Trastornos del ciclo de la metilación en pacientes con fenilcetonuria

  TESIS DOCTORAL TRASTORNOS DEL CICLO DE LA METILACIÓN EN PACIENTES CON FENILCETONURIA Fdo.:................................................... Olalla Elena López Suárez Departamento de Pediatría SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015   AUTORIZACIÓN DOS DIRECTORES DA TESE Dna. Mª Luz Couce Pico, Profesora do Departamento de Pediatría da Universidade de Santiago de Compostela (USC); D. Luís Aldámiz-Echevarría Azuara, Profesor do Departamento Pediatría da Universidad del País Vasco (UPV/EHU), D. José María Fraga Bermúdez, Catedrático de Pediatría da Universidade de Santiago de Compostela (USC); Como Director/a/es/as da Tese de Doutoramento titulada «Trastornos del ciclo de la metilación en pacientes con fenilcetonuria» Presentada por Dna. Olalla Elena López Suárez, Alumna do Programa de Doutoramento de Pediatría 2121-05-1V01 (RD 778). Autoriza a presentación da tese indicada , considerando que reúne os requisitos esixidos no artigo 34 do regulamento de Estudos de Doutoramento , e que como Director da mesma non incurre nas causas de abstención establecidas na lei 30/1992. Asdo. Mª Luz Couce Pico ............................................................................................... Asdo. Luís Aldámiz-Echevarría Azuara .............................................................................................. Asdo. José Mª Fraga Bermúdez ..............................................................................................      AGRADECIMIENTOS “Si yo pudiera enumerar cuánto debo a mis grandes antecesores y contemporáneos, no me quedaría mucho en propiedad” Goethe. El camino hasta llegar aquí ha sido largo (mucho más largo de lo que sería prudente reconocer) y lleno de todos los recovecos, idas y venidas que caracterizan la vida de una persona corriente, que es lo que yo soy. Afortunadamente, nunca he estado sola, y a lo largo de todo este proceso he recibido el inestimable apoyo de muchas personas, intentaré no olvidarme de ninguna: Gracias a mis directores de tesis, por haberme ofrecido esta oportunidad, por dedicarme tantas horas de su tiempo y por saber animarme cuando más lo necesitaba. Gracias a todos mis compañeros de la Unidad de Neonatología del CHUS, por su cariño, su comprensión, sus consejos y su trabajo, que es una parte del mío. Gracias a todo el personal de los Laboratorios de Metabolopatías del CHUS y de Cruces, por su gran profesionalidad y porque sin su trabajo, esta tesis no sería posible. De forma especial gracias a ti, Fernando, por tu implicación y por estar siempre ahí. Gracias a la mejor secretaria de Departamento que se puede tener; Montse, qué sería de nosotros sin ti. Gracias a mi familia, que siempre confía en mí, aunque yo deje de hacerlo. Gracias a todos mis amigos y amigas, que han sido infinitamente pacientes y que siempre están cuando los necesito. Gracias Paulo, por ver en mí lo que yo no veo. Esta tesis es tan mía como vuestra. Gracias, de corazón.         ABREVIATURAS ADMA: N-N-dimetil-L-arginina asimétrica. ADP: adenosín bifosfato. AECOM: Asociación española para el estudio de los errores congénitos del metabolismo. AGAT: L-arginina-glicina amidinotransferasa. Ala: alanina. Arg: arginina. Asn: asparagina. Asp: ácido aspártico. ATP: adenosín trifosfato. BBB: barrera hematoencefálica. BHMT: betaína: homocisteína metiltransferasa. BH4: (6R)-L-eritro-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina. BH4db: www.bh4.org. Ca: Calcio. CDR/RDA: cantidad diaria recomendada. CEDEM: Centro de diagnóstico de enfermedades moleculares. Citr: Citrulina. Cr: creatina. Crn: creatinina. CSUR: centro superior de unidad de referencia. Cys: cisteína. DDAH 1 y 2: dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 y 2. DE: derivación estándar. DGGE: electroforesis de gel de gradiente de desnaturalización. DHPR: dihidropterina reductasa. DNA/ADN: ácido desoxirribonucleico. EDTA: ácido etilen-diamino-tetra-acético.     ELISA: enzimoinmunoanálisis competitivo. EMH: enfermedad metabólica hereditaria. F: femenino. GAA: guadininoacetato. GAMT: guanidinoacetato metiltransferasa. GC-MS: cromatografía de gases-espectrometría de masas. GEMO: gliceril-éter monooxigenasa. GGT: gamma glutamil transpeptidasa. Gln: glutamina. Glu: ácido glutámico. Gly: Glicina. GMP: glucomacropéptido. GOT/AST: aspartato aminotransferasa. GPT/ALT: alanina aminotransferasa. GTP: Guanosina trifosfato. GTPCH: guanosín-trifosfato-ciclohidrolasa. Hcy: homocisteína. HDL: lipoproteína de alta densidad. 5HIA: ácido 5 hidroxi-indol-acético. His: histidina. HMV: ácido homovanílico. HPA: hiperfenilalaninemia. HPAB: hiperfenilalaninemia benigna. HPLC: cromatografía líquida de alta resolución. Hyl: hidroxilisina. Hyp: hidroxiprolina. ICD: índice de control dietético. Ile: isoleucina.     IMC: índice de masa corporal. IVA: aciduria isovalérica. LAT 1: L-aminoácido transportador 1. LC-MS/MS: cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. LCR: líquido cefalorraquídeo. LDL: lipoproteína de baja densidad. Leu: leucina. LNAA: aminoácidos neutros de gran tamaño (triptófano, tirosina, leucina, isoleucina, valina). L-NMMA: N-monometil-L-arginina. Lys: lisina. M: masculino. MCbl: metil-cobalamina. Met: metionina. MLPA: amplificación de sondas dependiente de ligandos. MMA: ácido metilmalónico. MRM: monitorización por reacción múltiple. mRNA/ARNm: ácido ribonucleico mensajero. MS: metionina sintetasa. MS/MS: espectrometría de masas en tándem. MSR: metionina sintetasa reductasa. MSUD: enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (maple syrup urine disease). MTHF: metiltetrahidrofolato. MTHFR: 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa. NADH: nicotinamida adenina dinucleótido reductasa. NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. NKH: hiperglicinemia no cetósica. NMDA: N-metil-D-aspartato. NO: óxido nítrico.      elevación de cisteína, glicina y ornitina). Ello supone una menor disponibilidad de grupos metilo para otras reacciones metabólicas; nosotros hemos estudiado las relacionadas con la vía Arg-ADMA-NO y la vía Arg-GAA-Cr, comprobando que en efecto existe una menor producción de dimetilarginina asimétrica (ADMA) y creatinina (Crn). La determinación de estos metabolitos podría ser utilizada para el control dietético de los pacientes, lo que en el caso de la Crn es especialmente importante, dada la rapidez y el bajo coste de su determinación. Si bien estudios previos habían sugerido alteraciones en estos metabolitos, ninguno hasta la fecha había estudiado la vía de la metilación en los pacientes PKU ni la había puesto en relación con el tratamiento dietético de estos pacientes. Palabras clave: ácido fólico, fenilcetonuria, metilación, tratamiento dietético, vitamina B12. ABSTRACT In this study we show that patients with phenylketonuria (PKU) who follow strict dietary treatment with a low intake of natural proteins and a high intake of phenylalanine-free dietary supplements enriched with vitamins and minerals have excessive vitamin B12 and folic acid levels that lead to alterations in the methylation cycle. Alterations include increased remethylation, evidenced by reduced homocysteine, methionine, arginine, and citrulline levels, and increased trans-sulfuration, evidenced by elevated cysteine, glycine, and ornithine levels. The result of these changes is less availability of methyl groups for other metabolic reactions. We specifically studied reactions related to the Arg-ADMA-NO and the Arg-GAA-Cr pathways, and found lower production of asymmetric dimethylarginine (ADMA) and creatinine (Crn). Measurement of these metabolites might therefore be of use for monitoring dietary treatment in patients with PKU. This possibility is particularly interesting in the case of creatinine, as testing is rapid and inexpensive. While previous studies have suggested that these metabolites are altered in PKU, ours is the first study to      analyze the methylation pathway in this setting and to link metabolic alterations to dietary treatment. Key words: dietary treatment, folic acid, methylation, phenylketonuria, vitamin B12.        INDICE  Tesis Doctoral Índice  1 ÍNDICE 1. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 5 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 9 2.1. FENILCETONURIA. DEFINICIÓN..................................................... 11 2.2. HISTORIA DE LA FENILCETONURIA. LOS INICIOS .................. 15 2.3. CONCEPTOS BÁSICOS ........................................................................ 19 2.3.1. Aminoácidos. Definición .................................................................... 19 2.3.2. Fenilalanina ........................................................................................ 20 2.4. HIPERFENILALANINEMIA ................................................................ 20 2.4.1. Concepto ............................................................................................. 20 2.4.2. Epidemiología ..................................................................................... 21 2.4.3. Fisiopatología ..................................................................................... 21 2.5. DEFICIENCIA DE PAH. GENÉTICA ................................................. 24 2.6. CLÍNICA .................................................................................................. 27 2.7. DIAGNÓSTICO ....................................................................................... 28 2.7.1. Cribado ............................................................................................... 28 2.7.2. Confirmación Diagnóstica ................................................................. 30 2.7.3. Defectos del cofactor BH4 .................................................................. 31 2.7.4. Sobrecarga de BH4 ............................................................................. 32  2.8. CLASIFICACIÓN ................................................................................... 34 2.9. TRATAMIENTO ..................................................................................... 36 2.9.1. Dieta .................................................................................................... 36 2.9.2. Diclorhidrato de Sapropterina ......................................................... 38 2.9.3. Glucomacropéptido ........................................................................... 39 2.9.4. Aminoácidos neutros de gran tamaño ............................................. 40 Tesis Doctoral Índice  2 2.10. EVOLUCIÓN DE LA PKU .................................................................. 42 2.11. HOMOCISTEÍNA Y CICLO DE LA METILACION ...................... 46 2.12. DIMETILARGININA ASIMÉTRICA (ADMA) ................................ 48 2.12.2. Óxido nítrico ..................................................................................... 50 2.12.3. Inhibición de la síntesis de óxido nítrico ........................................ 51 2.12.4. Eliminación de ADMA .................................................................... 51 2.12.5. ADMA e Hiperfenilalaninemia ....................................................... 54 2.13. VÍA ARGININA-GUANIDINOACETATO-CREATINA ................. 55 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ......................................................................... 57 3.1. HIPÓTESIS CONCEPTUAL ................................................................. 59 3.2. HIPÓTESIS OPERATIVA ..................................................................... 59 3.3. OBJETIVOS ............................................................................................. 59 4. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................... 61 4.1. VARIABLES DEL ESTUDIO ................................................................ 65 4.1.1. Variable principal .............................................................................. 65 4.1.2. Variables secundarias ........................................................................ 66 4.1.2.1. Antropometría ............................................................................... 66 4.1.2.2. Variables de control de PKU - nutrición ..................................... 67 4.1.2.3. Valoración de los trastornos de la vía Arg-ADMA-NO .............. 68 4.1.2.4. Valoración de los trastornos de la vía Arg-GAA-Cr ................... 69 4.1.2.5. Valoración bioquímica para completar el estudio del ciclo de la metilación ................................................................................. 70 4.2. ESTUDIOS ESTADÍSTICOS ................................................................. 70 Tesis Doctoral Índice  3 5. RESULTADOS ............................................................................................... 71 5.1. VIA METABOLICA DE LA HOMOCISTEINA ................................. 81 5.2. RUTAS METABOLICAS RELACIONADAS CON LA METILACIÓN ................................................................................................ 83 5.2.1. Vía Arg-ADMA-NO ........................................................................... 83 5.2.2. Vía Arg-GAA-Creatina ..................................................................... 86 5.3. CORRELACIONES ................................................................................ 88 6. DISCUSIÓN .................................................................................................... 93 6.1. ESTUDIO GENÉTICO ........................................................................... 95 6.2. NUTRICIÓN Y DESARROLLO ........................................................... 97 6.3. METILACIÓN ....................................................................................... 102 6.4. MARCADORES DE CUMPLIMIENTO DIETÉTICO/SEVERIDAD ......................................................................... 109 6.5. NUEVAS ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS ................................... 111 6.6. SESGOS Y LIMITACIONES ............................................................... 112 7. CONCLUSIONES ........................................................................................ 113 8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 119  1. JUSTIFICACIÓN Tesis Doctoral Introducción 12 Figura 1. Clasificación de Saudubray de las enfermedades metabólicas hereditarias en el período neonatal. La PKU se debe a un defecto en la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH, EC 1.14.16.1) catalizadora de la hidroxilación de fenilalanina (Phe) a tirosina (Tyr) (Figura 2).   ," .% (!/,&# &# ! 2% (! &#&" ,$#%!%  $$#',+--- &#&" , $#%!)%  $$,++ &#&" , "# , &# ,.%#% /,&# &# ! )&$&# &#&" , $&!"%,ƌĂƐƚŽƌŶŽĚĞůĂɴ1 (! &#&" , " % 0" "0 $$, $$% ,"% 0" & &#&" ,."&#/,&  $$ &#&" , %#0$&"%,% $0 #&% $0# $  Grupo IV: Predominio de convulsiones: NKH, SO, enzimas peroxisómicas. Grupo V: Tesaurismosis: enzimas lisosomales y peroxisómicas Tesis Doctoral Introducción 13 FENILALANINA Fenilacetonas TIROSINA BH4 Fenilalanina hidroxilasa Catecolaminas Aminotransferasa 4-OH-fenilpiruvato Dioxigenasa 4-OH-fenillactato 4-OH-fenilacetato Dioxigenasa Homogensitato Melallacetoacetato Vit C Fumarilacetoacetato Succinalacetoacetato SuccinilacetonaFumarilacetoacetasa Fumarato Acetoacetato Figura 2. Metabolismo de la Fenilalanina y Tirosina. La disfunción de la PAH produce hiperfenilalaninemia (HPA). En un 12% de los casos, la HPA puede deberse a un déficit del cofactor, Ltetrahidrobiopterina (BH4) (Figura 3). Tesis Doctoral Introducción 14 Figura 3. Hidroxilación de la Phe. El ciclo catalítico de la PAH en presencia de su cofactor natural BH4 se expresa en rojo, las rutas principales de biosíntesis de BH4 en azul, y las de reducción del cofactor oxidado en verde. Las enzimas implicadas se muestran en recuadros. Se indica activación (+) ejercida por la L-Phe y la inhibición (-) ejercida por la BH4 sobre la etapa limitante en la biosíntesis del cofactor. La BH4 está implicada en varias reacciones enzimáticas (Figura 4). Las enzimas conocidas que dependen de BH4 son PAH, tirosina hidroxilasa (TYH), triptófano hidroxilasa (TRYH) 1 y 2, los 3 tipos de óxido nítrico sintetasa (NOS) y gliceril-éter monooxigenasa (GEMO). A nivel celular se ha identificado BH4 como factor de crecimiento en Crithidia fasciculata y con función de factor de control de infectividad en Leishmania major. En el sistema nervioso central BH4 es un factor de autoprotección para óxido nítrico (NO) o neuroprotector general para NOS y tiene función liberadora de dopamina1. Tesis Doctoral Introducción 15 Figura 4. Reacciones enzimáticas mediadas por BH4: 1) Fenilalanina hidroxilasa-PAH; 2) Tisosina hidroxilasa-TYH; 3) Triptófano hidroxilasa-TRYH; 4) Óxido nítrico sintetasa-NOS; 5) Gliceril-etermonooxigenasa-GEMO. q-BH2: quinonoil dihidrobiopterina. 2.2. HISTORIA DE LA FENILCETONURIA. LOS INICIOS En 1934, un médico noruego, Asbjörn Fölling, profesor de Investigaciones nutricionales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Oslo, realizó la primera descripción de la fenilcetonuria al estudiar a dos hermanos con retraso mental severo. Ambos niños presentaban además alteraciones cutáneas y un olor corporal especial. Al analizar la orina de los niños, detectó en ésta la presencia de ácido fenilpirúvico, y decidió entonces explorar si esta relación estaba presente en otros niños con retraso mental2. Fölling identificó así 34 pacientes más procedentes de 22 familias diferentes; además observó que todos ellos compartían una serie de características comunes tales como tez clara, dermatitis, hombros anchos, figura encorvada, marcha espástica y deterioro intelectual severo. Denominó esta enfermedad como “Imbecillitas phenylpirúvica” y los datos genealógicos de esta muestra le dieron la convicción evidente de que su herencia era autosómica Tesis Doctoral Introducción 16 recesiva3. El término fenilcetonuria no se acuñó hasta 19374 y su expresión abreviada, PKU, se ha venido utilizando en los últimos 20 años. En su primer artículo sobre PKU, Fölling teorizó que el aumento de la cantidad de ácido fenilpirúvico observado en las muestras de orina de los niños era resultado de una incapacidad para metabolizar la fenilalanina, un aminoácido. Sucesivas mediciones de los niveles de fenilalanina en sangre de pacientes afectos de PKU confirmaron esta teoría3,4. A partir de esta aportación, otros científicos como George Jervis en EEUU y Lionel Penrose en Inglaterra, iniciaron investigaciones sobre PKU en las poblaciones de sus países5. Jervis observó que si daba Phe a individuos sanos aumentaba la Tyr, sin embargo, esto no ocurría en los pacientes con fenilcetonuria, en los que sí aumentaba la excreción de ácido fenilpirúvico en orina; además los fluidos corporales de los pacientes con PKU contenían una cantidad anormalmente elevada de fenilalanina. Por todo ello, llegó a la conclusión de que estos pacientes tenían problemas en catalizar la conversión de fenilalanina a tirosina y en 1953, demostró que la enzima fenilalanina hidroxilasa, que convierte la fenilalanina en tirosina en el hígado normal, estaba ausente en el hígado de los pacientes afectos de PKU6,7. En 1951 Woolf y Vulliamy fueron los primeros en sugerir que los niveles de fenilalanina y sus productos de degradación podían reducirse mediante la restricción dietética de la ingesta de fenilalanina. También postulaban que otra posibilidad para reducirlos podría ser aumentar la tasa de excreción de fenilalanina administrando alguna sustancia que compitiera para reducir la reabsorción tubular8,9. Dos años más tarde, Bickel et al, siguiendo con esta idea, elaboraron una dieta restringida en fenilalanina y la usaron para tratar a un niño con PKU que tenía retraso mental. Demostraron que la dieta conseguía una reducción importante en la concentración de fenilalanina sanguínea y mejoraba el comportamiento. Durante los siguientes años, varios niños con riesgo de presentar PKU fueron diagnosticados e iniciaron la dieta pronto tras el Tesis Doctoral Introducción 17 nacimiento. Estudios posteriores demostraron que bajo estas condiciones la dieta podía prevenir el retraso mental10-12. De esta forma, a mediados de los años 50, se desarrolló una dieta especial que consiguió prevenir el desarrollo de retraso mental en pacientes con PKU. Para ello se debía iniciar la dieta a edades precoces de la infancia, antes de que se hubiera establecido el retraso mental, y por tanto, preferentemente en el período neonatal. Esta evidencia condujo al cribado neonatal de PKU13. En 1961 Guthrie desarrolló un método que permitía la determinación de Phe. Este método inicialmente se basaba en una técnica llamada “inhibición competitiva”: un compuesto que normalmente evita el crecimiento de una bacteria in vitro, deja de hacerlo cuando grandes cantidades de Phe están presentes en la sangre analizada. Como resultado, en cualquier zona donde haya un nivel elevado de fenilalanina en la muestra de sangre, habrá un crecimiento bacteriano fácilmente detectable14. Sin embargo, ésta era una técnica laboriosa, inviable como cribado neonatal masivo. Entonces se dio cuenta de que una forma simple de recoger sangre entera de los niños era pinchar el talón y secar las gotas de sangre emergente con papel de filtro. Así surgió el test de Guthrie, y se inició el cribado neonatal de la PKU14,15. En 1968 Wilson y Jungner formularon los principios de detección precoz de enfermedades16, que han sido desde entonces el marco principal para considerar si un programa de cribado es aplicable o no. Dichos principios son los que a continuación se enumeran: x La enfermedad debe constituir un problema importante de salud. x Debe existir un tratamiento aceptado para los pacientes en los que se identifica la enfermedad. x Es preciso disponer de servicios de diagnóstico y tratamiento. x Debe existir una fase de latencia o de síntomas incipientes. Tesis Doctoral Introducción 18 x Debe disponerse de una prueba o examen apropiado. x La prueba debe ser aceptable para la población. x Es necesario conocer debidamente el ciclo natural de la enfermedad, inclusive la evolución desde la fase de latencia hasta la de enfermedad declarada. x Se debe establecer una norma sobre las personas que deben tratarse como enfermos. x El coste del programa de localización de casos (incluido el diagnóstico y tratamiento de los pacientes diagnosticados), debe estar económicamente equilibrado en relación con los posibles gastos totales de atención médica. x La localización de casos debe constituir un proceso ininterrumpido, no un proyecto de “una sola vez”. Siguiendo estos criterios, la PKU, junto con otras enfermedades hereditarias metabólicas, forma parte del cribado metabólico neonatal en la práctica totalidad del mundo occidental. Udenfried y Cooper en 195217 y Kaufman en 195718 describieron el proceso químico del metabolismo de la Phe en el hígado, que implica varios componentes como el oxígeno, la PAH, la dihidropterina reductasa (DHPR), la BH4 y la nicotinamida adenina dinucleótido reductasa (NADH) (ver Figuras 2 y 3). En pacientes con PKU clásica la alteración se produce a nivel de la PAH, mientras que en otros pacientes la alteración se debe a la deficiencia de la coenzima BH419. Los doctores Chen y Woo, ambos del Departamento de Medicina Celular y Genética en la Escuela de Medicina Mount Sinai, aislaron e identificaron por primera vez en 1983 el gen PAH, que codifica la enzima fenilalanina hidroxilasa, y que se localiza en el cromosoma 12 (12q22-24)20. Tesis Doctoral Introducción 19 En los últimos años, la investigación genética ha llevado a realizar varios ensayos de expresión in vitro de numerosos alelos de PAH, visualizándose varios dominios de la PAH, lo que ha dado origen a los primeros ensayos sobre terapia génica. 2.3. CONCEPTOS BÁSICOS 2.3.1. Aminoácidos. Definición Los aminoácidos son sustancias químicas orgánicas en cuya composición molecular un grupo amino básico y un grupo carboxilo ácido se unen a la misma molécula de carbono. Se diferencian por el radical de la molécula R. Proceden de las proteínas de la dieta, de la proteólisis muscular y de la síntesis propia. Son utilizados por el organismo para la biosíntesis de proteínas, como precursores de sustratos nitrogenados (neurotransmisores, catecolaminas, etc.) y en pequeña cantidad son eliminados por heces, orina y descamación cutánea21. En una clasificación, específicamente nutricional, los aminoácidos pueden ser esenciales o no esenciales. Los primeros se llaman así debido a que su síntesis corporal es inadecuada o nula para satisfacer las necesidades metabólicas y por tanto deben ser aportados como parte de la dieta. Los aminoácidos no esenciales, si no están presentes en cantidades adecuadas en el momento de la síntesis proteica, pueden ser sintetizados mediante diferentes procesos, como la transaminación, ya sea a partir de aminoácidos esenciales o a partir de precursores apropiados de carbono y nitrógeno que se encuentran en la célula. Los aminoácidos esenciales son: la valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr). La arginina (Arg) y la histidina (His) son esenciales en los niños muy pequeños ya que sus requerimientos son mayores que su capacidad para sintetizar estos aminoácidos. Los aminoácidos no esenciales son: la glicina (Gly), alanina (Ala), prolina (Pro), hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl), serina (Ser), arginina (Arg), Tesis Doctoral Introducción 20 taurina (Tau), histidina (His), ácido glutámico (Glu), cisteína (Cys), tirosina (Tyr), asparagina (Asn), glutamina (Gln) y ácido aspártico (Asp)22. 2.3.2. Fenilalanina La fenilalanina es un aminoácido aromático esencial que constituye aproximadamente el 5% de las proteínas, y cuyos niveles en sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) permanecen prácticamente constantes a lo largo de toda la vida desde el momento del nacimiento. Los niveles de fenilalanina en sangre aumentan a expensas de la fenilalanina procedente de la dieta y del catabolismo proteico, y disminuyen a expensas de su utilización en la síntesis proteica, la hidroxilación de fenilalanina a tirosina, la eliminación urinaria, y en circunstancias excepcionales, de su decarboxilación y transaminación a feniletilamina y fenilpiruvato, respectivamente21. La fenilalanina es un precursor de la tirosina, y ambos aminoácidos actúan a su vez como precursores de las catecolaminas DOPA (dopamina, adrenalina y noradrenalina), de la melanina y de la tiroxina22. 2.4. HIPERFENILALANINEMIA 2.4.1. Concepto La hiperfenilalaninemia es el error congénito del metabolismo de los aminoácidos más frecuente, constituyendo un grupo genéticamente heterogéneo de alteraciones congénitas del metabolismo de la fenilalanina, que tienen en común un déficit de su hidroxilación y como consecuencia de ello un aumento de sus niveles en sangre. Fue la primera enfermedad en la que se identificó un agente tóxico, la fenilalanina, como causa de retraso mental severo y para la cual se encontró un tratamiento que prevenía la aparición de las características clínicas de la enfermedad. Tesis Doctoral Introducción 21 2.4.2. Epidemiología En Europa la incidencia oscila alrededor de 1 por cada 10.000 nacimientos, pero en algunas zonas de Europa esta incidencia es más elevada. En Turquía se ha detectado en 1 de cada 4.000 nacimientos, debido a la elevada consanguinidad en su población, y también se han observado incidencias más elevadas en el norte de Irlanda, mientras que Finlandia tiene la prevalencia más baja de Europa con 1 caso cada 100.000. En EEUU se ha observado una prevalencia de 1/15.000. En Latinoamérica varía entre un caso por 25.000-50.000 nacimientos, con prevalencia más elevada en el sur de Latinoamérica. Las prevalencias en Asia varían de 1 por cada 15.000-100.500 nacimientos según las diferentes regiones de China, <1/200.000 en Tailandia y cerca de 1/70.000 en Japón. África parece tener una prevalencia de fenilcetonuria muy baja y España tiene una prevalencia especialmente elevada de hiperfenilalaninemia leve. En España la incidencia estimada es de 1:19.747 para PKU y de 1:12.422 la de las hiperfenilalaninemias moderadas y leves23. En Galicia, Couce et al describen una prevalencia de PKU de 1/12.363 mientras que la de HPA benignas es de 1/6.00524. 2.4.3. Fisiopatología La mayor parte de los casos de hiperfenilalaninemia se deben a alguna mutación en el gen que codifica la enzima hepática PAH, que convierte la fenilalanina en tirosina utilizando como cofactor la BH4, común para las hidrolasas de la tirosina y del triptófano. En un 1-2% de los casos, se debe a una alteración en los genes que codifican las enzimas implicadas en la biosíntesis o regeneración del cofactor BH425. Tesis Doctoral Introducción 28 El objetivo del tratamiento de la hiperfenilalaninemia en pacientes PKU es prevenir el establecimiento o el empeoramiento de tales complicaciones de la enfermedad. Los enfermos que siguen un tratamiento adecuado e instaurado de forma precoz tienen un desarrollo neurológico e intelectual dentro de los límites normales. 2.7. DIAGNÓSTICO 2.7.1. Cribado El cribado de PKU debe ser realizado a todos los recién nacidos en los primeros días de vida para permitir una intervención terapéutica lo más precoz posible y así prevenir el desarrollo de secuelas neurológicas. La muestra de sangre se suele obtener al tercer día de vida28, tras punción del talón (Figura 10). Recientemente se ha publicado la posibilidad de realizar dicha extracción tras punción venosa a nivel del dorso de la mano, ya que ello parece ofrecer como ventaja menos dolor para el niño, así como menos riesgo de efectos secundarios tales como osteocondritis del calcáneo, equimosis, hematomas, etc36. Figura 10. Toma de muestra de sangre en el talón de un recién nacido para realizar las pruebas de cribado metabólico. La sangre se recoge en un papel de filtro absorbente denominado genéricamente tarjeta de Guthrie, que cumpla con las normas del National Committee for Clinical Laboratory Standars (2014/07 de Munktell). Tesis Doctoral Introducción 29 La clásica prueba de Guthrie ya no se utiliza. En la actualidad se han ido desarrollando otros métodos analíticos que mejoran la precisión, sensibilidad, viabilidad y tiempo de ejecución del test analítico. El cribado de la PKU se puede realizar mediante fluorometría, métodos enzimáticos colorimétricos, cromatrografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en papel o en capa fina y últimamente mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). La espectrometría de masas en tándem es un método rápido para conseguir determinaciones fiables y cuantitativas de las concentraciones de aminoácidos en pequeños volúmenes de sangre o plasma. Este método proporciona menos tasa de resultados falsos positivos, mediante la medición de los niveles de fenilalanina y tirosina y provee la proporción fenilalanina/tirosina. Además, pueden ser evaluados a la vez otros errores congénitos del metabolismo28,37. El punto de corte para la Phe se establece en 150 μmol/L si se determina por métodos fluorométricos y en 120 μmol/L si es por MS/MS, y se considera normal una relación Phe/Tyr <2. Para una determinación correcta es necesario asegurarse de que el paciente haya realizado una ingesta adecuada de proteínas y que no esté recibiendo nutrición parenteral38. Algunos niños, particularmente los recién nacidos prematuros, pueden presentar inmadurez de los sistemas enzimáticos involucrados en el metabolismo de los aminoácidos, resultando así una elevación transitoria en sangre de Phe que da positivo en el test de cribado de PKU. Los resultados de un cribado precoz de PKU en neonatos enfermos o sometidos a alimentación parenteral o transfusión sanguínea, deberían ser interpretados con precaución, realizándose un segundo test si no está claro que el niño haya ingerido suficiente proteína cuando el primer test fue realizado23,28. Situaciones especiales en las que debe realizarse una segunda muestra son: x Prematuros y gemelos monocigóticos: Se recomienda una segunda toma de muestra en los prematuros de menos de 34 semanas y/o 2.000 g de peso y gemelos monocigóticos al mes de vida, o entre la tercera y cuarta semana de vida. Tesis Doctoral Introducción 30 x Recién nacidos con patología grave al nacimiento: En estos casos, se debe tomar una muestra en el momento de ingreso (antes de que puedan recibir tratamiento antibiótico, alimentación parenteral,…) y repetirla a las 48-72 horas de vida según los resultados, fundamentalmente porque pueden existir elevaciones transitorias de TSH/IRT en la primera muestra. x Transfusiones previas al cribado: En este caso se debe ralizar una toma de muestra a las 48-72 horas de la transfusión y repetirla a los 120 días. x Alimentación parenteral: En aquellos pacientes que estén recibiendo esta nutrición debe practicarse un nuevo cribado a los tres días de haber reiniciado la alimentación enteral normal, con independencia de la edad del niño en ese momento. 2.7.2. Confirmación Diagnóstica En todos los casos de hiperfenilalaninemia, tras asegurarse de que el paciente recibe una alimentación con una ingesta proteica equivalente a 3 gramos de proteínas naturales/kg/día (150 mg/kg/día de Phe)39, se procede a la confirmación y diagnóstico diferencial de la hiperfenilalaninemia mediante: x Cuantificación de aminoácidos en plasma o suero (permite establecer los niveles de Phe y Tyr). x Valoración de la actividad de DHPR en eritrocitos40 en sangre total en papel de filtro. x Cuantificación e identificación de aminoácidos, ácidos orgánicos y pterinas (neopterina y biopterina)41 en orina de al menos 6-12 horas recogida en oscuridad y congelada posteriormente.  Tesis Doctoral Introducción 31 2.7.3. Defectos del cofactor BH4 Aproximadamente un 1-2% de las elevaciones de Phe detectadas en el cribado neonatal son debidas a alteraciones en el metabolismo de la BH442. Las alteraciones de la BH4 son más severas que la PKU por deficiencia enzimática, en el sentido de que su respuesta al tratamiento es sustancialmente diferente, ya que no responden a la dieta restringida en proteínas naturales. El análisis de orina, como veremos más adelante, para el estudio de neopterina y biopterina y la medición de la actividad de DHPR en sangre, son imprescindibles para el diagnóstico de esta entidad, y ha de llevarse a cabo lo antes posible. En los defectos del cofactor BH4, los niveles de fenilalanina son muy variables, desde 150 Pmol/L hasta incluso 3.600 Pmol/L. La actividad DHPR en eritrocitos se encuentra disminuida en las deficiencias de DHPR. En las deficiencias de GTPCH y en las de PTPS, la actividad DHPR es normal43. Con la valoración de excreción de pterinas en orina se puede precisar ante qué déficit concreto nos encontramos44: x Neopterina normal, biopterina muy aumentada, con un porcentaje de biopterinas >84%: Deficiencia de DHPR. x Neopterina y biopterina muy disminuidas, porcentaje de biopterina del 50%: Deficiencia de GTPCH. x Neopterina muy aumentada, biopterina muy disminuida, porcentaje de biopterina <12%: Deficiencia en PTPS. x Presencia de primapterina (“7-biopterina”) en orina: Deficiencia de PCD. Ante la sospecha de una deficiencia en la síntesis y/o en el reciclaje de la BH4, deberemos efectuar dos pruebas más45: x Determinación de pterinas y neurotransmisores en LCR, ya que los niveles de ácido homovanílico (HMV) y ácido 5 hidroxiindolacético (5HIA) en LCR están muy disminuidos45, así como las diferencias en Tesis Doctoral Introducción 32 los ratios de los niveles de neurotransmisores, que proporcionan información diagnóstica relevante en cuanto a la severidad del déficit de BH446. x Sobrecarga con BH4 oral: esta prueba consiste en la administración al paciente de 20 mg/kg de BH4, tomando muestras de sangre basal (antes de la sobrecarga), y a las 4, 8, 12 y 24 horas de la misma28,44. En las deficiencias de síntesis de BH4 (deficiencias de GTPCH y de PTPS) se normalizan los valores de Phe a las 4 horas post-BH4 y se mantienen normales en las siguientes tomas de la sobrecarga. En las deficiencias de DHPR, disminuye la Phe basal un 30-40% entre las 4 y 8 horas pero posteriormente vuelve a aumentar hasta los niveles basales. 2.7.4. Sobrecarga de BH4 Antes se utilizaba esta prueba únicamente en las deficiencias de síntesis o de regeneración del cofactor, pero tras los estudios de Kure39, en los que se constató que algunos pacientes PKU responden a la sobrecarga de BH4, ahora se practica en todos los pacientes con hiperfenilalaninemia que precisen tratamiento (Figura 11). El test de sobrecarga de BH4 permite así identificar a los pacientes PKU que responden a la administración de BH4. Esto es importante ya que en estos pacientes la administración de BH4 disminuye los niveles sanguíneos de Phe, o incluso puede llegar a normalizarlos47. La mayoría de protocolos de test de sobrecarga de BH4 que se utilizan para diagnosticar la respuesta a la BH4, se han descrito con dosis iniciales de 1020 mg/kg de sapropterina. Una concentración plasmática de 400 μmol/L al comienzo del test se considera un punto de corte razonable para poder observarse un efecto clínico sustancial de la medicación, si bien es cierto que límites más bajos pueden ser también valorables para los pacientes más jóvenes. Una reducción de la Phe sanguínea del 30% se considera una respuesta positiva al tratamiento, otros la consideran a partir del 50%, aunque se reconoce en ficha    .4(#&&#,.&'4#)*,-,#*.),*,#(#0#/,&*/(.)),. *,.#,&/&)(-#,&,-*/-.*)-#.#0( /(#6(-)#(#0#/& #&)-(#0&--(!/5()-"-(/(.,((.,1ȝ')&-'#( (/0)&)-(#0&-"1-)'*,/&.)&,(#&"(.-&.-. -),,!)( ,-*/-.&-'3-"#./&(&- ),'-'3-'),-+/ -)(#-'/.#)(-&(&-+/-.(2#'.#(.)05/( .#0#,-#/& .-,-*/-.&0,51&)-,-*)(),-&(.)-*#(.- +/(),-*)(()(/(,/#6(-/-.(#&(&)-(#0&--(!/5()-" (.,)&-"),-#(##&-),,!-/*)((/(&.).& ,-*)(),- & *,).))&) *,)*/-.) *), & !,/*)  .,$) /,)*) *,)*)( '#(#-.,,/()-#--*,)*.,#('!%!1'#,&)-(#0&--(!/5()- "&-1"),-#-)-,0-(-)&"-(!/5( - )(-#, *)-#.#0) )( &&) - )(-#!/ #(.# #,  &)- ,-*)(),- #(##&-*/(&--#!/#(.-"),-,,/(-!/().-.&)- *#(.-(),-*)(),--(-)&)-(#0&--(!/5()-" '#(#-.,3()-&- )., )-#-  -*,)*.,#(   '!%! 1 -# - )-,0 -(-)&"-(!/5(-)(-#,*)-#.#0))(-.-!/().-. -)(-#!/*),&).(.)#(.# #,&)-,-*)(),-&(.)-  Tesis Doctoral Introducción 34 Figura 11. Diagrama diagnóstico de la PKU y de los defectos de BH4. (Fuente: Blau et al). 2.8. CLASIFICACIÓN La HPA puede ser clasificada en 2 categorías generales, según cuál de las 2 enzimas que participan en el sistema de hidroxilación de la Phe esté alterada: PAH o cofactor BH4. Dependiendo del defecto enzimático, el genotipo y la severidad de la HPA (basada en las concentraciones sanguíneas de Phe sin tratamiento) pueden distinguirse cuatro fenotipos diferentes52: Tesis Doctoral Introducción 35 x Niveles 120 a 360 μmol/L: HPA benigna. x Niveles 360-600 μmol/L: PKU leve. x Niveles 600-1200 μmol/L: PKU moderada. x Niveles 1200 μmol/L: PKU clásica. En los tres primeros tipos, existe una cierta actividad residual del enzima, mientras que en la PKU clásica, la actividad de la PAH es nula o muy escasa23,35. Esta clasificación no siempre es sencilla, ya que las concentraciones de Phe son medidas en los recién nacidos en un momento en que la Phe en sangre puede no haber tenido tiempo de alcanzar su máximo nivel, y los puntos de corte para estas clasificaciones varían entre distintos países26. La clasificación también puede realizarse en base a la tolerancia de la Phe de la dieta, lo cual no siempre es fácil de medir con precisión. Así, en la PKU clásica, la tolerancia habitualmente no es mayor de 250 mg/día, mientras que en la PKU leve o incluso moderada, la tolerancia puede ir desde los 250 a los 400 mg/día23. La tolerancia a la Phe normalmente se determina a los 5 años de edad, y según ella la PKU puede clasificarse en28: x PKU clásica: tolerancia <20 mg/kg/día (250-350 mg/día). x PKU moderada: tolerancia de 20 a 25 mg/kg/día (350-400 mg/día). x PKU leve: tolerancia de 25-50 mg/kg/día (400-600 mg/día). x Hiperfenilalaninemia leve: pacientes sin necesidad de dieta. Recientemente se ha demostrado que la tolerancia de fenilalanina puede ser predecible ya a la edad de 2 años y que la tolerancia a la edad de 2,3 y 5 años se correlaciona con la de los 10 años de edad. Por el contrario, en adultos puede ser necesario reajustar la tolerancia a la fenilalanina28.  Tesis Doctoral Introducción 36 2.9. TRATAMIENTO 2.9.1. Dieta La restricción de fenilalanina en la dieta continúa siendo el pilar del tratamiento de la fenilcetonuria y habitualmente se inicia inmediatamente tras la confirmación de la hiperfenilalaninemia en el neonato. El objetivo de la dieta es conseguir concentraciones de fenilalanina en sangre dentro de los niveles recomendados. En la actualidad, la recomendación es suministrar a los pacientes un aporte proteico situado en el rango 113-129% de la cantidad diaria recomendada (CDR)53. El diagnóstico e intervención precoz tras el nacimiento, con dieta restringida en fenilalanina de por vida, mantiene su concentración en sangre dentro de los rangos recomendados para la edad y previene el desarrollo de discapacidades mentales severas23. Para evitar un déficit del resto de aminoácidos presentes en la proteínas naturales, deben suplementar su dieta con preparados, fórmulas de aminoácidos libres de fenilalanina, enriquecidas con hidratos de carbono, lípidos, ácidos grasos esenciales, minerales y vitaminas23,54, que varían entre unos productos y otros y que constituyen la mayor fuente de aporte proteico de sus dietas. Estos productos son costosos y tienen un sabor más desagradable. Este balance entre la tolerancia a la fenilalanina y sus requerimientos, varía de unos pacientes a otros en función de distintos factores, como son la actividad residual de la PAH in vivo, el sexo o la edad54. Aunque la restricción de la fenilalanina en la dieta es el pilar del tratamiento de la fenilcetonuria en todo el mundo, existen diferencias significativas en los niveles de fenilalanina sanguínea que se recomiendan tanto en niños como en adultos entre distintos países55 (Tabla 1, Figura 12). Tesis Doctoral Introducción 37 España Reino Unido56 Alemania EEUU Inicio tratamiento  360 μmol/L > 420μmol/L > 600 μmol/L > 600 μmol/L 0 - 6 años < 360 μmol/L < 360μmol/L < 240 μmol/L < 360 μmol/L 6 - 9 años < 480 μmol/L < 480 μmol/L < 240 μmol/L < 360 μmol/L 9 - 12 años < 600 μmol/L < 480 μmol/L < 900 μmol/L < 360 μmol/L 12 - 15 años < 600 μmol/L < 700 μmol/L < 900 μmol/L < 600 μmol/L Adolescentes /adultos < 600 μmol/L < 700 μmol/L < 1200 μmol/L < 900 μmol/L Embarazo < 180 μmol/L < 240 μmol/L < 240 μmol/L < 240 μmol/L Tabla 1. Límites superiores de las concentraciones objetivo de Phe (μmol/L) recomendada para el tratamiento de PKU en diferentes países23. Figura 12: Límites superiores de las concentraciones objetivo de Phe (μmol/L) recomendada para el tratamiento de PKU en diferentes países26. (y: years). Por otra parte, la restricción proteica de la dieta de los pacientes fenilcetonúricos tiene como riesgo principal la aparición de deficiencias nutricionales, de ahí la importancia de realizar una monitorización exhaustiva desde el punto de vista clínico, dietético y analítico. En España se sigue generalmente el Protocolo de diagnóstico, tratamiento y seguimiento de las Hiperfenilalaninemias propuesto por la AECOM en 1998 y actualizado en 2011, que se expone en la Tabla 2 de forma resumida44,58. Tesis Doctoral Introducción 44 En cuanto al comportamiento, existen escasos conocimientos sobre los posibles problemas psiquiátricos en pacientes afectos de PKU, y hay una particular ausencia de datos sobre la neurobiología de esta enfermedad. Algunos hallazgos apuntan hacia la posibilidad de problemas de comportamiento, tendencia a la depresión, ansiedad o tendencias fóbicas. También se han observado comportamientos como el déficit de atención e hiperactividad, sobre todo del primer tipo66. En cuanto a su calidad de vida, algunos estudios muestran menor autonomía, peor autoestima, menor extroversión e impulsividad y sensación de no estar lo suficientemente sano66 con respecto a personas no PKU, mientras que otros no encuentran estas diferencias23. Dado que se conoce que las consecuencias clínicas para un mismo nivel de fenilalanina en sangre son diferentes para cada paciente adulto, el abordaje del tratamiento en estos pacientes debería ser individualizado. Se precisan más datos sobre el tratamiento en adultos para realizar guías terapéuticas como ya existen para la edad infantil26. Los pacientes diagnosticados de PKU por cribado neonatal en los años 60s-70s, son ahora adultos de mediana edad, por lo que en las siguientes décadas surgirán los primeros estudios en pacientes ancianos tratados precozmente. No se conoce todavía si estos pacientes tendrán más riesgo de desarrollar demencia temprana u otras formas de declive neurológico. Los efectos de la restricción dietética a largo plazo son difíciles de predecir. Las dietas restrictivas de los pacientes con PKU pueden alterar el estado antioxidante como consecuencia de la deficiencia de selenio o de coenzima Q10. Algunos estudios indican que la peroxidación lipídica o el daño del DNA son mayores en pacientes con PKU, incluso cuando los niveles de fenilalanina están bajo control26. La ingesta proteica en pacientes afectos de PKU casi en su mayor parte consiste en fórmulas de aminoácidos libres de fenilalanina y con frecuencia exceden las CDR en la población general, especialmente durante los primeros Tesis Doctoral Introducción 45 años de vida. La ingesta de aminoácidos sintéticos provoca un pico en la concentración de aminoácidos en plasma poco después de su ingesta, lo que conlleva una elevada carga ácida renal, mientras que tras la ingesta de proteína natural las concentraciones plasmáticas de aminoácidos permanecen estables. La proteína de la dieta es un modulador bien conocido de la función renal72. En este sentido, Hennermann et al72 realizaron un estudio en el que encontraron, en los pacientes adolescentes y adultos afectos de PKU estudiados, una alta prevalencia de proteinuria, disminución de la tasa de filtración glomerular, hipercalciuria e hipertensión arterial, ésta última principalmente relacionada con la obesidad, que tiene una elevada prevalencia en los pacientes con PKU54. Estas alteraciones podrían deberse a la ingesta de elevadas cantidades de aminoácidos sintéticos, al aumento del estrés oxidativo y al daño local a través de la alta excreción de derivados de la fenilalanina72. Recientemente, Mirás et al han puesto de manifiesto que la disminución en la ingesta de proteína natural podría jugar un papel en el desarrollo de enfermedad ósea mineral en pacientes PKU, mientras que los pacientes con terapia con tetrahidrobiopterina, que permite una dieta proteica más laxa, presentarían mejor masa ósea73. La determinación periódica de fosfatasa alcalina ósea permitiría identificar a los pacientes con riesgo aumentado de enfermedad mineral ósea74. Se necesitan nuevos estudios longitudinales a largo plazo que precisen el efecto de una dieta con tales restricciones de proteína natural sobre el crecimiento. En diferentes estudios previos mayoritariamente se han encontrado diferencias en el crecimiento en pacientes PKU respecto a sujetos sanos, pero la variabilidad de estos estudios y los pequeños tamaños muestrales, impiden sacar conclusiones definitivas75. Arnold et al, encontraron una fuerte correlación entre una menor altura y la menor concentración de prealbúmina, siendo una prealbúmina <20 mg/dL el valor por debajo del cual aparece deterioro del crecimiento76. Tesis Doctoral Introducción 46 Se ha puesto de manifiesto en diversos estudios una mayor tendencia a la obesidad en los pacientes PKU, pero se precisan otros nuevos para valorar sus causas y su impacto en la salud de éstos75. Por otra parte, Schulpis et al, demostraron que los pacientes que siguen una dieta estricta PKU, presentan unos niveles más bajos de vitaminas B6, B12 y ácido fólico, que conllevan una elevación moderada de la homocisteína en plasma, lo que a su vez correlacionaron con un incremento del riesgo cardiovascular77. Por este motivo, los suplementos nutricionales de estos pacientes están enriquecidos con vitaminas del grupo B y ácido fólico. 2.11. HOMOCISTEÍNA Y CICLO DE LA METILACION La homocisteína es un aminoácido azufrado, no esencial, no proteinógeno, que se origina a partir de la metionina, aminoácido esencial que proviene de las proteínas. La homocisteína se halla en una encrucijada de vías metabólicas: la de la trans-sulfuración y la de la remetilación (Figura 13)78. Figura 13. Vía metabólica de los aminoácidos sulfurados. Vía de trans-sulfuración de la metionina y ciclo de la remetilación. Adaptado de Sanjurjo y Baldellou. Tesis Doctoral Introducción 47 Por la vía de la trans-sulfuración, la metionina, a través de la enzima metionina adenosiltransferasa se convierte en S-adenosilmetionina (SAM), que es el principal dador de grupos metilo del organismo. Estas reacciones van a dar lugar a la producción de S-adenosilhomocisteína (SAH), la cual se metaboliza en adenosina y homocisteína por la S-adenosilhomocisteína hidrolasa. La homocisteína se transforma en cistationina mediante la cistationina E-sintetasa, con ayuda del cofactor piridoxal-fosfato. La cistationina a su vez se transforma en cisteína, precursora del glutatión y la taurina, compuestos de gran importancia metabólica como antioxidante (glutatión) y neurotransmisor (taurina). La cisteína es finalmente catabolizada eliminándose por la orina en forma de sulfato. La homocisteína se puede también remetilar transformándose en metionina por dos vías. La reacción de remetilación más importante es catalizada por la metionina sintetasa (MS), que utiliza como sustrato el metiltetrahidrofolato (MTHF) y debe ser activada por la metionina sintetasa reductasa (MSR). Esta reacción de remetilación requiere metil-cobalamina (MCbl) como coenzima. El MTHF constituye la mayor fuente de folato plasmático y proviene de la reducción de 5,10-metilentetrahidrofolato, catalizada por la enzima 5,10metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Esta enzima tiene un papel indirecto, pero básico, en la remetilación de la homocisteína. La otra vía de remetilación se localiza principalmente en el hígado y en el riñón, siendo catalizada por la betaína:homocisteína metiltransferasa (BHMT). El metabolismo de la homocisteína se halla estrechamente regulado por la ingesta de aminoácidos sulfurados. Cuando existe un exceso de metionina debido a una elevada ingesta proteica, la homocisteína es catabolizada por la vía de la trans-sulfuración, transformándose en cisteína y eliminándose por la orina en forma de sulfato. Si la ingesta de metionina es baja, la homocisteína se remetila, formándose metionina y SAM, dador de grupos metilo. Estos grupos metilo actúan en la remetilación de más de 100 metabolitos (DNA, creatina/creatinina, ADMA, hormonas, neurotransmisores)78. Tesis Doctoral Introducción 48 Alteraciones en la vía de la trans-sulfuración dan lugar a varios trastornos hereditarios en el metabolismo de los aminoácidos sulfurados, mientras que las alteraciones en la vía de la remetilación están ligadas a los defectos del metabolismo de la cobalamina y el folato. En cualquiera de los casos, la consecuencia bioquímica será una hiperhomocisteinemia. Si existe una alteración genética que condiciona el déficit (total o parcial) de las enzimas implicadas en el metabolismo de la homocisteína, hablaremos de una homocistinuria congénita; hablaremos de una homocistinuria adquirida cuando ésta sea derivada de factores asociados al estilo de vida (vegetarianismo puro), fármacos (antagonistas del ácido fólico, carbamacepina, óxido nítrico, metrotexate, colestiramina, niacina, etc) o ciertas condiciones clínicas (insuficiencia renal, arteriosclerosis)79-81. Los pacientes PKU que siguen un tratamiento dietético, como ya hemos comentado anteriormente, presentan un riesgo de desarrollar un déficit de vitaminas B6, B12 y ácido fólico, lo que a su vez en teoría generaría una homocistinuria adquirida77; sin embargo, la restricción proteica y los aportes de B12 y ácido fólico de los suplementos conllevarían la situación contraria, esto es, una disminución de la homocisteína que se remetilaría a metionina. 2.12. DIMETILARGININA ASIMÉTRICA (ADMA) La N-N-dimetil-L-arginina asimétrica (ADMA) es un inhibidor competitivo endógeno del grupo enzimático óxido nítrico sintetasa, que cataliza la conversión del aminoácido L-arginina en L-citrulina y NO, lo que conlleva una reducción de la producción de NO. Esta competencia se debe a la estrecha similitud entre la composición química de la L-arginina y la molécula de ADMA; la ADMA difiere de la L-arginina en que posee 2 grupos metilos en el grupo amino-terminal de la L-arginina82. 2.12.1. Formación de ADMA La producción de ADMA es debida a la proteólisis de proteínas con residuos de L-arginina metilados. La arginina libre no se metila, sólo se metilan aquellos residuos de L-arginina presentes en las proteínas. Tesis Doctoral Introducción 49 Este proceso de metilación de los residuos L-arginina de las proteínas, es catalizado por medio de un grupo de enzimas denominadas S-adenosilmetionina N-metiltransferasa (PRMTs), proteínas metilasas I y II, debido a que transfieren uno o más grupos metilos desde el donador S-adenosilmetionina, producto intermediario del metabolismo de la homocisteína, a proteínas o polipéptidos con residuos de L-arginina. Esta reacción produce N-adenosil-L-homocisteína y proteínas metiladas que contienen residuos de L-arginina metilada, y la posterior proteólisis de dichas proteínas con los residuos L-arginina metilados, da lugar a la liberación de tres tipos de compuestos; ADMA, dimetilarginina simétrica (SDMA) y Nmonometil-L-arginina (L-NMMA)82,84. (Figura 14) Figura 14. Vía metabólica de formación de la dimetilarginina asimétrica (ADMA). La metilación de las proteínas con residuos de L-arginina se debe a la acción de proteínas metilasas (PRMT), que transfieren grupos metilos desde la S-adenosilmetionina (SAM) a la S-adenosilhomocisteína (SHA), productos intermediarios del metabolismo de la homocisteína. La proteólisis de las proteínas con residuos de Larginina produce ADMA. (Fuente: Galán et al) El ADMA es el principal producto de la PRMT tipo I, mientras que la tipo II forma SDMA. Ambas son capaces de producir L-NMMA83,84. Tesis Doctoral Introducción 50 En condiciones de estrés oxidativo, se puede incrementar la actividad de la PRMT I en las células endoteliales, dando lugar a un aumento en la producción de ADMA85. Concentraciones elevadas de ADMA pueden bloquear la síntesis de NO, molécula antiaterogéna endógena por excelencia, debido a su función reguladora del endotelio vascular. Las disminuciones del NO favorecen la disfunción endotelial causada por factores de riesgo cardiovascular, inflamaciones o alteraciones metabólicas82 (Figura 15). Figura 15. Esquema de la reacción química de la síntesis de óxido nítrico (Galán et al). La NOS cataliza la transformación del aminoácido L-arginina en L-citrulina y NO, utilizando como cofactor el NADPH y O2. 2.12.2. Óxido nítrico El NO se sintetiza a partir de la L-arginina por medio de la acción de un grupo de enzimas denominado NOS. El NO tiene funciones antiaterogénicas, capacidad de producir vasodilatación, regula la presión arterial, controla el tono vascular y contribuye a mantener la estructura de la pared arterial, produce una inhibición endógena de la agregación plaquetaria (antiagregante y antiadherente plaquetar), frena la proliferación de células de músculo liso en la pared vascular inhibiendo la expresión de proteínas de adherencia (P-selectina para las plaquetas y E-integrinas para los leucocitos), hecho que impide la liberación de factores de Tesis Doctoral Introducción 51 crecimiento capaces de cambiar el fenotipo de las células musculares lisas, de contráctiles a secretoras; reduce la producción de radicales libres ocasionados en los procesos inflamatorios y citotóxicos, con lo que disminuye el estrés oxidativo al neutralizar el radical superóxido de las membranas celulares e inhibe la oxidación de las partículas de LDL, disminuye la formación de placas de ateroma e inhibe la activación leucocitaria, con lo que impide la adhesión de leucocitos y monocitos al endotelio vascular82,86. 2.12.3. Inhibición de la síntesis de óxido nítrico La actividad de la NOS se puede inhibir por el L-NMMA y el ADMA, productos que como se ha comentado anteriormente resultan de la proteólisis de proteínas con residuos de arginina metilados. Estas sustancias se denominan monometilargininas o dimetilargininas, en función de que presenten uno o dos grupos metilos en el grupo aminoterminal de la arginina y pueden detectarse tanto en suero como en orina. En condiciones fisiológicas estos compuestos se encuentran en concentraciones bajas, pero en algunas circunstancias patológicas, pueden llegar a ser suficientemente elevadas como para disminuir la síntesis de NO82. 2.12.4. Eliminación de ADMA La enzima dimetilarginina dimetilaminohidrolasa (DDAH) hidroliza la mayor parte del ADMA en L-citrulina y dimetilamina. La DDAH 1 parece estar involucrada en la regulación de la concentración de ADMA y la DDAH 2 en la concentración local de ADMA. La actividad de la DDAH está disminuida por el estrés oxidativo, lo que conlleva el acúmulo de ADMA. La LDL oxidada, la homocisteína y la hiperglucemia, disminuyen la actividad de la DDAH. La demostración de las acciones biológicas del ADMA y el efecto del estrés oxidativo en la DDAH, ha dado credibilidad al concepto de que el ADMA podría explicar la unión entre los factores de riesgo cardiovascular y la disfunción endotelial. Otra parte del ADMA se elimina en forma de cetoácidos debido a la acción de la enzima dimetilarginina piruvato aminotransferasa82,84,86. Tesis Doctoral Introducción 52 Debido a la acción inhibitoria que el ADMA ejerce sobre la NOS, concentraciones elevadas de ADMA bloquean la formación de NO en el endotelio vascular, lo cual provoca alteraciones de éste al disminuir la vasodilatación y favorecer la agregación plaquetaria, la proliferación celular, la oxidación de las LDL, la aparición de radicales libres y otros factores que contribuyen a la formación y progresión del proceso aterosclerótico. Por ello, el ADMA se considera un factor de riesgo cardiovascular82. La reducción en la producción de NO causa disfunción endotelial, vasoconstricción, elevación de la presión arterial, aterosclerosis y progresión de la enfermedad renal83,84. En adultos se han observado elevaciones del ADMA en sangre en pacientes con arterosclerosis sistémica, hipercolesterolemia, hipertensión arterial esencial, hipertensión pulmonar, enfermedad renal crónica, diabetes mellitus, enfermedad arterial periférica, enfermedades coronarias, preeclampsia, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad hepática, infarto, hipertiroidismo, resistencia a la insulina y muchas otras alteraciones clínicas82,83. El ADMA se considera un predictor de enfermedades cardiovasculares y muerte en la población adulta83,84. En pediatría los estudios sobre ADMA han sido limitados por el pequeño tamaño de las muestras, aunque varios de ellos han encontrado elevaciones del ADMA en la población pediátrica en diferentes situaciones clínicas. Dentro de la enfermedades metabólicas, se ha visto que en niños con alteraciones congénitas del ciclo de la urea los niveles de ADMA están elevados83.También se han observado niveles de ADMA elevados en neonatos pretérmino con ventilación mecánica84. Los niveles de ADMA son muy variables según las diferentes edades. Desde el nacimiento hasta la adolescencia ocurren numerosos cambios fisiológicos en el cuerpo, que pueden influir en este hecho, como que el 20% del ADMA se excreta en orina y la función renal es diferente desde el nacimiento hasta la adolescencia. Durante la niñez los niveles de ADMA son más altos que Tesis Doctoral Introducción 53 en el adulto y disminuyen desde el nacimiento hasta aproximadamente los 25 años de edad, con una media de decrecimiento de 15 nmol por año83,84. Aunque los niveles de ADMA son mayores en neonatos y en la población geriátrica, queda por determinar si la relación entre los niveles normales de ADMA y la edad puede ser atribuída a la función renal. Además, se ha observado que en personas sanas pueden existir variaciones intraindividuales del ADMA entre un 5 y un 14%82. Se precisan más estudios para valorar si hay otros factores que influyan en el valor de ADMA. Se han observado diferencias en los niveles de ADMA en adultos sanos en diferentes trabajos, que pueden ser debidos a la edad, raza, índice de masa corporal o metodología del estudio84. Sin embargo, se precisan más ensayos para poder asegurar si estos u otros factores influyen en los niveles de ADMA en la población pediátrica. Los diferentes métodos de medición de ADMA, producen resultados diferentes estadísticamente significativos. Los métodos habitualmente utilizados para cuantificar la concentración de ADMA son la HPLC y el método de enzimoinmunoanálisis competitivo (ELISA). Aunque el HPLC sea el método de elección, los métodos comercializados de ELISA son más aplicables y alcanzan unos coeficientes de variación aceptables82. Hasta la fecha, no se dispone de un agente específico que reduzca los niveles de ADMA. Diferentes trabajos han informado de que el tratamiento con metformina, anticonceptivos orales, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, bloqueadores de los receptores de angiotensina, fenofibratos y áFLGRĮ-lipoico, pueden reducir el nivel de ADMA plasmático, pero permanece la duda de si la reducción de un 10-24% de los niveles de ADMA plasmático inducido por estos agentes en diferentes enfermedades es beneficioso83-85.  Tesis Doctoral Hipótesis y Objetivos 60 x Secundarios - Valorar la vía metabólica Arg-ADMA-NO en pacientes afectos de PKU. - Valorar la vía metabólica Arg-GAA-Cr en pacientes afectos de PKU. - Conocer la influencia del tratamiento con BH4 en estas vías metabólicas. - Valorar la relevancia nutricional de los suplementos dietéticos en el ciclo de la metilación. - Correlacionar los niveles de ADMA con la nutrición de los pacientes afectos de PKU. - Correlacionar los niveles de Cr con la nutrición de los pacientes afectos de PKU. - Establecer posibles opciones terapéuticas. 4. MATERIAL Y MÉTODOS  Tesis Doctoral Material y Métodos 63 4. MATERIAL Y MÉTODOS Sujetos: pacientes de ambos sexos afectos de fenilcetonuria. Criterios de inclusión: x Diagnóstico de PKU, confirmado en base a los niveles de fenilalanina en el momento del diagnóstico, a la tolerancia de fenilalanina y a los estudios genéticos. x Firma del consentimiento informado por parte del paciente o padre/tutor legal. Criterios de exclusión primaria: x Padecer una enfermedad crónica o situación inflamatoria asociada que pueda dar lugar a una alteración del estrés oxidativo. x Haber sufrido trasplante renal, pulmonar o cardíaco. Grupos de estudio: los pacientes afectos de PKU se dividieron en dos grupos, en función de si tomaban o no dihidrocloruro de sapropterina (Kuvan®). Se estableció también un grupo control con el mismo número de sujetos sanos de similares características de edad, sexo, peso y talla. Diseño: estudio transversal con recogida de datos durante un período de 12 meses (1 de julio de 2014 a 30 de junio de 2015). Ámbito del estudio: Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Metabólicas Congénitas del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela y Unidad de Metabolismo del Hospital Universitario de Cruces. Tamaño de la muestra: el estudio llevado a cabo por Huemer et al88 mostró diferencias significativas en su variable principal (ADMA) con una población de 16 pacientes afectos de PKU, respecto a la población control. Nosotros, en base a nuestra casuística (más de 100 pacientes HPAB/PKU), establecimos un tamaño muestral de 40 pacientes. Tesis Doctoral Material y Métodos 64 Planificación: la información relativa al estudio se les proporcionó a los sujetos afectos de PKU en el momento de acudir a la consulta, dentro del protocolo de rutina que está establecido con objeto de hacer un seguimiento de su patología. Si los pacientes accedían a participar se les solicitaba que firmaran el consentimiento informado. En el caso de los menores de 12 años, el consentimiendo fue firmado por los padres/tutor legal. En el caso de los menores de edad por encima de 12 años, además de la firma de los padres/tutor legal se requirió el consentimiento del menor. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Cruces y por el Comité de Ética del Hospital Clínico Universitario de Santiago. Se obtuvo una muestra de orina (5 mL) y una muestra de sangre por venopunción (1 tubo EDTA, 2 mL) en situación de ayuno de 10-12 horas en una de las visitas rutinarias que realizaban los pacientes al hospital. Inmediatamente después de la extracción, las muestras de sangre se centrifugaban (4.000 g, 4 ºC, 10 min) con objeto de separar la fracción plasmática de la fracción de hematíes. La fracción de plasma se dividía en alícuotas de 300 μL. Estas alícuotas, junto con la fracción de hematíes y la orina, se almacenaban a -80ºC hasta su posterior uso. Asimismo, se llevó a cabo el estudio clínico de los pacientes, recogiendo datos antropométricos, nutricionales y medición de la tensión arterial. Las muestras de sangre (previa centrifugación) y orina recogidas por el Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, se almacenaban a -80ºC hasta su posterior envío a la Unidad de Metabolismo del Hospital Universitario de Cruces, para lo que se empleó nieve carbónica con objeto de mantener las muestras congeladas durante el transporte. Se informó al Servicio de Cirugía Pediátrica del Hospital Universitario de Cruces del rango de edades que presentaba el grupo de pacientes reclutado y de la distribución de géneros, peso y talla en este grupo, con objeto de que reclutaran sujetos sanos pareados por edad, sexo, peso y talla. Estos niños eran básicamente sanos con cirugías programadas para corrección de alteraciones menores. Cuando los sujetos acudían a la consulta preoperatoria, se les Tesis Doctoral Material y Métodos 65 proporcionaba la información sobre el estudio, y en el supuesto de que desearan participar, se les pedía que firmaran el consentimiento informado, o en el caso de los sujetos menores de edad, que lo firmaran los padres/tutor legal. Una vez recogidas las muestras, el Servicio de Cirugía las hacía llegar a la Unidad de Metabolismo para someterlas al tratamiento anteriormente descrito. Los estudios genéticos se realizaron mediante análisis de DNA de los pacientes, para lo cual se obtuvo una muestra de 3 mL de sangre en EDTA, extraída en uno de los controles analíticos habituales de cada paciente. El análisis genético se llevó a cabo en el Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM), de la Universidad Autónoma de Madrid, usándose electroforesis de gel de gradiente de desnaturalización (DGGE) y secuenciación directa a través del kit BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems®) y electroforesis capilar con el analizador genético ABI Prism 3700 (Applied Biosystems®). Todas las muestras de los pacientes en las que sólo se identificaba una mutación causal tras la secuenciación de todos los exones de la PAH, fueron sometidas a análisis MLPA (SALSA MLPA P055 PAH Probemix, MRCHolland), para descartar delecciones largas o duplicaciones. Se comprobó la actividad residual de la PAH para cada mutación a través de las bases de datos recogidas en la PAHdb (www.pahdb.mcgill.ca) y/o en la BH4db (www.bh4.org). 4.1. VARIABLES DEL ESTUDIO 4.1.1. Variable principal: El ciclo de la metilación, basado en los parámetros homocisteína, metionina y cisteína en plasma. La determinación de homocisteína se llevó a cabo mediante inmunofluorescencia de polarización (Arquitect Homocysteine Reagent Kit, Abbott®) Tesis Doctoral Material y Métodos 66 La metionina y la cisteína se detectaron mediante un cromatógrafo iónico Biochrom 30, equipado con precolumna y columna cromatográfica intercambiadora de iones litio Ultropak 8. El pH de la fase móvil se fue aumentando de forma progresiva durante el tiempo de análisis. Tras la separación cromatográfica, se llevó a cabo una derivatización postcolumna con ninhidrina, monitorizándose la absorbancia a 570 y 440 nm. La identificación y la cuantificación se realizaron por comparación con los tiempos de retención y las áreas de pico de un patrón de aminoácidos de composición y concentración conocidas (Sigma). 4.1.2. Variables secundarias: 4.1.2.1. Antropometría El peso y la talla se obtuvieron en la consulta una vez firmado el consentimiento informado. En los menores de 24 meses se determinó la longitud en supino a través de un infantómetro con dos bases, una fija que se orienta en la cabeza y una movible a nivel de los pies; el peso a esta edad se midió con báscula manual para lactantes. A partir de los 24 meses se determinó la talla de pie con un tallímetro de pared, y el peso corporal con básculas digitales con una precisión de 100 g. Los pacientes se pesaban descalzos, sin ropa y por la mañana tras ayuno nocturno. Las mediciones fueron realizadas, en cada centro, siempre por el mismo personal experimentado. También se recogió el grado de desarrollo sexual (de acuerdo con la valoración de las características sexuales externas primarias y secundarias que establece la escala de Tanner). El estado nutricional fue evaluado mediante el cálculo del índice de masa corporal (IMC) mediante la fórmula IMC = peso / altura2 (Kg/m2) Los pacientes mayores de 18 años se clasificaron como bajo peso (IMC <18,5), peso normal (IMC 18,5-24,99), sobrepeso (IMC 25-29,99) y obesidad (IMC GHDFXHUGR con los criterios de la OMS (Organización Mundial de la Salud). Los pacientes menores de 18 años se clasificaron de acuerdo al IMC siguiendo los criterios de Tesis Doctoral Material y Métodos 67 la OMS para el desarrollo infantil (bajo peso: IMC en percentil <15; peso normal: IMC en percentiles 15-85, sobrepeso: IMC en percentiles 85-95, obesidad: IMC en percentil >95)95,96. Se obtuvieron los correspondientes Z-score de talla, peso e IMC. Para ello, los valores obtenidos de los pacientes reclutados se compararon con los de la población general (Carrascosa et al97, www.webpediatrica.com/endocrinoped/antropometria.php). 4.1.2.2. Variables de control de PKU - nutrición De acuerdo al protocolo establecido para el seguimiento de los pacientes afectos de PKU58, la medida de los niveles de fenilalanina en sangre se emplea como variable que refleja el cumplimiento por parte de los pacientes de la dieta prescrita. Como variable adicional que refleja el buen control metabólico del paciente, se realizó una mediana de los niveles de fenilalanina en sangre de los 12 meses previos a la inclusión del paciente en el estudio (Índice de Control Dietético -ICD-). Se consideraron niveles adecuados de Phe en sangre en niños menores de 6 años <360 Pmol/L, entre 6 y 10 años <480 Pmol/L y d600 Pmol/L en los mayores de esa edad. Por otro lado, de acuerdo al planteamiento que se ha realizado en el estudio, se llevó a cabo un control de la dieta de los pacientes. Para ello se solicitó a los pacientes o padres/tutores legales que anotaran las cantidades exactas de los alimentos ingeridos en los tres días posteriores a la inclusión del sujeto en el estudio. La encuesta dietética se recogía en la siguiente visita a la consulta que los pacientes tenían concertada. Posteriormente, el cálculo de las cantidades de proteína total (g/kg), proteína natural (g/kg), proteína proveniente del suplemento (g/kg) y fenilalanina (mg/kg) ingeridas por cada paciente se efectuaron con ayuda del programa dispuesto a tal efecto en la página web www.odimet.org. En los casos en los que los pacientes estuvieran tomando sapropterina (Kuvan®), se anotó la dosis diaria que tomaban (mg/kg) y la fecha de inicio del tratamiento. Tesis Doctoral Material y Métodos 68 Variables bioquímicas: Se determinaron los niveles de prealbúmina, como marcador nutricional, así como un análisis bioquímico que incluyera los valores de glucosa, insulina, vitamina D, calcio, selenio, zinc, proteínas totales, ácido úrico, colesterol, triglicéridos y transaminasas (GOT, GPT, GGT). Se consideraron los valores de referencia de los Laboratorios del Hospital de Cruces y de Santiago de Compostela, que son equiparables, así como los considerados como valores de referencia para los pacientes afectos de PKU para los siguientes parámetros: selenio (60-125 ȝJ/), vitamina D (20-42 ng/mL) y prealbúmina (21-41 mg/dL). Los análisis de bioquímica se obtuvieron en ayunas, a la misma hora (8 de la mañana) y los pacientes se encontraban asintomáticos y no estaban recibiendo ninguna medicación (salvo la sapropterina). Los procedimientos fueron los habituales de cada centro. Análisis de otros aminoácidos en plasma: Se realizó un análisis completo de los perfiles de aminoácidos en plasma, haciendo especial hincapié, además de lo referido, en las concentraciones de glicina, ornitina, arginina y citrulina. La técnica empleada fue la misma que la ya descrita para la determinación de metionina y cisteína. 4.1.2.3. Valoración de los trastornos de la vía Arg-ADMA-NO Determinación de ADMA y SDMA en plasma La preparación de la muestra implica la adición de los estándares internos a la muestra de plasma y posterior eliminación de las proteínas mediante un proceso de ultracentrifugación. A pesar de que habitualmente la determinación de ADMA/SDMA en sangre se acomete mediante el empleo de un kit ELISA98, el método es laborioso, costoso y en ocasiones poco sensible en las medidas. Por ello, utilizamos una nueva metodología para la cuantificación de dicho metabolito y sus isómeros, empleando cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un espectrómetro tándem masas (LC-MS/MS). Tesis Doctoral Material y Métodos 69 La columna cromatográfica usada para facilitar la separación del ADMA/SDMA de otros metabolitos que puedan interferir en su medida es de tipo C18. Dada la polaridad del analito, se efectuó un gradiente con objeto de establecer las mejores condiciones de separación cromatográfica. La monitorización del ADMA/SDMA se realizó a través del espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. El primer cuadrupolo fragmentó los diferentes analitos presentes en la muestra en iones de masas diferentes, que fueron distinguidos en función de su cociente masa/carga en el segundo cuadrupolo o célula de colisión. El tercer cuadrupolo efectuó un segundo proceso de fragmentación sobre los iones seleccionados en el segundo cuadrupolo. De esta forma, las dimetilargininas quedaron inequívocamente identificadas por el ión hijo resultante en el tercer cuadrupolo, siendo así posible su cuantificación99. 4.1.2.4. Valoración de los trastornos de la vía Arg-GAA-Cr Determinación de GAA y creatina en plasma La determinación de GAA y Cr en plasma se realizó mediante LCMS/MS. La preparación de la muestra implica la adición de los estándares internos marcados isotópicamente a la muestra de plasma. Tras la precipitación de las proteínas con acetonitrilo, el sobrenadante se trasvasa a un vial para ser evaporado hasta sequedad. Tras derivatización con ácido clorhídrico en butanol, se vuelve a evaporar para reconstituir en fase móvil. La cuantificación se llevó a cabo en el modo MRM (multiple reaction monitoring) del LC-MS/MS. Determinación de creatinina en orina La determinación de Crn en orina se llevó a cabo mediante LC-MS/MS. La preparación de la muestra implica la adición de los estándares internos marcados isotópicamente a la muestra y dilución con agua. La cuantificación de la Crn se llevó a cabo en el modo MRM del LC-MS/MS. Determinación de la creatinina en plasma Se llevó a cabo en el laboratorio de bioquímica de acuerdo con el procedimiento estándar. Tesis Doctoral Resultados 76 Paciente Sexo Fenotipo PKU Alelo 1 Alelo 2 Tratamiento con Kuvan  20 F Clásica c.1066-11G>A c.781C>T No IVS10nt-11G>A p.R261X 21 F Moderada c.143T>C c.1162G>A Sí p.L49S p.V388M 22 F Moderada c.194T>C c.1162G>A No p.I65T p.V388M 23 F Moderada c.782G>A c.1241A>G Sí p.R261Q p.Y414C 24 F Clásica c.781C>T c.1315+1G>A No p.R261X IVS12ds 25 F Moderada c.194T>C c.1217T>C No p.I65T p.I406T 26 F Leve c.194T>C c.1162G>A No p.I65T p.V388M 27 F Clásica c.1162G>A c.913-7A>G No p.V388M IVS8-7A>G 28 F Clásica c.136G>A c.782G>A No p.G46S p.R261Q 29 F Clásica c.1162G>A c.194T>C No p.V388M p.I65T 30 F Clásica c.754C>T c.527G>T No p.R252W p.R176L 31 M Moderada c.143T>C c.194T>C Sí p.L49S p.I65T 32 M Moderada c.1162G>A c.1162G>A Sí p.V388M p.V388M 33 M Moderada c.734T c.1211C>T No p.V245G p.T404I 34 M Clásica c.782G>A c.1066-11G>A No p.R261Q IVS10nt-11G>A 35 M Moderada c.441+5G>T c.441+5G>T No IVS4+5G>T IVS4+5G>T 36 M Moderada No encontrada c.838G>A Sí p.E280K 37 M Moderada c.1045T>C c.204A>T Sí p.S349P p.R68S 38 M Clásica c.194T>C c.47_48delCT No p.I65T p.S16X 39 M Moderada c.1066(-3)C>T c.1222C>T Sí IVS10nt-3C>T p.R408W 40 M Moderada c.1162G>A c.842C>T Sí p.V388M p.P281L 41 M Clásica c.1066-11G>A c.782G>A No IVS10nt-11G>A p.R261Q 42 M Clásica c.1315+1G>A c.1315+1G>A No IVS12+1G>A IVS12+1G>A Tabla 6. Resumen de las mutaciones encontradas en los pacientes PKU. Las variantes han sido nombradas con respecto a la secuencia de referencia NM_000277. Los pacientes 1-19 son de la Comunidad Autónoma de Galicia, los pacientes 20-42 pertenecen a la Comunidad Autónoma del País Vasco. Tesis Doctoral Resultados 77 A continuación, se presentan los parámetros analizados para la valoración del control de la enfermedad. En la Tabla 7 se refleja el resumen de los datos dietéticos en cuanto a la mediana de Phe en el último año, ingesta de proteínas totales, naturales y procedentes de suplementos por kg de peso y día, así como la tolerancia de Phe en los pacientes PKU. El rango de referencia para la población general con respecto a la ingesta de proteínas totales estaría entre 0,8 y 1,3 g/Kg/día; en los pacientes PKU, tal y como se refleja en dicha tabla, esta ingesta es de 1r0,5 g/Kg/día, de forma que los pacientes PKU reciben un 117% de la CDR. Sin embargo, la ingesta de proteínas naturales es un 48% de la CDR. Media ( r r DE) P3-P95 Porcentaje de pacientes <P3 Porcentaje de pacientes >P95 Mediana Phe en el último año ( P mol/L) 437 r 340 117-1.230 10 2,5 Proteínas totales (g/Kg/día) 1 r 0,5 0,17-1,9 0 5 Proteínas naturales (g/Kg/día) 0,6 r 0,5 0,15-1,9 0 2,5 Proteínas procedentes de suplemento (g/Kg/día) 0,4 r 0,4 0-1,3 0 2,5 Tolerancia Phe (mg/día) 651 r 468 121-2.025 0 7,5 Tabla 7. Valoración del control de la enfermedad en los pacientes PKU de nuestra muestra a partir de los parámetros metabólico-dietéticos. Dentro de la muestra de pacientes PKU, queremos destacar dichos parámetros de control de la enfermedad para el subgrupo de pacientes que reciben tratamiento con BH4 (Tabla 8). Podemos ver cómo la mediana de Phe en estos pacientes está considerablemente más baja, y cómo el consumo de proteínas totales y de proteínas naturales es superior al del total de la muestra. Tesis Doctoral Resultados 78 El adecuado cumplimiento dietético se determina en función de la mediana de Phe en el último año y la edad del paciente. La distribución de los pacientes PKU en base a este parámetro se refleja en la Tabla 9. El cumplimiento es en general adecuado, siendo el grupo de mayor transgresión dietética el de los pacientes mayores de 10 años que no reciben tratamiento con BH4. Edad <6 años Edad 6-10 años Edad >10 años (Phe <360 P P mol/L) (Phe <480 P P mol/L) (Phe d d 600 P P mol/L) No BH4 BH4 No BH4 BH4 No BH4 BH4 15/15 (100%) - 3/3 (100%) 2/2 (100%) 8/15 (53%) 6/7 (86%) Tabla 9. Distribución de los pacientes PKU según la mediana de Phe de acuerdo a cada rango de edad. Los porcentajes se refieren al total de pacientes en cada grupo. En la Tabla 10, se reflejan los datos del perfil nutricional, glucolipídico y bioquímico de los pacientes PKU. Se señalan los valores de referencia considerados normales, el porcentaje de pacientes que presentan valores por encima o por debajo del rango de normalidad establecido para cada parámetro analítico y el porcentaje de pacientes que se encuentra en los extremos superior o inferior (según proceda) de la distribución. Podemos apreciar que los niveles de prealbúmina, 25-OH-vitamina D, selenio, HDL colesterol y LDL colesterol se encuentran por debajo del rango de normalidad en un porcentaje significativo de los pacientes. Media (r r DE) P3 Mediana Phe en el último año ( P mol/L) 286 r 227 132 Proteínas totales (g/Kg/día) 1 r 0,5 0,17 Proteínas naturales (g/Kg/día) 0,8 r 0,4 0,17 Proteínas procedentes de suplemento (g/Kg/día) 0,23 r 0,2 0 Tolerancia Phe (mg/día) 882,3 r 503 312 Tabla 8. Parámetros de control de la enfermedad en los 9 pacientes tratados con BH4. Tesis Doctoral Resultados 79 PKU Rango de referencia % de pacientes con parámetros fuera de rango % de pacientes con percentiles fuera de rango ų>33 – P97]         <P3 >P97 Prealbúmina (mg/dL) 22,6 [11,2-53,1] 21-41 60,7 5 15 2,6 Proteínas totales (g/dL) 7,2 [6-7,8] 6-8 2,4 2,4 0 0 Ca (mg/dL) 9,7 [9-10,9] 8,1-10,8 0 0 0 0 25-OH vitamina D (ng/mL) 28 [14-72] 20-42 13,5 8 55 2,5 Se J/ 68 [33-91] 60-125 35 0 21 0 Zn JG/ 83 [66-116] 65-140 0 0 2,5 0 Colesterol (mg/dL) 145 [76-240] 100-240 2,6 2,6 2,5 0 Triglicéridos (mg/dL) 72 [31-379] 30-170 0 2,6 0 2,5 HDL-colesterol (mg/dL) 50 [30-74] >40 13 - 13 0 LDL-colesterol (mg/dL) 89 [39-125] <130 - 0 60 0 Glucosa (mg/dL) 83 [59-103] 70-110 1 2,5 2,5 0 Insulina (g/L) 8,7 [0,8-29,2] 3,2-16,3 23 0 0 13 GOT - AST (U/L) 29,5 [16-103,7] 5-56 0 2,5 0 2,5 GPT - ALT (U/L) 20 [12-81,4] 5-47 0 2,5 0 2,5 GGT (U/L) 12 [5-48] 2-40 0 2,5 0 2,5 Creatinina (mg/dL) 0,4 [0,1-1] 0,1-1,1 - 0 0 0 Tabla 10. Perfil nutricional, glucolipídico y bioquímico de los pacientes PKU. Las cifras en azul destacan el porcentaje de pacientes que se encuentran por debajo del rango de normalidad y del P3. (Ca = Calcio; Se = selenio; Zn = Zinc). Tesis Doctoral Resultados 80 Cuando valoramos los distintos parámetros metabólico-nutricionales en los pacientes PKU en función de recibir o no tratamiento con BH4, no se encuentran diferencias estadísticamente significativas en cuanto a los niveles de: vitamina D, calcio, selenio, zinc, colesterol, triglicéridos, HDL, LDL, ácido úrico, GOT, GPT, GGT, glucosa ni insulina. Al analizar lo que ocurre con el perfil de aminoácidos, vemos cómo los niveles de arginina, citrulina y metionina se encuentran disminuidos en los pacientes PKU con respecto a los controles, aunque sólo son significativos para la arginina, mientras que los niveles de glicina, ornitina y cisteína se encuentran significativamente elevados. Los niveles de fenilalanina se encuentran, naturalmente, elevados (Tabla 11). Aminoácido (P P mol/L) Media en el grupo control Media en el grupo PKU Significación estadística Fenilalanina 57,57 415,62 ( n ) <0,001 Arginina 89,47 49,89 ( p ) <0,001 Glicina 217,55 280,83 ( n ) <0,001 Citrulina 31,55 29,59 ( p ) ns Ornitina 46,54 61,28 ( n ) 0,001 Metionina 24,74 22,36 ( p ) ns Cisteína 17,21 33,92 ( n ) <0,001 Tabla 11. Diferencias en el perfil de aminoácidos de los pacientes PKU con respecto a la población control. En azul se destacan los valores elevados, y en verde los disminuidos. (ns = no significativo). Cuando se estratifica a los pacientes en función del tratamiento con BH4, no se encuentran diferencias estadísticamente significativas con respecto al perfil de aminoácidos.  Tesis Doctoral Resultados 81 5.1. VIA METABOLICA DE LA HOMOCISTEÍNA Para la valoración de la metilación, se realizó un análisis comparativo entre los pacientes PKU y los controles, cuyos resultados presentamos a continuación. Se llevó a cabo una determinación de los niveles de aminoácidos plasmáticos metionina y cisteína, así como de la homocisteína plasmática, de los niveles plasmáticos de ácido fólico y vitamina B12 y de ácido metilmalónico en orina. Todo ello aparece presentado en la Tabla 12. Media r r DE Rango (P3-P97) Rango de Referencia % Pacientes con percentiles fuera de rango <P3 >P97 Metionina ( P mol/L) 22,4 r 6,3 10,7-35,7 13,8-56 5 - Homocisteína ( P mol/L) 6,3 r 4,7 2,3-25,7 5-15 48 - Cisteína ( P mol/L) 33,9 r 7,9 22,2-51 1,7-37,9 - 31,2 Ácido fólico (ng/mL) 21,5 r 10,4 4,5-50,8 3,4-20 - 56,4 Vitamina B12 (pg/mL) 696 r 387 217,8-1.942 220-980 2,6 15,4 MMA orina ( P mol/L) 0,26 r 0,3 0,001-1,65 - - - Tabla 12. Media, desviación estándar y percentiles de los aminoácidos metionina, homocisteína y cisteína, de las vitaminas ácido fólico y B12 y del MMA en orina. En los pacientes PKU la vitamina B12 y el ácido fólico estaban significativamente aumentados con respecto a la población control (entendida como el rango de control de la bioquímica). En los pacientes tratados con BH4, los niveles de estas sustancias eran más similares a los del rango de normalidad, de forma estadísticamente significativa en el caso de la B12 (p=0,01) (Figura 18). Tesis Doctoral Resultados 82 Figura 18. La concentración de ácido fólico (A) y vitamina B12 (B), es mayor en los pacientes PKU que en los controles, si bien en los pacientes que reciben BH4 los niveles de estas sustancias son más similares a los de la población control.  Tesis Doctoral Resultados 83 5.2. RUTAS METABOLICAS RELACIONADAS CON LA METILACIÓN 5.2.1. Vía Arg-ADMA-NO Para la valoración de la vía Arg-ADMA-NO, determinamos los valores de ADMA, SDMA y arginina en el plasma de los pacientes PKU. La media y la distribución de estos valores aparecen reflejados en la Tabla 13. Valores plasmáticos (P P mol/L) Media r DE Rango (P3-P97) Rango de Referencia % Pacientes con valores <P3 ADMA 0,35 r 0,09 0,18-0,6 0,4-1,11 72,5 SDMA 0,44 r 0,09 0,3-0,6 0,37-1,28 30 Arginina 49,89 r 18 21,52-91,4 51,2-160,5 42,5 Tabla 13. Valoración de la vía Arg-ADMA-NO. En los pacientes PKU encontramos unos niveles plasmáticos de ADMA, SDMA y arginina, inferiores a los de los controles, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. También encontramos una relación Arg/ADMA mayor en los pacientes PKU con respecto a los controles, si bien esta diferencia no es significativa (Tabla 14). Valores plasmáticos Media en el grupo control Media en el grupo PKU Significación estadística (p) ADMA ( P mol/L) 0,65 0,35 (p) <0,001 SDMA ( P mol/L) 0,57 0,43 (p) <0,001 Arg ( P mol/L) 87,7 49,89 (p) <0,001 Arg/ADMA 140,6 158,7 (n) 0,69 Tabla 14. Diferencias en los niveles plasmáticos de ADMA, SDMA y arginina, así como en la relación Arg/ADMA en los pacientes PKU con respecto a los controles. Cuando estratificamos a los pacientes PKU en función de su tratamiento con BH4, vemos que aquellos que no reciben dicho tratamiento tienen niveles más bajos de ADMA, SDMA y Arg que aquellos que sí lo reciben, aunque esta Tesis Doctoral Resultados 84 diferencia no es significativa (p= 0,17 / 0,57 / 0,46 respectivamente). De la misma manera, la relación Arg/ADMA es mayor en los pacientes PKU que no reciben BH4, de forma no significativa (p=0,57) (Figura 19).    Figura 19. Diferencias entre los niveles de: ADMA (A), SDMA (B), Arg (C) y Arg/ADMA (D) entre los controles y los pacientes PKU, estando éstos estratificados en función de su respuesta a la BH4.  Tesis Doctoral Resultados 92 De la misma manera, encontramos una correlacion positiva entre los niveles de creatinina plasmática y los valores de ácido úrico, colesterol, y prealbúmina, y negativa entre la creatinina plasmática y la vitamina D y la GOT (Tabla 18). Parámet ros de laboratorio Correlación con la creat inina plasmát ica Correlación de Pearson P Vitamina D (ng/mL) -0,39 0,019 Ácido úrico (mg/dL) 0,44 0,007 Colesterol (mg/dL) 0,32 0,048 GOT/AST (U/L) -0,54 0,001 Prealbúmina (mg/dL) 0,72 0 Tabla 18. Correlaciones entre la creatinina plasmática y distintos parámetros de laboratorio. Por último, encontramos una correlación positiva entre la cifra de creatinina plasmática y la mediana de Phe en el último año y la Phe de control, y negativa entre la creatinina plasmática y los aportes de proteínas totales y naturales por Kg de peso y día (Tabla 19). Parámetros de control Correlación con la creatinina plasmática Cor r el a ci ón de Pear son P Aportes proteínas totales (g/Kg/día) -0,56 0,01 Aportes proteínas naturales (g/Kg/día) -0,59 0,007 Mediana de Phe en el último año (P P mol/L) 0,83 <0,001 Phe de control ( P mol/L) 0,63 <0,001 Tabla 19. Correlación de las cifras de creatinina plasmática con distintos parámetros de control de la PKU. 6. DISCUSIÓN Tesis Doctoral Discusión 95 6. DISCUSIÓN En esta Tesis Doctoral se recogen los datos y estudios realizados sobre el ciclo de la metilación en 84 pacientes, de los cuales 42 son controles y 42 son pacientes fenilcetonúricos seguidos en las Unidades de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Metabólicas Congénitas del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela y del Hospital de Cruces. Estas unidades son ambas Centro de referencia a nivel nacional (CSUR) para el diagnóstico y tratamiento de los pacientes con enfermedades metabólicas hereditarias, dentro de las que se encuentra la PKU. Tras el descubrimiento de la PKU y el inicio del cribado metabólico neonatal universal, se ha podido realizar el diagnóstico precoz de estos pacientes y consecuentemente el tratamiento dietético desde edades muy tempranas, lo que ha permitido evitar el desarrollo de secuelas neurológicas que derivarían en la mayor parte de los casos en retraso mental severo. Con ello, se ha conseguido que estos pacientes lleven una vida prácticamente normal, salvo por las peculiaridades de su dieta; sin embargo han ido apareciendo otros aspectos derivados o bien de la propia enfermedad, o quizá secundarios al tratamiento de la misma, que inciden directamente en la calidad de vida de estos pacientes. Entre ellos queremos destacar las alteraciones de la metilación, que si bien se han ido sospechando en los últimos años a raíz de alteraciones descritas en los metabolitos relacionados, como la homocisteína o el ADMA87,100 todavía son muy poco conocidas. 6.1. ESTUDIO GENÉTICO La deficiencia de PAH causa un rango de fenotipos PKU basados en los niveles de Phe a su detección previos al tratamiento dietético, y/o en la tolerancia de Phe en la dieta. Los puntos de corte para la clasificación de PKU clásica, moderada y leve pueden variar de unos países a otros, siendo los aceptados en España los establecidos en el protocolo de fenilcetonuria de AECOM58, que a su vez coinciden con los de la guía de EEUU52, según los cuales la PKU puede Tesis Doctoral Discusión 96 clasificarse en: clásica(Phe   ȝ mol/L), moderada (Phe entre 600 y 1200 ȝmol/L), leve (Phe entre 360 y 600 ȝmol/L) y HPA benigna (Phe <360 ȝmol/L). El estudio genético también ayuda a establecer el fenotipo. En un estudio realizado para conocer las mutaciones más prevalentes del gen PAH en Galicia35, se recogieron datos de 105 pacientes diagnosticados de hiperfenilalaninemia a lo largo de 31 años, de los cuales 39 eran PKU clásicas, 20 formas moderadas, 8 formas leves y 38 HPA benignas. Nuestro trabajo recoge resultados de 42 pacientes tanto de la población PKU de Galicia como del País Vasco, manteniéndose las mismas proporciones en cuanto a la clasificación diagnóstica de la enfermedad (23 formas clásicas, 16 moderadas y 3 leves). Si bien es cierto que conocemos el resultado funcional en cuanto a actividad enzimática de la PAH que conllevan ciertas mutaciones, y que por tanto en base a ellas podemos predecir el fenotipo de los pacientes PKU, también es cierto que todavía existen factores no conocidos que condicionan el fenotipo real101. La actividad residual relativa de la PAH se calculó conforme a los datos expuestos en las bases de datos de PAHdb y/o BH4db, que proporcionan valores calculados de acuerdo con la expresión in vitro de proteínas mutantes recombinadas. La actividad de PAH se define como la suma media de actividades de los dos alelos mutados y se expresa como el porcentaje de la forma salvaje de la enzima. De acuerdo con esto, las mutaciones p.E280K, p.R243X, p.R243Q, p.R158Q, p.R252W, IVS12+1G>A, p.S349P, y p.R408W se asocian con una actividad nula o muy baja de PAH; p.R261Q, p.V388M, p.R176L, y p.L348V con una actividad enzimática moderada y p.E390G, p.V230I, p.P244L, y p.P211T con una actividad residual elevada. Se objetiva en nuestro estudio una buena correlación genotipo-fenotipo, con pacientes portadores de mutaciones nulas que muestran altos niveles de concordancia con los fenotipos más graves como ha sido publicado previamente102,103. Las salvedades serían el paciente 12, en el que a pesar de presentar las mutaciones p.R243X y p.R176L, ambas asociadas a una actividad Tesis Doctoral Discusión 97 enzimática muy baja, dan lugar a una forma clínica leve, y el paciente 19 que también es una PKU leve a pesar de la mutación p.R176L. En el resto, mutaciones asociadas a escasa actividad de PAH y con fenotipo concordante (PKU clásica) son: p.R243Q (paciente 28), p.R158Q (paciente 18), p.R252W (paciente 30), p.S349P (paciente 2) y p.E280K (pacientes 8 y 9), p.R243X (pacientes 4, 5, 7 y 10) y IVS12+1G>A (paciente 42). Las mutaciones asociadas con un déficit moderado de la actividad enzimática y con concordancia genotipo-fenotipo (PKU moderada) son: p.R261Q (paciente 23) y p.V388M (pacientes 21, 22, 32, 40). De la misma manera, podríamos ser capaces de preveer la respuesta a la BH4 en función del genotipo, ya que existen mutaciones que se asocian a una mayor incidencia de respuesta al tratamiento con sapropterina104,105. Así, de los pacientes respondedores, presentan una mutación que previsiblemente se asocia a respuesta a la BH4 el 1 y el 37 (p.R68S), el 21 y el 32 (p.V388M), el 23 (p.R261Q) y el 31 (p.I65T). Entre los pacientes de Galicia, la mutación más frecuentemente encontrada es la c.1066-11G>A o también conocida como IVS10nt-11G>A (8/19), considerada como la principal mutación mediterránea106-108 y asociada a un fenotipo clásico, como ya habían señalado Couce et al35. Entre los pacientes del País Vasco, las mutaciones más frecuentemente encontradas son la p.V388M (7/23) y la p.I65T (6/23) (asociadas a un fenotipo moderado). 6.2. NUTRICIÓN Y DESARROLLO El crecimiento y desarrollo de los pacientes PKU es un tema de preocupación en cuanto a su seguimiento, ya que el tratamiento nutricional al que se someten, con un escaso aporte de proteínas naturales, puede conllevar un estado de malnutrición y retraso de crecimiento. Esto se debe a que existe una importante limitación tanto en la administración de las fuentes naturales de algunas vitaminas y minerales (vitaminas del grupo B, ácido fólico, zinc, selenio, Tesis Doctoral Discusión 98 hierro, entre otros) como en su biodisponibilidad, y esta limitación es tanto más importante cuanto más estricto es el tratamiento dietético68. Los ensayos clínicos existentes arrojan resultados contradictorios, ya que mientras algunos muestran que la nutrición, el crecimiento y el desarrollo físico de los pacientes PKU es inferior al de individuos sanos67,68,109-112, otros por el contrario afirman que un crecimiento y desarrollo adecuados son posibles cuando se realiza un correcto tratamiento dietético, ya sea con con BH4 o sin ella69,113-117. Un estudio reciente llevado a cabo en nuestro país para evaluar el desarrollo pondoestatural de los pacientes PKU, valoró el desarrollo de una cohorte de pacientes con PKU y HPA desde los 6 meses hasta los 18 años, encontrándose una correlación positiva entre la tolerancia de Phe de la dieta y el peso y la talla de los pacientes, de tal manera que mientras que aquellos que presentaban una HPAB apenas tenían alteraciones en cuanto a los parámetros antropométricos, en los pacientes PKU destacaban dos períodos de mayor afectación para el crecimiento y desarrollo, que eran la primera infancia y la edad adulta, alcanzando estos niños una talla final inferior al p50 68. En nuestra muestra, se incluyen pacientes de un amplio rango de edades (6 meses a 43 años), así como pacientes respondedores/no respondedores a BH4, y por tanto, pacientes con unas características nutricionales bastante variadas en cuanto a tolerancia de Phe en la dieta, aunque en general con un buen control dietético en la mayoría de ellos. Cuando analizamos lo que ocurre con el IMC en el total de la muestra, nos encontramos con que el 51,2% de los pacientes presentan un peso normal y 17 pacientes (41,5%) presentan sobrepeso, de acuerdo con la definición de la OMS95,96. En la literatura se refiere cómo los pacientes PKU presentan una tendencia a ganar peso a medida que la edad aumenta118-121, existiendo un rebote del IMC a partir de los 6 años68. Una de las teorías que se postulan para explicar este fenómeno es que los suplementos exentos en Phe son ricos en carbohidratos y proporcionan un alto aporte calórico122; por otra parte la carga social que Tesis Doctoral Discusión 99 implica el seguimiento de este tipo de dietas hace que los pacientes rechacen la actividad física. En cuanto a la talla, al considerar los Z-score, y por tanto comparar los datos de nuestros pacientes con la población de referencia, encontramos que presentan una puntuación inferior a 0 (-0.8), si bien es cierto que los pacientes de nuestra muestra se encuentran en distintos estadíos de desarrollo y que por lo tanto no podemos tener una conclusión definitiva acerca de su talla final (14 pacientes son mayores de 16 años, el resto, se ecuentran por debajo de esa edad). De forma general, se estima que los pacientes con PKU clásica tienen una tolerancia de Phe <350 mg/día, las PKU moderadas tienen una tolerancia 350400 mg/día y las leves de 400-600 mg/día28. Si bien en nuestra muestra las formas más frecuentes son la clásica y la moderada, la tolerancia media de Phe es de 651 mg/día, es decir, bastante elevada con respecto a lo esperable por su fenotipo. La tolerancia de Phe es mucho mayor en los pacientes tratados con BH4, alcanzando una media de 882 mg/día. De la misma manera, la ingesta de proteínas totales en los pacientes PKU, de forma global, es de 1r0,5 g/kg/día, de las cuales las proteínas naturales suponen algo más de la mitad (0,6r0,5 g/kg/día), mientras que en los pacientes tratados con BH4 las proteínas naturales suponen tres cuartas partes de las totales (0,8 r 0,4 g/kg/día). El control dietético de los pacientes se establece de acuerdo a la mediana de Phe en el último año58; cuando consideramos este parámetro para cada grupo de edad, vemos cómo en los pacientes hasta los 10 años hay un buen cumplimiento dietético, con independencia del tratamiento con BH4 (y por tanto de una mayor libertad dietética), siendo los pacientes mayores de 10 años y no tratados con BH4 los que tienen peor adherencia a la dieta (7 de 15 pacientes, es decir el 47%, tienen mala adherencia). Este dato a su vez confirma algo bien conocido en los pacientes PKU, que es la disminución en la adherencia al tratamiento a medida que los pacientes van creciendo66,67. Ante el riesgo teórico que hemos comentado anteriormente de que los pacientes PKU desarrollen un déficit de vitaminas y minerales, la práctica Tesis Doctoral Discusión 100 habitual es añadir estos micronutrientes a las fórmulas de aminoácidos libres de Phe que se emplean para su tratamiento dietético. Siguiendo con esta línea de pensamiento, los pacientes tratados con BH4 o aquellos que tengan un peor cumplimiento dietético podrían considerarse de riesgo para desarrollar estas deficiencias nutricionales, al recibir poca cantidad de fórmula exenta de Phe y enriquecida en vitaminas y minerales, mientras que los pacientes con un cumplimiento dietético estricto podrían estar en riesgo de recibir aportes excesivos de suplementos54,123-125. Sin embargo, los datos reales sobre el impacto que estos suplementos tienen en el equilibrio nutricional de los pacientes PKU son escasos126,127, y el perfil idóneo de micronutrientes para evitar alteraciones en la biodisponibilidad de otras sustancias todavía no ha sido establecido de forma definitiva128. Recientemente, Crujeiras et al129 llevaron a cabo un estudio multicéntrico transversal valorando el estado nutricional de 156 pacientes PKU, para lo cual consideraron la mediana de Phe en el último año, la tolerancia de Phe, parámetros antropométricos y bioquímicos, entre ellos, la determinación de proteínas totales, prealbúmina, electrolitos, selenio, zinc, ácido fólico, vitamina B12, ferritina y vitamina D. En sus resultados, destacan unos niveles de proteínas totales, calcio, fósforo, vitamina B12 y zinc en rango normal para casi todos los pacientes, unos niveles bajos de prealbúmina, vitamina D y selenio, y, sorprendentemente, unos niveles elevados de ácido fólico. El adecuado control y cumplimiento dietético de los pacientes analizados fue comprobado por los autores. En nuestra serie, que incluye varios de los pacientes analizados en dicho ensayo previo, un porcentaje importante de pacientes presentaba valores por debajo del rango de normalidad en cuanto a las determinaciones de prealbúmina, 25-OH-VitaminaD y selenio. Especialmente importante es el caso de la prealbúmina, con un 60,7% de pacientes de la muestra PKU con cifras inferiores a 21 mg/dL y del selenio, con un 35% de pacientes con cifras inferiores a 60 Pg/L. Tesis Doctoral Discusión 101 Como ya hemos comentado, nuestros pacientes corresponden fundamentalmente a formas de PKU clásicas y moderadas, en las que además hemos objetivado un adecuado control dietético en base a la mediana de Phe y a los datos obtenidos a partir de la encuesta dietética de estos pacientes (tolerancia de Phe, ingesta de proteínas totales y naturales). Por otra parte, los niveles de prealbúmina constituyen uno de los marcadores más fiables de malnutrición o de escaso desarrollo, de tal manera que niveles inferiores a 20-21 mg/dL son predictores de escaso crecimiento76,130. Por lo tanto, y aunque no podamos señalar una asociación estadísticamente significativa, sí podemos establecer una relación entre el fenotipo de PKU, la restricción dietética/adhesión al tratamiento y el escaso desarrollo estatural (puesto de manifiesto en el Z-score de talla). Con respecto al selenio, desde hace algunos años se suplementan las fórmulas exentas en Phe diseñadas para el tratamiento de la PKU con este mineral, por su posible papel en el control del estrés oxidativo asociado a esta enfermedad. La cantidad de selenio que aportan las fórmulas varía de unas casas comerciales a otras, y además, la absorción intestinal de selenio depende de la ingesta de proteínas animales. Estudios recientes han puesto de manifiesto que a pesar de esta suplementación, los niveles de selenio en los pacientes PKU se encuentran bajos, mejorando en aquellos que llevan una dieta más libre en cuanto a consumo de proteínas naturales115,129. En el caso de la 25-OH-VitaminaD, un 13,5% de los pacientes presentan cifras inferiores a 20 ng/mL (insuficiencia moderada), si bien es cierto que la producción de esta vitamina depende de múltiples factores, siendo el más importante la exposición solar, que varía según la latitud, de forma que el déficit de vitamina D es más frecuente en la zona Norte de España, que en la zona Sur129. Por otra parte, aunque la vitamina D está implicada en el desarrollo óseo, y éste se encuentra alterado en los pacientes PKU, Mirás et al73 no encontraron una relación entre los niveles de vitamina D y la pérdida de masa ósea de los pacientes PKU, relación que sí existía con la ingesta proteica (a mayor restricción proteica, menor masa ósea). Tesis Doctoral Discusión 108 esta manera, la proteína de la dieta es un modulador bien conocido de la función renal72. Otra de las vías que consideramos que podría verse afectada por la menor disponibilidad de grupos metilo es la Arg-GAA-Cr. En el riñón, la Arg cede su grupo amidino a la glicina para dar lugar a GAA. Posteriormente, en el hígado, se produce la metilación de GAA que da lugar a Cr, la cual es liberada para su captación por los tejidos. La donación del grupo metilo se produce gracias a la transformación de SAM en Sadenosilhomocisteína. La metilación del GAA para producir creatina consume más grupos metilos que el resto de reacciones de metilación juntas; por este motivo, en condiciones normales, la síntesis de creatina regula la disponibilidad de grupos metilo para el resto de reacciones, como pueda ser la formación de metionina a partir de homocisteína94. Sin embargo, nuestra hipótesis es que en la PKU, la producción de creatina estaría limitada por la disminución de grupos metilo, de tal manera que la GAA no metilada, aumentaría en plasma, mientras que los valores plasmáticos de creatina disminuirían. Así, vemos cómo nuestros pacientes presentan unos valores de GAA aumentados (1,75 vs 1,58 Pmol/L) y unos valores de Cr disminuídos (34,6 vs 41,9 Pmol/L), aunque de forma no estadísticamente significativa. Los niveles plasmáticos del metabolito de la Cr, la creatinina, sí están significativamente bajos (0,5 vs 0,65 mg/dL). En los pacientes tratados con BH4, los valores de creatina son significativamente inferiores, en contra de lo que podríamos esperar de acuerdo con nuestra hipótesis; dado el número de pacientes que reciben este tratamiento en nuestra muestra, no podemos saber si este resultado se trata de un epifenómeno, o puede ser justificado desde un punto de vista metabólico. No hemos hallado en la literatura referencias previas a estas alteraciones en los pacientes PKU. Tesis Doctoral Discusión 109 6.4. MARCADORES DE CUMPLIMIENTO DIETÉTICO/SEVERIDAD Otra evidencia de la alteración de la vía de la metilación en la PKU son las correlaciones que pudimos establecer entre los niveles de Phe, homocisteína y ADMA, que por otra parte nos ponen de manifiesto el valor de la determinación de homocisteína y de ADMA para el seguimiento del cumplimiento dietético por parte de los pacientes. Para el seguimiento de los pacientes afectos de PKU deben realizarse medidas periódicas de los niveles de Phe en sangre, cuya frecuencia varía en función de la edad de los pacientes. La AECOM establece que en los menores de 6 meses se lleve a cabo una determinación semanal, entre los 6 y los 24 meses quincenal, y mensual en pacientes mayores de 24 meses; la mediana de Phe en el último año se utiliza como variable adicional de control metabólico, que refleja de forma indirecta el cumplimiento dietético. Se consideran adecuados unos valores de mediana de Phe en sangre en niños menores de 6 años <360 Pmol/L, entre 6 y 10 años <480 Pmol/L y d600 Pmol/L en los mayores de esa edad58. De acuerdo con nuestros resultados, y dadas las alteraciones en la vía de la metilación postuladas y comprobadas en nuestro estudio, encontramos en algunos metabolitos un valor potencial como marcadores añadidos del cumplimiento dietético de los pacientes. Por un lado, encontramos una correlación positiva entre los niveles de Phe y los de homocisteína (a mayor Phe mayor Hcy). Si los niveles de Phe están altos es porque el paciente no estaría realizando un adecuado cumplimiento dietético, y al consumir más proteína natural de la que debe, la Phe, aminoácido azufrado, aumentaría los niveles de Hcy y se pondría en marcha la trans-sulfuración. Eso nos lleva a la siguiente correlación, negativa, entre los niveles de homocisteína y los niveles de ADMA (a mayor nivel de homocisteína, menor nivel de ADMA). Si ese paciente con mal cumplimiento dietético consume suplementos proteicos enriquecidos en fólico y B12, además de la trans- Tesis Doctoral Discusión 110 sulfuración, se pondría en marcha la remetilación, y por tanto, el consumo de grupos metilo conduciría a un descenso del ADMA. Finalmente, la correlación negativa ente los niveles de Phe y los de ADMA (a mayor nivel de Phe, menor nivel de ADMA) viene a corroborar las dos anteriores; a peor cumplimiento dietético, menores niveles de ADMA plasmáticos. La correlación positiva entre las cifras de vitamina B12 y la GOT (R2=0,26, p=0,001) y GPT (R2=0,2, p=0,005) refuerza nuestra hipótesis y nos permite extrapolar la función hepática como marcador de la adhesión a la dieta. Aquellos pacientes que reciben más cantidad de suplemementos (adhesión a la dieta), tendrán mayores cifras de enzimas hepáticas, ya que estos suplementos exigen del metabolismo hepático y al mismo tiempo, si reciben más suplemento, los niveles de B12 serán también mayores, como hemos demostrado. Por otro lado, sabemos que las cifras de creatinina plasmática varían con la edad, esto es, con la cantidad de masa muscular y por tanto, a mayor edad, mayores niveles de creatinina plasmática87. Además, sabemos que a mayor edad, menor adherencia al tratamiento dietético, es decir, menor consumo de suplementos66,67, tal y como nosotros mismos hemos comprobado. Ello nos permite explicar las correlaciones negativas entre la creatinina plasmática y los niveles de vitamina D (-0,39, p=0,019), Vitamina B12 (-0,35, p=0,003) y GOT (-0,54, p=0,001): a mayor edad, menor adherencia dietética-consumo de suplementos, menor aporte vitamínico y menor sobrecarga hepática. Y de la misma manera, a menor consumo de suplementos, y mayor consumo de proteínas naturales, mayores niveles de ácido úrico, colesterol y prealbúmina (correlaciones positivas con la creatinina: 0,44; 0,33 y 0,72 respectivamente, con p<0,05) Según nuestra hipótesis, ya hemos explicado cómo en los pacientes PKU que realizan un tratamiento dietético estricto, con altos aportes de suplementos enriquecidos, los niveles de Cr estarían bajos, y con ellos, los de su metabolito creatinina (tal y como hemos comentado anteriormente). Tesis Doctoral Discusión 111 De nuestra observación, podría deducirse que otro de los metabolitos que podría servir como marcador del cumplimiento dietético es la creatinina plasmática. Si los pacientes incumplen la dieta, y consumen más proteínas naturales y menos suplementos, la creatinina aumentaría al mismo tiempo que aumenta la Phe; al hallar una correlación positiva entre los dos metabolitos, podemos considerar que esta hipótesis es acertada. La determinación de la creatinina plasmática puede realizarse mediante un análisis de laboratorio rutinario de forma rápida y poco costosa, lo que le añadiría valor como posible sistema de control de adherencia al tratamiento, considerado siempre de forma conjunta con el gold estándar, la determinación de Phe. De la misma manera, si existe un mal control dietético, y se ingieren proteínas naturales al mismo tiempo que los suplementos, en la medida que se elevan la Phe y la creatinina, la deficiencia de Arg se hará más evidente (correlación negativa), la trans-sulfuración será mayor, y los niveles de Cys también. Desde otro punto de vista, podemos utlizar la misma creatinina como indicador de la severidad de la PKU. Las formas más leves, es decir, aquellas en las que es posible un mayor consumo de proteínas totales y de proteínas naturales, tienen menores niveles de creatinina plasmática (correlación negativa). Lo mismo ocurre en el caso de la mediana de Phe en el último año o de la Phe de control; si sus cifras son bajas, las de creatinina también lo serán (correlación positiva). 6.5. NUEVAS ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS En base a nuestros resultados, nos cabe pensar que los pacientes PKU a tratamiento dietético podrían beneficiarse de la administración de suplementos de metionina, con lo que aumentarían los niveles de homocisteína y ello podría suponer una menor alteración o incluso una normalización de la vía de la metilación. De la misma manera, otra posible nueva vía terapéutica sería la administración de suplementos de creatina, presente en la leche materna pero no Tesis Doctoral Discusión 112 en los suplementos dietéticos que reciben los pacientes PKU. Ambas hipótesis merecen un estudio independiente que excede los objetivos de nuestro trabajo. 6.6. SESGOS Y LIMITACIONES Este estudio ha sido realizado en la población del área Norte de España (Galicia y País Vasco), en pacientes PKU diagnosticados en su imnensa mayoría mediante el cribado neonatal, de distintos rangos de edad y con un adecuado cumplimiento dietético. El tamaño muestral fue calculado en base a la casuística de nuestros centros y al empleado en otros estudios que encontraron diferencias significativas en el análisis de metabolitos relacionados con la metilación. Con todo, no deja de tratarse de un estudio transversal aunque fuera planificado de forma prospectiva, siendo necesaria la realización de un estudio prospectivo, con mayor número de pacientes en cada grupo de edad y sobre todo respondedores a BH4, así como de distintas áreas geográficas tanto a nivel nacional como internacional, para evitar los sesgos derivados de condicionantes genéticos y culturales (hábitos dietéticos, estilo de vida, etc). A la vista de los datos de nuestro estudio podemos concluir que el tratamiento dietético y nutricional en los pacientes PKU, como consecuencia de la restricción proteica y el aporte excesivo de fólico y B12 que contienen los productos dietéticos empleados para estos pacientes, condiciona un aumento de las vías de trans-sulfuración y remetilación que consume grupos metilo de forma que no pueden ser empleados en otras reacciones, generando así un déficit de producción de ADMA y Cr/Crn, hecho sugerido en algún estudio previo, pero no demostrado hasta ahora. Además del control de fenilalanina, la determinación de Crn que se analiza fácilmente en muchos laboratorios y las determinaciones de ADMA y SDMA podrían ser también de utilidad para la monitorización de la adherencia dietética de estos pacientes. Por otra parte, el tratamiento con BH4, al permitir una dieta más libre en proteínas naturales y un menor consumo de producto dietético especial libre de Phe, parece alterar en menor medida la vía de la metilación y ello le supone un valor añadido a su indicación. 7. CONCLUSIONES  Tesis Doctoral Conclusiones 115 7. CONCLUSIONES 1En nuestra muestra existe una buena correlación genotipo-fenotipo, con pacientes portadores de mutaciones nulas que muestran altos niveles de concordancia con los fenotipos más graves, tal y como ha sido publicado en algunos estudios previos. 2El aporte proteico y el control de los niveles de Phe es adecuado según los estándares recomendados en la mayoría de nuestros pacientes PKU. La ingesta de proteínas totales de los pacientes PKU es un 117% de la CDR, de ellas, las proteínas naturales suponen un 48% de la CDR, excepto en los pacientes responsivos a BH4 que reciben como cabría esperar un aporte mayor de proteínas naturales. La mediana de Phe en el último año es adecuada en la práctica totalidad de la muestra, salvo en 8 de los 15 pacientes mayores de 10 años no tratados con BH4, que tienen niveles de Phe por encima de lo recomendado. 3A pesar de lo anterior, los pacientes PKU presentan un desarrollo estatural inferior a la población de referencia, presentando un Z-score de talla de -0,8. En cuanto al IMC, el 41,5% de los pacientes presentan sobrepeso y ningún paciente es obeso. Además, un porcentaje significativo de pacientes presenta valores de prealbúmina inferiores a 21 mg/dL (60,7%), concentraciones de selenio inferiores a 60 Pg/L (35%), de LDL-colesterol inferiores a 39 mg/dL (60%) y de HDL-colesterol inferiores a 30 mg/dL (13%). En cuanto a la vitamina D, un 13,5% de los pacientes PKU presentan una insuficiencia moderada. 4Aunque los niveles están más normalizados, no encontramos diferencias estadísticamente significativas en cuanto a los niveles prealbúmina, selenio, vitamina D ni colesterol fraccionado al estratificar la muestra en función del tratamiento con BH4, probablemente como consecuencia del número de pacientes que reciben esta terapia. Tesis Doctoral Conclusiones 116 5Los valores de ácido fólico y de vitamina B12 de los pacientes PKU de nuestra muestra se encuentran significativamente elevados con respecto a la población de referencia, mientras que en los pacientes respondedores a BH4, los valores de ambos micronutrientes se acercan más al rango de normalidad. 6Al analizar lo que ocurre con el perfil de aminoácidos, vemos que el 48% de los pacientes PKU presentan unos valores de Hcy muy inferiores al rango de referencia, así como una disminución en los niveles de Met, Arg y Citr, lo que indica un aumento de la vía de la remetilación. Por otro lado, los niveles de Cys están elevados, así como de los aminoácidos que dependen de la Arg para su metabolismo (Gly y Orn) lo que indica un aumento de la trans-sulfuración. 7La restricción proteica propia de la dieta de los pacientes PKU, unida al excesivo aporte de ácido fólico y vitamina B12 de sus suplementos, ocasionan una alteración de la vía de la metilación en los pacientes PKU, al aumentar tanto la vía de la trans-sulfuración como de la remetilación. Esto supone un consumo de grupos metilo que no pueden emplearse en otras reacciones, lo que se traduce en una disminución en la producción de ADMA, SDMA, Creatina y Creatinina, tal y como hemos demostrado. 8El tratamiento con BH4, al permitir una dieta más libre en proteínas naturales y un menor aporte de suplentos, debería condicionar una menor alteración en la metilación; si bien las cifras de ADMA, SDMA y Creatinina en los pacientes tratados con BH4 se aproximan más al rango de referencia, no hallamos diferencias estadísticamente significativas. 9Las determinaciones de ADMA y Crn plasmática pueden se útiles como marcadores indirectos del cumplimiento dietético por parte de los pacientes. Esto es especialmente importante en el caso de la Crn plasmática, ya que se trata de una determinación que puede realizarse de forma estándar en un análisis de laboratorio ordinario y con un coste bajo. Tesis Doctoral Conclusiones 117 10Nuestros resultados ponen por primera vez de manifiesto las alteraciones de la vía de la metilación en pacientes PKU y su relación con el tratamiento dietético, en especial en el caso de la Arg-GAA-Cr, que no había sido previamente estudiada en esta enfermedad. En base a nuestros resultados, consideramos que nuevas líneas de investigación de cara al tratamiento de la PKU podrían ser la administración de suplementos de metionina y/o de creatina. Tesis Doctoral Bibliografía 124 46 Jäggi L, Zurflüh MR, Schuler A, Ponzone A, Porta F, Fiori L, et al. Outcome and long-term follow-up of 36 patients with tetrahydrobiopterin deficiency. Mol Genet Metab 2008; 93: 295–305. 47 Muntau A. C, Röschinger W, Habich M, Demmelmair H, Hoffmann B, Sommerhoff CP, et al. Tetrahydrobiopterin as an alternative treatment for mild phenylketonuria. N Engl J Med 2002; 347: 2122–2132 48 Burton BK, Grange DK, Milanowski A, Vockley G, Feillet F, Crombez EA, et al. 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