Análisis genético molecular de la retinitis pigmetaria en dos familias que presentan diferentes modos de herencia mendeliana

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR DE LA RETINITIS PIGMENTARIA EN DOS FAMILIAS QUE PRESENTAN DIFERENTES MODOS DE HERENCIA MENDELIANA Alejandro J. Brea Fernández Santiago de Compostela, 2008 El Profesor Doctor Ángel Carracedo Álvarez, Catedrático de Medicina Legal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela CERTIFICA: Que la presente Tesis Doctoral: “ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR DE LA RETINITIS PIGMENTARIA EN DOS FAMILIAS QUE PRESENTAN DIFERENTES MODOS DE HERENCIA MENDELIANA” del licenciado en Biología D. Alejandro J. Brea Fernández ha sido realizada bajo su dirección, considerándola en condiciones para optar al Grado de Doctor y autorizándola para su presentación ante el tribunal correspondiente. Y para que así conste, expido el presente certificado en Santiago de Compostela a 30 de Abril de 2008. Fdo. Prof. Dr. Ángel Carracedo Álvarez UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR DE LA RETINITIS PIGMENTARIA EN DOS FAMILIAS QUE PRESENTAN DIFERENTES MODOS DE HERENCIA MENDELIANA Memoria que presenta, para optar al grado de Doctor, Alejandro J. Brea Fernández Santiago de Compostela, Abril 2008 A Pequi y a nuestro hijo Alejandro Ante los fenómenos que desfilan por los órganos sensoriales, la actividad del intelecto sólo puede ser verdaderamente útil y fecunda reduciéndose modestamente a observarlos, describirlos, compararlos y clasificarlos, según sus analogías y diferencias, para llegar después, por inducción, al conocimiento de sus condiciones determinantes y leyes empíricas. Santiago Ramón y Cajal, Los tónicos de la voluntad. ÍNDICE XVI I.4.2.2. El ciclo de los retinoides en los conos..................................................................................49 I.4.2.3. Genes responsables de RP implicados en el metabolismo del retinol ..............................50 I.4.2.3.1. Lecitín Retinol Aciltransferasa........................................................................................................50 I.4.2.3.2. Proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina................................................ 51 I.4.2.3.3. Proteína de unión al retinaldehído, 1............................................................................................... 53 I.4.2.3.4. Transportador con una casette de unión a ATP............................................................................... 53 I.4.2.3.5. Receptor acoplado a proteína G del epitelio pigmentario de la retina.............................................55 I.4.3. Mantenimiento de la estructura de las células fotorreceptoras................................ 56 I.4.3.1. Genes responsables de RP implicados en el mantenimiento de la estructura de los fotorreceptores..................................................................................................................................63 I.4.3.1.1. Periferina 2 / RDS........................................................................................................................... 63 I.4.3.1.2. Proteína de membrana del segmento externo de los bastones, 1.....................................................64 I.4.3.1.3. Prominina, 1.................................................................................................................................... 65 I.4.4. Factores de transcripción de los fotorreceptores ....................................................... 66 I.4.4.1. Genes responsables de RP implicados en la transcripción ...............................................67 I.4.4.1.1. Factor de transcripción de conos y bastones con caja homeótica de tipo Otx ................................. 67 I.4.4.1.2. Factor de transcripción neuroretinal con cremallera de leucina ...................................................... 68 I.4.4.1.3. Receptor nuclear de la sufamilia 2 grupo E3................................................................................... 69 I.4.5. Interacciones celulares..................................................................................................70 I.4.5.1. Genes responsables de RP implicados en interacciones celulares....................................75 I.4.5.1.1. Protooncogen c-MER receptor tirosín kinasa.................................................................................. 75 I.4.5.1.2. Homólogo del gen crumbs de Drosophila.......................................................................................76 I.4.5.1.3. Usherina..........................................................................................................................................77 I.4.6. Procesado del RNA mensajero..................................................................................... 78 I.4.6.1. Genes responsables de RP implicados en el procesado de mRNA...................................79 I.4.6.1.1. Factor 3 de procesado de pre-mRNA.............................................................................................. 79 I.4.6.1.2. Factor 8 de procesado de pre-mRNA.............................................................................................. 80 I.4.6.1.3. Factor 31 de procesado de pre-mRNA............................................................................................ 81 I.4.6.1.4. Proteína RP9 o proteína asociada a la kinasa PIM1........................................................................82 I.4.7. Transporte intracelular y citoesqueleto...................................................................... 83 I.4.7.1. Genes responsables de RP implicados en el transporte intracelular y el citoesqueleto..87 I.4.7.1.1. Proteína similar a tubby................................................................................................................... 87 I.4.7.1.2. Regulador de GTPasa implicado en Retinitis Pigmentaria.............................................................. 89 I.4.7.1.3. Proteína RP1 ...................................................................................................................................92 I.4.7.1.4. Proteína RP2 ...................................................................................................................................93 I.4.7.1.5. Fascina retinal................................................................................................................................. 95 I.4.8. Genes responsables de RP con función desconocida.................................................. 96 I.4.8.1. Inosina 5´ monofosfato deshidrogenasa 1 ..........................................................................96 I.4.8.2. Anhidrasa carbónica IV.......................................................................................................97 I.4.8.3. Proteína similar a ceramida kinasa....................................................................................98 I.4.8.4. Semaforina 4A....................................................................................................................100 I.4.8.5. Proteína rica en arginina y serina de unión a Topoisomerasa I.....................................101 ÍNDICE XVII I.4.8.6. Homólogo de la proteína canina de degeneración progresiva de conos y bastones......102 I.4.9. Los loci huérfanos de la RP........................................................................................ 103 I.4.9.1. RP6......................................................................................................................................103 I.4.9.2. RP22....................................................................................................................................103 I.4.9.3. RP23....................................................................................................................................104 I.4.9.4. RP24....................................................................................................................................104 I.4.9.5. RP25....................................................................................................................................104 I.4.9.6. RP28....................................................................................................................................105 I.4.9.7. RP29....................................................................................................................................105 I.4.9.8. RP32....................................................................................................................................105 I.4.9.9. RP33....................................................................................................................................106 I.4.9.10. RP34..................................................................................................................................106 II. OBJETIVOS...............................................................................................107 III. MATERIAL Y MÉTODOS.....................................................................111 III.1. Familias del estudio ..............................................................................................113 III.1.1. Construcción de árboles genealógicos.................................................................... 113 III.1.2. Familia 68................................................................................................................. 113 III.1.3. Familia R.................................................................................................................. 115 III.2. Extracción de ácidos nucleicos.............................................................................115 III.2.1. Recogida de las muestras ........................................................................................ 115 III.2.2. Extracción de DNA genómico................................................................................. 116 III.2.2.1. Método de extracción de DNA genómico con Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico a partir de sangre total......................................................................................................................116 III.2.2.2. Método de extracción de DNA genómico con QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN) a partir de sangre total...............................................................................................117 III.2.2.3. Cuantificación del DNA..................................................................................................118 III.2.2.4. Conservación del DNA ...................................................................................................119 III.2.3. Extracción de RNA.................................................................................................. 119 III.2.3.1. Obtención de la interfase de células blancas de cada individuo..................................119 III.2.3.2. Aislamiento del RNA de las células blancas .................................................................120 III.2.3.3. Conservación del RNA ...................................................................................................121 III.3. Análisis de marcadores genéticos polimórficos..................................................121 III.3.1. Análisis de marcadores microsatélites................................................................... 121 III.3.1.1. Parámetros de selección de los STRs.............................................................................122 III.3.1.2. Primera fase: exclusión de los loci y genes conocidos..................................................122 III.3.1.2.1. Locus RP2...................................................................................................................................122 III.3.1.2.2. Locus RP3...................................................................................................................................123 III.3.1.2.3. Locus RP6...................................................................................................................................123 ÍNDICE XVIII III.3.1.2.4. Locus RP23 ................................................................................................................................ 124 III.3.1.2.5. Locus RP24 ................................................................................................................................ 124 III.3.1.2.6. Locus RP34 ................................................................................................................................ 125 III.3.1.3. Segunda fase: Selección de STRs para acotamiento fino del locus RP24...................125 III.3.1.4. Tercera fase: Selección de STRs para análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo largo del cromosoma X................................................125 III.3.1.4.1. Etapa I: análisis de la región subtelomérica del brazo largo....................................................... 126 III.3.1.4.2. Etapa II: análisis de la región comprendida entre el centrómero y el locus RP24 ...................... 126 III.3.1.4.3. Etapa III: análisis de la región Centrómero-RP24 ampliada en ambos extremos ....................... 126 III.3.1.4.4. Etapa IV: análisis de la región Centrómero-RP24 reampliada en su extremo 3´........................ 126 III.3.1.5. Cuarta fase: Selección de STRs para análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo corto del cromosoma X................................................127 III.3.1.6. Quinta fase: análisis de 10 STRs del cromosoma X con un décaplex del IPATIMUP (Instituto de Inmunología y Patología Molecular de la Universidad de Oporto)......................127 III.3.2. Análisis de polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) ................................... 127 III.3.2.1. Parámetros de selección de SNPs...................................................................................127 III.3.2.2. I Región: definida entre los marcadores DXS996 y DXS 1223....................................128 III.3.2.3. II Región: definida entre los marcadores DXS1224 y DXS 7163................................128 III.3.2.4. III Región: definida entre los marcadores DXS1226 y DXS 9896...............................128 III.3.2.5. IV Región: definida entre los marcadores DXS9907 y DXS6679................................129 III.3.2.6. V Región: definida entre los marcadores DXS1068 y DXS 988 ..................................129 III.3.2.7. VI Región: definida entre los marcadores DXS7132 y DXS 6800...............................129 III.3.2.8. VII Región: definida entre los marcadores DXS986 y DXS 1002...............................129 III.3.2.9. VIII Región: definida entre los marcadores DXS8045 y DXS 7423............................129 III.3.3. Amplificación de STRs y SNPs por PCR............................................................... 130 III.3.3.1. Diseño de los primers......................................................................................................130 III.3.3.2. Condiciones de amplificación.........................................................................................130 III.3.3.2.1. Termociclador ............................................................................................................................ 130 III.3.3.2.2.- Mezcla de reacción.................................................................................................................... 130 III.3.3.2.3. Concentración de DNA .............................................................................................................. 131 III.3.3.2.4. Programa de amplificación......................................................................................................... 131 III.3.3.2.5. Control de amplificación............................................................................................................ 131 III.3.4. Electroforesis y detección de los productos amplificados..................................... 132 III.3.4.1. Electroforesis vertical en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes.....................132 III.3.4.2. Electroforesis horizontal en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes................133 III.3.4.3. Electroforesis capilar en secuenciador con primers marcados con FAM ..................134 III.3.5. Tinción de los geles .................................................................................................. 135 III.3.5.1 Tinción con Bromuro de Etidio ......................................................................................135 III.3.5.2. Tinción con nitrato de plata ...........................................................................................136 III.3.6. Caracterización de los alelos................................................................................... 137 III.3.7. Reconstrucción de los haplotipos. Análisis de cosegregación .............................. 137 ÍNDICE XIX III.4. Análisis de genes responsables de RP autosómica recesiva ..............................137 III.4.1. Array de genes de RP autosómica recesiva en plataforma SNPlex..................... 138 III.4.2. Array de genes de RP autosómica recesiva en plataforma MassARRAY.......... 142 III.4.3. Análisis de Cosegregación....................................................................................... 145 III.5. Análisis Mutacional ..............................................................................................146 III.5.1. Amplificación de los exones .................................................................................... 146 III.5.1.1. Diseño de los primers......................................................................................................146 III.5.1.2. Mezcla de reacción..........................................................................................................146 III.5.1.3. Programa de amplificación............................................................................................146 III.5.1.4. Control de amplificación................................................................................................147 III.5.2. Secuenciación directa de los exones amplificados................................................. 147 III.6. RT-PCRs y cDNAs................................................................................................148 III.6.1. Diseño de los primers .............................................................................................. 148 III.6.2. Mezcla de reacción .................................................................................................. 149 III.6.3. Programa de amplificación..................................................................................... 149 III.6.4. Control de amplificación......................................................................................... 150 III.6.5. Secuenciación........................................................................................................... 150 III.7. Búsqueda por todo el genoma (Whole Genome Scan) .......................................150 III.7.1. GeneChip® Human Mapping 250K NspI Array................................................... 150 III.7.2. Análisis de ligamiento.............................................................................................. 158 IV. RESULTADOS .........................................................................................161 IV.1. Capítulo I: Búsqueda del gen responsable de RP en la familia 68 ...................163 IV.1.1. Análisis de marcadores microsatélites ................................................................... 165 IV.1.1.1. Primera fase: Exclusión de loci y genes conocidos.......................................................165 IV.1.1.1.1. Gen RP2 (Locus RP2) ................................................................................................................165 IV.1.1.1.2. Gen RPGR (Locus RP3).............................................................................................................166 IV.1.1.1.3. Locus RP6 ..................................................................................................................................166 IV.1.1.1.4. Locus RP23.................................................................................................................................167 IV.1.1.1.5. Locus RP24.................................................................................................................................168 IV.1.1.1.6. Locus RP34.................................................................................................................................169 IV.1.1.2. Segunda fase: Acotamiento fino del locus RP24...........................................................169 IV.1.1.3. Tercera fase: Análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo largo del cromosoma X.........................................................................................171 IV.1.1.3.1. Etapa I: análisis de la región subtelomérica del brazo largo .......................................................171 IV.1.1.3.2. Etapa II: análisis de la región comprendida entre el centrómero y el locus RP24.......................171 IV.1.1.3.3. Etapa III: análisis de la región centrómero-RP24 ampliada en ambos extremos ........................173 IV.1.1.3.4. Etapa IV: análisis de la región centrómero-RP24 reampliada en su extremo 3´ .........................174 IV.1.1.4. Cuarta fase: análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo corto del cromosoma X.........................................................................................176 ÍNDICE XX IV.1.1.5. Quinta fase: análisis con el décaplex del IPATIMUP...................................................178 IV.1.2. Análisis de polimorfismos de un único nucleótido (SNPs).................................... 178 IV.1.2.1. Región I, acotada por DXS996 y DXS1223 ...................................................................178 IV.1.2.2. Región II, acotada por DXS1224 y DXS 7163...............................................................179 IV.1.2.3. Región III, acotada por DXS1226 y DXS 9896 .............................................................179 IV.1.2.4. Región IV, acotada por DXS9907 y DXS 6679..............................................................180 IV.1.2.5. Región V, acotada por DXS1068 y DXS988..................................................................180 IV.1.2.6. Región VI, acotada por DXS7132 y DXS 6800..............................................................180 IV.1.2.7. Región VII, acotada por DXS986 y DXS 1002..............................................................180 IV.1.2.8. Región VIII, acotada por DXS8045 y DXS 7423 ..........................................................181 IV.1.3. Reconstrucción de los haplotipos a partir de los genotipos.................................. 181 IV.1.4. Análisis de genes responsables de arRP: array de plataforma MassARRAY.... 183 IV.1.5. Whole Genome Scan: GeneChip® Human Mapping 250K NspI Array ............. 185 IV.1.5.1. Análisis de ligamiento Two-point....................................................................................185 IV.1.5.2. Análisis de ligamiento Multipoint...................................................................................186 IV.2. Capítulo II: Búsqueda del gen responsable de RP en la familia R .................. 203 V. DISCUSIÓN................................................................................................227 Búsqueda del gen responsable de RP en la familia 68................................................ 229 Exclusión de loci y genes conocidos de la XlRP .......................................................... 230 Búsqueda de un nuevo locus en el cromosoma X........................................................ 231 Análisis de genes responsables de arRP en la familia 68............................................ 233 Análisis de ligamiento de todo el genoma .................................................................... 235 Análisis de ligamiento paramétrico Two-point ............................................................ 237 Análisis de ligamiento paramétrico Multipoint ........................................................... 238 Búsqueda del gen responsable de RP en la familia R................................................. 241 Análisis mutacional del gen MERTK............................................................................ 242 Efecto de la mutación IVS16+1G>T............................................................................. 242 Mecanismos de degradación del mRNA alterado....................................................... 246 Efecto de la mutación en la proteína............................................................................ 246 VI. CONCLUSIONES.....................................................................................249 VII. ANEXO.....................................................................................................253 VIII. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................261 ABREVIATURAS XXI ABREVIATURAS ad: Autosómico dominante AMD: Degeneración macular atrófica (Atrophic Macular Degeneration) ar: Autosómico recesivo ARAT: Acil-CoA-retinol aciltransferasa ARMD: Degeneración macular asociada a la edad (Age-Related Macular Degeneration) AVMD: Distrofia macular viteliforme del adulto (Adult Vitelliform Macular Dystrophy) BD: Distrofia de Bothnia (Bothnia Dystrophy) CACD: Distrofia coroidea areolar central (Central Areolar Choroidal Dystrophy) cGMP: Guanidín Monofosfato cíclico cM: CentiMorgan CNG: Canales catiónicos regulados por cGMP (Cyclic Nucleotide-Gated channel) COD: Distrofia de los conos (Cone Dystrophy) CORD: Distrofia de conos y bastones (Cone-Rod Dystrophy) CPRD: Degeneración pigmentaria agrupada de la retina (Clumped Pigmentary Retinal Degeneration) CRBP: Proteína celular de unión al retinol (Cellular Retinol Binding Protein) CS: Esclerosis coroidea (Choroidal Sclerosis) CSNB: Ceguera nocturna estacionaria congénita (Congenital Stationary Night Blindness) CSRD: Distrofia retinal infantil severa (Childhood-onset Severe Retinal Dystrophy) DAG: Diacilglicerol digRP: RP digénica EORD: Distrofia Retinal de inicio temprano (Early-Onset Retinal Dystrophy) ESCS: Síndrome de incremento de conos S (Enhanced S-Cone Syndrome) FFM: Fundus flavimaculatus FISH: Hibridación in situ por fluorescencia (Fluorescence in situ hybridation) G*: Gαt-GTP activada GARP: Proteína rica en ácido glutámico (Glutamic Acid-Rich Protein) GC: Guanilato ciclasa GCAP: Proteína activadora de la guanilato ciclasa (Guanylate Cyclase Activating Protein) GFS: Síndrome de Goldmann-Favre (Goldmann-Favre Syndrome) GPCRs: Receptores acoplados a proteína G (G Protein-Coupled Receptors) GRK1: Rodopsín kinasa GTP: Guanosina 5´-trifosfato INL: Capa nuclear interna (Inner Nuclear Layer) ABREVIATURAS XXII IRBP: Proteína interfotorreceptora de unión a retinoides (Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein) Kb: Kilobase LCA: Amaurosis congénita de Leber (Leber Congenital Amaurosis) LWS: Sensible a longitud de onda larga (Long Wavelength-Sensitive) Mb: Megabase MD: Distrofia macular (Macular Dystrophy) mRNA: RNA mensajero mtDNA DNA mitocondrial NFRCD: Distrofia de conos y bastones de Newfoundland (Newfoundland Rod-Cone Dystrophy) pb: Par de bases PCOD: Distrofia progresiva de los conos (Progressive Cone Dystrophy) PDE*: Fosfodiesterasa activada PE: Fosfatidiletanolamina PKA: Proteín kinasa dependiente de cAMP PLC: Fosfolipasa C PPCRA: Atrofia corioretinal paravenosa pigmentaria (Pigmented Paravenous Chorioretinal Atrophy) PPRPE: Preservación Para-Arteriolar del RPE (Para-Arteriolar Preservation of the RPE) PTK: Proteín tirosín kinasa PTP: Proteín tirosín fosfatasa R*: Rodopsina activada REC: Recoverina REST: Partícula de almacenamiento de éster de retinil (Retinyl Ester Storage Particle) RP: Retinitis Pigmentaria RPA: Retinitis punctata albescens RPE: Epitelio Pigmentario de la Retina (Retinal Pigment Epithelium) rpm: Revoluciones por minuto SDS: Dodecil sulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate) SNP: Polimorfismo de un único nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism) snRNP: Ribonucleoproteína nuclear (Small Nuclear Ribonucleoprotein) STGD: Enfermedad de Stargardt (Stargardt Disease) STR: Repetición corta en tandem (Short Tandem Repeat) SWS: Sensible a longitud de onda corta (Short Wavelength-Sensitive) USH: Síndrome de Usher (Usher Syndrome) Xl: Ligado al cromosoma X λmax: Máxima absorción I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3 I.1. Diferenciación de la retina de vertebrados El interés por la anatomía, la función y el desarrollo del ojo humano se remonta a los tiempos de Aristóteles. No existía verdadera constancia de cómo se desencadenaban los hechos que conducían a la formación del ojo hasta que, en el siglo XVII, Steno y Malpighi describieron por primera vez la fisura coroidea (O'Rahilly, 1975). En la actualidad, este proceso es conocido desde las primeras divisiones del zigoto, apareciendo su primera manifestación a los 18 días de gestación (Figura 1). En este estadío embrionario, se distinguen dos surcos poco profundos a cada lado del cerebro anterior, los denominados surcos neurales. Hacia los 22 días –cuando el embrión posee 8 pares de somitas y aproximadamente 2 mm. de longitud total– aparecen el primordio y el surco óptico en el surco neural de cada lado del prosencéfalo. Dos días más tarde, el neuroporo rostral se cierra y se producen sendas evaginaciones del cerebro anterior a través de estos surcos originando las vesículas ópticas. Estas vesículas entran en contacto con el ectodermo superficial induciendo en él los cambios necesarios para la formación del cristalino. Así, sobre el día 28, se identifica el disco retinal en la pared de la vesícula óptica y el disco del cristalino en el ectodermo de superficie. Posteriormente, se produce la invaginación del disco retinal, el cual arrastra tras de sí a la vesícula óptica dando lugar a la formación de las cúpulas ópticas de pared doble. La capa interna y la externa de la pared doble están separadas por el espacio intrarretiniano que desaparece poco después haciendo que las dos capas se yuxtapongan. A lo largo del proceso de desarrollo del ojo, ambas capas sufrirán varios cambios que darán lugar a la formación de la retina neural a partir de la capa interna y del epitelio pigmentario de la retina a partir de la externa. Figura 1. Esquema del desarrollo del ojo de vertebrados. Los tejidos presuntivos del ojo han sido coloreados de la siguiente manera: en azul, el cristalino/córnea; en verde, la retina neural; en amarillo, el epitelio pigmentario de la retina (RPE); en morado, el pedículo óptico; en rojo, el prosencéfalo ventral/mesodermo precordal y en gris, el mesénquima. (A) Formación de la vesícula óptica. La flecha indica la evaginación de la presunta región del prosencéfalo que da lugar al surco óptico (OP). PNR, presunta retina neural; POS, presunto pedículo óptico ventral; PLE, presunto ectodermo del cristalino; M, mesénquima; VF, prosencéfalo ventral; PCM, mesodermo precordal. (B) Desarrollo de la vesícula óptica. Este proceso culmina con un período de contacto íntimo con la placoda del cristalino (LP) y la presunta retina neural (NR). VOS, pedículo óptico ventral; DOS, pedículo óptico dorsal. (C) Invaginación de la vesícula óptica. El punto en el cual convergen la retina neural (NR) y el RPE dará lugar a los componentes del cuerpo ciliar y el iris (C/I). LV, vesícula del cristalino. (D) Estructura del ojo en estadios gestacionales avanzados. C, córnea; LE, epitelio del cristalino; LF, fibras del cristalino; I, iris; CB, cuerpo ciliar; GCL, capa de células ganglionares; INL; capa nuclear interna; ONL, capa nuclear externa y ON, nervio óptico. Tomada de (Chow y Lang, 2001). A B C D INTRODUCCIÓN 10 de fetos de 20 semanas, tiempo en el cual se produce la diferenciación de los segmentos externos de las células fotorreceptoras (Hageman y Johnson, 1991). Los bastones son las primeras células involucradas en la síntesis de IRBP y en su consiguiente secreción dentro de la matriz interfotorreceptora. La importancia de la regulación de la permeabilidad en la membrana limitante externa ejercida por las JAMs (Junction Adhesion Molecules A, B y C) radica en evitar la salida de la proteína IRBP del espacio interfotorreceptor, en donde es absolutamente necesaria (Daniele et al., 2007). Además de esta molécula, la matriz interfotorreceptora está constituida por otras proteínas, glicoproteínas y glucosaminoglicanos. Entre ellos se pueden encontrar glicoproteínas similares a la mucina, varios enzimas, una fosfodiesterasa de cGMP, antígenos solubles, factores tróficos y una gran variedad de proteínas séricas, tales como la albúmina o las inmunoglobulinas (Hageman y Johnson, 1991). Se ha comprobado que los componentes de la matriz interfotorreceptora se distribuyen de forma heterogénea siguiendo dos patrones básicos: aquel que demuestra diferencia de composición apical-basal; y aquel que demuestra diferencia de composición dependiendo del tipo de célula fotorreceptora con la que toma contacto. Las interacciones entre las regiones apicales del RPE, las células de Müller y los fotorreceptores con la matriz interfotorreceptora son esenciales para el mantenimiento de la aposición del RPE y la retina neural. La alteración química de los componentes de la matriz interfotorreceptora provocaría la separación de la retina del RPE (Daniele et al., 2007). I.2. Topografía de la capa de fotorreceptores de la retina Los bastones y los conos, fácilmente distinguibles entre sí por su particular morfología, pueden ser reconocidos en la mayoría de las retinas de los vertebrados. La proporción de bastones/conos de una retina suele servir como indicador del estilo de vida del animal del que procede. Así, las retinas de animales nocturnos o de las profundidades marinas, presentan una mayor cantidad de bastones, maximizando la sensibilidad a la luz en detrimento de la discriminación de color (visión escotópica). Por su parte, las retinas de los animales diurnos presentan una mayor cantidad de conos, los cuales facilitan la visión en condiciones de alta intensidad de brillo y proporcionan una óptima visión en color (visión fotópica). Como ejemplos de las distribuciones extremas de los fotorreceptores se pueden citar a Gekko gekko, un gecko nocturno que solo posee bastones en su retina y a Anolis carolinensis, un camaleón americano en cuya retina solo existen conos (Yokoyama y Yokoyama, 1996). La enorme mayoría de los primates poseen ojos especializados en la visión diurna, pero aún así en sus retinas se encuentran ambos tipos de células fotorreceptoras. Fisiológicamente, los bastones son 100 veces más sensibles a la luz que los conos, aunque detectan una gama más reducida de las intensidades de luz de fondo y su respuesta a la luz es de 2 a 5 veces más lenta. En consecuencia, INTRODUCCIÓN 11 mediante los conos discriminan colores y finos detalles a plena luz del día, mientras que con los bastones garantizan –aunque de forma menos eficiente– la visión en condiciones de luz tenue (visión mesotópica). Es bastante impreciso realizar un cómputo de los fotorreceptores de una retina, puesto que en la medida influirán factores como la edad del donante, el tamaño de la porción analizada, la localización anatómica de la porción en la retina y la gran variabilidad existente en relación con la cantidad de fotorreceptores que posee cada individuo (Jonas et al., 1992; Curcio et al., 1993). Pese a ello, en 1935, Østerberg realizó el primer cómputo de células fotorreceptoras en la retina de un único ojo de un varón de 16 años. Los datos obtenidos reflejaban unos valores totales de 110000000 a 125000000 bastones y de 6300000 a 6800000 conos. Además, calculó las densidades de los conos obteniendo un valor máximo de 150000 conos/mm2 en el centro de la fóvea, que descendía bruscamente a 4000-5000 conos/mm2 en la periferia de la retina. Del mismo modo calculó las densidades de los bastones, encontrando un máximo de 160000 bastones/mm2 a unos 5-6 mm del centro de la fóvea (no detectó la presencia de bastones en la fóvea) que disminuía progresivamente a 30000-40000 bastones/mm2 en la periferia de la retina. Un estudio posterior realizado sobre una mayor cantidad de retinas y con otras técnicas evidenció valores menores que los obtenidos por Østerberg. Así, las cifras totales obtenidas fueron de 38742000 a 80650000 bastones y de 2235495 a 4284437 conos. La densidad máxima de conos se situó en 125000 conos/mm2 a una distancia aproximada de 40 μm del centro de la fóvea. Sin embargo, como estos estudios no evaluaban el contenido en fotorreceptores del centro de la fóvea, fue necesario realizar una extrapolación a partir de una curva de distribución en dirección a la fóvea para estimar las densidades de los conos, obteniéndose un valor final de 150000 a 180000 conos/mm2, en concordancia con los datos obtenidos por Østerberg. En cuanto a la densidad de los bastones, el pico máximo obtenido de 150000 bastones/mm2 se localizaba a 3-5 mm de la fóvea, reduciéndose esta cifra hasta los 30000-40000 bastones/mm2 en la periferia de la retina, dato que también se correspondía con el estudio de Østerberg (Jonas et al., 1992). Finalmente, el estudio de la topografía de las células fotorreceptoras en la retina humana refleja un hacinamiento de los conos en una pequeña región de la retina denominada fóvea, donde se focaliza la imagen (Figura 5). Dentro de la fóvea existe una pequeña región central de unos 100 μm de diámetro en la cual la densidad de conos sensibles a longitudes de onda corta o al azul disminuye bruscamente y llega a alcanzar valores nulos en los 50 μm centrales (Bumsted y Hendrickson, 1999). Hasta el momento, se desconoce si la ausencia de este tipo de conos en esta región de la fóvea supone alguna ventaja en la capacidad visual. Por otro lado, los bastones se disponen en las partes más periféricas de la retina permitiendo la captación de luz tenue en la oscuridad (Kolb, 2003). INTRODUCCIÓN 12 I.3. Histopatología y patología molecular de la Retinitis Pigmentaria El término Retinitis Pigmentaria (RP; OMIM #268000) fue empleado por primera vez en 1857 por el médico holandés Franz Cornelius Donders (Tilburg in Nordbrabant, 1818 – Utrecht, 1889). Con él hacía referencia a las alteraciones pigmentarias observadas en la retina de algunos individuos ciegos. A lo largo de los años este término ha sido muy criticado, principalmente porque no existe evidencia alguna que indique un origen inflamatorio de esta patología (Dewar y Reading, 1975). Hoy en día, aunque se reconoce que la expresión Retinitis Pigmentaria es semánticamente incorrecta, puesto que RP es una patología hereditaria y no inflamatoria, sigue siendo ampliamente aceptada y utilizada (Pagon, 1988). La RP forma parte de un grupo de enfermedades hereditarias de la retina caracterizadas por la degeneración progresiva de los conos y los bastones (Armstrong y Smith, 1999; Hartong et al., 2006). En este grupo también se incluye la ceguera nocturna estacionaria congénita (CSNB), la distrofia macular (MD), la distrofia de conos y bastones (CORD) y la degeneración macular asociada a la edad (ARMD) (Armstrong y Smith, 1999). Los estudios realizados sobre RP en diferentes poblaciones han permitido estimar una prevalencia mundial de 1 de cada 4000 personas (Haim, 2002; Hamel, 2006; Hartong et al., 2006). Figura 5.- Distribución aproximada de los bastones y los conos en la retina. La ausencia de bastones (línea con cuadrados) y conos (línea con círculos) entre -15 y -19 grados se corresponde con la región del punto ciego. En este punto convergen los axones de las células ganglionares y salen de la retina como el nervio óptico. Tomada de http://dragon.uml.edu/psych/rodconedistribution.html INTRODUCCIÓN 13 I.3.1. Aspectos genéticos de la RP La naturaleza hereditaria de la RP se confirmó cuando Liebreich, en 1861, observó que la incidencia de esta patología era más alta en familias resultantes de matrimonios entre primos hermanos (Dewar y Reading, 1975). La RP es una de las patologías moleculares con mayor heterogeneidad genética en cuanto al modo de herencia. Aproximadamente el 45% de los casos de RP son esporádicos, pero los restantes presentan diversos patrones de herencia (Hamel, 2003). La RP puede ser heredada como un carácter autosómico dominante (30-40% de los casos), autosómico recesivo (5060%) o ligado al cromosoma X (5-15%) (Hartong et al., 2006). Estas proporciones asumen que todos los casos aislados son autosómicos recesivos, aunque unos pocos podrían presentar nuevas mutaciones dominantes, ejemplos de isodisomía uniparental o, en los hombres, mutaciones ligadas a X (Thompson et al., 2002; Rivolta et al., 2002a). Patrones de herencia no mendeliana, como son la herencia digénica (Goldberg y Molday, 1996; Dryja et al., 1997; Kedzierski et al., 2001; Loewen et al., 2001) o la herencia mitocondrial (Mansergh et al., 1999), representan una pequeña proporción de los casos. Las variaciones en la penetrancia son frecuentes, particularmente en el caso de las mutaciones de PAP1, PRPF31 y RP1 (van Heyningen y Yeyati, 2004; Hamel, 2006). Por otro lado, además de la presentación no sindrómica, RP puede presentarse de forma sindrómica como el síndrome de Usher o el de Bardet-Biedl (Farrar et al., 2002). I.3.1.1. Modos de herencia de la RP Esta patología está relacionada con múltiples genes, los cuales muestran varios patrones de herencia: 1.- RP autosómica dominante (adRP). Las formas autosómicas dominantes representan un 30-40% de los casos de RP. Son fácilmente identificables mediante un examen minucioso de los individuos afectados, los cuales presentarán rasgos o características asociados a la función genética aberrante (Armstrong y Smith, 1999). En estas formas de RP el inicio de la sintomatología suele instaurarse al final de la primera o inicio de la segunda década de vida. La relativamente suave sintomatología inicial irá volviéndose más severa a medida que avanza el desarrollo de la patología (Dewar y Reading, 1975). Algunas de las formas de adRP pueden mostrar penetrancia incompleta (Voaden, 1991). La variación de la expresión del alelo salvaje en contraposición con la del mutante puede influenciar la penetrancia del fenotipo patológico (van Heyningen y Yeyati, 2004). En el caso de PRPF31, las manifestaciones clínicas de la RP parecen estar moduladas por la baja expresión del alelo salvaje en contraposición con la del alelo mutado (Vithana et al., 2003; Rivolta et al., 2006). Los individuos sintomáticos heredarían de su progenitor no portador una relativamente pobre expresión del alelo salvaje, en comparación con los individuos asintomáticos. Los bajos niveles de la proteína PRPF31 en los fotorreceptores provocarían un empeoramiento de la sintomatología de la RP, debido a INTRODUCCIÓN 14 la sensibilidad que presentan estas células ante cambios de concentración de este factor de splicing en situaciones de elevada síntesis de RNA mensajero o mRNA (como la generada durante el recambio de los segmentos externos). 2.- RP autosómica recesiva (arRP). Las formas autosómicas recesivas explican entre un 50 y un 60% de los casos de RP. Al contrario de lo que sucede en la adRP, los individuos que heredan un único alelo autosómico recesivo de RP no muestran ningún signo de la patología. Generalmente, la sintomatología de estas formas de RP comienza en torno al final de la primera o inicio de la segunda década de vida (Dewar y Reading, 1975). Sin embargo, existen formas de arRP de inicio tardío. Estas son poco frecuentes y suelen provocar un deterioro moderado de la función retinal, con una progresión más lenta y menor pérdida de agudeza visual que las formas de inicio temprano. 3.- RP ligada al cromosoma X (XlRP). La naturaleza heterogénea de la RP se confirma al comprobar que esta patología presenta patrones de herencia asociados con el género (Falls, 1952; Bird, 1975). Aunque las formas de RP ligadas al sexo son menos frecuentes que las de adRP y arRP (un 515% de los casos), son consideradas las más severas en cuanto a inicio y progresión (Capeans et al., 1998). La progresión de la disfunción de los fotorreceptores es menor en la adRP, seguida por la arRP, siendo la más rápida en XlRP (Baumgartner, 2000; Tzekov et al., 2003). Los fenotipos XlRP son más frecuentes en hombres que en mujeres, puesto que las mujeres portadoras pueden minimizar los efectos negativos de los genes defectivos gracias al proceso de inactivación al azar (lyonización) del cromosoma X. La diferente inactivación del cromosoma X en estas mujeres origina un mosaico somático constituido por células con el cromosoma X mutado inactivado y células con el cromosoma X normal inactivado (Rivolta et al., 2002b). Estas mujeres pueden presentar características del fundus y/o anomalías electrorretinográficas que indican una pérdida moderada de fotorreceptores. Sin embargo, algunas de estas portadoras pueden mostrar un cuadro clínico de degeneración retinal que, probablemente, se deba a la desfavorable inactivación del cromosoma X normal en la mayoría de las células de la retina. Aunque los síntomas pueden ser severos, lo normal es que las portadoras padezcan una patología menos agresiva que la de los hombres afectados. 4.- Herencia Mitocondrial. Otra forma de herencia ligada al sexo de la RP, totalmente distinta a la anterior en cuanto a sus determinantes genéticos, es la asociada con la herencia de línea materna. En un pedigree irlandés, cuyos individuos afectados presentaban RP y pérdida auditiva progresiva (síntomas similares a síndrome de Usher tipo III), se encontró que el patrón de cosegregación podía ser compatible con herencia autosómica dominante, ligada al sexo o matrilineal (Mansergh et al., 1999). La búsqueda del posible gen causal mediante análisis de ligamiento consiguió excluir más del 90% del genoma nuclear. La marcada variabilidad en los síntomas, junto con la observación de anomalías musculares y cardíacas subclínicas, potenciaron la secuenciación del DNA mitocondrial (mtDNA) de los individuos de este pedigree en busca de posibles alteraciones. La secuenciación reveló la presencia de una transversión heteroplásmica C>A en la posición 12258 del mtDNA de los individuos afectados, no presente en ninguno de los 270 individuos sanos utilizados INTRODUCCIÓN 15 como controles. Los datos obtenidos avalaban la evidencia de que la mutación C12258A del mtDNA era responsable del fenotipo de la RP en este pedigree y que la variabilidad de los síntomas se debía al grado de heteroplasmía. Aunque no se conoce de forma precisa el mecanismo molecular causante de este fenotipo, se intuye que debe estar relacionado con la reducción de la producción de ATP por la mitocondria. Esto originaría graves consecuencias en los tejidos con gran demanda de ATP, tales como el muscular o el neural. 5.- Herencia digénica de la RP. En aquellos casos en los que una pareja de individuos con un mismo fenotipo patológico recesivo da lugar a una nueva generación de individuos normales se confirma que los progenitores difieren en los genes que causan ese fenotipo (Rivolta et al., 2002b). Todos los individuos de la nueva generación serán dobles heterozigotos obligados y portarán un alelo salvaje y otro mutado de cada uno de los dos loci. En tal caso, de estos dos loci se dice que son complementarios o que exhiben complementación no alélica. Si, por el contrario, los dobles heterozigotos de una generación fuesen afectos, se consideraría que estos dos loci se encuentran en un estado de no complementación no alélica. La primera prueba de herencia digénica dialélica en humanos fue aportada por los estudios de los genes RDS y ROM1 en unas pocas familias con RP. Mientras que todos los individuos afectados de estas familias eran dobles heterozigotos y portaban sendas mutaciones en ROM1 y en RDS (Goldberg y Molday, 1996; Dryja et al., 1997; Loewen et al., 2001), los que solamente portaban una de las dos mutaciones eran sanos. Ratones con mutaciones en Rds y Rom1 similares a las encontradas en estas familias presentaban fenotipos parecidos (Kedzierski et al., 2001). La mutación en RDS encontrada en todas estas familias con RP digénica, afecta a un aminoácido esencial para el ensamblaje del complejo RDS/ROM1 (Goldberg y Molday, 1996; Loewen et al., 2001). Los mutantes pueden formar dímeros RDS/RDS, pero no pueden formar el complejo tetramérico con los dímeros de ROM1/ROM1. El gran descenso de la cantidad de tetrámeros funcionales sería responsable de la patología en los dobles heterozigotos. En los heterozigotos sencillos, las mutaciones de RDS o ROM1 no impedirían la formación de las cantidades de tetrámero necesarias para mantener la estructura y viabilidad del fotorreceptor. 6.- Disomías uniparentales. El inusual modo de herencia mediante el cual un individuo puede recibir los dos cromosomas de un par cromosómico de un único progenitor se denomina disomía uniparental (Rivolta et al., 2002b). Si el par cromosómico heredado es el mismo que el del progenitor donante, se habla de heterodisomía uniparental. En cambio, si el par cromosómico uniparental heredado se origina por la duplicación de un único cromosoma del progenitor, se dice que existe isodisomía uniparental y el individuo será homoalélico para todos los loci de ese cromosoma. No obstante, los cromosomas heterodisómicos uniparentales pueden poseer regiones isodisómicas debido a los eventos de recombinación meiótica sufridos tras su anormal segregación. La isodisomía uniparental puede revelar la presencia de alelos patológicos recesivos en el cromosoma duplicado, puesto que la homozigosidad de dichos alelos originará la aparición de fenotipos patológicos. A lo INTRODUCCIÓN 16 largo de la literatura se pueden encontrar artículos que relacionan la isodisomía uniparental con RP (Thompson et al., 2002; Rivolta et al., 2002a). Sin embargo, los casos de RP asociados a isodisomía uniparental son tan escasos que es difícil conocer con certeza la frecuencia de esta combinación. I.3.1.2. RP sindrómica RP es una patología que generalmente se encuentra confinada al ojo, ocasionando graves daños. Sin embargo, el 20-30% de los afectados presentan, además de la RP, una enfermedad no ocular asociada, dando lugar a más de 30 síndromes diferentes (Hartong et al., 2006). La forma más frecuente de RP sindrómica es el síndrome de Usher (10-20% de los casos de RP recesiva), en el cual la RP se asocia con deterioro auditivo. Mutaciones en al menos 11 genes causan la aparición de uno de los tres tipos conocidos de síndrome de Usher. El tipo I cursa con pérdida auditiva profunda presente desde el nacimiento y ataxia vestibular. El tipo II presenta moderada pérdida auditiva no progresiva. Y el tipo III, se manifiesta con audición normal durante la juventud, que puede ir empeorando gradualmente a medida que el individuo envejece (Lorenz y Preising, 2004; Reiners et al., 2006). Dependiendo de la mutación, varios genes del síndrome de Usher pueden causar RP sin pérdida auditiva (Rivolta et al., 2002a; Bernal et al., 2003a; Aller et al., 2004) o sordera profunda sin RP (Liu et al., 1997; Weil et al., 1997; Bork et al., 2001; Astuto et al., 2002). Otra forma importante de RP sindrómica es el síndrome de Bardet-Biedl (5-6% de los casos de RP). En este síndrome la RP puede asociarse de modo variable con obesidad, deterioro cognitivo, polidactilia, hipogenitalismo y enfermedad renal (Beales et al., 1999). Menos frecuentes son los síndromes de Senior Loken –RP asociada a nefronoftisis– o Alport, sordera y nefritis progresiva asociadas a un punteado amarillento alrededor de la mácula, más que con una auténtica RP (Hamel, 2003). I.3.2. Aspectos clínicos de la RP El fenotipo de la RP se caracteriza por afectación bilateral, pérdida de visión periférica, predominancia de la disfunción de los bastones y progresión de la degeneración de ambos tipos de fotorreceptores (Kanski, 2003). La clínica de esta patología es variable e incluye síntomas de ceguera nocturna (nictalopía) con elevados umbrales de adaptación a la oscuridad, electrorretinografía anormal de la ondas a y b, dificultad en la movilidad secundaria a la constricción del campo visual, pigmentación anormal de la retina, inclusión de espículas óseas en la región medial–periférica de la retina, deficiencia en la visión de la gama de colores del azul al amarillo (tritanopía), disminución de la sensibilidad al contraste, estrechamiento de las arterias, palidez del nervio óptico, predisposición a la miopía, catarata subcapsular posterior y cambios vítreos (Pagon, 1988; Kanski, 2003; Omar et al., 2005; Hartong et al., 2006). INTRODUCCIÓN 17 La sintomatología suele comenzar con dificultad en la adaptación a la oscuridad y ceguera nocturna en la adolescencia, y pérdida del campo visual medial-periférico en la edad adulta temprana (Hartong et al., 2006). Así como va progresando la patología se va agravando la pérdida de la visión periférica y los individuos afectados pueden desarrollar la visión en túnel, típica de la RP. Alcanzados los 40 años la constricción de los campos visuales es tan grande y provoca tales dificultades para la visión, que estos individuos son considerados como prácticamente ciegos. Finalmente, en torno a los 60 años de edad, pierden la visión central, con lo cual la capacidad para recibir estímulos visuales se reduce a la mera percepción de luz. La pérdida progresiva de bastones acarrea importantes consecuencias funcionales, como la ceguera nocturna o la constricción del campo visual, pero por si sola no causa un gran detrimento de la agudeza visual (Ecklund, 2000). Es más, la característica ceguera de los estados avanzados de RP se debe a la degeneración postergada de los conos (Hackam et al., 2004). No se conocen los mecanismos que inducen la muerte de los conos tras la muerte de los bastones, pero es probable que la viabilidad de estas células este mediada por factores de supervivencia (Huang et al., 1993; Lavail et al., 1998; Mohand-Said et al., 1998). Generalmente, el inicio de la RP se relaciona con la edad a la cual aparece la sintomatología visual. Algunos pacientes experimentan la pérdida de la visión en la infancia, mientras que otros permanecen asintomáticos hasta bien entrada la mediana edad. La diferente valoración que refieren los afectados sobre los mismos síntomas provoca que la edad de comienzo sea considerada una medida muy imprecisa de la severidad de la patología y aporte escasa o nula información acerca del inicio de la degeneración de los fotorreceptores (Hartong et al., 2006). Por lo tanto, el grado de afectación y la velocidad de progresión de la patología serán determinados a través de exámenes clínicos y pruebas que detallen medidas cuantitativas de la función de la retina (electrorretinogramas, amplitud de los campos visuales, etc…). Esta información permitirá al clínico reconocer el estadío de la RP en que se encuentra cada individuo y estimar la prognosis de la patología de forma personalizada. En la patogénesis de la RP se pueden distinguir tres fases (Baumgartner, 2000): estadío 1, fase de inducción caracterizada por el descenso de la amplitud del trazado de los electrorretinogramas, aunque no existen grandes alteraciones del campo visual; estadío 2, pérdida de la visión periférica como resultado de los procesos apoptóticos de los fotorreceptores; y estadío 3, pérdida potencial de los conos (responsables de la visión central) a pesar de no poseer ningún defecto genético. I.3.3. Hallazgos anatomopatológicos en la RP A nivel histológico, los cambios más destacables que ocasiona la RP se encuentran en la retina neural –donde se constata la ausencia de bastones y conos– y en el RPE, ausente o desorganizado en algunas áreas (Merin y Auerbach, 1976). Además del adelgazamiento de la retina, causado por la pérdida de fotorreceptores, existe un edema que provoca su engrosamiento. Estas dos alteraciones INTRODUCCIÓN 18 morfológicas suelen ir acompañadas de la pérdida de agudeza visual (Sandberg et al., 2005). Sin embargo, no existen evidencias de infiltrados celulares inflamatorios (Voaden, 1991). La capa nuclear externa de la retina se encuentra severamente atenuada en los individuos afectados de RP (Humayun et al., 1999). La capa nuclear interna y la capa de células ganglionares están considerablemente bien conservadas, pero muchas de esas células sufrirán una degeneración en estadíos más tardíos de la enfermedad (Hartong et al., 2006). La forma típica de RP se caracteriza por la degeneración pigmentaria bilateral de la retina, la difuminación de los vasos sanguíneos retinales y palidez del disco óptico (Armstrong y Smith, 1999). La degeneración de la retina conduce a un escotoma anular, que se irá extendiendo periférica y centralmente, hasta dejar un pequeño campo visual central. En las formas atípicas de RP, que a menudo presentan un inicio más tardío, existe menor alteración pigmentaria y mayor variabilidad en los defectos del campo visual, presentando escotomas sectoriales además de los centrales. De forma más detallada, los cambios histológicos que se producen en las retinas afectadas de RP son los siguientes: 1.- Bastones. La muerte de los bastones comienza en la retina medial-periférica (ecuatorial) y progresa hacia la mácula y la retina más periférica, no afectando a los fotorreceptores más periféricos hasta bien avanzada la patología (Milam et al., 1998). En la perifería medial temporal existen zonas con fotorreceptores no degenerados, además de fotorreceptores que se reestructuran en rosetas (Tulvatana et al., 1999). Estas rosetas están compuestas mayoritariamente por bastones y unos pocos segmentos internos similares a los de los conos, dispuestos radialmente en torno a un lumen central vacío. 2.- Segmentos externos. En todas las formas de RP, el primer cambio histológico que sufren los bastones es el acortamiento de sus segmentos externos. Generalmente, esta alteración afecta antes al segmento externo de los bastones que al de los conos (Armstrong y Smith, 1999). Dicho cambio morfológico, relacionado con la disminución de función de los bastones, indica un deterioro del proceso de renovación del segmento externo (Milam et al., 1998). Tras la modificación del segmento externo se producirá la degeneración del interno y la despigmentación gradual del RPE (Armstrong y Smith, 1999). 3.- Cilio conector. El defecto estructural o funcional del cilio conector causa el descenso del transporte de proteínas desde el segmento interno hacia el externo, resultando en el acortamiento y disfunción del segmento externo (Milam et al., 1998). 4.- Neuritas de los bastones. En aquellas regiones periféricas de las retinas con RP donde los fotorreceptores han empezado a morirse se observa que los bastones desarrollan largos procesos semejantes a los axones (Li et al., 1995; Milam et al., 1996). Estas neuritas contienen rodopsina en sus membranas de superficie y se extienden dentro de la retina interna, evitando las dendritas de las células horizontales y bipolares (objetivos normales de los axones de los bastones en la capa plexiforme externa) para asociarse con los procesos hipertrofiados de las células de Müller. En los INTRODUCCIÓN 19 conos no parece existir un desarrollo de neuritas tan grande como el que presentan los bastones. No obstante, en las retinas con RP, las células amacrinas y las horizontales también desarrollan neuritas (Fariss et al., 2000). Estos cambios en las neuronas de la retina pueden contribuir a las anomalías electrorretinográficas y la progresiva disminución de la visión. 5.- Conos. La muerte de los bastones en las retinas de RP suele provocar cambios en los conos circundantes, tales como el acortamiento del segmento externo, la densificación citoplasmática, la elongación axonal y, por último, la muerte del fotorreceptor (Milam et al., 1998; John et al., 2000). Cuando se produce la muerte de todos los bastones y la mayoría de los conos, la mácula continúa manteniendo una monocapa de somas de conos con segmentos muy cortos o ausentes. Los conos también muestran segmentos externos más cortos en aquellas zonas de la perifería donde los bastones han comenzado a degenerarse. 6.- Espacio interfotorreceptor. Tras la muerte de los fotorreceptores, el espacio interfotorreceptor desaparece debido a la migración de las células del RPE hacia la retina interna y la extensión de los hipertrofiados procesos de las células de Müller hacia la región de la membrana de Bruch (Milam et al., 1998). Durante los primeros estadíos de la RP, el volumen del espacio interfotorreceptor disminuye a medida que los segmentos externos de los fotorreceptores van acortándose. La muerte de los bastones también puede provocar cambios en la composición de la matriz interfotorreceptora, los cuales pueden estar asociados con la degeneración de los conos. 7.- RPE, membrana de Bruch y coriocapilares. Después de la muerte de todos los fotorreceptores, las células del RPE se separan de la membrana de Bruch y migran hacia las regiones perivasculares de la retina interna, empleando a las fibras de Müller como soporte para su expansión. (Merin y Auerbach, 1976; Milam et al., 1998). Los pigmentos liberados del RPE serán fagocitados por macrófagos, los cuales también migrarán hacia las capas internas de la retina (Armstrong y Smith, 1999). Los macrófagos y las células del RPE liberarán sus pigmentos en las zonas próximas a los vasos sanguíneos, originando la característica apariencia de espículas óseas típica de la RP. La migración de las células del RPE hacia la retina interna provoca notables alteraciones en los vasos sanguíneos de la retina (Milam et al., 1998). El depósito de matriz extracelular entre las células del RPE y las células endoteliales de la delgada pared de las vénulas y capilares puede llegar a ocluir la luz de los vasos. El engrosamiento de las paredes de los vasos y la oclusión de su luz se correlacionan con la esclerosis y la atrofia de la vasculatura retinal, particulares características funduscópicas de la RP. Los gruesos depósitos perivasculares pueden comprometer el flujo de nutrientes desde el vaso sanguíneo hasta las neuronas de la retina interna (Milam et al., 1998) y provocar un creciente deterioro de la oxigenación retinal que conduzca a la muerte de los fotorreceptores (Baumgartner, 2000). Otra alteración importante de los vasos retinales inducida por la RP es la fenestración de las células del endotelio vascular próximas a las células del RPE, permitiendo el filtrado de proteínas séricas hacia los espacios perivasculares (Milam et al., 1998). INTRODUCCIÓN 26 embargo, las ratios de formación y degradación de la Metarodopsina II derivada de la conopsina son 20 veces superiores a las de la derivada de la rodopsina. Esto sugiere que la conopsina comienza a activar proteína G inmediatamente después de la fotorrecepción, mientras que la rodopsina lo hace cuando la Metarodopsina II alcanza su vida media. De hecho, los conos presentan una mayor fotorrespuesta que los bastones, aunque estos últimos son mucho más sensibles a la luz (Shichida y Yamashita, 2003). Los pigmentos visuales pertenecen a un grupo de proteínas transmembrana denominado receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Los GPCRs interaccionan con la región C-terminal de la proteína G, una proteína periférica, a través de los loops citoplasmáticos de los dominios transmembrana de la apoproteína. Sin embargo, como el sitio de unión de la proteína G se encuentra cerca de la región de loops extracelulares, los segmentos transmembrana deberán sufrir varios reordenamientos para lograr desplazar dichos sitios de interacción hacia los dominios citoplasmáticos. La rotación y translación de los extremos citoplasmáticos de los segmentos α-hélice III y VI de la rodopsina bovina propagan los cambios conformacionales a través de la membrana hacia los loops citoplasmáticos (Figura 9). La rodopsina bovina interacciona con la transducina a través del segundo (III-IV), tercero (V-VI) y cuarto loop citoplasmáticos, mientras que el extremo C-terminal de la subunidad α de la transducina resulta ser uno de los sitios de interacción con la rodopsina. Tras la fotoisomerización del cromóforo y el consiguiente reordenamiento de los segmentos transmembrana III y IV, el tercer loop citoplasmático de la rodopsina queda expuesto para establecer una interacción con la región C-terminal de la subunidad α de la transducina. Esta interacción es uno de los mecanismos que garantizan el acoplamiento específico entre la rodopsina bovina y la transducina. (Spudich et al., 2000; Shichida y Yamashita, 2003). Muchos GPCRs –entre los que se encuentran varios receptores visuales y hormonales– necesitan formar hetero u homoligómeros para poder desarrollar sus funciones. Existen evidencias que indican que la rodopsina se organiza en dímeros (Fotiadis et al., 2003; Fotiadis et al., 2004) que a su vez se reorganizan en estructuras oligoméricas de mayor orden, agrupando de 10 a 30 dímeros (Liang et al., 2003). Sin embargo, se ha comprobado que la rodopsina monomérica es completamente funcional, por lo que es considerada como la unidad funcional mínima responsable de la activación de la proteína G. Esto sugiere que la oligomerización de los GPCRs no es un proceso esencial para la activación de la proteína G, aunque podría contribuir de forma importante en procesos específicos del fotorreceptor tales como el ajuste de la respuesta a la luz, la estabilización y la desensibilización (Whorton et al., 2008). La organización de la rodopsina en oligómeros no facilitaría su difusión Figura 8. Fotoisomerización del retinal a través de uno de los dobles enlaces de la cadena poliena. Estructura de la porción retinal de las proteínas retinilidenas y la fotoisomerización catalizada por las apoproteínas. Adaptada de (Spudich et al., 2000). N H N H 11-cis retinal todo-trans retinal hν INTRODUCCIÓN 27 lateral, lo cual entorpecería el contacto con la transducina y retrasaría la fotorrespuesta. La carencia de movilidad de los oligómeros de rodopsina estaría compensada con la elevada constante de difusión de la transducina y su presencia en alta concentración en los fotorreceptores, garantizando un tiempo de respuesta adecuado para cada estímulo visual (Liang et al., 2003). I.4.1.1.2. Activación de la transducina Las proteínas G heterotriméricas son los mediadores moleculares que relacionan a los GPCRs con sus respectivas proteínas efectoras (enzimas o canales iónicos) constituyendo la segunda de las tres etapas de la cascada de señalización (Arshavsky et al., 2002). La primera etapa consiste en la activación de los GPCRs mediante la unión de una molécula agonista. En los pigmentos visuales el 11-cis retinal actúa como un potente antagonista, pero tras su isomerización a todo-trans retinal, se comporta como un agonista y activa los GPCRs. En la segunda etapa, los GPCRs activados activan a múltiples moléculas de proteína G, catalizando el intercambio de Guanosina 5´-trifosfato (GTP) a Guanosina difosfato (GDP) en la proteína G. Y en la tercera etapa de la cascada de señalización, la proteína G activada se une a su efector, el cual ejercerá una acción potenciadora o inhibidora sobre determinados procesos. La proteína G transducina es un heterotrímero constituido por una subunidad α, una β y una γ. En la oscuridad, el heterotrímero se encuentra fuertemente asociado a la membrana del disco a través de dos modificaciones lipídicas: un grupo acilo en el extremo N-terminal de la subunidad α (miristoilación) y un grupo farnesilo en el extremo C-terminal de la subunidad γ (isoprenilación) Figura 9. Cambios conformacionales de la rodopsina bovina debidos a la fotoisomerización del cromóforo. La fotoisomerización del cromóforo induce la separación de los segmentos transmembrana III y VI (visto desde el lado citoplasmático). (A) Vista anterior de los cambios inducidos por fotoisomerización del cromóforo en la molécula de rodopsina. (B) Vista superior del mismo proceso. Tomada de (Shichida y Yamashita, 2003). A B INTRODUCCIÓN 28 (Lobanova et al., 2007). La transducina de los bastones muestra sutiles diferencias con respecto a la de los conos. La subunidad α de la transducina humana presenta dos isoformas: Gt1α o Gtrα en los bastones y Gt2α o Gtcα en los tres tipos de conos (Hisatomi y Tokunaga, 2002). La Metarodopsina II (R*) activa a la transducina al inducir el cambio de GDP por GTP en la subunidad α (Gαt). Una simple R* es capaz de activar varias moléculas de transducina durante el tiempo que permanece activada (en bovinos, un promedio de 220 moléculas s-1). Tras su activación, la transducina se libera de la R* y se produce la disociación de la Gαt-GTP activada (G*) y el Gβγt. Inmediatamente después, la G* activa a su enzima efector, la fosfodiesterasa de cGMP, cuya función consiste en hidrolizar el cGMP a 5´-GMP (tasa de recambio >4000 s-1). La disociación del heterotrímero causa que las subunidades G* y Gβγ queden unidas a la membrana de los discos por una única modificación lipídica. En este momento, la afinidad que presentan las subunidades G* y Gβγ disociadas por la membrana de los discos, es inferior a la que poseen cuando están formando el heterotrímero. Esta disminución de afinidad facilita la liberación de las subunidades G* y Gβγ de la membrana y su posterior difusión por el citoplasma (Lobanova et al., 2007). La alta tasa de hidrólisis de GTP que presenta la G* facilita la rápida reconstitución del heterotrímero, por lo que las subunidades de la transducina no permanecen separadas durante mucho tiempo. La unión de la proteína fosducina con la Gβγ retrasa la regeneración del heterotrímero al prevenir su asociación con la G*, aún después de que la hidrólisis de GTP haya tenido lugar (Figura 10). Además, la fosducina potencia la movilidad de la Gβγ volviéndola más soluble al enmascarar su grupo farnesilo y reducir las interacciones electrostáticas con los fosfolípidos de membrana cargados negativamente (Calvert et al., 2006). Ante la presencia de luz, la fosducina sufre una defosforilación en los segmentos externos que la habilita para poder unirse a la Gβγ. Por el contrario, su fosforilación en la oscuridad por una proteín kinasa dependiente de cAMP (PKA) liberaría a la Gβγ restaurando la sensibilidad a la luz que presentan los fotorreceptores. Aparte de las funciones anteriormente mencionadas, la fosducina está implicada en la protección contra la proteolisis de la Gβγ por la vía ubiquitínproteosoma, en la regulación de la transcripción o en la regulación de la actividad de otras proteínas G distintas a la transducina (Sokolov et al., 2004). Figura 10. Disociación de las subunidades de la transducina e importancia de la fosducina. La activación de la transducina por una R* induce la disociación de sus subunidades. En ese estado, las subunidades pueden escaparse de la membrana de los discos. La unión de la fosducina con la Gβγ previene la rápida reconstitución del heterotrímero y potencia la movilidad de las subunidades de la transducina por el citoplasma. Tomada de (Calvert et al., 2006). INTRODUCCIÓN 29 I.4.1.1.3. Activación de la fosfodiesterasa La fosfodiesterasa de cGMP (PDE; o también conocida como PDE6) es un heterotetrámero constituido por dos subunidades catalíticas similares o idénticas (α y β en bastones; α y α en conos) y dos subunidades reguladoras γ idénticas (PDEγ) (Cote et al., 1994; Arshavsky et al., 2002). Las subunidades α y β contienen un sitio catalítico y dos sitios de unión no catalíticos para cGMP (Cote et al., 1994). Por su parte, las subunidades PDEγ inhiben la actividad de la PDE, manteniéndola en niveles muy bajos en los estadíos de no activación. La unión de una G* a una subunidad PDEγ descarta el efecto inhibidor que esta última ejerce sobre el sitio catalítico de las subunidades α o β, produciéndose la activación de la PDE. El mecanismo de activación de la PDE por la G* depende del estado de ocupación de los sitios no catalíticos de las subunidades α y β. Cuando estos sitios están ocupados, la G* forma un complejo con el holoenzima αβγ2 provocando el desplazamiento de las PDEγ de sus sitios de inhibición. Esto permite que el dímero αβ comience a ejecutar su actividad catalítica, a pesar de no haberse producido la total disociación de las PDEγ. En ese momento, la afinidad de los sitios no catalíticos del dímero αβ hacia el cGMP disminuye levemente, causando la disociación parcial de la molécula de cGMP. La activación de la PDE causa la total separación de las PDEγ del dímero αβ, originando una enorme reducción de la afinidad de los sitios no catalíticos hacia el cGMP que conlleva a la rápida y completa disociación del cGMP. Sin embargo, el dímero αβ posee la misma actividad catalítica que el estado anterior (Figura 11). Según las simulaciones efectuadas por Reingruber et al., utilizando datos obtenidos en conos de carpa, se estima que la cascada de señalización originada por un solo fotopigmento excitado de los conos no podría activar a más de 10 moléculas de PDE (Reingruber y Holcman, 2008). Según esta cifra, los conos precisan absorber un elevado número de fotones de forma casi sincrónica para lograr activar una cantidad mínima de moléculas de PDE; las suficientes para generar una señal que supere a la establecida como ruido de fondo por la activación espontánea de la PDE. I.4.1.1.4. Cierre de los canales asociados a cGMP La reducción de la concentración citoplasmática de cGMP causada tras la activación de la PDE6, provoca el cierre de los canales catiónicos regulados por cGMP (CNG; Cyclic NucleotideFigura 11. Regulación recíproca de los sitios de unión no catalíticos de cGMP y PDEγ sobre la actividad catalítica de la PDE. (A) En la oscuridad, las PDEγ inhiben la actividad del sitio catalítico (muesca en forma de V) de las subunidades α y β. cG, cGMP unido a los sitios no catalíticos. (B) La G* (o Gαt-GTP) desplaza parcialmente las PDEγ, evitando la inhibición de la catálisis y disminuyendo la afinidad hacia el cGMP de los sitios no catalíticos. (C) La completa disociación de las PDEγ determina una gran reducción de la afinidad hacia el cGMP en los sitios no catalíticos o reguladores. Tomada de (Cote et al., 1994). INTRODUCCIÓN 30 Gated channel) de la membrana plasmática (Arshavsky et al., 2002). La clausura de los CNGs ocasiona la reducción de la corriente interna –sostenida en la oscuridad por los iones de Na+ y Ca2+–, causando la hiperpolarización de la membrana y un descenso de la liberación del transmisor sináptico (glutamato) en el terminal del fotorreceptor. Los CNGs de los bastones de bovinos forman un tetrámero constituido por dos subunidades α, con una masa molecular de 63 kDa cada una, y dos subunidades β, con 240 kDa cada una (Cook et al., 1987; Pittler et al., 1992; Chen et al., 1994; Higgins et al., 2002), aunque también es posible encontrar una estequiometría 3α:1β (Zhong et al., 2002). La subunidad α (o CNG1) forma un canal sensible a cGMP, mientras que la β tercia la modulación entre el Ca2+ y la Calmodulina (CAM) (Figura 12). Los canales de los conos de los bovinos presentan otro tipo de subunidad α, la CNG3, y al contrario de lo que ocurre en los de los bastones, no están modulados por Ca2+-Calmodulina (Hisatomi y Tokunaga, 2002). Sin embargo, la elevada permeabilidad que presentan los canales de los conos frente al Ca2+, permite variaciones (inducidas por la luz) en la concentración plasmática de este ión más rápidas y con mayor duración que en los bastones. Las proteínas que constituyen los CNGs son miembros de la superfamilia de proteínas de canales iónicos regulados por voltaje, y dentro de esta superfamilia, presentan una alta homología con los canales de K+ (Kramer y Molokanova, 2001). Cada subunidad del CNG posee un extremo Nterminal citoplasmático, seis segmentos transmembrana y un extremo C-terminal también citoplasmático. Además de muchas estructuras similares a las de la subunidad α, la subunidad β contiene un sitio de unión a Calmodulina y una extensión del extremo N-terminal denominada parte GARP (Glutamic Acid-Rich Protein), pero no posee residuo de glutamato de la región del poro, ni sitio de glicosilación ligado a asparragina (Molday, 1998). Las dos subunidades α y las dos subunidades β se ensamblan en un complejo tetramérico en el cual las subunidades idénticas suelen situarse una enfrente de la otra, aunque es muy posible que in vivo también se puedan encontrar adyacentes. Las regiones del poro que unen a los segmentos S5 y S6 cerca de la superficie extracelular Figura 12. (A) Estructura tridimensional de un canal regulado por cGMP. Las cuatro subunidades que constituyen el canal se disponen para formar un poro. Cada subunidad posee un lugar de unión a cGMP. (B) Estructura de la subunidad α. El cuarto segmento transmembrana posee varios aminoácidos cuyas cargas positivas actúan como sensor de voltaje para la regulación del canal, relativamente insensible en los canales regulados por cGMP. El loop situado entre el quinto y el sexto segmento transmembrana, conocido como dominio P, forma parte del poro y determina la conductancia y la selectividad iónica del canal. El residuo de histidina (H420) potencia la regulación del canal por Ni2+, mientras que el de tirosina (Y498) resulta esencial para la modulación del canal por fosforilación. El sitio de unión del cGMP se localiza en la región C-terminal de cada subunidad. Tomada de (Kramer y Molokanova, 2001). INTRODUCCIÓN 31 de la membrana, se extienden hacia el centro de la cavidad, en donde pueden funcionar como filtro selectivo de iones. El residuo de glutamato en la región del poro de la subunidad α es responsable del bloqueo externo de cationes divalentes que muestra el canal. La respuesta de los CNGs ante la variación de la concentración plasmática de cGMP es modulada por varios sistemas intracelulares, alterando la sensibilidad de los canales hacia el cGMP (Kramer y Molokanova, 2001). Los CNGs poseen dominios específicos que actúan como receptores para cada una de estas señales intracelulares: Ca2+-Calmodulina, óxido nítrico, metales de transición, metabolitos fosfolipídicos, cambios en el estado de fosforilación e interacciones con proteínas de membrana, como las proteín tirosín kinasas. La Ca2+-Calmodulina se une a la subunidad β de los canales de los bastones alterando la interacción entre los extremos N y C-terminal de las subunidades, lo que provoca una reducción de la sensibilidad del canal hacia el cGMP. El objetivo principal del óxido nítrico es la guanilato ciclasa, la cual activa los canales mediante la síntesis de cGMP. Los metales de transición, como el Ni2+ y el Zn2+, en concentraciones suficientemente altas, pueden inducir un bloqueo dependiente de voltaje al unirse a sitios de la vía de permeabilización del canal. Los metabolitos fosfolipídicos, como el diacilglicerol (DAG), alteran la apertura del canal al unirse a las regiones hidrofóbicas de las proteínas del canal y/o deformar la bicapa de las zonas próximas a los canales. Las proteín serina/treonina fosfatasas defosforilan el canal y aumentan su sensibilidad al cGMP, mientras que las proteín serina/treonina kinasas lo fosforilan (en presencia de ATP) y lo vuelven menos sensible a cGMP, aumentando las probabilidades de estar cerrado. Las proteín tirosín kinasas (PTK) y proteín tirosín fosfatasas (PTP), compiten por el mismo sitio del canal (Molokanova et al., 1997; Molokanova et al., 2000; Kramer y Molokanova, 2001; Molokanova y Kramer, 2001). Cuando se une la PTP se produce la apertura del canal, mientras que la unión de la PTK provoca su cierre (Figura 13). Figura 13. Modulación de la actividad de los canales reguladores de cGMP inducida por la proteín tirosín kinasa (PTK) y la proteín tirosín fosfatasa (PTP). En los dibujos superiores se representa un canal cerrado y en los inferiores un canal abierto. A su vez, los de la izquierda están fosforilados y los de la derecha defosforilados. Los óvalos grises representan moléculas de cGMP. El grosor de la flecha indica la estructura más favorable para la regulación del canal. Tomada de (Kramer y Molokanova, 2001). INTRODUCCIÓN 32 I.4.1.2. Fase de inactivación de la fototransducción Como sucede en otras vías de señalización mediadas por la proteína G, la finalización de la cascada de fototransducción requiere la inactivación de todos los intermediarios activados (R*, G* y PDE*) y la restauración de las condiciones basales de los fotorreceptores en la oscuridad. El reestablecimiento del estado basal se consigue mediante la fosforilación de la rodopsina por una rodopsín kinasa seguida de la unión de la arrestina a la rodopsina fosforilada, la hidrólisis del GTP de la transducina por su actividad guanosín trifosfatasa (GTPasa) intrínseca, la restauración de la inhibición de la PDE por sus subunidades γ, y la elevación de los niveles de cGMP por una guanilato ciclasa. I.4.1.2.1. Inactivación de la rodopsina La R* se vuelve inactiva tras ser fosforilada por una rodopsín kinasa (GRK1) y unirse a la arrestina (Palczewski et al., 1989). GRK1 se ancla a la membrana de los discos mediante su extremo C-terminal farnesilado y establece un complejo con una proteína de unión al Ca2+, la recoverina (REC) (Figura 14). En condiciones basales, este complejo inhibe la fosforilación de la rodopsina sin afectar a la actividad catalítica de la kinasa (Higgins et al., 2006). Sin embargo, el descenso de la concentración citoplasmática de Ca2+ causa su disociación e incrementa la tasa de fosforilación de la rodopsina (Calvert et al., 1998; Hisatomi y Tokunaga, 2002; Calvert et al., 2006). Después de ser fosforilada, la R* se une a la arrestina. Cada monómero de arrestina posee un área cóncava en el dominio N-terminal y otra en el C-terminal. Ambas concavidades son responsables de la característica estructura en doble cáliz de la arrestina y favorecen la interacción con un dímero de rodopsina (Hirsch et al., 1999; Skegro et al., 2007). La disposición de las cargas positivas en la superficie del dímero de rodopsina se ajusta perfectamente a la de las cargas negativas que posee la arrestina, facilitando la unión de ambas moléculas (Liang et al., 2003) (Figura 15). Además, esta unión está mediada por la fosforilación de los seis o siete lugares de fosforilación del extremo C-terminal de la rodopsina, altamente conservados en diferentes especies de mamíferos. De hecho, el número de fosfatos incorporados al pigmento visual determina la interacción rodopsina-arrestina. La adición de un solo fosfato no facilita la interacción con la arrestina, dos fosfatos inducen una interacción con alta afinidad y la incorporación de tres fosfatos promueve la firme sujeción de la arrestina, permitiéndole Figura 14. Inactivación de la rodopsina. Las reacciones responsables de la inactivación de la rodopsina fotoexcitada incluyen la fosforilación de R* por una rodopsín kinasa (RK), seguida de una unión a la arrestina (Arr). La actividad de la RK es regulada por una proteína de unión al Ca2+, la recoverina (Rec), la cual se une a la RK inhibiéndola en presencia de altos niveles de Ca2+. Tomada de (Calvert et al., 2006). Ca 2 + INTRODUCCIÓN 33 Figura 15. Complejo formado por un dímero de rodopsina y un monómero de arrestina. La estructura bipartita de la arrestina (morado) puede acomodar dos moléculas de rodopsina (amarillo). Los sitios de fosforilación de la rodopsina están representados por esferas verdes. Tomada de (Park et al., 2004). ejercer su acción sobre la rodopsina. Mayores niveles de fosforilación no incrementan la estabilidad del complejo formado por la arrestina y la rodopsina activada, pero si consiguen potenciar la unión de la arrestina a la fosforodopsina o fosfoconopsina en la oscuridad. El complejo formado por la arrestina y la rodopsina activada hiperfosforilada libera el todo-trans retinal de una forma más rápida, sugiriendo que la arrestina interrumpe la señalización de la rodopsina inmediatamente después de la adición del tercer fosfato por la rodopsín kinasa (Vishnivetskiy et al., 2007). I.4.1.2.2. Inactivación de la transducina La hidrólisis del GTP unido a la G* (en GDP y Pi) provoca la inactivación de la G* (Figura 16). Dicha hidrólisis está regulada por la actividad GTPasa de la PDE, la cual depende del estado de ocupación de los sitios no catalíticos de las subunidades α y β (Cote et al., 1994; Arshavsky et al., 2002). Si estos sitios permanecen ocupados con cGMP la tasa de hidrólisis de GTP es relativamente baja y la G* puede permanecer activa durante un periodo de tiempo relativamente largo. Cuando la luz causa la disminución de la concentración plasmática de cGMP libre, seguido de una disociación del cGMP de los sitios no catalíticos, la tasa de hidrólisis del GTP se multiplica y la duración de la activación de la G* se reduce. Este mecanismo podría acelerar la recuperación de la fotorrespuesta (Calvert et al., 1998). El tiempo de actuación de la PDE* está controlado por la G*, puesto que la hidrólisis del GTP provoca su inactivación y consecuentemente la de la PDE (Arshavsky et al., 2002). INTRODUCCIÓN 34 I.4.1.2.3. Inactivación de la fosfodiesterasa La hidrólisis del GTP unido a la G* provoca la disociación de la G* y la PDE, tras lo cual el enzima efector recupera su estado inactivado (Arshavsky et al., 2002). La actividad GTPasa es un factor determinante tanto para la sensibilidad como para el tiempo de respuesta a la luz. De hecho, cuanto más baja es esta actividad, más tiempo permanecerá activada la PDE, mayor será la amplitud de la respuesta y mayor será la sensibilidad. Sin embargo, el aumento de sensibilidad conlleva una menor respuesta y un mayor tiempo de resolución del proceso de fototransducción. Por este motivo, los fotorreceptores emplean un mecanismo molecular para potenciar la relativamente baja actividad GTPasa en al menos dos órdenes de magnitud. Esto lo consiguen gracias a la PDEγ y a un complejo proteico constituido por una proteína reguladora de la señalización de la proteína G (RGS9) y la variante de splicing larga de la subunidad β de la proteína G tipo 5 (Gβ5L) (Tsang et al., 1998; Arshavsky et al., 2002). Aunque RGS9 se expresa en ambos tipos de fotorreceptores, se encuentra en mayor proporción en los conos (Hisatomi y Tokunaga, 2002). Esta circunstancia sería la responsable de la cinética de fotorrespuesta más rápida y la menor sensibilidad de los conos, en comparación con los bastones. La asociación entre RGS9 y la proteína transmembrana R9AP ocasiona el anclaje del complejo RGS9-Gβ5L a la membrana de los discos de los fotorreceptores, estabilizando el complejo regulador que acelera la tasa de hidrólisis de GTP (Keresztes et al., 2004) (Figura 17). Por un lado, la PDEγ contribuiría de forma directa a la hidrólisis de GTP, estabilizando el estado de transición de la G* (Arshavsky et al., 2002). Y por otro lado, incrementaría la afinidad entre la G* y el complejo RGS9-Gβ5L (el más eficiente activador de la GTPasa de una proteína G heterotrimérica, con una tasa de recambio de ~100 s-1 a 22ºC). Aunque ambas acciones de la PDEγ se manifiestan en la misma proporción y poseen igual importancia en la regulación de la actividad GTPasa, la última es Figura 16. Ciclo de activación e inactivación de la proteína G en la fototransducción. La interacción de la R* con la transducina provoca el intercambio del GDP unido a la subunidad α por GTP. La Gαt-GTP (G*) se disocia de las subunidades Gβt y Gγt, y activa a la PDE por la interacción con la subunidad inhibidora PDEγ. La hidrólisis del GTP provoca la inactivación de la G*. Tras ello la Gαt-GDP volverá a constituir el heterotrímero con Gβt y Gγt. Tomada de (Arshavsky et al., 2002). INTRODUCCIÓN 35 Figura 17. Formación del complejo GAP e inactivación de la PDE activada (E*). Modelo de fototransducción en donde la inactivación de E* está caracterizada por la disociación de la Gα unida a GDP. τε; constante de inactivación de la PDE activada (E*) en el tiempo. Tomada de (Pugh, 2006). suficientemente válida de por sí para concluir la fotorrespuesta en los fotorreceptores (incluso en los más rápidos, los conos humanos). Sin embargo, si la G* fuese inactivada por el complejo RGS9-Gβ5L sin necesidad de unirse a la PDE, podría darse la circunstancia de que algunas moléculas de G* fuesen inactivadas antes de activar a la PDE, provocando que la señal de amplificación fuese menor. Por lo tanto, la activación de la GTPasa dependiente de la asociación de G* y PDEγ garantiza la alta eficiencia de transmisión de señal entre G* y PDE, puesto que la hidrólisis de GTP no tendría lugar sin la unión de G* a PDE. I.4.1.2.4. Apertura de los canales regulados por cGMP Tras la inactivación de la R*, la G* y la PDE*, una guanilato ciclasa (GC) se encarga de aumentar la concentración citoplasmática del cGMP hasta alcanzar el valor del estado basal en la oscuridad, permitiendo la apertura de los canales (Arshavsky et al., 2002). Con ello se logra que el sistema vuelva a estar dispuesto para un nuevo proceso de señalización. La GC presenta una baja actividad ciclasa en la oscuridad. Sin embargo, cuando la respuesta a la luz disminuye la concentración intracelular de Ca2+, esta actividad es estimulada a través de unas proteínas de unión al Ca2+ denominadas proteínas activadoras de la guanilato ciclasa (GCAPs; GCAP2 se localiza en los bastones y GCAP3 en todos los subtipos de conos) (Hisatomi y Tokunaga, 2002). De esta forma, el incremento de la síntesis de cGMP consigue contrarrestar el elevado efecto hidrolítico de la PDE (Govardovskii et al., 2000). La GC se une directamente a los filamentos de actina que forman parte del citoesqueleto de los segmentos externos de los fotorreceptores y se distribuye por toda la extensión de las membranas de los discos (Hallett et al., 1996). En la retina humana pueden identificarse dos tipos de GC: GC1 y GC2 (Hisatomi y Tokunaga, 2002). GC1 se localiza principalmente en los segmentos externos de los conos y secundariamente en los de los bastones. Por su parte, GC2 se encuentra en igual cantidad en conos y en bastones. INTRODUCCIÓN 42 I.1.4.1.6. Arrestina Símbolo: SAG (OMIM: *181031) Proteína codificada: 16 exones, 406 a.a. Otros alias: S-ANTIGEN Función: Inhibición de la activación de la fosfodiesterasa Región cromosómica: 2q37.1 Especificidad de tejido: Retina y glándula pineal Posición: 233881207-233920440 Localización subcelular: Citoplasma Patologías asociadas: arRP, arCSNB Propiedades: Interactúa selectivamente con Ca2+ El gen que codifica a la arrestina, una proteína soluble de 48 kDa encontrada en retina y glándula pineal, fue inicialmente localizado en la región cromosómica 2q24-q37 (Ngo et al., 1990). Posteriormente, mediante FISH (Fluorescence in situ hybridation) se refinó esta localización a q37 (Calabrese et al., 1994). La variante de splicing p44 (44 kDa) posee una secuencia aminoacídica similar a la de la arrestina (excepto por la ausencia de los 35 residuos C-terminales), pero presenta mayor actividad inhibitoria de la fototransducción (Palczewski et al., 1994). Mientras que la arrestina se distribuye por toda la célula, p44 se encuentra restringida al segmento externo de los fotorreceptores, lo que sugiere un posible rol de esta variante en la cascada de fototransducción (Smith et al., 1994). Mutaciones en SAG inducen la enfermedad de Oguchi (arCSNB) (Fuchs et al., 1995; Nakamachi et al., 1998). La mutación 1147delA de este gen, causa frecuente de enfermedad de Oguchi en población japonesa, también ha sido relacionada con arRP, aportando evidencia de expresión variable de la mutación en el gen SAG (Nakazawa et al., 1998). Dicha mutación explica <1% de los casos de arRP (Hartong et al., 2006). I.1.4.1.7. Proteína activadora de la guanilato ciclasa, 1B Símbolo: GUCA1B (OMIM: *602275) Proteína codificada: 4 exones, 201 a.a. Otros alias: GCAP2 Función: Estimulación de la guanilato ciclasa 1 Región cromosómica: 6p21.1 Especificidad de tejido: Retina (bastones y conos) Posición: 42259000-42270672 Localización subcelular: Membrana celular Patologías asociadas: adRP, adMD Propiedades: Une tres iones de Ca2+ Los genes GUCA1A y GUCA1B comparten el mismo locus, localizado en la región 6p21.1 (Surguchov et al., 1997). Sin embargo, el parecido entre sus respectivas secuencias se limita a ciertas porciones de los exones 1 y 2. Muy probablemente, la coexistencia de estos dos genes en un mismo locus y la relativa semejanza de sus secuencias nucleotídicas, se deban a un evento de duplicación génica. En la retina humana, la proteína GUCA1B se distribuye mayoritariamente en los segmentos INTRODUCCIÓN 43 internos, somas y sinapsis de los conos; y en menor grado en los segmentos internos de los bastones y las neuronas de la retina interna (Otto-Bruc et al., 1997). Aunque GUCA1A está involucrada en la regulación por Ca2+ de la Guanilato Ciclasa de bastones y conos, GUCA1B puede tener una función no fototransductora en los fotorreceptores y en las neuronas de la retina interna. La identificación de una transición en heterozigosis G>A en el codón 157 del gen GUCA1B (resultando en el cambio del aminoácido arginina por glicina) cosegregando con RP en tres individuos no relacionados, permitió considerar a este gen como responsable de adRP (Sato et al., 2005). Esta mutación explica menos del 1% de los casos de adRP (Hartong et al., 2006). Los exámenes fenotípicos realizados a los individuos de las familias afectadas, revelan que esta mutación esta asociada, además de RP, con degeneración macular y con un fenotipo normal (Sato et al., 2005). Esto sugiere que la citada mutación en GUCA1B causa una forma autosómica dominante de distrofia retinal con expresión fenotípica variable y penetrancia incompleta. I.4.2. Metabolismo del retinol La perfecta adaptación del sistema visual a los diferentes niveles de iluminación ambiental se establece en un período de tiempo relativamente corto. No obstante, después de una exposición intensa o prolongada a la luz, el ojo tarda decenas de minutos en acomodarse a la oscuridad. Este lentísimo fenómeno de recuperación de la sensibilidad visual es el encargado de restaurar la corriente circulante del fotorreceptor, de regenerar los pigmentos visuales de los fotorreceptores y de reestablecer el umbral de la visión. La duración de los procesos de adaptación a la oscuridad y de regeneración del Figura 21. Ciclo bioquímico del procesado de retinoides. RPE, epitelio pigmentario de la retina; IPM, matriz interfotorreceptora; OS, segmento externo; Rh, rodopsina; M, metarodopsina; RK, rodopsín kinasa; Arr, arrestina; RAL, 11-cis retinal; RDH, retinol deshidrogenasa; ROL, todo-trans retinol; ABCR, casete de unión a ATP de la retina; IRBP, proteína interfotorreceptora de unión al retinol; CRBP, proteína celular de unión al retinol; LRAT, lecitín retinol acil transferasa; RGR, receptor de la retina acoplado a proteína G; CRALBP, proteína celular de unión al retinal. Tomada de (Lamb y Pugh, 2004). INTRODUCCIÓN 44 pigmento visual estará determinada por la concentración de 11-cis retinal existente en el fotorreceptor (Lamb y Pugh, 2004). En algunas especies de invertebrados, la recuperación del 11-cis retinal se produce por una fotoisomerización retrógrada de la metarodopsina en rodopsina (Lamb y Pugh, 2004). Esta fotoisomerización tiene lugar dentro del fotorreceptor y durante la misma, el retinal permanece unido covalentemente a la opsina. En vertebrados, por el contrario, ni los conos ni los bastones pueden convertir el todo-trans retinal en 11-cis retinal por si mismos. De hecho, estos fotorreceptores precisan la ayuda de otras células para desenvolver una serie de reacciones químicas (conocidas como el ciclo de los retinoides o ciclo visual) con el fin de obtener el 11-cis retinal (Figura 21). En los bastones, el todo-trans retinal se libera de la opsina y sale de la célula fotorreceptora en dirección al RPE. Aquí, será reconvertido a 11-cis retinal y posteriormente volverá a ingresar en el fotorreceptor. El todo-trans retinal liberado por los conos será procesado por un ciclo ligeramente distinto, parte del cual se desarrollará dentro de las células de Müller (Mata et al., 2002). La liberación de la molécula de todo-trans retinal por parte del pigmento visual, se produce por la hidrólisis del enlace covalente en base de Schiff que lo mantiene unido a la apoproteína (Heck et al., 2003; Schädel et al., 2003). Sin embargo, muchas moléculas del aldehído permanecerán unidas mediante interacciones hidrofóbicas a lugares específicos de sus respectivas opsinas (conocidos como “sitios de salida” o sitio III), distintos al lugar de unión convencional del cromóforo con la opsina (sitio I). El todotrans retinal unido al sitio de salida no será liberado hasta que otra molécula de retinaldehído (generalmente 11-cis retinal) se una al sitio de entrada (sitio II) (Figura 22). Las opsinas, entonces, actuarían como una chaperona, transportando el todo-trans retinal hasta la membrana de los segmentos externos (Lamb y Pugh, 2004). A lo largo del ciclo de los retinoides, varias chaperonas serán las encargadas de guiar a las diferentes configuraciones de la molécula de retinoide a través de los sucesivos pasos, protegiéndolas de la degradación e incrementando enormemente su solubilidad en la fase acuosa. En última instancia, el todo-trans retinal será reducido por el enzima todo-trans retinol deshidrogenasa (RDH) a todo-trans retinol e inmediatamente será liberado de la opsina (Rattner et al., 2000) (Figura 23). Figura 22 Sitios de unión del retinoide a la opsina. El ligando (11-cis retinal/todotrans retinal) pasa a través de la rodopsina por una especie de túnel formado entre el sitio de entrada (sitio II), el sitio activo (sitio I) y el sitio de salida (sitio III). El sitio II puede albergar al todo-trans retinal, al 11cis retinal o a ambos a la vez. Tomada de (Schädel et al., 2003). INTRODUCCIÓN 45 Aquellas moléculas de todo-trans retinal que se liberan de la metarodopsina como retinoides libres, pueden unirse de forma espontánea a la fosfatidiletanolamina (PE) a través de un enlace en base de Schiff dando lugar a la N-retilidena-PE o NrPE (McBee et al., 2001). Posteriormente, una segunda molécula de todo-trans retinal puede unirse a la NrPE, formando la A2PE. Esta molécula sufre un cambio químico y origina un producto con mayor condensación, la N-retilidena-N-retiniletanolamina o A2E, el componente mayoritario de la lipofuscina (Figura 24). Hasta el momento, no se conoce ningún enzima capaz de degradar estos productos de doble condensación (A2PE y A2E), lo que explicaría su acumulación. La proteína transportadora ABCR retiraría la NrPE de la cara interna de la membrana de los discos (actuando como una flipasa fosfolipídica), evitando la formación de A2PE y A2E. Después de la hidrólisis del ABCR y el todo-trans retinal, el aldehído será reducido a todo-trans retinol por la RDH en el citoplasma, requiriendo NADPH como cofactor (Rattner et al., 2000). El todo-trans retinol obtenido por ambas vías se desplazará a través del citoplasma y atravesará la membrana plasmática del segmento externo. Una vez aquí, se unirá a la proteína interfotorreceptora de unión a retinoides (IRBP) y atravesará la matriz interfotorreceptora hasta alcanzar el RPE (Lamb y Pugh, 2004). La IRBP es una chaperona con cuatro sitios de unión para retinoides; dos de unión a todo-trans retinol y dos de unión al 11-cis retinal. En el citoplasma de las células del RPE, el todo-trans retinol se unirá a otra chaperona, la proteína celular de unión al retinol (CRBP), antes de ser esterificado por el enzima lecitín retinol acil transferasa (LRAT). El aporte de ácidos grasos necesarios para el proceso de esterificación está regulado por el enzima acil-CoA-retinol aciltransferasa (ARAT). El todo-trans retinil éster finalmente obtenido se unirá a otra proteína chaperona, RPE65, que lo trasladará hasta el enzima retinil éster isomerohidrolasa. La entrada de retinoides en el ciclo está regulada por la palmitoilación reversible de RPE65 por LRAT (Xue et al., 2004). La forma asociada a la membrana de RPE65 (mRPE65) sufrirá una triple palmitoilación, Figura 23. Organización subcelular del ciclo de retinoides. Como cada célula del RPE está en contacto con 20-30 segmentos externos de bastones, es necesario que los enzimas implicados en el procesado de los retinoides estén ampliamente distribuidos por toda la célula. La membrana del retículo endoplasmático liso, presente en alta proporción en las células del RPE, contiene la mayoría de los enzimas implicados en el ciclo de los retinoides. OS, segmento externo; IPM, matriz interfotorreceptora; RPE, epitelio pigmentario de la retina; SER, retículo endoplasmático liso; RAL, retinaldehído; ROL, retinol; AL, grupo aldehído; OL, grupo alcohol; E, grupo éster. Tomada de (Lamb y Pugh, 2004). INTRODUCCIÓN 46 capacitándola para actuar como una chaperona de las largas cadenas de todo-trans retinil éster y promover su entrada en el ciclo (Figura 25). Además, mRPE65 actúa como un donante de palmitoil para el 11-cis retinol en presencia de LRAT, tras lo que se convierte en la forma soluble de RPE65 (sRPE65). La forma soluble no palmitoilada también funciona como una chaperona, conduciendo el todo-trans retinol hasta LRAT para generar todo-trans retinil éster. En la oscuridad, cuando no se requiere la síntesis de 11-cis retinal, LRAT convierte a mRPE65 en sRPE65, provocando un descenso del aporte de todo-trans retinil éster al ciclo. La disminución de la cantidad de todo-trans retinil éster disponible causa el bloqueo del ciclo de los retinoides. Si el ciclo sigue su curso, el todo-trans retinil éster aportado por la mRPE65 será el substrato de la retinil éster isomerohidrolasa, que lo isomerizará a 11-cis retinol (Gollapalli y Rando, 2003; Moiseyev et al., 2003). La energía empleada en la reacción de isomerización proviene de la hidrólisis del enlace éster. El consiguiente aumento de la concentración de 11-cis retinol actuaría como regulador de la isomerohidrolasa, al ejercer un feedback negativo sobre el enzima. Figura 24. Formación de A2E en el RPE. La fosfatidiletanolamina (PE) reacciona con el todo-trans retinal (TtRAL) formando N-retiniliden a fosfatidiletanolamina (APE). APE es el substrato de ABCR. APE puede interactuar con otra molécula de TtRAL generando dihidro-N-retinilidena-N-retinil fosfatidiletanolamina (A2PE-H2). A2PE-H2 será fagocitad a por el RPE, donde se oxidará a N-retilena-N-retinil fosfatidiletanolamina (A2PE). Por último, A2PE sufrirá un a hidrólisis ácida dentro de los fagosomas convirtiéndose en N -retilidena-N-retinil etanolamina (A2E). Adaptada de ( McBee et al., 2001 ) . INTRODUCCIÓN 47 Moiseyev et al. han sugerido que RPE65 podía ser el enzima responsable de la actividad isomerohidrolasa del ciclo visual y que el sustrato hidrofóbico sería suministrado por LRAT (Moiseyev et al., 2005) (Figura 26). Estudios posteriores han confirmado que RPE65 es una isomerohidrolasa del ciclo visual dependiente de Fe2+ (Moiseyev et al., 2006). Llegado este punto del ciclo, el 11-cis retinol puede seguir dos vías. Por un lado, puede volver a ser esterificado por la LRAT y posteriormente almacenado. La elevada tasa de intercambio del 11cis retinol manifestada entre los capilares de la coroides y el RPE, genera la pérdida de retinoides esenciales para la nueva síntesis del cromóforo de los pigmentos visuales. Para evitar esta pérdida, los retinoides son almacenados con la intención de mantener las concentraciones de ésteres de retinil en los niveles adecuados. La proteína LRAT resulta esencial en este proceso de acumulación de retinoides (Batten et al., 2004). En el ojo humano, la regeneración de la rodopsina después de una breve exposición a la luz no requeriría el reciclaje de los retinoides, puesto que la cantidad de todo-trans retinil éster almacenado evitaría la síntesis del 11-cis retinal a partir del procesado del todo-trans retinal recién liberado (Lamb y Pugh, 2006). La cantidad de todo-trans retinil éster almacenado en el RPE humano equivale (en moles) a ~2,5 veces la cantidad de retinoide que se encuentra unido a la Figura 26. Interacciones entre RPE65 y LRAT. RPE65 está asociada a la membrana mediante tres cisteínas palmitoiladas (C). Lrat convierte todotrans retinol (at-ROL) en todo-trans retinil éster (at-RE), el cual será transportado hasta RPE65 a través de la membrana. RPE65 obtiene este sustrato altamente hidrofóbico de la membrana y lo convierte en 11cis retinol (11-cis-ROL). Adaptada de (Moiseyev et al., 2005). Figura 25. Aporte de retinoides al ciclo visual mediado por RPE65. En la oscuridad, el interruptor molecular de RPE65 se desconecta y el 11-cis retinol es palmitoilado empleando a mRPE65 como donante del grupo acilo. Esta reacción genera 11-cis retinil palmitato (molécula de almacenamiento del cromóforo) y sRPE65. tRP, todo-trans retinil palmitato; tROL todotrans retinol; cRP, 11-cis retinil palmitato; cROL, 11-cis retinol; cRDH, 11-cis retinol deshidrogenasa 5 (RDH5). Tomada de (Xue et al., 2004). INTRODUCCIÓN 48 Figura 27. Distribución de los RESTs en el RPE. Cada célula del RPE contiene varios retinosomas (REST) semejantes a vacuolas de ~6,9 μm de longitud y ~0,8 μm de diámetro rellenas de retinil éster y, al menos, un componente proteico: la proteína relacionada con la diferenciación adiposa (ADRP). Los RESTs se disponen de forma alineada y perpendicular a la capa de células del RPE. Adaptada de (Imanishi et al., 2004) rodopsina de los fotorreceptores. En ratones, el retinil éster es almacenado en unas estructuras intracelulares especializadas denominadas RESTs (Retinyl Ester Storage Particles) o retinosoma (Imanishi et al., 2004) (Figura 27). No está claro cuando estas estructuras se usan para almacenar retinoides o cuando se usan en el ciclo de los retinoides. Sin embargo, es muy probable que estas estructuras funcionen como un almacén dinámico que facilitaría la rápida movilización de retinoides siempre que se necesitasen. Por otro lado, el 11-cis retinol puede continuar el ciclo de los retinoides, donde será oxidado por la 11-cis retinol deshidrogenasa (11-cis RDH, o RDH5) transformándose en 11-cis retinal (Simon et al., 1995). Este nuevo producto se unirá a la chaperona proteína celular de unión al retinaldehído (CRALBP) y será trasladado hasta la membrana de la célula del RPE (Lamb y Pugh, 2004). Desde aquí, el 11-cis retinal atravesará la matriz interfotorreceptora unido a IRBP y alcanzará la membrana del segmento externo de los fotorreceptores. En los conos, el 11-cis retinal se unirá a las opsinas dispuestas en la membrana del segmento externo. Sin embargo, en los bastones, el 11-cis retinal tendrá que desplazarse por el citoplasma sin ayuda de ninguna chaperona hasta llegar a las membranas de los discos, en donde se unirá a la opsina. En un primer momento, el 11-cis retinal y la opsina se unen de forma no covalente en un sitio denominado “sitio de entrada” o sitio II (Schädel et al., 2003) (Figura 22). Tras esta primera aproximación, se establece espontáneamente un enlace en base de Schiff entre el sitio I de la apoproteína y el 11-cis retinal, induciendo un cambio conformacional que estabiliza la molécula de rodopsina en los bastones o la de conopsina en los conos (Lamb y Pugh, 2004). I.4.2.1. Vías alternativas del ciclo de los retinoides Dentro del ciclo de los retinoides, existen dos rutas que actúan como bypass de algunos pasos, pero no poseen elevada relevancia dentro de la dinámica del procesado del retinoide. En primer lugar, la ruta establecida por la proteína ABCR transporta una relativa pequeña proporción de todo-trans retinal libre. Sin embargo, este transporte minoritario se convierte en un mecanismo esencial a la hora de evitar los daños que causa el todo-trans retinal que se escapa de la ruta normal y se transforma en un agente tóxico, el ácido todo-trans retinoico (Hao y Fong, 1999). La elevada afinidad que presenta INTRODUCCIÓN 49 este ácido por RPE65, favorece la unión a esta proteína en detrimento de su ligando natural, el todotrans retinil éster. La unión del ácido todo-trans retinoico con RPE65 provoca la inhibición de la función del ciclo visual (Gollapalli y Rando, 2004). En segundo lugar, la vía mediada por RGR proporciona una isomerización directa de todo-trans retinal en 11-cis retinal en presencia de luz (Hao y Fong, 1996; Hao y Fong, 1999). La significativa proporción de 11-cis retinal obtenido a través de esta ruta (con respecto al rendimiento final del ciclo de los retinoides), permite la reconstitución de los pigmentos visuales de los fotorreceptores (Chen et al., 2001). No obstante, la pequeña cantidad de RGR apreciada en el ojo (una centésima parte de la cantidad de rodopsina) limita la contribución de esta vía en la regeneración del 11-cis retinal aún en presencia de luz (Lamb y Pugh, 2004). I.4.2.2. El ciclo de los retinoides en los conos La distancia existente entre el segmento externo de los bastones y el RPE es muy inferior a la observada entre el RPE y los segmentos externos de los conos, mucho más pequeños que los de los bastones. La gran separación entre RPE y conos, dificulta la transferencia del 11-cis retinol generado en el RPE. Por ello, los conos han tenido que desarrollar rutas alternativas para lograr el aporte de 11cis retinol adecuado para poder ser funcionales bajo condiciones de luminosidad (Mata et al., 2002). Las células de Müller han resultado ser piezas clave en la ejecución de estas vías alternativas. Así, en las retinas de pollo y ardilla, las células de Müller presentan una vía de producción de 11-cis retinol mediada por los enzimas todo-trans retinol isomerasa, 11-cis retinil éster sintasa y retinil éster hidrolasa. Este proceso, junto con la presencia de un enzima 11-cis RDH (RDH12) en los segmentos externos de los conos, indican la posible producción del 11-cis retinal por los propios fotorreceptores (Haeseleer et al., 2002; Mata et al., 2002). En las células de Müller, también se ha detectado la expresión de RGR (Jiang et al., 1993). RDH10, una todo-trans retinol deshidrogenasa expresada en RPE y células de Müller (Wu et al., 2002), aportaría el todo-trans retinal necesario para el correcto funcionamiento de RGR. Las células de Müller, por lo tanto, también estarían capacitadas para generar 11-cis retinal a partir de todo-trans retinol en presencia de luz (Wu et al., 2004). Al contrario que los bastones, los conos no necesitarían los pasos que tienen lugar en el RPE, haciendo que el proceso de regeneración de las conopsinas se ejecutase unas 20 veces más rápido que el de la rodopsina (Mata et al., 2002). Esta vía alternativa de síntesis de 11-cis retinal sustentaría la excelente visión de los vertebrados en condiciones de alta intensidad de luz (Figura 24). INTRODUCCIÓN 50 I.4.2.3. Genes responsables de RP implicados en el metabolismo del retinol Esta categoría recoge aquellos genes cuyas mutaciones provocan alteraciones en el metabolismo del retinol. I.4.2.3.1. Lecitín Retinol Aciltransferasa Símbolo: LRAT (OMIM: +604863) Proteína codificada: 3 exones, 231 a.a. Otros alias: O95237 Función: Producción de ésteres de todo-trans retinil Región cromosómica: 4q32.1 Actividad catalítica: PC + Retinol → 2-acyl-GPC + RE Posición: 155884613-155893720 Especificidad de tejido: Muy expresada. Entre otros, RPE Patologías asociadas: arRP, arLCA Localización subcelular: Retículo endoplasmático PC, fosfatidilcolina; 2-acyl-GPC, 2-acilglicerofosfocolina; RE, retinil éster; RPE, Epitelio Pigmentario de la Retina La secuencia aminoacídica de LRAT, el enzima responsable de la conversión de todo-trans retinol en retinil ésteres, fue descrita en 1999 (Ruiz et al., 1999). Esta proteína de 25,3 kDa se distribuye por RPE, hígado, testículo, intestino y páncreas. La localización cromosómica del gen LRAT se asignó a la región 4q31.2 (Ruiz et al., 2001). A pesar de que uno de los primeros estudios mutacionales de LRAT no evidenció ninguna asociación con distrofias retinales (Ruiz et al., 2001), en Figura 24. Ciclo de los retinoides en los conos. El TtROL liberado al espacio extracelular por los conos es transportado por la IRBP hasta las células de Müller, en donde el enzima TtRol isomerasa cataliza la isomerización pasiva del TtROL a 11cROL. Además, las células de Müller contienen CRALBP que se unirá al 11cROL. El enzima 11cRE sintasa cataliza la esterificación del 11cRE usando Palm-CoA como donante del grupo acilo. Tras ello, el enzima REH es activado por CRALBP generando 11cROL, que será transportado hasta el segmento externo del cono mediante IRBP. Dentro del segmento externo, el 11cROL es oxidado por la 11cRDH. El 11cRAL resultante se unirá a la apoproteína y regenerará la conopsina. hν, fotón; MII, metarodopsina II; TtRAL, todo-trans retinal; TtROL, todo-trans retinol; 11cROL, 11-cis retinol; 11cRE, 11-cis retinil éster. Enzimas (representadas en letra azul): TtRDH, todo-trans retinol deshidrogenasa; REH, retinil éster hidrolasa; 11cRAL, 11-cis retinal; 11cRDH, 11-cis retinal deshidrogenasa. Adaptada de (Mata et al., 2002). Conopsina (Apoproteína + 11cRAL) hν MII Apoproteína TtRAL 11cRAL TtROL 11cROL NADPHNADP + TtRDH 11cRE sintasa 11cRDH TtROL 11cROL (CRALBP) TtROL isomerasa 11cRE REH Palm-CoA HS-CoA IRBP Célula de Müller Segmento externo del cono Conopsina (Apoproteína + 11cRAL) hν MII Apoproteína TtRAL 11cRAL TtROL 11cROL NADPHNADP + TtRDH 11cRE sintasa 11cRDH TtROL 11cROL (CRALBP) TtROL isomerasa 11cRE REH Palm-CoA HS-CoA IRBP Célula de Müller Segmento externo del cono INTRODUCCIÓN 51 un estudio posterior se detectaron dos mutaciones que implicaban a este gen en la patogénesis de la distrofia retinal infantil severa (CSRD; Childhood-onset Severe Retinal Dystrophy) (Thompson et al., 2001). El término CSRD se emplea para hacer referencia a amaurosis congénita de Leber (LCA) o a formas severas de arRP, patologías genéticamente heterogéneas que afectan a los bastones y a los conos (Sweeney et al., 2007). RP se diagnostica en aquellos individuos que mantienen una buena visión central durante la primera década de vida, a pesar de la degeneración de los receptores (Morimura et al., 1998). Por su parte, el diagnostico de LCA implica la ceguera desde el nacimiento o la pérdida de visión en los primeros meses de vida. CSRD o EORD (Early-Onset Retinal Dystrophy) recogerían todos aquellos casos de afectados de degeneración de la retina que pierden la visión durante los primeros años de vida y en los cuales no existe el suficiente criterio diagnóstico para diferenciar una LCA de una arRP severa. Una de las mutaciones halladas en el estudio de Thompson et al., la deleción heterozigota de 2 adeninas (396delAA), se encontró en el alelo paterno de un individuo diagnosticado a los 3 años de degeneración severa de la retina (Thompson et al., 2001). La imposibilidad para hallar la mutación 396delAA en el alelo materno de este individuo sugería que, o bien la distrofia retinal de este paciente no estaba causada por esta mutación, o bien era producto de la herencia digénica con otro gen defectivo. La otra mutación, una transversión en homozigosis 525T>A que genera un cambio aminoacídico de serina por arginina en el residuo 175, cosegregaba con arRP en dos individuos no relacionados cuyos progenitores mostraban consanguinidad. Posteriormente, Senechal et al. encontraron una mutación en LRAT (c.217delAT) relacionada con LCA (Senechal et al., 2006). Esta nueva mutación causa la parada prematura de la síntesis proteica en el codón 120, resultando en una proteína no funcional. La prevalencia actual de las mutaciones de LRAT entre los casos de arRP, se sitúa en torno al 1% (Hartong et al., 2006). I.4.2.3.2. Proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina Símbolo: RPE65 (OMIM: +180069) Proteína codificada: 14 exones, 534 a.a. Otros alias: RP20 Función: Regeneración del 11-cis retinal Región cromosómica: 1p31.2 Especificidad de tejido: RPE Posición: 68667095-68688230 Localización subcelular: Citoplasma y membrana celular Patologías asociadas: arRP, arLCA Propiedades: Chaperona La secuencia aminoacídica de la proteína RPE65 bovina fue descrita en 1993 (Hamel et al., 1993). A pesar de comportarse como una molécula de 65 kDa en geles de SDS-PAGE, su masa molecular real se estimó en 60,94 kDa. Mediante FISH, se determinó la localización del gen RPE65 humano en la región cromosómica 1p31 (Hamel et al., 1994). La proteína RPE65 humana se expresa INTRODUCCIÓN 58 amontonamiento de discos, aunque estos poseen un diámetro superior al normal. Para poder albergarlos, el segmento debe expandirse lateralmente, provocando el aumento de la presión ejercida contra los segmentos externos adyacentes. El incremento sostenido de la presión causa una importante desorganización estructural dentro de cada segmento externo, conduciendo al fotorreceptor hacia la apoptosis. Periferina/rds y Rom1 se asocian de forma no covalente constituyendo complejos de homodímeros y heterodímeros (Bascom et al., 1992b; Wrigley et al., 2000; Goldberg, 2006). Estos dímeros se unen a las partículas de transporte intraflagelar y son conducidos hacia el segmento externo a través del cilio conector (Figura 29). Una vez allí, son liberados en los lugares de evaginación de la membrana, permitiendo su incorporación al disco en formación. Los dímeros del nuevo disco interactuarán con otros dímeros de la superficie basal de la membrana plasmática del segmento externo. La dimerización no covalente de estos homo o heterodímeros constituye el tetrámero, una estructura con una importante función en la formación del borde del disco. La formación del tetrámero resulta un requisito indispensable para la correcta incorporación de la periferina/rds en las membranas de los discos recién formados (Loewen et al., 2003). Durante la neogénesis de un disco, la periferina/rds (restringida a una región adyacente al cilio) se ira distribuyendo por la membrana a medida que esta se expande. La repulsión de las cargas entre las moléculas de periferina/rds adyacentes de la superficie citoplasmática causa la curvatura de la membrana del disco, constituyendo Figura 29. Periferina/rds en la formación y mantenimiento de los discos. (A) Liberación de los dímeros de periferina/rds de la partícula de transporte intraflagelar (IFT) en la zona de evaginación de la membrana. Transporte de los canales catiónicos regulados por cGMP (CNGs) mediada por IFT. (B) Interacción entre dímeros de periferina/rds del disco en formación y periferina/rds dispuesta en la superficie basal de la membrana plasmática. Formación del tetrámero. (C) Interacción de los dominios citoplasmáticos de periferina/rds con las variantes solubles de GARP, subunidad β de los CNGs u otras proteínas, creando un patrón intracelular para la morfogénesis continua de los discos. Interacción entre GARP2 y PDE6. (D) Desestabilización de la membrana plasmática por interacción con la hélice anfipática del dominio C-terminal de la periferina/rds, previa a la eliminación de los paquetes de discos. (E) Polimerización de tetrámeros de periferina/rds mediante puentes disulfuro dispuestos a lo largo del perímetro del disco en formación. Tomada de (Goldberg, 2006). D E A B C INTRODUCCIÓN 59 el borde (Connell y Molday, 1990). La formación del borde del disco, localización final de la periferina/rds, es un proceso secundario a la evaginación de la membrana plasmática del cilio para formar los nuevos discos (Arikawa et al., 1992). Los tetrámeros se unirán mediante puentes disulfuro formando estructuras homo o heterooctaméricas (Loewen y Molday, 2000). Los homotetrámeros de periferina/rds se unen mediante el establecimiento de puentes disulfuro entre las cisteínas de la posición 150 del largo loop intradiscal de la proteína. En el caso de los heterotetrámeros, el puente disulfuro se establece entre la cisteína 150 de la periferina/rds y la cisteína 153 de la Rom1. Por su parte, las dos cisteínas 153 de Rom1 presentan muy baja capacidad para formar puentes disulfuro intermoleculares. Posteriormente, estos octámeros se reorganizarán en una estructura de mayor orden: los oligómeros. La periferina/rds exhibe una fuerte tendencia a formar oligómeros de varios tamaños. Sin embargo, la asociación de periferina/rds con Rom1 limita el tamaño de los oligómeros y el número de subunidades que participan en la formación de puentes disulfuro intermoleculares. Rom1 ejerce una modulación negativa sobre la oligomerización de la periferina/rds, controlando el tamaño de los oligómeros y regulando las dimensiones de los discos durante la morfogénesis del segmento externo (Figura 30). La formación de los puentes disulfuro y la dimerización de la periferina /rds, causan las restricciones estructurales responsables de la morfología aplastada de los discos (Wrigley et al., 2000) y de la formación del borde (Loewen y Molday, 2000). Además, la polimerización de tetrámeros adyacentes dispone toda una serie de sitios de anclaje a lo largo del perímetro del borde del disco (Goldberg, 2006). La localización de la periferina/rds en el borde del disco sugiere una posible implicación de Figura 30. Polimerización de la periferina/rds y Rom1 mediada por puentes disulfuro. Periferina/rds (gris) y Rom1 (blanco) interactúan para constituir complejos homo y heterotetraméricos. Una elevada proporción de homotetrámeros de periferina/rds se unen mediante puentes disulfuro para formar homooctámeros. Estos oligómeros pueden continuar asociándose para formar homooligómeros. Una porción considerable de heterotetrámeros de periferina/rds y Rom1 se unen mediante puentes disulfuro para formar heterooctámeros. Los heteroctámeros no forman oligómeros de mayor orden. Los homotetrámeros de Rom1, presentes en baja proporción, no pueden formar oligómeros unidos mediante puentes disulfuro. Hasta que no se establecen los puentes disulfuro, tanto la cisteína 150 de la periferina/rds como la cisteína 153 de Rom1, permanecen en su estado reducido (SH). Adaptada de (Loewen y Molday, 2000 ) . INTRODUCCIÓN 60 esta proteína en el anclaje de los discos al sistema citoesquelético del fotorreceptor (Connell y Molday, 1990; Bascom et al., 1992b). La interacción con el citoesqueleto se establecería a través de un dominio altamente cargado del extremo C-terminal de la periferina/rds. El extremo C-terminal posee, además, otros dos dominios funcionales: una señal de localización para el segmento externo de los bastones y una secuencia de afinidad para las incisuras; no observadas en el extremo C-terminal de Rom1 (Connell y Molday, 1990; Tam et al., 2004). La secuencia de afinidad para las incisuras faculta a la periferina/rds para incidir en su organización, generando su estabilización y/o su alineación. El anclaje de los discos a la membrana plasmática mediante estructuras filamentosas restringiría la rotación del disco y mantendría la alineación de las incisuras entre los discos. Por otro lado, los discos adyacentes podrían asociarse a través de interacciones proteicas para mantener su posición relativa. Las estructuras espaciadoras que unen los discos adyacentes se encuentran distribuidas por toda la superficie del disco, puesto que si se localizasen exclusivamente en el borde y las incisuras, la región aplanada del disco no estaría lo suficientemente asentada para mantener el preciso almacenamiento de los discos (Nickell et al., 2007) (Figura 31). Los espaciadores están constituidos por complejos de proteínas entre las que se incluyen la periferina/rds, Rom1 y las proteínas GARP. La interacción de periferina/rds con el dominio GARP de la subunidad β de los canales catiónicos regulados por cGMP (CNGs) tendría como resultado la formación de estructuras que adherirían los bordes de los discos a la membrana plasmática del segmento externo (Poetsch et al., 2001; Batra-Safferling et al., 2006) (Figura 32). Las interacciones periferina/rdsGARP-periferina/rds permitirían la asociación de los discos adyacentes y el mantenimiento de su posición relativa (Tam et al., 2004). Además, las variantes solubles de las GARPs se unirían al complejo periferina/rds-Rom1, ligando el borde de los discos adyacentes (Batra-Safferling et al., 2006). Recientemente, se ha demostrado la alta afinidad entre GARP2 (variante de splicing de la subunidad β de los CNGs) y PDE6 (Pentia et al., 2006), asociación ya observada hacia tiempo por Körschen et al. (Körschen et al., 1999). Esta asociación reduciría el ruido de fondo generado por la Figura 31. Representación tridimensional del segmento externo de un bastón de ratón. Fracción de 8 discos (amarillo) y la correspondiente membrana plasmática (azul). Las áreas de alta densidad (amarillo oscuro) que contienen a la rodopsina, pueden ser diferenciadas de las áreas menos densas (amarillo claro). Los espaciadores que conectan los discos adyacentes entre sí (rojo) se distribuyen por toda la superficie del disco. Los espaciadores que unen el borde del disco con la membrana plasmática han sido representados en color naranja. Las imágenes han sido obtenidas mediante tomografía crioelectrónica. Tomada de (Nickell et al., 2007). http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612010/DC1/6). INTRODUCCIÓN 61 activación espontánea de la PDE6 en la oscuridad. La posibilidad de que la función de PDE6 estuviese regulada por la asociación con GARP2 unida a periferina/rds, sugiere un papel importante de la periferina/rds en la fototransducción de los bastones. Las proteínas GARP no aparecen en conos, ni tan siquiera la de la subunidad β de los CNGs, por lo que muy probablemente este tipo de fotorreceptores poseen mecanismos alternativos para establecer y mantener la arquitectura de sus segmentos externos (Goldberg, 2006). La interacción de los dominios citoplasmáticos de la periferina/rds con variantes solubles de las proteínas GARP u otras proteínas en los conos, establecerá una pauta intracelular para la continua morfogénesis de los discos. La red de interacciones establecida durante la morfogénesis se conservará en los discos maduros, garantizando el correcto y ordenado amontonamiento de los discos. En último lugar, la periferina/rds también está implicada en el mantenimiento de la longitud de los segmentos externos. La longitud de un segmento externo depende de los procesos de formación y eliminación de los discos sufridos en ese fotorreceptor. La localización del extremo C-terminal de la periferina/rds dentro del citoplasma del segmento externo permite la interacción entre el borde del disco y la membrana plasmática (Goldberg, 2006). Esta interacción promueve la fusión entre el disco y la membrana plasmática causando la eliminación de los discos envejecidos, un proceso esencial para la renovación del segmento externo (Boesze-Battaglia y Stefano, 2002). Los grupos de discos eliminados serán posteriormente fagocitados por el RPE. La fusión entre disco y membrana plasmática facilita la renovación del segmento externo, pero ¿cómo reconoce el fotorreceptor a los discos que deben ser eliminados? En los segmentos externos de los bastones, el contenido en colesterol de las membranas de los discos disminuye a medida que envejecen (Boesze-Battaglia, 1997). Sin embargo, el contenido en fosfatidiletanolamina (PE) prácticamente no varía a lo largo de la vida del disco. El colesterol proporciona estabilidad a la bicapa de las membranas, mientras que la PE favorece las estructuras con menor radio de curvatura, desestabilizando la bicapa. El bajo contenido en colesterol que presenta un disco envejecido, no puede contrarrestar los efectos desestabilizadores ejercidos por la PE. Esto generará la desestabilización de la membrana del disco, un prerrequisito para la fusión del disco con la membrana plasmática del segmento externo. Otra explicación alternativa se basa en la protección que la estructura normal de la bicapa lipídica ofrece a los lípidos contra el ataque de enzimas como las fosfolipasas o la colesterol oxidasa. Los cambios en el contenido de colesterol podrían, entonces, modular indirectamente la Figura 32. Interacción entre GARP2, parte GARP y el borde del disco. La interacción entre la parte GARP de la subunidad β y la periferina/rds, hace que los CNGs queden ligados al borde del disco. Cada tetrámero de periferina/rds se unirá a 4 moléculas de GARP2, o a 3 moléculas de GARP2 y una parte GARP. Tomada de (Batra-Safferling et al., 2006). INTRODUCCIÓN 62 actividad de estos enzimas. La baja proporción de colesterol facilitaría la acción de los citados enzimas, provocando la desestabilización de las membranas de los discos y su fusión con la membrana plasmática. Los eventos de fusión en los segmentos externos de los bastones son muy localizados y extraordinariamente regulados. De esta forma se evita que la fusión de los discos en un lugar no adecuado de la membrana plasmática genere un proceso anormal de renovación del segmento externo, que repercutiría considerablemente en la función del fotorreceptor (Boesze-Battaglia, 1997). La unión de GARP2 con la periferina/rds previene la fusión indiscriminada del disco con la membrana plasmática o la fusión de los bordes de dos discos adyacentes (Batra-Safferling et al., 2006). En definitiva, en el mantenimiento de la estructura de las células fotorreceptoras intervendrán tanto la rodopsina, con su función estructural secundaria, como la periferina/rds con sus múltiples acciones: guiar la morfogénesis del disco y sus bordes, alinear los amontonamientos de los discos y garantizar su aposición con la membrana plasmática, y eliminar los discos envejecidos en la parte distal del segmento externo (Goldberg, 2006). Sin embargo, es probable que la estructura de los fotorreceptores pueda estar influenciada por otras proteínas con diferentes acciones estructurales. Tal es el caso de PROML1, una proteína que origina la protrusión de la membrana en la base del segmento externo para la formación de los nuevos discos. La pérdida de función de esta proteína impediría la evaginación de la membrana, causando la alteración de la morfogénesis de los discos y la consiguiente degeneración de los fotorreceptores (Maw et al., 2000). Por otro lado, PROML1 podría estar implicada en el alineamiento de los precursores de los discos recién sintetizados, un paso esencial para su biogénesis (Jaszai et al., 2007). INTRODUCCIÓN 63 I.4.3.1. Genes responsables de RP implicados en el mantenimiento de la estructura de los fotorreceptores I.4.3.1.1. Periferina 2 / RDS Símbolo: PRPH2 (OMIM: *179605) Proteína codificada: 3 exones, 346 a.a. Otros alias: RDS Función: Estabilización y compactación del SE Región cromosómica: 6p21.1 Especificidad de tejido: Retina (bastones y conos) Posición: 42772316-42798287 Localización subcelular: Membrana Patologías asociadas: adRP, adMD, digRP con ROM1, adAVMD, adCACD Propiedades: Tetraspanina SE, Segmento Externo de los fotorreceptores. El gen rds murino codifica una glicoproteína de membrana uniformemente distribuida entre de los discos de los segmentos externos de los fotorreceptores (Travis et al., 1991b). Su expresión coincide con la aparición de los discos, hecho que remarca la importancia de esta proteína como elemento estructural. Connell et al. comprobaron que la secuencia aminoacídica de la proteína rds murina compartía una gran homología (92,5%) con la periferina bovina, concluyendo que la periferina era el producto normal del gen rds (Connell et al., 1991). La periferina o periferina/rds, es una proteína localizada a lo largo del borde de los discos de los segmentos externos de bastones y conos (Arikawa et al., 1992). Debido a la semejanza del fenotipo de los ratones rds (retinal degeneration slow) con las anomalías patológicas observadas en la RP, se procedió a la clonación y caracterización del gen RDS humano (Travis et al., 1991a). Tras ello, se comprobó que RDS se expresaba en retina y se localizaba en el brazo corto del cromosoma 6. Estos autores propusieron que RDS podía ser un candidato de RP, pero no pudieron confirmar su hipótesis al no disponer de ningún pedigree de RP que mostrase ligamiento con el cromosoma 6. Sin embargo, Farrar et al. demostraron la cosegregación de RP y un locus del brazo corto del cromosoma 6 (RP6, próximo a RDS), en un pedigree irlandés afectado de adRP (Farrar et al., 1991b). Esto motivó la búsqueda de mutaciones del gen RDS en otros pedigríes de adRP, hallándose varias de ellas prácticamente al mismo tiempo (Kajiwara et al., 1991; Farrar et al., 1991a). El análisis de ligamiento multipunto del locus RP6 –con la incorporación de marcadores intragénicos de RDS– evidenció un valor de LOD máximo (8,21) para RDS (Jordan et al., 1992). La secuenciación directa de este gen determinó un cambio nucleotídico en el exón 2 (Ser212Gly), el cual cosegregaba con adRP en el pedigree irlandés (Farrar et al., 1992). Posteriores estudios de RDS, revelaron nuevas mutaciones cosegregando con adRP (Dryja et al., 1997). Pero también hallaron mutaciones cosegregando con Retinitis punctata albescens (Kajiwara et al., 1993), con distrofia macular pigmentaria en forma de mariposa (Nichols et al., 1993), con INTRODUCCIÓN 64 distrofia macular viteliforme del adulto (Wells et al., 1993; Felbor et al., 1997), con adRP asociada a maculopatía en ojo de buey (Kikawa et al., 1994) o con distrofia coroidea areolar central (Yanagihashi et al., 2003). Además, se ha descrito como mutaciones en RDS, asociadas a mutaciones en ROM1, dan lugar a una forma digénica de RP (Dryja et al., 1997). La mutación L185P impide que la periferina/RDS forme homotetrámeros consigo misma, debiendo asociarse con ROM1 para constituir complejos heterotetraméricos estructuralmente normales (Goldberg y Molday, 1996). La presencia conjunta de L185P y una mutación nula en ROM1, impediría la correcta tetramerización de ambas proteínas (Goldberg y Molday, 1996; Loewen et al., 2001). Esto causaría el descenso de los niveles de tetrámeros que contienen periferina/RDS por debajo del umbral crítico requerido para la formación y estabilización de los segmentos externos, conduciendo a la característica degeneración de fotorreceptores de la RP. Los ratones transgénicos generados por Kedzierski et al., en los que se habían incluido las dos mutaciones de RDS y ROM1, sirvieron para demostrar la más rápida tasa de degeneración de los fotorreceptores presente en el modelo digénico en comparación con los modelos monogénicos dominantes (Kedzierski et al., 2001). El conjunto de las mutaciones del gen RDS supone un 9% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a). I.4.3.1.2. Proteína de membrana del segmento externo de los bastones, 1 Símbolo: ROM1 (OMIM: *180721) Proteína codificada: 3 exones, 351 a.a. Otros alias: ROSP1 Función: Estabilización y compactación del SE Región cromosómica: 11q12.3 Especificidad de tejido: Retina (bastones) Posición: 62137199-62139164 Localización subcelular: Membrana Patologías asociadas: adRP, digRP con RDS Propiedades: Forma homoheterodímeros con RDS Bascom et al. localizaron el gen ROM1 humano en la región q13 del cromosoma 11 (Bascom et al., 1992a). Este gen codifica una proteína con 4 dominios transmembrana localizada en el borde de los discos de los segmentos externos de los bastones (Bascom et al., 1992a). La proteína ROM1, resulta indispensable en la regulación de la morfogénesis de los discos y en la viabilidad de los bastones de mamíferos (Clarke et al., 2000a). De hecho, en ratones Rom1-/-, los discos poseen un diámetro superior al normal, los segmentos externos están altamente desorganizados y los bastones mueren lentamente por apoptosis. Por otro lado, ROM1 juega un papel importante en el proceso de renovación del segmento externo, puesto que potencia los procesos específicos de fusión entre la membrana de los discos y la plasmática (Boesze-Battaglia et al., 2007). INTRODUCCIÓN 65 Aunque han sido encontradas mutaciones en ROM1 cosegregando con adRP (Sakuma et al., 1995; Martínez-Mir et al., 1997b), la patogenicidad de alguna de ellas ha sido cuestionada (MartínezMir et al., 1997b). Descontando las formas de RP digénica que involucran a RDS y ROM1, el porcentaje de casos de adRP explicados por las mutaciones en ROM1 resulta inferior al 1% (Sullivan et al., 2006a). I.4.3.1.3. Prominina, 1 Símbolo: PROM1 (OMIM: *180721) Proteína codificada: 27 exones, 865 a.a. Otros alias: PROML1 Función: Morfogénesis de los discos Región cromosómica: 4p15.32 Especificidad de tejido: Stem Cells, retina, cerebro... Posición: 15578955-15686664 Localización subcelular: Membrana Patologías asociadas: arRP con MD Propiedades: Proteína glicosilada La proteína Prominina posee un dominio N-terminal extracelular, cinco segmentos transmembrana flanqueados por dos pequeños loops citoplasmáticos y dos grandes loops extracelulares glicosilados y un dominio C-terminal citoplasmático (Miraglia et al., 1997; Weigmann et al., 1997). En ratones, Prominina (prom) se encuentra asociada a las protusiones microvillosas de la superficie apical de las células neuroepiteliales, pudiendo interactuar con su citoesqueleto de actina (Weigmann et al., 1997). La Prominina humana (PROM1) fue inicialmente identificada como un receptor antigénico (AC133) de células madre hematopoiéticas y células progenitoras, sugiriendo un posible rol de esta proteína en hematopoiesis o diferenciación celular (Miraglia et al., 1997; Yin et al., 1997). AC133 también se expresaba en dos líneas celulares de retinoblastoma y en una de teratocarcinoma (Yin et al., 1997), además de su expresión normal en retina (Miraglia et al., 1997; Weigmann et al., 1997). La interesante presencia de tránscritos de PROM1 en retina, fue achacada a la capacidad de las células ganglionares para regenerar los axones (Miraglia et al., 1997). De hecho, PROM1 se concentra selectivamente en las protusiones de las membranas plasmáticas de las células no epiteliales, debido a su interacción con el citoesqueleto de actina (Weigmann et al., 1997; Corbeil et al., 1999). En la retina, PROM1 se localiza en la región de protusión de membrana de la base de los segmentos externos de los bastones, implicándose en la morfogénesis de los discos (Maw et al., 2000). PROM1 también se encuentra en los conos, pero distribuida a lo largo de todo el segmento externo (Jaszai et al., 2007). Mutaciones en el gen PROM1, ocasionan un tipo de degeneración de la retina autosómica recesiva (Maw et al., 2000) o arRP severa acompañada de degeneración macular (Zhang et al., 2007). INTRODUCCIÓN 66 I.4.4. Factores de transcripción de los fotorreceptores A través de un complejo proceso de determinación, migración y diferenciación, las células multipotenciales del neuroepitelio darán lugar a la retina adulta (Adler, 1993; Cepko et al., 1996). Este proceso involucra a toda una jerarquía de factores de transcripción, cuya función consiste en regular la expresión de genes esenciales para la formación de la retina. Tres de estos factores de transcripción, CRX, NRL y NR2E3, controlan la expresión de genes específicos de los fotorreceptores (Phelan y Bok, 2000). CRX se expresa en todos los precursores de los fotorreceptores (Chen et al., 1997) y resulta fundamental para el mantenimiento de los fotorreceptores de mamíferos (Freund et al., 1997). Además, CRX establece una asociación sinérgica con NRL sobre la regulación de la actividad del promotor del gen RHO (Chen et al., 1997). NRL se expresa únicamente en bastones (Swain et al., 2001) y regula positivamente la actividad de los promotores de ciertos genes de la retina, como RHO (Kumar et al., 1996; Rehemtulla et al., 1996) y PDE6B (Lerner et al., 2001), generando un incremento de la producción de sus proteínas. La implicación de NRL en la regulación de los genes de los fotorreceptores, junto con los altos niveles de expresión de esta proteína en la retina adulta, ponen de manifiesto su gran relevancia en el control de la función retinal (Rehemtulla et al., 1996). CRX también regula la expresión en los fotorreceptores de NR2E3, un receptor nuclear perteneciente a la familia de los factores de transcripción (Kobayashi et al., 1999). NR2E3 determinaría el fenotipo del fotorreceptor durante la retinogénesis humana (Haider et al., 2000). Por un lado, NR2E3 activaría los genes específicos de los bastones junto con CRX, NRL y otras proteínas. Y, por otro lado, reprimiría la transcripción de genes específicos de los conos en los bastones que se están diferenciando (Cheng et al., 2004; Wright et al., 2004) y (Chen et al., 2005). La pérdida de funcionalidad de cualquiera de estos tres factores de transcripción impediría la correcta diferenciación de las células fotorreceptoras, induciéndolas a la degeneración. En el caso de CRX, la pérdida de función originaría retinas en las cuales no existen segmentos externos de los fotorreceptores. La completa pérdida de función de NRL y NR2E3 no permitiría suprimir los genes de los conos y activar a los de los bastones, causando la alteración del desarrollo de los bastones (Gire et al., 2007). INTRODUCCIÓN 67 I.4.4.1. Genes responsables de RP implicados en la transcripción I.4.4.1.1. Factor de transcripción de conos y bastones con caja homeótica de tipo Otx Símbolo: CRX (OMIM: +602225) Proteína codificada: 4 exones, 299 a.a. Otros alias: CORD2 Función: Mantenimiento del fotorreceptor Región cromosómica: 19q13.32 Especificidad de tejido: Retina, glándula pineal Posición: 53016911-53038393 Localización subcelular: Núcleo Patologías asociadas: adCORD, arLCA, adLCA, adRP Propiedades: Interactúa con SCA7 El gen CRX, localizado en 19q13.3, codifica un factor de transcripción –con un homeodominio similar al de OTX1 y OTX2, requeridas para el normal desarrollo del ojo– que resulta esencial para la diferenciación de los fotorreceptores (Freund et al., 1997; Furukawa et al., 1997). La conservada expresión de CRX en fotorreceptores completamente diferenciados, sugiere una importante función de mantenimiento relacionada con la morfogénesis de nuevos discos en el segmento externo (Freund et al., 1997). CRX controla la biogénesis del segmento externo y la renovación de los discos mediante la regulación de la expresión de algunas proteínas del segmento externo, tales como rodopsina, conopsina, IRBP, PDEβ y arrestina (Chen et al., 1997; Freund et al., 1997; Furukawa et al., 1997). In vitro, CRX actúa sinergicamente con NRL en la transactivación del promotor de la rodopsina (Chen et al., 1997). La interacción sinérgica de CRX con QRX, un nuevo gen homeobox localizado en 19p13.3, provoca el incremento de la función transactivadora de CRX y NRL (Wang et al., 2004). Aparte de la regulación de genes específicos de los receptores, CRX también regula la expresión de genes específicos de la glándula pineal con relevancia en el control del ritmo circadiano (Li et al., 1998). Ratones Crx-/- muestran un desajuste del ritmo circadiano (Furukawa et al., 1999), además de una gran alteración de los terminales sinápticos y un bloqueo de la morfogénesis de los segmentos externos (Morrow et al., 2005). Mutaciones en CRX han sido asociadas a adCORD (Swain et al., 1997; Freund et al., 1997; Sohocki et al., 1998), arLCA (Freund et al., 1998; Swaroop et al., 1999), adLCA (Sohocki et al., 1998; Rivolta et al., 2001) y adRP (Sohocki et al., 1998). No está totalmente confirmado si la mutación R41Q localizada por Sohocki et al. cosegrega realmente con adRP, puesto que dicha mutación había sido previamente hallada en una familia con adCORD (Swain et al., 1997). En estudios posteriores Rivolta et al. volvieron a encontrar la mutación R41Q en un individuo con adRP (Rivolta et al., 2001). Las mutaciones del gen CRX son responsables de <1% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a) y del 0,6% de los casos de LCA (Hanein et al., 2004). INTRODUCCIÓN 74 DAG por la fosfolipasa C. La activación de la cascada de señalización con IP3 como segundo mensajero, origina un incremento del número de proteínas fosforiladas (Heth y Schmidt, 1992). La actuación conjunta de los niveles de IP3 y Ca2+ regula la fagocitosis. El incremento de los niveles de IP3 activaría la ingestión de los segmentos externos, mientras que el incremento de los niveles de DAG y Ca2+ activaría la proteín kinasa C e interrumpiría la fagocitosis (Rodríguez de Turco et al., 1992; Heth y Marescalchi, 1994). La incapacidad para ingerir el segmento externo mostrada por aquellas células del RPE sin receptores de MERTK, se debe a la ausencia del incremento de los niveles de IP3. El incremento de los niveles de Ca2+ puede activar otro sistema de segundo mensajero mediado por cAMP, el de la fosfolipasa A2-eicosanoides (Rodríguez de Turco et al., 1992). Aunque el sistema IP3/Ca2+ es elemental para el inicio de la fagocitosis, el sistema de segundo mensajero de cAMP resulta ser un importante modulador de la tasa de fagocitosis (Hall et al., 1993). De hecho, un incremento en los niveles de cAMP reduciría la actividad fagocítica (Gregory et al., 1994). Ambos sistemas de segundos mensajeros pueden interactuar y pueden estar regulados por la serotonina vía proteín kinasa C (Osborne et al., 1993; Nash y Osborne, 1995; Nash et al., 1997). La fagocitosis de los segmentos externos también está regulada por ritmos circadianos (Lavail, 1976; Young, 1978; O'Day y Young, 1978; Besharse y Hollyfield, 1979; Lavail, 1980; Flannery y Fisher, 1984), encontrando el pico máximo de esta actividad inmediatamente después de la exposición a la luz (Teirstein et al., 1980). El complejo patrón de la regulación circadiana sobre la eliminación y fagocitosis de los segmentos externos presenta diferencias entre conos y bastones (Nguyen-Legros y Hicks, 2000). La eliminación de los segmentos externos de los conos difiere unas 10-16 horas de la eliminación de los segmentos externos de los bastones y está principalmente restringida al primer estadio de la fase oscura (la noche). No obstante, en ambos tipos de fotorreceptores, este control depende de un reloj circadiano de la retina (Cahill y Besharse, 1993), pero no está totalmente establecido como este reloj interviene en el inicio de la fagocitosis (Nguyen-Legros y Hicks, 2000). Es muy probable que la coordinación entre el reloj circadiano y la fagocitosis pueda deberse a un transmisor, la dopamina (Besharse y Spratt, 1988; Nguyen-Legros y Hicks, 2000). De hecho, la regulación negativa de la fagocitosis debida al incremento de los niveles de cAMP (Hall et al., 1993) y la intervención de receptores de dopamina en la activación de la adenilato ciclasa, sugieren que la regulación circadiana puede ser mediada por el sistema dopamina/melatonina (Reme et al., 1986; Cahill y Besharse, 1993; Nguyen-Legros y Hicks, 2000; Nir et al., 2002). En este sentido, se ha podido comprobar un nuevo rol de los receptores de integrinas. Aquellos ratones que han perdido los receptores de αVβ5-integrina, presentan una alteración de la sincronización de la fagocitosis de los segmentos externos y no muestran el máximo de fagocitosis después de la exposición a la luz (Nandrot et al., 2004). Por último, en la tercera etapa, se producirá la activación de varios sistemas enzimáticos con la intención de movilizar los elementos citoesqueléticos y otros constituyentes implicados en la inclusión de partículas y su digestión. El receptor de macrófagos CD36 regula la internalización de la porción INTRODUCCIÓN 75 del segmento externo (Ryeom et al., 1996a; Ryeom et al., 1996b; Sparrow et al., 1997; Finnemann y Silverstein, 2001). CD36 interacciona con el receptor TLR4 (Toll-Like Receptor 4) adaptando el metabolismo de las células del RPE para degradar las porciones de segmento externo ingeridas (Kindzelskii et al., 2004). El proceso de ingestión de fagosomas es saturable y dependiente de la temperatura. Además, no todos los fagosomas unidos a la membrana apical serán ingeridos. Después de una fase de ingestión es necesario un periodo de descanso de 2-3 horas antes de volver a introducir más fagosomas (Hall y Abrams, 1987). Una vez introducidos en el citoplasma de las células del RPE los fagosomas comienzan a ser digeridos (Nguyen-Legros y Hicks, 2000). La digestión ocurre mayoritariamente en el polo basal de las células donde los fagosomas se fusionan con los lisosomas generando los fagolisosomas. El proceso normal de digestión es rápido. Así, los segmentos externos de los conos que han sido fagocitados durante la noche son reducidos a cuerpos residuales fluorescentes (lipofuscina), al mismo tiempo que los discos de los bastones son eliminados por la mañana. La progresiva acumulación de lipofuscina en el citoplasma de las células del RPE no limita la capacidad fagocítica de la célula (Finnemann et al., 2002). Sin embargo, el ambiente interno de la célula puede volverse perjudicial, ya que el principal componente de la lipofuscina, A2E, es una molécula altamente tóxica (McBee et al., 2001; Sparrow et al., 2003). Las células del RPE con altas concentraciones de A2E degradan eficientemente las proteínas de los segmentos externos ingeridos, pero presentan grandes problemas para digerir los fosfolípidos (Finnemann et al., 2002). Esto podría deberse a la inhibición selectiva de A2E sobre la fosfolipasa A2 y la fosfolipasa C. Alternativamente, A2E podría retrasar la digestión de los segmentos externos al bloquear selectivamente el transporte de lípidos, impidiendo su entrada en el lisosoma. El retraso en la degradación de los lípidos originaría el depósito de material no digerido en el interior de la célula del RPE, lo que podría contribuir a su degeneración. I.4.5.1. Genes responsables de RP implicados en interacciones celulares I.4.5.1.1. Protooncogen c-MER receptor tirosín kinasa Símbolo: MERTK (OMIM: +604705) Proteína codificada: 19 exones, 999 a.a. Otros alias: MER Función: Fagocitosis de los segmentos externos Región cromosómica: 2q13 Actividad catalítica: ATP+a[P]-L-tyr→ADP+a[P]-L-tyrP Posición: 112372662-112503416 Especificidad de tejido: No expresada en linfocitos B y T Patologías asociadas: arRP Localización subcelular: Membrana [P], Proteína; tyr, Tirosina; tyrP, Tirosina fosfato. INTRODUCCIÓN 76 El análisis de una librería de expresión B-linfoblastoide λgt11 humana, permitió aislar el cDNA que codificaba la tirosín kinasa transmembrana c-mer (Graham et al., 1994). MERTK (c-mer), es expresada en monocitos, tejido epitelial, tejido reproductivo y numerosas líneas neoplásicas de células B y T. El gen MERTK humano, inicialmente localizado en la región cromosómica 2q14.1 (Weier et al., 1999), pertenece a la familia de receptores kinasa MER/AXL/TYRO3 (Graham et al., 1994). Su estructura comprende 19 exones que codifican una proteína de 999 aminoácidos (110 kDa) con varios dominios funcionales: dos Inmunoglobulina tipo C-2, dos Fibronectina tipo III, uno transmembrana y uno tirosín kinasa, el cual contiene la inusual secuencia KWIAIES (Graham et al., 1994; Gal et al., 2000). El RNA que codifica a MERTK puede sufrir splicing alternativo, generando nuevas isoformas de la proteína (Graham et al., 1994). Las 8 isoformas actualmente conocidas de MERTK, presentan gran variación de tamaño y diferente reordenamiento de exones e intrones (UCSC Genome Browser on Human; Mar. 2006 Assembly). MERTK comenzó a ser relacionado con la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, cuando D´Cruz et al. demostraron que era el gen responsable de la distrofia retinal de las ratas RCS (Royal College of Surgeons) (D'Cruz et al., 2000). Exámenes histológicos de la retina de estas ratas revelaron un anormal acúmulo de pequeñas porciones de los segmentos externos entre la capa de fotorreceptores y el RPE, debido a la pérdida de actividad fagocítica del RPE (Dowling y Sidman, 1962; Herron et al., 1969; Bok y Hall, 1971). El hallazgo de mutaciones en el ortólogo humano de MERTK cosegregando con individuos afectados de arRP evidenció la implicación de los defectos de la actividad fagocitaria del RPE en las patologías de la retina (Gal et al., 2000). Desde el primer estudio mutacional de MERTK realizado por Gal et al. han aparecido nuevas mutaciones implicando a este gen como responsable de arRP (McHenry et al., 2004; Tschernutter et al., 2006). Mutaciones en MERTK explican un 1% de los casos de arRP (Hartong et al., 2006). I.4.5.1.2. Homólogo del gen crumbs de Drosophila Símbolo: CRB1 (OMIM: +604210) Proteína codificada: 12 exones, 1406 a.a. Otros alias: P82279 Función: Morfogénesis del receptor Región cromosómica: 1q31.3 Especificidad de tejido: Retina, cerebro, testículo Posición: 195504031-195714208 Localización subcelular: Membrana Patologías asociadas: arRP con PPRPE, arRP, arLCA, adPPCRA Propiedades: Se asocia con MPDZ, MPP4 y MPP5 en la membrana limitante externa RET3C11, un cDNA específico de retina clonado por den Hollander et al. (den Hollander et al., 1999c), codifica una proteína (CRB1) homóloga a la proteína crumbs de Drosophila melanogaster (den Hollander et al., 1999a). La proteína crumbs está implicada en la polaridad apical-basal, las INTRODUCCIÓN 77 interacciones célula-célula y la morfogénesis de los fotorreceptores (den Hollander et al., 1999a; Pellikka et al., 2002); mientras que CRB1 es esencial para la integridad de la membrana limitante externa y la morfogénesis de los fotorreceptores (Mehalow et al., 2003) y el mantenimiento de la polarización (van de Pavert et al., 2004). Además, el hecho de que las retinas con mutaciones en CRB1 estén engrosadas y desestructuradas indica una probable función de CRB1 en el proceso apoptótico del normal desarrollo de la retina (Jacobson et al., 2003). CRB1 fue asignado a la región cromosómica 1q31-q32.1 (den Hollander et al., 1999c), que contenía un locus (RP12) implicado en una forma severa de arRP (van Soest et al., 1994). La colocalización de RP12 y CRB1 promovió la búsqueda de mutaciones causales de RP en ese gen. El análisis de CRB1 reveló la presencia de varias mutaciones cosegregando con esta forma severa de arRP, caracterizada por la preservación del RPE paraarteriolar (PPRPE) (den Hollander et al., 1999a; Bernal et al., 2003b; den Hollander et al., 2004). Estudios posteriores asociaron nuevas mutaciones de CRB1 a arLCA (den Hollander et al., 2001; Lotery et al., 2001a; Bernal et al., 2003b; Hanein et al., 2004), a arRP sin PPRPE (Lotery et al., 2001b; Bernal et al., 2003b), a arRP asociada a vasculopatía exudativa similar a la de Coats (den Hollander et al., 2001; den Hollander et al., 2004), o a atrofia corioretinal paravenosa pigmentaria (PPCRA) autosómica dominante (McKay et al., 2005). Mutaciones en CRB1 representan el 6,5% de los casos de arRP (Daiger et al., 2007). I.4.5.1.3. Usherina Símbolo: USH2A (OMIM: +608400) Proteína codificada: 72 exones, 5202 a.a. Otros alias: USH2 Función: Implicada en visión y audición Región cromosómica: 1q41 Especificidad de tejido: Ampliamente distribuida Posición: 213862859-214663361 Localización subcelular: Membrana Patologías asociadas: arRP, arUSH tipo 2 Propiedades: Interactúa con colágeno IV, fibronectina, USH1C y WHRN El locus del síndrome de Usher tipo II (USH2) se localizó en el tercio distal del brazo largo del cromosoma 1 (Kimberling et al., 1990; Lewis et al., 1990). El hallazgo de una familia afectada por Usher tipo II que no cosegregaba con USH2 propició que este locus fuese renombrado como USH2A. Un posterior refinamiento de la región 1q41 redujo la extensión del locus USH2A a 2,1 cM (Kimberling et al., 1995). Finalmente, tras acotar el intervalo a ~1 cM, Eudy et al. identificaron al gen USH2A (Eudy et al., 1998). La proteína codificada por este gen contiene dominios laminina EGF (Epidermal Growth Factor) y dominios fibronectina tipo III, señalando a usherina como una posible proteína de la matriz extracelular específica de tejido o una molécula de adhesión celular (Eudy et al., 1998). La interacción entre el dominio laminina de usherina y el dominio 7S del colágeno tipo IV es INTRODUCCIÓN 78 esencial para la estabilización de la usherina en la membrana basal (Bhattacharya et al., 2004). Usherina puede encontrarse en un gran número de tejidos, pero sólo se expresará en la membrana basal de las estructuras y capilares del ojo y el oído, del intestino delgado y del colon (Bhattacharya et al., 2002). El normal desarrollo y homeostasis de las membranas basales de la retina y el oído interno dependen de la presencia de usherina. Individuos con Usher tipo II presentan gran afectación de ojo y oído, a pesar de que intestino delgado y colón no muestren aparentes consecuencias. El consiguiente examen del gen USH2A reveló la presencia de tres diferentes mutaciones cosegregando con Usher tipo II (Eudy et al., 1998). Análisis posteriores identificaron nuevas mutaciones en USH2A responsables de Usher tipo II (Weston et al., 2000; Seyedahmadi et al., 2004; van Wijk E. et al., 2004) o de arRP sin pérdida de audición (Rivolta et al., 2000; Rivolta et al., 2002a; Bernal et al., 2003a; Seyedahmadi et al., 2004). Uno de los casos de RP sin pérdida de audición identificado por Rivolta et al. estaba causado por una heterodisomía uniparental paterna con parcial isodisomía del cromosoma 1 (Rivolta et al., 2002a). El individuo en cuestión era homozigoto para la mutación Cys759Phe, a pesar de que su madre no era portadora y su padre era heterozigoto no afecto. Tras descartar una posible hemizigosidad, debida a una deleción materna de la región cromosómica que contiene a USH2A, se procedió al escrutinio de ambas copias del cromosoma 1 del individuo afectado con marcadores microsatélites. Los resultados confirmaron la homozigosidad de los marcadores distales de ambos brazos y la heterozigosidad de los más cercanos al centrómero. La región homozigota (isodisómica) incluía el locus de USH2A, de ahí la presencia en homozigosis del alelo mutado. Mutaciones en USH2A son responsables del 10 % de los casos de arRP (Daiger et al., 2007). I.4.6. Procesado del RNA mensajero La característica presencia de secuencias no codificantes (intrones) dentro del genoma de eucariotas, puede alterar la transcripción de los genes. Por lo tanto, los intrones deben ser eliminados antes de que la célula utilice la información contenida en el gen. Cualquier fallo en el proceso de reconocimiento y eliminación de los intrones (splicing), puede generar un mRNA alterado que acarreará unas desastrosas consecuencias. La precisa excisión de los intrones del pre-mRNA se produce en el espliceosoma, un complejo macromolecular altamente dinámico constituido por cinco pequeños RNAs nucleares (snRNAs) y unas 200 proteínas (Zhou et al., 2002a; Valadkhan, 2007). Cada molécula de snRNA se une a proteínas específicas y constituyen las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs). En mamíferos, el espliceosoma se ensambla de forma secuencial sobre el pre-mRNA mediante la unión de cinco snRNPs: U1, U2, U4/U6, U5 y U4/U6:U5 tri-snRNP (Zhou et al., 2002b). U1 es la primera snRNP en asociarse al pre-mRNA, interactuando con el sitio de splicing de la región 5´. En ese momento, el snRNA de U1 comienza a emparejarse en el extremo 5´ del intrón, comprometiendo al pre-mRNA para su procesado (Figura 36). Posteriormente, la snRNP INTRODUCCIÓN 79 U2 se asocia con la región del punto de bifurcación del intrón para formar un pre-espliceosoma o complejo A. Los snRNAs U4 y U6 muestran una gran complementariedad de secuencia, por lo que se encuentran habitualmente emparejados formando el U4/U6 di-snRNP. A su vez, U4/U6 di-snRNP interactúa con U5 snRNP para formar U4/U6:U5 tri-snRNP, el cual se asociará con el preespliceosoma para formar el complejo B. La formación del espliceosoma con capacidad catalítica o complejo C requerirá una intrincada serie de reordenamientos de las proteínas y el RNA, catalizados por NTPasas RNA-dependientes/RNA helicasas. Tras la finalización de la reacción de splicing, el espliceosoma se disociará y se volverá a reensamblar sobre otros premRNAs para su procesado (Grainger y Beggs, 2005). Existe una serie de factores de splicing asociados a los espliceosomas que están codificados por genes implicados en enfermedades genéticas. Tal es el caso de los factores U4/U6-61K, codificado por PRPF31 (Vithana et al., 2001; Makarova et al., 2002); de U4/U6-90K, codificado por PRPF3 (Chakarova et al., 2002); de U5-220K, codificado por PRPF8 (McKie et al., 2001) y de PAP-1 (Maita et al., 2004b). Mutaciones en estos genes pueden causar defectos en el procesado del pre-mRNA. I.4.6.1. Genes responsables de RP implicados en el procesado de mRNA I.4.6.1.1. Factor 3 de procesado de pre-mRNA Símbolo: PRPF3 (OMIM: *607301) Proteína codificada: 16 exones, 683 a.a. Otros alias: HPRP3 Función: Eliminación de intrones del pre-mRNA Región cromosómica: 1q21.2 Especificidad de tejido: Retina, hígado, riñón y sangre Posición: 148560642-148592294 Localización subcelular: Núcleo Patologías asociadas: adRP Propiedades: Interactúa con PPIH, HPRP3P y PRPF4 El locus RP18, identificado en una familia danesa cosegregando con adRP, fue asignado a la región 1p13-q23 del cromosoma 1 humano (Xu et al., 1996). La búsqueda del gen responsable de RP contenido en este locus, concluyó con el hallazgo de PRPF3 en 1q21.2 (Heng et al., 1998). El gen Figura 36. Ensamblaje del espliceosoma. U1 se une al sitio donador de splicing, mientras que U2 se une a la región que contiene la Adenina (A) localizada a 20-40 nucleótidos del sitio aceptor del splicing. Step 1 y Step 2 indican las dos reacciones de transesterificación implicadas en el splicing del pre-mRNA. Tomada de (Grainger y Beggs, 2005). INTRODUCCIÓN 80 PRPF3 (Precursor RNA Processing Factor 3), codifica una proteína de 90 kDa asociada a la ribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP) U4/U6 (Lauber et al., 1997). PRPF3 es un factor esencial para el splicing del pre-mRNA (Wang et al., 1997). El análisis mutacional del gen PRPF3 en individuos afectados de adRP, reveló la presencia de varias mutaciones (Chakarova et al., 2002). Este hallazgo permitió señalar a los defectos del proceso de splicing como causa de la degeneración de la retina observada en estos individuos. No obstante, Jones et al. ya habían intuido esta posibilidad en 1990, afirmando que el descenso de los niveles de mRNA apreciado en individuos con RP se debía a la muerte de los fotorreceptores o a defectos genéticos que alteran la expresión del mRNA en la retina (Jones et al., 1990). Mutaciones en el gen HPRP3 representan el 1% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a). I.4.6.1.2. Factor 8 de procesado de pre-mRNA Símbolo: PRPF8 (OMIM: *607300) Proteína codificada: 43 exones, 2335 a.a. Otros alias: PRPC8 Función: Eliminación de intrones del pre-mRNA Región cromosómica: 17p13.3 Especificidad de tejido: Ampliamente expresada Posición: 1500673-1534926 Localización subcelular: Núcleo Patologías asociadas: adRP Propiedades: Forma parte del complejo U5 snRNP La comparación de la secuencia del cDNA de PRPF8 con bases de datos de ESTs humanas, permitió reasignar la posición del locus RP13 a la región cromosómica 17p13.3 (Luo et al., 1999). PRPF8 es un factor de splicing altamente conservado asociado al complejo U5 snRNP, el cual forma parte de los espliceosomas mayor y menor. La secuenciación del gen PRPF8 en individuos afectados de RP cosegregando con RP13, permitió reconocer mutaciones responsables de adRP (McKie et al., 2001; Kondo et al., 2003; Martínez-Gimeno et al., 2003). Todas estas mutaciones se encuentran en el último exón de PRPF8. Muchas de ellas afectan a aminoácidos altamente conservados sugiriendo la implicación del extremo C-terminal de PRPF8 en una importante función (Grainger y Beggs, 2005). Mutaciones en PRPF8 explican un 3% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a). INTRODUCCIÓN 81 I.4.6.1.3. Factor 31 de procesado de pre-mRNA Símbolo: PRPF31 (OMIM: *606419) Proteína codificada: 14 exones, 499 a.a. Otros alias: PRP31 Función: Eliminación de intrones del pre-mRNA Región cromosómica: 19q13.42 Especificidad de tejido: Ampliamente expresada Posición: 59310649-59326954 Localización subcelular: Núcleo Patologías asociadas: adRP Propiedades: Une a U4/U6 y U5 snRNP para formar U4/U6·U5 tri-snRNP En algunas familias ligadas al locus RP11, los individuos portadores del gen mutado pueden estar severamente afectados o, por el contrario, no presentar ningún síntoma de RP. La expresividad del gen contenido en este locus estaría regulada por una forma “todo o nada” de penetrancia incompleta denominada expresividad bimodal (Al-Maghtheh et al., 1996). Probablemente, el mecanismo de penetrancia incompleta observado en RP11 este influenciado por el nivel de expresión del alelo salvaje homólogo (McGee et al., 1997; Vithana et al., 2003; Rivolta et al., 2006). Los eventos de recombinación observados en las familias ligadas a RP11 permitieron reducir la extensión del locus a un intervalo de ~6 cM, localizado en la región cromosómica 19q13.4 (McGee et al., 1997). Finalmente, mediante clonación posicional, Vithana et al. identificaron el gen responsable de RP en el locus RP11: PRPF31 (Vithana et al., 2001). Este gen codifica una proteína de 61 kDa necesaria para la formación de U4/U6·U5 tri-snRNP (Makarova et al., 2002). PRPF31 es homólogo al factor de splicing Prp31p de levaduras, el cual también resulta esencial para constituir a U4/U6·U5 tri-snRNP y para el proceso de splicing del pre-mRNA (Weidenhammer et al., 1996; Weidenhammer et al., 1997). El análisis de PRPF31, en busca de variaciones de secuencia patológicas, reflejó diversas mutaciones cosegregando con adRP (Vithana et al., 2001; Martínez-Gimeno et al., 2003; Wang et al., 2003; Xia et al., 2004; Waseem et al., 2007). Recientemente, Mordes et al. han confirmado que PRPF31 es indispensable para el splicing del pre-mRNA de un grupo de genes específicos de los fotorreceptores, entre los que se encuentran RDS y FSCN2 (Mordes et al., 2007). Mutaciones en PRPF31 inhibirán el proceso de splicing, ocasionando la síntesis de proteínas aberrantes que podrían inducir la degeneración del fotorreceptor (Vithana et al., 2001; Makarova et al., 2002) (Mordes et al., 2007). El porcentaje de casos de adRP, relacionados con mutaciones en PRPF31, se sitúa en torno al 8% (Sullivan et al., 2006a; Sullivan et al., 2006b). INTRODUCCIÓN 82 I.4.6.1.4. Proteína RP9 o proteína asociada a la kinasa PIM1 Símbolo: RP9 (OMIM: *607331) Proteína codificada: 6 exones, 221 a.a. Otros alias: PAP-1 Función: Proteína diana de la kinasa PIM1 Región cromosómica: 7p14.3 Especificidad de tejido: Ampliamente distribuida Posición: 33100935-33115527 Localización subcelular: Núcleo Patologías asociadas: adRP Propiedades: Es fosforilada por PIM1 En 1993, Inglehearn et al. describieron un nuevo locus implicado en adRP mediante un análisis de ligamiento en una familia inglesa (Inglehearn et al., 1993). Este locus (RP9) estaba acotado por los marcadores D7S435 –localizado por hibridación in situ en la región 7p13-p15.1– y D7S460. Un posterior análisis de esta región con otros marcadores redefinió la extensión del locus al intervalo de 1,6 - 4 cM delimitado por D7S484 y D7S526 (Inglehearn et al., 1994). La secuenciación de unos de los genes contenidos en este intervalo reveló un cambio nucleotídico en el exón 5 (c.410A>T; H137L en proteína) en todos los individuos afectados de la citada familia inglesa. Además de otro cambio nucleotídico en el exón 6 (c.509A>G; D170G en proteína) en un único individuo afectado de RP (Keen et al., 2002). Estos hallazgos confirmaron a dicho gen como el responsable de RP contenido en el locus RP9. El gen RP9 (PAP-1, PIM-1 Associated Protein) se expresa en diversos tejidos (Keen et al., 2002). En el núcleo de las células, PAP-1 suele estar asociado con factores de splicing como U2AF35 (Maita et al., 2004b) o PRPF3 (Maita et al., 2004a). Al igual que sucede en los componentes del U4/U5·U6 tri-snRNP –PRPF3, PRPF8 y PRPF31–, mutaciones en PAP-1 causan RP. Por lo tanto, es bastante probable que PAP-1 sea una proteína que conecte al U4/U5·U6 tri-snRNP con U2AF35 (Maita et al., 2004b). La mutación D170G provocaría una gran alteración de la actividad de splicing de PAP-1 y un descenso en la proporción de PAP-1 fosforilada (Maita et al., 2004b). PIM1 podría regular la fosforilación de PAP-1. De hecho, el grado de fosforilación de PAP-1 se correlaciona con su actividad de splicing. Por el contrario, la mutación H137L no causaría ningún efecto perjudicial sobre la actividad de splicing de PAP-1. Un estudio realizado sobre 200 familias con adRP, con el fin de conocer las prevalencias de las mutaciones de los genes conocidos, no identificó ninguna mutación patogénica en PAP-1. No obstante, encontraron una variante paráloga de la mutación H137L, es decir, el resultado de una amplificación simultánea de dos secuencias muy similares: la de PAP-1 en 7p14.2 y la de un gen similar a PAP-1 situado a 20 Kb del gen original. Aunque el rediseño de los primers eliminó este artefacto, surgió la duda de si la mutación H137L encontrada por Keen et al. era realmente una mutación. Esto podría ser la explicación de porque H137L no afecta la actividad de splicing de PAP-1. INTRODUCCIÓN 83 I.4.7. Transporte intracelular y citoesqueleto Los fotorreceptores de vertebrados son neuronas polarizadas con dos compartimentos funcionales perfectamente distinguibles: el segmento externo, responsable de la fotosensibilidad, y el interno, en donde tienen lugar la mayor parte de las reacciones metabólicas de la célula. El segmento externo es el resultado de la modificación sufrida por un cilio primario inmóvil con el fin de incrementar su sensibilidad a la luz. Cuanto más especializada está la estructura del cilio en la captación de luz, mayor capacidad tiene el fotorreceptor para recibir información del entorno. En los fotorreceptores maduros, la porción distal del segmento externo está tan modificada que ya no recuerda a un cilio. Sin embargo, una pequeña parte del cilio primario original, denominada cilio conector, permanece prácticamente inalterado y sin ninguna modificación. El cilio conector sería, entonces, el único nexo físico de unión entre los segmentos externo e interno del fotorreceptor y actuaría como un pequeño puente celular entre ambos compartimentos. La estructura normal de los cilios primarios suele presentar diferentes subcompartimentos: el cuerpo basal, la zona de transición, el axonema, la membrana ciliar y la punta del cilio (Fliegauf et al., 2007). Los cuerpos basales –los cuales contienen a los centríolos– actúan como centros organizadores de los microtúbulos del fototorreceptor y a partir de ellos emergen los cilios (Troutt y Burnside, 1988b; Muresan et al., 1993). La formación del cilio comprende la unión específica de proteínas en el área del cuerpo basal, donde se produce el ensamblaje de las subestructuras del axonema. La estructura del cilio conector es similar a la de la zona de transición de los cilios móviles, un pequeño compartimento proximal situado entre el cuerpo basal y el axonema. El axonema del cilio conector está constituido por microtúbulos y posee una estructura 9×2+0, caracterizada por la pérdida del par central de microtúbulos, los brazos de dineína y estructuras accesorias del cilio móvil (Figura 37). En los segmentos externos existen dos sistemas citoesqueléticos de microtúbulos: uno se encuentra en el axonema del cilio conector y otro en las muescas de las múltiples incisuras de los discos de los bastones de algunos vertebrados (Figura 38). Tanto en el axonema como en las incisuras, los microtúbulos están conectados mediante filamentos a las membranas adyacentes del segmento externo (Eckmiller, 2004). El prominente citoesqueleto de microtúbulos está compuesto por tubulinas convencionales, incluyendo a la γ-tubulina del Figura 37. Aparato ciliar de un bastón. (A) Segmento externo (OS) unido al segmento interno (IS) a través del cilio conector (CC). N, núcleo; ST, terminal sináptico. (B) El aparato ciliar está constituido por el axonema (AX) y el complejo cuerpo basal-centríolo, del cual emerge una radícula ciliar (CR) que se proyecta hacia el segmento interno. BB, cuerpo basal; C, centríolo. (C) Cortes transversales del cuerpo ciliar, estructura común de 9×3, y del axonema con su característica estructura de 9×2+0. Tomada de (Schmitt y Wolfrum, 2001). INTRODUCCIÓN 90 2000). Alteraciones de la estructura normal de la proteína RPGRIP1 están relacionadas con LCA (Dryja et al., 2001) y arCORD (Hameed et al., 2003). Por otro lado, PDE6δ es una proteína de unión a prenil implicada en la solubilización de la PDE de la membrana de los discos de los segmentos externos durante la fototransducción (Cook et al., 2001; Zhang et al., 2004). El complejo RPGR-PDEδ podría actuar como un inhibidor de la disociación del nucleótido guanina (GDI, Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor) de la subunidad α de alguna proteína G heterotrimérica (Linari et al., 1999). Este modo de actuación podría compararse con el del complejo Gβγ de la transducina, el cual se comporta como un GDI manteniendo inactivada a la subunidad α. Los dos tipos de actuación de RPGR –como GEF o como GDI– implican su posible interacción con una proteína de unión a GTP todavía no identificada (Linari et al., 1999). Estudios más recientes han mostrado las interacciones entre una isoforma de RPGR (RPGRORF15), RPGRIP1 y la proteína nucleofosmina (NPM) –chaperona que se moviliza entre los nucleolos y el citoplasma– en el cuerpo basal de las células con cilios primarios y los centríolos de células de mamíferos en cultivo (Shu et al., 2005). Del mismo modo, se ha podido reconocer la interacción entre RPGR y una proteína ciliar con dominio IQ, la nefrocistina-5 o IQCB1 (Otto et al., 2005). Las interacciones de RPGRORF15 con proteínas de mantenimiento estructural de los cromosomas localizadas en el axonema del cilio conector –SMC1 o SMC3– y con proteínas involucradas en el transporte mediado por microtúbulos –IFT88, kinesinas y dineinas– implican a esta isoforma de RPGR en la regulación del transporte ciliar (Khanna et al., 2005). Un modelo de ratón deficiente para RPGR permitió comprobar como la ausencia de esta proteína provocaba la distribución ectópica de las opsinas (Hong et al., 2000). Por lo tanto, RPGR estaría implicada en el mantenimiento de la distribución polarizada de proteínas a través del cilio conector, bien facilitando el transporte direccional, bien restringiendo la redistribución de la opsinas desde el segmento externo hacia el interno. Esta esencial función explicaría porque la expresión de la enfermedad esta limitada a la retina, a pesar de la amplia distribución de RPGR por los diferentes tejidos. Todo esto redunda en la localización de RPGR en el cilio conector de los fotorreceptores. Defectos en el gen RPGR pueden inducir –además de RP–pérdida auditiva, sinusitis e infecciones crónicas recurrentes del tracto respiratorio (Iannaccone et al., 2003; Zito et al., 2003; Moore et al., 2006). Dichas manifestaciones clínicas ponen de relieve la función ciliar de RPGR en tejido no retinal. El primer análisis mutacional de RPGR realizado por Meindl et al. reveló la presencia de varias mutaciones responsables de XlRP ligada a RP3 (Meindl et al., 1996). Estudios posteriores definieron nuevas mutaciones en RPGR asociadas a XlRP (Buraczynska et al., 1997; Fujita et al., 1997; Jacobson et al., 1997; Bauer et al., 1998; Fishman et al., 1998a; Fishman et al., 1998b; Dry et al., 1999; Kirschner et al., 1999; Miano et al., 1999; Zito et al., 1999; Sharon et al., 2003b; Demirci et al., 2004; Jin et al., 2005; García-Hoyos et al., 2006; Pelletier et al., 2007; Shu et al., 2007). Los análisis de ligamiento realizados en familias con XlRP demostraron que un 70-75% de las familias cosegregaban con RP3 (Ott et al., 1990; Buraczynska et al., 1997; Miano et al., 1999). Sin INTRODUCCIÓN 91 embargo, las mutaciones encontradas en RPGR no justicaban un número tan elevado de casos. La posibilidad de un nuevo gen responsable de RP en este locus, o la presencia de mutaciones en regiones desconocidas de RPGR, explicaban la discrepancia entre la proporción de familias ligadas a RP3 y las familias que poseían mutaciones en RPGR (Buraczynska et al., 1997). La secuenciación de una región de 172 Kb –conteniendo todo el gen RGPR– permitió reconocer un nuevo exón alternativo terminal (ORF15) en el extremo 3´ (Vervoort et al., 2000). ORF15 contiene al exón 15 y parte del intrón 15, codifica 567 aminoácidos y posee un dominio repetitivo rico en residuos de ácido glutámico y glicina. El análisis de ORF15 reveló la presencia de mutaciones en el 60% de los individuos con XlRP. La elevada proporción de mutaciones encontradas en este exón, en comparación con otras partes del gen, indica que ORF15 es un hot spot mutacional (Vervoort et al., 2000). Numerosos estudios han reflejado mutaciones en ORF15 responsables de XlRP (Vervoort et al., 2000; Yokoyama et al., 2001; Aguirre et al., 2002; Pusch et al., 2002; Bader et al., 2003; Koenekoop et al., 2003; Rebello et al., 2003; Zito et al., 2003; Sharon et al., 2003b; García-Hoyos et al., 2006; Aleman et al., 2007; Pelletier et al., 2007; Shu et al., 2007), de XlCORD (Mears et al., 2000; Demirci et al., 2002; Sharon et al., 2003b; Ebenezer et al., 2005), de XldRP (Rozet et al., 2002), de XlCOD (Yang et al., 2002), de XlRP asociada a vasculopatía exudativa similar a la de Coats (Demirci et al., 2006) o de XlrAMD (Atrophic Macular Degeneration) (Ayyagari et al., 2002). Aunque XlRP suele afectar solamente a hombres, varias mutaciones de RPGR –particularmente en ORF15– pueden causar sintomatología en las mujeres portadoras, simulando un patrón de herencia autosómico dominante con penetrancia incompleta (Mears et al., 2000; Rozet et al., 2002). Mutaciones en el gen RPGR representan un 74,2% de los casos de XLRP (Daiger et al., 2007). Estas mutaciones se encuentran en los exones 1 a 14 y, principalmente, en el exón ORF15 (Vervoort y Wright, 2002). No se han encontrado mutaciones en los exones 16 a 19 –incluyendo los exones alternativos ORF14, 15a, 15b1 y 15b2 por lo que no parecen ser necesarios para la normal función de la proteína en la retina. Esto contrasta con la gran cantidad de mutaciones que posee ORF15, indicando que RPGRORF15 puede ser la isoforma más funcional del gen (Hong y Li, 2002). INTRODUCCIÓN 92 I.4.7.1.3. Proteína RP1 Símbolo: RP1 (OMIM: *603937) Proteína codificada: 4 exones, 2156 a.a. Otros alias: ORP1 Función: Transporte de proteínas Región cromosómica: 8q12.1 Especificidad de tejido: Retina Posición: 55691180-55705947 Localización subcelular: Cilio conector Patologías asociadas: adRP, arRP Propiedades: Primera MAP descrita en fotorreceptores El locus RP1 fue localizado en la región pericentromérica del 8q mediante un análisis de ligamiento en una familia norteamericana con adRP (Blanton et al., 1991). Diferentes grupos de investigación anunciaron, de forma simultánea, la identificación del gen causal contenido en RP1 (Guillonneau et al., 1999; Pierce et al., 1999; Sullivan et al., 1999). La proteína codificada por RP1 presentaba un posible dominio transmembrana, un motivo de cremallera de leucina, una región homóloga con la proteína BIF de Drosophila melanogaster y una región N-terminal con homología a la proteína asociada a microtúbulos (MAP) doblecortina humana (DCX) –involucrada en la migración neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso central– (Pierce et al., 1999). La presencia de RP1 en el cilio conector de bastones y conos sugirió su posible implicación en el transporte de proteínas desde el segmento interno hacia el externo (Liu et al., 2002). Aparte de esta función, RP1 podría estar implicada en la regulación de la dinámica de los microtúbulos, el mantenimiento de la estructura y orientación del cilio conector o el bloqueo de difusión entre ambos segmentos del fotorreceptor. El examen de la retina del modelo murino Rp1-/- evidenció la desorganización de los segmentos externos, la disposición anormal de la rodopsina en los segmentos internos y cuerpos celulares y la progresiva degeneración de los fotorreceptores (Gao et al., 2002). Todo ello compatible con las sugerencias establecidas por Liu et al. (Liu et al., 2002). Otro modelo de ratón, portador en homozigosis de una mutación en Rp1 (Rp1myc/myc), mostró como grupos de 20-40 discos anormalmente largos se disponían de forma paralela u oblicua al eje longitudinal del segmento externo, causando la rápida degeneración del fotorreceptor (Liu et al., 2003). Tal observación implicó a Rp1 en la organización de los discos del segmento externo. Posteriormente, se demostró que RP1 formaba parte del axonema e interactuaba con los microtúbulos a través del dominio DCX, controlando su longitud y estabilidad (Liu et al., 2004). Estas afirmaciones ratificaban que RP1 era la primera MAP identificada en los fotorreceptores. Es posible que RP1 interactúe con miembros de las cascadas de señalización mediadas por JNK (c-Jun Nterminal Kinase) (Liu et al., 2005). En tal caso, se establecería una relación bidireccional en la que RP1 podría ser fosforilada y, por lo tanto, regulada por JNK; al mismo tiempo que poseería una regulación por feedback sobre JNK. Sin embargo, no se conoce el mecanismo por el cual JNK regula a INTRODUCCIÓN 93 RP1 o como mutaciones en RP1 pueden reducir específicamente las vías de señalización mediadas por JNK, originando un anormal patrón de expresión de genes. Tras el cribado mutacional de RP1 realizado por Sullivan et al., Pierce et al. y Guillonneau et al., numerosos autores han detallado toda una serie de nuevas mutaciones de este gen asociadas a adRP (Bowne et al., 1999; Jacobson et al., 2000; Payne et al., 2000; Berson et al., 2001; Dietrich et al., 2002; Kawamura et al., 2004; Gamundi et al., 2006; Roberts et al., 2006) o arRP (Khaliq et al., 2005; Riazuddin et al., 2005). Las mutaciones del gen RP1 representan el 3,5% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a) y <1% de los de arRP (Hartong et al., 2006). I.4.7.1.4. Proteína RP2 Símbolo: RP2(OMIM: +312600) Proteína codificada: 5 exones, 350 a.a. Otros alias: O75695 Función: Estimula la actividad GTPasa de la tubulina Región cromosómica: Xp11.3 Especificidad de tejido: Ubicua Posición: 46581319-46626733 Localización subcelular: Membrana celular Patologías asociadas: XlRP Propiedades: Interactúa con Arl3 unido a GTP En 1996, Thiselton et al. redefinían la extensión del locus RP2 a un intervalo de 5 cM restringido a la región cromosómica Xp11.3-p11.23 (Thiselton et al., 1996). El escrutinio de este intervalo en 26 individuos afectados de XlRP –con el fin de reconocer posibles reordenamientos cromosómicos submicroscópicos– detectó la retrotransposición de un elemento LINE1 completo en uno de los sujetos analizados (Schwahn et al., 1998). Este elemento se insertaba en un intrón de un gen desconocido expresado en retina y otros tejidos analizados. El análisis de este nuevo gen demostró que estaba mutado en seis pacientes con XlRP. Esta evidencia confirmó a dicho gen como el responsable de RP en el locus RP2. La proteína codificada por el gen RP2 muestra un tramo de 39 aminoácidos altamente hidrofílicos, seguidos de un dominio con homología al cofactor C humano (Schwahn et al., 1998). Estudios previos sugieren que el cofactor C es una chaperona que puede asociarse a los microtúbulos, por lo que es considerada como una MAP (Microtubule-Associated Protein) (Tian et al., 1996). Este cofactor está involucrado en el correcto plegamiento de la molécula de β-tubulina y su asociación con la α-tubulina para formar los heterodímeros constitutivos de los microtúbulos. RP2, al igual que el cofactor C, puede estimular la actividad GTPasa de la β-tubulina (GAP-tubulina) en presencia del cofactor D (Bartolini et al., 2002). Sin embargo, la heterodimerización de las subunidades de tubulina es competencia exclusiva del cofactor C. Mientras que Arl2 –ADP ribosylation factor (ARF)-like 3; una pequeña proteína de unión a GTP relacionada con Ras– es responsable de regular la función GAP- INTRODUCCIÓN 94 tubulina ejercida por los cofactores C y D, Arl3 –unida específicamente a RP2– no modula tal función cuando es realizada por RP2 y el cofactor D. La mutación del único residuo de arginina conservado común entre RP2 y cofactor C (R118H en RP2 y R262A en el cofactor C), causa la pérdida de la función GAP-tubulina de ambas moléculas, contribuyendo a la degeneración de la retina. La gran similitud mostrada por RP2 con respecto al cofactor C indica su probable implicación en la biogénesis de tubulina. Además, RP2 contiene sitios putativos de modificación acílica N-terminal mediante miristoilación y palmitoilación (Chapple et al., 2000). La modificación acílica permite la asociación de RP2 con la membrana plasmática de las células de la retina (Grayson et al., 2002). Por el contrario, la distribución del cofactor C se limita al citoplasma y el cilio conector, mientras que Arl3 se localiza en el cilio conector y otras estructuras microtubulares. La asociación entre Arl3 y los microtúbulos, junto con su localización en la membrana plasmática, sugieren que RP2 podría ser un nexo de unión entre la membrana y el citoesqueleto, facilitando el tráfico de membrana o los procesos de señalización celular. Mutaciones en los sitios de acilación –situados entre los 15 primeros aminoácidos Nterminales de RP2– ocasionarían la uniforme distribución citoplasmática de la proteína (Chapple et al., 2000; Schwahn et al., 2001). En células COS-7 y HeLa, las mutaciones en RP2 que causan el truncado del extremo C-terminal (2/3 de las variantes patogénicas) provocan la irregular diseminación de la proteína por el citoplasma (Schwahn et al., 2001). Estas formas truncadas de la proteína serían eliminadas por la célula. La pérdida de la proteína y/o su errónea distribución intracelular podrían ser la base de la degeneración de los fotorreceptores en la mayoría de los casos de RP causados por mutaciones en RP2. RP2 también posee una región con homología al dominio N-terminal de nucleósido difosfato kinasas (NDKs), requeridas para la síntesis de nucleósidos trifosfato (Miano et al., 2001). Además de esta función, este dominio presenta actividad exonucleasa 3´-5´, sugiriendo la posible implicación de RP2 en procesos de reparación de DNA (Yoon et al., 2006). Después del análisis mutacional efectuado por Schwahn et al. en RP2 han sido identificadas nuevas mutaciones relacionadas con XlRP (Hardcastle et al., 1999; Mears et al., 1999; Mashima et al., 2000; Sharon et al., 2000; Thiselton et al., 2000; Wada et al., 2000; De Luca et al., 2001; Miano et al., 2001; Breuer et al., 2002; Bader et al., 2003; Sharon et al., 2003b; Dandekar et al., 2004; Zhang et al., 2006; Pelletier et al., 2007). Las mutaciones halladas en RP2 explican un 15,1% de los casos de XlRP (Daiger et al., 2007). INTRODUCCIÓN 95 I.4.7.1.5. Fascina retinal Símbolo: FSCN2(OMIM: *607643) Proteína codificada: 4 exones, 516 a.a. Otros alias: RFSN Función: Morfogénesis de los discos Región cromosómica: 17q25.3 Especificidad de tejido: Retina Posición: 77110012-77114632 Localización subcelular: Segmentos interno y externo Patologías asociadas: adRP, adMD Propiedades: Posee una variante proteica de 492 a.a. En un intento por encontrar nuevos genes específicos de la retina, Saishin et al. aislaron un cDNA que contenía la secuencia de un nuevo miembro de la familia génica de las fascinas (Saishin et al., 1997). Las fascinas –proteínas agrupadoras de actina– se entrecruzan con la F-actina formando haces enormemente ordenados en el interior de las extensiones celulares dinámicas (p.e: los filopodios de los conos de crecimiento neuronal) (Tubb et al., 2000). Este nuevo gen, parálogo del gen Fascina (FSCN1), se denominó Fascina retinal (FSCN2) por su exclusiva expresión en retina (Saishin et al., 1997; Tubb et al., 2000). Más específicamente, su expresión está limitada a los segmentos interno y externo de los fotorreceptores (Saishin et al., 2000). La localización cromosómica de FSCN2 se determinó mediante FISH, ubicándolo en 17q25 (Tubb et al., 2000). FSCN2 no tiene una función totalmente definida. Sin embargo, la implicación de otras fascinas en la construcción de estructuras intracelulares sugiere que FSCN2 puede estar relacionada con el ensamblaje de filamentos de actina en soporte a la morfogénesis de los discos. Los análisis mutacionales de FSCN2 mostraron que la mutación 208delG está asociada a adRP (Wada et al., 2001) y a adMD (Wada et al., 2003). Mediante la construcción de un modelo murino portador de la mutación 208delG en heterozigosis, se pudo comprobar que la haploinsuficiencia del gen de la FSCN2 transtorna el mantenimiento y/o elongación de los discos del segmento externo, conduciendo a la degeneración del fotorreceptor (Yokokura et al., 2005). También se han encontrado varios polimorfismos responsables de cambios aminoacídicos, pero no cosegregan con ninguna de las dos patologías (Gamundi et al., 2005; Sullivan et al., 2006a). Mutaciones en FSCN2 representan <1% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a). INTRODUCCIÓN 96 I.4.8. Genes responsables de RP con función desconocida En este grupo se han incluido aquellos genes responsables de RP cuya función es desconocida o no está bien definida. I.4.8.1. Inosina 5´ monofosfato deshidrogenasa 1 Símbolo: IMPDH1 (OMIM: *146690) Proteína codificada: 17 exones, 514 a.a. Otros alias: IMPD1 Función: Biosíntesis de nucleótidos guanina Región cromosómica: 7q32.1 Actividad catalítica: IMP+NAD++H2O → XMP+NADH Posición: 127819567-127837272 Especificidad de tejido: Ampliamente expresada Patologías asociadas: adRP, adLCA Propiedades: Homotetrámero IMP, Inosina 5´ monofosfato; XMP, Xantosina 5´ monofosfato El uso de marcadores microsatélite en un análisis de ligamiento de una familia española permitió que Jordan et al. localizasen un nuevo locus para adRP (RP10) en 7q31-q35 (Jordan et al., 1993). La combinación de estos resultados con los de otro análisis de ligamiento de una familia americana ligada a RP10, consiguió disminuir la extensión inicial del locus a un intervalo de ~5 cM (McGuire et al., 1996). El análisis de una tercera familia con adRP redujo el tamaño de la región crítica a 1 cM, un intervalo físico de ~1,7 Mb. Un análisis comparativo de la expresión de ~6000 genes –mediante microarrays– en retinas de ratones salvajes y retinas de ratones a los que se le había delecionado el gen de la rodopsina (Rho-/-), reveló una serie de tránscritos cuyos niveles estaban reducidos en las retinas de los ratones Rho-/- (Kennan et al., 2002). El homólogo humano de uno de estos genes codificaba la Inosina 5´ monofosfato deshidrogenasa tipo I humana (IMPDH1), un enzima esencial en la síntesis de ribonucleótidos de guanina. IMPDH1, previamente asignado a la región cromosómica 7q31.3-q32 (Gu et al., 1994), se localizaba dentro del locus RP10. El análisis mutacional de IMPDH1 en la citada familia española reflejó la presencia de una mutación en el exón 7 (Arg224Pro) cosegregando con adRP (Kennan et al., 2002). En otro estudio, se comparó la expresión de genes en retinas de ratones normales con retinas de ratones knockout para crx (crx-/-) (Bowne et al., 2002). Los datos obtenidos mostraron como la expresión de uno de los tránscritos (IMPDH1) estaba disminuida 6 veces con respecto a los niveles normales. La secuenciación de IMPDH1 reflejó una mutación en el exón 7 (Asp226Asn) presente en todos los individuos afectados de tres familias no relacionadas con adRP ligada a RP10 y en ninguno de los controles. Inicialmente, se consideró que el mal plegamiento y la agregación de la proteína IMPDH1 mutada –más que por su reducida actividad enzimática– eran responsables del severo fenotipo INTRODUCCIÓN 97 patológico apreciado en los individuos afectados (Aherne et al., 2004). Sin embargo, Mortimer et al. demostraron que las mencionadas mutaciones no tenían efectos sobre la actividad enzimática, la estabilidad de la proteína o su agregación (Mortimer y Hedstrom, 2005). Aunque si encontraron que disminuían la afinidad de la unión con ácidos nucleicos y la capacidad de asociación con el RNA. Tal observación indicaba que las mutaciones alteraban al subdominio con función no definida de la proteína IMPDH1 (McLean et al., 2004). Aunque IMPDH1 se expresa en muchos tejidos, los altos niveles de isoformas específicas de esta proteína en los fotorreceptores sugieren que la degeneración de la retina es secundaria a la pérdida de función de una o más de estas isoformas (Bowne et al., 2006a). Sin embargo, la mutación responsable de la alterada función de las isoformas no tiene porque afectar a la actividad enzimática de la forma canónica de IMPDH1, mucho menos expresada en retina. Posteriores estudios detallaron nuevas mutaciones de IMPDH1 cosegregando con adRP (Grover et al., 2004; Wada et al., 2005) o adLCA (Bowne et al., 2006b). Mutaciones en IMPDH1 explican el 2,5% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a) y ~1% de los de adLCA (Daiger et al., 2007). I.4.8.2. Anhidrasa carbónica IV Símbolo: CA4 (OMIM: *114760) Proteína codificada: 8 exones, 312 a.a. Otros alias: CA IV Función: Hidratación reversible del dióxido de carbono Región cromosómica: 17q23.1 Actividad catalítica: CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+ Posición: 55582131-55591686 Especificidad de tejido: Endotelio de los coriocapilares Patologías asociadas: adRP Localización subcelular: Membrana celular En 1997, Bardien et al. redefinieron la localización del locus RP17 a 17q22 (Bardien et al., 1997). El análisis de ligamiento realizado en dos familias sudafricanas con adRP situó a RP17 en un intervalo de 10 cM definido por los marcadores D17S1607 y D17S1874. Posteriormente, mediante un análisis de ligamiento en una familia danesa con adRP, den Hollander et al. recortaron la extensión de este locus a un intervalo de 7,7 cM delimitado por D17S1607 y D17S948 (den Hollander et al., 1999b). No obstante, Bardien-Kruger et al. volverían a rebajar la extensión de RP17 gracias a los datos obtenidos del análisis de ligamiento de dos nuevas familias, acotando una región de 1 cM comprendida entre D17S1604 y D17S948 (Bardien-Kruger et al., 1999). La secuenciación de genes candidatos de esta región reveló que uno de ellos –CA4– contenía una mutación que causaba un cambio aminoacídico en el codón 14 (R14W) (Rebello et al., 2004). Esta mutación cosegregaba con el fenotipo patológico en dos familias con adRP y no se encontró en ninguno de los controles, confirmando que CA4 era el gen responsable de RP contenido en RP17. INTRODUCCIÓN 98 CA4 codifica un enzima que se ancla a la membrana plasmática a través de glicosilfosfatidilinositol (Waheed et al., 1992). CA4 se expresa en la superficie luminal de los capilares pulmonares y de los túbulos renales proximales (Brown et al., 1990; Zhu y Sly, 1990). También tiene una elevada expresión en los coriocapilares, pero no es detectable en neuroretina (Hageman et al., 1991). Rebello et al. han propuesto que la mutación R14W provoca la acumulación de formas no plegadas de la proteína en el retículo endoplasmático (ER) de las células endoteliales de los coriocapilares (Rebello et al., 2004). Esto ocasionará el stress del ER, el cual inducirá la respuesta de proteínas no plegadas (UPR, Unfolded Protein Response) por parte de la célula. El stress crónico al que está sometido el ER causará la apoptosis de las células endoteliales, generando la isquemia de la retina y su consiguiente degeneración. Experimentos realizados en células COS-7 transfectadas con el alelo mutado R14W de CA4, han demostrado que el uso de ciertos inhibidores de la anhidrasa carbónica promueve el plegamiento de la proteína mutada y reduce los efectos apoptóticos ocasionados por la mutación (Bonapace et al., 2004). Por otro lado, mutaciones en CA4 pueden causar la alteración de la regulación del pH efectuada por el complejo CA4/NCB1, induciendo la degeneración del fotorreceptor (Yang et al., 2005). El mantenimiento del pH en el interior del fotorreceptor es vital para la fototransducción. Sin embargo, estas células contienen una alta carga ácida (ácido láctico, CO2, HCO3o H+) resultado de su elevada tasa metabólica. La eliminación de estos ácidos de la retina y el RPE por el flujo sanguíneo de los coriocapilares previene el descenso de pH en el interior del fotorreceptor. En la membrana de las células endoteliales de los coriocapilares, CA4 se acopla funcionalmente con NCB1 (Na+/Bicarbonate Co-Transporter 1) formando un complejo que produce HCO3para el transporte a través de la membrana y, a su vez, consume HCO3que le llega a través de la membrana. NCB1 sería el encargado del transporte de HCO3-, mientras que CA4 sería la responsable de la actividad catalítica del complejo. Las mutaciones de CA4 representan <1% de los casos de adRP (Sullivan et al., 2006a). I.4.8.3. Proteína similar a ceramida kinasa Símbolo: CERKL (OMIM: *608381) Proteína codificada: 13 exones, 532 a.a. Otros alias: Q49MI3-2 Función: Desconocida Región cromosómica: 2q31.3 Especificidad de tejido: Retina, cerebro, hígado, riñón … Posición: 182109650-182229996 Localización subcelular: Citoplasma, Núcleo, Nucleolo Patologías asociadas: arRP Propiedades: No fosforila a la ceramida Mediante análisis de cosegregación y mapeo de homozigosidad con marcadores microsatélites y SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), Tusón et al. consiguieron reducir la extensión inicial del locus RP26 (2q31.2-q32.3) de 17,4 Mb hasta 2,5 Mb (Tusón et al., 2004). Ninguno de los 5 genes INTRODUCCIÓN 99 descritos o los 4 mRNAs parcialmente caracterizados contenidos en este intervalo mostraba variantes patogénicas en su secuencia. Sin embargo, la búsqueda exhaustiva en las bases de datos para localizar cDNAs no caracterizados o ESTs dentro en esta región, concluyó con el hallazgo de dos secuencias relacionadas: una EST y un cDNA incompleto de ojo/retinoblastoma. La proteína supuestamente codificada por estas dos secuencias mostraba homología con las ceramidas de eucariotas, la esfingosina y las diacilglicerol kinasas, sugiriendo que ambas secuencias correspondían a un gen no descrito hasta el momento. Esta proteína mostraba su mayor homología con la ceramida kinasa humana (CERK) (Sugiura et al., 2002), por lo que el gen fue denominado CERKL (Ceramide KinaseLike). La secuenciación de CERKL en los miembros de la familia donde se había descrito el locus RP26 reflejó una mutación en el exón 5 (R257X), la cual truncaba el dominio catalítico de la proteína (Tusón et al., 2004). R257X se encontró en homozigosis en todos los individuos afectados de esta familia y en ninguno de los 170 controles. Esta observación confirmó que CERKL era el gen responsable de RP contenido en el locus RP26. En humanos, CERKL se expresa en varios tejidos y entre ellos la retina (Tusón et al., 2004). Mediante hibridación in situ en cortes de retina de ratón adulto, se comprobó que la expresión predominante de Cerkl se localiza en la capa de células ganglionares. Sin embargo, también se detecta una débil señal en la capa nuclear interna y la de fotorreceptores. Las ceramida kinasas convierten el metabolito esfingolipídico ceramida en ceramida 1-fosfato (Sugiura et al., 2002). Mientras que ceramida induce la apoptosis, ceramida 1-fosfato actúa como un citoprotector (Frago et al., 2003). Por lo tanto, la deficiencia de CERKL podría variar los niveles de metabolitos esfingolipídicos e incrementar la sensibilidad del fotorreceptor y otras células de la retina hacia el estímulo apoptótico (Tusón et al., 2004). El aumento de susceptibilidad hacia la apoptosis conduciría a la progresiva depleción de los fotorreceptores y, finalmente, a la ceguera. Sin embargo, el mecanismo por el cual CERKL conduce a la degeneración de los fotorreceptores es muy discutido. Bornancin et al. han propuesto que la causa de la RP en individuos portadores de la mutación R257X en CERKL se debe a la acumulación de la proteína truncada en el núcleo (Bornancin et al., 2005). Según estos autores, CERKL es una proteína que ejerce su actividad enzimática en el nucleolo. Mutaciones en CERKL podrían impedir su salida del núcleo, imposibilitando su normal función. Posteriormente, German et al. han afirmado que la ceramida es un mediador de la apoptosis en los fotorreceptores (German et al., 2006). En estas células, el stress oxidativo incrementaría los niveles ceramida endógena al estimular la vía de biosíntesis de novo, aumentando la señal para entrar en apoptosis. El ácido docosahexanoico (DHA, el más abundante ácido graso poliinsaturado de la retina) protegería al fotorreceptor del stress oxidativo y del daño inducido por la ceramida, incrementando la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y glicosilando a la ceramida para prevenir su acumulación. Recientemente, Inagaki et al. han identificado una señal de localización nuclear (NLS, Nuclear Localization Signal) en la forma mutada de CERKL R257X (Inagaki et al., 2006). La forma no mutada de CERKL se localiza en el núcleo y el INTRODUCCIÓN 106 La identificación del locus RP32 fue resultado de un análisis de ligamiento realizado con marcadores microsatélites en una familia pakistaní afectada por una severa forma de arRP (Zhang et al., 2005). Este locus abarca una región de 10,5 cM del brazo corto del cromosoma 1, situada a 7,1 Mb de ABCA4. La secuenciación de 5 genes candidatos –OLFM3, GNAI3, LOC126987, FLJ25070 y DKFZp586g0123– y 6 ESTs contenidos en este locus no reveló la presencia de mutaciones causales. I.4.9.9. RP33 (OMIM: %610359) Región cromosómica: 2cen-q12.1 Delimitado por: D2S2159 y D2S1343 Extensión: ~9,43 Mb Modo de herencia: Autosómico dominante El locus RP33 –hoy en día el único asociado a adRP sin gen causal identificado– fue identificado a través de un análisis de ligamiento de todo el genoma en una familia china (Zhao et al., 2006). Este locus se localiza en una región de 4,8 cM del brazo largo del cromosoma 2, situada en las cercanías del gen MERTK responsable de arRP. El análisis mutacional de los genes SEMA4C, CNGA3 y HNKIST contenidos en RP33 no reflejó ninguna variante de secuencia patogénica asociada a RP. I.4.9.10. RP34 (OMIM: %300605) Región cromosómica: Xq28-qter Delimitado por: DXS8061 y DXS1108 Extensión: ~2,74 Mb Modo de herencia: Ligado al cromosoma X El genotipado y posterior análisis de ligamiento con marcadores microsatélite en una familia afectada de XlRP permitió la identificación de un nuevo locus de XlRP (Melamud et al., 2006). El locus RP34 –localizado en la región subtelomérica del brazo largo del cromosoma X– alberga a más de 100 genes. La secuenciación de dos genes candidatos –CNGA2 y MPP1– no reveló ninguna mutación patogénica, permitiendo su exclusión como genes causales de RP en este locus. II. OBJETIVOS OBJETIVOS 109 II.1. Identificar el gen responsable de Retinitis Pigmentaria en las familias 68 y R con el fin de profundizar en las bases moleculares de dicha patología II.1.1. Descartar los genes y loci de RP conocidos II.1.2. Delimitar una región candidata II.1.3. Examinar los genes en la región candidata II.1.4. Determinar la mutación causal II.2. Evaluar la utilización de tecnología de genotipado high-throughtput en el diagnóstico genético de Retinitis Pigmentaria. II.2.1. Buscar regiones candidatas en todo el genoma II.2.2. Identificar el gen responsable de RP 110 III. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 113 III.1. Familias del estudio Las familias afectadas fueron recogidas a mediados de los años 90 (Blanco, 1998). Como fuente de búsqueda de estas familias se consultaron el Archivo de Historias Clínicas del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago y la lista de afiliados a la AGARP (Asociación Gallega de afectados por Retinosis Pigmentaria). Todos los individuos afectados cumplimentaron una encuesta epidemiológica que recogía información acerca de la sintomatología y edad de instauración de la patología, de la posible existencia de consanguinidad y de los antecedentes de RP en su familia. Esto sirvió como filtro para seleccionar los parientes de cada individuo afectado que debían ser explorados clínica y electrofisiológicamente para descartar afectación subclínica. Con ello, se consiguió la suficiente información para construir el árbol genealógico y establecer el patrón de herencia de la RP en cada familia. III.1.1. Construcción de árboles genealógicos La representación gráfica de los pedigríes se efectuó con el software GenoPro® 2007 v2.00 (GenoPro Inc., Montreal, Canadá), utilizando las normas convencionales de simbología: cuadrados para hombres y círculos para mujeres, individuos fallecidos representados con una línea diagonal superpuesta al símbolo del género e individuos afectados con el símbolo de género en fondo negro. La nomenclatura de cada individuo también se basó en las normas convencionales: numeración romana ascendiente en relación con el orden de aparición de las generaciones y numeración arábiga creciente de izquierda a derecha para los distintos individuos de cada generación. Las uniones consanguíneas se representaron con una doble línea entre ambos progenitores, mientras que las no consanguíneas presentaban una única línea. III.1.2. Familia 68 Esta pequeña familia originaria de la costa occidental gallega presenta tres varones afectados de RP. Dos de ellos son hermanos e hijos de una pareja no afectada. La madre de estos dos individuos era hija de otro individuo afectado, por lo que se deduce que era una portadora asintomática de RP. Los datos anteriores avalan un modo de herencia mendeliana de RP en esta familia, compatible con un patrón de herencia ligado al cromosoma X (Figura 40). Al inicio de esta tarea investigadora, no se conocía la existencia de ningún otro familiar afectado de RP. MATERIAL Y MÉTODOS 114 La segunda entrevista con los miembros de esta familia aportó nueva información sobre el individuo I.1. Este varón falleció a una edad anciana presentando graves alteraciones visuales que, desde hacía ya bastantes años, solamente le permitían apreciar sombras. No existía ningún informe clínico que confirmase el diagnóstico de RP en este individuo, situación bastante comprensible al estar hablando de una persona nacida a finales del siglo XIX que vivió siempre en el medio rural. Ninguno de los miembros entrevistados recordaba la existencia de parentesco consanguíneo entre los individuos de la segunda generación. El primer hijo varón (III.1) falleció a la edad de 40 años sin presentar síntomas aparentes de la patología. De los cuatro hermanos supervivientes, solamente dos presentan un patrón clínico acorde con la sintomatología típica de la RP. Los dos afectados, de 63 (III.3) y 61 años (III.5), poseen informes oftalmológicos en los cuales son diagnosticados de RP. El mayor (III.3) solamente muestra –desde los 50 años– dificultad para adaptar la visión en condiciones de poca luz, como el amanecer o el anochecer. El otro individuo (III.5) presenta un glaucoma bilateral con elevada tensión ocular que le ha ocasionado, junto con la RP, la ceguera total desde los 57 años. Tabla 1. Hallazgos clínicos de varones afectos y mujeres portadoras de la familia 68 Individuo Edad inicio Ojo Refracción Agudeza Visual Hallazgos oftalmoscópicos Campo visual D +1,25 +1,25x90 1 RP típica Reducción concéntrica III.3 35 (CN) I +1 +1x85 1 RP típica Reducción concéntrica D -1,25 -0,75x180 0,1 RP típica Reducción concéntrica III.5 20 (CN) I -1 -0,5x170 PL RP típica Reducción concéntrica D Plano 1 Normal Normal III.9 — I Plano 1 Normal Normal D Plano 1 Normal Normal IV.5 — I Plano 1 Normal Normal D Plano 1 Normal Normal IV.6 — I Plano 1 Normal Normal D -11,75 -0,5x180 0,7 Fondo miópico Anormal IV.7 — I -14,75 -0,5x180 0,6 Fondo miópico Anormal D, derecho; I, izquierdo; CN, ceguera nocturna; PL, Percibe luz. Tomada de (Blanco, 1998). Figura 40: Pedigree Familia 68. III.3 y III.5 están diagnosticados clínicamente de RP. A través de la entrevista familiar se deduce que I.1 padecía RP, pero no existe ningún informe clínico concluyente. I II III IV 1 ? 2 21 1 3 5 7 92 1234 4 5678 6 910 11 12 8 13 14 MATERIAL Y MÉTODOS 115 III.1.3. Familia R Originaria del interior de Galicia, esta familia presenta consanguinidad debido a una unión entre primos hermanos aparentemente sanos. Tres de los 9 hijos de esta unión, un varón y dos mujeres, presentan un cuadro clínico de RP. En los tres es evidente una gran alteración de la visión, tanto periférica como central, que disminuye su calidad de vida de forma patente, necesitando ayuda para la práctica totalidad de las actividades cotidianas. Las edades de los individuos afectados se sitúan en un rango que comprende la cuarta y quinta década de vida. Considerando la consanguinidad de la familia, la aparente ausencia de enfermedad de los progenitores y la presencia de afectados de ambos sexos, se deduce que el modo de herencia mendeliano de la enfermedad en esta familia se corresponde con un patrón de herencia autosómica recesiva (Figura 41). Al contrario de lo que ocurre en la familia 68, en esta familia la instauración de la enfermedad es temprana y la clínica es mucho más agresiva. III.2. Extracción de ácidos nucleicos El material biológico utilizado como punto de inicio para la gran mayoría de las pruebas realizadas en esta tesis fue el DNA genómico. El RNA se extrajo para sintetizar el cDNA empleado en el análisis del efecto de la mutación IVS16+1G>T en la proteína MERTK. III.2.1. Recogida de las muestras Las muestras de la mayoría de los individuos seleccionados para este estudio fueron recogidas a mediados de los años 90. Tras consentimiento informado, se les extrajo 10 mL de sangre periférica mediante punción venosa. La sangre obtenida se separó en alícuotas de 700 μL y se congeló a -80ºC. Figura 41: Pedigree Familia R. La consanguinidad en esta familia es debida a una unión entre dos primos hermanos en la primera generación. PRIMOS HERMANOS 1 2 21 123 3 54 4 5 6 87 6 910 7 1211 8 9 1413 10 11 15 I II III MATERIAL Y MÉTODOS 122 III.3.1.1. Parámetros de selección de los STRs La información necesaria para seleccionar los STRs se extrajo de el UCSC Genome Browser on Human; May 2004 Assembly (http://genome.ucsc.edu/). Los parámetros de selección de los STRs que constituyeron este estudio fueron: 1.- Su localización en el cromosoma. En todos los loci o genes analizados la primera aproximación empleaba dos STRs, flanqueando sus extremos 5´ y 3´, junto con un tercer STR interno situado, preferentemente, dentro de una región codificante. 2.- Excepto en aquellos casos puntuales en los que los STRs seleccionados habían sido empleados en estudios previos, y que podían ser marcadores de mapas de híbridos de radiación, el resto de los STRs escogidos debían cumplir la condición de ser marcadores de mapas genéticos. 3.- La heterozigosidad de los STRs fue un factor clave para su selección. Siempre que las condiciones lo permitiesen, se escogían los STRs que presentaban la heterozigosidad más alta para asegurar la mayor informatividad de estos marcadores en las familias analizadas. 4.- Tamaño del monómero de repetición. Debido a que la discriminación de los diferentes alelos en geles de acrilamida era más evidente cuando se utilizaban STRs tetraméricos, se decidió escoger, como primera opción, los STRs con mayor tamaño del monómero de repetición. III.3.1.2. Primera fase: exclusión de los loci y genes conocidos Hasta el momento solo se han descrito 6 loci del cromosoma X relacionados con RP. De ellos, solamente se han podido identificar dos genes causales. Los loci descartados en este estudio han sido: III.3.1.2.1. Locus RP2 Xp11.3 El gen identificado en este locus como responsable de RP es el RP2 (Schwahn et al., 1998). Los STRs empleados en estudios previos para descartar este gen como responsable de RP en la familia 68 fueron MAOA, MAOB y DXS6849 (Blanco, 1998). En el presente estudio los STRs seleccionados para poder excluir este gen fueron el DXS1055, DXS1003, GATA160B08 y DXS6849 (Esquema 1). Esquema 1. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP2. En azul, marcadores utilizados en estudios previos; en rojo, marcadores utilizados en este estudio; en azul-rojo marcadores utilizados en ambos estudios. 43 44 45 46 47 48 49 MAOA DXS1003 GATA160B08 MAOB DXS6849 DXS1055 RP MATERIAL Y MÉTODOS 123 III.3.1.2.2. Locus RP3 Xp11.4 El gen identificado en este locus como responsable de RP es el RPGR (Meindl et al., 1996). Los STRs empleados en estudios previos para descartar este gen como responsable de RP en la familia 68 fueron el M6, CYBB, DXS1110, DXS6679, DXS1068 y DXS1058 (Blanco, 1998). En el presente estudio los STRs seleccionados para poder excluir este gen fueron el DXS8090, DXS1110, DXS6679 y DXS1069 (Esquema 2). III.3.1.2.3. Locus RP6 Xp21.3-p21.2 Hasta el momento, no se ha identificado el gen responsable de RP en este locus. Los marcadores empleados en estudios previos para delimitar este locus fueron el DXS28 y DXS164 pERT87 (Ott et al., 1990). En el presente estudio los STRs seleccionados para poder excluir este locus fueron el DXS7106, DXS9896, DXS1214, DXS9907 y DXS1049 (Esquema 3). Esquema 2. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP3. DXS8090 34 35 36 37 38 39 40 CYBB DXS1110 DXS6679 M6 DXS1068 DXS1058 DXS1069 RPG NUEVO MARCADOR ANTIGUO MARCADOR Esquema 3. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP6. DXS164 p ERT87 DXS28 28 29 30 31 32 33 34 DXS1049 27 35 DXS9907 DXS1214 DXS9896 DXS7106 NUEVO MARCADOR ANTIGUO MARCADOR MATERIAL Y MÉTODOS 124 III.3.1.2.4. Locus RP23 Xp22.31-p22.13 Hasta el momento, no se ha identificado el gen responsable de RP en este locus. Los STRs empleados en estudios previos para delimitar este locus fueron el DXS1223, DXS7103, DXS1224, DXS999 y DXS7161 (Hardcastle et al., 2000). En el presente estudio los STRs seleccionados para poder excluir este locus fueron el DXS1223, DXS7103, DXS1224, DXS9902, DXS1195 y DXS7163 (alias de DXS7161) (Esquema 4). III.3.1.2.5. Locus RP24 Xq26.3-q27.3 Hasta el momento, no se ha identificado el gen responsable de RP en este locus. Los STRs empleados en estudios previos para delimitar este locus fueron el DXS8094, DXS1211, DXS1192, DXS8013, DXS1205, DXS8106, DXS8084 y DXS8043 (Gieser et al., 1998). En el presente estudio los STRs seleccionados para poder excluir este locus fueron el DXS8094, DXS1192, DXS1205, DXS9908 y DXS8043 (Esquema 5). Esquema 5. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP24. DXS9908 DXS1192 DXS8094 DXS8043 DXS1211 DXS8013 DXS1205 DXS8106 DXS8084 13 13 13 13 13 14 14 14 14 141313 NUEVO MARCADOR ANTIGUO MARCADOR Esquema 4. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP23. DXS7161 DXS999 DXS1224 DXS7103 DXS1223 8 1111129 11111 7 DXS9902 DXS1195 NUEVO MARCADOR ANTIGUO MARCADOR MATERIAL Y MÉTODOS 125 III.3.1.2.6. Locus RP34 Xq28 Hasta el momento, no se ha identificado el gen responsable de RP en este locus. Los STRs empleados en estudios previos para delimitar este locus fueron el DXS8061, DXS1073 y DXS1108 (Melamud et al., 2006). En el presente estudio, los STRs seleccionados para poder excluir este locus fueron el DXS8061, DXS1073 y DXS1108 (Esquema 6). III.3.1.3. Segunda fase: Selección de STRs para acotamiento fino del locus RP24 En un segundo paso, el locus RP24 fue sometido a un análisis más exhaustivo. Para ello fueron seleccionados nuevos marcadores dentro la región delimitada por DXS8094 y DXS8043. Se intentó mantener entre ellos una distancia no superior a 1 Mb. Los STRs escogidos fueron DXS1041, DXS1062, DXS1211, DXS1232, DXS984, DXS1227, DXS8106, DXS8084 y DXS8073. III.3.1.4. Tercera fase: Selección de STRs para análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo largo del cromosoma X Esta fase se subdividió en cuatro etapas para facilitar el análisis y descarte de las regiones del brazo largo del cromosoma X que pudiesen contener un locus responsable de RP en la familia 68. En Esquema 6. Localización de los marcadores utilizados para el análisis del locus RP34. DXS8061 DXS1108 DXS1073 149 150 151 152 153 154 155 NUEVO MARCADOR ANTIGUO MARCADOR Esquema 7. Localización de los marcadores utilizados para el acotamiento fino del locus RP24. En verde, marcadores utilizados en el p rimer análisis; en naran j a , marcadores utilizados en el se g undo análisis. DXS1041 DXS1232 DXS9908 DXS1192 DXS8094 DXS8043 DXS1211 DXS1205 DXS8106 DXS8084 13 13 13 13 13 14 14 14 14 141313 DXS1062 DXS984 DXS1227 DXS8073 MATERIAL Y MÉTODOS 126 todas las etapas los STRs fueron seleccionados manteniendo la premisa de estar separados entre si a ~ 5 cM. III.3.1.4.1. Etapa I: análisis de la región subtelomérica del brazo largo Xq27.3-q28 Los STRs seleccionados para el cribado de la citada región cromosómica constituyeron un grupo denominado “STS Markers terminales” que comprendía a: DXS8045, DXS8091, DXS8069 y DXS1073. III.3.1.4.2. Etapa II: análisis de la región comprendida entre el centrómero y el locus RP24 Xq12-q25 Analizó la amplia región cromosómica existente entre el centrómero y el locus RP24. Al grupo de STRs seleccionados se les denominó “GATAs Xq” (la gran mayoría eran tetraméricos), el cual estaba formado por: DXS8380, DXS6800, DXS6793, DXS6803, DXS6801, DXS6789, DXS7126, DXS6797, GATA165B12 y DXS9909. III.3.1.4.3. Etapa III: análisis de la región Centrómero-RP24 ampliada en ambos extremos Xq11.1-q25 La región analizada amplió ligeramente, en ambos extremos, los límites de la analizada en la etapa anterior. En la selección de los STRs para analizar esta región primó su posición intercalada con respecto a los de grupo GATAs Xq. Este nuevo grupo de STRs se denominó “STSs Xq I” e incluía a: DXS8029, DXS986, DXS1217, DXS8077, DXS1106, DXS8088, DXS8064, DXS1001 y DXS8009 III.3.1.4.4. Etapa IV: análisis de la región Centrómero-RP24 reampliada en su extremo 3´ Xq12-q25 Con los STRs elegidos en esta etapa, se logró ampliar la región analizada en etapas previas hacia el extremo 3´. Al igual que en la etapa anterior, los nuevos STRs tenían posiciones intercaladas con respecto a todos los seleccionados hasta ahora. Este nuevo grupo se denominó STSs Xq II e incluyó a: DXS1213, DXS1275, DXS8101, DXS1221, DXS1002, DXS1196, DXS1203, DXS990, DXS8063, DXS8096, DXS1059, DXS1220, DXS8067, DXS8059, DXS8057 y DXS1047. MATERIAL Y MÉTODOS 127 III.3.1.5. Cuarta fase: Selección de STRs para análisis de las regiones susceptibles de albergar un locus responsable de RP en el brazo corto del cromosoma X Xp22.33-p11.21 Las regiones situadas entre los loci descartados del brazo corto del cromosoma X fueron examinadas mediante una serie de STRs denominada “STSs Xp” que contenía a: DXS7099, DXS7100, DXS1060, DXS996, DXS7593, DXS1226, DXS989, DXS1061, DXS1068, DXS8042, DXS993, DXS8080, DXS8083, DXS1039, DXS8023, DXS988 y DXS991. III.3.1.6. Quinta fase: análisis de 10 STRs del cromosoma X con un décaplex del IPATIMUP (Instituto de Inmunología y Patología Molecular de la Universidad de Oporto) Haciendo uso de la experiencia de esta institución en el análisis de STRs altamente informativos del cromosoma X, se procedió al estudio de la familia 68 con una batería de STRs previamente seleccionados que formaban parte de un “décaplex” de análisis del cromosoma X. Para diferenciarlos del resto de STRs seleccionados en etapas anteriores, se decidió imponer la nomenclatura de “Pt” a todos los analizados por el IPATIMUP. Estos 10 STRs eran: DXS8378, DXS7132, DXS9898, DXS6809, DXS101, GATA172D05, HPRTB, DXS8377, DXS7423 y DXS10011. III.3.2. Análisis de polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) Los SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) son variaciones de secuencia de un único nucleótido mucho más frecuentes a lo largo del genoma (~1 cada 290 pb) que los STRs (Kruglyak y Nickerson, 2001). Sin embargo, se estima que su informatividad es entre 2 y 3 veces menor que la de un STR (Kruglyak, 1997). De las diferentes fuentes de variación genética entre individuos, los SNPs destacan por ser el tipo más común de las variaciones de secuencia, ser abundantes en el genoma, ser estables y no mutar con facilidad y poseer relativa facilidad de genotipado. III.3.2.1. Parámetros de selección de SNPs Los datos necesarios para la recolección de los SNPs fueron obtenidos a partir de SNPBrowser v3.5 (Applied Biosystems), UCSC Genome Browser on Human; May 2004 Assembly (http://genome.ucsc.edu/) y dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). La selección de los SNPs para completar las regiones no analizadas por los STRs se basó en las siguientes premisas: MATERIAL Y MÉTODOS 128 1.- Su localización en el cromosoma. Los SNPs seleccionados se situaban en regiones donde no había opción de escoger un nuevo STR o en regiones en las que se quería hacer un acotamiento más fino. Se emplearon SNPs con una separación entre ellos de 300 Kb a 1 Mb y no pertenecientes al mismo bloque haplotípico dentro de la población estudiada. 2.- La heterozigosidad de los SNPs. Se seleccionaron aquellos SNPs que presentasen mayor valor de heterozigosidad dentro de la región que se quería analizar y mantuviesen la distancia de separación fijada anteriormente. 3.- Frecuencia del alelo menor (MAF). No se seleccionaron aquellos SNPs, siempre que las condiciones lo permitieron, cuyo alelo menos frecuente se presentase en la población con una frecuencia inferior al 10 %. La selección de SNPs se hizo dentro de las siguientes regiones: III.3.2.2. I Región: definida entre los marcadores DXS996 y DXS 1223 Xp22.32-p22.31 Para su análisis se seleccionaron 9 SNPs separados a una distancia de aproximadamente 300 Kb. Los SNPs elegidos fueron: rs5916301, rs1882409, rs5916393, rs5989526, rs6529997, rs4830772, rs1179098, rs1454623 y rs1012417. III.3.2.3. II Región: definida entre los marcadores DXS1224 y DXS 7163 Xp22.2-p22.13 Los 6 SNPs seleccionados para el análisis de esta región estaban separados a una distancia aproximada de 1 Mb. Está región engloba al marcador DXS1195. Los SNPs escogidos fueron: rs4830881, rs4565623, rs2071182, rs1727974, rs9306755 y rs6633170. III.3.2.4. III Región: definida entre los marcadores DXS1226 y DXS 9896 Xp22.11-p21.3 Separados a una distancia media de 1 Mb, los SNPs seleccionados dentro de esta región fueron: rs6629539, rs2520324, rs1018879, rs4358969, rs4898288, rs4428795 y rs196982. Esta región incluía a los marcadores DXS989 y DXS7106. MATERIAL Y MÉTODOS 129 III.3.2.5. IV Región: definida entre los marcadores DXS9907 y DXS6679 Xp21.1-p11.4 Ubicados con una separación aproximada de 1 Mb, los SNPs seleccionados para la exploración de esta región fueron: rs3788899, rs5971730, rs4636356, rs996563, rs6629087 y rs5964310. La región analizada englobaba al marcador DXS1110. III.3.2.6. V Región: definida entre los marcadores DXS1068 y DXS 988 Xp11.4-p11.22 Para su estudio se escogieron 8 SNPs separados entre sí a ~1 Mb: rs5917339, rs1023064, rs766117, rs4074014, rs533190, rs4824748, rs2382900 y rs4893622. Dentro de esta región se incluían los marcadores DXS1055, DXS1003, GATA160B08, DXS6849, DXS1039 y DXS8023. III.3.2.7. VI Región: definida entre los marcadores DXS7132 y DXS 6800 Xq11.1-q21.1 Los SNPs seleccionados para escrutar esta región: rs6525038, rs2206203, rs4562482, rs1171984, rs6525567, rs174211, rs242461 y rs4263894 estaban separados a 1 Mb aproximadamente. III.3.2.8. VII Región: definida entre los marcadores DXS986 y DXS 1002 Xq21.1-q21.2 En ella se han analizado los siguientes 7 SNPs separados a una distancia de ~1 Mb: rs3923574, rs2806641, rs5921935, rs212922, rs724982, rs929129 y rs242847. La región estudiada englobaba al marcador DXS6793. III.3.2.9. VIII Región: definida entre los marcadores DXS8045 y DXS 7423 Xq27.3-q28 Se necesitaron 5 SNPs separados a una distancia media de 1 Mb para analizar toda su extensión. Los SNPs seleccionados fueron: rs5965765, rs5951961, rs1419963, rs6649483 y rs658680. La región analizada incluía el marcador DXS8377. MATERIAL Y MÉTODOS 130 III.3.3. Amplificación de STRs y SNPs por PCR Tras la minuciosa selección de los marcadores polimórficos, se diseñaron los respectivos primers y se ajustaron loas condiciones de PCR para lograr la amplificación más eficiente. III.3.3.1. Diseño de los primers Ambos primers, forward y reverse, se diseñaron mediante Primer Express v2.0 (Applied Biosystems), Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) y NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html). El parámetro de referencia utilizado para diseñar los primers fue que su TM se ajustase a 60ºC. Por lo tanto, dependiendo de la concentración de G y C de cada oligonucleótido, la longitud de los primers varió entre 18 y 27 nucleótidos. Además de la importancia de mantener libre el extremo 3´, con el diseño de primers se evitó la presencia de hairpins, palíndromos, repeats y dímeros entre un único primer o entre los dos primers utilizados para la amplificación de un fragmento de DNA. Esto se consiguió mediante el estudio de las ΔG de las posibles primers, que permitió escoger aquellos cuyas estructuras secundarias cumplían todos los preceptos impuestos anteriormente y eran más estables a 55ºC (ΔG más alta). III.3.3.2. Condiciones de amplificación La amplificación de todos los STRs y SNPs se realizó de forma simplex (amplificación de un único STR o SNP por reacción de PCR). En general, y salvo modificaciones puntuales, el protocolo de amplificación fue el siguiente: III.3.3.2.1. Termociclador Para la realización de la PCR se emplearon indistintamente los termocicladores de Applied Biosystems: GeneAmp 2700 96-well (utiliza eppendorfs de 0,2 mL), GeneAmp 9700 96-well (eppendorfs de 0,2 mL) y Applied Biosystems 9800 Fast 96-well (eppendorfs de 0,1 mL). III.3.3.2.2.- Mezcla de reacción Para un volumen final de 50 μL se añadieron 5 μL de Buffer 10X, 3 μL de MgCl2 25 mM, 1 μL de cada primer a una concentración final de 10 μM, 1 μL de dNTPs 10 mM, 0,28 μL de Taq polimerasa a 5 U/μL, 37,72 μL de H2O MilliQ autoclavada y 1 μL de muestra de DNA. MATERIAL Y MÉTODOS 131 III.3.3.2.3. Concentración de DNA La concentración de DNA utilizada osciló entre 20 y 150 ng/μL como consecuencia del diferente rendimiento obtenido de la extracción de DNA de muestras antiguas o recientes. III.3.3.2.4. Programa de amplificación La temperatura de annealing fue un parámetro no constante debido a las distintas TM de los primers. En todos los casos, la temperatura de annealing empleada en la primera prueba de PCR fue de 55ºC. Esta temperatura se fue ajustando, dependiendo de la cantidad de productos inespecíficos obtenidos o de la cantidad de producto específico de PCR amplificado, hasta conseguir la temperatura de annealing óptima para cada pareja de primers. El programa designado para la amplificación de la mayoría de los STRs tenía los siguientes ciclos: Desnaturalización inicial: 94ºC 2 min. 40 ciclos de: Desnaturalización: 94ºC 20 seg. Annealing-Extensión: 55ºC 1 min. Mantenimiento: 4ºC ad infinitum. Por otro lado, el programa diseñado para la amplificación de los SNPs contenía los siguientes pasos: Desnaturalización inicial: 94ºC 2 min. 35 ciclos de: Desnaturalización: 94ºC 20 seg. Annealing: 55ºC 30 seg. Extensión: 72ºC 30 seg. Mantenimiento: 4ºC ad infinitum. III.3.3.2.5. Control de amplificación Además de las muestras de DNA de los individuos estudiados, también se amplificó un control negativo para descartar la contaminación de la mezcla de reacción con DNA ajeno. El control negativo solamente contenía agua y la mezcla de reacción, por lo que no debía presentar amplificación de ningún tipo. En caso de presentarla, la PCR debería ser repetida de nuevo por posible contaminación de la mezcla de reacción o manipulación del material en condiciones no asépticas. DISCUSIÓN 234 establecerse con gentes del lugar. Por esta razón, se decidió analizar a esta familia para descartar que no estuviese ligada a alguno de los genes responsables de las formas autosómicas recesivas de la RP. El proceso de exclusión de los genes conocidos de arRP en una familia implica el análisis de más de 320 exones, lo que se traduce en la secuenciación de más de 100 Kb (Pomares et al., 2007). Por lo tanto, el descarte de genes de arRP para realizar un correcto diagnóstico molecular se convierte en una tarea sumamente compleja que consume una gran parte de los recursos técnicos y humanos del laboratorio. El desarrollo de las tecnologías de genotipado de SNPs (high-throughput SNP multiplexing) ha supuesto un nuevo método de aproximación a semejante problema. En los últimos años, la utilización de arrays para analizar y descartar genes asociados a diferentes patologías ha sido una práctica habitual entre los diversos grupos de investigación (Jaakson et al., 2003; Zernant et al., 2005; Yzer et al., 2006; Cremers et al., 2007). La mayoría de estos arrays se centran en el análisis de las variaciones de secuencia patogénicas conocidas de los genes a estudio. Sin embargo, el desconocimiento de todas las mutaciones causales y la elevada heterogeneidad genética que presenta la RP implica un complicado, y a menudo no definitivo, diagnóstico molecular (Kondo et al., 2003). La utilización combinada de las técnicas high-throughput de genotipado de SNPs y el análisis de cosegregación ha proporcionado una nueva estrategia para la identificación o exclusión de genes responsables de arRP en las familias afectadas (Pomares et al., 2007). Para tal efecto, este grupo diseñó un array con el que se analizaban 22 genes, 17 de los cuales eran responsables de arRP (ABCA4, CERKL, CNGA1, CNGB1, CRB1, LRAT, MERTK, NR2E3, PDE6A, PDE6B, RGR, RHO, RLBP1, RPE65, SAG, TULP1, USH2A), aunque cuatro de ellos también causaban arLCA (CRB1, LRAT, RPE65 y TULP1). Los cinco restantes eran exclusivos de arLCA (AIPL1, CRX, GUCY2D, RPGRIP1 y RDH12). Cada uno de estos genes era analizado con 4 SNPs situados en las regiones upstream, intragénica y downstream del gen. Estos SNPs habían sido previamente seleccionados por su alta informatividad (frecuencia del alelo menor superior a 0,35), por su cercana localización al gen y por pertenecer a diferentes bloques haplotípicos. La posición de los SNPs y la distancia genética existente entre ellos y el gen era esencial para su selección, puesto que con ello se evitaba que posibles eventos de recombinación pasasen desapercibidos. La gran proximidad al gen candidato que mostraban los SNPs seleccionados fortalecía las inferencias del análisis de cosegregación, mejorando la información genética ofrecida por los microsatélites que en muy pocas ocasiones podían localizarse tan cercanos al gen analizado. Los genotipos obtenidos del análisis de estos SNPs en las plataformas high-throughput fueron utilizados para la reconstrucción del haplotipo de cada individuo, esenciales para la realización del análisis de cosegregación. A diferencia de los arrays anteriores, el array diseñado por Pomares et al. no analiza variantes de secuencia patogénicas en los genes estudiados, sino que se utiliza para mostrar la cosegregación de estos genes con la arRP. Esto garantiza que aunque el gen presente una nueva mutación, el array podrá detectar su cosegregación y lo identificará como el gen responsable de la DISCUSIÓN 235 arRP. Para reconocer la nueva mutación causal el gen tendrá que ser secuenciado en toda su extensión, incluyendo los límites intrón-exón. El genotipado de los 88 SNPs analizados por este array en los individuos de la familia 68 permitió la reconstrucción de los correspondientes haplotipos y el consiguiente análisis de cosegregación. Los criterios establecidos por Pomares et al. para la inclusión de un gen analizado con este array, requerían su cosegregación con la RP o la falta de informatividad de sus SNPs. Todos aquellos genes que no cumplían estas condiciones eran descartados como genes responsables de RP en la familia estudiada. Siguiendo estos criterios, de los 22 genes analizados con este array en la familia 68, solo 18 pudieron ser excluidos por no presentar cosegregación con la RP. A pesar de no haber podido obtener los genotipos de los SNPs hCV8211028, hCV11231355 y hCV2407262, el análisis de cosegregación resultó perfectamente válido ya que la informatividad de los otros tres SNPs analizados en cada gen permitió descartar los genes RPGRIP1, RHO y LRAT con total seguridad. USH2A, CNGB1, CNGA1 y TULP1 no pudieron ser descartados por mostrar cosegregación con RP. En el caso de CNGB1, se detectó una recombinación afectando al SNP más distal de una de las copias de este gen en el individuo III.3. Este hallazgo no afectó al análisis de cosegregación, puesto que los otros tres SNPs con los que se analizaba este gen aportaban la información suficiente para confirmar su aparente cosegregación con la RP. Aunque el análisis de cosegregación reveló cuatro posibles candidatos, hay que tener en cuenta la posibilidad de que esta cosegregación sea espúrea y esté enmascarando la identidad del verdadero gen responsable de RP en esta familia. De estos cuatro genes, USH2A es el que posee mayor número de exones (72), seguido de CNGB1 (33), TULP1 (15) y CNGA1 (8). Además, también es el que representa el porcentaje más alto de casos de arRP (10%), por delante de CNGB1 (4%), CNGA1 (2,3%) y TULP1 (1%) (Hartong et al., 2006; Daiger et al., 2007). Análisis de ligamiento de todo el genoma El relativamente alto número de genes de arRP no descartados con el array, junto con la imposibilidad de exclusión de la gran región del cromosoma X y la posible implicación de RP24 como locus candidato, justificaron el posterior análisis de ligamiento de todo el genoma con la intención de determinar la región exacta de cosegregación de la RP en la familia 68. Los análisis de ligamiento genético han resultado ser una excelente herramienta para la identificación de nuevos genes responsables de enfermedades genéticas. Pero, además, también son esenciales para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas por genes conocidos cuando existen más de dos loci candidatos (Kondo et al., 2003). El análisis de ligamiento es una técnica estadística utilizada para encontrar la localización aproximada de un gen candidato en relación a un mapa constituido por marcadores con localizaciones conocidas (Almgren et al., 2003). Esta técnica se basa en buscar evidencia de DISCUSIÓN 236 cosegregación entre el gen candidato y alguno de los marcadores, aportando información acerca de su posible localización en el cromosoma. Para calcular la significación del ligamiento se utiliza una medida estadística conocida como LOD (Logarithm of the Odds). Un valor de LOD superior a 3,0 indica que las probabilidades a favor del ligamiento entre el marcador y la región candidata son 1.000 veces superiores a las del no ligamiento. Valores de LOD inferiores a -2 excluirían el ligamiento. En el cromosoma X, valores de LOD superiores a 2 se consideran suficientes para determinar ligamiento entre dos loci. Hasta hace poco tiempo, la ejecución de un análisis de ligamiento se prolongaba –dependiendo del número de marcadores y cantidad de individuos analizados– durante varias semanas o meses. Sin embargo, la aparición de las tecnologías de genotipado high-throughput de SNPs ha revolucionado este campo. De los diferentes tipos de marcadores que se pueden utilizar en los estudios de ligamiento, los SNPs son los de primera elección debido a su abundancia y distribución por todo el genoma, su estabilidad al no presentar una alta tasa de mutación y su relativa facilidad de genotipado (Wang et al., 1998). Varios autores han confirmado la validez de los SNPs para este tipo de estudios tras comparar los datos obtenidos de un mismo análisis de ligamiento efectuado con STRs y SNPs y observar que ambos conducían a similares resultados (John et al., 2004; Chen et al., 2005a; Wang et al., 2005b). Hoy en día, la utilización de las tecnologías high-throughput posibilita la obtención del genotipo de cientos de miles de SNPs en solo unas horas, facilitando enormemente la consecución de los estudios de ligamiento. El número de SNPs a genotipar en estos estudios de ligamiento de todo el genoma dependerá del tipo de patología, del grupo poblacional o del número de muestras estudiadas. En esta tesis doctoral, se ha utilizado el GeneChip® Human Mapping 250K NspI Array como soporte para el genotipado de SNPs. Este array supone un paso intermedio entre los inicialmente diseñados para el análisis de 10000 y 100000 SNPs, y los de última generación con capacidad para analizar cerca de 1000000 de SNPs. La enorme dificultad que supuso examinar los datos genotípicos de los 262264 marcadores analizados con el array NspI se solventó mediante la utilización del software easyLinkage v5.08 (Hoffmann y Lindner, 2005). A través de esta suite informática se combinaron los genotipos generados por el array NspI, la información del pedigree, las posiciones genéticas de cada SNP y sus frecuencias en población caucásica, con el fin de generar los archivos requeridos para correr los programas de análisis de ligamiento. Antes de proceder con ningún cálculo, se realizó un cribado de los datos para eliminar los errores que podrían interferir negativamente en el proceso, proporcionando falsa información sobre la región de ligamiento o reduciendo significativamente los valores de LOD (Chang et al., 2006; Middeldorp et al., 2007). En primer lugar, se desecharon los SNPs que no habían sido genotipados (blanks) y aquellos cuyo call rate era inferior al 95%. Tras ello, se descartaron los que presentaban errores mendelianos y no mendelianos. En un paso posterior, se identificaron los SNPs no informativos y se eliminaron o se conservaron dependiendo del tipo de análisis de ligamiento que se iba a efectuar. Finalmente, tras el cribado de los datos, de los 262264 SNPs genotipados por el DISCUSIÓN 237 array NspI solo 148263 (56,53%) fueron utilizados en el análisis de ligamiento Two-point. El hecho de que todos los marcadores estuviesen en equilibrio Hardy-Weinberg indicaba una gran calidad de los datos, puesto que se asumía que las altas tasas de errores de genotipado generaban desequilibrio (Hosking et al., 2004). Análisis de ligamiento paramétrico Two-point Este procedimiento se caracteriza por analizar el ligamiento entre dos loci, generalmente un gen candidato y un marcador. Si estos dos loci muestran un perfecto ligamiento siempre serán transmitidos conjuntamente durante la meiosis y su frecuencia de recombinación (Ө) será igual a 0. Sin embargo, si no presentan ligamiento se transmitirán independientemente y su Ө será de 0,5. La probabilidad de ligamiento sobre un intervalo de fracciones de recombinación puede medirse y expresarse en una escala logarítmica para producir un valor de LOD (log10 de las probabilidades). Este sería el resultado de dividir la probabilidad que habría surgido de los datos si los loci estuviesen ligados (Ө < 0,5) entre la probabilidad que habría surgido de los datos si los loci no lo estuviesen (Ө = 0,5). El valor de Ө que proporciona el mayor valor de LOD (Zmax) es el mejor estimador del grado de ligamiento entre dos loci (Kaufman y Aim, 2003). Tras el análisis Two-point realizado en la familia 68, aquellas regiones cuyos marcadores poseían valores de LOD superior a 0,9 en cromosomas autosómicos o 0,7 en cromosoma X fueron consideradas como regiones de interés (Tabla 24). Ninguna de ellas pudo ser designada como el locus candidato por los bajos valores de LOD obtenidos en el análisis (no llegaban a superar el 1). Sin embargo, dos de estas regiones destacaban de entre las otras, pues una de ellas contenía al gen USH2A y la otra contenía al locus RP24. No se encontró ligamiento con ninguna región que contuviese a CNGB1, CNGA1 o TULP1. Por el contrario, si existía cierta evidencia de ligamiento (LOD <1) con regiones que contenían genes relacionados con patologías degenerativas de la retina como IMPDH1 (responsable de adRP) o CNGB3 (responsable de acromatopsia y de una forma dominante de distrofia progresiva de los conos, PCOD). Aunque esta observación fue considerada como el efecto de una cosegregación espúrea, algo normal debido al pequeño tamaño de la familia y el gran número de marcadores analizado. También se pudo constatar el relativamente alto valor de LOD para 6 SNPs puntuales: SNP_A-1865603, SNP_A-4199763, SNP_A-2085919, SNP_A-2309186, SNP_A-1801704 y SNP_A-2016342. Cuando el análisis de ligamiento se realiza con una única familia, es muy probable que se definan varias regiones cromosómicas de especial interés o que, en caso de encontrar una única región, esta contenga una gran cantidad de genes (Dryja y Berson, 1995). Cada uno de estos genes deberá ser individualmente analizado en busca de variaciones de secuencia, con la consiguiente carga de trabajo y consumo de recursos del laboratorio. No obstante, las variaciones en el DNA no son raras y pueden DISCUSIÓN 238 encontrarse en una considerable proporción de los genes analizados. Solo una de estas variaciones de secuencia será la responsable de la RP y, obligatoriamente, debe cosegregar con RP en la familia analizada. Sin embargo, todas las variaciones de secuencia encontradas cosegregan con RP puesto que se encuentran en la región de cosegregación definida por el análisis de ligamiento, dificultando todavía más la identificación del gen responsable de RP. Los resultados obtenidos del análisis de ligamiento Two-point llevado a cabo sobre la familia 68 no aportaban la información requerida para descartar muchas de las regiones y SNPs que habían mostrado cierto ligamiento. Por lo tanto, se decidió continuar el estudio realizando un análisis de ligamiento Multipoint con la esperanza de poder descartar la mayoría de las regiones de interés. Análisis de ligamiento paramétrico Multipoint Generalmente, el análisis de ligamiento Two-point es utilizado como primera aproximación para el análisis de los datos genotípicos (Almgren et al., 2003). Tras ello, se realiza un análisis Multipoint que emplea múltiples marcadores de forma simultánea con el fin de extraer la máxima información posible de los datos. El análisis Multipoint considera las posiciones de los marcadores como fijas y varía la ubicación del locus candidato a lo largo del mapa. Para cada tentativa de posición del locus, se calcula una probabilidad multilocus y se compara con la probabilidad multilocus de una posición no ligada. Por lo tanto, el análisis de ligamiento Multipoint requiere una gran cantidad de cálculos que son realizados por ordenadores. La complejidad computacional de este análisis se incrementa de forma lineal con respecto al número de individuos y de forma exponencial en relación al número de marcadores empleados. Una ventaja del análisis Multipoint sobre el Two-point, radica en que en el primero el problema de la homozigosidad de los marcadores no es tan devastador como en el segundo (Almgren et al., 2003). En el análisis Multipoint, los marcadores próximos proporcionan una información que no está disponible en el Two-point. Por esta razón, no es recomendable eliminar los SNPs no informativos para realizar el análisis Multipoint. Consecuentemente, los 95831 (36,54%) SNPs no informativos identificados durante el cribado de los datos fueron incluidos en el análisis de ligamiento Multipoint efectuado sobre las regiones de interés definidas por el análisis Two-point. Otra ventaja del análisis Multipoint es que proporciona información acerca de los entrecruzamientos que habrían podido producirse en ambos lados del locus candidato. Sin embargo, la principal desventaja del método multipunto es su gran sensibilidad a la incorrecta especificación del modelo genético de la enfermedad (Almgren et al., 2003). El elevado número de marcadores SNPs genotipados en el array NspI ocasionó un notable incremento de la complejidad computacional del análisis Multipoint. Por esta razón, este análisis se limitó a las regiones de interés previamente definidas por el Two-point. Aunque los valores de LOD DISCUSIÓN 239 obtenidos con el Multipoint fueron ligeramente superiores a los conseguidos con el Two-point, ninguno de los marcadores analizados mostraba un valor superior a 3, impidiendo demostrar estadísticamente el ligamiento con algún locus de RP. El estudio Multipoint reveló como se acotaban subregiones dentro de las regiones de interés analizadas (Tabla 25) o como estas eran excluidas al disminuir drásticamente el valor de LOD por debajo del límite de -2. Al igual que se había establecido para el análisis Two-point, las regiones delimitadas por marcadores con valores de LOD superior a 0,9 en cromosomas autosómicos o 0,7 en cromosoma X fueron consideradas como regiones con probabilidad de contener al gen candidato. El análisis Multipoint descartó ligamiento con el SNP del cromosoma 3 (Figura 46) y con la inmensa mayoría de los marcadores de la región de interés del cromosoma X, que se redujo a una región con dos únicos SNPs (LODs 1,0244 y 1,0168, respectivamente) separados por ~1200 pb, ambos localizados fuera del locus RP24 (Figura 66). Los valores de LOD alcanzados por el SNP_A2085919 (Figura 61) y el SNP_A-2309186 (Figura 62) del cromosoma 15 no facilitaron su exclusión puesto que no superaban el límite de -2. Los bajos valores de LOD obtenidos para los marcadores de la región que contenía a USH2A no permitieron confirmar estadísticamente el ligamiento, aunque si fueron lo suficientemente altos para evitar su exclusión. Sin olvidar que cualquiera de las otras regiones identificadas podía contener un gen de RP no descrito hasta el momento, se decidió –en base a la posibilidad de que esta familia estuviese verdaderamente afectada por una forma de XlRP– realizar un nuevo estudio en las regiones que contenían a USH2A y el locus RP24. Sin embargo, para este nuevo análisis Multipoint se consideró al individuo III.1 como afectado, respaldando la suposición de que la familia 68 estaba ligada al locus RP24. La información obtenida a partir del array de genes de arRP no pudo confirmar si este individuo estaba realmente sano, lo que habría descartado con absoluta seguridad que RP24 era el locus responsable de RP en esta familia. El análisis realizado bajo estas condiciones, mostró que los marcadores del locus RP24 aumentaban sus valores de LOD hasta 1,0280 (Figura 67), mientras que la gran mayoría de los de la región que contiene a USH2A descendían hasta valores muy negativos (Figura 68). Esta última región presentaba tres picos en la gráfica de LOD, pero ninguno de ellos se correspondía con la localización física de USH2A. Por lo tanto, este segundo análisis Multipoint descartaba a la región que contiene a USH2A y confirmaba a la que contenía a RP24 como la región con mayor probabilidad de contener al gen candidato. El análisis inicial del cromosoma X con 82 marcadores STRs y otros 33 SNPs, seguido del cribado de 22 genes con el array de arRP y, por último, el análisis de ligamiento realizado con 262264 SNPs, no han logrado identificar con la suficiente consistencia la región susceptible de contener el gen responsable de RP en la familia 68. DISCUSIÓN 240 Figura 67.- Análisis de ligamiento Multipoint de la región del cromosoma X limitada por SNP_A-1800923 y SNP_A-4205073, considerando a III.1 como afectado de RP. Figura 68.- Análisis de ligamiento Multipoint de la región del cromosoma 1 limitada por SNP_A-4216544 y SNP_A-2067830, considerando a III.1 como afectado de RP. DISCUSIÓN 241 Búsqueda del gen responsable de RP en la familia R Durante el transcurso del complicado estudio de la familia 68 se comenzó el análisis paralelo de una familia consanguínea afectada por una forma recesiva de RP. El claro modo de herencia mostrado en el pedigree de la familia R sugería la utilización del array diseñado por Pomares et al. como estrategia de primera elección para comenzar la búsqueda del gen responsable (Pomares et al., 2007). Dicha estrategia representaba una vía rápida y efectiva para reducir el número de genes candidatos sobre los que había que realizar el análisis mutacional. De esta forma, se evitaba el largo y lento proceso de exclusión de genes responsables de arRP a través de análisis de cosegregación o de ligamiento realizados con marcadores polimórficos. Mientras que la familia 68 fue analizada con la versión final del array para la plataforma MassARRAY, el cribado de genes de arRP en la familia R se realizó con la versión diseñada para la plataforma SNPlex. Este modelo de array examinaba 21 genes –RDH12 se analizaba exclusivamente con el de MassARRAY– mediante el genotipado de 175 SNPs, 84 de los cuales fueron escogidos para constituir la versión final del array. Ambos diseños de array demostraron ser totalmente válidos para la exclusión de los genes analizados. Los haplotipos reconstruidos a partir del genotipado de los 175 SNPs (Tabla 1 Anexo) reflejaron la evidente cosegregación de la RP con el gen MERTK y la patente homozigosidad de las copias de este gen en todos los individuos afectados de la familia R (Tabla 26). De acuerdo con los criterios de inclusión de genes establecidos por Pomares et al. para las familias consanguíneas, estas dos observaciones señalaron a MERTK como el probable gen responsable de arRP en esta familia. En al año 2000, Gal et al. habían demostrado como mutaciones en MERTK implicaban la alteración de la actividad fagocítica de las células del RPE, causando la instauración de RP en humanos (Gal et al., 2000). Por lo tanto, debía realizarse un análisis mutacional de MERTK con el ánimo de obtener el diagnóstico molecular de la RP en la familia R. Tabla 26.- Genotipos de los SNPs analizados en el gen MERTK con el array de la plataforma SNPlex. SNP POSICIÓN rs13016143 G G G GG GA GG AG GG A 112365943 rs11683409 G G G GG GG GG GG GG G 112486605 rs6722814 G G G GG AA AG AG GG A 112527553 rs10182333 G G G GG AA AG AG GG A 112558327 rs12618637 T T T T T G G G T G T T T G 112615909 rs2254860 T T T T T T T T T T T T T T 112712281 rs1996328 C C C C C C C C C C C C C C 112775887 I.1 I.2 II.2 II.3 II.5 II.6 II.12 II.14 II.15 DISCUSIÓN 242 Análisis mutacional del gen MERTK El análisis mutacional efectuado sobre el gen MERTK consistió en la secuenciación de sus 19 exones –incluyendo las regiones limítrofes exón-intrón– con la intención de descartar las mutaciones causales de RP descritas hasta el momento y buscar nuevas variantes de secuencia. El hecho de que todas las mutaciones causales conocidas (IVS10-2A>G; R651X; 2070delAGGAC; R722X; 2214delT y R844C) se situasen dentro o cerca de las regiones codificadoras del dominio tirosín kinasa (Gal et al., 2000; McHenry et al., 2004; Tschernutter et al., 2006) motivó que la secuenciación empezase por los últimos exones del gen. Los resultados obtenidos permitieron la exclusión de las mutaciones causales anteriormente citadas, así como el reconocimiento de 28 variantes de secuencia: tres cambios no sinónimos (Ser118Asn, Arg466Lys y Ile518Val), dos cambios sinónimos (Asn498Asn and Ser627Ser), un cambio en la región upstream y 22 cambios intrónicos (Tabla 1 del manuscrito). Todos los cambios nucleotídicos encontrados en los exones del gen MERTK de esta familia habían sido previamente descritos y considerados como variantes no patogénicas (Gal et al., 2000; Tada et al., 2006). Por el contrario, algunos de los cambios intrónicos identificados no eran mencionados en los estudios de estos autores, aunque casi todos figuraban en las bases de datos como polimorfismos SNPs (con la excepción de IVS8-91G>A, IVS13+104G>A y IVS17-103G>T). La secuenciación de MERTK también evidenció una inserción TTTATTTATTTA en el intrón 2 –previamente identificada por Tada et al. (Tada et al., 2006)–, aunque el hallazgo de la inserción TTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTA en la misma región sugería la posibilidad de que ambas fuesen variantes alélicas de un STR tetramérico (TTTA). Sin duda, el cambio intrónico más importante de entre los identificados por el análisis mutacional de MERTK en la familia R –y el único potencialmente patogénico– es la transversión de una G por una T en el primer nucleótido del intrón 16. Efecto de la mutación IVS16+1G>T La nueva mutación (IVS16G+1>T) altera la secuencia consenso (GT) del sitio donante de splicing (Figura 1G Anexo), sugiriendo la posibilidad de un splicing anormal del exón 16. En base a esta suposición, se consideraron tres posibles mecanismos (Strachan y Read, 2004): 1.- Retención del intrón 16. La incapacidad del espliceosoma para escindir la secuencia completa del intrón 16 –al estar alterado el sitio donante de splicing– causaría la incorporación de este intrón en el mRNA. Por lo tanto, el mRNA contendría una nueva secuencia entre el exón 16 y el exón 17 que variaría la pauta normal de lectura, dando lugar a una proteína aberrante (Figura 69). Este DISCUSIÓN 243 mecanismo suele ser bastante frecuente cuando el tamaño del intrón no es muy grande y los sitios donante o aceptor de splicing están mutados. 2.- Salto (skipping) del exón 16. En este caso, la mutación del sitio donante de splicing del intrón 16 provocaría que el espliceosoma no pudiese separar el intrón 16 del extremo 3´ del exón 16, causando su conjunta eliminación durante el procesado del pre-mRNA. El efecto de este mecanismo en el mRNA originaría un salto en el normal reordenamiento de los exones, incorporando al exón 17 inmediatamente después del exón 15 (Figura 69). El mRNA finalmente obtenido mostraría la pérdida de todos los nucleótidos del exón 16 y su traducción daría lugar a una proteína defectuosa al no contener ninguno de los aminoácidos codificados por tal exón. 3.- Activación de un sitio críptico de splicing. Debido a que el espliceosoma no puede reconocer el sitio donante de splicing (GT) del intrón 16 al estar mutado, podría darse la circunstancia de que utilizase algún otro punto como sitio alternativo de splicing (criptic splice site). Por lo tanto, todas las parejas de nucleótidos GT situados en el exón 16 o en el intrón 16 podrían actuar como potenciales sitios crípticos de splicing. En tal caso, el mRNA contendría una forma extendida o recortada del exón 16 dependiendo de la localización del sitio críptico de splicing (Figura 69). Con el propósito de verificar cual era el efecto real de la mutación IVS16+1G>T en el mRNA de MERTK, se sintetizó el cDNA correspondiente y se estudió el reordenamiento de los exones. Inicialmente, se diseñó un primer Forward (F1) que se combinó con tres Reverse (R1, R2, y R3) para amplificar tres fragmentos. El primero (F1-R1; tamaño: 443 pb) se situaba entre el exón 15 y el 18, el Figura 69.- Posibles mecanismos de splicing alternativo del exón 16. En la parte superior se representan los 19 exones de MERTK. La mutación IVS16+1G>T (asterisco) afecta al splicing normal del exón 16. (A) Splicing normal del exón 16. (B) Retención del intrón 16. (C) Skipping del exón 16. (D) Criptic splice site (flechas rojas) en el exón 16 con pérdida de parte del exón. CONCLUSIONES 251 La Retinitis Pigmentaria forma parte de un grupo de enfermedades hereditarias de la retina caracterizadas por la degeneración progresiva de los conos y los bastones. Esta memoria de tesis doctoral ha establecido sus bases en el análisis genético molecular de dicha patología en dos familias que muestran diferentes modos de herencia, presentándose a continuación de manera esquematizada las conclusiones más relevantes de dicho estudio: 1.- El análisis genético molecular realizado sobre la familia 68 no ha logrado determinar con absoluta certeza el gen responsable de la RP en dicha familia. El escrutinio de la práctica totalidad del cromosoma X con 82 STRs y 33 SNPs, el cribado de 22 genes asociados a RP autosómica recesiva y la realización de un análisis de ligamiento de todo el genoma con 262264 marcadores SNPs, no han permitido acotar de manera consistente una región cromosómica que pudiese ser designada como candidata. 2.- El fallecimiento a una edad temprana del individuo III.1 de la familia 68 ha impedido establecer su real grado de afectación, dificultando en sobremanera la resolución de las hipótesis suscitadas con este análisis. Posteriores estudios han de estar orientados hacia el reconocimiento de genes candidatos en la región que contiene al locus RP24 y la secuenciación de los 72 exones del gen USH2A, pudiendo identificar de esta forma el gen responsable de RP en esta familia. 3.- El cribado de los datos genotípicos previo al análisis de ligamiento de todo el genoma resulta de vital importancia, debido a que la inserción de errores en el análisis final podrían maximizar o minimizar el valor LOD obtenido para cada marcador, influenciando negativamente las conclusiones del estudio. 4.- Las técnicas de genotipado resultan una herramienta esencial para el diagnóstico molecular de una patología con una heterogeneidad genética tan elevada como la mostrada por la RP. La correcta utilización de esta tecnología ha permitido identificar a MERTK como el gen responsable de la forma autosómica recesiva de RP que afecta a la familia R. 5.- El análisis mutacional del gen MERTK en la familia R reveló la presencia de una mutación no descrita hasta el momento. Esta variante de secuencia patogénica afecta al sitio donante de splicing del intrón 16 (IVS16+1G>T) causando el skipping del exón 16 en el mRNA. Como consecuencia, se genera un cambio de pauta de lectura que introduce un codón de parada prematuro en el exón 17 dando lugar a un tránscrito de mRNA alterado. CONCLUSIONES 252 6.- La identificación del efecto de la proteína mutada MERTK, así como el de las isoformas conocidas de mRNA de MERTK, resulta esencial para el conocimiento del complejo proceso de la renovación de los segmentos externos y de la actividad fagocítica de las células del RPE. Para tal fin, se requieren experimentos adicionales, tales como la replicación de la mutación en un animal transgénico o estudios funcionales. VII. ANEXO ANEXO 255 Tabla 1. Haplotipos reconstruidos a partir de los genotipos obtenidos con el array de arRP en la plataforma SNPlex G E N C h r. SNP Posición II.3 II.15 II.2 III.1 III.2 III.3 II.5 III.4 III.5 II.12 III.8 III.9 II.6 II.13 II.14 III.10 HCV3207864 68467736 A G A G A G A A G A A A A G A A G A A G G A G A G A A AA G G A HCV7782611 68666420 T T T T T TT TT TT TT TT TT TT TT T T T T T T TT TT T HCV1914618 68685343 T T T T T TT TT TT TT TT TT T C T T T T T T T T TC T T T HCV1914666 68736450 G G G G G GGGGGGGGGGGGGGGGG G G G G G AG G G G RPE65 1 HCV3134634 68909560 A A A A A AAAAAAAAAAAAAAAAA A A A A A AA A A A HCV1210478 94113144 G T G T G TT G G G T G G T T GGGGT GG G G G T G TG T G G HCV11881232 94252625 C C C T C TT C C C T C C T T T C T C C C C C C C T T TC T C T HCV11983424 94261085 G G G A G A A G G C A G G A A A G A G G G A G A G A A AG A G A HCV3082029 94303106 C T C T C TT T C T T T C T T T C T C T C C C C C T T TC T C T HCV3082046 94331013 T T C T T TT CT CT CT TT TT TT TT T T T C T T CT TT T HCV1775949 94343923 C C C C C CCCCCCCCCCCCCCCCC C C C C C CC C C C HCV9846807 94431982 C G G G C G G G C G G G C G G G C G C G G C G C G G G GC G C G HCV1463697 94466291 C C C C C CCCCCCCCCCCCCCCCC C C C C C CC C C C ABCA4 1 HCV953167 94678793 A A A A A AAAAAAAAAAAAAAAAA A A A A A AA A A A HCV16191189 194323085 T T G T G G G G G G G T T TT TT T G G G G G G G T T GG G G T HCV1742539 195432335 C C T C T TT TT TT C C C C T C T T TT T T T T C C TT TT C HCV1742484 195532264 C C C C C C C T C T C C C C C T C T C C C T C T C C C TC C C C HCV1745234 195577400 T T T T T TT TT TT TT TT TT TT TT T T T T T T TT TT T HCV1685780 195628194 G A G A G A G A G A G A G A G G A G G A G A G G G A A GG A G A HCV8348898 195653470 T C C C C C C T C T C T T CT T C T C C C T C C C C C TC C C C HCV2033046 195755980 G A A A A A A G A G A G G A G G A G A A A G A A A A A GA A A A CRB1 1 HCV8356234 195833465 C T C T C T C T C T C T C T C C T C C T C T C C C T C CC T C C HCV910720 213394031 A A A A A A A A A A A A A A A G A G A A A G A A A A A AA A A A HCV12077292 214122694 A A A A A AAAAAACAAAAAAAAAA A A A A C AA A A C HCV1859793 214331011 A A A A C C C A C A C C C C C A C A A C C A C C A A C CC C C C HCV11395244 214425025 A A A A A A A A A A A A A A A G A G A A A G A A A A G AA A A G HCV1595315 214536491 T T T T T TT TT TT TT TT CT CT TT C T T T T C TT TT C HCV11671918 214618714 T T T T T TT TT TT TT TT CT CT TT C T T T T C TT TT C HCV399068 214658626 C C C C C C C C C C C C C C C T C T C C C T C T C C T CC C C T HCV2719580 214753597 G A G A A A A G A G A A A A A A A A G A A A A G G A A AA A A A HCV11672005 214830563 C C C C T TT TT TT TT TT CT C C T T T T T C C T CT TT T USH2A 1 HCV2958558 214858228 G A G A A A A A A A A G A A A G A G G A A A A A G A A GA A A A HCV11508766 112365943 G G G A G G G G G A G A G G G G G G G A G G A A A G G GG G G G HCV178264 112486605 G G G G G G G G G G G G G G G C G C G G G C G G G G C CG G G C HCV11505590 112527553 G G G A G G G A G G G G G A A A A A G A G A A G A A A AG G G A HCV211916 112558327 G G G A G G G A G A G A G A A G A G G A G A A G A A G AG G G G HCV11506230 112615909 T T T G T TT GT GT GT G G T G T T GT G G T G G T GT TT T HCV15970375 112712281 T T T T T TT TT TT TT TT CT CT TT C T T T T C CT TT C MERTK 2 HCV317359 112775887 C C C C C C C C C C C C C C C T C T C C C T C C C C T TC C C T hCV1051244 181860076 C G C G C G G C G C C C C G G C G C G G G G G G C G G CC C C G HCV1276243 182060025 G G G G G G G G G G G G G G G A G G G G G G G G G G G AG G G G HCV1276238 182080396 G C G C G C C C C G G G G C C C C C C G C G G G G C C CG C G C HCV1276214 182109997 G G G G G G G G G G G G G G G A G G G G G G G G G G G AG G G G HCV1276197 182136281 C C C C C C C C C C C C C C C T C C C C C C C C C C C TC C C C HCV2857988 182241456 G G G G G G G C G C G C G G G G G C G G G G G G G G G GG G G G HCV2915674 182413397 G G G G G GGGGGGGGGGGGGGGGG G G G G G GG G G G HCV16042243 182759240 C C C C C CCCCCCCCCCCCCCCCC C C C C C CC C C C CERKL 2 HCV8725398 182773597 T T T T T TT TT CT CT TT TT TT TT T T T T T T CT TT T PRIMOS HERMANOS 1 2 21 123 3 54 4 5 6 87 6 910 7 1211 8 9 1413 10 11 15 I II III ANEXO 256 HCV9095570 233846587 TT T C C C C C C C C C T T T C T T C C C T C C T T C C T T TC HCV11530549 233869411 GA G A A A A A A A A A G A G G G G A A A G A G G A A A G A GA HCV9095756 233912663 AG A A A G A G A G A G A G A A A A A G A A A A A G G G A G AG HCV9095814 233922840 TC T T T C T C T C T C T C T C T C T C T T T C T C C C T C TC HCV9095953 233949483 AA A A A A A AAAAAAAAAAAAAAAAA A A A A A A AA HCV9096035 233988971 GA G A A A A AAAAAGAGAGAAAAAAA G A A A G A GA HCV9096087 234011399 GG G G G G G GGGGGGGGGGGGGGGGG G G G G G G GG HCV9095659 234514337 GA G G G A G A G A G A G A G G G G G A G G G G G A A A G A GA SAG 2 HCV8738825 234721653 TT T T T T T TTTTTTTTTTTTTTTTT T T T T T T TT HCV11909732 130472576 AA A G A G A A G A G A A G A A G A A A A A A A A A A A A A AA HCV89980 130533633 GG G G G G G AGGGAGGGGGGGGGGGG G G G G G G GG HCV3140846 130596312 CC C A C A C C A C A C C A C C A C C C C A C A C C C C C C CC HCV8765558 130687872 TG G G G G G GGGGGGGGGGGT GGGT G T G G G T G TG HCV8765858 130723332 AA A A A A A AAAAAAAAAAAAAAAAA A A A A A A AA HCV2990757 130769103 GC G C C C C C C G C C G C G G C G G C C C G C G C G G G C GG HCV3140804 130802991 GG A A G A G A A A A A A A A A A A G G G A G A G G A A G G GA RHO 3 HCV16110276 131033267 AG G G G G G A G G G A G G G G G G A G G G A G A G G G A G AG HCV9657559 424079 AA A G A A A G A G A A A G A A G A A A A G A G A A A G A A AA HCV9657182 506586 AG A G A G G G A G A G A G A A G A A G G G A G A A G G A A AG HCV362907 523001 CT C T C T T T C T C T C T C C T C C T T T C T C C T T C C CT HCV1842170 629670 TT T T T T T TTTTTTTTCTCTTTTTT T T T T T T TT HCV11282186 675993 AA G A A A A A A A A G G A G G A G A A A A A A A G A A A G GA HCV1884877 724351 AA G G A A A G A G A A G G G G G G A A A G A A A G A G A G GA HCV1884918 750258 TG G G T G G G T G T T G G G G G G T G G T T T T G T G T G GT PDE6B 4 HCV1885018 834035 CT C C C T T C C C C T C C C C C C C T T T C T C C C T C C CC HCV15959300 47595470 TT T T T T T TTTTTTTTTTTTTTTTT T T C T T T TC HCV1557315 48089683 CC C C C C C CCCCCCCCCCCCCCCCT C C C C C C CC HCV124148 48157569 TT T T T T T TTTTTTTTCTTTTTTTT T T C C T T TC HCV8263193 48399261 AA G A A A A GAAAAAAAAAGAAAAAA A A G A A G GG HCV1557199 48483337 CC T C C C C T C T C T C C C C C T C C C C C T C C T T C T TT HCV1557225 48525111 AG A G A G A A G A A A A G G G A A A G A G G G A G A A G A AA HCV1557302 48613506 CC T C C C C T C T C T C C C C C T C C C C C C C C T C C T TT HCV471901 48638845 AA A A A A A GAAAAAAAGAGAAAAAG A A G A A A AG CNGA1 4 HCV15988301 48817925 GG G A G A G A A A G A G G A G G G G A G A A G G A G A A G GG HCV2892931 155667191 TT T A T A A T T T T T A A A T A A T A A A A A T T A A A A AA HCV2892894 155688630 GG G C G C C CGGGCCCCGCCGCCCCC G G C C C C CC HCV2892863 155745420 GG G A G A A G G G G G A A A G A A G A A A A A G G A A A A AA HCV2892855 155762819 TT T C T C C T T T T T C C C T C C T C C C C C T T C C C C CC HCV1642217 156068138 CC C C C C C CCACCCCCCCCCCCACA C C C A C C CC HCV11254570 156115993 AA A G A G G GAGAGGGGGGGAGGGGG A A A G G G GA LRAT 4 HCV2407262 156244562 GT T T G T T G G G G G T T T G T G T T T T T T G T T T T T TT HCV1878759 149034577 CG C C C C C CCCCCCCCCCCCCCCCG C G C C C G GC HCV986560 149273253 AG A A A A A AAAAAAAAAAAAAAAAG A G A A A G GA HCV11833562 149300095 GG G G G G G GGGGGGGGCGGGGGGGC G G G C G G GG HCV2083663 149380161 AG A G A A A A A A A A A G G A A G A G A G A G G G A A A G GA HCV2083640 149395594 GA G A G G G G G G G G G A A G G A G A G A G A A A G G G A AG HCV3220627 149423491 CC T C C T C T T T C T T C C T T T T C T C T C C C T T C C CT PDE6A 5 HCV1122055 149427821 GG G A G G G G G G G G G A A G G A G A G A G A A G G G G G GG HCV16167650 35436854 TT T T T T T GTGTGTTTTTTTTTTTT T T T T T T TT HCV8852002 35512641 CA A A A A A C A A A C A A A C A C A A A A A A A A A A C A CA HCV3278242 36834650 TT T T T T T CTCTCTTTTTTTTTTTT T T T T T T TT HCV325510 36976733 TT T G T T T G T G T G T G G T G T T G T G T T T T T T T T TT HCV2489242 36997551 GG G T G G G T G G G T G T T G T G G T G T G G G G G G G G GG HCV1256775 37121043 GA G G A G G GGA AGGGGAGAGGGGGG A G G G G A GG HCV8852038 37161531 CT C C T C C CCT TCCCCTCTCCCCCC T C C C C T CC HCV1979230 37240295 GT T T T T T TTTTTTTTTTTTTTTTT T T T T G T GT HCV16067248 37263216 TT G G T G G T G T T T G G G T G T G G G G G G T G G G T T TG TULP1 6 HCV1979103 37341996 CC C C C C C T C C C T C C C T C T C C C C C T C C T C C C CT HCV1904747 85630396 GG A G G A A G A G A G A G G G G A A G G G A G G A A A G G GA HCV1904699 85908918 GT G T G G G T GGGT GGGGGGGGGGGG T G G G G T GG HCV1904740 85950129 AC C C A C C C C A C C C A A A A C C A A A C A C C C C A C AC HCV1904806 85989424 CC T C T T T CTTTCTTTTTTTTTCTC C T T T C C CT HCV1904813 85994716 GG A G A A A GAGAGAAAAAAAAAAAA G A G A G G GG HCV1904891 86084916 AA A A A A A GAAAGAAAAAAAAAAAA A A A G A A AA HCV11206103 86088516 CC G C C G G C G C G C G C C G C G G C C G G G C G G C C C CG RGR 1 0 HCV11193587 86124939 CC T C C T T C T C T C T C C T C T T C C T T T C T T C C C CT ANEXO 257 HCV2803252 19828288 G G G G GG- - G G G G G G G G G G G G G G G G G G G GG G G G HCV2434547 20609902 C T C C C C C T C T C T C C C C C C T C C T C T C C T TC C C T HCV2434610 20661565 C C T C C C C C C C C C C C C T C T C T T C T C T C T CT C C T HCV8211028 20705711 G A G A G A G G A A G G G A G G A G A G G G G G G A A GG A A A HCV2803138 20786575 T T T T T T T T T C T T T T T C T C T T T C T C T T C CT T T C HCV11719767 20848428 A G G A A A A A A G A A A A A G A G G G G G G G G A A GG A A A HCV1436524 21025770 A A G G A G A A G G A A A G A G G G A G G A G A G G A GG G G A HCV7532826 21063338 A A G A A A A A A A A A A A A A A A A G G A G A G A A AG A A A RPGRIP1 1 4 HCV3266507 21071787 T C C C T C T C C T T C T C T T C T C C C C C C C C C TC C C C HCV8085701 69524477 G G G G G A G A G G G A A G G A G A A G A G A G G G G AG G G G HCV301676 69734662 C T C T T C T C T T T C C C C C C C C C C C C C C C T CC T T T HCV1952280 69851435 C T C T T C T C T T T C C C C C C C C C C C C C C C C CC T T C HCV3140333 69890429 T T T T T C T C T T T C C C C C C C C C C C C C T C C CT T T C HCV3140341 69905831 G C G C C G C G C C C G G G G G G G G G G G G G G G G GG C C G HCV1870770 70027183 A A A A A G A G A A A G G G G G G G G G G G G G A G G GA A A G HCV303751 70094745 A A A A A G A G A A A G G G G G G G G G G G G G A G G GA A A G NR2E3 1 5 HCV8870237 70353669 C C C C C T C T C C C T T T T T T T T T T T T T C T T TC C C T HCV9296636 87482020 C T T T C T C T C T T T C C C T C T C C C C C T C T T TT T T T HCV9303112 87501679 T C C T T C T C T C C T T T T C T C T T T T T C T T T TC T C T HCV2582956 87530756 A G G A A G A G A G G A A A A G A G A A A A A G A A G AG A G G HCV11709919 87537843 T G G T T G T G T G G T T T T G T G T T T T T G T T G TG T G G HCV2582923 87555958 A G G A A G A G A G G A A A A G A G A A A A A G A A G AG A G G HCV8719939 87659606 C T T C C T C T C T T C C C C T C T C C C C C T C C T TT C T T HCV2582802 87674801 G A A G G A G A G A A G G G G A G A G G G G G A G G A AA G A A RLBP1 1 5 HCV2582809 87680130 T A A T T A T A T A A T T T T A T A T T T T T A T T A AA T A A HCV1318840 56311769 A A A A A G A G G G G G A G G A A A A A A G A G A A A AA A A A HCV1318858 56327967 A G A G A G A A G A G A A G G A A A A G A A A A A G G AA A A G HCV57334 56367591 T C T C T C T T C T C T T C C T T T T C T T T T T C C TT T T C HCV3283832 56510815 T C T C T T T C T C T C T T T C T C T C T T T T T C T TT T T T HCV2827495 56556341 C T C T C T C T T T T T C T T T C T C T C T C T C T T TC C C T HCV8143605 56631711 G A G A G A G A A A A A G A A A G A G A G G G A G A A AG G G A HCV2395383 57713606 C C C C C T C T T T T T C T T C C C C C C C C C C C C CC C C C HCV2395379 57720478 G C G C G G G C G C G C G G G C G C G C G G G G G C G GG G G G CNGB1 1 6 HCV11897613 57833024 A G A G G A G G A G A G G A A G G G A G A A A A A G G AA G A G HCV3199850 6017782 C G C G G C G G G G C G C G G G G G C G G G C G C G G GG C G G HCV2036741 6050270 G C G C C C C C C C C G G C C G C G G C C G G G G C G GC C C G HCV149230 6341033 G G G G A A A G A G A A G G G A G A G A A A G A G G A AG A G A HCV1573792 6370485 A A A A G A G G G G A A A A A A A A A G G A A A A A A AA A A A HCV247666 6383333 G A G A A A A A A A A G G A A A A A G A A A G A G A G AA A A G HCV7947665 6447453 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C T TC C C T HCV8726397 6462126 T C T C C C C C C C C T T C C C C C T C C C T C T C T TC C C T HCV9276889 6504037 T T T T T C T C T C C T T T T T T T T T T C T C T T C TT C T C AIPL1 1 7 HCV12118354 6652502 G G G G A G A A A A G G G G G G G G G A A A G A G G G GG G G G HCV8727884 7666115 G G G G G G G G G G G A G G G G G G G G G G G G G G A GG G G A HCV262231 7704554 A A A A G G G G G G G A A A A G A G A G G G A G A A G GA G A G HCV197857 7766290 T T T T C C C C C C C C T T T C T C T C C C T C T T C CT C T C HCV504346 7847690 T T T T G G G T G T G T T T T G T G T G G G T G T T G TT G T G hCV111930 7881173 G G G G A G A G A G G G G G G A G A G A A A G A G G A GG G G A HCV12117271 7977349 A G A G A G A A A A G A A G G G G G A A A G A G A G G AG G G G HCV9276996 8035325 C T C T C C C C C C C T C T T T T T C C C C C C C T C CT C T C HCV9276973 8043643 A A A A A A A C A C A A A A A A A A A A A C A C A A A CA A A A HCV15770427 8122264 C C C C C C C G C G C G C C C C C C C C C G C G C C G CC C C G GUCY2D 1 7 HCV12117162 8201562 G G G G G A G G G G A A G G G G G G G G G G G G G G A GG A G A HCV8714416 52897537 T G T G T T T T T T T T T T T T T T T G T T G T T T G TG T T G HCV1996743 52942132 G C G C G G G C G C G G G G G G G G G C G G C G G C C CC C C C HCV1996824 52977975 A C A C A A A C A C A A A A A A A A A C A A C A A A A CC A A A HCV1996882 53031112 T C T C T C T C T C T T T C C T C T T C T T C T C T T TC T T T HCV3170678 53073177 G A G A G G G G G G G G G G G G G G G A G G A G G A A GA A A A HCV2932709 53191121 T C T C T T T T T T T T T T T T T T T C T T C T T C T TC C C T HCV2939084 53249000 A A A A A A A A A A A G A A A G A G A A A A A A A G A GA G G A CRX 1 9 HCV2939064 53261521 T T T T T G T G T G T G T G G G G G T T T T T T G T G TT T T G ANEXO 258 Figura 1. Descarte de mutaciones conocidas causantes de RP la familia 68 A. Exclusión de la mutación: IVS10-2A>G B. Exclusión de la mutación: R651X C. Exclusión de la mutación: 2070delAGGAC D. Exclusión de la mutación: R722X E. Exclusión de la mutación: 2214delT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX11 REFSEQ GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.2 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.3 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.5 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.6 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.12 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.14 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG II.15 GCCCTGTTTTTATAGTGAAGTATCTTTGTTTTCATTCACCCAGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTGGTGAATTATATAG 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX14 REFSEQ CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.2 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.3 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.5 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.6 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.12 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.14 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT II.15 CGTGCATGAAAGACTTCAGCCACCCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTACTTCCGAGAAATGCAGGAGTGGGTGGCCAAGAGGGCTCTGCT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX15 REFSEQ ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.2 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.3 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.5 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.6 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.12 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.14 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT II.15 ATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGGTAATGATCTCCTTGTGTTACCCCTGAACACTTCT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX16 REFSEQ ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.2 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.3 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.5 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.6 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.12 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.14 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT II.15 ATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCAT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX17 REFSEQ TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.2 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.3 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.5 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.6 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.12 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.14 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC II.15 TAACCTGCTCTCTGTAGGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAGAAGATTTACAGTGGCGATTATTAC ANEXO 259 F. Exclusión de la mutación: R844C G. Identificación de una nueva mutación: IVS16+1G>T Figura 2. Efecto de la mutación IVS16+1G>T en el reordenamiento de los exones de MERTK: Análisis del cDNA. A. Análisis del fragmento amplificado por F1 y R1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EX19 REFSEQ GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.2 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.3 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.5 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.6 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.12 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.14 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA II.15 GTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACCTTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|. EX16 REFSEQ AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATGTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.2 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATTTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.3 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATTTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.5 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATKTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.6 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATGTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.12 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATKTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.14 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATTTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT II.15 AGGAATTTTCTTCATCGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATKTAAGAGTCCTCGGCTATCCTGGAAGGGTTTGGACCTCATGGTGTTTGGT 123 bp ladder 123 bp ladder II.2 II.3 II.5 II.9 II.12 II.14 II.15 II.6 A B C (-) BIBLIOGRAFÍA 266 56. Boesze-Battaglia, K. (1997): Fusion of intracellular rod outer segment disk membranes with the surrounding plasma membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 38:487-497. 57. Boesze-Battaglia, K., Stefano, F. P., Fitzgerald, C. y Muller-Weeks, S. (2007): ROM-1 potentiates photoreceptor specific membrane fusion processes. Exp Eye Res 84:22-31. 58. Boesze-Battaglia, K. y Stefano, F. P. (2002): Peripherin/rds fusogenic function correlates with subunit assembly. Exp Eye Res 75:227-231. 59. Boggon, T. J., Shan, W. S., Santagata, S., Myers, S. C. y Shapiro, L. (1999): Implication of tubby proteins as transcription factors by structure-based functional analysis. Science 286:2119-2125. 60. Bok, D. (2007): Contributions of genetics to our understanding of inherited monogenic retinal diseases and age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol 125:160-164. 61. Bok, D. y Hall, M. O. (1971): The role of the pigment epithelium in the etiology of inherited retinal dystrophy in the rat5. J Cell Biol 49:664-682. 62. Bonapace, G., Waheed, A., Shah, G. N. y Sly, W. S. (2004): Chemical chaperones protect from effects of apoptosisinducing mutation in carbonic anhydrase IV identified in retinitis pigmentosa 17. Proc Natl Acad Sci USA 101:12300-12305. 63. Bork, J. M., Peters, L. M., Riazuddin, S., Bernstein, S. L., Ahmed, Z. M., Ness, S. L., Polomeno, R., Ramesh, A., Schloss, M., Srisailpathy, C. R., Wayne, S., Bellman, S., Desmukh, D., Ahmed, Z., Khan, S. N., Kaloustian, V. M., Li, X. C., Lalwani, A., Riazuddin, S., Bitner-Glindzicz, M., Nance, W. E., Liu, X. Z., Wistow, G., Smith, R. J., Griffith, A. J., Wilcox, E. R., Friedman, T. B. y Morell, R. J. (2001): Usher syndrome 1D and nonsyndromic autosomal recessive deafness DFNB12 are caused by allelic mutations of the novel cadherin-like gene CDH23. Am J Hum Genet 68:26-37. 64. Bormann, J. y Feigenspan, A. (1995): GABAC receptors. Trends Neurosci 18:515-519. 65. Bornancin, F., Mechtcheriakova, D., Stora, S., Graf, C., Wlachos, A., Devay, P., Urtz, N., Baumruker, T. y Billich, A. (2005): Characterization of a ceramide kinase-like protein. Biochim Biophys Acta 1687:31-43. 66. Bowne, S. J., Daiger, S. P., Hims, M. M., Sohocki, M. M., Malone, K. A., McKie, A. B., Heckenlively, J. R., Birch, D. G., Inglehearn, C. F., Bhattacharya, S. S., Bird, A. y Sullivan, L. S. (1999): Mutations in the RP1 gene causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet 8:2121-2128. 67. Bowne, S. J., Liu, Q., Sullivan, L. S., Zhu, J., Spellicy, C. J., Rickman, C. B., Pierce, E. A. y Daiger, S. P. (2006a): Why do mutations in the ubiquitously expressed housekeeping gene IMPDH1 cause retina-specific photoreceptor degeneration? Invest Ophthalmol Vis Sci 47:3754-3765. 68. Bowne, S. J., Sullivan, L. S., Blanton, S. H., Cepko, C. L., Blackshaw, S., Birch, D. G., Hughbanks-Wheaton, D., Heckenlively, J. R. y Daiger, S. P. (2002): Mutations in the inosine monophosphate dehydrogenase 1 gene (IMPDH1) cause the RP10 form of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet 11:559-568. 69. Bowne, S. J., Sullivan, L. S., Mortimer, S. E., Hedstrom, L., Zhu, J., Spellicy, C. J., Gire, A. I., Hughbanks-Wheaton, D., Birch, D. G., Lewis, R. A., Heckenlively, J. R. y Daiger, S. P. (2006b): Spectrum and frequency of mutations in IMPDH1 associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa and leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci 47:34-42. 70. Boylan, J. P. y Wright, A. F. (2000): Identification of a novel protein interacting with RPGR. Hum Mol Genet 9:20852093. 71. Bozanic, D., Tafra, R. y Saraga-Babic, M. (2003): Role of apoptosis and mitosis during human eye development. Eur J Cell Biol 82:421-429. 72. Breuer, D. K., Yashar, B. M., Filippova, E., Hiriyanna, S., Lyons, R. H., Mears, A. J., Asaye, B., Acar, C., Vervoort, R., Wright, A. F., Musarella, M. A., Wheeler, P., MacDonald, I., Iannaccone, A., Birch, D., Hoffman, D. R., Fishman, G. A., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G., Sieving, P. A. y Swaroop, A. (2002): A comprehensive mutation analysis of RP2 and RPGR in a North American cohort of families with X-linked retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet 70:1545-1554. 73. Briggs, C. E., Rucinski, D., Rosenfeld, P. J., Hirose, T., Berson, E. L. y Dryja, T. P. (2001): Mutations in ABCR (ABCA4) in patients with Stargardt macular degeneration or cone-rod degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:22292236. 74. Brown, D., Zhu, X. L. y Sly, W. S. (1990): Localization of membrane-associated carbonic anhydrase type IV in kidney epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 87:7457-7461. BIBLIOGRAFÍA 267 75. Buczylko, J., Saari, J. C., Crouch, R. K. y Palczewski, K. (1996): Mechanisms of opsin activation. J Biol Chem 271:2062120630. 76. Budu, Matsumoto, M., Hayasaka, S., Yamada, T. y Hayasaka, Y. (2000): Rhodopsin gene codon 106 mutation (Gly-to-Arg) in a Japanese family with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Jpn J Ophthalmol 44:610-614. 77. Bumsted O'Brien, K. M., Schulte, D. y Hendrickson, A. E. (2003): Expression of photoreceptor-associated molecules during human fetal eye development. Mol Vis 9:401-409. 78. Bumsted, K. y Hendrickson, A. (1999): Distribution and development of short-wavelength cones differ between Macaca monkey and human fovea. J Comp Neurol 403:502-516. 79. Bunge, S., Wedemann, H., David, D., Terwilliger, D. J., van den Born, L. I., ulehla-Scholz, C., Samanns, C., Horn, M., Ott, J., Schwinger, E., Schinzel, A., Denton, M. J. y Gal, A. (1993): Molecular analysis and genetic mapping of the rhodopsin gene in families with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Genomics 17:230-233. 80. Buraczynska, M., Wu, W., Fujita, R., Buraczynska, K., Phelps, E., Andreasson, S., Bennett, J., Birch, D. G., Fishman, G. A., Hoffman, D. R., Inana, G., Jacobson, S. G., Musarella, M. A., Sieving, P. A. y Swaroop, A. (1997): Spectrum of mutations in the RPGR gene that are identified in 20% of families with X-linked retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet 61:1287-1292. 81. Burstedt, M. S., Sandgren, O., Holmgren, G. y Forsman-Semb, K. (1999): Bothnia dystrophy caused by mutations in the cellular retinaldehyde-binding protein gene (RLBP1) on chromosome 15q26. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:995-1000. C 82. Cahill, G. M. y Besharse, J. C. (1993): Circadian clock functions localized in Xenopus retinal photoreceptors. Neuron 10:573-577. 83. Calabrese, G., Sallese, M., Stornaiuolo, A., Stuppia, L., Palka, G. y De, B. A. (1994): Chromosome mapping of the human arrestin (SAG), beta-arrestin 2 (ARRB2), and beta-adrenergic receptor kinase 2 (ADRBK2) genes. Genomics 23:286-288. 84. Calvert, P. D., Ho, T. W., LeFebvre, Y. M. y Arshavsky, V. Y. (1998): Onset of feedback reactions underlying vertebrate rod photoreceptor light adaptation. J Gen Physiol 111:39-51. 85. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N. y Arshavsky, V. Y. (2006): Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol 16:560-568. 86. Capeans, C., Blanco, M. J., Lareu, M. V., Barros, F., Pineiro, A., Sanchez-Salorio, M. y Carracedo, A. (1998): Linkage analysis in a large Spanish family with X-linked retinitis pigmentosa: phenotype-genotype correlation. Clin Genet 54:26-32. 87. Caruso, G., Bisegna, P., Shen, L., Andreucci, D., Hamm, H. E. y DiBenedetto, E. (2006): Modeling the role of incisures in vertebrate phototransduction. Biophys J 91:1192-1212. 88. Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M. y Ezzeddine, D. (1996): Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci USA 93:589-595. 89. Chaitin, M. H. y Hall, M. O. (1983): Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 24:812-820. 90. Chakarova, C. F., Hims, M. M., Bolz, H., bu-Safieh, L., Patel, R. J., Papaioannou, M. G., Inglehearn, C. F., Keen, T. J., Willis, C., Moore, A. T., Rosenberg, T., Webster, A. R., Bird, A. C., Gal, A., Hunt, D., Vithana, E. N. y Bhattacharya, S. S. (2002): Mutations in HPRP3, a third member of pre-mRNA splicing factor genes, implicated in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet 11:87-92. 91. Chakarova, C. F., Papaioannou, M. G., Khanna, H., Lopez, I., Waseem, N., Shah, A., Theis, T., Friedman, J., Maubaret, C., Bujakowska, K., Veraitch, B., bd El-Aziz, M. M., Prescott, d. Q., Parapuram, S. K., Bickmore, W. A., Munro, P. M., Gal, A., Hamel, C. P., Marigo, V., Ponting, C. P., Wissinger, B., Zrenner, E., Matter, K., Swaroop, A., Koenekoop, R. K. y Bhattacharya, S. S. (2007): Mutations in TOPORS cause autosomal dominant retinitis pigmentosa with perivascular retinal pigment epithelium atrophy. Am J Hum Genet 81:1098-1103. 92. Chang, G. Q., Hao, Y. y Wong, F. (1993): Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron 11:595-605. BIBLIOGRAFÍA 268 93. Chang, Y. P., Kim, J. D., Schwander, K., Rao, D. C., Miller, M. B., Weder, A. B., Cooper, R. S., Schork, N. J., Province, M. A., Morrison, A. C., Kardia, S. L., Quertermous, T. y Chakravarti, A. (2006): The impact of data quality on the identification of complex disease genes: experience from the Family Blood Pressure Program. Eur J Hum Genet 14:469-477. 94. Chapple, J. P., Hardcastle, A. J., Grayson, C., Spackman, L. A., Willison, K. R. y Cheetham, M. E. (2000): Mutations in the N-terminus of the X-linked retinitis pigmentosa protein RP2 interfere with the normal targeting of the protein to the plasma membrane. Hum Mol Genet 9:1919-1926. 95. Chen, G., Adeyemo, A., Zhou, J., Yuan, A., Chen, Y. y Rotimi, C. (2005a): Genome scan linkage analysis comparing microsatellites and single-nucleotide polymorphisms markers for two measures of alcoholism in chromosomes 1, 4, and 7. BMC Genet 6 Suppl 1:S4. 96. Chen, J., Rattner, A. y Nathans, J. (2005b): The rod photoreceptor-specific nuclear receptor Nr2e3 represses transcription of multiple cone-specific genes. J Neurosci 25:118-129. 97. Chen, P., Hao, W., Rife, L., Wang, X. P., Shen, D., Chen, J., Ogden, T., Van Boemel, G. B., Wu, L., Yang, M. y Fong, H. K. (2001): A photic visual cycle of rhodopsin regeneration is dependent on Rgr. Nat Genet 28:256-260. 98. Chen, S., Wang, Q. L., Nie, Z., Sun, H., Lennon, G., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A. y Zack, D. J. (1997): Crx, a novel Otx-like paired-homeodomain protein, binds to and transactivates photoreceptor cell-specific genes. Neuron 19:1017-1030. 99. Chen, T. Y., Illing, M., Molday, L. L., Hsu, Y. T., Yau, K. W. y Molday, R. S. (1994): Subunit 2 (or beta) of retinal rod cGMP-gated cation channel is a component of the 240-kDa channel-associated protein and mediates Ca(2+)- calmodulin modulation. Proc Natl Acad Sci USA 91:11757-11761. 100. Chen, Y., Ma, J. X. y Crouch, R. K. (2003): Down-regulation of RPE65 protein expression and promoter activity by retinoic acid. Mol Vis 9:345-354. 101. Cheng, H., Khanna, H., Oh, E. C., Hicks, D., Mitton, K. P. y Swaroop, A. (2004): Photoreceptor-specific nuclear receptor NR2E3 functions as a transcriptional activator in rod photoreceptors. Hum Mol Genet 13:1563-1575. 102. Cheng, T., Peachey, N. S., Li, S., Goto, Y., Cao, Y. y Naash, M. I. (1997): The effect of peripherin/rds haploinsufficiency on rod and cone photoreceptors. J Neurosci 17:8118-8128. 103. Chow, R. L. y Lang, R. A. (2001): Early eye development in vertebrates. Annu Rev Cell Dev Biol 17:255-296. 104. Cideciyan, A. V., Hood, D. C., Huang, Y., Banin, E., Li, Z. Y., Stone, E. M., Milam, A. H. y Jacobson, S. G. (1998): Disease sequence from mutant rhodopsin allele to rod and cone photoreceptor degeneration in man. Proc Natl Acad Sci USA 95:7103-7108. 105. Clarke, G., Goldberg, A. F., Vidgen, D., Collins, L., Ploder, L., Schwarz, L., Molday, L. L., Rossant, J., Szel, A., Molday, R. S., Birch, D. G. y McInnes, R. R. (2000a): Rom-1 is required for rod photoreceptor viability and the regulation of disk morphogenesis. Nat Genet 25:67-73. 106. Clarke, G., Goldberg, A. F., Vidgen, D., Collins, L., Ploder, L., Schwarz, L., Molday, L. L., Rossant, J., Szel, A., Molday, R. S., Birch, D. G. y McInnes, R. R. (2000b): Rom-1 is required for rod photoreceptor viability and the regulation of disk morphogenesis. Nat Genet 25:67-73. 107. Collins, C., Hutchinson, G., Kowbel, D., Riess, O., Weber, B. y Hayden, M. R. (1992): The human beta-subunit of rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase: complete retinal cDNA sequence and evidence for expression in brain. Genomics 13:698-704. 108. Connell, G., Bascom, R., Molday, L., Reid, D., McInnes, R. R. y Molday, R. S. (1991): Photoreceptor peripherin is the normal product of the gene responsible for retinal degeneration in the rds mouse. Proc Natl Acad Sci USA 88:723-726. 109. Connell, G. J. y Molday, R. S. (1990): Molecular cloning, primary structure, and orientation of the vertebrate photoreceptor cell protein peripherin in the rod outer segment disk membrane. Biochemistry 29:4691-4698. 110. Cook, N. J., Hanke, W. y Kaupp, U. B. (1987): Identification, purification, and functional reconstitution of the cyclic GMP-dependent channel from rod photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA 84:585-589. 111. Cook, T. A., Ghomashchi, F., Gelb, M. H., Florio, S. K. y Beavo, J. A. (2001): The delta subunit of type 6 phosphodiesterase reduces light-induced cGMP hydrolysis in rod outer segments. J Biol Chem 276:5248-5255. 112. Coppieters, F., Leroy, B. P., Beysen, D., Hellemans, J., De, B. K., Haegeman, G., Robberecht, K., Wuyts, W., Coucke, P. J. y De, B. E. (2007): Recurrent mutation in the first zinc finger of the orphan nuclear receptor NR2E3 causes autosomal dominant retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet 81:147-157. BIBLIOGRAFÍA 269 113. Corbeil, D., Roper, K., Hannah, M. J., Hellwig, A. y Huttner, W. B. (1999): Selective localization of the polytopic membrane protein prominin in microvilli of epithelial cells - a combination of apical sorting and retention in plasma membrane protrusions. J Cell Sci 112 ( Pt 7):1023-1033. 114. Cote, R. H., Bownds, M. D. y Arshavsky, V. Y. (1994): cGMP binding sites on photoreceptor phosphodiesterase: role in feedback regulation of visual transduction. Proc Natl Acad Sci USA 91:4845-4849. 115. Cotran, P. R., Ringens, P. J., Crabb, J. W., Berson, E. L. y Dryja, T. P. (1990): Analysis of the DNA of patients with retinitis pigmentosa with a cellular retinaldehyde binding protein cDNA. Exp Eye Res 51:15-19. 116. Crabb, J. W., Goldflam, S., Harris, S. E. y Saari, J. C. (1988): Cloning of the cDNAs encoding the cellular retinaldehydebinding protein from bovine and human retina and comparison of the protein structures. J Biol Chem 263:18688-18692. 117. Cremers, F. P., Kimberling, W. J., Kulm, M., de Brouwer, A. P., van, W. E., te, B. H., Cremers, C. W., Hoefsloot, L. H., Banfi, S., Simonelli, F., Fleischhauer, J. C., Berger, W., Kelley, P. M., Haralambous, E., Bitner-Glindzicz, M., Webster, A. R., Saihan, Z., De, B. E., Leroy, B. P., Silvestri, G., McKay, G. J., Koenekoop, R. K., Millán, J. M., Rosenberg, T., Joensuu, T., Sankila, E. M., Weil, D., Weston, M. D., Wissinger, B. y Kremer, H. (2007): Development of a genotyping microarray for Usher syndrome. J Med Genet 44:153-160. 118. Cremers, F. P., van de Pol, D. J., van, D. M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A. F. y Hoyng, C. B. (1998): Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt's disease gene ABCR. Hum Mol Genet 7:355-362. 119. Curcio, C. A., Millican, C. L., Allen, K. A. y Kalina, R. E. (1993): Aging of the human photoreceptor mosaic: evidence for selective vulnerability of rods in central retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 34:3278-3296. D 120. D'Cruz, P. M., Yasumura, D., Weir, J., Matthes, M. T., Abderrahim, H., Lavail, M. M. y Vollrath, D. (2000): Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Hum Mol Genet 9:645-651. 121. Daiger, S. P., Bowne, S. J. y Sullivan, L. S. (2007): Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol 125:151-158. 122. Danciger, M., Blaney, J., Gao, Y. Q., Zhao, D. Y., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G. y Farber, D. B. (1995): Mutations in the PDE6B gene in autosomal recessive retinitis pigmentosa. Genomics 30:1-7. 123. Danciger, M., Heilbron, V., Gao, Y. Q., Zhao, D. Y., Jacobson, S. G. y Farber, D. B. (1996): A homozygous PDE6B mutation in a family with autosomal recessive retinitis pigmentosa. Mol Vis 2:10. 124. Dandekar, S. S., Ebenezer, N. D., Grayson, C., Chapple, J. P., Egan, C. A., Holder, G. E., Jenkins, S. A., Fitzke, F. W., Cheetham, M. E., Webster, A. R. y Hardcastle, A. J. (2004): An atypical phenotype of macular and peripapillary retinal atrophy caused by a mutation in the RP2 gene. Br J Ophthalmol 88:528-532. 125. Daniele, L. L., Adams, R. H., Durante, D. E., Pugh, E. N. y Philp, N. J. (2007): Novel distribution of junctional adhesion molecule-C in the neural retina and retinal pigment epithelium. J Comp Neurol 505:166-176. 126. De Luca, A., Torrente, I., Mangino, M., Danesi, R., Dallapiccola, B. y Novelli, G. (2001): Three novel mutations causing a truncated protein within the RP2 gene in Italian families with X-linked retinitis pigmentosa. Mutat Res 432:79-82. 127. DeAngelis, M. M., Grimsby, J. L., Sandberg, M. A., Berson, E. L. y Dryja, T. P. (2002): Novel mutations in the NRL gene and associated clinical findings in patients with dominant retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol 120:369-375. 128. Demirci, F. Y., Radak, A. L., Rigatti, B. W., Mah, T. S. y Gorin, M. B. (2004): A presumed missense mutation of RPGR causes abnormal RNA splicing with exon skipping. Am J Ophthalmol 138:504-505. 129. Demirci, F. Y., Rigatti, B. W., Wen, G., Radak, A. L., Mah, T. S., Baic, C. L., Traboulsi, E. I., Alitalo, T., Ramser, J. y Gorin, M. B. (2002): X-linked cone-rod dystrophy (locus COD1): identification of mutations in RPGR exon ORF15. Am J Hum Genet 70:1049-1053. 130. Demirci, F. Y. K., Rigatti, B. W., Mah, T. S. y Gorin, M. B. (2006): A novel RPGR exon ORF15 mutation in a family with X-linked Retinitis Pigmentosa and Coats'-like exudative vasculopathy. Am J Ophthalmol 141:208-210. BIBLIOGRAFÍA 270 131. den Hollander, A. I., Davis, J., van der Velde-Visser SD, Zonneveld, M. N., Pierrottet, C. O., Koenekoop, R. K., Kellner, U., van den Born, L. I., Heckenlively, J. R., Hoyng, C. B., Handford, P. A., Roepman, R. y Cremers, F. P. (2004): CRB1 mutation spectrum in inherited retinal dystrophies. Hum Mutat 24:355-369. 132. den Hollander, A. I., Heckenlively, J. R., van den Born, L. I., de Kok, Y. J., van der Velde-Visser SD, Kellner, U., Jurklies, B., van Schooneveld, M. J., Blankenagel, A., Rohrschneider, K., Wissinger, B., Cruysberg, J. R., Deutman, A. F., Brunner, H. G., pfelstedt-Sylla, E., Hoyng, C. B. y Cremers, F. P. (2001): Leber congenital amaurosis and retinitis pigmentosa with Coats-like exudative vasculopathy are associated with mutations in the crumbs homologue 1 (CRB1) gene. Am J Hum Genet 69:198-203. 133. den Hollander, A. I., ten Brink, J. B., de Kok, Y. J., van, S. S., van den Born, L. I., van Driel, M. A., van de Pol, D. J., Payne, A. M., Bhattacharya, S. S., Kellner, U., Hoyng, C. B., Westerveld, A., Brunner, H. G., Bleeker-Wagemakers, E. M., Deutman, A. F., Heckenlively, J. R., Cremers, F. P. y Bergen, A. A. (1999a): Mutations in a human homologue of Drosophila crumbs cause retinitis pigmentosa (RP12). Nat Genet 23:217-221. 134. den Hollander, A. I., van der Velde-Visser SD, Pinckers, A. J., Hoyng, C. B., Brunner, H. G. y Cremers, F. P. (1999b): Refined mapping of the gene for autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP17) on chromosome 17q22. Hum Genet 104:73-76. 135. den Hollander, A. I., van Driel, M. A., de Kok, Y. J., van de Pol, D. J., Hoyng, C. B., Brunner, H. G., Deutman, A. F. y Cremers, F. P. (1999c): Isolation and mapping of novel candidate genes for retinal disorders using suppression subtractive hybridization. Genomics 58:240-249. 136. Dewar, A. J. y Reading, H. W. (1975): The biochemical aspects of Retinitis Pigmentosa. Int.J.Biochem. 6:615-641. 137. Dhallan, R. S., Macke, J. P., Eddy, R. L., Shows, T. B., Reed, R. R., Yau, K. W. y Nathans, J. (1992): Human rod photoreceptor cGMP-gated channel: amino acid sequence, gene structure, and functional expression. J Neurosci 12:3248-3256. 138. Dietrich, K., Jacobi, F. K., Tippmann, S., Schmid, R., Zrenner, E., Wissinger, B. y pfelstedt-Sylla, E. (2002): A novel mutation of the RP1 gene (Lys778ter) associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Br J Ophthalmol 86:328-332. 139. Dowling, J. E. y Sidman, R. L. (1962): Inherited retinal dystrophy in the rat. J Cell Biol 14:73-109. 140. Dry, K. L., Manson, F. D., Lennon, A., Bergen, A. A., Van Dorp, D. B. y Wright, A. F. (1999): Identification of a 5' splice site mutation in the RPGR gene in a family with X-linked retinitis pigmentosa (RP3). Hum Mutat 13:141-145. 141. Dryja, T. P., Adams, S. M., Grimsby, J. L., McGee, T. L., Hong, D. H., Li, T., Andreasson, S. y Berson, E. L. (2001): Null RPGRIP1 alleles in patients with Leber congenital amaurosis. Am J Hum Genet 68:1295-1298. 142. Dryja, T. P. y Berson, E. L. (1995): Retinitis pigmentosa and allied diseases. Implications of genetic heterogeneity. Invest Ophthalmol Vis Sci 36:1197-1200. 143. Dryja, T. P., Berson, E. L., Rao, V. R. y Oprian, D. D. (1993): Heterozygous missense mutation in the rhodopsin gene as a cause of congenital stationary night blindness. Nat Genet 4:280-283. 144. Dryja, T. P., Finn, J. T., Peng, Y. W., McGee, T. L., Berson, E. L. y Yau, K. W. (1995): Mutations in the gene encoding the alpha subunit of the rod cGMP-gated channel in autosomal recessive retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci USA 92:10177-10181. 145. Dryja, T. P., Hahn, L. B., Cowley, G. S., McGee, T. L. y Berson, E. L. (1991): Mutation spectrum of the rhodopsin gene among patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci USA 88:9370-9374. 146. Dryja, T. P., Hahn, L. B., Kajiwara, K. y Berson, E. L. (1997): Dominant and digenic mutations in the peripherin/RDS and ROM1 genes in retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci 38:1972-1982. 147. Dryja, T. P., McEvoy, J. A., McGee, T. L. y Berson, E. L. (2000): Novel rhodopsin mutations Gly114Val and Gln184Pro in dominant retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci 41:3124-3127. 148. Dryja, T. P., Rucinski, D. E., Chen, S. H. y Berson, E. L. (1999): Frequency of mutations in the gene encoding the alpha subunit of rod cGMP-phosphodiesterase in autosomal recessive retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:1859-1865. 149. Dunaief, J. L., Dentchev, T., Ying, G. S. y Milam, A. H. (2002): The role of apoptosis in age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol 120:1435-1442. 150. Duncan, J. L., Lavail, M. M., Yasumura, D., Matthes, M. T., Yang, H., Trautmann, N., Chappelow, A. V., Feng, W., Earp, H. S., Matsushima, G. K. y Vollrath, D. (2003): An RCS-like retinal dystrophy phenotype in mer knockout mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 44:826-838. BIBLIOGRAFÍA 271 E 151. Ebenezer, N. D., Michaelides, M., Jenkins, S. A., Audo, I., Webster, A. R., Cheetham, M. E., Stockman, A., Maher, E. R., Ainsworth, J. R., Yates, J. R., Bradshaw, K., Holder, G. E., Moore, A. T. y Hardcastle, A. J. (2005): Identification of novel RPGR ORF15 mutations in X-linked progressive cone-rod dystrophy (XLCORD) families. Invest Ophthalmol Vis Sci 46:1891-1898. 152. Ecklund, W. J. (2000): Retinitis pigmentosa: distribution of inheritance patterns in a VA blind rehabilitation center population. Clin Eye Vis Care 12:107-112. 153. Eckmiller, M. S. (2004): Defective cone photoreceptor cytoskeleton, alignment, feedback, and energetics can lead to energy depletion in macular degeneration. Prog Retin Eye Res 23:495-522. 154. Eichers, E. R., Green, J. S., Stockton, D. W., Jackman, C. S., Whelan, J., McNamara, J. A., Johnson, G. J., Lupski, J. R. y Katsanis, N. (2002): Newfoundland rod-cone dystrophy, an early-onset retinal dystrophy, is caused by splicejunction mutations in RLBP1. Am J Hum Genet 70:955-964. 155. El Matri L., Ambresin, A., Schorderet, D. F., Kawasaki, A., Seeliger, M. W., Wenzel, A., Arsenijevic, Y., Borruat, F. X. y Munier, F. L. (2006): Phenotype of three consanguineous Tunisian families with early-onset retinal degeneration caused by an R91W homozygous mutation in the RPE65 gene. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 244:1104-1112. 156. Eudy, J. D., Weston, M. D., Yao, S., Hoover, D. M., Rehm, H. L., Ma-Edmonds, M., Yan, D., Ahmad, I., Cheng, J. J., Ayuso, C., Cremers, C., Davenport, S., Moller, C., Talmadge, C. B., Beisel, K. W., Tamayo, M., Morton, C. C., Swaroop, A., Kimberling, W. J. y Sumegi, J. (1998): Mutation of a gene encoding a protein with extracellular matrix motifs in Usher syndrome type IIa. Science 280:1753-1757. F 157. Falls, H. F. (1952): The role of the sex chromosome in hereditary ocular pathology. Trans Am Ophthalmol Soc 50:421-467. 158. Fariss, R. N., Li, Z. Y. y Milam, A. H. (2000): Abnormalities in rod photoreceptors, amacrine cells, and horizontal cells in human retinas with retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol 129:215-223. 159. Farjo, Q., Jackson, A., Pieke-Dahl, S., Scott, K., Kimberling, W. J., Sieving, P. A., Richards, J. E. y Swaroop, A. (1997): Human bZIP transcription factor gene NRL: structure, genomic sequence, and fine linkage mapping at 14q11.2 and negative mutation analysis in patients with retinal degeneration. Genomics 45:395-401. 160. Farjo, R., Skaggs, J. S., Nagel, B. A., Quiambao, A. B., Nash, Z. A., Fliesler, S. J. y Naash, M. I. (2006): Retention of function without normal disc morphogenesis occurs in cone but not rod photoreceptors. J Cell Biol 173:59-68. 161. Farrar, G. J., Kenna, P., Jordan, S. A., Kumar-Singh, R., Humphries, M. M., Sharp, E. M., Sheils, D. y Humphries, P. (1992): Autosomal dominant retinitis pigmentosa: a novel mutation at the peripherin/RDS locus in the original 6plinked pedigree. Genomics 14:805-807. 162. Farrar, G. J., Kenna, P., Jordan, S. A., Kumar-Singh, R., Humphries, M. M., Sharp, E. M., Sheils, D. M. y Humphries, P. (1991a): A three-base-pair deletion in the peripherin-RDS gene in one form of retinitis pigmentosa. Nature 354:478-480. 163. Farrar, G. J., Kenna, P., Redmond, R., Shiels, D., McWilliam, P., Humphries, M. M., Sharp, E. M., Jordan, S., Kumar-Singh, R. y Humphries, P. (1991b): Autosomal dominant retinitis pigmentosa: a mutation in codon 178 of the rhodopsin gene in two families of Celtic origin. Genomics 11:1170-1171. 164. Farrar, G. J., Kenna, P. F. y Humphries, P. (2002): On the genetics of retinitis pigmentosa and on mutation-independent approaches to therapeutic intervention. EMBO J 21:857-864. 165. Farrar, G. J., McWilliam, P., Bradley, D. G., Kenna, P., Lawler, M., Sharp, E. M., Humphries, M. M., Eiberg, H., Conneally, P. M., Trofatter, J. A. y Humphries, P. (1990): Autosomal dominant retinitis pigmentosa: linkage to rhodopsin and evidence for genetic heterogeneity. Genomics 8:35-40. 166. Felbor, U., Schilling, H. y Weber, B. H. (1997): Adult vitelliform macular dystrophy is frequently associated with mutations in the peripherin/RDS gene. Hum Mutat 10:301-309. 167. Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., Lavail, M. M. y Vollrath, D. (2002): Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem 277:17016-17022. [Document text truncated for crawler view.]