Análisis integrado de enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero y sus repercusiones en salud pública en el Noroeste de España

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Cynthia López Novo Tesis doctoral Análisis integrado de enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero y sus repercusiones en salud pública en el Noroeste de España Lugo, 2023 Programa de doctorado en Medicina y Sanidad Veterinaria TESIS DE DOCTORADO ANÁLISIS INTEGRADO DE ENTEROPATÓGENOS IMPLICADOS EN LA DIARREA NEONATAL DEL TERNERO Y SUS REPERCUSIONES EN SALUD PÚBLICA EN EL NOROESTE DE ESPAÑA Cynthia López Novo ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA Y SANIDAD VETERINARIA LUGO 2023 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Cynthia López Novo Título de la tesis: Análisis integrado de enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero y sus repercusiones en salud pública en el Noroeste de España Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Lugo, 24 de julio de 2023. Firma electrónica DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES La doctoranda declara no tener ningún conflicto de interés en relación a la presente Tesis Doctoral. En Lugo, a 24 de Julio de 2023 Fdo. Cynthia López Novo FINANCIACIÓN Este trabajo se ha realizado gracias a la concesión de las siguientes ayudas y proyectos de investigación: • Ayudas para la Formación del Profesorado Universitario 2019 (FPU 19/02069). Ministerio de Universidades. Gobierno de España. • Ayudas de apoyo a la etapa predoctoral en las universidades del Sistema Universitario de Galicia, en los organismos públicos de investigación de Galicia y en otras entidades del Sistema gallego de I+D+i (ED481A-2019/032). Consellería de Educación, Universidade e Formación Profesional. Xunta de Galicia. • Retos Investigación: Proyectos I+D+i 2016 (AGL2016-73034P). Ministerio de Esconomía y Competitividad. Gobierno de España. Investigador principal: María Patrocinio Morrondo Pelayo • Ayudas para la consolidación y estructuración de unidades de investigación competitivas y otras acciones de fomento en el SUG, en los organismos públicos de investigación de Galicia y en otras entidades del Sistema gallego de I+D+i para el 2019 (GRC 2019/04). Consellería de Educación, Universidade e Formación Profesional. Xunta de Galicia. Investigador principal: Pablo Díez Baños. AGRADECIMIENTOS Es bien sabido que desarrollar una Tesis Doctoral es un trabajo duro detrás del cual hay innumerables horas de esfuerzo y dedicación. Sin embargo, no es únicamente fruto del trabajo individual y su consecución habría resultado mucho más difícil sin la ayuda de todas las personas que, a lo largo de estos años, me han transmitido sus conocimientos y brindado su apoyo, tanto en lo profesional como en lo personal. En primer lugar, me gustaría expresar mi agradecimiento a mis dos directores de tesis. Al Dr. Pablo Díaz Fernández por su dedicación y disponibilidad siempre que he necesitado orientación en el campo de la parasitología, por haberme enseñado a profundizar en cada una de las posibilidades que ofrecen los resultados, y por sus inestimables aportaciones a este trabajo que han mejorado sustancialmente su calidad. Al Dr. Alberto Prieto Lago por haberme transmitido su pasión por la microbiología y la biología molecular, por su apoyo y tutorización desde el primer día que entré en el laboratorio y por sus “tómate la vida con calma”, que es algo en lo que he avanzado, pero en lo que todavía tengo mucho margen de mejora. También me gustaría destacar especialmente el papel del Dr. Gonzalo Fernández Rodríguez. A pesar de que no ha ejercido como director de esta tesis, siempre le estaré agradecida por la confianza que depositó en mí para emprender este camino y por sus consejos, motivación y aportaciones, que me han servido de mucha ayuda tanto en este como en otros aspectos de mi carrera profesional y me han impulsado a mejorar cada día. Asimismo, quiero agradecer al resto de miembros del grupo INVESAGA su ayuda y el conocimiento que me han transmitido a lo largo de estos años. Al Dr. Ceferino López por su disposición para ayudarme siempre que he tenido alguna cuestión burocrática o estadística que solucionar. Al Dr. Pablo Díez Baños, la Dra. Patrocinio Morrondo y a la Dra. Rosario Panadero, por mostrarme que la curiosidad y las ganas de emprender nuevos proyectos son la clave para articular una carrera investigadora tan exitosa y dilatada. A la Dra. Susana Remesar, David García, Néstor Martínez y Ana Saldaña por los momentos de desconexión tan necesarios durante las pausas de café. No obstante, de todos los compañeros, merecen una mención especial dos de ellos: el Dr. José Manuel Díaz Cao y el Dr. Gonzalo López Lorenzo. A José Manuel por su inestimable ayuda con el tratamiento de datos y el análisis estadístico, pues sin su orientación es probable que todavía no lo hubiese terminado, así como por las conversaciones arreglando el mundo y la actualidad político-social. A Gonzalo por su disposición absoluta para ayudarme siempre que lo he necesitado, por haberme enseñado todo lo que sé sobre el sector porcino, por su paciencia cuando “me ahogo en un cubito de hielo” y por la amistad que nos une. Por otro lado, quiero mostrar mi agradecimiento a los miembros del grupo PARAQUASIL: el Dr. Hipólito Gómez-Couso, la Dra. Elvira Ares Mazás y la Dra. Seila Couso Pérez, por su asistencia en la caracterización molecular de Giardia duodenalis, y al Laboratorio Interprofesional Galego de Análise do Leite (LIGAL) por su colaboración en las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos realizadas. Asimismo, merecen una mención especial todos los veterinarios y ganaderos que han contribuido en la recogida de las muestras necesarias para llevar a cabo esta tesis. Cambiando a un ámbito más personal, me gustaría agradecer a mis amigos, en especial a Mery, el haber seguido ahí todos estos años y las vivencias que hemos compartido que me han hecho crecer como persona. No puedo dejar de mencionar a mi compañero de vida desde hace casi dos años, Rolle, que es una de las personas que más me ha sufrido en esta última etapa. Gracias por ser mi confidente, por estar siempre a mi lado pase lo que pase, por entenderme incluso cuando ni yo me entiendo y por tu infinita paciencia con mis pequeños y grandes dramas. Quérote moito moito. Finalmente, quiero agradecerle todo a mi familia, por haberme apoyado en todas las decisiones que he ido tomando y haberme dado los mejores consejos. A mi tía Rosa, por preocuparse y tener siempre una palabra de ánimo para mí, a mi prima Alexia, que siempre será como mi hermana pequeña y, muy especialmente a mis padres, Adolfo y Pury. Papá, mamá, gracias por haberlo dado todo por mí, por los valores que me habéis transmitido, por vuestro apoyo incondicional, por vuestra paciencia y por tratar de levantarme el ánimo cuando soy un mar de dudas y me inunda la desesperanza y la negatividad. Os quiero muchísimo y sólo espero que estéis la mitad de orgullosos de mí de lo que lo estoy yo de vosotros. ÍNDICE 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...................................................................................... 1 1.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES E IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL SECTOR BOVINO GALLEGO .................................................................................. 3 1.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA Y SANITARIA DE LA DIARREA NEONATAL DEL TERNERO .................................................................................... 7 1.3. PROCESO DE LA DIARREA Y CUADRO CLÍNICO .................................... 10 1.3.1. Tipos de diarrea ...................................................................................... 10 1.3.2. Implicaciones de la diarrea a nivel sistémico ......................................... 12 1.4. DIARREA INFECCIOSA .................................................................................. 14 1.4.1. Agentes causales: enteropatógenos bacterianos ..................................... 14 1.4.1.1. Escherichia coli .......................................................................... 14 1.4.1.1.1. E. coli enterotoxigénica (ETEC) .................................... 16 1.4.1.1.2. E. coli enteropatógena (EPEC) ...................................... 19 1.4.1.1.3. E. coli productora de toxinas Shiga (STEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC) ........................................................... 20 1.4.1.2. Salmonella spp. .......................................................................... 22 1.4.1.3. Abomasitis por Clostridium spp. ................................................ 24 1.4.2. Agentes causales: enteropatógenos víricos ............................................. 25 1.4.2.1. Rotavirus .................................................................................... 25 1.4.2.2. Coronavirus ................................................................................ 26 1.4.2.3. Torovirus .................................................................................... 28 1.4.2.4. Calicivirus .................................................................................. 29 1.4.2.4.1. Norovirus ....................................................................... 29 1.4.2.4.2. Nebovirus ....................................................................... 31 1.4.2.4.3. Patogenia y lesiones ....................................................... 31 1.4.2.5. Virus de la diarrea vírica bovina ................................................ 31 1.4.2.6. Otros virus. ................................................................................. 32 1.4.3. Agentes causales: enteropatógenos parasitarios ..................................... 32 1.4.3.1. Cryptosporidium spp. ................................................................. 32 1.4.3.2. Giardia duodenalis ..................................................................... 37 1.4.3.3. Eimeria spp. ............................................................................... 40 1.4.4. Epidemiología ......................................................................................... 45 1.4.4.1. Factores de riesgo asociados al ternero ...................................... 45 1.4.4.2. Factores de riesgo asociados al ambiente ................................... 50 1.4.4.3. Factores asociados con el agente causal ..................................... 54 1.4.5. Diagnóstico ............................................................................................. 58 1.4.5.1. Exploración clínica ..................................................................... 58 1.4.5.2. Diagnóstico epidemiológico ....................................................... 62 1.4.5.3. Diagnóstico laboratorial ............................................................. 63 1.4.6. Prevención y control ............................................................................... 70 1.4.6.1. Tratamiento ................................................................................ 70 1.4.6.1.1. Tratamiento sintomático ................................................ 70 1.4.6.1.2. Tratamientos específicos................................................ 74 1.4.6.2. Otras medidas de prevención ..................................................... 86 1.4.6.2.1. Minimizar la exposición al patógeno ............................. 86 1.4.6.2.2. Mejorar la inmunidad .................................................... 89 1.5. DIARREA NEONATAL POR CAUSAS NUTRICIONALES .......................... 93 2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 97 3. ESTUDIO I: PREVALENCIA E INTERACCIONES DE LOS PRINCIPALES ENTEROPATÓGENOS IMPLICADOS EN LA DIARREA NEONATAL DEL TERNERO ....................................................................................................................... 101 3.1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS .................................................................. 103 3.2. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................. 105 3.2.1. Diseño del estudio y obtención de las muestras ................................... 105 3.2.2. Análisis laboratorial de las muestras .................................................... 106 3.2.2.1. Análisis bacteriológico ............................................................. 106 3.2.2.2. Análisis virológico ................................................................... 109 3.2.2.3. Análisis parasitológico ............................................................. 110 3.2.3. Análisis de datos ................................................................................... 118 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 120 3.3.1. Análisis individual de los enteropatógenos .......................................... 120 3.3.2. Análisis integrado de los enteropatógenos ........................................... 152 4. ESTUDIO II: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y POTENCIAL ZOONÓSICO DE AISLADOS DE Cryptosporidium spp. Y Giardia duodenalis PROCEDENTES DE TERNEROS CON DIARREA DEL NOROESTE DE ESPAÑA. ........................................................................................................................................... 179 4.1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS .................................................................. 181 4.2. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................. 187 4.2.1. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp............................. 187 4.2.2. Caracterización molecular de Giardia duodenalis ............................... 189 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 193 4.3.1. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp............................. 193 4.3.2. Caracterización molecular de Giardia duodenalis ............................... 202 5. ESTUDIO III: EVALUACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICAS AISLADAS DE TERNEROS DIARREICOS DEL NOROESTE DE ESPAÑA .......................................................... 207 5.1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS .................................................................. 209 5.2. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................. 213 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 215 6. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 227 7. RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT ......................................................................... 233 8. REFERENCIAS........................................................................................................... 257 9. ANEXOS....................................................................................................................... 303 ANEXO I: Concentraciones de cada antibiótico utilizadas en la tarjeta AST-GN96 .................................................................................................................................. 305 ABREVIATURAS A/E Lesiones attaching and effacing ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensajero AST Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos BCoV Coronavirus bovino bg β-giardina BLEE Beta-lactamasas de espectro extendido BNeV Nebovirus bovino BNoV Norovirus bovino BRoV Rotavirus A bovino BToV Torovirus bovino BVDV Virus de la diarrea vírica bovina CMI Concentración mínima inhibitoria CMI90 Concentración mínima inhibitoria del 90% de las cepas CNF Factor citotóxico necrotizante Ct Ciclo umbral dNTP Desoxirribonucleótido EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EHEC E. coli enterohemorrágica ELISAd Enzimoinmunoanálisis de adsorción de captura de antígeno ELISAi Enzimoinmunoanálisis de adsorción indirecto EMA Agencia Europea del Medicamento EPEC E. coli enteropatógena ETEC E. coli enterotoxigénica FTP Fallo en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas G Genogrupo g Gramo GAD Glutamato descarboxilasa Gb3 Globotriaosilceramida GCC Guanilil-ciclasa-C gdh Glutamato-dehidrogenasa GIII Genogrupo III gp60 Glicoproteína de 60 kDa IC95% Intervalo de confianza al 95% ICF Inmunocromatografía IFAT Inmunofluorescencia directa IgG Inmunoglobulina G kb Kilobase kg Kilogramo L Litro MDR Multirresistentes mEq Miliequivalente mg Miligramo ml Mililitro Mm Milímetro mM Milimolar por litro mmol Milimolar mOsm Miliosmol NCD Diarrea neonatal del ternero nm Nanómetro ºC Grados centígrados opg Ooquistes por gramo de heces OR Odds Ratio pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PIB Producto Interior Bruto PMQR Resistencia a las quinolonas mediada por plásmidos qPCR PCR en tiempo real QRDR Región determinante de la resistencia a las quinolonas RFLP Análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción rpm Revoluciones por minuto RT-PCR PCR con transcripción inversa s Segundo ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Distribución por ayuntamientos de las explotaciones bovinas de Galicia. ............ 5 Figura 2. Ciclo biológico de C. parvum. ............................................................................. 36 Figura 3. Ciclo biológico de G. duodenalis. ........................................................................ 38 Figura 4. Ciclo biológico de E. bovis. ................................................................................. 42 Figura 5. Prevalencia de los enteropatógenos asociados con la aparición de NCD en terneros neonatos con diarrea de Galicia y Asturias. ...................................................................... 120 Figura 6. Distribución de las muestras positivas a Eimeria spp. en función de sus recuentos de ooquistes por gramo de heces (opg). ............................................................................ 133 Figura 7. Diagramas de caja que representan la distribución por edades de las muestras positivas a cada enteropatógeno. ....................................................................................... 136 Figura 8. Líneas de tendencia que representan la prevalencia de los diferentes enteropatógenos en función de la edad del animal. ........................................................... 137 Figura 9. Prevalencia de los enteropatógenos incluidos en el estudio en las infecciones simples. .............................................................................................................................. 154 Figura 10. Prevalencia de las infecciones mixtas al considerar el número de patógenos identificados....................................................................................................................... 156 Figura 11. Porcentaje de muestras positivas a cada enteropatógeno que corresponden a infecciones simples y mixtas. ............................................................................................ 157 Figura 12. Porcentaje de muestras positivas a cada enteropatógeno al considerar únicamente las infecciones mixtas. ....................................................................................................... 157 Figura 13. Treinta combinaciones de patógenos más frecuentes en el conjunto de las infecciones mixtas. ............................................................................................................ 158 Figura 14. Treinta combinaciones de patógenos más frecuentes en la primera semana de edad. ................................................................................................................................... 165 Figura 15. Interacciones significativas positivas y negativas detectadas en la primera semana de edad. .............................................................................................................................. 166 Figura 16. Red formada por las interacciones entre los patógenos detectadas en la primera semana de edad. ................................................................................................................. 167 Figura 17. Treinta combinaciones de patógenos más frecuentes en la segunda semana de edad. ................................................................................................................................... 168 Figura 18. Interacciones significativas positivas y negativas detectadas en la segunda semana de edad. .............................................................................................................................. 170 Figura 19. Treinta combinaciones de patógenos más frecuentes en la tercera semana de edad. ........................................................................................................................................... 171 Figura 20. Interacciones significativas positivas y negativas detectadas en la tercera semana de edad. .............................................................................................................................. 172 Figura 21. Treinta combinaciones de patógenos más frecuentes en la cuarta semana de edad. ........................................................................................................................................... 174 Figura 22. Interacciones significativas positivas y negativas detectadas en la cuarta semana de edad. .............................................................................................................................. 175 Figura 23. Alineamiento de secuencias de ADN de los productos de PCR del gen que codifica para la glicoproteína de 60 kDa de diversos aislados representativos del subtipo IIaA15G2R1 de C. parvum identificados en terneros. ...................................................... 196 Figura 24. Porcentaje de cepas de E. coli enterotóxigénica en función del número de antibióticos frente a los que mostró resistencia. ................................................................ 215 Figura 25. Porcentaje de cepas de E. coli enterotoxigénica susceptibles a cada antibiótico testado. ............................................................................................................................... 218 Figura 26. Frecuencias de la concentración mínima inhibitoria para los diferentes antibióticos beta-lactámicos testados: ampicilina (A), amoxicilina/ácido clavulánico (B), cefalexina (C), cefalotina (D), ceftiofur (E), cefoperazona (F) y cefquinoma (G). ........... 219 Figura 27. Frecuencias de la concentración mínima inhibitoria para la gentamicina (A), neomicina (B), flumequina (C), enrofloxacino (D), marbofloxacino (E), tetraciclina (F) y trimetoprim/sulfametoxazol (G). ....................................................................................... 220 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3 1.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES E IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL SECTOR BOVINO GALLEGO La importancia económica del sector ganadero a nivel mundial ha ido disminuyendo a lo largo del siglo XX, fruto de la desagrarización de la economía. No obstante, los valores actuales de las principales macromagnitudes agrarias se alcanzaron de forma más tardía en España que en el resto de la Unión Europea, principalmente por la demora en la implantación de la Política Agraria Común. En la actualidad, el sector primario representa el 2,8% del Producto Interior Bruto (PIB) español y cerca del 4% del empleo (Instituto Nacional de Estadística, 2020; Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020a), pero su impacto sobre el conjunto de la economía es mucho mayor si tenemos en cuenta a la industria agroalimentaria, que es el subsector industrial más importante del país, ya que por sí sola representa alrededor de un 3% del PIB y ocupa a unas 500.000 personas (Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020b). La producción final agraria asciende a 50.000 millones de euros y consta en un 60% de producción final vegetal y en un 40% de producción final ganadera, de la cual alrededor del 26% corresponde al sector bovino (Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020a). Sin embargo, en el caso de la Comunidad Autónoma de Galicia, el sector agrario representa un 4,7% del PIB y un 7,1% del empleo, prácticamente duplicando la media nacional (Instituto Galego de Estatística, 2020a). La producción final agraria es de 3.625 millones de euros y está constituida por un 64% de producción final ganadera y un 36% de producción final vegetal, es decir, una situación prácticamente inversa a la observada en el conjunto del territorio nacional (MERCASA, 2020). Dentro del sector ganadero gallego, el ganado bovino adquiere una importancia especial, suponiendo el 37% de las unidades de ganado mayor (UGM) de la Comunidad (Consellería do Medio Rural, 2021). El vacuno gallego supone el 14% del censo bovino CYNTHIA LÓPEZ NOVO 4 nacional, el 39% de la producción láctea y el 14% de la producción de carne (Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, 2020c, 2020d, 2021). En este contexto, se debe mencionar la ausencia de una distinción clara entre los sectores cárnico y lácteo en el bovino gallego. Aunque sea posible diferenciar entre censo lechero y cárnico, no es tan sencillo establecer una clasificación de explotaciones en función de sus producciones, ya que, además de la existencia de explotaciones mixtas, también tiene importancia la producción de carne en explotaciones de aptitud láctea que ceban parte de sus terneros (Consellería do Medio Rural, 2020). De todas formas, de las casi 30.800 explotaciones de vacuno registradas en Galicia, unas 6.900 son eminentemente lecheras y 19.900 de aptitud cárnica. A este último grupo hay que sumarle los casi 3.500 cebaderos de terneros de la Comunidad (Instituto Galego de Estatística, 2020b). La distribución de las explotaciones bovinas en Galicia al considerar los ayuntamientos (Figura 1) se correlaciona con las características socioeconómicas de la Comunidad, caracterizada por una alta dispersión poblacional, aunque con una creciente concentración demográfica en los núcleos urbanos y en las zonas costeras de A Coruña y Pontevedra. Como consecuencia de ello, existe un alto riesgo de despoblamiento de las zonas rurales, especialmente en las provincias de Lugo y Ourense. Además, la población sufre un progresivo envejecimiento, sobre todo en Lugo y Ourense, donde más del 25% de los habitantes tiene más de 65 años (Consellería do Medio Rural, 2020). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 Como consecuencia de esta estructura demográfica y del minifundismo y alto grado de parcelación que caracteriza a Galicia, en el sector vacuno gallego observamos un modelo dual. Por un lado, destaca la existencia de explotaciones industrializadas y tecnificadas, principalmente en el ámbito del sector lácteo, cuyas rentabilidades están condicionadas en cierta medida por la dependencia externa para la obtención de sus medios de producción. No obstante, en el ámbito gallego la instauración de este tipo de granjas se ve condicionada por la escasa base territorial de las explotaciones, lo que limita el número de animales que Figura 1. Distribución por ayuntamientos de las explotaciones bovinas de Galicia (Consellería do Medio Rural, 2021). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 6 pueden mantener, sin bien es cierto que existen bolsas de tierra sin emplear que podrían favorecer el ajuste territorial de las granjas existentes y disminuir sus costos de forraje (Blanco, 2014; Consellería do Medio Rural, 2020). Por otra parte, nos encontramos con un gran número de pequeñas explotaciones, de escasa dimensión y baja capitalización, que orientan su producción hacia la comercialización a través de mercados locales. Sin embargo, es de mención inexcusable que en los últimos años se ha producido una disminución en el número de explotaciones y, como consecuencia, de efectivos bovinos. Este fenómeno se debe fundamentalmente a la desaparición de aquellas unidades menos productivas y la jubilación de muchos titulares de granjas de pequeño tamaño (Consellería do Medio Rural, 2020). Finalmente, es necesario hacer referencia a los sistemas de producción empleados en el sector bovino gallego. Las explotaciones de ganado vacuno lechero se ubican fundamentalmente en zonas llanas, ya que poseen condiciones climatológicas y orográficas más propicias. Este tipo de producción se ha ido intensificando de modo progresivo, sobre todo en las explotaciones de mayor tamaño, con el confinamiento de los animales en las naves, una sustitución considerable de la alimentación mediante pastos por forrajes y la proliferación de los sistemas de alimentación con carro mezclador (Sineiro García et al., 2009). En contraste, en las regiones montañosas predominan los rebaños de vacas nodrizas, basados en razas autóctonas más adaptadas a la orografía y a las condiciones climatológicas desfavorables, capaces de aprovechar unos recursos que de otra forma resultarían improductivos. Se trata de explotaciones en régimen extensivo o semiextensivo, con baja carga ganadera y poca inversión en mano de obra e infraestructuras (Acero Adámez, 2009). No obstante, dentro de la aptitud cárnica, también nos encontramos los cebaderos de terneros, que habitualmente utilizan sistemas intensivos de producción y, para minimizar costes, se localizan cerca de las zonas donde se encuentran los mataderos y las industrias de alimentación animal. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 13 misma como por la inhibición de las catecolaminas (Izzo et al., 2015). Por otra parte, puede desembocar en una disfunción de la gotera esofágica, dando lugar al ruminal drinking y la consecuente acidosis ruminal (Lorenz, 2004a). Asimismo, la acidosis del animal altera el funcionamiento de la bomba sodio-potasio, evitando que el sodio sea expulsado de las células a costa de disminuir los niveles de potasio en las mismas. De esta forma, a pesar de que se producen pérdidas de sodio y de potasio a través de las heces que dan lugar a una disminución del contenido total de potasio corporal, la redistribución del mismo hacia el espacio extracelular se traduce en un incremento de sus niveles en el plasma sanguíneo, dando lugar a una hipercaliemia (Lewis y Phillips, 1972, 1973; Sweeney, 1999). Como resultado de todo esto, el animal muestra ataxia, depresión, enoftalmos y pérdida de los reflejos palpebral y de succión, que pueden llegar hasta el decúbito prolongado y el coma (Kasari y Naylor, 1985a; Lorenz, 2004b; Izzo et al., 2015). Asimismo, si la malabsorción persiste, el animal puede desarrollar caquexia y fallecer a causa de la malnutrición y la hipoglucemia (Izzo et al., 2015). Sin embargo, en la mayoría de los casos, la muerte del animal viene dada por el desequilibrio existente entre los niveles de potasio intracelular y extracelular, que puede resultar en fallo cardíaco (Weldon et al., 1992). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 14 1.4. DIARREA INFECCIOSA 1.4.1. Agentes causales: enteropatógenos bacterianos Al nacimiento, el tracto digestivo del ternero es estéril, pero diversas bacterias lo colonizan durante sus primeras 24 horas de vida. Estos microorganismos forman una flora intestinal que acompañará al animal durante toda su vida, cuyos componentes mayoritarios son bacterias anaerobias y ciertas cepas de E. coli, que actúan como comensales y están presentes en concentraciones de 107-108 organismos por gramo de heces. Sin embargo, existen otras cepas de E. coli y otras bacterias como Salmonella spp. o Clostridium perfringens que son reconocidos enteropatógenos, dando lugar a síndromes como la NCD (Schaechter, 2009; Gyles y Fairbrother, 2010). 1.4.1.1. Escherichia coli Escherichia coli es una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae de la clase -Proteobacteria (Moxley, 2013a). Miden entre 5-10 m de longitud y 20 nm de diámetro y se consideran Gram negativas, anaerobias facultativas, no formadoras de esporas, móviles y con forma de bacilo. Generalmente fermentan lactosa, poseen lisinadescarboxilasa, producen indol, no crecen en citrato y no producen ureasa, ácido sulfhídrico, ni acetoína (Voges-Proskauer negativa). Su nicho principal es la capa mucosa del colon (Kaper et al., 2004; Schaechter, 2009; Gyles y Fairbrother, 2010). Estructura y serotipado Como en la mayoría de las bacterias Gram negativas, E. coli presenta una pared celular que consiste en una membrana externa y una membrana citoplasmática, entre las que se disponen el periplasma y una fina capa de peptidoglucanos. Algunas cepas cuentan con una cápsula polisacarídica que rodea a la membrana externa y muchas de ellas son móviles gracias a la presencia de 5-10 flagelos, que están conformados por proteínas específicas, REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 15 siendo la principal la flagelina (Schaechter, 2009; Moxley, 2013a). Además, muchas cepas de E. coli cuentan con fimbrias, que son apéndices en forma de pelo, situados de forma difusa por la superficie de la bacteria, que les permiten adherirse entre sí y a superficies de su entorno (Nagy y Fekete, 1999; Schaechter, 2009; Moxley, 2013a). Las cepas de E. coli se clasifican principalmente por las diferencias serológicas existentes entre sus antígenos O, K y H, determinados por el lipopolisacárido de la membrana externa, el polisacárido capsular del que disponen algunas cepas y las proteínas flagelares, respectivamente. Hasta el momento, se han descrito 174 tipos de antígenos O y 53 tipos de antígenos H. Mientras que los antígenos O y H se suelen identificar mediante un método conocido como serotipado, los antígenos K no se suelen determinar de forma rutinaria. Adicionalmente, se pueden caracterizar los antígenos fimbriales F, cuya identificación puede ser útil para la caracterización de las cepas (Gyles y Fairbrother, 2010). La mayoría de las cepas de E. coli son comensales. Sin embargo, una pequeña proporción de cepas altamente adaptadas han adquirido atributos de virulencia específicos que les confieren una mayor capacidad para adaptarse a nuevos nichos y causar diferentes acciones patógenas, lo que podría traducirse en la aparición de cuadros clínicos de diversa gravedad. Los factores de virulencia pueden ser de dos clases: factores de colonización, y toxinas y moléculas efectoras. Dentro de los primeros, se han descrito 28 factores de colonización en las E. coli patógenas, destacando de entre ellos las adhesinas, que son proteínas incluidas en la membrana externa cuya función es unirse a los receptores de la superficie de la célula hospedadora. Pueden ser fimbriales, propias de las fimbrias, o afimbriales, asociadas a la cápsula (Kaper et al., 2004; Moxley, 2013a). En cuanto las toxinas y moléculas efectoras, se han identificado 33 diferentes, provocando diversas alteraciones en el metabolismo y la estructura de la célula hospedadora (Kaper et al., 2004). La presencia de genes de virulencia determina la expresión de ciertos factores de virulencia, que permiten clasificar a las E. coli patógenas en diferentes patotipos, siendo la E. coli enterotoxigénica (ETEC), la E. coli enteropatogéna (EPEC) y la E. coli enterohemorrágica (EHEC) los patotipos más importantes en la NCD (Gyles y Fairbrother, 2010). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 16 1.4.1.1.1. E. coli enterotoxigénica (ETEC) ETEC es el patotipo de E. coli más frecuentemente relacionado con la aparición de diarrea en los animales de producción, e incluye las cepas que producen tanto enterotoxinas como adhesinas (Nagy y Fekete, 2005). Las primeras actúan de forma local en los enterocitos, estimulando la secreción de agua y electrolitos y/o una menor absorción de fluidos. A su vez, las adhesinas permiten que las bacterias se adhieran a las microvellosidades de las células epiteliales del intestino delgado sin inducir lesiones morfológicas, de forma que puedan transferir las enterotoxinas de una forma más eficaz a las células diana (Nagy y Fekete, 1999; Gyles y Fairbrother, 2010). Factores de virulencia de ETEC causante de NCD Las cepas de ETEC responsables de NCD suelen caracterizarse por producir las adhesinas F5 y/o F41, y la enterotoxina STa. No obstante, se han detectado cepas que producen la fimbria F17 y/o las enterotoxinas STb y LTII, incluso en combinación con las anteriormente citadas (Dubreuil et al., 2016). Suelen pertenecer a los serogrupos O8, O9, O20 y O101, y habitualmente producen un antígeno polisacarídico capsular (K25, K28, K30, K35) que intensifica la colonización inducida por las adhesinas (Nagy et al., 2005). a) Adhesinas fimbriales Las ETEC aisladas en cada especie animal muestran familias o grupos de diferentes fimbrias que determinan su patogenicidad en esa especie (Acres, 1985). Las fimbrias presentan adhesinas, que se unen a receptores específicos de la célula hospedadora; sin embargo, el grado de expresión de estos receptores depende, en muchos casos, de la edad del hospedador, que obviamente influye en la resistencia o susceptibilidad del animal a la adhesión de la bacteria (Nagy y Fekete, 2005). Hasta hace unos años, la nomenclatura de las fimbrias no estaba estandarizada y se relacionaba con su cepa de origen, estructura o función. Aunque esa nomenclatura todavía se mantiene, en la actualidad las fimbrias se designan mediante un código constituido por la letra F (indicativa de fimbria) seguida de un número específico para tipo (Gyles y Fairbrother, 2010). A continuación, se describen las principales fimbrias de las ETEC implicadas en la NCD. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 17 Fimbria F5 (también conocida como K99) Es la fimbria más importante en las ETEC que afectan a los terneros, codificada por el locus fan que se encuentra en un plásmido (Acres, 1985; Gyles y Fairbrother, 2010). La mayor subunidad de esta fimbria es la adhesina, que le permite unirse a sus receptores específicos, ciertos glicolípidos como el N–ácido glicolilneuramínico–GM3, N–ácido glicolilneuramínico–GM2 y N–ácido glicolilneuramínico–GD1a; por ello, la adhesina media la unión de ETEC a la mucosa del intestino delgado posterior de los terneros (Teneberg et al., 1993; Gyles y Fairbrother, 2010). Fimbria F41 Este tipo de fimbrias son apéndices fibrilares codificados por genes presentes en el cromosoma. Aparecen junto a las F5 en ETEC de los serogrupos O9 y O101. Se han descrito cepas que solo producen F41, pero aún no se han aislado en ganado vacuno (De Graaf y Roorda, 1982; Acres, 1985; Gyles y Fairbrother, 2010). Al igual que en el caso de F5, la colonización mediada por F41 se observa en el intestino delgado posterior de los terneros, pero muestra diferentes receptores, principalmente glicoproteínas como la glicoforina (Acres, 1985; Klemm, 1985; Brooks et al., 1989; Gyles y Fairbrother, 2010). Fimbria F17 Aunque las fimbrias F17 se encuentran sobre todo en cepas bovinas de E. coli necrotoxigénico, produciendo factor citotóxico necrotizante (CNF) 1 o CNF2, también se han hallado en cepas ETEC bovinas; en estas cepas todavía se desconoce su función o asociación con la diarrea (Mainil et al., 2000; Gyles y Fairbrother, 2010). Son fimbrias flexibles, de 3 nm de ancho, codificadas por un cluster de genes presente en un plásmido. Su subunidad principal, conocida como 17A, termina en una fibrilla que contiene la adhesina 17G, que se une a los receptores N–acetil–D–glucosamina situados entre las microvellosidades del epitelio intestinal de los rumiantes neonatos (Lintermans et al., 1991; Buts et al., 2003). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 18 b) Adhesinas afimbriales Dentro de ellas se incluye la CS31A, una estructura capsular que rodea a la bacteria. Esta adhesina, codificada por un plásmido y compuesta de la proteína ClpG, también aparece en las cepas de E. coli causantes de septicemia en el ganado bovino (Girardeau et al., 1988; Contrepois et al., 1993; Le Bouguénec y Bertin, 1999). c) Enterotoxinas Las enterotoxinas son proteínas extracelulares capaces de ejercer su acción en el epitelio intestinal. Las ETEC producen dos tipos de enterotoxinas: las ST, toxinas de bajo peso molecular y termoestables; y las LT, toxinas de elevado peso molecular y termolábiles. Ambas están codificadas por plásmidos y las LT son mucho más antigénicas que las ST. Las ETEC implicadas en la NCD solo producen enterotoxinas ST y, dentro de este grupo, STa. (Gyles y Fairbrother, 2010). Patogenia y lesiones Para que las cepas ETEC provoquen NCD deben adherirse al epitelio del intestino delgado mediante sus antígenos fimbriales, principalmente F5 (Acres, 1985; Mouricout y Julien, 1987), permitiendo que la bacteria colonice la mucosa intestinal en lugar de ser expulsada por los movimientos peristálticos (Foster y Smith, 2009). La adhesión bacteriana depende de la temperatura y del pH. Los antígenos fimbriales solo se expresan en medios con un pH menor de 6,5, siendo su pH óptimo entre 4,75 y 5,25. Debido a que el pH del fluido intestinal aumenta a medida que progresa hacia el intestino grueso, es en el íleon donde se alcanza este umbral y, por tanto, la colonización por ETEC (Mouricout y Julien, 1987; Francis et al., 1989; Foster y Smith, 2009). Por otra parte, la capacidad de los antígenos fimbriales de ETEC para unirse al epitelio del intestino delgado depende de la edad, decreciendo gradualmente desde las primeras doce horas de vida a las dos semanas de edad, cuando dejan de expresarse los receptores de sus adhesinas (Runnels et al., 1980). Una vez establecida, la bacteria coloniza el íleon, prolifera y se extiende en sentido proximal por todo el intestino delgado, a la vez que comienza producir la enterotoxina STa (Acres, 1985; Foster y Smith, 2009; Gyles y Fairbrother, 2010); este proceso es también REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 19 dependiente del pH, siendo muy limitado cuando es menor de siete. Por lo tanto, la producción de la toxina es máxima en la última porción del intestino delgado (Mitchell et al., 1974). Esta toxina es el mediador primario de la NCD causada por ETEC, ya que provoca una alteración en el balance iónico y electrolítico que resulta en una diarrea secretora (Holland, 1990; Foster y Smith, 2009). Finalmente, es reseñable que el efecto de ETEC sobre la integridad de la mucosa intestinal varía en función del serotipo implicado y de otros factores fisiológicos y nutricionales del intestino delgado (Acres, 1985). Mientras que algunos estudios no señalan cambios significativos (Tzipori et al., 1983), otros han descrito una atrofia de las vellosidades con degeneración y exfoliación de los enterocitos apicales de yeyuno e íleon, acompañada por una reacción inflamatoria caracterizada por una infiltración por neutrófilos, especialmente alrededor de las placas de Peyer (Bellamy y Acres, 1979). 1.4.1.1.2. E. coli enteropatógena (EPEC) Factores de virulencia, patogenia y lesiones Las cepas enteropatógenas de E. coli no producen enterotoxinas, sino que presentan el gen eae que codifica para la intimina, una adhesina que genera lesiones conocidas como attaching and effacing (A/E) en los últimos tramos del intestino delgado y en el intestino grueso (Knutton et al., 1991; Nataro y Kaper, 1998; Krause et al., 2005). Estas lesiones consisten en que las microvellosidades son reemplazadas por estructuras filamentosas compactas denominadas pedestales (Moon et al., 1983; Gyles y Fairbrother, 2010; Moxley, 2013b). Las EPEC presentes en la pared intestinal se adhieren a las células epiteliales mediante los pili tipo IV (bundle-forming pili) y los filamentos EspA. Esta adhesión da lugar a la expresión de un mecanismo de secreción de tipo III que provoca la traslocación de los receptores Tir a la superficie de los enterocitos donde funcionan como receptores para la intimina (Clarke et al., 2003; Lung et al., 2014; Kolenda et al., 2015). La unión de la intimina a los receptores Tir provoca cambios en el citoesqueleto celular, incluyendo la acumulación de actina polimerizada que causa la destrucción de las microvellosidades de la zona donde está adherida la bacteria. De esta forma, se configuran los pedestales, que protruyen de la CYNTHIA LÓPEZ NOVO 20 superficie celular y engloban a cada bacteria de forma individual (Moon et al., 1983; Gyles y Fairbrother, 2010). Aún no se conoce completamente el mecanismo por el cual las cepas de EPEC provocan diarrea (Donnenberg y Finlay, 2013; Kolenda et al., 2015), pero se ha sugerido que la pérdida de microvellosidades debida a las lesiones A/E puede inducir una diarrea por malabsorción (Nataro y Kaper, 1998; Gyles y Fairbrother, 2010). Sin embargo, la rápida aparición de la diarrea parece indicar hacia la implicación de un mecanismo secretor más activo, que probablemente esté relacionado con la actividad sobre los mediadores intracelulares del transporte iónico intestinal (Gyles y Fairbrother, 2010). Además, existen otros elementos que podrían jugar un papel importante en la aparición de la diarrea, como son la respuesta inflamatoria localizada que se produce en el lugar de la lesión, o el incremento de la secreción de cloro que resulta de la transmigración de los leucocitos polimorfonucleares al punto de adhesión de la bacteria (Gyles y Fairbrother, 2010). 1.4.1.1.3. E. coli productora de toxinas Shiga (STEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC) Factores de virulencia Las cepas de E. coli productoras de toxinas Shiga (STEC) son aquellas que producen toxinas Stx, caracterizadas por su efecto citopático profundo e irreversible sobre las células Vero (Paton y Paton, 1998). Las principales toxinas Stx en E. coli son Stx1, una familia homogénea de toxinas idénticas a las de Shigella dysenteriae, y Stx2, una familia más heterogénea que puede dividirse en varios subtipos y que es homóloga a Stx1 en un 56%. Los E. coli adquieren los genes que codifican para esta toxina mediante su infección con un bacteriófago (Gyles y Fairbrother, 2010; Moxley, 2013b). Las cepas enterohemorrágicas (EHEC) de E. coli son un subconjunto de STEC que poseen factores de virulencia adicionales, como el factor de generación de lesiones A/E y un plásmido de virulencia (Levine, 1987). Si bien la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) considera que en la actualidad el término EHEC está obsoleto en medicina humana y recomienda englobar este tipo de cepas dentro del término general STEC REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 21 (Koutsoumanis et al., 2020), a efectos de este trabajo se va a seguir empleando para diferenciarlas. Un elevado porcentaje de bovinos son portadores asintomáticos de STEC (Gyles, 2007), pero ciertas cepas de EHEC, particularmente los serogrupos O2, O8, O22, O77, O82, O105, O113 y O171, son virulentos para el ganado vacuno, especialmente para los terneros jóvenes. En esta misma línea, el serotipo O157:H7 puede provocar colibacilosis en terneros, pero se considera no virulento en los bóvidos de mayor edad (Orden et al., 1998; Naylor et al., 2005). No obstante, la importancia de la presencia de este último serotipo en vacuno radica en su potencial zoonótico, actuando este tipo de ganado como uno de los principales reservorios del mismo para el ser humano (Moxley y Smith, 2010). Patogenia y lesiones Con carácter general, el mecanismo de acción de las cepas de STEC consiste en que sus toxinas Stx se unen con gran afinidad a los receptores globotriaosilceramida (Gb3) de la superficie de los enterocitos y se internalizan mediante endocitosis. Una vez en el interior de la célula inhiben la síntesis proteica, lo que resulta, en general, en la muerte de la célula (Gyles y Fairbrother, 2010). Por su parte, la patogenia de las cepas EHEC incluye la mortalidad celular por la acción de las toxinas Stx, que acabamos de describir, acompañada por la producción de lesiones A/E en el intestino grueso, especialmente en la parte terminal del recto (Kaper et al., 2004). Este último mecanismo de acción, que es idéntico al descrito para EPEC, daría lugar a una diarrea por malabsorción agravada por el probable incremento de la permeabilidad intestinal y de la actividad secretora de las células epiteliales (Nataro y Kaper, 1998; Gyles y Fairbrother, 2010). Además, las cepas de EHEC pueden contar con un plásmido de virulencia adicional que, en el caso de E. coli O157:H7, contiene, entre otros elementos, el operón Ehx, que codifica una toxina que induce la lisis y la apoptosis de los enterocitos, colaborando por tanto en el incremento de la permeabilidad del epitelio intestinal (Bielaszewska et al., 2014). En el caso de los bóvidos, todavía no está claro el papel de las toxinas Stx en la NCD, ya que un elevado porcentaje de individuos asintomáticos son portadores de cepas de STEC y/o EHEC (Kolenda et al., 2015). Como se ha descrito previamente, para su patogenia resulta imprescindible la presencia de los receptores Gb3, que no están presentes en su endotelio vascular intestinal (Pruimboom-Brees et al., 2000), lo que impediría su transporte al torrente CYNTHIA LÓPEZ NOVO 22 sanguíneo y la aparición de signos clínicos sistémicos. Tampoco poseen este tipo de receptores las células del colon que ya han sufrido un proceso de proliferación y migración a superficie luminal (Hoey et al., 2002). Sin embargo, las células poco diferenciadas de este tramo del tracto intestinal sí poseen receptores para Stx1 (Hoey et al., 2003); no obstante, la absorción de la toxina por parte de las mismas no causa la muerte celular, probablemente debido a la inactivación de Stx1 mediante su exclusión del retículo endoplasmático y su transporte a los lisosomas (Hoey et al., 2003). Sin embargo, los linfocitos periféricos e intestinales y aproximadamente un tercio de los macrófagos que residen en la mucosa intestinal sí expresan los receptores Gb3, lo que permite que las toxinas Stx sean capaces de alterar una gran variedad de procesos de inmunomodulación (Menge, 2020); por lo tanto, el papel de Stx en la patogenia de la infección en los bóvidos sería principalmente inmunosupresor. Este hecho explicaría su presencia en animales asintomáticos (Menge, 2020), e implica que la aparición de diarrea sanguinolenta consecutiva a la infección con STEC que se ha descrito en algunas ocasiones (Chanter et al., 1986; Wieler et al., 1992; Dean-Nystrom et al., 1997) probablemente esté relacionada con otros factores de virulencia de las cepas y no con la producción de Stx (Menge, 2020). 1.4.1.2. Salmonella spp. Salmonella es un género de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que se caracterizan por ser Gram negativas, anaerobias facultativas, oxidasa negativas y con forma de bacilo (Coburn et al., 2007; Nielsen, 2013; Sanderson y Nair, 2013). Aunque no presentan una gran resistencia a los desinfectantes, a la incidencia de la luz solar directa ni a los antibióticos, se han aislado cepas multirresistentes en ganado bovino (Davis et al., 2007; Nielsen, 2013). Además, pueden sobrevivir durante meses en materia orgánica como el estiércol y durante años en materia fecal seca (Taylor y Burrows, 1971; Plym-Forshell y Ekesbo, 1996; Nielsen, 2013). Estructura y serotipado Al igual que se mencionó en el caso de E. coli, Salmonella spp. cuenta con un lipopolisacárido en su membrana externa, en el que se ubica una región altamente variable conocida como antígeno O. Asimismo, cuenta con el antígeno flagelar H y el polisacárido REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 29 yeyuno hasta el colon, donde provoca una respuesta inflamatoria aguda con edema e infiltración celular (Pohlenz et al., 1984; Fagerland et al., 1986). El virus se introduce en las células por endocitosis mediada por receptores y se replica en su interior. Sus nuevas copias se ensamblan mediante gemación, cuando las cápsides del citoplasma de la célula se asocian con las proteínas de membrana del aparato de Golgi, y salen de la célula por citolisis o por exocitosis (Fagerland et al., 1986). Este proceso provoca cambios citopáticos en las células, como degeneración vacuolar severa, necrosis y exfoliación, así como la fusión de las vellosidades (Pohlenz et al., 1984; Woode et al., 1984). Como resultado, en los animales afectados se observa la necrosis de los enterocitos de las vellosidades y de las criptas en el íleon, y de los enterocitos de la superficie y de las criptas en el ciego y en el colon (Hall, 1987). No se ha descrito por completo el mecanismo mediante el cual el virus induce la diarrea, pero podría ser producto de las lesiones que provocarían una atrofia de las vellosidades con la consecuente reducción en la capacidad de absorción de agua, dando lugar como resultado una diarrea por malabsorción y maladigestión (Woode, 1982; Hoet y Saif, 2004). 1.4.2.4. Calicivirus La familia Caliciviridae incluye cinco géneros: Norovirus, Sapovirus, Nebovirus, Lagovirus y Vesivirus (Green, 2013). De ellos, Norovirus y Nebovirus podrían actuar como agentes etiológicos de NCD, por lo que serán descritos a continuación. 1.4.2.4.1. Norovirus Los norovirus, como todos los calicivirus, son virus pequeños no envueltos que miden entre 27 y 35 nm de diámetro. La cápside contiene 90 dímeros de la proteína VP1 que forman una cubierta de la que protruyen 90 capsómeros en forma de arco (Green, 2013). Su genoma es un ARN monocatenario orientado en sentido positivo de 7,5 kb de tamaño. La proteína VP1 forma dos dominios: S y P, que a su vez se clasifica en los subdominios P1 y P2. El dominio S forma la parte interna de la cápside, envolviendo al ARN y manteniendo la estructura icosaédrica. El dominio P, que se une al S por una bisagra flexible, forma las CYNTHIA LÓPEZ NOVO 30 protrusiones en forma de arco de la cápside. El subdominio P1 constituye los laterales de estos arcos y posiciona al P2 en el alto de los mismos, de manera que este último se extiende por encima de la superficie viral. El subdominio P2 tiene la mayor divergencia de secuencias del genoma, por lo que determina el fenotipo antigénico del virus, y ejerce un papel importante en la unión a los receptores celulares (Prasad et al., 1999; Chakravarty et al., 2005; Green, 2013). La proteína VP2 tiene funciones de regulación de la expresión de VP1 y de estabilización de VP1 en la estructura del virus (Bertolotti-Ciarlet et al., 2003). Los norovirus se califican en 5 genogrupos (G) en función del alineamiento de las secuencias de aminoácidos de VP1 (Zheng et al., 2006; Otto et al., 2011). Los norovirus bovinos (BNoV) pertenecen al genogrupo III (GIII) (Ando et al., 2000; van der Poel et al., 2003), siendo las cepas Jena y Newbury Agent 2 los prototipos de los genotipos GIII.1 y GIII.2, respectivamente (Dastjerdi et al., 1999; Liu et al., 1999). Hasta no hace mucho, no se había conseguido cultivar norovirus en líneas celulares, lo que limitaba el estudio de sus características de supervivencia. Sin embargo, en la actualidad, se conseguido aplicar esta técnica a algunos norovirus humanos y animales (Wobus et al., 2004; Jones et al., 2015), lo que ha permitido confirmar que se trata de virus con una elevada capacidad de supervivencia ambiental, siendo resistentes a la mayoría de los desinfectantes comunes (D’Souza y Su, 2010). No obstante, es preciso tener en cuenta que el grado de resistencia a los distintos compuestos está relacionado con la cepa (Rachmadi et al., 2018). En este sentido, frente al norovirus murino han demostrado eficacia los compuestos halogenados, los agentes oxidantes, como el hipoclorito sódico, y una combinación de compuestos de amonio cuaternario, alcohol y aldehídos (Zonta et al., 2016). Sin embargo, el hipoclorito sódico es menos efectivo frente a los norovirus humanos (Tung et al., 2013). Por lo tanto, si bien los estudios de eficacia frente a norovirus de otras especies pueden orientar sobre la resistencia de BNoV a los desinfectantes, es precisa la realización de estudios específicos que permitan confirmar cuales son los compuestos químicos realmente eficaces frente a las cepas de norovirus bovino. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 31 1.4.2.4.2. Nebovirus La estructura morfológica del virión de nebovirus es igual a la ya comentada para los norovirus, con las proteínas estructurales VP1 y VP2; su genoma también es un ARN monocatenario de 7,5 kb de tamaño, si bien presenta ligeras modificaciones con respecto al de los norovirus (Oliver et al., 2006; Green, 2013). 1.4.2.4.3. Patogenia y lesiones Los calicivirus bovinos infectan a las células epiteliales de las vellosidades del intestino delgado. El norovirus bovino ejerce su acción patógena fundamentalmente en el yeyuno e íleon, sin afectar al ciego y colon (Bridger et al., 1984; Smiley et al., 2002; Otto et al., 2011), mientras que el nebovirus afecta en mayor medida a los tramos proximales del intestino delgado (Castells y Colina, 2021). El virus se introduce en las células mediante un proceso de endocitosis dependiente de pH y, tras su replicación, se produce la apoptosis de la célula y la liberación de sus nuevas copias (Mauroy et al., 2011; Gutiérrez-Escolano, 2014). El resultado de este proceso es una pérdida abrupta de enterocitos, que se ve reflejada en la atrofia de las vellosidades, hiperplasia de las criptas y edema en la submucosa de los tramos intestinales afectados, y que tiene como consecuencia una diarrea por maladigestión y malabsorción (Smiley et al., 2002; Otto et al., 2011). 1.4.2.5. Virus de la diarrea vírica bovina El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) raramente causa NCD en terneros, aunque este signo clínico se puede observar esporádicamente en los persistentemente infectados. Estos individuos se han infectado durante la gestación con un biotipo no citopático del BVDV y son inmunotolerantes al mismo. Sin embargo, si se infectan posteriormente con un biotipo citopático o se produce una mutación de su biotipo no citopático que lo convierta en citopático, pueden desarrollar la enfermedad de las mucosas, que a su vez puede provocar la erosión y ulceración del epitelio intestinal (Holland et al., 1993; Bielefeldt-Ohmann, 1995). No obstante, la infección por el BVDV se caracteriza por provocar inmunodepresión, lo que puede contribuir a la infección concomitante por los agentes infecciosos y parasitarios expuestos previamente que terminan por provocar NCD. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 32 1.4.2.6. Otros virus Existen diversos estudios que relacionan otros virus intestinales como astrovirus, adenovirus, parvovirus y picobirnavirus con casos de NCD, aunque su patogenicidad y grado de contribución al proceso todavía se desconoce (Storz et al., 1978; Orr, 1984; Durham et al., 1985; Vanopdenbosch y Wellemans, 1989; Mohamed et al., 2017). 1.4.3. Agentes causales: enteropatógenos parasitarios La NCD a menudo tiene un origen parasitario, pues varias especies de parásitos se encuentran involucradas en ella en diferentes momentos de la vida del ternero. Entre ellas, destaca Cryptosporidium parvum, que es uno de los enteropatógenos más prevalentes en la NCD, junto con Giardia duodenalis y los coccidios del género Eimeria (Royer, 2015). 1.4.3.1. Cryptosporidium spp. El género Cryptosporidium incluye parásitos protozoarios que infectan principalmente a las células epiteliales del tracto gastrointestinal de todo tipo de vertebrados (Fayer, 2008). Actualmente se reconocen 44 especies válidas y más de 120 genotipos dentro de este género, siendo probable que muchos genotipos alcancen el estatus de especie (Ryan et al., 2021). En el ganado vacuno se han identificado unas 17 especies de Cryptosporidium spp. (Tabla 1), siendo las principales Cryptosporidium andersoni, Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium parvum y Cryptosporidium ryanae (Upton y Current, 1985; Lindsay et al., 2000; Fayer et al., 2005, 2008). No obstante, sólo C. parvum se considera un agente causal de NCD en terneros menores de 30 días de edad. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 33 Tabla 1. Especies de Cryptosporidium spp. identificadas en el ganado vacuno. Especie Referencia C. parvum Upton y Current (1985) C. andersoni Lindsay et al. (2000) C. bovis Fayer et al. (2005) C. ryanae Fayer et al. (2008) C. hominis Smith et al. (2005) C. muris Bornay-Llinares et al. (1999) C. wrairi Azami et al. (2007) C. serpentis Azami et al. (2007) C. baileyi Azami et al. (2007) C. felis Bornay-Llinares et al. (1999) C. suis Geurden et al. (2007) C. scrofarum Wang et al. (2017) C. ubiquitum Fayer et al. (2010) C. meleagridis Mendonça et al. (2007) C. tyzzeri Wang et al. (2017) C. occultus (anteriormente conocida como genotipo C. suis-like) Langkjær et al. (2007) C. xiaoi Mirhashemi et al. (2016) Este género se clasifica taxonómicamente dentro del Filo Apicomplexa, cuyos miembros se caracterizan por ser parásitos intracelulares, con fases capaces de moverse por deslizamiento, con un complejo apical durante al menos algunas de sus fases vitales, y posiblemente capaces de realizar conjugación sexual (Bowman, 2014). Durante mucho tiempo, este género se consideró un coccidio perteneciente a la Subclase Coccidia (Ryan et al., 2021a). Sin embargo, estudios recientes señalaron que los criptosporidios están más relacionados con las gregarinas, lo que explicaría la relación superficial existente entre estes organismos y las células que parasitan, y por qué casi todos los anticoccidiósicos han resultado inadecuados en el control de la infección con este parásito (Carreno et al., 1999; Bowman, 2014). Así, el género Cryptosporidium se incluye actualmente en Filo Apicomplexa, Clase Conoidasida, Subclase Gregarinasina y Orden Cryptogregarinorida (Adl et al., 2019). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 34 Ciclo biológico El ciclo biológico de Cryptosporidium spp. es directo e incluye una fase asexual con dos generaciones de merontes y una fase sexual que termina con la formación de ooquistes esporulados (De Graaf et al., 1999). Todas las especies de Cryptosporidium presentan un desarrollo similar, pero en este trabajo nos centraremos en el de C. parvum por tratarse de la especie más importante asociada a la NCD y de la que se dispone de numerosa información. El ciclo biológico de este parásito (Figura 2) comienza cuando un hospedador adecuado ingiere ooquistes esporulados del protozoo. En el tracto gastrointestinal, y en un período máximo de 48 horas, se produce la exquistación, es decir, la apertura de la pared del ooquiste por la sutura, a través de la cual salen cuatro esporozoítos (Fayer, 2008; Borowski et al., 2010). Los esporozoítos, que son móviles, buscan sus células hospedadoras, generalmente enterocitos maduros que se localizan en el extremo apical de las vellosidades intestinales del yeyuno e íleon (Wetzel et al., 2005; Valigurová et al., 2008). A continuación, se unen a ellas en un proceso mediado por adhesinas que resulta en la internalización del parásito, lo que tiene como consecuencia cambios en la expresión génica de la célula hospedadora (Wanyiri y Ward, 2006; Castellanos-Gonzalez et al., 2008). Así, la membrana apical de la célula envuelve al protozoo, dando lugar a la vacuola parasitófora, de localización intracelular pero extracitoplasmática (Valigurová et al., 2008; Kolářová y Valigurová, 2021). En el punto de contacto entre el parásito y la célula, se forma una organela de alimentación que permite que el parásito adquiera nutrientes de la célula hospedadora, ya que carece de varias rutas metabólicas de síntesis, como las de las purinas, pirimidinas, aminoácidos y algunos ácidos grasos (Borowski et al., 2008; Fayer, 2008). Una vez dentro de la célula hospedadora, los esporozoítos se transforman en trofozoítos y comienza la fase asexual del ciclo. Así, en un proceso de merogonia, los trofozoítos dan lugar a merontes tipo I, que liberan merozoítos tipo I. Estos merozoítos, tras invadir otros enterocitos, pueden generar dos tipos de merontes: otros merontes tipo I, que a su vez originan más merozoítos tipo I en lo que se conoce como ciclo autoinfectivo, o merontes tipo II (Petry, 2004; Fayer, 2008; Borowski et al., 2008, 2010). Cada meronte tipo II da lugar a cuatro merozoítos tipo II, que inician la fase sexual del ciclo tras invadir otros enterocitos y generar microy macrogamontes. Cada microgamonte libera microgametos que, tras fecundar a los macrogamontes, forman un zigoto. Finalmente, los zigotos pueden dar lugar REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 35 a dos tipos de ooquistes: los ooquistes de pared gruesa, que se eliminan al ambiente con las heces del hospedador; y los de pared fina (Borowski et al., 2008). Ambos están ya esporulados y contienen cuatro esporozoítos en su interior, por lo que ya son infectantes para el hospedador. Los ooquistes de pared fina miden unos 5 m de diámetro, y su pared de una única capa se rompe con facilidad en la luz intestinal, siendo responsable de un proceso de autoinfección; por tanto, en ausencia de una respuesta inmunitaria protectora, este protozoo puede mantenerse en el hospedador sin que éste ingiera nuevos ooquistes de pared gruesa (Borowski et al., 2008; Jenkins et al., 2010). El diámetro de los ooquistes de pared gruesa varía en función de la especie de Cryptosporidium. Así, en el caso de aquellas que se multiplican en el intestino delgado, como C. parvum, oscila entre 4 y 6 m, mientras que los ooquistes de las que lo hacen en el abomaso, como C. andersoni, tienen un tamaño ligeramente mayor (7-8 m) (Fayer, 2008). El grosor de su pared les confiere una elevada resistencia a las condiciones ambientales adversas; así, se mantienen infectivos durante períodos prolongados a temperaturas entre 4 y 20 ºC, pero temperaturas superiores a 55 ºC los inactivan en segundos (Fayer et al., 1998; Fujino et al., 2002; Pokorny et al., 2002). Además, resisten la acción de numerosos productos químicos empleados para la desinfección de superficies así como para el tratamiento de aguas para el consumo humano, como el cloro y el ozono (Petry, 2004; Borowski et al., 2010). Se ha comprobado que, en terneros, el período de prepatencia oscila entre dos y siete días, mientras que el de patencia varía entre una y tres semanas (Fayer et al., 1998; Egyed et al., 2003). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 36 Figura 2. Ciclo biológico de C. parvum. Patogenia La invasión del parásito tiene importantes efectos negativos sobre el epitelio intestinal del hospedador, ya que se traduce en un incremento de la apoptosis de los enterocitos (McCole et al., 2000; Buret et al., 2003). Sin embargo, dicho proceso de muerte celular está modulado por la fase del ciclo en la que se encuentre el parásito. Así, la apoptosis se inhibe durante la fase de trofozoíto, cuando el organismo es más dependiente del hospedador, pero se incrementa posteriormente (Liu et al., 2009; Mele et al., 2004). Debido a la pérdida de enterocitos, fundamentalmente en el íleon, se produce un acortamiento de la longitud de las vellosidades intestinales y una hiperplasia de las criptas intestinales, que se traduce en una diarrea por malabsorción y maladigestión; esta situación se agrava por una diarrea secretora debida al incremento de la permeabilidad del epitelio intestinal lesionado y a la respuesta inflamatoria en la lámina propia de la zona de la infección (Robinson et al., 2001; O’Handley y Olson, 2006). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 37 1.4.3.2. Giardia duodenalis Giardia es un género de parásitos flagelados que infecta al tracto gastrointestinal de un amplio rango de hospedadores vertebrados. Taxonómicamente se incluye dentro del Filo Metamonada, Clase Fornicata, Orden Diplomonadida y Familia Hexamitidae (Adam, 2000; Bowman, 2014; Ryan et al., 2021a; Rojas-López et al., 2022). Aunque son organismos eucariotas, carecen de ciertos orgánulos y rasgos típicos de estas células, como mitocondrias, peroxisomas y aparato de Golgi (Adam, 2000; Plutzer et al., 2010). Actualmente se describen nueve especies dentro de este género en base a la morfología de los quistes y trofozoítos, su especificidad de hospedador y sus características genéticas: Giardia agilis, Giardia ardeae, Giardia cricetidarum, Giardia duodenalis (también conocida como Giardia intestinalis o Giardia lamblia), Giardia muris, Giardia microti, Giardia peramelis, Giardia psittaci y Giardia varani (Ryan et al., 2021). G. duodenalis es la única especie que afecta a un amplio rango de mamíferos, entre los que se incluyen el ser humano y la mayoría de animales domésticos de interés veterinario (Ryan y Zahedi, 2019). Se considera un complejo de especies que comprende ocho genotipos (A-H) con diferente especificidad de hospedador (Tabla 2), si bien algunos de ellos, fundamentalmente el A y el B, tienen potencial zoonósico (Cacciò et al., 2018). De todos ellos, en ganado vacuno predomina el E, que se considera específico de ungulados; no obstante, los genotipos A y B también se han identificado con frecuencia en bovinos, por lo que se ha sugerido que estos animales pueden constituir una potencial fuente de infección para las personas (Cai et al., 2021). Asimismo, los genotipos C, D y F, que principalmente afectan a cánidos y felinos, se han identificado de forma esporádica en bovinos (Ryan y Zahedi, 2019; Cai et al., 2021). Cabe señalar que esta clasificación de G. duodenalis en genotipos no está exenta de controversia, ya que diversos estudios indican que la distancia genética entre ellos es lo suficientemente grande como para que cada uno constituya una especie distinta (Franzén et al., 2009; Jerlström-Hultqvist et al., 2010; Adam et al., 2013). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 38 Tabla 2. Genotipos de Giardia duodenalis y sus hospedadores más habituales. Adaptado de Ryan y Cacciò (2013). Genotipo Hospedador A Humanos y otros primates, ganado, perros, gatos, y algunas especies de mamíferos salvajes B Humanos y otros primates, perros, gatos y algunas especies de mamíferos salvajes C Perros y otros cánidos D Perros y otros cánidos E Ungulados F Gatos G Ratas H Mamíferos marinos (pinnípedos) Ciclo biológico El ciclo biológico de G. duodenalis es directo (Figura 3) y comprende dos fases del parásito: trofozoítos que se localizan en la superficie del intestino delgado y quistes que se expulsan con las heces y que presentan una gran resistencia en el ambiente (Monis et al., 2009). El ciclo comienza cuando un hospedador adecuado ingiere los quistes que se encuentran en el medio; en el intestino delgado proximal se produce la exquistación, donde los quistes dan lugar a trofozoítos (Svärd et al., 2003). Figura 3. Ciclo biológico de G. duodenalis. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 45 1.4.4. Epidemiología La diarrea neonatal del ternero es un proceso cuya aparición es consecuencia de la interacción entre numerosos factores, que se pueden clasificar en tres tipos: los asociados al ternero, los dependientes del ambiente en que se encuentra y los asociados al patógeno (Johnson et al., 2017). 1.4.4.1. Factores de riesgo asociados al ternero a) Edad Los terneros son más susceptibles a presentar diarrea neonatal en sus primeros 30 días de vida (Bendali et al., 1999a), lo que se debe a una concurrencia de factores que provocan que el sistema inmunitario del neonato, que todavía es inmaduro, se vea comprometido (Hulbert y Moisá, 2016). Así, desde su nacimiento, el ternero está expuesto a numerosas situaciones estresantes ya que debe adaptarse al ambiente extrauterino, con una elevada carga de patógenos, y regular su propia temperatura corporal, a lo que se suma que su sistema digestivo debe experimentar una serie de modificaciones y adaptaciones para pasar de prerrumiante a rumiante (Meale et al., 2017; Osorio, 2020). Como consecuencia de todo esto, la prevalencia de NCD es especialmente elevada durante las dos primeras semanas de vida, con un pico de incidencia en el octavo día (Bendali et al., 1999a; Bartels et al., 2010; Urie et al., 2018). De todos modos, la importancia de cada uno de los patógenos implicados varía en función de la edad del animal (Tabla 4). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 46 Tabla 4. Rango de edad en el que es más habitual la infección con los agentes causales de NCD durante el primer mes de vida del ternero. Datos extraídos de Hoet y Saif (2004); Heller y Chigerwe (2018); Díaz et al. (2019). Agente causal Rango de edad más frecuente E. coli enterotoxigénica 0-7 días Salmonella spp. 5-14 días BRoV 5-14 días BCoV 5-30 días BToV 2-5 días BNoV 6-14 días BNeV 7-20 días Cryptosporidium parvum 7-28 días Giardia duodenalis 10-30 días Eimeria spp. 24-30 días b) Co-infecciones La presencia de co-infecciones es un factor predisponente para la aparición de brotes de NCD, sobre todo en el caso de aquellas que afectan al tracto respiratorio y las onfaloflebitis. Esto se debe a que la aparición de una infección compromete el sistema inmune del animal, lo que hace que sea más susceptible a sufrir otras infecciones y, por ende, a padecer enfermedades multifactoriales y plurietiológicas (Klein-Jöbstl et al., 2014). c) Factores estresantes Antes del parto, el mantenimiento de las madres en condiciones que les supongan un estrés, como la malnutrición o las elevadas temperaturas, tiene efectos negativos sobre el desarrollo intestinal del feto y su posterior maduración tras el nacimiento, lo que podría facilitar la colonización intestinal por parte de los enteropatógenos (Osorio, 2020). Además, el mantenimiento del ternero en condiciones de alojamiento inadecuadas, como el hacinamiento, temperaturas elevadas, mala ventilación, o el manejo y las condiciones asociadas al transporte, pueden dar lugar a una situación de estrés con un efecto inmunosupresor que aumente el riesgo de que el neonato padezca NCD (Barrington y Parish, 2001; Hulbert y Moisá, 2016; Vlasova y Saif, 2021a). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 47 d) Fallo en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas Numerosos estudios señalan el fallo en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas (FTP) como uno de los factores más importantes asociado al incremento de la incidencia de NCD (Arsenopoulos et al., 2017; Lora et al., 2018). La máxima protección se obtiene cuando el ternero absorbe una cantidad suficiente de inmunoglobulinas, lo que se consigue tras la ingesta de un volumen adecuado de calostro de calidad lo antes posible después del nacimiento. En este sentido, en primer lugar, resulta determinante la concentración de inmunoglobulina G (IgG) que contenga el calostro, que tiene una gran variabilidad entre las madres del rebaño (Gulliksen et al., 2008), por lo que es uno de los factores más importantes involucrados en el FTP (Barrington et al., 2002; Arsenopoulos et al., 2017). En este sentido, el calostro de las novillas suele ser de peor calidad, así como el de aquellas vacas con partos prematuros o que paren terneros muy pesados (Gulliksen et al., 2008; Kessler et al., 2020). Asimismo, suelen producir un calostro de menor calidad las madres no vacunadas, las que padecen alguna patología, incluso subclínica, o las que sufren incontinentia lactis, donde la elevada presión en la ubre da lugar a la pérdida de calostro antes del parto (Conneely et al., 2013; Phipps et al., 2017; Reschke et al., 2017; Denholm et al., 2018). Otro factor que tiene influencia en la calidad del calostro es la época del año en que se produce el parto, pues se ha descrito que es peor en invierno que durante el resto del año, lo que podría estar relacionado con la superioridad nutricional del pasto, que es más escaso en invierno, con respecto al ensilado (Gulliksen et al., 2008; Conneely et al., 2013; Arsenopoulos et al., 2017). Finalmente, resulta determinante el tiempo que transcurre entre el parto y la primera extracción de calostro, ya que si se prolonga más de 6 horas se produce una reducción significativa de la concentración de IgG por el marcado incremento de la producción láctea (Conneely et al., 2013; Reschke et al., 2017; Kessler et al., 2020). Se ha señalado que el calostro, para ser de buena calidad, debe tener una concentración de IgG por encima de 50 g/L, que equivale a una densidad de 1050 g/L o a un valor de Brix del 22% (Vasseur et al., 2009; Bartier et al., 2015; Bartens et al., 2016; Buczinski y Vandeweerd, 2016). La administración de calostro con concentraciones de IgG inferiores se asocia a un incremento de la morbilidad y mortalidad de los procesos y un descenso del rendimiento futuro del animal (Robison et al., 1988; Donovan et al., 1998; Faber et al., 2005). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 48 Además de la concentración de inmunoglobulinas, también se ha de tener en cuenta la procedencia y calidad microbiológica del calostro. En cuanto al primer elemento, el consumo de calostro fresco procedente de las vacas del mismo rebaño probablemente proporcione una protección inmunológica específica frente a los patógenos que se encuentren en dicha granja. Así, se ha observado un aumento de la prevalencia de los agentes causales de NCD en terneros alimentados durante su primera semana de vida con lactorreemplazante o con calostro previamente almacenado, que suele perder calidad y no siempre contiene inmunoglobulinas específicas frente a los patógenos presentes en ese momento en la explotación (Mohammed et al., 1999; Barrington et al., 2002; Trotz-Williams et al., 2008; Al Mawly et al., 2015). En este sentido, la vacunación de la madre en el último trimestre de gestación frente a los principales agentes causales de diarrea puede ser una buena forma de aumentar la inmunidad específica proporcionada con el calostro (Saif et al., 1983, 1984; Ellis et al., 1996; Gonzalez et al., 2021). Así, se han desarrollado varias vacunas comerciales frente a ETEC, BRoV y BCoV, aunque todavía no se dispone de vacunas frente a Cryptosporidium spp. y otros enteropatógenos (Cresswell et al., 2014). Con respecto a la calidad bacteriológica del calostro, la presencia de bacterias puede interferir con la absorción y transporte de moléculas a través de las células epiteliales intestinales (James et al., 1981), además de que puede suponer el primer contacto del neonato con algunos microorganismos patógenos, como Salmonella spp., E. coli o Mycobacterium paratuberculosis (Streeter et al., 1995; Steele et al., 1997). La carga bacteriana del calostro fresco no debe exceder las 100.000 ufc/ml (McGuirk y Collins, 2004) y, para no sobrepasar este umbral, resulta útil la aplicación de medidas preventivas en la recogida de calostro, como una adecuada preparación de la ubre, el uso de recipientes de recogida y materiales limpios y desinfectados, la refrigeración o congelación en el plazo de una hora desde su extracción o la aplicación de tratamientos como la pasteurización o la irradiación (Godden, 2008; Nguyen et al., 2019). Además de la calidad del calostro, existen otros factores que influyen en la consecución de una adecuada transferencia de inmunoglobulinas al ternero. En primer lugar, reviste una gran trascendencia el consumo temprano de un volumen suficiente de calostro. En este sentido, se recomienda que el neonato ingiera tres o más litros de calostro en las primeras seis horas de vida, y una cantidad similar en las doce horas siguientes (Díaz et al., 2019), ya que la capacidad de absorción de inmunoglobulinas del tracto intestinal del ternero REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 49 disminuye a medida que pasa el tiempo tras el parto y es prácticamente nula a las 24 horas post-partum (McGee y Earley, 2019). Para asegurar la ingesta de un volumen suficiente de calostro, se recomienda la separación temprana de los neonatos de sus madres y el empleo de sistemas de alimentación como las tetinas o la sonda esofágica. De hecho, diversos estudios han constatado que la FTP es más frecuente entre aquellos terneros a los que se deja consumir el calostro directamente de su madre con respecto a los sistemas artificiales (Besser et al., 1991; Trotz-Williams et al., 2007; MacFarlane et al., 2015). Esto se debe a que los animales que son amamantados ingieren un volumen de calostro muy variable en sus primeras horas, que en muchos casos es insuficiente, lo que está relacionado con varios factores. Por un lado, el encalostrado natural implica que los neonatos han de ser lo suficientemente vigorosos para ponerse en pie y encontrar el pezón materno, lo que es más habitual en aquellos que tienen un mayor peso al nacimiento e implica que tiendan a ingerir calostro más pronto que los animales más pequeños y débiles. Por otra parte, las madres tienen que permanecer levantadas y tener un buen comportamiento maternal con el ternero. En este sentido, las novillas suelen tener un peor comportamiento maternal y es más habitual que rechacen al ternero, lo que impide o dificulta el amamantamiento y está relacionado con unas mayores tasas de FTP en sus crías (Edwards, 1982; Broom, 1983; Weaver et al., 2000; Vasseur et al., 2009; McGee y Earley, 2019). Finalmente, existen otros factores intrínsecos al ternero que tienen importancia desde la óptica de la adecuada transferencia pasiva de inmunoglobulinas. Los terneros nacidos tras un parto distócico, que es más frecuente en novillas, suelen ser menos vigorosos y tienen una mayor probabilidad de sufrir hipoxia, acidosis o dolor por la tracción ejercida. Además, el estrés derivado de esta situación provoca que tarden más en mostrar su comportamiento normal, lo que retrasa la ingesta de calostro (Chan et al., 1993; Mee, 2008; Barrier et al., 2013). Además, pueden permanecer acostados durante períodos más largos tras el nacimiento, lo que se asocia, además de a un consumo de calostro más tardío, a una mayor exposición a patógenos fecales (Bendali et al., 1999b; Barrier et al., 2012, 2013). Por último, la presencia de anormalidades congénitas, heredables o de desarrollo en un ternero puede constituir un factor de riesgo para el FTP, dependiendo del carácter, localización y grado del defecto (Barrington et al., 2002). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 50 1.4.4.2. Factores de riesgo asociados al ambiente Los factores de riesgo de NCD asociados con el ambiente son los más susceptibles a la implantación de medidas de bioseguridad específicas. En esta categoría se incluyen las condiciones atmosféricas (temperatura, humedad, ventilación, calidad de aire, etc.), alojamiento (casetas individuales, corrales de grupo, en pastoreo), instalaciones (zona de partos, camas, otros animales, protocolos de limpieza, etc.), densidad de animales y su manejo. Todos estos factores pueden afectar negativamente al sistema inmunitario del ternero e influir en la acumulación de los patógenos en el ambiente, así como en su supervivencia y replicación (Barrington et al., 2002; Maunsell y Donovan, 2008; Hulbert y Moisá, 2016). a) Alojamientos, parideras y fómites El alojamiento de los terneros tiene una gran influencia en la aparición de casos de diarrea, pues la mayoría de los agentes causales de este proceso se transmiten de forma muy efectiva por vía fecal-oral a partir del contacto con los animales infectados (transmisión directa) y con un ambiente contaminado (transmisión indirecta) (Lee et al., 2019). Con respecto a la transmisión directa, el mayor riesgo se produce cuando los individuos susceptibles están en contacto con otros terneros con diarrea, aunque también cuando comparten instalaciones con terneros lactantes más mayores o con bovinos de otros grupos de edad, que pueden actuar como portadores asintomáticos (Barrington et al., 2002; Maunsell y Donovan, 2008). En este sentido, el hacinamiento de los animales, más frecuente en las explotaciones más grandes, incrementa las posibilidades de contacto entre individuos y también con superficies contaminadas, por lo que actúa como un factor de riesgo para la aparición de NCD (Frank y Kaneene, 1993; Trotz-Williams et al., 2008; Gulliksen et al., 2009). No obstante, en contraste con lo indicado previamente con respecto al tamaño de la explotación, un estudio realizado en Galicia detectó una mayor incidencia de criptosporidiosis en las granjas más pequeñas, lo que se relaciona con que en este territorio las explotaciones más grandes suelen tener unas mejores condiciones de alojamiento e higiene (Castro-Hermida et al., 2002a). Por otra parte, la contaminación ambiental también genera una elevada presión de infección sobre el neonato, actuando como uno de los factores de riesgo más importantes de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 51 cara a la aparición de un brote de NCD (Cho y Yoon, 2014), por lo que la ausencia de un protocolo de limpieza y desinfección que se aplique de forma periódica y exhaustiva está asociada a una mayor incidencia de este proceso (Gulliksen et al., 2009; Cummins et al., 2016). Con respecto a esto, resulta de vital importancia el empleo de compuestos que sean realmente efectivos frente a los agentes causales, sobre todo si tenemos en cuenta que algunos de ellos, como Cryptosporidium spp., pueden permanecer infectantes en el ambiente durante meses y son resistentes a la mayoría de los desinfectantes de uso común (Quilez et al., 2005; Fayer, 2008; van Mol et al., 2022). Además de la resistencia ambiental, en este tipo de transmisión también tiene gran importancia que la carga del agente en el medio supere la dosis infectiva requerida. En efecto, la carga patogénica del ambiente juega un papel determinante sobre la intensidad de los signos clínicos que padecen los animales y la rapidez de su inicio, sobre todo si tenemos en cuenta que la mayoría de los terneros van a estar expuestos a estos agentes en algún punto de su vida. La existencia de una presión de infección extremadamente alta es muy probable durante los brotes de NCD; es ejemplo de ello un estudio realizado por Zambriski et al. (2013), que señala que el número de ooquistes que suele excretar al medio un ternero infectado es inmensamente superior a la dosis infectiva media de C. parvum. Esa elevada contaminación ambiental es capaz de sobrepasar incluso a la mejor transferencia pasiva de inmunidad, provocando que el proceso se extienda a terneros que no lo padecían previamente (Barrington et al., 2002; Maunsell y Donovan, 2008). Las características de las instalaciones en que se alojan los animales también tienen una gran relevancia desde el punto de vista de la contaminación ambiental. En primer lugar, es importante que estén bien drenadas, ya que la acumulación de humedad favorece la supervivencia de los patógenos y aumenta la contaminación del área (Bendali et al., 1999b). Otros elementos a considerar son el tipo de suelo y de cama empleados. Se ha demostrado que el riesgo de NCD es mayor en aquellos rebaños que utilizan paja sobre tierra o suelo de cemento, siendo preferible el emparrillado (Díaz et al., 2018b). No obstante, aunque el material empleado tiene su importancia, quizás sea todavía más determinante la frecuencia de cambio de cama, ya que si está llena de heces se convierte en una de las principales fuentes de patógenos (Medrano-Galarza et al., 2018b). En efecto, existen estudios que demuestran que una renovación frecuente (cada dos o tres días) de la cama de paja, que incluya la retirada de la cama vieja y la limpieza de los puntos donde se acumula la suciedad, se asocia de forma CYNTHIA LÓPEZ NOVO 52 significativa a un menor riesgo de infección (Bendali et al., 1999b; Mohammed et al., 1999; Gulliksen et al., 2009; Medrano-Galarza et al., 2018b). Además del alojamiento, el área de partos es uno de los ambientes con mayor riesgo de transmisión de patógenos a terneros susceptibles y, por lo tanto, una de las áreas más importantes para la higiene ambiental (Maunsell y Donovan, 2008). Por ello, las parideras no deben utilizarse para otras actividades distintas al parto y, particularmente, debe evitarse su uso como alojamiento temporal de animales enfermos. En este sentido, Fossler et al. (2005) comprobaron que en aquellas granjas que usan el área de partos como enfermería, el riesgo de que los terneros excreten Salmonella spp. se multiplica por dos. De la misma forma, no se recomienda la permanencia del ternero en la paridera durante un largo período de tiempo ya que, aparte de estar asociada a una mayor incidencia de FTP, incrementa su exposición a los patógenos ambientales allí presentes (Klein-Jöbstl et al., 2014). Además, si no existe un área de partos ni se separa al ternero de su madre, un mayor número de neonatos pueden ser abandonados y se favorece la succión cruzada, lo que puede dar lugar a una reducción en la cantidad de calostro ingerida, provocando que los terneros sean más susceptibles a los agentes patógenos (Torsein et al., 2011). Por otra parte, en lo que se refiere a las camas, se ha observado que la incidencia de NCD es menor en los terneros nacidos en parideras con suelo de cemento, ya que permite una limpieza y desinfección más exhaustiva que otros materiales como la tierra o la arena (Castro-Hermida et al., 2002; Trotz-Williams et al., 2008). Tanto en los alojamientos como en el área de partos, el neonato puede entrar en contacto con un gran número de elementos en los que pueden persistir los agentes causales de NCD, pudiendo por tanto actuar como fómites. Algunos de los más habituales son los empleados para la administración de calostro, como los cubos y las tetinas. También suponen un riesgo en este sentido todas aquellas actividades, como el cambio de cama, que implican el movimiento del personal y del equipamiento entre grupos de animales y corrales (Maldonado-Camargo et al., 1998; Sischo et al., 2000). Finalmente, tanto los alojamientos como las parideras deberían de estar dotadas de una buena ventilación, ya que si constituyen un espacio cerrado, los procedimientos que provocan la suspensión en el aire de patógenos del polvo o de las heces, como el lavado a presión, pueden aumentar la transmisión de los agentes causales de NCD (Mohammed et al., 1999; Barrington et al., 2002). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 53 b) Vectores La presencia de vectores en la granja también puede considerarse como un factor de riesgo para la transmisión de la infección, sobre todo cuando se encuentran en gran número y no se han tomado medidas de control. Uno de los más importantes son las moscas, cuyas poblaciones se incrementan notablemente alrededor de las explotaciones durante los meses de verano, pues constituyen una gran fuente de materia orgánica (especialmente leche así como heces sólidas y diarreicas) para su alimentación y multiplicación (Barrington et al., 2002). Estos insectos pueden transportar un gran número de patógenos entéricos presentes de las heces, contribuyendo por tanto a la diseminación y transmisión de los mismos (Cohen et al., 1991; Barrington et al., 2002). En este sentido, se ha confirmado que las moscas pueden vehicular un elevado número de ooquistes de Cryptosporidium spp., depositándolos en las zonas en las que se posan, y que los pueden albergar durante 3 semanas tras su exposición (Graczyk et al., 2000). De la misma forma, los roedores también pueden actuar como una fuente de patógenos entéricos en el ambiente de la explotación; así, por ejemplo, se ha demostrado que aproximadamente un tercio de los roedores excreta una media de 103 ooquistes de Cryptosporidium spp. por pellet fecal (Torres et al., 2000), siendo especialmente importante su papel en la transmisión de C. parvum (Chalmers et al., 1997; Bajer et al., 2003). Lo mismo sucede con los pájaros, que pueden jugar un papel importante en la diseminación de los patógenos a diferentes naves y a otras granjas (Smith et al., 2014). c) Estación Varios autores han señalado mayores incidencias de este proceso en invierno, pues durante esta estación es habitual que en las explotaciones haya una mayor densidad de animales por alojamiento, a lo que se une una temperatura ambiental más baja y una mayor humedad en el ambiente (Schumann et al., 1990; Frank y Kaneene, 1993; Bendali et al., 1999a; Gulliksen et al., 2009). Todo ello resulta en una mayor carga ambiental de agentes patógenos y una mayor resistencia de los mismos en el medio (Lundborg et al., 2005; Gulliksen et al., 2009), lo que provoca un incremento de la presión de infección. Además, la climatología fría y húmeda puede resultar en un retraso y en una disminución de la absorción de inmunoglobulinas por parte del neonato (Olson et al., 1980; Beam et al., 2009), lo que unido a la ya comentada inferior calidad del calostro producido en esta estación, puede CYNTHIA LÓPEZ NOVO 54 provocar una menor resistencia del ternero a la presión de infección, incrementando las probabilidades de aparición de NCD. En contraste, en zonas donde se registran temperaturas muy elevadas, la incidencia de diarrea puede ser mayor en el verano, fundamentalmente porque el estrés por calor que padece el ternero provoca un aumento de sus niveles de glucocorticoides que provocan una disminución de la absorción intestinal de inmunoglobulinas (Uetake, 2013). d) Introducción de animales La incorporación en la explotación de terneras de reposición también puede suponer un factor de riesgo para la aparición de NCD, pues éstos pueden introducir nuevos agentes infecciosos en la granja, así como contribuir al mantenimiento de la infección con los previamente presentes, dando lugar a un brote diarreico. Además, es más probable que compren animales de reposición los ganaderos cuyos terneros mueren por este proceso (Schumann et al., 1990; Barrington et al., 2002; Gulliksen et al., 2009). 1.4.4.3. Factores asociados con el agente causal Numerosos agentes patógenos pueden estar involucrados en la aparición de NCD. Su prevalencia varía en función de la zona geográfica en la que se realice el estudio (Tabla 5), pero, en general, son ubicuos y endémicos. Así, se ha comprobado que prácticamente el 100% de los bovinos se infectan con Cryptosporidium spp., G. duodenalis y Eimeria spp., especialmente durante los primeros meses de vida (Xiao y Herd, 1994; Castro-Hermida et al., 2002b; Daugschies y Najdrowski, 2005), y es habitual que las infecciones persistan en la etapa adulta, aunque en bajas concentraciones y sin signos clínicos de infección (Fayer et al., 2000; Castro-Hermida et al., 2002b, 2007; Trout et al., 2007; Lucas et al., 2014). Además, el resto de agentes causales de NCD también se han detectado en un elevado número de animales asintomáticos (Cho et al., 2013; Coura et al., 2014; Kolenda et al., 2015; Gomez et al., 2017), lo que se debe a que muchos de ellos actúan más como oportunistas secundarios que como patógenos primarios altamente virulentos y a que, como hemos ido mencionando, la aparición de NCD también depende de la presencia de otros factores (Reynolds et al., 1986; Barrington et al., 2002). Por lo tanto, su detección no puede interpretarse por sí sola como causa de la diarrea (De La Fuente et al., 1998). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 61 Tabla 7. Continuación. Agente etiológico Características de la diarrea Otros signos clínicos Nebovirus Amarillenta con restos de tejidos. C. parvum Acuosa y amarillenta. Los animales infectados no suelen tener fiebre ni estar deprimidos. G. duodenalis Pastosa, suele presentar moco. Fiebre. Eimeria spp. Diarrea mucoide y/o sanguinolenta Tenesmo. Los terneros con infecciones más graves pueden mostrar una coccidiosis nerviosa, con temblores musculares o nistagmo. De la misma forma, puede resultar interesante la realización de la necropsia de los individuos inmediatamente tras su muerte, ya que a los cinco minutos del fallecimiento comienza la autolisis y la invasión bacteriana de la mucosa intestinal (Izzo et al., 2015). Durante este procedimiento, se debe prestar atención a la presencia de áreas intestinales con diferente color, consistencia o contenido, así como de otras lesiones que pueden ser orientativas de cara a dilucidar la etiología del proceso (Tabla 8). Tabla 8. Hallazgos observables en la necropsia en función del agente causal de la diarrea (González y Astiz, 2005; Heller y Chigerwe, 2018; Díaz et al., 2019). Agente etiológico Hallazgos en la necropsia E. coli enterotoxigénica Intestino dilatado con gas y líquido amarillento, sin daños apreciables en la mucosa ni hemorragia. En caso de endotoxemia, hipopión, meningitis, onfaloflebitis y presencia de fibrina en las articulaciones, en el abdomen, etc. Salmonella spp. Enteritis fibrinosa a fibrino-necrótica con contenido sanguinolento, especialmente en yeyuno, íleon y colon. Peritonitis con presencia de fibrina en la cavidad abdominal. Signos de diseminación bacteriana a otros órganos como los riñones. Focos de necrosis hepática. Rotavirus, Coronavirus y C. parvum Enteritis catarral sin más hallazgos anatomopatológicos observables. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 62 Tabla 8. Continuación. Agente etiológico Hallazgos en la necropsia Eimeria spp. Enteritis hemorrágica con nódulos o líneas blanco-grisáceas, especialmente en el intestino grueso. 1.4.5.2. Diagnóstico epidemiológico Una vez realizado el examen clínico de los terneros afectados, es igualmente importante recopilar los factores de riesgo y puntos críticos existentes en la explotación que pueden estar detrás del brote, ya que resultará útil para interpretar correctamente los resultados de laboratorio, minimizar las pérdidas asociadas al problema existente y prevenir su reaparición en el futuro (Smith, 2012). En primer lugar, es importante conocer el historial de diarreas de la explotación y toda la información asociada al brote: su duración y progresión, tasa de mortalidad y morbilidad, estación del año, el número y, especialmente, la edad de los animales afectados ya que, como hemos visto en el apartado de epidemiología, puede resultar muy orientativa de cara a sospechar de unos enteropatógenos u otros (Moran, 2002; Díaz et al., 2019). A continuación, es preciso realizar una visita pormenorizada de la explotación para revisar todas las instalaciones y pautas de manejo que puedan tener incidencia en la salud del ternero neonato. En este sentido, cobran especial importancia el manejo del animal en sus primeros días de vida y su encalostrado (calidad y cantidad del calostro, momento y forma de administración), el diseño de los alojamientos y de las parideras y los protocolos de higiene y desinfección. Asimismo, es conveniente disponer de información sobre los protocolos seguidos para la introducción de animales en la explotación, el manejo de las madres durante el período de secado y periparto, así como conocer las medidas preventivas aplicadas frente a este y otros procesos infectoparasitarios, incluyendo tratamientos y pautas de vacunación administradas (Moran, 2002; González y Astiz, 2005; Heller y Chigerwe, 2018). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 63 1.4.5.3. Diagnóstico laboratorial La identificación de los agentes patógenos implicados en un caso o brote de diarrea neonatal es esencial pues permite establecer las medidas preventivas y de control específicas más adecuadas en cada caso, incluyendo la instauración de una pauta de vacunación o tratamiento específico en el caso de ciertos enteropatógenos. Por otro lado, permite identificar agentes zoonósicos que pueden estar implicados en el proceso con importancia desde el punto de vista de la salud pública, como algunas especies de Salmonella y Cryptosporidium y algunos genotipos de G. duodenalis (Holschbach y Peek, 2018; Chalmers et al., 2019; Taghipour et al., 2022). Sin embargo, a la hora de realizar un adecuado diagnóstico etiológico se debe tener en cuenta que en la mayoría de los animales con diarrea está presente más de un enteropatógeno, y algunos de ellos pueden estar presentes incluso en terneros sanos (Cho y Yoon, 2014; García-Meniño et al., 2015). Algunos, como la mayoría de las cepas de E. coli, incluso forman parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal de los terneros, por lo que su aislamiento a partir de heces o de contenido intestinal no es significativo a no ser que se demuestre la presencia de factores de virulencia (Izzo et al., 2015). Para la realización de un diagnóstico etiológico correcto es imprescindible recoger las muestras oportunas. En este sentido, la toma de muestras debería incluir animales de todas las semanas de edad afectados por el brote, así como animales aparentemente sanos, ya que podrían estar infectados de forma subclínica. Así, se recomienda recoger un mínimo de 10 gramos de heces directamente del recto de animales, siempre y cuando no hayan sido tratados en las 24-48 horas posteriores a la aparición de los signos clínicos (Díaz et al., 2019). Cuando haya varios animales afectados, pueden examinarse las heces de cada animal de forma individual o elaborarse pools que deberían incluir deyecciones de tres individuos (Loy y Brodersen, 2022). Las muestras recogidas deberán conservarse en refrigeración y analizarse en el menor tiempo posible. Asimismo, si se realiza la necropsia de individuos fallecidos a causa del proceso, resulta interesante tomar muestras de duodeno, yeyuno medio, íleon proximal, válvula íleocecal y colon, así como de ganglios linfáticos regionales y otros órganos afectados, para examinarlas en busca de lesiones que confirmen los diagnósticos macroscópicos establecidos previamente (Blanchard, 2012). Se recomienda CYNTHIA LÓPEZ NOVO 64 incluir porciones de tejido que incluyan lesiones acompañadas de otras aparentemente sanas (Díaz et al., 2019). Si las muestras están destinadas a la realización de cultivos bacterianos, se deben enviar en refrigeración, mientras que para el cultivo de virus pueden refrigerarse o congelarse. En el caso de emplearlas para estudios histopatológicos, deben ser frescas o estar fijadas en formol (Lew et al., 1990; Morales et al., 2017). Se han desarrollado numerosas técnicas para la detección de enteropatógenos en heces (Tabla 9); aunque ninguna presenta una sensibilidad y especificidad del 100%, las técnicas moleculares suelen ser las más fiables. Tabla 9. Técnicas laboratoriales disponibles para cada agente causal de la NCD. Adaptado de Díaz et al. (2019). ELISAd: Enzimoinmunoanálisis de adsorción de captura de antígeno; ICF: Inmunocromatografía; PCR: Reacción en cadena de la polimerasa; qPCR: PCR en tiempo real; IFAT: Inmunofluorescencia directa; RT-PCR: PCR con transcripción inversa. ELISAi: Enzimoinmunoanálisis de adsorción indirecto. Agente etiológico Cultivo Microscópicas Inmunológicas Moleculares E. coli enterotoxigénica Cultivo bacteriano - ELISAd, ICF, Aglutinación PCR, qPCR E. coli enteropatógena Cultivo bacteriano - - PCR, qPCR E. coli productora de toxinas Shiga y enterohemorrágica Cultivo bacteriano - - PCR, qPCR Salmonella spp. Cultivo bacteriano Aglutinación PCR, qPCR Rotavirus Aislamiento vírico Microscopía electrónica ELISAd, IFAT, ICF RT-PCR6, PCR, qPCR Coronavirus Aislamiento vírico Microscopía electrónica IFAT RT-PCR, PCR, qPCR Torovirus - Microscopía electrónica ELISAd, IFAT RT-PCR, PCR, qPCR Norovirus - Microscopía electronica ELISAd RT-PCR, PCR, qPCR REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 65 Tabla 9. Continuación. Agente etiológico Cultivo Microscópicas Inmunológicas Moleculares Nebovirus - Microscopía electronica ELISAd RT-PCR, PCR, qPCR Cryptosporidium spp. - Microscopía óptica tras tinción ELISAd, ELISAi, IFAT, ICF PCR, qPCR G. duodenalis - Microscopía óptica tras flotación ELISAd, IFAT, ICF PCR, qPCR Eimeria spp. - Microscopía óptica tras flotación ELISAi PCR, qPCR Técnicas de cultivo Las técnicas de cultivo a partir de heces o de muestras intestinales permiten detectar diversos agentes bacterianos y víricos (Tabla 9). El aislamiento vírico sigue considerándose el gold standard para la detección de dichos patógenos (Popow-Kraupp y Aberle, 2011), pero su realización es laboriosa y requiere mucho tiempo, por lo que en la actualidad tan sólo se emplea como método confirmatorio (Cho y Yoon, 2014). Por su parte, el cultivo bacteriano se usa de forma habitual para la identificación de este tipo de agentes; sin embargo, no está exento de inconvenientes ya que, por un lado, los resultados no se obtienen hasta 24-72 h después de realizar la técnica y, por otro, a pesar de la existencia de medios de cultivos selectivos y diferenciales, es un método muy poco específico, lo que hace necesaria su combinación con otros (Cho y Yoon, 2014). Así, en el caso de los patotipos de E. coli, el diagnóstico definitivo requiere confirmar que las colonias aisladas poseen determinados factores de virulencia mediante técnicas de detección de antígenos como el ELISA, la inmunocromatografía y la aglutinación en placa o en látex (Blanchard, 2012; Peek et al., 2018) o, preferiblemente, con métodos de identificación molecular como la PCR (Sjöling et al., 2007). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 66 Técnicas microscópicas Las técnicas microscópicas se emplean fundamentalmente para la detección de los ooquistes o quistes de los protozoos implicados en la NCD. Son métodos que permiten un diagnóstico rápido de forma económica, pero presentan una baja sensibilidad. Para incrementarla se puede recurrir a métodos de concentración previa de los quistes u ooquistes. Con esta finalidad, se emplean técnicas como la flotación con solución salina saturada, sacarosa o sulfato de zinc (Casemore et al., 1985) o la concentración difásica con formoléter o con agua y acetato de etilo (Mank et al., 1997; Smith, 2008; Díaz et al., 2018a). Además, para incrementar la probabilidad de detectar estas formas parasitarias y, por tanto, aumentar la sensibilidad, se suelen emplear técnicas de tinción, como la de Heine o la de Ziehl-Neelsen modificada, entre otras, para los ooquistes de Cryptosporidium spp. (Henriksen y Pohlenz, 1981; Heine, 1982), o la tinción con lugol, la de Giemsa, la tricrómica de Mason o la tinción con hematoxilina de hierro para los trofozoítos y quistes de G. duodenalis (Ament, 1972; Thornton et al., 1983; Huang y White, 2006; Smith y Paget, 2007). La baja sensibilidad de las técnicas microscópicas no suele suponer un problema en el diagnóstico de los casos clínicos de Cryptosporidium spp., pues suelen caracterizarse por la eliminación de millones de ooquistes en las heces. No obstante, existen casos de animales asintómaticos o en fases iniciales de la infección, donde la intensidad de eliminación de ooquistes es muy baja. Por ello, para aumentar la fiabilidad del diagnóstico, se recomienda realizar una concentración previa de ooquistes y posteriormente confirmar con una técnica de gran sensibilidad como la inmunofluorescencia directa o la PCR (Smith, 2008; Mirhashemi et al., 2015). Otra de las limitaciones de la utilización de la microscopía es que no permite determinar la especie de Cryptosporidium spp. ni el genotipo de G. duodenalis implicado en la infección, por lo que no permiten determinar su potencial zoonósico (Thompson y Monis, 2004; Blanchard, 2012). Sin embargo, en el caso de Eimeria spp., el análisis morfométrico de los ooquistes permite diferenciar especies; debido a que algunas estructuras de interés sólo aparecen en ooquistes esporulados, una correcta identificación de estas formas parasitarias precisa de su esporulación previa, que se consigue mediante su incubación en REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 67 una solución de dicromato potásico al 2,5% durante 7-10 días (Koutny et al., 2012; Bangoura y Daugschies, 2018). Por su parte, la microscopía electrónica presenta la ventaja de que se puede emplear para identificar virus difíciles de cultivar, pero es una técnica muy poco sensible (Cho y Yoon, 2014). De hecho, el pleomorfismo de algunos agentes como BCoV o BToV y su similitud puede dar lugar a identificaciones erróneas (Woode, 1987). De todos modos, este inconveniente puede reducirse mediante la introducción de un paso de confirmación serológica en la técnica (microscopía inmunoelectrónica o inmunoelectrónica de fase sólida) (Liebler et al., 1992), que requiere una elevada inversión en equipamiento, de ahí que en la actualidad su uso se limite a situaciones de elevada carga viral o casos de diarrea provocada por agentes infecciosos desconocidos (Cho y Yoon, 2014; Pang y Lee, 2015). Técnicas inmunológicas Las técnicas inmunológicas pueden ser indirectas o directas. Con respecto a las primeras, se han desarrollado varios métodos para detectar anticuerpos frente a varios agentes causales de la NCD, pero no resultan útiles, ya que, por un lado, pueden dar lugar a falsos positivos debido a la presencia de anticuerpos maternales o de reacciones cruzadas con otros microorganismos; y, por otro, pueden resultar en falsos negativos, dado que, en caso de exposición a alguno de estos enteropatógenos, el animal no sería capaz de desarrollar anticuerpos hasta más allá de la cuarta semana de vida (Hulbert y Moisá, 2016; Díaz et al., 2019). En lo que se refiere a las técnicas directas, destacan el ELISA de captura de antígeno y la inmunocromatografía, dos métodos muy empleados por su rapidez y sencillez. Si bien el primero suele realizarse en entornos laboratoriales, el segundo resulta muy práctico porque constituye el fundamento de los kits de diagnóstico de campo disponibles para ETEC, BRoV, BCoV y C. parvum. No obstante, la sensibilidad de ambos métodos tiende a ser inferior que la de las técnicas de cultivo y que la de las moleculares (Cho et al., 2010). Por lo tanto, para obtener resultados fiables, es importante que las muestras sobre las que se aplican estas técnicas procedan de animales con diarrea aguda (Cho y Yoon, 2014). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 68 Por otra parte, también resulta de utilidad la inmunofluorescencia directa, ya que es una técnica altamente sensible y específica que puede emplearse para un screening rápido de un gran número de muestras (Johnston et al., 2003). Además, en el caso de algunos agentes como Cryptosporidium spp., se considera la técnica de elección, ya que tiene un umbral de detección mucho más bajo que el ELISA de captura de antígeno (Anusz et al., 1990). Sin embargo, no está exenta de inconvenientes. En primer lugar, no permite diferenciar entre las especies y genotipos de Cryptosporidium spp. y G. duodenalis, respectivamente (Chalmers y Katzer, 2013; Koehler et al., 2014). Además, en el caso de los agentes víricos, su realización en fragmentos de intestino delgado puede dar lugar a falsos negativos por la pérdida post-mortem de las células epiteliales infectadas (Benfield et al., 1984; Dar et al., 1998). Finalmente, el microscopio y el inmunoconjugado necesarios para efectuarla tienen un alto coste económico, por lo que no resulta accesible como método de rutina (Díaz et al., 2019). Técnicas moleculares Las técnicas moleculares son las más utilizadas en la actualidad para el diagnóstico de la mayoría de los enteropatógenos implicados en la NCD, ya que tienen una elevada especificidad y sensibilidad y permiten obtener resultados de forma rápida (Cho y Yoon, 2014). Se basan en la amplificación de fragmentos de ADN o ARN de los distintos agentes mediante el uso de cebadores específicos; en la Tabla 10 se incluyen los principales loci empleados para la identificación de los enteropatógenos más importantes en la NCD. Estas técnicas son especialmente útiles para detectar virus de difícil aislamiento y bacterias de crecimiento lento. Además, en el caso de E. coli, su realización tras el cultivo permite identificar los factores de virulencia y, de esta manera, conocer el patotipo implicado en el brote. De forma similar, permiten identificar las especies y subtipos de Cryptosporidium spp. y los genotipos de G. duodenalis, lo que es muy útil para conocer su epidemiología y posibles rutas de infección, así como su potencial zoonósico (Smith, 2008; Plutzer y Karanis, 2009; Feng y Xiao, 2012). Sin embargo, estas técnicas muestran varias limitaciones que repercuten negativamente en su sensibilidad. En este sentido, destaca la presencia de inhibidores de PCR en la muestra, que es habitual en las heces; así como la incapacidad para detectar el REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 69 patógeno cuando la carga de ADN en la muestra es muy baja, o para identificar determinadas cepas víricas o bacterianas cuya secuencia no coincida con los cebadores utilizados (Cho et al., 2010; Mirhashemi et al., 2015). Tabla 10. Principales loci empleados para la detección y caracterización de los enteropatógenos más habitualmente implicados en la NCD. Agente etiológico Locus Referencia E. coli enterotoxigénica Gen que codifica para subunidad fimbrial de F5 Sta Franck et al. (1998) E. coli enteropatógena Gen eaeA E. coli enterohemorrágica Gen eaeA Gen que codifica para la subunidad A de Stx1 Gen que codifica para la Subunidad A de Stx2 Rotavirus Gen que codifica para la proteína VP4 Gen que codifica para la proteína VP7 Isegawa et al. (1993) Coronavirus Gen que codifica para la proteína de la nucleocápside (Gen N) Tsunemitsu et al. (1999) Torovirus Gen que codifica para la glicoproteína de las espículas (Gen S) Hoet et al. (2002) Norovirus y Nebovirus Gen que codifica para la proteína ARNdependiente ARN polimerasa (RdRp) Smiley et al. (2003) Cryptosporidium spp. Gen del ARN ribosomal 18s (Gen SSU rRNA o 18s rRNA) Xiao et al. (1999) Gen que codifica para la proteína de la pared del ooquiste (Gen COWP) Kato et al. (2003) Gen que codifica para la actina Homem et al. (2012) Gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kDa (hsp70) Stinear et al. (1996) Gen de la glicoproteína de 60 kDa (Gen gp60)1 Strong et al. (2000) 1Se utiliza para determinar el subtipo de C. parvum tras su identificación mediante la PCR y posterior secuenciación del gen 18s rRNA. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 70 Tabla 10. Continuación. Agente etiológico Locus Referencia G. duodenalis Gen que codifica para la β-giardina (bg) Cacciò et al. (2002) Gen que codifica para la glutamatodehidrogenasa (gdh) Read et al. (2004) Gen que codifica para la triosa fosfato isomerasa (tpi) Sulaiman et al. (2003) Gen del ARN ribosomal 18s (Gen SSU rRNA o 18s rRNA) Read et al. (2002) 1.4.6. Prevención y control Como se ha desarrollado previamente, la NCD es una enfermedad multifactorial en la que no se observan demasiadas diferencias en sus signos clínicos en función de los agentes etiológicos implicados, dando lugar a una deshidratación progresiva, pérdida de electrolitos y acidosis metabólica que pueden ser fatales. En este sentido, existen pautas generales para su tratamiento, prevención y control, válidas para todas las etiologías. Sin embargo, el diagnóstico de los agentes causales implicados resulta determinante para el establecimiento de las medidas específicas más adecuadas en cada caso. 1.4.6.1. Tratamiento 1.4.6.1.1. Tratamiento sintomático Cuando nos enfrentamos a un caso de NCD, antes de conocer su etiología, tras el examen físico y la toma de muestras es importante aplicar un tratamiento sintomático que mejore el estado general y los signos clínicos del ternero afectado. Para ello, en primer lugar, se ha de rehidratar al animal y administrarle fármacos que permitan reducir su dolor abdominal. Posteriormente, cuando ya se haya dilucidado el componente etiológico del proceso, se puede acudir a la antibioterapia, en caso de que tenga un origen bacteriano, y a REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 77 influyen en la aparición de cepas resistentes. En este sentido, la edad del animal juega un papel importante, predominando los clusters resistentes en los animales de entre 2 y 4 semanas de edad por el desarrollo insuficiente de su microbiota (Berge et al., 2005, 2010; Oikonomou et al., 2013). Para conocer el espectro de antibióticos frente a los que se han desarrollado resistencias y su evolución en el tiempo, resulta muy útil la realización de estudios de resistencias, cuyos resultados permiten optimizar la selección de los antibióticos a administrar ante un brote. La detección de las resistencias asociadas a E. coli y otros agentes bacterianos puede hacerse de diversas formas. El método más utilizado en la actualidad es la determinación fenotípica de los patrones de resistencia, que consiste en exponer al agente bacteriano a antibióticos representantes de las distintas familias empleadas en terapéutica para conocer frente a cuáles es resistente; los resultados permiten predecir la respuesta a la acción de un determinado antibiótico a nivel de campo, incluso aunque ese en concreto no haya sido incluido en el análisis (Livermore et al., 2001). Esta técnica también resulta útil para deducir los mecanismos de resistencia presentes en el agente bacteriano en cuestión (Cantón, 2010), pero no permite conocerlos con exactitud, lo que supone un problema dado que se pueden diseminar a otras bacterias. Además, algunos mecanismos genéticos de resistencia son difíciles de detectar mediante las técnicas fenotípicas y pueden dar lugar a fallos de tratamiento a nivel de campo (Anjum et al., 2017). Por todo ello, se han desarrollado técnicas de caracterización molecular de los mecanismos de resistencia antibiótica (Anjum et al., 2017). Sin embargo, dada la gran diversidad de genes potencialmente implicados en las resistencias, no resulta sencillo identificarlos todos en función de su secuencia, fundamentalmente debido a que se están descubriendo continuamente nuevos genes o variantes alélicas de los ya conocidos (Anjum et al., 2017). Además, la presencia de un determinante de resistencia no implica su expresión, y por tanto, la manifestación fenotípica de la resistencia a nivel de campo (Cantón, 2010). Por lo tanto, a la hora de conocer la susceptibilidad de una cepa a un antibiótico, el uso de las técnicas moleculares todavía no es excluyente de la determinación fenotípica. En esta revisión se analizarán los principales mecanismos de resistencia presentes en los E. coli de terneros con NCD en función de las principales familias antibióticas utilizadas para su tratamiento. La resistencia a los beta-lactámicos como las penicilinas o CYNTHIA LÓPEZ NOVO 78 cefalosporinas, muy empleadas para el tratamiento de la NCD (Constable, 2009; Peek et al., 2018), puede ser la consecuencia de la disminución de la permeabilidad de la membrana externa bacteriana, la alteración de la diana celular o la existencia de bombas de expulsión activa; sin embargo, el mecanismo más importante es la producción de enzimas, en concreto betalactamasas (Navarro et al., 2010). La producción de unas u otras da lugar a distintos patrones de resistencia que se resumen en la Tabla 11. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 79 Tabla 11. Patrones de resistencia a betalactámicos de E. coli en función de la beta-lactamasa producida. Adaptado de Navarro et al. (2010). Fenotipo de resistencia adquirida Betalactamasas producidas AMP AMC TIC PIP C1ª FOX CXM C3ª C4ª CARB Producción de penicilinasas TEM-1, TEM2, SHV-1 R S R r S/r S S S S S Hiperproducción de penicilinasas TEM-1, TEM2, SHV-1 R r R R R S S S S S Producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) Enzimas derivadas de TEM-1, TEM-2 y SHV-1; enzimas de la familia CTX-M R S/R R R R S R S/R S/R S Producción de betalactamasas resistentes a los inhibidores Enzimas derivadas de TEM-1, TEM-2 y, en menor medida, SHV-1 R R R R S S S S S S Hiperproducción de betalactamasa cromosómica de clase C y AmpC plasmídicas Betalactamasa cromosómica no inducible de clase C; betalactamasas AmpC plasmídicas R R R R R R R r/R S S Producción de betalactamasas activas frente a carbapenémicos Carbapenemasas de clase A, clase B y/o clase D R R R R R R R r r r AMP: ampicilina; AMC: amoxicilina-ácido clavulánico; TIC: ticarcilina; PIP: piperacilina; C1ª: cefalosporinas de primera generación; FOX: cefoxitina; CXM: cefuroxima; C3ª: cefalosporinas de tercera generación; C4ª: cefalosporinas de cuarta generación; CARB: carbapenémicos; S: sensible; r: halos reducidos o concentración mínima inhibitoria elevada pero dentro del rango de sensibilidad; R: resistente CYNTHIA LÓPEZ NOVO 80 Otra familia antibiótica frecuentemente empleada para el tratamiento de la NCD es la de las fluoroquinolonas, que incluye antibióticos como el enrofloxacino o el marbofloxacino. La resistencia a estos compuestos suele ser la consecuencia de mutaciones en los genes que codifican para la ADN girasa y la ADN topoisomerasa IV, que son las enzimas diana de estos compuestos, reduciendo la capacidad de las quinolonas para unirse a ellas e inhibir su actividad (Hopkins et al., 2005; Hooper y Jacoby, 2015). Las mutaciones en estas enzimas suelen producirse en las regiones denominadas QRDR (región determinante de la resistencia a las quinolonas) y están ligadas a un incremento en la concentración mínima inhibitoria de todos los compuestos de esta familia. En efecto, la aparición de alguna de estas mutaciones implica que posteriormente se van a ir desarrollando más en esa o en otra QRDR, por lo que ante una resistencia a alguna fluoroquinolona deberíamos considerar resistencia a todas ellas (Navarro et al., 2010). Además de los mecanismos de resistencia cromosómicos, también se ha descrito la adquisición de plásmidos específicos de resistencia a las quinolonas (resistencia las quinolonas mediada por plásmidos o PMQR). Estos plásmidos contienen genes que codifican para diversos mecanismos de resistencia, incluyendo proteínas Qnr, que protegen a las enzimas diana de la bacteria de la acción del antibiótico; la enzima AAC(6′)-Ib-cr acetiltransferasa, que modifica la estructura de ciertas quinolonas, y las bombas de expulsión activa (Hooper y Jacoby, 2015; Poirel et al., 2018). La resistencia a los aminoglucósidos, a la que pertenecen compuestos tan habituales a nivel de campo como la neomicina o la gentamicina, se corresponde con varios mecanismos de modificación de los puntos diana del fármaco, disminución de la permeabilidad celular o eliminación del antibiótico de la célula a través de bombas de expulsión activas; sin embargo, lo más frecuente es que se deba a la inactivación enzimática del fármaco, que consiste en la producción de enzimas capaces de modificar la estructura molecular de los aminoglucósidos de forma que no puedan alcanzar o unirse a su punto diana en la bacteria (Ramirez y Tolmasky, 2010). En la actualidad, se conocen tres tipos de enzimas capaces de inactivar a los aminoglucósidos: las acetiltransferasas, las nucleotidiltransferasas y las fosfotransferasas. En los E. coli de origen humano y animal son especialmente frecuentes las acetiltransferasas AAC(3)-II/IV y AAC(6')-Ib, las nucleotidiltransferasas ANT(2″) y ANT(3″) y las fosfotransferasas APH(6)-Ia, APH(6)-Id y REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 81 APH (3')-I/II (Poirel et al., 2018). El patrón de resistencia fenotípico asociado a cada una de estas enzimas se indica en la Tabla 12. Tabla 12. Patrones de resistencia a aminoglucósidos de E. coli en función de la enzima producida. Adaptado de Livermore et al., (2001), Navarro et al., (2010) y Ramirez y Tolmasky, (2010). Enzima GEN NET TOB AMK KAN NEO Observaciones AAC(3)-II R R R S R S Más resistente a GEN que a TOB, resistencia moderada a KAN y NET. AAC(3)-IV R R R S R R Resistente también a apramicina. AAC(6') S/r R R R R R ANT(2″) R S R S R S ANT(3″) - - - - - - Resistente a estreptomicina y espectinomicina. APH(6)-Ia/Id - - - - - - Resistente a estreptomicina. APH(3')-I/II S S S S R R GEN: gentamicina; NET: netilmicina; TOB: tobramicina; AMK: amicacina; KAN: kanamicina; NEO: neomicina; S: sensible; r: halos reducidos o concentración mínima inhibitoria elevada pero dentro del rango de sensibilidad; R: resistente. La resistencia a las tetraciclinas es el resultado de la adquisición de genes que activan dos tipos principales de mecanismos: el más frecuente es la expulsión del compuesto de la célula a través de las bombas de expulsión activa, aunque también se han descrito proteínas de protección ribosómica que se unen a las regiones diana de las tetraciclinas en los ribosomas, impidiendo que el antibiótico pueda acceder a ellos (Nguyen et al., 2014). En cuanto a su presencia en E. coli, en las diversas cepas de esta especie bacteriana se han identificado nueve genes tet que codifican para la producción de bombas de expulsión activa (tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G), tet(J), tet(L) y tet(Y)), siendo tet(A) y tet(B) los más frecuentes; y dos que codifican para la síntesis de las proteínas de protección ribosómica (tet(M) and tet(W)). Además, en algunos aislados, se ha detectado la presencia de un tercer mecanismo de resistencia que consiste en la producción de una oxidorreductasa que inactiva las tetraciclinas, codificada por el gen tet(X) (Poirel et al., 2018). Una misma cepa puede tener más de uno de estos mecanismos de resistencia; de hecho, se ha detectado la presencia de más de un gen tet en un solo aislado, lo que puede deberse a su adquisición a través de CYNTHIA LÓPEZ NOVO 82 plásmidos u otros elementos genéticos móviles que, en ocasiones, también contienen genes de resistencia frente a otras familias de antibióticos (Poirel et al., 2018). Las sulfonamidas suelen administrarse en combinación con el trimeptoprim para el tratamiento de la NCD, denominándose sulfonamidas potenciadas por el efecto sinérgico de ambos compuestos. La resistencia a las sulfonamidas potenciadas puede deberse a dos tipos de mecanismos: la presencia de mutaciones en los genes que codifican para las enzimas diana de estos compuestos (dihidropteroato sintasas para las sulfonamidas y dihidrofolato reductasas para el trimetoprim) y la adquisición de los genes sul y dfr, que codifican para la producción de dihidropteroato sintasas y dihidrofolato reductasas resistentes a las sulfonamidas y al trimetoprim, respectivamente, de forma que estas enzimas sustituyen a las sensibles (Poirel et al., 2018; Van Duijkeren et al., 2018). Antiprotozoarios a) Cryptosporidium spp. En la actualidad, existen muy pocos fármacos comercializados con actividad frente a Cryptosporidium spp. Además, aquellos que están disponibles no son muy efectivos y, en la mayoría de los casos, sólo reducen la duración de la diarrea y del período de excreción de ooquistes, por lo que se emplean fundamentalmente de forma preventiva (Thomson et al., 2017). El lactato de halofuginona es uno de los pocos fármacos autorizados para el tratamiento específico y prevención de la criptosporidiosis. Se trata de un coccidiostático que se administra por vía oral y cuyo mecanismo de acción no se conoce completamente, si bien se ha sugerido que afecta a varios procesos celulares reduciendo la viabilidad de las fases de merozoíto y esporozoíto (Naciri et al., 1993; Keller et al., 2012). El tratamiento consiste en administrar 100 μg de halofuginona por kg peso vivo, una vez al día durante 7 días consecutivos, siempre tras la ingesta de calostro, leche o lactorreemplazante. Este fármaco puede emplearse de forma metafiláctica en explotaciones con antecedentes de criptosporidiosis, iniciándose la pauta en las primeras 24-48 horas de vida del ternero; o de forma terapéutica, comenzando su administración en las 24 horas posteriores a la aparición de la diarrea (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2020a). El REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 83 tratamiento con halofuginona no previene o cura la enfermedad por completo, pero se ha descrito que puede retrasar la aparición de la diarrea y reducir la intensidad de la excreción de ooquistes, disminuyendo por tanto la contaminación ambiental con el parásito y el riesgo de que otros animales se infecten (Lefay et al., 2001; Jarvie et al., 2005; Trotz-Williams et al., 2011). Algunos antibióticos han demostrado su eficacia frente a la criptosporidiosis. Uno de ellos es la paromomicina, un aminoglucósido con efecto criptosporidiostático que ha demostrado su utilidad como tratamiento preventivo (Fayer y Ellis, 1993; Grinberg et al., 2002). Se administra por vía oral a una dosis de 35.000 UI de paromomicina por kg de peso vivo durante 7 días consecutivos. No se recomienda su uso en animales menores de tres días de edad y, una vez que se deja de administrar, se vuelve a producir la diarrea y la eliminación del parásito, por lo que se recomienda su empleo a partir de los 5 días de edad para cubrir el período de mayor incidencia de la criptosporidiosis (Grinberg et al., 2002; Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2022). Finalmente, se han hecho numerosos estudios para verificar la eficacia de otros fármacos frente a la criptosporidiosis. Entre ellos, el decoquinato ha resultado poco eficaz frente a esta parasitosis, ya que administrado por vía oral entre los 7 y 14 días de edad o a partir del nacimiento no tiene ningún efecto sobre la excreción de ooquistes, la consistencia fecal y el grado de deshidratación de los animales afectados (Lallemond et al., 2006). En contraste, el lasalocid, un ionóforo que se administra por vía oral, puede funcionar como un tratamiento efectivo frente a la criptosporidiosis, si bien se ha de tener cuidado con su dosificación, ya que dosis de tan sólo 5 mg por kg de peso vivo pueden tener efectos letales en terneros, motivo por el cual no se debe usar en animales tan jóvenes (Agencia Europea del Medicamento, 2005; Murakoshi et al., 2014). b) Giardia duodenalis El tratamiento específico frente a G. duodenalis se basa en el uso de bencimidazoles, destacando el fenbendazol y el albendazol. Se administran por vía oral a una dosis de 50 mg por kg de peso vivo durante tres días consecutivos y reducen significativamente la excreción de quistes en las heces (Xiao et al., 1996; O’Handley et al., 1997, 2000; Geurden et al., 2006c). Además, en algunos estudios se ha observado que el empleo de estos fármacos CYNTHIA LÓPEZ NOVO 84 resulta en un incremento de la ganancia diaria de peso (Geurden et al., 2010). Sin embargo, a pesar de su elevada eficacia, se elimina rápidamente por lo que, una vez se retira el tratamiento, es habitual que se produzcan reinfecciones si los terneros no se separan de las fuentes ambientales de infección (Xiao et al., 1996). Al igual que en el caso de Cryptosporidium spp., también se han realizado estudios para comprobar la eficacia de otros fármacos frente a la giardiosis. En este sentido, la paromomicina, que se administra en el agua de bebida, ha demostrado una eficacia comparable al fenbendazol en condiciones experimentales (Geurden et al., 2006b); o el secnidazol, un nitroimidazol que ha dado buenos resultados frente al parásito en estudios preliminares y tiene la ventaja de que se administra en una sola dosis, pero no está autorizado en España (Volpato et al., 2018). c) Eimeria spp. De cara a establecer un tratamiento frente a Eimeria spp., debemos tener en cuenta que los fármacos específicos frente a los coccidios se pueden clasificar en función de su mecanismo de acción frente al parásito. Por un lado, los coccidiostáticos detienen o ralentizan el desarrollo del parásito en determinadas etapas de su ciclo biológico, mientras que los coccidicidas dañan irreversiblemente al protozoo en una o varias fases de su ciclo (Bangoura y Bardsley, 2020). Algunos compuestos funcionan como coccidiostáticos o coccidicidas en función de la dosis administrada o la duración del tratamiento (Bangoura y Daugschies, 2020). Las sulfonamidas fueron los primeros anticoccidianos que se emplearon en el tratamiento de la coccidiosis bovina. Se administran en el agua de bebida durante unos 5-7 días y son coccidiostáticos a dosis bajas y coccidicidas a dosis altas (Taylor et al., 2016). Sin embargo, su empleo durante varios días sólo resulta en una cierta reducción de la excreción de ooquistes y de los signos clínicos (Svensson y Olofsson, 1996; Svensson, 1998). Además, existen estudios que señalan que poseen una efectividad limitada y únicamente sobre las fases asexuales del parásito, o incluso que no son eficaces y su efecto se debe principalmente a la acción frente a otras bacterias entéricas que actúan de forma concomitante en animales con coccidiosis (Daugschies y Najdrowski, 2005; Keeton y Navarre, 2018). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 85 El decoquinato es un fármaco coccidiostático que actúa únicamente sobre los esporozoítos y los merontes de primera generación, evitando el desarrollo y liberación de merozoítos y, por tanto, el posterior daño intestinal (Taylor y Bartram, 2012). Por este motivo, en terneros con riesgo de coccidiosis, debe administrarse de forma continuada en pienso a una dosis de 0,5-1 mg/Kg peso vivo durante al menos 28 días (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2021a). De entre todos los tratamientos disponibles, los más utilizados en la actualidad son los derivados triazinónicos, destacando el toltrazurilo y el diclazurilo. Ambos compuestos se administran por vía oral en dosis única de 15 mg por kg de peso vivo el primero, y de 1 mg por kg de peso vivo el segundo (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2020b, 2021b). Son coccididas y efectivos frente a varias fases del ciclo biológico de Eimeria spp., reduciendo la magnitud de los signos clínicos y la intensidad y duración de la eliminación de ooquistes, dando lugar a una mejora en la ganancia diaria de peso (Hackstein et al., 1995; Epe et al., 2005; Mundt et al., 2007; Le Sueur et al., 2009; Philippe et al., 2014). Cabe destacar que, mientras el toltrazurilo es eficaz frente a todas las fases del parásito y permite reducir la excreción de ooquistes por parte de los animales infectados en los primeros días tras el tratamiento, el diclazurilo es menos efectivo durante esta primera fase, pero previene la eliminación durante un período de tiempo más prolongado (Bohrmann, 1991; Mundt et al., 2007; Philippe et al., 2014). Con estos fármacos es fundamental determinar el momento ideal para comenzar a administrarlos; en este sentido, para programar adecuadamente su punto de inicio, se recomienda hacer una monitorización previa de la evolución de la enfermedad en varios animales y así conocer cuándo aparecen los signos clínicos (Epe et al., 2005; Mundt et al., 2005; Ghanem et al., 2008; Enemark et al., 2015). Esto permitirá estimar el momento más adecuado para administrar el fármaco de forma metafiláctica, que tiene como ventaja que permite que el animal entre en contacto con el protozoo, sin que éste pueda causarle lesiones graves, y se desarrolle una respuesta inmunitaria, de forma que el animal queda protegido frente a la reinfección (Bangoura y Bardsley, 2020). Esto es especialmente importante cuando se emplea el toltrazurilo, que al destruir todas las fases del protozoo inmediatamente tras su administración, puede impedir el desarrollo de una inmunidad específica frente a la especie de Eimeria spp. que ha causado el brote en la explotación. Como consecuencia de ello, se podría producir una coccidiosis subclínica tras el tratamiento con un importante impacto en la ganancia media diaria de los CYNTHIA LÓPEZ NOVO 86 animales afectados (Philippe et al., 2014). Por otra parte, el tratamiento de los animales que ya han desarrollado sintomatología clínica, en muchas ocasiones, no tiene mucho sentido por el carácter autolimitante de la enfermedad; aunque produce una cierta reducción de los signos clínicos, no suele traducirse en la desaparición inmediata de la diarrea, porque el daño intestinal ya es muy grave (Epe et al., 2005; Bangoura y Daugschies, 2018). Finalmente, es importante tener en cuenta que los coccidios pueden terminar desarrollando resistencias frente a los anticoccidianos más utilizados. En avicultura, ya se han descrito numerosas cepas de Eimeria spp. resistentes a anticoccidianos como consecuencia de su empleo rutinario durante largos períodos de tiempo (Blake y Tomley, 2014), mientras que, en rumiantes, ya se ha descrito la presencia de cepas de Eimeria spp. resistentes al toltrazurilo en ovejas (Odden et al., 2018). Por lo tanto, para evitar que este tipo de problemas se agraven, el uso de los tratamientos específicos frente a cualquier agente parasitario o bacteriano debe apoyarse en un diagnóstico previo y ha de combinarse con pautas de manejo preventivas. 1.4.6.2. Otras medidas de prevención La prevención de la diarrea neonatal se basa principalmente en minimizar la exposición al patógeno, mejorando las medidas de bioseguridad de la granja, y aumentar la inmunidad del neonato, donde cobra gran importancia asegurar un correcto encalostrado. 1.4.6.2.1. Minimizar la exposición al patógeno Dado que los agentes implicados en la aparición de NCD se transmiten por vía fecaloral, la reducción de la contaminación ambiental es un elemento fundamental tanto en el control como en la prevención del proceso donde, además de las rutinas de limpieza y desinfección, juegan un papel muy relevante las características de las instalaciones en las que se alojan los terneros. Reducir la presión de infección en la zona donde se encuentran los terneros neonatos es esencial. En general, las casetas individuales que se limpian y desinfectan adecuadamente y se cambian de lugar entre terneros son el mejor sistema para limitar la acumulación y la REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 93 1.5. DIARREA NEONATAL POR CAUSAS NUTRICIONALES Además de los agentes causales más habituales, de cara a determinar las causas que provocan la diarrea neonatal del ternero, también se han de contemplar otros elementos de variada naturaleza, de entre los que destacan las deficiencias en los alimentos administrados a los terneros o en su manejo. a) Ruminal drinking El ruminal drinking o acidosis ruminal del ternero lactante provoca cuadros de indigestión derivados del reflujo de la leche del abomaso al rumen, donde se acumula y fermenta. Su aparición puede explicarse por la administración de cantidades excesivas de leche por toma, o por la disfunción de la gotera esofágica, que se produce fundamentalmente por un incorrecto manejo de la leche o del lactoreemplazante, estrés o administración de agua ad libitum. Este proceso, que va acompañado de acidosis metabólica, puede desencadenar abomasitis y enteritis, responsables de la diarrea (González y Astiz, 2005). b) Variaciones bruscas en la composición y/o concentración de la leche y administración de lactoreemplazantes de mala calidad Las variaciones bruscas en la composición y/o concentración de la leche, a las cuales el sistema digestivo del ternero no está adaptado, provocan un exceso de nutrientes no digeridos en el intestino que resulta en la aparición de una diarrea osmótica. Este mismo efecto se produce tras la ingestión de lactoreemplazantes de baja digestibilidad o con una composición relativa inadecuada de nutrientes. En este sentido, es importante tener en cuenta que los terneros no digieren adecuadamente las proteínas vegetales, salvo la soja (González y Astiz, 2005; Blanchard, 2012). No obstante, en algunos animales, la administración de esta última puede dar lugar a una reacción alérgica sistémica con aparición de diarrea osmótica (Kilshaw y Sissons, 1979). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 94 c) Pauta inadecuada de destete El desarrollo del rumen de los bóvidos durante la etapa lactante se basa en la administración de cantidades crecientes de alimentos sólidos a partir de los 7 días de vida (Vermunt, 1994). Si este proceso no se realiza de una forma adecuada, en el momento del destete el animal todavía no es capaz de digerir adecuadamente el pienso, lo que resulta en la aparición de una diarrea osmótica (González y Astiz, 2005). d) Empleo de antibióticos El uso prolongado de antibióticos como tratamiento o como componente de lactoreemplazantes medicamentosos puede causar una disrupción de la flora normal de los preestómagos y del intestino, dando lugar a una disbiosis que puede estar asociada a la diarrea (Elad et al., 1998; Blanchard, 2012). e) Deficiencia de cobre Esta patología, más frecuente en terneros de cebo que se alimentan de pastos ricos en molibdeno (Enjalbert et al., 2006), provoca un incremento de la mortalidad perinatal y signos clínicos como la pérdida del color del pelo alrededor de los ojos, retraso del crecimiento y diarrea (Suttle y Angus, 1976; Enjalbert et al., 2006). 2. OBJETIVOS OBJETIVOS 99 Teniendo en cuenta los antecedentes recogidos en la Revisión Bibliográfica, en esta Tesis Doctoral se plantearon los siguientes objetivos: 1º. Determinar la prevalencia de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal en terneros menores de un mes del noroeste de España. 2º. Analizar la posible influencia de la edad del animal y la consistencia de las heces en la prevalencia de infección de cada uno de los agentes patógenos. 3º. Identificar las asociaciones más comunes entre los enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero y analizar su relación con la edad del animal. 4º. Identificar los subtipos de C. parvum presentes en terneros diarreicos menores de un mes del noroeste de España, conocer su distribución por granjas e investigar su potencial zoonósico. 5º. Identificar los genotipos de G. duodenalis presentes en terneros menores de un mes con diarrea del noroeste de España, conocer su distribución por granjas y determinar su potencial zoonósico. 6º. Determinar, empleando un sistema automatizado de caracterización fenotípica, la susceptibilidad a cinco familias antibióticas (beta-lactámicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y trimetoprim-sulfonamidas) de las cepas de ETEC aisladas de las heces de terneros diarreicos del noroeste de España. 7º. Determinar la frecuencia de las resistencias frente a los beta-lactámicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y trimetoprim-sulfonamidas en estas cepas, así como la presencia de cepas multirresistentes. 3. ESTUDIO I: PREVALENCIA E INTERACCIONES DE LOS PRINCIPALES ENTEROPATÓGENOS IMPLICADOS EN LA DIARREA NEONATAL DEL TERNERO ESTUDIO I: Prevalencia e interacciones de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero. 109 Los resultados obtenidos se validaron e interpretaron según las instrucciones del fabricante, de forma que se consideraron positivas aquellas muestras con un ciclo umbral (Ct) inferior o igual a 38. Así, la presencia de diferentes factores de virulencia permitió identificar los patotipos de E. coli presentes en cada muestra. Además, en aquellas muestras que presentaban unos Ct suficientemente bajos (por debajo de 25) para los factores de virulencia constitutivos de un patotipo concreto, se procedió a intentar aislarlo. Para ello, de la placa de agar MacConkey en la que se había sembrado la muestra de heces, se seleccionaron tres colonias que se sembraron en sus respectivas placas de agar sangre. De esta forma, se obtuvo un cultivo puro de cada una que fue sometido a extracción de ADN y posterior qPCR mediante el protocolo ya indicado. A continuación, los aislados individuales que se lograron identificar como pertenecientes a un patotipo concreto se congelaron a -80ºC en crioviales de 2 ml con crioperlas de vidrio tratadas con crioprotectores, que actúan como conservante (Crioinstant, Deltalab, Barcelona, España). En las muestras donde se detectaron colonias compatibles con Salmonella spp. tras cultivo en agar XLD, dichas colonias se resembraron en agar sangre (VWR Chemicals, Llinars del Vallès, España) y se confirmaron empleando una prueba comercial de suero aglutinante (Salmonella Antisera, PRO-LAB Diagnostics, Bromborough, Reino Unido), que se basa en la detección de los antígenos somático y Vi. Para ello, en un portaobjetos se homogeneizó una pequeña parte de la colonia con dos gotas de solución salina estéril, de forma que se obtuvieron dos suspensiones homogéneas. A continuación, se añadió una gota del antisuero a una de las gotas de la suspensión, mientras que a la otra, que se empleó como control, se le adicionó una gota de solución salina estéril. Se mezcló el antisuero con la suspensión bacteriana empleando un asa de siembra estéril y se inclinó suavemente el portaobjetos a un lado y a otro durante un minuto. Finalmente, empleando el microscopio, se observó si se había producido aglutinación, que es indicativa de la presencia de Salmonella spp. 3.2.2.2. Análisis virológico En este estudio, la detección de agentes víricos realizada incluyó dos especies implicadas comúnmente en la NCD (rotavirus A y coronavirus) y tres consideradas emergentes (torovirus, norovirus y nebovirus). Para ello se emplearon técnicas moleculares, CYNTHIA LÓPEZ NOVO 110 efectuando en primer lugar una extracción de ARN directamente sobre las muestras fecales mediante un kit comercial (RNeasy PowerMicrobiome Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez efectuada la extracción del ARN vírico, se procedió a su detección mediante una qPCR con transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando los kits comerciales EXOone Rotavirus A oneMIX, EXOone Bovine Coronavirus oneMIX, EXOone Bovine Torovirus oneMIX, EXOone Norovirus Genotype 3 oneMIX y EXOone Nebovirus oneMIX (Exopol, Zaragoza, España). Se empleó el mismo protocolo de qPCR usado para los factores de virulencia de E. coli, si bien difiere el protocolo térmico debido a que en el primer paso del mismo se realiza el proceso de transcripción inversa (Tabla 14). Los resultados obtenidos se validaron e interpretaron según las instrucciones del fabricante, de forma que se consideraron positivas aquellas muestras con un Ct inferior o igual a 38. Tabla 14. Protocolo para la replicación del ARN vírico en la qPCR. Ciclos Tiempo Temperatura 1 ciclo 15 minutos 45ºC 1 ciclo 5 minutos 95ºC 42 ciclos 15 segundos 95ºC 60 segundos 60ºC 3.2.2.3. Análisis parasitológico Cryptosporidium spp. y Giardia duodenalis Para detectar ooquistes de Cryptosporidium spp. y quistes de Giardia duodenalis, se empleó una técnica de inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales (IFAT) comercial (Aqua Glo G/C, Waterborne Inc., Nueva Orleans, EE. UU). Para incrementar la sensibilidad, primeramente se realizó una concentración difásica de las formas parasitarias empleando un protocolo con agua destilada y acetato de etilo (Díaz et al., 2018a): 1. Mezclar 2 g de heces con 20 ml de agua destilada y filtrar la suspensión obtenida utilizando una malla de 40-60 m de diámetro de poro. ESTUDIO I: Prevalencia e interacciones de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero. 111 2. Verter el filtrado obtenido en un tubo con tapón de rosca de 15 ml y centrifugar cinco minutos a 2.000 x g (Allegra 21R, Beckman Coulter, Fullerton, California, EE.UU.). 3. Desechar el sobrenadante obtenido y añadir 8 ml de agua destilada y 2 ml de acetato de etilo (Ethyl Acetate 99.8% GLR, Labkem, Vilassar de Dalt, Barcelona, España). 4. Agitar para mezclar y centrifugar a 2.000 x g (Allegra 21R, Beckman Coulter, Fullerton, California, EE.UU.) durante 5 minutos. 5. Desechar el sobrenadante y mezclar el sedimento de cada tubo con 1 ml de agua destilada y traspasar a un microtubo de 2 ml. 6. Centrifugar la suspensión obtenida a 6.700 x g durante cuatro minutos en una centrífuga Eppendorf Minispin (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y desechar el sobrenadante hasta que solo queden 0,25 ml en cada tubo. Para realizar la IFAT se vertieron, tras homogeneizar en vórtex, 10 l de cada concentración de oo/quistes en un portaobjetos y se dejaron secar al aire. A continuación, se fijaron con metanol durante 5 minutos; para asegurar un contacto óptimo con el anticuerpo, se rodeó cada muestra con un rotulador de silicona (Super Pap Pen Mini, Daido Sangyo, Tokio, Japón) y se añadieron unos 45 l de inmunoconjugado 1x. Después, los portaobjetos se incubaron en una cámara húmeda a 37 ºC durante 30 min. Al final de este período, las muestras se lavaron cuidadosamente y se dejaron secar al aire; finalmente, se añadió una gota de medio de montaje (No-Fade™ Mounting Medium, Waterborne Inc., Nueva Orleans, EE.UU.) a cada preparación y se observaron con un microscopio de fluorescencia (Olympus CX-43-RFAB, Olympus, Tokio, Japón), a 200 aumentos. Se realizó una estimación semicuantitativa de la intensidad de eliminación en función del número medio de oo/quistes observado por campo de acuerdo con la siguiente escala: 1 (pocos; <1 oo/quistes), 2 (moderada; 2-5 oo/quistes) y 3 (muchos; > 5 oo/quistes) (Avendaño et al., 2019). Análisis genotípico de Cryptosporidium spp. Las muestras que resultaron positivas a Cryptosporidium spp. mediante IFAT se seleccionaron para proceder a su análisis genotípico y determinar las especies de Cryptosporidium presentes. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 112 En primer lugar, se procedió a la extracción del ADN parasitario presente en la muestra. Para ello se emplearon 200 µl del sedimento obtenido mediante la técnica de sedimentación difásica con agua destilada y acetato de etilo previamente descrita. Como la pared del ooquiste de Cryptosporidium es especialmente resistente, la eficiencia del procedimiento de extracción se incrementó rompiendo mecánicamente los ooquistes empleando varios ciclos de congelación-descongelación (Díaz et al., 2010). Para ello, la concentración de ooquistes se sometió a un proceso de tres ciclos de congelación en nitrógeno líquido (-196C durante un minuto) y descongelación (100C durante siete minutos). A continuación, se procedió a la extracción del ADN de Cryptosporidium spp. empleando el kit comercial QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGen, Valencia, California, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo indicado por el fabricante. Una vez efectuada la extracción se realizó el análisis genotípico. Para ello se llevó a cabo una PCR anidada que amplifica un fragmento del gen que codifica para la subunidad ribosomal 18s (SSU ARNr), empleando los cebadores (Tabla 15) y el protocolo previamente descritos por Xiao et al. (2001) y Jiang et al. (2005), seguida del análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) empleando tres endonucleasas (Feng et al., 2007). Tabla 15. Cebadores usados en la amplificación del gen que codifica para la subunidad ribosómica 18s de Cryptosporidium spp. (Xiao et al., 2001; Jiang et al., 2005). Primer Secuencia (5' – 3') 18S1F TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG 18S1R CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA 18S2F GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG 18S2R CTC ATA AGG TGC TGA AGG AGT A El protocolo de PCR consistió en dos etapas independientes entre sí, incluyéndose controles positivos (Cryptosporidium tyzzeri) y negativos (agua destilada) en cada una de ellas. La primera PCR permite amplificar un fragmento de 1.325 pares de bases (pb), para lo que se añadieron 5 µl de ADN purificado de cada muestra a 45 µl de una mezcla compuesta de 0,2 µM de los cebadores 18S1F y 18S1R, 200 µM de cada desoxirribonucleótido (dNTP) (dNTPs MIX, NZYTech, Lisboa, Portugal), 2,5 unidades de ESTUDIO I: Prevalencia e interacciones de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero. 113 Taq polimerasa (NZYTaq DNA polymerase, NZYTech, Lisboa, Portugal), 6 mM de MgCl2.y tampón de la Taq polimerasa 1x. Los 50 µl de volumen final de reacción de cada muestra se introdujeron en un termociclador (T100 thermal cycler, Bio-Rad, Hércules, California, EE.UU.) para realizar la amplificación según el protocolo indicado en la Tabla 16. Tabla 16. Protocolo de amplificación del gen que codifica para la subunidad ribosómica 18s de Cryptosporidium spp. Número de ciclos Fase Temperatura Tiempo 1 ciclo Desnaturalización inicial 94ºC 3 minutos 35 ciclos Desnaturalización 94ºC 45 segundos Hibridación 55ºC 45 segundos Extensión 72ºC 60 segundos 1 ciclo Extensión final 72ºC 7 minutos La segunda etapa del protocolo tiene como propósito la amplificación de un fragmento interno de aproximadamente 840 pb. Para ello, se añadieron 5 µl del producto de la primera PCR de cada muestra a 45 µl de una mezcla de idéntica composición a la anterior salvo en el caso de los cebadores, que se sustituyeron por los 18S2F y 18S2R (Tabla 15) y del MgCl2, ya que en este caso se empleó una concentración de 3 mM. La amplificación se realizó empleando el mismo termociclador y protocolo usado en la primera PCR. A continuación, los productos de PCR obtenidos se cargaron en un gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón TAE 1x (Applichem GmbH, Darmstadt, Alemania) al que se añadió un sustituto de bromuro de etidio 1x (RedSafe, INTRON biotecnology, Gyeonggi, Corea del Sur). Posteriormente se realizó una electroforesis en tampón TAE 1x, usando una fuente de alimentación Power Pac Basic (BioRad, Hércules, California, EE.UU.) que se programó a 100V durante 40 minutos. Finalmente, se observaron los resultados en un analizador de imagen GelDoc Go Imaging System (Bio-Rad, Hércules, California, EE.UU.). Aquellas muestras donde se observaron amplicones del tamaño esperado se seleccionaron para la realización de la RFLP, que permite identificar la especie de Cryptosporidium al comparar los tamaños de los fragmentos obtenidos con los señalados previamente en varios estudios. Primeramente, se efectuó una digestión de los productos CYNTHIA LÓPEZ NOVO 114 obtenidos en la segunda reacción de PCR empleando las endonucleasas SspI, VspI y MboII (New England Biolabs, Massachusetts, EE.UU.). La digestión se realizó durante dos horas a 37ºC en un volumen total de 20 µl, aunque el protocolo varió en función de la cantidad de ADN obtenido en la PCR anidada (Tabla 17). Tabla 17. Protocolo empleado para la digestión de los productos obtenidos en la segunda PCR que amplifica un fragmento del gen que codifica para la subunidad ribosómica 18s de Cryptosporidium spp. Bandas intensas Bandas moderadas Bandas tenues Endonucleasas 10 U 10 U 10 U Buffer 1x 1x 1x Producto PCR 2 µl 10 µl 17 µl Los fragmentos de restricción obtenidos se cargaron en un gel de agarosa al 2% en tampón TAE 1x con un sustituto de bromuro de etidio (RedSafe, INTRON biotecnology, Gyeonggi, Corea del Sur) y, tras sumergirlos en tampón TAE 1x, se sometieron a una electroforesis a 110V durante 70 minutos. El patrón de bandas se visualizó con el GelDoc Go Imaging System (Bio-Rad, Hércules, California, EE.UU.) y, para determinar las especies y/o genotipos de Cryptosporidium presentes, se compararon los patrones de restricción obtenidos con los señalados en estudios previos (Tabla 18) (Feng et al., 2007; Xiao y Ryan, 2008). Tabla 18. Patrones de restricción (en pares de bases) para las especies de Cryptosporidium más frecuentes en ganado bovino en función de la endonucleasa utilizada. SspI VspI MboII C. parvum 450, 267, 108, 12, 11 629, 115, 104 771, 76 C. bovis 432, 267, 103, 34 617, 115, 104 412, 185, 162, 76 C. ryanae 432, 267, 103, 34 616, 115, 104 574, 185, 76 C. andersoni 448, 397 730, 115 769, 76 Finalmente, para confirmar los resultados de la RFLP, se realizó la secuenciación de un número representativo de aislados cuyo patrón de restricción no coincidió con el de C. parvum. La purificación de las muestras y la determinación de la secuencia nucleotídica se ESTUDIO I: Prevalencia e interacciones de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero. 115 realizó en la Unidad de Secuenciación y Análisis de fragmentos de la Universidad de Santiago de Compostela. Los productos de amplificación se secuenciaron en ambos sentidos utilizando el BigDye Terminator v3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) y se leyeron en un secuenciador automático ABI-prism 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). Las secuencias obtenidas se examinaron y solaparon con el programa Chromas Pro v.1.7.5. (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, Queensland, Australia) y posteriormente se alinearon con BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.2.3. (Ibis Biosciences, Carlsbad, California, EE.UU.). Finalmente, la identificación de las especies presentes se realizó mediante la comparación de las secuencias de ADN obtenidas con aquellas de especies/genotipos de Cryptosporidium depositadas en la base de datos GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI), usando la aplicación BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Eimeria spp. La presencia de ooquistes de Eimeria spp. se evidenció con la técnica de flotación modificada de McMaster que permite, además, realizar un análisis cuantitativo de la intensidad de excreción de ooquistes. Primeramente, se mezclaron 3 gramos de heces de cada muestra con 42 ml de agua y la suspensión obtenida se filtró utilizando una malla de 150 µm de diámetro de poro. El líquido filtrado se recogió en tubos de 12 ml que se centrifugaron a 380 x g durante 10 minutos en una centrífuga Selecta Centromix (J.P. Selecta, Abrera, España). Posteriormente, se desechó el sobrenadante y el sedimento resultante se resuspendió en solución salina saturada (densidad= 1,19) con el que se llenaron las dos celdillas de la cámara de McMaster. Finalmente, se procedió al recuento mediante visualización al microscopio óptico (CH-2, Olympus, Tokio, Japón) a 100 aumentos, empleando la siguiente fórmula para estimar los ooquistes por gramo de heces (opg). 𝑂𝑜𝑞𝑢𝑖𝑠𝑡𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑐𝑒𝑠 (𝑜𝑝𝑔)= ( (𝑛º 𝑜𝑜𝑞𝑢𝑖𝑠𝑡𝑒𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠)𝑥 45 𝑚𝑙 0,30 𝑚𝑙 )/ 3g Todas aquellas muestras que resultaron positivas mediante flotación se seleccionaron para su posterior identificación específica mediante el estudio morfométrico de los ooquistes esporulados, que se llevó a cabo siguiendo la técnica descrita por Hendrix y Robinson CYNTHIA LÓPEZ NOVO 116 (2022); así, las heces se depositaron en una placa de Petri y posteriormente se añadió una solución de dicromato potásico al 2,5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.). La mezcla se incubó a 20 ºC durante al menos 5 días, ya que en este período todas las especies de Eimeria que afectan al ganado vacuno suelen haber completado su esporulación (Taylor et al., 2016); la mezcla se homogeneizó diariamente con una pipeta pasteur, con el objetivo de oxigenarla y permitir así la esporulación de los ooquistes. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, la muestra se introdujo en tubos de 12 ml y se centrifugó a 380 x g (Selecta Centromix, J.P. Selecta, Abrera, España) durante 5 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el sedimento se homogeneizó con solución de sacarosa de Sheather (densidad = 1,27); el tubo se rellenó con la solución de flotación hasta formar un menisco en la parte superior, donde se colocó un cubreobjetos de 18 x 18 mm; posteriormente, se centrifugó de nuevo a 380 x g durante 5 minutos. Por último, el cubreobjetos se depositó sobre un portaobjetos y los ooquistes se observaron al microscopio (CH-2, Olympus, Tokio, Japón) a 400 aumentos. Para identificar las especies de Eimeria se tuvieron en cuenta una serie de características de los ooquistes, como su tamaño, color o presencia de diferentes estructuras siguiendo las descripciones de Taylor et al. (2016) y Joachim et al. (2018), que se recogen en la Tabla 19. Para realizar el análisis morfométrico de los ooquistes se empleó un ocular micrométrico (Olympus 19-10/100, Olympus, Tokio, Japón), que permite medir su longitud y su anchura. En este trabajo se identificaron un máximo de 100 ooquistes por muestra. ESTUDIO I: Prevalencia e interacciones de los principales enteropatógenos implicados en la diarrea neonatal del ternero. 117 Tabla 19. Características morfométricas de los ooquistes que resultan útiles para identificar la especie de Eimeria. Adaptado de Taylor et al. (2016) y Joachim et al. (2018). Especie Forma Tamaño medio (µm) Micrópilo Gránulo polar y/o residuos del ooquiste Pared externa Cuerpo residual del ooquiste Cuerpo residual del esporocisto Cuerpos de Stieda E. alabamensis Ovoide 13-24 x 11-16 No No Bicapa No Sí Sí E. auburnensis Elongado u ovoide 32-46 x 20-25 Si Si (residuos no) Bicapa, granulada No Sí Sí E. bovis Ovoide o subesférica 23-34 x 17-23 Si No Bicapa, anaranjada No Sí Sí E. brasiliensis Elipsoidal 33-43 x 24-30 Si Si (residuos no) Bicapa, amarronada, a veces con placas No Sí Sí E. bukidnonensis Ovoide o con forma de pera 47-50 x 33-38 Si Si (residuos no) Bicapa, con listas radiales No No No E.canadensis Ovoide o elipsoidal 28-37 x 20-27 Variable Si No Sí No descrito E. cylindrica Cilíndrico o elongada 16-37 x 12-15 No No Una capa, incolora No Sí No E. ellipsoidalis Elipsoidal u ovoide 20-26 x 13-17 Sí No Fina, oscura No Sí Sí E. pellita Forma de huevo 36-41 x 26-30 Si Si (residuos no) Gruesa, marrón, con protuberancias No Sí Sí E.subspherica Redondeada o subesférica 9-14 x 8-13 No No Una capa, incolora No No Sí E. wyomingensis Ovoide 37-45 x 26-31 Si No Una capa, amarronada No No Sí E. zuernii Subesférica 15-22 x 13-18 No No Una capa No Sí Sí, muy pequeños E. illinoisensis Elipsoidal u ovoide 24-29 x 19-22 No No Una capa, incolora No descrito No descrito No descrito CYNTHIA LÓPEZ NOVO 118 3.2.3. Análisis de datos Los datos obtenidos en este estudio se procesaron con ayuda de la hoja de cálculo Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, EE.UU.) y su análisis estadístico se realizó mediante los paquetes estadísticos SPSS Statistics v.25 (International Business Machines Corp., Armonk, Nueva York, EE.UU.) y R 4.1.2 (R Core Team, 2021). En primer lugar, se calculó el porcentaje de muestras positivas para cada patógeno y su distribución según la edad del animal de procedencia (en semanas) y la consistencia de las heces. A continuación, para determinar la posible influencia de estos dos parámetros sobre la probabilidad de detectar cada uno de los enteropatógenos incluidos en el estudio se realizaron regresiones logísticas de efectos mixtos, incluyendo la granja como intercepción aleatoria, empleando el paquete lme4 de R (Bates et al., 2015). En esta regresión, para el caso de E. coli, se consideró cada patotipo como un patógeno independiente y se incluyeron las variables cuantitativas indicadas a continuación: • Variable dependiente: resultado para cada muestra del enteropatógeno acerca del que se pretende averiguar si su aparición está relacionada con los predictores: positivo o negativo. • Predictores: o Edad del animal: menos de 7 días, entre 7 y 14 días, entre 14 y 21 días y más de 21 días. o Consistencia de las heces: pastosa, pastosa-acuosa y acuosa. o Resultado para cada muestra de los demás agentes incluidos en el estudio: positivo o negativo. El resultado de la regresión se consideró significativo cuando p<0,05 y, en esos casos, se calculó el Odds Ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95%. Se comprobó la existencia de una posible colinealidad entre las variables mediante la función “vif” del paquete car de R (Fox y Weisberg, 2019). Por otra parte, para poder realizar el análisis integrado de los enteropatógenos estudiados, en primer lugar, se clasificaron las muestras en aquellas que eran positivas a un ESTUDIO III: Evaluación de la susceptibilidad antibiótica de Escherichia coli enterotoxigénicas aisladas de terneros diarreicos del noroeste de España. 221 Por otra parte, los resultados obtenidos también se analizaron en función de la familia antibiótica a la que pertenece cada uno de los compuestos testados. Los antibióticos betalactámicos (Figura 25) son de uso muy habitual en veterinaria (Agencia Europea del Medicamento, 2022) y, de hecho, algunos de los miembros de esta familia se encuentran entre los antibióticos considerados de elección para el tratamiento de la NCD (Constable, 2009; Peek et al., 2018), lo que podría explicar que un 76-100% de las cepas de ETEC incluidas en este estudio fuesen resistentes a los compuestos de esta familia. Resultados previos refuerzan esta hipótesis, pues se ha observado una mayor presencia de cepas de E. coli resistentes a ampicilina en terneros diarreicos que en individuos sanos, lo que probablemente se debe a una administración más frecuente de este antibiótico en aquellas granjas con problemas de NCD (Blanco et al., 1993a; Gunn et al., 2003). De igual modo, el uso rutinario de cefalosporinas de primera y segunda generación en el tratamiento de la NCD también podría ser la causa de que todas las cepas de ETEC incluidas en el estudio fuesen resistentes a estos antibióticos. En ningún otro trabajo se ha encontrado un porcentaje tan elevado de cepas resistentes a estos compuestos, pero sí se han obtenido altas tasas de resistencia en investigaciones realizadas en Alemania (80,5%; Feuerstein et al., 2022), Irán (65,9%; Shahrani et al., 2014), Turquía (91,6%; Güler et al., 2008) o China (52-67%; Jia et al., 2022). Por el contrario, las cefalosporinas de tercera y cuarta generación demostraron tener una eficacia muy elevada frente a ETEC procedentes de terneros con NCD, pues el porcentaje de susceptibilidad osciló entre el 93 y el 95%, lo que está en línea con los resultados obtenidos por Güler et al. (2008) (100%) y Feuerstein et al. (2022) (76,8%). Teniendo en cuenta que los compuestos de estos dos últimos grupos se emplean con relativa frecuencia en el tratamiento de la NCD (De Briyne et al., 2014), lo más probable es que las diferencias en la susceptibilidad a las cefalosporinas de tercera-cuarta y de primera-segunda generación estén relacionadas con diversos mecanismos de resistencia que puedan haber desarrollado los aislados incluidos en este estudio. En este sentido, es probable que las cepas analizadas contasen con mecanismos de hiperproducción de beta-lactamasas, como TEM-1, TEM-2 y SHV-1, de beta-lactamasas resistentes a los inhibidores (IRT) y/o de oxacilinasas, como OXA-1, que son capaces de conferir resistencia a las cefalosporinas de primerasegunda generación pero no a las de tercera-cuarta, por lo que se relacionan con el patrón fenotípico observado en este estudio (Navarro et al., 2010). CYNTHIA LÓPEZ NOVO 222 La diferencia en la frecuencia de uso también podría explicar la divergencia en la susceptibilidad a los compuestos testados de la familia de los aminoglucósidos (Figura 25). Así, la gentamicina fue uno de los antibióticos más eficaces, con un 93% de aislados sensibles, mientras que a la neomicina, de uso común en las granjas de ganado vacuno para el tratamiento de mamitis y, hasta hace unos años, para la prevención de la NCD (Sawant et al., 2005; Brunton et al., 2012), tan sólo fueron sensibles el 37% de las cepas. Estos resultados coinciden con estudios previos en los que se obtuvieron porcentajes de sensibilidad del 75-89,7% para la gentamicina y del 39,1%-51% para la neomicina (Orden et al., 2000; Güler et al., 2008; Lim et al., 2010; Cengi z y Adigüzel, 2020; Feuerstein et al., 2022). Sin embargo, otros trabajos han señalado porcentajes de cepas resistentes a la gentamicina (48-83,8%) muy superiores a los descritos en este trabajo (Donaldson et al., 2006; Shahrani et al., 2014; Jia et al., 2022). De forma similar a lo indicado para las cefalosporinas, la presencia de cepas resistentes a la neomicina y sensibles a la gentamicina también puede estar relacionada con el mecanismo de resistencia del que dispongan los ETEC. La resistencia a los aminoglucósidos se asocia a varios mecanismos, siendo el más común la inactivación enzimática, en la que pueden intervenir tres tipos de enzimas: acetiltransferasas (AACs), nucleotidiltransferasas (ANTs) y fosfotransferasas (APHs) (Ramirez y Tolmasky, 2010) y su presencia puede determinarse de forma fenotípica mediante la exposición a diversos aminoglucósidos (Navarro et al., 2010). Aunque en este estudio sólo se incluyeron dos compuestos de esta familia, es posible que los mecanismos de resistencia a los aminoglucósidos mayoritarios en estas cepas puedan ser APH(3’) o AAC(6’), que son los que se relacionan con la resistencia a la neomicina y la sensibilidad a la gentamicina (Livermore et al., 2001). De la misma forma que se ha comentado para las dos familias anteriormente descritas, el mayor porcentaje de cepas resistentes a las sulfonamidas (88%) que a las tetraciclinas (71%) (Figura 25) también podría ser la consecuencia de su distinta frecuencia de empleo. En este sentido, un estudio realizado en varios países europeos indicó que las tetraciclinas se usaron como tratamiento de elección sólo en el 15% de los terneros con diarrea neonatal, mientras que las sulfonamidas se administraron en el 70% de los casos (Eibl et al., 2021). Las elevadas tasas de resistencia frente a ambos compuestos están en la línea de lo señalado en trabajos previos aunque, en general, se señalan mayores prevalencias de cepas resistentes a las tetraciclinas (61,9–100%) que a las sulfonamidas (35,8–84,9%) ESTUDIO III: Evaluación de la susceptibilidad antibiótica de Escherichia coli enterotoxigénicas aisladas de terneros diarreicos del noroeste de España. 223 (Hariharan et al., 2004; Güler et al., 2008; Lim et al., 2010; Shahrani et al., 2014; Cengi z y Adigüzel, 2020; Feuerstein et al., 2022). En este estudio sólo se incluyó un representante de cada una de estas dos familias pues las bacterias muestran un comportamiento similar frente al resto de compuestos que las forman; por este motivo, el uso de un antibiótico representante de grupo es suficiente para conocer la susceptibilidad de los aislados a todos los demás (Livermore et al., 2001). Sin embargo, a diferencia de en los casos anteriores, el estudio fenotípico no es suficiente para deducir los mecanismos particulares de resistencia presentes en estas cepas, por lo que, para conocerlos, sería necesaria su caracterización usando métodos moleculares. No obstante, en el caso de las tetraciclinas, el más común es la expulsión del compuesto de la célula, que puede producirse a través de hasta nueve tipos de bombas (Nguyen et al., 2014; Poirel et al., 2018), mientras que la resistencia a las sulfonamidas suele estar ligada a mutaciones en los genes que codifican para las enzimas diana o la sustitución de estas últimas por enzimas resistentes (Poirel et al., 2018; Van Duijkeren et al., 2018). La última familia testada en este estudio fue la de las fluoroquinolonas (Figura 25), detectándose elevadas tasas de resistencia frente a sus compuestos (66–95%), que son notablemente superiores a la obtenida por Feuerstein et al. (2022) (37,9%) en Alemania. Con respecto a los estudios realizados en otras partes del mundo, nuestros valores también resultan más elevados que los observados por Cengi z y Adigüzel (2020) (42,4%) en Turquía o por Lim et al. (2010) (22,7%) en Corea del Sur, pero son similares a los descritos en otro trabajo realizado en Turquía (91,6%) (Güler et al., 2008) y en Uruguay (80%) (Umpiérrez et al., 2017). La resistencia a las fluoroquinolonas suele tener su origen en mutaciones cromosómicas, fundamentalmente de los genes que codifican para la ADN girasa y la ADN topoisomerasa IV, y/o en la adquisición de plásmidos específicos (resistencia las quinolonas mediada por plásmidos o PMQR) (Poirel et al., 2018). Dado que estos mecanismos de resistencia son comunes a todas las fluoroquinolonas, la resistencia a un compuesto de primera generación de esta familia aumenta las posibilidades de que la cepa también lo sea a los de las siguientes generaciones (Rodríguez-Martínez et al., 2011; Pereira et al., 2014). Este hecho explicaría la tendencia creciente de la CMI en el caso del enrofloxacino y del marbofloxacino, ambos compuestos de tercera generación, en contraste con la flumequina, de primera generación y en la que este valor se situó en todos los casos en la concentración más elevada. Por lo tanto, es muy probable que estos resultados estén relacionados con el CYNTHIA LÓPEZ NOVO 224 hecho de que las fluoroquinolonas se encuentran entre los antibióticos más empleados para el tratamiento de la NCD (Eibl et al., 2021). En este sentido se ha demostrado que el tratamiento de terneros neonatos con diarrea con enrofloxacino aumenta el número de E. coli resistentes presentes en las heces y que la presión de selección provocada por este compuesto puede resultar en la selección de resistencias frente a otros miembros de la misma familia como el ciprofloxacino y el ácido nalidíxico (Pereira et al., 2014). Como consecuencia de todo esto, la elevada prevalencia de las resistencias a las fluoroquinolonas observada en este estudio resulta preocupante, sobre todo si tenemos en cuenta que la Agencia Europea del Medicamento (EMA) las ha clasificado como antibióticos de importancia crítica para la salud humana (Agencia Europea del Medicamento, 2020). Aunque numerosas investigaciones defienden que la aparición de resistencias a antibióticos en las cepas de ETEC causantes de NCD se debe principalmente a la utilización extendida e indiscriminada de antibióticos para el tratamiento de este proceso (Brunton et al., 2014; Duse et al., 2015; Gonggrijp et al., 2016; Tenhagen et al., 2020), otros estudios sugieren que también podría tener relación con la administración al ternero de leche procedente de vacas que han recibido antibioterapia frente a la mamitis (Aust et al., 2013; Maynou et al., 2017). A pesar de ello, un trabajo reciente realizado en varios países europeos demuestra que los ganaderos y veterinarios clínicos continúan empleando estos compuestos de forma recurrente para el control de la NCD, independientemente de su etiología y de los signos clínicos observados (Eibl et al., 2021). Además, los resultados de nuestro estudio indican que la mayoría de las cepas de ETEC son resistentes frente a las opciones de primera línea (Categoría D de la EMA) recomendadas para el tratamiento de la NCD, como las aminopenicilinas, las tetraciclinas o las sulfonamidas (Constable, 2009; Peek et al., 2018). Así, tan sólo la gentamicina y las cefalosporinas de tercera y cuarta generación podrían considerarse opciones eficaces. Sin embargo, estos compuestos están clasificados en las categorías C (gentamicina) y B (cefalosporinas de tercera y cuarta generación) de la EMA, por lo que son antibióticos de uso restringido, y más especialmente los de la Categoría B, que se consideran de importancia crítica para la medicina humana (Agencia Europea del Medicamento, 2020). Los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que el uso de la antibioterapia en el tratamiento de la NCD debe limitarse incluso cuando ésta se deba a infecciones por ETEC. En este sentido, solo deberían administrarse antibióticos cuando se observen signos clínicos indicativos de enfermedad sistémica. En estos casos resulta muy ESTUDIO III: Evaluación de la susceptibilidad antibiótica de Escherichia coli enterotoxigénicas aisladas de terneros diarreicos del noroeste de España. 225 útil la realización de un antibiograma que permita conocer la susceptibilidad de las cepas circulantes en la granja y, por tanto, seleccionar el antibiótico más adecuado a administrar. Asimismo, disponer de un historial de antibiogramas de la explotación permite monitorizar la evolución de las resistencias a lo largo del tiempo, lo que facilita la selección empírica del antibiótico a emplear ante infecciones bacterianas futuras. El presente estudio de esta Tesis Doctoral reproduce los contenidos de la siguiente publicación: Prieto, A., López-Novo, C., Díaz, P., Díaz-Cao, J.M., López-Lorenzo, G., Antón, C., Remesar, S., García-Dios, D., López, C., Panadero, R., Díez-Baños, P., Morrondo, P., Fernández, G., 2022. Antimicrobial Susceptibility of Enterotoxigenic Escherichia coli from Diarrhoeic Neonatal Calves in Spain. Animals 12, 264. Editorial: MDPI (ISSN: 2076-2615). doi: https://doi.org/ 10.3390/ani12030264 6. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 229 A partir de los resultados obtenidos en los diferentes estudios se extraen las siguientes conclusiones: 1º. La presencia de enteropatógenos juega un papel muy relevante en la aparición de la diarrea neonatal del ternero, pues en casi todas las muestras se detectó al menos un agente. 2º. Cryptosporidium parvum y el rotavirus bovino fueron los patógenos más frecuentes, mientras que Escherichia coli enterotoxigénica se halló en menor proporción. Cabe destacar la elevada prevalencia de otros agentes menos estudiados como los calicivirus bovinos emergentes, Giardia duodenalis y E. coli enteropatógena y enterohemorrágica, lo que plantea la necesidad de prestarles una mayor atención, pudiendo ser útil su inclusión en los paneles diagnósticos de rutina. 3º. Otros agentes, como el torovirus bovino y E. coli productora de toxinas Shiga fueron muy poco frecuentes. Destaca la baja presencia del coronavirus bovino, considerado uno de los principales enteropatógenos involucrados en la diarrea neonatal del ternero, y la ausencia de Salmonella spp., indicando que actualmente la importancia de ambos agentes en el proceso es escasa. Finalmente, la baja prevalencia de Eimeria spp. está probablemente relacionada con el rango de edad de los animales incluidos en el estudio. 4º. La edad del ternero y la consistencia de las heces influyeron en la prevalencia de algunos enteropatógenos. Así, la presencia de E. coli enterotoxigénica fue muy probable en terneros menores de siete días con una diarrea muy acuosa, mientras que se debe sospechar de Cryptosporidium spp. y norovirus bovino especialmente en animales de 8-21 días que eliminan heces líquidas. Además, la probabilidad de que los animales estén infectados con G. duodenalis y Eimeria spp. es más elevada si las heces son pastosas-acuosas, siendo más frecuente el primero en terneros de 3-4 semanas de vida y el segundo en los de cuatro semanas. Por último, se debería sospechar de E. coli enterohemorrágica en terneros de más de 15 días que eliminen heces pastosas. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 230 5º. La mayor parte de los brotes de diarrea neonatal son el resultado de infecciones mixtas, sobre todo a medida que aumenta la edad de los individuos infectados. Las asociaciones detectadas con mayor frecuencia fueron las constituidas por dos o tres enteropatógenos, pero se identificaron hasta siete agentes en una misma muestra. Teniendo en cuenta que la mayoría de los laboratorios sólo identifican cuatro enteropatógenos, nuestros resultados sugieren que el diagnóstico etiológico es, con frecuencia, incompleto, lo que se traduce en la aplicación de medidas de control no siempre eficaces. 6º. Los calicivirus fueron muy prevalentes en las infecciones mixtas, mostrando una asociación significativa con rotavirus y C. parvum. Este hallazgo sugiere que estos virus provocan fundamentalmente inmunosupresión que favorece la infección con otros enteropatógenos. 7º. La detección de infecciones mixtas integradas por E. coli enteropatógena y E. coli enterohemorrágica fue significativamente improbable a lo largo de todo el primer mes de vida, lo que podría estar relacionado con un efecto inhibitorio derivado de la producción de bacteriocinas por estos patotipos. 8º. Se constató una elevada diversidad genética dentro de C. parvum, pues se identificaron 11 subtipos pertenecientes a la familia alélica IIa. Los más frecuentes fueron el IIaA15G2R1 y el IIaA16G3R1, mientras que el hallazgo de IIaA13G2R1, IIaA14G1R1, IIaA14G2R1, IIaA16G1R1, IIaA17G3R1, IIaA17G4R1 y IIaA17R1 supone la primera cita de estos subtipos en ganado vacuno en España. Todos los subtipos identificados presentaron potencial zoonósico, lo que sugiere que los terneros con diarrea neonatal constituyen un importante reservorio de C. parvum para el ser humano. 9º. Todos los aislados de G. duodenalis pertenecieron al genotipo E. Como este genotipo se ha identificado ocasionalmente en humanos, no se puede excluir que los terneros infectados supongan un riesgo para la salud pública. Además, la ausencia del RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 237 ooquistes de coccidios permitió identificar diez especies, siendo E. ellipsoidalis, E. bovis y E. zuernii las más prevalentes; en todas las muestras positivas se detectó la presencia de más de una especie de Eimeria. Finalmente, Salmonella spp. no se aisló en ninguna muestra, confirmando su escasa importancia como agente causal de NCD. La edad de los animales influyó significativamente sobre la prevalencia de algunos agentes. Así, ETEC fue más prevalente en la primera semana de edad, mientras que Cryptosporidium spp. lo fue en la segunda semana. El porcentaje de animales positivos a BNeV, EHEC y G. duodenalis fue más elevado en los animales mayores de 15 días, y Eimeria spp. fue más frecuente en la cuarta semana. De forma similar, se observó una relación estadísticamente significativa entre la presencia de algunos agentes y la consistencia de la muestra fecal. Así, la detección de ETEC, BNoV y Cryptosporidium spp. fue significativamente más frecuente en las muestras de consistencia acuosa. Por el contrario, el porcentaje de muestras positivas a G. duodenalis fue significativamente superior en las muestras de consistencia pastosa-acuosa y EHEC se relacionó con la excreción de heces pastosas. Estos datos pueden ser muy útiles para el veterinario clínico que se enfrente a un brote de NCD en una explotación de ganado vacuno al facilitar el establecimiento de una primera sospecha etiológica. Obviamente, esta sospecha debe complementarse con otros datos clínicos y epidemiológicos que se obtengan tras el examen clínico reglado del animal y una adecuada anamnesis y, finalmente, confirmarla mediante análisis en el laboratorio. Uno de los aspectos más novedosos de este estudio son los resultados de las coinfecciones. Así, tras el análisis de las infecciones mixtas se constató la presencia de varios enteropatógenos en el 82,1% de las muestras. La mayoría de las co-infecciones estuvieron constituidas por dos (27%) o tres (33,6%) patógenos, aunque se identificaron hasta siete agentes en una misma muestra (1,2%). Teniendo en cuenta que el diagnóstico de rutina de la NCD sólo incluye cuatro enteropatógenos (ETEC, BRoV, BCoV y C. parvum), nuestros resultados demuestran que, frecuentemente, los resultados laboratoriales no permiten alcanzar un diagnóstico etiológico completo, lo que dificulta la aplicación de las medidas de control más adecuadas en cada caso. Las co-infecciones integradas únicamente por uno o varios virus y C. parvum fueron las más abundantes (20,9%), destacando la elevada prevalencia de los calicivirus bovinos, que sugiere que, en la mayoría de las ocasiones, el papel de estos virus emergentes en la NCD consistiría en provocar una inmunosupresión que CYNTHIA LÓPEZ NOVO 238 favoreciese la infección con otros enteropatógenos que actúan como agentes primarios. Así, BRoV, BNoV y C. parvum constituyeron la infección mixta predominante en este estudio, y junto con BNeV formaron la tercera combinación más frecuente, mientras que la segunda estaba integrada únicamente por BRoV y C. parvum. Nuestros datos también demostraron que la frecuencia de las infecciones mixtas se incrementa con la edad (desde el 73,2-86,2% en las dos primeras semanas hasta alcanzar el 94,3% y 95,7% en la tercera y cuarta semanas de vida, respectivamente), así como el número de patógenos que las integran. Además, algunos de los patógenos implicados en las infecciones mixtas interaccionaron significativamente entre sí, tanto de forma positiva como negativa, y dichas asociaciones variaron con la edad. Así, en la primera semana de vida, la mayoría de las interacciones positivas se detectaron entre BRoV y otros agentes víricos (BToV, BNoV y BCoV), si bien también se encontró una asociación positiva entre C. parvum y G. duodenalis, así como de cada uno de estos protozoos con BNeV y EPEC. También se identificaron interacciones negativas entre ETEC y C. parvum y entre EPEC, EHEC y STEC. A partir de la segunda semana, las asociaciones fueron más esporádicas. Entre los 8 y los 14 días de vida se repitieron las relaciones positivas entre BRoV y BNoV y entre G. duodenalis y BNeV; este último virus se asoció además con BToV y STEC. La interacción entre EPEC y EHEC resultó negativa y se mantuvo durante el resto del estudio. En la tercera semana, en contraste con lo observado en los primeros siete días, fue improbable detectar C. parvum en combinación con G. duodenalis y Eimeria spp., que además se asociaron positivamente entre sí. La interacción negativa entre C. parvum y G. duodenalis se mantuvo durante la cuarta semana, período en el que fue más probable la detección conjunta de BCoV y BNoV. Debido a que algunos de los agentes implicados en la NCD presentan potencial zoonósico, su presencia podría representar un peligro para la salud pública. De todos ellos destacan C. parvum y G. duodenalis, dada su elevada prevalencia tanto en terneros neonatos como en personas. Por ello, en el segundo estudio de esta Tesis Doctoral se identificaron los subtipos de C. parvum y genotipos de G. duodenalis presentes en terneros diarreicos menores de un mes del noroeste de España con el objeto de determinar su potencial zoonósico. Primeramente, se seleccionaron las muestras que resultaron positivas a C. parvum y G. duodenalis en el primer estudio. El análisis subtípico de C. parvum consistió RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 239 en amplificar un fragmento del gen gp60 y en el posterior análisis de las secuencias obtenidas. Para la caracterización molecular de G. duodenalis se analizaron fragmentos de los genes bg, gdh y tpi. Se identificaron 11 subtipos de C. parvum, todos ellos pertenecientes a la familia alélica IIa, predominando el subtipo IIaA15G2R1 (77,1%) y el IIaA16G3R1 (11,9%). El resto fueron hallazgos esporádicos, aunque resulta reseñable que este trabajo constituye la primera cita de los subtipos IIaA13G2R1, IIaA14G1R1, IIaA14G2R1, IIaA16G1R1, IIaA17G3R1, IIaA17G4R1 y IIaA17R1 en ganado vacuno en España. Todos los subtipos detectados presentan potencial zoonósico; además, el subtipo predominante (IIaA15G2R1) es el más común en casos de infecciones por C. parvum en personas en España. Todos estos datos sugieren que los terneros que padecen NCD constituyen un importante reservorio de C. parvum para el ser humano, pudiendo ser responsables de un porcentaje significativo de los brotes detectados en personas. En cuanto a su distribución por granjas, todos los aislados procedentes del mismo rebaño pertenecieron al mismo subtipo, salvo en dos casos, lo que demuestra la elevada morbilidad de este protozoo dentro de la explotación. En lo que respecta a la caracterización molecular de G. duodenalis, tan sólo amplificaron el 9,5% de las muestras seleccionadas. El mayor número de muestras positivas se obtuvo para el gdh (5), mientras que el análisis de los genes bg y tpi permitieron obtener cuatro y tres positivos, respectivamente. Tras el análisis de las secuencias obtenidas se determinó que todos los aislados pertenecían al genotipo E, el más común en ganado vacuno y ocasional en personas; por todo ello, no se puede excluir que los terneros infectados supongan un riesgo para la salud pública. No obstante, el reducido porcentaje de aislados genotipados, probablemente debido al elevado polimorfismo de las secuencias, no permite excluir por completo la presencia de otros genotipos zoonósicos como el A, que se ha detectado previamente en terneros asintomáticos en la misma zona geográfica. Sin embargo, teniendo en cuenta que todos los individuos analizados eliminaban heces diarreicas, la única presencia del genotipo E podría indicar que éste presenta una mayor patogenicidad para el ternero. El impacto de la NCD en la salud pública también puede relacionarse con una de las medidas más frecuentemente empleadas para su tratamiento, la antibioterapia, pues su uso indiscriminado favorece la selección de bacterias resistentes. Este hecho supone un grave CYNTHIA LÓPEZ NOVO 240 problema al reducir de forma muy considerable las opciones terapéuticas para controlar de forma eficaz las infecciones bacterianas en humanos y animales. De entre los agentes bacterianos implicados en la NCD destaca ETEC, por lo que se debe prestar especial atención a las resistencias asociadas a este patógeno para optimizar la selección de los antibióticos a emplear. En base a todo esto, en el tercer estudio de esta Tesis Doctoral se planteó determinar la susceptibilidad de las cepas de ETEC aisladas de las heces de terneros diarreicos del noroeste de España a cinco familias antibióticas (beta-lactámicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y trimetoprim-sulfonamidas), conocer la frecuencia de las resistencias frente a estas familias e identificar la presencia de cepas multirresistentes (MDR). Para ello se seleccionaron aquellas muestras fecales del primer estudio en las que se confirmó la presencia de la fimbria F5 y la enterotoxina STa y que, además, presentaban valores de ciclo umbral (Ct) inferiores a 25 para ambos genes. Para cada muestra, se seleccionó una colonia confirmada como ETEC por qPCR, que se sometió a las pruebas de susceptibilidad a 14 antibióticos representativos de las cinco familias más empleadas en veterinaria (beta-lactámicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y trimetoprim-sulfonamidas). Así, se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada antibiótico para cada una de las cepas testadas, lo que permitió clasificar los aislados de ETEC como susceptibles, intermedios o resistentes a cada compuesto. Además, también en base a la CMI, se obtuvo la concentración mínima necesaria de cada antibiótico para inhibir el crecimiento del 90% de las cepas (CMI90). Los resultados obtenidos muestran una situación muy preocupante e indican que, en granjas del noroeste de España, las resistencias a antibióticos son muy frecuentes en cepas de ETEC aisladas de terneros menores de un mes con diarrea. Todas las cepas fueron resistentes a al menos cuatro de los catorce antibióticos testados, y más de la mitad (51%) lo fueron a diez o más compuestos. Además, todas las cepas fueron resistentes a al menos un antibiótico de tres de las cinco familias testadas, pudiendo categorizarse como cepas MDR. La CMI90 fue equivalente a la mayor de las concentraciones utilizadas para ocho de los antibióticos testados, lo que indica que la mayoría de los aislados fueron resistentes a la máxima concentración de esos compuestos, mostrando por tanto una gran resistencia a los mismos. Al analizar los resultados por familias antibióticas se observaron notables diferencias en la susceptibilidad a los compuestos de una misma familia, que en la mayoría de los casos parecen tener su origen en su frecuencia de uso. De esta manera, la mayoría de RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 241 las cepas de ETEC analizadas fueron resistentes a los antibióticos de primera línea más empleados para el tratamiento de la NCD, destacando el 100% de aislados resistentes a la ampicilina, la cefalexina y la cefalotina. Tan sólo la gentamicina y las cefalosporinas de tercera y cuarta generación (ceftiofur, cefoperazona y cefquinoma) fueron capaces de inhibir el crecimiento de más del 90% de las cepas siendo, por lo tanto, opciones eficaces para el tratamiento de la NCD. Sin embargo, son compuestos de uso restringido por considerarse de importancia crítica para la medicina humana. Todos estos resultados permiten concluir que el uso de la antibioterapia en el tratamiento de la NCD debe limitarse incluso cuando ésta se deba a infecciones por ETEC. En este sentido, solo deberían administrarse antibióticos cuando se observen signos clínicos indicativos de enfermedad sistémica. Además, la realización de un antibiograma para conocer la susceptibilidad de las cepas circulantes en la granja permitirá optimizar la selección del compuesto a administrar. Asimismo, disponer de un historial de antibiogramas de la explotación permite monitorizar la evolución de las resistencias a lo largo del tiempo y facilita la selección empírica del antibiótico a emplear ante infecciones bacterianas futuras. RESUMO A diarrea neonatal do xato (NCD) é un proceso moi frecuente nas explotacións de gando vacún e cuxa aparición representa importantes perdas económicas para o gandeiro. A súa orixe pode deberse a deficiencias nutricionais ou de manexo pero, na maioría das ocasións, é o resultado da infección enteropatóxenos de natureza vírica, bacteriana e parasitaria. Na actualidade, os principais enteropatóxenos asociados á NCD son diferentes patotipos de E. coli (E.coli enterotoxixénica ou ETEC, E. coli enteropatóxena ou EPEC, E. coli enterohemorráxica ou EHEC e E. coli produtora de toxinas Shiga ou STEC), Cryptosporidium parvum, rotavirus A bovino (BRoV), coronavirus bovino (BCoV), e, en menor medida, Salmonella spp., Giardia duodenalis e Eimeria spp. Recentemente suxeriuse que outros axentes considerados emerxentes, como o torovirus bovino (BToV) ou varios calicivirus como o norovirus bovino (BNoV) e o nebovirus bovino (BNeV) tamén poderían estar implicados no proceso. Debido a que a sintomatoloxía dos animais con NCD é similar independentemente do patóxeno implicado, establecer unha sospeita etiolóxica en condicións de campo non é sinxelo. Por iso, establecer unha relación entre a presenza de cada enteropatóxeno e dous parámetros como a idade do animal no momento da diarrea e as características das feces, podería resultar moi orientativo para establecer unha primeira sospeita etiolóxica que permita implementar as primeiras medidas de control ante a aparición dun brote. Por outra parte, a maioría dos estudos realizados que avalían a presenza de varios axentes amosan que a aparición de NCD é, habitualmente, o resultado de infeccións mixtas. Por iso, identificar os axentes implicados nas co-infeccións e as súas interaccións resulta esencial para aplicar as medidas de control máis axeitadas en cada caso, incluíndo os tratamentos específicos fronte a determinados patóxenos entéricos. Por todo iso, no primeiro estudo desta Tese de Doutoramento propúxose determinar a prevalencia dos principais enteropatóxenos implicados na NCD en xatos con diarrea menores dun mes do noroeste de España. Tamén se analizou a posible influencia da idade e a consistencia das feces sobre a porcentaxe de infección polos diferentes axentes. Finalmente, identificáronse as asociacións más comúns entre os patóxenos, así como a súa relación coa ideade. Para iso, recolléronse 420 mostras fecais de xatos diarreicos menores dun mes procedentes de 222 gandarías de Galicia e Asturias, que se clasificaron en función RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 243 da semana de idade do xato e da súa consistencia. Os enteropatóxenos bacterianos (E. coli y Salmonella spp.) illáronse por inoculación en placa e, naquelas mostras nas que se observaron colonias compatibles con E. coli, identificouse molecularmente o patotipo mediante a detección de oito factores de virulencia (eae, F5, Sta, STb, LT, F17, Stx1, Stx2). Pola súa parte, as colonias compatibles con Salmonella spp. confirmáronse empregando unha proba comercial de soro aglutinante. A detección dos axentes víricos (BRoV, BCoV, BToV, BNoV y BNeV) realizouse mediante RT-qPCR. En canto aos enteropatóxenos parasitarios, a detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. e quistes de G. duodenalis efectuouse mediante inmunofluorescencia directa precedida dunha técnica de concentración difásica. A presenza de ooquistes de Eimeria spp. evidenciouse mediante flotación. Ademais, as mostras positivas a Cryptosporidium spp. e Eimeria spp. seleccionáronse para a súa posterior identificación específica. Para iso, no primeiro caso, procedeuse á análise xenotípica mediante unha PCR que amplifica o xene que codifica para a subunidade ribosomal 18s, seguida da análise de polimorfismo de lonxitude dos fragmentos de restrición (RFLP); mentres que no segundo efectuouse o estudo morfométrico dos ooquistes esporulados. Os resultados obtidos amosaron que no 97,1% das mostras detectouse polo menos un dos axentes incluídos no estudo, suxerindo que a presenza de patóxenos entéricos segue xogando un papel moi relevante na aparición da NCD. BRoV e Cryptosporidium spp. foron os enteropatóxenos máis frecuentes, con prevalencias superiores ao 50%. A análise xenotípica de Cryptosporidium spp. permitiu constatar que C. parvum (98,12%) predominou sobre C. bovis (0,94%) e C. ryanae (0,94%). Os nosos datos confirman a importancia destes axentes en xatos diarreicos menores dun mes, incluso cando se dispón de vacinas e tratamentos específicos con eficacia probada. A continuación, detectouse BNoV (45,7%), seguido por BNeV (22,4%), ETEC (22,1%), EPEC (21%), EHEC (20,2%) e G. duodenalis (17,6%). De todos estes axentes, ETEC é o único asociado claramente coa NCD, mentres que o papel do resto no proceso non se coñece con exactitude. Non obstante, a súa detección nunha proporción tan elevada das mostras propón a necesidade de prestarlles unha maior atención, podendo ser útil a súa inclusión nos paneis diagnósticos de rutina. Catro axentes detectáronse con prevalencias que oscilaron entre o 7 e o 10%: BToV, BCoV, Eimeria spp. e STEC. O exame morfométrico dos ooquistes de coccidios permitiu identificar dez especies, sendo E. ellipsoidalis, E. bovis e E. zuernii as máis prevalentes; en todas as mostras positivas CYNTHIA LÓPEZ NOVO 244 detectouse a presenza de máis dunha especie de Eimeria. Salmonella spp. non se illou en ningunha mostra, confirmando a súa escasa importancia como axente causal de NCD. A idade dos animais influíu significativamente sobre a prevalencia dalgúns axentes. Así, ETEC foi máis prevalente na primeira semana de idade, mentres que Cryptosporidium spp. foino na segunda semana. A porcentaxe de animais positivos a BNeV, EHEC e G. duodenalis foi máis elevada nos animais maiores de 15 días, e Eimeria spp. foi máis frecuente na cuarta semana. De xeito similar, observouse unha relación estatisticamente significativa entre a presenza dalgúns axentes e a consistencia da mostra fecal. Así, a detección de ETEC, BNoV e Cryptosporidium spp. foi significativamente máis frecuente nas mostras de consistencia acuosa. Pola contra, a porcentaxe de mostras positivas a G. duodenalis foi significativamente superior nas mostras de consistencia pastosa-acuosa e EHEC relacionouse coa excreción de feces pastosas. Estes datos poden ser moi útiles para o veterinario clínico que se enfronte a un brote de NCD nunha explotación de gando vacún ao facilitar o establecemento dunha primeira sospeita etiolóxica. Obviamente, esta sospeita debe complementarse con outros datos clínicos e epidemiolóxicos que se obteñan tras o exame clínico sistemático do animal e unha adecuada anamnese e, finalmente, confirmala mediante análise no laboratorio. Un dos aspectos máis novidosos deste estudo son os resultados das co-infeccións. Así, tras o análise das infeccións mixtas constatouse a presenza de varios enteropatóxenos no 82,1% das mostras. A maioría das co-infeccións estiveron constituídas por dous (27%) ou tres (33,6%) patóxenos, aínda que se identificaron ata sete axentes nunha mesma mostra (1,2%). Tendo en conta que o diagnóstico de rutina da NCD só inclúe catro enteropatóxenos (ETEC, BRoV, BCoV e C. parvum), os nosos resultados demostran que, frecuentemente, os resultados de laboratorio non permiten acadar un diagnóstico etiolóxico completo, o que dificulta a aplicación das medidas de control máis adecuadas en cada caso. As co-infeccións integradas unicamente por un ou varios virus e C. parvum foron as máis abundantes (20,9%), destacando a elevada prevalencia dos calicivirus bovinos, que suxire que, na maioría das ocasións, o papel destes virus emerxentes na NCD consistiría en provocar unha inmunosupresión que favorecese a infección con outros enteropatóxenos que actúan como axentes primarios. Así, BRoV, BNoV e C. parvum constituíron a infección mixta RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 245 predominante neste estudo, e xunto con BNeV formaron a terceira combinación máis frecuente, mentres que a segunda estaba integrada únicamente por BRoV e C. parvum. Os nosos datos tamén demostraron que a frecuencia das infección mixtas increméntase coa idade (desde o 73,2-86,2% nas dúas primeiras semanas ata acadar o 94,3% e 95,7% na terceira e cuarta semanas de vida, respectivamente), así como o número de patóxenos que as integran. Ademais, algúns dos patóxenos implicados nas infeccións mixtas interaccionaron significativamente entre si, tanto de forma positiva como negativa, e ditas asociacións variaron coa idade. Así, na primeira semana de vida, a maioría das interaccións positivas detectáronse entre BRoV e outros axentes víricos (BToV, BNoV y BCoV), se ben tamén se atopou unha asociación positiva entre C. parvum e G. duodenalis, así como de cada un destes protozoos con BNeV e EPEC. Tamén se identificaron interaccións negativas entre ETEC e C. parvum e entre EPEC, EHEC e STEC. A partir da segunda semana, as asociacións foron máis esporádicas. Entre os 8 e os 14 días de vida repetíronse as relacións positivas entre BRoV e BNoV e entre G. duodenalis e BNeV; este último virus asociouse ademais con BToV e STEC. A interacción entre EPEC e EHEC resultou negativa e mantívose durante o resto do estudo. Na terceira semana, en contraste co observado nos primeiros sete días, foi improbable detectar C. parvum en combinación con G. duodenalis e Eimeria spp., que ademais asociáronse positivamente entre si. A interacción negativa entre C. parvum e G. duodenalis mantívose durante a cuarta semana, período no que foi máis probable a detección conxunta de BCoV e BNoV. Debido a que algúns dos axentes implicados na NCD presentan potencial zoonósico, a súa presenza podería representar un perigo para a saúde pública. De todos eles, destacan C. parvum e G. duodenalis, dada a súa elevada prevalencia tanto en xatos neonatos como en persoas. Por iso, no segundo estudo desta Tese de Doutoramento identificáronse os subtipos de C. parvum e xenotipos de G. duodenalis presentes en xatos diarreicos menores dun mes do noroeste de España co obxectivo de determinar o seu potencial zoonósico. Primeiramente, seleccionáronse as mostras que resultaron positivas a C. parvum e G. duodenalis no primeiro estudo. A análise subtípica de C. parvum consistiu en amplificar un fragmento do xene gp60 e na posterior análise das secuencias obtidas. Para a caracterización molecular de G. duodenalis analizáronse fragmentos dos xenes bg, gdh e tpi. Identificáronse 11 subtipos de C. parvum, todos eles pertencentes á familia alélica IIa, predominando o subtipo CYNTHIA LÓPEZ NOVO 246 IIaA15G2R1 (77,1%) e o IIaA16G3R1 (11,9%). O resto foron achados esporádicos, aínda que resulta salientable que este traballo constitúe a primeira cita dos subtipos IIaA13G2R1, IIaA14G1R1, IIaA14G2R1, IIaA16G1R1, IIaA17G3R1, IIaA17G4R1 e IIaA17R1 en gando vacún en España. Todos os subtipos detectados presentan potencial zoonósico; ademais, o subtipo predominante (IIaA15G2R1) é o máis común en casos de infección por C. parvum en persoas en España. Todos estes datos suxiren que os xatos que padecen NCD constitúen un importante reservorio de C. parvum para o ser humano, podendo ser responsables dunha porcentaxe significativa dos brotes detectados en persoas. En canto á súa distribución por granxas, todos os illados procedentes do mesmo rabaño pertenceron ao mesmo subtipo, salvo en dous casos, o que demostra a elevada morbilidade deste protozoo dentro da explotación. No que respecta á caracterización molecular de G. duodenalis, tan só amplificaron o 9,5% das mostras seleccionadas. O maior número de mostras positivas obtívose para o gdh (5), mentres que a análise dos xenes bg e tpi permitiron obter catro e tres positivos, respectivamente. Tras a análise das secuencias obtidas determinouse que todos os illados pertencían ao xenotipo E, que é o máis común en gando vacún e ocasional en persoas; por todo iso, non se pode excluir que os xatos infectados supoñan un risco para a saúde pública. Porén, a reducida porcentaxe de illados xenotipados, probablemente debido ao elevado polimorfismo das secuencias, non permite excluír por completo a presenza doutros xenotipos zoonósicos como o A, que se detectou previamente en xatos asintomáticos na mesma zona xeográfica. Non obstante, tendo en conta que todos os individuos analizados eliminaban feces diarreicas, a única presenza do xenotipo E podería indicar que este presenta unha maior patoxenicidade para o xato. O impacto da NCD na saúde pública tamén pode relacionarse cunha das medidas máis frecuentemente empregadas para o seu tratamento, a antibioterapia, pois o seu uso indiscriminado favorece a selección de bacterias resistentes. Este feito supón un grave problema ao reducir de forma moi considerable as opcións terapéuticas para controlar de forma eficaz as infeccións bacterianas en humanos e animais. De entre os axentes bacterianos implicados na NCD destaca ETEC, polo que se debe prestar especial atención ás resistencias asociadas a este patóxeno para optimizar a selección dos antibióticos a empregar. En base a todo isto, no terceiro estudo desta Tese de Doutoramento propúxose determinar a susceptibilidade das cepas de ETEC illadas das feces de xatos diarreicos do RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 253 IIaA17G3R1, IIaA17G4R1 y IIaA17R1 in cattle from Spain. All the detected subtypes have zoonotic potential; moreover, the predominant subtype (IIaA15G2R1) is the most common one in human infections with C. parvum in Spain. These data suggest that the calves which suffer from NCD constitute an important C. parvum reservoir for humans and can be responsible for a significant percentage of the outbreaks that have been detected in people. Regarding their distribution according to the farm of origin, all the isolates from the same herd belonged to the same subtype, except for two cases, which proves the high morbidity of this protozoan in the farm environment. Regarding the molecular characterization of G. duodenalis, only 9.5% of the samples could be amplified. The highest number of positive samples was obtained for the gdh gene (5), whereas the analysis of the bg and tpi genes enabled the obtention of four and three positives, respectively. Assemblage E was identified in all the obtained sequences, it is the most common one in cattle and its presence in humans is occasional; thus, we cannot exclude a public health risk stemming from the infected calves. Nevertheless, given the low percentage of genotyped isolates, probably due to the high polymorphism of the sequences, the presence of other zoonotic genotypes like assemblage A cannot be ruled out, especially considering that it has previously been detected in healthy calves from the same geographical area. However, provided that all the sampled animals were diarrhoeic, the sole presence of genotype E may indicate that it is more pathogenic for the calf. The impact of NCD on public health can also be related to one of the most frequently used treatment measures, antibiotic therapy, provided that its indiscriminate use favours the selection of resistant bacteria. This is a severe issue given that it considerably reduces the available therapeutic options to effectively control bacterial infections in humans and animals. ETEC is one of the most important bacterial agents involved in NCD; thus, we must pay special attention to the resistance mechanisms linked to this pathogen to optimize the selection of the antibiotics which are going to be used against it. On this basis, in the third study of this Doctoral Thesis we aimed to characterize the susceptibility of ETEC strains isolated from diarrhoeic calves from the northwest of Spain against five antimicrobial families (betalactams, aminoglycosides, quinolones, tetracyclines and trimethoprim/sulphonamides), to determine the frequency of the resistance mechanisms against these families and to identify the presence of multidrug-resistant (MDR) strains. In CYNTHIA LÓPEZ NOVO 254 order to do so, we selected those samples from the first study in which the presence of the F5 adhesin and the Sta enterotoxin was confirmed with cycle threshold (Ct) values under 25 for both genes. For each sample, one colony confirmed as ETEC by qPCR was chosen and antimicrobial susceptibility testing (AST) was performed. The AST included 14 antibiotics representative of the five most used antimicrobial families in veterinary medicine (betalactams, aminoglycosides, quinolones, tetracyclines and trimethoprim/sulphonamides). The results of the minimum inhibitory concentration (CMI) for each antibiotic were used to classify the ETEC isolates as susceptible, intermediate or resistant to each compound. Moreover, the minimum concentration of each antibiotic to suppress the growth of 90% of the strains was calculated (CMI90%). The obtained results show a very worrying situation and indicate that, in farms from the northwest of Spain, antimicrobial resistance is very frequent in ETEC isolates from diarrhoeic calves under a month of age. All the strains were resistant to at least four out of the 14 tested antimicrobials, and more than half of them (51%) to ten or more compounds. Furthermore, all the strains were resistant to at least one antibiotic from three out of the five tested families and can be classified as multidrug-resistant strains. CMI90 was equal to the highest concentration used for eight of the tested antibiotics, which indicates that most of the strains were resistant to the maximum concentration of those compounds and, thus, showed great resistance to them. When we analysed the results according to antimicrobial families, we noticed remarkable differences in the susceptibility to the different compounds of the same family, which in most cases may have their origin in their respective frequency of use. Thus, most of the analysed ETEC strains were resistant to the first line antimicrobials most commonly used to treat NCD cases, with 100% of the strains resistant to ampicillin, cephalexin and cephalotin. Only gentamicin and third and fourth generation cefalosporins (ceftiofur, cefoperazone and cefquinome) could suppress the growth of more than 90% of the strains and are, thus, effective options to treat NCD. However, the usage of these compounds is restricted as they are considered critically important antibiotics for human medicine. These results lead to the conclusion that the use of antibiotic therapy in the treatment of NCD must be limited, even when its onset is due to an ETEC infection. In this respect, antibiotics should only be dispensed when clinical signs of systemic disease are observed. Moreover, the implementation of ASTs to determine the susceptibility of the strains which are circulating in the farm environment is very useful to optimize the selection RESUMEN-RESUMO-ABSTRACT 255 of the compound that is going to be used in the treatment. Likewise, establishing a farm record of antimicrobial susceptibility is helpful to monitor the evolution of resistance over time and facilitates the empirical selection of antimicrobials against future bacterial infections. 8. REFERENCIAS REFERENCIAS 259 Abal-Fabeiro, J.L., Maside, X., Llovo, J., Bartolomé, C., 2015. Aetiology and epidemiology of human cryptosporidiosis cases in Galicia (NW Spain), 2000-2008. Epidemiol. Infect. 143, 3022-3035. doi:10.1017/S0950268815000163 Abdel-Moein, K.A., Saeed, H., 2016. The zoonotic potential of Giardia intestinalis assemblage E in rural settings. Parasitol. Res. 115, 3197-3202. doi:10.1007/S00436-016-5081-7/TABLES/2 Abeywardena, H., Jex, A.R., Gasser, R.B., 2015. A Perspective on Cryptosporidium and Giardia, with an emphasis on bovines and recent epidemiological findings, Advances in Parasitology 88, 243-301. doi:10.1016/bs.apar.2015.02.001 Abraham, S., Trott, D.J., Jordan, D., Gordon, D.M., Groves, M.D., Fairbrother, J.M., Smith, M.G., Zhang, R., Chapman, T.A., 2014. Phylogenetic and molecular insights into the evolution of multidrug-resistant porcine enterotoxigenic Escherichia coli in Australia. Int. J. Antimicrob. Agents 44, 105-111. doi:10.1016/J.IJANTIMICAG.2014.04.011 Acero Adámez, P., 2009. Planificación y manejo de la explotación de vacuno de carne. Junta de Castilla y León. Acres, S.D., 1985. Enterotoxigenic Escherichia coli Infections in Newborn Calves: A Review. J. Dairy Sci. 68, 229-256. doi:10.3168/jds.S00220302(85)80814-6 Adam, R.D., 2021. Giardia duodenalis: Biology and Pathogenesis. Clin. Microbiol. Rev. 34, e0002419. doi:10.1128/CMR.00024-19 Adam, R.D., 2001. Biology of Giardia lamblia. Clin. Microbiol. Rev. 14, 447-475. Adam, R.D., 2000. The Giardia lamblia genome. Int. J. Parasitol. 30, 475-484. Adam, R.D., Dahlstrom, E.W., Martens, C.A., Bruno, D.P., Barbian, K.D., Ricklefs, S.M., Hernandez, M.M., Narla, N.P., Patel, R.B., Porcella, S.F., Nash, T.E., 2013. Genome Sequencing of Giardia lamblia Genotypes A2 and B Isolates (DH and GS) and Comparative Analysis with the Genomes of Genotypes A1 and E (WB and Pig). Genome Biol. Evol. 5, 2498-2511. doi:10.1093/GBE/EVT197 Adams, R.B., Guerrant, R.L., Zu, S., Fang, G., Roche, J.K., 1994. Cryptosporidium parvum infection of intestinal epithelium: Morphologic and functional studies in an in vitro model. J. Infect. Dis. 169, 170-177. doi:10.1093/infdis/169.1.170 Adkins, P.R.F., 2022. Cryptosporidiosis. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 38, 121-131. doi:10.1016/J.CVFA.2021.11.009 Adl, S.M., Bass, D., Lane, C.E., Lukeš, J., Schoch, C.L., Smirnov, A., Agatha, S., Berney, C., Brown, M.W., Burki, F., Cárdenas, P., Čepička, I., Chistyakova, L., del Campo, J., Dunthorn, M., Edvardsen, B., Eglit, Y., Guillou, L., Hampl, V., Heiss, A.A., Hoppenrath, M., James, T.Y., Karnkowska, A., Karpov, S., Kim, E., Kolisko, M., Kudryavtsev, A., Lahr, D.J.G., Lara, E., Le Gall, L., Lynn, D.H., Mann, D.G., Massana, R., Mitchell, E.A.D., Morrow, C., Park, J.S., Pawlowski, J.W., Powell, M.J., Richter, D.J., Rueckert, S., Shadwick, L., Shimano, S., Spiegel, F.W., Torruella, G., Youssef, N., Zlatogursky, V., Zhang, Q., 2019. Revisions to the Classification, Nomenclature, and Diversity of Eukaryotes. J Eukaryot Microbiol. 66, 4-119. doi:10.1111/JEU.12691 Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2022. Parofor crypto 140.000 UI/ml solución oral para bovino prerrumiante. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2021a. Deccox 60 mg/g premezcla medicamentosa para ovino y bovino. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2021b. Baycox Multi 50 mg/ml suspensión oral para bovino, porcino y ovino. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2020a. Halofusol 0,5 mg/ml solución oral para terneros. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 2020b. Vecoxan 2,5 mg/ml Suspensión oral terneros y corderos. Agencia Europea del Medicamento, 2022. Sales of veterinary antimicrobial agents in 31 European countries in 2021. Luxemburgo. doi:10.2809/39517 Agencia Europea del Medicamento, 2020. Categorisation of antibiotics used in animals promotes responsible use to protect public and animal health. Amsterdam, Países Bajos. Agencia Europea del Medicamento, 2019. Categorisation of antibiotics in the European Union. Agencia Europea del Medicamento, 2005. Commitee for Veterinary Medicinal Products: Lasalocid Sodium Summary Report. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 260 Aghakeshmiri, F., Azizzadeh, M., Farzaneh, N., Gorjidooz, M., 2017. Effects of neonatal diarrhea and other conditions on subsequent productive and reproductive performance of heifer calves. Vet. Res. Commun. 41, 107-112. doi:10.1007/s11259-017-9678-9 Ågren, E.C.C., Sternberg Lewerin, S., Wahlström, H., Emanuelson, U., Frössling, J., 2016. Low prevalence of Salmonella in Swedish dairy herds highlight differences between serotypes. Prev. Vet. Med. 125, 38-45. doi:10.1016/j.prevetmed.2015.12.015 Ahmed, A.M., Younis, E.E.A., Osman, S.A., Ishida, Y., El-khodery, S.A., Shimamoto, T., 2009. Genetic analysis of antimicrobial resistance in Escherichia coli isolated from diarrheic neonatal calves. Vet. Microbiol. 136, 397-402. doi:10.1016/j.vetmic.2008.11.021 Aita, T., Kuwabara, M., Murayama, K., Sasagawa, Y., Yabe, S., Higuchi, R., Tamura, T., Miyazaki, A., Tsunemitsu, H., 2012. Characterization of epidemic diarrhea outbreaks associated with bovine torovirus in adult cows. Arch. Virol. 157, 423. doi:10.1007/S00705-011-1183-9 Akam, A., Khelef, D., Kaidi, R., Othmani, A., Lafri, M., Tali-Maamar, H., Rahal, K., Tahrat, N., Chirila, F., Cozma, V., Abdul-Hussain, M.S., 2004. Frequency of Cryptosporidium parvum, Escherichia coli K99 and Salmonella spp. isolated from healthy and unhealthy calves in six breeding farms from Mitidja, Algeria (Preliminary results). Rev. Sci. Parasitol. 5, 1321. Al-Majali, A.M., Asem, E.K., Lamar, C.H., Robinson, J.P., Freeman, M.J., Saeed, A.M., 2000. Studies on the Mechanism of Diarrhoea Induced by Escherichia coli Heat-Stable Enterotoxin (STa) in Newborn Calves. Vet. Res. Commun. 24, 327338. doi:10.1023/A:1006444105846 Al Mawly, J., Grinberg, A., Prattley, D., Moffat, J., Marshall, J., French, N., 2015. Risk factors for neonatal calf diarrhoea and enteropathogen shedding in New Zealand dairy farms. Vet. J. 203, 155-160. doi:10.1016/j.tvjl.2015.01.010 Alfieri, A.A., Parazzi, M.E., Takiuchi, E., Médici, K.C., Alfieri, A.F., 2006. Frequency of group A rotavirus in diarrhoeic calves in Brazilian cattle herds, 1998-2002. Trop. Anim. Health Prod. 38, 521-526. doi:10.1007/S11250-006-4349-9 Allen, U.D., Deadman, L., Wang, E.E.L., 1994. Standardizing the assessment of diarrhea in clinical trials : results of an interobserver agreement study. Acta Pædiatrica 83, 179-182. Alotaibi, M.A., Al-Amad, S., Chenari Bouket, A., AlAqeel, H., Haider, E., Hijji, A. Bin, Belbahri, L., Alenezi, F.N., 2022. High Occurrence Among Calves and Close Phylogenetic Relationships With Human Viruses Warrants Close Surveillance of Rotaviruses in Kuwaiti Dairy Farms. Front. Vet. Sci. 9, 1-8. doi:10.3389/fvets.2022.745934 Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A.A., Matos, O., Antunes, F., 2003. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J. Clin. Microbiol. 41, 2744-2747. doi:10.1128/JCM.41.6.27442747.2003 Aly, S.S., Pithua, P., Champagne, J.D., Haines, D.M., 2013. A randomized controlled trial on preweaning morbidity, growth and mortality in Holstein heifers fed a lacteal-derived colostrum replacer or pooled maternal colostrum. BMC Vet. Res. 9, 168. doi:10.1186/1746-6148-9-168 Ament, M.E., 1972. Diagnosis and treatment of giardiasis. J. Pediatr. 80, 633-637. doi:10.1016/S0022-3476(72)80061-1 Ammar, S.S.M., Mokhtaria, K., Tahar, B.B., Amar, A.A., Redha, B.A., Yuva, B., Mohamed, H.S., Abdellatif, N., Laid, B., 2014. Prevalence of rotavirus (GARV) and coronavirus (BCoV) associated with neonatal diarrhea in calves in western Algeria. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 4, S318-S322. doi:10.12980/APJTB.4.2014C778 Anderson, D.C., Kress, D.D., Bernardini, T.M.M., Davis, K.C., Boss, D.L., Doornbos, D.E., 2003. The Effect of Scours on Calf Weaning Weight. Prof. Anim. Sci. 19, 399-403. Anderson, M., Clift, C., Schulze, K., Sagan, A., Driss, S.N., Ouakrim, A., Mossialos, E., 2019. Averting the AMR crisis: What are the avenues for policy action for countries in Europe? European Observatory on Health Systems and Policies, Copenhague, Dinamarca. Ando, T., Noel, J.S., Fankhauser, R.L., 2000. Genetic Classification of “Norwalk‐like Viruses”. J. Infect. Dis. 181, S336-S348. doi:10.1086/315589 Angappan, M., Ghatak, S., Milton, A.A.P., Verma, A.K., Inbaraj, S., Abhishek, Chaudhuri, P., Agarwal, R.K., Thomas, P., 2021. Detection of novel sequence types and zoonotic transmission potentiality among strains of Shiga toxigenic Escherichia coli (STEC) from dairy calves, animal handlers and associated environments. REFERENCIAS 261 Brazilian J. Microbiol. 52, 2541-2546. doi:10.1007/S42770-021-00561-9 Anjum, M.F., 2015. Screening methods for the detection of antimicrobial resistance genes present in bacterial isolates and the microbiota. Future Microbiol. 10, 317-320. doi:10.2217/FMB.15.2 Anjum, M.F., Zankari, E., Hasman, H., 2017. Molecular Methods for Detection of Antimicrobial Resistance. Microbiol. Spectr. 5. doi:10.1128/MICROBIOLSPEC.ARBA-00112017 Ankarklev, J., Jerlström-Hultqvist, J., Ringqvist, E., Troell, K., Svärd, S.G., 2010. Behind the smile: Cell biology and disease mechanisms of Giardia species. Nat. Rev. Microbiol. 8, 413-422. doi:10.1038/nrmicro2317 Anusz, K.Z., Mason, P.H., Riggs, M.W., Perryman, L.E., 1990. Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in bovine feces by monoclonal antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 28, 2770-2774. doi:10.1128/jcm.28.12.2770-2774.1990 Argenzio, R.A., 1992. Pathophysiology of diarrhea, en: Anderson, N. V., Sherding, R.G., Merritt, A.M., Whitlock, R.H. (Eds.), Veterinary Gastroenterology. Lea & Febiger, pp. 163-172. Argenzio, R.A., 1985. Pathophysiology of neonatal calf diarrhea. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 1, 461-469. doi:10.1016/S07490720(15)31296-2 Argenzio, R.A., 1981. Short-chain fatty acids and the colon. Dig. Dis. Sci. 1981 262 26, 97-99. doi:10.1007/BF01312223 Arsenopoulos, K., Theodoridis, A., Papadopoulos, E., 2017. Effect of colostrum quantity and quality on neonatal calf diarrhoea due to Cryptosporidium spp. infection. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 53, 50-55. doi:10.1016/j.cimid.2017.07.005 Asher, A.J., Hose, G., Power, M.L., 2016. Giardiasis in NSW : Identification of Giardia duodenalis assemblages contributing to human and cattle cases, and an epidemiological assessment of sporadic human giardiasis. Infect. Genet. Evol. 44, 157-161. Atlas, R., Snyder, J., 2015. Reagents, Stains, and Media: Bacteriology, en: Jorgensen, J.H., Pfaller, M.A. (Eds.), Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington D. C., EE.UU. pp. 316-349. Aust, V., Knappstein, K., Kunz, H.J., Kaspar, H., Wallmann, J., Kaske, M., 2013. Feeding untreated and pasteurized waste milk and bulk milk to calves: effects on calf performance, health status and antibiotic resistance of faecal bacteria. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 97, 1091-1103. doi:10.1111/JPN.12019 Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, 2022. The European Union One Health 2021 Zoonoses Report. EFSA J. 20. doi:10.2903/J.EFSA.2022.7666 Avendaño, C., Ramo, A., Vergara-Castiblanco, C., Bayona, M., Velasco-Benitez, C.A., SánchezAcedo, C., Quílez, J., 2019. Occurrence and molecular characterization of Giardia duodenalis in child population from Colombia. Infect. Genet. Evol. 76, 104034. doi:10.1016/J.MEEGID.2019.104034 Azami, M., Moghaddam, D.D., Salehi, R., Salehi, M., 2007. The identification of Cryptosporidium species in Isfahan, Iran by PCR-RFLP analysis of the 18S rRNA gene. Mol. Biol. 41, 851-856. doi:10.1134/S0026893307050196 Azcona-Gutiérrez, J., de Lucio, A., Hernández-deMingo, M., García-García, C., Miguel SoriaBlanco, L., Morales, L., Aguilera, M., Fuentes, I., Carmena, D., 2017. Molecular diversity and frequency of the diarrheagenic enteric protozoan Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp. in a hospital setting in Northern Spain. PLoS One 12, e0178575. doi:10.1371/journal.pone.0178575 Bachmann, L., Homeier, T., Arlt, S., Brueckner, M., Rawel, H., Deiner, C., Hartmann, H., 2009. Influence of different oral rehydration solutions on abomasal conditions and the acid-base status of suckling calves. J. Dairy Sci. 92, 1649-1659. doi:10.3168/jds.2008-1487 Bajer, A., Cacciò, S.M., Bednarska, M., Behnke, J.M., Pieniazek, N.J., Sinski, E., 2003. Preliminary Molecular Characterization of Cryptosporidium parvum Isolates of Wildlife Rodents From Poland. J. Parasitol. 89, 1053-1055. doi:10.1645/GE-3096RN Bangoura, B., Bardsley, K.D., 2020. Ruminant Coccidiosis. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 36, 187-203. doi:10.1016/J.CVFA.2019.12.006 Bangoura, B., Daugschies, A., 2020. Coccidiosis in Cattle, en: Dubey, J.P. (Ed.), Coccidiosis in Livestock, Poultry, Companion Animals, and Humans. CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU., pp. 79-90. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 262 Bangoura, B., Daugschies, A., 2018. Eimeria, en: Schnittger, L., Florin-Christensen, M. (Eds.), Parasitic Protozoa of Farm Animals and Pets. Springer International Publishing AG, Cham, Suíza, pp. 55-101. doi:10.1007/978-3-31970132-5 Barkley, J.A., Pempek, J.A., Bowman, A.S., Nolting, J.M., Lee, J., Lee, S., Habing, G.G., 2021. Longitudinal health outcomes for enteric pathogens in preweaned calves on Ohio dairy farms. Prev. Vet. Med. 190, 105323. doi:10.1016/J.PREVETMED.2021.105323 Barnett, S.C., Sischo, W.M., Moore, D.A., Reynolds, J.P., 2003. Evaluation of flunixin meglumine as an adjunct treatment for diarrhea in dairy calves. J. Am. Vet. Med. Assoc. 223, 1329-1333. doi:10.2460/javma.2003.223.1329 Barreiros, M.A.B., Alfieri, A.F., Médici, K.C., Leite, J.P.G., Alfieri, A.A., 2004. G and P genotypes of group A rotavirus from diarrhoeic calves born to cows vaccinated against the NCDV (P[1],G6) rotavirus strain. J. Vet. Med. Ser. B Infect. Dis. Vet. Public Heal. 51, 104-109. doi:10.1111/J.1439-0450.2004.00737.X Barrier, A.C., Haskell, M.J., Birch, S., Bagnall, A., Bell, D.J., Dickinson, J., Macrae, A.I., Dwyer, C.M., 2013. The impact of dystocia on dairy calf health, welfare, performance and survival. Vet. J. 195, 86-90. doi:10.1016/J.TVJL.2012.07.031 Barrier, A.C., Ruelle, E., Haskell, M.J., Dwyer, C.M., 2012. Effect of a difficult calving on the vigour of the calf, the onset of maternal behaviour, and some behavioural indicators of pain in the dam. Prev. Vet. Med. 103, 248-256. doi:10.1016/J.PREVETMED.2011.09.001 Barrington, G.M., Gay, J.M., Evermann, J.F., 2002. Biosecurity for neonatal gastrointestinal diseases. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 18, 734. doi:10.1016/S0749-0720(02)00005-1 Barrington, G.M., Parish, S.M., 2001. Bovine Neonatal Immunology. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 17, 463-476. doi:10.1016/S07490720(15)30001-3 Bartels, C.J.M., Holzhauer, M., Jorritsma, R., Swart, W.A.J.M., Lam, T.J.G.M., 2010. Prevalence, prediction and risk factors of enteropathogens in normal and non-normal faeces of young Dutch dairy calves. Prev. Vet. Med. 93, 162-169. doi:10.1016/j.prevetmed.2009.09.020 Bartens, M.C., Drillich, M., Rychli, K., Iwersen, M., Arnholdt, T., Meyer, L., Klein-Jöbstl, D., 2016. Assessment of different methods to estimate bovine colostrum quality on farm. N. Z. Vet. J. 64, 263-267. doi:10.1080/00480169.2016.1184109 Bartier, A.L., Windeyer, M.C., Doepel, L., 2015. Evaluation of on-farm tools for colostrum quality measurement. J. Dairy Sci. 98, 1878-1884. doi:10.3168/jds.2014-8415 Bartley, P.M., Roehe, B.K., Thomson, S., Shaw, H.J., Peto, F., Innes, E.A., Katzer, F., 2019. Detection of potentially human infectious assemblages of Giardia duodenalis in fecal samples from beef and dairy cattle in Scotland. Parasitology 146, 1123-1130. doi:10.1017/S0031182018001117 Bates, D., Mächler, M., Bolker, B.M., Walker, S.C., 2015. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. J. Stat. Softw. 67, 1-48. doi:10.18637/JSS.V067.I01 Beam, A.L., Lombard, J.E., Kopral, C.A., Garber, L.P., Winter, A.L., Hicks, J.A., Schlater, J.L., 2009. Prevalence of failure of passive transfer of immunity in newborn heifer calves and associated management practices on US dairy operations. J. Dairy Sci. 92, 3973-3980. doi:10.3168/jds.20092225 Behrendt, J.H., Hermosilla, C., Hardt, M., Failing, K., Zahner, H., Taubert, A., 2008. PMN-mediated immune reactions against Eimeria bovis. Vet. Parasitol. 151, 97-109. doi:10.1016/j.vetpar.2007.11.013 Bellamy, J.E., Acres, S.D., 1979. Enterotoxigenic colibacillosis in colostrum-fed calves: pathologic changes. Am. J. Vet. Res. 40, 1391-1397. Bendali, F., Bichet, H., Schelcher, F., Sanaa, M., 1999a. Pattern of diarrhoea in newborn beef calves in south-west France. Vet Res 30, 61-74. Bendali, F., Moez, S., Bichet, H., Schelcher, F., 1999b. Risk factors associated with diarrhoea in newborn calves. Vet Res 30, 509-522. Benfield, D.A., Stotz, I.J., Nelson, E.A., Groon, K.S., 1984. Comparison of a commercial enzymelinked immunosorbent assay with electron microscopy, fluorescent antibody, and virus isolation for the detection of bovine and porcine rotavirus. Am. J. Vet. Res. 45, 1998-2002. Benito, A.A., Arnal, J.L., García, B., Serrano, J.D., Barrios, J., Ondarra, M., Chacón, G., 2019. Identificación y genotipado de rotavirus A circulante en terneros con problemas digestivos en España, en: XXIV Congreso Internacional ANEMBE Medicina Bovina. Sevilla, España, p. 360. REFERENCIAS 269 0450.2005.00894.x Davis, L.R., Bowman, G.W., Boughton, D.C., 1957. The Endogenous Development of Eimeria alabamensis Christensen, 1941, an Intranuclear Coccidium of Cattle. J. Protozool. 4, 219-225. doi:10.1111/J.1550-7408.1957.TB02511.X Davis, M.A., Hancock, D.D., Besser, T.E., Daniels, J.B., Baker, K.N.K., Call, D.R., 2007. Antimicrobial resistance in Salmonella enterica serovar Dublin isolates from beef and dairy sources. Vet. Microbiol. 119, 221-230. doi:10.1016/J.VETMIC.2006.08.028 Davoudi, Y., Garedaghi, Y., Safarmashaei, S., 2011. Epidemiological study of Giardiasis in diarrheic calves in East-Azerbaijan province, Iran. J. Anim. Vet. Adv. 10, 2508-2510. doi:10.3923/JAVAA.2011.2508.2510 De Briyne, N., Atkinson, J., Borriello, S.P., Pokludová, L., 2014. Antibiotics used most commonly to treat animals in Europe. Vet. Rec. 175, 325-325. doi:10.1136/VR.102462 de Graaf, D.C., Vanopdenbosch, E., Ortega-Mora, L.M., Abbassi, H., Peeters, J.E., 1999. A review of the importance of cryptosporidiosis in farm animals. Int. J. Parasitol. 29, 1269-1287. doi:10.1016/S0020-7519(99)00076-4 De Graaf, F.K., Roorda, I., 1982. Production, purification, and characterization of the fimbrial adhesive antigen F41 isolated from calf enteropathogenic Escherichia coli strain B41M. Infect. Immun. 36, 751-758. De La Fuente, R., García, A., Ruiz-Santa-Quiteria, J.A., Luzón, M., Cid, D., García, S., Orden, J.A., Gómez-Bautista, M., 1998. Proportional morbidity rates of enteropathogens among diarrheic dairy calves in central Spain. Prev. Vet. Med. 36, 145-152. doi:10.1016/S01675877(98)00077-4 De La Fuente, R., Luzón, M., Ruiz-Santa-Quiteria, J.A., García, A., Cid, D., Orden, J.A., García, S., Sanz, R., Gómez-Bautista, M., 1999. Cryptosporidium and concurrent infections with other major enterophatogens in 1 to 30-day-old diarrheic dairy calves in central Spain. Vet. Parasitol. 80, 179185. doi:10.1016/S0304-4017(98)00218-0 de Lucio, A., Merino, F.J., Martínez-Ruiz, R., Bailo, B., Aguilera, M., Fuentes, I., Carmena, D., 2016. Molecular genotyping and sub-genotyping of Cryptosporidium spp. isolates from symptomatic individuals attending two major public hospitals in Madrid, Spain. Infect. Genet. Evol. 37, 49-56. doi:10.1016/J.MEEGID.2015.10.026 De Passillé, A.M., Borderas, T.F., Rushen, J., 2011. Weaning age of calves fed a high milk allowance by automated feeders: Effects on feed, water, and energy intake, behavioral signs of hunger, and weight gains. J. Dairy Sci. 94, 1401-1408. doi:10.3168/JDS.2010-3441 De Verdier, K., Nyman, A., Greko, C., Bengtsson, B., 2012. Antimicrobial resistance and virulence factors in Escherichia coli from Swedish dairy calves. Acta Vet. Scand. 54. doi:10.1186/17510147-54-2 Dean-Nystrom, E.A., Bosworth, B.T., Cray, W.C., Moon, H.W., 1997. Pathogenicity of Escherichia coli O157:H7 in the intestines of neonatal calves. Infect. Immun. 65, 1842-1848. doi:10.1128/IAI.65.5.1842-1848.1997 Del Coco, V.F., Córdoba, M.A., Bilbao, G., de Almeida Castro, A.P., Basualdo, J.A., Fayer, R., Santín, M., 2014. Cryptosporidium parvum GP60 subtypes in dairy cattle from Buenos Aires, Argentina. Res. Vet. Sci. 96, 311-314. doi:10.1016/J.RVSC.2013.12.010 Delling, C., Daugschies, A., 2022. Literature Review: Coinfection in Young Ruminant LivestockCryptosporidium spp. and Its Companions. Pathogens 11, 103. doi:10.3390/PATHOGENS11010103 Demigné, C., Rémésy, C., Chartier, F., Kaligis, D., 1983. Utilization of volatile fatty acids and improvement of fluid therapy for treatment of dehydration in diarrheic calves. Ann. Rech. Vet. 14, 541-547. Demigné, C., Rémésy, C., Chartier, F., LeFaivre, J., 1981. Effect of acetate or chloride anions on intestinal absorption of water and solutes in the calf. Am. J. Vet. Res. 42, 1356-1359. Deng, Y., Batten, C.A., Liu, B.L., Lambden, P.R., Elschner, M., Günther, H., Otto, H.P., Schnürch, P., Eichhorn, W., Herbst, W., Clarke, I.N., 2003. Studies of epidemiology and seroprevalence of bovine Noroviruses in Germany. J. Clin. Microbiol. 41, 2300-2305. doi:10.1128/JCM.41.6.2300-2305.2003 Denholm, K.S., McDougall, S., Chambers, G., Clough, W., 2018. Factors associated with colostrum quality in individual cows from dairy herds in the Waikato region of New Zealand. N. Z. Vet. J. 66, 115-120. doi:10.1080/00480169.2017.1418684 Desselberger, U., 2014. Rotaviruses. Virus Res. 190, 7596. doi:10.1007/978-1-4899-7448-8_30 Di Bartolo, I., Ponterio, E., Monini, M., Ruggeri, F.M., CYNTHIA LÓPEZ NOVO 270 2011. A pilot survey of bovine norovirus in northern Italy. Vet. Rec. 169, 73-73. doi:10.1136/vr.d2625 Di Felice, E., Mauroy, A., Pozzo, F.D., Thiry, D., Ceci, C., Di Martino, B., Marsilio, F., Thiry, E., 2016. Bovine noroviruses: A missing component of calf diarrhoea diagnosis. Vet. J. 207, 53-62. doi:10.1016/J.TVJL.2015.10.026 Di Martino, B., Di Profio, F., Martella, V., Ceci, C., Marsilio, F., 2011. Evidence for recombination in neboviruses. Vet. Microbiol. 153, 367-372. doi:10.1016/j.vetmic.2011.05.034 Díaz, P., Hadfield, S.J., Quílez, J., Soilán, M., López, C., Panadero, R., Díez-Baños, P., Morrondo, P., Chalmers, R.M., 2012. Assessment of three methods for multilocus fragment typing of Cryptosporidium parvum from domestic ruminants in north west Spain. Vet. Parasitol. 186, 188-195. doi:10.1016/J.VETPAR.2011.11.039 Díaz, P., Navarro, E., Prieto, A., Pérez-Creo, A., Viña, M., Díaz-Cao, J.M., López, C.M., Panadero, R., Fernández, G., Díez-Baños, P., Morrondo, P., 2018a. Cryptosporidium species in post-weaned and adult sheep and goats from N.W. Spain: Public and animal health significance. Vet. Parasitol. 254, 1-5. doi:10.1016/J.VETPAR.2018.02.040 Díaz, P., Navarro, E., Remesar, S., García-Dios, D., Martínez-Calabuig, N., Prieto, A., LópezLorenzo, G., López, C.M., Panadero, R., Fernández, G., Díez-Baños, P., Morrondo, P., 2021. The Age-Related Cryptosporidium Species Distribution in Asymptomatic Cattle from NorthWestern Spain. Animals 11, 256. doi:10.3390/ANI11020256 Díaz, P., Pedreira García, J., Morrondo, P., Díez-Baños, P., López, C., Panadero, R., Fernández, G., Prieto, A., Remesar, S., Díaz-Cao, J.M., López-Lorenzo, G., 2019. Servet Update: Diarrea Neonatal en Terneros. Servet, Zaragoza, España. Díaz, P., Quílez, J., Chalmers, R.M., Panadero, R., López, C., Sánchez-Acedo, C., Morrondo, P., Díez-Baños, P., 2010. Genotype and subtype analysis of Cryptosporidium isolates from calves and lambs in Galicia (NW Spain). Parasitology 137, 1187-1193. doi:10.1017/S0031182010000181 Díaz, P., Quílez, J., Prieto, A., Navarro, E., Pérez-Creo, A., Fernández, G., Panadero, R., López, C., DíezBaños, P., Morrondo, P., 2015. Cryptosporidium species and subtype analysis in diarrhoeic preweaned lambs and goat kids from north-western Spain. Parasitol. Res. 114, 4099-4105. doi:10.1007/S00436-015-4639-0/TABLES/1 Díaz, P., Varcasia, A., Pipia, A.P., Tamponi, C., Sanna, G., Prieto, A., Ruiu, A., Spissu, P., Díez-Baños, P., Morrondo, P., Scala, A., 2018b. Molecular characterisation and risk factor analysis of Cryptosporidium spp. in calves from Italy. Parasitol. Res. 117, 3081-3090. doi:10.1007/S00436-018-6000-X Directiva 2003/99/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 17 de noviembre de 2003, sobre la vigilancia de las zoonosis y de los agentes zoonóticos y por la que se modifica la Decisión 90/424/CEE del Consejo y se deroga la Directiva 92/117/CEE del Consejo. Diario Oficial de la Unión Europea L 325, 31. Donahue, M., Godden, S.M., Bey, R., Wells, S., Oakes, J.M., Sreevatsan, S., Stabel, J., Fetrow, J., 2012. Heat treatment of colostrum on commercial dairy farms decreases colostrum microbial counts while maintaining colostrum immunoglobulin G concentrations. J. Dairy Sci. 95, 2697-2702. doi:10.3168/jds.2011-5220 Donaldson, S.C., Straley, B.A., Hegde, N. V., Sawant, A.A., DebRoy, C., Jayarao, B.M., 2006. Molecular epidemiology of ceftiofur-resistant Escherichia coli isolates from dairy calves. Appl. Environ. Microbiol. 72, 3940-3948. doi:10.1128/AEM.02770-05/FORMAT/EPUB Donnenberg, M.S., Finlay, B.B., 2013. Combating enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) infections: The way forward. Trends Microbiol. 21, 317-319. doi:10.1016/j.tim.2013.05.003 Donovan, G.A., Dohoo, I.R., Montgomery, D.M., Bennett, F.L., 1998. Associations between passive immunity and morbidity and mortality in dairy heifers in Florida, USA. Prev. Vet. Med. 34, 31-46. doi:10.1016/S0167-5877(97)00060-3 Doran, D.J., Farr, M.M., 1962. Excystation of the Poultry Coccidium, Eimeria acervulina. J. Protozool. 19, 154-161. Drackley, J.K., 2008. Calf Nutrition from Birth to Breeding. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 24, 55-86. doi:10.1016/J.CVFA.2008.01.001 Dubreuil, J.D., Isaacson, R.E., Schifferli, D.M., 2016. Animal Enterotoxigenic Escherichia coli. EcoSal Plus 7, 1-47. doi:10.1128/ECOSALPLUS.ESP0006-2016 Duckmanton, L.M., Carman, S., Nagy, É., Petric, M., 1998a. Detection of bovine torovirus in fecal specimens of calves with diarrhea from Ontario REFERENCIAS 271 farms. J. Clin. Microbiol. 36, 1266-1270. doi:10.1128/JCM.36.5.1266-1270.1998 Duckmanton, L.M., Tellier, R., Liu, P., Petric, M., 1998b. Bovine torovirus: Sequencing of the structural genes and expression of the nucleocapsid protein of Breda virus. Virus Res. 58, 83-96. Duquesne, S., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., Rebuffat, S., 2007. Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria. Nat. Prod. Rep. 24, 708-734. doi:10.1039/B516237H Durham, P.J., Johnson, R.H., Isles, H., Parker, R.J., Holroyd, R.G., Goodchild, I., 1985. Epidemiological studies of parvovirus infections in calves on endemically infected properties. Res. Vet. Sci. 38, 234-240. doi:10.1016/s00345288(18)31832-0 Durham, P.J.K., Farquharson, B.C., Stevenson, B.J., 1979. Rotavirus and coronavirus associated diarrohoea in calves. N. Z. Vet. J. 27, 266-272. doi:10.1080/00480169.1979.34669 Duse, A., Waller, K.P., Emanuelson, U., Unnerstad, H.E., Persson, Y., Bengtsson, B., 2015. Risk factors for antimicrobial resistance in fecal Escherichia coli from preweaned dairy calves. J. Dairy Sci. 98, 500-516. doi:10.3168/JDS.20148432 Edwards, S.A., 1982. Factors affecting the time to first suckling in dairy calves. Anim. Sci. 34, 339-346. doi:10.1017/S0003356100010291 Egyed, Z., Sréter, T., Széll, Z., Varga, I., 2003. Characterization of Cryptosporidium spp.— recent developments and future needs. Vet. Parasitol. 111, 103-114. Eibl, C., Bexiga, R., Viora, L., Guyot, H., Félix, J., Wilms, J., Tichy, A., Hund, A., 2021. The antibiotic treatment of calf diarrhea in four european countries: A survey. Antibiotics 10, 910. doi:10.3390/ANTIBIOTICS10080910/S1 Elad, D., Brenner, J., Markovics, A., Yakobson, B., Shlomovitz, S., Basan, J., 1998. Yeasts in the gastrointestinal tract of preweaned calves and possible involvement of Candida glabrata in neonatal calf diarrhea. Mycopathologia 141, 7-14. Eldesoukey, I.E., Elmonir, W., Alouffi, A., Beleta, E.I.M., Kelany, M.A., Elnahriry, S.S., Alghonaim, M.I., alZeyadi, Z.A., Elaadli, H., 2022. Multidrug-Resistant Enteropathogenic Escherichia coli Isolated from Diarrhoeic Calves, Milk, and Workers in Dairy Farms: A Potential Public Health Risk. Antibiotics 11, 999. doi:10.3390/antibiotics11080999 Elizondo-Salazar, J.A., Jayarao, B.M., Heinrichs, A.J., 2010. Effect of heat treatment of bovine colostrum on bacterial counts, viscosity, and immunoglobulin G concentration. J. Dairy Sci. 93, 961-967. doi:10.3168/jds.2009-2388 Ellis, J.A., Hassard, L.E., Cortese, V.S., Morley, P.S., 1996. Effects of perinatal vaccination on humoral and cellular immune responses in cows and young calves. J. Am. Vet. Med. Assoc. 208, 393-400. Elmendorf, H.G., Dawson, S.C., McCaffery, J.M., 2003. The cytoskeleton of Giardia lamblia. Int. J. Parasitol. 33, 3-28. doi:10.1016/S0 Enemark, H.L., Dahl, J., Enemark, J.M.D., 2015. Significance of Timing on Effect of Metaphylactic Toltrazuril Treatment against Eimeriosis in Calves. Parasitol. Res. 114, 201212. doi:10.1007/s00436-015-4526-8 Engelen, F., Thiry, D., Devleesschauwer, B., Heyndrickx, M., Mainil, J., De Zutter, L., Cox, E., 2021. Pathogenic potential of Escherichia coli O157 and O26 isolated from young Belgian dairy calves by recto-anal mucosal swab culturing. J. Appl. Microbiol. 131, 964-972. doi:10.1111/JAM.14909 Enjalbert, F., Lebreton, P., Salat, O., 2006. Effects of copper, zinc and selenium status on performance and health in commercial dairy and beef herds: Retrospective study. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 90, 459-466. doi:10.1111/j.14390396.2006.00627.x Epe, C., Von Samson-Himmelstjerna, G., Wirtherle, N., Von Der Heyden, V., Welz, C., Beening, J., Radeloff, I., Hellmann, K., Schnieder, T., Krieger, K., 2005. Efficacy of toltrazuril as a metaphylactic and therapeutic treatment of coccidiosis in first-year grazing calves. Parasitol. Res. 97, S127. doi:10.1007/s00436-005-1456-x Estes, M.K., Cohen, J., 1989. Rotavirus gene structure and function. Microbiol. Rev. 53, 410-449. Estes, M.K., Greenberg, H.B., 2013. Rotaviruses, en: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, pp. 1347-1401. Etcheverría, A.I., Padola, N.L., 2013. Shiga toxinproducing Escherichia coli. Virulence 4, 366372. doi:10.4161/VIRU.24642 Ewaschuk, J.B., Naylor, J.M., Chirino-Trejo, M., Zello, G.A., 2004. Lactobacillus rhamnosus strain GG CYNTHIA LÓPEZ NOVO 272 is a potential probiotic for calves. Can. J. Vet. Res. 68, 249-253. Faber, J.E., Kollmann, D., Heise, A., Bauer, C., Failing, K., Bürger, H.J., Zahner, H., 2002. Eimeria infections in cows in the periparturient phase and their calves: Oocyst excretion and levels of specific serum and colostrum antibodies. Vet. Parasitol. 104, 1-17. doi:10.1016/S03044017(01)00610-0 Faber, S.N., Faber, N.E., Mccauley, T.C., Ax, R.L., 2005. Case Study: Effects Of Colostrum Ingestion on Lactational Performance. Prof. Anim. Sci. 21, 420-425. doi:10.15232/S10807446(15)31240-7 Fagan, J., Dwyer, P.J., Quinlan, J.F., 1994. The diagnosis and occurrence of enteropathogens associated with calf diarrhea in Ireland. Ir. Vet. J. 47, 313-318. Fagerland, J.A., Pohlenz, J.F.L., Woode, G.N., 1986. A morphological study of the replication of Breda virus (proposed family Toroviridae) in bovine intestinal cells. J. Gen. Virol. 67, 1293-1304. doi:10.1099/0022-1317-67-7-1293 Fantinatti, M., Bello, A.R., Fernandes, O., Da-Cruz, A.M., 2016. Identification of Giardia lamblia Assemblage E in Humans Points to a New Anthropozoonotic Cycle. J. Infect. Dis. 214, 1256-1259. doi:10.1093/INFDIS/JIW361 Fayer, R., 2008. General Biology, en: Fayer, R., Xiao, L. (Eds.), Cryptosporidium and cryptosporidiosis. CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU., pp. 142. Fayer, R., Ellis, W., 1993. Paromomycin is effective as prophylaxis for cryptosporidiosis in dairy calves. J. Parasitol. 79, 771-774. doi:10.2307/3283619 Fayer, R., Gasbarre, L., Pasquali, P., Canals, A., Almeria, S., Zarlenga, D., 1998a. Cryptosporidium parvum infection in bovine neonates: dynamic clinical, parasitic and immunologic patterns. Int. J. Parasitol. 28, 49-56. Fayer, R., Santín, M., Macarisin, D., 2010. Cryptosporidium ubiquitum n. sp. in animals and humans. Vet. Parasitol. 172, 23-32. doi:10.1016/j.vetpar.2010.04.028 Fayer, R., Santín, M., Trout, J.M., 2008. Cryptosporidium ryanae n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus). Vet. Parasitol. 156, 191-198. doi:10.1016/j.vetpar.2008.05.024 Fayer, R., Santin, M., Xiao, L., 2005. Cryptosporidium bovis n. sp (Apicomplexa : Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus). J. Parasitol. 91, 624-629. doi:10.1645/GE-3435 Fayer, R., Trout, J.M., Graczyk, T.K., Lewis, E.J., 2000. Prevalence of Cryptosporidium, Giardia and Eimeria infections in post-weaned and adult cattle on three Maryland farms. Vet. Parasitol. 93, 103112. doi:10.1016/S0304-4017(00)00356-3 Fayer, R., Trout, J.M., Jenkins, M.C., 1998b. Infectivity of Cryptosporidium parvum Oocysts Stored in Water at Environmental Temperatures. J. Parasitol. 84, 1165-1169. doi:10.2307/3284666 Fecteau, G., Van Metre, D.C., Paré, J., Smith, B.P., Higgins, R., Holmberg, C.A., Jang, S., Guterbock, W., 1997. Bacteriological culture of blood from critically ill neonatal calves. Can. Vet. J. 38, 95-100. Feng, Y., Gong, X., Zhu, K., Li, N., Yu, Z., Guo, Y., Weng, Y., Kváč, M., Feng, Y., Xiao, L., 2019. Prevalence and genotypic identification of Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis and Enterocytozoon bieneusi in pre-weaned dairy calves in Guangdong, China. Parasites and Vectors 12, 1-9. doi:10.1186/S13071-019-3310-5 Feng, Y., Ortega, Y., He, G., Das, P., Xu, M., Zhang, X., Fayer, R., Gatei, W., Cama, V., Xiao, L., 2007. Wide geographic distribution of Cryptosporidium bovis and the deer-like genotype in bovines. Vet. Parasitol. 144, 1-9. doi:10.1016/J.VETPAR.2006.10.001 Feng, Y., Xiao, L., 2012. Giardia, en: Liu, D. (Ed.), Molecular detection of human parasitic pathogens. CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU., pp. 77-90. Feng, Y., Xiao, L., 2011. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 110-140. doi:10.1128/CMR.00033-10 Feuerstein, A., Scuda, N., Klose, C., Hoffmann, A., Melchner, A., Boll, K., Rettinger, A., Fell, S., Straubinger, R.K., Riehm, J.M., 2022. Antimicrobial resistance, serologic and molecular characterization of E. coli isolated from calves with severe or fatal enteritis in Bavaria, Germany. Antibiotics 11, 23. doi:10.3390/antibiotics11010023 Follet, J., Guyot, K., Leruste, H., Follet-Dumoulin, A., Hammouma-Ghelboun, O., Certad, G., Dei-Cas, E., Halama, P., 2011. Cryptosporidium infection in a veal calf cohort in France: Molecular characterization of species in a longitudinal study. REFERENCIAS 273 Vet. Res. 42, 1-8. doi:10.1186/1297-9716-42-116 Fossler, C.P., Wells, S.J., Kaneene, J.B., Ruegg, P.L., Warnick, L.D., Bender, J.B., Eberly, L.E., Godden, S.M., Halbert, L.W., 2005. Herd-level factors associated with isolation of Salmonella in a multi-state study of conventional and organic dairy farms: II. Salmonella shedding in calves. Prev. Vet. Med. 70, 279-291. doi:10.1016/J.PREVETMED.2005.04.002 Foster, D.M., Smith, G.W., 2009. Pathophysiology of Diarrhea in Calves. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 25, 13-36. doi:10.1016/j.cvfa.2008.10.013 Foster, N., Berndt, A., 2013. Immunity to Salmonella in farm animals and murine models of disease., en: Barrow, P., Methner, U. (Eds.), Salmonella in domestic animals. CAB International, Wallingford, Reino Unido, pp. 136-161. doi:10.1079/9781845939021.0136 Fox, J., Weisberg, S., 2019. An R Companion to Applied Regression, 3rd ed. SAGE Publications. Francis, D.H., Allen, S.D., White, R.D., 1989. Influence of bovine intestinal fluid on the expression of K99 pili by Escherichia coli. Am. J. Vet. Res. 50, 822826. Franck, S.M., Bosworth, B.T., Moon, H.W., 1998. Multiplex PCR for enterotoxigenic, attaching and effacing, and shiga toxin-producing Escherichia coli strains from calves. J. Clin. Microbiol. 36, 1795-1797. doi:10.1128/JCM.36.6.17951797.1998 Frank, N.A., Kaneene, J.B., 1993. Management Risk Factors Associated with Calf Diarrhea in Michigan Dairy Herds. J. Dairy Sci. 76, 13131323. doi:10.3168/jds.S0022-0302(93)77462-7 Franzén, O., Jerlström-Hultqvist, J., Castro, E., Sherwood, E., Ankarklev, J., Reiner, D.S., Palm, D., Andersson, J.O., Andersson, B., Svärd, S.G., 2009. Draft Genome Sequencing of Giardia intestinalis Assemblage B Isolate GS: Is Human Giardiasis Caused by Two Different Species? PLOS Pathog. 5, e1000560. doi:10.1371/JOURNAL.PPAT.1000560 Friend, S.C.E., Stockdale, P.H.G., 1980. Experimental Eimeria bovis infection in calves: A histopathological study. Can. J. Comp. Med. 44, 129-140. Fritzen, J.T.T., Oliveira, M. V., Lorenzetti, E., Miyabe, F.M., Viziack, M.P., Rodrigues, C.A., Ayres, H., Alfieri, A.F., Alfieri, A.A., 2019. Longitudinal surveillance of rotavirus A genotypes circulating in a high milk yield dairy cattle herd after the introduction of a rotavirus vaccine. Vet. Microbiol. 230, 260-264. doi:10.1016/J.VETMIC.2019.02.022 Fujino, T., Matsui, T., Kobayashi, F., Haruki, K., Yoshino, Y., Kajima, J., Tsuji, M., 2002. The effect of heating against Cryptosporidium oocysts. J. Vet. Med. Sci. 64, 199-200. doi:Doi 10.1292/Jvms.64.199 Furman-Fratczak, K., Rzasa, A., Stefaniak, T., 2011. The influence of colostral immunoglobulin concentration in heifer calves’ serum on their health and growth. J. Dairy Sci. 94, 5536-5543. doi:10.3168/jds.2010-3253 García-Meniño, I., Díaz, P., Gómez, V., Prieto, A., Fernández, G., Díez-Baños, P., Morrondo, P., Mora, A., 2015. Estudio de prevalencia de enteropatógenos implicados en la diarrea del ternero en Galicia. Boletín de ANEMBE 108, 3337. García-Presedo, I., Pedraza-Díaz, S., González-Warleta, M., Mezo, M., Gómez-Bautista, M., OrtegaMora, L.M., Castro-Hermida, J.A., 2013. Presence of Cryptosporidium scrofarum, C. suis and C. parvum subtypes IIaA16G2R1 and IIaA13G1R1 in Eurasian wild boars (Sus scrofa). Vet. Parasitol. 196, 497-502. doi:10.1016/J.VETPAR.2013.04.017 Garcia-R, J.C., Ogbuigwe, P., Pita, A.B., Velathanthiri, N., Knox, M.A., Biggs, P.J., French, N.P., Hayman, D.T.S., 2021. First report of novel assemblages and mixed infections of Giardia duodenalis in human isolates from New Zealand. Acta Trop. 220, 105969. doi:10.1016/J.ACTATROPICA.2021.105969 García, A., Ruiz-Santa-Quiteria, J.A., Orden, J.A., Cid, D., Sanz, R., Gómez-Bautista, M., De La Fuente, R., 2000. Rotavirus and concurrent infections with other enteropathogens in neonatal diarrheic dairy calves in Spain. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 23, 175-183. doi:10.1016/S0147-9571(99)00071-5 Garro, C.J., Morici, G.E., Tomazic, M.L., Vilte, D., Encinas, M., Vega, C., Bok, M., Parreño, V., Schnittger, L., 2021. Occurrence of Cryptosporidium and other enteropathogens and their association with diarrhea in dairy calves of Buenos Aires province, Argentina. Vet. Parasitol. Reg. Stud. Reports 24, 100567. doi:10.1016/j.vprsr.2021.100567 Garthwaite, B.D., Drackley, J.K., McCoy, G.C., Jaster, E.H., 1994. Whole Milk and Oral Rehydration Solution for Calves with Diarrhea of Spontaneous CYNTHIA LÓPEZ NOVO 274 Origin. J. Dairy Sci. 77, 835-843. doi:10.3168/jds.S0022-0302(94)77018-1 Gelsinger, S.L., Gray, S.M., Jones, C.M., Heinrichs, A.J., 2014. Heat treatment of colostrum increases immunoglobulin G absorption efficiency in high- , medium-, and low-quality colostrum. J. Dairy Sci. 97, 2355-2360. doi:10.3168/jds.2013-7374 Geurden, T., Berkvens, D., Martens, C., Casaert, S., Vercruysse, J., Claerebout, E., 2007. Molecular epidemiology with subtype analysis of Cryptosporidium in calves in Belgium. Parasitology 134, 1981-1987. doi:10.1017/S0031182007003460 Geurden, T., Claerebout, E., Dursin, L., Deflandre, A., Bernay, F., Kaltsatos, V., Vercruysse, J., 2006a. The efficacy of an oral treatment with paromomycin against an experimental infection with Giardia in calves. Vet. Parasitol. 135, 241247. doi:10.1016/j.vetpar.2005.09.006 Geurden, T., Olson, M.E., 2011. Giardia in Pets and Farm Animals, and Their Zoonotic Potential, en: Luján, H.D., Svärd, S. (Eds.), Giardia: A Model Organism. Springer-Verlag, Viena, Austria, pp. 71-92. Geurden, T., Vandenhoute, E., Pohle, H., Casaert, S., De Wilde, N., Vercruysse, J., Claerebout, E., 2010a. The effect of a fenbendazole treatment on cyst excretion and weight gain in calves experimentally infected with Giardia duodenalis. Vet. Parasitol. 169, 18-23. doi:10.1016/j.vetpar.2009.12.027 Geurden, T., Vercruysse, J., Claerebout, E., 2010b. Is Giardia a significant pathogen in production animals? Exp. Parasitol. 124, 98-106. doi:10.1016/J.EXPPARA.2009.03.001 Geurden, T., Vercruysse, J., Claerebout, E., 2006b. Field testing of a fenbendazole treatment combined with hygienic and management measures against a natural Giardia infection in calves. Vet. Parasitol. 142, 367-371. doi:10.1016/j.vetpar.2006.07.019 Ghanem, M.M., Radwaan, M.E., Moustafa, A.M.M., Ebeid, M.H., 2008. Comparative therapeutic effect of toltrazuril, sulphadimidine and amprolium on Eimeria bovis and Eimeria zuernii given at different times following infection in buffalo calves (Bubalus bubalis). Prev. Vet. Med. 84, 161-170. doi:10.1016/j.prevetmed.2007.12.013 Giannella, R.A., Mann, E.A., 2003. E. coli heat-stable enterotoxin and guanylyl cyclase C: new functions and unsuspected actions. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 114, 67-85; discussion 856. Gillhuber, J., Rügamer, D., Pfister, K., Scheuerle, M.C., 2014. Giardiosis and other enteropathogenic infections: A study on diarrhoeic calves in Southern Germany. BMC Res. Notes 7, 1-9. doi:10.1186/1756-0500-7-112 Girard, F., Dziva, F., Stevens, M.P., Frankelt, G., 2009. Interactions of typical and atypical enteropathogenic Escherichia coli strains with the calf intestinal mucosa ex vivo. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5991-5995. doi:10.1128/AEM.01170-09 Girardeau, J.P., Der Vartanian, M., Ollier, J.L., Contrepois, M., 1988. CS31A, a new K88-related fimbrial antigen on bovine enterotoxigenic and septicemic Escherichia coli strains. Infect. Immun. 56, 2180-2188. Glombowsky, P., da Silva, A.S., Volpato, A., Soldá, N.M., Campigotto, G., Galli, G.M., Fávero, J.F., da Silva Santos, D., Machado, G., 2017. Relation between diarrhea and infection by protozoans in dairy calves. Comp. Clin. Path. 26, 929-933. doi:10.1007/s00580-017-2467-6 Godden, S.M., 2008. Colostrum Management for Dairy Calves. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. doi:10.1016/j.cvfa.2007.10.005 Godden, S.M., Haines, D.M., Hagman, D., 2009. Improving passive transfer of immunoglobulins in calves. I: dose effect of feeding a commercial colostrum replacer. J. Dairy Sci. 92, 1750-1757. doi:10.3168/JDS.2008-1846 Godden, S.M., Smith, S., Feirtag, J.M., Green, L.R., Wells, S.J., Fetrow, J.P., 2003. Effect of On-Farm Commercial Batch Pasteurization of Colostrum on Colostrum and Serum Immunoglobulin Concentrations in Dairy Calves. J. Dairy Sci. 86, 1503-1512. doi:10.3168/JDS.S00220302(03)73736-9 Godden, S.M., Smolenski, D.J., Donahue, M., Oakes, J.M., Bey, R., Wells, S., Sreevatsan, S., Stabel, J., Fetrow, J., 2012. Heat-treated colostrum and reduced morbidity in preweaned dairy calves: Results of a randomized trial and examination of mechanisms of effectiveness. J. Dairy Sci. 95, 4029-4040. doi:10.3168/jds.2011-5275 Göhring, F., Lendner, M., Daugschies, A., 2022. Distribution of Cryptosporidium parvum subgenotypes in pre-weaned calves in Germany. Vet. Parasitol. Reg. Stud. Reports 36, 100806. doi:10.1016/J.VPRSR.2022.100806 REFERENCIAS 275 Göhring, F., Möller-Holtkamp, P., Daugschies, A., Lendner, M., 2014. Co-infections with Cryptosporidium parvum and other enteropathogenes support the occurrence and severity of diarrhoea in suckling calves. Tierarztl. Umsch. 69, 112-120. Gomes Rocha, T., Dornelas, F., Silva, F., Gregori, F., Amauri, &, Alfieri, A., Da, M., Buzinaro, G., Fagliari, J.J., 2017. Longitudinal study of bovine rotavirus group A in newborn calves from vaccinated and unvaccinated dairy herds. Trop. Anim. Health Prod. 49, 783-790. doi:10.1007/s11250-017-1263-2 Gomez, D.E., Arroyo, L.G., Poljak, Z., Viel, L., Weese, J.S., 2017. Detection of Bovine Coronavirus in Healthy and Diarrheic Dairy Calves. J. Vet. Intern. Med. 31, 1884-1891. doi:10.1111/jvim.14811 Gomez, D.E., Weese, J.S., 2017. Viral enteritis in calves. Can. Vet. J. 58, 1267-1274. Gonggrijp, M.A., Santman-Berends, I.M.G.A., Heuvelink, A.E., Buter, G.J., van Schaik, G., Hage, J.J., Lam, T.J.G.M., 2016. Prevalence and risk factors for extended-spectrum β-lactamaseand AmpC-producing Escherichia coli in dairy farms. J. Dairy Sci. 99, 9001-9013. doi:10.3168/JDS.2016-11134 González, J.M., Gomez-Puertas, P., Cavanagh, D., Gorbalenya, A.E., Enjuanes, L., 2003. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. Arch. Virol. González, J.V., Astiz, S., 2005. Diarreas en el ternero neonato. Servet, Zaragoza, España. Gonzalez, R., Elvira, L., Carbonell, C., Vertenten, G., Fraile, L., 2021. The specific immune response after vaccination against neonatal calf diarrhoea differs between apparent similar vaccines in a case study. Animals 11, 1238. doi:10.3390/ani11051238 Goossens, E., Valgaeren, B.R., Pardon, B., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Deprez, P.R., Van Immerseel, F., 2017. Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens-associated enteric diseases: a review on bovine necrohaemorrhagic enteritis. Vet. Res. 48, 9. doi:10.1186/s13567-017-0413-x Gow, S., Waldner, C., 2006. An examination of the prevalence of and risk factors for shedding of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in cows and calves from western Canadian cow-calf herds. Vet. Parasitol. 137, 50-61. doi:10.1016/j.vetpar.2005.05.071 Graczyk, T.K., Fayer, R., Knight, R., MhangamiRuwende, B., Trout, J.M., Da Silva, A.J., Pieniazek, N.J., 2000. Mechanical transport and transmission of Cryptosporidium parvum oocysts by wild filth flies. Am. J. Trop. Med. Hyg. 63, 178-183. doi:10.4269/ajtmh.2000.63.178 Graham, D.Y., Sackman, J.W., Estes, M.K., 1984. Pathogenesis of rotavirus-induced diarrhea - Preliminary studies in miniature swine piglet. Dig. Dis. Sci. 29, 1028-1035. doi:10.1007/BF01311255 Green, K.Y., 2013. Caliciviridae: The Noroviruses, en: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, EE.UU., pp. 582-608. Griffith, D.M., Veech, J.A., Marsh, C.J., 2016. Cooccur: Probabilistic species co-occurrence analysis in R. J. Stat. Softw. 69, 1-17. doi:10.18637/jss.v069.c02 Grimont, P.A.D., Weill, F.-X., 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. doi:10.1038/nature12153 Grinberg, A., Lopez-Villalobos, N., Markovics, A., Kosak, A., Galindez, J., Tranquillo, V.M., 2002. Controlling the onset of natural cryptosporidiosis in calves with paromomycin sulphate. Vet. Rec. 151, 606-608. doi:10.1136/vr.151.20.606 Grove-White, D.H., 2004. A rational approach to treatment of calf diarrhoea. Ir. Vet. J. 57, 722-728. Güler, L., Gündüz, K., Ok, Ü., 2008. Virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from calves in Turkey. Zoonoses Public Health 55, 249-257. doi:10.1111/J.18632378.2008.01121.X Gulliksen, S.M., Jor, E., Lie, K.I., Hamnes, I.S., Løken, T., Åkerstedt, J., Østerås, O., 2009. Enteropathogens and risk factors for diarrhea in Norwegian dairy calves. J. Dairy Sci. 92, 50575066. Gulliksen, S.M., Lie, K.I., Sølverød, L., Østerås, O., 2008. Risk Factors Associated with Colostrum Quality in Norwegian Dairy Cows. J. Dairy Sci. 91, 704-712. doi:10.3168/JDS.2007-0450 Gunn, G.J., Hall, M., Low, J.C., 2003. Comparison of antibiotic resistance for Escherichia coli populations isolated from groups of diarrhoeic and control valves. Vet. J. 165, 172-174. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 276 doi:10.1016/S1090-0233(02)00244-7 Guo, Z., He, Q., Zhang, B., Yue, H., Tang, C., 2019. Detection and molecular characteristics of neboviruses in dairy cows in China. J. Gen. Virol. 100, 35-45. doi:10.1099/JGV.0.001172 Gutiérrez-Escolano, A.L., 2014. Host-cell factors involved in the calicivirus replicative cycle. Future Virol. 9, 147-160. Gyles, C.L., 2007. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 85, E45-E62. doi:10.2527/jas.2006-508 Gyles, C.L., Fairbrother, J.M., 2010. Escherichia coli, en: Gyles, C.L., Prescott, J.F., Songer, G., Thoen, C.O. (Eds.), Pathogenesis of bacterial infections in animals. Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, EE.UU., pp. 267-308. Habets, A., Engelen, F., Duprez, J.N., Devleesschauwer, B., Heyndrickx, M., De Zutter, L., Thiry, D., Cox, E., Mainil, J., 2020. Identification of Shigatoxigenic and Enteropathogenic Escherichia coli Serotypes in Healthy Young Dairy Calves in Belgium by Recto-Anal Mucosal Swabbing. Vet. Sci. 7, 167. doi:10.3390/VETSCI7040167 Hackstein, J.H.P., Mackenstedt, U., Mehlhorn, H., Meijerink, J.P.P., Schubert, H., Leunissen, J.A.M., 1995. Parasitic apicomplexans harbor a chlorophyll a-D1 complex, the potential target for therapeutic triazines. Parasitol. Res. 81, 207-216. doi:10.1007/BF00937111 Hailu, A.W., Degarege, A., Adamu, H., Costa, D., Villier, V., Mouhajir, A., Favennec, L., Razakandrainibe, R., Petros, B., 2021. Molecular characterization of Cryptosporidium spp. from humans in Ethiopia. PLoS One 16, e0253186. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0253186 Halaihel, N., Liévin, V., Ball, J.M., Estes, M.K., Alvarado, F., Vasseur, M., 2000. Direct Inhibitory Effect of Rotavirus NSP4(114-135) Peptide on the Na+-Glucose Symporter of Rabbit Intestinal Brush Border Membrane. J. Virol. 74, 9464-9470. doi:10.1128/JVI.74.20.9464-9470.2000 Hall, G.A., 1987. Comparative pathology of infection by novel diarrhoea viruses, en: Novel Diarrhoea Viruses. Ciba Foundation symposium No 128. John Wiley & Sons, Chichester, Reino Unido, pp. 192-217. doi:10.1136/jcp.40.12.1490-b Hall, G.A., Reynolds, D.J., Parsons, K.R., Bland, A.P., Morgan, J.H., 1988. Pathology of calves with diarrhoea in southern Britain. Res. Vet. Sci. 45, 240-250. doi:10.1016/S0034-5288(18)30939-1 Hamid, P.H., Hirzmann, J., Kerner, K., Gimpl, G., Lochnit, G., Hermosilla, C.R., Taubert, A., 2015. Eimeria bovis infection modulates endothelial host cell cholesterol metabolism for successful replication. Vet. Res. 46, 100-117. doi:10.1186/s13567-015-0230-z Hammer, C.J., Quigley, J.D., Ribeiro, L., Tyler, H.D., 2004. Characterization of a colostrum replacer and a colostrum supplement containing IgG concentrate and growth factors. J. Dairy Sci. 87, 106-111. doi:10.3168/jds.S0022-0302(04)731471 Hariharan, H., Coles, M., Poole, D., Page, R., 2004. Antibiotic resistance among enterotoxigenic Escherichia coli from piglets and calves from piglets and calves with diarrhea. Can. Vet. J. 45, 605. Harp, J.A., Jardon, P., Atwill, E.R., Zylstra, M., Checel, S., Goff, J.P., De Simone, C., 1996. Field testing of prophylactic measures against Cryptosporidium parvum infection in calves in a California dairy herd. Am. J. Vet. Res. 57, 15861588. Haschek, B., Klein, D., Benetka, V., Herrera, C., Sommerfeld-Stur, I., Vilcek, Š., Moestl, K., Baumgartner, W., 2006. Detection of bovine torovirus in neonatal calf diarrhoea in Lower Austria and Styria (Austria). J. Vet. Med. Ser. B Infect. Dis. Vet. Public Heal. 53, 160-165. doi:10.1111/J.1439-0450.2006.00936.X Hasoksuz, M., Sreevatsan, S., Cho, K., Hoet, A.E., Saif, L.J., 2002. Molecular analysis of the S1 subunit of the spike glycoprotein of respiratory and enteric bovine coronavirus isolates. Virus Res. 84, 101-109. Hassine-Zaafrane, M., Kaplon, J., Sdiri-Loulizi, K., Aouni, Z., Pothier, P., Aouni, M., Ambert-Balay, K., 2012. Molecular prevalence of bovine noroviruses and neboviruses detected in centraleastern Tunisia. Arch. Virol. 157, 1599-1604. doi:10.1007/S00705-012-1344-5 Hatalová, E., Valenčáková, A., Luptáková, L., Špalková, M., Kalinová, J., Halánová, M., Bednárová, V., Gabzdilová, J., Dedinská, K., Ondriska, F., Boldiš, V., 2019. The first report of animal genotypes of Cryptosporidium parvum in immunosuppressed and immunocompetent humans in Slovakia. Transbound. Emerg. Dis. 66, 243-249. doi:10.1111/TBED.13009 Hawkins, A., Burdine, K., Amaral-Phillips, D., Costa, J.H.C., 2019. An economic analysis of the costs associated with pre-weaning management strategies for dairy heifers. Animals 9, 471. REFERENCIAS 277 doi:10.3390/ani9070471 Heine, J., 1982. Eine einfache Nachweismethode für Kryptosporidien im Kot [A simple technique for the demonstration of cryptosporidia in feces]. Zentralblatt fur Vet. R. B. 29, 324-327. Heinrichs, A.J., Radostits, O.M., 2001. Health and Production Management of Dairy Calves and Replacement Heifers, en: Radostits, O.M. (Ed.), Herd health: Food Animal Production Medicine. Saunders, Filadelfia, Pensilvania, EE.UU., pp. 333-473. Heller, M.C., Chigerwe, M., 2018. Diagnosis and Treatment of Infectious Enteritis in Neonatal and Juvenile Ruminants. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 34, 101-117. doi:10.1016/j.cvfa.2017.08.001 Hendrix, C.M., Robinson, E., 2022. Diagnostic Parasitology for Veterinary Technicians, 6a. ed. Mosby Inc., St. Louis, Misuri, EE.UU. Henriksen, S.A., Pohlenz, J.F., 1981. Staining of cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique. Acta Vet. Scand. 22, 594-596. Hodnik, J.J., Acinger-Rogić, Ž., Alishani, M., Autio, T., Balseiro, A., Berezowski, J., Carmo, L.P., Chaligiannis, I., Conrady, B., Costa, L., Cvetkovikj, I., Davidov, I., Dispas, M., Djadjovski, I., Duarte, E.L., Faverjon, C., Fourichon, C., Frössling, J., Gerilovych, A., Gethmann, J., Gomes, J., Graham, D., Guelbenzu, M., Gunn, G.J., Henry, M.K., Hopp, P., Houe, H., Irimia, E., Ježek, J., Juste, R.A., Kalaitzakis, E., Kaler, J., Kaplan, S., Kostoulas, P., Kovalenko, K., Kneževič, N., Knific, T., Koleci, X., Madouasse, A., Malakauskas, A., Mandelik, R., Meletis, E., Mincu, M., Mõtus, K., MuñozGómez, V., Niculae, M., Nikitović, J., Ocepek, M., Tangen-Opsal, M., Ózsvári, L., Papadopoulos, D., Papadopoulos, T., Pelkonen, S., Polak, M.P., Pozzato, N., Rapaliuté, E., Ribbens, S., Niza-Ribeiro, J., Roch, F.F., Rosenbaum Nielsen, L., Saez, J.L., Nielsen, S.S., van Schaik, G., Schwan, E., Sekovska, B., Starič, J., Strain, S., Šatran, P., Šerić-Haračić, S., Tamminen, L.M., Thulke, H.H., Toplak, I., Tuunainen, E., Verner, S., Vilček, Š., Yildiz, R., Santman-Berends, I.M.G.A., 2021. Overview of Cattle Diseases Listed Under Category C, D or E in the Animal Health Law for Which Control Programmes Are in Place Within Europe. Front. Vet. Sci. 8, 688078. doi:10.3389/fvets.2021.688078 Hoet, A.E., Cho, K.O., Chang, K.O., Loerch, S.C., Wittum, T.E., Saif, L.J., 2002. Enteric and nasal shedding of bovine torovirus (Breda virus) in feedlot cattle. Am. J. Vet. Res. 63, 342-348. doi:10.2460/AJVR.2002.63.342 Hoet, A.E., Nielsen, P.R., Hasoksuz, M., Thomas, C., Wittum, T.E., Saif, L.J., 2003a. Detection of bovine torovirus and other enteric pathogens in feces from diarrhea cases in cattle. J. Vet. Diagnostic Investig. 15, 205-212. doi:10.1177/104063870301500301 Hoet, A.E., Saif, L.J., 2004. Bovine torovirus (Breda virus) revisited. Anim. Heal. Res. Rev. 5, 157171. Hoet, A.E., Smiley, J., Thomas, C., Nielsen, P.R., Wittum, T.E., Saif, L.J., 2003b. Association of enteric shedding of bovine torovirus (Breda virus) and other enteropathogens with diarrhea in veal calves. Am. J. Vet. Res. 64, 485-490. doi:10.2460/AJVR.2003.64.485 Hoey, D.E.E., Currie, C., Roderick, W.E., Nutikka, A., Lingwood, C.A., Gally, D.L., Smith, D.G.E., 2002. Expression of receptors for verotoxin 1 from Escherichia coli O157 on bovine intestinal epithelium. J. Med. Microbiol. 51, 143-149. doi:10.1099/0022-1317-51-2-143 Hoey, D.E.E., Sharp, L., Currie, C., Lingwood, C.A., Gally, D.L., Smith, D.G.E., 2003. Verotoxin 1 binding to intestinal crypt epithelial cells results in localization to lysosomes and abrogation of toxicity. Cell. Microbiol. 5, 85-97. Holland, R.E., 1990. Some Infectious Causes of Diarrhea in Young Farm Animals. Clin. Microbiol. Rev. 3, 345-375. Holland, R.E., Bezek, D.M., Sprecher, D.J., Patterson, J.S., Steficek, B.A., Trapp, A.L., 1993. Investigation of an epizootic of bovine viral diarrhea virus infection in calves. J. Am. Vet. Med. Assoc. 202, 1849–1854. Holland, R.E., Herdt, T.H., Refsal, K.R., 1986. Breath hydrogen concentration and small intestinal malabsorption in calves. Am. J. Vet. Res. 47, 2020-2024. Holschbach, C.L., Peek, S.F., 2018. Salmonella in Dairy Cattle. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. doi:10.1016/j.cvfa.2017.10.005 Holzhausen, I., Lendner, M., Göhring, F., Steinhöfel, I., Daugschies, A., 2019. Distribution of Cryptosporidium parvum gp60 subtypes in calf herds of Saxony, Germany. Parasitol. Res. 118, 1549-1558. doi:10.1007/s00436-019-06266-1 Homem, C.G., Nakamura, A.A., Silva, D.C., Teixeira, W.F.P., Coelho, W.M.D., Meireles, M. V., 2012. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 278 Real-time PCR assay targeting the actin gene for the detection of Cryptosporidium parvum in calf fecal samples. Parasitol. Res. 110, 1741-1745. doi:10.1007/S00436-011-2694-8/TABLES/3 Homerosky, E.R., Caulkett, N.A., Timsit, E., Pajor, E.A., Kastelic, J.P., Windeyer, M.C., 2017. Clinical indicators of blood gas disturbances, elevated L-lactate concentration and other abnormal blood parameters in newborn beef calves. Vet. J. 219, 49-57. doi:10.1016/J.TVJL.2016.12.001 Hooper, D.C., Jacoby, G.A., 2015. Mechanisms of drug resistance: Quinolone resistance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1354, 12-31. doi:10.1111/NYAS.12830 Hooshmand-Rad, P., Svensson, C., Uggla, A., 1994. Experimental Eimeria alabamensis infection in calves. Vet. Parasitol. 53, 23-32. doi:10.1016/0304-4017(94)90013-2 Hopkins, K.L., Davies, R.H., Threlfall, E.J., 2005. Mechanisms of quinolone resistance in Escherichia coli and Salmonella: Recent developments. Int. J. Antimicrob. Agents 25, 358373. doi:10.1016/J.IJANTIMICAG.2005.02.006 Horzinek, M.C., Weiss, M., 1984. Toroviridae: a taxonomic proposal. Zentralblatt für Veterinärmedizin R. B 31, 649-659. Horzinek, M.C., Weiss, M., Ederveen, J., 1987. Toroviridae: a proposed new family of enveloped RNA viruses., en: Brock, G.R., Whelan, J. (Eds.), Novel Diarrhoea Viruses. Ciba Foundation symposium No 128. John Wiley & Sons, Chichester, Reino Unido, pp. 162-174. House, J.K., Smith, G.W., McGuirk, S.M., Gunn, A.A., Izzo, M., 2015. Manifestations and Management of Disease in Neonatal Ruminants, en: Smith, B.P. (Ed.), Large Animal Internal Medicine. Elsevier Inc., St. Louis, Misuri, EE.UU., pp. 302338. Hrala, M., Bosák, J., Micenková, L., Křenová, J., Lexa, M., Pirková, V., Tomáštíková, Z., Koláčková, I., Šmajs, D., 2021. Escherichia coli Strains Producing Selected Bacteriocins Inhibit Porcine Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) under both In Vitro and In Vivo Conditions. Appl. Environ. Microbiol. 87. doi:10.1128/AEM.03121-20 Huang, D.B., White, A.C., 2006. An Updated Review on Cryptosporidium and Giardia. Gastroenterol. Clin. North Am. 35, 291-314. doi:10.1016/j.gtc.2006.03.006 Hublin, J.S.Y., Maloney, J.G., George, N.S., Molokin, A., Lombard, J.E., Urie, N.J., Shivley, C.B., Santin, M., 2022. Enhanced detection of Giardia duodenalis mixed assemblage infections in preweaned dairy calves using next generation sequencing. Vet. Parasitol. 304, 109702. doi:10.1016/j.vetpar.2022.109702 Huetink, R.E.C., Van der Giessen, J.W.B., Noordhuizen, J.P.T.M., Ploeger, H.W., 2001. Epidemiology of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis on a dairy farm. Vet. Parasitol. 102, 53-67. doi:10.1016/S0304-4017(01)00514-3 Hulbert, L.E., Moisá, S.J., 2016. Stress, immunity, and the management of calves. J. Dairy Sci. 99, 31993216. doi:10.3168/JDS.2015-10198 Hur, T.-Y., Jung, Y.-H., Choe, C.-Y., Cho, Y.-I., Kang, S.-J., Lee, H.-J., Ki, K.-S., Baek, K.-S., Suh, G.- H., 2013. The dairy calf mortality: the causes of calf death during ten years at a large dairy farm in Korea. Korean J. Vet. Res. 53, 103-108. Imre, K., Lobo, L.M., Matos, O., Popescu, C., Genchi, C., Dǎrǎbuş, G., 2011. Molecular characterisation of Cryptosporidium isolates from pre-weaned calves in Romania: Is there an actual risk of zoonotic infections? Vet. Parasitol. 181, 321-324. doi:10.1016/J.VETPAR.2011.04.042 Instituto Galego de Estatística, 2020a. Contas económicas anuais 2019. Instituto Galego de Estatística, 2020b. Número de explotacións segundo a tipoloxía. Galicia e provincias. Ano 2019. Instituto Nacional de Estadística, 2020. Contabilidad nacional trimestral de España. Iqbal, A., Lim, Y.A.L., Surin, J., Sim, B.L.H., 2012. High Diversity of Cryptosporidium Subgenotypes Identified in Malaysian HIV/AIDS Individuals Targeting gp60 Gene. PLoS One 7, e31139. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0031139 Isegawa, Y., Nakagomi, O., Nakagomi, T., Ishida, S., Uesugi, S., Ueda, S., 1993. Determination of bovine rotavirus G and P serotypes by polymerase chain reaction. Mol. Cell. Probes 7, 277-284. doi:10.1006/MCPR.1993.1041 Iwashita, H., Sugamoto, T., Takemura, T., Tokizawa, A., Vu, T.D., Nguyen, T.H., Pham, T.D., Tran, N.L., Doan, H.T., Pham, A.H.Q., Yamashiro, T., 2021. Molecular epidemiology of Giardia spp. in northern Vietnam: Potential transmission between animals and humans. Parasite Epidemiol. Control 12, e00193. doi:10.1016/J.PAREPI.2020.E00193 REFERENCIAS 285 Virol. 156, 1397-1413. Matthijnssens, J., Desselberger, U., 2012. Genome Diversity and Evolution of Rotaviruses, en: Hacker, J., Dobrindt, U., Kurth, R. (Eds.), Genome Plasticity and Infectious Diseases. ASM Press, Washington D.C., EE.UU., pp. 214-241. Maunsell, F., Donovan, G.A., 2008. Biosecurity and Risk Management for Dairy Replacements. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 24, 155-190. doi:10.1016/j.cvfa.2007.10.007 Mauroy, A., Gillet, L., Mathijs, E., Vanderplasschen, A., Thiry, E., 2011. Alternative attachment factors and internalization pathways for GIII.2 bovine noroviruses. J. Gen. Virol. 92, 1398-1409. doi:10.1099/vir.0.030072-0 Mauroy, A., Scipioni, A., Mathijs, E., Saegerman, C., Mast, J., Bridger, J.C., Ziant, D., Thys, C., Thiry, E., 2009. Epidemiological study of bovine norovirus infection by RT-PCR and a VLP-based antibody ELISA. Vet. Microbiol. 137, 243-251. doi:10.1016/J.VETMIC.2009.01.031 Maynou, G., Bach, A., Terré, M., 2017. Feeding of waste milk to Holstein calves affects antimicrobial resistance of Escherichia coli and Pasteurella multocida isolated from fecal and nasal swabs. J. Dairy Sci. 100, 2682-2694. doi:10.3168/JDS.2016-11891 McAllister, T.A., Olson, M.E., Fletch, A., Wetzstein, M., Entz, T., 2005. Prevalence of Giardia and Cryptosporidium in beef cows in southern Ontario and in beef calves in southern British Columbia. Can. Vet. J. 46, 47-55. McCole, D.F., Eckmann, L., Laurent, F., Kagnoff, M.F., 2000. Intestinal epithelial cell apoptosis following Cryptosporidium parvum infection. Infect. Immun. 68, 1710-1713. doi:10.1128/IAI.68.3.1710-1713.2000 McDaniels, A.E., Cochran, K.W., Gannon, J.J., Williams, G.W., 1983. Rotavirus and reovirus stability in microorganism-free distilled and wastewaters. Water Res. 17, 1349-1353. McDaniels, A.E., Rice, E.W., Reyes, A.L., Johnson, C.H., Haugland, R.A., Stelma, J., 1998. Confirmational identification of Escherichia coli, a comparison of genotypic and phenotypic assays for glutamate decarboxylase and β-Dglucuronidase. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4113. doi:10.1128/aem.64.10.4113-4113.1998 McGee, M., Earley, B., 2019. Review: Passive immunity in beef-suckler calves. Animal 13, 810-825. doi:10.1017/S1751731118003026 McGuirk, S.M., 2003. Solving Calf Morbidity and Mortality Problems, en: American Association of Bovine Practitioners: 36th Annual Conference. Columbus, Ohio, EE.UU. McGuirk, S.M., Collins, M., 2004. Managing the production, storage, and delivery of colostrum. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 20, 593603. doi:10.1016/j.cvfa.2004.06.005 McKerr, C., Adak, G.K., Nichols, G., Gorton, R., Chalmers, R.M., Kafatos, G., Cosford, P., Charlett, A., Reacher, M., Pollock, K.G., Alexander, C.L., Morton, S., 2015. An Outbreak of Cryptosporidium parvum across England & Scotland Associated with Consumption of Fresh Pre-Cut Salad Leaves, May 2012. PLoS One 10, e0125955. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0125955 McNulty, M.S., 1978. Rotaviruses. J. Gen. Virol. 40, 118. Meale, S.J., Chaucheyras-Durand, F., Berends, H., Guan, L.L., Steele, M.A., 2017. From preto postweaning: Transformation of the young calf’s gastrointestinal tract. J. Dairy Sci. 100, 59845995. doi:10.3168/JDS.2016-12474 Mebus, C.A., 1990. Neonatal Calf Diarrhea Virus, en: Dinter, Z., Morein, B. (Eds.), Virus infections of ruminants. Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Países Bajos, pp. 297-300. Mebus, C.A., Stair, E.L., Rhodes, M.B., Twiehaus, M.J., 1973. Pathology of Neonatal Calf Diarrhea Induced by a Coronavirus-Like Agent. Vet. Pathol. 10, 45-64. Mebus, C.A., Stair, E.L., Underdahl, N.R., Twiehaus, M.J., 1971. Pathology of Neonatal Calf Diarrhea Induced by a Reo-Like Virus. Vet. Pathol. 8, 490505. Medrano-Galarza, C., LeBlanc, S.J., DeVries, T.J., Jones-Bitton, A., Rushen, J., Marie de Passillé, A., Endres, M.I., Haley, D.B., 2018a. Effect of age of introduction to an automated milk feeder on calf learning and performance and labor requirements. J. Dairy Sci. 101, 9371-9384. doi:10.3168/JDS.2018-14390 Medrano-Galarza, C., LeBlanc, S.J., Jones-Bitton, A., DeVries, T.J., Rushen, J., Marie de Passillé, A., Endres, M.I., Haley, D.B., 2018b. Associations between management practices and within-pen prevalence of calf diarrhea and respiratory disease on dairy farms using automated milk feeders. J. Dairy Sci. 101, 2293-2308. doi:10.3168/JDS.2017-13733 CYNTHIA LÓPEZ NOVO 286 Mee, J.F., 2008. Newborn Dairy Calf Management. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 24, 1-17. doi:10.1016/J.CVFA.2007.10.002 Mele, R., Gomez Morales, M.A., Tosini, F., Pozio, E., 2004. Cryptosporidium parvum at different developmental stages modulates host cell apoptosis in vitro. Infect. Immun. 72, 6061-6067. doi:10.1128/IAI.72.10.6061-6067.2004 Mendonça, C., Almeida, A., Castro, A., de Lurdes Delgado, M., Soares, S., da Costa, J.M.C., Canada, N., 2007. Molecular characterization of Cryptosporidium and Giardia isolates from cattle from Portugal. Vet. Parasitol. 147, 47-50. doi:10.1016/j.vetpar.2007.03.019 Menge, C., 2020. The role of Escherichia coli Shiga toxins in STEC colonization of cattle, Toxins. doi:10.3390/toxins12090607 Menge, C., Wieler, L.H., Schlapp, T., Baljer, G., 1999. Shiga toxin 1 from Escherichia coli blocks activation and proliferation of bovine lymphocyte subpopulations in vitro. Infect. Immun. 67, 22092217. doi:10.1128/IAI.67.5.2209-2217.1999 MERCASA, 2020. Alimentación en España 2020. Milnes, A.S., Binns, S.H., Oliver, S.L., Bridger, J.C., 2007. Retrospective study of noroviruses in samples of diarrhoea from cattle, using the Veterinary Laboratories Agency’s Farmfile database. Vet. Rec. 160, 326-330. doi:10.1136/VR.160.10.326 Minetti, C., Taweenan, W., Hogg, R., Featherstone, C., Randle, N., Latham, S.M., Wastling, J.M., 2014. Occurrence and Diversity of Giardia duodenalis Assemblages in Livestock in the UK. Transbound. Emerg. Dis. 61, e60-e67. doi:10.1111/tbed.12075 Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2021. Panel Situación Sector Lácteo España. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020a. Indicadores Económicos, Anuario de Estadística 2019. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020b. La Industria de la Alimentación, Anuario de Estadística 2019. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020c. Encuesta ganadera 2020. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2020d. El sector de la carne de vacuno en cifras. Mirhashemi, M.E., Zintl, A., Grant, T., Lucy, F., Mulcahy, G., Waal, T. De, 2016. Molecular epidemiology of Cryptosporidium species in livestock in Ireland. Vet. Parasitol. 216, 18-22. doi:10.1016/J.VETPAR.2015.12.002 Mirhashemi, M.E., Zintl, A., Grant, T., Lucy, F.E., Mulcahy, G., De Waal, T., 2015. Comparison of diagnostic techniques for the detection of Cryptosporidium oocysts in animal samples. Exp. Parasitol. 151-152, 14-20. doi:10.1016/j.exppara.2015.01.018 Misic, Z., Abe, N., 2007. Subtype analysis of Cryptosporidium parvum isolates from calves on farms around Belgrade, Serbia and Montenegro, using the 60 kDa glycoprotein gene sequences. Parasitology 134, 351-358. doi:10.1017/S0031182006001508 Mitchell, E.S.E., Smith, R.P., Ellis-Iversen, J., 2012. Husbandry risk factors associated with subclinical coccidiosis in young cattle. Vet. J. 193, 119-123. doi:10.1016/J.TVJL.2011.09.017 Mitchell, I. de G., Tame, M.J., Kenworthy, R., 1974. Conditions for the production of Escherichia coli enterotoxin in a defined medium. J. Med. Microbiol. 7, 395-400. Mohamed, F.F., Mansour, S.M.G., El-Araby, I.E., Mor, S.K., Goyal, S.M., 2017. Molecular detection of enteric viruses from diarrheic calves in Egypt. Arch. Virol. 162, 129-137. doi:10.1007/s00705016-3088-0 Mohammed, H.O., Wade, S.E., Schaaf, S., 1999. Risk factors associated with Cryptosporidium parvum infection in dairy cattle in southeastern New York State. Vet. Parasitol. 83, 1-13. doi:10.1016/S0304-4017(99)00032-1 Mohd Nor, N., Steeneveld, W., Mourits, M.C.M., Hogeveen, H., 2012. Estimating the costs of rearing young dairy cattle in the Netherlands using a simulation model that accounts for uncertainty related to diseases. Prev. Vet. Med. 106, 214-224. doi:10.1016/J.PREVETMED.2012.03.004 Mohler, V.L., Izzo, M.M., House, J.K., 2009. Salmonella in Calves. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 25, 37-54. doi:10.1016/j.cvfa.2008.10.009 Monis, P.T., Cacciò, S.M., Thompson, R.C.A., 2009. Variation in Giardia: towards a taxonomic revision of the genus. Trends Parasitol. 25, 93100. doi:10.1016/j.pt.2008.11.006 Moon, H.W., Whipp, S.C., Argenzio, R.A., Levine, REFERENCIAS 287 M.M., Giannella, R.A., 1983. Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines. Infect. Immun. 41, 1340-1351. Morales, A., Lamprea, A., García, A., Méndez, A., 2017. La necropsia en campo: un servicio agregado en la medicina veterinaria rural. Rev. Med. Vet. 34, 167-180. Moran, J., 2002. Calf rearing: A practical guide. Landlinks Press, Collingwood, Australia. Mouricout, M.A., Julien, R.A., 1987. Pilus-Mediated Binding of Bovine Enterotoxigenic Escherichia coli to Calf Small Intestinal Mucis. Infect. Immun. 55, 1216-1223. Moxley, R., 2013a. Enterobacteriaceae: Escherichia, en: McVey, D.S., Kennedy, M., Chengappa, M.M. (Eds.), Veterinary Microbiology. WileyBlackwell, Ames, Iowa, EE.UU., pp. 62-74. Moxley, R., 2013b. Family Enterobacteriaceae, en: McVey, D.S., Kennedy, M., Chengappa, M.M. (Eds.), Veterinary Microbiology. WileyBlackwell, Ames, Iowa, EE.UU., pp. 53-61. Moxley, R.A., Smith, D.R., 2010. Attaching-effacing Escherichia coli Infections in Cattle. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 26, 29-56. doi:10.1016/J.CVFA.2009.10.011 Mukherjee, A.K., Chowdhury, P., Rajendran, K., Nozaki, T., Ganguly, S., 2014. Association between Giardia duodenalis and Coinfection with Other Diarrhea-Causing Pathogens in India. Biomed Res. Int. 2014, 786480. doi:10.1155/2014/786480 Mundt, H.C., Bangoura, B., Rinke, M., Rosenbruch, M., Daugschies, A., 2005. Pathology and treatment of Eimeria zuernii coccidiosis in calves: Investigations in an infection model. Parasitol. Int. 54, 223-230. doi:10.1016/j.parint.2005.06.003 Mundt, H.C., Rödder, F., Mengel, H., Bangoura, B., Ocak, M., Daugschies, A., 2007. Control of coccidiosis due to Eimeria bovis and Eimeria zuernii in calves with toltrazuril under field conditions in comparison with diclazuril and untreated controls. Parasitol. Res. 101, 93-104. doi:10.1007/s00436-007-0616-6 Murakoshi, F., Takeuchi, M., Inomata, A., Horimoto, T., Ito, M., Suzuki, Y., Kato, K., 2014. Administration of lasalocid-NA is preventive against cryptosporidiosis of newborn calves. Vet. Rec. 175, 353. doi:10.1136/vr.102508 Mushtaq, H., Bakht, J., Khan, I., Ahmad, B., 2021. Antimicrobial efficacy and prevalence of colicinogenic E. coli in faecal matter of human, cow and sheep. Int. J. Antimicrob. Agents 57, 106221. doi:10.1016/J.IJANTIMICAG.2020.106221 Naciri, M., Mancassola, R., Yvoré, P., Peeters, J.E., 1993. The effect of halofuginone lactate on experimental Cryptosporidium parvum infections in calves. Vet. Parasitol. 45, 199-207. doi:10.1016/0304-4017(93)90075-X Naciri, M., Paul Lefay, M., Mancassola, R., Poirier, P., Chermette, R., 1999. Role of Cryptosporidium parvum as a pathogen in neonatal diarrhoea complex in suckling and dairy calves in France. Vet. Parasitol. 85, 245-257. doi:10.1016/S03044017(99)00111-9 Nagy, B., Fekete, P.Z., 2005. Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. Int. J. Med. Microbiol. 295, 443-454. Nagy, B., Fekete, P.Z., 1999. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals. Vet. Res. 30, 259-284. Nagy, B., Tóth, I., Fekete, P.Z., 2005. Adhesins and receptors for colonisation by different pathotypes of Escherichia coli in calves and young pigs, en: Holzapfel, W.H., Naughton, P.J., Pierzynowski, S.G., Zabielski, R., Salek, E. (Eds.), Microbial Ecology in Growing Animals. Elsevier Inc., Filadelfia, Pensilvania, EE.UU., pp. 157-190. Nataro, J.P., Kaper, J.B., 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11, 142201. Navarro, F., Miró, E., Mirelis, B., 2010. Lectura interpretada del antibiograma de enterobacterias. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 28, 638-645. doi:10.1016/j.eimc.2010.05.002 Naylor, J.M., 2009. Neonatal Calf Diarrhea. Food Anim. Pract. 70. doi:10.1016/B978-1416035916.10021-1 Naylor, J.M., 1992. Effects of electrolyte solutions for oral administration on clotting of milk. J. Am. Vet. Med. Assoc. 201, 1026-1029. Naylor, J.M., Forsyth, G.W., 1986. The Alkalinizing Effects of Metabolizable Bases in the Healthy Calf. Can. J. Vet. Res. 50, 509-516. Naylor, S.W., Gally, D.L., Low, C.J., 2005. Enterohaemorrhagic E. coli in veterinary medicine. Int. J. Med. Microbiol. 295, 419-441. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 288 Ng, J., Eastwood, K., Durrheim, D., Massey, P., Walker, B., Armson, A., Ryan, U.M., 2008. Evidence supporting zoonotic transmission of Cryptosporidium in rural New South Wales. Exp. Parasitol. 119, 192-195. doi:10.1016/J.EXPPARA.2008.01.010 Ng, J., Yang, R., McCarthy, S., Gordon, C., Hijjawi, N., Ryan, U.M., 2011. Molecular characterization of Cryptosporidium and Giardia in pre-weaned calves in Western Australia and New South Wales. Vet. Parasitol. 176, 145-150. doi:10.1016/j.vetpar.2010.10.056 Ng, J.S.Y., Eastwood, K., Walker, B., Durrheim, D.N., Massey, P.D., Porigneaux, P., Kemp, R., McKinnon, B., Laurie, K., Miller, D., Bramley, E., Ryan, U., 2012. Evidence of Cryptosporidium transmission between cattle and humans in northern New South Wales. Exp. Parasitol. 130, 437-441. doi:10.1016/J.EXPPARA.2012.01.014 Ngeleka, M., Godson, D., Vanier, G., Desmarais, G., Wojnarowicz, C., Sayi, S., Yanyun, H., Movasseghi, R., Fairbrother, J.M., 2019. Frequency of Escherichia coli virotypes in calf diarrhea and intestinal morphologic changes associated with these virotypes or other diarrheagenic pathogens. J. Vet. Diagnostic Investig. 31, 611-615. Nguyen, D.N., Currie, A.J., Ren, S., Bering, S.B., Sangild, P.T., 2019. Heat treatment and irradiation reduce anti-bacterial and immunemodulatory properties of bovine colostrum. J. Funct. Foods 57, 182-189. doi:10.1016/j.jff.2019.04.012 Nguyen, F., Starosta, A.L., Arenz, S., Sohmen, D., Dönhöfer, A., Wilson, D.N., 2014. Tetracycline antibiotics and resistance mechanisms. Biol. Chem. 395, 559-575. doi:10.1515/hsz-2013-0292 Nielsen, L.R., 2013. Review of pathogenesis and diagnostic methods of immediate relevance for epidemiology and control of Salmonella Dublin in cattle. Vet. Microbiol. 162, 1-9. doi:10.1016/j.vetmic.2012.08.003 Nielsen, P.P., Jensen, M.B., Lidfors, L., 2008. Milk allowance and weaning method affect the use of a computer controlled milk feeder and the development of cross-sucking in dairy calves. Appl. Anim. Behav. Sci. 109, 223-237. doi:10.1016/J.APPLANIM.2007.01.015 Nouri, M., Constable, P.D., 2006. Comparison of two oral electrolyte solutions and route of administration on the abomasal emptying rate of Holstein-Friesian calves. J. Vet. Intern. Med. 20, 620-626. doi:10.1892/08916640(2006)20[620:COTOES]2.0.CO;2 Nourmohammadzadeh, F., Davoudi, Y., Abdollahpour, G., Nouri, A., 2012. The prevalence of rotavirus in neonatal calf diarrhoea, using electron microscopic examination. Comp. Clin. Path. 21, 1231-1234. doi:10.1007/S00580-011-1270Z/FIGURES/1 O’ Leary, J.K., Blake, L., Corcoran, G.D., Sleator, R.D., Lucey, B., 2020. Increased diversity and novel subtypes among clinical Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis isolates in Southern Ireland. Exp. Parasitol. 218, 107967. doi:10.1016/J.EXPPARA.2020.107967 O’Brien, E., McInnes, L., Ryan, U., 2008. Cryptosporidium GP60 genotypes from humans and domesticated animals in Australia, North America and Europe. Exp. Parasitol. 118, 118121. doi:10.1016/J.EXPPARA.2007.05.012 O’Handley, R. M., O., M. E., M., T. A., M., D. W., J., M., Royan, G., Cheng, K.J., 1997. Efficacy of fenbendazole for treatment of giardiasis in calves. Am. J. Vet. Res. 58, 384-388. O’Handley, R.M., Cockwill, C., Jelinski, M., McAllister, T.A., Olson, M.E., 2000. Effects of repeat fenbendazole treatment in dairy calves with giardiosis on cyst excretion, clinical signs and production. Vet. Parasitol. 89, 209-218. doi:10.1016/S0304-4017(00)00200-4 O’Handley, R.M., Cockwill, C., McAllister, T.A., Jelinski, M., Morck, D.W., Olson, M.E., 1999. Duration of naturally acquired giardiosis and cryptosporidiosis in dairy calves and their association with diarrhea. J. Am. Vet. Med. Assoc. 214, 391-396. O’Handley, R.M., Olson, M.E., 2006. Giardiasis and Cryptosporidiosis in Ruminants. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 22, 623-643. doi:10.1016/j.cvfa.2006.07.002 Odden, A., Enemark, H.L., Ruiz, A., Robertson, L.J., Ersdal, C., Nes, S.K., Tømmerberg, V., Stuen, S., 2018. Controlled efficacy trial confirming toltrazuril resistance in a field isolate of ovine Eimeria spp. Parasites Vectors 2018 111 11, 1-11. doi:10.1186/S13071-018-2976-4 Ogbuigwe, P., Biggs, P.J., Garcia-Ramirez, J.C., Knox, M.A., Pita, A., Velathanthiri, N., French, N.P., Hayman, D.T.S., 2022. Uncovering the genetic diversity of Giardia intestinalis in isolates from outbreaks in New Zealand. Infect. Dis. Poverty 11, 1-10. doi:10.1186/S40249-022-00969X/FIGURES/3 REFERENCIAS 289 Oikonomou, G., Teixeira, A.G.V., Foditsch, C., Bicalho, M.L., Machado, V.S., Bicalho, R.C., 2013. Fecal Microbial Diversity in Pre-Weaned Dairy Calves as Described by Pyrosequencing of Metagenomic 16S rDNA. Associations of Faecalibacterium Species with Health and Growth. PLoS One 8, 63157. doi:10.1371/journal.pone.0063157 Oliver, S.L., Asobayire, E., Dastjerdi, A.M., Bridger, J.C., 2006. Genomic characterization of the unclassified bovine enteric virus Newbury agent1 (Newbury1) endorses a new genus in the family Caliciviridae. Virology 350, 240-250. doi:10.1016/j.virol.2006.02.027 Oliver, S.L., Wood, E., Asobayire, E., Wathes, D.C., Brickell, J.S., Elschner, M., Otto, P., Lambden, P.R., Clarke, I.N., Bridger, J.C., 2007. Serotype 1 and 2 Bovine Noroviruses Are Endemic in Cattle in the United Kingdom and Germany. J. Clin. Microbiol. 45, 3050-3052. doi:10.1128/JCM.02015-06 Olson, D.P., Papasian, C.J., Ritter, R.C., 1980. The effects of cold stress on neonatal calves. II. Absorption of colostral immunoglobulins. Can. J. Comp. Med. 44, 19. Olson, M.E., Goh, J., Phillips, M., Guselle, N., McAllister, T.A., 1999. Giardia Cyst and Cryptosporidium Oocyst Survival in Water, Soil, and Cattle Feces. J. Environ. Qual. 28, 19911996. Olson, M.E., O’Handley, R.M., Ralston, B.J., McAllister, T.A., Thompson, R.C.A., 2004. Update on Cryptosporidium and Giardia infections in cattle. Trends Parasitol. 20, 185-191. doi:10.1016/j.pt.2004.01.015 Omole, O.O., Nappert, G., Naylor, J.M., Zello, G.A., 2001. Both Land D-lactate contribute to metabolic acidosis in diarrheic calves. J. Nutr. 131, 2128-2131. doi:10.1093/jn/131.8.2128 Orden, J.A., Ruiz-Santa-Quiteria, J.A., Cid, D., García, S., Sanz, R., de la Fuente, R., 1998. Verotoxinproducing Escherichia coli (VTEC) and eaepositive non-VTEC in 1–30-days-old diarrhoeic dairy calves. Vet. Microbiol. 63, 239-248. Orden, J.A., Ruiz-Santa-Quiteria, J.A., García, S., Cid, D., De La Fuente, R., 2000. In Vitro Susceptibility of Escherichia coli Strains Isolated from Diarrhoeic Dairy Calves to 15 Antimicrobial Agents. J. Vet. Med. Ser. B 47, 329-335. doi:10.1046/J.1439-0450.2000.00356.X Organización Mundial de la Salud, 2022. Global Antimicrobial Resistance and Use Surveillance System (GLASS) Report 2022. Orr, J.P., 1984. Necrotizing enteritis in a calf infected with adenovirus. Can. Vet. J. 25, 72-4. Osorio, J.S., 2020. Gut health, stress, and immunity in neonatal dairy calves: the host side of hostpathogen interactions. J. Anim. Sci. Biotechnol. 11, 1-15. doi:10.1186/S40104-020-005093/FIGURES/4 Otto, P.H., Clarke, I.N., Lambden, P.R., Salim, O., Reetz, J., Liebler-Tenorio, E., 2011. Infection of calves with bovine norovirus GIII.1 strain Jena virus: an experimental model to study the pathogenesis of norovirus infection. J. Virol. 85, 12013-12021. Otto, P.H., Rosenhain, S., Elschner, M.C., Hotzel, H., Machnowska, P., Trojnar, E., Hoffmann, K., Johne, R., 2015. Detection of rotavirus species A, B and C in domestic mammalian animals with diarrhoea and genotyping of bovine species A rotavirus strains. Vet. Microbiol. 179, 168-176. Ouwehand, A., Isolauri, E., Salminen, S., 2002. The role of the intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood. Eur. J. Nutr. doi:10.1007/s00394-002-1105-4 Paget, T.A., Jarroll, E.L., Manning, P., Lindmark, D.G., Lloyd, D., 1989. Respiration in the cysts and trophozoites of Giardia muris. J. Gen. Microbiol. 135, 145-154. doi:10.1099/00221287-135-1-145 Palmer, G.H., Bywater, R.J., Stanton, A., 1983. Absorption in calves of amoxicillin, ampicillin, and oxytetracycline given in milk replacer, water, or an oral rehydration formulation. Am. J. Vet. Res. 44, 68-71. Panciera, R.J., Thomassen, R.W., Garner, F.M., 1971. Cryptosporidial Infection in a Calf. Vet. Pathol. 8, 479-484. Pang, X., Lee, B.E., 2015. Laboratory Diagnosis of Noroviruses: Present and Future. Clin. Lab. Med. 35, 345-362. doi:10.1016/j.cll.2015.02.008 Papp, H., László, B., Jakab, F., Ganesh, B., De Grazia, S., Matthijnssens, J., Ciarlet, M., Martella, V., Bányai, K., 2013. Review of group A rotavirus strains reported in swine and cattle. Vet. Microbiol. 165, 190-199. Pardon, B., Hostens, M., Duchateau, L., Dewulf, J., De Bleecker, K., Deprez, P., 2013. Impact of respiratory disease, diarrhea, otitis and arthritis on mortality and carcass traits in white veal calves. BMC Vet. Res. 9, 1-14. doi:10.1186/1746-61489-79/TABLES/6 CYNTHIA LÓPEZ NOVO 290 Park, S.J., Oh, E.H., Park, S.I., Kim, H.H., Jeong, Y.J., Lim, G.K., Hyun, B.H., Cho, K.O., 2008. Molecular epidemiology of bovine toroviruses circulating in South Korea. Vet. Microbiol. 126, 364-371. doi:10.1016/J.VETMIC.2007.07.012 Parreño, V., Béjar, C., Vagnozzi, A., Barrandeguy, M., Costantini, V., Craig, M.I., Yuan, L., Hodgins, D., Saif, L., Fernández, F., 2004. Modulation by colostrum-acquired maternal antibodies of systemic and mucosal antibody responses to rotavirus in calves experimentally challenged with bovine rotavirus. Vet. Immunol. Immunopathol. 100, 7-24. doi:10.1016/J.VETIMM.2004.02.007 Paton, J.C., Paton, A.W., 1998. Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections. Clin. Microbiol. Rev. 11, 450479. Peek, S.F., McGuirk, S.M., Sweeney, R.W., Cummings, K.J., 2018. Infectious Diseases of the Gastrointestinal Tract, en: Peek, S.F., Divers, T.J. (Eds.), Rebhun’s Diseases of Dairy Cattle. St. Louis, Misuri, EE.UU., pp. 249-356. doi:10.1016/B978-141603137-6.50012-0 Peng, M.M., Wilson, M.L., Holland, R.E., Meshnick, S.R., Lal, A.A., Xiao, L., 2003. Genetic diversity of Cryptosporidium spp. in cattle in Michigan: implications for understanding the transmission dynamics. Parasitol. Res. 90, 175-180. doi:10.1007/S00436-003-0834-5 Pereira, R. V., Siler, J.D., Ng, J.C., Davis, M.A., Grohn, Y.T., Warnick, L.D., 2014. Effect of on-farm use of antimicrobial drugs on resistance in fecal Escherichia coli of preweaned dairy calves. J. Dairy Sci. 97, 7644-7654. doi:10.3168/JDS.20148521 Perrin, B., Martel, J., Solsona, M., Contrepois, M., Dubourguier, H., Girardeau, J., Guuet, P., Bordas, C., Hayers, F., Quilleriet-Eliez, A., 1981. Fréquence du rotavirus et l’association rotavirus et Escherichia coli K99+ chez des veaux de quelques départements français. Ann. Rech. Vétérinaires 12, 259-263. Petry, F., 2004. Structural Analysis of Cryptosporidium parvum. Microsc. Microanal. 10, 586-601. Pfortmueller, C.A., Kabon, B., Schefold, J.C., Fleischmann, E., 2018. Crystalloid fluid choice in the critically ill: Current knowledge and critical appraisal. Wien. Klin. Wochenschr. doi:10.1007/s00508-018-1327-y Philipp, H., Schmidt, H., Düring, F., Salamon, E., 2003. Efficacy of Meloxicam (Metacam®) as Adjunct to a Basic Therapy for the Treatment of Diarrhoea in Calves. Acta Vet. Scand. 44, P95. doi:10.1186/1751-0147-44-s1-p95 Philippe, P., Alzieu, J.P., Taylor, M.A., Dorchies, P., 2014. Comparative efficacy of diclazuril (Vecoxan®) and toltrazuril (Baycox bovis®) against natural infections of Eimeria bovis and Eimeria zuernii in French calves. Vet. Parasitol. 206, 129-137. doi:10.1016/j.vetpar.2014.10.003 Philips, R.., Lewis, L.D., Knox, K.L., 1971. Alterations in body water turnover and distribution in neonatal calves with acute diarrhea. Ann. N. Y. Acad. Sci. 176, 231-243. Phipps, A.J., Beggs, D.S., Murray, A.J., Mansell, P.D., Pyman, M.F., 2017. Factors associated with colostrum immunoglobulin G concentration in northern-Victorian dairy cows. Aust. Vet. J. 95, 237-243. doi:10.1111/AVJ.12601 Plutzer, J., Karanis, P., 2009. Genetic polymorphism in Cryptosporidium species: An update. Vet. Parasitol. 165, 187-199. doi:10.1016/j.vetpar.2009.07.003 Plutzer, J., Ongerth, J., Karanis, P., 2010. Giardia taxonomy, phylogeny and epidemiology: Facts and open questions. Int. J. Hyg. Environ. Health 213, 321-333. doi:10.1016/j.ijheh.2010.06.005 Plym-Forshell, L., Ekesbo, I., 1996. Survival of Salmonella in Urine and Dry Faeces from Cattle– An Experimental Study. Acta Vet. Scand. 37, 127-131. doi:10.1186/BF03548104/METRICS Pohlenz, J.F.L., Cheville, N.F., Woode, G.N., Mokresh, A.H., 1984. Cellular Lesions in Intestinal Mucosa of Gnotobiotic Calves Experimentally Infected with a New Unclassified Bovine Virus (Breda Virus). Vet. Pathol. 21, 407-417. Poirel, L., Madec, J.-Y., Lupo, A., Schink, A.-K., Kieffer, N., Nordmann, P., Schwarz, S., 2018. Antimicrobial Resistance in Escherichia coli. Microbiol. Spectr. 6, ARBA-0026-2017. doi:10.1097/01.inf.0000141751.73083.7a Pokorny, N.J., Weir, S.C., Carreno, R. a, Trevors, J.T., Lee, H., 2002. Influence of temperature on Cryptosporidium parvum oocyst infectivity in river water samples as detected by tissue culture assay. J. Parasitol. 88, 641-643. doi:10.1645/00223395(2002)088[0641:IOTOCP]2.0.CO;2 Popow-Kraupp, T., Aberle, J.H., 2011. Diagnosis of respiratory syncytial virus infection. Open Microbiol. J. 5, 128-134. doi:10.2174/1874285801105010128 REFERENCIAS 291 Poulsen, K.P., Foley, A.L., Collins, M.T., McGuirk, S.M., 2010. Comparison of passive transfer of immunity in neonatal dairy calves fed colostrum or bovine serum-based colostrum replacement and colostrum supplement products. J. Am. Vet. Med. Assoc. 237, 949-954. doi:10.2460/javma.237.8.949 Pourasgari, F., Kaplon, J., Sanchooli, A., Fremy, C., Karimi-Naghlani, S., Otarod, V., Ambert-Balay, K., Mojgani, N., Pothier, P., 2018. Molecular prevalence of bovine noroviruses and neboviruses in newborn calves in Iran. Arch. Virol. 163, 12711277. Prasad, B.V. V, Hardy, M.E., Dokland, T., Bella, J., Rossmann, M.G., Estes, M.K., 1999. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science 286, 287-290. Pruimboom-Brees, I.M., Morgan, T.W., Ackermann, M.R., Nystrom, E.D., Samuel, J.E., Cornick, N.A., Moon, H.W., 2000. Cattle lack vascular receptors for Escherichia coli 0157:H7 Shiga toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 1032510329. doi:10.1073/PNAS.190329997 Quigley, J.D., Strohbehn, R.E., Kost, C.J., O’Brien, M.M., 2001. Formulation of colostrum supplements, colostrum replacers and acquisition of passive immunity in neonatal calves. J. Dairy Sci. 84, 2059-2065. doi:10.3168/jds.S00220302(01)74650-4 Quilez, J., Sanchez-Acedo, C., Avendaño, C., Del Cacho, E., Lopez-Bernad, F., 2005. Efficacy of two peroxygen-based disinfectants for inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 2479-2483. doi:10.1128/AEM.71.5.2479-2483.2005 Quílez, J., Sánchez-Acedo, C., Del Cacho, E., Clavel, A., Causapé, A.C., 1996. Prevalence of Cryptosporidium and Giardia infections in cattle in Aragón (northeastern Spain). Vet. Parasitol. 66, 139-146. Quílez, J., Torres, E., Chalmers, R.M., Hadfield, S.J., Del Cacho, E., Sánchez-Acedo, C., 2008a. Cryptosporidium genotypes and subtypes in lambs and goat kids in Spain. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6026-6031. doi:10.1128/AEM.00606-08 Quílez, J., Torres, E., Chalmers, R.M., Robinson, G., Del Cacho, E., Sanchez-Acedo, C., 2008b. Cryptosporidium species and subtype analysis from dairy calves in Spain. Parasitology 135, 1613-1620. doi:10.1017/S0031182008005088 R Core Team, 2021. R: A language and environment for statistical computing. Rachmadi, A.T., Kitajima, M., Watanabe, K., Yaegashi, S., Serrana, J., Nakamura, A., Nakagomi, T., Nakagomi, O., Katayama, K., Okabe, S., Sano, D., 2018. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 84, e00244-18. doi:10.1128/AEM.00244-18 Rajurkar, M.N., Lall, N., Basak, S., Mallick, S.K., 2012. A simple method for demonstrating the giardia lamblia trophozoite. J. Clin. Diagnostic Res. 6, 1492-1494. doi:10.7860/JCDR/2012/4358.2541 Ralston, B.J., McAllister, T.A., Olson, M.E., 2003. Prevalence and infection pattern of naturally acquired giardiasis and cryptosporidiosis in range beef calves and their dams. Vet. Parasitol. 114, 113-122. doi:10.1016/S0304-4017(03)00134-1 Ramig, R.F., 2004. Pathogenesis of Intestinal and Systemic Rotavirus Infection. J. Virol. 78, 1021310220. doi:10.1128/jvi.78.19.10213-10220.2004 Ramirez, M.S., Tolmasky, M.E., 2010. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist. Updat. 13, 151171. doi:10.1016/J.DRUP.2010.08.003 Ramo, A., Quílez, J., Vergara-Castiblanco, C., Monteagudo, L., Cacho, E. Del, Clavel, A., 2015. Multilocus typing and population structure of Cryptosporidium from children in Zaragoza, Spain. Infect. Genet. Evol. 31, 190-197. doi:10.1016/j.meegid.2015.01.023 Razakandrainibe, R., Diawara, E.H.I., Costa, D., Le Goff, L., Lemeteil, D., Ballet, J.J., Gargala, G., Favennec, L., 2018. Common occurrence of Cryptosporidium hominis in asymptomatic and symptomatic calves in France. PLoS Negl. Trop. Dis. 12, e0006355. doi:10.1371/JOURNAL.PNTD.0006355 Read, C., Walters, J., Robertson, I.D., Thompson, R.C.A., 2002. Correlation between genotype of Giardia duodenalis and diarrhoea. Int. J. Parasitol. 32, 229-231. doi:10.1080/13518040701205365 Read, C.M., Monis, P.T., Thompson, R.C.A., 2004. Discrimination of all genotypes of Giardia duodenalis at the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP. Infect. Genet. Evol. 4, 125130. doi:10.1016/J.MEEGID.2004.02.001 Renaud, D.L., Rot, C., Marshall, J., Steele, M.A., 2021. The effect of Cryptosporidium parvum, rotavirus, and coronavirus infection on the health and performance of male dairy calves. J. Dairy Sci. 104, 2151-2163. doi:10.3168/JDS.2020-19215 CYNTHIA LÓPEZ NOVO 292 Reschke, C., Schelling, E., Michel, A., RemyWohlfender, F., Meylan, M., 2017. Factors Associated with Colostrum Quality and Effects on Serum Gamma Globulin Concentrations of Calves in Swiss Dairy Herds. J. Vet. Intern. Med. 31, 1563-1571. doi:10.1111/JVIM.14806 Reynolds, D.J., Morgan, J.H., Chanter, N., Jones, P.W., Bridger, J.C., Debney, T.G., Bunch, K.J., 1986. Microbiology of calf diarrhoea in southern Britain. Vet. Rec. 119, 34-39. Rice, D.H., Besser, T.E., Hancock, D.D., 1997. Epidemiology and virulence assessment of Salmonella dublin. Vet. Microbiol. 56, 111-124. doi:10.1016/S0378-1135(96)01352-1 Rico Fernández, A., 2020. Factores de riesgo en la diarrea infecciosa del ternero neonato: actuación frente a un brote. Universidade de Santiago de Compostela. Rieux, A., Chartier, C., Pors, I., Delafosse, A., Paraud, C., 2013. Molecular characterization of Cryptosporidium isolates from high-excreting young dairy calves in dairy cattle herds in Western France. Parasitol. Res. 112, 3423-3431. doi:10.1007/s00436-013-3520-2 Ro, Y., Choi, W., Hong, L., Kim, E., Choe, E., Kim, D., 2022. Comparison of the bovine blood gas parameters produced with three types of portable blood gas analyzers. J. Vet. Sci. 23, e60. doi:10.4142/JVS.22050 Robertson, L.J., Lim, Y.A.L., 2011. Waterborne and Environmentally-Borne Giardiasis, en: Luján, H., Svärd, S. (Eds.), Giardia: A Model Organism. Springer-Verlag, Viena, Austria, pp. 29-71. Robinson, P., Okhuysen, P.C., Chappell, C.L., Lewis, D.E., Shahab, I., Lahoti, S., White, A.C.J., 2001. Expression of IL-15 and IL-4 in IFN-gammaindependent control of experimental human Cryptosporidium parvum infection. Cytokine 15, 39-46. Robison, J.D., Stott, G.H., DeNise, S.K., 1988. Effects of Passive Immunity on Growth and Survival in the Dairy Heifer. J. Dairy Sci. 71, 1283-1287. doi:10.3168/JDS.S0022-0302(88)79684-8 Rodríguez-Martínez, J.M., Cano, M.E., Velasco, C., Martínez-Martínez, L., Pascual, Á., 2011. Plasmid-mediated quinolone resistance: an update. J. Infect. Chemother. 17, 149-182. doi:10.1007/S10156-010-0120-2 Roeder, B.L., Chengappa, M.M., Nagaraja, T.G., Avery, T.B., Kennedy, G.A., 1987. Isolation of Clostridium perfringens from neonatal calves with ruminal and abomasal tympany, abomasitis, and abomasal ulceration. J. Am. Vet. Med. Assoc. 190, 1550-1555. Rojas-López, L., Marques, R.C., Svärd, S.G., 2022. Giardia duodenalis. Trends Parasitol. 38, 605606. doi:10.1016/j.pt.2022.01.001 Rollin, R.E., Mero, K.N., Kozisek, P.B., Phillips, R.W., 1986. Diarrhea and malabsorption in calves associated with therapeutic doses of antibiotics: absorptive and clinical changes. Am. J. Vet. Res. 47, 987-991. Royer, S., 2015. Detection et caracterisation moleculaire de Cryptosporidium lors de diarrhees chez le le veau non sevre dans une clientelle allaitante. Université Claude-Bernard - Lyon I. Ruest, N., Couture, Y., Faubert, G., 1995. Pathogenic potential of Giardia infection in cattle. Parasitol. Today 5, 184. Runnels, P.L., Moon, H.W., Schneider, R.A., 1980. Development of resistance with host age to adhesion of K99+ Escherichia coli to isolated intestinal epithelial cells. Infect. Immun. 28, 298300. Ryan, U.M., Cacciò, S.M., 2013. Zoonotic potential of Giardia. Int. J. Parasitol. 43, 943-956. doi:10.1016/j.ijpara.2013.06.001 Ryan, U.M., Feng, Y., Fayer, R., Xiao, L., 2021a. Taxonomy and molecular epidemiology of Cryptosporidium and Giardia – a 50 year perspective (1971–2021). Int. J. Parasitol. 51, 1099-1119. doi:10.1016/J.IJPARA.2021.08.007 Ryan, U.M., Zahedi, A., 2019. Molecular epidemiology of giardiasis from a veterinary perspective. Adv. Parasitol. 106, 209-254. doi:10.1016/BS.APAR.2019.07.002 Ryan, U.M., Zahedi, A., Feng, Y., Xiao, L., 2021b. An update on zoonotic Cryptosporidium species and genotypes in humans. Animals 11, 1-22. doi:10.3390/ani11113307 Rycroft, A.N., 2013. Structure, Function and Synthesis of Surface Polysaccharides in Salmonella, en: Barrow, P., Methner, U. (Eds.), Salmonella in Domestic Animals. CAB International, Wallingford, Reino Unido, pp. 20-37. Ryu, J.-H., Kim, S., Park, J., Choi, K.-S., 2020a. Characterization of virulence genes in Escherichia coli strains isolated from pre-weaned calves in the Republic of Korea. Acta Vet. Scand. 62, 45. doi:10.1186/s13028-020-00543-1 REFERENCIAS 293 Ryu, J.-H., Shin, S.-U., Choi, K.-S., 2020b. Molecular surveillance of viral pathogens associated with diarrhea in pre-weaned Korean native calves. Trop. Anim. Health Prod. 52, 1811-1820. doi:10.1007/s11250-019-02181-w/Published Saif, L.J., Redman, D.R., Smith, K.L., Theil, K.W., 1983. Passive immunity to bovine rotavirus in newborn calves fed colostrum supplements from immunized or nonimmunized cows. Infect. Immun. 41, 1118-1131. doi:10.1128/iai.41.3.1118-1131.1983 Saif, L.J., Smith, K.L., Landmeier, B.J., Bohl, E.H., Theil, K.W., Todhunter, D.A., 1984. Immune response of pregnant cows to bovine rotavirus immunization. Am. J. Vet. Res. 45, 49-58. Sánchez, R.O., Romero, J.R., Founroge, R.D., 2008. Dynamics of Eimeria oocyst excretion in dairy calves in the Province of Buenos Aires (Argentina), during their first 2 months of age. Vet. Parasitol. 151, 133-138. doi:10.1016/J.VETPAR.2007.11.003 Sanderson, K.E., Nair, S., 2013. Taxonomy and Species Concepts in the Genus Salmonella, en: Barrow, P.A., Methner, U. (Eds.), Salmonella in Domestic Animals. CAB International, Wallingford, Reino Unido, pp. 1-19. Sandhu, K.S., Gyles, C.L., 2002. Pathogenic Shiga toxin-producing Escherichia coli in the intestine of calves. Can. J. Vet. Res. 66, 65. Sandine, W.E., 1979. Roles of Lactobacillus in the Intestinal Tract. J. Food Prot. 42, 259-262. doi:10.4315/0362-028x-42.3.259 Santin, M., 2020. Cryptosporidium and Giardia in Ruminants. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 36, 223-238. doi:10.1016/J.CVFA.2019.11.005 Santín, M., Trout, J.M., Fayer, R., 2008. A longitudinal study of cryptosporidiosis in dairy cattle from birth to 2 years of age. Vet. Parasitol. 155, 15-23. doi:10.1016/J.VETPAR.2008.04.018 Santín, M., Trout, J.M., Xiao, L., Zhou, L., Greiner, E., Fayer, R., 2004. Prevalence and age-related variation of Cryptosporidium species and genotypes in dairy calves. Vet. Parasitol. 122, 103-117. doi:10.1016/J.VETPAR.2004.03.020 Santín, M., Zarlenga, D.S., 2009. A multiplex polymerase chain reaction assay to simultaneously distinguish Cryptosporidium species of veterinary and public health concern in cattle. Vet. Parasitol. 166, 32-37. doi:10.1016/J.VETPAR.2009.07.039 Santoro, A., Dorbek-Kolin, E., Jeremejeva, J., Tummeleht, L., Orro, T., Jokelainen, P., Lassen, B., 2019. Molecular epidemiology of Cryptosporidium spp. in calves in Estonia: High prevalence of Cryptosporidium parvum shedding and 10 subtypes identified. Parasitology 146, 261267. doi:10.1017/S0031182018001348 Sawant, A.A., Sordillo, L.M., Jayarao, B.M., 2005. A survey on antibiotic usage in dairy herds in Pennsylvania. J. Dairy Sci. 88, 2991-2999. doi:10.3168/JDS.S0022-0302(05)72979-9 Sayers, R.G., Kennedy, A., Krump, L., Sayers, G.P., Kennedy, E., 2016. An observational study using blood gas analysis to assess neonatal calf diarrhea and subsequent recovery with a European Commission-compliant oral electrolyte solution. J. Dairy Sci. 99, 4647-4655. doi:10.3168/jds.2015-10600 Schaechter, M., 2009. Escherichia Coli, en: Schaechter, M. (Ed.), Encyclopedia of Microbiology. Elsevier Inc., San Diego, California, EE.UU., pp. 125-132. Schulz, S., Green, C.K., Yuen, P.S.T., Garbers, D.L., 1990. Guanylyl cyclase is a heat-stable enterotoxin receptor. Cell 63, 941-948. doi:10.1016/0092-8674(90)90497-3 Schumann, F.J., Townsend, H.G., Naylor, J.M., 1990. Risk factors for mortality from diarrhea in beef calves in Alberta. Can. J. Vet. Res. 54, 366-372. Scott, P.R., Hall, G.A., Jones, P.W., Morgan, J.H., 2004. Calf Diarrhoea, en: Andrews, A.H., Blowey, R.W., Boyd, H., Eddy, R.G. (Eds.), Bovine Medicine: Diseases and Husbandry of Cattle. Blackwell Science Ltd., Oxford, Reino Unido, pp. 185-214. Segura, R., Prim, N., Montemayor, M., Valls, M.E., Muñoz, C., 2015. Predominant Virulent IbA10G2 Subtype of Cryptosporidium hominis in Human Isolates in Barcelona: A Five-Year Study. PLoS One 10, e0121753. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0121753 Sellers, Z.M., Childs, D., Chow, J.Y.C., Smith, A.J., Hogan, D.L., Isenberg, J.I., Dong, H., Barrett, K.E., Pratha, V.S., 2004. Heat-stable enterotoxin of Escherichia coli stimulates a non-CFTRmediated duodenal bicarbonate secretory pathway. Am. J. Physiol. Liver Physiol. 288, G654-G663. doi:10.1152/ajpgi.00386.2004 Seppä-Lassila, L., Orro, T., Lassen, B., Lasonen, R., Autio, T., Pelkonen, S., Soveri, T., 2015. Intestinal pathogens, diarrhoea and acute phase proteins in naturally infected dairy calves. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 41, 10-16. CYNTHIA LÓPEZ NOVO 294 doi:10.1016/J.CIMID.2015.05.004 Shahrani, M., Dehkordi, F.S., Momtaz, H., 2014. Characterization of Escherichia coli virulence genes, pathotypes and antibiotic resistance properties in diarrheic calves in Iran. Biol. Res. 47, 1-13. doi:10.1186/0717-6287-47-28 Shams, Z., Tahamtan, Y., Pourbakhsh, A., 2012. Detection of enterotoxigenic K99 (F5) and F41 from fecal sample of calves by molecular and serological methods. Comp. Clin. Path. 21, 475478. doi:10.1007/s00580-010-1122-2 Sharma, K., Taku, A.K., Malik, A., Bhat, M.A., Javed, R., Badroo, G.A., Kour, A., 2017. Molecular characterization and antimicrobial profiling of Escherichia coli isolates from diarrheic calves. Indian J. Anim. Sci. 87, 1467-1471. doi:10.56093/ijans.v87i12.79782 Sharpee, R.L., Mebus, C.A., Bass, E.P., 1976. Characterization of a calf diarrheal coronavirus. Am. J. Vet. Res. 37, 1031-1041. Shi, Z., Wang, W., Chen, C., Zhang, X., Wang, J., Xu, Z., Lan, Y., 2020. First report and genetic characterization of bovine torovirus in diarrhoeic calves in China. BMC Vet. Res. 16. doi:10.1186/S12917-020-02494-1 Shull, J.J., Frederick, H.M., 1978. Adverse effect of oral antibacterial prophylaxis and therapy on incidence of neonatal calf diarrhea. Vet Med Small Anim Clin. 73, 924-930. Signorini, M.L., Soto, L.P., Zbrun, M. V., Sequeira, G.J., Rosmini, M.R., Frizzo, L.S., 2012. Impact of probiotic administration on the health and fecal microbiota of young calves: A meta-analysis of randomized controlled trials of lactic acid bacteria. Res. Vet. Sci. 93, 250-258. doi:10.1016/j.rvsc.2011.05.001 Silverlås, C., De Verdier, K., Emanuelson, U., Mattsson, J.G., Björkman, C., 2010. Cryptosporidium infection in herds with and without calf diarrhoeal problems. Parasitol. Res. 107, 1435-1444. doi:10.1007/s00436-010-2020-x Silvestro, L., Caputo, M., Blancato, S., Decastelli, L., Fioravanti, A., Tozzoli, R., Morabito, S., Caprioli, A., 2004. Asymptomatic carriage of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in farm workers in Northern Italy. Epidemiol. Infect. 132, 915-919. doi:10.1017/S0950268804002390 Sineiro García, F., Santiso Blanco, J.A., Calcedo Ordoñez, V., Lorenzana Fernández, R., 2009. El sector lácteo, escenarios de evolución. Sischo, W.M., Atwill, E.R., Lanyon, L.E., George, J., 2000. Cryptosporidia on dairy farms and the role these farms may have in contaminating surface water supplies in the northeastern United States. Prev. Vet. Med. 43, 253-267. Sjöling, Å., Wiklund, G., Savarino, S.J., Cohen, D.I., Svennerholm, A.M., 2007. Comparative analyses of phenotypic and genotypic methods for detection of enterotoxigenic Escherichia coli toxins and colonization factors. J. Clin. Microbiol. 45, 3295-3301. doi:10.1128/JCM.00471-07 Smiley, J.R., Chang, K.O., Hayes, J., Vinjé, J., Saif, L.J., 2002. Characterization of an Enteropathogenic Bovine Calicivirus Representing a Potentially New Calicivirus Genus. J. Virol. 76, 1008910098. doi:10.1128/jvi.76.20.10089-10098.2002 Smiley, J.R., Hoet, A.E., Tråvén, M., Tsunemitsu, H., Saif, L.J., 2003. Reverse transcription-PCR assays for detection of bovine enteric caliciviruses (BEC) and analysis of the genetic relationships among BEC and human caliciviruses. J. Clin. Microbiol. 41, 3089-3099. doi:10.1128/JCM.41.7.3089-3099.2003 Smith, B.P., 2015a. Salmonellosis in Ruminants, en: Smith, B.P. (Ed.), Large Animal Internal Medicine. Elsevier Inc., St. Louis, Misuri, EE.UU., pp. 830-834. Smith, D.R., 2012. Field Disease Diagnostic Investigation of Neonatal Calf Diarrhea. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 28, 465-481. Smith, G., 2015b. Antimicrobial decision making for enteric diseases of cattle. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 31, 47-60. doi:10.1016/J.CVFA.2014.11.004 Smith, G., Berchtold, J., 2014. Fluid therapy in calves. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. Anim. Pract. 30, 409-427. doi:10.1136/inp.i4668 Smith, G.W., 2009. Treatment of Calf Diarrhea: Oral Fluid Therapy. Vet. Clin. North Am. - Food Anim. Pract. 25, 55-72. doi:10.1016/j.cvfa.2008.10.006 Smith, H., 2008. Diagnosis, en: Fayer, R., Xiao, L. (Eds.), Cryptosporidium and cryptosporidiosis. CRC Press, Boca Raton, Florida, EE.UU., pp. 173-208. Smith, R.P., Clifton-Hadley, F.A., Cheney, T., Giles, M., 2014. Prevalence and molecular typing of Cryptosporidium in dairy cattle in England and Wales and examination of potential on-farm transmission routes. Vet. Parasitol. 204, 111-119. REFERENCIAS 301 Sequencing of Human Oral Microbes. PLoS One 11, e0154389. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0154389 Yang, X., Guo, Y., Xiao, L., Feng, Y., 2021. Molecular Epidemiology of Human Cryptosporidiosis in Lowand Middle-Income Countries. Clin. Microbiol. Rev. 34, 1-26. doi:10.1128/CMR.00087-19 Younis, E.E., Ahmed, A.M., El-Khodery, S.A., Osman, S.A., El-Naker, Y.F.I., 2009. Molecular screening and risk factors of enterotoxigenic Escherichia coli and Salmonella spp. in diarrheic neonatal calves in Egypt. Res. Vet. Sci. 87, 373-379. doi:10.1016/J.RVSC.2009.04.006 Zahedi, A., Field, D., Ryan, U.M., 2017. Molecular typing of Giardia duodenalis in humans in Queensland – first report of Assemblage E. Parasitology 144, 1154-1161. doi:10.1017/S0031182017000439 Zambriski, J.A., Nydam, D. V, Wilcox, Z.J., Bowman, D.D., Mohammed, H.O., Liotta, J.L., 2013. Cryptosporidium parvum: Determination of ID 50 and the dose-response relationship in experimentally challenged dairy calves. Vet. Parasitol. 197, 104-112. doi:10.1016/j.vetpar.2013.04.022 Zhang, K., Wu, Y., Jing, B., Xu, C., Chen, Y., Yu, F., Wei, Z., Zhang, Y., Cui, Z., Qi, M., Zhang, L., 2022. Seasonal monitoring of Cryptosporidium species and their genetic diversity in neonatal calves on two large-scale farms in Xinjiang, China. J. Eukaryot. Microbiol. 69, e12878. doi:10.1111/JEU.12878 Zheng, D.-P., Ando, T., Fankhauser, R.L., Beard, R.S., Glass, R.I., Monroe, S.S., 2006. Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology 346, 312-323. Zonta, W., Mauroy, A., Farnir, F., Thiry, E., 2016. Comparative Virucidal Efficacy of Seven Disinfectants Against Murine Norovirus and Feline Calicivirus, Surrogates of Human Norovirus. Food Environ. Virol. 8, 1-12. doi:10.1007/S12560-015-9216-2 [Document text truncated for crawler view.]