Descifrando la función de las proteínas con bromodominios en la generación de células pluripotentes

TESE DE DOUTORAMENTO DESCIFRANDO LA FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS CON BROMODOMINIOS EN LA GENERACIÓN DE CÉLULAS PLURIPOTENTES José Ángel Pardavila Paz ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL DA UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2021 AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR/TITOR DA TESE D./Dna. Anxo Vidal Figueroa En condición de: Director/a Título da tese: Descifrando la función de las proteínas con bromodominios en la generación de células pluripotentes INFORMA: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna José Ángel Pardavila Paz, baixo a miña dirección/titorización, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director/titor desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago de Compostela, 10 de Febreiro de 2021 Sinatura electrónica AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR/TITOR DA TESE D./Dna. Miguel Ángel Fidalgo Pérez En condición de: Titor/a e director/a Título da tese: Descifrando la función de las proteínas con bromodominios en la generación de células pluripotentes INFORMA: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna José Ángel Pardavila Paz, baixo a miña dirección/titorización, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director/titor desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago de Compostela, 10 de Febreiro de 2021 Sinatura electrónica DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. José Ángel Pardavila Paz Título da tese: Descifrando la función de las proteínas con bromodominios en la generación de células pluripotentes Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 23 de febrero de 2021. Firma electrónica DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERÉS José Ángel Pardavila Paz declara no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral En Santiago de Compostela, 03 de marzo de 2021 6 1. RESUMEN 7 8 La generación de células pluripotentes inducidas (iPSCs) representa una poderosa herramienta para entender los programas moleculares que determinan la identidad celular y alberga un gran potencial con fines terapéuticos. Sin embargo, la generación de iPSCs por lo general sigue siendo un proceso ineficiente y no del todo seguro, lo que limita sus potenciales usos clínicos. Mientras que la reprogramación somática para alcanzar la pluripotencia conlleva numerosos cambios transcriptómicos y epigenéticos a lo largo de distintas trayectorias celulares, el impacto del reconocimiento de residuos acetilados de lisina (Kac) dista mucho de ser comprendido. Por esto, en esta tesis investigamos de una manera exhaustiva el papel del reconocimiento de residuos Kac mediada por proteínas que contienen bromodominios (BRDs) durante reprogramación y en pluripotencia. Aquí identificamos que la actividad global BRD contenida en la superfamilia de proteínas BRD resulta esencial tanto para la generación de células iPSC como para el mantenimiento del estado celular pluripotente. Además, a través de cribados químicos descubrimos actividades BRD específicas que resultan inhibidoras o facilitadoras del proceso de reprogramación. De manera destacada, encontramos que la actividad BRD de la familia BET resulta imprescindible en pluripotencia y en las etapas finales de la reprogramación durante la transición pre-iPSC a iPSC. A nivel molecular, por medio de aproximaciones ómicas y análisis bioinformáticos, identificamos que la ausencia de actividad BRD de BET afecta a los procesos de estabilidad genómica, organización de la cromatina y control de la expresión génica que participan en la adquisición de pluripotencia. Finalmente, mediante aproximaciones de ganancia y pérdida de función hallamos funciones no redundantes e incluso opuestas de cada uno de los miembros de la familia BET que intervienen en reprogramación y pluripotencia. De manera colectiva, nuestros resultados proporcionan un conocimiento más a fondo de las dinámicas nucleares que tienen lugar en un contexto de reprogramación y pluripotencia, y contribuyen a un mejor entendimiento de las vías moleculares que preservan la identidad celular. Además, la manipulación de los mecanismos identificados en los que participa la actividad BRD de BET tiene el potencial de facilitar la generación de iPSCs de una manera más eficiente y segura. 9 10 2. INTRODUCCIÓN 11 12 2.1 EXORDIO Uno de los avances más fascinantes en las últimas décadas es la posibilidad de manipular los programas celulares de diferenciación para generar cualquier célula deseada, lo que representa una gran esperanza con fines terapéuticos. Probablemente, el descubrimiento más llamativo a este respecto fue el realizado en 2006 por el Dr. Shinya Yamanaka cuando demostró que es posible reprogramar células diferenciadas hacia células pluripotentes inducidas (iPSCs), las cuales son muy similares a las células troncales embrionarias (ESCs). Por medio de la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción (OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC) las células diferenciadas pueden ser reprogramadas y adquirir el estado celular pluripotente, que se caracteriza por un potencial ilimitado de autorrenovación y capacidad de dar lugar a cualquiera de los tipos celulares presentes en un organismo adulto. Así, no es de extrañar que la comunidad científica haya dedicado un gran esfuerzo en tratar de entender los programas moleculares que intervienen y determinan la adquisición de pluripotencia durante el proceso de reprogramación celular somática (SCR). Sin embargo, a pesar de los grandes avances realizados desde el descubrimiento de las iPSCs, todavía existen varios retos actuales que necesitan ser resueltos para poder hacer realidad totas las expectativas generadas en torno a esta poderosa tecnología. Esto se debe en gran parte a que todavía no se conocen en profundidad los programas moleculares que gobiernan este complejo proceso de reprogramación de una identidad celular diferenciada en una pluripotente. Motivados por esto, en esta tesis doctoral nos propusimos esclarecer el papel casi desconocido del reconocimiento de la acetilación en residuos de lisina (Kac) durante la SCR y en la pluripotencia una vez establecida. En concreto, abordamos mediante una gran variedad de aproximaciones moleculares y celulares cuál sería la función o funciones del reconocimiento en residuos Kac por los bromodominios (BRDs), los únicos dominios proteicos conocidos con capacidad de interpretar esta modificación epigenética. En las siguientes secciones y con el fin de facilitar la comprensión de los resultados obtenidos, se introducirá de manera simple y concisa el estado del arte relacionado con la meta de estudio de esta tesis doctoral. 13 2.2 EL ESTADO CELULAR PLURIPOTENTE En mamíferos, la pluripotencia es un estado celular que existe de manera transitoria durante los estadios tempranos del desarrollo embrionario. En condiciones de cultivo celular, las células pluripotentes (PSCs, por sus siglas en inglés) incluyen a las células troncales embrionarias (ESCs, por sus siglas en inglés) y las células pluripotentes inducidas (iPSCs, por sus siglas en inglés). Debido a que las PSCs poseen la capacidad de autorrenovarse indefinidamente en cultivo y la habilidad de diferenciarse a cualquier tipo celular que forma parte de un organismo adulto (Figura I1), representan una prometedora herramienta para la medicina regenerativa entre otros fines. Figura I1. Características principales de las PSCs. Esquema simplificado en el que se muestran las principales características de las PSCs. Cada PSC individual puede dar lugar a otra célula idéntica mediante división simétrica (autorrenovación) y posee la habilidad a su vez, mediante división asimétrica, de dar lugar a células precursoras de cada una de las tres capas germinales que se corresponden con ectodermo, mesodermo y endodermo (diferenciación). A continuación, se abordará de manera breve el conocimiento actual de los mecanismos moleculares gobernando el estado celular pluripotente y se encuentran estrechamente relacionados con este trabajo de tesis doctoral. Esta sección versará sobre la pluripotencia murina por ser el modelo de estudio escogido para abordar qué funciones desempeñan las proteínas que contienen BRDs en reprogramación y pluripotencia. 14 2.2.1 Las etapas tempranas del desarrollo embrionario Tras la fecundación, la formación y división del zigoto se produce la activación del programa transcripcional embrionario (Figura I2). Esta activación del programa embrionario ocurre en ratón el día 1.5 post-fertilización, en el estado celular de dos células (2C) 1,2. En sentido estricto, las 2C son totipotentes o, lo que es lo mismo, capaces de dar lugar a cualquier célula precursora de las tres capas germinales del embrión y a todas las estructuras extraembrionarias necesarias para el desarrollo del mismo 1-3. Figura I2. Etapas tempranas del desarrollo embrionario. Simplificación esquemática mostrando las etapas del desarrollo embrionario temprano en ratón (arriba) y respectiva recapitulación de tipo celulares in vitro (centro) e interconversión en ellos (flechas) mediante cultivo en medios específicos. El código de color (abajo) representa el estado de pluripotencia en el que se encuentran las células resaltadas durante el desarrollo in vivo (arriba) o de la recapitulación del estado in vitro (abajo). 15 En la etapa comprendida entre 2,5-3,5 días post-fertilización la división, polarización y especialización celular conduce a la formación de una estructura multicelular hueca denominada blastocisto 2. El blastocisto es una estructura compuesta por dos masas celulares, una dispuesta de manera externa y otra interna, formando una oquedad denominada blastocele 2. La capa celular externa, constituida por células de trofoectodermo (TE) y denominada trofoblasto, contribuirá a las estructuras extraembrionarias necesarias para la implantación y el desarrollo embrionario posterior 2. La masa celular interna (ICM, por sus siglas en inglés), rodeada por una capa de células del endodermo primitivo denominada hipoblasto, está formada por las células de las que se derivan las ESCs 2. Las células de la ICM que forman el ectodermo primitivo (o embrioblasto/epiblasto), darán lugar a todos los tipos celulares que constituyen un individuo adulto incluyendo la línea germinal. Las células de la ICM en estado pre-implantacional se encuentran en un estado celular pluripotente que se ha denominado naïve 2,4. A día 4 post-fertilización, se produce la implantación del blastocisto en la pared uterina mediante un intrincado proceso en el cual el blastocisto ha de salir de su capa externa (la zona pellucida proveniente del oocito) para yuxtaponerse y adherirse a la pared uterina, para que finalmente las células del trofoblasto invadan y reconstruyan las arterias espirales maternas asegurando el flujo sanguíneo entre madre y feto 5. Tras la implantación, las células pluripotentes se encuentran formando el epiblasto post-implantacional, del cual se puede derivar otro tipo de célula madre troncal, denominada del epiblasto tardío (EpiSCs, por sus siglas en inglés), que se caracterizan por un estado celular pluripotente con características propias que se ha denominado primed 2,4,6,7. Hoy en día, sabemos que tanto en desarrollo como en cultivo celular la pluripotencia abarca un espectro continuo de distintos estados celulares con características propias 8,9. Por ejemplo, recientemente se ha conseguido derivar también en cultivo, además de los estados de pluripotentes naïve y primed, un estado pluripotente al que se ha denominado formative 8,10,11. 2.2.2 Las células troncales embrionarias Inicialmente las ESCs de origen murino fueron derivadas de células de la ICM de blastocistos pre-implantacionales y cultivadas sobre 22 de manera cooperativa distintas dianas aguas abajo entre los que se incluyen ellos mismos, Pou5f1 y Sox2 73,74. Por su parte, NANOG es requerido para la formación del epiblasto tardío a partir de la ICM 75,76. Es de resaltar, que la expresión constitutiva de NANOG en ESCs murinas permite la autorrenovación de éstas en ausencia de la citoquina LIF, de la que hablaremos en la siguiente sección 75,76. OCT4, SOX2 y NANOG (OSN), ocupan simultáneamente la mayoría de sus dianas genómicas, entre las cuales se incluyen TFs esenciales en el control de pluripotencia, como ESRRB y miembros de la familia KLF (ej. KLF2 y KLF4) 77-80. OSN también trabajan en conjunto reprimiendo la transcripción de genes específicos de linaje, impidiendo la salida de pluripotencia y diferenciación espontánea de las ESCs 81. Figura I6. Red transcripcional y factores centrales en pluripotencia. Los factores centrales OCT4, SOX2 y NANOG interactúan entre ellos en un bucle de regulación y autorregulación positiva (flechas rojas vacías) y a su vez, cada uno de ellos interactúa de manera positiva (flechas rojas) o negativa (flechas azules) con otros factores de transcripción y viceversa. Este ciclo regulatorio formado por OSN parece ser el responsable de la inducción de la expresión de genes asociados a 23 pluripotencia, incluyendo su propia expresión, durante la formación de iPSCs a partir de células somáticas 67,82. c-MYC, uno de los cuatro “factores de Yamanaka”, y presente en muchos de los cócteles de reprogramación utilizados hasta la fecha, parece facilitar la activación de este circuito de retroalimentación mediante la estimulación de la expresión génica y la proliferación celular, pero de forma general, no específica de genes relacionados con el estado celular pluripotente 83. 2.3.1.2 Vías de señalización La adquisición y mantenimiento de pluripotencia requiere la activación e inhibición de múltiples vías de señalización (Figura I7). Como ya se ha comentado, las ESCs de origen murino fueron inicialmente derivadas en cultivo en presencia de fibroblastos irradiados y en presencia de suero, lo que proporciona al medio de cultivo citoquinas (ej, LIF, WNT y BMP4) junto con otros factores que favorecen la autorrenovación 12,13,67. Las señales de LIF (Figura I7, izquierda) activan el programa genético de autorrenovación a través del factor STAT3 84. Entre las múltiples dianas de vía LIF-STAT3 se encuentran los factores Klf4 y Tfcp2l1, cuya sobreexpresión facilita la autorrenovación de las ESCs sin necesidad de LIF 85-87 mediante la regulación al alza de la expresión del gen Nanog, el cual, y como hemos mencionado anteriormente, es suficiente para mantener la autorrenovación independiente de LIF cuando es sobreexpresado 87. Asimismo, se ha demostrado que la proteína BCL-3 actúa aguas abajo de la señalización LIF-STAT3 promoviendo el mantenimiento de pluripotencia mediante su asociación con OCT4 y β-CATENINA 88. Las señales de BMP, procedentes del suero, actúan mediante los factores de transcripción SMAD (Figura I7, derecha) evitando la diferenciación mediante la inhibición de genes de diferenciación 89. El efecto de la señalización BMP parece afectar al destino neuroectodérmico mientras LIF estaría evitando la diferenciación a linajes no neuronales 25. 24 Figura I7. Rutas de señalización extrínsecas que participan en el control del estado celular pluripotente. Esquema simplificado de las principales rutas de señalización que afectan autorrenovación de las PSCs. Las flechas señalan activación y las barras inhibición o bloqueo de la actividad de la diana. Las líneas continuas implican una diana directa o conocida aguas abajo y las discontinuas indican un efecto indirecto o inferido. Desde la izquierda y en el sentido de las agujas del reloj: BMP4 está presente en suero y actúa vía SMADs para para activar genes ID. La señalización LIF afecta muchas rutas, pero actúa principalmente vía fosforilación de STAT3 mediada por JAK, activando Tcfp2l1 y Klf4. La ruta WNT canónica bloquea la actividad GSK3 llevando a la estabilización de B-Catenina, que a su vez anula la represión de genes de pluripotencia mediada por TCF3. El inhibidor de GSK3 CHIR99021 imita fielmente la señalización WNT mediante la inhibición de GSK3. La señalización FGF active la ruta de las MAPK, llevando a la fosforilación de MEK, el cual fosforila y active ERK. ERK activado promueve la transición a un estado pluripotente primed, el cual se ve bloqueado mediante el uso del inhibidor de MEK PD0325901. La presencia de estos factores en el medio de cultivo hace que las ESCs integren señales de las rutas LIF-STAT3 y BMP-SMAD, mostrando un estado celular heterogéneo en cultivo debido a la competición con la vía FGF4-ERK, que promueve la diferenciación celular 90,91. También es posible mantener la pluripotencia de las PSCs en un estado homogéneo mediante la inhibición dual (2i) de las vías de señalización de las quinasas MEK/ERK y GSK3 mediante el uso de las 25 pequeñas moléculas PD0325901 y CHIR99021 (Figura I7, derecha), respectivamente 92. Las ESCs mantenidas en este medio libre de suero en presencia de 2i contribuyen a la formación de quimeras y transmisión a la línea germinal y se asemejan a las células pluripotentes del estado naïve de la ICM embrionaria a nivel transcriptómico 92-94. La inhibición dual de MEK/ERK y GSK, entre otras cosas, permite la estabilización de los niveles de KLF2 que resulta esencial para la pluripotencia naïve 79. Además, ERK también fosforila NANOG, reduciendo su actividad y estabilidad 95, por lo que su inhibición mantiene la actividad de este TF clave 25. 2.3.2 Regulación epigenética de la pluripotencia De manera general, la regulación epigenética puede definirse como los cambios fenotípicos, muchas veces heredables, producidos sin alteraciones en la secuencia de ADN (genotípicos). Estos cambios son mediados por una gran variedad de reguladores epigenéticos involucrados en modificaciones químicas sobre histonas y moléculas de ADN y ARN, así como por variantes de histonas y por ARNs no codificantes entre otros 96-98. El desarrollo, la especificación y el mantenimiento de destino celular requieren una fina coordinación entre factores de transcripción y las modificaciones químicas epigenéticas subyacentes que forman en conjunto el epigenoma celular. 99. La estructura, dinámica y función de la cromatina de células pluripotentes (PSCs) es distinta a la de las células diferenciadas 100. La cromatina de las PSCs se encuentra activa, en una conformación abierta, con un ADN menos metilado a nivel global y presencia de un patrón de modificaciones en histonas muy particular. Estas características epigenéticas distintivas resultan en una cromatina más abierta, en un estado más plástico y dinámico, lo que contribuye a mantener su potencial de diferenciación 100-103. Es importante resaltar la conservación de la preservación de estas características generales a nivel epigenético entre ESCs e iPSCs de origen murino y humano al ser comparadas con células diferenciadas. 26 2.3.2.1 Reguladores epigenéticos La regulación de la expresión génica se lleva a cabo mediante la colaboración de TFs que se unen a motivos específicos en el ADN dentro de promotores y potenciadores (o enhancers) que, en trabajo conjunto con los reguladores epigenéticos lleva a la activación o represión de los genes diana 104. Entre estos reguladores epigenéticos, nos encontramos factores que determinan el estado químico del epigenoma, ya que regulan la adición de la marca epigenética, la reconocen e interpretan y la retiran. Respectivamente y de manera general, nos referimos a estas proteínas epigenéticas como “escritoras” (writers), “lectoras” (readers) y “borradoras” (erasers) (Figura I8), 9698. Estos reguladores epigenéticos controlan el paisaje transcripcional específico de cada tipo celular mediante la deposición o retirada de modificaciones químicas reversibles sobre el ADN/ARN u otras proteínas como las histonas. Figura I8. Factores epigenéticos y dinámica de establecimiento e interpretación del epigenoma. Esquema representativo ejemplificando modificaciones químicas (círculos ocres) sobre las colas de las histonas. La adición de marca es catalizada por las “escritoras” (globo verde) y su retirada por las “borradoras” (globo rosa). La interpretación de las modificaciones es llevada a cabo por las “lectoras” (globo azul). Gran parte del efecto que presentan OCT4, SOX2 y NANOG sobre la modulación de la expresión génica se debe a su capacidad de interactuar y responder a reguladores epigenéticos 105,106 (Figura I9), entre los que se incluyen los complejos remodeladores de cromatina NuRD 106, SWI/SNF e ISWI 107 o TIP60-P400 108,109 y los complejos Mediator asociados a los potenciadores de la transcripción 110. 27 Figura I9. Principales interacciones entre la circuitería de transcripción central y reguladores epigenéticos. Principales factores epigenéticos (círculos de colores) interactuando con la red de transcripción central de pluripotencia (círculo amarillo central). El punteado rojo resalta los reguladores epigenéticos formando parte de los complejos explicitados. Las funciones más destacadas están resaltadas en color concordante a los factores. Colores pardos: factores relacionados con la acetilación de histonas; colores verdes: factores relacionados con la metilación de histonas y ácidos nucleicos. Otros reguladores epigenéticos con funciones relevantes en el control del estado celular de la pluripotencia son los modificadores de histonas 64, como las deacetilasas de histonas (HDACs) 64,111, y las metiltransferasas de histonas (ej. SETDB1 y WDR5) 112, las proteínas MLL (SET1A/B) 64, la familia de demetilasas con dominio Jumonji C 28 (JMJC) 64 y los complejos Polycomb 1 y 2 (PRC1 y PRC2) que son esenciales tanto en el desarrollo embrionario temprano 64,113,114 como en el control adecuado de los programas de diferenciación 64,113,115. 2.3.2.2 Metilación en células pluripotentes Existen diferencias claras y destacadas en el metiloma de las células pluripotentes y las somáticas. Por ejemplo, la cromatina de las ESCs muestra un mayor grado de marcas activadoras en las histonas (ej. H3K4me3) y un ADN globalmente hipometilado 116-118. Esto sugiere una asociación hiperdinámica de las proteínas de la cromatina, reflejando la plasticidad del genoma pluripotente 103. En las células diferenciadas la cromatina se presenta en una conformación más cerrada, menos activa y con marcas represivas en las histonas (ej. H3K27me3 y H3K9me3), alrededor de las cuales se empaqueta un ADN hipermetilado en los genes asociados con la pluripotencia. La metilación del ADN es, de lejos, la modificación epigenética más estudiada hasta la fecha e implica la modificación dinámica y heredable de la propia molécula de ADN 64. La adición de un grupo metilo en la quinta posición de un residuo de citosina (5mC) es una marca epigenética bien caracterizada con importantes funciones durante el desarrollo mamífero 64. Las regiones con dinucleótidos CpG están enriquecidas en 5mC, pero la marca escasea en regiones de alta densidad CpG o “islas CpG” 64,119. Sin embargo, aproximadamente el 25% de los lugares de 5mC en ESCs humanas se encuentran en otras disposiciones, sugiriendo la existencia de mecanismos de metilación alternativos exclusivos de ESCs 120-122. Los patrones de metilación del ADN suelen asociarse a represión de la expresión génica 64. La dinámica de la 5mC (Figura I10) viene marcada por las acciones de las metiltransferasas DNMT1, DNMT3A y DNMT3B 64. La demetilación activa es mediada principalmente por las enzimas TET (TET1, TET2 y TET3) que catalizan la oxidación de 5mC a 5hmC y sus intermediarios/subproductos 123. El genoma de la PSCs se encuentra hipometilado a nivel global en comparación con el genoma de las 29 células somáticas 64,116,118,124-126. TET1 y TET2 son las principales demetilasas de ADN que participan en el control de la pluripotencia 64,127 128,129, aunque se ha reportado que ejercen funciones específicas 130. Figura I10. Factores epigenéticos principales en la metilación del ADN. En eucariotas, la deposición del grupo metilo en el quinto carbono de las citosinas es catalizada por DNMT3A y DNMT3B (flecha recta). Los patrones de metilación introducidos son preservados por DNMT1 durante la replicación. Se considera que la demetilación pasiva (curva de puntos) ocurre durante las divisiones celulares en ausencia de DNMT1. La retirada activa mediante oxidación (o hidroximetilación) de la marca (flecha curvada) es llevada a cabo en mamíferos por la familia de proteínas TET, que convierten la 5-metilcitosina en 5-hidroximetilcitosina. En cuanto a la metilación en histonas (Figura I11), cabe destacar que en ESCs las marcas H3K4me3 (asociada con cromatina transcripcionalmente activa) y H3K27me3 (reguladora a la baja de la transcripción) suelen encontrarse en los mismos promotores, operando como una “marca bivalente” que parece presentarse en genes clave en desarrollo 131,132 manteniéndolos preparados para activarse mediante su asociación con la forma transcripcionalmente competente (fosforilada en serina 5) de la RNAPolII 133-135. En definitiva, las células pluripotentes presentan una mayor proporción de eucromatina que las células diferenciadas 100 y ésta se presenta en distintas regiones 136. La formación de eucromatina incluye 30 la metilación de las lisinas 4 y 79 de la histona H3 137,138, en cooperación con otros eventos epigenéticos que incluyen el cambio de la histona H2A por la H2A.Z 139, y la acetilación de la lisina 16 en la histona 4 140. Además, cabe destacar que los cuerpos génicos de las regiones transcripcionalmente activas están enriquecidos en la marca H3K36me3 141, ligada con la elongación transcripcional 142. 2.3.2.2 Acetilación de histonas Entre las principales y más estudiadas modificaciones posttraduccionales (PTMs) epigenéticas en eucariotas encontramos la acetilación en residuos de lisina (Kac) en las colas de las histonas 143 (Figura I12). La Kac en histonas desempeña un papel clave tanto en la remodelación de la cromatina como en la transcripción 144-146 y resulta esencial en el control del metabolismo y la señalización celular 147-149. La Kac en las colas de histonas neutraliza la carga positiva de los residuos de lisina afectando a las interacciones proteína-proteína y proteína-DNA, la estabilidad y localización subcelular de las proteínas 150. Generalmente la Kac de histonas está asociada con el establecimiento de eucromatina y, por tanto, con activación transcripcional 150. Hace años se demostró in vitro que los nucleosomas hiperacetilados mostraban una reparación mayor del ADN que los menos acetilados 151 y actualmente ya se han establecido distintos mecanismos relacionadas con vías de reparación y estabilidad del ADN regulados por acetilación 152-155. Normalmente, los lugares de comienzo de transcripción y los potenciadores activos, tanto clásicos como superpotenciadores (conocidos como “superenhancers” en inglés) presentan la marca de acetilación en la lisina 27 de la histona H3 (H3K27ac) 156,157. Las ESCs muestran niveles elevados de acetilación en los residuos de lisina 9 y 14 de la histona H3 (H3K9ac y H3K14ac) que disminuyen durante la diferenciación celular 158-161. 31 Figura I11. Proteínas involucradas en la regulación de los niveles de marcas de metilación importantes en el estado celular pluripotente. Los niveles globales de las marcas explicitadas (arriba) vienen dados por el juego dinámico entre los reguladores epigenéticos que las depositan (“writers”), las retiran (“erasers”) y las interpretan (“readers”). La Kac de histonas está catalizada por las acetiltransferasas de histonas (HATs o KATs, por sus siglas en inglés) y retiradas por las deacetilasas de lisinas de histonas (HDACs o KDACS, por sus siglas en inglés) (Figura I12). Estas encimas actúan como coactivadores o correpresores esenciales durante la generación de iPSCs, bien manteniendo el estado somático o bien ayudando al establecimiento de pluripotencia inducida por factores de transcripción 60. Estos factores, acetiltransferasas y deacetilasas, son respectivamente los “writers” y “erasers” de la acetilación de histonas, regulando los niveles de acetilación a nivel celular. Las proteínas epigenéticas “lectoras” (readers) de la acetilación son las proteínas que contienen dominios proteicos denominados bromodominios (BRDs) de los que hablaremos 38 cooperativa temprana no significa activación inmediata de los genes diana 175. Figura I15. Principales barreras en la generación de iPSCs. Diagrama mostrando las principales barreras moleculares que se presentan durante la SCR, las células que superan todas estas barreras activan la red de pluripotencia endógena y acaban formando iPSCs. 2.4.2.3 Reorganización de la estructura de la cromatina. El papel a nivel de la configuración de la cromatina que ejercen los cuatro factores de reprogramación (OSKM) han sido evidenciados mediante multitud de diferentes aproximaciones experimentales que incluyen desde experimentos de pérdida de función hasta integraciones bioinformáticas de los resultados obtenidos por una amplia variedad de ensayos ómicos 206-210. De esta forma, se ha podido demostrar que la presencia de diversas modificaciones químicas en la cromatina, como 39 H3K4me2 210, preceden a los cambios conformacionales para reconfigurar la cromatina durante el proceso de SCR. Además, la adición o retira de determinadas marcas epigenéticas suele conllevar la alteración a nivel local de las propiedades biofísicas en la cromatina lo que contribuye a una reorganización global de la misma en fases que condiciona el paisaje transcripcional durante la SCR 211. 2.4.3 Reprogramación epigenética durante la inducción de pluripotencia Los reguladores epigenéticos resultan claves en el complicado proceso de toma de decisiones moleculares que determina la identidad celular. Hasta la fecha, se han identificado tanto reguladores epigenéticos que actúan como facilitadores del proceso de SCR como otros que actúan como barreras para la obtención de células pluripotentes 212. En este sentido, numerosas evidencias han mostrado que la inhibición de ciertos reguladores epigenéticos (ej. complejos represores con actividad deacetilasa de histonas o con actividad metilasa tanto en histonas como moléculas de ADN) puede facilitar la generación de iPSCs 201,213-217. 2.4.3.1 Control epigenético sobre el programa somático Además de los factores de transcripción, los reguladores epigenéticos juegan papeles fundamentales en la represión del programa somático 175. Por ejemplo, OSKM induce la activación temprana del gen que codifica Sap30, un componente del complejo represor SIN3A con actividad deacetilasa de histonas, que resulta importante para el silenciamiento temprano durante la SCR de genes “somáticos” 175. Sin embargo, este mismo complejo represor SIN3A parece ser dispensable durante estadios tardíos en la formación de iPSCs 197. En este sentido, se ha mostrado que la pérdida de la marca activadora H3K27ac por el complejo SIN3A en los potenciadores de genes somáticos resulta importante durante las etapas tempranas de la reprogramación 197,200. Cabe destacar que la existencia de fallos en la reconfiguración parcial del epigenoma en estas etapas iniciales impiden que la SCR pueda continuar para finalmente formar iPSCs 175,218. 40 2.4.3.2 Epigenética y activación del programa pluripotente Las regiones de heterocromatina represiva transcripcionalmente que se encuentran enriquecidas en metilación de residuos de lisina 9 en histona H3 (H3K9me3), donde residen genes críticos en pluripotencia 175, se han mostrado como refractarias a la unión de OSKM en los estadios tempranos de la SCR 201, apuntando a la necesidad de un remodelado previo de la cromatina para su relajación y accesibilidad 175. En este sentido, se ha visto que ensayos de pérdida de función de las metiltransferasas de H3K9me3 (ej. G9A, SETDB1, SUV39H1 y SUV39H2) facilita la SCR a partir tanto de fibroblastos de origen humano como murino 201,219,220. También, la pérdida de función del complejo CAF-1 facilita la relajación de la cromatina somática y aumenta la accesibilidad y unión de SOX2 a potenciadores, tanto clásicos como los conocidos como “superenhancers”, que resultan críticos en la activación del programa transcripcional asociado al estado celular pluripotente 216. Por otro lado, la regulación fina de los patrones de metilación en el ADN es esencial para la activación de genes “pluripotentes”, y en este sentido se ha visto que la activación forzada de las enzimas TET con actividad demetilasa facilitan la reprogramación en una manera que resulta dependiente del contexto celular 175,221. También se han descrito otros reguladores epigenéticos que son necesarios para el papel transcripcional de OSKM entre los que se incluyen los complejos SWI/SNF, NuRD y MLL 222-224. 2.4.3.3 Impacto epigenético sobre la arquitectura de la cromatina. Numerosas evidencias sugieren que la estructura tridimensional de la cromatina y su reorganización resulta esencial para las decisiones de destino celular (revisado en detalle en 100,225. Aunque todavía estamos comenzando a comprender el grado de reorganización y los mecanismos y relaciones moleculares envueltos, cada cambio de identidad celular que sucede durante la SCR tiene asociada una arquitectura de la cromatina determinada 206-209,226,227. Por ejemplo, se ha descrito que, precediendo o coincidiendo con la reescritura epigenética y cambio transcripcional en genes relacionados con la pluripotencia se producen bucles en la cromatina 206,207. Además, se ha 41 caracterizado con detalle los cambios en la estructura tridimensional de la cromatina que suceden durante la SCR y su correlación con cambios transcripcionales 210, lo que apoya un papel causal de la reorganización de la cromatina sobre éstos, ya que suceden a la par o ligeramente antes del cambio en la transcripción 175. Otros hallazgos sugieren que la remodelación inapropiada de la cromatina representa otra barrera epigenética que puede actuar como cuello de botella para el establecimiento del programa pluripotente 175. Mientras ciertos reguladores epigenéticos salvaguardan la identidad celular somática principalmente mediante la prevención de la activación de los “genes de pluripotencia”, también existen reguladores epigenéticos que participan en la arquitectura de la cromatina que salvaguardan la identidad celular mediante la perpetuación de los programas de transcripción somáticos específicos. Una cuestión importante en el tintero es qué reguladores que determinan la estructura de la cromatina contrarrestan el silenciamiento de la expresión génica específica de linaje mediado por OSKM durante la SCR. 2.4.4 Aplicaciones y retos actuales de la tecnología iPSC Desde el trabajo original dirigido por el Dr. Yamanaka 38, hemos sido testigos de cómo la generación de iPSC ha revolucionado el campo de la pluripotencia no sólo evitando los problemas éticos asociados a la destrucción de embriones para la obtención de células pluripotentes (PSCs), sino probando que es una tecnología muy poderosa a la hora de crear nuevas oportunidades para el estudio de enfermedades humanas, descubrimiento de fármacos y medicina regenerativa entre otras (revisado en detalle en 228-230 (Figura I16). Por ejemplo, podríamos destacar resultados muy esperanzadores en más de cien ensayos clínicos utilizando iPSCs con fines de terapia celular regenerativa y modelado de enfermedades humanas (para más detalle, ver https://clinicaltrials.gov/). Además, el proceso de SCR conducente a la obtención de iPSCs también ha demostrado ser una aproximación muy valiosa para investigar los mecanismos moleculares involucrados en los cambios de identidad celular 216,231-235, lo que continúa siendo una de las principales preguntas abiertas en la biología moderna. 42 Figura I16. Principales aplicaciones de las iPSCs. Las iPSCs específicas de paciente tienen el potencial de modelar enfermedades (parte izquierda) de manera personalizada. También permiten el estudio de los mecanismos fisiopatológicos y del desarrollo de las células derivadas, así como el cribado y desarrollo de fármacos adecuados para medicina de precisión. Además, en terapia celular (parte derecha), la conjunción de la tecnología iPSC con la de edición génica, podría generar iPSCs genéticamente corregidas que, tras diferenciarse a células “sanas”, podrían reimplantarse de nuevo en el paciente. Desde una perspectiva más traslacional, uno de los grandes avances ha sido las distintas aproximaciones realizadas para lograr iPSCs sin integración en el genoma de los factores de reprogramación 52-58 (Figura I5). Sin embargo, a pesar de los grandes progresos realizados a escala mundial en la reprogramación celular somática (SRC) para generar iPSCs, todavía existen grandes desafíos (ej. baja eficiencia, inestabilidad genómica, potencial tumorigénico, rechazo inmunológico, heterogeneidad y pérdida de madurez entre otras) 229,236-238 (Figura I17), que necesitan ser solventados para desatar el potencial completo de esta prometedora tecnología con fines clínicos. Así, aunque ya ha transcurrido más de una década de estudio del proceso de SCR proporcionado gran cantidad de datos acerca de cómo la pluripotencia 43 puede ser inducida, principalmente usando fibroblastos murinos para inducir reprogramación por razones históricas, la imagen completa de los fundamentos moleculares implicados en la generación de iPSCs aguarda ser proporcionada, lo que limita su prometedor potencial terapéutico. Por eso, esta tesis doctoral tiene como meta principal proporcionar un conocimiento más a fondo de la función de los reguladores epigenéticos que contienen bromodominios durante la inducción del estado celular pluripotente. Figura I17. Retos que presenta actualmente la aplicación clínica de la tecnología iPSC. La figura muestra los problemas principales que presenta a hoy en día la tecnología iPSC para su posible utilización con fines terapéuticos. 2.5 LAS PROTEÍNAS QUE CONTIENEN BROMODOMINIOS El bromodominio (de aquí en adelante denominado BRD para simplificar) es el único dominio proteico con reconocimiento selectivo 44 y capacidad de unión a residuos de lisina químicamente modificados con un grupo acetilo (monoacetil-lisina o Kac) 239,240. Los BRDs están presentes de forma individual o múltiple en número en un amplio rango de proteínas diferentes tanto en estructura como en función 241. El genoma humano codifica 61 BRDs que están contenidos en 46 proteínas 241 mientras que el genoma murino codifica 53 BRDs presentes en 40 proteínas. Las proteínas con BRDs están presentes en casi todos los tejidos y la desregulación de varias de éstas o de su actividad lectora de Kac ha sido implicada en enfermedades humanas tales como cáncer o autoinmunidad entre otras (revisado en detalle en 150,242,243. 2.5.1 La arquitectura del dominio BRD El BRD es un dominio proteico modular evolutivamente conservado de aproximadamente 110 aminoácidos primeramente identificado en 1992 como un nuevo motivo estructural por J.W. Tamkun y colegas en Drosophila melanogaster 244. El plegamiento estructural del BRD consiste en un empaquetamiento de cuatro hélices α levógiras (hélices αZ, αA, αB y αC) y dos bucles (bucles ZA y BC) conectando respectivamente las hélices αZ con αA y αB con αC 143. Existe una gran variación en la secuencia de los bucles ZA y BC, tanto en longitud como en composición aminoacídica, sin embargo, el reconocimiento y unión a Kac está conservada 143. Figura I18. Estructura tridimensional del BRD. Estructura simplificada del BRD C-Terminal (BD1) de BRD2 mostrando las hélices αZ, αA, αB y αC y los bucles ZA y BC. Estructura basada en modelo humano con un 100% de identidad de secuencia (6fff.1.A "Human BRD2 C-terminal bromodomain with (S)-5-(1-acetyl-2-cyclopropyl-4-(2-(hydroxymethyl)- benzyl)-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-6-yl)pyrimidine-2carboxamide" P25440). 2.5.2 El reconocimiento de residuos de lisina acetilados El dominio BRD, mediante los bucles ZA y BC estabilizando las hélices α, forma una estructura hidrofóbica que reconoce la Kac 143,245247. La variabilidad entre los bucles ZA y BC de los distintos BRDs es 45 lo que les otorga preferencia de reconocimiento por distintos sitios de Kac en las histonas 143. A pesar de esto, la unión BRD-Kac está conservada, y en 48 de los 61 BRDs en humanos conlleva la formación de dos puentes de hidrógeno, uno entre el oxígeno carbonilo de la Kac y la cadena lateral NH2 del aminoácido Asn y otro entre el mismo oxígeno y la cadena lateral OH de la Tyr 240. En los 13 restantes BRDs, denominados Bromodominios atípicos (aBRDs, por sus siglas en inglés), cuya función es todavía desconocida, no se conserva la Asn sino que está reemplazada por una Tyr, un Thr o una Asp, lo cual sugiere que estos aBRDs, a pesar de conservar el plegamiento típico de los BRDs, no presentan capacidad de unión a Kac 143. Como proteínas “lectoras” (readers) de la acetilación, las proteínas con BRDs juegan papeles cruciales sobre la regulación de la expresión génica vía interpretación epigenética y reclutamiento de complejos regulatorios 143,150. Así, el reconocimiento e interacción BRD-Kac resulta esencial para la correcta remodelación de la cromatina. Este impacto en la cromatina se puede dar de modo directo o mediante el reclutamiento y direccionamiento de otras enzimas remodeladoras, así como cooperando con otros factores lo que resulta en un alto orden de complejidad y especificidad 143,150. Esta unión BRD-Kac se produce principalmente en las colas N-terminales de las histonas 248. La afinidad y selectividad de los BRDs por histonas acetiladas es normalmente débil, pero se incrementa mediante la interacción entre BRDs con regiones donde existen múltiples lugares de acetilación en proximidad 241. 2.5.3 Clasificación de las proteínas BRDs En 2012 se presentó la primera clasificación de las 46 proteínas humanas que contienen BRDs (por simplicidad a partir de este punto denominadas proteínas BRD) realizada en base al grado de similitud de las secuencias aminoacídicas de estos dominios dando como resultado ocho subfamilias 241. Por otro lado, en 2019 Zaware y Zhou propusieron una clasificación funcional de estas 46 proteínas BRD en nueve grupos y cuatro subgrupos 143. A pesar de que incluso existe bastante solapamiento entre ambas clasificaciones, la clasificación funcional 143 muestra de manera más clara los papeles celulares diversos 46 que tienen las proteínas BRD, y es en la que nos centraremos en esta sección. Entre las diversas funciones que muestran las proteínas BRD se incluyen la modificación de histonas, el reclutamiento de factores de transcripción, el remodelado de la cromatina y el ensamblaje de complejos mediadores o potenciadores, afectando tanto en la iniciación como en la elongación de la transcripción 143. Además, la mayor parte de las proteínas BRD contienen en su estructura otros dominios modulares conservados que funcionan independientemente o en conjunto con los BRDs mediando otras interacciones proteína-proteína o interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos 143. 2.5.3.1 Grupo I: HAT Subgrupo Ia: HATs En este grupo lo forman coactivadores transcripcionales que incluyen las histonas acetil transferasas (HATs) PCAF, GCN5L2, EP300 (p300) y CREBBP (p300/CBP) además de las subunidades del complejo factor de transcripción IID (TFIID, por sus siglas en inglés) TAF1 y TAF1L (Figura I19, arriba). En los primeros, los BRDs se sitúan adyacentes al dominio catalítico HAT que desempeña un papel clave en la variedad de funciones de estas proteínas. En estas proteínas (PCAF, GCN5L2, CREBBP y EP300) el BRD promueve la activación transcripcional ayudando en el reclutamiento del sustrato, facilitando así la acetilación mediada por HAT en múltiples residuos de lisina tanto en histonas como en factores de transcripción 249. Además, el BRD puede controlar la activación de la HAT p300 mediante interacciones inter o intramoleculares con el bucle autoinhibitorio de p300, que es rico en lisina y sufre hiperacetilación 250. El complejo TFIID consiste en las subunidades TAF y TBP (TATA-Binding Protein), y mediante los dos BRDs de TAF1, une la Kac en histonas con el reconocimiento de factores de transcripción basales a promotores clave 251. A través de esta función de acoplamiento entre la acetilación por medio del dominio HAT y la unión a Kac por medio de los BRDs, TAF1 puede reclutar otras HATs para trabajar cooperativamente en el ensamblaje y 47 activación de complejos potenciadores o mediadores en genes diana y en el inicio de la transcripción 143. Subgrupo Ib: HATs MOZ Este grupo está formado por BRPF1/2/3 y BRD8, y todas las subunidades accesorias de la familia de HATs MYST (MOZ/MORF, MOF, TIP60 y HBO1) que se encuentran conservadas en eucariotas 143 (Figura I19, abajo). Figura I19. Esquema simplificado del grupo I de proteínas BRD. Se representa cada uno de los miembros que componen los subgrupos de las proteínas BRD con actividad HAT. Se indica la longitud en aminoácidos de cada proteína, así como los principales dominios funcionales que contienen. BRD: bromodominio; PCAF-N: dominio PCAF; HAT: dominio acetiltransferasa de histonas; Taz: dominio dedo de zinc; Kix: dominio de interacción inducido por quinasa; PHD: homeodominio planta; ZZ: dominio dedo de zinc de unión a dos iones; TBP: Dominio de unión a TATA; EPL1: dominio potenciador de similares a polycomb; PWWP: dominio con motivo Pro-Trp-Trp-Pro conservado. Estas HATs de la familia MYST son las responsables de la acetilación de histonas libres y están implicadas en cáncer 252. 54 actividad E3 ubiquitina ligasa y marca la β-catenina nuclear para su degradación, lo que conlleva arresto de la proliferación celular y le permite actuar como gen supresor de tumores 281. TRIM66/TIF1δ interacciona con HP1γ y es específica de testículos 282. Figura I24. Esquema simplificado del grupo VI de proteínas BRD. Se representa los cuatro miembros que componen este grupo de proteínas BRD con actividad SUMO/Ubiquitín E3. Se indica la longitud en aminoácidos de cada proteína, así como los principales dominios funcionales que contienen. BRD: bromodominio; BBOX: dominio dedo de zinc tipo caja B; BBC: dominio caja B C-terminal; PHD: Homeodomino planta. 2.5.3.7 Grupo VII: Familia de proteínas SP de los cuerpos nucleares PML El grupo VII está formado por la familia de proteínas SP SP100, SP110, SP140 y SP140L 143 (Figura I25). Estas proteínas presentan una alta similitud de secuencia con el regulador autoinmune AIRE 283, aunque sus funciones moleculares todavía se desconocen 143. Esta familia de proteínas son componentes de los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica (PML) subnuclear o PML-NBs 284,285. Estos PML-NBs se forman en respuesta a diversos tipos de estrés celular tales como infección viral, señalización de interferón y daño en el ADN 143. La estructura de SP140 y SP140L presenta un aBRD en tándem con un dominio SAND (SP100, AIRE, NucP41/P75 y DEAF) 286 y un dedo PHD, los cuales pueden unirse a ADN e histonas, sugiriendo que estas proteínas pueden estar mediando interacciones proteína-proteína y 55 proteína-ADN involucradas en la regulación de la estructura de la cromatina 143. Figura I25. Esquema simplificado del grupo VII de proteínas BRD. Se representa los cuatro miembros que componen este grupo de proteínas BRD que forman parte de los cuerpos nucleares PML. Se indica la longitud en aminoácidos de cada proteína, así como los principales dominios funcionales que contienen. aBRD: bromodominio atípico; SP100: Dominio HSR (región homogéneamente teñida) de SP100; SAND: dominio presente en la familia Sp100, AIRE-1, NucP41/75, DEAF-1; aBRD: bromodominio atípico. 2.5.3.8 Grupo VIII: Correpresores transcripcionales El grupo VIII está formado por las proteínas MYND (por sus siglas en inglés de Myeloid, Nervy and DEAF-1) ZMYND8 (PRKCBP1, RACK-7 o SPIKAR) y ZMYND11 (BS69) 143 (Figura I26), ambas reportadas como supresores tumorales 287. Estas proteínas presentan una organización en dominios consistente en una secuencia de señalización nuclear N-terminal, un módulo PHD-BRD-PWWP y dominio MYND C-terminal 143. ZMYND11 se une mediante su módulo BRD-PWWP a la histona H3.3K36me3 288. ZMYND8 es una proteína de unión a quinasa C 289 y regulador transcripcional 290. ZMYND8 es reclutada a sitios de daño en el ADN y para el control de la transcripción mediante la interacción coordinada del módulo PHD-BRD-PWWP con H3K4me1, H3K14ac y el ADN 291. ZMYND8 también se une a proteínas no histonas a través de su módulo PHD-BRD-PWWP Nterminal, particularmente con la proteína de unión a Actina citoplasmática DEBRINA 292, aunque este secuestro citoplasmático de 56 ZMYND8 por DEBRINA requiere mayor investigación, ya que las acciones de los BRDs se dan mayoritariamente en el núcleo 143. Figura I26. Esquema simplificado del grupo VIII de proteínas BRD. Se representa los dos miembros que componen este grupo de proteínas BRD con actividades correpresoras transcripcionales. Se indica la longitud en aminoácidos de cada proteína, así como los principales dominios funcionales que contienen. BRD: bromodominio; PHD: homeodominio planta; PWWP: dominio con motivo Pro-Trp-TrpPro conservado; MYND: dedo de zinc tipo myeloid, nervy y DEAF-1; aBRD: bromodominio atípico. 2.5.3.9 Grupo IX: Proteínas con repetición WD Este grupo lo componen las proteínas con repetición WD BRWD1 (WDR9), BRWD3 y PHIP (WDR11) 143 (Figura I27). Estas proteínas han sido implicadas en una amplia variedad de funciones celulares tales como la transcripción, el procesamiento del ARN, la transducción de señales, en ensamblaje del citoesqueleto y la regulación del ciclo celular 293. Estas proteínas presentan un tándem BRD-aBRD, con un BRD que muestra unión a Kac canónica y un aBRD de función desconocida 143. Figura I27. Esquema simplificado del grupo IX de proteínas BRD. Se representa los tres miembros que componen este grupo de proteínas BRD que contienen repeticiones WD. Se indica la longitud en aminoácidos de cada proteína, así como los 57 principales dominios funcionales que contienen. BRD: bromodominio; aBRD: bromodominio atípico; WD40: dominio repetido de beta-transducina comúnmente terminado en un dipéptido WD (triptófano-ácido aspártico). 2.5.4 Moléculas inhibidoras de los BRDs La importancia que tienen los BRDs en el reconocimiento, modificación de histonas y en la estructura de la cromatina, así como sus papeles directos en la regulación de la transcripción génica, los hace muy interesantes para el desarrollo de pequeñas moléculas capaces de modular selectivamente las interacciones entre proteínas mediadas por acetilación. Desde que el descubrimiento de la estructura de PCAF (KAT2B) reveló que tenía un bolsillo de unión a Kac bien definido y adecuado para la unión de pequeñas moléculas 239, y el descubrimiento en 2005 del primer inhibidor de BRD, el NP1 específico de PCAF 294, se han desarrollado pequeñas moléculas ligando para una amplia variedad de bromodominios 243,295-299. Los BRDs han suscitado un enorme interés desde que un cribado fenotípico identificó a la familia BET como potenciales dianas terapéuticas en diversas situaciones oncológicas 300. Así, el desarrollo de compuestos relacionados con la Kac ha sido rápido y estas pequeñas moléculas moduladoras de la actividad BRD han probado su valor para estudiar de manera profunda, precisa y selectiva la química epigenética de la Kac y las funciones de los BRDs tanto en procesos fisiológicos como patológicos, proporcionando nuevas estrategias con fines terapéuticos 143,150,300. A continuación, de manera resumida, se desglosarán los distintos inhibidores disponibles comercialmente de las proteínas BRD que han sido utilizados a lo largo de esta tesis doctoral. 2.5.4.1 Inhibidores de la familia BET Los residuos de unión a ligando son comunes en los dos BRDs (BD1 y BD2) de la familia, siendo todos sus miembros inhibidos por las diazepinas, como la tienotriazolodiazepina JQ1 301 y sus relacionadas 143 (Figura I28). Se ha demostrado que JQ1 301 desplaza de la cromatina a las oncoproteínas de fusión BRD4-NUT, resultando en regresión tumoral, diferenciación de células escamosas y arresto del crecimiento en modelos de ratón de carcinoma de línea media NUT con xenoinjertos derivados de paciente 143,302. La benzodiazepina I-BET762 58 303 ha demostrado intervenir en la expresión de genes inflamatorios clave en macrófagos activados mediante la disrupción de los complejos de la cromatina responsables 143,303. La tienotriazolodiazepina MS147 ha mostrado mayor potencia que JQ1 143 y bloquea la activación del factor de transcripción NF-κB inducida por el VIH en la nefropatía asociada a VIH 304. CPI-203 ha mostrado efectos sinérgicos con la lenalidomida contra linfoma de células del manto resistente 305 y potenciar los efectos antiproliferativos de la rapamicina en tumores pancreáticos neuroendocrinos humanos 306. La diazepina OTX015, ha demostrado ser eficaz en la inhibición de la proliferación en una variedad líneas celulares de cáncer humano de pulmón de células pequeñas y no pequeñas con diferentes mutaciones oncogénicas 307. La última de las diazepinas, CPI-0610 ha demostrado eficacia antitumoral in vivo en un modelo de xenoinjerto de ratón utilizando células de leucemia mieloide aguda MV-4-11 308. Figura I28. Inhibidores de los BRDs de la familia BET. Representación bidimensional de las estructuras moleculares de las principales moléculas inhibidoras del reconocimiento de acetilación por BRDs de la familia BET. Además de las diazepinas, se han utilizado otros quimiotipos como base para el diseño de inhibidores de BET y otros BRDs. El anillo de isoxazol de I-BET-151 es una de sus principales características, reemplazando el núcleo basado en diazepina por un núcleo con características de quinolina 143,309. I-BET151 ha demostrado bloquear el crecimiento de las células de leucemia de fusión MLL 309. Además, se ha comprobado que I-BET151 inhibe la progresión de neoplasmas 59 mieloproliferativos dirigidos por la mutación JAK2V617F 310. Otro importante inhibidor de BET basado en quinolina es la dihidroquinazolinona PFI-1 311. PFI-1 ha demostrado tener efectos antiproliferativos en líneas celulares de leucemia, además, las líneas sensibles muestran arresto celular en la fase G1, regulación a la baja de la expresión de MYC e inducción de apoptosis y la diferenciación de blastos primarios de leucemia 311. El primer ensayo clínico en humanos con etanosulfonamida ABBV-075 o Mivebresib, ha demostrado efectos esperanzadores en tratamiento de leucemia mieloide aguda recidivante o refractaria siendo este compuesto bien tolerado por los pacientes 312. Por otro lado, se ha demostrado que la inhibición farmacológica de los BRDs de BET bloquea la expresión oncogénica de cMyc en mieloma múltiple 313,314, leucemia de fusión MLL 309 y AML 315. Además, la inhibición farmacológica de la familia BET ha sido mostrada como potencial tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración 316. 2.5.4.2 Inhibidores de otros grupos El inhibidor de BRDs de amplio espectro bromosporina (BSP) ha sido desarrollado por SGC (Structural Genomics Consortium) (https://www.thesgc.org/chemical-probes/Bromosporine) y es muy útil para estudiar las funciones de los BRDs en su conjunto 317 (Figura I29). Figura I29. Inhibidor de BRDs de amplio espectro. Estructura bidimiensional de la estructura molecular del ligando de unión no específica a BRDs bromosporina (BSP) que actúa como un inhibidor de amplio espectro contra todos los BRDs. Recientemente, también se han desarrollado pequeñas moléculas inhibidoras para otros BRDs distintos de la familia BET (Figura I30), incluso para algunos BRDs para los cuales se había reportado una baja capacidad de generación de ligandos debido a la 60 unión superficial o a una hidrofobia subóptima de su bolsillo de unión a Kac 143,318,319. Figura I30. Otros inhibidores de BRDs. Representación bidimensional de las estructuras moleculares de los principales ligandos específicos de los BRDs de miembros de las familias distintas de BET. Los inhibidores de CREBBP son, tras los de BET, los más estudiados de entre las pequeñas moléculas inhibidoras de BRDs 317. Se ha reportado que la Isquemina (Ischemin) es un inhibidor selectivo del BRD de CREBBP capaz de inhibir la interacción de CREBBP con p53, alterando los genes diana de p53 en apoptosis y reparación del ADN 320. PF-CBP1, otro inhibidor selectivo de CREBBP, ha demostrado regular a la baja genes inflamatorios clave en macrófagos y también el gen RSG4, diana ligada a la enfermedad de Parkinson, en neuronas 321. El consorcio SGC y la compañía GSK (GlaxoSmithKline) han reportado I-CBP112 como un inhibidor selectivo para los BRDs de CREBBP y EP300 que actúa en rangos nanomolares 143. El tratamiento con ICBP122 debilita la autorrenovación de las células iniciadoras de leucemia tanto in vitro como in vivo 322. Junto a la Universidad de Oxford, el consorcio SGC reportó en 2014 el compuesto SGC-CBP30 61 323, también selectivo contra los BRDs de CREBBP y EP300 en rangos nanomolares 143. Sin embargo, este inhibidor no es adecuado para uso in vivo debido a su rápida metabolización 317. Se ha reportado que ambos CBP112 y SGC-CBP30 suprimen la respuesta Th17 crítica para varias enfermedades autoinmunes humanas 317,324. Además, también suprimen el factor de transcripción IRF4 y su red, incluyendo c-MYC, crítico para la viabilidad de las células de mieloma 325. Por último, el inhibidor de CREBBP y EP300 CPI-637 también ha reportado alta potencia y selectividad sobre otros BRDs in vitro 326. También se han reportado inhibidores para BRDs menos caracterizados 240 143. Por ejemplo, GSK2801 y BAZ2-ICR han mostrado alta afinidad y selectividad por BAZ2A y BAZ2B 143,327,328. El consorcio SGC ha desarrollado un inhibidor selectivo contra PCAF y GCN5L2 (KAT2B y KAT2A, respectivamente) llamado L-Moses, con gran permeabilidad celular, ninguna citotoxicidad observable en PBMCs y estabilidad metabólica en microsomas de hígado de ratón y humano, lo cual, lo haría viable para su potencial uso in vivo 329 (https://www.thesgc.org/chemical-probes/L-Moses). Por otro lado, se han desarrollado inhibidores para los BRDs de BRD9 y BRD7 como la lactama fusionada con quinolona LP99 330, que muestra una actividad ligeramente menor para BRD7 pero ninguna o despreciable contra otros BRDs 143. Otros dos inhibidores de BRD9, BI-7273 y BI-9564 331, han demostrado ejercer acciones antitumorales en un modelo de xenoinjerto de leucemia mieloide aguda 331. Además, el inhibidor de BRD9 y BRD7 TP-472, también ha mostrado una alta selectividad y actividades in vivo (https://www.thesgc.org/chemical-probes/TP-472). La tienopiridina IBRD9 es el inhibidor de BRD9 más potente y selectivo hasta ahora desarrollado 143. I-BRD9 muestra una selectividad de 200 a 700 veces mayor sobre BRD7 que los BRDs de la familia BET 332. Se han desarrollado también inhibidores para las BRPFs como el OF-1, que muestra una alta selectividad en la inhibición de BRPF1B, BRPF2 y PRPF3 (https://www.thesgc.org/chemical-probes/OF-1). Junto con Pfizer, el consorcio SGC ha reportado también PFI-4, un inhibidor selectivo de BRPF1B y una isoforma de BRPF1 que se une a histonas acetiladas de una forma opuesta a BRPF1B 317 (https://www.thesgc.org/chemical-probes/PFI-4). También este mismo 62 consorcio, en colaboración con la Universitiy College of London, ha descubierto el inhibidor NI-57, que inhibe selectivamente todas las BRPFs 317, https://www.thesgc.org/chemical-probes/NI-57). El consorcio SGC también ha desarrollado un inhibidor de SMARCA2, SMARCA4 y los 6 BRDs de PBRM1 llamado PFI-3, que ha demostrado una alta selectividad en comparación con otros BRDs 333; (https://www.thesgc.org/chemical-probes/PFI-3). De hecho, la inhibición de SMARCA 2 y SMARCA4 con PFI-3, ha demostrado que la actividad ATPasa de su dominio catalítico tiene un papel crítico en cáncer mientras sus BRDs no 334. BAY-299 es un inhibidor de BRD1 y del segundo bromodominio de TAF1 reportado también por el consorcio SGC en colaboración con Bayer (https://www.thesgc.org/chemical-probes/BAY-299); 317. 2.6 FUNCIONES MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS BRD Las proteínas BRD tienen diversas funciones moleculares que ejercen en solitario o formando parte de complejos mayores. Tal como se ha mencionado anteriormente, están involucradas en la regulación génica a través de la modulación transcripcional, mediante modificación y remodelación de la cromatina e incluso actuando sobre la propia maquinaria transcripcional. Por otro lado, las proteínas BRD pueden reconocer específicamente histonas y actuar como andamiaje, controlando la transcripción mediante el reclutamiento de otros reguladores transcripcionales a la cromatina. 2.6.1 Los BRDs y la remodelación de la cromatina Las proteínas con BRDs se asocian normalmente en complejos que controlan la compactación y descompactación de la cromatina mediante distintos mecanismos que llevan a su remodelación 150. Por ejemplo, la apertura de la estructura de la cromatina dependiente de ATP que produce una de las subunidades centrales del complejo, SMARCA4 (BRG1) o SMARCA2 (BRM) en los complejos SWI/SNF humanos, resulta en la estimulación de la transcripción 150. Los complejos remodeladores de cromatina ISWI con sus subunidades BRDs también regulan la replicación y transcripción de la cromatina mediante su remodelado 150,335,336 y mediando diversos procesos que incluyen desde 63 la respuesta a daño en el ADN 263, el silenciamiento dependiente de ARN no codificante 337 y actividades de ensamblaje nucleosomal 143,150 entre otras. También se han propuesto papeles en la remodelación de la cromatina para algunas proteínas con repetición WD. Por ejemplo, BRWD1 (WDR9) ha sido propuesto como regulador transcripcional involucrado en el remodelado de la cromatina mediante su interacción con el componente del complejo mSWI/SNF SMARCA4 (BRG1) 338,339. 2.6.2 Los BRDs y la modificación de histonas Como ya se ha descrito, varias proteínas con BRD muestran actividad catalítica que participa en la deposición de diversas marcas epigenéticas en histonas que forman parte de la cromatina. Por ejemplo, es el caso de ciertas proteínas BRD que poseen actividad acetiltransferasa (HAT) (ej. KAT2B, CREBBP, EP300, GCN5L2 (KAT2A), BRD8) o actividad metiltranferasa (ej. de KMT2A y ASH1L) 143,150. Así, estas proteínas BRD actúan como “escritoras” epigenéticas añadiendo grupos acetilo o metilo sobre histonas lo que impacta en la estructura de la cromatina 150. En el caso de BRD8, que se encuentra formando parte del complejo NuA4 y es responsable de la acetilación de las histonas H4 y H2A en levaduras 258, también se ha mostrado que participa en un complejo de pre-deposición de la variante histónica H2A.Z favoreciendo su intercambio en los nucleosomas 340,341. Sin embargo, la función y actividad biológica exacta de BRD8 no han sido resueltas por ahora 150. MLL metila H3K4 en regiones regulatorias importantes y, mediante la modulación de la estructura de la cromatina y la accesibilidad del ADN, regula la expresión génica 150,342. La acetilación de la histona H3 estimula la actividad metiltransferasa de MLL sobre H3K4 343. Por otro lado, proteínas BRD sin actividad catalítica propia pueden participar en la modificación de histonas mediante el reclutamiento de 70 3. OBJETIVOS E IMPACTO 71 72 El presente proyecto de tesis doctoral pretende diseccionar nuevos mecanismos transcripcionales y epigenéticos subyacentes a la inducción de pluripotencia. Más concretamente, la meta principal de este trabajo consiste en entender cómo la actividad BRD que reconoce acetilación en residuos de lisisna (Kac) participa en el proceso de reprogramación y pluripotencia. Numerosas evidencias científicas indican que la función de reconocimiento BRD-Kac durante reprogramación y pluripotencia desempeña funciones importantes en el control de la expresión génica en diversos contextos fisiológicos y patológicos. La hipótesis de partida es que el reconocimiento BRD-Kac es un mecanismo clave para la generación eficiente y segura de iPSCs. En este trabajo de investigación se realizará un estudio exhaustivo del mecanismo molecular subyacente a la actividad de reconocimiento BRD-Kac durante la generación de iPSCs, con especial foco en el papel de la actividad BRD en la composición de la cromatina y la regulación transcripcional, y cómo esta actividad influye en el control de destino celular. Con este fin, el presente trabajo fue diseñado con cuatro objetivos principales que se enumeran a continuación. Objetivo 1: Identificar el impacto de la actividad BRD en reprogramación. Mediante cribados químicos, se identificarán el efecto de actividades BRD durante la generación eficiente de iPSCs. Para esto, se llevarán a cabo ensayos de reprogramación en presencia de inhibidores tanto de la actividad BRD global como de inhibidores ligandos específicos de BRDs concretos presentes en las distintas familias de proteínas que los contienen. Objetivo 2: Establecer la conexión física entre actividad BRD, estado de la cromatina y regulación transcripcional. Nuestra hipótesis de partida es que la actividad de alguno o varios de los miembros de las distintas familias de BRDs resulta imprescindible en la regulación apropiada de la cromatina y control de la expresión génica que interviene durante la toma de decisiones celulares en 73 reprogramación. Para este fin, se utilizará una amplia variedad de aproximaciones celulares y moleculares, así como análisis ómicos y bioinformáticos. Objetivo 3: Diseccionar los mecanismos de acción específicos de proteínas BRD en reprogramación Nosotros hipotetizamos que incluso proteínas BRD de la misma familia podrían ejercer funciones específicas en la inducción de pluripotencia. Para examinar la función específica de proteínas BRD con actividad esencial en reprogramación identificados en el objetivo 2, se utilizarán ensayos de ganancia y pérdida de función de manera conjunta con una amplia variedad de técnicas moleculares y ensayos celulares. Objetivo 4: Analizar el efecto de la actividad BRD en el mantenimiento de pluripotencia. Teniendo en cuenta la complejidad de los programas moleculares que gobiernan la reprogramación y los que controlan la pluripotencia, nuestra hipótesis de partida se enmarca en la posible existencia de mecanismos alternativos, compensatorios o diferenciales entre ambos procesos. Por esto, se estudiará el impacto de la actividad BRD-Kac global y específica identificada en objetivos 2 y 3 sobre la capacidad de autorrenovación de iPSCs y ESCs. Para este fin, se utilizarán manipulaciones químicas y genéticas combinadas con una amplia variedad de técnicas estándar en el campo de pluripotencia. 74 4. MATERIALES Y MÉTODOS 75 76 4.1 REACTIVOS Y KITS Todos los reactivos químicos utilizados en este trabajo fueron de grado de investigación. Los reactivos utilizados aquí se indican en la Tabla Suplementaria 1. Las concentraciones utilizadas para cada tratamiento se indican en las correspondientes secciones de este apartado y a lo largo de Resultados. Los kits utilizados a lo largo de este estudio se indican en la Tabla Suplementaria 2. 4.2 MODELOS EXPERIMENTALES Modelos Experimentales: Líneas Celulares NOMBRE FUENTE IDENTIF. iOSKM MEF (fibroblastos embrionarios murinos) Dr. Jianlong Wang (Columbia Univ., USA) n/a Oct4-GFP MEF (fibroblastos embrionarios murinos) Dr. Jianlong Wang (Columbia Univ., USA) n/a NSO4G (células progenitoras neurales) Dr. Jianlong Wang (Columbia Univ., USA) n/a CCE (ESCs murinas) Dr. Jianlong Wang (Columbia Univ., USA) n/a J1 (ESCs murinas) ATCC SCRC-1010 Oct4-∆PE-GFP (ESCs murinas) Dr. Jianlong Wang (Columbia Univ., USA) n/a Nanog-GFP (ESCs murinas) Dr. Konrad Hochedlinger (Harvard Univ., USA) n/a NG4 (ESCs murinas) Dr. Christoph Schaniel (ISMMS, USA) n/a rOSKMN TNGA (pre-iPSCs murinas) Este estudio n/a rOKMN NSO4G (pre-iPSCs murinas) Este estudio n/a Brd2 KO (pre-iPSCs murinas) Este estudio n/a Brd3 KO (pre-iPSCs murinas) Este estudio n/a Brd4 KO (pre-iPSCs murinas) Este estudio n/a HEK293T ATCC CRL-3216 Plat-E Cell Biolabs RV-101 O4G-MEF. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, por sus siglas en inglés) conteniendo un transgén reportero estabilizador de la proteína 77 verde fluorescente (eGFP, por sus siglas en inglés) bajo el control de la expresión del gen Oct4. iOSKM MEFs. MEFs con sistema inducible de reprogramación OSKM en presencia de doxiciclina (Col1a1-tetO-OSKM). NSO4G. Células progenitoras neurales conteniendo un transgén reportero eGFP bajo el control de la expresión del gen Oct4. rOKMN. Células parcialmente reprogramadas (referidas como preiPSCs) obtenidas a partir de la población negativa para OCT4 de NSO4G transducidas con OKM y NANOG (N). rOSKMN. Células parcialmente reprogramadas (pre-iPSCs) obtenidas a partir de la población negativa para Nanog-GFP de TNGA MEFs transducidos con OSKMN. rOKMN KO. Se generaron líneas pre-iPSC knock out para los genes Brd2, Brd3 y Brd4 mediante tecnología CRISPR-Cas9. Células troncales embrionarias de ratón (ESCs). En este estudio se utilizaron las líneas CCE y J1. ESCs con reporteros. Se utilizaron líneas Nanog-GFP y NG4 con reportero GFP bajo el control del gen Nanog, y la línea Oct4-∆PE-GFP con un reportero GFP bajo el control del potenciador distal del gen Oct4. Hek293T. Células de Riñón Embrionario Humano 293T transfectadas de manera estable con el antígeno largo T de SV40. Esta línea celular es competente para replicar vectores que portan la región de replicación SV40. Esta línea produce titulaciones altas cuando es utilizada para generar retrovirus. Estas células fueron utilizadas para la generación de partículas lentivirales conteniendo shARNs contenidos en el vector pLKO.pim Plat-E (The Platinum Retroviral Packaging Cells). Esta línea está basada en la línea 293T. Exhibe una estabilidad más larga y produce 78 mayores cantidades de proteínas estructurales retrovirales. Estas células contienen los genes Gag, Pol y Env, permitiendo el empaquetamiento lentiviral con transfección de plásmido único. Estas células fueron utilizadas para la producción de partículas retrovirales conteniendo factores de reprogramación. 4.3 CULTIVO CELULAR Medio somático. Este medio utilizado para el cultivo celular de MEFs, Kek293T y Plat-E contiene un 88% de DMEM alto en glucosa (SigmaAldrich, D6429), un 10% de FBS (Gibco™, 10270106) inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (Gibco™, 15140122) y 2mM L-Glutamina (Sigma-Aldrich, G7513). Medio pluripotente SL. Este medio contiene un 80% de DMEM alto en glucosa (Sigma-Aldrich, D6429), 15% de FBS inactivado por calor (Gibco™, 10270106) ,100 U/mL penicilina y 100 µg/mL estreptomicina (Gibco™, 15140122), 1% de mezcla de nucleósidos (Sigma-Aldrich: Adenosine, A4036; Guanosine, G6264, Uridine, U3003; Cytidine, C4654; Thymidine, T1895), 2mM L-Glutamina (Sigma-Aldrich, G7513), 100µM de aminoácidos no esenciales (Gibco™, 11140050) 8ng/mL 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, M6250) y factor inhibidor de leucemia recombinante (rLIF) (producido en el laboratorio y testado para un mantenimiento eficiente de la autorrenovación). Este medio se caracteriza por la presencia de suero y la citoquina LIF (referido en este trabajo como medio SL) y es el medio que se utiliza de manera estándar para el mantenimiento y cultivo de células pluripotentes de origen murino (ESC y iPSCs). También se ha utilizado este medio de cultivo para el mantenimiento de pre-iPSCs y durante reprogramación de MEFs a lo largo de este trabajo. Medio pluripotente SL+2i. Este medio tiene de base el medio SL al que se le añaden los inhibidores de las quinasas Gsk3β (3μM CHIR99021; Sigma-Aldrich, SML1046) y MEK (1 μM PD 0325901; Sigma-Aldrich, PZ0162). Empleado en ensayos de mantenimiento y 79 adquisición de pluripotencia para evaluar la independencia de la actividad BRD de BET en presencia del inhibidor JQ1. Medio pluripotente 2iL. Contiene de base el medio N2B27 compuesto de un 50% de DMEM con mezcla de nutrientes F-12 Ham (DME/F-12; Sigma-Aldrich, D6421) y 50% de medio Neurobasal™ (Gibco™, 21103049), suplementado con: 1x B-27 (Gibco™, 17504044), 1x N-2 (Gibco™, 17502048), 2mM de L-Glutamina (Sigma-Aldrich, G7513), 110 U/mL de penicilina y 110µg/mL estreptomicina (Gibco™, 15140122) y 9.125ng/mL 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, M6250). Para obtener el medio 2iL, este medio N2B27 fue suplementado con 3μM del inhibidor de Gsk3β CHIR99021 (Sigma-Aldrich, SML1046), 1 μM del inhibidor de Mek PD0325901 (Sigma-Aldrich, PZ0162) y rLIF (producido y testado en el laboratorio). Este medio permite ha sido utilizado en los experimentos de reprogramación de pre-iPSCs (rOKM+NANOG, rOKM+ESRRB, rOKM+KLF2 y rOSKM+NANOG). 4.4 TRATAMIENTOS CON INHIBIDORES QUÍMICOS CONTRA BRDS A continuación, se muestran los distintos inhibidores contra bromodominios utilizados en este trabajo, así como sus concentraciones en los ensayos de reprogramación y mantenimiento de pluripotencia. La tabla también muestra la proteína o proteínas diana de cada inhibidor en particular. INHIBIDORES DE BROMODOMINIOS INHIBIDOR CONC. TRABAJO PROTEÍNA(S) DIANA Bromosporine (BSP) 1 µM Inhibidor BRD específico de amplio espectro (+)-JQ1 0,1-0,5 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) I-BET151 10 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) PFI-1 2 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) I-BET762 2 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) CPI-203 1 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) CPI-0610 2 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) MS147 1 µM Familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) 86 suplementaria 6) fueron diseñadas y sintetizadas para dirigirse al lugar de inicio de transcripción de Brd2, Brd3 o Brd4, utilizando las pautas descritas en la herramienta de libre acceso del grupo del Dr. Zhang del MIT (EEUU) (https://zlab.bio/guide-design-resources). Su posterior clonación se realizó en el vector pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 (Addgene, #62988). Una vez validadas las secuencias clonadas por secuenciación Sanger, las pre-iPSCs fueron transfectadas con el plásmido conteniendo cada sgRNA y seleccionadas de manera transitoria en presencia de 2 µg de puromicina durante 48 horas (para más detalle, ver sección 4.7). La validación de las líneas generadas fue realizada mediante la técnica de western blot (para más detalle, ver apartado 4.32) con el uso de anticuerpos específicos contra BRD2, BRD3 y BRD4 (Tabla suplementaria 4). 4.10 ENSAYOS DE REPROGRAMACIÓN EN FIBROBLASTOS Para los ensayos de reprogramación realizados en MEFs en este estudio con los cuatro “factores de Yamanaka” (OSKM) se utilizaron las siguientes dos aproximaciones complementarias: 1.-Sistema de reprogramación OSKM inducible Para este fin, se utilizaron las células somáticas iOSKM MEFs (para más detalle, ver apartado 4.2) que contienen un casete OSKM (Col1a1tetO-OSKM) que se activa en presencia de doxiciclina (SantaCruz Biotechnology, sc-337691). De modo resumido, 50.000 células se sembraron por pocillo de MW-6, pretratados con gelatina al 0.1% (Sigma-Aldrich, G9391), en medio somático fresco (para más detalle, ver apartado 4.3). Al día siguiente, el medio fue reemplazado por medio de reprogramación consistente en medio pluripotente SL (para más detalle, ver apartado 4.3) en presencia de 2 µg/mL de doxiciclina (Dox). Cada 48 h el medio pluripotente SL conteniendo Dox fue reemplazado hasta el final del proceso de reprogramación. El número de colonias iPSCs generadas se estimó mediante contaje de colonias positivas para el marcador de pluripotencia fosfatasa alcalina (para más detalle, ver apartado 4.12). 87 2.- Sistema de reprogramación OSKM constitutivo Para este fin, se utilizaron células somáticas O4G-MEFs (para más detalle, ver apartado 4.2), que contienen un reportero GFP bajo el control del gen Oct4. De manera resumida, 20.000 células fueron sembradas por pocillo de placa MW-12 (Corning™, 3513), pretratados con gelatina al 0.1% y cultivados en medio somático (para más detalle, ver apartado 4.3). Al siguiente día, los fibroblastos se infectaron en presencia de 6ug/mL de polibreno (Sigma-Aldrich, H9268) con partículas lentivirales concentradas conteniendo OSKM generadas a partir del vector de reprogramación pHAGE2-EF1aFull-hOct4-F2AhKlf4-IRES-hSox2-P2A-hcMyc-W-loxP) (para más detalle ver apartado 4.8). Veinticuatro horas tras la infección, el medio fue remplazado por medio pluripotente SL (para más detalle, ver apartado 4.3). A lo largo del proceso de reprogramación el medio pluripotente SL fue reemplazado cada 48 h. La valoración de la eficiencia de reprogramación se realizó mediante contaje de colonias positivas para Oct4-GFP por microscopía de fluorescencia y/o mediante citometría de flujo (para más detalle, ver apartado 4.14). 4.11 ENSAYOS DE REPROGRAMACIÓN EN PRE-IPSCS Para los estudios de reprogramación sobre intermediarios avanzados de reprogramación (referidos de aquí en adelante como pre-iPSCs) obtenidos a partir de MEFs con rOSKM o progenitores neurales con rOSK (para más detalle, ver apartado 4.2) tal como se describió previamente 390. De manera resumida, 50.000 o 100.000 células rOKM (+NANOG, +ESRRB o+KLF2) o rOSKM (+NANOG) fueron sembradas en placas pocillos de placa MW-12 pretratados con 0.1% de gelatina en medio pluripotente SL (para más detalle, ver apartado 4.3). Tras 24 horas en condiciones estándar, el medio de cultivo fue cambiado por medio fresco pluripotente SL, medio pluripotente SL+2i (para más detalle, ver apartado 4.3). El medio de cultivo fue cambiado cada 24h o 48h y la eficiencia de reprogramación se valoró mediante el contaje de colonias positivas para Oct4-GFP (rOKM) o Nanog-GFP 88 (rOSKM) por microscopía de fluorescencia y/o mediante citometría de flujo (para más detalle, ver apartado 4.14). 4.12 DETECCIÓN DE FOSFATASA ALCALINA La actividad fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) en las células analizadas fue ensayada mediante tinción para dicho marcador utilizando Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, 86R) y siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones propias. Brevemente, antes de comenzar con la tinción AP se prepararon las soluciones requeridas (ver tabla de abajo). Las placas de cultivo a teñir fueron enjuagadas con DPBS 1x completo con Ca+2 y Mg+2 (Sigma-Aldrich, D8662) y fijadas con la solución de fijación durante 30 seg a RT. Luego lavadas con agua desionizada durante 1 min a RT. Las células se incubaron con solución de tinción durante 15 min a RT en oscuridad. Finalmente se realizó un lavado con agua desionizada durante 2 min a RT, para proceder finalmente con el secado de esta. SOLUCIÓN DE FIJACIÓN (Volumen para 1xplaca de 6 pocillos) REACTIVO VOLUMEN (mL) Citrate 2,5 Acetona 6,5 Formaldehydo 37% 0,8 SOLUCIÓN DE TINCIÓN (Volumen para 1xplaca de 6 pocillos) REACTIVO VOLUMEN (mL) Sodium Nitrite Solution 0,2 FRV-Alkaline Solution 0,2 Mezclar mediante inversión suave. Dejar reposar por 2 minutos y añadirlo al agua. Agua desionizada 9 Mezclar enérgicamente Naphthol AS-BI Alkaline Solution 0,2 89 4.13 ENSAYO DE FORMACIÓN DE COLONIAS PLURIPOTENTES Para analizar el efecto del tratamiento con JQ1 con distintas condiciones de cultivo en la capacidad de autorrenovación de células pluripotentes (ESCs y iPSCs) se utilizó el ensayo de formación de colonias (CFA, por sus siglas en inglés), un ensayo estándar en el campo de pluripotencia, siguiendo las condiciones previamente descritas 130. De manera resumida, se sembraron las células pluripotentes (ESCs o iPSCs) a baja densidad con 800 células por pocillo de MW-6 pretratados con gelatina 0.1% y en medio pluripotente SL (para más detalle, ver apartado 4.2). 24 h más tarde, el medio fue cambiado los distintos medios pluripotentes ensayados (SL, SL+2i y 2iL) (para más detalle, ver apartado 4.2) en presencia de 100 nM de JQ1 o DMSO como vehículo. Los medios fueron cambiados cada 48 h manteniendo las mismas condiciones. Tras 6 días de cultivo, las células fueron teñidas para detectar la actividad AP (para más detalle, ver apartado 4.12) como marcador de pluripotencia y las colonias fueron clasificadas como: indiferenciadas (positivas para AP), parcialmente diferenciadas (de media a baja señal AP) y diferenciadas (tinción negativa para AP). Los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado para cada condición experimental. 4.14 CITOMETRÍA DE FLUJO Para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), las células analizadas por citometría de flujo se individualizaron mediante Tripsina-EDTA 0.05% (Sigma-Aldrich, T3924) y posterior inactivación con suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) (Gibco™, 10270106). Luego, se recolectaron mediante centrifugación durante 5 min a 300 x g a RT. Tras la inactivación de la tripsina, los pellets celulares fueron lavados con DPBS 1x (Corning™, 21-031-CV) y centrifugados nuevamente con los mismos parámetros. Las células contenidas en los pellets fueron individualizadas en 1 mL de DPBS mediante pipeteo suave y posteriormente se recolectaron en tubo con tamiz 35 µm (Falcon®, 352235). La suspensión celular se 90 mantuvo en hielo hasta su análisis por la técnica de FACS mediante un citómetro de flujo FACSCalibur™ (BD Biosciences) o Accuri C6 (BD Biosciences). Las células con marcaje fluorescente fueron analizadas mediante la adquisición de 10.000-20.000 eventos totales y según los parámetros requeridos teniendo en cuenta el apropiado espectro de absorción/emisión. En todos los casos, se emplearon células sin marcaje fluorescente como controles negativos. Los datos recogidos por FACS se analizaron mediante el software FlowJo (v7.6.1) (para más detalle, ver apartado 4.35). 4.15 ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR Para el análisis del ciclo celular entre condiciones diferentes se utilizó el mismo número de células individualizadas y se procedió a su permeabilización 0.1% (v/v) de Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, G9391) en DPBS 1x, y se marcó el contenido de ADN con 10µM de 4’-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich, D9542) durante 10 min a RT. La determinación del porcentaje de células en las fases G1, S y G2-M del ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo (para más detalle, ver apartado 4.14) y posterior análisis de los datos obtenidos con el software FlowJo (v7.6.1) utilizando el modelo de ciclo Dean-Jett-Fox. 4.16 ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR POR MTT Se infirió el porcentaje de proliferación celular a través del ensayo del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) 392, que determina el posible efecto citotóxico de un tratamiento químico basado en la reducción metabólica de este compuesto por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa de las células tratadas en otro compuesto coloreado de color azul (formazan). La cantidad de células proliferando (células vivas) es proporcional a la cantidad producida de formazan. De manera resumida, se sembraron 5.000 células (somáticas, pre-iPSCs o pluripotentes) por pocillo de MW-96. Tras 48 h en presencia del compuesto químico ensayado se añadió un 10% de MTT (Sigma-Aldrich, M5655) y se incubaron las células durante 4 horas a 91 37ºC en oscuridad. Al finalizar la incubación, la absorbancia fue medida a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm y corregida por la absorbancia del blanco (pocillos sin células, incubados con medio) mediante un lector de placa Mithras LB 940 (Berthol Thecnologies). 4.17 DETERMINACIÓN DE MUERTE CELULAR Ensayo de exclusión por DAPI De manera resumida, las células individualizadas sin permeabilizar fueron incubadas durante 10 min a RT en presencia de 1µM de DAPI (Sigma-Aldrich, D9542) en DPBS 1x con 0,5% de FBS. El porcentaje de muerte celular (células positivas para DAPI) fue determinado por citometría de flujo (para más detalle, ver apartado 4.14) y posterior análisis con el software FlowJo (v7.6.1). Ensayo de exclusión por azul tripán De manera resumida, las células individualizadas fueron incubadas durante 2 min a temperatura ambiente en presencia de solución de azul de tripán al 0,08% (Amresco, K940). El porcentaje de células vivas comparado a células muertas (teñidas de azul) se calculó por contaje en el microscopio utilizando una cámara de Neubauer (Hirschmann™, 8100103). 4.18 INMUNOFLUORESCENCIA De manera resumida, los diferentes tipos celulares analizados fueron primeramente fijadas con paraformaldehído (PFA) (Sigma-Aldrich, P6148) en solución al 4% (p/v) durante 15 min a RT y en oscuridad. Tras esto, las células fueron permeabilizadas con un 0.25% (v/v) de Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, G9391) en DPBS 1x durante 5 min a RT. Luego, se procedió a bloquearlas con un 10% de BSA (Fisher BioReagents™, BP1605) en DPBS 1x durante 30 min a 37ºC. La inmunotinción fue llevaba a cabo mediante la incubación durante toda la noche a 4ºC en presencia de los anticuerpos primarios (Tabla 92 suplementaria 4) diluidos en BSA 3% en DPBS 1x. Al día siguiente, se realizaron 3 lavados de 15 min a RT con DPBS 1x. La detección de los inmunocomplejos se realizó con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos (Tabla suplementaria 4) y 1µM de DAPI durante 1 h a RT. Las células fueron visualizadas con un microscopio invertido Leica DMI 6000 (Leica Microsystems), con las magnificaciones apropiadas dependiendo del ensayo, y el software LAS X (Leica Microsystems). 4.19 INMUNOFLUORESCENCIA CUANTITATIVA DE CÉLULA ÚNICA Para medir los niveles de fluorescencia de manera cuantitativa por célula individual se utilizaron condiciones similares a las descritas anteriormente 130. De manera resumida, se sembraron 3.000 células por pocillo de MW-48 y al día siguiente se procedió a realizar el ensayo de inmunofluorescencia (para más detalle, ver apartado 4.18) con los anticuerpos apropiados (Tabla suplentaria 4). Las inmunotinciones fueron visualizadas y fotografiadas con un microscopio invertido Leica DMI 6000 (Leica Microsystems) con magnificaciones de 10x y 20x, manteniendo los mismos parámetros de adquisición y autofoco para todas las imágenes a comparar. La intensidad de la señal de estas imágenes fue luego corregida de manera homogénea para el conjunto, utilizando el programa LAS X Life Science (Leica Microsystems). Las imágenes obtenidas fueron finalmente analizadas de manera individual mediante el software de análisis de imagen CellProfiler™ 2.1.1 (https://cellprofiler.org/). Para la cuantificación de cada marcador, las imágenes fueron cargadas de manera individual en el programa y agrupadas por este según la condición experimental. Luego se convirtieron a imagen las intensidades de la señal del anticuerpo específico (en el canal correspondiente distinto al canal de DAPI) y la de DAPI (canal propio). Posteriormente, se establecieron los núcleos como objeto primario a identificar mediante su asociación con la imagen obtenida a partir de la intensidad de DAPI (Input image from ColorToGray: DAPI) y adecuando los píxeles de captura de objeto 93 primario con el tamaño del núcleo (Primary Objects to be idenfitied=Nuclei, Typical diameter of objects=20-70), previamente asociado con la señal DAPI (Iput image from ColorToGray: DAPI). Finalmente, se correlacionan las otras señales de fluorescencia (no azul) para medir los niveles de intensidad en la señal de anticuerpo analizado (Object= Color no azul=Proteína marcada). Los resultados obtenidos del procesamiento de las imágenes por el CellProfiler™ 2.1.1, fueron importados a Microsoft Excel (Microsoft), dónde la intensidad de la señal anticuerpo-específica de cada célula fue corregido por su valor de DAPI, obteniendo el valor relativo de fluorescencia específico detectado para esa célula. 4.20 ESTIMACIÓN DEL DAÑO EN ADN La activación mediante fosforilación en residuo de serina 139 de la variante de histona H2AX (representada como γH2AX) se produce como primera respuesta a las roturas en cadena doble de ADN (DSB, por sus siglas en inglés), que constituyen una de las lesiones en el ADN más críticas con respecto a la integridad genómica (PMID: 18610740). Por esto, como medida de estimación indirecta del daño en el ADN que se produce en pre-iPSCs tratadas durante 24 h con JQ1 0,5 µM, se utilizó la técnica de cuantitativa de célula única con el uso de un anticuerpo específico contra γH2AX (Abcam, ab81299) siguiendo las condiciones anteriormente indicadas (para más detalle, ver apartado 4.19). 4.21 ANÁLISIS DEL GRADO DE COMPACTACIÓN NUCLEAR El análisis del grado de compactación nuclear, en los contextos celulares y condiciones de tratamiento indicadas a lo largo de este estudio, se realizó a partir de la determinación de la visualización del contenido de ADN nuclear mediante tinción con DAPI (para más detalle, ver apartado 4.18). Los núcleos celulares teñidos con DAPI fueron visualizados y fotografiados de manera aleatoria con un microscopio invertido Leica DMI 6000 (Leica Microsystems), utilizando magnificaciones de 10x con los mismos parámetros de adquisición y autofoco del microscopio. para todas las imágenes. Las 94 imágenes obtenidas se analizaron mediante el software de análisis de imagen CellProfiler™ 2.1.1 (https://cellprofiler.org/). Se adecuaron los píxeles de captura de objeto primario con el tamaño del núcleo obtenido mediante la conversión a imagen de la intensidad de DAPI ce cada célula individualizada (para más detalle, ver apartado 4.19). Se estableció el diámetro nuclear (Nuclei Diameter) y el grado de compactación nuclear (Nuclei Compactness), ofrecido por el CellProfiler™ 2.1.1 y delimitado por el propio programa como valor de la medida de tamaño nuclear y el grado de compactación respectivamente para cada una de las células individuales. Los resultados obtenidos del procesamiento de las imágenes por el CellProfiler™ 2.1.1, fueron importados en Microsoft Excel para su tratamiento. Posteriormente, se calcularon los valores de densidad nucleares de cada población en base a dicho valor utilizando el programa GraphPad Prism (v8.0.2). 4.22 ENSAYO DE ACCESIBILIDAD EN LA CROMATINA Para valorar el impacto de la inhibición de actividad BRD de BET en la accesibilidad a la cromatina, 1x106 pre-iPSCs fueron sembradas en placa de 100mm (Corning™, 3548) pretratadas con 0.1% gelatina y mantenidas por 24 h en condiciones de cultivo pluripotente SL (para más detalle, ver apartado 4.3). Luego, las células fueron tratadas con vehículo DMSO o 0,5µM de JQ1 durante 24 h en medio pluripotente SL fresco. 48 horas tras la siembra, las células fueron individualizadas y repartidas en alícuotas de un millón de células para analizar el grado de accesibilidad en cromatina mediante el ensayo de micrococo nucleasa utilizando el EZ Nucleosomal DNA Prep Kit (Zymo Research, D5220) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se emplearon concentraciones de 0,1, 0,25 y 5 unidades de micrococo nucleasa durante 5 min para las células tratadas con JQ1 o DMSO. De manera resumida, 1x106 células por condición se lavaron con DPBS 1x. Una vez retirado el sobrenadante se procedió al aislamiento de sus núcleos a 4ºC y con tampones fríos. 10µL de Nuclei Prep Buffer fueron añadidos al pellet celular que fue resuspendido mediante pipeteo suave. Tras una incubación de 5 min, los núcleos fueron peleteados por 95 centrifugación y el sobrenadante descartado. Los pellets celulares fueron lavados con Atlantis Digestion Buffer y los tubos invertidos suavemente 2-3 veces para ser nuevamente centrifugados. Tras repetir el paso de lavado, los núcleos precipitados fueron resuspendidos mediante la adición de 10µL de MN Digestion Buffer y DMSO o tratamiento enzimático con micrococo nucleasa usando 0,1, 0,25 y 0.5 unidades de la enzima. Los componentes fueron suavemente mezclados y la reacción se dejó incubar durante 5 min a RT, tras lo cual, la reacción fue parada mediante la adición 5X Stop Buffer. Los componentes fueron mezclados y se procedió al aislamiento del ADN nucleosomal. Primeramente, un volumen relación 5:1 de DNA Binding Buffer fue añadido la reacción de “parada”, los componentes mezclados por vórtex y la mezcla cargada en un Collection Tube dentro de una columna Zymo-SpinTM IICR Column. Luego, se centrifugaron los componentes por 30 seg. El filtrado fue descartado y la columna lavada con DNA Wash Buffer y centrifugado por 30 seg y se descartó el filtrado. Tras repetir el lavado, la columna fue transferida a un nuevo tubo limpio y procedió con el paso de elución mediante la adición de 30µL de DNA Elution Buffer a la matriz de la columna. Tras 1 min a RT, se procedió al paso final de centrifugación durante 30 seg. El ADN nucleosomal recogido fue almacenado a -20ºC hasta su uso. La visualización del grado de accesibilidad en la cromatina se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio (Fisher Bioreagents, BP1302-10). 4.23 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN Para la extracción y purificación de ADN de alta calidad a partir de célula en cultivo se utilizó Centra Puregene Cell Kit (Qiagen, 158388) siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. De manera resumida, 1x106 células fueron resuspendidas en 200µL Cell Lysis Solution (Qiagen, 158908) e incubadas durante 1 h hora a RT para romper agregados celulares. Luego se procedió al tratamiento de esta solución con 3µL RNAse A (1 mg/ml) (Thermo Scientific™, EN0531) durante 1 h a 37ºC. Las muestras fueron llevadas a RT y se añadieron 102 enfriado. Se añadió el volumen adecuado (ver tabla abajo) de MEB frío conteniendo inhibidores de proteasas al pellet y se vorteó el tubo durante 5 seg a máxima potencia para repetir la incubación a 4ºC durante 10 min con agitación suave. Tras centrifugación, el sobrenadante, que es el extracto membrana, fue transferido a un tubo limpio enfriado previamente. Tras esto, se añadió el volumen adecuado (ver tabla abajo) de NEB frío conteniendo inhibidores de proteasas al pellet y se vorteó a máxima potencia durante 15 seg para luego incubar el tubo a 4ºC durante 30 min con agitación suave. Tras la centrifugación, el sobrenadante, que es el extracto nuclear soluble, fue transferido a un tubo limpio enfriado previamente. Al pellet se le añadió el volumen adecuado (ver tabla abajo) de tampón de la fracción unida a cromatina (5µL de CaCl2 100mM y 3uL, o 300 unidades de MNase, por cada 100µL de NEB a temperatura ambiente) y se vorteó igual que en el paso previo para ser luego incubado durante 5 min en un baño a 37ºC. Se repite el vórtex y se centrifuga para finalmente el sobrenadante, que es el extracto nuclear de fracción unida a cromatina, fue transferido a un tubo pre enfriado. Finalmente, se añade al pellet el volumen adecuado (ver tabla abajo) de PEB a RT conteniendo inhibidores de protesasas y se vortea a máxima potencia durante 15 segundos para luego ser incubado durante 10 min a RT. Tras la centrifugación, el sobrenadante, que es el extracto citoesquelético, fue transferido a un tubo nuevo enfriado previamente. Todas las muestras fueron mantenidas almacenadas a -80ºC hasta su uso. Vol.(µL) de reactivos utilizados según vol. calculado pellet celular Vol. del pellet (µL) CEB (µL) MEB (µL) NEB (µL) NEB (µL)* PEB (µL) 10 100 100 50 50 50 20 200 200 100 100 100 50 500 500 250 250 250 100 1000 1000 500 500 500 *NEB con MNase (Micrococcal Nucleasa) y CaCl2 Nota: escalar este protocolo dependiendo del volumen del pellet celular indicado en la tabla. Mantener una relación de volúmenes de los reactivos CEB:MEB:NEB:PEB a 1:1:0,5:0,5 de manera respectiva. 103 4.31 OBTENCIÓN DE HISTONAS Las histonas fueron extraídas con el kit Histone Extraction (Abcam, ab113476) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cultivaron 1x106 células. Las células cultivadas fueron lavadas con DPBS 1x a 4ºC suplementado con 5mM de butirato de sodio para preservar los niveles de acetilación. Las células fueron resuspendidas en TEB (Triton Extraction Buffer) conteniendo un 0,5% de TritonX-100 (v/v), 2mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), 0.02% (p/v) NaN3 a una densidad celular de 1x107 células por mL y lisadas en hielo durante 10 min con agitación suave. Las muestras fueron centrifugadas y el sobrenadante descartado. Este paso se repitió con la mitad de volumen de TEB y el pellet celular fue resuspendido en 0.2N HCl a una densidad celular de 1x107 células por mL. Las muestras se dejaron incubando durante la noche a 4ºC para la extracción ácida de las histonas. Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas y el sobrenadante conteniendo las histonas traspasado a un tubo. La concentración fue determinada mediante ensayo de Bradford (Sigma-Aldrich, B6916) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron almacenadas a -20ºC hasta su uso. 4.32 ANÁLISIS MEDIANTE WESTERN BLOT Para observar las diferencias en los niveles de proteínas entre distintas muestras, la misma cantidad de proteína fue mezclada con tampón Laemmli 4x (casero) y cargado en 4–20% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (BIO-RAD, 4561095S) o en geles de Acrilamida/Bis-acrilamida (Sigma-Aldrich, A3574) caseros, para ser luego separados electroforéticamente. La proteína fue transferida a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Immobilon-P PVDF Membrane (Millipore, IPVH00010). Todas las transferencias se hicieron durante la noche, a 4ºC y 30mV. Al día siguiente, las membranas fueron lavadas con agua miliQ, teñidas mediante tinción de 104 Ponceau, incubando con reactivo de Ponceau S (Sigma-Aldrich, P3504) durante 3 min a RT, y lavadas nuevamente con agua miliQ para tomar fotografías. Tras tomar las fotografías y cortar la membrana nuevamente, estas fueron lavadas tres veces durante 5 min con tampón salino tris (TBS) 1x (Fisher Bioreagents, BP2471-1) conteniendo un 0,1% del detergente no-iónico TWEEN® 20 (Sigma-Aldrich, P1379) (referido en adelante como TBS/T). Tras los lavados, las membranas fueron bloqueadas con un 5% de leche desnatada en polvo (LabScientific, M-0841) disuelta en TBS/T y posteriormente incubadas en agitación con anticuerpos primarios (Tabla suplementaria 4) diluidos en TBS/T con 0,5% leche en polvo, durante 1 h a RT o durante la noche a 4ºC. Tras 3 lavados de 15 min con TBS/T las membranas fueron incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (Tabla suplementaria 4) durante 45 min a 4ºC y en agitación. Finalmente, tras 3 lavados de 15 min con TBS/T las membranas fueron incubadas con diferentes substratos ECL (Tabla suplementaria 2) dependiendo de la intensidad de señal obtenida durante 5 min, y posteriormente en sala oscura expuestas a placa radiográficas Fuji Super RX-N (Fujifilm, 16189949) empleando un hipercasete estándar y revelados para su visualización utilizando una máquina de revelado Fujifilm (FPM100A). 4.33 INMUNOPRECIPITACIÓN DE NUCLEOSOMAS Y VISUALIZACIÓN La inmunoprecipitación de nucleosomas se realizó a partir extractos nucleares preparados de la forma descrita anteriormente (para más detalle, ver apartado 4.30) y estos fueron incubados con anticuerpo antiHistona H3 (Abcam, ab1791) durante toda la noche a 4ºC. El segundo día, las Dynabeads™ Protein G (Invitrogen, 10009D) equilibradas fueron añadidas a cada reacción e incubadas en rotación por 4 horas a 4ºC. Los complejos nucleosomales-H3/bolas fueron lavadas con buffer de inmunoprecipitación (ver tabla abajo) y las proteínas visualizadas mediante Western Blot (para más detalle, ver apartado 4.32) o mediante 105 tinción con nitrato de plata. Para este fin, los productos se corrieron electroforéticamente en un gel comercial del 4–20% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (BIO-RAD, 4561095S) y se visualizaron mediante el uso de Pierce™ Silver Stain Kit (Thermo Scientific™, 24612) siguiendo las instrucciones del fabricante. De manera resumida, los geles fueron lavados por dos veces durante 5 min con agua miliQ y fijados en una solución 30% etanol y 30% ácido acético dos veces durante 15 min a RT. Los geles fueron posteriormente lavados con etanol 30% por dos veces de 5 min y mismos lavados con agua miliQ. El gel fue luego sensibilizado durante un minuto con la solución de sensibilización de trabajo (50µL Sensitizer Solution en 25mL agua) y lavado dos veces con agua miliQ durante 1 min. Se añadió a los geles la solución de tinción de trabajo (0.5mL Enhancer con 25mL de Stain) y se tiñó durante 30 min a RT. Los geles fueron nuevamente lavados dos veces con agua durante 20 seg y se añadió la solución desarrolladora de trabajo (0,5mL Enhancer con 25mL de Developer) y se dejaron desarrollar durante 2-3 minutos hasta que las bandas aparecieron. El desarrollo fue parado añadiendo la solución de parada (con ácido acético 5%) durante 10 min y posteriormente los geles fueron lavados varias veces con H2O mQ durante 2-4 h a RT. 4.34 IDENTIFICACIÓN DE CAMBIOS PROTEICOS POR SILAC-MS Para identificar los cambios proteicos producidos en la fracción unidad a cromatina en pre-iPSC tratadas con JQ1 0,5 µM durante 24 h con respecto al vehículo control DMSO se utilizó la técnica cuantitativa de marcaje de aminoácidos en cultivo celular con isotopos (SILAC, por sus siglas en inglés) y su posterior detección por espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) tal y como se ha descrito anteriormente 395. De manera resumida, las pre-iPSCs fueron cultivas en medio pluripotente utilizando Mouse Embryonic Stem Cell SILAC Kit (Thermo Scientific, 88206) en presencia de “aminoácidos ligeros” [L-arginina-HCL (Thermo Scientific, 88427) y L-lysine-2HCL (Thermo Scientific, 88429)] en el caso de las control o “aminoácidos 106 pesados” [L-arginine:HCL (U-13C6, 99%; U-15N4, 99%) (Cambridge Isotope Laboratories, CNLM-539-H-0.25) y L-lysine-2HCL (U-13C6, 99%; U-15N2, 99%) (Cambridge Isotope Laboratories, CNLM-291-H0.25)] en el caso de las tratadas con JQ1. La fracción proteica nuclear unida a cromatina fue extraída como se describió anteriormente (para más detalle, ver apartado 4.30). 250 µg de fracción unida a cromatina, procedente de cada una de las dos condiciones, fue combinada en una proporción 1:1. Ambos extractos fueron corridos en geles 4–20% MiniPROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (BIO-RAD, 4561095S) que se tiñeron con GelCode Blue Safe Protein Stain buffer (Thermo Scientific™, 24594) y sujetos a análisis LC-MS/MS de línea completa. Los datos de MS fueron procesados por el software Proteome Discoverer™ (v.3.68, Thermo Scientific™) con el motor SEQUEST contra la base de datos International Protein Index mouse protein sequence (v.3.68). Las listas de proteínas fueron filtradas de acuerdo con el número mínimo de péptidos identificados (>1). Las proteínas contaminantes comunes (como tripsina, queratinas, actinas o tubulinas) fueron retiradas. Los registros duplicados fueron retirados sobre la base de símbolos (Protein Symbol) únicos. Luego, la relación de enriquecimiento proteico fue calculado sobre la base de la relación pesado/ligero (SILAC) para la obtención indirecta del valor de la relación JQ1/Vehículo. 4.35 SOFTWARE Y ALGORITMOS A continuación, se indican los distintos programas informáticos (software) y algoritmos utilizados a lo largo de esta tesis doctoral. NOMBRE FUENTE IDENTIFICADOR/DIRECCIÓN Bowtie2 v2.3.0 Johns Hopkins Univ. http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml Bwa v0.5.9 (Li and Durbin, 2009) 396 https://sourceforge.net/projects/biobwa/files/ CellProfiler software v2.1.1 Broad Institute https://cellprofiler.org 107 Cluster v3.0 Stanford Univ. http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/ cluster/software.htm#ctv Cufflinks v2.2.1 Washington Univ. http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/ DAVID Laboratory of HRI https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp EndNote X9 The EndNote Team https://endnote.com/ FlowJo v7.6.1 FlowJo, LLC https://www.flowjo.com/ GENE-E v3.0.215 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/GENEE/ GraphPad Prism software v8.0.2 GraphPad https://www.graphpad.com/company/ GSEA v4.0.3, y MSigDB Broad Institute http://software.broadinstitute.org/gsea/in dex.jsp IGV software v2.7.2 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/softwa re/igv/download ImageJ v1.33 NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Interactive Tree Of Life (iTOL) software v5.5.1 EMBL 397 LAS X Life Science Sotware Leica Microsystems https://www.leicamicrosystems.com/products/microscopesoftware/p/leica-las-x-ls/ Leica Application Suite v3.4.2.18368 Leyca Microsystems https://www.leica-microsystems.com/ mfold v3.6 The RNA Institute http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/d ownload-mfold Molecular Imager® Gel Doc™ XR Image Lab™ Software BIO-RAD https://www.bio-rad.com/eses/sku/1708195-molecular-imager-gel-docxr-system-with-image-labsoftware?ID=1708195 Morpheus software Broad Institute https://software.broadinstitute.org/morph eus/ OriginPro 2017 v9.4.0.220 OriginLab https://www.originlab.com/Origin OriginPro 2019b v9.6.5.169 OriginLab https://www.originlab.com/Origin PRIMER1 (Ye et al., 2001) 398 http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html Prism v8.0.2 GraphPad https://www.graphpad.com/ Proteome Discoverer™ v.3.68. Thermo Scientific™ https://www.thermofisher.com/order/cata log/product/OPTON-30812?ce Samtools v0.1.18 (Li et al., 2009) 399 https://github.com/samtools/samtools Sequencher v5.4 Gene Codes Corporation http://www.genecodes.com/ 108 Serial Cloner software v2.6.1 Serial cloner http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.ht ml SOAPnuke v1.5.6 BGI https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke StepOne Software v2.3 Thermo Fisher™ https://www.thermofisher.com/es/es/hom e/life-science/pcr/real-time-pcr/ The CLUSTAL_X 400 https://academic.oup.com/nar/article/25/ 24/4876/1747529 TMHMM Server v. 2.0 DTU Bioinformatics http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ TopHat v2.1.1 Johns Hopkins Univ. https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index .shtml 4.36 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Todos los análisis fueron ejecutados con GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.), Excel o R (http://www.r-project.org). La significación estadística fue hallada mediante la prueba T de Student o ANOVA de dos colas con o sin Tukey’s post test, tal y como se especifica en las leyendas de las figuras a lo largo de este trabajo. Los valores P menores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. 4.37 RECURSOS BIBLIOGRÁFICOS Para la revisión bibliográfica del presente trabajo, se usaron las plataformas digitales de libre acceso Google Académico (https://scholar.google.es/) y PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). La introducción de las referencias bibliográficas consultadas fue realizada mediante la utilización del software EndNote X9 (https://endnote.com/). 109 110 5. RESULTADOS 111 118 Figura R4. Análisis de los cambios dinámicos temporales de expresión de los genes que codifican proteínas BRD durante la SCR. Mapa de calor mostrando la expresión los genes que codifican las proteínas BRD a lo largo de la reprogramación de MEFs mediante el sistema inducible OSKM. La abundancia normalizada de la expresión de cada gen BRD se muestra representada por el tamaño de círculo. El color indicado en la escala representa el valor de expresión mínimo y máximo para cada gen BRD en unidades de fragmentos por millón de kilobases (FPKMs, por sus siglas en inglés). 119 En conjunto, estos datos revelan una nueva firma dinámica de expresión de genes que codifican las proteínas BRD asociada a la reprogramación exitosa por OSKM que resulta heterogénea y no dependendiente de actividad funcional 143 o conservación estructural 241. Esta firma BRD puede servir como una herramienta para interrogar los mecanismos moleculares en los que intervienen las proteínas BRD, a nivel individual o mediante posibles interacciones con otros miembros de esta familia (Figura R3), durante las diferentes trayectorias celulares que se suceden para alcanzar el estado celular pluripotente. Estos resultados añaden una mayor complejidad a la hora de diseccionar la relevancia de la actividad BRD durante la SCR ya que cada proteína BRD podría participar diferencialmente en la regulación de cada una de las diferentes entidades celulares surgidas en el proceso de adquisición de pluripotencia. 5.1.3 Determinación de la función de los dominios BRD en SCR mediante cribado químico Debido a la heterogeneidad funcional que presentan las proteínas que contienen BRDs, para determinar el papel del reconocimiento de residuos de lisina acetilados (Kac) por proteínas BRD específicas durante la generación de iPSCs se utilizaron inhibidores selectivos de actividad BRD. Debido a la naturaleza química de esta aproximación, primero se elaboró una clasificación estructural de los 53 dominios BRD existentes en ratón mediante un análisis filogenético de similitud a partir de las secuencias aminoacídicas de estos dominios (NCBI, UniProt, PFAM). Los resultados de este análisis in silico reveló la existencia de ocho familias estructurales de BRDs en ratón (Figura R5). Teniendo en cuenta la organización basada en dominios en proteínas BRD realizada por el grupo del Dr. Filippakopoulos en 2012 utilizando los 61 BRDs existentes en la especie humana 241, se observa desde una perspectiva evolutiva una gran conservación estructural basada en dominios BRD entre estas dos especies de mamíferos. 120 Figura R5. Árbol filogenético de dominios BRD en ratón e inhibidores BRD. Análisis in silico basado en las similitudes estructurales existentes de los 53 dominios BRD que codifica el genoma de ratón. Se representa la agrupación de las 8 familias estructurales obtenidas por código de colores para facilitar la visualización de estas. Se muestran las distintas moléculas inhibidoras (en negro) utilizadas en este estudio indicando el BRD específico de la proteína que lo contiene del que son ligando (en azul). Los círculos rojos representan el grado de parsimonia y máxima verosimilitud obtenido por el método de Bootstrap. Para investigar cómo los dominios BRD pueden afectar a la formación de iPSCs, se procedió a la realización de un pequeño cribado químico con 28 inhibidores BRD selectivos disponibles comercialmente (Figura R5). Se determinó mediante citometría de flujo (FACS) si la presencia individual de cada uno de estos 28 inhibidores afectaba a la eficiencia de reprogramación de fibroblastos transducidos con OSKM medida por el porcentaje de células positivas 121 para Oct4-GFP (Figura R6a). De manera consistente con ensayos anteriores, en el caso del tratamiento con el inhibidor BRD de amplio espectro BSP la eficiencia de reprogramación se redujo dramáticamente comparada con el tratamiento con DMSO (Veh.) (0.64% vs 11% de células GFP+) (Figura R6b). De manera interesante, se observó que el tratamiento con inhibidores de la las familias I (L-Moses), III (SGCCBP30, Ischemin, I-CBP112, CPI-637 y PF-CPB1) y VIII (PFI-3) facilitaba el aumento de células Oct4-GFP+ en magnitudes comprendidas entre el 25% y 50% con respecto al tratamiento con Veh. (Figura R6c). La presencia del inhibidor GSK2801 (familia V) así como el tratamiento con el inhibor TP-472, que actúa sobre los BRDs contenidos en las proteínas BRD7 y BRD9 de la familia IV, también facilitaban, aunque en menor proporción a los anteriores inhibidores mencionados, la obtención de células pluripotentes (Figura R6c). Por otro lado, la inhibición de la actividad BRD correspondiente a los coactivadores transcripcionales BET (familia II) resultó de manera consistente en una reducción drástica del porcentaje de células Oct4GFP+ obtenidas con cada uno de los 8 inhibidores BET selectivos utilizados (JQ1, I-BET151, PF-1, I-BET762, CPI-203, CPI-0610, MS147, ABBV-075 y OTX015) (Figura R6c). También se observó que la presencia de los inhibidores PFI-4 y OF-1 (BRPF1, BRPF3 y BRD1 de la familia IV) así como el tratamiento con I-BRD9 (BRD9 de la familia IV) y BAY-299 (BRD1 de la familia IV y TAF1 de la familia VII) afectaba negativamente en el proceso de SCR con rangos comprendidos entre el 20% y 40% de disminución de células Oct4GFP+ obtenidas (Figura R6c). Interesantemente, el tratamiento con los inhibidores I-BRD9 y TP-472 sugieren la existencia de actividades BRD opuestas contenidas en la misma familia estructural IV, siendo el caso de las proteínas BRD7 y BRD9 cuya actividad lectora Kac actúa restringiendo o facilitando la reprogramación respectivamente (Figura R6c). En su conjunto, los resultados obtenidos en este cribado químico muestran la existencia de actividad BRD específica que resulta 122 necesaria para la generación de células pluripotentes así como identifica la existencia de dominios BRD que desempeñaban un papel como barrera en la SCR durante la generación de iPSCs (Figura R6c). Figura R6. Identificación de actividad BRD específica en SCR mediante cribado químico. a, Representación esquemática de la estrategia de cribado químico contra función BRD específica para la determinación de eficiencia de la reprogramación OSKM de Oct4-GFP MEFs mediante FACS. b, Análisis por FACS del porcentaje de células positivas para GFP en Oct4-GFP MEFs tras 15 días de reprogramación en presencia de BSP (1µM) o DMSO como control (Veh.). c, Resultados relativos al control Veh. del número de células positivas para GFP tras el ensayo de reprogramación siguiendo la estrategia de cribado químico indicada en a y detección por FACS como en b. 5.1.4 La inhibición de la familia BET fenocopia la supresión de actividad BRD global en reprogramación Los datos del cribado químico sugieren que los dominios BRD presentes en miembros de la familia BET (BRD2, BRD3, BRD4 y BRDT) son los principales mediadores de la respuesta obtenida 123 mediante la inhibición global de la actividad BRD por tratamiento con BSP en la inducción de pluripotencia (Figura R6c). Además de no permitir la generación de células positivas para Oct4-GFP (Figura R6c), posteriores valoraciones microscópicas de los cultivos en reprogramación revelaron que tanto el tratamiento con BSP como la presencia de inhibidores de la familia BET permitían cambios de identidad celular asociados al proceso de reprogramación. En concreto, se observó que en presencia de estos inhibidores BET y BSP un número considerable de células bajo reprogramación perdían su típica morfología fibroblástica inicial para adquirir una morfología con rasgos epiteliales que sueles ser característica de intermediarios de reprogramación que surgen en etapas avanzadas de la SCR. Para valorar cuantitativamente este posible efecto, se llevaron a cabo ensayos de reprogramación a partir de MEFs con OSKM en presencia o ausencia de inhibidores durante tiempos largos de reprogramación (>20 días), y se clasificaron morfológicamente los dos tipos principales de colonias surgidas como intermediarios avanzados de reprogramación (de ahora en adelante, pre-iPSCs) si las colonias estaban formadas por acúmulos de células individualizadas o iPSCs si las colonias presentaban la típica morfología compacta de las mismas (Figura R7a). Interesantemente, en comparación con células tratadas con DMSO (Veh.) la presencia tanto de BSP como inhibidores BET reduce considerablemente el porcentaje de colonias con “morfología típica” iPSC y conlleva un aumento de aquellas con “morfología típica” pre-iPSC (Figura R7b). Este resultado fue altamente reproducible en posteriores ensayos utilizando el inhibidor BET JQ1, el cual es el inhibidor referente y el más utilizado para abordar el estudio de la función de los bromodominios de esta familia de coactivadores transcripcionales 224,301,403. Así, los resultados mostraron que el tratamiento con JQ1 reduce significativamente el número de colonias semejantes a iPSCs y aumenta significativamente el número total de colonias semejantes a pre-iPSCs (Figura R7c). A este respecto, resultó llamativo observar que la relación pre-iPSCs/iPSCs era prácticamente inversa entre los cultivos tratados o no con el inhibidor JQ1 (Figura R7c). 124 En conjunto, estos datos muestran que la inhibición de la actividad específica BRD de BET impide la formación de iPSCs, lo que fenocopia el efecto de la inhibición BRD global mediante BSP durante SCR, y sugieren que la actividad BRD de las BET puede resultar esencial en las etapas finales de la formación de iPSCs. Figura R7. La inhibición específica de la actividad BRD de la familia BET compromete la generación de iPSCs. a, Representación esquemática de la estrategia de reprogramación utilizada para valorar los cambios morfológicos producidos en los cultivos en SCR. Se muestran imágenes representativas de las colonias semejantes a pre-iPSC o semejantes a iPSCs según su aspecto por microscopía de contraste de fases. b, Porcentaje de tipo de colonias indicado en cada uno de los tratamientos. c, Número de colonias semejantes a pre-iPSC o iPSC obtenidas en presencia de JQ1 (0,1µM) o Veh. siguiendo la estrategia de reprogramación indicada en a. Los datos son mostrados como media ± s.e.m. (n=3 experimentos independientes). Los análisis estadísticos fueron realizados mediante pruebas t de Student de dos colas. ****p<0.0001. 125 5.1.5 La actividad BRD de BET es dispensable en las etapas iniciales de la reprogramación Nuestros resultados sugieren que las células obtenidas en los ensayos de SCR en presencia de JQ1 no alcanzan el estadio celular pluripotente, pero sí se producen ciertos cambios morfológicos que son compatibles con los que acontecen durante la transición mesenquimalepitelial (MET, por sus siglas en inglés) al inicio de la SCR (Figura R7). La MET es un proceso esencial y limitante para la formación de iPSCs 179,404,405. Tal como se indicó en la introducción, las trayectorias celulares que resultan permisivas para la generación de iPSCs ocurren de manera gradual, siendo tres las fases o trayectorias principales (“iniciación”, “maduración” y “estabilización”) durante la SCR (Figura R8a). Durante la primera fase de “iniciación”, que corresponde con la MET, se produce la regulación a la baja de los genes mesenquimales y se activan los genes epiteliales. A la fase de “iniciación” le sucedería la denominada fase de “maduración”, en la que se produce la regulación al alza de transcritos epiteliales y la reactivación de los genes de pluripotencia. A medida que aumenta la expresión de los genes de pluripotencia, se entraría en la fase de “estabilización” y el proceso de SCR finalizaría cuando la red de pluripotencia endógena es sostenible e independiente de OSKM. Teniendo en cuenta esto, los cultivos de MEF sujetos a reprogramación en presencia y ausencia de JQ1 fueron caracterizados transcripcionalmente a distintos tiempos del proceso en base a la abundancia relativa de distintos trascritos mesenquimales, epiteliales y de pluripotencia (Figura R8b). Los resultados de RT-qPCR muestran que la expresión de los genes mesenquimales Cdh2 y Zeb1 presenta su máximo a nivel al principio de la SCR, antes de que las células sufran la MET, y van disminuyendo hasta alcanzar su mínimo a día 6-9, tanto en las células control como en los cultivos en presencia de JQ1 (Figura R8b, izquierda). Por otro lado, la activación de los marcadores epiteliales Cdh y Ocln no se ve comprometida en presencia de JQ1, aunque parece que la expresión de Ocln empieza un poco retardada a en presencia de JQ1 en los primeros días de la SCR (Figura R8b, centro). Estos resultados muestran que la regulación a la baja de los genes mesenquimales y la activación y regulación al alza de los genes 126 epiteliales parece no estar afectada de manera significativa por la inhibición de la actividad BRD de las proteínas BET, lo que resulta en una MET comparable entre células tratadas con DMSO (Veh.) y JQ1. Figura R8. La inhibición de la actividad BRD de BET no compromete la MET durante reprogramación. a, Representación esquemática de las trayectorias y procesos más importantes que tiene que superar una célula somática de origen mesenquimal (MEF) para alcanzar el estado celular pluripotentes (iPSC). b, Resultados de la expresión relativa normalizada a Gapdh y el valor más alto en cada condición obtenidos por la técnica de RT-qPCR para los marcadores mesenquimales 127 (izquierda), epiteliales (centro) y de pluripotencia (derecha) indicados. Los datos son mostrados como media ± s.e.m. (n=3 experimentos independientes). Los análisis estadísticos fueron realizados mediante pruebas t de Student de dos colas. **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001; ns diferencia no significativa. Sin embargo, la actividad de BRD de la familia BET resulta esencial para la activación y regulación al alza de la red endógena de pluripotencia, como se aprecia de manera significativa comparando los niveles de expresión de los marcadores de pluripotencia Nanog y Esrrb entre células tratadas con JQ1 y Veh. (Figura R8b, derecha). 5.1.6 La actividad BRD de BET resulta necesaria para la adquisición de pluripotencia Una vez comprobado que la actividad BET no resulta necesaria para que transcurra la MET de manera satisfactoria (Figuras R7 y R8), se valoró con más detalle el posible “estancamiento” de las células cultivadas en presencia de JQ1 en la fase de intermediario avanzado de reprogramación pre-iPSC. Para este fin, se caracterizó con mayor profundidad las entidades celulares resultantes de la SCR no productiva en presencia de JQ1. Como se ha indicado anteriormente, la SCR hacia iPSC es un proceso secuencial con varias fases que presentan programas transcripcionales particulares. Por ejemplo, tras la MET se produce la regulación al alza del marcador de membrana asociado a pluripotencia SSEA-1 192,406, y en un subgrupo de intermediarios de reprogramación SSEA-1+ se activará finalmente la red de pluripotencia endógena mediante demetilación activa de genes como Oct4 42,191,192. Para probar que la inhibición de la actividad BRD de la familia BET impide la formación de iPSCs (SSEA-1+ y OCT4+) bloqueando la reprogramación en un estadio pre-iPSC (SSEA-1+ y OCT4-) (Figura R9a) se evaluaron los niveles de estos dos marcadores de referencia en este campo de estudio. Así, en primer lugar, mediante la reprogramación por OSKM de MEFs albergando un reportero GFP bajo el control de la expresión endógena de Oct4 (Oct4-GFP MEFs) y combinando microscopía en campo claro con microscopía de fluorescencia, se pudo realizar un seguimiento temporal del efecto del tratamiento con JQ1 durante la SCR. 134 generación de iPSCs de manera permanente (Figura R11b). En su conjunto, nuestros datos sugieren que la inhibición de la actividad BRD de las BET en las etapas iniciales de la transición pre-iPSC a iPSC puede conllevar cambios moleculares permanentes en la biología celular de los intermediarios avanzados de reprogramación (ej. rOKMN) que afectan de manera negativa a la adquisición del estado celular pluripotente. Figura R11. La presencia de JQ1 impide el inicio de la transición pre-iPSC a iPSC. a, Representación esquemática del ensayo de reprogramación para valorar el impacto en escala temporal del tratamiento con JQ1 a partir de pre-iPSCs (rOKMN) con reportero GFP bajo el control del promotor de Oct4. Las pre-iPSCs son mantenidas de manera estable en medio estándar de cultivo (SL) y estimuladas a ser reprogramadas en medio de reprogramación 2iL en ausencia de suero. A la derecha se muestran imágenes representativas obtenidas por microscopía de contraste de fases y microscopía de fluorescencia de pre-iPSCs mantenidas en SL y iPSC generadas tras 9 días en medio 2iL. b, Cuantificación del número de colonias positivas para Oct4-GFP generadas (derecha) siguiendo los tratamientos indicados (izquierda). Se indican los tratamientos con JQ1 (0,5µM) (cuadro con trama) o vehículo DMSO 135 (cuadro sin trama) en medio SL (azul) o 2iL (verde) durante un periodo de 12 días. Los análisis estadísticos fueron realizados mediante pruebas t de Student no pareada de dos colas. ****p<0.0001. 5.2.3 La presencia de JQ1 no afecta a la capacidad proliferativa ni a la viabilidad celular de las pre-iPSCs Numerosas evidencias científicas han puesto de manifiesto que alteraciones en los procesos celulares relacionados a proliferación y viabilidad pueden impactar directamente y de manera no específica en el rendimiento de SCR para formar iPSCs 83,410-412. De este modo, se examinó si el efecto de la inhibición de la actividad BRD de BET en la transición de pre-iPSC a iPSC en condiciones de cultivo estándar SL pudiese estar mediado por un defecto general en proliferación o viabilidad celular (Figura R12a). De manera general, el tratamiento con JQ1 no produjo alteraciones evidentes en la morfología de las preiPSCs en comparación con las tratadas con DMSO (Veh.) (Figura R12b). Tampoco se detectaron diferencias apreciables con respecto al porcentaje de muerte celular entre pre-iPSCs tratadas con JQ1 o Veh. (Figura R12c). En la misma línea que los resultados anteriores, la presencia de JQ1 no alteró el porcentaje de pre-iPSCs presentes en G1, S o G2-M con respeto al tratamiento control de DMSO (Veh.) (Figura R12c). Confirmando el análisis de ciclo celular, el seguimiento del marcador celular de proliferación Ki67, ausente en células quiescentes en G0, mediante ensayos de inmunofluorescencia no reveló diferencias significativas entre células tratadas con JQ1 o con D>MSO (Veh.) (Figura R12d-e) Estos resultados muestran que la exposición a JQ1 no impide la transición pre-iPSC a iPSC a través alteraciones en la capacidad proliferativa o viabilidad celular de las células tratadas. 136 Figura R12. Las pre-iPSCs tratadas con JQ1 no presentan defectos en ciclo celular y viabilidad. a, Representación esquemática de la estrategia para valorar el impacto de la presencia de JQ1 (0,5µM) sobre viabilidad celular y capacidad proliferativa de pre-iPSCs (rOKMN) cultivadas en presencia de suero y LIF (SL). b, Imágenes visibles representativas obtenidas por microscopio de fases de las células cultivadas en presencia de DMSO (Veh.) o JQ1 (0,5µM). c. Porcentaje de muerte celular analizado por citometría de flujo en pre-iPSCs tratadas con JQ1 (0,5µM) o DMSO (Veh) en SL. d, Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo en pre-iPSCs tratadas con JQ1 o DMSO (Veh) en SL. Se muestra el porcentaje de células presentes en G1, S y G2 (G2-M). e, Imágenes representativas obtenidas mediante inmunofluorescencia de la presencia del marcador de proliferación celular Ki67 en pre-iPSC tratadas con JQ1 (0,5µM) durante 72 horas en SL. En rojo se muestra Ki67 y en azul los núcleos teñidos con DAPI. f, Cuantificación de la intensidad de Ki67 relativizada a la señal de DAPI por célula pre-iPSC individual tratada con JQ1 (0,5µM) o DMSO (Veh.) durante 72 horas en SL. El análisis estadístico fue realizado mediante prueba t de Student no pareada de dos colas. ns indica diferencias no significativas. 137 5.3 DISECCIÓN DE LOS MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD BRD DE LA FAMILIA BET EN LA ADQUISICIÓN DE PLURIPOTENCIA 5.3.1 La inhibición de la actividad BRD de BET altera la composición de la cromatina El requerimiento de la actividad BRD de las proteínas BET en la adquisición del estado celular pluripotente nos instó a investigar qué programas moleculares envueltos en esta fase de reprogramación se encuentran alterados ante la inhibición de la actividad BRD de reconocimiento Kac de esta familia de coactivadores transcripcionales. Ya que numerosas evidencias apoyan que la familia BET interviene en el reclutamiento de múltiples factores y cofactores a la cromatina, entre los que se encuentran TFs y reguladores epigenéticos 143,271,274,378,413, se analizó si la inhibición de la actividad BRD de BET podría afectar a la composición de la fracción proteica unida a cromatina en pre-iPSCs. En concreto, decidimos centrarnos en el efecto del tratamiento agudo con JQ1 de 24 horas en condiciones de cultivo SL ya que nuestros resultados mostraron que era suficiente para comprometer de manera significativa la transición pre-iPSC a iPSC (Figura R11b). Se ha mostrado que el ligando específico JQ1 se une competitivamente al bolsillo hidrofóbico e impide el reconocimiento BRD-Kac de los miembros de esta familia desplazándolos de la cromatina 241,301. Por esto, en primer lugar, se analizó si el tratamiento con JQ1 era suficiente para desplazar a los miembros de la familia BET (BRD2, BRD3 y BRD4) de la cromatina de pre-iPSCs. De manera consistente a otros contextos celulares, nuestros resultados confirmaron que la presencia de JQ1 también fue suficiente para reducir de manera drástica la presencia de BRD2, BRD3 y BRD4 en la cromatina aislada de pre-iPSCs en SL en comparación con las condiciones control con DMSO (Veh.) (Figura R13a). 138 Figura R13. La actividad BRD de BET interviene en la composición de la cromatina de pre-iPSCs. a, Análisis mediante western blot (WB) de la presencia de BRD2, BRD3 y BRD4 de la familia BET en la fracción proteica unida a cromatina (CB) procedente de pre-iPSCs cultivadas en SL y tratadas con JQ1 (0,5µM) o DMSO (Veh.) durante 24 horas. Los niveles de la histona H3 fueron analizados como control de carga. b, Ensayo de enriquecimiento de fracción nucleosomal de histona 3 (H3 nucleosome pull down) a partir de pre-iPSCs tratadas como en a. La inmunoprecipitación de la fracción nucleosomal se realizó mediante un anticuerpo específico contra H3 global a partir de extractos proteicos nucleares. La detección de las proteínas que interaccionan de manera directa o indirecta con H3 se realizó mediante la tinción 139 con nitrato de plata. Se indica en la imagen la señal correspondiente al tamaño de las histonas principales que conforman el nucleosoma (H2A, H2B, H3 y H4). c, Representación esquemática de la estrategia SILAC/MS para identificar posibles cambios en la composición de la cromatina producidos por la inhibición de la actividad BRD de BET. La fracción proteica unida a cromatina (CB) fue obtenida de pre-iPSCs tratadas como en a. y previamente marcadas durante diez días con la presencia en el medio de cultivo de dos combinaciones distintas de isótopos estables de los aminoácidos lisina (Lys) y arginina (Arg). 250 µg de fracción CB pura procedente de cada una de las dos condiciones ensayadas (JQ1 y Veh.) fueron mezcladas en una ratio 1:1 y posteriormente analizadas por espectrometría de masas (LC-MS/MS). d, Diagrama de dispersión de los datos obtenidos por SILAC/MS siguiendo la estrategia mostrada en c. El eje de ordenadas muestra la cobertura (%) de aminoácidos y el de ordenadas la relación (en Log2) entre los niveles proteicos presentes en células tratadas con JQ1 (Lys/Arg pesados) con respecto a los presentados por las tratadas con DMSO (Lys/Arg ligeros). Los puntos azules y rojos representan las proteínas cuya presencia está disminuida o aumentada más del 50% en las células tratadas con JQ1 con respecto a las tratadas con DMSO (Veh.), respectivamente. n representa el número total de proteínas en la clasificación indicada. e-f, Validación mediante la técnica de WB de candidatos resaltados en el panel d cuya presencia se encuentra disminuida (e) o aumentada (f) en la fracción CB de pre-iPSCs como consecuencia de la presencia en SL de JQ1 (0,5µM) durante 24 horas. Se indican como control de carga los niveles proteicos de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 detectados mediante la tinción de Ponceau. Luego, mediante un enriquecimiento de fracción nucleosomal de histona H3 se puedo apreciar que las pre-iPSCs tratadas con JQ1 en SL mostraban evidencias de cambios en el reclutamiento de proteínas en comparación con la condición control en presencia de DMSO (Veh.) (Figura R13b). Con el fin de conocer qué proteínas estaban deslocalizadas en presencia de JQ1, y en qué grado podría manifestarse una localización aberrante, se diseñó una estrategia cuantitativa para analizar sólo la fracción proteica unida de manera directa o indirecta a la cromatina mediante el marcaje estable de isótopos por aminoácidos en cultivo celular y detección por espectrometría de masas (SILAC/MS, por sus siglas en inglés) (Figura R13c). El análisis in silico de los resultados obtenidos a partir de esta técnica ómica reveló que el tratamiento con JQ1 produce alteraciones importantes en la fracción proteica unida a la cromatina (CB, por sus siglas en inglés) con respecto al tratamiento con el vehículo control DMSO (Figura R13d). En concreto, se detectó en la fracción CB una reducción de más del doble (>50%) en la presencia de 386 proteínas, mientras 145 proteínas 140 mostraron un incremento mayor del 50% de sus niveles en cromatina en las pre-iPSCs tratadas con JQ1 con respecto a las tratadas con el vehículo control (Veh.) (Figura R13d). Mediante ensayos de western blot se validaron varios de los principales candidatos que disminuía (ej. ZFP42, NACC1, PSPC1, HELLS, MTA1 y KDM1A) (Figura R13e). o aumentaba (ej. AIFM1, KLF4, KDM5A, ENDOG, WDR5 y KDM5B) (Figura R13f) su presencia en la fracción proteica CB obtenida a partir de pre-iPSCs cultivas en SL y tratadas durante 24 horas con vehículo o JQ1. En conjunto, estos resultados muestran que la inhibición de la actividad BRD de BET durante la SCR, cambia sustancialmente la composición de la fracción proteica unida a cromatina. 5.3.2 JQ1 altera la cromatina de manera dependiente e independiente de actividad transcipcional Teniendo en cuenta el papel de las proteínas BET en la regulación transcripcional, se procedió a examinar la posible existencia de correlación entre las 531 deslocalizadas en la fracción CB en presencia de JQ1 (Figura R14a) con el cambio transcripcional de los genes que las codifican como consecuencia directa o indirecta del desplazamiento de las proteínas BET de la cromatina en respuesta a la inhibición de su actividad BRD (Figura R13a). Para este fin, se analizaron los cambios transcripcionales globales en pre-iPSCs tratadas durante 24 horas en SL con JQ1 con respecto a DMSO mediante secuenciación profunda de ARN (RNA-seq, por sus siglas en inglés). De las 145 proteínas cuya deslocalización en la fracción CB aumenta más del doble (>50%) (Figuras R13d y R14a), 60 de éstas también presentan un incremento transcripcional significativo mayor del 10% (ej. Kdm1b, Rybp, Mecp2 y Ap2m1), mientras que no se observó esta correlación positiva entre aumento de niveles proteicos con aumento de expresión en los genes que codifican a estas proteínas en el restante 59% (85 de 145) (ej. Wdr5, Klf4, Med27, Kdm5b, Ino80 y Prmt1) (Figura R14b y R14d). 141 Figura R14. Cambios en la cromatina dependientes e independientes de actividad transcripcional en presencia de JQ1. a. Diagrama de tarta mostrando el porcentaje y número de proteínas con incremento (rosa) o disminución (azul) de sus niveles (>50%) en la fracción unida a cromatina (CB) mediado por el tratamiento con JQ1 (0,5µM) respecto a DMSO (Veh.). b-c, Diagrama de dispersión mostrando los cambios en la expresión génica (ordenadas) y los cambios en la abundancia proteica en la fracción CB (abscisas). Los cambios transcripcionales y los cambios proteicos fueron identificados mediante las técnicas ómicas de RNA-seq y SILAC-MS de manera respectiva a partir de pre-iPSC cultivadas en SL y tratadas durante 24h con JQ1 (0,5µM) o DMSO (Veh.) como control. Se indica de manera coloreada aquellos genes que codifican proteínas cuya presencia en cromatina se encuentra alterada más de un 50% en presencia de JQ1 y cuya actividad transcripcional se encuentra incrementada (b) o disminuida (c) más de un 10% de manera significativa. n=número 142 de factores en la categoría. Valores expresados como Log2 del factor de cambio JQ1/Veh. FDR: valor estadístico de tasa de falso hallazgo. d-e, Abundancia relativa de los niveles de ARN de genes que codifican para proteínas cuya abundancia incrementa (d) o disminuye (e) más de un 50% en pre-iPSCs tratadas con JQ1 (0,5µM) durante 24h. Los datos son mostrados como media ± s.e.m. Los análisis estadísticos fueron realizados mediante pruebas t de Student de dos colas. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns diferencia no significativa. Por otro lado, con respecto a las 386 proteínas cuya presencia en cromatina disminuye más de la mitad (>50%) en presencia de JQ1 (Figuras R13d y R14a), nos encontramos en una situación similar, pero a la inversa. Así un 28% (109 de 386) de las que disminuyen en la fracción CB (>50%) también se observa una correlación positiva con la disminución transcripcional a la baja (>10%) de los genes que las codifican en presencia de JQ1 (ej. Zfp42, Padi4, Pspc1, Cdk1 y Nacc1), pero no así en el 72% (277 de 386) restante (ej. Chaf1a, Hells, Kmt2a, Kdm1a y Tex10) (Figura R14c y R14e). Estos resultados corroboran que la actividad BRD de las BET resulta esencial para la composición de la cromatina tanto de manera dependiente como independiente de regulación transcripcional. Así mismo, estos datos sugieren la posibilidad de que la actividad BRD de las BET intervenga de manera directa o indirecta a nivel transcripcional activando (31%) o reprimiendo (28%) genes que codifican proteínas cuya presencia en cromatina se ve alterada (>50%) en presencia de JQ1. Por otro lado, en el contexto de aquellos genes cuya expresión no varía significativamente y que codifican para proteínas cuya presencia se ve afectada (>50%) en la cromatina de pre-iPSCs con la actividad BRD de BET inhibida, es posible que las BET y los complejos en los que participan puedan actuar compitiendo por los sitios de unión a cromatina (59%) o que estas proteínas con dominios BRD resulten necesarias para el reclutamiento en la fracción CB (72%). 143 5.3.3 JQ1 altera la presencia en cromatina de proteínas involucradas en procesos clave en reprogramación Para continuar avanzando en el porqué de la actividad BRD de BET resulta esencial en la adquisición del estado celular pluripotente durante reprogramación se investigó el impacto que el tratamiento con JQ1 en las pre-iPSCs podría estar teniendo sobre distintos aspectos clave en la biología celular. Para este fin se realizaron diversas aproximaciones in silico a través de la herramienta STRING para estudios funcionales de redes con asociaciones proteicas. En primer lugar, los análisis mediante ontología génica (GO) de procesos biológicos de las 531 proteínas deslocalizadas en la fracción CB en presencia de JQ1 (Figura R13d) revelaron la existencia de alteraciones significativas en procesos de regulación de la expresión génica, procesos del desarrollo, organización de la cromatina, arquitectura nuclear y respuesta a daño en el ADN entre otros (Figura R15a). Por otro lado, análisis de las rutas (Reactome Pathways) en las que estas 531 proteínas pueden estar involucradas también revelaron entre las más significativas aquellas relacionados con el control de la expresión génica, organización de la cromatina y control del daño en el ADN (Figura R15b). Teniendo en cuenta que estas tres rutas alteradas en presencia de JQ1 han sido mostradas por numerosos estudios como claves durante la SCR para generar iPSCs 60,181,414, decidimos continuar con un análisis in silico de enriquecimiento funcional de interacciones proteicas para determinar las posibles conexiones existentes entre las 531 proteínas deslocalizadas en cromatina de pre-iPSCs tratadas con JQ1. La visualización de las redes de interacción, basadas en datos publicados, para las 531 proteínas muestra la existencia de interacciones sencillas y complejas con rangos relevantes de confidencia entre 0.4 y 0.9 (Figura R15c). De manera destacable, una fracción considerable de las 531 proteínas alteradas en la fracción CB por JQ1 están involucradas en el control de alguno o varios de los tres procesos (ej. regulación expresión génica, organización cromatina y respuesta al daño en el ADN) que resultan clave para alcanzar el estado celular pluripotente 60,181. 246 37 Ieda, M. et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors. Cell 142, 375-386, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.07.002 (2010). 38 Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, doi:10.1016/j.cell.2006.07.024 (2006). 39 Yu, J. et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. 318, 1917-1920, doi:10.1126/science.1151526 %J Science (2007). 40 Takahashi, K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 131, 861-872, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.11.019 (2007). 41 Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317, doi:10.1038/nature05934 (2007). 42 Maherali, N. et al. Directly Reprogrammed Fibroblasts Show Global Epigenetic Remodeling and Widespread Tissue Contribution. Cell stem cell 1, 55-70, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2007.05.014 (2007). 43 Wernig, M. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324, doi:10.1038/nature05944 (2007). 44 Boland, M. J. et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature 461, 91-94, doi:10.1038/nature08310 (2009). 45 Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z. & Gao, S. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell stem cell 5, 135138, doi:10.1016/j.stem.2009.07.001 (2009). 46 Zhao, X.-y. et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 461, 86-90, doi:10.1038/nature08267 (2009). 47 Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M. & Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods 7, 53-55, doi:10.1038/nmeth.1409 (2010). 48 Patel, M. & Yang, S. Advances in Reprogramming Somatic Cells to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports 6, 367-380, doi:10.1007/s12015-010-9123-8 (2010). 49 Anokye-Danso, F. et al. Highly Efficient miRNA-Mediated Reprogramming of Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotency. Cell stem cell 8, 376-388, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.03.001 (2011). 50 Sandmaier, S. E. S. & Telugu, B. P. V. L. in Cell Reprogramming: Methods and Protocols (eds Paul J. Verma & Huseyin Sumer) 29-36 (Springer New York, 2015). 51 Kim, Y., Jeong, J. & Choi, D. Small-molecule-mediated reprogramming: a silver lining for regenerative medicine. Experimental & Molecular Medicine 52, 213-226, doi:10.1038/s12276-020-0383-3 (2020). 52 Soldner, F. et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell 136, 964-977, doi:10.1016/j.cell.2009.02.013 (2009). 53 Kaji, K. et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458, 771-775, doi:10.1038/nature07864 (2009). 54 Woltjen, K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 458, 766-770, doi:10.1038/nature07863 (2009). 55 Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K. & Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan 247 Academy. Series B, Physical and biological sciences 85, 348-362, doi:10.2183/pjab.85.348 (2009). 56 Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science (New York, N.Y.) 324, 797-801, doi:10.1126/science.1172482 (2009). 57 Kim, D. et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell stem cell 4, 472-476, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009). 58 Warren, L. et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell 7, 618630, doi:10.1016/j.stem.2010.08.012 (2010). 59 Buganim, Y. et al. Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase. Cell 150, 1209-1222, doi:10.1016/j.cell.2012.08.023 (2012). 60 Apostolou, E. & Hochedlinger, K. Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature 502, 462-471, doi:10.1038/nature12749 (2013). 61 Park, I.-H. et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451, 141-146, doi:10.1038/nature06534 (2008). 62 Takahashi, K. & Yamanaka, S. A developmental framework for induced pluripotency. 142, 3274-3285, doi:10.1242/dev.114249 %J Development (2015). 63 Smith, Z. D., Sindhu, C. & Meissner, A. Molecular features of cellular reprogramming and development. Nature Reviews Molecular Cell Biology 17, 139154, doi:10.1038/nrm.2016.6 (2016). 64 Gökbuget, D. & Blelloch, R. Epigenetic control of transcriptional regulation in pluripotency and early differentiation. 146, dev164772, doi:10.1242/dev.164772 %J Development (2019). 65 Boyer, L. A., Mathur, D. & Jaenisch, R. Molecular control of pluripotency. Current Opinion in Genetics & Development 16, 455-462, doi:https://doi.org/10.1016/j.gde.2006.08.009 (2006). 66 Ng, H.-H. & Surani, M. A. The transcriptional and signalling networks of pluripotency. Nature Cell Biology 13, 490-496, doi:10.1038/ncb0511-490 (2011). 67 Young, Richard A. Control of the Embryonic Stem Cell State. Cell 144, 940-954, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.01.032 (2011). 68 Nichols, J. et al. Formation of Pluripotent Stem Cells in the Mammalian Embryo Depends on the POU Transcription Factor Oct4. Cell 95, 379-391, doi:10.1016/S0092-8674(00)81769-9 (1998). 69 Schöler, H. R., Hatzopoulos, A. K., Balling, R., Suzuki, N. & Gruss, P. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. The EMBO journal 8, 2543-2550, doi:10.1002/j.1460-2075.1989.tb08392.x (1989). 70 Niwa, H., Miyazaki, J.-i. & Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genetics 24, 372376, doi:10.1038/74199 (2000). 71 Thomson, M. et al. Pluripotency factors in embryonic stem cells regulate differentiation into germ layers. Cell 145, 875-889, doi:10.1016/j.cell.2011.05.017 (2011). 72 Avilion, A. A. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes & development 17, 126-140, doi:10.1101/gad.224503 (2003). 248 73 Chew, J. L. et al. Reciprocal transcriptional regulation of Pou5f1 and Sox2 via the Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells. Molecular and cellular biology 25, 6031-6046, doi:10.1128/mcb.25.14.6031-6046.2005 (2005). 74 Rodda, D. J. et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. The Journal of biological chemistry 280, 24731-24737, doi:10.1074/jbc.M502573200 (2005). 75 Mitsui, K. et al. The Homeoprotein Nanog Is Required for Maintenance of Pluripotency in Mouse Epiblast and ES Cells. Cell 113, 631-642, doi:https://doi.org/10.1016/S0092-8674(03)00393-3 (2003). 76 Chambers, I. et al. Functional Expression Cloning of Nanog, a Pluripotency Sustaining Factor in Embryonic Stem Cells. Cell 113, 643-655, doi:https://doi.org/10.1016/S0092-8674(03)00392-1 (2003). 77 Chen, X. et al. Integration of External Signaling Pathways with the Core Transcriptional Network in Embryonic Stem Cells. Cell 133, 1106-1117, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.04.043 (2008). 78 Festuccia, N. et al. Esrrb Is a Direct Nanog Target Gene that Can Substitute for Nanog Function in Pluripotent Cells. Cell stem cell 11, 477-490, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.08.002 (2012). 79 Yeo, J.-C. et al. Klf2 Is an Essential Factor that Sustains Ground State Pluripotency. Cell stem cell 14, 864-872, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.04.015 (2014). 80 Bourillot, P.-Y. & Savatier, P. Krüppel-like transcription factors and control of pluripotency. BMC Biology 8, 125, doi:10.1186/1741-7007-8-125 (2010). 81 Morey, L., Santanach, A. & Di Croce, L. Pluripotency and Epigenetic Factors in Mouse Embryonic Stem Cell Fate Regulation. Molecular and cellular biology 35, 2716-2728, doi:10.1128/mcb.00266-15 (2015). 82 Jaenisch, R. & Young, R. Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear Reprogramming. Cell 132, 567-582, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.01.015 (2008). 83 Rahl, P. B. et al. c-Myc Regulates Transcriptional Pause Release. Cell 141, 432-445, doi:10.1016/j.cell.2010.03.030 (2010). 84 Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I. & Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes & development 12, 2048-2060, doi:10.1101/gad.12.13.2048 (1998). 85 Niwa, H., Ogawa, K., Shimosato, D. & Adachi, K. A parallel circuit of LIF signalling pathways maintains pluripotency of mouse ES cells. Nature 460, 118-122, doi:10.1038/nature08113 (2009). 86 Martello, G., Bertone, P. & Smith, A. Identification of the missing pluripotency mediator downstream of leukaemia inhibitory factor. The EMBO journal 32, 25612574, doi:10.1038/emboj.2013.177 (2013). 87 Ye, S., Li, P., Tong, C. & Ying, Q. L. Embryonic stem cell self-renewal pathways converge on the transcription factor Tfcp2l1. The EMBO journal 32, 2548-2560, doi:10.1038/emboj.2013.175 (2013). 88 Chen, C. Y. et al. Bcl3 Bridges LIF-STAT3 to Oct4 Signaling in the Maintenance of Naïve Pluripotency. Stem cells (Dayton, Ohio) 33, 3468-3480, doi:10.1002/stem.2201 (2015). 89 Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. & Smith, A. BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3. Cell 115, 281-292, doi:https://doi.org/10.1016/S00928674(03)00847-X (2003). 249 90 Kunath, T. et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. 134, 2895-2902, doi:10.1242/dev.02880 %J Development (2007). 91 Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C. & Dailey, L. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes & development 9, 2635-2645, doi:10.1101/gad.9.21.2635 (1995). 92 Ying, Q.-L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519-523, doi:10.1038/nature06968 (2008). 93 Boroviak, T., Loos, R., Bertone, P., Smith, A. & Nichols, J. The ability of inner-cellmass cells to self-renew as embryonic stem cells is acquired following epiblast specification. Nat Cell Biol 16, 516-528, doi:10.1038/ncb2965 (2014). 94 Marks, H. et al. The Transcriptional and Epigenomic Foundations of Ground State Pluripotency. Cell 149, 590-604, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.03.026 (2012). 95 Kim, S.-H. et al. ERK1 phosphorylates Nanog to regulate protein stability and stem cell self-renewal. Stem Cell Research 13, 1-11, doi:https://doi.org/10.1016/j.scr.2014.04.001 (2014). 96 Goldberg, A. D., Allis, C. D. & Bernstein, E. Epigenetics: A Landscape Takes Shape. Cell 128, 635-638, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.02.006 (2007). 97 Allis, C. D. & Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nature Reviews Genetics 17, 487-500, doi:10.1038/nrg.2016.59 (2016). 98 Roundtree, I. A. & He, C. RNA epigenetics—chemical messages for posttranscriptional gene regulation. Current Opinion in Chemical Biology 30, 46-51, doi:https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2015.10.024 (2016). 99 Ebrahimi, A. et al. Bromodomain inhibition of the coactivators CBP/EP300 facilitate cellular reprogramming. Nature Chemical Biology 15, 519-528, doi:10.1038/s41589019-0264-z (2019). 100 Gaspar-Maia, A., Alajem, A., Meshorer, E. & Ramalho-Santos, M. Open chromatin in pluripotency and reprogramming. Nature Reviews Molecular Cell Biology 12, 3647, doi:10.1038/nrm3036 (2011). 101 Gasser, S. M. Visualizing Chromatin Dynamics in Interphase Nuclei. 296, 14121416, doi:10.1126/science.1067703 %J Science (2002). 102 Giadrossi, S., Dvorkina, M. & Fisher, A. G. Chromatin organization and differentiation in embryonic stem cell models. Current Opinion in Genetics & Development 17, 132-138, doi:https://doi.org/10.1016/j.gde.2007.02.012 (2007). 103 Meshorer, E. & Misteli, T. Chromatin in pluripotent embryonic stem cells and differentiation. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 540-546, doi:10.1038/nrm1938 (2006). 104 Long, H. K., Prescott, S. L. & Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell 167, 1170-1187, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.018 (2016). 105 Wang, J. et al. A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature 444, 364-368, doi:10.1038/nature05284 (2006). 106 Liang, J. et al. Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nature Cell Biology 10, 731-739, doi:10.1038/ncb1736 (2008). 107 Ho, L. & Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature 463, 474-484, doi:10.1038/nature08911 (2010). 250 108 Chen, P. B. et al. Hdac6 regulates Tip60-p400 function in stem cells. eLife 2, e01557, doi:10.7554/eLife.01557 (2013). 109 Fazzio, T. G., Huff, J. T. & Panning, B. An RNAi Screen of Chromatin Proteins Identifies Tip60-p400 as a Regulator of Embryonic Stem Cell Identity. Cell 134, 162174, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.05.031 (2008). 110 Kagey, M. H. et al. Mediator and cohesin connect gene expression and chromatin architecture. Nature 467, 430-435, doi:10.1038/nature09380 (2010). 111 Jamaladdin, S. et al. Histone deacetylase (HDAC) 1 and 2 are essential for accurate cell division and the pluripotency of embryonic stem cells. 111, 9840-9845, doi:10.1073/pnas.1321330111 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2014). 112 Yuan, P. et al. Eset partners with Oct4 to restrict extraembryonic trophoblast lineage potential in embryonic stem cells. Genes & development 23, 2507-2520, doi:10.1101/gad.1831909 (2009). 113 Boyer, L. A. et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature 441, 349-353, doi:10.1038/nature04733 (2006). 114 O'Carroll, D. et al. The <em>Polycomb</em>-Group Gene<em>Ezh2</em> Is Required for Early Mouse Development. 21, 4330-4336, doi:10.1128/MCB.21.13.4330-4336.2001 %J Molecular and Cellular Biology (2001). 115 Landeira, D. et al. Jarid2 is a PRC2 component in embryonic stem cells required for multi-lineage differentiation and recruitment of PRC1 and RNA Polymerase II to developmental regulators. Nature Cell Biology 12, 618-624, doi:10.1038/ncb2065 (2010). 116 Leitch, H. G. et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nature Structural & Molecular Biology 20, 311-316, doi:10.1038/nsmb.2510 (2013). 117 Altun, G., Loring, J. F. & Laurent, L. C. DNA methylation in embryonic stem cells. 109, 1-6, doi:https://doi.org/10.1002/jcb.22374 (2010). 118 Hackett, Jamie A. et al. Synergistic Mechanisms of DNA Demethylation during Transition to Ground-State Pluripotency. Stem cell reports 1, 518-531, doi:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2013.11.010 (2013). 119 Kim, M. & Costello, J. DNA methylation: an epigenetic mark of cellular memory. Exp Mol Med 49, e322, doi:10.1038/emm.2017.10 (2017). 120 Wu, H. & Zhang, Y. Charting oxidized methylcytosines at base resolution. Nature structural & molecular biology 22, 656-661, doi:10.1038/nsmb.3071 (2015). 121 Lister, R. et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature 462, 315-322, doi:10.1038/nature08514 (2009). 122 Meissner, A. et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature 454, 766-770, doi:10.1038/nature07107 (2008). 123 Kohli, R. M. & Zhang, Y. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation. Nature 502, 472-479, doi:10.1038/nature12750 (2013). 124 von Meyenn, F. et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In Vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell 39, 104-115, doi:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2016.09.015 (2016). 125 Ficz, G. et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell stem cell 13, 351359, doi:10.1016/j.stem.2013.06.004 (2013). 251 126 Habibi, E. et al. Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. Cell stem cell 13, 360-369, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.06.002 (2013). 127 Dawlaty, Meelad M. et al. Tet1 Is Dispensable for Maintaining Pluripotency and Its Loss Is Compatible with Embryonic and Postnatal Development. Cell stem cell 9, 166-175, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.07.010 (2011). 128 Koh, K. P. et al. Tet1 and Tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell stem cell 8, 200-213, doi:10.1016/j.stem.2011.01.008 (2011). 129 Dawlaty, Meelad M. et al. Loss of Tet Enzymes Compromises Proper Differentiation of Embryonic Stem Cells. Developmental Cell 29, 102-111, doi:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2014.03.003 (2014). 130 Fidalgo, M. et al. Zfp281 Coordinates Opposing Functions of Tet1 and Tet2 in Pluripotent States. Cell stem cell 19, 355-369, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.05.025 (2016). 131 Bernstein, B. E. et al. A Bivalent Chromatin Structure Marks Key Developmental Genes in Embryonic Stem Cells. Cell 125, 315-326, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.02.041 (2006). 132 Azuara, V. et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology 8, 532-538, doi:10.1038/ncb1403 (2006). 133 Mikkelsen, T. S. et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448, 553-560, doi:10.1038/nature06008 (2007). 134 Pan, G. et al. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 4 and lysine 27 methylation in human embryonic stem cells. Cell stem cell 1, 299-312, doi:10.1016/j.stem.2007.08.003 (2007). 135 Stock, J. K. et al. Ring1-mediated ubiquitination of H2A restrains poised RNA polymerase II at bivalent genes in mouse ES cells. Nature Cell Biology 9, 1428-1435, doi:10.1038/ncb1663 (2007). 136 Mattout, A. & Meshorer, E. Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology 22, 334-341, doi:https://doi.org/10.1016/j.ceb.2010.02.001 (2010). 137 Ng, H. H., Ciccone, D. N., Morshead, K. B., Oettinger, M. A. & Struhl, K. Lysine79 of histone H3 is hypomethylated at silenced loci in yeast and mammalian cells: A potential mechanism for position-effect variegation. 100, 1820-1825, doi:10.1073/pnas.0437846100 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2003). 138 Santos-Rosa, H., Bannister, A. J., Dehe, P. M., Géli, V. & Kouzarides, T. Methylation of H3 lysine 4 at euchromatin promotes Sir3p association with heterochromatin. The Journal of biological chemistry 279, 47506-47512, doi:10.1074/jbc.M407949200 (2004). 139 Meneghini, M. D., Wu, M. & Madhani, H. D. Conserved Histone Variant H2A.Z Protects Euchromatin from the Ectopic Spread of Silent Heterochromatin. Cell 112, 725-736, doi:10.1016/S0092-8674(03)00123-5 (2003). 140 Sniekers, S. et al. Erratum: Genome-wide association meta-analysis of 78,308 individuals identifies new loci and genes influencing human intelligence. Nature Genetics 49, 1558-1558, doi:10.1038/ng1017-1558c (2017). 141 Ernst, J. et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature 473, 43-49, doi:10.1038/nature09906 (2011). 252 142 Li, J., Moazed, D. & Gygi, S. P. Association of the histone methyltransferase Set2 with RNA polymerase II plays a role in transcription elongation. The Journal of biological chemistry 277, 49383-49388, doi:10.1074/jbc.M209294200 (2002). 143 Zaware, N. & Zhou, M.-M. Bromodomain biology and drug discovery. Nature Structural & Molecular Biology 26, 870-879, doi:10.1038/s41594-019-0309-8 (2019). 144 Brownell, J. E. & Allis, C. D. Special HATs for special occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation. Current Opinion in Genetics & Development 6, 176-184, doi:https://doi.org/10.1016/S0959-437X(96)80048-7 (1996). 145 Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389, 349-352, doi:10.1038/38664 (1997). 146 Wolffe, A. P. Sinful repression. Nature 387, 16-17, doi:10.1038/387016a0 (1997). 147 Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E. & Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 536-550, doi:10.1038/nrm3841 (2014). 148 Verdin, E. & Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature reviews. Molecular cell biology 16, 258264, doi:10.1038/nrm3931 (2015). 149 Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R. & Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta 1864, 1372-1401, doi:10.1016/j.bbapap.2016.06.007 (2016). 150 Fujisawa, T. & Filippakopoulos, P. Functions of bromodomain-containing proteins and their roles in homeostasis and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18, 246-262, doi:10.1038/nrm.2016.143 (2017). 151 Ramanathan, B. & Smerdon, M. J. Enhanced DNA repair synthesis in hyperacetylated nucleosomes. The Journal of biological chemistry 264, 11026-11034 (1989). 152 Piekna-Przybylska, D., Bambara, R. A. & Balakrishnan, L. Acetylation regulates DNA repair mechanisms in human cells. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 15, 15061517, doi:10.1080/15384101.2016.1176815 (2016). 153 Balakrishnan, L., Stewart, J., Polaczek, P., Campbell, J. L. & Bambara, R. A. Acetylation of Dna2 endonuclease/helicase and flap endonuclease 1 by p300 promotes DNA stability by creating long flap intermediates. The Journal of biological chemistry 285, 4398-4404, doi:10.1074/jbc.m109.086397 (2010). 154 Carter, R. J. & Parsons, J. L. Base excision repair: A pathway regulated by posttranslational modifications. MCB.00030-00016, doi:10.1128/MCB.00030-16 %J Molecular and Cellular Biology (2016). 155 Chatterjee, S., Senapati, P. & Kundu, T. K. Post-translational modifications of lysine in DNA-damage repair. Essays in biochemistry 52, 93-111, doi:10.1042/bse0520093 (2012). 156 Creyghton, M. P. et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. 107, 21931-21936, doi:10.1073/pnas.1016071107 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2010). 157 Adam, R. C. et al. Pioneer factors govern super-enhancer dynamics in stem cell plasticity and lineage choice. Nature 521, 366-370, doi:10.1038/nature14289 (2015). 158 Krejcí, J. et al. Genome-wide reduction in H3K9 acetylation during human embryonic stem cell differentiation. Journal of cellular physiology 219, 677-687, doi:10.1002/jcp.21714 (2009). 253 159 Qiao, Y., Wang, R., Yang, X., Tang, K. & Jing, N. Dual roles of histone H3 lysine 9 acetylation in human embryonic stem cell pluripotency and neural differentiation. The Journal of biological chemistry 290, 2508-2520, doi:10.1074/jbc.M114.603761 (2015). 160 Efroni, S. et al. Global transcription in pluripotent embryonic stem cells. Cell stem cell 2, 437-447, doi:10.1016/j.stem.2008.03.021 (2008). 161 Jurkowska, R. Z. et al. H3K14ac is linked to methylation of H3K9 by the triple Tudor domain of SETDB1. Nature Communications 8, 2057, doi:10.1038/s41467-01702259-9 (2017). 162 Taunton, J., Hassig, C. A. & Schreiber, S. L. A Mammalian Histone Deacetylase Related to the Yeast Transcriptional Regulator Rpd3p. 272, 408-411, doi:10.1126/science.272.5260.408 %J Science (1996). 163 Eckschlager, T., Plch, J., Stiborova, M. & Hrabeta, J. Histone Deacetylase Inhibitors as Anticancer Drugs. International journal of molecular sciences 18, doi:10.3390/ijms18071414 (2017). 164 Verdone, L., Agricola, E., Caserta, M. & Di Mauro, E. Histone acetylation in gene regulation. Briefings in functional genomics & proteomics 5, 209-221, doi:10.1093/bfgp/ell028 (2006). 165 Gallinari, P., Marco, S. D., Jones, P., Pallaoro, M. & Steinkühler, C. HDACs, histone deacetylation and gene transcription: from molecular biology to cancer therapeutics. Cell Research 17, 195-211, doi:10.1038/sj.cr.7310149 (2007). 166 Marmorstein, R. Structure of histone acetyltransferases. Journal of molecular biology 311, 433-444, doi:10.1006/jmbi.2001.4859 (2001). 167 Yang, X. J. & Seto, E. HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention. Oncogene 26, 5310-5318, doi:10.1038/sj.onc.1210599 (2007). 168 Marmorstein, R. & Roth, S. Y. Histone acetyltransferases: function, structure, and catalysis. Current Opinion in Genetics & Development 11, 155-161, doi:https://doi.org/10.1016/S0959-437X(00)00173-8 (2001). 169 Liang, G., Taranova, O., Xia, K. & Zhang, Y. Butyrate promotes induced pluripotent stem cell generation. The Journal of biological chemistry 285, 25516-25521, doi:10.1074/jbc.M110.142059 (2010). 170 Shao, Z. et al. The acetyllysine reader BRD3R promotes human nuclear reprogramming and regulates mitosis. Nature Communications 7, 10869, doi:10.1038/ncomms10869 (2016). 171 Hochedlinger, K. & Jaenisch, R. Induced Pluripotency and Epigenetic Reprogramming. Cold Spring Harbor perspectives in biology 7, doi:10.1101/cshperspect.a019448 (2015). 172 Buganim, Y. et al. The developmental potential of iPSCs is greatly influenced by reprogramming factor selection. Cell stem cell 15, 295-309, doi:10.1016/j.stem.2014.07.003 (2014). 173 Theunissen, T. W. & Jaenisch, R. Molecular control of induced pluripotency. Cell stem cell 14, 720-734, doi:10.1016/j.stem.2014.05.002 (2014). 174 Hou, P. et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by smallmolecule compounds. Science (New York, N.Y.) 341, 651-654, doi:10.1126/science.1239278 (2013). 175 Apostolou, E. & Stadtfeld, M. Cellular trajectories and molecular mechanisms of iPSC reprogramming. Curr Opin Genet Dev 52, 77-85, doi:10.1016/j.gde.2018.06.002 (2018). 254 176 Tran, K. A. et al. Defining Reprogramming Checkpoints from Single-Cell Analyses of Induced Pluripotency. Cell Rep 27, 1726-1741.e1725, doi:10.1016/j.celrep.2019.04.056 (2019). 177 Schwarz, B. A. et al. Prospective Isolation of Poised iPSC Intermediates Reveals Principles of Cellular Reprogramming. Cell stem cell 23, 289-305.e285, doi:10.1016/j.stem.2018.06.013 (2018). 178 O’Malley, J. et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature 499, 88-91, doi:10.1038/nature12243 (2013). 179 Schiebinger, G. et al. Optimal-Transport Analysis of Single-Cell Gene Expression Identifies Developmental Trajectories in Reprogramming. Cell 176, 928-943.e922, doi:10.1016/j.cell.2019.01.006 (2019). 180 Guo, L. et al. Resolving Cell Fate Decisions during Somatic Cell Reprogramming by Single-Cell RNA-Seq. Molecular cell 73, 815-829.e817, doi:10.1016/j.molcel.2019.01.042 (2019). 181 Haridhasapavalan, K. K., Raina, K., Dey, C., Adhikari, P. & Thummer, R. P. An Insight into Reprogramming Barriers to iPSC Generation. Stem Cell Rev Rep 16, 5681, doi:10.1007/s12015-019-09931-1 (2020). 182 Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M. & Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of singlecell mass cytometry. Cell stem cell 16, 323-337, doi:10.1016/j.stem.2015.01.015 (2015). 183 Unternaehrer, J. J. et al. The epithelial-mesenchymal transition factor SNAIL paradoxically enhances reprogramming. Stem cell reports 3, 691-698, doi:10.1016/j.stemcr.2014.09.008 (2014). 184 Gingold, J. A. et al. A genome-wide RNAi screen identifies opposing functions of Snai1 and Snai2 on the Nanog dependency in reprogramming. Molecular cell 56, 140-152, doi:10.1016/j.molcel.2014.08.014 (2014). 185 Hawkins, K. E. et al. NRF2 Orchestrates the Metabolic Shift during Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming. Cell Rep 14, 1883-1891, doi:10.1016/j.celrep.2016.02.003 (2016). 186 Kida, Y. S. et al. ERRs Mediate a Metabolic Switch Required for Somatic Cell Reprogramming to Pluripotency. Cell stem cell 16, 547-555, doi:10.1016/j.stem.2015.03.001 (2015). 187 Zhou, G., Meng, S., Li, Y., Ghebre, Y. T. & Cooke, J. P. Optimal ROS Signaling Is Critical for Nuclear Reprogramming. Cell Reports 15, 919-925, doi:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.084 (2016). 188 Mathieu, J. & Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development (Cambridge, England) 144, 541-551, doi:10.1242/dev.128389 (2017). 189 Liu, X. et al. Sequential introduction of reprogramming factors reveals a timesensitive requirement for individual factors and a sequential EMT–MET mechanism for optimal reprogramming. Nature Cell Biology 15, 829-838, doi:10.1038/ncb2765 (2013). 190 Cacchiarelli, D. et al. Integrative Analyses of Human Reprogramming Reveal Dynamic Nature of Induced Pluripotency. Cell 162, 412-424, doi:10.1016/j.cell.2015.06.016 (2015). 191 Polo, J. M. et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell 151, 1617-1632, doi:10.1016/j.cell.2012.11.039 (2012). 255 192 Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T. & Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell stem cell 2, 230-240, doi:10.1016/j.stem.2008.02.001 (2008). 193 Kim, J. et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. 201103113, doi:10.1073/pnas.1103113108 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2011). 194 Kurian, L. et al. Conversion of human fibroblasts to angioblast-like progenitor cells. Nat Methods 10, 77-83, doi:10.1038/nmeth.2255 (2013). 195 Zhu, S. et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature 508, 93-97, doi:10.1038/nature13020 (2014). 196 Stumpf, P. S. & MacArthur, B. D. Machine Learning of Stem Cell Identities From Single-Cell Expression Data via Regulatory Network Archetypes. Frontiers in genetics 10, 2, doi:10.3389/fgene.2019.00002 (2019). 197 Li, D. et al. Chromatin Accessibility Dynamics during iPSC Reprogramming. Cell stem cell 21, 819-833.e816, doi:10.1016/j.stem.2017.10.012 (2017). 198 Knaupp, A. S. et al. Transient and Permanent Reconfiguration of Chromatin and Transcription Factor Occupancy Drive Reprogramming. Cell stem cell 21, 834845.e836, doi:10.1016/j.stem.2017.11.007 (2017). 199 Chen, J. et al. Hierarchical Oct4 Binding in Concert with Primed Epigenetic Rearrangements during Somatic Cell Reprogramming. Cell Reports 14, 1540-1554, doi:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.013 (2016). 200 Chronis, C. et al. Cooperative Binding of Transcription Factors Orchestrates Reprogramming. Cell 168, 442-459.e420, doi:10.1016/j.cell.2016.12.016 (2017). 201 Soufi, A., Donahue, G. & Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell 151, 994-1004, doi:10.1016/j.cell.2012.09.045 (2012). 202 Narayan, S., Bryant, G., Shah, S., Berrozpe, G. & Ptashne, M. OCT4 and SOX2 Work as Transcriptional Activators in Reprogramming Human Fibroblasts. Cell Rep 20, 1585-1596, doi:10.1016/j.celrep.2017.07.071 (2017). 203 Soufi, A. et al. Pioneer transcription factors target partial DNA motifs on nucleosomes to initiate reprogramming. Cell 161, 555-568, doi:10.1016/j.cell.2015.03.017 (2015). 204 Yin, Y. et al. Impact of cytosine methylation on DNA binding specificities of human transcription factors. Science (New York, N.Y.) 356, doi:10.1126/science.aaj2239 (2017). 205 Hanna, J. et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature 462, 595-601, doi:10.1038/nature08592 (2009). 206 Apostolou, E. et al. Genome-wide Chromatin Interactions of the Nanog Locus in Pluripotency, Differentiation, and Reprogramming. Cell stem cell 12, 699-712, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.04.013 (2013). 207 Wei, Z. et al. Klf4 Organizes Long-Range Chromosomal Interactions with the Oct4 Locus in Reprogramming and Pluripotency. Cell stem cell 13, 36-47, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.05.010 (2013). 208 Denholtz, M. et al. Long-range chromatin contacts in embryonic stem cells reveal a role for pluripotency factors and polycomb proteins in genome organization. Cell stem cell 13, 602-616, doi:10.1016/j.stem.2013.08.013 (2013). 209 de Wit, E. et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature 501, 227-231, doi:10.1038/nature12420 (2013). 262 311 Picaud, S. et al. PFI-1, a highly selective protein interaction inhibitor, targeting BET Bromodomains. Cancer research 73, 3336-3346, doi:10.1158/0008-5472.Can-123292 (2013). 312 Odenike, O. et al. Results from the first-in-human study of mivebresib (ABBV-075), a pan-inhibitor of bromodomain and extra terminal proteins, in patients with relapsed/refractory acute myeloid leukemia. 37, 7030-7030, doi:10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.7030 (2019). 313 Delmore, J. E. et al. BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell 146, 904-917, doi:10.1016/j.cell.2011.08.017 (2011). 314 Whyte, Warren A. et al. Master Transcription Factors and Mediator Establish SuperEnhancers at Key Cell Identity Genes. Cell 153, 307-319, doi:10.1016/j.cell.2013.03.035 (2013). 315 Zuber, J. et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature 478, 524-528, doi:10.1038/nature10334 (2011). 316 Asangani, I. A. et al. Therapeutic targeting of BET bromodomain proteins in castration-resistant prostate cancer. Nature 510, 278-282, doi:10.1038/nature13229 (2014). 317 Pérez-Salvia, M. & Esteller, M. Bromodomain inhibitors and cancer therapy: From structures to applications. Epigenetics 12, 323-339, doi:10.1080/15592294.2016.1265710 (2017). 318 Vidler, L. R., Brown, N., Knapp, S. & Hoelder, S. Druggability analysis and structural classification of bromodomain acetyl-lysine binding sites. Journal of medicinal chemistry 55, 7346-7359, doi:10.1021/jm300346w (2012). 319 Wu, Q. et al. A chemical toolbox for the study of bromodomains and epigenetic signaling. Nature Communications 10, 1915, doi:10.1038/s41467-019-09672-2 (2019). 320 Borah, J. C. et al. A small molecule binding to the coactivator CREB-binding protein blocks apoptosis in cardiomyocytes. Chemistry & biology 18, 531-541, doi:10.1016/j.chembiol.2010.12.021 (2011). 321 Chekler, E. L. et al. Transcriptional Profiling of a Selective CREB Binding Protein Bromodomain Inhibitor Highlights Therapeutic Opportunities. Chemistry & biology 22, 1588-1596, doi:10.1016/j.chembiol.2015.10.013 (2015). 322 Picaud, S. et al. Generation of a Selective Small Molecule Inhibitor of the CBP/p300 Bromodomain for Leukemia Therapy. Cancer research 75, 5106-5119, doi:10.1158/0008-5472.Can-15-0236 (2015). 323 Hay, D. A. et al. Discovery and optimization of small-molecule ligands for the CBP/p300 bromodomains. Journal of the American Chemical Society 136, 93089319, doi:10.1021/ja412434f (2014). 324 Hammitzsch, A. et al. CBP30, a selective CBP/p300 bromodomain inhibitor, suppresses human Th17 responses. 201501956, doi:10.1073/pnas.1501956112 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2015). 325 Conery, A. R. et al. Bromodomain inhibition of the transcriptional coactivators CBP/EP300 as a therapeutic strategy to target the IRF4 network in multiple myeloma. eLife 5, doi:10.7554/eLife.10483 (2016). 326 Taylor, A. M. et al. Fragment-Based Discovery of a Selective and Cell-Active Benzodiazepinone CBP/EP300 Bromodomain Inhibitor (CPI-637). ACS medicinal chemistry letters 7, 531-536, doi:10.1021/acsmedchemlett.6b00075 (2016). 263 327 Chen, P. et al. Discovery and Characterization of GSK2801, a Selective Chemical Probe for the Bromodomains BAZ2A and BAZ2B. Journal of medicinal chemistry 59, 1410-1424, doi:10.1021/acs.jmedchem.5b00209 (2016). 328 Drouin, L. et al. Structure enabled design of BAZ2-ICR, a chemical probe targeting the bromodomains of BAZ2A and BAZ2B. Journal of medicinal chemistry 58, 25532559, doi:10.1021/jm501963e (2015). 329 Moustakim, M. et al. Discovery of a PCAF Bromodomain Chemical Probe. Angewandte Chemie (International ed. in English) 56, 827-831, doi:10.1002/anie.201610816 (2017). 330 Clark, P. G. et al. LP99: Discovery and Synthesis of the First Selective BRD7/9 Bromodomain Inhibitor. Angewandte Chemie (International ed. in English) 54, 62176221, doi:10.1002/anie.201501394 (2015). 331 Martin, L. J. et al. Structure-Based Design of an in Vivo Active Selective BRD9 Inhibitor. Journal of medicinal chemistry 59, 4462-4475, doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01865 (2016). 332 Theodoulou, N. H. et al. Discovery of I-BRD9, a Selective Cell Active Chemical Probe for Bromodomain Containing Protein 9 Inhibition. Journal of medicinal chemistry 59, 1425-1439, doi:10.1021/acs.jmedchem.5b00256 (2016). 333 Fedorov, O. et al. Selective targeting of the BRG/PB1 bromodomains impairs embryonic and trophoblast stem cell maintenance. Science advances 1, e1500723, doi:10.1126/sciadv.1500723 (2015). 334 Vangamudi, B. et al. The SMARCA2/4 ATPase Domain Surpasses the Bromodomain as a Drug Target in SWI/SNF-Mutant Cancers: Insights from cDNA Rescue and PFI-3 Inhibitor Studies. Cancer research 75, 3865-3878, doi:10.1158/0008-5472.Can-14-3798 (2015). 335 Tallant, C. et al. Molecular basis of histone tail recognition by human TIP5 PHD finger and bromodomain of the chromatin remodeling complex NoRC. Structure (London, England : 1993) 23, 80-92, doi:10.1016/j.str.2014.10.017 (2015). 336 Collins, N. et al. An ACF1-ISWI chromatin-remodeling complex is required for DNA replication through heterochromatin. Nat Genet 32, 627-632, doi:10.1038/ng1046 (2002). 337 Zhou, Y. et al. Reversible acetylation of the chromatin remodelling complex NoRC is required for non-coding RNA-dependent silencing. Nature Cell Biology 11, 10101016, doi:10.1038/ncb1914 (2009). 338 Huang, H., Rambaldi, I., Daniels, E. & Featherstone, M. Expression of the Wdr9 gene and protein products during mouse development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 227, 608-614, doi:10.1002/dvdy.10344 (2003). 339 Pattabiraman, S. et al. Mouse BRWD1 is critical for spermatid postmeiotic transcription and female meiotic chromosome stability. Journal of Cell Biology 208, 53-69, doi:10.1083/jcb.201404109 %J Journal of Cell Biology (2014). 340 Altaf, M. et al. NuA4-dependent acetylation of nucleosomal histones H4 and H2A directly stimulates incorporation of H2A.Z by the SWR1 complex. The Journal of biological chemistry 285, 15966-15977, doi:10.1074/jbc.M110.117069 (2010). 341 Obri, A. et al. ANP32E is a histone chaperone that removes H2A.Z from chromatin. Nature 505, 648-653, doi:10.1038/nature12922 (2014). 342 Rao, R. C. & Dou, Y. Hijacked in cancer: the KMT2 (MLL) family of methyltransferases. Nature reviews. Cancer 15, 334-346, doi:10.1038/nrc3929 (2015). 264 343 Milne, T. A. et al. MLL Targets SET Domain Methyltransferase Activity to Hox Gene Promoters. Molecular cell 10, 1107-1117, doi:https://doi.org/10.1016/S10972765(02)00741-4 (2002). 344 Yang, X.-J. MOZ and MORF acetyltransferases: Molecular interaction, animal development and human disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1853, 1818-1826, doi:https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2015.04.014 (2015). 345 Klein, B. J. et al. Bivalent interaction of the PZP domain of BRPF1 with the nucleosome impacts chromatin dynamics and acetylation. Nucleic Acids Research 44, 472-484, doi:10.1093/nar/gkv1321 %J Nucleic Acids Research (2015). 346 Feng, Y. et al. BRPF3-HBO1 regulates replication origin activation and histone H3K14 acetylation. The EMBO journal 35, 176-192, doi:10.15252/embj.201591293 (2016). 347 Belkina, A. C. & Denis, G. V. BET domain co-regulators in obesity, inflammation and cancer. Nature reviews. Cancer 12, 465-477, doi:10.1038/nrc3256 (2012). 348 Wang, C.-Y. & Filippakopoulos, P. Beating the odds: BETs in disease. Trends in biochemical sciences 40, 468-479, doi:https://doi.org/10.1016/j.tibs.2015.06.002 (2015). 349 Jacobson, R. H., Ladurner, A. G., King, D. S. & Tjian, R. Structure and function of a human TAFII250 double bromodomain module. Science (New York, N.Y.) 288, 14221425, doi:10.1126/science.288.5470.1422 (2000). 350 Sdelci, S. et al. Mapping the chemical chromatin reactivation landscape identifies BRD4-TAF1 cross-talk. Nature Chemical Biology 12, 504-510, doi:10.1038/nchembio.2080 (2016). 351 Wang, P. J. & Page, D. C. Functional substitution for TAF II 250 by a retroposed homolog that is expressed in human spermatogenesis. Human Molecular Genetics 11, 2341-2346, doi:10.1093/hmg/11.19.2341 %J Human Molecular Genetics (2002). 352 Gong, F. et al. Screen identifies bromodomain protein ZMYND8 in chromatin recognition of transcription-associated DNA damage that promotes homologous recombination. Genes & development 29, 197-211, doi:10.1101/gad.252189.114 (2015). 353 Shen, H. et al. Suppression of Enhancer Overactivation by a RACK7-Histone Demethylase Complex. Cell 165, 331-342, doi:10.1016/j.cell.2016.02.064 (2016). 354 Guo, R. et al. BS69/ZMYND11 reads and connects histone H3.3 lysine 36 trimethylation-decorated chromatin to regulated pre-mRNA processing. Molecular cell 56, 298-310, doi:10.1016/j.molcel.2014.08.022 (2014). 355 Ciró, M. et al. ATAD2 Is a Novel Cofactor for MYC, Overexpressed and Amplified in Aggressive Tumors. 0008-5472.CAN-0009-2131, doi:10.1158/0008-5472.CAN09-2131 %J Cancer Research (1909). 356 Revenko, A. S., Kalashnikova, E. V., Gemo, A. T., Zou, J. X. & Chen, H. W. Chromatin loading of E2F-MLL complex by cancer-associated coregulator ANCCA via reading a specific histone mark. Molecular and cellular biology 30, 5260-5272, doi:10.1128/mcb.00484-10 (2010). 357 Leachman, N. T., Brellier, F., Ferralli, J., Chiquet-Ehrismann, R. & Tucker, R. P. ATAD2B is a phylogenetically conserved nuclear protein expressed during neuronal differentiation and tumorigenesis. Development, growth & differentiation 52, 747755, doi:10.1111/j.1440-169X.2010.01211.x (2010). 265 358 Cammas, F. et al. Cell differentiation induces TIF1beta association with centromeric heterochromatin via an HP1 interaction. Journal of cell science 115, 3439-3448 (2002). 359 Dupont, S. et al. FAM/USP9x, a Deubiquitinating Enzyme Essential for TGFβ Signaling, Controls Smad4 Monoubiquitination. Cell 136, 123-135, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.10.051 (2009). 360 Agricola, E., Randall, R. A., Gaarenstroom, T., Dupont, S. & Hill, C. S. Recruitment of TIF1γ to chromatin via its PHD finger-bromodomain activates its ubiquitin ligase and transcriptional repressor activities. Molecular cell 43, 85-96, doi:10.1016/j.molcel.2011.05.020 (2011). 361 Shang, E., Wang, X., Wen, D., Greenberg, D. A. & Wolgemuth, D. J. Double bromodomain-containing gene Brd2 is essential for embryonic development in mouse. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 238, 908-917, doi:10.1002/dvdy.21911 (2009). 362 Houzelstein, D. et al. Growth and early postimplantation defects in mice deficient for the bromodomain-containing protein Brd4. Molecular and cellular biology 22, 37943802, doi:10.1128/mcb.22.11.3794-3802.2002 (2002). 363 You, L., Chen, L., Penney, J., Miao, D. & Yang, X. J. Expression atlas of the multivalent epigenetic regulator Brpf1 and its requirement for survival of mouse embryos. Epigenetics 9, 860-872, doi:10.4161/epi.28530 (2014). 364 Tanaka, Y. et al. Extensive brain hemorrhage and embryonic lethality in a mouse null mutant of CREB-binding protein. Mechanisms of Development 95, 133-145, doi:https://doi.org/10.1016/S0925-4773(00)00360-9 (2000). 365 Yao, T. P. et al. Gene dosage-dependent embryonic development and proliferation defects in mice lacking the transcriptional integrator p300. Cell 93, 361-372, doi:10.1016/s0092-8674(00)81165-4 (1998). 366 Xu, W. et al. Loss of Gcn5l2 leads to increased apoptosis and mesodermal defects during mouse development. Nature Genetics 26, 229-232, doi:10.1038/79973 (2000). 367 Bu, P., Evrard, Y. A., Lozano, G. & Dent, S. Y. R. Loss of Gcn5 Acetyltransferase Activity Leads to Neural Tube Closure Defects and Exencephaly in Mouse Embryos. 27, 3405-3416, doi:10.1128/MCB.00066-07 %J Molecular and Cellular Biology (2007). 368 Bultman, S. et al. A Brg1 null mutation in the mouse reveals functional differences among mammalian SWI/SNF complexes. Molecular cell 6, 1287-1295, doi:10.1016/s1097-2765(00)00127-1 (2000). 369 Reyes, J. C. et al. Altered control of cellular proliferation in the absence of mammalian brahma (SNF2alpha). The EMBO journal 17, 6979-6991, doi:10.1093/emboj/17.23.6979 (1998). 370 Kim, J. & Kaartinen, V. Generation of mice with a conditional allele for Trim33. Genesis (New York, N.Y. : 2000) 46, 329-333, doi:10.1002/dvg.20401 (2008). 371 Huang, X., Gao, X., Diaz-Trelles, R., Ruiz-Lozano, P. & Wang, Z. Coronary development is regulated by ATP-dependent SWI/SNF chromatin remodeling component BAF180. Developmental biology 319, 258-266, doi:10.1016/j.ydbio.2008.04.020 (2008). 372 Banting, G. S. et al. CECR2, a protein involved in neurulation, forms a novel chromatin remodeling complex with SNF2L. Human Molecular Genetics 14, 513524, doi:10.1093/hmg/ddi048 %J Human Molecular Genetics (2005). 266 373 Maurice, T. et al. Altered Memory Capacities and Response to Stress in p300/CBPAssociated Factor (PCAF) Histone Acetylase Knockout Mice. Neuropsychopharmacology 33, 1584-1602, doi:10.1038/sj.npp.1301551 (2008). 374 Gregory, G. D. et al. Mammalian ASH1L is a histone methyltransferase that occupies the transcribed region of active genes. Molecular and cellular biology 27, 8466-8479, doi:10.1128/mcb.00993-07 (2007). 375 Tanaka, Y. et al. Dual function of histone H3 lysine 36 methyltransferase ASH1 in regulation of Hox gene expression. PloS one 6, e28171, doi:10.1371/journal.pone.0028171 (2011). 376 Lamonica, J. M. et al. Bromodomain protein Brd3 associates with acetylated GATA1 to promote its chromatin occupancy at erythroid target genes. doi:10.1073/pnas.1102140108 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2011). 377 Stonestrom, A. J. et al. Functions of BET proteins in erythroid gene expression. Blood 125, 2825-2834, doi:10.1182/blood-2014-10-607309 (2015). 378 Gaucher, J. et al. Bromodomain-dependent stage-specific male genome programming by Brdt. The EMBO journal 31, 3809-3820, doi:10.1038/emboj.2012.233 (2012). 379 Shang, E., Nickerson, H. D., Wen, D., Wang, X. & Wolgemuth, D. J. The first bromodomain of Brdt, a testis-specific member of the BET sub-family of doublebromodomain-containing proteins, is essential for male germ cell differentiation. 134, 3507-3515, doi:10.1242/dev.004481 %J Development (2007). 380 Matzuk, Martin M. et al. Small-Molecule Inhibition of BRDT for Male Contraception. Cell 150, 673-684, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.06.045 (2012). 381 Philipps, D. L. et al. The dual bromodomain and WD repeat-containing mouse protein BRWD1 is required for normal spermiogenesis and the oocyte–embryo transition. Developmental biology 317, 72-82, doi:https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2008.02.018 (2008). 382 Singhal, N. et al. Chromatin-Remodeling Components of the BAF Complex Facilitate Reprogramming. Cell 141, 943-955, doi:10.1016/j.cell.2010.04.037 (2010). 383 Kadoch, C. & Crabtree, G. R. Mammalian SWI/SNF chromatin remodeling complexes and cancer: Mechanistic insights gained from human genomics. Science advances 1, e1500447, doi:10.1126/sciadv.1500447 (2015). 384 Ho, L. et al. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is an essential component of the core pluripotency transcriptional network. 106, 51875191, doi:10.1073/pnas.0812888106 %J Proceedings of the National Academy of Sciences (2009). 385 Takebayashi, S.-i. et al. Murine esBAF chromatin remodeling complex subunits BAF250a and Brg1 are necessary to maintain and reprogram pluripotency-specific replication timing of select replication domains. Epigenetics & Chromatin 6, 42, doi:10.1186/1756-8935-6-42 (2013). 386 Kaeser, M. D., Aslanian, A., Dong, M. Q., Yates, J. R., 3rd & Emerson, B. M. BRD7, a novel PBAF-specific SWI/SNF subunit, is required for target gene activation and repression in embryonic stem cells. The Journal of biological chemistry 283, 3225432263, doi:10.1074/jbc.M806061200 (2008). 387 Morozumi, Y. et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology 8, 349-362, doi:10.1093/jmcb/mjv060 %J Journal of Molecular Cell Biology (2016). 267 388 Wu, T., Pinto, H. B., Kamikawa, Y. F. & Donohoe, M. E. The BET family member BRD4 interacts with OCT4 and regulates pluripotency gene expression. Stem cell reports 4, 390-403, doi:10.1016/j.stemcr.2015.01.012 (2015). 389 Di Micco, R. et al. Control of embryonic stem cell identity by BRD4-dependent transcriptional elongation of super-enhancer-associated pluripotency genes. Cell Rep 9, 234-247, doi:10.1016/j.celrep.2014.08.055 (2014). 390 Costa, Y. et al. NANOG-dependent function of TET1 and TET2 in establishment of pluripotency. Nature 495, 370-374, doi:10.1038/nature11925 (2013). 391 Lee, D.-F. et al. Combining competition assays with genetic complementation strategies to dissect mouse embryonic stem cell self-renewal and pluripotency. Nature Protocols 7, 729-748, doi:10.1038/nprot.2012.018 (2012). 392 Denizot, F. & Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival: Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods 89, 271-277, doi:https://doi.org/10.1016/0022-1759(86)90368-6 (1986). 393 Fuentes-Iglesias, A. et al. An Optimized Immunoprecipitation Protocol for Assessing Protein-RNA Interactions In Vitro. STAR Protocols 1, 100093, doi:https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100093 (2020). 394 Guallar, D. et al. ADAR1-Dependent RNA Editing Promotes MET and iPSC Reprogramming by Alleviating ER Stress. Cell stem cell 27, 300-314.e311, doi:https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.04.016 (2020). 395 Guallar, D. et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics 50, 443-451, doi:10.1038/s41588-018-0060-9 (2018). 396 Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-1760, doi:10.1093/bioinformatics/btp324 (2009). 397 Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: recent updates and new developments. Nucleic Acids Research 47, W256-W259, doi:10.1093/nar/gkz239 %J Nucleic Acids Research (2019). 398 Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R. & Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res 29, E88-88, doi:10.1093/nar/29.17.e88 (2001). 399 Li, H. et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078-2079, doi:10.1093/bioinformatics/btp352 (2009). 400 Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. The CLUSTAL_X Windows Interface: Flexible Strategies for Multiple Sequence Alignment Aided by Quality Analysis Tools. Nucleic Acids Research 25, 4876-4882, doi:10.1093/nar/25.24.4876 %J Nucleic Acids Research (1997). 401 Wu, T., Kamikawa, Y. F. & Donohoe, M. E. Brd4's Bromodomains Mediate Histone H3 Acetylation and Chromatin Remodeling in Pluripotent Cells through P300 and Brg1. Cell Rep 25, 1756-1771, doi:10.1016/j.celrep.2018.10.003 (2018). 402 Cieply, B. et al. Multiphasic and Dynamic Changes in Alternative Splicing during Induction of Pluripotency Are Coordinated by Numerous RNA-Binding Proteins. Cell Rep 15, 247-255, doi:10.1016/j.celrep.2016.03.025 (2016). 403 Shao, Z. et al. Reprogramming by De-bookmarking the Somatic Transcriptional Program through Targeting of BET Bromodomains. Cell Rep 16, 3138-3145, doi:10.1016/j.celrep.2016.08.060 (2016). 268 404 Li, R. et al. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts. Cell stem cell 7, 51-63, doi:10.1016/j.stem.2010.04.014 (2010). 405 Samavarchi-Tehrani, P. et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell stem cell 7, 64-77, doi:10.1016/j.stem.2010.04.015 (2010). 406 Brambrink, T. et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell stem cell 2, 151-159, doi:10.1016/j.stem.2008.01.004 (2008). 407 Silva, J. et al. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition. PLoS biology 6, e253, doi:10.1371/journal.pbio.0060253 (2008). 408 Silva, J. et al. Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell 138, 722737, doi:10.1016/j.cell.2009.07.039 (2009). 409 Yang, J. et al. Stat3 activation is limiting for reprogramming to ground state pluripotency. Cell stem cell 7, 319-328, doi:10.1016/j.stem.2010.06.022 (2010). 410 Kim, E. J. Y. et al. BAK/BAX-Mediated Apoptosis Is a Myc-Induced Roadblock to Reprogramming. Stem cell reports 10, 331-338, doi:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2017.12.019 (2018). 411 Banito, A. et al. Senescence impairs successful reprogramming to pluripotent stem cells. Genes & development 23, 2134-2139, doi:10.1101/gad.1811609 (2009). 412 Utikal, J. et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature 460, 1145-1148, doi:10.1038/nature08285 (2009). 413 Yang, Z. et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Molecular cell 19, 535-545, doi:10.1016/j.molcel.2005.06.029 (2005). 414 Zhang, M., Yang, C., Liu, H. & Sun, Y. Induced pluripotent stem cells are sensitive to DNA damage. Genomics, proteomics & bioinformatics 11, 320-326, doi:10.1016/j.gpb.2013.09.006 (2013). 415 Li, G.-M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Research 18, 8598, doi:10.1038/cr.2007.115 (2008). 416 Morrison, A. J. et al. INO80 and γ-H2AX Interaction Links ATP-Dependent Chromatin Remodeling to DNA Damage Repair. Cell 119, 767-775, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2004.11.037 (2004). 417 Young, Lauren M. et al. TIMELESS Forms a Complex with PARP1 Distinct from Its Complex with TIPIN and Plays a Role in the DNA Damage Response. Cell Reports 13, 451-459, doi:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.09.017 (2015). 418 Paull, T. T. et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology 10, 886-895, doi:https://doi.org/10.1016/S0960-9822(00)00610-2 (2000). 419 Jackson, S. P. & Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461, 1071-1078, doi:10.1038/nature08467 (2009). 420 Garcia, P. L. et al. JQ1 Induces DNA Damage and Apoptosis, and Inhibits Tumor Growth in a Patient-Derived Xenograft Model of Cholangiocarcinoma. 17, 107-118, doi:10.1158/1535-7163.MCT-16-0922 %J Molecular Cancer Therapeutics (2018). 421 Zhang, J. et al. BRD4 facilitates replication stress-induced DNA damage response. Oncogene 37, 3763-3777, doi:10.1038/s41388-018-0194-3 (2018). 269 422 Miller, A. L. et al. The BET inhibitor JQ1 attenuates double-strand break repair and sensitizes models of pancreatic ductal adenocarcinoma to PARP inhibitors. EBioMedicine 44, 419-430, doi:10.1016/j.ebiom.2019.05.035 (2019). 423 Marión, R. M. et al. A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity. Nature 460, 1149-1153, doi:10.1038/nature08287 (2009). 424 Ruiz, S. et al. Limiting replication stress during somatic cell reprogramming reduces genomic instability in induced pluripotent stem cells. Nat Commun 6, 8036, doi:10.1038/ncomms9036 (2015). 425 Wu, T. et al. Histone variant H2A.X deposition pattern serves as a functional epigenetic mark for distinguishing the developmental potentials of iPSCs. Cell stem cell 15, 281-294, doi:10.1016/j.stem.2014.06.004 (2014). 426 Gao, Y. & Gao, S. Quality control: H2A.X links to better iPSCs. Cell stem cell 15, 259-260, doi:10.1016/j.stem.2014.08.011 (2014). 427 Pal, S. & Sif, S. Interplay between chromatin remodelers and protein arginine methyltransferases. 213, 306-315, doi:https://doi.org/10.1002/jcp.21180 (2007). 428 Tanikawa, C. et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53–PADI4 pathway. Nature Communications 3, 676, doi:10.1038/ncomms1676 (2012). 429 Fuhrmann, J. & Thompson, P. R. Protein Arginine Methylation and Citrullination in Epigenetic Regulation. ACS chemical biology 11, 654-668, doi:10.1021/acschembio.5b00942 (2016). 430 Christophorou, M. A. et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature 507, 104-108, doi:10.1038/nature12942 (2014). 431 Wang, Y. et al. Human PAD4 Regulates Histone Arginine Methylation Levels via Demethylimination. 306, 279-283, doi:10.1126/science.1101400 %J Science (2004). 432 Cuthbert, G. L. et al. Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 118, 545-553, doi:10.1016/j.cell.2004.08.020 (2004). 433 Raijmakers, R. et al. Methylation of arginine residues interferes with citrullination by peptidylarginine deiminases in vitro. Journal of molecular biology 367, 1118-1129, doi:10.1016/j.jmb.2007.01.054 (2007). 434 Molina-Serrano, D., Schiza, V. & Kirmizis, A. Cross-talk among epigenetic modifications: lessons from histone arginine methylation. Biochemical Society transactions 41, 751-759, doi:10.1042/bst20130003 (2013). 435 Torres-Padilla, M.-E., Parfitt, D.-E., Kouzarides, T. & Zernicka-Goetz, M. Histone arginine methylation regulates pluripotency in the early mouse embryo. Nature 445, 214-218, doi:10.1038/nature05458 (2007). 436 Blanc, R. S. & Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular cell 65, 8-24, doi:10.1016/j.molcel.2016.11.003 (2017). 437 Zuo, Z.-y. et al. Klf4 methylated by Prmt1 is required for lineage segregation of epiblast and primitive endoderm. 2020.2004.2024.059055, doi:10.1101/2020.04.24.059055 %J bioRxiv (2020). 438 Asaga, H., Nakashima, K., Senshu, T., Ishigami, A. & Yamada, M. Immunocytochemical localization of peptidylarginine deiminase in human eosinophils and neutrophils. 70, 46-51, doi:https://doi.org/10.1189/jlb.70.1.46 (2001). 439 Neeli, I., Khan, S. N. & Radic, M. Histone deimination as a response to inflammatory stimuli in neutrophils. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 180, 18951902, doi:10.4049/jimmunol.180.3.1895 (2008). 270 440 Saksouk, N., Simboeck, E. & Déjardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin 8, 3, doi:10.1186/1756-89358-3 (2015). 441 Becker, J. S., Nicetto, D. & Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends in genetics : TIG 32, 29-41, doi:10.1016/j.tig.2015.11.001 (2016). 442 Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y. & Price, B. D. DNA doublestrand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 9169-9174, doi:10.1073/pnas.1403565111 (2014). 443 Taniguchi, Y. The Bromodomain and Extra-Terminal Domain (BET) Family: Functional Anatomy of BET Paralogous Proteins. International journal of molecular sciences 17, doi:10.3390/ijms17111849 (2016). 444 Borck, P. C., Guo, L. W. & Plutzky, J. BET Epigenetic Reader Proteins in Cardiovascular Transcriptional Programs. Circulation research 126, 1190-1208, doi:10.1161/circresaha.120.315929 (2020). 445 Schwarz, B. A., Bar-Nur, O., Silva, J. C. & Hochedlinger, K. Nanog is dispensable for the generation of induced pluripotent stem cells. Current biology : CB 24, 347350, doi:10.1016/j.cub.2013.12.050 (2014). 446 Carter, A. C., Davis-Dusenbery, B. N., Koszka, K., Ichida, J. K. & Eggan, K. Nanogindependent reprogramming to iPSCs with canonical factors. Stem cell reports 2, 119-126, doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.010 (2014). 447 Sridharan, R. et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell 136, 364-377, doi:10.1016/j.cell.2009.01.001 (2009). 448 Saunders, A. et al. The SIN3A/HDAC Corepressor Complex Functionally Cooperates with NANOG to Promote Pluripotency. Cell Reports 18, 1713-1726, doi:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.01.055 (2017). 449 Liu, W. et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death & Differentiation 21, 1950-1960, doi:10.1038/cdd.2014.124 (2014). 450 Horne, G. A. et al. Nanog requires BRD4 to maintain murine embryonic stem cell pluripotency and is suppressed by bromodomain inhibitor JQ1 together with Lefty1. Stem cells and development 24, 879-891, doi:10.1089/scd.2014.0302 (2015). 451 Finley, L. W. S. et al. Pluripotency transcription factors and Tet1/2 maintain Brd4independent stem cell identity. Nature Cell Biology 20, 565-574, doi:10.1038/s41556-018-0086-3 (2018). 452 Mattout, A., Biran, A. & Meshorer, E. Global epigenetic changes during somatic cell reprogramming to iPS cells. Journal of Molecular Cell Biology 3, 341-350, doi:10.1093/jmcb/mjr028 %J Journal of Molecular Cell Biology (2011). 453 Shukla, V., Vaissière, T. & Herceg, Z. Histone acetylation and chromatin signature in stem cell identity and cancer. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 637, 1-15, doi:https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2007.07.012 (2008). 454 Biran, A. & Meshorer, E. in Stem Cell Epigenetics Vol. 17 (eds Eran Meshorer & Giuseppe Testa) 207-230 (Academic Press, 2020). 455 Ichida, J. K. et al. Notch inhibition allows oncogene-independent generation of iPS cells. Nature Chemical Biology 10, 632-639, doi:10.1038/nchembio.1552 (2014). 456 Gonzales-Cope, M., Sidoli, S., Bhanu, N. V., Won, K.-J. & Garcia, B. A. Histone H4 acetylation and the epigenetic reader Brd4 are critical regulators of pluripotency in 271 embryonic stem cells. BMC Genomics 17, 95, doi:10.1186/s12864-016-2414-y (2016). 457 Li, X. et al. Small-Molecule-Driven Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Functional Neurons. Cell stem cell 17, 195-203, doi:10.1016/j.stem.2015.06.003 (2015). 458 Floyd, S. R. et al. The bromodomain protein Brd4 insulates chromatin from DNA damage signalling. Nature 498, 246-250, doi:10.1038/nature12147 (2013). 459 Huang, S., Litt, M. & Felsenfeld, G. Methylation of histone H4 by arginine methyltransferase PRMT1 is essential in vivo for many subsequent histone modifications. Genes & development 19, 1885-1893, doi:10.1101/gad.1333905 (2005). 460 Faiola, F. et al. NAC1 Regulates Somatic Cell Reprogramming by Controlling Zeb1 and E-cadherin Expression. Stem cell reports 9, 913-926, doi:https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2017.07.002 (2017). 461 Choi, H. et al. Nac1 facilitates pluripotency gene activation for establishing somatic cell reprogramming. Biochemical and biophysical research communications 518, 253-258, doi:10.1016/j.bbrc.2019.08.043 (2019). 462 Lessard, J. A. & Crabtree, G. R. Chromatin regulatory mechanisms in pluripotency. Annual review of cell and developmental biology 26, 503-532, doi:10.1146/annurevcellbio-051809-102012 (2010). 463 Ozmadenci, D. et al. Netrin-1 regulates somatic cell reprogramming and pluripotency maintenance. Nature Communications 6, 7398, doi:10.1038/ncomms8398 (2015). 464 Bourque, G. et al. Ten things you should know about transposable elements. Genome biology 19, 199, doi:10.1186/s13059-018-1577-z (2018). 465 Scotland, K. B., Chen, S., Sylvester, R. & Gudas, L. J. Analysis of Rex1 (zfp42) function in embryonic stem cell differentiation. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 238, 1863-1877, doi:10.1002/dvdy.22037 (2009). 466 Guallar, D. et al. Expression of endogenous retroviruses is negatively regulated by the pluripotency marker Rex1/Zfp42. Nucleic Acids Research 40, 8993-9007, doi:10.1093/nar/gks686 %J Nucleic Acids Research (2012). 467 Yeh, H.-W. et al. PSPC1 mediates TGF-β1 autocrine signalling and Smad2/3 target switching to promote EMT, stemness and metastasis. Nature Cell Biology 20, 479491, doi:10.1038/s41556-018-0062-y (2018). 468 Zhu, H. et al. Lsh is involved in de novo methylation of DNA. 25, 335-345, doi:https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600925 (2006). 469 Huang, X. & Wang, J. The extended pluripotency protein interactome and its links to reprogramming. Current Opinion in Genetics & Development 28, 16-24, doi:https://doi.org/10.1016/j.gde.2014.08.003 (2014). 470 Dunican, D. S. et al. Lsh regulates LTR retrotransposon repression independently of Dnmt3b function. Genome biology 14, R146, doi:10.1186/gb-2013-14-12-r146 (2013). 471 Wang, J. et al. The lysine demethylase LSD1 (KDM1) is required for maintenance of global DNA methylation. Nature Genetics 41, 125-129, doi:10.1038/ng.268 (2009). 472 Whyte, W. A. et al. Enhancer decommissioning by LSD1 during embryonic stem cell differentiation. Nature 482, 221-225, doi:10.1038/nature10805 (2012). 473 Wang, J. et al. Opposing LSD1 complexes function in developmental gene activation and repression programmes. Nature 446, 882-887, doi:10.1038/nature05671 (2007). 278 SF1-Specific AMPKα1 Deletion Protects Against Diet-Induced Obesity. Diabetes. 2018 Nov;67(11):2213-2226. IF: 7.199 (D1) En este trabajo participé en el diseño y elaboración de nuevos constructos para la experimentos de ganancia de función de las formas salvaje y mutantes de AMPKα1, incluyendo la generación de partículas lentivirales para su utilización en modelo in vivo de ratón. 4. Guallar D, Bi X*, Pardavila JA*, Huang X*, Saenz C, Shi X, Zhou H, Faiola F, Ding J, Haruehanroengra P, Yang F, Li D, Sanchez-Priego C, Saunders A, Pan F, Valdes VJ, Kelley K, Blanco MG, Chen L, Wang H, Sheng J, Xu M, Fidalgo M, Shen X, Wang J. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 2018 Mar;50(3):443-451. IF: 25.455 (D1) En esta publicación en la que figuro con igual contribución en segunda posición, he contribuido de manera directa en el diseño, elaboración y detección por citometría de flujo de nuevos sensores de las modificaciones químicas en el ARN (m5C y hm5C), así como ensayos de IP-CoIP entre otras aproximaciones experimentales tanto a nivel celular como molecular. 12.4 Proyectos 1. PID2019-105739GB-I00. Impacto del metabolismo y envejecimiento en pluripotencia a través de la regulación epigenética (IMAGINE). Agencia Estatal de Investigación (AEI). PI: Miguel Fidalgo (USC). 01/06/2020-31/05/2023. 2. ED431F 2016/016. Investigando las bases moleculares que regulan los estados alternativos de pluripotencia. Conselleria de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria (Xunta de Galicia). PI: Miguel Fidalgo (USC). 01/01/2016-31/12/2020. 3. BFU2016-80899-P. Análisis de la acción conjunta de la familia de proteínas “Ten-eleven translocation” y las proteínas con bromo dominios durante la generación de células pluripotentes inducidas. 279 Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. PI: Miguel Fidalgo (USC). 01/01/2017-31/12/2020. 12.5 Contratos, méritos tecnológicos o de transferencia 1. 01/02/2017-29/04/2017: Investigador en formación en el proyecto “Investigando las bases moleculares que regulan los estados alternativos de pluripotencia” Conselleria de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria. (USC). 2. 30/04/2017-29/04/2020: Investigador en formación en el proyecto de investigación “Análisis de la acción conjunta de la familia de proteínas Ten-eleven translocation y las proteínas con bromo dominios durante la generación de células pluripotentes inducidas” Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. (USC). 3. 2016-2020: Investigador perteneciente al grupo de investigación “Mecanismos moleculares da enfermidade (MeMoEn)”, con código GI2119 y adscrito al CiMUS (USC). 12.7 Participación en congresos, simposios y talleres Hasta la fecha he participado como autor en 20 contribuciones de diseminación de resultados científicos tanto a nivel nacional e internacional. A continuación, se indican los más relevantes: 1. Pardavila JA, Garcia-Outeiral V, Fuentes-Iglesias A, Guallar D, Fidalgo M. BET-Dependent Temporal Regultaion of Chromatin Architecture is a Key Step for Ground Pluripotent State Acquisition. II Annual CiMUS Workshop. Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CiMUS). Santiago de Compostela (Spain). 12/07/2019. 2. Pardavila JA, Fuentes-Iglesias A, Garcia-Outeiral V, Escudero A, Souto Y, Ameneiro A, Guallar D, Fidalgo M. BET Family of Proteins Influences Nuclear Reorganization During Somatic Cell Reprogramming. VII Xornada de Investigación 280 BIOINTEGRASAUDE 2019. IDIS, INIBIC and IISGS. Santiago de Compostela (Spain). 15/05/2019. 3. Pardavila JA, Fuentes-Iglesias A, Garcia-Outeiral V, Escudero A, Souto Y, Ameneiro C, Guallar D, Fidalgo M. BET Family of Proteins Influences Nuclear Reorganization During Somatic Cell Reprogramming. 13th EMBL Conference: Transcription and Chromatin. European Molecular Biology Laboratory. EMBL. Heidelberg (Germany). 25/08/2018-28/08/2018. 4. Pardavila JA, Garcia-Outeiral V, Fuentes-Iglesias A, Fidalgo M. Bromodomain and Extraterminal Domain Family of Proteins Regulate Cell Reprogramming through Nuclear Reorganization. I Annual CiMUS Workshop. Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CiMUS). Santiago de Compostela (Spain). 15/06/2018. 5. Pardavila JA. BET Family of Proteins Influences Nuclear Reorganization During Somatic Cell Reprogramming. Programa de conferencias “Happy Friday”. Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CiMUS). Santiago de Compostela (Spain). 24/05/2019. 12.8 Participación en cursos y seminarios de formación 1. Seguridad en la utilización de botellas y líquidos criogénicos. 19/04/2016-19/04/2016 (4 horas). Org: Praxair (Praxair-Departamento de Gases Especiales). Loc: Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CiMUS). 2. Riesgos laborales en el laboratorio. 19/10/2018-19/10/2018 (4 horas). Org: Universidade de Santiago de Compostela (USC). Loc: Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CiMUS). 3. How to improve your scientific presentations. 27/09/201928/09/2019 (16 horas). Org: Fundación Dr. Antonio Esteve. Loc: Centro Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS). 281 4. Publicación de alto impacto en biomedicina. 08/02/2018-08/02/2018 (4 horas). Org: Universidade de Santiago de Compostela (USC). Loc: Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CiMUS). 5. Scientific integrity: How to publish reproducible results. 23/05/201923/05/2019 (4 horas). Org: European Molecular Biology Organization (EMBO). Loc: Centro de Estudios Avanzados (USC). 282 13. AGRADECIMIENTOS 283 Decir en primer lugar que les estoy muy agradecido a todas las personas, agentes e instituciones que, de manera directa o indirecta, han hecho posible la elaboración de esta tesis doctoral. Inmensamente agradecido a mi tutor y director, el doctor Miguel Ángel Fidalgo Pérez, por su participación directa e inestimable y también por su gran paciencia, incansable labor didáctica, entusiasmo contagioso y toda la confianza depositada en mí. Saber y saber enseñar, es saber dos veces. Para o que queiras veciño. Así mismo, agradezco a mi codirector de tesis, el doctor Anxo Vidal Figueroa, su generosidad e interés permanente por mi trabajo, así como el respeto y disponibilidad mostrados en todo momento, incluso antes de comenzar esta etapa. Quiero hacerlo extensible además a todos los miembros de su grupo. Agradezco también a todo el personal del Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CIMUS), tanto su labor profesional como su siempre positiva actitud y, muchas veces, paciencia. Quiero mostrar además mi agradecimiento hacia todos los miembros de la Unidad Stem Cells & Epitranscriptomics (formada por los grupos de Stem Cells & Human Diseases y Epitranscriptomics & Ageing) presentes y pasados, especialmente a la doctora Diana Guallar, investigadora principal del grupo hermano, y a los compañeros que han participado de manera más directa en este trabajo: Adriana, Alejandro, Tiago, Vera y Yara. Muchas gracias cracks. Por supuesto, se lo agradezco a la persona que me animó a comenzar esta etapa, a quién está ahí en lo bueno y en lo malo y me acompañó durante un tiempo en lo mejor y lo peor. Muchas gracias, Laura. Finalmente, tengo que agradecerles a las cuatro personas que más quiero el haber estado ahí siempre, apoyando, confiando y animando en todo momento. A mis padres y hermanas, no tengo palabras para describir mi agradecimiento hacia vosotros. Gracias siempre, por todo.