Caracterización y valor clínico de las células tumorales circulantes en pacientes con cáncer de mama triple negativo y cáncer de ovario avanzado

! ! ! 1! ! TESIS DE DOCTORADO CARACTERIZACIÓN Y VALOR CLÍNICO DE LAS CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO Y CÁNCER DE OVARIO AVANZADO ! ! !Manuel Abreu Rodríguez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2019 ! 2! ! ! ! 3! ! DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS CARACTERIZACIÓN Y VALOR CLÍNICO DE LAS CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO Y CÁNCER DE OVARIO AVANZADO D. Manuel Abreu Rodríguez Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, 15 de Julio de 2019 Fdo. D. Manuel Abreu Rodríguez ! ! ! 4! ! ! ! 5! AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS CARACTERIZACIÓN Y VALOR CLÍNICO DE LAS CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO Y CÁNCER DE OVARIO AVANZADO Dña. Laura Muinelo Romay Dña. Laura Sánchez Piñón D. Rafael López López INFORMA/N: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por D. Manuel Abreu Rodríguez , bajo mi dirección, y a utorizo su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 15 de Julio de 2019 Fdo.! Laura Muinelo Romay (Directora) Fdo. Laura Sánchez Piñón (Directora y Tutora) Fdo. D. Rafael López López (Director) ! 6! ! ! ! ! 7! Yo, Manuel Abreu Rodríguez, autor de esta tesis, no cuento con conflictos te interés que declarar. ! 8! ! ! ! 9! Este trabajo ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III (PI13/01388) ! 16! 3.2.3 Tratamiento con inhibidores de la vía androgénica…………………………106 3.2.4 Tratamiento con carboplatino y paclitaxel………………………………….106 3.3 Análisis de la expresión génica…………………………………………...…107 3.3.1 Extración de ARN total de tejido parafinaldos………………………...……107 3.3.2 Extración de ARN total de líneas celulares…………………………………107 3.3.3 Extración de ARN total de CTCs de pacientes……………...………………107 3.3.4 Retrotranscripción…………………………………………..………………107 3.3.5 Preamplificación…………………………………………….………………108 3.3.6 RT-q-PCR……………………………………...……………………………109 3.4 Aislamiento y contaje de CTCs………………………..……………………110 3.4.1 Aislamiento mediante el kit CELLection Epithelial………………...………110 3.4.2 Aislamiento y contaje mediante el sistema CellSearch………………..……111 3.4.3 Aislamiento y recuperación de células puras mediante la tecnología DEPArray…………………………………………………………………………112 3.5 Análisis genómicos…………………………………………...………………113 3.5.1 Amplificación de genoma completo mediante el kit Ampli1 WGA…..……113 3.5.2 Extracción de ADN total de tejidos parafinados……………………………114 3.6 Secuenciación masiva paralela dirigida…………………………….………115 3.6.1 Construcción de librerías……………………………………………………115 3.6.2 Preparación de los templates………………………………………..………116 3.6.3 Secuenciación…………………………………………………………….…116 3.6.4 Análisis bioinformático………………………………………………..……116 3.7 Estudios proteicos……………………………………………………………117 3.7.1 Extracción de proteínas totales de las líneas celulares……………...………117 3.7.2 Western-Blot……………………………………………………………..….117 3.8 Ensayos funcionales……………………………………….…………………119 3.8.1 Ensayos funcionales in vitro…………………………………………...……119 3.8.1.1 Ensayo de migración en Transwell……………………...………119 3.8.1.2 Ensayo de proliferación en placa……………………...…………120 3.8.1.3 Ensayo de adhesión celular en placa………………………….…120 3.8.1.4 Ensayo de toxicidad con carboplatino y paclitaxel……………...121 ! ! ! 17! 3.8.1.5 Ensayo de formación de colonias en agar………………….……121 3.8.2 Ensayos funcionales in vivo…………………………………………………122 3.8.2.1 Ensayos en pez cebra………………………………………….…122 3.8.2.1.1 Cuidado y cruce de pez cebra……………………...…122 3.8.2.1.2 Estudios de toxicidad en pez cebra……………..……123 3.8.2.1.3 Ensayos de xenograft en pez cebra………………..…123 3.8.2.1.4 Análisis de los embriones inyectados……………...…125 3.8.2.2 Ensayos xenograft en modelos murinos…………………………125 3.9 Análisis estadístico……………………………………………………...……127 4. RESULTADOS……………………………………………..…………129 4.1 Resultados CMTN………………………………………………..……….…131 4.1.1 Valor clínico del contaje de CTCs en pacientes con CMTN……………..…131 4.1.1.1 Contaje de CTCs en pacientes con CMTN en estadíos III y IV mediantes la tecnología CellSearch…………………………………...…131 4.1.1.2 Asociación entre el número de CTCs y variables clínicas………133 4.1.1.3 Valor pronóstico del contaje de CTCs mediante el sistema CellSearch…………………………………………………………….…133 4.1.2 Caracterización del perfil de expresión génica de CTCs de pacientes con CMTN………………………………………………………………………..……136 4.1.2.1 Cuantificación y caracterización de CTCs en pacientes con CMTN mediante RT-q-PCR………………………………………………..……136 4.1.2.2 Estudio de correlación entre el número de CTCs obtenido con el sistema CellSearch y los niveles de los marcadores analizados mediante RT-q-PCR………………………………………………………….….…142 4.1.2.3 Valor diagnóstico del panel de marcadores identificado en la población de CTCs…………………………………………………....…142 4.1.2.4 Valor pronóstico de los marcadores identificados en la población de CTCs…………………………………………………………….…….…144 4.1.3 Validación de las potenciales dianas terapéuticas identificadas en CTCs de pacientes con CMTN…………………………………………………………...…148 ! 18! 4.1.3.1 Validación in vitro e in vivo del bloqueo de la vía mediada por el receptor de andrógenos como estrategia terapéutica en CMTN…………149 4.1.3.1.1 Impacto del bloqueo de la vía androgénica en la capacidad de proliferación, formación de colonias en agar y migración en la línea celular MDA-MB 231………………..…150 4.1.3.1.2 Estudio in vivo del efecto del bloqueo de la vía androgénica en la línea celular MDA-MB 231……………...…151 4.1.3.1.3 Ensayo de toxicidad en respuesta a tratamiento con abiraterona y enzalutamida en pez cebra…………………….…152 4.1.3.1.4 Ensayo de proliferación y migración en pez cebra…...152 4.1.3.2 Validación in vitro e in vivo de la inhibición de TIMP1 como estrategia terapéutica en CMTN…………………………………………155 4.1.3.2.1 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la expresión de marcadores de plasticidad celular en la línea MDA-MB 231….156 4.1.3.2.2 Efecto del silenciamiento de TIMP1 en la capacidad de proliferación, clonogenicidad, invasión y adhesión de la línea MDA-MB 231………………………………………………….156 4.1.3.2.3 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la respuesta al tratamiento con carboplatino y paclitaxel……………………...159 4.1.3.2.4 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la proliferación y migración de la línea celular MDA-MB 231 en pez cebra…..161 4.1.3.2.5 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la proliferación y formación de metástasis de la línea MDA-MB 231 en un modelo murino………………………………………………………….163 4.1.4 Análisis de las CTCs mediante secuenciación de nueva generación……….166 4.1.4.1 Aislamiento de las CTCs mediante la tecnología DEPArray y amplificación del genoma completo…………………………………….166 4.1.4.2 Análisis de las CTCs mediante secuenciación…………………..168 4.2 Resultados cáncer de ovario………………………………………………...177 4.2.1 Valor clínico del contaje de CTCs en pacientes con cáncer de ovario……...177 4.2.1.1 Características de las pacientes……………………….…………177 4.2.1.2 Contaje de CTCs en pacientes con cáncer de ovario mediante la tecnología CellSearch: asociación con variables clínicas y valor pronóstico……………………………………………………………......177 ! ! ! 19! 4.2.2 Caracterización del perfil de expresión génica en CTCs de pacientes con cáncer de ovario…………………………………………………………………...179 4.2.2.1 Cuantificación y caracterización de CTCs mediante RT-q-PCR..179 4.2.2.2 Estudio de correlación entre el número de CTCs obtenido con es sistema CellSearch y los niveles de los marcadores analizados mediante RT-q-PCR...……………………………………………………………..179 4.2.2.3 Valor diagnóstico del panel de expresión identificado en CTCs..183 4.2.2.4 Correlación de los marcadores de CTCs con las variables clínicas y la supervivencia de las pacientes………………………………………..184 4.2.3 Validación in vitro e in vivo de la inhibición de TIMP1 como estrategia terapéutica en cáncer de ovario…………………………………………………...185 4.2.3.1 Estudio in vitro del impacto del silenciamiento de TIMP1 en el fenotipo de la línea celular SKOV3……………………………………..186 4.2.3.2 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la expresión de marcadores de plasticidad celular en la línea SKOV3…………………..186 4.2.3.3 Efecto del silenciamiento de TIMP1 en la capacidad de proliferación, clonogenicidad, invasión y adhesión de la línea SKOV3...187 4.2.3.4 Impacto del silenciamiento de TIMP1 en la proliferación de la línea SKOV3 en pez cebra…………………………………………………….189 5. DISCUSIÓN…………………………………………………………...193 5.1 Valor del estudio de CTCs en pacientes con CMTN………………………….196 5.2 Valor del estudio de CTCs en pacientes con cáncer de ovario………………..215 6. CONCLUSIONES…………………………………………………….221 7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………...225 8. AGRADECIMIENTOS………………………………………….……281 9. ACLARACIONES……………………………………………….……285 ! ! ! ! ! ! ! !!!!! ! 20! ! ! ! ! ! ! ! 21! ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico. ADNc: ADN complementario. ADNtc: ADN tumoral circulante. ARN: Ácido ribonucleico. CBS: Cirugía conservadora de mama. CDX: Xenoinjerto derivado de células tumorales circulantes. CMC: Célula madre cancerosa. CMTN: Cáncer de mama triple negativo. CTC: Célula tumoral circulante. EMT: Transición epitelio mesénquima. FISH: Fluorescencia por hibridación in situ. miARN: Micro ARN. MMP: Metaloproteinasas de matriz. OMS: Organización mundial de la salud. SG: Supervivencia global. SLP: Supervivencia libre de progresión. TN: Triple negativo. ! 22! RTU: Listo para usar. AKT2: Quinasa serina treonina 2. AKT3: Quinasa serina treonina 3. ALDH1: Aldehido deshidrogenasa 1 ALDH2: Aldehido deshidrogenasa 2. AML2: Gen asociado a leucemia mieloide aguda 2. ANGTPL4: Proteína 4 de tipo angiopoyetina. ANXA2: Anexina 2. APOA1: Apoliproteína A1. AR: Receptor de andrógenos. ARID1A: Factor de remodelación de cromatina P250. ATM: Quinasa serina treonina ATM. B7H4: Proteína co-estimuladora inmune B7-H4 BCL11A: Proteína de leucemia/linfoma de célula B 11A. BCL2: Proteína reguladora de apoptosis BCL2. BDNF: Factor neurotrófico derivado de cerebro. BRAF: Proto-Oncogen BRAF. BRCA1: Proteína de susceptibilidad a cáncer de mama y ovario 1. ! ! ! 23! BRCA2: Proteína de susceptibilidad a cáncer de mama y ovario 2. CA125 : Mucina 16. CA15.3: Mucina 1. CCNA2: Ciclina A2. CCND1: Ciclina D1. CCNE1: Ciclina E1. CCNE2: Ciclina E2. CD117: Grupo de diferenciación 117. Kit. CD133: Grupo de diferenciación 133. Prominina 1. CD24: Grupo de diferenciación 24. CD44: Grupo de diferenciación 44. CD45: Grupo de diferenciación 45. Antígeno común leucocitario. CD49F: Grupo de diferenciación 49F. Integrina alfa 6. CDH1: E-Cadherina. CDH12: N-Cadherina. CDKN2A: Inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas 2A. CDP1: Proteína integral de membrana de Golgi 6. CK: Citoqueratina. ! 24! CK17: Citoqueratina 17. CK18: Citoqueratina 18. CK19: Citoqueratina 19. CMYC: Factor de transcripción P64. COX2: Cicloxigenasa 2. CRIPTO1: Factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma 1. CTLA4: Proteína asociada a linfocito T citotóxico 4. CTNNB1: ß catenina 1. CX26: Proteína de uniones GAP ß2. CXCL12: Factor de estimulación de crecimiento de células pre-B. CXCR4: Proteína asociada a lipopolisacáridos 3. DKFZ: Molécula DKFZp762E1312. ECAD: E-Cadherina. EGF: Factor de crecimiento epidérmico. EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico. EMP2: Proteína epitelial de membrana 2. EPCAM: Molécula de adhesión de célula epitelial. ERCC1: Proteína de reparación de ADN por excisión 1. ! ! ! 25! EREG: Epirregulina. ET1: Endotelina 1. ETV5: ETS variante 5. FGFR1: Receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 1. FGFR2: Receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 2. FOLR1: Receptor de folato 1. FOXA1: Proteína caja de horquilla A1. FOXM1: Proteína caja de horquilla M1. FUT8: Fucosiltransferasa 8. GAPDH: Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa. GDF1: Factor de crecimiento y diferenciación 1. GTSE1: Proteína expresada en fase S y G2. HE4: Proteína principal epidídimo específica E4. HER2: Receptor epidérmico humano de factor de crecimiento 2. HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos. IBP4: Proteína de unión reguladora de interferón factor 4. IGF1: Factor de crecimiento insulínico tipo 1. IGFR1: Receptor de factor de crecimiento insulínico tipo 1. ! 32! estudio presentaron, respectivamente, al menos 1CTC/7,5ml de sangre. Además, aquellas pacientes con niveles superiores a 5CTCs/7,5ml de sangre o presencia de clusters de CTCs presentaron peores tiempos de supervivencia, tanto global (SG) como libre de progresión (SLP), demostrando su valor como marcador pronóstico. Por otro lado, mediante la caracterización molecular de las CTCs presentes en las muestras de ambos tipos de tumores, observamos una gran plasticidad celular. En el caso de las CTCs de las pacientes con CMTN esta población circulante se caracterizó por la expresión de CDH1 y EPCAM, VIM, SNAI1, TIMP1, CRIPTO1, CD49F, ALDH2, CD44, BCL11A y AR, demostrando la convivencia de marcadores epiteliales, mesenquimales y de célula madre. Este fenotipo de plasticidad se evidenció también en las muestras de pacientes con cáncer de ovario mediante la expresión MUC1, CK19, TIMP1, CXCR4, CD24 y CD44. Respecto a este fenotipo intermedio o de plasticidad, numerosos estudios han puesto de manifiesto que la transición de características epiteliales a mesenquimales induce la aparición de propiedades de célula madre en las células tumorales de origen epitelial, siendo estos fenotipos híbridos o intermedios los vinculados a una mayor capacidad metastásica. Este estado intermedio o de plasticidad se considera más habitual que la transición completa de un fenotipo epitelial a mensenquimal y se ha descrito previamente en la población de CTCs en distintos tipos de tumores, asociándose a una mayor capacidad de estas células para formar metástasis. Es importante destacar también que en el presente estudio hemos podido aumentar el porcentaje de detección de CTCs mediante nuestro protocolo de aislamiento y detección indirecta con respecto al sistema CellSearch. El mejor modelo para la detección de CTCs en CMTN fue el formado por los marcadores TIMP1, SNAIL1 y BCL11A y el mejor modelo para la detección de CTCs en cáncer de ovario el formado por GAPDH, TIMP1, CK19 y MUC1. Por otro lado, en cuanto al impacto clínico del aislamiento y caracterización transcriptómica de la población de CTCs de la cohorte ! ! ! 33! TN de nuestro estudio, debemos destacar también que la presencia de niveles elevados de algunos de los marcadores se asoció con peores tasas de supervivencia, en términos de SG (CD49F, ALDH2, CD44, TIMP1 y GAPDH) y SLP (CD49F, TIMP1 y GAPDH). Otro de los objetivos del presente trabajo fue la identificación de potenciales dianas terapéuticas a través de la caracterización de las CTCs de las pacientes. Para ello, de la firma de marcadores presentes en esta población circulante de ambos tumores se seleccionó uno de ellos, TIMP1, para una mayor caracterización mediante estudios funcionales in vitro e in vivo. Seleccionamos este marcador debido a su importante expresión diferencial entre controles y pacientes, por su impacto en SG y SLP y por la reciente bibliografía que asocia niveles elevados de TIMP1 con un peor pronóstico en distintos tipos de tumores. En nuestro estudio demostramos que su silenciamiento en las líneas tumorales MDA-MB 231 (modelo de CMTN) y SKOV3 (modelo de cáncer de ovario) reduce la proliferación celular y aumenta la capacidad de adhesión a matrices de colágeno in vitro en ambas líneas celulares. El descenso en la capacidad proliferativa de ambas líneas silenciadas para este gen también se observó al analizar su comportamiento en un modelos de pez cebra. Además, el silenciamiento de TIMP1 en la línea MDA-MB 231 suprimió la aparición de metástasis pulmonares en un modelo ortotópico murino, demostrando la importancia de este gen en la biología de las CTCs y el proceso de diseminación metastásica. Además del estudio del papel de TIMP1 en CMTN, también se analizó en más detalle el impacto del bloqueo de la actividad de la vía del AR por su interés como diana terapéutica. Parte de los tumores TN presentan alta expresión de AR, constituyendo una interesante diana molecular para su tratamiento, pero su papel en el resto de tumores TN no está suficientemente explorado. Por ello, en el presente trabajo se estudió el impacto del tratamiento con abiraterona y enzalutamida en el comportamiento de la línea MDA-MB 231, observando una reducción de la proliferación celular tanto en ensayos in vitro como in vivo utilizando el modelo de pez cebra. ! 34! Es importante destacar que los resultados obtenidos en la caracterización funcional de TIMP1 y el AR evidencian el interés del estudio de la población de CTCs en pacientes con ambos tipos de tumores para comprender mejor cuales son los actores que están mediando el proceso de carcinogénesis y diseminación tumoral. Finalmente, para completar nuestra estrategia de estudio de las CTCs de las pacientes CMTN, se llevó a cabo un estudio de caracterización genómica en el que se comparó la población circulante y el tejido tumoral de 4 pacientes. Para ello se realizó un aislamiento de CTCs a nivel de célula única mediante el uso de la tecnología DEPArray, para su posterior análisis mediante un panel se secuenciación que incluyó un total de 163 genes. Los genes más frecuentemente mutados en las cuatro pacientes fueron TP53, PIK3CA, NOTCH2 y BRCA2. Todos ellos son genes habitualmente mutados en tumorales TN. En 3 de las pacientes se encontraron mutaciones comunes entre tejido y CTCs, siendo el porcentaje de concordancia más alto del 50. Es importante destacar que los resultados de este estudio confirmaron la presencia de una importante heterogeneidad molecular entre las distintas CTCs presentes en las pacientes, pero también entre esta población circulante y los correspondientes tejidos tumorales (tumor primario o metástasis). Por lo tanto, demostramos que este tipo de análisis constituye una herramienta de gran valor para poder llevar a cabo el genotipado dinámico y no invasivo del tumor, teniendo en cuenta la heterogeneidad molecular presente en la mayoría de los tumores y cuyo impacto en la evaluación de la enfermedad puede ser muy importante. Globalmente podemos decir que los resultados del presente trabajo demuestran el valor del estudio de la población tumoral circulante de pacientes con CMTN y cáncer de ovario avanzado para establecer nuevas opciones de diagnóstico, pronóstico y tratamiento en ambos tipos de tumores, constituyendo una estrategia de gran relevancia para acercar la oncología de precisión a estas pacientes. ! ! ! 35! INTRODUCCCIÓN ! 36! ! ! ! 37! 1-INTRODUCCIÓN A pesar de los continuos avances en prevención, diagnóstico y tratamiento, los tumores de mama y ovario siguen estando entre los tumores que afectan a mujeres con: mayor prevalencia en el caso de mama (28%) y con mayor agresividad en el caso de ovario, presentándose como el tumor ginecológico que más muertes causa (Galceran et al., 2017). Siendo dos tipos de tumores con distinto origen y con datos de incidencia, mortalidad y respuesta a terapia diferentes, presentan ciertas similitudes y mecanismos moleculares comunes. Así, por ejemplo, las mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 son las más comunes y mejor definidas en su relación con el desarrollo de la forma hereditaria de este tipo de tumores, estando presentes en un 515% del total de los tumores de mama y ovario. Ambos pertenecen al grupo de genes denominados supresores de tumores y participan en el crecimiento celular, la división celular y la reparación del ADN mediante recombinación homóloga de alta fidelidad (Alhuqail et al., 2018; Anders, Abramson, Tan, & Dent, 2016). Mutaciones en estos genes pueden dar lugar a una incapacidad para reparar el ADN que puede desembocar principalmente, en el desarrollo de tumores de los tipos mencionados. El riesgo de desarrollar este tipo de tumores es del 39-60% en portadores de mutaciones en BRCA1 y del 10-27% en portadores de mutaciones en BRCA2 (G. Liu et al., 2012). Otras características comunes entre el cáncer de mama y ovario (principalmente el de ovario del tipo seroso) son: la no amplificación de RB1 y CCNE1, la alta expresión de AKT3, la amplificación y la alta expresión de CMYC y la alta frecuencia de mutaciones en P53. Estas características comunes sugieren que ambos tipos de tumores pueden estar dirigidos parcialmente por eventos comunes y, por lo tanto, en algunos casos podrían considerarse aproximaciones terapéuticas comunes para combatirlos (Cancer Genome Atlas Network et al., 2012). ! 38! En el presente trabajo tratamos de identificar marcadores tumorales y dianas terapéuticas para ambos tumores a través del estudio de la población de CTCs presentes en la sangre de las pacientes, como vía alternativa y complementaria al tradicional estudio de muestras de tejido y con el objetivo de proporcionar nuevas herramientas clínicas que mejoren la esperanza de vida de estas pacientes. 1.1 CÁNCER DE MAMA Las mamas son órganos iguales, simétricos y glandulares situados en la parte frontal superior del pecho. Se encuentran constituidas por diferentes tipos de tejido, que van desde un tejido muy denso al tejido adiposo que rodea la glándula, proporcionándole consistencia y volumen. Estructuralmente está formada por gran cantidad de alvéolos que se unen formando los lóbulos (15-50) y lobulillos donde se produce la leche. A su vez éstos están unidos por una serie de tubos denominados ductos o conductos galactóforos que llevan la leche hasta el pezón (Bland & E., 2007) (Figura 1). La glándula mamaria está irrigada mediante vasos sanguíneos y vasos linfáticos, que son los encargados de recoger la linfa. Dichos vasos linfáticos desembocan en ganglios linfáticos situados en la axila y a ambos lados del esternón (Bland & E., 2007). Las mamás son el órgano que más cambios sufre desde el nacimiento hasta la edad adulta. Crecen durante la pubertad bajo la acción de las hormonas femeninas (estrógenos y progesterona) posteriormente, durante la edad reproductiva se ven influenciadas por el ciclo menstrual para que finalmente, en la menopausia, gran parte de la glándula mamaria se atrofie y sea remplazada por tejido adiposo (Bland & E., 2007). ! ! ! 39! ! ! Figura 1: Anatomía de la mama. Adaptada de Terese Winslow LLC Medical and Scientific Illustration. Con autorización de Terese Winslow. El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común y la segunda causa de muerte de mujeres en los países desarrollados. Presenta su mayor pico de incidencia entre los 45 y 50 años y la OMS estima que en 2020 una de cada ocho mujeres desarrollarán un cáncer de mama (Teles RHG, Moralles HF, 2018). Es importante destacar también que la supervivencia a 5 años en cáncer de mama es del 98% en enfermedad localizada, del 84% en enfermedad regional, pero de sólo el 23% en enfermedad metastásica. Además, un cuarto de los pacientes con cáncer de mama localizado y la mitad de las mujeres con afectación en ganglios axilares sufren una recaída (Howlander N, Krapcho M, Miller D, 2015). ! 40! Al considerar el riesgo de padecer cáncer de mama hemos de recordar que la mayoría de las mujeres que lo desarrollan no presentan factores de riesgo muy evidentes, ni tampoco antecedentes familiares. Sin embargo, existen ciertos factores que pueden aumentar la posibilidad de desarrollar un tumor de mama: • Edad. El riesgo de padecer cáncer de mama aumenta con la edad, presentándose en la mayoría de los casos en mujeres de más de 50 años (K. N. Anderson, Schwab, & Martinez, 2014). • Antecedentes personales. Una mujer que ha tenido cáncer en una mama presenta un riesgo aumentado de presentar un nuevo tumor de mama (K. N. Anderson et al., 2014). • Antecedentes familiares. El riesgo de padecer cáncer mama se ve aumentado si tienen algún pariente de primer grado o varios de segundo grado a los que se le ha diagnosticado cáncer de mama u ovarios. Si algún familiar ha desarrollado cáncer en las dos mamas. Si tiene un pariente hombre que haya desarrollado cáncer de mama. (K. N. Anderson et al., 2014). • Susceptibilidad genética: Principalmente las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 (Bane, Dushanthi, & Andrulis, 2013). • Exposición a estrógeno y progesterona. Las mujeres que han tenido la primera menstruación antes de los 11 años y/o llegaron a la menopausia después de los 55 tienen un mayor riesgo de padecer cáncer de mama ya que sus células mamarias han estado expuestas a dichas hormonas durante más tiempo (Elsawaf et al., 2013; McDonald, 2018). • Raza y origen étnico: Las mujeres de raza blanca tienen más probabilidades de desarrollar cáncer de mama que las mujeres de raza negra, pero entre las mujeres menores de 45 años, la enfermedad es más frecuente en las mujeres de raza negra que ! ! ! 41! en las de raza blanca. Las mujeres de ascendencia judía o de Europa del Este presentan también un mayor riesgo ya que son más propensas a presentar mutaciones en BRCA (McDonald, 2018). • Hiperplasia atípica de la mama: Las mujeres diagnosticadas de esta anomalía presentan también un riesgo aumentado de padecer cáncer de mama (Vierkant et al., 2017). • Carcinoma lobulillar in situ. Las mujeres diagnosticadas de esta patología presentan un riesgo aumentado de padecer un futuro tumor invasivo en cualquiera de las mamas (K. Mao et al., 2017). • Factores del estilo de vida. Distintos factores como el peso elevado, la baja actividad física, la mala alimentación y el consumo excesivo de alcohol pueden contribuir al desarrollo de cáncer de mama (Chaveepojnkamjorn, Thotong, Sativipawee, & Pitikultang, 2017). • La radiación. Las mujeres que hayan estado expuestas a radiación ionizante presentan un riesgo aumentado de padecer un cáncer de mama (Juerß et al., 2017). 1.1.1 Subtipos de cáncer de mama Este tumor se clasifica molecularmente en cinco subtipos con distinto pronóstico clínico y tratamiento (Perou, 2010) (Figura 2). ! 48! 1.1.2.2 Epidemiología y características clínicas Los tumores de mama TN representan entre el 10-20% del total de los casos de cáncer de mama (Kumar & Aggarwal, 2016) y tienen peor pronóstico que los tumores con expresión de receptores hormonales o HER2 (Dent et al., 2007; Onitilo, Engel, Greenlee, & Mukesh, 2009). Aproximadamente, el número de muertes causadas a nivel mundial por cáncer de mama ronda las 500.000, de las cuales 170.000 (alrededor del 30%) son casos de CMTN (Howlander N, Krapcho M, Miller D, 2015). El mayor riesgo de recaída tras cirugía se encuentra en el tercer año y a partir de dicha recaída el pronóstico clínico empeora considerablemente debido a que la supervivencia tras la aparición de metástasis se reduce mucho (Kumar & Aggarwal, 2016). Teniendo en cuenta la edad de diagnóstico, se observa que el CMTN presenta una distribución bimodal con un primer pico de incidencia en mujeres pre-menopáusicas, seguido de un segundo pico en mujeres de más de 70 años de edad. Por otra parte, cuando se comparan pacientes de ambos grupos con el mismo estadio se observa que el pronóstico del grupo de mujeres pre-menopáusicas es considerablemente peor (Abulkhair, Moghraby, Badri, & Alkushi, 2012; W. F. Anderson, Chatterjee, Ershler, & Brawley, 2002; Lund et al., 2009; Muguti, 1993). Se cree que CMTN pre-menopáusico es una enfermedad dirigida por pocas y muy relevantes moléculas, mientras que los tumores TN geriátricos presentan una mayor inestabilidad cromosómica, característica esencial de los tejidos senescentes y de los tumores geriátricos en general (Curtin et al., 2005). Esta heterogeneidad entre tumores de mujeres con distinta edad ha sido confirmada mediante estudios de secuenciación de alta profundidad (Curtis et al., 2012; Stephens et al., 2009). Los tumores de mama TN presentan una considerable heterogeneidad clínica dependiendo de la raza, además de la edad (Tabla 1). Las mujeres jóvenes de ascendencia africana presentan un riesgo tres veces mayor de padecer este tipo de tumores ! ! ! 49! independientemente de los factores de riesgo para el cáncer de mama (Stead et al., 2009). Por ejemplo, en un estudio epidemiológico realizado en población nigeriana se describió que el 59% de los casos de cáncer de mama en su país eran TN (Huo et al., 2009). Es importante destacar también que las mujeres africanas presentan estadios más avanzados a diagnóstico, ratios de crecimiento elevados, resistencia a quimioterapia y mayor tendencia a la formación de metástasis viscerales, principalmente en hígado y cerebro (Honorio & Guerra Pereira, 2016). Tabla 1: Heterogeneidad clínica, epidemiológica y terapéutica del CMTN. Otra de las características ya mencionada de los tumores de mama TN, es que tienen un fenotipo muy agresivo, presentándose con frecuencia como metastásicos a fecha de diagnóstico, causando lesiones locales del alto grado y un desarrollo temprano de metástasis después de la terapia adyuvante (Collett et al., 2005; Seewaldt & Scott, 2007; Vona-Davis et al., 2008). Además, este tipo de tumores generan frecuentemente metástasis viscerales, principalmente en hígado, pulmón y cerebro (Anders & Carey, 2009; Gadiyaram et al., 2009; Tsang, Li, Lai, Au, & Chua, 2009), aunque en ocasiones presentan un patrón de metástasis más similar a los tumores luminales, desarrollando solamente metástasis ganglionares y óseas (Wei et al., 2008). Estos tumores son también heterogéneos en cuanto al tiempo de recurrencia. A diferencia de los tumores con receptor de estrógenos positivo, cuya curva de recurrencia es lineal, los tumores TN presentan un mayor ratio de recurrencia en los primeros 5 años, observándose dos picos de recurrencia principales (Lee et al., 2009; ! 50! W.-J. Yin et al., 2009); el ya mencionado a los 3 años y el patrón de recurrencia tardía, asociado con una enfermedad menos agresiva vinculada a la aparición de metástasis óseas (Dent et al., 2007; Wei et al., 2008) (Figura 4). Estas diferencias observadas en el curso clínico de este tipo de tumores pueden ser debidas, en cierta medida, a la diferente edad de incidencia de la enfermedad (Tse et al., 2009). ! Figura 4: Patrón de recurrencia del CMTN. 1.1.2.3 Características moleculares Al igual que otros tipos de cáncer de mama, los tumores TN han sido uno de los focos de estudio del proyecto The Cancer Genome Atlas (TCGA). En este análisis a gran escala se analizaron diferencias en número de copias y en el patrón de metilación además de llevar a cabo secuenciación de exoma y transcriptoma, secuenciación de miARN y proteómica. Tras este análisis se pusieron de manifiesto los siguientes datos característicos de tumores TN: (1) presentan una muy alta frecuencia de mutaciones en P53, aproximadamente un 80% de los casos; (2) presentan frecuentemente inactivación de RB1 y BRCA1; (3) tienen una alta actividad de la vía PI3K causada principalmente por mutaciones de PIK3CA e inactivación/deleción de ! ! ! 51! INPP4B y/o PTEN; (4) presentan una importante actividad proliferativa, principalmente dirigida por la hiperactivación de FOX1M; (5) presentan de una gran similitud con los tumores de ovario del tipo seroso, incluyendo alta frecuencia de mutación de ATM y P53, alta expresión de AKT3 y MYC, inactivación de BRCA1, BRCA2 y RB1 y amplificación de la CCNE1; (6) presentan una alta inestabilidad genómica y (7) tienen una mayor presencia de hipometilación en comparación con otros tumores de mama. Por otra parte, el análisis del número de copias reveló distintas amplificaciones y deleciones. Las principales amplificaciones incluyen PIK3CA (49%), KRAS (32%), BRAF (30%), y EGFR (23%). Se observaron otras amplificaciones menos comunes en FGFR1, FGFR2, IGFR1, KIT, MET y PDGFRA. Las principales deleciones, como ya se ha citado, son en PTEN e INPP4B, promoviendo la activación de la vía PI3K (Cancer Genome Atlas Network et al., 2012) (Figura 5). Por otra parte, la vía de señalización Wnt/ß-catenina se encuentra muy activa en los tumores de mama TN y específicamente más activa en los tumores de pacientes africanas (King, Suto, & Li, 2012; Wend et al., 2013). Lindner y colaboradores describieron que en pacientes de raza africana estos tumores presentan más actividad de las vías de señalización relacionadas con factores de crecimiento, como IGF1 y VEGF (Lindner et al., 2013). Aunque está descrito que la señalización a través de IGF1 se encuentra aumentada en individuos obesos, lo cual no fue controlado en este estudio, y las mujeres africanas presentan un mayor índice de masa corporal que las caucásicas. De hecho, un estudio llevado a cabo en el estado de Carolina, estableció la relación entre obesidad y los tumores de mama TN (Carey et al., 2006). En otro estudio de 2016, se relacionó la activación de las vías que regulan CRIPTO1, Notch/CLS y Wnt/ßcatenina en CMC (células madre cancerosas) de mama con la adquisición de un fenotipo EMT y la formación de células iniciadoras de tumores de mama TN, las cuales presentan la capacidad para dirigir la progresión y la invasión tumoral (Rangel et al., 2016). Asimismo, Ben-Porath y colaboradores describieron que la expresión conjunta de los marcadores asociados a EMT y características stem, ! 52! NANOG/OCT4/SOX2 se encuentra directamente asociada con la presencia de tumores de TN de alto grado (Ben-Porath et al., 2008). Otros estudios también han puesto de manifiesto el marcado fenotipo mesenquimal de los tumores TN. Así, por ejemplo, recientemente se ha descrito la alta expresión nuclear de SNAIL2 y de TWIST y su correlación positiva con la expresión nuclear de VIM y negativa con la expresión de ECAD en membrana. Estos datos sugieren que EMT y la adquisición de un fenotipo stem, juegan un papel muy importante en el CMTN (S. Zhou et al., 2018). Por otro lado, se ha descrito que en CMTN la proporción de las poblaciones de CMC, tanto CD24-/CD44+ como ALDH+, está aumentada. Este aumento se postula como uno de los factores que pueden causar la resistencia a terapia en este tipo de tumores (Shima, Yamada, Ishikawa, & Endo, 2017). En un estudio reciente, se caracterizó transcripcionalmente la población (ALDH+/CD24-/CD44+) CMC. En esta población, con potencial tumorigénico y migratorio muy elevado (Ginestier et al., 2007), encontraron tres potenciales marcadores pronósticos (P4HA2, PTGR1 y RAB40B) que se relacionaban en las CMC con la capacidad de proliferación y formación de mamosferas y la capacidad proliferativa en líneas celulares de CMTN (M. Liu et al., 2018). Por otra parte, Wang y colaboradores, analizado por inmunohistoquímica biopsias de tejido de 145 pacientes con CMTN demostraron que las pacientes con marcaje CD24-/CD44+ presentaban un significativo peor pronóstico (H. Wang et al., 2017). En otra corte de 160 pacientes con CMTN también se asociaron niveles altos de CD44 con un mal pronóstico (Collina et al., 2015). ALDH1, otro marcador stem, fue estudiado mediante microarrays de tejido en una corte de 192 pacientes de Uganda y se detectó en un 48% de los tumores, presentando una correlación muy alta con el grado tumoral, reforzando la idea de la importancia de los marcadores stem en el CMTN (Nalwoga, Arnes, Wabinga, & Akslen, 2010). ! ! ! 53! ! Figura 5: Genes más frecuentemente mutados en CMTN. 1.1.2.4 Alteraciones moleculares durante el proceso de metástasis En relación al proceso de metástasis, Neophytou y colaboradores han descrito una serie de genes implicados en cada una de las etapas de proceso metastásico en pacientes con cáncer de mama y especialmente en CMTN (Figura 6). El proceso de intravasación, por el cual las células tumorales llegan a la circulación sanguínea tras liberarse del tumor primario, está dirigido por los principales reguladores de EMT como SLUG, SNAIL y TWIST. La vía de TGF-ß juega un papel crucial en esta etapa induciendo la sobre-expresión de MAFK y, por tanto, activando el proceso de EMT. A su vez el eje EMT-SMAD, en el que se encuentra implicado WAVE3, controla EMT mediante la regulación de la expresión de SLUG, SNAIL y TWIST o mediante el silenciamiento epigenético de genes epiteliales como CDH1. Por otra parte, la activación de CXCR4 vía CXCL12 o ANGTPL4 induce la activación de las vías reguladas por Mlk3 y Erk1/2, promoviendo la intravasación. Asimismo, se ha descrito que la expresión de supresores de metástasis como TP63, LIFR, LOXL4, FOXF2, SSBP1, RAB1B y TIEG1 inhiben dicho proceso de intravasación (Neophytou, Boutsikos, & Papageorgis, 2018). ! 54! ! ! Figura 6: Esquema del proceso de metástasis y principales genes implicados en cada una de las etapas. Adaptado de (Neophytou et al. 2018). Con autorización de CreativeCommons. Durante la etapa de supervivencia en circulación el receptor TRKB inhibe el proceso de anoikis mediante la vía de PI3K/Akt y también regula la interacción entre la célula tumoral y las células endoteliales mediante su activación BDNF dependiente. Por otra parte, se sabe que la unión de la célula tumoral a plaquetas es también importante para su supervivencia en circulación. En el proceso de extravasación se encuentran implicados muchos de los genes inductores del proceso de intravasación, ya que ambos procesos son considerados inversos. Durante el proceso de extravasación TGF-ß induce la expresión a ANTGPL4 a través de la vía de Smad. Los altos niveles de ANTGPL4 incrementan la retención de las células tumorales mediante la disrupción de las uniones entre células ! ! ! 55! endoteliales, facilitando de este modo el paso transendotelial de las mismas. Por otra parte, se ha descrito que otras moléculas como EREG, COX2, MMP1 y MMP2 promueven la extravasación pulmonar ya que tras su silenciamiento se elimina de forma casi completa la aparición de metástasis pulmonares. En cuanto al proceso de anidamiento a distancia es de gran importancia el restablecimiento del fenotipo epitelial, mediado en parte por la acción de miR-200 que inhibe la expresión de ZEB1 y SIP1, promoviendo de este modo la colonización metastásica. A su vez, las quimioquinas CXCL1/2 promueven las metástasis pulmonares mediante la atracción de células mieloides al área tumoral, produciendo el aumento de las proteínas de unión a calcio de bajo peso molecular S100A8/9, que promueven la superviviencia de las células tumorales mediante su unión a RAGE. Otra proteína de esta familia, S100A7, incrementa el ratio de crecimiento tumoral y la formación de metástasis, también mediante su unión a RAGE. Se ha descrito también que FGFR promueve la colonización metastásica pulmonar mediante la vía de PI3K/Akt. Es importante señalar, que aunque algunos de los genes se relacionan exclusivamente con la metástasis en CMTN, como por ejemplo TIEG1, MAFK y MLK3, la gran mayoría están también relacionados con otros tipos de tumores, sugiriendo su papel más fundamental en la progresión tumoral (Neophytou et al., 2018). 1.1.2.5 Alternativas terapéuticas Cuando los clínicos se enfrentan a un caso de CMTN, su actuación se ve limitada a la cirugía y a la administración de radioterapia y quimioterapia, a las cuales no responden todos las pacientes (Eralp et al., 2008; H. S. Kim, Lee, Lim, Kang, & Kim, 2011; Wysocki, Korski, Lamperska, Zaluski, & Mackiewicz, 2008). A continuación (Figura 7), se describen con más detalle las distintas opciones terapéuticas que existen en la actualidad para tratar a pacientes con CMTN: ! 56! ! Figura! 7:! Alternativas! terapéuticas! para! el! tratamiento! del! CMTN.! Adaptado! de! (Kalimutho!et!al.!2015).!Con autorización de CellPress. Cirugía: Se llevaron a cabo varios estudios para determinar si pacientes con CMTN se podrían beneficiar de la mastectomía en vez de la lumpectomía. Los resultados indicaron que, aunque el CMTN se asocia con una edad más joven y tumores de grado más alto, esto no afecta la elección del tratamiento quirúrgico ya que la tasa de recidiva local después de sufrir una cirugía conservadora de mama no es más alta en CMTN que en otros subtipos de cáncer de mama (Freedman, Anderson, Li, & Nicolaou, 2009). Radioterapia: Tradicionalmente, la radioterapia se administra en CMTN, tal y como hace en otros subtipos de cáncer de mama, después de la cirugía conservadora. Ya que los tumores de mama TN crecen rápidamente y son localmente agresivos, la cirugía conservadora seguida de radioterapia en etapa temprana, puede no ser equivalente a la mastectomía, como sucede en otros tipos de cáncer de mama (Panoff et al., 2011). Sin embargo, las mujeres con CMTN con ! ! ! 57! mutaciones en BRCA1 son potencialmente muy radiosensibles. En estas mujeres si la cirugía conservadora es seguida por radioterapia, la mama y el tejido circundante podrían erradicar los focos tumorales deficientes en BRCA1 y, por lo tanto, disminuir la posibilidad de una recidiva local (Abdulkarim et al., 2011). Quimioterapia: Los tumores de mama TN presentan una buena respuesta a quimioterapia en comparación con otros tipos de cáncer, pero su pronóstico sigue siendo peor ya que adquieren una rápida resistencia a tratamiento (Ismail-Khan & Bui, 2010). En estas pacientes se ha demostrado que la administración en adyuvancia de quimioterapia con dosis densa, administrando el tratamiento en un espacio corto de tiempo para conseguir una máxima muerte tumoral, da buenos resultados, aunque su beneficio en neoadyuvancia ha de ser estudiado con más detalle (Petrelli et al., 2015; Reinisch, Ataseven, & Kümmel, 2016). Es importante destacar que hoy en día la quimioterapia basada en taxanos y antraciclinas continúa siendo el tratamiento universal en neoadyuvancia y adyuvancia para todos los tipos de tumores de mama TN (Omarini et al., 2018), aunque también existen otras opciones de tratamiento. Por ejemplo, tumores TN BRCA mutados presentan alta sensibilidad a agentes que inducen daño en el ADN (Stefansson, Villanueva, Vidal, Martí, & Esteller, 2012), por lo que son buenos candidatos a tratamientos con platinos. Pero, a pesar de que el beneficio del tratamiento basado en platinos ha sido investigado en diferentes estudios en pacientes con tumores TN, el mejor agente, la mejor combinación y la mejor secuencia de administración basada en platinos siguen sin estar claros (X. Chen et al., 2014; Hurley et al., 2013; G von Minckwitz & Martin, 2012). Dentro de los taxanos que se utilizan en pacientes con CMTN están, por ejemplo, la doxorrubicina, el paclitaxel y el nab-paclitaxel (paclitaxel ligado a nanopartículas de albúmina). Existe evidencia del beneficio clínico del uso de nab-paclitaxel en sustitución de paclitaxel en pacientes con CMTN. En dos ensayos clínicos en fase III, en ! 64! Los carcinomas epiteliales derivan del epitelio de superficie que proviene del epitelio celómico o del epitelio endometrial ectópico. Estos carcinomas incluyen el adenocarcinoma seroso, el adenocarcinoma mucinoso, el adenocarcinoma endometrioide, el adenocarcinoma de células claras, el carcinoma de células transicionales (Brenner o no Brenner), el carcinoma mixto y el carcinoma indiferenciado. Los tumores malignos del estroma tienen como origen el estroma del ovario, que incluye los cordones sexuales que son los precursores del aparato endocrino del ovario postnatal. Estos tumores incluyen los tumores malignos de células de la granulosa-estroma, los tumores malignos de células de Sertoli-estroma, los tumores de células de Leydig y los tumores mixtos de los cordones sexualesestroma. Los tumores malignos de células germinales provienen de las células germinales que migran desde el saco vitelino y son pluripotenciales. Dentro de este grupo se incluye el disgerminoma, el carcinoma embrionario, el tumor de Yolk Sac, el teratoma inmaduro, el poliembrioma y los tumores mixtos de células germinales. Es importante destacar que los tumores epiteliales son los más comunes, representando más del 90-95% del total de los casos, siendo aproximadamente el 70-80% tumores serosos, de los cuales solamente un 25% son diagnosticados en estadios tempranos (Testa, Petrucci, Pasquini, Castelli, & Pelosi, 2018). Los tumores malignos del estroma y los tumores malignos de células germinales representan menos de un 10% del total de la malignidad ovárica (K.G. Manton, Igor Akushevich, 2009). 1.2.2 Epidemiología El cáncer de ovario, es el sexto tipo de cáncer más común en el mundo y la principal causa de muerte producida por tumores ginecológicos en Estados Unidos y Europa. Según datos de la Agencia ! ! ! 65! Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, los tumores de ovario representan el 4% de los nuevos diagnósticos de cáncer y son responsables del 4,3% de las muertes causadas por cáncer en mujeres a nivel mundial. Se estima que cada año se diagnostican 239.000 casos mundialmente, siendo diagnosticados la mayor parte en Europa central y del este (Ferlay et al., 2015). Por otra parte, los ratios de incidencia más bajos se encuentran entre las poblaciones asiática y africana (Cortez, Tudrej, Kujawa, & Lisowska, 2018; Testa et al., 2018). Es importante mencionar también que su incidencia media está bajando en las últimas décadas, pasando de 15 nuevos casos diagnosticados por cada 100.000 mujeres en el año 2000 a 11,5 casos en 2014 (Testa et al., 2018). La estima es que aproximadamente el 1,4% de las mujeres serán diagnosticadas de un cáncer de ovario en algún momento de sus vidas. Es importante comentar que existen ciertos factores que aumentan la posibilidad de padecer un tumor de ovario: • Edad. El riesgo de padecer cáncer de ovario aumenta con la edad, presentándose en la mayoría de los casos en mujeres de más de 63 años (Rooth, 2013). • Obesidad. Las mujeres con índice de masa corporal elevado presentan un mayor riesgo de padecer cáncer de ovario (Crane, Khulpateea, Alberts, Basen-Engquist, & Thomson, 2014). • Control de la natalidad. Las mujeres que han usado anticonceptivos orales presentan un menor riesgo de padecer cáncer de ovario (Crane et al., 2014). • Cirugía ginecológica. La ligadura tubárica y la histerectomía pueden reducir la posibilidad de padecer cáncer de ovario hasta en dos tercios (Rooth, 2013). • Medicamentos para la fertilidad. El uso de Clomifeno por más de un año, puede aumentar el riesgo de padecer tumores ! 66! ováricos (Gajjar, Ogden, Mujahid, & Razvi, 2012). • Antecedentes personales. Una mujer que ha tenido cáncer en una mama presenta un riesgo aumentado de presentar un tumor de ovario (Rooth, 2013). • Antecedentes familiares. El riesgo de padecer cáncer de ovario se ve aumentado si tienen algún pariente de primer grado o varios de segundo grado a los que se le ha diagnosticado cáncer de mama, ovario o colorrectal (Gajjar et al., 2012). • Predisposición genética: Principalmente las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 (Bane et al., 2013). • Factores del estilo de vida. Distintos factores como el peso elevado, la baja actividad física, la mala alimentación y el consumo excesivo de alcohol pueden contribuir al desarrollo de cáncer de ovario (Chaveepojnkamjorn et al., 2017). Si nos centramos en el carcinoma seroso de alto grado, factores tanto hormonales como reproductivos, se han relacionado con su patogénesis. Básicamente se proponen dos hipótesis: (1) “teoría de la ovulación incesante” que sostienen que un mayor número de ciclos ovulatorios incrementan el riego de desarrollar cáncer de ovario, debido al incremento del riesgo de la aparición de mutaciones somáticas en las células epiteliales del ovario; (2) “teoría de la gonadotropina” que atribuye a esta hormona una actividad a nivel molecular, que estimula la formación de tumores de ovario. Según estas hipótesis la menarquia temprana y la menopausia tardía incrementan el riesgo de padecer cáncer de ovario (Reid, Permuth, & Sellers, 2017). Por otro lado, como reflejo de la agresividad de este tumor es importante destacar que el número de muertes que causó en 2014 fue de 7,4 por cada 100.000 mujeres a nivel mundial. El subtipo con ! ! ! 67! mayor mortalidad es el carcinoma seroso de alto grado (Siegel, Miller, & Jemal, 2015). Aunque el porcentaje de supervivencia a 5 años es superior al 90% en pacientes diagnosticadas en estadio temprano, el 80% de las pacientes son diagnosticadas en estadios avanzados, bajando la supervivencia a 5 años al 73% en las pacientes con diseminación regional y a un 19% en las pacientes con metástasis a distancia. Por ello, la supervivencia a 5 años de la población general afectada con cáncer de ovario está en torno al 46,5%. En las pacientes que presentan recurrencia resistente a platinos tras la primera línea de tratamiento la supervivencia a cinco años es inferior al 30%. El bajo porcentaje de detección temprana está justificado por la falta de sintomatología evidente y la ausencia de métodos de monitorización o de diagnóstico temprano en mujeres sanas o en poblaciones de alto riesgo (Siegel et al., 2015). 1.2.3 Características moleculares El cáncer de ovario es una patología que presenta una gran heterogeneidad molecular (Figura 9). En los últimos años ha surgido un modelo dual para clasificar patológicamente los tumores en dos grupos, el tipo 1 y el tipo 2 (Kurman & Shih, 2016). Los tumores de Tipo 1 (10% del total) tienden a ser de bajo grado y causar poca sintomatología. Dentro de este primer tipo se encuentran los tumores serosos de bajo grado, los endometroides, los mucinosos, los de células claras y los tumores malignos de Brenner. Este tipo de tumores se caracterizan por la presencia de mutaciones en RAS, BRAF, HER2, CTNNB1, CDKN2A, PIK3CA, PTEN, y ARID1A y son genéticamente relativamente estables. Estas mutaciones se desarrollan en las primeras etapas de la evolución de la enfermedad y también se observan en tumores con bajo potencial de malignidad y en endometriosis, aunque hoy en día se puede realizar un estudio del desarrollo del tumor que permite diferenciar con claridad entre lesiones precursoras benignas y lesiones malignas (Kurman & Shih, 2016). ! 68! ! Figura 9: Subtipos de cáncer de ovario y alteraciones moleculares asociadas a cada uno de ellos. En cuanto a los tumores de Tipo 2, que comprenden los tumores serosos de alto grado, los tumores endometrioides de alto grado, los tumores mesodérmicos mixtos y los tumores indiferenciados, es importante destacar que son muy agresivos y de alto grado. Este tipo de tumores no presentan lesiones precursoras claras y están asociados con mucha frecuencia a mutaciones en P53 (el 97% de lo tumores serosos de alto grado portan mutaciones en P53), a la inactivación de BRCA (50% del total) y a una alta inestabilidad cromosómica. Por otra parte, suelen presentar mutaciones en RAS, RB1, PIK3CA y FOXM1 (Kurman & Shih, 2016). 1.2.4 Alteraciones moleculares durante el proceso de metástasis En cuanto al proceso de metástasis, está descrito que puede ocurrir de dos formas diferentes. La forma más común, conocida como diseminación transcelómica, se produce a través del fluido intraperitoneal y a través de líquido ascítico, diseminando hacia el peritoneo, los órganos peritoneales y preferencialmente hacia el omento, el cual representa la localización metastásica preferencial en ! ! ! 69! cáncer de ovario. Está descrito que la adhesión celular y la formación de metástasis se ve favorecida por la expresión de proteínas de la familia de las metaloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) principalmente MMP-2 y MMP-9, las cuales favorecen en proceso de adhesión celular y la formación de líquido ascítico mediante la expresión de VEGF. A su vez, está también descrito que el incremento en la expresión de ECAD favorece al proceso de adhesión celular. La proteína CXCL12 presente en el líquido ascítico se une a CXCR4 incrementando el potencial migratorio de las células tumorales y a su vez el líquido ascítico estimula la expresión de CD44 que tras su unión al ácido hialurónico facilita la migración y la adhesión celular (Yeung et al., 2015). La otra forma de diseminación es la hematógena/linfática, mediante la cual las células tumorales invaden los vasos sanguíneos o linfáticos, respectivamente, viajan a través de los mismos y finalmente llevan a cabo una extravasación generando metástasis a distancia. Debido a que se sabe que la diseminación transcelómica representa el mecanismo dominante en el proceso de metástasis en ovario, este tipo de diseminación y las CTCs han sido mucho menos estudiadas en cáncer de ovario (Yeung et al., 2015). McGrail y colaboradores describieron que en ambos tipos de diseminación las células sufren un proceso de EMT mediado por la vía de Rho/ROCK, el cual se considera un paso clave en el proceso de metástasis en cáncer de ovario (McGrail, Kieu, & Dawson, 2014). En este sentido es importante mencionar que tanto TGF-β, EGF, HGF y ET-1 inducen EMT en líneas celulares de cáncer de ovario. Asimismo niveles altos de factores que inducen EMT, como TWIST1 y ZEB1 se han asociado con una mayor invasividad y agresividad en líneas tumorales y pacientes con cáncer de ovario (D. Chen et al., 2013; Kajiyama et al., 2006; Vergara et al., 2010). Además, existen evidencias de la clara relación entre la aparición de un fenotipo mesenquimal en tumores de ovario y la adquisición de mecanismos de quimio-resistencia. Por ejemplo, se ha ! 70! descrito la expresión alta de TWIST, SNAIL, SLUG y VIM en líneas de cáncer de ovario resistentes a Cisplatino (Davidson et al., 2015; Haslehurst et al., 2012). Concordantemente, en muestras de ascitis de pacientes con cáncer de ovario seroso, la presencia de niveles altos de VIM y ZEB1 se asoció a una peor respuesta a quimioterapia (Beaufort et al., 2014). Éstos y otros resultados de estudios realizados in vitro con líneas celulares y en distintas cohortes de pacientes, demuestran el importante papel del proceso de EMT para la progresión de los tumores de ovario.! 1.2.5 Alternativas terapéuticas Cuando los clínicos se enfrentan a un caso de cáncer de ovario, la práctica de cirugía y la posterior administración de quimioterapia, sigue siendo la base del tratamiento para este tipo de pacientes (Cortez et al., 2018). Cirugía: Como hemos comentado, la base del tratamiento del cáncer de ovario sigue siendo la cirugía (citorreducción primaria óptima), seguida, según se requiera, de quimioterapia adyuvante basada en platinos y taxanos (“NIH consensus conference. Ovarian cancer. Screening, treatment, and follow-up. NIH Consensus Development Panel on Ovarian Cancer.,” 1995). La citorreducción primaria, es el principal tipo de cirugía que se lleva a cabo en este tipo de pacientes, pero existen otras modalidades que se pueden llevar a cabo durante las distintas etapas del curso de la enfermedad como son la cirugía citorreductora de intervalo, la cirugía de segunda mirada, la cirugía citorreductora secundaria y la cirugía paliativa (Caprotti et al., 2006; Eisenkop, Friedman, & Spirtos, 2000; Mangili et al., 2005; Vergote, van Gorp, Amant, Neven, & Berteloot, 2005). Quimioterapia: La mejora de las tasas de supervivencia en pacientes con tumores de ovario observadas se debe principalmente, a la introducción en las décadas de los ochenta y noventa de la quimioterapia basada en platinos y en taxanos. ! ! ! 71! -Neoadyuvancia: La quimioterapia neoadyuvante basada en platinos es la que se utiliza como primera opción de tratamiento, previo a la cirugía. Cuando no se puede practicar una citorreducción primaria óptima (70% de cánceres avanzados), la quimioterapia neoadyuvante permite conseguir la realización de la cirugía óptima en una proporción elevada de mujeres que en un principio se desestiman para esta la intervención (Cortez et al., 2018; Hegazy et al., 2005). Es importante destacar que dos ensayos clínicos aleatorios realizados en Europa publicados en 2003, demostraron que la quimioterapia neoadyuvante basada en platinos, se encuentra asociada a una mayor supervivencia total en aquellas pacientes de riesgo elevado y con una etapa temprana de la enfermedad (Trimbos et al., 2003; Young, 2003). -Adyuvancia: El tratamiento clásico en primera línea de cáncer de ovario consiste en la administración de seis ciclos de quimioterapia basada en platinos y taxanos (Bookman, 2005; du Bois et al., 2005). No obstante, la quimioterapia estándar con platinos y taxanos sólo cura alrededor de 25% de los casos de carcinoma ovárico avanzado. Así diversos estudios en marcha tratan de averiguar la eficacia de secuencias de administración diferentes (administración secuencial, semanal, mantenimiento) o de la suma de un tercer fármaco (en formas de dobletes secuenciales o tripletes) al esquema carboplatino y paclitaxel. Hasta la fecha no se tiene suficiente información para recomendar alguno de los nuevos regímenes con dos o tres fármacos, por encima de la combinación de carboplatino y paclitaxel como tratamiento de primera línea (Poveda, 2005). -Quimioterapia intraperitoneal: La vía de administración intraperitoneal de quimioterapia consiste en introducir fármacos citotóxicos mediante un catéter insertado en la cavidad peritoneal, con el fin de minimizar los efectos secundarios sistémicos, pudiendo así aumentar la dosis del citotóxico en contacto con el tumor. Este tipo de administración ha proporcionado datos de mejora de supervivencia (Armstrong et al., 2006) aunque su eficacia debe ser confirmada de forma inequívoca en ensayos clínicos en fase III (Cortez et al., 2018). ! 72! Terapias dirigidas e inmunoterapia: Fármacos dirigidos contra varios objetivos moleculares, han sido desarrollados y están siendo objeto de estudio para el tratamiento de este tipo de pacientes con la intención de mejorar su supervivencia (Duncan et al., 2008; Leffers et al., 2009; Mendelsohn, 2002; S. Yu et al., 2008). De entre ellos cabe destacar, de forma particular, la efectividad de los Inhibidores de PARP (Cortez et al., 2018; Leffers et al., 2009). Las proteínas PARP1 y PARP2 juegan un papel crucial en la reparación de las roturas en el ADN de cadena simple. En tumores con BRCA mutado el tratamiento con este tipo de fármacos lleva a un daño masivo del ADN y la consiguiente muerte celular (Yap, Sandhu, Carden, & de Bono, 2018). Tanto el olaparib, como el niraparib, se han aceptado recientemente como estándar de tratamiento en pacientes con cáncer de ovario recurrente BRCA mutado. Por otra parte, se ha visto que el olaparib aumenta de forma significativa la SLP en pacientes con cáncer de ovario recurrente con sensibilidad a platinos, independientemente del estado mutacional de BRCA. El niraparib mostró los mismos resultados, lo cual sugiere que aunque la eficacia de ambos es mayor en pacientes BRCA mutados, también puede beneficiar a otro tipo de pacientes (Papa, Caruso, Strudel, Tomao, & Tomao, 2016). Por otro lado, la activación de la respuesta inmune mediante el empleo de anticuerpos anti-PD1 (pembrolizumab o nivolumab) o anti-PD-L1 (atezolizumab y durvalumab) no ha demostrado mucha actividad en cáncer de ovario ya que solo alcanzan respuestas en torno al 10% y en la mayoría de los casos de corta duración (Iwai, Hamanishi, Chamoto, & Honjo, 2017). Desafortunadamente, el uso de inhibidores de EGFR (erlotinib, cetuximab y lapatinib) tampoco ha mostrado buenos resultados en los ensayos clínicos llevados a cabo en pacientes con cáncer de ovario (Cortez et al., 2018). Sin embargo, si se han obtenido beneficios clínicos utilizando anti-angiogénicos como el bevacizumab. Este fármaco es un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado que se une a VEGFR para bloquear su actividad, produciendo la normalización de la vasculatura tumoral y ! ! ! 73! reduciendo la presión intersticial del tumor, mejorando de esta forma, la efectividad de la terapia convencional. Sin embargo, el elevado precio del fármaco y la falta de marcadores predictivos de respuesta al mismo, dificultan su implementación en la mayoría de sistemas nacionales de salud (Cortez et al., 2018). También cabe mencionar que se encuentran en marcha ensayos clínicos para testar la acción de inhibidores del receptor de VEGF como, el ceridanib, el pazopanib y el nintedanib y de un inhibidor de angiopoyetina denominado trebananib. Por último, es importante comentar que se han identificado nuevas dianas para el desarrollo de fármacos tales como CTLA-4, P53, la señalización del ácido lisofosfatídico, y las proteínas de la familia BCL-2 (Duncan et al., 2008), pero aún no se utiliza en clínica ninguna terapia frente a estas dianas. 1.2.6 Retos para el manejo clínico del cáncer de ovario Debido a que la gran mayoría de las pacientes con este tipo de tumores son diagnosticadas en estadios avanzados, el cáncer de ovario sigue siendo el tumor ginecológico que más muertes causa. Por ello, es de gran importancia el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento y detección temprana para este tipo de tumores. La ultrasonografía transvaginal y el CA-125 son los métodos más comunes para la detección de cáncer de ovario, pero a pesar de esto siguen sin existir marcadores con una alta sensibilidad para el diagnóstico temprano de la enfermedad (Muinao et al., 2018). El CA-125 es el marcador serológico más estudiado para la detección de tumores de ovario de origen epitelial. Una concentración serológica de CA-125 superior a 35 U/ml es indicativa de una potencial patología. Su especificidad y sensibilidad rondan el 90% y el 60% respectivamente en estadios tempranos, mientras que, en estadios avanzados, la sensibilidad alcanza el 80-90% (Rein et al., 2011). La principal limitación de este marcador es su ausencia en un 20% de los tumores de ovario y por otra parte su elevación en otras ! 80! circulación, extravasar en órganos distantes generando nuevas localizaciones metastásicas. Adaptado de (Valastyan et al. 2011). Con autorización de Cell Press. Durante el proceso tumorigénico, una subpoblación tumoral puede adquirir un fenotipo migratorio e invasivo, que le proporciona capacidad de intravasar a la circulación sanguínea y/o linfática. Este proceso de intravasación se ve favorecido por las propiedades de los vasos sanguíneos asociados al tumor, que se forman mediante el proceso de neoangiogénesis. Algunas de estas propiedades, diferenciales con respecto a la vasculatura normal, se ven influenciadas en parte, por la acción de VEGF. Principalmente podemos hablar de una vasculatura tortuosa, con una interacción muy débil entre células endoteliales adyacentes y la ausencia de una cobertura de pericitos, características que favorecen la intravasación (Carmeliet & Jain, 2011). En circulación estas células se ven sometidas a un alto estrés mecánico, a señales de anoikis y al ataque de las células inmunes en el sistema circulatorio. A pesar de ello, algunas de son capaces de sobrevivir y alcanzar órganos distantes en un estado de viabilidad y de este modo, formar lesiones metastásicas. Un gran número de estudios, tanto prospectivos como retrospectivos, han demostrado la asociación entre niveles elevados de CTCs y el mal pronóstico en pacientes con distintos tipos de cáncer, así como su valor para la monitorización temprana de la respuesta a terapia (Castro-Giner, Scheidmann, & Aceto, 2018; Pantel & Speicher, 2016). Por otra parte, la caracterización de las CTCs constituye una herramienta de incalculable valor para la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la formación de las lesiones metastásicas (Fehm et al., 2009). Además, la expansión in vitro/vivo de CTCs permite llevar a cabo ensayos funcionales, que facilitan su caracterización fenotípica (proliferación, invasividad, etc) y también el estudio de su respuesta frente a determinados fármacos (M. Yu et al., 2014), constituyendo un modelo pre-clínico único. ! ! ! 81! Tabla 2: Principales características del proceso de diseminación metastásica. 1.3.1 Técnicas de aislamiento y caracterización de CTCs La presencia de células tumorales diseminadas en sangre fue ya descrita en 1869 por el médico Thomas Ashworth en pacientes con cáncer de mama (Haber & Velculescu, 2014), aunque hasta finales del siglo XX no se disponía de tecnología para su estudio. Actualmente, el estudio de las CTCs encuentra su limitación principal en el bajo número de este tipo de células en circulación, que dificulta su aislamiento entre el resto de los componentes de la sangre. Se estima que hay una CTC por cada 106-108 células sanguíneas en pacientes metastásicos (Coumans, Ligthart, Uhr, & Terstappen, 2012; Joosse, Gorges, & Pantel, 2015). Debido a esta limitación es necesario su enriquecimiento para hacer posible su posterior estudio. Existen diferentes tecnologías para el aislamiento de CTCs basadas en distintas propiedades de las mismas. Algunas de estas tecnologías están basadas en propiedades físicas como el tamaño, densidad, deformabilidad o carga dieléctrica. Estos métodos incluyen estrategias de centrifugación en gradientes o de filtración. Otras se basan en propiedades biológicas como la expresión específica de proteínas de membrana celular, como EpCAM, o la viabilidad e invasividad de las CTCs, que las diferencia de las células sanguíneas (Gabriel, Calleja, Chalopin, Ory, & Heymann, 2016; Joosse et al., 2015) (Figura 11). ! 82! Los principales métodos de aislamiento, basados en propiedades físicas, son: los sistemas de filtración como MetaCell® o ISET®; la centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll® o similares y los sistemas de microfluídica como el Parsortix® o el DFFchip®. Todos ellos utilizan el mayor tamaño de las CTCs frente a las células sanguíneas para aislarlas. Existen otras tecnologías, pertenecientes a diferentes casas comerciales, con pequeñas variaciones, pero en esencia muy similares a las ya mencionadas (Joosse et al., 2015). Los principales métodos de aislamiento de CTCs basados en propiedades biológicas son: el CellSearch®, que se basa en la separación mediante ferrofluídos unidos a anticuerpos anti-EpCAM; Dynabeads® o AdnaTest® que se basan en el uso de partículas inmunomagnéticas unidas a anticuerpos anti-EpCAM; CellCollectorTM que se basa en el uso de un filamento recubierto con anticuerpos anti-EpCAM y que se introduce en una vía tomada al paciente para capturar las CTCs in vivo; CTC-Chip® o HB-Chip® basados en el uso de canales de microfluídica recubiertos con anticuerpos anti-EpCAM; Isoflux® basado en el uso de un canal imantado y partículas inmunomagnéticas unidas a anticuerpos antiEpCAM; MACS® o EasySep® basado en depleción negativa de células sanguíneas y VitaAssayTM, que se basa en diferencias en capacidad invasiva de las células aisladas (Joosse et al., 2015). También se pueden combinar las dos estrategias, tal y como sucede con el CTC-iChip® que enriquece las células por tamaño y posteriormente lleva a cabo un segundo enriquecimiento mediante selección EpCAM positiva o la depleción negativa de células sanguíneas (Joosse et al., 2015). Es importante destacar que la tecnología CellSearch® (Menarini-Silicon Biosystems) es la única aprobada por la Food & Drug Adminitration (FDA) para el contaje de CTCs con objetivos clínicos en tumores metastásicos de mama, próstata y colon. Este sistema permite enumerar las CTCs EpCAM positivas combinando ! ! ! 83! una estrategia de inmunoaislamiento e inmudetección. Para el aislamiento utiliza partículas magnéticas funcionalizadas con anticuerpos anti-EpCAM. Posteriormente el sistema lleva a cabo una inmunofluorescencia en las células aisladas, utilizando anticuerpos frente a un panel de citoqueratinas epiteliales (CK8, CK18 y CK19), CD45 (marcador de células sanguíneas) para descartar el aislamiento inespecífico y DAPI para identificar el núcleo celular (L. Wang et al., 2016). Una de las limitaciones de esta tecnología radica en la utilización única de marcadores epiteliales para el aislamiento y la identificación de las CTCs. Es importante resaltar que las CTCs son heterogéneas en cuanto a la expresión de EpCAM, ya que durante el proceso de EMT pueden perder la expresión de este marcador epitelial, evidenciando la limitación de este marcador como única diana para su inmunoaislamiento (Grover, Cummins, Price, RobertsThomson, & Hardingham, 2014). Una vez la muestra ha sido enriquecida, contamos con diferentes metodologías para el estudio y caracterización de las CTCs. Entre las que se encuentran principalmente técnicas de análisis de ADN y ARN basadas en PCR, hibridación y secuenciación y ensayos funcionales con el fin de realizar un análisis fenotípico de las CTCs (Y. Song et al., 2017). En este sentido es importante comentar que en los últimos años se han desarrollado tecnologías como DEPArray® (Menarini-Silicon Biosystems) o el VyCAP, destinadas a la obtención de células individualizadas permitiendo una caracterización célula a célula para, de este modo, tener una visión más precisa de la heterogeneidad tumoral (Mesquita et al., 2017; Peeters et al., 2013). Como ejemplo, podemos mencionar un estudio de 2017 en el que se ha llevado a cabo el aislamiento de CTCs en cáncer de mama asociadas a metástasis cerebrales mediante el uso de citometría de flujo la tecnología DEPArrayTM y su caracterización mediante secuenciación de genoma completo (Boral et al., 2017). ! 84! ! ! Figura 11: Esquema de los principales métodos de aislamiento de CTCs, dependientes e independientes de antígeno de superficie. Adaptado de (Joosse et al. 2015). Con autorización de EMBO press. ! ! ! ! 85! En cuanto a su estudio funcional y también molecular, la generación de cultivos in vitro de CTCs es muy importante para poder contar con una mayor cantidad de células para analizar. A pesar de su gran interés, el cultivo de CTCs ha demostrado ser muy poco eficiente ya que requiere del uso de muestras de pacientes con una gran carga tumoral y se necesita una gran eficiencia de aislamiento para obtener un número suficiente que permita establecer el cultivo. Por otra parte, está la escasa viabilidad de las CTCs tras su aislamiento, relacionada entre otros motivos, al estado quiescente al que pasan las mismas cuando se encuentran en circulación. Debido a esto, solamente existen unas pocas evidencias de cultivos establecidos a partir de CTCs (Pantel, Klaus; Alix-panabières, 2015; M. Yu et al., 2014; L. Zhang et al., 2013). Asimismo, cabe mencionar que también se han conseguido establecer explantes derivados de CTCs (CDx) en modelos animales (Hodgkinson et al., 2014; Pereira-Veiga et al., 2018). 1.3.2 Transición epitelio mesénquima y CTCs La diseminación tumoral hematógena/linfática puede ocurrir de dos formas, de una forma pasiva y de una forma activa. Las células que intravasan de forma pasiva, mediante el crecimiento tumoral expansivo, mantienen con frecuencia la expresión de sus marcadores epiteliales como ECAD, EpCAM o CKs y presentan menor agresividad. Por otra parte, las células que intravasan de forma activa adquieren un fenotipo mesenquimal y de célula madre presentando una mayor agresividad y una mayor capacidad migratoria, invasiva y de autorrenovación. Esto ocurre mediante el proceso de EMT. Mediante este proceso, las células epiteliales pierden su polaridad, expresan marcadores mesenquimales y de célula madre, pierden los contactos célula-célula, sufren una remodelación del citoesqueleto y presentan de este modo un fenotipo migratorio que favorece a la progresión tumoral (Barriere et al., 2014; Polyak & Weinberg, 2009) (Figura 12). Se ha descrito en CTCs la expresión combinada de marcadores mesenquimales, de célula madre y epiteliales, evidenciando un ! 86! fenotipo mixto o intermedio. Esta expresión de marcadores mesenquimales y de célula madre en las CTC favorece ciertos procesos clave para la diseminación tumores como son la intravasación y la extravasación, la supervivencia en el torrente sanguíneo y la adquisición de resistencia frente a diversos agentes antitumorales. En CTCs de cáncer de endometrio, por ejemplo, se ha descrito la expresión conjunta del marcador epitelial EPCAM junto con la expresión de los marcadores de EMT ETV5, NOTCH1, SNAIL1, TGFß, ZEB1 y ZEB2 y los marcadores asociados a características de célula madre ALDH y CD44 (Alonso-alconada et al., 2014). Por otra parte, también se ha observado la expresión de marcadores asociados a EMT como TIMP1 o TGFß en la población de CTCs EpCAM positiva de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (Barbazán et al., 2012; Bonnomet et al., 2010; Kölbl, Jeschke, & Andergassen, 2016). ! ! Figura 12: Esquema del proceso de diseminación hematógena tumoral y los principales marcadores implicados en el proceso de EMT. En rojo se muestran los marcadores cuya expresión baja durante el proceso y en verde aquellos cuya expresión se ve aumentada durante el mismo. Adaptado de (Joosse et al. 2015). Con autorización de EMBO press. 1.3.3 CTCs en tumores de mama triple negativo Está descrito que los niveles de CTCs en pacientes con CMTN se encuentran correlacionados con el estadio tumoral de la ! ! ! 87! clasificación TNM y con la presencia de metástasis ganglionares. La monitorización dinámica de dichos niveles, tanto previos como posteriores a cirugía y la administración de terapia, pueden ser un parámetro a tener en cuenta debido a su alto valor para evaluar el pronóstico de las pacientes (Y. Zhang, Lv, Niu, Su, & Feng, 2017). En un meta-análisis llevado a cabo por Lu y colaboradores se evidenció que la detección de CTCs en sangre era un factor predictivo de mal pronóstico en pacientes con CMTN, independientemente de que las mismas sean detectadas en estadios tempranos o metastásicos. En este estudio, remarcaron la importancia de establecer métodos estándar universalmente aceptados para la detección de CTCs con el fin de poder monitorizar sus niveles y, de este modo, guiar el manejo clínico de este tipo de pacientes (Lu et al., 2016). Por otra parte, en un estudio llevado a cabo dentro del ensayo clínico Geparquattro, Riethdorf y colaboradores demostraron que la positividad para CTCs en pacientes con CMTN analizada mediante CellSearch® se asociaba a una reducción tanto en SLP como en SG (Riethdorf et al., 2017). Por otra parte, dentro del ensayo clínico JO21095, Iwata y colaboradores describieron que las pacientes con CMTN metastásico con positividad para CTCs analizadas mediante CellSearch® presentaban un significativo peor pronóstico clínico que las pacientes en las que no se detectaron CTCs (Iwata et al., 2017). Para caracterizar mejor la relevancia de P53 en el proceso de metástasis Powell y calaboradores desarrollaron un modelo murino inyectando líneas celulares derivadas de tumores de pacientes con CMTN y sus correspondientes líneas con deficiencia en P53. En este modelo observaron que el número de CTCs correlacionaba con el volumen tumoral y con la presencia de metástasis pulmonares. Por otra parte, el estado de P53 no presentó influencia sobre el grado de liberación de CTCs ni sobre la aparición de metástasis ganglionares o pulmonares. Sin embargo, sí observaron que las CTCs liberadas por los tumores generados a partir de las líneas con deficiencia en P53 producían lesiones metastásicas con un mayor ratio de proliferación (Powell et al., 2016). ! 88! Por otra parte, en un estudio llevado a cabo mediante CellSearch®, Jansson y colaboradores describieron la presencia de agrupaciones o clusters de CTCs de forma más frecuente en pacientes con CMTN en comparación con las pacientes con receptores de hormonales positivos. La aparición de estos clusters estaría en consonancia con la mayor agresividad de los tumores TN ya que en distintos estudios se ha demostrado que la diseminación colectiva es más eficiente que la individual (Jansson, Bendahl, Larsson, Aaltonen, & Rydén, 2016). Además del valor pronóstico de la monitorización de CTCs en pacientes con CMTN, recientes trabajos se han centrado en su caracterización molecular. Uno de estos estudios se centró en el análisis de expresión de cinco marcadores: CKs (8, 18 y 19), ER, PR, EGFR y HER2. Dentro de las poblaciones analizadas, la más frecuente fue la formada por las CTCs que expresaban conjuntamente CKs y EGFR. Esta población representó el 40-50% de las CTCs estudiadas, predominando claramente entre las demás poblaciones, tanto en un análisis previo a terapia como en un análisis posterior. Esta observación concuerda con la ya descrita alta expresión de EGFR en tumores primarios TN y sugiere un posible beneficio del uso de terapias anti-EGFR en este tipo de pacientes (Agelaki et al., 2017; Siziopikou & Cobleigh, 2007). Otro dato interesante es la mayor tasa de recaída que presentaron las pacientes con CTCs positivas para CKs y negativas para ER (Agelaki et al., 2017). Por otra parte, también observaron intervalos de SLP y SG significativamente más cortos en pacientes con CTCs positivas para CK y negativas para PR. Estos datos, sugieren que la ausencia de expresión de receptores hormonales en CTCs es un factor que indica peor pronóstico en pacientes con CMTN (Agelaki et al., 2017). Curiosamente, tras la administración de quimioterapia, la frecuencia de CTCs positivas para HER2 se vió reducida, mientras que esto no ocurrió en las CTCs que expresaban PR o ER. Esta observación, sugiere una eficacia diferencial de la quimioterapia para eliminar las distintas subpoblaciones de CTCs (Agelaki et al., 2017). ! ! ! 89! Por otra parte, está descrita la alta expresión de marcadores EMT y de célula madre en las CTCs de este tipo de pacientes, dando lugar a fenotipos altamente resistentes a la quimioterapia convencional. Por estos motivos es de gran importancia contar con nuevos agentes terapéuticos con el fin de eliminar estas CTCs quimio-resistentes (Aktas et al., 2009; Kallergi et al., 2011; Kasimir-Bauer et al., 2016; Kasimir-Bauer, Hoffmann, Wallwiener, Kimmig, & Fehm, 2012; Papadaki et al., 2014). Por otra parte, es importante remarcar que la presencia de CTC positivas para CKs y para HER2 en pacientes con CMTN metastásico, se encontró significativamente incrementado en comparación con pacientes con estadios tempranos. Este hallazgo sugiere que esta subpoblación celular presenta una mayor agresividad y predomina durante la evolución de la enfermedad en pacientes con tumores TN y que por lo tanto sería indicado el uso de terapia dirigidas para la eliminación dicha subpoblación celular (Agelaki et al., 2015; Georgoulias et al., 2012). En otro estudio, Bulfoni y colaboradores describieron la presencia de una subpoblación celular de CTCs que no expresaba marcadores epiteliales ni mesenquimales y que se encontraba significativamente aumentada en pacientes con CMTN (Bulfoni et al., 2016). Asimismo, Balacescu y colaboradores describieron que en la fracción de linfocitos de pacientes con CMTN se puede observar un enriquecimiento en vías de señalización relacionadas con inmunidad. Este enriquecimiento correlaciona con la inflamación y la necrosis en el tumor primario, sugiriendo la posibilidad de utilizar la inmunoterapia en combinación con la quimioterapia con el fin de mejorar pronóstico de este tipo de pacientes (Balacescu et al., 2016). Finalmente, es importante destacar que en un estudio recientemente publicado por nuestro grupo de investigación y directamente vinculado al trabajo de la presente tesis doctoral, hemos conseguido generar por primera vez un CDx a partir de CTCs aisladas de una paciente con CMTN con alta carga tumoral. La ! 96! ! ! ! 97! 2-OBJETIVOS A pesar de la continua evolución de las técnicas de prevención, diagnóstico y tratamiento, los tumores de mama y ovario siguen estando entre los que afectan a mujeres con mayor prevalencia en el caso de mama y con mayor agresividad en el caso de ovario. Clásicamente para avanzar en la comprensión de la biología de este tipo de tumores los estudios se han basado en la caracterización del tumor primario. Sin embargo, hay un paso clave en la progresión tumoral, la presencia de CTCs en sangre, que hasta la fecha no ha sido suficientemente estudiado. El proceso mediante el cual las células tumorales abandonan el tumor primario, intravasan a los vasos sanguíneos y luego son capaces de extravasar a órganos diana y formar metástasis presenta aún muchas incógnitas. Se sabe que para que las células tumorales se desprendan del tumor primario y formen nuevos focos tumorales epiteliales han de sufrir el fenómeno de EMT para que pierdan sus propiedades de adherencia y adquieran un fenotipo más migratorio. Al mismo tiempo, se produce un aumento en la actividad catalítica de distintas proteasas que degradan la matriz extracelular y facilitan la migración de las células tumorales. Una vez en sangre, estas células tienen que ser capaces de sobrevivir e implantarse en un nuevo tejido para lo que se cree que es necesario el proceso de transición mesénquima-epitelio (MET). En este contexto, el aislamiento y caracterización de CTCs de sangre de pacientes, presenta un gran potencial para comprender mejor la biología de estos tumores y para encontrar nuevas herramientas moleculares que ayuden a los clínicos a establecer terapias más dirigidas y eficaces. Por todo ello, el presente trabajo se desarrolló con el objetivo de comprender mejor los mecanismos moleculares que permiten la progresión de estos dos tipos de tumores a través del estudio de las CTCs, principales responsables del proceso de diseminación, para identificar nuevos marcadores tumorales y potenciales dianas ! 98! terapéuticas. Para ello se plantearon los siguientes objetivos secundarios: 1Analizar los niveles de CTCs en pacientes con CMTN y cáncer de ovario avanzado para determinar su valor como marcador pronóstico. 2Caracterizar a nivel molecular la población de CTCs de pacientes con CMTN y de ovario avanzado, prestando especial atención a genes implicados en plasticidad celular, con el objetivo de identificar marcadores pronóstico y moléculas clave para el proceso de diseminación y progresión tumoral. 3Validar el papel en el proceso de carcinogénesis y diseminación tumoral de los candidatos identificados en el estudio transcriptómico de las CTCs de ambos tipos tumorales mediante la utilización de modelos de estudio in vitro e in vivo. 4Comparar el perfil génico diferencial de las CTCs y tejido primario y/o metastásico de pacientes con CMTN para identificar alteraciones genéticas asociadas al proceso de diseminación tumoral y describir el grado de heterogeneidad molecular que presenta la población de CTCs. ! ! ! 99! MATERIALES Y MÉTODOS ! 100! ! ! ! 101! 3-MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 COHORTES DE PARTICIPANTES INCLUÍDAS EN EL ESTUDIO Para la realización del presente estudio se utilizaron dos cohortes de pacientes. Una en la que se incluyeron pacientes con CMTN y otra en la que se incluyeron pacientes con cáncer de ovario. En la cohorte de CMTN se incluyeron un total de 32 pacientes diagnosticadas con CMTN en estadios III y IV tratadas en el Servicio de Oncología del Hospital Universitario de Santiago de Compostela (Santiago de Compostela) en el MD-Anderson Cancer Center (Madrid, España) y en el Instituto Catalán de Oncología (Barcelona), cuyas características principales se describen en la Tabla 3. Paralelamente también se incluyeron 30 mujeres sanas con edad similar a la cohorte de las pacientes como controles. ! ! ! 102! Tabla 3: Características clínico-patológicas de las pacientes incluidas en la cohorte de CMTN. En el estudio de cáncer de ovario, se incluyeron 38 pacientes diagnosticadas con cáncer de ovario avanzado en el MD-Anderson Cancer Center (Madrid) de acuerdo con la clasificación de la FIGO. Es importante mencionar que 25 de las pacientes se incluyeron a diagnóstico y 11 a recurrencia (Tabla 4). En esta cohorte también se incluyeron 20 mujeres sanas como controles. ! ! ! 103! Tabla 4: Características clínico-patológicas de las pacientes incluidas en el estudio de cáncer de ovario. En el caso del estudio de CMTN los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación de Galicia (2013/462), mientras que en el caso del estudio de cáncer de ovario, las muestras fueron obtenidas a través del biobanco de la Fundación ! 104! MD-Anderson (B.0000745, registro nacional de biobancos ISCIII). Para la cesión de las mismas se contó con el consentimiento informado de las pacientes, y su análisis fue aprobado por el Comité Ético y Científico de la institución siguiendo los procedimientos establecidos en la ley actual de Investigación Orgánica Biomédica de 14 de julio 2007 y en el Real Decreto de Biobancos 1716/2011, en este caso, todos los datos se basan en información anónima. Es importante mencionar que todas las pacientes y mujeres sanas incluidas en las dos cohortes firmaron el pertinente consentimiento informado. A su vez, contamos con una aprobación general del Comité Ético de Investigación de Galicia (2017/538) para la identificación de marcadores de diagnóstico, pronóstico y seguimiento mediante el análisis de biopsia líquida en pacientes con cáncer, que nos permite el análisis de distintos tipos de muestras recibidas de otros centros, como en este caso el MD-Anderson. 3.2 MODELOS CELULARES 3.2.1 Cultivo de células tumorales humanas de cáncer de mama y ovario Los estudios funcionales del presente trabajo se han llevado a cabo utilizando dos líneas tumorales modelo para CMTN y cáncer de ovario, las MDA-MB 231 y las SKOV3, respectivamente (Anglesio et al., 2013; K. Liu et al., 2019). Las MDA-MB 231 proceden de la ATCC (HTB-26) y derivan de un adenocarcinoma primario de mama ER, PR, y HER2 negativo. Esta línea presenta una aneuploidía con contaje cromosómico triploide y se caracteriza por la ausencia de los cromosomas normales 8 y 15. Para llevar a cabo los distintos ensayos la línea celular se mantuvo en cultivo a 37ºC en atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se cultivó en medio DMEM (Lonza, Verviers, Bélgica) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS; Gibco, South America) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, USA). ! ! ! 105! La línea SKOV-3, procedente también de la ATCC (HTB-77), deriva de ascitis de una paciente con adenocarcinoma de ovario. Se caracteriza por su hipodiploidía presentando únicamente 43 cromosomas. Esta línea celular se mantuvo a 37ºC en atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se cultivó en medio McCoy’s 5A (Gibco, Grand Island, NY, USA) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS; Gibco, South America) y un 1% de penicilinaestreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, USA). 3.2.2 Silenciamiento de TIMP-1 mediante shARN Con el objetivo de bloquear la expresión de TIMP-1 en las líneas celulares MDA-MB 231 y SKOV-3 se utilizaron partículas lentivirales que contienen constructos comerciales dirigidos a bloquear la traducción del ARNm que da lugar a la proteína (Mission Lentiviral Transduction Particles, Sigma, St. Louis, MO, USA). Se utilizaron 4 shARNs diferentes (Tabla 5), siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y una concentración final de Polibrene (Hexadimetilbromide; Sigma) de 8 µg/ml. A su vez se utilizaron como control partículas comerciales que contienen un shARN dirigido frente a una secuencia no presente en mamíferos (Mission Non-Mammalian shARN Control Transduction Particles, Sigma, St. Louis, MO, USA). Las líneas se seleccionaron en presencia de puromicina (5 µg/ml). Las líneas silenciadas se nombraron en ambas líneas (MDA-MB 231 y la SKOV-3) como shTIMP1_1, shTIMP1_2, shTIMP1_3 y shTIMP1_4 mientras que la línea control se denominó PLKO. La eficacia del silenciamiento fue comprobada mediante RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa, cuantitativa a tiempo real) y Western Blot (WB). Por otra parte, la línea celular parental MDA-MB 231 fue infectada con partículas virales para inducir en ella la expresión estable de GFP y luciferasa (Lentiviral Particles for Firefly Luciferase, GeneCopoeia, Maryland, USA) (Tabla 5) para su uso en los ensayos ! 112! y personal experimentado seleccionó las CTCs de acuerdo al siguiente criterio: morfología redondeada, ≥ 4 µm, nucleadas (DAPI+), negatividad para el marcaje con CD45 y positividad para el marcaje con CKs. 3.4.3 Aislamiento y recuperación de células puras mediante la tecnología DEPArray Las CTCs de las pacientes se aislaron y se cuantificaron mediante la tecnología CellSearchTM (Menarini, Silicon Biosystems, Bolonia, Italia) a partir de muestras de sangre periférica, estos aislamientos se llevaron a cabo en colaboración con la Fundación Pública de Medicina Xenómica de Santiago de Compostela y con el Istituto Nazionale dei Tumori de Milán. En las pacientes con >10 CTCs la fracción enriquecida fue almacenadas en los cartuchos CellSearchTM a 4ºC y en vertical (Menarini, Silicon Biosystems, Bolonia, Italia). Partiendo de dichas fracciones enriquecidas en CTCs almacenadas en los cartuchos CellSearchTM se llevó a cabo un segundo aislamiento mediante la tecnología DEPArrayTM (Menarini, Silicon Biosystems, Bolonia, Italia), el cual permitió el aislamiento tanto de células individualizas como de grupos de células puros. DEPArrayTM es una plataforma automática diseñada para aislar y recuperar células individualizas. El instrumento está basado en la dielectroforesis, un principio electrocinético mediante el cual, creando un campo eléctrico no uniforme, se ejercen fuerzas en partículas neutras como las células. El campo eléctrico se crea dentro de un cartucho microfluídico (DEPArrayTM cartridge) al cual se transfieren las fracciones enriquecidas en CTCs aisladas mediante CellSearchTM, en dicho cartucho se forman “jaulas eléctricas” alrededor de las células, permitiendo que estas sean atrapadas. El sistema DEPArrayTM está equipado con un microscopio de fluorescencia de seis canales y una cámara digital que captura imágenes y permite la identificación celular mediante su marcaje fluorescente y sus características morfológicas. Las imágenes obtenidas pueden ser analizadas mediante el software específico de ! ! ! 113! DEPArrayTM permitiendo la selección y la recuperación de las células de interés en un tubo para su posterior análisis. El protocolo comenzó con el traspaso de la muestra desde los cartuchos CellSearchTM a los cartuchos DEPArrayTM. Mediante el uso de una micropipeta con puntas para cargar geles recubiertas con PBSBSA 2%, se retiró la muestra de los cartuchos CellSearchTM y se pasó a un tubo. Posteriormente los cartuchos CellSearchTM fueron lavados dos veces con un buffer de baja conductividad (SB115) con el fin de recuperar los restos de muestra que hubiese podido quedar, por otra parte, este buffer optimiza el proceso de recuperación de DEPArrayTM. La suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 300 xg, se lavaron en 1 ml de SB115 y finalmente se resuspendieron en 14 ml de SB115. Los cartuchos DEPArrayTM se cargaron con estos 14 ml y 800 µL de SB115 para recuperar las células. Tras insertar el cartucho en el equipo DEPArrayTM 9,26 ml de la muestra, fueron automáticamente inyectados en una microcámara del cartucho en donde las células se ordenaron en un campo eléctrico formado por 16.000 posiciones. Una vez ordenadas se tomaron imágenes de todas las células (CK, CD45, DAPI y luz transmitida) y se les asignó un identificador. Estas imágenes fueron analizadas y se seleccionaron las células de interés que fueron recuperadas individualmente en 30-40 µL de SB115, en tubos de 200 µL. Finalmente se llevó a cabo un proceso de reducción de volumen para dejar las células en 1 µL de SB115. 3.5 ANÁLISIS GENÓMICOS 3.5.1 Amplificación de genoma completo mediante el kit Ampli1 WGA El contenido de ADN de una célula única es muy escaso (6pg) para llevar a cabo cualquier tipo de análisis posterior al aislamiento, por este motivo es necesario llevar a cabo una amplificación de ! 114! genoma completo con el fin de poder contar con una cantidad de ADN suficiente para su análisis. Dicha amplificación de genoma completo se ha llevado a cabo en las células aisladas mediante la tecnología DEPArrayTM utilizando el kit comercial basado en PCR Ampli1 WGA (Menarini, Silicon Biosystems, Bolonia, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Menarini, Silicon Biosystems recomienda el uso de este kit en combinación con un kit de control de calidad basado en PCR Ampli1 QC (Menarini, Silicon Biosystems, Bolonia, Italia) que permite evaluar la calidad de los productos de la amplificación de genoma completo. Una pequeña parte del producto de la amplificación se procesó mediante una PCR multiplex de control de calidad, la cual permite la amplificación de cuatro regiones genómicas humanas de longitud creciente (91, 108-166, 299 y 614 pb). La calidad de los productos de la amplificación de genoma completo se estimó mediante la observación del producto de PCR de control de calidad en un gel agarosa. La ausencia de bandas sugirió un fallo en la amplificación de genoma completo, la presencia de una o dos bandas determinó una baja-media calidad del producto de amplificación, mientras que la presencia de tres o cuatro bandas aseguró que la amplificación se realizó de forma óptima. 3.5.2 Extracción de DNA total de tejidos parafinados Para el estudio comparativo entre el perfil mutacional de la población de CTCs y el tejido tumoral mediante NGS se obtuvieron muestras de tejido en parafina facilitadas por los Biobancos del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela y del Hospital Universitario de Bellvitge. Consistieron en cortes de parafina de 10 micras de grosor en los que el tumor representaba el 80% de la superficie del bloque. La extracción de ADN a partir de estas muestras se llevó a cabo a partir de un máximo de 4 secciones, empleando el kit de extracción QIAamp FFPE Tissue Kit (Quiagen, Hilden, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras obtenidas se ! ! ! 115! almacenaron a -20ºC. El ADN obtenido se cuantificó mediante la tecnología Qubit 2.0 (Promega). 3.6 SECUENCIACIÓN MASIVA PARALELA DIRIGIDA La secuenciación masiva paralela dirigida, se llevó a cabo utilizando la plataforma S5 System (ThermoFisher) siguiendo las indicaciones del fabricante. Este estudio de secuenciación se realizó en colaboración con el Laboratorio de Investigación Traslacional en Cáncer de la Fundación MD Anderson Internacional (Madrid) dirigido por la Dra. Gema Moreno Bueno. 3.6.1 Construcción de las librerías Una vez extraído el DNA fue cuantificado mediante la tecnología Qubit (Thermo Fisher) de acuerdo a protocolos establecidos. Para la generación de la librería de DNA, se utilizaron 10 ng del ADN extraído que inicialmente fue amplificado mediante una PCR con AmpliSeq Library Kit 2.0 y el panel Oncomine Comprehensive Assay v3 (Thermo) siguiendo las indicaciones del proveedor. La amplificación por PCR se realizó en un termociclador AB 2720 (ThermoFisher) utilizando el siguiente ciclo de amplificación: 99ºC, 2 minutos; seguido de 16-22 ciclos de 99ºC, 30 segundos / 60ºC, 3 minutos. Brevemente el panel de DNA de Oncomine permite el análisis simultaneo de 87 regiones consideradas hotspot (altamente modificadas en cáncer), 48 genes completos y 43 genes para determinación de ganancia de copias (detalle de los genes analizados: www.thermofisher.com/order/catalog/product/A36111). Tras la amplificación se llevo a cabo la digestión de los oligonucleótidos utilizando FuPa (50ºC, 10 minutos; 55ºC, 10 minutos; 60ºC, 10 minutos; 10ºC hasta 1 hora). A continuación, se añadió a los productos amplificados los adaptadores Ion P1 y un código de barra específicos Ion Xpress Barcode para cada muestra, lo que permitió la secuenciación conjunta de todas las muestras. Siguiendo alas especificaciones de la casa comercial las librerías de DNA obtenidas fueron purificadas y cuantificadas utilizando una PCR ! 116! cuantifica en tiempo real utilizando el kit Ion Library TaqMan Quantitation y el sistema ViiA7 (ThermoFisher). Tras obtener la concentración de cada librería, se seleccionaron 6.8-8 pM. 3.6.2 Preparación de los templates La preparación y el enriquecimiento de las librerías de DNA fue llevada a cabo mediante el uso del kit Ion PGM Template OT2 200 Ion PGM Hi-Q OT2 y el sistema OneTouch 2. Se seleccionó 100pM de cada librería de DNA y a continuación se utilizó Templatepositive Ion PGM Hi-Q Ion Sphere Particles (ISPs) que permitía la interacción de cada fragmento de DNA amplificado con esferas magnéticas que posteriormente fueron amplificadas mediante una PCR en emulsión en el sistema Ion OneTouch 2 seguida de un enriquecimiento ejecutado mediante el sistema Ion OneTouch ES. Las esferas portadoras de fragmentos de DNA amplificado (ISPs enriquecidas) se almacenaron entre 2ºC y 8ºC hasta 3 días. 3.6.3 Secuenciación El kit de secuenciación Ion PGM Sequencing 200 Ion PGM Hi-Q Sequencing y el sistema S5 (ThermoFisher) fue utilizado para la Secuenciación Dirigida de Nueva Generación de acuerdo a los protocolos del fabricante. Las ISPs enriquecidas fueron centrifugadas y mezcladas con los cebadores de secuenciación y la polimerasa de secuenciación. Un rango de 12-16 librerías fueron secuenciadas en chips 520 o 530 con el fin de alcanzar la cobertura óptima, con al menos 100 lecturas por base (100X). 3.6.4 Análisis bioinformático El alineamiento con el genoma humano de referencia Hg19/CRCh38 y la identificación de variantes, se llevó a cabo mediante el uso del software Torrent Suit v.4.2.1 (ThermoFisher). Todas las muestras fueron secuenciadas y analizadas en las mismas condiciones. Las variantes con un valor de calidad Phred-score menor ! ! ! 117! de 500 fueron consideradas como variantes con poca calidad. La predicción del impacto de las variantes en la función biológica de las correspondientes proteínas fue llevada a cabo mediante la herramienta de análisis Ion Reporter que incluye el alineamiento de las regiones amplificadas contra el genoma de referencia (GRCh37) y analizado su posible efecto en base a alteraciones previamente descritas (bases de datos indexadas: dbSNP, COSMIC database) y posteriormente comprobadas mediante el software de análisis Alamut version 2.0 (Interactive Biosoftware, Rouen, France), que incluye información de cuatro predictores bioinformáticos que calculan el posible efecto deletéreo de la mutación. Aquellas variantes identificadas no descritas previamente fueron tipificadas como posible o probablemente patogénica si al menos tres predictores le conferían un efecto adverso (Predictores: GVGD, SITF, MutationTaster, Polyphen). Las variantes cuya cobertura de lectura fue inferior a 100 o con una frecuencia menos del 1.5% no se tuvieron en cuenta. Para la elaboración de los árboles filogenéticos, las muestras fueron transformadas en una matriz dicotómica describiendo la presencia (con un valor de 1) o la ausencia (con un valor de 0) de los SNPs y las CNVs seleccionadas y descritas anteriormente. En base a dicha matriz se aplicó el algoritmo filogenético utilizando la distancia de haming y la estimación Neighbor-Joining Tree utlizando el principio de parsimonia. La visualización de los arboles se llevo a cabo mediante el uso de R. 3.7 ESTUDIOS PROTEICOS 3.7.1 Extracción de proteínas totales de líneas celulares Las líneas celulares se lavaron con PBS y se incubaron con buffer de lisis RIPA (Tris-HCl mM, pH 7.4; NP-40 1%; Deoxicolato de Na 0.5%; SDS 0,1%; NaCl 150 mM; EDTA 2mM; NaF 50mM; Na3VO4 2mM; PIC 1X; PMSF 1X) durante 1 minuto. A continuación, se recogieron con la ayuda de un scrapper y se centrifugaron durante 15 minutos a 15000 xg. El sobrenadante se almacenó a -80ºC. La concentración de proteínas totales se determinó mediante el método del ácido bicinconínico (BCA). ! 118! 3.7.2 Western-Blot El Western Blot (WB) es una técnica de análisis proteico que se utiliza para la detección de proteínas concretas dentro de un extracto proteico. En esta técnica, se emplea la electroforesis en gel de acrilamida para separar las proteínas en función de su tamaño, posteriormente estas proteínas son transferidas a una membrana de PVDF para hacer posible su incubación con el anticuerpo específico frente a la proteína que se desea detectar. Para nuestros análisis se partió de 40 µg de proteína total que se mezclaron con Laemmli Buffer 4X (Bio-Rad Laboratories, USA), se incubaron a 95ºC durante 5 minutos y se cargaron en un gel de SDS-Acrilamida al 10%. Posteriormente se transfirieron a una membrana de PVDF (Amersham Bioscience, UK) durante 1 hora y 45 minutos. Tabla 7: Anticuerpos utilizados en el estudio. Las membranas se bloquearon con BSA 5% en TBS-Tween 0,05% (TBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y a continuación se incubaron con el anticuerpo primario a la dilución adecuada para cada anticuerpo (Tabla 7), durante toda la noche a 4ºC. Las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T durante 15 minutos a TA y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 7). Tras un nuevo proceso de lavado, la señal se detectó utilizando el kit Immobilon Western Blotting (Millipore, Billerica, ! ! ! 119! MA, USA) mediante el uso de películas radiográficas y un revelador automático Curix 60 (Agfa-Gevaert, BE). 3.8 ENSAYOS FUNCIONALES 3.8.1 Ensayos funcionales in vitro 3.8.1.1 Ensayo de migración en transwell La migración celular es un proceso clave durante el proceso de curación de heridas y durante el proceso de diferenciación celular y desarrollo embrionario. Por otra parte, también es clave durante el proceso de metástasis tumoral. Para evaluar la capacidad migratoria de las líneas celulares MDA-MB 231 y SKOV-3, se llevaron a cabo ensayos utilizando transwell con membrana de policarbonato, con un tamaño de poro de 8.0 µm (Corning, NY, USA), en placas de 24 pocillos. Se sembraron 5x104 células en 100 µl de medio de cultivo sin suero en los transwell. Los pocillos de la placa fueron rellenados con 500 µl de medio de cultivo completo con 20% de FBS como agente quimioatrayente. Tras una incubación de 24h, el transwell se colocó en un pocillo con 500 µl de tripsina para despegar las células que habían atravesado la membrana. Estas células se marcaron utilizando Acetometil Ester de Calceína (4 µM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En las células vivas la calceína es hidrolizada por esterasas intracelulares dando lugar al anión calceína fluorescente que queda retenido en el citoplasma celular. La fluorescencia emitida por las células se midió a 485 nm usando un fluorímetro FLUOstar Optima (BMG labtech, DE) en placas de 96 pocillos. En los casos en los que se utilizó este ensayo para testar la acción de algún tratamiento, este se incorporó tanto al medio sin FBS como al medio con 20% de FBS, con el fin de que el gradiente sólo estuviese generado por la diferencia de concentración de FBS. ! 120! 3.8.1.2 Ensayo de proliferación en placa Con el fin de evaluar la capacidad proliferativa de las líneas celulares MDA-MB 231 y SKOV-3, se llevaron a cabo ensayos en placas de 96 pocillos. Se sembraron 104 células por pocillo en 200 µl de medio de cultivo completo con 10% de FBS. Una vez las células se adhirieron a la placa (4 horas) se midió el tiempo 0. Para ello se retiró el medio de cultivo y se añadió medio con Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en una dilución 1:10, se incubo durante 3 horas a 37ºC y se midió la fluorescencia utilizando un fluorímetro a 544 nm. Posteriormente se midió otra placa a tiempo 72 horas, para poder establecer porcentaje de proliferación. El Alamar Blue contiene Resazurina, un indicador redox que sufre un cambio de color en respuesta a su reducción mediante el metabolismo celular. Su forma reducida es rosa y muy fluorescente. Esta intensidad de fluorescencia es proporcional al número de células viables presentes en cada pocillo. En los casos en los que se utilizó este ensayo para testar la acción de la abiraterona, la enzalutamida, el carboplatino y el paclitaxel respectivamente, éste se incorporó al medio a la concentración adecuada, una vez las células se adhirieron a la placa. 3.8.1.3 Ensayo de adhesión celular en placa Con el fin de evaluar la capacidad de adhesión de las líneas celulares MDA-MB 231, SKOV3 y sus respectivos silenciamientos, se llevaron a cabo ensayos utilizando placas de 96 pocillos recubiertos con colágeno (Sigma, St. Louis, MO, USA). Se sembraron 5x104 células en 100 µl de medio de cultivo en cada pocillo, marcadas con Acetometil Ester de Calceína (4 µM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras una incubación de 1hora o 45 minutos, se lavaron con PBS (x3) aquellas células no adheridas. La fluorescencia emitida por las células adheridas se midió a 485 nm usando un fluorímetro FLUOstar Optima (BMG labtech, ! ! ! 121! DE) y se relativizó a una medida tomada a tiempo cero, para poder determinar el porcentaje de células adheridas. 3.8.1.4 Ensayo de toxicidad con Carboplatino y Paclitaxel Con el fin de evaluar si existían diferencias en cuanto al efecto del Carboplatino (Accord Healthcare, Inc.) y el Paclitaxel (Accord Healthcare, Inc.) sobre las células MDA-MB 231 parentales y sus respectivos silenciamientos, se llevó a cabo un ensayo de toxicidad en placas de 96 pocillos empleando concentraciones crecientes de ambos compuestos. Se sembraron 3x103 células por pocillo en 100 µl de medio de cultivo completo con 10% de FBS. Una vez las células se adhirieron a la placa se incorporaron los compuestos al medio a la concentración adecuada. Al cabo de 5 días se retiró el medio de cultivo y se añadió medio con Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en una dilución 1:10, se incubó durante 3 horas a 37ºC y se midió la fluorescencia utilizando un fluorímetro FLUOstar Optima (BMG labtech, DE) a 544 nm, pudiendo de este modo calcular los porcentajes de inhibición respecto a los controles sin tratar en cada una de las condiciones. 3.8.1.5 Ensayo de formación de colonias en agar Con el fin de evaluar la capacidad de formación de colonias de las líneas celulares MDA-MB 231 y SKOV-3 se llevaron a cabo ensayos con agarosa (Promega, Madison, WI, USA), en placas de 96 pocillos. Se recubrió el fondo de los pocillos con 70 µl de medio de cultivo completo con 10% de FBS, suplementado con agarosa a una concentración final del 0,6%. Una vez solidificado, se sembraron encima 3x103 células por pocillo, contenidas en 100 µl de medio de cultivo completo con 10% de FBS, suplementado con agarosa a una concentración final del 0,3%. Se esperó a que solidificase esta segunda capa y se añadieron 30 µl de medio de cultivo completo con 10% de FBS por encima. ! 128! que las correlaciones entre variables categóricas se analizaron mediante el test Chi-Cuadrado. Se aceptó como significativa una probabilidad menor al 5% (p<0.05). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 129! RESULTADOS ! 130! ! ! ! 131! 4-RESULTADOS 4.1 RESULTADOS CMTN 4.1.1 VALOR CLÍNICO DEL CONTAJE DE CTCs EN PACIENTES CON CMTN 4.1.1.1 Contaje de CTCs en pacientes con CMTN en estadios III y IV mediante la tecnología CellSearch Mediante el uso de la tecnología CellSearch se llevó a cabo el contaje de CTCs contenidas en 7,5 ml de sangre periférica de las 32 pacientes con CMTN en estadios III y IV. Con esta tecnología se aísla y cuantifica la población tumoral circulante con fenotipo epitelial. Se aíslan las CTCs EpCAM positivas y se tienen en cuenta para la enumeración solamente aquellas con positividad para el cóctel de CKs 9/18/19 y negatividad para CD45. Del total de las pacientes un 42% (14) presentaron al menos 1 CTC con un rango de entre 1 y 130 células, siendo todas ellas estadio IV (Figura 13). Es importante destacar que en tres de las pacientes se detectó la presencia de entre 1 y 3 clusters de CTCs, formados por entre 2 y 4 células (Figura 13). ! 132! Figura 13: Análisis de la población de CTCs en pacientes con CMTN mediante la tecnología CellSearch. A, Ejemplo de CTCs analizadas mediante la tecnología CellSearch, con marcaje positivo para CKs y DAPI y negativo para CD45. B, Cuantificación de CTCs mediante la tecnología CellSearch en pacientes con CMTN en estadios III y IV. (Test de Mann-Whitney; *p<0,05). ! Por otra parte, se tomaron muestras a progresión de 11 de las pacientes con la finalidad de ver como evolucionaba el número de CTCs y poder caracterizarlas molecularmente. En esta segunda toma de muestra se observó un aumento en el número de CTCs en el 55% (6) de las pacientes, siendo interesante comentar que en las pacientes con un primer contaje de CTCs igual o superior a 5 fueron en las que el aumento fue más acusado. Por otra parte, en el resto de las pacientes en las que se tomó muestra a progresión el número de CTCs se mantuvo igual que en la muestra basal y éste siempre fue menor a 5 CTCs. Es importante mencionar que en esta segunda toma de muestra una de las pacientes (M-CHUS20) presentó un número muy elevado de CTCs (969 CTCs en 7,5 ml de sangre). Esta alta carga tumoral circulante motivó que se intentase generar un CDx (del inglés CTCs derived xenograft) a partir de las CTCs aisladas de esta paciente. Para ello se inoculó la fracción de PBMCs de forma subcutánea en un ratón NUDE y a los tres meses se observó crecimiento tumoral. Este CDx, que constituye el primer xenograft de CTCs en pacientes con CMTN, se caracterizó molecularmente y permitió identificar las vías celulares ! ! ! 133! más relevantes en este tumor y nuevos potenciales marcadores pronóstico para tumores TN (Pereira-Veiga et al., 2018). ! 4.1.1.2 Asociación entre el número de CTCs y variables clínicas El 86% (19) de las pacientes metastásicas presentaron positividad para CTCs y, a su vez, un 26% de ellas mostraron un contaje superior a 5 CTCs/7,5 ml de sangre. Por otra parte, las 5 pacientes a tratamiento a fecha de muestra, presentaron niveles de CTCs menores (media 10,5; 0-37 CTCs) que las 26 que no estaban a tratamiento a fecha de recogida de la misma (media 23; 0-130 CTCs). Con el resto de variables clínicas estudiadas como el subtipo histológico, el grado histológico, el estadio a fecha de toma de muestra, el nivel de Ki67, la cirugía previa, la localización metastásica y los tratamientos previos a la toma de muestra, no se determinó ningún tipo de asociación debido probablemente a la heterogeneidad del grupo de pacientes a estudio. 4.1.1.3 Valor pronóstico del contaje de CTCs mediante el sistema CellSearch Por otra parte, también se observó que las 8 pacientes con un contaje de CTCs superior a 5 CTCs/7,5ml de sangre analizadas mediante la tecnología CellSearch presentaron un peor pronóstico tanto en términos de SG como de SLP, con valores estadísticamente significativos y unas diferencias en cuanto a supervivencia de 20 y 16 (meses, respectivamente (Figura 14) (Tabla 8). ! 134! Figura 14: Análisis de supervivencia en función del contaje de CTCs mediante CellSearch. A, Curvas Kaplan-Meier para SG y SLP en función del contaje de CTCs (<5 vs ≥ 5 CTCs/7,5ml sangre). B, Curvas Kaplan-Meier para SG y SLP en función de la presencia o ausencia de clusters de CTCs. (Log Rank Test; *p<0,05). A su vez se observó que aquellas pacientes en las que se detectaron clusters de CTCs mediante la tecnología CellSearch presentaban una SG significativamente menor que las pacientes sin clusters, con una diferencia en cuanto a la media de supervivencia de 23 meses. La SLP también fue mayor en las tres pacientes con clusters de CTCs, aunque sin alcanzar la significación estadística (Figura 14) (Tabla 8). ! ! ! 135! Tabla 8: Análisis Kaplan-Meier para SG y SLP en función del contaje de CTCs mediante CellSearch. En ambos casos se muestra también el análisis de regresión de Cox para cada uno de los marcadores evaluados, donde se observa que las pacientes con valores de CTCs iguales o superiores a 5CTCs/7,5 ml de sangre presentaron un riesgo de recurrencia 2,66 veces mayor y un riesgo de exitus 3,8 veces mayor. Por otra parte, este análisis mostró que las pacientes en las que se detectaron clusters de CTCs presentaron un riesgo de recurrencia 2 veces mayor y un riesgo de exitus 7 veces mayor (Tabla 9). Tabla 9: Análisis de regresión univariante de Cox para SG y SLP en función del contaje de CTCs mediante CellSearch. ! 136! 4.1.2 CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA DE CTCs DE PACIENTES CON CMTN 4.1.2.1 Cuantificación y caracterización de CTCs en pacientes con CMTN mediante RT-q-PCR Teniendo en cuenta las limitaciones del sistema CellSearch a la hora de caracterizar y cuantificar la población de CTCs, en paralelo a este análisis se llevó a cabo un inmunoiaslamiento manual utilizando el kit CellEction (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Con este protocolo se utilizan partículas magnéticas funcionalizadas con anticuerpos que reconocen el antígeno de superficie EpCAM, pero en este caso la fracción enriquecida en CTCs se puede recuperar para caracterizar a nivel transcriptómico. Este análisis se llevó a cabo en el total de las 32 pacientes con CMTN incluidas en el estudio (estadios III y IV) y en 30 individuos sanos, que constituyeron nuestro grupo control. La presencia de una población circulante adicional en las pacientes se confirmó mediante el análisis de la expresión por RT-q-PCR de GAPDH y PTPRC (CD45). GAPDH es un gen de expresión constitutiva tomado como referencia, que se caracteriza por su expresión estable y que por lo tanto puede ser directamente correlacionado con la celularidad de la muestra. Los niveles de GAPDH en cada muestra incluyen tanto a las CTCs aisladas como a las células sanguíneas unidas inespecíficamente. Con el fin de eliminar este fondo inespecífico de cada muestra, se utilizó la expresión del marcador de células hematopoyéticas CD45 como normalizador. Tal y como se observa en la Figura 15 los niveles de GAPDH en el grupo de pacientes fueron significativamente superiores al grupo de controles sanos, mientras que los niveles de CD45 no presentaron diferencias significativas. Estos datos demuestran que se aisló una población extra a partir de la sangre de pacientes en comparación con los controles sanos y que, por otra parte, el nivel de inespecificidad en el aislamiento fue similar en ambos grupos. ! ! ! 137! Figura 15: A y B, Niveles de expresión de GAPDH y CD45 en la fracción inmunoaislada de pacientes y controles, analizados mediante RT-q-PCR (Test de Mann-Whitney, *p<0,05). C y D, Valor diagnóstico de los niveles de expresión de GAPDH y CD45 (curvas ROC) para discriminar controles y pacientes. ABC, área bajo la curva. Asimismo, el análisis mediante curvas ROC confirmó la utilidad del análisis de los niveles de expresión de GAPDH para discernir entre controles y pacientes (AUC=0,665; p<0,027), mientras que la curva de CD45 presenta un ajuste más cercano a la diagonal, confirmando la ausencia de diferencias entre controles y pacientes. Una vez validada nuestra estrategia de análisis, se examinó el perfil expresión de un panel de genes relacionados con el proceso de EMT, con vías hormonales y con características de célula madre (CDH1, EPCAM, VIM, ZEB1, ZEB2, LOXL2, SNAI1, FUT8, ANXA2, ! 144! Figura 19: Modelo ROC de regresión logística combinando los marcadores TIMP1, SNAIL1 y BCL11A. 4.1.2.4 Valor pronóstico de los marcadores identificados en la población de CTCs Con el objetivo de determinar el valor pronóstico de los marcadores presentes en la población de CTCs de nuestra cohorte de pacientes con CMTN para predecir los tiempos de SG y SLP, se llevó a cabo un análisis de supervivencia Kaplan-Meier para todos los marcadores estudiados. Tras este análisis se observó que niveles de expresión elevados de todos los marcadores por separado, a excepción de BCL11A, se asociaron con peores tiempos de supervivencia, tanto SG como como SLP. En concreto, niveles elevados de CD49F, ALDH2, CD44, GAPDH y TIMP1 presentaron una asociación estadísticamente significativa con el tiempo de SG (Tabla 11) (Figura 20), mientras que para predecir la SLP los marcadores con impacto ! ! ! 145! estadísticamente significativo fueron CD49F, GAPDH y TIMP1 (Tabla 11) (Figura 21). ! Figura 20: Curvas Kaplan-Meier para SG en función de los niveles de expresión (alto/bajo) de CD49F, ALDH2, CD44, TIMP1 y GAPDH. ! 146! Figura 21: Curvas Kaplan-Meier para SLP en función de los niveles de expresión (alto/bajo) de CD49F, TIMP1 y GAPDH. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 147! Tabla 11: Resumen del análisis Kaplan-Meier de SG y SLP para los marcadores diferencialmente expresados entre controles y pacientes. En el caso de los marcadores que son significativos en el análisis Kaplan-Meier se muestra también el análisis de regresión de Cox (Tabla 12) donde se observa que las pacientes con niveles altos de CD49F, TIMP1 y GAPDH presentan respectivamente un riesgo de exitus 5 veces superior a las que tienen niveles bajos y las que tienen niveles altos de ALDH2 y CD44 presentan un riesgo de exitus 3 veces ! 148! superior a las que tienen niveles bajos. Por otra parte, las pacientes con niveles altos de CD49F, TIMP1 y GAPDH presentan un riesgo de recurrencia entre 3 y 4 veces mayor que las pacientes con niveles bajos de dichos marcadores. Tabla 12: Resultado del análisis de regresión univariante de Cox para los marcadores con impacto pronóstico. 4.1.3 VALIDACIÓN DE LAS POTENCIALES DIANAS TERAPÉUTICAS IDENTIFICADAS EN CTCs DE PACIENTES CON CMTN Una vez caracterizado el perfil de expresión de población de CTCs de pacientes con CMTN, e identificados marcadores con valor para predecir su pronóstico, seleccionamos dos genes, el AR y TIMP1 para determinar si su modulación podía ser de utilidad clínica como estrategia terapéutica en tumores TN. Estos dos genes se seleccionaron porque fueron de los que mostraron una mayor diferencia entre controles y pacientes, asociándose niveles elevados de los dos con peores tasas de supervivencia, y porque representan dos dianas terapéuticas con interés para tratar el cáncer de mama. A continuación, se describen los resultados de los estudios moleculares y funcionales llevados a cabo bloqueando la acción de ambas moléculas en la línea tumoral de CMTN MDA-MB 231. Esta línea tumoral estable se generó a partir de líquido pleural de una paciente con un adenocarcinoma hormono independiente (ERy PR-) y HER2- (Cailleau, Olivé, & Cruciger, 1978), siendo la línea epitelial más ! ! ! 149! utilizada como modelo de tumor TN en los laboratorios de investigación. 4.1.3.1 Validación in vitro e in vivo del bloqueo de la vía mediada por el receptor de andrógenos como estrategia terapéutica en CMTN Con el fin de bloquear la vía androgénica en nuestra línea celular modelo, la cual presenta positividad para la expresión del receptor de andrógenos tanto a nivel proteico (Figura 22 A) como a nivel transcripcional mediante RT-q-PCR , se utilizó tratamiento con dos fármacos que bloquean la vía a dos niveles diferentes. Uno de ellos fue la abiraterona, un potente inhibidor de la biosíntesis androgénica que actúa inhibiendo la acción de la enzima CYP17 esencial para la maduración de los precursores androgénicos. El otro fue la enzalutamida, un potente inhibidor del receptor androgénico que impide la unión de los andrógenos al receptor, inhibe su translocación nuclear, la unión del receptor de andrógenos al ADN y el reclutamiento de co-activadores transcripcionales, bloqueando la transcripción de los genes regulados por la vía androgénica (Antonarakis, 2013) (Figura 22 B). Figura 22: A, Niveles proteicos de AR analizados mediante Western Blot en la línea MDA-MB 231. B, Puntos de la vía androgénica en donde actúan la abiraterona y la enzalutamida. Adaptado de (Crona et al. 2017). DHEA, Dihidroepiandrosterona; AD, Androstenediona; T, Testosterona; D, Dihidrotestosterona. ! 150! 4.1.3.1.1 Impacto del bloqueo de la vía androgénica en la capacidad de proliferación, formación de colonias en agar y migración en la línea celular MDA-MB 231. Con el fin de evaluar la implicación de la vía androgénica en la proliferación de la línea celular MDA-MB 231 se llevaron a cabo ensayos de proliferación en placa con Alamar Blue mediante los cuales se observó que tras el bloqueo de la vía con abiraterona 10 µM o enzalutamida 10 µM (concentración máxima que no produce muerte celular, calculada mediante ensayo de toxicidad) la tasa proliferación relativa de la línea celular descendió un 32% y un 6% de media, respectivamente, en relación a la condición control (DMSO a 1% concentración) (Figura 23A). Este descenso fue estadísticamente significativo solamente en el caso del tratamiento con abiraterona. Por otro lado, para determinar la implicación de la vía androgénica en la capacidad de formación de colonias en ausencia de sustrato de la línea celular MDA-MB 231 se llevaron a cabo ensayos de formación de colonias en agar en los cuales se pudo observar un descenso en dicha clonogenicidad en las condiciones de tratamiento con abiraterona 10 µM y enzalutamida 10 µM del 42% y del 9%, respectivamente, en referencia a la condición control (Figura 23B). De nuevo, tal y como ocurrió en los ensayos de proliferación, este descenso solamente alcanzó la significación estadística en la condición de tratamiento con abiraterona. Por último, para evaluar la implicación de la vía androgénica en la capacidad de migración de nuestra línea celular modelo se llevaron a cabo ensayos de migración en placa utilizando Transwell. Tras estos ensayos no se observaron diferencias en migración entre las líneas tratadas con abiraterona 10 µM o enzalutamida 10 µM y la condición control (Figura 23C). Con estos resultados indican que el bloqueo de la actividad de AR con abiraterona en las MDA-MB 231 reduce la capacidad proliferativa en adhesión a sustrato y en condiciones de crecimiento ! ! ! 151! sin adhesión. Esto podría indicar que la inhibición de la síntesis de andrógenos es más eficiente que el bloqueo directo del receptor. Figura 23: Estudios funcionales in vitro con la línea celular MDA-MB 231 en presencia de los inhibidores de la vía androgénica, abiraterona 10 µM o enzalutamida 10 µM. A, Ensayo de proliferación. B, Ensayo de formación de colonias en agar. C, Ensayo de migración en transwell. (Test de Mann-Whitney; *p<0,05; **p<0.01). nreplica= 6 replicados, ntotal= 5 ensayos. El DMSO al 1% se utilizó como vehículo de los fármacos. 4.1.3.1.2 Estudio in vivo del efecto del bloqueo de la vía androgénica en la línea celular MDA-MB 231 Con el fin de estudiar in vivo el efecto del bloqueo de la vía androgénica en la línea celular MDA-MB 231, se ha utilizado como modelo animal el pez cebra. Esta especie de vertebrado, tiene un mantenimiento sencillo, una fácil reproducción y además sus ! 152! embriones son transparentes lo que permite la visualización de las células transplantadas en el animal. Por otra parte, se pueden disolver compuestos en el agua con el fin de evaluar su eficacia frente a diferentes tipos celular inyectados en el pez. 4.1.3.1.3 Ensayo de toxicidad en respuesta a tratamiento con abiraterona y enzalutamida en pez cebra Con el fin de conocer la concentración mínima que causa mortalidad en los embriones de pez cebra, se llevó a cabo un ensayo de toxicidad con los dos fármacos. Tras realizar los test de toxicidad durante 96 hpf pudimos concluir que la concentración a utilizar sería de 1 µM, puesto que tanto en la abiraterona como en la enzalutamida los efectos tóxicos se manifestaron a partir de las 24 hpf a concentración 10 µM de ambos fármacos, sin tener en cuenta el efecto de la temperatura. Por otra parte, observamos que la enzalutamida es más tóxica que la abiraterona, siendo la mortalidad a 96 hpf del 83,34% en el grupo tratado con la enzalutamida y del 41,66% en el grupo tratado con la abiraterona, a la concentración de 30 µM. 4.1.3.1.4 Ensayo de proliferación y migración en pez cebra Los embriones de pez cebra fueron inyectados en circulación con la línea control MDA-MB 231-GFP, para poder analizar las diferencias de proliferación y capacidad de migración debidas a la presencia de los fármacos abiraterona y enzalutamida a una concentración 1 µM. Las células MDA-MB 231-GFP fueron tripsinizadas, concentradas e inyectadas en la circulación (Ducto de Cuvier) de los embriones de pez cebra a las 48 hpf e incubados durante 6 días después de la inyección a 34ºC para poder analizar la proliferación de las distintas condiciones en la región del tejido hematopoiético caudal del embrión de pez cebra. De esta manera los embriones fueron fotografiados a 1, 4 y 6 dpi con el objetivo de poder realizar una comparación entre las fotografías de fluorescencia entre los distintos días y condiciones. ! ! ! 153! Los resultados obtenidos indicaron que tanto la abiraterona como la enzalutamida causaban inhibición en la proliferación de las células inyectadas en comparación con el control tanto a 4 como a 6 dpi. Se observaron reducciones estadísticamente significativas del 44% en el tratamiento con abiraterona y 54% con enzalutamida a los 4 dpi, mientras que a los 6 dpi la reducción observada fue del 57% en ambos casos (Figuras 24 y 25). Figura 24: Proliferación de la línea celular MDA-MB 231 en los peces cebra en presencia de los inhibidores de la vía androgénica, abiraterona y enzalutamida (1 µM). Crecimiento tumoral normalizado (nreplica= 15 embriones/condición, ntotal= 45 embriones/condición; 4 dpi, 4 días post-inyección; 6 dpi, 6 días post-inyección T-Test; *p<0.05). ! 256! matrices through a mechanosensitive Rho-ROCK pathway. Journal of Cell Science, 127(Pt 12), 2621–6. https://doi.org/10.1242/jcs.144378 Mego, M., De Giorgi, U., Broglio, K., Dawood, S., Valero, V., Andreopoulou, E., Cristofanilli, M. (2009). Circulating tumour cells are associated with increased risk of venous thromboembolism in metastatic breast cancer patients. British Journal of Cancer, 101(11), 1813–6. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6605413 Mendelsohn, J. (2002). Targeting the epidermal growth factor receptor for cancer therapy. 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PloS One, 10(6), e0130873. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130873 ! 280! ! ! ! 281! 8-AGRADECIMIENTOS Me gustaría, primeramente, comenzar con el agradecimiento a mis directores, gracias a los tres por haber confiado en mi desde el principio abriéndome las puertas al mundo de la investigación biomédica. Gracias Rafa por tu labor en la promoción de la investigación, imprescindible. Gracias Laura Sánchez por tu ayuda constante, por tus buenas palabras, por tu amabilidad, por tus consejos, por tus ánimos y tu alegría. Un claro ejemplo de una persona que ha llegado a lo más alto sin perder un átomo de humanidad, para mi un ejemplo a seguir. Por último gracias Laura Muinelo por tu ayuda completamente imprescindible, sin ti esta tesis no existiría, gracias por tu paciencia, tu entrega, tu esfuerzo, tu implicación y tu afán de mejora continua. Un ejemplo de una persona que se gana día a día el ser una investigadora con todas la letras y cuya capacidad de trabajo supera a la de cualquier otra persona que yo haya conocido. Por último, es para mi importante decir que, tras estos años, considero que además de haber sido mi directora será para siempre una buena amiga. Gracias a Alicia, la mejor técnico que existe. Desde el primer hasta el último día has hecho todo lo posible para que me sintiese cómodo en el laboratorio, una suerte para el grupo poder contar contigo y para mi un honor el haber trabajado contigo y aprendido de ti. Gracias Ramón, otro profesional impresionante, gracias por tu humildad, por tu buen humor, por tu simpatía innata, por tus amplísimos conocimientos biológicos, de los cuales he podido aprender un montón y por estar disponible para ayudar siempre. Gracias a Oscar, nuestro odontólogo particular, gracias por tu amabilidad y saber estar, has sido siempre un gran compañero y estoy ! 288! menor que 5 CTC o mayor/igual que 5 CTC ya que es el punto de corte habitual establecido por la FDA. En cambio cuando se habla de pronóstico y clusters de CTC utilizamos simplemente la presencia o ausencia de los mismos, evaluada mediante el sistema CellSearch. 9.3Análisis de supervivencia: indicación el evento analizado. En todos los casos de análisis de supervivencia se ha utilizado: a) Para supervivencia global (SG) el intervalo desde la toma de muestra hasta el fallecimiento de la paciente. b) Para supervivencia libre de progresión de la enfermedad (SLP) el intervalo desde la toma de muestra hasta el diagnóstico de progresión de la enfermedad.