectivas. A diferencia de lo que ocurre en mamíferos, las lampreas y algunas especies de peces, anfibios y reptiles son capaces de recuperar la motilidad después de una lesión medular y constituyen modelos efectivos para el estudio de las condiciones y los factores que permiten lograr la recuperación de la función. La lamprea como modelo en neurobiología y regeneración Las lampreas, junto con los mixinos, son los representantes vivos más antiguos de los vertebrados. Pertenecen al grupo de los agnatos (peces sin mandíbula) (Hubbs y Potter, 1971; Mallatt y Winchell, 2007; Janvier, 2010), también denominados ciclóstomos, y ocupan una posición filogenética única entre los Amphioxus (procordados) y los gnatostomados (vertebrados con mandíbula) (Hardisty, 1983; Kuratani y col., 2002; Takezaki y col., 2003). Las lampreas se distribuyen en las zonas templadas de ambos hemisferios y se pueden encontrar tanto en aguas dulces como saladas. Muchas especies de lamprea son parásitas y se alimentan de sangre y linfa al fijar su ventosa bucal a la piel de diferentes peces. Sin embargo, todas las lampreas pueden alimentarse también de pequeños invertebrados. Silvia M. Valle Maroto Página 14 Posición filogenética de las lampreas, tomado de Green y Bronner, 2014. La lamprea de mar, Petromyzon marinus, es la especie de lamprea que se puede encontrar en los ríos de Galicia y la que se ha utilizado en este estudio. Tiene un complejo ciclo de vida que empieza en el río con el periodo embrionario, que dura aproximadamente 12 días, al que le siguen un corto periodo prolarvario, en el que se alimentan del vitelo almacenado y un largo periodo larvario, durante el cual viven enterradas en el fango y se alimentan por filtración. Mediante una compleja metamorfosis las larvas se transforman en jóvenes adultos. Los cambios durante la metamorfosis incluyen: una reorganización radical de los órganos internos, la erupción y maduración de los ojos, modificación de la región prebranquial, que da lugar a la formación de un disco oral especializado para la succión, desarrollo de dientes y de otras estructuras bucales, transformación de la estructura de las branquias para permitir la respiración tidal y conversión de una larva que vive enterrada y se alimenta por filtración en un depredador nadador Joven adulto de lamprea de mar Introducción general Página 15 eficiente. Terminada completamente la metamorfosis, los jóvenes adultos migran al mar, donde viven durante uno o dos años como parásitos de otros peces. Tras este tiempo regresan al río para aparearse y, tras la puesta, mueren (Hardisty y Potter, 1971). El sistema nervioso central de las lampreas (revisado en Nieuwenhuys and Nicholson, 1998), puede ser considerado el prototipo de los vertebrados debido a que posee todas las características básicas del sistema nervioso central de los vertebrados, pero con muchas menos neuronas que en mamíferos. Algunas de sus neuronas son células de proyección espinal gigantes que son fácilmente indentificables. La posición filogenética de las lampreas y su complejo ciclo de vida han hecho que sean un modelo atractivo y muy utilizado en estudios de evolución y desarrollo (evodevo) (revisiones en Kuratani y col., 2002 y Osorio y Rétaux., 2008) y en estudios centrados en descifrar los cambios adaptativos a los diferentes estilos de vida de las larvas y los adultos. La simplicidad de su sistema nervioso, junto con su accesibilidad, facilidad de manipulación y Ciclo de vida de la lamprea de mar Silvia M. Valle Maroto Página 16 capacidad de supervivencia del tejido in vitro, las han convertido también en un modelo adecuado para determinar las redes y circuitos neuronales implicados en el proceso de locomoción en los vertebrados (Grillner y col., 2008). Estos estudios han hecho que las lampreas sean los organismos que han proporcionado una información más detallada a nivel celular y de redes neuronales acerca de dicho proceso. La facilidad de identificación y manipulación de las neuronas gigantes del cerebro de las lampreas ha permitido que se utilicen también como modelo para estudiar los efectos citotóxicos de proteínas relacionadas con la enfermedad de Alzheimer (Hall, 1999; Hall y col., 2000; Honson y col., 2009; Lee y col., 2012). En la actualidad, y desde mediados del siglo pasado, las lampreas también se utilizan como un modelo interesante en estudios de regeneración del SNC, ya que después de una sección medular completa son capaces de recuperar la locomoción espontáneamente (Shifman y Selzer, 2007). En 1980, el NIH propuso cinco criterios que se deben cumplir para demostrar Esquema del cerebro de la lamprea Introducción general Página 17 la existencia de regeneración funcional de la médula espinal (Guth y col., 1980). Dichos criterios son los siguientes: 1.- La lesión experimental debe causar desconexión de las prolongaciones nerviosas. 2.- Las prolongaciones de las neuronas del sistema nervioso central deben ser capaces de atravesar la región de la lesión. 3.- Las fibras regeneradas deben realizar contactos sinápticos. 4.- Las fibras regeneradas deben generar respuestas postsinápticas. 5.- Los cambios en la función deben derivarse de las conexiones regeneradas. Hasta el momento, la lamprea es el único vertebrado en el que se ha demostrado que se cumplen los cinco criterios. Recientemente, las lampreas también han sido propuestas como modelo para los estudios de regeneración desde el punto de vista evolutivo, para los cuales se ha acuñado el término evo-rego (Barreiro Iglesias, 2012). La médula espinal de la lamprea La médula espinal de la lamprea es aplanada, lo que facilita la difusión de oxígeno y metabolitos a su interior ya que carece de vasos sanguíneos. En sección transversal, se distinguen: la sustancia gris, que ocupa una posición central, rodea el canal central y se expande lateralmente y la sustancia blanca, situada en la periferia y que, aunque recibe este nombre, no tiene color blanco ya que los axones de la lamprea son amielínicos. En la sustancia blanca hay cuerpos de neuronas emigradas, prolongaciones dendríticas y contactos sinápticos. Las raíces dorsales y ventrales presentan alternancia debido al curso intramiotómico de las raíces dorsales y de la finalización intramiotómica de las raíces ventrales, por lo que no forman nervios espinales mixtos (Nieuwenhuys y Nicholson, 1998). Silvia M. Valle Maroto Página 18 Esquema de la médula espinal de lamprea En la médula espinal se distinguen tres tipos celulares según su función: - Células dorsales: son células sensitivas primarias situadas en posición dorsomedial, formando dos filas longitudinales. Tienen una prolongación periférica (que sale con las raíces dorsales y termina en la piel, donde recibe estimulación mecánica), una prolongación rostral larga que cursa en la columna dorsal y una ventral corta. - Células motoras: situadas en la parte ventrolateral de la sustancia gris formado dos columnas longitudinales. Pueden ser somáticas o viscerales. - Interneuronas: sus prolongaciones permanecen en el SNC. Son heterogéneas en cuanto a posición, distribución, tamaño, morfología y conexiones (revisiones en Rovainen, 1979; Buchanan, 1996; 1999; 2001). En función de estos criterios se clasifican en: - Gigantes: situadas únicamente en el tercio caudal de la médula, son células sensitivas de segundo orden cuyos axones proyectan contralateral y rostralmente pudiendo acabar en la médula o en la parte posterior del cerebro. - Laterales: son las interneuronas más grandes de la parte rostral de la médula espinal de lamprea, su axón proyecta ipsilateral y caudalmente e inhiben interneuronas caudales cruzadas. -Interneuronas caudales contralaterales: participan en la red locomotora espinal. Su inhibición provoca la activación del lado opuesto de la médula. - Interneuronas excitadoras: también participan en la red locomotora y tienen un papel en la generación del ritmo. - Interneuronas inhibidoras: son otro componente de la red locomotora, responsables de la alternancia derecha-izquierda del patrón locomotor. - Células del borde: están situadas en los tractos laterales, generalmente contra el borde ventrolateral de la médula espinal. Son receptores de tensión y pueden ser excitadoras que contactan con neuronas ipsilaterales o inhibidoras, cuyas prolongaciones cruzan la línea media inhibiendo neuronas contralaterales. - Células que contactan con el líquido cerebroespinal (CSFc): se sitúan alrededor del canal central, al que envían una prolongación. Son de distintos tipos atendiendo al neurotransmisor que expresan. La sustancia blanca se divide en tres funículos: dorsal, lateral y ventral. Por ellos corren tractos ascendentes, descendentes e intrínsecos. Los tractos ascendentes largos son la columna dorsal y el lemnisco lateral. Por la columna dorsal cursan fibras sensitivas procedentes de las células de los ganglios de las raíces dorsales y de las células dorsales, que llevan información sensorial de la piel al tronco cerebral. El lemnisco espinal está formado por fibras que cursan por el fascículo lateral Introducción general Página 19 llevando información sensitiva al cerebro e información de los patrones motores al tronco cerebral. Los tractos descendentes son el retículoespinal y el vestíbuloespinal. Varios estudios han mostrado la citoarquitectura de las neuronas que proyectan a la médula en el cerebro de la lamprea de mar (Ronan, 1989; Swain y col., 1993; Davis y McClellan, 1994, Barreiro-Iglesias y col., 2008a; b). El tracto reticuloespinal tiene su origen en las células reticulares del núcleo del fascículo longitudinal medial situado en el diencéfalo y de los núcleos reticulares mesencefálico y rombencefálicos (el sistema reticuloespinal será tratado con más detalle a continuación). El sistema vestibuloespinal consta de alrededor de 400 neuronas y se localiza a nivel de los núcleos octavomotor intermedio (Bussières y col., 1999) y posterior (Pombal y col., 1994¸ Bussières y col., 1999) y proyecta sólo a la médula espinal rostral. Los tractos intrínsecos están formados por fibras intersegmentales cortas mediadoras de reflejos (Ariens Kappers, 1947). Además de las neuronas y sus prolongaciones, otro componente importante de la médula espinal de la lamprea es la glía, constituida por los ependimocitos y los astrocitos. Los ependimocitos rodean el canal central y tienen una corta prolongación apical y una larga prolongación lateral. Los cuerpos de los astrocitos forman una banda en la sustancia gris que se prolonga lateralmente hacia la sustancia blanca. Sus prolongaciones se extienden radialmente hasta las superficies dorsal y ventral de la médula. Las células gliales de la lamprea tienen citoqueratinas y carecen de proteína ácido fibrilar glial. El sistema reticuloespinal de la lamprea Varios estudios han mostrado la citoarquitectura de las neuronas que proyectan a la médula en el cerebro de la lamprea de mar (Ronan, 1989; Swain y col., 1993; Davis y McClellan, 1994, Barreiro-Iglesias et al., 2008a; b). El sistema descendente en lamprea adulta consta de aproximadamente 2400 neuronas reticuloespinales. La mayoría de estas células, aproximadamente 2000, se originan en los núcleos reticulares (Swain y col., 1993) Esquema mostrando las células de glía de la médula espinal de la lamprea. Silvia M. Valle Maroto Página 20 considerados tradicionalemente como mesencefálicos y rombencefálicos, aunque parte de las neuronas más rostrales son diencefálicas. El núcleo reticular mesencefálico (MRN) contiene alrededor de 90 células reticuloespinales que proyectan ipsilateralmente a la médula espinal, incluidas tres células de Müller (M1-M3) a cada lado de la línea media (Bussières y col., 1999; Dubuc y col., 2008). El resto de las neuronas reticuloespinales se localizan a nivel rombencefálico. La formación reticular rombencefálica ha sido dividida en tres o cuatro regiones dependiendo de los distintos tipos de estudios e investigadores. Cuatro regiones fueron descritas y/o utilizadas por Koyama y col. (1989), Ronan y Northcutt (1990), Pombal y col. (1997, 2001, 2006) y VillarCerviño y col. (2008a, 2009): formación reticular ístmica (IsRF), formación reticular trigeminal (TRF), formación reticular medial (MRF) y formación reticular posterior (PRF). Sin embargo, otros autores como Nieuwenhuys (1977), Ronan (1989) y Davis y McClellan (1994) clasifican los núcleos en tres grupos: núcleo rombencefálico reticular anterior (ARRN), núcleo rombencefálico reticular medial (MRRN) y núcleo rombencefálico reticular posterior (PRRN). Los núcleos medio y posterior son equivalentes en las dos nomenclaturas, la diferencia está en el núcleo anterior, en el que los autores que establecen cuatro regiones subdividen este núcleo reticular anterior en dos. La región más rostral se localiza a nivel del istmo (IsRF). La segunda región se sitúa a nivel del núcleo motor del nervio trigémino (TRF). El ARRN contiene alrededor de 90 células en la lamprea adulta, de las cuales, alrededor del 30% proyectan contralateralmente (Dubuc et al., 2008). Este núcleo incluye las células de Müller (I1-I6) que proyectan ipsilateralmente, Los núcleos rombencefálicos reticulares más caudales contienen el 90% de todas las células reticuloespinales. El MRRN tiene aproximadamente 330 células reticuloespinales, de las que el 20% proyectan al lado contralateral, incluida la célula de Mauthner, que envía un prominente axón a la región dorsolateral de la médula espinal (Rovainen, 1967; Dubuc y col., 2008). En el MRRN también se encuentran las células de Müller B1-B6, todas ellas con proyección ipsilateral, El PRRN es el núcleo reticular de mayor tamaño. Se extiende rostrocaudalmente por la mitad posterior del rombencéfalo y consta de alrededor de 730 células reticuloespinales, de las cuales aproximadamente un 16% proyectan contralateralmente (Dubuc y col., 2008). Introducción general Página 21 Esquema que muestra una vista dorsal del cerebro de la lamprea de mar con la localización de las neuronas reticuloespinales, que son identificables individualmente, de los núcleos reticuloespinales y de los núcleos motores de los nervios craneales. B1-B6: células de Müller de la región bulbar; D: diencéfalo; hab.-ped. tr.: tracto habenulopeduncular; I1-I6: células de Mller de la región ístmica; inf.: infundíbulo; Isth: istmo; isth. retic.: formación reticular ístmica; IX: núcleo motor del glosofaríngeo; M1-M4: células de Mller 1 a 4; Mes: mesencéfalo; Mth: células de Mauthner; Mth’: células de Mauthner auxiliares; Rh: rombencéfalo; SC: médula espinal; s.m.i.: sulco mediano inferior; Vm: núcleo motor del trigémino; X: núcleo motor vagal. (Tomado de Rodicio y Barreiro Iglesias, 2012). Silvia M. Valle Maroto Página 22 El circuito locomotor en lampreas Al igual que en el resto de los vertebrados, el circuito locomotor incluye los circuitos espinales que coordinan los movimientos básicos en la propulsión. Estos circuitos se localizan en los centros generadores de patrones (CPGs), en los sistemas comando del tronco encefálico y en los sistemas de control (revisión en Grillner y Wallén, 1985). El circuito locomotor de lamprea (tomado de Grillner y col., 2008) En la lamprea, estos circuitos están inhibidos durante el reposo y necesitan ser activados desde centros comando localizados a nivel del tronco encefálico, las regiones locomotoras mesencefálica (MLR) y diencefálica (DLR). Éstas regulan el nivel de actividad de los CPGs espinales a través de las neuronas reticuloespinales (Grillner y col., 2008). Además de ser iniciada, la locomoción debe tener la capacidad de adaptarse en respuesta a entradas comportamentales específicas o a diversas perturbaciones, como por ejemplo, cuando la cabeza del animal contacta con una superficie sólida. La formación reticular rombencefálica integra la información sensorial, visual y vestibular, que controla la orientación, así como la postura y la información motora procedente de los ganglios basales (Deliagina y col., 1992; 1993; 2000; Deliagina y Fagerstedt, 2000). De este modo, inicia la locomoción y ejerce efectos modificadores sobre los circuitos espinales que son necesarios JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Justificación y objetivos Página 31 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS El presente trabajo se encuadra dentro de los estudios que nuestro grupo está realizando sobre el posible papel de los neurotransmisores en la regeneración espinal. Como objetivo de esta tesis doctoral nos hemos propuesto analizar los cambios que tienen lugar en los sistemas de neurotransmisores inhibidores (GABAérgico y glicinérgico) de la médula espinal de la lamprea de mar en respuesta a la lesión medular y durante la regeneración. La identificación de los cambios que tienen lugar en la médula espinal en vertebrados que recobran espontáneamente la locomoción después de una lesión medular puede ofrecer pistas para determinar los factores clave que conducen a la recuperación de la función y para descifrar los mecanismos de plasticidad que tienen lugar durante el proceso de regeneración. Se sabe que en la médula espinal de la lamprea los sistemas GABAérgico y glicinérgico de la médula espinal constan de un componente intrínseco constituido por neuronas espinales y sus prolongaciones, y, en el caso del sistema glicinérgico, también de un componente extrínseco formado por fibras descendentes procedentes de neuronas localizadas en el tronco cerebral. Un paso previo para determinar los cambios en los distintos sistemas implicados en la locomoción es conocer su organización en el animal intacto. A pesar de la abundancia de estudios sobre las proyecciones reticuloespinales en lampreas, es muy poco lo que se conoce sobre las proyecciones reticuloespinales inhibidoras. Ya que los anticuerpos generados contra neurotransmisores aminoacidérgicos marcan el soma de las neuronas en el sistema nervioso central en lampreas (Meléndez-Ferro y col., 2002,2003; Robertson y col., 2007; Villar-Cerviño y col., 2008a; b; 2009), hemos decidido empezar por caracterizar las proyecciones reticuloespinales inhibidoras mediante la combinación de técnicas de trazado neuronal retrógrado y técnicas de inmunofluorescencia. Por ello, los objetivos concretos de este trabajo son: 1.- Estudiar el patrón de distribución de las neuronas reticulares glicinérgicas de proyección espinal. 2.- Conocer si existen neuronas reticulares GABAérgicas que proyecten a la médula espinal y en caso afirmativo estudiar su patrón de distribución. 3.- Conocer si hay neuronas reticuloespinales inhibidoras que colocalicen glicina y GABA. 4.- Analizar los cambios de expresión de los neurotrasmisores inhibidores en respuesta a la lesión. Para ello, analizaremos el patrón de expresión espaciotemporal de la inmunorreactividad a GABA y glicina durante la primera semana después de la sección completa de la médula espinal. Silvia M. Valle Maroto Página 32 5.- Analizar los cambios de expresión de los neurotransmisores inhibidores durante la regeneración medular en larvas de lamprea de mar. Los resultados y la discusión de esta tesis doctoral han sido organizados en tres apartados: 1.- Proyecciones rombencefálicas inhibidoras descendentes en larvas de lamprea de mar. Las proyecciones descendentes inhibidoras se analizaron mediante la combinación de técnicas de trazado neuronal con la detección inmunofluorescente de los neurotransmisores glicina y GABA. 2.- Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en respuesta a una lesión medular en lamprea de mar. La lesión medular consistió en una sección medular completa a nivel de la quinta branquia y los cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores se detectaron mediante técnicas de inmunofluorescencia. 3.- Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en la médula espinal de la lamprea de mar durante la regeneración. Estos cambios se analizaron usando técnicas de inmunofluorescencia para la visualización de los neurotransmisores GABA y glicina en las células y sus prolongaciones. Además se investigó la proporción de neuronas espinales de proyección ascendente o descendente mediante la combinación de técnicas de trazado neuronal con la detección inmunofluorescente de los neurotransmisores glicina y GABA. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos Página 35 MATERIAL Y MÉTODOS Declaración ética Todos los experimentos llevados a cabo en el presente estudio han sido aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Santiago de Compostela y por la Consellería do Medio Rural e do Mar de la Xunta de Galicia (JPLV/IId) y han sido realizados de acuerdo con las directrices españolas y de la Unión Europea sobre bienestar animal y experimentación. Individuos Para la realización de este estudio se han empleado larvas de lamprea de mar Petromyzon marinus L. (n = 94). Como la edad de las larvas no es conocida y existe una relación entre la longitud corporal y la edad (Ooi y Youson, 1976, Purvis, 1979; Rubinson y Cain, 1989), en este trabajo, las larvas se caracterizaron por su longitud corporal. Para el estudio de las proyecciones rombencefálicas inhibidoras descendentes en larvas de lamprea de mar se utilizaron 10 larvas de lamprea de un tamaño comprendido entre 50 y 140 mm. Para el estudio de la respuesta aguda de los sistemas inhibidores a la lesión medular se han utilizado 41 larvas [3 control y 41 lesionadas (0, n=8; 1, n=8; 2, n=6; 3, n=6; 4, n=5, 7, n=8 días postlesión (dpl)]. Para el estudio de los cambios en los sistemas inhibidores durante la regeneración mediante técnicas de inmunofluorescencia se usaron 41 larvas [9 control y 32 lesionadas (0dpl, n=9 y 2, n=5; 4, n=6; 10, n=7; 24, n=5 semanas post-lesión (spl)]. Para poner de manifiesto las neuronas con proyección ascendente o descendente se usaron 2 larvas. Todas las larvas utilizadas para los estudios de la respuesta aguda a la lesión y los cambios de los sistemas de neurotransmisores inhibidores durante la regeneración, excepto un animal de 80 mm y otro de 156 mm, tenían un tamaño corporal comprendido entre 90 y 125 mm de longitud. Las larvas fueron distribuidas al azar y homogéneamente entre los distintos tipos de experimentos. Por tanto, para las lesiones de médula espinal se utilizaron larvas maduras (de cerca de 100 mm de longitud corporal o mayores). Estas larvas tienen una edad de 5 años o más y su sistema reticuloespinal está totalmente desarrollado a lo largo de toda la médula espinal, por lo que no hay confusión entre posibles procesos de desarrollo y regeneración (Shifman y col., 2007). De hecho, la mayor parte de los estudios de regeneración espinal en lampreas se han realizado en larvas maduras. Los animales se capturaron en el río Ulla (Galicia, noroeste de España), con el permiso de la Consellería do Medio Rural e do Mar de la Xunta de Galicia, y se mantuvieron en un acuario con sedimento de río y condiciones de temperatura y aireación adecuadas. Silvia M. Valle Maroto Página 36 Cirugía Los animales se anestesiaron profundamente mediante su inmersión en metanosulfonato de tricaína (MS-222; Sigma, St. Louis, MO) diluído en solución Ringer (pH 7.4) de composición: NaCl 137 mM, KCl 2.9 mM, CaCl2 2.1 mM, HEPES 2 mM. Las larvas se colocaron con el lado dorsal hacia arriba en una placa revestida de Sylgard, llena de solución Ringer. La médula espinal se expuso mediante una incisión transversal en la pared corporal a nivel de la quinta branquia. Con un bisturí se realizó una sección completa de la médula espinal, visualizando los extremos cortados de la médula bajo la lupa. Tras la cirugía, las lampreas se mantuvieron en hielo durante 1 hora para permitir que la herida se secara al aire (excepto aquellas procesadas inmediatamente después de la lesión). Durante esta hora, los animales se mantuvieron sobre una toalla de papel empapada en solución Ringer evitando el contacto directo con el hielo. Después de este tiempo, se dejó recuperar a los animales en tanques de agua dulce con aireación, a una temperatura de 19.5ºC, dado que se sabe que las lampreas pueden recuperar su locomoción normal a esta temperatura (Cohen y col., 1999). Cada animal lesionado se examinó 24 horas después de la cirugía para confirmar que no era capaz de realizar movimientos caudalmente al lugar de la lesión. La sección espinal se considera completa si al estimular la cabeza, el animal sólo puede mover el cuerpo rostralmente a la lesión. Trazado retrógrado El trazado retrógrado se utilizó para determinar el origen de las proyecciones inhibidoras descendentes a la médula espinal y para analizar si las neuronas espinales que pierden el fenotipo inhibidor después de una lesión medular son capaces de volver a expresar los neurotransmisores inhibidores. En ambos casos el trazado retrógrado se combinó con inmunohistoquímica. Para determinar el origen de las proyecciones inhibidoras descendentes se realizaron experimentos de trazado neuronal retrógado empleando neurobiotina (NB; 322.8 Da; Vector Laboratories, Burlingame, CA) como trazador. Las larvas de lamprea se anestesiaron profundamente con benzocaína (0.05 %; Sigma, St. Louis, MO) y la médula espinal se expuso mediante una incisión realizada en la región dorsal del cuerpo a nivel de la tercera branquia. El trazador se aplicó en la médula espinal a este nivel con la ayuda de una minucia (tamaño: #000; diámetro: 0.25 mm). La incisión se selló con pegamento quirúrgico (Hystoacril, B. Braun Surgical, Melsungen, Alemania). Los animales se mantuvieron en solución Ringer con aireación, a 4º C durante 3 días para permitir el transporte de la NB desde el punto de inyección en el axón hasta el soma neuronal en el cerebro. Los tiempos de transporte utilizados se obtuvieron en base a resultados de experimentos control llevados a cabo para comprobar el tiempo de transporte óptimo para este trazador en larvas de lamprea de mar (Barreiro-Iglesias y col., 2008b). Para poner de manifiesto las neuronas espinales con proyección ascendente o descendente se usó el mismo protocolo, pero la aplicación del trazador se realizó a nivel de la quinta branquia, en el lugar de la lesión (aplicándolo en ambos extremos cortados de la médula) y los animales se dejaron recuperan 2 semanas después de su procesamiento. Material y métodos Página 37 Procesamiento del tejido Todos los animales se anestesiaron profundamente con MS-222 al 0.1% diluido en solución Ringer y se sacrificaron por decapitación. Para los estudios histológicos se procesaron los animales control, los animales a los que se les aplicó un trazador después del tiempo de transporte del mismo, y los animales lesionados, con o sin aplicación del trazador después de los diferentes periodos de recuperación tras la lesión.. La cabeza hasta la segunda branquia (en los animales destinados al estudio de las proyecciones descendentes) o la región del cuerpo comprendida entre la 4ª6ª branquia (en los animales destinados al estudio de los cambios después de la lesión y durante la regeneración) se fijaron por inmersión en glutaraldehído al 5% y metabisulfito sódico (MB) al 1% en Tris salino (TBS; pH 7.4) durante 20 horas. Una vez fijado, el tejido se embebió en Neg 50 TM (Microm International GmbH, Walldorf, Alemania). A continuación se congeló en isopentano enfriado con nitrógeno líquido y se realizaron secciones transversales de 14 µm de grosor en un criostato, colocando los cortes en portas de vidrio Superfrost Plus ® (Menzel, Braunschweig, Alemania). Inmunofluorescencia La técnica de inmunofluorescencia se utilizó para poner de manifiesto la expresión de GABA y glicina. Las secciones se pretrataron con NaBH4 0.2 % en agua destilada durante 45 minutos a temperatura ambiente para eliminar la autofluorescencia inducida por el glutaraldehído. Las secciones se incubaron durante 3 días a 4ºC en mezclas de diferentes anticuerpos: anticuerpo policlonal contra glicina obtenido en conejo (Immunosolution, Jesmond, Australia; código IG1003, lote 1953; dilución 1:3000), anticuerpo monoclonal contra GABA obtenido en ratón (Sigma; clon GB-69, No A 0310, dilución 1: 1200), anticuerpo policlonal contra GABA obtenido en conejo (Affiniti, Mamhead, UK; 1:500), anticuerpo monoclonal contra citoqueratinas (LCM29) obtenido en ratón ( generosamente donado por el Dr. Selzer, Philadelphia; 1:100) o un ), anticuerpo monoclonal contra HuC/HuD obtenido en ratón (Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands; 1:100) (ver comentario). A continuación se incubó durante 1 hora con una mezcla de inmunoglobulina de cabra anti-conejo conjugada con Cy3 (Chemicon, Temecula, CA; 1:200) e inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con Cy5 (Chemicon; 1:100; en el estudio de las proyecciones descendentes) o conjugada con FITC (Chemicon; 1:100; en el estudio de los cambios después de la lesión y durante la regeneración). Todos los anticuerpos se diluyeron en TBS que contenía un 1% de MB, 0.2 % de Triton X-100 y un 15 % de suero normal de cabra. Para la detección indirecta del trazador, las secciones se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente con fluoresceína isotiocianato (FITC)-marcada con avidina D (Vector, Burlingame, CA; 1:1000) en TBS con 0.3% Triton X-100. Las secciones se lavaron con agua destilada y se montaron con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield; Vector). Anticuerpos La especificidad del anticuerpo policlonal anti-glicina se ha caracterizado con anterioridad (Villar-Cerviño y col., 2008a). El anticuerpo anti-glicina (Inmunosolution) se elaboró contra tiroglobulina porcina conjugada con glicina y el proveedor lo probó en Silvia M. Valle Maroto Página 38 secciones de retina y cerebelo de varios mamíferos y otros vertebrados así como en inmunoensayos dot blot con una variedad de aminoácidos encontrados en proteínas y con los aminoácidos no proteicos D-serina, D-alanina y D-aspartato; con GABA y con el tripéptido que contiene glicina, glutatión (GSH) y ninguno produjo reactividad significativa. Este anticuerpo ha sido desarrollado por Dr. David V. Pow (University of Newcastle, Newcastle, New South Wales, Australia) y utilizado en un gran número de estudios en neuronas glicinérgicas de la retina, cerebro y médula espinal. Para los controles de procesamiento de tejido, el antisuero primario se omitió en algunas secciones de tejido. No se observó tinción es estos controles. Además, se realizó Western blot con extractos de proteína de lamprea (VillarCerviño y col., 2006; resultados no publicados) y no se tiñó ninguna banda de proteína en estos blots. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-GABA se ha utilizado con anterioridad en nuestro laboratorio (Villar-Cerviño y col., 2008b). El anticuerpo se elaboró contra GABA conjugado con albúmina de suero bovina (BSA) y glutaraldehído. La actividad y especificidad fueron evaluadas por el proveedor mediante inmunoensayos dot blot. No se observó actividad cruzada con BSA, ácido Lγ-aminobutirico, ácido L-glutatámico, ácido Laspártico, glicina, ácido ∂-aminovalérico, L-treonina, L-glutamina, taurina, putrescina, L-alanina o carnosina. El anticuerpo mostró una reacción cruzada débil con β-alanina. Además, las secciones de cerebro y retina de lamprea de mar incubadas con el anticuerpo revelaron el mismo patrón de marcaje revelado en con otros anticuerpos anti-GABA (Meléndez y col., 2001, 2002, 2003; Villar-Cerviño y col., 2006, 2008b; Robertson y col., 2007). La preadsorción del anticuerpo de GABA con BSA no bloqueó la inmunotinción en lamprea. No se detectó inmunorreactividad cuando el anticuerpo primario fue omitido en el procedimiento inmunohistoquímico. Además, se realizó Western blot con extractos de proteínas de cerebro de lamprea (resultados no publicados) y no se tiñó ninguna banda de proteína en estos blots. La especificidad del anticuerpo policlonal anti-GABA ha sido caracterizada por el proveedor mediante ELISA contra conjugados de BSAglutaraldehído. Este anticuerpo ha sido utilizado en estudios previos de lamprea (Meléndez-Ferro y col., 2002; Villar-Cerviño y col., 2006). Además, mediante Western blot de extractos de proteína de cerebro de lamprea se comprobó que los anticuerpos anti-glicina, policlonal anti-GABA y monoclonal anti-GABA no reconocen ninguna proteína nativa del cerebro de la lamprea (Villar-Cerviño y col., 2006). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-citoqueratinas (LCM 29) es un anticuerpo específico de lamprea que ha sido previamente caracterizado (Merrick y col., 1995) y usado en estudios de médula espinal de lampreas (Lurie y col., 1994; Uematsu y col., 2004; Vidal Pizarro y col., 2004). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-HuC/HuD se desarrolló contra las proteínas neuronales humanas HuC y HuD que se unen específicamente a antígenos presentes exclusivamente en neuronas y es, por tanto, utilizado como marcador neuronal. También ha sido utilizado en lampreas como marcador neuronal (Zhang y col., 2014). Material y métodos Página 45 Abreviaturas ARRN núcleo rombencefálico reticular anterior CSF-c células licuorcontactantes DC columna dorsal DCN núcleo de la columna dorsal DN núcleo dorsal del área octavolateral dorsal DM dorsomedial Dpl días post-lesión dV raíz descendente del nervio trigémino DTh tálamo dorsal GLY glicina Hy hipotálamo Is istmo IX núcleo motor glosofaríngeo LAT lateral LP palio lateral M mesencéfalo MN núcleo medial del área octavolateral MO bulbo raquídeo MRRN núcleo robencefálico reticular medial OB bulbo olfatorio OLA área octavolateral Pt área pretectal PRRN núcleo rombencefálico reticular posterior SC medulla espinal Silvia M. Valle Maroto Página 46 Spl semana post-lesión VId subnúcleo abducens dorsal (rectus ventral) VIIm núcleo motor facial VIv subnúcleo abducens ventral (rectus caudal) Vm núcleo motor trigeminal VM ventromedial VN núcleo ventral del área octavolateral nucleus Xm núcleo motor vagal RESULTADOS Página 48 Resultados Página 49 RESULTADOS Proyecciones Rombencefálicas Inhibidoras Descendentes en larvas de Lamprea de mar En la primera investigación se ha estudiado por primera vez el origen de las proyecciones rombencencefálicas inhibidoras descendentes a la médula espinal en la lamprea de mar utilizando métodos de trazado neuronal e inmunofluorescencia. Consideraciones metodológicas En estudios experimentales previos se ha observado una gran variabilidad en el número de células marcadas en las diferentes poblaciones neuronales que proyectan a la médula espinal (Swain y col., 1993). La variabilidad de los resultados experimentales se debe a la captación de trazadores neuronales en la médula espinal sugiriendo que el procedimiento experimental no demuestra completamente la población real de las neuronas aferentes. A pesar de esto, los resultados de este estudio demuestran claramente la existencia de proyecciones reticuloespinales inhibidoras en lampreas y pueden considerarse representativos de la organización de este sistema. Organización general de las proyecciones rombencefálicas inhibidoras descendentes El patrón de expresión de células glicina-inmunoreactivas (-ir) en el cerebro y médula espinal de la lamprea observado en nuestras preparaciones coincide con el descrito previamente (Villar-Cerviño y col., 2008a, 2009). Asimismo, el patrón de expresión de las células GABA-inmunoreactivas (-ir) coincide con el descrito en estudios previos (MeléndezFerro y col., 2003; Robertson y col., 2007). Tras la aplicación del trazador en la médula espinal, se observaron neuronas glicina-ir/GABA-negativas que proyectan a la médula espinal en tres núcleos rombencefálicos: los núcleos reticulares anterior, medial y posterior y neuronas GABA-ir/glicina-negativas con proyección espinal en los núcleos reticulares anterior y posterior. También se observaron algunas neuronas glicina-ir/GABA-ir en el núcleo reticular posterior pero la mayoría de la neuronas glicina-ir que proyectan a la médula espinal no mostraron inmunoreactividad a GABA, del mismo modo, la mayoría de las células GABA-ir no mostraron inmunoreactividad a glicina. En la figura 1 se muestra la organización de las neuronas inhibidoras de proyección espinal. Silvia M. Valle Maroto Página 50 Núcleo rombencefálico reticular anterior (ARRN) El núcleo rombencefálico reticular anterior se extiende desde la región ístmica hasta sobrepasar la región localizada a nivel del núcleo motor del nervio trigémino. En esta región se localizan cuatro células de Müller (I1-I4) pertenecientes al grupo celular ístmico. VillarCerviño y col., (2008; 2009) diferencian dos poblaciones glicina-ir en el ARRN. La región ístmica, en la región reticular intermedioventral y la región trigeminal, localizada en la zona medial de la placa basal caudalmente al istmo y ventromedialmente al núcleo motor del nervio trigémino. En el núcleo rombencefálico reticular anterior se observaron dos poblaciones de neuronas inhibidoras, una formada por células doblemente marcadas con NB y glicina y otra formada por células marcadas con NB y GABA. Además hay células marcadas con NB que no tienen glicina ni GABA, así como neuronas glicina-ir y GABA-ir que no tienen proyección espinal. Las células glicina-ir observadas se localizan en la región caudal del núcleo rombencefálico reticular anterior a nivel del núcleo motor del trigémino. Por su posición este grupo de neuronas pertenece a la población glicina-ir reticular trigeminal previamente descrita por Villar-Cerviño y col. (2008; 2009). Estas neuronas (8.25 ± 0.48 μm de diámetro menor; ver tabla 1), poseen un pericarion fusiforme y dendritas que se extienden lateralmente (Fig. 8A). En esta región el número de células glicina-ir con proyección espinal observado fue bajo. En el ARRN también se observaron escasas células GABA-ir con proyección descendente. Las células observadas pertenecen a la población GABA-ir localizada a nivel ístmico descrita previamente por Meléndez-Ferro y col. (2003) y Robertson y col. (2007) en el ARRN. Estas células (8.75 ± 0.81 de diámetro menor; ver tabla 1) presentan soma redondeado (Fig. 8B). En todos los ejemplares estudiados el número de células glicina-ir fue mayor que el de células GABA-ir. Núcleo rombencefálico reticular medial (MRRN) El núcleo reticular medial se localiza a nivel de los núcleos motores de los nervios facial y octavolateral y caudalmente al núcleo motor trigeminal. Está formado por un gran número de neuronas reticulares entre las que se encuentra la célula de Mauthner, localizada lateralmente y cinco células de Müller (B1-B5). Además, en esta región pueden observarse células más pequeñas con proyección espinal así como numerosas células que no proyectan a la médula. A nivel del MRRN se observaron células doblemente marcadas con NB y glicina. Sin embargo, no se encontraron células GABA-ir con proyección espinal en las muestras analizadas. En este núcleo, las células reticuloespinales de mayor tamaño (células de Mauthner y de Müller) son glicina-negativas/GABA-negativas, pero hay algunas células glicina-ir/GABA-negativas de proyección descendente con soma redondo (Fig. 8C) (9.58 ± 2.09 μm de diámetro menor; ver tabla 1). Estas células son de mayor tamaño que las células glicina-ir que no proyectan a la médula espinal y pertenecen a la población glicina-ir descrita anteriormente por Villar-Cerviño y col. (2008, 2009) en el MRRN ventralmente al núcleo motor del nervio facial. El número de estas células es bajo. Resultados Página 51 Núcleo rombencefálico reticular posterior (PRRN) La formación rombencefálica reticular posterior de las larvas de lamprea de mar se encuentra a nivel de la placa basal a nivel del núcleo motor de los nervios glosofaríngeo y vago. En esta región se pueden observar neuronas densamente empaquetadas que se extienden caudalmente hasta el óbex, esto es, hasta la zona de transición rombencéfalo-médula espinal. Esta región consta de una parte lateral y otra medial. En la parte medial se localizan células reticulares grandes pero también una población constituida por numerosas células de tamaño medio y pequeño. Las células de pequeño tamaño son más abundantes que las de tamaño mediano. En la parte lateral de este núcleo reticular también pueden observarse algunas células de diferente tamaño: pequeñas, medianas y en menor medida grandes. Al igual que en la formación rombencefálica reticular medial, las células de mayor tamaño son glicinanegativas/GABA-negativas. En el núcleo reticular rombencefálico posterior las células inhibidoras se sitúan medialmente, es decir en las capas periventriculares. En todos los ejemplares estudiados su número fue mayor que el de las situadas en los núcleos reticulares más rostrales, pero como en ellos aparecen mezcladas con otras células de proyección espinal. Las células inhibidoras presentan una morfología variable pudiéndose encontrar células redondas, fusiformes o multipolares. En esta región rombencefálica atendiendo a su inmunorectividad se pudieron diferenciar tres poblaciones inhibidoras con proyección espinal diferentes: neuronas glicinair/GABA negativas (8.91 ± 3.29 μm de diámetro menor; ver tabla 1), neuronas GABAir/glicina negativas (7.19 ± 1.05 μm de diámetro menor; ver tabla 1) y neuronas glicinair/GABA-ir (10.82 ± 2.72 μm de diámetro menor; ver tabla 1). Las células glicina-ir son más abundante que las GABA-ir y las glicina-ir/GABA-ir. Además hay neuronas glicinérgicas y GABAérgicas que no están marcadas con NB. Las células glicina-ir pertenecen a la población descrita por Villar-Cerviño y col. (2009) en larvas de lamprea de mar, localizada en el PRRN medial a nivel ventral a los núcleos motores de los nervios glosofaríngeo-vago (Fig. 6A, 3B). La población GABA-ir pertenece a la observada en estudios anteriores por Meléndez-Ferro y col. (2003) y Robertson y col. (2007) (Fig. 6A, 3C) en esta región. Silvia M. Valle Maroto Página 52 FIGURAS Tabla 1. Tamaño medio de las células inhibidoras descendentes de los núcleos reticulares rombencefálicos de larvas de lamprea de mar, tomando como referencia el diámetro menor de las mismas Resultados Página 53 TABLA 1 ARRN Células descendentes glicina-ir 8.25 ± 1.48 Células descendentes GABA-ir 8.75 ± 0.81 MRRN Células descendentes glicina-ir 9.58 ± 2.09 PRRN Células descendentes glicine-ir 8.91 ± 3.29 Células descendentes GABA-ir 7.19 ± 1.05 Células descendentes glicina-ir/GABA-ir 10.82 ± 2.72 Están representados los valores medios para cada núcleo reticular rombencefálico. Silvia M. Valle Maroto Página 54 Figura 1. Representación esquemática de secciones transversales del rombencéfalo de una larva de lamprea de mar en la que se muestra la distribución de las células descendentes glicina-ir y /o GABA-ir (derecha) y las principales estructuras cerebrales (izquierda). A-C: Rombencéfalo. El nivel de las secciones se indica arriba a la derecha. La correspondencia con las microfotografias en otras figuras se indica en los recuadros. Barra de calibrado: 50 μm. Resultados Página 61 Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en respuesta a una lesión medular en lamprea de mar. En larvas control de lamprea de mar, aquellas que no han sido lesionadas, a nivel de la quinta branquia la médula espinal es aplanada y el perfil del canal central es redondeado y regular. A partir de 4 dpl, se observan cambios morfológicos en el canal central. Así, en las primeras 400 - 600 µm rostrales y caudales al lugar de la lesión de los ejemplares lesionados, el canal central aumenta de tamaño y adquiere un perfil irregular, lo que concuerda con las descripciones realizadas en estudios previos (Selzer, 1978). La expresión de GABA y glicina en las células de la médula espinal de la lamprea de mar se ha descrito con anterioridad [GABA (Batueva y col., 1990; Brodin y col., 1990; Meléndez-Ferro y col., 2003; Ruiz y col., 2004; Robertson y col., 2007), glicina (Gustafsson y col., 20002; Shupliakov y col., 1996; Villar-Cerviño y col., 2008b) y se puede observar en la Fig. 7. Brevemente, en las larvas de lamprea de mar control se han observado células glicinérgicas (Fig. 7A) y GABAérgicas (Fig. 7B) en las poblaciones lateral (Fig. 7C, G) y dorsal (Fig. 7D, G) de la sustancia gris y en células que contactan con el líquido cerebroespinal (CSFc) (Fig. 7E, F). Las células del borde ventrales son también glicinérgicas. De acuerdo con lo descrito anteriormente, se ha observado colocalización de glicina y GABA (Villar-Cerviño y col., 2008b) en algunas células de estas poblaciones (datos no mostrados). La figura 5 muestra la colocalización de los neurotransmisores aminoacidérgicos inhibidores con Hu (marcador neuronal) (Fig. 8A-B’’) y la ausencia de colocalización de estos neurotransmisores con citoqueratinas (marcador de astrocitos en lamprea) (Fig. 8C-D’’) en los animales control. Esto indica que los astrocitos en animales control probablemente presentan niveles muy bajos de estos neurotransmisores, lo que no permite su observación con anticuerpos. La lesión de la médula espinal produce un claro descenso en la expresión de glicina y GABA en las neuronas y su acumulación en los astrocitos de las regiones adyacentes a la de la lesión. La inmunorreactividad a GABA y glicina se mantiene progresivamente en neuronas cada vez más distales a la región de la lesión. Los cambios observados durante la primera semana tras la sección completa de la médula espinal se muestran en las Figuras 6, 7, 8 y 9. Respuesta neuronal y astrocítica inmediatamente después de la lesión A 0 dpl (inmediatamente después de la lesión), en las primeras 300 µm rostrales y caudales a la lesión, las neuronas y las prolongaciones neuronales no muestran inmunorreactividad a glicina, mientras que sí se observa en los astrocitos una inmunorreactividad intensa (Fig. 6A-A’’). Después de estas 300 µm, se mantiene la inmunorreactividad a glicina en las neuronas y en las prolongaciones neuronales. Entre 300350 µm desde el lugar de la lesión, se observa inmunorreactividad a glicina tanto en neuronas como en astrocitos, en la misma sección espinal (Fig. 6C-C’’). Las poblaciones glicinérgicas de la sustancia gris (dorsomedial, lateral y CSFc) y de la sustancia blanca (células del borde ventrales) se observan claramente a partir de 350 µm desde el lugar de la lesión. Silvia M. Valle Maroto Página 62 A 0 dpl, en las primeras 400 µm rostrales y caudales al lugar de la lesión la mayoría de las poblaciones y prolongaciones neuronales no muestran inmunorreactividad a GABA, pero sí la muestran los astrocitos (Fig. 6B-B’’). Además, se ha observado colocalización de GABA y glicina en los astrocitos. El único tipo neuronal que mantiene la inmunorreactividad a GABA en las regiones rostral y caudal adyacentes a la lesión son las células CSFc. Sus prolongaciones apicales aparecen aplanadas y son fuertemente inmunorreactivas en estas primeras micras desde el lugar de la lesión. Además, parecen estar revistiendo el canal central (Fig. 7A). El neuropilo marginal, que está formado por las prolongaciones de las células CSFc, también continúa siendo inmunorreactivo a GABA tras la lesión (Fig. 7B). Es necesario destacar que, a diferencia de lo que ocurre con las células CSFc GABAérgicas, las células CSFc glicinérgicas pierden su inmunorreactividad tras la lesión. Más allá de las 400 µm desde el lugar de la lesión, otros cuerpos neuronales y prolongaciones (además de las células CSFc) mantienen la inmunorreactividad a GABA. Entre las 400 y las 450 µm desde el lugar de la lesión, se observan astrocitos y neuronas inmunorreactivos a GABA en la misma sección de médula espinal (Fig. 7C-C’’). Entre 400 y 600 µm desde el lugar de la lesión, la inmunorreactividad a GABA en las prolongaciones y las poblaciones celulares dorsal y lateral de la sustancia gris es ligeramente inferior a la de las muestras control. A partir de 600 µm desde el lugar de la lesión, el patrón de inmunorreactividad es similar al observado en las larvas control, en las que todas las poblaciones celulares GABAérgicas son inmunorreactivas a GABA. Respuesta neuronal y astrocítica durante la primera semana después de la lesión Se observa inmunorreactividad a glicina en los astrocitos hasta 1 dpl (Fig. 7D-D’’). Sin embargo, en las larvas procesadas entre 2 y 7 dpl, los astrocitos no muestran inmunorreactividad a glicina. En las primeras 300 µm desde el lugar de la lesión, entre 1 y 3 dpl, parece que la glicina se acumula progresivamente formando halos alrededor de los axones descendentes del fascículo dorsal (8.8 % de axones con halos), lateral (10.1% de axones con halos) y, ocasionalmente, alrededor de uno de los axones gigantes que forman parte del fascículo longitudinal medial (3.8 % de los axones con halos) o alrededor del axón de Mauthner (7.7 % de los axones de Mauthner con halos) (Fig. 8A, B, 9A). Estos halos no muestran inmunorreactividad a citoqueratinas. La presencia de halos de glicina no se correlaciona significativamente con la capacidad de supervivencia de las neuronas que dan origen a los axones a los que rodean (Fig. 9C). A partir de las 300 µm desde el lugar de la lesión en larvas procesadas entre 1 y 4 dpl se observa un patrón de inmunorreactividad a glicina similar al de las larvas control. Este patrón se observa ya a partir de las 80 µm desde el lugar de la lesión en las larvas procesadas 7 dpl. Con la excepción de las células CSFc, que son inmunorreactivas a GABA, entre 1 y 4 dpl, ninguna otra neurona presenta inmunorreactividad a GABA en las primeras 100 a 150 µm desde el lugar de la lesión. 1 dpl se observa inmunorreactividad a GABA en las prolongaciones de los astrocitos situadas en las primeras 80 µm desde el lugar de la lesión. De 2 a 7 dpl, no se observa inmunorreactividad a GABA en los astrocitos. Al igual que para la glicina, se encuentran halos inmunorreactivos a GABA y negativos a citoqueratinas alrededor de los axones descendentes (5.2 % de los axones del fascículo dorsal, 3.2 % de los axones del fascículo lateral, 0.8 % de los axones gigantes del fascículo longitudinal medial y 0% de los axones de Mauthner) (Fig. 8C, 9B). En este caso, se ha detectado una correlación entre la Resultados Página 63 presencia de halos inmunorreactivas a GABA alrededor de los axones reticuloespinales y la capacidad de supervivencia de las neuronas de origen de dichos axones, determinada por Shifman y col. (2008) (Coeficiente de correlación de Pearson, r= 0.92, P<0.05; Fig. 9C). A los 7 dpl, el patrón de expresión de GABA es similar al de las larvas control desde las primeras 100-140 µm desde el lugar de la lesión. Silvia M. Valle Maroto Página 64 FIGURAS Figura 4. Microfotografias de secciones transversales de la médula espinal de lamprea de mar mostrando inmunorreactividad a GABA y glicina (GLY) en animales control. A: inmunorreactividad a glicina. B: inmunorreactividad a GABA. C-E: Detalles de neuronas glicinérgicas. F-G: Detalles de neuronas GABAérgicas. En todas las figuras la región dorsal está hacia arriba. Células de la población dorsal (punta de flecha); células de la población lateral (flechas rellenas); células que contactan con el líquido cerebroespinal (CSFc) (flechas delineadas). En las figuras C, D y G la región lateral está a la izquierda. Barras de calibrado = 75µm (A y B); 15 µm (CG). Resultados Página 65 FIGURA 4 Silvia M. Valle Maroto Página 66 Figura 5.- A-A’’, B-B’’ Microfotografías que muestran detalles de neuronas (cabezas de flechas) doblemente inmunorreactivas a glicina (GLY) (AA’) o GABA (BB’) y Hu A,A’’, B,B’’. Las flechas señalan neuronas sólo inmunorreactivas a Hu. C-C’’, D-D’’ Microfotografías mostando neuronas inmunorreactivas a glicina (flechas, C-C’) o GABA (flechas, D-D’) y astrocitos inmunorreactivos a citoqueratinas (CK) (puntas de flecha, C,C’’, D,D’’). En todas las figuras dorsal es arriba y lateral a la derecha. Barras de calibrado: 25 µm (B-B’’); 20 µm (A-A’’, C-D’’). Resultados Página 67 FIGURA 5 Silvia M. Valle Maroto Página 68 Figura 6.- Microfotografías de secciones transversales de la médula espinal que muestran detalles de astrocitos (puntas de flecha) doblemente marcados para glicina (GLY) y citoqueratinas (CK) A-A’, C-C’’ y para GABA y citoqueratinas B, B’’ en larvas procesadas inmediatamente después de la lesión. Las flechas en C-C’’ señalan neuronas glicinérgicas. En todas las figuras dorsal está arriba y lateral a la derecha. Barras de calibrado: 20 µm. Resultados Página 69 FIGURA 6 Silvia M. Valle Maroto Página 70 Figura 7.- Microfotografías de secciones transversales de la médula espinal mostrando detalles de inmunorreactividad a GABA y astrocitos (puntas de flecha) doblemente marcados para glicina (GLY) o GABA y citoqueratinas (CK). A: Células CSF-c GABAérgicas. Las puntas de flecha señalan a los procesos apicales aplanados. La estrella indica el canal central. B: Inmunorreactividad a GABA en el neuropilo marginal (punta de flecha). El asterisco indica el axón de Mauthner. C-C’’: Astrocitos y neuronas (flechas) GABAérgicas D-D’’: Astrocitos que expresan inmunorreactividad a glicina. Todas las microfotografías son de larvas procesadas inmediatamente después de la lesión excepto D-D’’ que pertenece a un ejemplar procesado 1 día después de la lesión. En todas las figuras dorsal está arriba y lateral a la derecha, excepto en D-D’’, en la que lateral está a la izquierda. Barras de calibrado: 20 µm (A-C’’); 10 µm (D-D’’). Resultados Página 77 Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en la médula espinal de la lamprea de mar durante la regeneración Inmunorreactividad de Glicina y GABA en la médula espinal En este estudio, se describen los cambios en la inmunorreactividad de glicina y GABA durante la regeneración de la médula espinal de la lamprea de mar tras la sección completa de la médula espinal. Como vimos en el apartado anterior, en las larvas de lamprea de mar, la mayoría de los cuerpos celulares glicinércicos se distribuyen a lo largo de los márgenes dorsomedial y lateral de la sustancia gris, aunque también pueden observarse células glicinérgicas débilmente teñidas en la pared del canal central (Fig. 4 A, C-E). Además, hay escasas células en la sustancia blanca medular: algunas células del borde, unas pocas células intersticiales localizadas en la sustancia blanca ventromedial cerca de los axones reticuloespinales gigantes y, ocasionalmente, pueden encontrarse células que muestran inmunorreactividad a glicina en la columna dorsal. Las células GABAérgicas en la médula de las larvas de lamprea de mar se localizan en la mayoría de regiones que también contienen células glicinérgicas: en las regiones dorsomedial y lateral de la sustancia gris y alrededor de las paredes del canal central, donde son más abundantes y están teñidas más intensamente que las células glicinérgicas (Fig. 4B, F, G). También se pueden observar ocasionalmente células inmunorreactivas a GABA en la sustancia blanca. En la médula espinal, la mayoría de las fibras glicinérgicas discurren en las columnas dorsolateral y ventral de la sustancia blanca, mientras que la columna dorsal contiene escasas fibras glicinérgicas (Fig. 4A, 10A). Del mismo modo, las fibras GABAérgicas en la médula espinal son bastante numerosas en la sustancia blanca, excepto en la columna dorsal. La mayor densidad de fibras GABAérgicas se observa en la región adyacente a la columna dorsal (Fig. 4B, 10B). La distribución de las células y fibras inhibidoras aquí descrita concuerda con los resultados de Villar-Cerviño y col., (2008). Cambios cuantitativos en las células glicinérgicas y GABAérgicas durante la regeneración de la médula espinal Como se ha explicado en la sección material y métodos, y debido al bajo número de neuronas inhibidoras en la sustancia blanca, se cuantificaron tres poblaciones de células glicinérgicas y GABAérgicas localizadas en la sustancia gris: dorsomedial (DM), lateral (LAT) y células que contactan con el líquido cerebroespinal (CSF-c). Se han analizado los cambios en el número de células glicinérgicas y GABAérgicas rostral y caudalmente al lugar Silvia M. Valle Maroto Página 78 de la lesión en larvas control (no lesionadas) y en larvas lesionadas a diferentes tiempos de regeneración: 0 dpl, 2, 4, 10 y 24 spl. La distribución de las diferentes poblaciones celulares es muy similar a la que se observa en los animales no lesionados. En las Figuras 11 y 12 se muestran los cambios en la inmunorreactividad a glicina y en el número de células glicinérgicas de las poblaciones de la sustancia gris, respectivamente, en la médula espinal de ejemplares control y de ejemplares procesados a diferentes tiempos tras la lesión. En la región rostral al lugar de la lesión, a 0 dpl se observa una reducción significativa del 86.2% en el número de neuronas glicina-inmunorreactivas (-ir) de la población dorsal, con respecto a los animales control. A las 2 y 4 spl, existe un aumento significativo del 50.3 y 57.3%, respectivamente, en el número de neuronas glicina-ir de esta población con respecto a las larvas no lesionadas, recuperándose valores similares a los controles a las 10 y 24 spl. La disminución en el número de neuronas glicinérgicas que se observa entre 2 y 4 spl y 10 y 24 spl, es también significativa (Fig. 11 A-D, 12 A). Caudalmente al lugar de la lesión, a 0 dpl se observa una disminución significativa en el número de células glicinérgicas de la población dorsal del 91.9%. A partir de las 2 spl, el número de células recupera niveles similares a los animales control y se mantienen así durante el proceso regenerativo (Fig. 11 A, E-G, 12 B). En la población de neuronas glicinérgicas laterales, se observa una reducción significativa del número de células a 0 dpl, tanto rostral como caudalmente a la lesión, del 83.4 % y 90.6%, respectivamente, con respecto a las larvas control. Los niveles se recuperan a partir de 2 spl y se mantienen así en todos los tiempos estudiados tras la lesión (Fig. 11, 12 C, D). La misma tendencia se observa en la población de células glicinérgicas CSFc. La reducción en el número de neuronas glicinérgicas a 0 dpl es del 86% a nivel rostral y del 98.2% a nivel caudal, con respecto a los animales no lesionados. En ambos casos se recupera el número de células a las 2 spl y continúa sin haber diferencias significativas durante el resto del proceso de regeneración, con respecto a los animales control (Fig. 11, 12 E, F). En las Figuras 13 y 14 se muestran los cambios en la inmunorreactividad a GABA y en el número de células GABAérgicas de las poblaciones de la sustancia gris, respectivamente, en la médula espinal de ejemplares control y de ejemplares procesados a diferentes tiempos tras la lesión. En relación con los cambios en el número de células de las poblaciones celulares GABAérgicas, todas ellas, tanto rostral como caudalmente al lugar de la lesión, siguen el mismo patrón de recuperación. En todos los casos se observa una disminución significativa en el número de células GABAérgicas a 0 dpl, con respecto a los animales control, seguida de una recuperación a las 2 spl de los niveles encontrados en animales no lesionados, que se mantiene a las 10 y 24 spl. Así, en la población de neuronas GABAérgicas dorsales, la reducción a 0 dpl es del 87.3% a nivel rostral y de 82.1% a nivel caudal (Fig. 13, 14A, B). Resultados Página 79 En la población lateral, se observa una disminución significativa a 0 dpl del 78.8% y 76.5%, rostral y caudalmente al lugar de la lesión, respectivamente (Fig. 13, 14C, D). La población de neuronas GABAérgicas CSFc sufre una reducción de su número a 0 dpl del 76.8% a nivel rostral y del 73.2% a nivel caudal (Fig. 13, 14E, F). Cambios cuantitativos en las fibras glicinérgicas y GABAérgicas durante la regeneración de la médula espinal La variación en el número de fibras (perfiles) glicinérgicos y GABAérgicos se ha estudiado rostral y caudalmente a la lesión en los individuos control (no lesionados) y en larvas lesionadas a diferentes tiempos de recuperación: 0 dpl, 2, 4, 10 y 24 spl (Fig.15, 17). Para ello, la sustancia blanca de la médula espinal se ha dividido en tres regiones: DM, VM y LAT (Fig.10). En relación al número de perfiles glicinérgicos, en las tres áreas estudiadas, tanto rostral como caudalmente a la lesión, se observa una reducción significativa en el número de perfiles glicinérgicos a 0 dpl, con respecto a los animales control. A las 2 spl, el número de perfiles glicinérgicos vuelve a valores similares a los observados en las larvas control, no encontrándose diferencias significativas entre las larvas no lesionadas y los animales procesados a 2, 4, 10 y 24 spl. En la región DM, la disminución en el número de perfiles glicinérgicos a 0 dpl es del 37.8% a nivel rostral y del 41.5% a nivel caudal (Fig. 16 A, B). En la región VM, esta reducción en las áreas rostral y caudal es de un 45% y 46.9%, respectivamente (Fig. 16 E, F). Finalmente, en la región LAT, se observa una disminución en el número de perfiles glicinérgicos a 0 dpl del 48.1% y del 58.6%, rostral y caudalmente al lugar de la lesión, respectivamente (Fig. 16 C, D). El mismo patrón se observa en cuanto a los cambios en el número de perfiles GABAérgicos. Así, en la región DM, se produce una disminución significativa en el número de perfiles GABAérgicos del 92.9% a nivel rostral y del 95.1% a nivel caudal, a 0 dpl, con respecto a los animales control (Fig. 18 A, B). En la región VM, se observa una reducción significativa del 89.7% y del 92% a nivel rostral y caudal, respectivamente, del número de perfiles GABAérgicos a 0 dpl, con respecto a las larvas no lesionadas (Fig. 18 E, F). Finalmente, en la región LAT, se ha visto una disminución significativa en el número de perfiles GABAérgicos a 0 dpl del 86.1% y del 88%, rostral y caudalmente al lugar de la lesión, respectivamente (Fig. 18 C, D). En todas las regiones y tanto rostral como caudalmente al lugar de la lesión, el número de perfiles GABAérgicos recupera niveles similares a los animales no lesionados a 2 spl y se mantienen así a lo largo de todo el proceso regenerativo (Fig. 18). Silvia M. Valle Maroto Página 80 Células doblemente marcadas con glicina o GABA y trazador en la zona adyacente a la lesión una y dos semanas después de la misma. Para conocer el tipo y la proporción de neuronas espinales de proyección ascendente o descendente, se ha aplicado el trazador neurobiotina a ambos lados de los bordes generados en la médula espinal tras una sección medular completa. Las larvas se han procesado dos semanas después de la lesión, combinando la detección del trazador con la detección inmunohistoquímica de los neurotransmisores GABA y glicina. En la región comprendida entre las primeras 150-400 µm desde el lugar de la lesión, se han analizado las células doblemente marcadas con trazador y glicina o GABA (Figs. 19, 20). En estas larvas, el 1,5% de las células glicinérgicas laterales de la zona rostral a la lesión y el 3% de las mismas en la zona caudal presentan doble marcaje. El análisis de las células doblemente marcadas con GABA y neurobiotina muestra que, en la región rostral, el 0,35% de las células dorsalesy el 1,5% de las células laterales son dobles mientras que en la región caudal, muestran doble marcaje el 1% de las células CSFc y el 3% de las células laterales. Silvia M. Valle Maroto Página 82 FIGURAS Figura 10.- Inmunorreactividad a glicina (A) y a GABA (B) en la médula espinal a nivel de la 5º branquia en una lamprea de mar control no lesionada. Microfotografías confocales de una sección transversal de la médula espinal mostrando las 3 regiones en las cuales se dividió la sustancia blanca para cuantificar el número de fibras inmunorreactivas a glicina y a GABA. Dorsomedial (DRMD), ventromedial (VRMD) y lateral (LAT). Barras de calibrado = 75µm. Resultados Página 83 FIGURA 10 Silvia M. Valle Maroto Página 84 Figura 11.- Microfotografías de secciones transversales mostrando inmunoreactividad a glicina. A: células glicinérgicas en una larva control. B-D: células glicinérgicas de la región rostral a la lesión en larvas procesadas a distintos tiempos después de la lesión: 0 dpl (B). 2 spl (C). 10 spl (D). E-G: células glicinérgicas de la región caudal a la lesión en larvas procesadas a distintos tiempos después de la lesión: 0 dpl (E). 2 spl (F). 10 spl (G). La estrella señala el canal central. Barra de calibrado = 75µm Resultados Página 85 FIGURA 11 Silvia M. Valle Maroto Página 86 Figura 12.- Gráficos mostrando el número de células inmunorreactivas a glicina por sección en las regiones rostrales y caudales adyacentes al lugar de la lesión. A, B: Número de células dorsales inmunorreactivas a glicina en las regiones rostral (A) y caudal (B). C, D: Número de células laterales inmunorreactivas a glicina en las regiones rostral (C) y caudal (D). E, F: Número de células CSFc inmunorreactivas a glicina en las regiones rostral (E) y caudal (F). p < 0.0001.*: 0.01 - 0.05; **: 0.01 - 0.001; ***: 0.001 - 0.0001; **** < 0.0001. Resultados Página 93 FIGURA 15 Silvia M. Valle Maroto Página 94 Figura 16.- Gráficos mostrando el número de perfiles inmunorreactivos a glicina por sección en las regiones rostrales y caudales adyacentes al lugar de la lesión. A, B: Número de perfiles inmunorreactivos a glicina en las regiones dorsomedial rostral (A) y caudal (B). C, D: Número de perfiles inmunorreactivos a glicina en las regiones lateral rostral (C) y caudal (D). E, F: Número de perfiles inmunorreactivos a glicina en las regiones ventromedial rostral (E) y caudal (F). p < 0.0001.*: 0.01 - 0.05; **: 0.01 - 0.001; ***: 0.001 - 0.0001; **** < 0.0001. Resultados Página 95 FIGURA 16 Silvia M. Valle Maroto Página 96 Figura 17.- Microfotografías de secciones transversales mostrando la inmunoreactividad a GABA. A: fibras GABAérgicas en una larva control. B-F: fibras GABAérgicas de la región rostral a la lesión en larvas procesadas a distintos tiempos después de la lesión: 0 dpl (B). 2 spl (C). 4 spl (D). 10 spl (E). 24 spl (F). G-H: fibras GABAérgicas de la región caudal a la lesión en larvas procesadas a distintos tiempos después de la lesión: 0 dpl (G). 2 spl (H). 4 spl (I). 10 spl (J). 24 spl (K). Barra de calibrado = 75µm. Resultados Página 97 FIGURA 17 Silvia M. Valle Maroto Página 98 Figura 18.- Gráficos mostrando el número de perfiles inmunorreactivos a GABA por sección en las regiones rostrales y caudales adyacentes al lugar de la lesión. A, B: Número de perfiles inmunorreactivos a GABA en las regiones dorsomedial rostral (A) y caudal (B). C, D: Número de perfiles inmunorreactivos a GABA en las regiones lateral rostral (C) y caudal (D). E, F: Número de perfiles inmunorreactivos a GABA en las regiones ventromedial rostral (E) y caudal (F). p < 0.0001.*: 0.01 - 0.05; **: 0.01 - 0.001; ***: 0.001 - 0.0001; **** < 0.0001. Resultados Página 99 FIGURA 18 Silvia M. Valle Maroto Página 100 Figura 19.- Recuperación de la inmunorreactividad a glicina en células glicinérgicas axotomizadas. A-B’’: Microfotografías de secciones transversales de la médula espinal de larvas a 2 spl mostrando células con doble marcaje para glicina y Neurobiotina (NB). A-A’: Célula lateral rostral. B-B’’: Célula lateral caudal. Los asteriscos señalan glóbulos rojos. Barra de calibrado = 20 µm. Resultados Página 101 FIGURA 19 Silvia M. Valle Maroto Página 102 Figura 20.- Recuperación de la inmunorreactividad a GABA en células GABAérgicas axotomizadas. A-D’’: Microfotografías de secciones transversales de la médula espinal de larvas 2 spl mostrando células con doble marcaje para GABA y Neurobiotina (NB). A-A’’: Célula dorsal rostral. B-B’’: Célula lateral rostral. C-C’’: Células CSFc caudales a la lesión. D-D’’: Célula lateral caudal. Barra de calibrado= 20 µm. Discusión Página 109 Estos autores mostraron que estas células poseían una proyección contralateral descendente a la médula espinal e inmunorreactividad a GABA. La comparación de los resultados de la presente investigación en lamprea con los que acabamos de señalar de anfibios y mamíferos indican que las proyecciones reticuloespinales rombencefálicas inhibidoras aparecen temprano en la evolución de los vertebrados. Sin embargo, tanto en mamíferos como en lampreas se han descrito proyecciones reticulares descendentes glicinérgicas y GABAérgicas; mientras, en anfibios solo se ha demostrado hasta el momento inhibición reticuloespinal GABAérgica. Son necesarios estudios en otros grupos de vertebrados para comprender como han evolucionado estos sistemas en los vertebrados. Significado de la colocalización de dos neurotransmisores inhibidores “rápidos” en neuronas reticuloespinales Nuestros resultados muestran la colocalización de glicina y GABA en neuronas del PRRN con proyección espinal. La existencia de la colocalización de inmunorreactividad para glicina y GABA en una neurona sugiere la posible co-liberación de estos neurotransmisores en los terminales sinápticos. La sinapsis glicinérgicas y GABAérgicas poseen similitudes morfológicas. La glicina y el GABA comparten el mismo transportador vesicular presináptico, el transportador vesicular de aminoácidos inhibitorios VIAAT (Dumoulin y col., 1999; Sagné y col., 1997) y pueden activar GlyRs y GABAARs postsinápticos (Muller y col., 2008). El primero que describió una liberación conjunta de GABA y glicina en la médula espinal y tronco del encéfalo fue Jonas y col. (1998). La liberación conjunta de GABA y glicina desde una sola vesícula presináptica permite dos niveles de complementariedad funcional. La fuerza del impulso inhibidor aumenta cuando los dos sistemas inhibidores están activos. Además, los dos tipos de inhibición son cinéticamente complementarios (Jonas y col. 1998; O’Brien y Berger, 1999). La inhibición mediada por el receptor de glicina es más rápida que la mediada por los receptores GABAA (O’Brien y Berger, 1999) lo que sugiere que el componente mediado por glicina de la respuesta sináptica dual puede asegurar un bloqueo inmediato del impulso transmitido por la motoneurona mientras que el componente mediado por GABA puede permitir una inhibición más prolongada (Russier y col., 2002). La cotransmisión mediada por glicina y GABA puede proporcionar la regulación precisa en el transcurso de la conductancia postsináptica a través de la cantidad relativa de glicina y GABA liberada desde el terminal presináptico. Esto puede ser de importancia crítica para la coordinación motora (Eccles, 1964) y para la generación de los patrones locomotores (Tegnér y col., 1993). La cotransmisión podría permitir también el retrocontrol de los neurotransmisores liberados por los receptores GABAB presinápticos, lo que no es posible en la sinapsis glicinérgicas puras. Por último, la cotransmisión puede dar lugar a mecanismos compensatorios cuando exista un defecto genético en una subunidad del receptor de glicina (Brune y col., 1996). Consideraciones funcionales La presencia de neuronas glicinérgicas y GABAérgicas en los núcleos rombencéfalicos reticulares de lampreas indica que estas neuronas ejercen una acción inhibidora sobre neuronas espinales. Estas presentaron tres tipos de fenotipos de neurotransmisores inhibidores diferentes que están distribuidos diferencialmente en todos los Silvia M. Valle Maroto Página 110 núcleos rombencéfalicos reticulares, lo que sugiere fuertemente que inervan diferentes tipos celulares y/o ejercen diferentes efectos en la médula espinal, como se ha descrito previamente en los núcleos reticuloespinales excitadores de lampreas (Wannier y col., 1998). Los embriones y renacuajos de Xenopus detienen la natación en respuesta a presión sobre la glándula cemental de la cabeza, que está inervada por receptores trigeminales sensibles a presión (Boothby y Roberts, 1992). Las neuronas sensoriales primarias trigeminales excitan neuronas reticuloespinales inhidoras GABAérgicas localizadas en el rombencéfalo medio (Perrins y col., 2002) que a su vez inhiben motoneuronas e interneuronas premotoras espinales involucradas en la generación del ritmo de la natación y su detención (Li y col., 2003). En nuestros experimentos no se encontraron células GABAérgicas en el MRRN de lampreas, pero si estaban presenten en el PRRN y podrían estar implicadas en la detención de la locomoción. Se ha propuesto también que las células glicinérgicas del MRRN y del PRRN participan en el control supraespinal de la locomoción en la lamprea (Wannier y col., 1995). Además las células GABAérgicas localizadas en el PRRN podrían estar implicadas en el control de la respiración como se ha propuesto en mamíferos para las neuronas GABAérgicas localizadas en la parte caudal del rafe (Cao y col., 2006) ya que en lampreas las células serotoninérgicas no se localizan en la línea media (rafe) sino que están mezcladas con otras células reticulares (revisión en Abalo y col., 2007). Nuestros resultados también demostraron la presencia tanto de neuronas glicinérgicas como GABAérgicas en el ARRN. En mamíferos, se ha demostrado que las células GABAérgicas del rombencéfalo ventromedial rostral terminan en la médula espinal dorsal y se ha propuesto que forman parte de la inhibición del procesamiento de la información nociceptiva en al asta dorsal de la médula espinal (Reichling y Basbaum, 1990; Antal y col., 1996). Es necesario investigar si las células GABAérgicas reticuloespinales están implicadas en la nocicepción en lampreas. Discusión Página 111 Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en la médula espinal de la lamprea de mar durante la regeneración. Este es el primer estudio de la respuesta a corto plazo en la expresión de neurotransmisores aminoacidérgicos inhibidores tras una sección completa de la médula espinal en la lamprea de mar. La expresión de glicina y GABA experimenta alteraciones durante la primera semana tras la lesión. Los cambios se observan en las regiones adyacentes al lugar de la lesión y consisten, principalmente, en la pérdida de inmunorreactividad a los neurotransmisores en las neuronas y en su expresión en los astrocitos. Estos cambios son debidos, probablemente, a la liberación de los neurotransmisores desde las neuronas en respuesta a la lesión y a su recaptación por parte de los astrocitos. Además, se ha observado que un tipo neuronal particular (las células CSFc) pierde la inmunorreactividad a glicina, pero no a GABA tras la lesión. Liberación de neurotransmisores aminoacidérgicos inhibidores por las neuronas y su recaptación por los astrocitos En mamíferos, se ha descrito un aumento en los niveles extracelulares de glicina y GABA tras la lesión medular (Panter y col, 1990). Se sabe que la glicina está también involucrada en la neurotransmisión glutamatérgica (revisión en Zafra y Giménez, 2008), ya que es un coagonista obligatorio para la activación de los receptores de glutamato NMDA (Johnson y Ascher, 1987). Por tanto, el incremento de los niveles extracelulares de glicina después de la lesión medular puede potenciar la excitotoxicidad causada por el glutamato (Panter y col., 1990). Nuestros resultados muestran que, en las primeras 24 horas tras la lesión, los astrocitos de la lamprea de mar son inmunorreactivos a glicina. Esto indica que el nivel de glicina en los mismos se ha elevado considerablemente, lo que puede ser debido a la captación de la glicina liberada por las neuronas inmediatamente después de la lesión. Resultados previos de nuestro grupo, han demostrado que los astrocitos de las lampreas son capaces de captar activamente el glutamato que se libera desde las neuronas inmediatamente después de la lesión (Fernández-López, 2014). La presencia de glicina y GABA en los astrocitos tras la lesión sugiere que mecanismos similares están actuando también para captar los neurotransmisores inhibidores inmediatamente después de la lesión. La captación de la glicina por los astrocitos puede prevenir la potenciación de la excitotoxicidad glutamatérgica en lampreas y, junto con la captación del glutamato, es uno de los factores que puede explicar la sorprendente falta de muerte de las neuronas espinales de estos animales en los días posteriores a la lesión medular, demostrada por Shifman y col. (2012). Contrastando con los efectos tóxicos de los altos niveles de glicina extracelular, se ha demostrado que el GABA tiene efectos neuroprotectores (Chen-Xu y col., 2000; Han y col., 2008; O’Connell y col., 2001; Yang y col., 2000). Aunque el GABA también se acumula en los astrocitos en las primeras 24 horas después de la lesión, la recuperación del patrón de inmunorreactividad a GABA se produce antes que la del de glicina, lo que podría ayudar a alcanzar la recuperación funcional. De hecho, un estudio reciente muestra que la elevación Silvia M. Valle Maroto Página 112 endógena de los niveles de GABA tras una sección medular completa en lampreas puede estar relacionada con una mejor recuperación de la función (Svensson y col., 2013). Expresión sostenida de GABA en las células CSFc A diferencia de otros tipos celulares y de lo que sucede con la glicina, las células CSFc GABAérgicas de las lampreas no pierden la inmunorreactividad a GABA tras la lesión medular en la región que rodea al lugar de la lesión. Resulta interesante que las dendritas apicales de estas células cambien su morfología. Las porciones apicales se aplanan y parecen delimitar el perímetro del canal central. Por el contrario, no se han observado cambios en las dendritas apicales de estas células en las anguilas (Dervan y Roberts, 2003). La persistencia de la inmunorreactividad a GABA en estas células plantea la cuestión de si la liberación de GABA por parte de las células CSFc puede influir en la regeneración en las lampreas. El GABA podría actuar como neuroprotector o como promotor de la regeneración, sin que ambas funciones sean excluyentes. Las células CSFc son las primeras células espinales GABAérgicas que aparecen durante el desarrollo (Meléndez-Ferro y col., 2003). El GABA actúa como un factor que modula varios procesos esenciales durante el desarrollo (ver revisión en Owens y Kriegstein, 2002), la mayoría de los cuales, si no todos, son también necesarios para conseguir la regeneración. La persistencia específica de la expresión de GABA en las células CSFc sugiere que, tras la lesión medular en la lamprea de mar, el GABA puede llevar a cabo un papel similar al que ejerce durante el desarrollo para conseguir la regeneración. La función de las dendritas apicales en las células CSFc fue objeto de numerosas hipótesis. Se había propuesto que son quimiosensibles (Huang y col., 2006), detectando cambios en la composición del líquido cerebroespinal (CSF) y también otras funciones, como mecanorrecepción o secreción (Vigh y col., 2004). Recientemente se ha demostrado que son quimiorreceptores detectando bajadas de pH y se ha sugerido que protegen de la actividad neuronal excesiva (Jalalvand y col., 2016). El aplanamiento y la reestructuración de las dendritas apicales delimitando el perímetro del canal central indican que éstas responden a la lesión, Parece probable que la liberación masiva de glutamato en respuesta a la lesión provoque descensos del pH y que estas neuronas respondan al mismo. También podrían desempeñar nuevos papeles durante la regeneración. Por ejemplo, formando una barrera física entre el interior del canal central y los espacios extracelulares de la médula espinal. También podrían estar relacionados con otros cambios en el canal central. Por ejemplo, la fibra de Reissner del canal central se interrumpe tras la lesión y los nuevos materiales producidos por ella se acumulan en el lugar de la lesión (Barreiro-Iglesias y col., 2009b). La fibra de Reissner contiene, adhiere y transporta a grandes distancias señales que participan en el desarrollo y otras moléculas, como espondinina del órgano subcomisural, dopamina y serotonina (Caprile y col., 2003; Gobron y col., 2000). Por tanto, su acumulación podría estar relacionada con los cambios observados en las dendritas apicales de las células CSFc. Discusión Página 113 Acumulación de neurotransmisores inhibidores alrededor de los axones reticuloespinales descendentes identificables Un resultado sorprendente de este estudio es la presencia de halos inmunorreactivos a glicina y GABA alrededor de algunos axones reticuloespinales descendentes, en respuesta a la lesión. El sistema reticuloespinal tiene un papel predominante en el control de la locomoción (Grillner y col., 2008). La gran acumulación de neurotransmisores inhibidores alrededor de los axones reticuloespinales cerca del lugar de la lesión sugiere que podrían tener un papel en el control del destino de las neuronas reticuloespinales. Se sabe que las diferentes células reticuloespinales identificables de la lamprea tienen distintas capacidades de regeneración (Jacobs y col., 1997) y de supervivencia tras una sección completa de la médula espinal (Barreiro-Iglesias y Shifman, 2012; Shifman y col., 2008). En este estudio, se ha determinado la proporción de axones que presentan halos inhibidores alrededor en diferentes tipos de axones descendentes y se han comparado estos datos con los porcentajes de supervivencia de las neuronas descendentes correspondientes tras la lesión. Rovainen (1976) ha descrito la localización de los axones reticuloespinales identificables en la médula espinal de las lampreas. La capacidad de supervivencia de los axones reticuloenpinales decendentes identificables ha sido descrita por Shifman y col., (2008) 12 meses después de la sección completa de la médula espinal a nivel de la 5ª branquia. Las células de Mauthner, cuyas fibras discurren por el fascículo lateral, y las células de Müller, cuyos axones discurren por el fascículo longitudinal medial, tienen una baja tasa de supervivencia (probabilidad de supervivencia/regeneración menor del 60 %). Sin embargo, las células accesorias de Mauthner y otras neuronas reticuloespinales identificables, cuyos axones discurren principalmente en el fascículo dorsal y también en el lateral, tienen una elevada tasa de supervivencia (probabilidad de supervivencia/regeneración de más del 60 %) (Shifman y col., 2008). Se ha observado una correlación positiva y significativa entre la presencia de halos GABA-inmunorreactivos alrededor de los axones reticuloespinales y la capacidad de supervivencia de las correspondientes neuronas reticuloespinales. Esto sugiere enérgicamente un papel protector del GABA sobre estas neuronas en el lugar de la lesión. La acumulación extracelular de GABA alrededor de los axones reticuloespinales puede deberse a un incremento regulado en la producción y liberación de neurotransmisores inhibidores para hiperpolarizar los axones. Mantener los axones descendentes hiperpolarizados podría protegerlos contra la excitotoxicidad, contrarrestando los efectos perjudiciales que condcucirían a la muerte neuronal retrógrada (Saransaari y Oja, 1997). Silvia M. Valle Maroto Página 114 Cambios en los sistemas de neurotransmisores inhibidores en la médula espinal de la lamprea de mar durante la regeneración. En el estudio de los cambios que tienen lugar en los sistemas espinales gabaérgico y glicinérgico de la lamprea de mar durante la recuperación tras una lesión medular completa se ha visto que, tras una disminución importante inmediatamente después de la lesión, ambos sistemas recuperan rápidamente el número de células y prolongaciones. El sistema dopaminérgico de la lamprea también se recupera completamente tras la lesión, pero lo hace de manera más lenta (a las 4 spl) (Fernández-López y col., 2015), mientras que los sistemas glutamatérgico (Fernández-López y col., 2016) y serotonérgico (Cohen y col., 2005) presentan una recuperación incompleta a pesar de la recuperación funcional. Esto indica que en lamprea cada sistema neurotransmisor responde de manera diferente por lo que para poner de manifiesto los mecanismos que subyacen e influyen en la recuperación es importante conocer el comportamiento de cada sistema individual. Evolución de las poblaciones de células inhibidoras En relación a los cambios en el número de células, ambos sistemas, gabaérgico y glicinérgico, muestran una drástica disminución inmediatamente después de la lesión en todas las poblaciones, tanto rostral como caudalmente a la lesión, en concordancia con lo que se ha visto en el anterior estudio. Ambos sistemas muestran una rápida recuperación en el número de células a las 2 spl. Sin embargo, mientras en el sistema gabaérgico no se observa un incremento en el número de células de ningún tipo a ningún tiempo postlesión con respecto a los controles, en el sistema glicinérgico se observa este fenómeno en la población dorsomedial rostral. Así, esta población multiplica por dos su número a las 2 y 4 spl, siendo significativo tanto el aumento en el número de células con respecto a las larvas control como la disminución desde las 2 a las 10 y 24 spl, donde los niveles vuelven a ser como en los controles. Además, el número de células CSFc a nivel rostral aumenta 1,4 veces a las 2 y 4 spl con respecto a los ejemplares control y a nivel caudal aumenta 1,3 y 1,5 veces a las 4 y 10 spl, respectivamente, aunque estas diferencias no llegan a ser significativas. El hecho de que la recuperación sea tan rápida junto a la escasa muerte neuronal que se ha observado durante los dos primeros días después de la lesión en la médula espinal de la lamprea (Fernández-López y col., 2016), sugiere que la gran disminución en el número de células inmediatamente tras la lesión se debe principalmente a la descarga del neurotransmisor. La contribución de la muerte neuronal a la reducción inicial en el número de células también es posible y no se puede excluir. La completa recuperación de estos dos sistemas así como el incremento en el número de células de algunas poblaciones celulares glicinérgicas que se observa a diferentes tiempos tras la lesión podría explicarse por la producción de nuevas neuronas glicinérgicas y GABAérgicas tras la lesión y/o un cambio de fenotipo de otras neuronas que hayan sobrevivido. Con respecto a la producción de nuevas neuronas, en un estudio reciente, se ha demostrado la existencia de neurogénesis en la médula espinal después de una lesión en lampreas (Zhang y col., 2014), aunque no se ha determinado el tipo de neurotransmisor expresado por estas nuevas neuronas. Tampoco lo hemos podido demostrar aquí debido a los diferentes métodos de fijación del tejido que se requieren para poner de manifiesto la Discusión Página 115 proliferación celular y el GABA y la glicina. Sobreproducción de células en un determinado momento seguida de una reducción para volver a niveles de animales control se ha observado previamente en la generación de motoneuronas y de neuronas serotonérgicas en el pez cebra tras una lesión medular (Reimer y col., 2008; Kuscha y col., 2012) y parece estar actuando también en el sistema glutamatérgico de la lamprea (Fernández-López y col., 2016). Cambios de fenotipo neurotransmisor en respuesta a la lesión han sido puestos de manifiesto recientemente en Caenorhabditis elegans (Alam y col., 2016). En este invertebrado, el corte del axón de un tipo de neuronas GABAérgicas induce la expresión temporal de la enzima triptófano hidroxilasa, implicada en la síntesis de serotonina. Estas neuronas llegan a expresar serotonina a niveles detectables mediante inmunofluorescencia. Sin embargo, la adquisión del fenotipo serotonégico no implica la pérdida del fenotipo GABAérgico ya que mantienen constante la expresión del transportador vesicular de GABA. Hasta la fecha no hay estudios que investiguen si procesos similares en respuesta a la lesión tienen lugar en células de lamprea o de otros vertebrados. La aplicación del trazador neurobiotina a los extremos de la médula generados por la lesión y su combinación con la detección de glicina o GABA permite poner de manifiesto las neuronas cuyas prolongaciones han sido seccionadas y los resultados obtenidos indican que su proporción es muy baja. Como la recuperación del número de células inmunorreactivas se obtiene a las dos semanas, analizamos estas células en ejemplares que se dejaron recuperar durante dos semanas. El número de neuronas doblemente marcadas es muy bajo, lo que indica que la mayor parte de las neuronas inhibidoras de la médula espinal participan en circuitos locales y, por lo tanto, no han captado el trazador. Un estudio similar sobre las poblaciones dorsal y lateral de células glutamatérgicas arrojó resultados muy diferentes, con proporciones del 43 al 50% de neuronas glutamatérgicas que coexpresaban el trazador (Fernández-López y col., 2016). Además de poner de manifiesto el gran número de células glutamatérgicas con proyecciones ascendentes o descendentes, la elevada proporción de células doblemente marcadas junto con el escaso número de células glutamatérgicas después de la lesión permitió demostrar la recuperación de la expresión de glutamato en células glutamatérgicas que la han perdido en respuesta a la lesión. La baja proporción de células inhibidoras doblemente marcadas con trazador y glicina o GABA 2 semanas después de la lesión, cuando el número de células que expresan estos neurotransmisores es similar al de los ejemplares control, en relación al número de las que mantienen la expresión de los neurotransmisores después de la lesión, impide determinar si estas neuronas han recuperado la expresión o no la habían perdido. Las células glicinérgicas doblemente marcadas pertenecen a la población lateral. También hay células de la población lateral GABAérgica doblemente marcadas. En ambos casos aparecen tanto en la región rostral como en la caudal a la lesión. Estas células podrían corresponder a las células espinobulbares situadas en la sustancia gris, algunas de las cuales tienen además proyección descendente (Einum y Buchanan, 2006). Se encontraron también algunas células de la población dorsal GABAérgica rostral a la lesión doblemente marcadas, lo que indica que tienen proyección descendente. Células marcadas con axones ascendentes o descendentes también han sido previamente marcadas con peroxidasa pero la mayor parte de ellas no pudieron ser identificadas (Armstrong y col., 2003). En conjunto, estos resultados sugieren que existe una mayor variedad o complejidad en los tipos celulares de la médula espinal de la lamprea, como ya ha sido apuntado previamente por otros autores (Parker 2006, 2010). Silvia M. Valle Maroto Página 116 Evolución del número de fibras inhibidoras La cuantificación de las prolongaciones neuronales en ambos sistemas muestra que experimentan un proceso similar al de los somas, drástica reducción en el número de prolongaciones inmediatamente después de la lesión (0 dpl) y rápida recuperación a las 2 spl. Estos cambios tienen lugar tanto en la zona rostral como en la caudal y son similares en las tres regiones (dorsomedial, lateral y ventromedial) en las que se ha dividido la sustancia blanca. La rápida recuperación de las fibras inhibidoras y la falta de diferencias entre las zonas caudal y rostral y entre las distintas regiones parece deberse a la recuperación de las neuronas intrínsecas que participan en circuitos locales. A favor de esta hipótesis podemos aducir los siguientes hechos: a) Como hemos demostrado en los experimentos con neurobiotina, tanto el número de fibras originadas en neuronas rombencefálicas descendentes como el número de neuronas inhibidoras intrínsecas con proyección ascendente o descendente es muy bajo. b) Las fibras intrínsecas se recuperan antes que las fibras reticuloespinales descendentes que durante las dos primeras semanas se retraen, a la cuarta alcanzan el nivel de la lesión y a partir de la quinta son capaces de atravesarla (Yin y Selzer, 1983). Los datos disponibles indican que, mientras que la mayoría de las neuronas espinales que se recuperan pertenecen a categorías no identificadas (Armstrong y col., 2003), sólo el 40% de los axones que han sido seccionados por la lesión, tanto si son de células intraespinales ascendentes o descendentes, como si son de células reticuloespinales, son capaces de crecer a través de la misma (Davis y McClellan, 1994). Hasta la fecha se ha demostrado la regeneración de los grandes axones reticuloespinales originados en células excitadoras (Davis y McClellan1994) y de los axones serotonérgicos originados en la población localizada en el núcleo vagal rombencefálico (Cornide-Petronio y col., 2011) de lamprea, pero la regeneración de axones reticuloespinales inhibidores todavía no ha sido abordada. El hecho de que no todas las neuronas sean capaces de regenerar sus axones a través de la lesión indica que a pesar de la recuperación en el número de células y prolongaciones inhibidoras, deben existir mecanismos de plasticidad que contribuyan a la recuperación funcional. Comparación con otros vertebrados El efecto de la lesión medular sobre las células inhibidoras sólo ha sido investigado en el asta dorsal de la médula espinal de mamíferos, debido a que en ella se localizan las células GABAérgicas cuya disfunción es responsable del desarrollo del dolor neuropático central después de una lesión medular. Por su origen y localización, las células dorsales de la médula de lamprea podrían equiparase a las células del asta dorsal de mamíferos (Meléndez-Ferro y col., 2003; Villar-Cerviño y col., 2008b). Sea cual sea el modelo de lesión medular utilizado siempre se observa una pérdida de la expresión de GABA (Gwak y col, 2008; Meisner y col., 2010; Zhang y col., 1994) que puede estar asociada a muerte celular (Zhang y col., 1994). Aunque tanto en lampreas como en mamíferos la expresión de GABA disminuye, para poder profundizar en la importancia del GABA en la recuperación son necesarios más estudios en otros vertebrados, tanto en aquellos capaces de regenerar como en aquellos que no o son. Dada la importancia de las células glicinérgicas comisurales en la regulación de la alterancia derecha izquierda durante la natación también es necesario el estudio de su evolución en otros vertebrados, como paso previo al análisis de su papel durante la regeneración. CONCLUSIONES Bibliografía Página 125 Barreiro-Iglesias A, Villar-Cerviño V, Anadón R, Rodicio MC. 2008b. Descending brainspinal cord projections in a primitive vertebrate, the lamprey: cerebrospinal fluidcontacting and dopaminergic neurons. J Comp Neurol 511:711-723. Batueva V, Suderevskaya EI, Vesselkin NP, Pierre J, Repérant J. 1990. Localisation of GABA-immunopositive cells in the river lamprey spinal cord. J Hirnforsch 31:739–745. Ben-Ari Y, Gaiarsa JL, Tyzio R, Khazipov R. 2007. GABA: a pioneer transmitter that excites immature neurons and generates primitive oscillations. Physiol. Rev. 87, 1215– 1284. Berki AC, O'Donovan MJ, Antal M. 1995. Developmental expression of glycine immunoreactivity and its colocalization with GABA in the embryonic chick lumbosacral spinal cord. J Comp Neurol 362:583-596. Betz H. 1987. Biology and structure of the mammalian glycine receptor. Trends Neurosci 10:113–117. Betz H, Becker CM. 1988. The mammalian glycine receptor: biology and structure of a neuronal chloride channel protein. Neurochem Int 13:137-146. Boothby KM, Roberts A. 1992. The stopping response of Xenopus laevis embryos: pharmacology and intracellular physiology of rhythmic spinal neurones and hindbrain neurones. J Exp Biol 169:65-86. Bormann J, Feigenspan A. 1995. GABAC receptors. Trends NeurosciBormann J, Hamill OP, Sakmann B. 1987. Mechanism of anion permeation through channels gated by glycine and gamma-aminobutyric acid in mouse cultured spinal neurones. J Physiol 385:243–286. Brocard F, Dubuc R. 2003.Differential contribution of reticulospinal cells to the control of locomotion induced by the mesencephalic locomotor region. J Neurophysiol 90:17141727. Brodin L, Dale N, Christenson J, Storm-Mathisen J, Hökfelt T, Grillner S. 1990.Three types of GABA-immunoreactive cells in the lamprey spinal cord. Brain Res 508:172-175. Brune W, Weber RG, Saul B, von Knebel Doeberitz M, Grond-Ginsbach C, Kellerman K, Meinck HM, Becker CM. 1996. A GLYRA1 null mutation in recessive hyperekplexia challenges the functional role of glycine receptors. Am J Hum Genet 58:989-997. Buchanan JT. 1996.Lamprey spinal interneurons and their roles in swimming activity. Brain Behav Evol 48:287-296. Buchanan JT. 1999.The roles of spinal interneurons and motoneurons in the lamprey locomotor network. Prog Brain Res 123:311-321. Buchanan JT. 2001.Contributions of identifiable neurons and neuron classes to lamprey vertebrate neurobiology. Prog Neurobiol 63(4):441-66 Buchanan JT, Brodin L, Dale N, Grillner S. 1987. Reticulospinal neurones activate excitatory amino acid receptors. Brain Res 408:321-325. Silvia M. Valle Maroto Página 126 Buchanan JT, Grillner S. 1987. Newly identified 'glutamate interneurons' and their role in locomotion in the lamprey spinal cord. Science 236:312-314. Buchanan JT, Einum JF. 2008.The spinobulbar system in lamprey. Brain Res Rev 57:3745. Bussières N, Pflieger JF, Dubuc R. 1999. Anatomical study of vestibulospinal neurons in lampreys. J Comp Neurol 407:512-526. Cangiano L, Grillner S. 2005. Mechanisms of rhythm generation in a spinal locomotor network deprived of crossed connections: the lamprey hemicord. J Neurosci 25:923-935. Cao Y, Matsuyama K, Fujito Y, Aoki M. 2006. Involvement of medullary GABAergic and serotonergic raphe neurons in respiratory control: electrophysiological and immunohistochemical studies in rats. Neurosci Res 56:322-331. Caprile T, Hein S, Rodrıguez S, Montecinos H, Rodrıguez E. 2003. Reissner fiber binds and transports away monoamines present in the cerebrospinal fluid. Brain Res Mol Brain Res 110:177–192. Chen G, Trombley PQ, van den Pol AN. 1996. Excitatory actions of GABA in developing rat hypothalamic neurones. J Physiol 494:451-464. Chen-Xu W, Yi Y, Qiu L, Shuaib A. 2000.Neuroprotective activity of tiagabine in a focal embolic model of cerebral ischemia. Brain Res 874:75–77. Choi MY. 1988. Dynamic model of neural networks. Phys Rev Lett 61:2809-2812 Christenson J, Bongianni F, Grillner S, Hökfelt T. 1991. Putative GABAergic input to axons of spinal interneurons and primary sensory neurons in the lamprey spinal cord as shown by intracellular Lucifer yellow and GABA immunohistochemistry. Brain Res 538:313–318. Christenson J, Alford S, Grillner S, Hökfelt T.1991. Co-localized GABA and somatostatin use different ionic mechanisms to hyperpolarize target neurons in the lamprey spinal cord. Neurosci Lett 134:93-97. Cohen AS, Coussens CM, Raymond CR, Abraham WC. 1999. Long-lasting increase in cellular excitability associated with the priming of LTP induction in rat hippocampus. J Neurophysiol 82:3139-3148. David-Watine B, Goblet C, de Saint Jan D, Fucile S, Devignot V, Bregestovski P, Korn H. 1999. Cloning, expression and electrophysiological characterization of glycine receptor alpha subunit from zebrafish. Neuroscience 90:303–317. Davis GR Jr, McClellan AD.Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinal cord-transected lamprey. J Comp Neurol 344:65-82. Deliagina TG, Fagerstedt P. 2000. Responses of reticulospinal neurons in intact lamprey to vestibular and visual inputs. J Neurophysiol 83:864-878. Bibliografía Página 127 Deliagina TG, Grillner S, Orlovsky GN, Ullén F. 1993. Visual inputs affects the response to roll in reticulospinal neurons of the lamprey. Brain Res 95:421-428. Deliagina TG, Orlovsky GN, Grillner S, Wallén P. 1992. Vestibular control of swimming in lamprey. III. Activity of vestibular afferents: converge of vestibular inputs on reticulospinal neurons. Brain Res 90:499-507. Deliagina TG, Zelenin PV, Faderstedt P, Grillner S, Orlovsky GN. 2000. Activity of reticulospinal neurons during locomotion in the freely behaving lamprey. J Neurophysiol 83:853-863. Demediuk P, Daly MP, Faden AI.1989. Effect of impact trauma on neurotransmitter and nonneurotransmitter amino acids in rat spinal cord. J Neurochem 52:1529-1536. Dervan AG, Roberts BL. 2003. Reaction of spinal cord central canal cells to cord transection and their contribution to cord regeneration. J Comp Neurol 458:293–306. Drew KL, Pehek EA, Rasley BT, Ma YL, Green TK.2004.Sampling glutamate and GABA with microdialysis: suggestions on how to get the dialysis membrane closer to the synapse. J Neurosci Methods 140:127-131. Dubuc R, Brocard F, Antri M, Fénelon K, Gariépy JF, Smetana R, Ménard A, Le Ray D, Viana Di Prisco G, Pearlstein E, Sirota MG, Derjean D, St-Pierre M, Zielinski B, Auclair F, Veilleux D. 2008. Initiation of locomotion in lampreys. Brain Res Rev 57:172-182. Dumoulin A, Rostaing P, Bedet C, Lévi S, Isambert MF, Henry JP, Triller A, Gasnier B. 1999, Presence of the vesicular inhibitory amino acid transporter in GABAergic and glycinergic synaptic terminal boutons. J Cell Sci 112:811–823. Eccles JC. 1964. Presynaptic inhibition in the spinal cord. Prog Brain Res 12:65-91 Einum JF, Buchanan JT. 2006. Spinobulbar neurons in lamprey: cellular properties and synaptic interactions. J Neurophysiol 96:2042-2055. El Manira A, Pombal MA, Grillner S. 1997. Diencephalic projection to reticulospinal neurons involved in the initiation of locomotion in adult lampreys Lampetra fluviatis. J Comp Neurol 29: 603-616. Fagerstedt P, Zelenin PV, Deliagina TG, Orlovsky GN, Grillner S. 2000. Crossed reciprocal inhibition evoked by electrical stimulation of the lamprey spinal cord. Exp Brain Res 13:147-154. Fernández-López B, Barreiro-Iglesias A, Rodicio MC. 2014a. Confocal microscopy used for the semiautomatic quantification of the changes in aminoacidergic fibres during spinal cord regeneration. En Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Neuromethods 87:239-250. Fernández-López B, Barreiro-Iglesias A, Rodicio MC.2016. Anatomical recovery of the spinal glutamatergic system following a complete spinal cord injury in lampreys. Sci Rep 6:37786. Silvia M. Valle Maroto Página 128 Fernández-López B, Romaus-Sanjurjo D, Cornide-Petronio ME, Gómez-Fernández S, Barreiro-Iglesias A, Rodicio MC. 2015.Full anatomical recovery of the dopaminergic system after a complete spinal cord injury in lampreys. Neural Plast 2015:350750. Fernández-López B, Valle-Maroto SM, Barreiro-Iglesias A, Rodicio MC. 2014. Neuronal release and successful astrocyte uptake of aminoacidergic neurotransmitters after spinal cord injury in lampreys. Glia 62:1254-1269. Filli L, Schwab ME. 2015. Structural and functional reorganization of propriospinal connections promotes functional recovery after spinal cord injury. Neural Regen Res 10:509–513. Fink AJ, Croce KR, Huang ZJ, Abbott LF, Jessell TM, Azim E. 2014. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature 509:43-48. Gaiarsa J-L, Porcher C. 2013 Emerging neurotrophic role of GABAB receptors in neuronal circuit development. Front Cell Neurosci 7:206. Grillner S. 1981. Control of locomotions in bipeds, tetrapods, and fish. In: Handbook of Physiology. The Nervous System II (Brooks VB, ed), pp 1179-1236. Baltimore: American Physiological Society. Grillner S. 2003 The motor infrastructure: from ion channels to neuronal networks.Nat Rev Neurosci 4:573-586. Grillner S, Deliagina T, Ekeberg O, el Manira A, Hill RH, Lanser A, Orlovsky GN, Wallén P. 1995. Neural networks that co-ordinate locomotion and body orientation in lamprey. Trends Neurosci 18: 270-279. Grillner S, McClellan A, Sigvardt K, Wallén P, Wilén M. 1981. Activation of NMDAreceptors elicits "fictive locomotion" in lamprey spinal cord in vitro. Acta Physiol Scand. 113:549-551. Grillner S, Wallén P, Saitoh K, Kozlov A, Robertson B. 2008. Neural bases of goaldirected locomotion in vertebrates – an overview. Brain Res Rev 57: 2-12. Grillner S, Wallén P. 1985. Central pattern generators for locomotion, with special reference to vertebrates. Rev Neurosci 8:233-261. Grillner S, Wallén P. 1980. Does the central pattern generation for locomotion in lamprey depend on glycine inhibition? Acta Physiol Scand 110:103-105. Grillner S, Wallén P, Saitoh K, Kozlov A, Robertson B 2008. Neural bases of goaldirected locomotion in vertebrates--an overview. Brain Res Rev 57:2-12. Gobron S, Creveaux I, Meiniel R, Didier R, Herbet A, Bamdad M, El Bitar F, Dastugue B, Meiniel A. 2000. Subcommissural organ/Reissner’s fiber complex: Characterization of SCO-spondin, a glycoprotein with potent activity on neurite outgrowth. Glia 32:177–191. Gustafsson AB, Sayen MR, Williams SD, Crow MT, Gottlieb RA.2002. TAT protein transduction into isolated perfused hearts: TAT-apoptosis repressor with caspase recruitment domain is cardioprotective. Circulation 106:735-739. Bibliografía Página 129 Guth L, Brewer CR, Collins WF, Goldberger ME, Perl ER. 1980. Criteria for evaluating spinal cord regeneration experiments. Surg Neurol 14:392. Gwak YS, Crown ED, Unabia GC, Hulsebosch CE. 2008. Propentofylline attenuates allodynia, glial activation and modulates GABAergic tone after spinal cord injury in the rat. Pain 138:410-422 Hall GF. 1999. PHF-Tau from Alzheimer brain is rapidly dephosphorylated and degraded when injected into neurons in situ. J Alzheimers Dis 1: 379-386. Hall GF, Chu B, Lee G, Yao J. 2000. Human tau filaments induce microtubule and synapse loss in an in vivo model of neurofibrillary degenerative disease. J Cell Sci 113: 1373-1387. Han N, Ding SJ, Wu T, Zhu YL. 2008. Correlation of free radical level and apoptosis after intracerebral hemorrhage in rats. Neurosci Bull 24:351-358. Hardisty MW. 1983. The significance of lampreys for biological research. Endeavour 7:110-115. Hardisty MW, Potter IC. 1971. The general biology of adult lampreys. In: Hardisty MW, Potter IC, editors. The biology of lampreys, vol 1. London: Academic Press. p 127–206. Hausmann ON. 2003. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord 41:369-378. Higashijima S, Schaefer M, Fetcho JR. 2004. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol 480:19-37. Homma S, Rovainen CM. 1978. Conductance increases produced by glycine and gammaaminobutyric acid in lamprey interneurones. J Physiol 279:231-252. Holstege JC. 1991. Ultrastructural evidence for GABAergic brain stem projections to spinal motoneurons in the rat. J Neurosci 11:159-167. Holstege JC, Bongers CM. A glycinergic projection from the ventromedial lower brainstem to spinal motoneurons. An ultrastructural double labeling study in rat. Brain Res 566:308-315. Honson NS, Jensen JR, Abraha A, Hall GF, Kuret J. 2009. Small-molecule mediated neuroprotection in an in situ model of tauopathy. Neurotox Res. 15:274-283. Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Treankner D, Ryba NJ, Zuker CS. 2006. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature 442:934–938. Hubbs, C. L., Potter, I. C. 1971. Distribution, phylogeny and taxonomy. En “The Biology of Lampreys”. Vol. 1. pp: 1-65. Hardisty, M. W. y Potter, I. C. (Eds.). Academic Press. London. Imboden M, Devignot V, Goblet C. 2001. Phylogenetic relationships and chromosomal location of five distinct glycine receptor subunit genes in the teleost Danio rerio. Dev Genes Evol 211:415-422. Silvia M. Valle Maroto Página 130 Ikeda Y, Nishiyama N, Saito H, Katsuki H. 1997. Furosemide-sensitive calcium rise induced by GABAA-receptor stimulation in cultures of embryonic rat striatal neurons. Jpn J Pharmacol 74:165-169. Jacobs AJ, Swain GP, Snedeker JA, Pijak DS, Gladstone LJ, Selzer ME. 1997. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci 17: 5206-5220. Jalalvand E, Robertson B, Wallén P, Grillner S. 2016. Ciliated neurons lining the central canal sense both fluid movement and pH through ASIC3. Nat Commun. 7:10002. Jalalvand E, Robertson B, Wallén P, Hill RH, Grillner S. 2014. Laterally projecting cerebrospinal fluid-contacting cells in the lamprey spinal cord are of two distinct types. J Comp Neurol 522:1753-1768. Jankowska E, Lund S, Lundberg A, Pompeiano O.1968. Inhibitory effects evoked through ventral reticulospinal pathways. Arch Ital Biol 106:124-140. Janvier P.2010.microRNAs revive old views about jawless vertebrate divergence and evolution. Proc Natl Acad Sci U S A 107:19137-19138. Johnson JW, Ascher P. 1987. Glycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons. Nature 325:529–531. Jonas P, Bischofberger J, Sandkühler J.1998. Corelease of two fast neurotransmitters at a central synapse. Science 281:419-424. Kazatu Y, Akaike N, Kominaya S, Nabekura J. 1999. Regulation of intracellular chloride by cotransporters in developing lateral superior olive neurons. J Neurosci 19:2843-2851. Kirsch J, Betz H. 1998. Glycine-receptor activation is required for receptor clustering in spinal neurons. Nature 392:717-720 Koyama H, Kishida R, Goris RC, Kusunoki T. 1989. Afferent and efferent projections of the VIIIth cranial nerve in the lamprey Lampetra japonica. J Comp Neurol 280:663-671. Kuratani S, Kuraku S, Murakami Y. 2002. Lamprey as an evo-devo model: lessons from comparative embryology and molecular phylogenetics. Genesis 34:175-183. Kuscha V, Barreiro-Iglesias A, Becker CG, Becker T. 2012. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. J Comp Neurol 520:933-951. Langosch D, Becker CM, Betz H. 1990. The inhibitory glycine receptor: a ligand-gated chloride channel of the central nervous system. Eur J Biochem 194:1-8. Lee S, Kim W, Li Z, Hall GF. 2012. Accumulation of vesicle-associated human tau in distal dendrites drives degeneration and tau secretion in an in situ cellular tauopathy model. Int J Alzheimers Dis 2012:172837. Bibliografía Página 131 Li WC, Perrins R, Walford A, Roberts A. 2003. The neuronal targets for GABAergic reticulospinal inhibition that stops swimming in hatchling frog tadpoles. J Comp Physiol A 189:29-37. Liu D, Thangnipon W, McAdoo D J. 1991. Excitatory amino acids rise to toxic levels upon impact injury to the rat spinal cord. Brain Res 547: 344–348. Liu D, Xu G Y, Pan E, McAdoo, D J. 1999. Neurotoxicity of glutamate at the concentration released upon spinal cord injury. Neuroscience 93: 1383–1389. Llinas R, Terzuolo CA. 1964. Mechanisms of supraspinal actions upon spinal cord activities. Reticular inhibitory mechanisms on alphaextensor motoneurons. J Neurophysiol 27:579-59. LoTurco JJ, Owens DF. Heath MJ, Davis MB, Kriegstein AR. 1995. GABA and glutamate depolarize cortical progenitor cells and inhibit DNA synthesis. Neuron 15:1287-1298. Lukasiewicz PD. 1996. GABAC receptors in the vertebrate retina. Mol Neurobiol. 12:181-194. Lurie DI, Pijak DS, Selzer ME. 1994. Structure of reticulospinal axon growth cones and their cellular environment during regeneration in the lamprey spinal cord. J Comp Neurol 344: 559-580. Mackler SA, Selzer ME. 1985. Regeneration of functional synapses between individual recognizable neurons in the lamprey spinal cord. Science. 229, 774–776. Magoun HW, Rhines R. 1946. An inhibitory mechanism in the bulbar reticular formation. J Neurophysiol 27:579-591. Mallatt J, Winchell CJ. 2007. Ribosomal RNA genes and deuterostome phylogeny revisited: more cyclostomes, elasmobranchs, reptiles, and a brittle star. Mol Phylogenet Evol 43:1005-1022. Matsushima K, Kocha H, Watanabe R, Honda M, Nakamura N.1993. Diffuse cerebrospinal gliomatosis mimicking amyotrophic lateral sclerosis. Intern Med 32:476479. Meisner JG, Marsh AD, Marsh DR. 2010.Loss of GABAergic interneurons in laminae IIII of the spinal cord dorsal horn contributes to reduced GABAergic tone and neuropathic pain after spinal cord injury. J Neurotrauma 27:729-737. Meléndez-Ferro M. 2001. Distribución de la inmunorreactividad al ácido gammaaminobutírico (GABA) en el sistema nervioso de la lamprea de mar durante el desarrollo y en la etapa adulta. Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. Meléndez-Ferro M, Pérez-Costas E, González MJ, Pombal MA, Anadón R, Rodicio MC. 2000. GABA-immunoreactive internuclear neurons in the ocular motor system of lampreys. Brain Res 855:150-157. Silvia M. Valle Maroto Página 132 Meléndez-Ferro M, Pérez-Costas E, Rodríguez-Muñoz R, Gómez-López MP, Anadón R, Rodicio MC. 2001. GABA immunoreativity in the olfactory bulbs of the adult sea lamprey Petromyzon marinus L. Brain Res 893: 253-260. Meléndez-Ferro M, Pérez-Costas E, Villar-Cheda B, Abalo XM, Rodríguez-Muñoz R, Rodicio MC, Anadón R. 2002. Ontogeny of gamma-aminobutyric acid-immunoreactive neuronal populations in the forebrain and midbrain of the sea lamprey. J Comp Neurol 446:360-376. Meléndez-Ferro M, Pérez-Costas E, Villar-Cheda B, Rodríguez-Muñoz R, Anadón R, Rodicio MC. 2003. Ontogeny of gamma-aminobutyric acid-immunoreactive neurons in the rhombencephalon and spinal cord of the sea lamprey. J Comp Neurol 464:17-35. Merrick SE, Pleasure SJ, Lurie DI, Pijak DS, Selzer ME, Lee VM. 1995. Glial cells of the lamprey nervous system contain keratin-like proteins. J Comp Neurol 355:199-210. Muller E, Le-Corronc H, Legendre P. 2008. Extrasynaptic and postsynaptic receptors in glycinergic and GABAergic neurotransmission: a division of labour? Front Mol Neurosci 1:3. NieuwenhuysR. 1977. The brain of the lamprey in a comparative perspective. Ann N Y Acad Sci 299:97-145. Nieuwenhuys R, Nicholson C. 1998. Lampreys, Petromyzontoidea. In: Nieuwenhuys R, Donkelaar T, Nicholson C (eds). The central nervous system of vertebrates, vol. 1. Springer-Verlag, Berlin, pp 397-495. O´Brien JA, Berger AJ. 1999. Cotransmission of GABA and glycine to brain ítem motoneurons. J Neurophysiol 82:1638-1641. O’Connell AW, Fox GB, Kjller C, Gallagher HC, Murphy KJ, Kelly J, Regan CM. 2001. Anti-ischemic and cognition-enhancing properties of NNC-711, a gamma-aminobutyric acid reuptake inhibitor.Eur J Pharmacol 424:37–44. Ohta Y, Grillner S. 1989.Monosynaptic excitatory amino acid transmission from the posterior rhombencephalic reticular nucleus to spinal neurons involved in the control of locomotion in lamprey. J Neurophysiol 62:1079-1089. Oliphint PA, Alieva N, Foldes AE, Tytell ED, Lau BY, Pariseau JS, Cohen AH, Morgan JR. 2010. Regenerated synapses in lamprey spinal cord are sparse and small even after functional recovery from injury. J Comp Neurol 518: 2854-2872. Ooi EC, Youson JH. 1976. Growth of the opisthonephric kidney during larval life in the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can J Zool 54:1449-1458 Osório J, Rétaux S. 2008. The lamprey in evolutionary studies. Dev Genes Evol 218:221235. Owens DF, Kriegstein AR. 2002. Is there more to GABA than synaptic inhibition? Nat. Rev. Neurosci 3: 715–727. Bibliografía Página 133 Panter SS, Yum SW, Faden AI. 1990. Alteration in extracellular amino acids after traumatic spinal cord injury. Ann Neurol 27:96–99. Parker, D. 2006. Complexities and uncertainties of neuronal network function. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 81–99. Parker, D. 2010. Neuronal network analyses: premises, promises and uncertainties. Phil. Trans. R Soc B 365, 2315–2328 Perrins R, Walford A, Alan Roberts A. 2002. Sensory Activation and Role of Inhibitory Reticulospinal Neurons that Stop Swimming in Hatchling Frog Tadpoles. J Neurosci 22:4229–4240. Pombal MA, El Manira A, Grillner S. 1997. Afferents of the lamprey striatum with special reference to the dopaminergic system: a combined tracing and immunohistochemical study. J Comp Neurol 386:71-91. Pombal MA, López JM, de Arriba MC, Megias M, González A. 2006. Distribution of neuropeptide FF-like immunoreactive structures in the lamprey nervous system and its relation to catecholaminergic neuronal structures. Peptides 27:1054-1072. Pombal MA, Marin O, González A. 2001. Distribution of choline acetyltransferaseimmunoreactive structures in lamprey brain. J Comp Neurol 431:105-126. Pombal MA, Rodicio MC, Anadon R. 1994. The Anatomy of the Vestibulo-Ocular System in Lampreys. En Information Processing Underlying Gaze Control. DelgadoGarcía JM, Godaux E. and Vidal P P eds. Pergamon, Gran Bretaña pp 1-11. Purvis GP. 1979. Practical pointers: how time management got me under control. Hosp Financ Manage 33:42-44. Reichling DB, Basbaum AI. 1990. Contribution of brainstem GABAergic circuitry to descending antinociceptive controls: I. GABA-immunoreactive projection neurons in the periaqueductal gray and nucleus raphe magnus. J Comp Neurol 302:370-377. Reichenberger I, Dieringer N. 1994. Size-related colocalization of glycine and glutamate immunoreactivity in frog and rat vestibular afferents. J Comp Neurol 349:603-614. Reichenberger I, Straka H, Ottersen OP, Streit P, Gerrits NM, Dieringer N. 1997. Distribution of GABA, glycine, and glutamate immunoreactivities in the vestibular nuclear complex of the frog. J Comp Neurol 377:149-164. Reimer MM, Sörensen I, Kuscha V, Frank RE, Liu C, Becker CG, Becker T. 2008. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. J Neurosci 28;8510–8516. Roberts A, Dale N, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. 1987. The early development of neurons with GABA immunoreactivity in the CNS of Xenopus laevis embryos. J Comp Neurol 261:435-449. Roberts E, Frankel S. 1950. Gamma-aminobutyric acid in brain: its formation from glutamic acid. J Biol Chem 187:55-63 Silvia M. Valle Maroto Página 134 Robertson B, Auclair F, Ménard A, Grillner S, Dubuc R. 2007. GABA distribution in lamprey is phylogenetically conserved. J Comp Neurol 503:47-63. Rodicio MC, Barreiro-Iglesias A. 2012.Las lampreas como modelo animal en estudios de regeneración tras lesión medular. Rev Neurol 55:157-66. RodicioMC, Villar-Cerviño V, Abalo XM, Villar-Cheda B, Meléndez-Ferro M, PérezCostas E, Anadón R. 2005. Chemoarchitecture of the dorsal column nucleus of the larval sea lamprey. Brain Res Bull 66:536-540. Ronan M. 1989.Origins of the descending spinal projections in petromyzontid and myxinoid agnathans. J Comp Neurol 281:54-68. Ronan M, Northcutt RG. 1990. Projections ascending from the spinal cord to the brain in petromyzontid and myxinoid agnathans. J Comp Neurol 291:491-508. Rossignol S, Dubuc R, Gossard JP.2006. Dynamic sensorimotor interactions in locomotion. Physiol Rev 86:89-154. Rouse DT Jr, McClellan, AD. 1997. Descending propriospinal neurons in normal and spinal cord-transected lamprey. Exp. Neurol 146, 113–124. Rovainen CM. 1967. Physiological and anatomical studies on large neurons of the central nervous system of sea lamprey (Petromyzon marinus). I. Müller and Mauthner cells. J Neurophysiol 30:1000-1023. Rovainen CM. 1976. Regeneration of Muller and Mauthner axons after spinal transection in larval lampreys. J Comp Neurol 168: 545-54. Rovainen CM. Neurobiology of lampreys. 1979. Physiol Rev 59:1007-1077. Rubinson K, Cain H. 1989. Neural differentiation in the retina of the larval sea lamprey (Petromyzon marinus). Vis Neurosci 3:241-248. Russier M, Kopysova IL, Ankri N, Ferrand N, Debanne D. 2002. GABA and glycine corelease optimizes functional inhibition in rat brainstem motoneurons in vitro. J Physiol Ruiz Y, Pombal MA, Megıas M. 2004. Development of GABA immunoreactive cells in the spinal cord of the sea lamprey, P. marinus. J Comp Neurol 470: 151–163. Saransaari P, Oja SS. 1997. Enhanced GABA release in cell-damaging conditions in the adult and developing mouse hippocampus. Int J Dev Neurosci 15:163–174. Sagné C, El Mestikawy S, Isambert MF, Hamon M, Henry JP, Giros B, Gasnier B. 1997. Cloning of a functional vesicular GABA and glycine transporter by screening of genome databases. FEBS Lett 417:177-183. Schmitt DE, Hill RH, Grillner S. 2004. The spinal GABAergic system is a strong modulator of burst frequency in the lamprey locomotor network. J Neurophysiol 92:2357-2367. Selzer ME. 1978. Mechanisms of functional recovery and regeneration after spinal cord transection in larval sea lamprey. J Physiol (Lond) 277: 395-408.