Desarrollo de un sistema simultáneo de detección multitoxina para ficotoxinas

Agradecimientos Quisiera agradecer… Al Dr. Luis M. Botana por haberme ofrecido la oportunidad de formar parte de este gran equipo del que tanto he aprendido a nivel profesional y personal. A la Dra. M. Carmen Louzao por depositar su confianza en mí desde el primer momento, por formarme como investigadora y por guiarme durante todo este proyecto, el cual no habría llegado a su fin, sin sus consejos y ayuda. A la Dra. Natalia Vilariño por enseñarme desde el primer día el significado de la investigación, por contagiarme sus ganas de aprender y mejorar y por apoyarme a lo largo de esta carrera, a veces de fondo, a veces de resistencia, que llega a su meta. A mis compañeros. Hemos sido muchos los que compartimos risas y trabajo, habéis sido muchos los que, con vuestra energía, me ayudasteis a superar cada jornada. A los piononos granadinos y a los barqueros penicheros por haber hecho de la tesis una época inolvidable y de los congresos momentos memorables. A mis compañeros de poyata y escritorio, Laura, Diego, Sara y Paula por estar siempre cerca e i-lumi-narme con vuestra sonrisa, dulzura y simpatía. A Andrea y Marta por acompañarme cuesta arriba, cuesta abajo, bajo el sol o la lluvia, en esta peregrinación científica. Nos quedan muchos caminos por recorrer. A mis Roi-nvolucionados, especialmente a mi tocaya y a Andrés, por haber vivido, casi como propio, cada día de esta tesis. A las biológas que me acompañan desde antaño, en especial, a Cris, mi boirense favorita, por haberme dado tanto, de lejos y de cerca. A Ana, Iban y Fernando por ayudarme a emerger y mantenerme a flote en mi retorno. A mis 12 variopintas lucensas por estar siempre ahí demostrándole al mundo que las diferencias, lejos de destruir y distanciar, ayudan a construir y apiñar. A te, Paolo, compagno di sogni e di incubi, per transformare gli ultimi nei primi. A mis 5 fami-fantásticos, Marcos, mamá, papá, Mili, Tito y Jaime porque nadie como ellos conoce lo que significa llegar hasta aquí, porque nadie como yo sabe que sin ellos nunca habría llegado hasta donde estoy. ¡Gracias! Grazas! Grazie! Mulţumesc! Thank you! Obrigada! Danke! Merçi! Resumen RESUMEN La aparición de toxinas acuáticas en pescado, marisco, agua de bebida y de recreo tiene una importante repercusión socioeconómica en el entramado acuícola mundial. Estas toxinas representan un riesgo para la salud, por ello se ha establecido legalmente el contenido máximo de algunas de ellas en moluscos destinados al consumo humano, agua de bebida y/o recreo. Estas regulaciones han potenciado el desarrollo de métodos de detección. En Europa, el bioensayo en ratón ha sido el método de referencia para la mayoría de las toxinas acuáticas, aunque, debido a sus inconvenientes técnicos y éticos, actualmente solo se emplea para detectar toxinas paralizantes. La cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LCMS/MS) es el método oficial para detectar toxinas lipofílicas y es una técnica ampliamente utilizada para otros grupos tóxicos, pero es cara y requiere personal especializado. La tendencia actual en este campo científico es el desarrollo de ensayos alternativos para el cribado de muestras. En esta tesis doctoral se presentan métodos de detección basados en la interacción con proteínas específicas para cada grupo tóxico y en la aplicación de marcaje fluorescente. La metodología empleada combina distintos conceptos tecnológicos: citometría de flujo, uso de microesferas, digitalización de las señales y química tradicional. De este modo, se desarrollaron y/u optimizaron métodos para detectar individualmente toxinas de los grupos de la saxitoxina, ácido okadaico, ácido domoico, azaspirácido, palytoxina, microcystina, cylindrospermopsina y anatoxina-a. Además, se crearon dos métodos multitoxina para detectar simultáneamente, usando un pequeño volumen de muestra, hasta cinco grupos de toxinas acuáticas, de aparición frecuente y concurrente. El análisis simultáneo de varias toxinas en una misma muestra permite reducir los tiempos experimentales y el gasto de reactivos. Por tanto, los métodos alternativos para toxinas acuáticas desarrollados en esta tesis doctoral proporcionan una herramienta semicuantitativa de ejecución sencilla, rápida y eficaz para el cribado de muestras. Palabras clave: citometría de flujo, toxinas acuáticas, detección multitoxina, multidetección, método de criba. Resumo RESUMO A aparición de toxinas acuáticas en pescado, marisco e auga de bebida e de recreo ten unha importante repercusión socioeconómica na estrutura acuícola mundial. Estas toxinas representan un risco para a saúde, por iso se estableceu legalmente o contido máximo dalgunhas delas en moluscos destinados ao consumo humano, auga de bebida e/ou recreo. Estes regulamentos potenciaron o desenvolvemento de métodos de detección. En Europa, o bioensaio en rato foi o método de referencia para a maioría das toxinas, non obstante, debido aos seus inconvenientes técnicos e éticos, actualmente só se emprega para detectar toxinas paralizantes. A cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LCMS/MS) é o método oficial para detectar toxinas lipofílicas e é unha técnica amplamente utilizada para outros grupos tóxicos, pero é cara e require persoal especializado. A tendencia actual neste campo científico é o desenvolvemento de ensaios alternativos para o cribado de mostras. Nesta tese doutoral preséntanse métodos de detección baseados nas interaccións con proteínas específicas para cada grupo tóxico e na aplicación de marcaxe fluorescente. A metodoloxía empregada combina distintos conceptos tecnolóxicos: citometría de fluxo, uso de microesferas, dixitalización dos sinais e química tradicional. Deste xeito, desenvolvéronse e/ou optimizáronse métodos para detectar individualmente toxinas dos grupo da saxitoxina, ácido okadaico, ácido domoico, azaspirácido, palytoxina, microcystina, cylindrospermopsina e anatoxina-a. Ademais, creáronse dous métodos multitoxina para detectar simultaneamente, empregando un pequeno volume de mostra, ata cinco grupos de toxinas acuáticas, de aparición frecuente e concorrente. A análise simultánea de varias toxinas nunha mesma mostra permite reducir os tempos experimentais e o gasto de reactivos. Polo tanto, os métodos alternativos para toxinas acuáticas desenvolvidos nesta tese doutoral proporcionan unha ferramenta semicuantitativa de execución sinxela, rápida e eficaz para o cribado de mostras. Palabras clave: citometría de fluxo, toxinas acuáticas, detección multitoxina, multidetección, método de criba. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 3 1.1. T OXINAS ACUÁTICAS ......................................................................................... 5 1.1.1. Toxinas marinas ...............................................................................7 1.1.2. Toxinas de agua dulce y/o salobre................................................... 16 1.2. R IESGO SANITARIO ASOCIADO A TOXINAS ACUÁTICAS .................................... 23 1.2.1. Límites regulados de toxinas marinas .............................................. 24 1.2.2. Límites regulados de toxinas de agua dulce y/o salobre .................... 27 1.3. M ÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS ............................................................ 28 1.3.1. Métodos analíticos .......................................................................... 28 1.3.2. Métodos biológicos ......................................................................... 31 1.4. M ETODOLOGÍA ............................................................................................... 35 1.4.1. Citometría de flujo de la tecnología Luminex ................................... 35 1.4.2. Cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas (UPLC-MS)........................................................ 38 2. OBJETIVOS ............................................................................................ 43 3. PUBLICACIONES.................................................................................. 47 BLOQUE 1. D ISEÑO , DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS MARINAS Artículo 1. Detection of paralytic shellfish toxins by a solid-phase inhibition immunoassay using a microsphere-flow cytometry system. ................................ 57 Artículo 2. Multidetection of paralytic, diarrheic, and amnesic shellfish toxins by an inhibition immunoassay using a microsphere-flow cytometry system. .................. 67 Acta anexa al artículo 2. Sensitivity improvement of an immuno-detection method for azaspiracids based on the use of microspheres coupled to a flow-fluorimetry system. ..... 83 Artículo 3. Detection of palytoxin-like compounds by a flow cytometry-based immunoassay supported by functional and analytical methods........................... 95 BLOQUE 2. D ISEÑO , DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS DE AGUA DULCE O SALOBRE Artículo 4. Multi-detection method for five common microalgal toxins based on the use of microspheres coupled to a flow-cytometry system. .................................. 149 4. DISCUSIÓN ......................................................................................... 167 5. CONCLUSIONES ................................................................................ 181 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................... 185 1. Introducción 1. Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN El volumen total de agua existente en el planeta Tierra cubre el 71 % de la corteza terrestre (Figura 1A) del cual, un 96,5 % forma parte de las aguas oceánicas, mientras que, el agua dulce tan solo representa un 2,5 % (Figura 1B) [1]. El área de distribución de las aguas oceánicas (3,62 x 108 km2) y su alto porcentaje de recambio, les confiere un papel fundamental en el entramado acuático global [2]. Figura 1. Proporción espacial y volumétrica del agua en la Tierra. A) Superficie terrestre cubierta por agua (%). B) Tipos de aguas existentes en la Tierra (%). La amplia extensión de las aguas oceánicas, así como, su promedio de profundidad (3,7 km) [2], albergan un gran número de especies marinas. En la actualidad, se han descrito aproximadamente 2,3 x 105 especies, cifra que dista del 1 x 106 que, se estima, pueden llegar a existir en los océanos [3]. Los grupos que aportan la mitad de la riqueza de especies a la biodiversidad marina son peces, moluscos y crustáceos, mientras que, los protistas (protozoos y algas) contribuyen en un 20 %. Los ecosistemas de agua dulce, a pesar de ocupar tan solo un 1 % de la superficie terrestre, pueden llegar a albergar 1,8 x 106 especies, aunque actualmente solo se han descrito unas 1 x 105 [4]. En ambos medios acuáticos el fitoplancton constituye la base de la cadena trófica. Dentro del fitoplancton se engloban distintos grupos, como el de los dinoflagelados, las diatomeas o las cianobacterias, entre otros. Actualmente se han descrito unas 2300 especies de dinoflagelados marinos y de agua dulce [5], más de 8000 especies de diatomeas y unas 3300 especies de cianobacterias que se reparten equitativamente entre agua dulce y salada [6]. Dado que el fitoplancton es el productor primario dentro de la cadena trófica, cuando este sufre explosiones poblacionales, se incrementa la productividad del ecosistema. La 1. Introducción 4 abundancia de nutrientes junto con otros factores ambientales vinculados al cambio climático [7,8] son catalizadores del crecimiento exponencial del fitoplancton. Sin embargo, el exceso de biomasa generado puede llegar a reducir la cantidad de oxígeno disponible en el agua, convirtiéndolo en un elemento limitante y comprometiendo la estabilidad del medio. Dicha amenaza se agrava ante la proliferación de especies productoras de toxinas acuáticas, de modo que estos episodios pueden resultar perjudiciales para el ecosistema, las actividades dependientes de los mismos y, especialmente, para la salud humana y animal. El término "mareas rojas tóxicas" se utiliza comúnmente para referirse a estos sucesos, debido a su amplia descripción en medios salinos y a los cambios de coloración que estos producen en las aguas. Sin embargo, el término floraciones algales nocivas o "FAN", es más amplio, puesto que engloba las proliferaciones algales tóxicas que ocurren tanto en agua salada como en dulce (Figura 2) y será, por tanto, el que se emplee a lo largo de esta tesis doctoral. Figura 2. Floración algal en un lago artificial de uso público. El incremento en la frecuencia de aparición de las floraciones algales nocivas en las últimas décadas [7] ha impulsado la investigación de las toxinas acuáticas asociadas a estas proliferaciones. 1. Introducción 5 1.1. TOXINAS ACUÁTICAS Las toxinas acuáticas son sustancias bioquímicas generadas por distintos organismos como los dinoflagelados, las cianobacterias, las algas… Su presencia en el agua, recurso del cual el ser humano es altamente dependiente, supone un riesgo para la salud pública. Aunque existen diversas vías de exposición a las toxinas, la más común es la intoxicación por ingesta de productos contaminados e implica, para la mayoría de ellas, su entrada en la cadena trófica. Por tanto, estas toxinas no solo representan una amenaza sanitaria sino que además repercuten gravemente en los ecosistemas acuáticos provocando grandes pérdidas económicas a las industrias vinculadas, especialmente a la alimentaria. Inicialmente, la comunidad científica centró su atención en las toxinas de origen marino, siendo ampliamente estudiadas, debido a las graves afecciones que su ingesta puede causar en humanos y animales. Posteriormente, la aparición de intoxicaciones ocasionadas por la presencia de toxinas de agua dulce impulsó su estudio en mayor profundidad. En la actualidad, se conoce la estructura química común a cada uno de los grupos de toxinas establecidos hasta ahora, se han descrito distintos análogos y se han identificado algunos de los organismos productores. Generalmente, las toxinas acuáticas se clasifican en base a sus características químicas en: toxinas paralizantes, toxinas diarreicas, toxinas amnésicas, azaspirácidos, palytoxinas, brevetoxinas, ciguatoxinas, iminas cíclicas, pectenotoxinas, tetrodotoxinas, yessotoxinas, microcystinas, cylindrospermopsinas, toxinas de la clase de la anatoxina-a y nodularinas (Tabla 1). A continuación, se presentan en detalle las toxinas acuáticas, marinas y de agua dulce y/o salobre, empleadas para el desarrollo de los métodos de detección que se describen en la presente tesis doctoral. 1. Introducción 6 Tabla 1. Clases de toxinas marinas, de agua dulce y/o salobre, sus moléculas representativas (y el total de compuestos que conforman el grupo) y algunos de los géneros productores descritos. Clases de toxinas Representativas (número análogos) Organismo productor Toxinas paralizantes Saxitoxina (>50) Alexandrium (d),Gymnodinium (d) y Pyrodinium (d) Toxinas diarreicas Ácido okadaico y dinofisistoxinas (>10) Dinophysis (d) y Prorocentrum (d) Toxinas amnésicas Ácido domoico (>10) Chondria (ar), Nitzschia (dia) y Pseudo-Nitzschia (dia) Azaspirácidos Azaspirácido 1 (>20) Azadinium (d) Palytoxinas Palytoxina (>15) Ostreopsis (d), Palythoa (co), Parazoanthus (co), Trichodesmium (c) y Zoanthus (co) Brevetoxinas Brevetoxina 1 y 2 (>17) Karenia (d) Ciguatoxinas Ciguatoxina y maitotoxina (>8) Gambierdiscus (d) Iminas cíclicas Gymnodiminas y espirólidos (>25) Alexandrium (d), Gymnodinium (d), Prorocentrum (d), Symbiodinium (d) y Vulcanodinium (d) Pectenotoxinas Pectenotoxina 2 (>16) Dinophysis (d) y Protoperidinium (d) Tetrodotoxinas Tetrodotoxina (>20) Aeromonas (b), Pseudomonas (b) y Vibrio (b) Yessotoxinas Yessotoxina (>30) Gonyaulaxspinifera (d), Lingulodinium (d) y Protoceratium (d) Microcystinas Microcystina-LR (>90) Anabaena (c), Anabaenopsis (c), Microcystis (c), Nostoc (c), Oscillatoria (c), Phormidium (c), Planktothrix (c), Plectonema (c), Rivularia (c) y Tolypothrix (c) Cylindrospermopsinas Cylindrospermopsina (3) Anabaena (c), Aphanizomenon (c), Cylindrospermopsis (c), Lyngbya (c), Oscillatoria (c), Raphidiopsis (c) y Umezakia (c) Toxinas anatoxina-a Anatoxina-a (4) Anabaena (c), Aphanizomenon (c), Oscillatoria (c), Phormidium (c) y Planktothrix (c) Toxinas paralizantes Saxitoxina (>50) Anabaena (c), Aphanizomenon (c), Cylindrospermopsis (c), Lyngbya (c), Oscillatoria (c), Phormidium (c) y Planktothrix (c) Toxinas amnésicas Ácido domoico (3) Nitzschia (dia) Nodularinas Nodularina-R (9) Nodularia (c) Toxinas marinas y toxinas de agua dulce y/o salobre (ar): alga roja, (b): bacteria, (c):cianobateria, (co): coral, (d): dinoflagelado, (dia): diatomea 1. Introducción 7 1.1.1. Toxinas marinas En esta sección se presentan cinco grupos de toxinas marinas de distribución global y aparición recurrente. Su presencia en productos destinados al consumo y su implicación en intoxicaciones humanas y animales las convierten en sustancias peligrosas para la sanidad pública. 1.1.1.1. Toxinas paralizantes Las toxinas paralizantes, también conocidas por su sigla en inglés PSPs ("paralytic shellfish poisoning"), han sido objeto de estudio desde principios del siglo XX. Desde entonces se han identificado las especies productoras, organismos vectores y numerosos análogos. Actualmente, se asocia la síntesis de PSPs con los géneros de dinoflagelados Alexandrium, Gymnodinium o Pyrodinium [9]. Entre los organismos que pueden actuar como vectores se encuentran los moluscos bivalvos, moluscos gasterópodos, equinodermos y cefalópodos [10-12]. Esta clase de toxinas hidrofílicas, representada por la saxitoxina (STX), está formada por un cuantioso grupo de tetrahidropurinas que se clasifican según su estructura química (Figura 3) [13-15]. Las PSPs ejercen su efecto tóxico mediante su unión al sitio 1 de la subunidad α de los canales de sodio dependientes de voltaje. Bloquean el transporte iónico e inhiben la transmisión de los impulsos nerviosos provocando, en última instancia, la parálisis [16,17]. Los síntomas neurológicos debidos a PSPs se caracterizan por la aparición de parestesia, debilidad, ataxia, sensación disociativa, náuseas, vómito, disnea, mareos, dolor de cabeza, disfagia y disartria, pudiendo llegar a ser letales en los casos más graves [18]. Con el desarrollo y aceptación de los métodos de detección analíticos se hizo necesario establecer los factores de equivalencia tóxica (TEFs) para cada análogo (el valor de TEF indica la potencia relativa de cada análogo comparada con la toxicidad de la molécula representativa de la clase tóxica [19]). La publicación de la opinión científica de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) para el grupo de las PSPs propone TEFs calculados en base a ocho trabajos realizados mediante administración intraperitoneal [14]. Estos son, en su mayoría, coincidentes con los valores determinados por la comisión del Codex Alimentarius que incluyen datos recogidos de estudios de toxicidad para PSPs administradas por vía oral [15] (Figura 3). 1. Introducción 8 Figura 3. Estructura química y toxicidades relativas (TEFs) de las PSPs (GTX, goniautoxina). Como consecuencia de la aparición de las PSPs el incremento de los casos de intoxicación llegó a convertirse en un problema sanitario global [18,20,21]. La presencia de PSPs se ha identificado tanto en el hemisferio norte como el sur, mayoritariamente en aguas frías de la costa de Canadá, Chile, Japón y el norte de EEUU, pero también se han descrito casos de PSPs en Australia, Costa Rica, España, Guatemala, Inglaterra, México, Singapur, Sudáfrica y Taiwán [22]. 1. Introducción 15 En 1985, se hizo referencia por primera vez a la coexistencia de la PLTX con cinco toxinas minoritarias pertenecientes al grupo de las PLTXs, siendo una de ellas un isómero, la isoPLTX. Desde entonces la descripción de análogos e isómeros de esta familia no se ha detenido, de hecho, la caracterización de los últimos compuestos incorporados a esta clase tóxica no cuenta con más de un año [72,73]. Así, durante la última década, el conocimiento acerca de las moléculas tipo PLTX ha experimentado un gran avance con la inclusión de nuevos compuestos (ostreocinas y ovatoxinas, principalmente) y organismos productores (Tabla 2). Estos últimos, se pueden clasificar en zoántidos, de los géneros Palythoa, Zoanthus y Parazoanthus; dinoflagelados, del género Ostreopsis y cianobacterias, del género Trichodesmium. Las moléculas de tipo PLTX actúan sobre la bomba Na+/K+-ATPasa. Esta proteína, que expulsa 3 iones Na+ del interior celular e incorpora 2 iones K+ al citoplasma mediante la hidrólisis de una molécula de ATP, mantiene el gradiente iónico y es, por tanto, crucial para la funcionalidad celular eucariótica [74]. Cuando las moléculas de tipo PLTX se unen a la subunidad α extracelular de la Na+/K+-ATPasa, transforman la proteína en un canal iónico no específico, alterando el equilibrio iónico y produciendo efectos a nivel sistémico que ponen en peligro la supervivencia del individuo [74,75]. Se cree que la PLTX es la responsable del clupeotoxismo, un síndrome vinculado a la ingesta de peces de la familia Clupeidae que incluye, por ejemplo, a sardinas y arenques. El clupeotoxismo se caracteriza por causar erupción maculopapular y/o dermatitis eritematosa, mialgia, fiebre y problemas cardiorespiratorios que pueden provocar la muerte [74]. Además también se ha relacionado la aparición de afecciones respiratorias y dérmicas con la presencia de moléculas tipo PLTX en aerosoles, aguas de recreo y acuarios [76]. Aunque los datos toxicológicos existentes para este grupo de moléculas son escasos, revelan que la toxicidad de PLTX y 42-hidroxiPLTX es similar y, a su vez, mayor que la de la ostreocina-d [7780]. Sin embargo, se necesitan más estudios de toxicidad in vivo para poder evaluar el riesgo que supondría para la salud humana el contacto con estas moléculas o su entrada en la cadena alimentaria, así como, para determinar la toxicidad de cada uno de los compuestos pertenecientes a la clase de las PLTXs. 1. Introducción 16 Tabla 2. Resumen de los organismos productores de moléculas tipo PLTX descritos en la literatura científica. Organismos productores PLTXs detectadas Referencias Palythoa tuberculosa PLTX, 42-hidroxiPLTX (42S-hidroxi-50RPLTX y 42S-hidroxi-50S-PLTX), homoPLTX, bishomoPLTX, deoxiPLTX, neoPLTX e isoPLTX, PLTX-b [81-84] P. helodiscus y P. toxica PLTX, 42-hidroxiPLTX y deoxiPLTX [81,85] P. caribaeorum, P. mammilosa, P. vestitus, P. caesia, P. affinis margaritae, P. heliodiscus, P. mutuki, Zoanthus sansibaricus, Z. solanderi, Z. sociatus y Parazoanthus sp. Detectada actividad tipo PLTX [65,67,85-91] Ostreopsis cf. (confer) ovata Ovatoxina-a, -b, -c, -d, -e, -f, -g, -g isobárica, -h, -a IK2, -d IK2, -e IK2, PLTX y PLTX isobárica [72,73,83,92,93] Ostreopsis spp. Ovatoxina-a AC, -b AC, -d AC y -e AC [94] O. siamensis Ostreocina-b y -d, PLTX y actividad tipo PLTX no debida a análogos descritos [95-97] O. mascarenensis Mascarenotoxina-a y -b [98] Trichodesmium spp. PLTX y 42-hidroxiPLTX [99] 1.1.2. Toxinas de agua dulce y/o salobre En este apartado se presentan cinco toxinas detectadas en agua dulce y/o salobre cuya producción se asocia con afloramientos masivos de microalgas en aguas de consumo y de recreo. La vinculación de estos episodios con intoxicaciones humanas y animales genera gran preocupación sobre la seguridad del uso y consumo del agua dulce. 1. Introducción 17 1.1.2.1. Microcystinas Las microcystinas (MCs) son cianotoxinas que deben su nombre al primer género de cianobacterias asociado con su producción, Microcystis. Hoy en día se sabe que también las sintetizan otros géneros fitoplanctónicos como Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc y Oscillatoria [21] y varios géneros bentónicos: Anabaena, Nostoc, Phormidium, Planktothrix, Plectonema, Rivularia y Tolypothrix [100]. Las MCs son heptapéptidos cíclicos que contienen aminoácidos dextrógiros (d) y levórigos (l) y cuya estructura general es dAla-lX-dMeAsp-lZ-Adda-dGlu-Mdha. Donde lX y lZ representan aminoácidos levógiros que varían en cada análogo; dMeAsp es el ácido eritro-β-metilaspártico dextrógiro; Adda es el ácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil10-fenildeca-4,6-dienoico, el grupo más inusual de las MCs; y Mdha es la Nmetildehidroalanina. Se han descrito modificaciones en los siete aminoácidos y se han identificado, hasta el momento, alrededor de 90 variantes de la estructura general. Las sustituciones más frecuentes se dan en los aminoácidos levógiros de las posiciones lX y lZ, siendo la arginina (R), leucina (L) o tirosina (Y) las más comunes para la posición lX y la alanina (A) o arginina (R) para la posición lZ. Estas y otras modificaciones estructurales se reflejan en la nomenclatura de los distintos análogos de este grupo de toxinas, por ejemplo, la MC cuyos sustituyentes lX y lZ son, respectivamente, L y R se conoce como microcystina-LR (MC-LR) (Figura 8) [101,102]. Figura 8. Estructura química de MC-LR y sustituciones aminoacídicas para MC-RR y MC-YR. 1. Introducción 18 La diana biológica de las MCs son las protein-fosfatasas de serina/treonina 1 y 2A (PP1 y PP2A). Estas toxinas bloquean el acceso del sustrato a las enzimas siendo los aminoácidos Adda, dGlu y Mdha (Figura 8) relevantes en la interacción con el centro catalítico [103]. Las MCs se clasifican como sustancias hepatotóxicas debido al daño que ejercen en dicho órgano mediante la inhibición de las protein-fosfatasas de serina/treonina. Tras la ingesta de estas toxinas los polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATPs, del inglés "organic anion-transporting polypeptides") son responsables de su absorción y distribución. Estas proteínas se encargan del transporte transmembrana de ácidos biliares y hormonas en hepatocitos, pero también se expresan en el tracto gastrointestinal, riñón y cerebro, de modo que estos órganos pueden resultar vulnerables a dichas cianotoxinas [104,105]. Las proteinfosfatasas de serina/treonina, tal como se comentaba anteriormente, están implicadas en la regulación de la homeostasis celular [33]. La inhibición de estas enzimas a nivel hepático, mediada por las MCs, genera una hiperfosoforilación de los filamentos estructurales del citoesqueleto que promueve la deformación de los hepatocitos y, en última instancia, el daño hepático [106,107]. La alteración celular que provocan las MCs también lleva a la inestabilidad genómica. De hecho, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer ha incluido la MC-LR como una sustancia potencialmente carcinógena para el ser humano (clase 2B) [108]. Se ha demostrado que la acción inhibitoria de la MC-LR sobre las protein-fosfatasas de serina/treonina conlleva a la producción de sustancias reactivas de oxígeno induciendo daños en el ADN con efectos genotóxicos. Asimismo, impide dos vías importantes de reparación del ADN: la reparación por escisión de nucleótidos para daños en una sola hebra y la reparación por recombinación no homóloga para daños en ambas hebras [105]. La presencia de las MCs se ha detectado en Asia, América, Europa y norte de África. El caso más grave de envenenamiento por MCs ocurrió en Brasil en el año 1996, en el que 126 pacientes de hemodiálisis se intoxicaron y 60 fallecieron. Desde entonces se han descrito varias intoxicaciones humanas y animales debidas a MCs, provocando gastroenteritis en la mayoría de los casos en seres humanos [21]. Sin embargo, dada su caracterización como moléculas potencialmente carcinógenas, las MCs representan un riesgo sanitario global. 1. Introducción 19 1.1.2.2. Cylindrospermopsinas El grupo de las cylindrospermopsinas (CYNs) se identificó por primera vez en 1979 tras la hospitalización de 148 personas con síntomas de hepato-enteritis en Isla Palmera, Australia. Se determinó como causante de dicha intoxicación una floración masiva en un embalse, único suministro de agua de la isla, en la cual la especie predominante era Cylindrospermopsis raciborskii [109]. Actualmente, se conocen otros cinco géneros de cianobacterias fitoplanctónicas capaces de producir CYNs, Anabaena, Aphanizomenon, Lyngbya, Raphidiopsis y Umezakia; y dos bentónicos: Lyngbya y Oscillatoria [100,110]. La molécula representativa de esta clase es la cylindrospermopsina (CYN), un alcaloide con un grupo guanidino y un uracilo que conforman el esqueleto tricíclico (Figura 9). Esta clase tóxica incluye un epímero natural de la CYN, la 7-epiCYN, y un análogo, la deoxiCYN, que se diferencia de la CYN por la ausencia del grupo hidroxilo situado en el C7 (Figura 9) [111,112]. Además se han descrito dos productos de degradación, la 5-cloroCYN y el ácido cylindrospérmico, derivados de la cloración del agua para consumo humano [113]. Figura 9. Estructura química de las CYNs: CYN, 7-epiCYN y deoxiCYN. Aún no se conoce la diana de la CYN, aunque, a nivel orgánico se ha descrito que provoca daños en el hígado y que también puede llegar a dañar riñones, pulmón, timo, vejiga, glándulas adrenales, tracto intestinal, sistema inmune y corazón [101,105]. Se considera que la CYN inhibe principalmente la síntesis proteica y de glutatión y que puede inducir genotoxicidad [105,114]. El mecanismo de acción por el que la CYN ejerce su efecto tóxico a corto plazo se ha relacionado con los metabolitos que genera el citocromo P450, mientras que, su toxicidad a largo plazo se ha vinculado con la inhibición de la síntesis proteica [105,114,115]. 1. Introducción 20 Sin embargo, en algunos modelos celulares, como los hepatocitos de rata, no se ha demostrado que la CYN inhiba totalmente la síntesis proteica a largo plazo [116,117] y en cultivos celulares de tipo intestinal se ha demostrado que genera un incremento en la síntesis de glutatión en lugar de inhibirla [117,118]. La genotoxicidad de la CYN se relaciona con la activación metabólica de la toxina por medio de las enzimas del citocromo P450 [105]. Se considera que el grupo uracilo y el hidroxilo del C7 (Figura 9) de las CYNs resultan cruciales para la toxicidad de estos compuestos [111,112]. Durante el afloramiento masivo de Cylindrospermopsis raciborskii en Australia, las 148 personas que resultaron intoxicadas presentaron tres estadios diferenciados, comenzando con una hepatitis seguida de una fase de letargo de uno o dos días que daba paso a un proceso diarreico [114]. Aunque no se conocen más casos de intoxicaciones humanas desde la acaecida en Australia, las CYNs se consideran toxinas de distribución global que representan un riesgo para la salud a escala mundial [110]. 1.1.2.3. Anatoxinas-a La clase denominada anatoxina-a (ANA-a) incluye varias neurotoxinas alcaloides. Las toxinas ANA-a se descubrieron a raíz de su implicación en el envenenamiento de ganado vacuno durante una floración masiva de Anabaena flosaquae [119]. La producción de las toxinas ANA-a se vincula a tres géneros de cianobacterias fitoplanctónicas, Anabaena, Aphanizomenon y Planktothrix, y a dos bentónicos, Oscillatoria y Phormidium [21,100]. Las toxinas de este grupo son aminas secundarias bicíclicas, siendo la ANA-a (2-acetil-9-azabiclo[4.2.1]non-2-eno) la molécula representativa de esta clase y la más estudiada, junto con su análogo 2- (propan-1-oxo-1-yl)-9-azabicyclo[4.2.1]non-2-eno, llamado homoANA-a (Figura 10). Recientemente se han descrito dos derivados que se incluyen en este grupo tóxico: la 4-oxohomoanatoxina-a y la 11-carboxianatoxina-a [119,120]. También se considera que forman parte de esta familia los productos de oxidación de la ANA-a y la homoANA-a, que dependiendo de las condiciones ambientales generarán distintos compuestos no tóxicos, epoxio dihidro-, o la 4-hidroxihomoANA-a [121123]. 1. Introducción 21 Figura 10. Estructura química de A) ANA-a y B) homoANA-a. La ANA-a y la homoANA-a actúan como potentes agonistas de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs, del inglés "nicotinic acetylcholine receptors"). Mediante su unión provocan una despolarización continua que bloquea la neurotransmisión [124,125]. Dado que esta es necesaria para la actividad del músculo esquelético, las toxinas ANA-a producen una parálisis muscular que puede resultar letal cuando se ven afectados los músculos respiratorios [102]. De hecho, las intoxicaciones por toxinas ANA-a en animales de laboratorio de pequeño tamaño se caracterizan por la aparición de contracciones musculares involuntarias seguidas de una reducción del movimiento, cianosis, convulsiones y parada respiratoria producida por la parálisis muscular que causa la muerte; los animales de mayor tamaño, envenenados en el campo, sufren colapso y muerte súbita [102]. Actualmente, solo se conoce un posible caso de intoxicación humana por ingesta de agua contaminada con cianobacterias del género Anabaena, pero la identificación del compuesto causante del deceso no fue concluyente [126]. Este grupo de compuestos se han identificado en África, Asia, EEUU y Europa [21]. 1.1.2.4. Toxinas paralizantes Las toxinas paralizantes descritas en agua dulce son sintetizadas por varios géneros de cianobacterias Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium y Planktothrix [13,100]. Las toxinas Lyngbya wollei (LWTX, figura 11) son PSPs cuya producción se ha asociado únicamente a ecosistemas dulceacuícolas [21]. Sin embargo, existe una amplia variedad de moléculas (STX, neoSTX, GTX 1-4, C1/C2, decarbamoilSTX, decarbamoilneoSTX…) producidas por cianobacterias que son estructuralmente idénticas a las que sintetizan los dinoflagelados (Figura 3). A estos compuestos se les ha otorgado una potencia tóxica similar o idéntica a la de las PSPs de origen marino [13,102,105]. 1. Introducción 22 Figura 11. Estructura química de las toxinas Lyngbya wollei o LWTXs, PSPs de agua dulce. Hoy en día, no se han descrito intoxicaciones humanas debidas al consumo de PSPs de origen dulceacuícola y las intoxicaciones en animales son escasas, aunque siempre letales [21,126]. Se han detectado PSPs de agua dulce en Alemania, Australia, Brasil, China, EEUU y México [22]. 1.1.2.5. Toxinas amnésicas La producción de toxinas amnésicas se ha descrito recientemente en estuarios asiáticos asociada con la especie de diatomea bentónica Nitzschia navis-varingica [127,128]. En los estuarios donde se ha detectado la presencia de DA (Figura 5), se han identificado, además, otros análogos de la clase, concretamente el ácido isodomoico-A y el ácido isodomoico-B. La estructura química de las ASPs parece ser independiente del organismo productor y de su ecosistema de origen ya que las moléculas encontradas en estuarios no muestran diferencias estructurales con sus homólogos marinos [129,130]. No se han encontrado datos que especifiquen la toxicidad de las ASPs de origen salobre. 1. Introducción 23 1.2. RIESGO SANITARIO ASOCIADO A TOXINAS ACUÁTICAS Los efectos dañinos que las toxinas acuáticas provocan en el ser humano las convierte en un riesgo sanitario a nivel mundial. Las vías de exposición a las toxinas pueden ser:  por ingesta de organismos acuáticos destinados al consumo humano que hayan incorporado toxinas en sus tejidos [131,132]  por ingesta de o contacto con agua contaminada destinada al consumo humano [131]  por contacto con aguas de recreo, con aerosoles producidos durante las floraciones algales nocivas o con organismos que producen las toxinas [131,132] Actualmente, se ha descrito el aumento en la severidad y en la frecuencia de las proliferaciones algales tóxicas, asimismo se ha constatado la expansión geográfica de organismos toxigénicos y de algunas toxinas. Los primeros informes acerca de la distribución de las PSPs las situaban en áreas del hemisferio norte, sin embargo, a día de hoy está ampliamente aceptado su carácter global [22]. La presencia de las DSPs se asoció inicialmente a Europa, Japón y Suramérica, aunque en la actualidad se reconocen como toxinas distribuidas a nivel mundial [40]. Las ASPs se detectaron por vez primera en Canadá y, más tarde, se identificaron en aguas del Océano Índico y Pacífico, en la costa oeste norteamericana y en Europa [22,49]. Las intoxicaciones por AZAs se asocian al continente europeo pero ya se ha descrito su presencia en varias zonas del Océano Pacífico [56,64]. La aparición de las PLTXs, inicialmente común en aguas del IndoPacífico, es ahora reiterada en áreas del Mar Mediterráneo y del Océano Atlántico [133-135]. En el caso de las toxinas de agua dulce existe una expansión geográfica de cianobacterias, entre ellas las productoras de cianotoxinas, vinculada al incremento de la temperatura del agua [136]. Estos cambios en el patrón de distribución geográfica pueden ser debidos a diversos factores como la eutrofización, la pérdida de biodiversidad, la descarga de agua de lastre que implica el transporte de especies y/o el cambio climático [132,136]. 1. Introducción 24 1.2.1. Límites regulados de toxinas marinas Varias legislaciones nacionales e internacionales preservan la seguridad alimentaria humana restringiendo el contenido de toxinas marinas en los productos que se destinan al consumo. Aunque existen algunas diferencias en cuanto a los límites establecidos, en general, dichas regulaciones son coincidentes. A ello ha contribuido la existencia de directrices elaboradas a través de varias acciones de carácter internacional. En el año 2004, mediante una consulta ad hoc a expertos de la FAO/COI/OMS sobre biotoxinas marinas en moluscos bivalvos, se creó el anteproyecto de la norma para los moluscos bivalvos vivos y elaborados. Durante este encuentro se acordó clasificar las toxinas marinas en base a su estructura química en ocho grupos: AZAs, brevetoxinas, DA, iminas cíclicas, OA, pectenotoxinas, STX y yessotoxinas. Producto de esta consulta se realizó una evaluación de los riesgos que las toxinas conllevan y se establecieron recomendaciones para los niveles máximos de estas ocho clases de toxinas en moluscos bivalvos (Tabla 3) [137]. En Europa, EFSA publicó varias opiniones científicas de paneles de expertos sobre los ocho grupos de toxinas recogidos en la consulta FAO/COI/OMS y algún otro adicional como, por ejemplo, el de las PLTXs. En estas opiniones se detalla información sobre las características químicas de las toxinas, sus efectos, el riesgo que suponen para el ser humano y los métodos de detección descritos para su análisis (oficiales, validados y los más usados). Además, las opiniones de EFSA recomiendan establecer la cantidad máxima de cada grupo de toxinas que debería contener la carne de marisco destinada al consumo humano (Tabla 3) [14,29,51,138-143]. Estos textos, elaborados por expertos internacionales, intentan proteger al ser humano limitando el contenido de biotoxinas en marisco. La aproximación más apropiada para salvaguardar al consumidor sería establecer la ingesta diaria tolerable (TDI), es decir, la cantidad estimada de una sustancia en alimentos, normalmente expresada en base al peso corporal, que puede ser ingerida a diario a lo largo de la vida del individuo sin que se aprecien riesgos para su salud. Sin embargo, la información toxicológica disponible, tanto durante la consulta FAO/COI/OMS como durante la elaboración de las opiniones de EFSA, proviene de estudios realizados a corto plazo y de efecto agudo y, por tanto, solo se pudieron establecer 1. Introducción 31 método, en el procedimiento operativo estándar se establece que se realizará la cuantificación de todos los análogos de cada clase usando la molécula representativa de cada grupo. Mientras la cuantificación del compuesto representativo es directa, la de los demás análogos es indirecta, asumiendo que todas las toxinas de la clase poseen la misma eficiencia de ionización. Cuando los métodos analíticos requieren la aplicación de los TEFs dejan de ser cuantitativos, ya que proporcionan una estimación del contenido real de toxinas en la muestra, es decir, ofrecen datos semicuantitativos. El uso, cada vez más frecuente, de la LC-MS/MS como método de detección multitoxina favorece el análisis simultáneo de varios compuestos [179,180,182,183]. Este diseño experimental permite reducir el gasto por muestra, tanto en reactivos como en tiempo de ejecución. Este ahorro es también significativo durante los procesos de validación. Estos procedimientos que se basan en dos directrices, una europea y otra internacional, implican una importante inversión en esfuerzo y material [181,184]. Una vez validada la técnica, esta se puede establecer como método de análisis rutinario. Aunque en laboratorios con alta carga de trabajo, el uso del LC-MS/MS puede resultar caro, ya que requiere un mantenimiento periódico de los equipos, necesita sistemas de reserva y personal altamente cualificado para su manejo. No obstante, la combinación de técnicas LC-MS/MS con un método funcional validado, que establezca un cribado del número de muestras a analizar, puede resultar altamente eficiente [175]. Otros métodos analíticos, como la resonancia magnética nuclear (NMR, del inglés "nuclear magnetic resonance"), el bombardeo de átomos rápidos (FAB, del inglés "fast-atom bombardment") o la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI, del inglés "matrix assisted laser desorption/ionization"), también se han empleado para dilucidar la estructura química de algunas toxinas. Aunque estas técnicas no se utilizan rutinariamente debido al elevado coste de los equipos y el alto grado de especialización del personal que los maneja. 1.3.2. Métodos biológicos Los métodos biológicos son aquellos que incluyen un componente biológico en el sistema de detección. Su validación es imprescindible para proporcionar alternativas a los métodos analíticos [185]. Los criterios de validación para estos 1. Introducción 32 ensayos de criba, considerados en su mayoría semicuantitativos o cualitativos, difieren de los especificados para ensayos analíticos cuantitativos [15,148]. En cualquier caso, para validarlos también es necesario realizar estudios intrae interlaboratorio y cumplir unos criterios mínimos que demuestren la adecuación del método [148]. 1.3.2.1. Bioensayo El bioensayo consiste en la administración a un animal del extracto obtenido de la muestra y la observación de la aparición de los signos de toxicidad. Generalmente, se usa un mínimo de tres animales por muestra, normalmente ratones o ratas de laboratorio [176]. Los experimentos in vivo presentan varios inconvenientes, puesto que son métodos semicuantitativos con importantes limitaciones técnicas. Por una parte, ofrecen poca sensibilidad, tienen una alta incidencia de falsos positivos, no permiten obtener un perfil de toxinas, son altamente variables y, por lo tanto, de difícil validación. Además, requieren personal cualificado e instalaciones especializadas [186]. Por otra parte, las implicaciones éticas relacionadas con los bioensayos, han propulsado regulaciones legales que proponen la sustitución de este tipo de métodos por otros alternativos [156,187]. Este proceso resulta complejo, ya que el bioensayo actúa como "detector universal" pudiendo revelar toxinas aún no descritas, es decir, ofrece un alto nivel de protección para el consumidor que difícilmente se puede obtener con otro tipo de análisis [185]. 1.3.2.2. Métodos funcionales basados en cultivos celulares Existen múltiples métodos de detección basados en los efectos nocivos que una o varias toxinas acuáticas ejercen sobre un cultivo de células. Los métodos que analizan parámetros como viabilidad/muerte celular o el potencial de membrana son inespecíficos y no selectivos. Aunque este tipo de ensayos resultan ventajosos para desarrollar métodos de criba e incluso permiten desenmascarar compuestos desconocidos. Actualmente se ha prevalidado un citoensayo para la multidetección de OA, AZA1 y pectenotoxina 2 en el que se estudia la viabilidad celular midiendo la actividad metabólica mediante la capacidad reductora de las enzimas oxidoreductasas dependientes de NAD(P)H (nicotinamida adenina dinucleótido 1. Introducción 33 (fosfato)). Durante el ensayo se combina el uso de tres cultivos celulares, con distintos tiempos de cultivo y de incubación con las toxinas [188,189]. También se han desarrollado métodos en microplaca para la detección rutinaria de PSPs con fluorescencia [190] o de otras, como las brevetoxinas o ciguatoxinas [191]. Esta técnica se basa en la medición de los cambios del potencial de membrana provocados por la actuación de dichas toxinas sobre los canales de sodio [190,191]. Los métodos específicos son aquellos en los que la viabilidad celular se cuantifica en función de un evento clave, característico de la toxina, durante el desarrollo de la respuesta celular. Estos ensayos pueden llegar a ser más sensibles que los analíticos como ocurre, por ejemplo, con el citoensayo para las PLTXs. Su especificidad se basa en inhibir la toxicidad celular de la PLTX con ouabaína, un inhibidor de la Na+/K+-ATPasa, o con anticuerpos específicos para la PLTX [96,192]. Los métodos basados en cultivos celulares, en general, son fácilmente ejecutables pero la mayoría resultan inespecíficos y durante el análisis de muestras pueden aparecer interferencias de matriz. Además, dependen del mantenimiento de los cultivos celulares o de una fuente segura y constante de células primarias [186]. 1.3.2.3. Métodos basados en unión a receptor Los métodos basados en receptor se desarrollan usando dianas biológicas de las toxinas marinas. Los primeros experimentos de este tipo consistían en un ensayo competitivo con las toxinas, PSPs o brevetoxinas, marcadas radiactivamente [193,194]. Aunque el método para PSPs ha sido validado, normalmente, el uso de radiactividad no se contempla como una técnica apropiada para tareas rutinarias [154,185,195]. Recientemente se ha validado un ensayo colorimétrico para detectar DSPs que evita la exposición a radiaciones. Este se basa en la inhibición de su diana biológica, las fosfatasas, y se utiliza para su cuantificación en moluscos [196,197]. El uso de receptores alternativos, como el receptor xenobiótico de tunicados, permite detectar la presencia de toxinas de origen marino, en este caso de OA y pectenotoxina 11 [198]. También se han desarrollado métodos competitivos basados en el uso de receptores nicotínicos de acetilcolina o proteínas homólogas, como la extraída del caracol de agua dulce Lymnaea stagnalis, para detectar varias iminas cíclicas. Durante estos ensayos, las toxinas acuáticas compiten con la bungarotoxinaα, una toxina extraída de la serpiente Bungarus multicinctus, por la unión al receptor. 1. Introducción 34 La detección de toxinas se realiza empleando distintas técnicas como la quimioluminiscencia, fluorescencia, colorimetría, polarización de fluorescencia o el Luminex [199-201]. Estos métodos requieren disponer de una fuente segura de suministro de los receptores nicotínicos de acetilcolina o alguna de las proteínas homólogas, reactivos que, en ocasiones, pueden resultar limitados y, por tanto, limitantes. Estas técnicas son de fácil ejecución pero pueden aparecer interferencias durante el análisis de matrices. Son ensayos específicos aunque no selectivos, ya que la diana biológica no ofrece información acerca del tipo ni del contenido de análogos de un grupo presentes en la muestra. 1.3.2.4. Métodos inmunológicos En el campo de las toxinas acuáticas el uso de anticuerpos ha sido una estrategia recurrente a la hora de desarrollar métodos de detección. Actualmente, se han descrito anticuerpos capaces de reconocer a la mayoría de los grupos de toxinas marinas y de agua dulce descritas. De hecho, se han establecido inmunoensayos para detectar ASPs, AZAs, CYNs, DSPs, MCs, PLTXs y PSPs, entre otras [186]. El inmunoensayo puede desarrollarse como un ensayo competitivo o directo y puede aplicarse utilizando varias técnicas como el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), biosensores ópticos como la resonancia de plasmones de superficie (SPR, del inglés "surface plasmon resonance"), biosensores electroquímicos, chips asociados a sistemas de microfluidos… [175,176,186]. El inmunoensayo resulta muy eficaz cuando el anticuerpo permite detectar todos los análogos del grupo y además posee mayor afinidad por las moléculas más tóxicas. Estas dos condiciones pueden llegar a cumplirse en clases de toxinas con pocas variantes estructurales, pero en grupos numerosos es difícil de conseguir. Cuando se usan anticuerpos monoclonales la fuente de suministro del reactivo suele estar asegurada; no es así, cuando los ensayos requieren anticuerpos policlonales, puesto que su producción es limitada. Estas técnicas no permiten estudiar el perfil tóxico y pueden aparecer interferencias al analizar muestras muy complejas. Sin embargo, los inmunoensayos ofrecen una buena alternativa a métodos complejos y caros porque son rápidos y no requieren personal altamente cualificado ni instrumentación sofisticada. 1. Introducción 35 1.4. METODOLOGÍA A continuación se presentan las dos metodologías principalmente empleadas durante el desarrollo de la presente tesis doctoral: la citometría de flujo del sistema Luminex y la cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas (UPLC-MS). 1.4.1. Citometría de flujo de la tecnología Luminex Actualmente, el empleo de métodos multidetección basados en el uso de microesferas acopladas a la citometría de flujo se ha generalizado con fines científicos y clínicos [202]. Estos posibilitan la detección simultánea de varios analitos en una sola muestra, reduciendo el tiempo de manipulación y uso de reactivos. La plataforma Luminex permite desarrollar métodos multidetección mediante la combinación de los principios de la citometría de flujo, el uso de microesferas, la digitalización de señales y la química tradicional. Las microesferas que se usan asociadas a esta tecnología son de poliestireno, tienen un diámetro de 5,6 µm y están internamente marcadas con fluoróforos. El ratio de fluoróforos que contiene permite clasificarlas por su señal espectral en regiones o clases de microesferas. Inicialmente la tecnología Luminex ofrecía la posibilidad de trabajar con 100 regiones distintas, en la actualidad, esta cifra se ha ampliado a 500 para microesferas magnéticas (Figura 12). Figura 12. Esquema de una microesfera de poliestireno (5,6 µm) con grupos carboxilo en su superficie y sin fluoróforos internos junto con las 500 regiones de microesferas diferenciadas mediante distintos ratios de fluoróforos internos. La tecnología Luminex pone a disposición del usuario microesferas magnéticas o no magnéticas con distintas opciones de revestimiento para que cada usuario pueda adaptarlas a sus necesidades experimentales. La superficie de las microesferas puede 1. Introducción 36 estar recubierta de grupos carboxilo, de 24 bases nucleotídicas o de grupos avidina. De los tipos de microesferas disponibles comercialmente para la personalización del ensayo, las más versátiles son aquellas que están recubiertas de grupos carboxilo (Figura 12). Estas posibilitan la unión covalente de ligandos, de modo que cada clase de microesferas puede llegar a ser específica para un determinado analito. Además, existen kits comerciales que incluyen más de 40 regiones de microesferas. Dentro de la variedad de moléculas que el kit permite detectar, el usuario puede seleccionar las de su interés y crear su propio panel multidetección. Para poder detectar los analitos que se unen a las microesferas es necesario marcarlos con otro fluoróforo, generalmente, ficoeritrina. Las microesferas, una vez en el analizador del Luminex, se dirigen mediante una cortina de flujo hacia cámara de lectura, a donde llegan individualmente y se analizan con dos láseres: el de clasificación y el de cuantificación (Figura 13). El láser clasificador, o rojo, excita los fluoróforos internos de la microesfera con una longitud de onda (λ) de 635 nm e identifica a cual de las regiones pertenece según su señal espectral. El láser cuantificador, o verde, excita el fluoróforo con el que se marcó el analito de interés, normalmente la ficoeritrina, usando una longitud de onda de 532 nm y se detecta la emisión, con un filtro de 565-585 nm, relacionada con la cantidad de analito presente en la muestra. Por tanto, la tecnología Luminex permite desarrollar métodos multidetección mediante la incubación simultánea de una muestra con microesferas de varias regiones, siendo cada región específica para un analito. Figura 13. Plataforma Luminex y esquema de la clasificación (láser rojo, λ 635 nm) y la cuantificación (láser verde, λ 532 nm) de las microesferas en un método multidetección. 1. Introducción 37 Los métodos de detección asociados a esta plataforma son inmunológicos, basados en receptor, de genotipado o de expresión génica. La clave del ensayo está en la funcionalización de las microesferas uniendo una determinada molécula a su superficie, de manera que se conviertan en específicas para un determinado analito. Sobre la superficie de las microesferas se puede inmovilizar la molécula detectora, para un ensayo directo, o la molécula a detectar, para un ensayo indirecto, ofreciendo una gran flexibilidad para diseñar el método en base a las necesidades experimentales. En esta tesis doctoral se han utilizado ensayos indirectos o de competición utilizando como moléculas detectoras proteínas, bien anticuerpos o bien receptores, que se unen de forma específica a las toxinas de una clase tóxica concreta. La funcionalización de las microesferas se realiza mediante la inmovilización, por unión covalente, de la molécula de interés que confiere especificidad a la microesfera. Para ello es necesario activar los grupos carboxilo que recubren su superficie. Los carboxilos en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carboiimida (EDC) y n-hidroxisuccinimida (NHS) forman un éster semi-estable. Dicho éster, al reaccionar con una amina, genera un enlace amida estable (Figura 14). La amina de esta reacción puede proceder de la propia molécula a inmovilizar o de una estructura espaciadora o puente, sobre la cual se inmovilizará finalmente la molécula que proporciona especificidad. Mediante esta cadena de reacciones se generan microesferas específicas para cada analito con el objetivo de desarrollar métodos de detección. Figura 14. Esquema de la activación de los grupos carboxilo que recubren la superficie de las microesferas para la inmovilización de los distintos analitos. Los métodos de detección se diseñan inicialmente como ensayos individuales que se optimizan para obtener su máxima sensibilidad. Cuando el fin último es desarrollar una multidetección, es importante que los ensayos individuales compartan condiciones experimentales comunes para aunarlos en un único método de detección múltiple. 1. Introducción 38 1.4.2. Cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas (UPLC-MS) Los métodos basados en el uso de equipos de UPLC-MS permiten el estudio del perfil molecular de la muestra. La separación cromatográfica facilita el desarrollo de ensayos multidetección, aunque el incremento de resolución que los espectrómetros de masas han experimentado en los últimos años posibilita la detección de compuestos que aparecen cromatográficamente solapados. Los equipos de UPLC-MS están compuestos por varios elementos esenciales: el sistema de separación cromatográfica, la fuente de ionización de la muestra, el espectrómetro de masas, el sistema de vacío, el detector y el procesador de datos [203]. La separación cromatográfica de fase reversa es la más comúnmente empleada y consta de una fase estacionaria (no-polar, composición del relleno de la columna) y una fase móvil (polar, consistente en una mezcla de fase acuosa y solvente orgánico, generalmente). Los componentes de la muestra una vez separados a través de las columnas de UPLC pasan a la fuente de ionización. Las moléculas pueden formar iones mediante varios tipos de ionización: por electroespray (ESI), por presión atmosférica (API, del inglés "atmospheric pressure ionization‖), química por presión atmosférica (APCI, del inglés ―atmospheric pressure chemical ionization‖), por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), por resonancia magnética nuclear (NMR), por bombardeo de átomos rápidos (FAB)… La ESI fue la fuente de ionización empleada durante el desarrollo de la presente tesis doctoral. Esta convierte la muestra, que fluye disuelta en un solvente polar y volátil a través de un capilar con carga eléctrica, en un aerosol de gotas altamente cargadas. A medida que el gas de secado evapora el solvente se va incrementando la carga eléctrica de la superficie de las gotas. En consecuencia, cuando la fuerza repulsiva de dichas cargas excede la tensión superficial del solvente, ocurre la fisión y los iones de la muestra se liberan en fase gaseosa. El espectrómetro emplea campos magnéticos y/o eléctricos para transportar los iones generados hasta el detector. Los diferentes analizadores de masas que existen ofrecen distintos rangos de detección de masa/carga (m/z), precisión, resolución y/o velocidad de adquisición, algunos de ellos son: el triple cuadrupolo, la trampa iónica (IT), el tiempo de vuelo (TOF), los sistemas híbridos… Para el desarrollo de los métodos de detección basados en LC-MS que se presentan 1. Introducción 39 en esta tesis doctoral se utilizaron equipos dotados con triple cuadrupolo e IT-TOF. Los equipos triple cuadrupolo cuentan con un primer cuadrupolo que puede escanear todos los iones de la muestra o tan solo seleccionar alguno. A continuación, se localiza la celda de colisión en la que, generalmente, se fracciona algún ion. Finalmente, se encuentra el segundo cuadrupolo que, al igual que el primero, puede escanear todos los iones o seleccionar alguno de ellos. Estos espectrómetros se usan comúnmente en modo de monitorización de reacción múltiple (MRM, del inglés "multiple reaction monitoring"), es decir, seleccionan en el primer cuadrupolo un ion, se fracciona en la celda de colisión y se seleccionan los fragmentos de interés en el segundo cuadrupolo. Los triple cuadrupolo han sido ampliamente empleados en la detección de múltiples tipos moléculas, en diversas áreas científicas, especialmente para cuantificar compuestos ya conocidos [204]. Los equipos IT-TOF-MS acumulan iones en el octopolo que serán seleccionados y/o fraccionados en la IT para ser detectados en función de su tiempo de vuelo en el espectrómetro TOF mediante un detector de masas (Figura 15). Los equipos IT-TOF-MS se han utilizado para la detección, identificación e, incluso, caracterización de nuevas moléculas [204]. Tanto el triple cuadrupolo, como el IT-TOF-MS, permiten la multidetección de varios analitos en un solo pinchazo. Figura 15. Esquema del equipo IT-TOF-MS (Shimadzu). 3. Publicaciones 47 3. PUBLICACIONES En esta sección se recopila la metodología empleada para la realización de los experimentos, los resultados obtenidos durante el desarrollo de la presente tesis doctoral y las discusiones correspondientes. El conjunto de datos se encuentra recogido en cinco publicaciones, cuatro artículos y un acta, anexa al segundo artículo. Para su presentación se subdividen en dos bloques de métodos de detección en función del origen de las toxinas: marino y de agua dulce/salobre. BLOQUE 1. DISEÑO, DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS MARINAS Artículo 1. Detection of paralytic shellfish toxins by a solid-phase inhibition immunoassay using a microsphere-flow cytometry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao, Katrina Campbell, Christopher T. Elliott, Kentaro Kawatsu, Mercedes R. Vieytes y Luis M. Botana. Publicado en 2012 en Analytical Chemistry 84 (10): 4350-6. Este artículo explora la capacidad para inmunodetectar STX y sus análogos mediante un ensayo de fase sólida usando microesferas y el sistema de detección basado en la citometría de flujo en un equipo Luminex 200. La técnica consiste en la competición de las toxinas en solución con la STX unida a las microesferas por unirse al anticuerpo monoclonal anti-GTX2/3 (GT-13A). Este método detecta la STX en la solución de ensayo (tampón) y en extracto de mejillón en un rango de 2,2 (concentración inhibitoria al 20 %, IC20) a 19,7 ng/mL (IC80). Además, la reactividad cruzada del ensayo con otras toxinas del grupo, semejante a la de otros inmunoensayos previamente publicados, permite detectar la mayoría de los análogos excepto los hidroxilados en N1. El método es compatible con una extracción con metanol y tampón acetato y proporciona una recuperación de STX cercana al 100 %. Este inmunoensayo se puede utilizar como método de criba para detectar STX en un rango entre 260 y 2360 μg/kg. Por tanto, el uso de microesferas acopladas al sistema de citometría de flujo proporciona una sensibilidad similar a la publicada para otros inmunoensayos y ofrece un sólido precedente para el desarrollo de un método sencillo y flexible para la multidetección de toxinas en una sola muestra. 3. Publicaciones 48 Artículo 2. Multidetection of paralytic, diarrheic, and amnesic shellfish toxins by an inhibition immunoassay using a microsphere-flow cytometry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao, Paula Rodríguez, Katrina Campbell, Christopher T. Elliott y Luis M. Botana. Publicado en 2013 en Analytical Chemistry 85 (16): 7794-802. Este artículo presenta el diseño, desarrollo y optimización del método para multidetectar PSPs, DSPs y ASPs de origen marino en muestras de marisco basado en la tecnología xMap de Luminex. El método multitoxina consiste en realizar tres inmunoensayos competitivos simultáneos. Las toxinas en solución compiten con las toxinas inmovilizadas en la superficie de tres clases de microesferas por unirse al anticuerpo monoclonal específico correspondiente. Las IC50 obtenidas en la solución experimental (tampón) resultaron similares en la detección individual de las toxinas y en la múltiple: 5,6 ± 1,1 ng/mL para STX, 1,1 ± 0,03 ng/mL para OA y 1,9 ± 0,1 ng/mL para DA. El protocolo de preparación de las muestras se optimizó para extraer simultáneamente STX, OA y DA usando una mezcla de metanol y tampón acetato. Los tres inmunoensayos son compatibles con extractos de dos tipos de matrices, mejillón y viera, mostrando rangos dinámicos (IC20-IC80) apropiados y buenos valores de recuperación (cercanos al 90 % para STX, 80 % para OA y 100 % para DA). Este inmunoensayo multitoxina basado en el uso de microesferas proporciona un método de criba sencillo y rápido capaz de detectar simultáneamente, en la misma muestra, tres grupos de toxinas marinas cuya presencia en el marisco está regulada. Acta anexa al artículo 2. Sensitivity improvement of an immuno-detection method for azaspiracids based on the use of microspheres coupled to a flow-fluorimetry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao y Luis M. Botana. Publicado en 2014 en Frontiers in Marine Science como resumen de la presentación oral en el IMMR (International Meeting on Marine Research). Este anexo recoge la modificación de un método previamente desarrollado para detectar AZAs utilizando el sistema Luminex [205]. Esta modificación, que consiste en inmovilizar un análogo diferente en la microesfera, permite aumentar la sensibilidad de este método inmunológico hasta 3 ó 4 veces o minimizar el tiempo experimental. 3. Publicaciones 49 Artículo 3. Detection of palytoxin-like compounds by a flow cytometry-based immunoassay supported by functional and analytical methods. María Fraga, Natalia Vilariño, M Carmen Louzao, Diego A. Fernández, Mark Poli y Luis M. Botana. Sometido en septiembre del 2015 para su publicación en Analytica Chimica Acta. Este trabajo describe el diseño y optimización de un ensayo semicuantitativo para detectar las moléculas del grupo de las PLTXs desarrollado mediante el uso de la tecnología Luminex. El método se basa en la competición de las PLTXs que se encuentran libres en una solución y de la PLTX inmovilizada en la superficie de las microesferas por unirse a un anticuerpo monoclonal anti-PLTX. El ensayo muestra una IC50 de 1,83 nM y un rango dinámico (IC20-IC80) de 0,47-6,54 nM para la PLTX. La aplicación de un protocolo de extracción sencillo, basado en el uso de una mezcla de metanol y tampón acetato, a muestras de mejillón artificialmente contaminadas proporcionó una recuperación de 104 ± 8 % y un rango de detección para la PLTX de 0,47 a 6,54 nM. Además, se analizaron extractos de Ostreopsis cf. siamensis y Palythoa tuberculosa que resultaron positivos para moléculas tipo PLTX. Aunque, los resultados obtenidos con la muestra de coral sugieren que este anticuerpo no detecta con eficiencia la 42-hidroxiPLTX Estas mismas muestras se analizaron con un ensayo de citotoxicidad, basado en la pérdida de viabilidad en las células de neuroblastoma ocasionada por la presencia de toxina, y con un UPLC-IT-TOF-MS que también indicaron la presencia de compuestos tipo PLTX. Por tanto, este método optimizado para detectar individualmente PLTX proporciona una herramienta semicuantitativa útil para el cribado de moléculas tipo PLTX en distintas matrices. 3. Publicaciones 50 BLOQUE 2. DISEÑO, DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS DE AGUA DULCE O SALOBRE Artículo 4. Multi-detection method for five common microalgal toxins based on the use of microspheres coupled to a flow-cytometry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao, Laura P. Rodríguez, Amparo Alfonso, Katrina Campbell, Christopher T. Elliott, Palmer Taylor, Vítor Ramos, Vítor Vasconcelos y Luis M. Botana. Publicado en 2014 en Analytica Chimica Acta 850 (19): 57–6. Este artículo muestra el desarrollo y optimización de un método diseñado para la multidetección de cinco grupos de toxinas propias de ecosistemas de agua dulce y salobre: MCs, CYNs, toxinas ANA-a, PSPs y ASPs. Se desarrollaron cinco ensayos inhibitorios que emplean distintas proteínas detectoras y clases de microesferas acopladas al sistema de citometría de flujo de Luminex. A continuación, se combinaron los ensayos en un solo método para la detección simultánea de las toxinas. Las IC50 obtenidas con este método fueron 1,9 ± 0,1 µg/L para MC-LR, 1,3 ± 0,1 µg/L para CYN, 61 ± 4 µg/L para ANA-a, 5,4 ± 0,4 µg/L para STX y 4,9 ± 0,9 µg/L para DA. Se extrajeron muestras de cultivos de cianobacterias liofilizadas usando un proceso simple y se analizaron mediante el método de Luminex y por UPLC-IT-TOF-MS. La cuantificación obtenida por ambos métodos fue similar para todas las toxinas excepto para ANA-a, mostrando un menor contenido estimado por UPLC-IT-TOF-MS. Por tanto, este nuevo método multitoxina proporciona una herramienta de criba rápida, sencilla y semicuantitativa para la detección simultánea de cinco toxinas de agua dulce y salobre, medioambientalmente importantes, en la solución de ensayo (tampón) y en extractos de cianobacterias. 3. Publicaciones BLOQUE 1. DISEÑO, DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS MARINAS 3. Publicaciones Artículo 1. Detection of paralytic shellfish toxins by a solid-phase inhibition immunoassay using a microsphere-flow cytometry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao, Katrina Campbell, Christopher T. Elliott, Kentaro Kawatsu, Mercedes R. Vieytes y Luis M. Botana. Publicado en 2012 en Analytical Chemistry 84 (10): 4350-6. 3. Publicaciones Acta anexa al artículo 2. Sensitivity improvement of an immuno-detection method for azaspiracids based on the use of microspheres coupled to a flowfluorimetry system. María Fraga, Natalia Vilariño, M. Carmen Louzao y Luis M. Botana. Publicado en 2014 en Frontiers in Marine Science como resumen de la presentación oral en el IMMR (International Meeting on Marine Research). 3. Publicaciones 83 http://www.frontiersin.org/10.3389/conf.FMARS.2014.02.00166/event_abstract 3. Publicaciones Artículo 3. Detection of palytoxin-like compounds by a flow cytometry-based immunoassay supported by functional and analytical methods. María Fraga, Natalia Vilariño, M Carmen Louzao, Diego A. Fernández, Mark Poli y Luis M. Botana. Sometido para su publicación en Analytica Chimica Acta en septiembre del 2015. 3. Publicaciones 95 3. Publicaciones 96 3. Publicaciones 97 3. Publicaciones 98 3. Publicaciones 105 3. Publicaciones 106 3. Publicaciones 107 3. Publicaciones 108 3. Publicaciones 109 3. Publicaciones 110 3. Publicaciones 111 3. Publicaciones 112 3. Publicaciones 113 3. Publicaciones 114 3. Publicaciones 121 3. Publicaciones 122 3. Publicaciones 123 3. Publicaciones 124 3. Publicaciones 125 3. Publicaciones 126 3. Publicaciones 127 3. Publicaciones 128 3. Publicaciones 129 3. Publicaciones 130 3. Publicaciones 137 3. Publicaciones 138 3. Publicaciones 139 3. Publicaciones 140 3. Publicaciones 141 3. Publicaciones 142 3. Publicaciones BLOQUE 2. DISEÑO, DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE TOXINAS DE AGUA DULCE O SALOBRE 4. Discusión 167 4. DISCUSIÓN La legislación del contenido máximo de las toxinas acuáticas en productos destinados al consumo humano ha impulsado el desarrollo de diversos métodos de detección. El bioensayo ha sido históricamente empleado en la identificación de la toxicidad de muestras acuáticas pero actualmente su uso como método oficial ha quedado relegado al grupo de las PSPs de origen marino. Los inconvenientes metodológicos, las limitaciones técnicas e implicaciones éticas del bioensayo han promovido la publicación de regulaciones que proponen minimizar el uso de animales de laboratorio. Hoy en día, la mayoría de los métodos oficiales y/o validados para la detección de las toxinas marinas se basan en el uso de LC-MS. Pero para un laboratorio de análisis rutinario esta metodología suele implicar un alto gasto y resultar lenta o ineficiente cuando se trabaja con un gran número de muestras. Con la finalidad de reducir costes y aumentar la eficacia de los análisis se ha impulsado el desarrollo de ensayos alternativos más baratos, simples y rápidos que permiten cribar las muestras a analizar por métodos confirmatorios. En esta tesis doctoral se presentan ocho métodos de detección individual optimizados, basados en el uso de anticuerpos o dianas biológicas y la plataforma Luminex. Aplicando la potencialidad del sistema Luminex algunos de estos ensayos individuales se combinaron en métodos multidetección para toxinas de aparición reiterada y simultánea. Así se generó un método para multidetectar tres grupos de toxinas marinas, otro para cinco grupos de toxinas de agua dulce y/o salobre y dos métodos individuales para toxinas marinas, que resultan compatibles en cuanto a tiempos de incubación y solución de extracción, con el método multidetección. La validez de todos los métodos como herramienta semicuantitativa se evaluó mediante la comparación con resultados obtenidos por métodos confirmatorios, basados en UPLC-MS, en su mayoría. Inicialmente, se exploró la eficacia y la sensibilidad de la plataforma Luminex para inmunodetectar el grupo marino de las PSPs, en solución de ensayo y en extracto de mejillón. El método mostró una sensibilidad y reactividad cruzada similares a las que presentan otros inmunoensayos usando el mismo anticuerpo monoclonal anti-PSPs [206-209]. Resultados similares se obtuvieron durante el posterior desarrollo de métodos individuales para PSPs de agua dulce, así como, en 4. Discusión 168 los métodos multidetección, indicando la idoneidad de este sistema como alternativa a otros formatos de inmunoensayo. Igualmente, los inmunoensayos desarrollados posteriormente para el resto de los grupos, AZA, ANA-a, CYN, DA, MC, OA y PLTX, han demostrado capacidades de detección semejantes a las de otros inmunoensayos previamente publicados [82,205,210-213]. Estos resultados confirman que la plataforma de detección sobre microesferas utilizando citometría de flujo es adecuada para proporcionar sensibilidades similares a las de métodos tradicionales y a las de otros innovadores. Tras comprobar la adecuación y prestaciones de la tecnología Luminex en términos de sensibilidad y sencillez experimental los esfuerzos se focalizaron en desarrollar un método multidetección para PSPs, DSPs y ASPs, dada su reiterada y simultánea aparición y/o bioacumulación [165-167]. La conjugación de varios métodos individuales en una detección multitoxina mantiene su sensibilidad y rango de detección originales y comparables a los de otros inmunoensayos [206,210,213215]. Del mismo modo, la transferencia de los cinco métodos individuales para toxinas de agua dulce y salobre, MCs, CYNs, toxinas ANA-a, PSPs y ASPs, a detección múltiple tampoco generó problemas, excepto para la ANA-a. En este caso, la combinación con los demás métodos individuales generó una interferencia con la señal basal, pero no impidió obtener una curva dosis-respuesta y detectar la toxina. La aparición de este tipo de interferencias entre los reactivos de distintos ensayos individuales ya se ha descrito con anterioridad, por ello, es necesario comprobar siempre de forma empírica si son compatibles cuando se combinan. Este método multidetección para toxinas dulceacuícolas proporciona una sensibilidad similar a la de otros inmunoensayos previamente publicados [212]. Los protocolos empleados para la ejecución de los métodos multitoxina descritos resultó sencillo, facilitando y acelerando el análisis de muestras que contenían varios tipos de toxinas. Como anexo al método multitoxina de origen marino se presenta la optimización de un ensayo previamente desarrollado para detectar otro grupo de toxinas actualmente regulado, los AZAs [205]. La puesta a punto, basada principalmente en la naturaleza de la molécula inmovilizada, permite: 1) obtener la misma sensibilidad que la inicialmente publicada pero reduciendo 14 h el tiempo experimental o 2) mejorar entre 3 y 4 veces la sensibilidad manteniendo constante el tiempo del ensayo. Esto demuestra que la sensibilidad de los métodos inmunológicos 4. Discusión 169 presentados en esta tesis puede potenciarse modificando parámetros de los ensayos, que en este momento se han adecuado a las regulaciones vigentes, pero que podrían requerir futuros ajustes ante modificaciones legales del contenido tóxico en productos destinados al consumo humano. Entre los parámetros que pueden afectar a la sensibilidad y que son susceptibles de proporcionar futuras adaptaciones de los métodos, de ser necesario, está no solo el análogo inmovilizado sino también la cantidad de molécula inmovilizada, la concentración de las proteínas de reconocimiento, el fluoróforo, la estrategia de inmovilización, el número de microesferas o los tiempos de incubación. Los ensayos resultantes de esta optimización se diseñaron para facilitar la futura inclusión del método individual de AZAs en la multidetección. Tal como se indicó anteriormente es necesario comprobar empíricamente su compatibilidad pero la aparición de interferencias que imposibiliten la detección parece poco frecuente. Además, se desarrolló y optimizó un inmunoensayo para detectar las toxinas del grupo de las PLTXs en mejillón, dinoflagelados y corales, aunque esta clase tóxica aún no está regulada. Al igual que en el caso anterior, para su puesta a punto se mantuvieron constantes los parámetros del método que permitirían su anexión a la multidetección de PSPs, DSPs y ASPs, de modo que es posible también adicionarlo en un futuro a este método multitoxina de agua salada. Uno de los puntos críticos en la multidetección es obtener un protocolo de preparación de muestra válido para todas las toxinas que se quieren detectar. El proceso de preparación de muestra para un método de criba debe ser sencillo y rápido, además, la solución empleada ha de ser capaz de extraer eficazmente todos los grupos de toxinas incluidos en la multidetección y minimizar la aparición de interferencias. Tras la realización de varias pruebas con los distintos métodos inmunológicos individuales, se concluyó que el metanol es el solvente que menos interfiere en la capacidad de unión de las moléculas detectoras utilizadas, siendo los ensayos compatibles con concentraciones de metanol <20 % en el pocillo. Sin embargo, la eliminación de las interferencias que generan las matrices, tanto marinas como dulceacuícolas, requirió una mayor dilución de los extractos en algunos casos. El método de extracción múltiple para las toxinas marinas fue el más difícil de optimizar, pues precisó el uso de una solución capaz de extraer moléculas hidrofílicas y lipofílicas de matrices complejas como son las de mariscos bivalvos, en este caso 4. Discusión 170 mejillón y vieira, que suelen ser problemáticas en cuestión de interferencias con este tipo de métodos. De hecho, el extracto de vieira generó una interferencia mayor que el de mejillón y no permitía la detección, por lo que fue necesario incrementar la sensibilidad del ensayo para utilizar extractos más diluidos sin aumentar la complejidad de la extracción. Por consiguiente, se optimizó la sensibilidad del método para poder detectar las toxinas PSPs, DSPs y ASPs dentro de sus límites regulados. Para ello se utilizó un tiempo incubación más largo y una concentración de anticuerpo menor para incrementar la sensibilidad. De este mismo modo se manipuló la sensibilidad para la MC-LR. Por lo tanto, aunque en las condiciones presentadas estos métodos se adecuan a las regulaciones actuales, esta tecnología es susceptible de optimización en varios parámetros para combinar sensibilidad y ausencia de interferencias con nuevas matrices, permitiendo la adaptación de los métodos a futuras necesidades de detección. Como puede ser necesario para la PLTX, para la que no hay una legislación vigente que sirviese de orientación a la hora de ajustar la sensibilidad de esta detección. Una vez optimizados todos los parámetros experimentales para analizar los extractos de moluscos bivalvos se consiguió recuperar aproximadamente un 90 % de STX, 80 % de OA, 100 % de DA y 100 % de PLTX. La recuperación para AZAs utilizando el mismo protocolo fue del 87 % [205]. Estos resultados demuestran la efectividad del método de extracción, tanto en ensayos individuales como en multidetección, para las toxinas de origen marino. Además, el protocolo de extracción ha de adecuarse a las características de la matriz que en el caso de las toxinas de agua dulce se realiza a partir de cianobacterias y requiere la ruptura de las células. De este modo, en estos métodos la eficacia del proceso está directamente ligada a la introducción de un paso de sonicación, el cual proporcionó una eficiencia de extracción de las toxinas de agua dulce comparable a la de las toxinas marinas. Para demostrar la validez de estos métodos de detección resulta esencial conocer la capacidad de la técnica para detectar la variedad de compuestos tóxicos de cada clase. En general, esta capacidad se corresponde con la afinidad de las proteínas detectoras por los distintos análogos del grupo, aunque podría verse afectada por otros factores. Durante el desarrollo del método basado en el uso del Luminex para detectar PSPs se analizó la reactividad cruzada del anticuerpo anti-PSPs. Este permite detectar la mayoría de los análogos, excepto los hidroxilados en la posición 4. Discusión 171 N1 (Figura 3). Esta reactividad cruzada se corresponde con la descrita para este mismo anticuerpo en otras plataformas de detección como los biosensores [206-208]. Los resultados obtenidos demuestran que la tecnología de detección con microesferas y citometría de flujo no afecta a la capacidad de detección de distintos análogos cuando se utilizan los mismos reactivos y estrategias de inmovilización. Por lo tanto, al igual que en otros inmunoensayos para PSPs, este método permitiría identificar la mayoría de las muestras como positivas [216,217]; dado que, tal como reflejan varios estudios, los perfiles tóxicos de organismos marinos y dulceacuícolas afectados por floraciones algales nocivas por PSPs suelen contener una mezcla de análogos [12,218,219]. Sin embargo, este método infraestimaría la toxicidad de aquellas muestras que contengan un alto porcentaje de PSPs hidroxiladas en N1 [217,220], algunas de ellas con TEFs similares a los de la STX [14,21,102]. En el caso de los métodos para DSPs y AZAs, la reactividad cruzada de los anticuerpos, previamente caracterizada, indica que pueden detectar los análogos regulados. La reactividad cruzada del anticuerpo anti-DSPs es coincidente con los TEFs del OA, DTX1 y DTX2, y es también capaz de detectar la DTX3 [210,221]. El anticuerpo anti-AZAs interacciona con las tres moléculas de AZAs reguladas, AZA1-3, y su reactividad cruzada, aunque no se corresponde con los TEFs, es aceptable [205]. Para las PLTXs, el anticuerpo anti-PLTX es afín a la molécula representativa, pero no es capaz de detectar la 42-hidroxiPLTX, para la cual se asume la misma potencia tóxica que para la PLTX [80], tal como evidenció la comparación con los datos obtenidos para las muestras de coral por UPLC-MS y citotoxicidad. Estos datos concuerdan con los previamente publicados [82,222], demostrando nuevamente la similitud que ofrece la metodología Luminex respecto a otros inmunoensayos. Los resultados obtenidos por el citoensayo, basado en el uso de neuroblastoma BE(2)-M17 y siguiendo las pautas previamente establecidas [96], para las muestras de Ostreopsis cf. siamensis confirmaron la presencia de moléculas tipo PLTX en un rango de concentración similar al conseguido por el inmunoensayo. El análisis por UPLC-MSIT-TOF de los extractos de O. cf. siamensis, que resultó complejo por la escasa concentración molar de compuestos sospechosos de pertenecer a la clase de las PLTXs, permitió, tras la optimización del procedimiento de limpieza, detectar la presencia de siete moléculas con espectros tipo PLTX. La comparación de los resultados del ensayo inmunológico y del UPLC-MS parece indicar que el anticuerpo 4. Discusión 172 anti-PLTX es capaz de detectar, al menos, alguna de las cuatro moléculas que, a juzgar por sus espectros, podrían pertenecen al grupo de las PLTXs y estar relacionadas con la ostreocina-d, aunque nunca se han descrito. Esto apoyaría la toxicidad de O. cf. siamensis relacionada con compuestos del grupo de las PLTXs demostrada en varios trabajos previamente publicados, en los que nunca se aportaron datos conseguidos mediante análisis por LC-MS [96,223,224] probablemente debido falta de estándares y la baja sensibilidad. Así, los resultados obtenidos permiten concluir que el método de inmunodetección desarrollado con Luminex, a pesar de la baja reactividad cruzada del anticuerpo anti-PLTX con moléculas tipo PLTX hidroxiladas en la posición C42, es capaz de detectar otras toxinas potencialmente pertenecientes a la clase de las PLTXs. Incluso se ha publicado que este anticuerpo puede interaccionar con las ovatoxinas [225], lo que resulta sorprendente, dado que se ha descrito que muchas de estas moléculas están hidroxiladas en C42 [72,92,95]. Sin embargo, estos datos no hacen referencia a la afinidad o reactividad cruzada, sino que se basan en técnicas de inmunocitoquímica que no resultan adecuados para realizar la evaluación de estos parámetros. Tal como ocurre para las PSPs, el anticuerpo anti-PLTX no cubre el espectro completo de análogos tóxicos del grupo pero la capacidad de detección del método individual para PSPs y de los métodos multitoxina que lo engloban podría incrementarse mediante la incorporación de un anticuerpo anti-N1-hidroxi-PSPs. Esta aproximación se ha realizado con éxito en un sistema multidetección basado en un método de resonancia de plasmones de superficie (SPR) pero no es reproducible por la falta de disponibilidad de dicho anticuerpo [214]. La misma opción es válida para la detección de las PLTXs, aunque por el momento no se conoce ningún anticuerpo con capacidad para interaccionar con la 42-hidroxiPLTX. En el caso de las toxinas de agua dulce, el anticuerpo antiCYN se ajusta a los datos de toxicidad existentes [112,226]. La caracterización del anticuerpo anti-MCs no estaba publicada, así que se estudió su reactividad cruzada con las MCs más comunes, MC-LR, MC-RR y MC-YR, que resultó ser concordante con los escasos datos que existen sobre su toxicidad in vivo [227,228]. La carencia de análogos de DA no permitió estudiar la reactividad cruzada del anticuerpo anti-ASPs y tampoco se pudo analizar la afinidad de la proteína de unión a acetilcolina de Lymnaea stagnalis por falta de análogos de toxinas ANA-a. De modo que, a la vista de las reactividades cruzadas conocidas, los métodos desarrollados con Luminex 4. Discusión 173 permitirían, en general, detectar la presencia de una mezcla de toxinas del mismo grupo en una muestra. La desventaja de estos inmunoensayos para los grupos con más análogos es que, si en el perfil tóxico predominan compuestos tóxicos que las moléculas de reconocimiento detectan con baja/moderada afinidad, los métodos podrían infraestimar la toxicidad de las muestras analizadas. Por esto, resulta necesario realizar una caracterización pormenorizada de las proteínas de reconocimiento y poder disponer de moléculas alternativas que detecten la variedad de análogos que compone cada clase de toxinas. En este sentido el sistema Luminex ofrece la ventaja de incorporar nuevas moléculas detectoras sin tener que hacer modificaciones instrumentales, facilitando el proceso de multidetección de los análogos. La capacidad de los ensayos basados en el uso de la tecnología Luminex para estimar la cantidad de toxina en una muestra se demostró comparando los resultados con los obtenidos por otros métodos de detección. Se analizaron los mismos extractos mediante el sistema Luminex y mediante equipos de UPLC-MS/MS. En el caso de las PLTXs se usó además un segundo método confirmatorio: un ensayo citotóxico. Para las inmunodetecciones múltiples, de toxinas marinas y dulceacuícolas, las cuantificaciones obtenidas fueron muy similares a las del LCMS/MS y los negativos para cada grupo (ausencia de toxina) fueron también coincidentes. Estos resultados demuestran la eficacia de los métodos multidetección como herramienta para la criba de muestras. En el caso de la PLTX la ausencia de estándares para otras moléculas del grupo y la complejidad de las muestras impidió la total cuantificación e identificación por otros métodos y, por ende, la comparación adecuada de los resultados. Aunque los datos obtenidos por UPLC-MS y el citoensayo parecen indicar que el método desarrollado con la plataforma Luminex es apropiado para realizar una estimación de la concentración de PLTX. Estos ensayos son semicuantitativos si el perfil tóxico de la muestra es muy complejo, ya que estiman la concentración de toxinas en función de la molécula representativa disponible, pero se consideran cuantitativos cuando las muestras contaminadas con un único compuesto se cuantifican usando el mismo análogo como calibrante [38,117,229,230]. Desde hace más de una década se ha constatado un incremento en el número y variedad de metodologías inmunológicas o basadas en receptor para detectar 4. Discusión 174 individualmente o mediante multidetección toxinas de origen marino, dulceacuícola o salobre como las PSPs, DSPs ASPs, MCs, CYNs y/o toxinas ANA-a [212,231234]. El desarrollo de métodos multitoxina se ha acentuado en los últimos años con el uso de biosensores basados en la resonancia de plasmón superficial (SPR) o el LCMS/MS entre otros [179,180,209,214-216,235-237]. La multidetección basada en resonancia de plasmones de superficie (SPR) se ha desarrollado para toxinas marinas en tres modalidades para detectar 1) STX, OA y DA [215], 2) STX, neoSTX, OA y DA [214] y 3) STX, OA, DA y PLTX [216]. Los métodos presentan buenos resultados de sensibilidad usando una pequeña cantidad de muestra, sin embargo, el número de analitos a detectar y el número de muestras a analizar es limitado y requieren largos tiempos de análisis [214-216]. También se han desarrollado inmunoensayos multidetección para toxinas marinas y de agua dulce empleando chips alternativos a los que tradicionalmente se usan para la resonancia de plasmones de superficie (SPR). Algunos ejemplos son chips de cristal que permiten al usuario escoger la superficie de unión sobre la que posteriormente se adhieren los distintos tipos de analitos, microesferas acopladas a sistemas de microfluidos o cartuchos comerciales portátiles. El ensayo que combina el uso de chips de cristal y quimioluminiscencia para multidetectar tres grupos de toxinas de origen marino (STX, OA y DA) requiere un elevado volumen de muestra (500 µL) y, aunque se pueden reutilizar los chips, este proceso provoca una caída de la señal que implica el uso de una corrección adicional de los datos brutos para poder obtener resultados coherentes [209]. El método que emplea microesferas permite multidetectar tres clases de toxinas de agua dulce (MC-LR, CYN y STX) mediante un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) realizado en fase sólida, es decir sobre la superficie de las microesferas, con la ayuda de un sistema de microfluidos y microcolumnas. Su diseño limita el número de compuestos a detectar, es un dispositivo que no se encuentra disponible comercialmente y resulta una técnica lenta [235]. El otro ensayo de inmunodetección múltiple para cinco clases tóxicas (MCLR, CYN, STX, OA y DA) emplea cartuchos comerciales sobre los que inmoviliza las toxinas. Aunque el número de analitos o de muestras a multidetectar se puede aumentar usando cartuchos adicionales, cada cartucho solo permite realizar 11 análisis dado el tamaño de su superficie y el alto número de réplicas que requiere. Por tanto, aunque sus componentes están disponibles comercialmente, resulta un 4. Discusión 175 método lento, especialmente si es necesario analizar muchas muestras y/o analitos [236]. Actualmente muchos de los métodos existentes para multidetectar toxinas dulceacuícolas están basados en el uso de LC-MS/MS. Los ensayos analíticos permiten cuantificar e identificar múltiples análogos de diversas clases de toxinas, siempre y cuando, los estándares estén disponibles [179,180,237]. En el caso de las toxinas marinas existen métodos para la detección de varias toxinas lipofílicas, como el estandarizado por el EU-RLMB [157], o de distintos análogos de la misma clase como el preCOX o el PCOX para las PSPs [151-153], aunque hasta el momento, no se ha publicado ningún método analítico que permita detectar simultáneamente las toxinas liposolubles y PSPs. Estas técnicas analíticas se consideran, generalmente, cuantitativas, pero si no se dispone de los análogos presentes en las muestras y se desconoce la eficiencia de ionización de los mismos, la metodología se considera semicuantitativa. Los métodos desarrollados en la presente tesis doctoral, usando como base la tecnología Luminex, permiten detectar toxinas acuáticas con la misma eficiencia que otros ensayos de características similares previamente publicados. Sin embargo, la plataforma Luminex ofrece la posibilidad de combinar varias detecciones individuales en un solo método multidetección con una tecnología rápida, sencilla y barata. Esta conjunción consigue reducir tiempos experimentales, ahorrar reactivos y volumen de muestra que, en muchas ocasiones, resulta limitante. La eficacia puede ser mayor si la multidetección se aplica como método de criba para reducir el número de muestras a analizar por métodos oficiales, como los analíticos o el bioensayo. Los métodos analíticos resultan caros pues requieren personal altamente cualificado, instrumentos de alto coste, sistemas de reserva (gaseosa y eléctrica) acoplados, uso de solventes de gran pureza y el tiempo de análisis para algunos compuestos es demasiado alto. Además, aunque la validación para métodos analíticos y semicuantitativos es laboriosa, la de los métodos analíticos tiene que cumplir, a mayores de los requisitos que establece la CE 2002/657 [184], los parámetros específicos de sensibilidad determinados por la comisión del Codex Alimentarius [181]. El bioensayo plantea importantes limitaciones técnicas, puesto que es semicuantitativo, genera falsos positivos, posee alta variabilidad y baja sensibilidad. Asimismo, implica el uso de instalaciones especializadas, personal con formación específica sobre manejo de animales de experimentación y conlleva 4. Discusión 176 implicaciones éticas. En este sentido, el sistema Luminex es un equipo relativamente económico y ofrece varios kits comerciales con distintos tipos de microesferas que el investigador puede personalizar para realizar detecciones múltiples o simples, según las necesidades experimentales. Teóricamente, con esta tecnología se pueden llegar a multidetectar un máximo de 500 analitos, pero en la práctica es necesario tener en cuenta los problemas derivados de la reactividad cruzada y las interferencias. No obstante, en el mercado se han encontrado kits comerciales que posibilitan la detección simultánea de más de 40 analitos. Además, el sistema Luminex facilita el incremento del número de analitos a detectar o de muestras a analizar sin necesidad de realizar modificaciones estructurales ni instrumentales, tan solo, requiere usar microesferas y microplacas adicionales. Esta flexibilidad de la metodología, junto con la posible adaptación a otras plataformas comerciales de detección basadas en citometría de flujo y microesferas, la convierten en una alternativa de interés comercial. Por tanto, esta tecnología, de uso sencillo, nos ha permitido desarrollar métodos multidetección semicuantitativos, robustos y sensibles, empleando tiempos de análisis rápidos y constantes.