Aplicacións analíticas avanzadas para a predición do valor nutricional das forraxes máis utilizadas nas explotacións leiteiras de Galicia

TESE DE DOUTORAMENTO Aplicacións analíticas avanzadas para a predición do valor nutricional das forraxes máis utilizadas nas explotacións leiteiras de Galicia Sonia Pereira Crespo ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL DA UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN ENXEÑARÍA PARA O DESENVOLVEMENTO RURAL E CIVIL LUGO 2020 DECLARACIÓN DO AUTOR/A DA TESE D./Dn a. Sonia Pereira Crespo Título da tese: Aplicacións analíticas avanzadas para a predición do valor nutricional das forraxes máis utilizadas nas explotacións leiteiras de Galicia Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De ser o caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. E comprométome a presentar o Compromiso Documental de Supervisión no caso de que o orixinal non estea na Escola. En Lugo, 07 de Decembro de 2020. Sinatura electrónica AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR/TITOR DA TESE D./Dn a. Gonzalo Flores Calvete En condición de: Director/a Título da tese: Aplicacións analíticas avanzadas para a predición do valor nutricional das forraxes máis utilizadas nas explotacións leiteiras de Galicia INFORMA: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna Sonia Pereira Crespo, baixo a miña dirección/titorización, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director/titor desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Lugo, 07 de Decembro de 2020 Sinatura electrónica AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR/TITOR DA TESE D./Dn a. Elena Fernández Rodríguez En condición de: Titor/a Título da tese: Aplicacións analíticas avanzadas para a predición do valor nutricional das forraxes máis utilizadas nas explotacións leiteiras de Galicia INFORMA: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna Sonia Pereira Crespo, baixo a miña dirección/titorización, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director/titor desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Lugo, 07 de Decembro de 2020 Sinatura electrónica Agradecementos Concluída esta Tese, quero expresar o meu profundo agradecemento a todas as persoas e institucións que fixeron posíbel levar a cabo este traballo. Agradezo ao CIAM por facilitarme todos os medios necesarios para realizar a miña Tese e a todas as compañeiras e compañeiros que colaboraron directa ou indirectamente na consecución deste traballo. Da mesma maneira, agradezo ao LIGAL e ao LAFIGA todo o apoio recibido. Quero expresar un especial agradecemento á equipa de investigación da que estou infinitamente orgullosa de formar parte: Laura González, Marcos Veiga, Adrián Botana, César Resch, Thierry Dagnac e Valentín García, son uns compañeiros excepcionais. Ao igual que o Director desta Tese, Gonzalo Flores, que para min sen dúbida é o mellor líder posíbel, unha persoa inspiradora que é exemplo de loita e superación, sen o seu apoio e gran traballo a presente Tese non chegaría ao seu punto final. Quero agradecer tamén dun xeito especial a Bruno Fernández, Juan Valladares, Teresa Moreno, Juan Castro e Antonio Arráez, por toda a axuda recibida. Tamén desexo expresar un especial agradecemento a todos os estudantes da Universidad Autónoma del Estado de México que estiveron de estadía no CIAM colaborando neste traballo, especialmente a Dalia. Chegar até aquí foi unha longa viaxe, acompañada por xente formidábel, moitas grazas ás miñas amizades que tanto me coidan e apoian, moitas grazas Patri, Sandra, Pili e Berto. Por último, agradezo aos meus pais Manuel e Celia, polo infinito apoio e os grandes esforzos que fixeron por min. Tamén un gran agradecemento ao meu irmán, Javi, un apoio importante na miña vida desde o día que nacín. Unha lembranza especial a miña tía Elvira e a miña madriña Maricarme, das que sempre recibín gran apoio e foron exemplo de brava valentía e gran corazón. I Resumo II RESUMO II RESUMO O uso de forraxes de calidade e a mellora da eficiencia da súa utilización no racionamento das vacas de leite é unha das claves da viabilidade económica e ambiental do sector produtor leiteiro galego, inmerso nun mercado aberto, competitivo e cada vez máis esixente. Para elo, cómpre dispoñer dun sistema avanzado de valoración nutricional dos alimentos que informe con precisión do valor enerxético e nitroxenado das forraxes dispoñíbeis nas explotacións. No presente traballo se perseguiron cinco obxectivos: 1) Describir as características de composición química e dixestibilidade da materia orgánica (DMO) dos principais grupos de forraxes frescas e de forraxes conservadas como fenos e ensilaxes utilizadas nas explotacións leiteiras de Galiza; 2) desenvolver ecuacións NIRS para a estimación da composición química e a DMO das forraxes e de mesturas completas (unifeed) comunmente utilizadas para a alimentación das vacas de leite; 3) avaliar a capacidade de NIRS para estimar os parámetros de degradabilidade ruminal de ensilaxes de herba e de millo; 4) obter ecuacións de regresión baseadas na composición química das mostras para estimar os valores de DMO dos distintos grupos de forraxes e das mesturas unifeed así como da degradabilidade ruminal das ensilaxes de herba e de millo comparando a súa capacidade preditiva coa obtida mediante a técnica NIRS e 5) construír e validar ecuacións NIRS para predicir os parámetros de calidade fermentativa de ensilaxes de herba e ensilaxes de millo. As coleccións de forraxes e mesturas unifeed utilizados nesta tese ascenderon a un total de 4645 mostras, das cales 2181 eran forraxes frescas, 1262 ensilaxes de herba, 996 de ensilaxes de millo, 125 de mostras unifeed e 81 de fenos de pradeira. As mostras, procedentes de granxas leiteiras galegas e das fincas experimentais do Centro de Investigacións Agrarias de Mabegondo (CIAM) foron recollidas ao longo de diversos anos e pretenden reflectir, na maior medida posíbel, a variabilidade existente na práctica. Os valores de referencia da DMO se corresponden con valores determinados in vivo con ovinos a nível de mantemento (n=368 mostras) ou de dixestibilidade in vitro con líquido ruminal corrixida por estándares de dixestibilidade in vivo coñecida RESUMO IV (n=1476 mostras) e os de degradabilidade ruminal in situ (n=132 mostras) foron determinados con gando vacún, todos eles realizados en diferentes ensaios e anos nas instalacións do CIAM, nos que se gardaron rigorosamente as normas de benestar en animais de experimentación. A composición química das forraxes determinouse por métodos de referencia nos laboratorios do CIAM e a calidade fermentativa das ensilaxes (n=1043 mostras) no Laboratorio Agrario e Fitopatolóxico de Galicia (LAFIGA). Os resultados obtidos no presente traballo se comparan favorabelmente cos reportados por diferentes autores na bibliografía internacional, tanto na estimación da composición química e valor de DMO como de parámetros de degradabilidade ruminal de forraxes frescas e conservadas e da calidade fermentativa de ensilaxes, mostrando a potencialidade de NIRS como técnica non destrutiva para a estimación rápida e precisa do valor nutricional de alimentos para o gando vacún, sustentada no amplo número de mostras representativas das características dos principais tipos de forraxes frescas e conservadas das explotacións leiteiras galegas. As ecuacións NIRS permitiron obter, en xeral, unha satisfactoria predición da composición química dos diferentes grupos de mostras analizadas, sendo máis precisas, en xeral, as estimacións realizadas para forraxes frescas, fenos e mesturas unifeed, comparadas coas ensilaxes. Os parámetros mellor preditos foron proteína bruta (PB), fibra neutro deterxente (FND), carbohidratos non estruturais totais (CNET) e solúbeis en auga (CSA), amidón (ALM) e extracto etéreo (EE), con valores medios de 𝑅𝑃𝐷 (relación entre a desviación estándar do conxunto de mostras e o erro estándar de predición en validación externa ou cruzada) superiores a 5,0, seguidos do contido en fibra ácido deterxente (FAD) e de materia orgánica (MO) con valores medios de 𝑅𝑃𝐷 de 4,0 e 2,9, respectivamente, sendo posíbel realizar en tódolos casos predicións cuantitativas de entre excelente e aceptábel calidade. As ecuacións para a estimación de fibra bruta e de lignina, realizadas unicamente sobre mostras de xirasol fresco, de ensilaxes de herba e de ensilaxes de millo, non foron de utilidade preditiva. Os modelos de predición NIRS para a estimación do valor de DMO permitiron unha predición cuantitativa entre boa e aceptábel en tódalas forraxes frescas, fenos e mesturas unifeed, así como nas ensilaxes de herba, sendo considerada como moderada para as ensilaxes de millo, todas elas aplicábeis á estimación cuantitativa de mostras externas, salvo no caso dos fenos onde só se realizou a validación cruzada das ecuacións. Os valores do erro de predición de DMO se mantiveron por debaixo de 1,5 veces o erro do RESUMO V método de referencia, indicando un excelente axuste. A calidade preditiva das ecuacións NIRS para a estimación da DMO de forraxes frescas e fenos foi máis alta, comparada coa das ensilaxes, con valores medios de RPD de 3,3 para as forraxes frescas e fenos, de 2,6 para ensilaxes de herba e de 1,9 para ensilaxes de millo. O uso das ecuacións NIRS na estimación do valor de DMO dos distintos grupos de produtos estudados permitiu reducir o erro medio de predición (𝑆𝐸𝑃) dos mellores modelos empíricos a practicamente a metade, pasando de ±4,5% a ±2,4%, mentres que a varianza explicada se incrementaba desde o 51% ao 79% cando se aplicaban as ecuacións a grupos independentes de mostras da mesma clase. A ecuación NIRS para a predición do valor da dixestibilidade in vivo da parede celular (DFND) de ensilaxes de millo mostrou un axuste mediocre en validación externa, cun valor de 𝑅𝑃𝐷 de 1,6 permitindo unicamente unha clasificación cualitativa en rangos, se ben o valor do erro medio de predición (𝑆𝐸𝑃= ±4,8%) foi moi parecido ao erro do método de referencia obtido nas avaliacións in vivo para este parámetro (±4,4%). As ecuacións empíricas mostraron unha baixa aptitude preditiva dos parámetros de degradabilidade ruminal in situ, en particular para as ensilaxes de millo. A mellora da precisión e exactitude de NIRS na estimación da degradabilidade efectiva da MS, FND e PB das ensilaxes, respecto das ecuacións empíricas, ponse de manifesto polo incremento de entre o 50 e o 53% da varianza media explicada en validación externa e pola redución do erro de predición entre un 43% e un 36% para as ensilaxes de herba e de millo, respectivamente. As ecuacións NIRS para a predición directa do valor da degradabilidade efectiva (𝑫𝑻) da MS, FND, PB e ALM por NIRS foron máis exactas e precisas que as ecuacións que estimaban os parámetros que definen a cinética de degradación ruminal dos respectivos constituíntes. Entre estes, a fracción inmediatamente solúbel (𝒂) foi o parámetro mellor predito, sendo de menor calidade as ecuacións NIRS para a estimación da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (𝒃) e, particularmente, a correspondente á velocidade de degradación ruminal (𝒄). En base aos valores da relación 𝑅𝑃𝐷 en validación cruzada, as ecuacións NIRS obtidas para as ensilaxes de herba permitirían realizar unha predición cuantitativa entre excelente e aceptábel de tódolos parámetros de degradabilidade da MS, FND e PB, salvo para velocidade de degradación ruminal da MS e da PB, que só permitiría unha predición cuantitativa en rangos, non sendo posíbel estimar por NIRS o valor de 𝒄FND. Para ensilaxes de millo a fiabilidade das ecuacións foi claramente inferior, permitindo RESUMO VI unicamente a predición cualitativa en rangos dos valores de degradabilidade teórica DTMS, DTPB e 𝑫𝑻ALM e das fraccións solúbel e potencialmente degradábel de MS e PB, non sendo posíbel estimar por NIRS os valores da velocidade de degradación cMS, cPB e 𝒄ALM nin ningún outro parámetro de degradación da parede celular, incluída a degradabilidade efectiva DTFND . As ecuacións NIRS construídas por separado para as coleccións de mostras secas e moídas de ensilaxes de herba e de millo foron máis exactas e precisas que as ecuacións xerais realizadas sobre o total de mostras, e mostraron a capacidade de realizar unha satisfactoria predición cuantitativa do valor de pH e dos contidos en láctico, acético, nitróxeno (N) solúbel e N amoniacal en ambos tipos de ensilaxes, mentres que a predición do contido en etanol nas ensilaxes de millo só permitiría unha clasificación en rangos para este parámetro. En xeral, foron mellor preditos os produtos de fermentación con menores perdas de volatilidade durante o secado en estufa (láctico vs. etanol e acético). Se proba por tanto que as calibracións NIRS desenvolvidas no presente traballo son unha ferramenta útil para a avaliación nutricional rápida e precisa das principais forraxes producidas na explotacións leiteiras de Galiza. A dispoñibilidade destas ecuacións facilita a toma de decisións estratéxicas en relación ao manexo xeral da base forraxeira das granxas, ás necesidades de suplementación e á elaboración de racións económicas, favorecendo a optimización do uso de forraxes na alimentación de gando vacún de leite e colaborando ao mesmo tempo á minimización do impacto ambiental da actividade gandeira. As calibracións NIRS están actualmente operativas para o seu uso en rutina mediante a realización da oportuna transferencia de información entre os instrumentos NIRS do CIAM e LIGAL, os cales están estandarizados para poder compartir información, o que produciu unha substancial mellora da calidade da oferta analítica dos diferentes tipos de mostras ao servizo das ganderías galegas por parte do LIGAL. Ao mesmo tempo están sendo utilizadas con propósito de apoio aos proxectos de investigación e de mellora xenética de plantas forraxeiras realizados no CIAM, debendo ser obxecto de actualización e mellora permanente para representar nas coleccións de calibración, na maior medida posíbel, a variabilidade na composición das mostras no ámbito de aplicación das ecuacións de predición. RESUMEN VII RESUMEN El uso de forrajes de calidad y la mejora de la eficiencia de su utilización en el racionamiento de las vacas de leche es una de las claves de la viabilidad económica y ambiental del sector lechero gallego, inmerso en un mercado abierto, competitivo y cada vez más exigente. Para ello, se requiere disponer de un sistema avanzado de valoración nutricional de los alimentos que informe con precisión do valor energético y nitrogenado de los forrajes disponibles en las explotaciones. En el presente trabajo se persiguieron cinco objetivos: 1) Describir las características de composición química e digestibilidad de la materia orgánica (DMO) de los principales grupos de forrajes frescos y de forrajes conservados como henos y ensilajes utilizados en las explotaciones lecheras de Galicia; 2) desenvolver ecuaciones NIRS para la estimación de la composición química y la DMO de los forrajes y de las mezclas completas (unifeed) comúnmente utilizadas para la alimentación de las vacas de leche; 3) evaluar la capacidad de NIRS para estimar los parámetros de degradabilidad ruminal de ensilajes de hierba y de maíz; 4) obtener ecuaciones de regresión basadas en la composición química de las muestras para estimar los valores de DMO de los distintos grupos de forrajes y de las mezclas unifeed así como de la degradabilidad ruminal de los ensilajes de hierba y de maíz comparando su capacidad predictiva con la obtenida mediante la técnica NIRS y 5) construir y validar ecuaciones NIRS para predecir los parámetros de calidad fermentativa de ensilajes de hierba y ensilajes de maíz. Las colecciones de forrajes y mezclas unifeed utilizadas en la presente tesis ascendieron a un total de 4645 muestras, de las cuales 2181 eran forrajes frescos, 1262 ensilajes de hierba de pradera, 996 de ensilajes de maíz, 125 de muestras unifeed y 81 de henos de pradera. Las muestras, procedentes de granjas lecheras gallegas y de fincas experimentales del Centro de Investigacións Agrarias de Mabegondo (CIAM) fueron recogidas a lo largo de diversos años y pretenden reflejar, en la mayor medida posible, la variabilidad existente en la práctica. Los valores de referencia da DMO se corresponden con valores determinados in vivo con ovinos a nivel de mantenimiento (n=368 muestras) o de digestibilidad in vitro con líquido ruminal corregida por RESUMEN VIII estándares de digestibilidad in vivo conocida (n=1476 muestras) y los de degradabilidad ruminal in situ (n=132 muestras) fueron determinados con ganado vacuno, todos ellos realizados en distintos ensayos y diferentes años en las instalaciones del CIAM, en los que se guardaron rigurosamente las normas de bienestar en animales de experimentación. La composición química de los forrajes se determinó por métodos de referencia en los laboratorios del CIAM y la calidad fermentativa de los ensilajes (n=1043 muestras) en el Laboratorio Agrario e Fitopatolóxico de Galicia (LAFIGA). Los resultados obtenidos en el presente trabajo se comparan favorablemente con los reportados por diferentes autores en la bibliografía internacional, tanto en la estimación de la composición química y valor de DMO como de los parámetros de degradabilidad ruminal y calidad fermentativa, mostrando la potencialidad de NIRS como técnica no destructiva para la estimación rápida y precisa del valor nutricional de alimentos para el ganado vacuno, sustentada en el amplio número de muestras representativas de las características de los principales tipos de forrajes frescos y conservados de las explotaciones lecheras gallegas. Las ecuaciones NIRS permitieron obtener una satisfactoria predicción de la composición química de los diferentes grupos de muestras analizadas, siendo más precisas, en general, las estimaciones realizadas para forrajes frescos, henos y mezclas unifeed, comparadas con los ensilajes. Los parámetros mejor predichos fueron proteína bruta (PB), fibra neutro detergente (FND), carbohidratos no estructurales totales (CNET) y solubles en agua (CSA), almidón (ALM) y extracto etéreo (EE), con valores medios de 𝑅𝑃𝐷 (relación entre la desviación estándar del conjunto de muestras y el error estándar de predicción en validación cruzada o externa) superiores a 5,0, seguidos del contenido en fibra ácido detergente (FAD) y de materia orgánica (MO) con valores medios de 𝑅𝑃𝐷 de 4,0 y 2,9, respectivamente, siendo posible realizar en todos los casos predicciones cuantitativas de calidad entre excelente y aceptable. Las ecuaciones para la estimación de fibra bruta y de lignina, realizadas únicamente sobre muestras de girasol fresco, de ensilajes de hierba e de ensilajes de maíz, no fueron de utilidad predictiva. Los modelos de predicción NIRS para la estimación del valor de DMO permitieron una predicción cuantitativa que se califica entre buena y aceptable en todos los forrajes frescos, henos y mezclas unifeed, así como en los ensilajes de hierba, siendo considerada como moderada para los ensilajes de maíz, siendo todas las ecuaciones NIRS aplicables a la estimación cuantitativa de muestras externas, salvo en el caso de SUMMARY XV For maize silages, the reliability of NIRS models was clearly lower, allowing only qualitative prediction in ranges of the effective degradability 𝑬𝑫DM, 𝑬𝑫CP, 𝑬𝑫STA and the soluble and potentially degradable fractions of DM and CP, not being of practical utility the NIRS equations for the prediction of the values of degradation rate 𝒄DM, 𝒄CP and 𝒄STA or any other parameter of degradation of cell wall, including the effective degradability 𝑬𝑫NDF. NIRS calibration models constructed for the prediction of fermentation parameters of samples of herbage silages or maize silages were more accurate and precise than global NIRS equations developed from the whole silage samples collection, showing that it is possible to obtain satisfactory quantitative predictions of pH values and of the lactic acid, acetic acid, soluble nitrogen (N) and ammonia-N contents in both herbage and maize silage samples, whilst the quality prediction by NIRS of the ethanol content in maize silages only allowed a basic classification in ranges. In general, the fermentation products with lower volatility losses during oven drying (lactic vs. ethanol and acetic) showed better NIRS predictions. It is confirmed the utility of the NIRS models developed in the present work as a tool for the rapid and precise nutritional evaluation of the forages and TMR used in Galician dairy farms. The availability of these equations will therefore facilitate the farmers’ adoption of strategic decisions regarding the management of forage area, the need of concentrate supplementation and the formulation of economic rations, promoting the optimization of the use of forages in the dairy cows’ feeding rations and helping, at the same time, to minimize the environmental impact of dairy farming. The NIRS models developed in the present study are currently operational for routine use after being transferred the spectral and mathematical information between the CIAM and LIGAL NIRS instruments, which are standardized for sharing the calibrations between them. The results of the present work led to a substantial improvement in the quality, coverage and analytical capacity of the LIGAL in the area of feed analysis. At the same time, the NIRS equations are actually providing support for research purposes and forage breeding programs at the CIAM. In a process of continuous improvement of the NIRS equations obtained, the collections of feed samples must be subjected to a permanent updating and re-calibration of the SUMMARY XVI existing models in order to incorporate as much as possible of the variability found in the practical conditions of application of the NIRS prediction equations. XVII ABREVIATURAS UTILIZADAS A: absorbancia a: fracción inmediatamente degradábel aALM: fracción inmediatamente degradábel do amidón ACET: ácido acético ACP: análise de compoñentes principais AFIA: Asociación de Industrias de Alimentación Animal de Australia aFND: fracción inmediatamente degradábel da fibra neutro deterxente AOAC: Association of Official Analytical Chemists AMD: amidón aMS: fracción inmediatamente degradábel da materia seca ANOVA: análise da varianza aPB: fracción inmediatamente degradábel da proteína bruta b: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel bALM: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel do amidón bFND: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da fibra neutro deterxente bMS: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da materia seca bPB: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da proteína bruta BUT: ácido butírico c: velocidade de degradación ruminal da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel cALM: velocidade de degradación ruminal da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel do amidón XVIII CEL: celulosa cFND: velocidade de degradación ruminal da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da fibra neutro deterxente CIAM: Centro de Investigacións Agrarias de Mabegondo cMS: velocidade de degradación ruminal da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da materia seca CNET: carbohidratos non estruturais totais CP: compoñentes principais cPB: velocidade de degradación ruminal da fracción insolúbel pero potencialmente degradábel da proteína bruta CSA: carbohidratos solúbeis en auga CV: coeficiente de variación CZ: cinzas DFND: dixestibilidade de fibra neutro deterxente DMO: dixestibilidade da materia orgánica DoTT: dixestibilidade da materia orgánica método Tilley-Terry DMS: dixestibilidade da materia seca DMSTT: dixestibilidade da materia seca método Tilley-Terry DoGas: dixestibilidade da materia orgánica método produción de gas DOMD: materia orgánica dixestíbel por unidade de materia seca DoNDC: dixestibilidade enzimática da materia orgánica método fibra neutro deterxentecelulasa DoPC: dixestibilidade enzimática da materia orgánica método pepsina-celulasa DP: degradabilidade potencial XIX DPALM: degradabilidade potencial do amidón DPFND: degradabilidade potencial da fibra neutro deterxente DPMS: degradabilidade potencial da materia seca DPPB: degradabilidade potencial da proteína bruta D: corrección da tendencia (detrend) DT: degradabilidade teórica ou efectiva DTALM: degradabilidade teórica ou efectiva do amidón DTFND: degradabilidade teórica ou efectiva da fibra neutro deterxente DTMS: degradabilidade ruminal teórica efectiva da materia seca DTPB: degradabilidade ruminal teórica ou efectiva da proteína bruta EE: extracto etéreo ELN: extractivos libres de nitróxeno EM: enerxía metabolizábel EN: enerxía neta ENLm: enerxía neta leite a nivel de mantemento EtOH: etanol FAD: fibra ácido deterxente FB: fibra bruta FEDNA: Federación Española para el Desarrollo de la Nutrición Animal FEGA: Fondo Español de Garantía Agraria FND: fibra neutro deterxente GH: distancia global estandarizada de Mahalanobis HCEL: hemicelulosa XX INRA: Institut National de la Recherche Agronomique ISOBUT: ácido isobutírico ISOVAL: ácido isovalérico k: taxa fraccional de paso no rume LAD: lignina ácido deterxente LAFIGA: Laboratorio Agrario e Fitopatolóxico de Galicia LIGAL: Laboratorio Interprofesional Galego de Análise do Leite Max: valor máximo Min: valor mínimo MLR: regresión lineal múltiple (multiple lineal regression) MO: materia orgánica MOD: materia orgánica dixestíbel MPLS: regresión mediante mínimos cadrados parciais modificada (modified partial least squares regression) MS: materia seca MSC: corrección de efectos aditivos ou multiplicativos causados pola dispersión (multiplicative scatter correction) N: nitróxeno NIRS: espectroscopía de reflectancia no infravermello cercano N-NH3: nitróxeno amoniacal NRC: National Research Council N-Solúbel: mitróxeno solúbel NT: nitróxeno total XXI PB: proteína bruta PCR: regresión por compoñentes principais (principal component regression) PLS: regresión mediante mínimos cadrados parciais (partial least squares regression) PROP: ácido propiónico r: coeficiente de correlación de Pearson R: reflectancia R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración r2: coeficiente de determinación en validación externa REDALAN: Rede Española de Alimentación Animal RER: relación entre o rango de valores de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición RERvc: relación entre rango de valores e o erro de predición en validación cruzada RERve: relación entre rango de valores e o erro de predición en validación externa RMS: raíz media cuadrática (root mean square) RPD: relación entre a desviación estándar do conxunto de mostras para o valor de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición RPDvc: relación entre a desviación estándar e o erro de predición en validación cruzada RPDve: relación entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa RSD: erro estándar residual s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión SAU: superficie agraria útil SD: desviación estándar SEC: erro estándar de calibración XXII SECV: erro estándar de validación cruzada SEL: erro estándar de laboratorio SEP: erro estándar de predición SEPc: erro estándar de predición corrixido por bias SERIDA: Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario SNV: transformación que estandariza e centra os datos de absorbancia de cada lonxitude de onda (standard normal variate) T: estadístico T, análogo a unha t de Student TDN: total de nutrintes dixestíbeis UE: Unión Europea VAL: ácido valérico W-MSC: corrección del efecto multiplicativo da dispersión promediada (weight multiplicative scatter correction) 1 − VR: coeficiente de determinación da validación cruzada XXIII ÍNDICE TÁBOAS 1 Composición media anual da dieta consumida polas vacas en lactación, en porcentaxe sobre a MS total 15 2 Consumo medio de forraxes, concentrados e materias primas nunha mostra de explotacións de leite de Galiza, en porcentaxe de cada alimento sobre o total de MS anual da explotación 15 3 Valores medios (e desviación estándar) do contido en materia seca, composición química, dixestibilidade e parámetros fermentativos dos principais alimentos utilizados nas explotacións leiteiras galegas 17 4 Valores medios (e rango de variación) da composición química e dixestibilidade da materia orgánica de cultivos forraxeiros pratenses e anuais de Francia 22 5 Capacidade preditiva dos compoñentes da parede celular para estimar a dixestibilidade da materia orgánica das forraxes 33 6 Capacidade preditiva de diversas ecuacións de regresión baseadas nos contidos en PB e compoñentes da parede celular para estimar a dixestibilidade da materia orgánica de forraxes 33 7 Valores medios de composición química e dixestibilidade in vivo da materia orgánica da colección de mostras de forraxes verdes, ensilaxes e fenos da Rede Española de Alimentación Animal (REDALAN) 2003-2006 39 8 Mellores modelos de predición de DMO baseadas en compoñentes químicos obtidos para a colección de mostras de forraxes da Rede Española de Alimentación Animal (REDALAN) 2003-2006 40 9 Tamaño do conxunto de calibración utilizado por diversos autores para o desenvolvemento de modelos de predición NIRS 55 10 Precisión esperada en determinacións de laboratorio para determinar o valor nutricional de forraxes 57 11 Criterio de interpretación do parámetro coeficiente de determinación da validación cruzada ( 1 − 𝑉𝑅 ) 60 12 Calidade da predición das ecuacións NIRS en función do parámetro 𝑅𝐸𝑅 61 13 Clasificación de valores dos estatísticos de 𝑅𝑃𝐷 e 𝑅𝐸𝑅 nas calibracións NIRS para o control de produtos e procesos 62 14 Criterios de interpretación dos valores do coeficiente de variación en relación co control NIRS de produtos e procesos 63 XXIV 15 Comparación da calidade preditiva de parámetros químicos de distintas forraxes mediante NIRS en mostras secas e moídas 67 16 Comparación da calidade preditiva de parámetros fermentativos de distintas ensilaxes mediante NIRS 76 17 Rango de variación para os erros de predición dos principais parámetros determinados en forraxes e alimentos destinados aos ruminantes no INRA 81 18 Comparación da calidade preditiva da dixestibilidade e valor enerxético de distintas forraxes mediante NIRS 84 19 Comparación da calidade preditiva dos parámetros da degradabilidade ruminal de distintas forraxes mediante NIRS 88 20 Tamaño e características da composición botánica do colectivo de mostras 98 21 Número de mostras con determinacións de dixestibilidade in vivo e de dixestibilidade in vitro corrixidas por estándares nos diferentes grupos de forraxes e mesturas unifeed 106 22 Erro estándar do método de referencia para a determinación da composición química e dixestibilidade in vitro e in vivo 108 23 Erro estándar do método de referencia para a determinación de parámetros de calidade fermentativa de ensilaxes 108 24 Erro estándar do método de referencia na determinación de parámetros de degradabilidade ruminal in situ de ensilaxes de herba e ensilaxes de planta enteira de millo 109 25 Composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección total de mostras de forraxes frescas utilizadas para a obtención de ecuacións empíricas para a predición de DMO 117 26 Matriz de correlacións entre parámetros de composición química e dixestibilidade da materia orgánica do total da colección universal de mostras de forraxes frescas utilizadas para a obtención de ecuacións empíricas 118 27 Ecuacións universais baseadas en parámetros químicos para a predición da dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de forraxes frescas 120 28 Estatísticos de calibración e validación das ecuacións universais baseadas en parámetros químicos para a predición da dixestibilidade da materia orgánica das mostras de forraxes frescas 120 29 Estatísticos de calibración e validación cruzada das ecuacións NIRS para estimación da composición química e da dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de forraxes frescas 124 XXXI ÍNDICE FIGURAS 1a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para a colección de mostras de forraxes frescas 125 1b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para a colección de mostras de forraxes frescas (Continuación) 126 2 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para a colección de mostras de forraxes frescas 126 3 Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS en validación externa para mostras de pastos frescos 144 4 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS en validación externa para mostras de pastos frescos 145 5 Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de chícharo, de triticale e das súas mesturas, en estado fresco 159 6 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de chícharo, de triticale e das súas mesturas, en estado fresco 160 7 Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS en validación externa para mostras de planta enteira de millo en estado fresco 167 8 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS en validación externa para mostras de planta enteira de millo en estado fresco 168 9a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de sorgo e os seus compoñentes morfolóxicos, en estado fresco 176 9b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de sorgo e os seu compoñentes morfolóxicos, en estado fresco (Continuación) 177 XXXII 10 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de sorgo e os seus compoñentes morfolóxicos, en estado fresco 177 11a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de xirasol e as súas fraccións, en estado fresco 187 11b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de xirasol e as súas fraccións en estado fresco (Continuación) 188 12 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de planta enteira de xirasol e as súas fraccións, en estado fresco 189 13 Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para a colección de mostras de forraxes ensiladas 197 14 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medida polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para a colección de mostras de forraxes ensiladas 198 15a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba 208 15b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba (Continuación) 209 16 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba 209 17a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo 221 17b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo (Continuación) 222 18 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo 222 19 Plot de valores de dixestibilidade da fibra neutro deterxente medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo 223 XXXIII 20a Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed 237 20b Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed (Continuación) 238 21 Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed 238 22 Plot de valores de parámetros fermentativos medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións universais NIRS para mostras de ensilaxes de herba e de planta enteira de millo 273 23 Plot de valores de parámetros fermentativos medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba 278 24 Plot de valores de parámetros fermentativos medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo 283 XXXIV Indice xeral 2 3 Índice xeral 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 11 1.1 A base forraxeira das explotacións de leite de Galiza ............................................. 11 1.2 As forraxes predominantes nas explotacións leiteiras galegas ................................ 12 1.3 A necesidade de coñecer o valor nutricional das forraxes....................................... 18 1.4 Valoración nutricional de alimentos para ruminantes ............................................. 19 1.5 Predición do valor enerxético das forraxes.............................................................. 23 1.6 Métodos de estimación do valor enerxético das forraxes ........................................ 24 1.6.1 Determinación da dixestibilidade in vivo .......................................................... 25 1.6.2 Técnicas alternativas da estimación do valor enerxético de forraxes ............... 27 1.6.2.1 Valores tabulares de composición de alimentos ........................................ 27 1.6.2.2 Uso das ecuacións empíricas baseadas na composición nutricional das forraxes para estimar a dixestibilidade .................................................................... 29 1.6.2.3 Métodos in vitro ......................................................................................... 35 1.7 Ecuacións de predición da dixestibilidade de forraxes obtidas pola Rede Española de Alimentación Animal (REDALAN) .......................................................................... 38 1.8 A caracterización proteica das forraxes ................................................................... 41 1.8.1 Medida in situ da degradabilidade ruminal ....................................................... 43 1.9 A Espectroscopía de reflectancia no infravermello cercano (NIRS) ....................... 44 1.9.1 Orixe e fundamento da tecnoloxía NIRS .......................................................... 44 1.9.2 Instrumentación e modos de análise ................................................................. 46 1.9.3 Quimiometría e a súa aplicación na tecnoloxía NIRS ...................................... 48 1.9.4 Análise de compoñentes principais .................................................................... 51 1.9.5 Detección de mostras anómalas ou outliers ....................................................... 51 1.9.6 Análise cuantitativa ........................................................................................... 52 1.9.7 Selección do modelo de calibración ................................................................. 57 1.9.8 Avaliación da capacidade preditiva do modelo de calibración ......................... 58 1.9.9 Estandarización de instrumentos e transferencia de calibracións ..................... 63 1.9.10 Monitorización da validez das ecuacións NIRS ............................................. 64 4 1.10 Utilización da tecnoloxía NIRS para a caracterización dos alimentos para o gando .............................................................................................................................. 65 1.10.1 Predición de compoñentes químicos ............................................................... 66 1.10.1.1 Cinzas ....................................................................................................... 70 1.10.1.2 Proteína..................................................................................................... 71 1.10.1.3 Fibra ......................................................................................................... 72 1.10.1.4 Extracto etéreo.......................................................................................... 73 1.10.1.5 Carbohidratos non estruturais .................................................................. 74 1.10.2 Predición de parámetros fermentativos en ensilaxes ....................................... 75 1.10.3 Predición de parámetros biolóxicos ................................................................. 78 1.10.3.1 Predición da dixestibilidade ..................................................................... 79 1.10.3.2 Predición de parámetros de degradabilidade ruminal ............................... 85 2. OBXECTIVOS ........................................................................................................... 93 3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 97 3.1 Material vexetal ........................................................................................................ 97 3.1.1 Forraxes frescas ................................................................................................. 97 3.1.1.1 Herba de pradeiras, pastos permanentes e cultivos de inverno de trevos anuais e as súas mesturas con raigrás ...................................................................... 97 3.1.1.2 Chícharo, triticale e as súas mesturas .......................................................... 99 3.1.1.3 Planta enteira de millo ................................................................................. 99 3.1.1.4 Planta enteira e compoñentes morfolóxicos de sorgo ................................. 99 3.1.1.5 Planta enteira e compoñentes morfolóxicos de xirasol ............................... 99 3.1.2 Forraxes ensiladas ............................................................................................ 100 3.1.2.1 Ensilaxes de herba ..................................................................................... 100 3.1.2.2 Ensilaxes de millo ..................................................................................... 101 3.1.3 Fenos de herba ................................................................................................. 101 3.1.4 Mesturas unifeed .............................................................................................. 101 3.2 Métodos analíticos de referencia ............................................................................ 102 3.2.1 Análises químicas por vía húmida ................................................................... 102 3.2.2 Análises de parámetros fermentativos ............................................................. 103 3.2.3 Análises de parámetros biolóxicos .................................................................. 103 3.2.3.1 Determinación da dixestibilidade in vivo .................................................. 103 3.2.3.2 Determinación da dixestibilidade in vitro ................................................. 105 3.2.3.2 Degradabilidade ruminal in situ ................................................................ 106 5 3.2.4 Erro estándar dos métodos de referencia ......................................................... 107 3.3 Análise estatística na construción das ecuacións de regresión baseadas en parámetros químicos ..................................................................................................... 109 3.4 Desenvolvemento de ecuacións NIRS .................................................................... 111 3.4.1 Análise e instrumentación NIRS ...................................................................... 111 3.4.2 Tratamento quimiométrico dos datos espectrais .............................................. 112 3.4.3 Selección das ecuacións de calibración NIRS e avaliación da súa capacidade preditiva .................................................................................................................... 113 4. RESULTADOS ........................................................................................................ 117 4.1 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de forraxes en estado fresco ............................................................................................................................ 117 4.1.1 Modelo xeral para forraxes en estado fresco .................................................. 117 4.1.1.1 Ecuacións empíricas ................................................................................. 117 4.1.1.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 121 4.1.2 Pastos frescos .................................................................................................. 127 4.1.2.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 127 4.1.2.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 140 4.1.3 Cultivos de inverno: Chícharo, triticale e as súas mesturas en estado fresco .. 146 4.1.3.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 146 4.1.3.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 155 4.1.4 Planta enteira de millo en estado fresco ......................................................... 161 4.1.4.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 161 4.1.4.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 164 4.1.5 Planta enteira de sorgo e as súas fraccións en estado fresco........................... 169 4.1.5.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 169 4.1.5.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 173 4.1.6 Planta enteira de xirasol e compoñentes morfolóxicos en estado fresco ........ 178 4.1.6.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 178 4.1.6.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 183 4.2 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de forraxes ensiladas. .... 190 4.2.1 Modelo xeral para forraxes ensiladas ............................................................. 190 4.2.1.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 190 4.2.1.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 194 4.2.2 Ensilaxes de herba .......................................................................................... 199 6 4.2.2.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ....................................... 199 4.2.2.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO ....... 204 4.2.3 Ensilaxes de planta enteira de millo ............................................................... 210 4.2.3.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO ...................................... 210 4.2.3.2 Ecuacións empíricas para a predición de DFND .................................... 214 4.2.3.3 Ecuacións NIRS para a predición da composición química, DMO e DFND .................................................................................................................... 217 4.3 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de fenos de herba .......... 224 4.3.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO .............................................. 224 4.3.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO .............. 226 4.4 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de mesturas unifeed ...... 229 4.4.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO .............................................. 229 4.4.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO .............. 233 4.5 Modelos preditivos para a estimación dos parámetros de degradabilidade ruminal in situ de ensilaxes de herba e de millo ............................................................................ 239 4.5.1 Predición da degradabilidade ruminal de ensilaxes de herba .......................... 239 4.5.1.1 Ecuacións empíricas ................................................................................. 239 4.5.1.2 Ecuacións NIRS ....................................................................................... 248 4.5.2 Predición da degradabilidade ruminal de ensilaxes de millo .......................... 253 4.5.2.1 Ecuacións empíricas ................................................................................. 253 4.5.2.2 Ecuacións NIRS ....................................................................................... 264 4.6 Modelos preditivos para a estimación de parámetros fermentativos de ensilaxes. 269 4.6.1 Modelo xeral ................................................................................................... 269 4.6.2 Ensilaxes de herba .......................................................................................... 274 4.6.3 Ensilaxes de millo ........................................................................................... 279 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................. 287 5.1 Modelos xerais para a estimación da composición química e dixestibilidade de forraxes ......................................................................................................................... 287 5.2 Pastos frescos ......................................................................................................... 297 5.3 Cultivos de inverno en estado fresco ..................................................................... 304 5.4 Planta enteira de millo en estado fresco ................................................................ 310 5.5 Planta enteira de sorgo e fraccións en estado fresco ............................................. 316 5.6 Planta enteira de xirasol e fraccións en estado fresco ........................................... 321 5.7 Ensilaxes de herba ................................................................................................. 325 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 13 millo rota con raigrás italiano (en mestura ou non con trevos anuais) ou outros cultivos de inverno, como cereais de grao pequeno (centeo, triticale ou avea, fundamentalmente) en mestura ou non con algunha leguminosa (veza ou chícharo). Os cultivos de inverno e de verán son aproveitados como ensilado na súa práctica totalidade. O aproveitamento da herba como ensilado é realizado de forma xeral en tódalas explotacións, conservando desta forma os primeiros e ocasionalmente os segundos cortes e secando a herba no campo para realizar feno nos cortes tardíos de pradeiras a mediados-finais de xullo ou de prados en zonas máis húmidas, en ocasións mediante un único aproveitamento do crecemento de primavera-verán. Por outra banda, as proporcións relativas ocupadas por herba e cultivos forraxeiros cambian co tamaño das explotacións, existindo no conxunto da mostra estudada unha correlación positiva entre a porcentaxe de SAU ocupada polo cultivo de millo e o tamaño da explotación, a produción total de leite e a produtividade por vaca. Así, mentres que nas explotacións máis pequenas (< 175 t de leite/ano) a relación entre as respectivas superficies se aproximaba ao ratio 80/20, nas de máis de 325 t de leite/ano se incrementaba claramente a proporción de terras cultivadas, acadando un valor de 55/45 entre a porcentaxe de superficie de herba e de millo. Unicamente en determinadas explotacións de zonas máis altas e frías, onde o cultivo do millo presenta dificultades, as granxas de maior dimensión adoptan modelos baseados de forma case exclusiva no aproveitamento da herba mediante ensilado, alimentando as vacas estabuladas con racións completas onde predomina esta forraxe e que normalmente coexisten con granxas que realizan pastoreo coas vacas en produción durante os períodos de crecemento activo do pasto. O estudo evidenciaba, por tanto, a maior intensificación da produción forraxeira nas explotacións máis grandes, dada a superior produtividade de MS por hectárea das rotacións de dous cultivos por ano con millo como cultivo de verán (18-20 t MS/ha para o total da rotación) que chegaría a duplicar á de prados e pradeiras (7-12 t MS/ha) segundo información extraída de diversos estudos do CIAM (Piñeiro e Díaz, 2005, Botana et al., 2016b). Esta diversidade de aproveitamentos dos recursos forraxeiros configura os principais modelos produtivos das explotacións leiteiras galegas descritos noutros traballos, entre eles os de Flores et al. (2017), de Botana et al. (2018) e de Botana (2019), caracterizados pola realización ou non do pastoreo e pola proporción relativa das ensilaxes de millo e de herba na alimentación das vacas. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 14 Como se indica no traballo de Botana et al. (2018), deixando aparte un reducido grupo de granxas que basean a alimentación forraxeira en fenos producidos na propia explotacións e alfalfas e outras forraxes desecadas procedentes do exterior, se estima que as explotacións de pastoreo, ocupando o 16% da SAU das explotacións de leite, co 12% do total das vacas, producirían o 9% do total do leite de Galiza, mentres que o grupo de granxas que basean a alimentación en ensilaxes de herba terían unha ocupación do 22% do total da SAU leiteira, manexarían o 17% das vacas e producirían o 13% do total do leite. Son as explotacións onde a ensilaxe de millo constitúe unha parte importante ou maioritaria da ración das vacas leiteiras as que constitúen a parte con maior peso produtivo galego xa que ocuparían o 58% da SAU total leiteira, manexando o 67% das vacas e sendo responsábeis de case o 75% da produción. Dentro das explotacións de pastoreo de Galiza, as ecolóxicas representarían unicamente o 2,3% da produción total de leite deste grupo en 2014, indicando as posibilidades de incremento desta actividade produtiva. En canto á composición da dieta media das vacas leiteiras en produción nas explotacións galegas, na Táboa 1 se mostra, en base aos traballos anteriores, a participación dos distintos ingredientes na ración media anual expresados en porcentaxe sobre o total de materia seca (MS) consumida para os distintos sistemas de produción. Como pode observarse, no grupo de explotacións que representa o sistema de produción predominante e máis intensivo, baseado no uso de ensilaxe de millo, a proporción de forraxe na dieta diaria é aproximadamente do 60% da MS, representando os concentrados e materias primas o 40% restante, o que evidencia a importancia das forraxes, maioritariamente producidas na propia explotación, na alimentación das vacas. Neste grupo, aproximadamente os 2/3 da ración forraxeira son achegados polas ensilaxes de millo, correspondendo o resto ás ensilaxes de herba e forraxes secas. Unha proporción similar entre forraxes e concentrados (60/40) se observa no grupo de granxas que basean a alimentación forraxeira nas ensilaxes de herba, onde a ensilaxe de millo aínda ten certa presenza. As explotacións de pastoreo fan claramente un uso menos intensivo dos concentrados, representando estes unicamente o 20% da MS diaria total, mentres que a herba fresca supón case o 40% da ración, que se complementa, de media, con ensilaxes de herba e de millo e de forraxes secas no entorno do 16-12% e do 11% da MS total, respectivamente. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 15 Táboa 1.- Composición media anual da dieta consumida polas vacas en lactación, en porcentaxe sobre a MS total Tipo de sistema Herba fresca Ensilaxe herba Ensilaxe millo Forraxes secas Concentrados e mat. primas Pastoreo 39,5 16,6 12,0 11,4 20,5 Ensilaxe de herba 0,0 44,5 13,1 3,0 39,4 Ensilaxes de herba/millo e ensilaxe millo 0,0 10,2-21,9 37,5-46,2 3,0-6,2 38,1-40,2 Fonte: elaboración propia a partir de Botana et al. (2018) Outro traballo, realizado coa participación de 50 granxas leiteiras colaboradoras (Flores et al., 2019) permitiu obter información acerca da composición da dieta dos distintos grupos de animais, incluídas as vacas leiteiras en produción, a recría, vacas secas e resto de bovinos da explotación para ter un coñecemento máis aproximado acerca das cantidades e da composición das forraxes consumidas nas explotacións. Na Táboa 2 se reflicte, para os distintos tipos de explotacións, a proporción que representan as forraxes frescas e conservadas, concentrados e materias primas sobre o total anual de MS consumida polo gando bovino, agás os tenreiros lactantes, expresada en porcentaxe sobre a materia seca total. Táboa 2.- Consumo medio de forraxes, concentrados e materias primas nunha mostra de explotacións de leite de Galiza, en porcentaxe de cada alimento sobre o total de MS anual da explotación Sistema de alimentación forraxeira predominante nas explotacións Baseadas no Pastoreo Baseadas en Ensilaxes Ecolóxicas Convencionais Herba Millo e Millo/herba Herba verde 45,7 32,4 9,7 1,7 Ensilaxe de herba 22,8 30,0 28,5 19,8 Ensilaxe de millo 4,0 3,3 6,6 31,8 Concentrado comercial 14,6 22,9 41,0 33,5 Herba seca 8,6 6,4 8,0 4,7 Palla 1,8 3,8 2,5 4,7 Alfalfa, feno 2,2 0,1 1,8 0,3 Polpa remolacha 0,0 0,9 0,0 0,0 Melaza 0,0 0,0 0,4 0,1 Fariña cereal 0,3 0,1 1,4 0,1 Torta de soia 0,0 0,0 0,0 1,0 Grao húmido de millo 0,0 0,1 0,0 1,3 Bagazo de cervexa 0,0 0,0 0,0 0,9 Fonte: Flores et al. (2019) Como se pode observar, as ensilaxes de herba forman unha parte importante da dieta media anual en tódalas tipoloxías de explotacións (20-30% da MS total), só superadas REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 16 pola contribución da herba fresca nas explotacións de pastoreo (32-45% da MS total) e pola ensilaxe de millo nas máis intensivas (31,8% da MS total). As forraxes secas contribúen aproximadamente nun 10-12% adicional e os concentrados comerciais, cunha ampla variación (14-41% da MS total) completan a práctica totalidade do consumo, con menos dun 3% para outras materias primas alternativas. Derivados dos datos obtidos no traballo anterior, na Táboa 3 se indican os valores medios dos parámetros de composición química e dixestibilidade dos principais alimentos consumidos na mostra das explotacións leiteiras galegas cooperantes, así como da calidade fermentativa das ensilaxes de herba e de millo. A herba fresca mostrou os valores máis altos de dixestibilidade da materia orgánica (DMO: 72,2%) e de proteína bruta (PB: 18,5% MS) e unha baixa proporción de paredes celulares (fibra neutro deterxente, FND: 45,3% MS) mostrando o elevado valor nutricional desta forraxe. As ensilaxes de millo mostraron un valor de DMO tamén elevado pero algo máis baixo que o da herba fresca (70,1%), cun baixo valor proteico (7,0% MS) e un contido en FND semellante ao da herba fresca (45,8% MS) indicando o seu alto valor enerxético e elevada inxestibilidade potencial. As ensilaxes de herba mostraron valores medios de DMO (64,4%) e de PB (11,3% MS) máis baixos que os correspondentes á herba fresca, así como un teor máis elevado de paredes celulares (55% MS) o cal reflicte fundamentalmente o estado de madurez máis avanzado da herba nos cortes para ensilar comparado co aproveitamento a dente. Os fenos mostraron a baixa calidade nutricional que caracteriza aos cortes tardíos de prados e pradeiras realizados a mediados de verán coa herba nun avanzado estado de madurez, mostrando una reducida dixestibilidade (49,8%), baixo contido proteico (6,9% MS) e alta proporción de paredes celulares (69,3% MS). Por outra banda, a composición da palla, procedente polo xeral das zonas cerealistas da meseta, mostra o valor nutricional medio máis baixo (DMO: 39,2%; PB: 3,9% MS; FND: 81,6% MS) sendo unicamente empregada como fonte de fibra ou para cama do gando. O contido en MS das ensilaxes de herba (36,2%) reflicten a realización xeneralizada do presecado da herba segada no campo que consegue promover, de media, unha correcta calidade fermentativa, mostrando valores de pH de 4,10 e unha fermentación predominantemente láctica, con valores de ácido acético (ACET) inferiores ao 2% MS e de ácido láctico (LACT) próximos ao 7% MS, mentres que a proporción de nitróxeno REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 17 (N) amoniacal respecto do N total mostra un valor medio de 6,6%, por debaixo do valor umbral do 7-8% que caracteriza ás ensilaxes cunha reducida proteólise no silo (Pflaum et al., 1997). As ensilaxes de millo reproduciron os típicos valores desta forraxe evidenciando a súa capacidade para fermentar correctamente, cun contido medio en MS do 32,3%, baixo pH (3,57) e contidos de láctico (6,4% MS), acético (1,6% MS) e N amoniacal (8,7% MS) frecuentemente encontrados nas ensilaxes desta planta. Táboa 3.- Valores medios (e desviación estándar) do contido en materia seca, composición química, dixestibilidade e parámetros fermentativos dos principais alimentos utilizados nas explotacións leiteiras galegas Herba (n=72) E. Herba (n=256) E. Millo (n=194) Feno (n=51) Palla (n=33) Unifeed (n=93) Concentrado (n=190) MS 18 , 3 36 , 2 32 , 3 - - 44 , 5 86 , 5 (4,8) (10,3) (3,6) (7,3) (0,9) MO 88 , 7 91 , 6 96 , 3 93 , 6 94 , 9 92 , 9 94 , 3 (2,1) (1,9) (0,5) (1,2) (0,8) (1,5) (1,1) PB 18 , 5 11 , 3 7 , 0 6 , 9 3 , 9 15 , 0 19 , 8 (4,4) (2,7) (1,0) (2,8) (0,4) (1,6) (4,2) FND 45,3 55,6 45,8 69,3 81,6 38,7 - (6,7) (6,8) (3,5) (8,3) (2,7) (3,4) FAD 25,1 36,0 24,7 41,8 49,1 22,4 - (4,5) (4,3) (2,9) (4,6) (2,7) (2,8) FB - - - - - 18,3 5,7 (2,4) (1,6) CSA 9 , 4 - - - - - - (3,4) EE - - - - - 3 , 5 3 , 8 (0,6) (1,1) ALM - - 28 , 7 - - 23 , 5 33 , 8 (5,8) (5,0) (7,5) DMO 72,2 64,4 70,1 49,8 39,2 74,6 - (4,4) (6,4) (1,9) (10,0) (3,1) (3,2) pH - 4,07 3,58 - - - - (0,45) (0,13) LACT - 6,9 6,4 - - - - (4,2) (1,6) ACET - 1 , 9 1 , 6 - - - - (0,8) (0,4) N - Solúbel - 46 , 6 60 , 4 - - - - (9,9) (5,1) N - NH 3 - 6 , 6 8 , 7 - - - - (3,8) (1,2) n: número de observacións; MS: materia seca (%); MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FB: fibra bruta (%MS); CSA: carbohidratos solúbeis en auga (%MS); EE: extracto etéreo (%MS); ALM: amidón (%MS); DMO: dixestibilidade da MO (%); LACT: ácido láctico (%MS); ACET: ácido acético (%MS); N-Solúbel: Nitróxeno (N) solúbel (% N Total); N-NH3: N amoniacal (% N Total) Fonte: Flores et al. (2019) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 18 1.3 A necesidade de coñecer o valor nutricional das forraxes Os ruminantes ocupan unha posición estratéxica con relación ao home, producindo proteína de alto valor biolóxico para o seu consumo, a partir de alimentos fibrosos e fontes de nitróxeno non proteico que non poden ser utilizados directamente polos humanos. Por esta razón, os ruminantes se sitúan nun nicho ecolóxico vital como vectores de nutrientes para os humanos (Van Soest, 1994). Nunha revisión sobre os impactos medioambientais das estratexias de alimentación animal, Tamminga (1996) indica que o uso de enerxía fósil na obtención de alimentos para ruminantes varía, por kg de materia seca producida, de 1 a 3 megaxulios para as forraxes até máis de 8 megaxulios para os concentrados, indicando que a intensificación forraxeira das explotacións é unha vía de reducir el input de enerxía fósil destinada á produción de alimentos para o gando, e así contribuír á diminuír o impacto medioambiental da produción gandeira. O coñecemento preciso da composición dos alimentos para o gando é unha condición necesaria para a súa utilización eficiente na alimentación animal, a través da preparación de dietas económicas e equilibradas. Tal información é clave cando se trata de alcanzar os altos niveis de produción animal requiridos hoxe en día nos mercados competitivos actuais, sen esquecer os requirimentos dos consumidores acerca da calidade e seguridade dos produtos, así como a sensibilidade dos consumidores cara sistemas de produción cun impacto ambiental menor. Para aproveitar as capacidades dos programas informáticos complexos desenvoltos nos últimos anos para o cálculo de racións para o gando vacún, utilizadas pola maioría dos nutricionistas, é necesario dispoñer dun sistema preciso e fiábel de valoración nutricional dos ingredientes que compoñen as racións. Desta forma, o nutricionista que formula as racións para o gando vacún de leite necesita coñecer, fundamentalmente, o contido enerxético e o valor proteico das forraxes. O avance dos coñecementos científicos sobre a fermentación ruminal obrigou a cambios importantes na formulación de racións para vacas de leite. A sincronía ruminal dos aportes de enerxía e proteína permite reducir os custos de alimentación, mellorar o benestar animal en base á redución dos desequilibrios do funcionamento ruminal e diminuír a concentración de NH3 no rume (Sniffen et al., 1992), diminuíndo a excreción de N ao medio, coa conseguinte redución do impacto ambiental da actividade gandeira. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 19 A necesidade de contar con métodos que permitan realizar unha avaliación nutritiva das forraxes se xustifica debido á elevada variabilidade que presentan no seu valor nutricional e á alta contribución relativa que realizan ao total da materia seca consumida polas vacas de leite. O seu coñecemento é un prerequisito para a formulación de racións, para a súa avaliación económica e para a predición das respostas animais obtidas (Buckmaster e Muller, 1994). Por outra parte, como indican entre outros autores Hristov et al. (2010) e McBeth et al. (2013) o coñecemento da composición química e o valor nutricional dos alimentos para o gando é fundamental para a planificación da produción forraxeira das explotacións, de forma que os cultivos elixidos e o seu manexo respondan as necesidades dunha dieta equilibrada e económica para os animais a cuxo consumo van destinados e para elaborar e utilizar de forma precisa das racións de vacas leiteiras como elemento fundamental para unha produción de leite rendíbel e respectuosa co medio ambiente. 1.4 Valoración nutricional de alimentos para ruminantes O valor nutritivo é un concepto multifactorial, pero convencionalmente se clasifica polo nutricionista en tres compoñentes xerais: capacidade de inxestión voluntaria (inxestibilidade), concentración enerxética e valor nitroxenado (Van Soest, 1982). En xeral, a produción animal está limitada en primeiro lugar polo subministro de enerxía e en segundo lugar polo subministro de proteína (Weller e Jones, 2002). O valor nutritivo das forraxes varía fundamentalmente debido a factores relacionados co seu xenotipo, estado fisiolóxico, factores de medio e a consecuencia dos procesos aos que son sometidos (variabilidade intrínseca). Outra importante fonte de variabilidade, con frecuencia ignorada, xorde das diferenzas na metodoloxía utilizada na obtención da información (variabilidade extrínseca), toda vez que os procedementos de análise e os protocolos de obtención de información con animais poden variar de acordo co laboratorio ou centro experimental onde se desenvolven os traballos. Os sistemas tradicionais para determinar o contido de fibra vexetal desde o punto nutricional o método de análise proximal ou de Weende e o método de fraccionamento de Van Soest. A metodoloxía de análise de Weende foi ideado por Henneberg e Stohmann (1859) na estación experimental de Weende (Alemaña). O método consiste en separar, a partir da MS da mostra, unha serie de fraccións que presentan unhas certas REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 20 características comúns de solubilidade ou insolubilidade en diferentes reactivos. Con este método obtéñense cinco principios nutritivos brutos que inclúen: 1) as cinzas (CZ) compostos de materiais inorgánicos en xeral, 2) a proteína bruta (PB) que xunto á proteína verdadeira inclúe péptidos, aminoácidos, bases nitroxenadas, amidas e outros compostos nitroxenados, 3) o extracto etéreo (EE) composto por graxas, ceras, resinas, lípidos complexos, pigmentos e vitaminas liposolubles, 4) a fibra bruta (FB) integrada por celulosa (CEL), hemicelulosa (HCEL), lignina e cutina e 5) os extractivos libres de nitróxeno (ELN) que se compoñen de amidón e azucres ademais de recoller unha porción doutros compostos integrantes doutras fraccións. As catro primeiras fraccións (CZ, PB, FB, EE) obtéñense a partir de análises específicas, mentres que a quinta (ELN) calcúlase restando á porcentaxe de MS as catro fraccións anteriores. Os nutrólogos consideran a análise proximal dos alimentos arcaica e pouco exacta, debido fundamentalmente a que o contido en FB subestima a proporción de paredes celulares na planta e recupera só unha fracción variábel de HCEL, CEL e lignina que aparecen incorporadas á fracción ELN (Van Soest, 1994), razón pola cal en numerosos casos a dixestibilidade de ELN é máis baixa que a da propia FB. Sen embargo, o método de determinación da FB do sistema Weende segue a ser utilizado hoxe porque é un método oficial da AOAC e existe unha ampla base de datos acumulada procedente de forraxes moi diversos, ademais de ser un método analítico de baixa dificultade (Jung, 1997). Un avance substancial na descrición nutricional dos alimentos do gando foi a proposta analítica de P. Van Soest (1963) que dividía aos compoñentes do alimento en tres fraccións en relación ao aproveitamento dixestivo do animal (totalmente dixestíbel, parcialmente dixestíbel e indixestíbel), sendo este o sistema máis difundido globalmente. Os compostos obtidos mediante esta técnica teñen, por tanto, unha aparente significación biolóxica, acorde co aproveitamento que os ruminantes fan dos mesmos. No desenvolvemento do modelo (Van Soest, 1994) se consideran dúas partes diferenciadas na célula vexetal: o contido celular ou protoplasto, constituído por sustancias dixestíbeis, e a parede celular, de dixestibilidade variábel, realizándose a separación das dúas fraccións mediante o uso de deterxentes iónicos. Así, o contido celular (constituído por sustancias hidrosolúbeis, azucres, lípidos, ácidos orgánicos, pectinas, amidón, proteínas e nitróxeno non proteico) é solúbel en deterxente neutro, mentres que a fracción insolúbel, excepto as pectinas, corresponde aos constituíntes da REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 21 parede celular ou FND. Nesta fracción, a súa vez, divídese nunha parte solúbel en deterxente ácido composta por HCEL e proteína e outra fracción insolúbel constituída por CEL, LAD, compostos nitroxenados lignificados, cutina e a proteína alterada pola calor, denominada fibra ácido deterxente (FAD). A dixestibilidade do contido celular dunha forraxe é practicamente total, mentres que a celulosa, a hemicelulosa e as pectinas son degradadas mediante enzimas producidas polas bacterias do rume, sendo a lignina, polo contrario, completamente indixestíbel (Van Soest, 1994). A lignina está unida mediante enlaces covalentes á celulosa e sobre todo á hemicelulosa e limita a eficacia de acción dos microorganismos ruminais na hidrólise destes compostos. Consecuentemente, a dixestibilidade das forraxes está determinada fundamentalmente polo grao de lignificación das paredes celulares conxuntamente coa proporción desta fracción na MS total (Goering e Van Soest, 1970). Diversos sistemas de alimentación de ruminantes (entre outros NRC 2001 e INRA 2010) utilizan os valores de FND e FAD relacionándoos, respectivamente, coa inxestibilidade potencial e coa dixestibilidade das forraxes, sendo establecidos níveis umbral ou obxectivo destes constituíntes para optimizar a utilización da ración e garantir un correcto funcionamento do rume. No detallado estudo sobre a composición química e a dixestibilidade in vivo das forraxeiras clásicas de Francia, Demarquilly e Andrieu (1992) describiron as principais características dunha ampla mostra de forraxes en estado fresco (Táboa 4) incluíndo pratenses e outros cultivos forraxeiros anuais. Comparando con resultados doutros países europeos, os autores indican que os resultados franceses terían un valor orientativo para outros países do norte de Europa, polo menos para os primeiros ciclos das especies pratenses e para os cultivos forraxeiros anuais, polo que é de interese a súa revisión. No citado estudo se inclúen os resultados de máis de 1700 mostras de diferentes especies pratenses colleitadas desde o estado vexetativo até a floración para os primeiros ciclos e os rebrotes sucesivos á idade de 4-8 semanas. Os contidos medios (en %MS) de CZ, PB e FB foron de 10,0%, 14,5% e 27,0%, respectivamente, mentres que o da DMO foi de 71,0%. Existe un amplo rango de variación, en particular para o contido en PB, sobre todo en gramíneas, onde pode variar de 5,0 a 27,5 %MS. Polo contrario, o REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 22 criterio menos variábel é a DMO, aínda que o rango de variación é importante, desde o 50% ao 86% para o conxunto das forraxes estudadas. Táboa 4.- Valores medios (e rango de variación) da composición química e dixestibilidade da materia orgánica de cultivos forraxeiros pratenses e anuais de Francia Forraxe n MS CZ PB FB DMO Pradeira temporal, gramíneas 916 19,1 (10-34) 10,8 (5-24) 14,3 (5-27) 26,8 (15-38) 71,5 (49-84) Pradeira natural 295 19,2 (11-35) 9,4 (5-21) 14,3 (8-23) 27,0 (17-36) 69,5 (50-82) Pradeira temporal, ano de sementeira 141 16,5 (10-25) 13,0 (8-20) 18,9 (10-27) 24,3 (16-31) 76,0 (60-84) Alfalfa 172 21,3 (14-27) 11,2 (4-17) 22,1 (16-28) 27,8 (16-37) 66,0 (56-80) Trevo violeta 56 15,7 (11-24) 11,8 (9-16) 19,2 (12-24) 22,3 (12-31) 72,0 (57-83) Herba en estado de pastoreo 139 19,2 (12-38) 12,1 (7-20) 15,9 (8-26) 27,2 (18-36) 74,4 (66-85) Millo tras a floración 82 23,4 (13-33) 5,7 (3-8) 8,8 (5-11) 20,1 (14-25) 71,5 (67-79) Cereais tras a floración† 15 32,2 (23-41) 6,98 (4-9) 7,2 (5-10) 29,7 (26-35) 60,6 (57-63) Chícharo tras a floración 3 25,0 (18-33) 8,8 (8-9) 17,2 (16-17) 18,6 (18-19) 75,4 (73-75) n: número de observacións; MS: materia seca (%); CZ: cinzas (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FB: fibra bruta (%MS); DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%) † avea, trigo, cebada, centeo e sorgo forraxeiro Fonte: Demarquilly e Andrieu (1992) Para outros cultivos forraxeiros, o citado traballo de Demarquilly e Andrieu (1992) mostra rangos de variación máis estreitos que no caso das pratenses. No caso da planta de millo, a DMO é practicamente constante desde a floración á madurez do grao (valor medio 71-72%) posto que o incremento no total da planta da proporción de espiga, cuxa dixestibilidade é constante e arredor dun 83%, compensa o descenso de dixestibilidade do resto da planta, que descende desde o 70 ao 60% entre ambos estados. Os sorgos forraxeiros e os cereais grao teñen unha dixestibilidade próxima ao 80% en estado vexetativo, antes do comezo de elongación dos talos, e diminúe rapidamente a partir do encanado, para estabilizarse a partir do estado leitoso do grao, con valores entre o 58% (avea, centeo e sorgo forraxeiro) e o 63% (trigo e cebada). Na fase de maduración a DMO é claramente máis baixa que a da planta de millo, debido a que os talos destas REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 29 información relacionada coas características químicas e nutricionais dunha forraxe debe ser coidadosamente examinada antes da súa incorporación a unha base de datos e, unha vez incorporada, necesita ser manexada tamén con coidado. De non facelo así, producirase unha falsa variabilidade entre forraxes, que pode comprometer o uso na práctica da información xerada. 1.6.2.2 Uso das ecuacións empíricas baseadas na composición nutricional das forraxes para estimar a dixestibilidade De uso xeneralizado desde hai décadas, as ecuacións empíricas obtidas a partir das asociacións estatísticas entre a dixestibilidade e determinadas fraccións químicas das mostras, son usadas aínda na actualidade para obter información acerca do valor enerxético de forraxes. Os métodos usados para predicir DMO consisten basicamente en definir relacións matemáticas para relacionar os valores in vivo cos resultados das análises realizadas no laboratorio (Vermorel, 1978). A literatura científica contén unha ampla colección de ecuacións de predición que relacionan fraccións do alimento coa dixestibilidade, aspecto que foi revisado exhaustivamente por diversos autores, sendo de salientar o clásico traballo de Minson (1982), a este respecto. Os constituíntes dos alimentos poden ser clasificados, en relación ao seu efecto sobre a dixestibilidade, como uniformes e non uniformes atendendo ao test de Lucas (Lucas, 1964). As fraccións uniformes teñen dixestibilidade constante para todo tipo de alimentos (cinzas, lignina, solubles en deterxente neutro e ácidos graxos), mentres que as non uniformes (parede celular, por exemplo) mostran unha dixestibilidade variábel entre diferentes alimentos e para os mesmos alimentos dependendo de factores como estado de madurez e condicións ambientais, entre outros. A existencia dunha correlación entre un constituínte do alimento e a dixestibilidade non implica necesariamente unha relación causal e pode deberse a unha mera asociación estatística. Por esta razón moitas ecuacións de predición baseadas en parámetros químicos son enteiramente dependentes da poboación na que se obtiveron, e a relación observada entre a variábel dependente (dixestibilidade ou contido enerxético) e os preditores non é a mesma para os distintos tipos de forraxes e incluso é diferente dentro da mesma forraxe, toda vez que esta relación está condicionada, entre outros, por factores ambientais, condicións de cultivo, procesado post-colleita e manexo no almacenamento até o seu consumo, entre outros (Weiss, 1993). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 30 As ecuacións derívanse de regresións establecidas entre a DMO in vivo e a concentración dunha determinada fracción química, usualmente a estimación da parede celular, da lignocelulosa, da fibra bruta, da lignina ou a proteína. Estes modelos de regresión deben ser construídos e validados para áreas xeográficas concretas a partir de bases de datos suficientemente amplas construídas a partir de mostras analizadas por métodos de referencia no laboratorio e das cales se coñezan os valores de DMO in vivo. Baixo esta premisa, e dado o efecto que as condicións de medio exercen sobre a relación entre a composición química das forraxes e a súa DMO ou valor enerxético (Van Soest et al., 1978), é xeralmente recoñecido que a exactitude e precisión das estimacións proporcionadas polas ecuacións de predición de valor enerxético das forraxes será moito máis elevada cando se utilizan ecuacións obtidas na mesma área xeográfica de procedencia das mostras que recibe o laboratorio, comparado coa aplicación de ecuacións foráneas, procedentes doutros ambientes, e con frecuencia non contrastadas ou validadas. A temperatura e a intensidade da luz afectan á lignificación da parede celular da forraxe, favorecendo as temperaturas suaves e a maior intensidade lumínica un menor grao de lignificación, mentres que temperaturas altas e baixa intensidade lumínica exerce un efecto contrario (Van Soest et al., 1978). Como consecuencia, mostras co mesmo contido químico en parede celular e incluso en lignina poden ter valores de DMO significativamente diferentes, motivado polo distinto grao de entrecruzamento da lignina coas cadeas de polisacáridos da parede celular a nivel molecular o que condiciona un diferente nivel de dispoñibilidade para a degradación microbiana das forraxes no rume (Deinum et al., 1968; Van Soest, 1994). É coñecido, a este respecto, que a igualdade da concentración de lignina entre gramíneas e leguminosas, estas mostran unha superior dixestibilidade da materia orgánica debido ao menor contido en paredes celulares, especialmente de hemicelulosa, e a un menor grao de interacción química entre a lignina e a hemicelulosa en comparación coas gramíneas (Gordon, 1975). Frame et al. (1995) na súa revisión sobre os avances na tecnoloxía de produción e utilización de pastos acontecidos na segunda metade do século XX, indican que a predición do valor de enerxía metabolizábel a partir da dixestibilidade da forraxe se introduciu na década de 1960, en base á relativamente boa correlación estatística entre o contido en fibra e a dixestibilidade. O parámetro de calidade da herba máis citado era, sen embargo, a concentración de PB, seguido polo contido en carbohidratos solúbeis e a fibra bruta, sendo complementados pola estimación do valor enerxético derivado dos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 31 valores de composición química. As ecuacións de regresión que relacionaban a dixestibilidade in vivo da materia orgánica como indicador do valor enerxético da forraxe (Raymond, 1969) integraban usualmente como preditor a concentración de paredes celulares e/ou as súas fraccións, acompañada ou non do contido en proteína e, menos frecuentemente, doutros compostos como o contido en carbohidratos non fibrosos (Jones e Moseley, 1993). A posta en práctica do sistema de análises con deterxentes para o fraccionamento da fibra (Van Soest, 1967) permitiu refinar as estimacións obtidas a partir do método proximal de Weende e lograr mellorar a estimación da dixestibilidade in vivo ou da enerxía metabolizábel das forraxes (AFRC, 1990). Se acepta de forma xeral que as fraccións do alimento con maior influencia na dixestibilidade son os compoñentes da parede celular, toda vez que o contido celular das forraxes e os alimentos do gando en xeral son case enteiramente dixestíbeis para o ruminante (Van Soest, 1963; Goering e Van Soest, 1970). Os parámetros relacionados coa descrición da parede celular máis utilizados nas ecuacións de predición son FND, FAD e LAD. A predición das estimacións utilizando estas fraccións da fibra son variábeis tanto entre as distintas fracción como para a mesma fracción, pero en teoría o erro na predición debería reducirse progresivamente a medida que a fracción de fibra representa o constituínte máis indixestíbel, é dicir, desde FND a FAD e posteriormente a LAD (Kitessa et al., 1990). Sen embargo isto non é sempre certo debido, entre outros factores, ás imprecisións cometidas na determinación das fraccións, o cal afecta sobre todo á utilización da lignina como preditor, sobre todo no caso de forraxes e outros alimentos onde a súa concentración é baixa. Outro elemento de importancia é a variabilidade na expresión da mesma fracción, toda vez que a lignina nas forraxes pode ser expresada como LAD-permanganato (Van Soest, 1963), LAD-sulfúrico (Goering e Van Soest, 1970) ou lignina determinada con bromuro de acetilo (Morrison, 1972a,b) que renden valores lixeiramente diferentes sobre a mesma mostra. A fiabilidade dos modelos de predición tende a mellorar, de forma xeral, cando aqueles se aplican ao mesmo tipo de forraxes usados para xerar as ecuacións, debido a que estas son poboación-dependentes e a súa aplicación a outros tipos de forraxe conleva un incremento no erro de predición (Weiss, 1994). A fin de solventar esta dependencia das coleccións utilizadas na calibración dos modelos, Goering e Van Soest (1970) desenvolveron ecuacións sumativas baseadas na uniformidade da dixestibilidade do REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 32 contido celular, determinado mediante a solubilidade no deterxente neutro, mediante a expresión DMS(%) = [0,98 x (100 - FND)] + (kd-FND x FND) - 12,9; onde DMS é a dixestibilidade da materia seca, FND se expresa en %MS e o coeficiente kd-FND é a dixestibilidade da FND (%), representado o valor 12,9 a excreción metabólica fecal. Como indican distintos autores, entre eles Aerts et al. (1977) o uso de ecuacións sumativas na predición da dixestibilidade, en comparación co uso de fraccións de fibra, permite obter unha maior precisión. Sen embargo, non evita o problema da estimación do valor de dixestibilidade da FND, o cal constitúe, en definitiva, o elemento esencial da determinación da dixestibilidade e valor enerxético dos alimentos. Na revisión realizada por Kitessa et al. (1990) sobre métodos de estimación da dixestibilidade de alimentos para os ruminantes, se indica que a principal avantaxe de usar ecuacións baseadas na composición química das forraxes é que a determinación dos preditores é simple, razoabelmente rápida e relativamente barata. As súas desavantaxes se relacionaban, sobre todo, co feito de que non teñen en conta os efectos de determinados tratamentos e procesos que poden sufrir as mostras (mecánicos, químicos ou por calor, por exemplo) que teñen efecto sobre a dixestibilidade pero que non alteran substancialmente a composición química da mostra e que contribúen a explicar a súa menor precisión comparada con outros métodos alternativos. Como indica Osbourn (1978), a estimación da dixestibilidade da materia orgánica das forraxes mediante ecuacións a partir das concentracións de lignina ou de lignocelulosa ten un erro de como mínimo o 7% do valor predito, advertindo que o efecto do ambiente na relación entre a dixestibilidade e os preditores de composición química das forraxes implica un marcado incremento do erro cando as ecuacións se aplican fóra das zonas climáticas locais onde foron obtidas, ou en estacións con anomalías climáticas importantes. Cando se asocian os parámetros compoñentes da parede celular co contido en proteína, a estimación da dixestibilidade é razoabelmente precisa, con valores da desviación estándar residual (𝑅𝑆𝐷) no entorno de ±4,0 unidades porcentuais e inferiores, sempre que se dispoñan de modelos por separado para cada especie e diferenciados para primeiros cortes e rebrotes (Jarrige, 1980). Nas Táboas 5 e 6 se indica o valor do erro estándar de ecuacións de regresión univariábeis que usan os contidos de FB, FAD e LAD e de ecuacións que integran o valor de PB conxuntamente con compoñentes da parede celular como preditores para a estimación da DMO de distintas forraxes. Se pode observar a maior precisión da lignina REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 33 como preditor, polo xeral seguida da FAD e da FB ou FND, así como un erro relativamente máis elevado na estimación da dixestibilidade das ensilaxes de herba, comparativamente ao observado para forraxes en estado fresco e fenos (Van der Koelen e Van Es, 1973; Van Soest e Mertens, 1977; Jarrige, 1980). Táboa 5.- Capacidade preditiva dos compoñentes da parede celular para estimar a dixestibilidade da materia orgánica das forraxes Forraxes n 𝑹𝑺𝑫 Referencia FB FAD LAD Gramíneas e leguminosas 187 11,0 9,0 - Van Soest e Mertens (1977) Gramíneas frescas 12 41 - 4,1 3,0 - 2,2 - Van der Koelen e Van Es (1973) “ “ “ “ “ Fenos de gramíneas 56 75 - 2,8 2,6 - 2,5 - Ensilaxes de herba 18 30 - 4,4 3,0 - 2,9 - Alfalfa 35 3,2 2,8 - Jarrige (1980) “ “ “ Gramíneas 57 4,3 4,4 - Fenos de prado 32 2,8 2,4 - Ensilaxes de herba 26 5,9 4,4 - 𝑅𝑆𝐷: desviación estándar residual da ecuación de predición; n: número de observacións; FB: fibra bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); LAD: lignina ácido deterxente (%MS) Táboa 6.- Capacidade preditiva de diversas ecuacións de regresión baseadas nos contidos en PB e compoñentes da parede celular para estimar a dixestibilidade da materia orgánica de forraxes Valor de 𝑹𝑺𝑫 na ecuación de regresión Forraxes n PB, FB PB, FAD PB, HCEL PB, CEL PB, LAD PB, FND Gramíneas, frescas 96 4,2 4,1 4,9 4,6 3,0 4,1 Leguminosas, frescas 53 3,4 3,2 5,2 4,0 3,4 3,7 Fenos de prado 31 3,5 3,2 4,2 4,0 3,4 3,9 𝑅𝑆𝐷: desviación estándar residual da ecuación de predición; n: número de observacións; PB: proteína bruta (%MS); FB: fibra bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); LAD: lignina ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS) Fonte: Jarrige (1980) Nunha revisión das ecuacións de predición da dixestibilidade da materia orgánica de forraxes utilizadas en Francia (Aufrére et al., 2007; Baumont et al., 2009) se indica que as estimacións máis precisas de DMO se conseguiron mediante o método de solubilidade enzimática (Aufrére e Michalet-Doreau, 1990), cuxas ecuacións mostraron un erro de predición de entre ±2,7 a ±,2,0 unidades porcentuais, en tanto que a utilización de ecuacións empíricas baseadas nos contidos de FB e PB conlevaba un erro de predición entre ±3,5 e ±5,1 unidades. Na publicación das Táboas INRA (2010) se REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 34 ofrecen ecuacións de predición para a estimación da dixestibilidade da materia orgánica de forraxes frescos e conservados a partir de constituíntes químicos, indicando os estatísticos coeficiente de determinación 𝑅2 e erro estándar residual 𝑅𝑆𝐷, pero sen reportar se as ecuacións foron sometidas a un proceso de validación cruzada ou externa. Para a estimación de DMO (%) de forraxes frescas, as ecuacións de regresión de dúas variábeis (PB e FB ou FAD) para pastos permanentes (n=89) mostran valores de 𝑅2 de 0,73 e de 𝑅𝑆𝐷 de ±3,0 a ±3,1%; para especies de gramíneas (n=874) o valor de 𝑅2 varía entre 0,60 e 0,63 e o de 𝑅𝑆𝐷 entre ±3,8 e ±4,0% e para especies leguminosas (n=172) se indican regresións univariábeis baseadas en FB ou FAD con valores respectivos de 𝑅2 de 0,71 e 0,65 e de 𝑅𝑆𝐷 de ±3,5 e ±3,9%. Para o millo fresco (n=254) se indica unha ecuación baseada en FB e PB con valores de 𝑅2 e 𝑅𝑆𝐷 de 0,40 e ±2,0%, respectivamente, mostrando valores claramente máis baixos tanto da porcentaxe de varianza explicada como do erro estándar residual, como consecuencia da menor variabilidade das coleccións de planta enteira de millo comparado coas forraxeiras pratenses. Nas citadas táboas, as coleccións de mostras nas que se derivaron as ecuacións para ensilaxes é moito máis reducida, considerándose que a dixestibilidade do millo ensilado se considera igual á obtida a partir da planta fresca. Para ensilaxes de pastos permanentes (n=26), ensilaxes de gramíneas (n=85) e ensilaxes de leguminosas (n=17), as Táboas INRA (2010) ofrecen ecuacións de regresión univariábeis baseadas en compoñentes da fibra. Cando se utilizan como preditores de DMO (%) os contidos de FB ou FND se obteñen valores respectivos de 𝑅2 e 𝑅𝑆𝐷 entre 0,73 e 0,74 e entre ±2,6 e ±2,6% para as ensilaxes de pastos permanentes, entre 0,72 e 0,64 e entre ±3,8 e ±3,4% para as ensilaxes de gramíneas e entre 0,71 e 0,78 e entre ±2,2 e ±1,9% para as ensilaxes de leguminosas, mostrando un maior poder preditivo da FAD comparada coa FB no caso das forraxes ensiladas. Na mesma publicación a colección de mostras das que se derivan as ecuacións para fenos teñen un tamaño moderado e, como nos casos anteriores, as ecuacións de predición de DMO se basean nos contidos de FB ou FAD e en PB para os fenos de pastos permanentes (n=54) ou fenos de gramíneas (n=74), mentres que para os fenos de leguminosas (n=20) as ecuacións de regresión teñen á FB ou a FAD como preditores. Os valores de 𝑅2 e 𝑅𝑆𝐷 para os distintos grupos son de 0,74 e ±2,6% para os pastos permanentes, de 0,64 a 0,74 e ±3,1 a ±2,7% para as gramíneas e de 0,71 a 0,78 e ±2,2 a ±1,9% para as leguminosas, sendo polo xeral FAD un mellor preditor que FB, como no caso das ensilaxes. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 35 Para forraxes do Reino Unido, o AFRC (1993) publicou diversas ecuacións de regresión para a predición do valor de enerxía metabolizábel. Os modelos utilizaban como preditores parámetros químicos, como a FAD modificada (FADM) de Clancy e Wilson (1966) ou valores de dixestibilidade obtidos a partir de métodos in vitro mediante incubación con líquido ruminal ou solubilidade enzimática polo método FND-celulasa. Os valores do coeficiente de determinación 𝑅2 dos modelos con FADM, dixestibilidade in vitro e enzimática como únicos preditores foron, respectivamente, de 0,59; 0,61 e 0,68 para herba fresca e de 0,67; 0,83 e 0,49 para fenos de herba, sendo máis baixos para ensilaxes de herba (0,14; 0,24 e 0,20, respectivamente), mentres que para ensilaxes de millo os correspondentes valores de 𝑅2 foron de 0,46 para FADM e de 0,64 para a dixestibilidade enzimática. Nesta publicación non se indican resultados de validación das ecuacións, ao igual que no caso do INRA. 1.6.2.3 Métodos in vitro Unha alternativa ao procedemento in vivo son os métodos in vitro, sendo unha opción viábel para reducir o número de animais utilizados, o tempo de recollida e a cantidade de alimentos a usar, permitindo ademais avaliar un elevado número de alimentos ou dietas de forma simultánea. Os métodos in vitro habitualmente utilizados para estimar a DMO de alimentos e forraxes, son tanto os baseados na utilización de líquido ruminal (Tilley e Terry, 1963), como os métodos enzimáticos pepsina-celulasa (McLeod e Minson, 1978; Riveros e Argamentería, 1987; Aufrère e Michalet-Doreau, 1988). A estes métodos cabe engadir a medida da produción de gas durante a incubación in vitro (Menke et al., 1979) como forma alternativa de estimar a dixestibilidade. O método Tilley e Terry (1963), baseado na incubación das mostras de alimento en liquido ruminal e pepsina, intenta simular a dixestión ruminal e gástrica no animal e é un dos máis útiles para a predición da DMO en forraxes. O principal inconveniente desta técnica é, por unha banda, a elevada laboriosidade da súa determinación, o que non se adapta ben ás labores de estimación rutinaria nun laboratorio e, por outra, a súa dependencia dunha fonte de inóculo ruminal, coa conseguinte necesidade de instalacións e man de obra para o seu coidado. Unha das limitacións do método Tilley-Terry é que a pesar de que a comunidade microbiana posúe unha alta estabilidade (Weimer, 2015), os resultados das determinacións in vitro con líquido ruminal vense afectados pola variabilidade e calidade do líquido ruminal, que está influída, entre outros factores, polo animal, tipo de dieta e o momento de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 36 extracción do liquido ruminal (Weiss, 1994). Para reducir dita variabilidade, o método require unha coidadosa estandarización na súa execución tanto no relativo ás dietas consumidas polos animais donantes como á metodoloxía de recollida e redución de tempos de manipulación, recomendándose obter o líquido ruminal en máis dun animal (Krizsan e Huhtanen, 2013; Palmonari et al., 2014), que no caso de ser da especie bovina se facilita a extracción e correcta manipulación do inóculo ruminal até a chegada ao laboratorio. Nun ring-test no cal participaron dez laboratorios, Hall e Mertens (2012) observaron unha significativa variabilidade entre aqueles para os valores da dixestibilidade de fibra neutro deterxente (DFND), o cal foi fundamentalmente atribuída ao número de individuos doantes utilizados e á composición da dieta consumida polos animais, que modificaba a efectividade do inóculo ruminal. Diversos traballos investigaron a repetibilidade e reproducibilidade das determinacións por este método. Analizando unha base de datos de 482 mostras de dixestibilidade in vivo e in vitro (Tilley-Terry) coñecidas, procedentes de 21 laboratorios, Goldman et al. (1987) obtiveron ecuación de regresión para a predición de DMO in vivo (%) a partir dos valores in vitro con coeficientes de determinación 𝑅2 de 0,96; 0,95 e 0,97 e valores de 𝑅𝑆𝐷 de ±2,7, ±3,1 e ±2,2%, respectivamente. Os autores resaltan a utilidade da determinación da dixestibilidade in vitro para a construción de bases de datos de valor nutricional de forraxes amplas e robustas e sinalan a boa reproducibilidade de resultados entre laboratorios e a necesidade de que os valores in vitro estean corrixidos por estándares in vivo. A este respecto, Genizi et al. (1990) revisaron a relación entre os valores in vivo dunha colección de 104 mostras e os valores in vitro (Tilley-Terry) analizados en tres laboratorios diferentes onde se realizaba a corrección con estándares entre tandas, reportando unha alta correlación entre os valores in vitro dos diferentes laboratorios, con valores do coeficiente de correlación 𝑟 entre 0,93 e 0,97 sendo aproximadamente da mesma magnitude para DMS e DMO. Gierus et al. (2016) utilizaron o método de determinación de dixestibilidade in vitro (Tilley-Terry) para a estimación do valor de DMO e EM de cinco especies de leguminosas forraxeiras en Alemaña, efectuando a corrección dos valores in vitro por estándares de dixestibilidade in vivo coñecida e reportaron que os valores de 𝑅2 entre os resultados obtidos para un subconxunto de mostras con valores in vivo e in vitro coñecidos se aproximaron á unidade, mostrando a capacidade do método Tilley-Terry para estimar o verdadeiro valor de dixestibilidade e de valor enerxético de forraxes. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 37 Se considera que a determinación de dixestibilidade in vitro corrixida por estándares de dixestibilidade in vivo coñecida proporciona unha estimación fiábel da dixestibilidade das forraxes, como indica entre outros autores Weiss (1994) e Nousiainen (2004), dado o alto coeficiente de determinación das ecuacións de regresión (𝑅2>0,80) que relacionan ambos valores. Este criterio é compartido por diversos autores (p. ex.: Lundberg et al., 2004; Stalker et al., 2013) que fan notar que a construción de coleccións suficientemente robustas para as forraxes dunha zona a partir de mostras de dixestibilidade in vivo coñecida é frecuentemente inalcanzábel, sendo necesario recorrer a mostras avaliadas in vitro debidamente corrixidas por patróns de dixestibilidade in vivo coñecida. Neste sentido, na meta-análise realizada por Huhtanen et al. (2009) onde se estudou a relación entre os valores de DMO determinados in vivo en gando vacún e ovino e os valores de DMO in vitro con líquido ruminal, se observou que cando se usan valores de DMO in vitro corrixidos por estándares para predicir a DMO in vivo de gando vacún, o incremento do erro causado pola covarianza entre os estimadores non é importante cando a calibración in vitro se basea nun conxunto amplo de datos, citándose valores de n>80 e un rango de DMO de 58,1 a 84,0% no citado traballo. Como conclusión do mesmo, indican que os valores de DMO en gando vacún poden ser preditos con similar fiabilidade mediante a técnica de dixestibilidade in vitro con líquido ruminal, corrixidos con estándares de dixestibilidade in vivo coñecida, comparada coa determinación de dixestibilidade in vivo con ovinos alimentados a nível de mantemento. Os métodos enzimáticos pepsina-celulasa substitúen o inóculo ruminal por celulasas comerciais, permitindo unha determinación máis sinxela, que demanda menos tempo de análise e non require a utilización de animais donantes, se ben polo xeral a capacidade dos enzimas comerciais para degradar a FND é substancialmente inferior á dos microbios ruminais (McQueen e Van Soest, 1975; Nousiainen, 2004). Con todo, o principal problema desta técnica é a variación na actividade das preparacións enzimáticas comerciais ao proceder de diferentes fontes fúnxicas ou de provedores diferentes, polo que pode variar a súa capacidade para solubilizar as paredes celulares (Krizsan et al., 2012), o que afecta a súa reproducibilidade. De Boever et al. (1988) recomendan a inclusión de estándares de dixestibilidade in vivo coñecida nas diferentes series, o cal permite reducir significativamente a variabilidade entre determinacións, mellorar a calidade das estimacións, e cando non se dispón de suficientes mostras de dixestibilidade in vivo coñecidas, constitúen a referencia para construír métodos de estimación alternativos. A REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 38 determinación da dixestibilidade da materia orgánica de forraxes utilizados en Francia (Aufrére et al., 2007; Baumont et al., 2009) baseada nas determinacións polo método de solubilidade enzimática pepsina-celulasa (Aufrére e Michalet-Doreau, 1990) ou os realizados en España a partir do método FND-celulasa de Riveros e Argamentería (1987) mostran que as estimacións de DMO in vivo teñen un erro de predición de entre ±2,5 a ±3,5 unidades porcentuais, claramente inferior á das ecuacións empíricas baseadas en parámetros químicos. 1.7 Ecuacións de predición da dixestibilidade de forraxes obtidas pola Rede Española de Alimentación Animal (REDALAN) En España non está adoptada oficialmente ningunha unidade de medida das necesidades enerxéticas dos ruminantes nin do contido enerxético dos alimentos, o que indubidabelmente dificulta a adopción de técnicas analíticas encamiñadas á estimación dos parámetros nutricionais que requiren os modernos sistemas de alimentación. As diversas equipas españolas de investigación foron adoptando metodoloxías en función das necesidades de cada institución e das posibilidades existentes en cada momento, sendo xeradas diversas táboas de composición de alimentos adaptadas ás condicións de cada unidade. En determinados centros se levaron a cabo valoracións de alimentos para ruminantes por métodos in vivo, xerando mostras útiles para calibrar e comparar técnicas de predición da dixestibilidade in vivo de forraxes a partir de métodos de laboratorio. Entre os anos 2003 e 2006 na Rede Temática de Nutrición de Ruminantes Española, financiada polo INIA se creou un banco de datos de mostras de forraxes dos que era coñecida a dixestibilidade in vivo da materia orgánica e cuxa información se pode consultar na páxina web do SERIDA (http://www.serida.org/redalan/dovivo.php) e que foi unha das bases da creación da citada base de datos do SIA da escola de enxeñeiros agrónomos da Universidade de Córdoba. A información procedía de cinco centros de investigación españois, entre eles o CIAM e o SERIDA nos que se efectuaron determinacións de dixestibilidade in vivo da materia orgánica de diversas mostras de alimentos, desde forraxes verdes e ensilaxes de zonas húmidas, até fenos e subprodutos mediterráneos, ascendendo a un total de 751 mostras. Na Táboa 7 se mostran os valores medios de composición química e de DMO in vivo da colección de mostras de forraxes REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 45 como 𝐴=log(1/𝑅), onde 𝑅 son os valores da reflectancia ou cociente entre a radiación reflectida pola mostra e a radiación incidente sobre a mostra (Williams e Norris, 1987). Segundo a lei de Lambert-Beer, o valor da absorbancia resultante dunha mostra que conteña unha substancia con capacidade de absorber radiación NIR é directamente proporcional á concentración da sustancia que absorba dita radiación (Williams e Norris, 1987). Un espectro NIR é unha representación gráfica dos valores de absorbancia obtidos ás diferentes lonxitudes de onda do rango espectral. A interpretación dun espectro NIR é complexa, debido a existencia de bandas de combinación e sobretonos para unha mesma molécula, provocando a superposición das mesmas. Por outra parte, o espectro pode estar sometido a presenza de outras fontes de erro que afectan aos datos espectrais: as relacionadas coa mostra (tamaño, forma e distribución das partículas, humidade e temperatura), co instrumento (relación sinal/ruído, precisión na lonxitude de onda, linearidade do sinal, tipo e tamaño de cápsula) e as operacionais (preparación da mostra) (Williams e Norris, 1987). Karl Norris e colaboradores no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos no ano 1964 desenvolveron a primeira aplicación da técnica NIRS para determinar o contido en humidade en graos de cereais (Ben-Gera e Norris, 1968). Anos máis tarde, Norris et al. (1976) publicaron o primeiro traballo da aplicación da tecnoloxía NIRS para predicir a composición química, inxestibilidade e dixestibilidade de forraxes, sendo a base na cal se estableceu un sistema computacional para investigadores sobre valor nutricional de forraxes no USDA (Givens et al., 1997). Norris (1989) define a técnica NIRS como un método instrumental de análise para medir de forma rápida e repetíbel a composición química das mostras con pouca ou ningunha preparación previa das mesmas, estando dotada de catro avantaxes fundamentais: rapidez, simplicidade na preparación da mostra, multiplicidade de análises nunha soa operación e non destrución da mostra, que pode ser analizada de novo polo mesmo procedemento ou por outro diferente. Entre os inconvenientes principais se indicaban os requirimentos de instrumental, a dependencia de procedementos de calibración, a complexidade na elección do tratamento matemático dos datos e a falta de sensibilidade para constituíntes menores. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 46 1.9.2 Instrumentación e modos de análise A consolidación da instrumentación NIRS como técnica de análise alternativa aos métodos químicos e químico-biolóxicos tradicionais desde o último terzo do pasado século, foi impulsada polos avances tecnolóxicos instrumentais que permitiron o rexistro de espectros de forma fiábel e reproducíbel, polo desenvolvemento da informática e polas novas técnicas matemáticas e estatísticas para o tratamento dos datos espectrais e valores de referencia. Os cambios máis relevantes nos instrumentos NIRS están relacionados coa mellora da relación sinal/ruído, a precisión na lonxitude de onda, a dispoñibilidade de diferentes sistemas de interacción da radiación coa mostra e a existencia dunha gran variedade de accesorios como cápsulas e cubetas de distintas formas, ben sexa en mostras extraídas do proceso (análises off line en laboratorio ou at line en instrumento próximo ao proceso) ou durante o proceso (análises on line e in line) (Flores-Rojas, 2009). En paralelo aos avances enfocados na mellora da instrumentación, de especial relevancia foi a importante mellora dos programas informáticos para a obtención e tratamento dos espectros NIR e a posibilidade de clonación entre diferentes instrumentos para a transferencia de ecuacións ou modelos quimiométricos entre eles (Garrido et al., 1996; Garrido et al., 2003). As compoñentes básicas dun instrumento NIRS son: una fonte de enerxía radiante, un dispositivo para a selección e dispersión das lonxitudes de onda, un compartimento para a presentación das mostras e uns detectores que converten a enerxía radiante nun sinal eléctrico e un procesador de sinal. Tras a incidencia da radiación sobre a mostra, a radiación reflectida a través da mostra é recollida polos detectores que a converten nun sinal eléctrico. Posteriormente, mediante un convertedor analóxico-dixital o sinal procedente dos detectores é amplificado e transformado nun sinal dixital, e por último, o sinal dixital é transmitido a un ordenador para o seu almacenamento e procesamento (Shenk e Westerhaus, 1995b). Actualmente existe unha ampla variedade de instrumentos NIRS de varrido continuo, cada un con características particulares que determinan a súa aptitude para distintas aplicacións, facilidade de uso e custe. Se distinguen desde monocromadores que utilizan unha rede de difracción móbil (grating) para a selección de lonxitudes de onda até REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 47 equipos con tecnoloxías máis actuais, como os de rede de diodos (diode array, DA), os de transformada de Fourier (FT-NIR) ou os baseados na tecnoloxía MEMS, coñecida así polas súas siglas en inglés: Micro-Electro-Mechanical System. A configuración básica destes elementos será diferente entre os instrumentos dependendo do carácter da radiación que use o equipo (Osborne et al., 1993). Os instrumentos NIRS permiten rexistrar o espectro tanto de mostras sólidas como líquidas ou gasosas, existindo gran variedade de accesorios para presentar a mostra ao instrumento. En función da natureza e tipo de produto existen catro modos principais de análises NIR: transmitancia, reflectancia, transflectancia e interactancia, determinados pola localización dos detectores con respecto á mostra (Shenk e Westerhaus, 1995b). As modalidades máis estendidas son a reflectancia e a transmitancia. Un instrumento en modo reflectancia mide a reflectancia difusa e se utiliza principalmente para mostras sólidas e semisólidas, nas que a radiación NIR penetra unha certa distancia (normalmente uns mm), interactuando coas partículas e sendo selectivamente absorbida. A enerxía que non se absorbe é reflectida e pode ser cuantificada por detectores situados no mesmo plano que a mostra. A profundidade de penetración da luz dentro da mostra está determinada pola potencia da fonte (Groenewald e Köster, 2006). Cando o instrumento traballa en modo reflectancia, a mostra se empaqueta para que sexa o suficientemente opaca e a transmisión sexa cero (Murray, 1993). O modo de transmitancia é usado para mostras líquidas, semilíquidas e sólidas. Neste caso, a radiación NIR atravesa a mostra, interactuando no seu camiño coas moléculas que a compoñen, sendo unha parte absorbida por elas. A enerxía que non é absorbida atravesa a mostra e é cuantificada polos detectores ubicados detrás da mostra, no lado oposto á fonte de radiación. A modalidade transflectancia é a combinación das dúas anteriores. A radiación NIR atravesa a mostra até o fondo da cápsula ou cubeta, onde se sitúa unha superficie reflectinte (normalmente alumino ou ouro) que provoca a reflexión da radiación, de forma que se transmite outra vez a través da mostra, incidindo sobre os detectores (Osborne et al., 1993). Probablemente, debido a que esta modalidade de análise integra un fenómeno de transmisión por duplicado xunto cunha reflexión da radiación NIR, é polo que posteriormente Foss NIRSystems comezou a utilizar o termo folded REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 48 transmission (dobre transmisión). No caso da análise NIRS de produtos pastosos ou líquidos esta é a modalidade máis utilizada, debido a maior facilidade de enchido e limpeza das cápsulas en comparación con outras modalidades de análise. Por último, o modo de interactancia se basea no uso de sondas de fibras ópticas concéntricas, onde a fonte de radiación (exterior da sonda) está separada do detector (interior da sonda), situándose ambos elementos en contacto coa superficie da mostra (Shenk e Westerhaus, 1995b). A incorporación aos instrumentos tradicionais de sondas con este modo de análise permitiu o desenvolvemento de estudos en mostras intactas e con diferentes volumes, de tal forma que se minimiza ou elimina o tempo de preparación de mostra (Fernández e Garrido, 2000) sendo posíbel obter os espectros das mostras directamente sobre elas, de tal forma que o tempo de preparación da mostra se elimina ou minimiza. 1.9.3 Quimiometría e a súa aplicación na tecnoloxía NIRS Ademais dos avances instrumentais e do desenvolvemento dos ordenadores, o impulso definitivo para o avance da técnica NIRS foi a aplicación dunha nova modalidade de análise denominada quimiometría (Cozzolino et al., 2011a). A quimiometría é unha parte da ciencia química que se serve das matemáticas, da estatística e da lóxica formal para deseñar ou seleccionar procedementos experimentais óptimos e proporcionar información química relevante a partir da análise de sinais analíticos (Massart et al., 1997). A complexidade do sinal NIR fai imprescindíbel a utilización de técnicas quimiométricas que nos permitan interpretar, entender e modelar grandes conxuntos de datos. Como se indicou anteriormente, a superposición das bandas de absorción dos diferentes constituíntes presentes na mostra, xunto coa grande cantidade de datos existentes e a elevada información redundante (colinealidade) provocan una baixa selectividade dos datos espectrais NIR (Shenk e Westerhaus, 1994), polo cal os procedementos univariantes para o tratamento da información NIRS non son suficientes (Osborne et el., 1993; Næs et al., 2002), sendo necesario recorrer a métodos de calibración multivariantes, é dicir, baseados na combinación das absorbancias a varias lonxitudes de onda que son analizados de forma simultánea (Næs et al., 2002). Estas ferramentas son consideradas fundamentais na obtención de información relevante a partir dos datos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 49 espectrais, sendo o desenvolvemento e a evolución da tecnoloxía NIRS paralelos aos avances rexistrados en ditos campos (Shenk e Westerhaus, 1995b). Nos datos espectrais adoitan aparecer con certa frecuencia perturbacións indesexábeis, comunmente coñecidas como ruído, que afectan de maneiras distintas á forma do espectro. O ruído pode ser debido ás compoñentes da instrumentación no rexistro do espectro (ruído instrumental), a variacións das condicións de temperatura ou humidade durante o proceso de recollida de espectros (ruído ambiental) ou debido a natureza da mostra. Os pretratamentos espectrais teñen como obxectivo principal corrixir o ruído presente nos datos espectrais (Rinnan et al., 2009; Cozzolino et al., 2011b). Existen múltiples técnicas de pretratamento espectral que son habitualmente combinadas secuencialmente coa finalidade de eliminar na maior medida posíbel as perturbacións espectrais e mellorar así a calidade dos resultados. Os pretratamentos máis usualmente utilizados para o desenvolvemento de aplicacións NIRS (Rinnan et al., 2009) son: i. Promedio de espectros. O ruído instrumental é considerado de natureza aleatoria, polo que un promediado de varias sinais analíticas da mesma mostra diminúe o ruído aumentando a relación sinal/ruído. ii. Suavizado espectral (smoothing). Este método é usado naqueles casos nos que o promediado de espectros non é suficiente (Stuart, 2004), existindo algoritmos matemáticos de suavizado que, aplicados ao espectro reducen o ruído, mellorando o aspecto visual do espectro sen eliminar información (Cozzolino et al., 2011b). iii. Derivadas. Este tratamento é unha ferramenta fundamental para diminuír dous dos problemas básicos na espectroscopía NIRS, a superposición de picos de absorción e as variacións da liña base dos espectros (Shenk e Westerhaus, 1995b), sendo tamén un método moi usado para corrixir a radiación dispersa nos datos espectrais NIR (Næs et al., 2002). Normalmente se utilizan a primeira e segunda derivada. A primeira derivada elimina os desprazamentos da liña base constantes e a segunda derivada elimina os desprazamentos que varían linelamente coa lonxitude de onda (Osborne et al., 1993). Unha derivación se caracteriza pola amplitude ou distancia entre os segmentos a derivar e a lonxitude do segmento a ser suavizado. Os tamaños do segmento e da distancia deben ser optimizados en cada proceso de calibración, non existindo ningún tratamento matemático ideal para tódalas aplicacións. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 50 iv. Centrado. Este método é un pretratamento habitual previo ao desenvolvemento dun modelo de calibración ou dunha análise de compoñentes principais. O centrado permite eliminar a preponderancia no modelo dunha variábel que presente unha gran variedade numérica fronte a outra variábel (Haaland e Thomas, 1988). Un aspecto que repercute de maneira importante na baixa selectividade da información espectral NIR é a dispersión da radiación incidente, tamén denominado efecto scatter ou radiación dispersa (Osborne et al., 1993). Este feito, debido fundamentalmente a fenómenos físicos como a textura, o tamaño e a xeometría das partículas que conforman a mostra (Shenk et al., 1992), provocan numerosas variacións non desexadas nos datos espectrais NIR (Barnes et al., 1989; Næs et al., 2002). Para separar no espectro NIR os efectos destas variacións de orixe físico do efecto causado pola información química das mostras, existen numerosos métodos que se agrupan baixo o nome de tratamentos da corrección do efecto scatter ou radiación dispersa (Bertrand e Dufour, 2000). Segundo Næs et al. (2002) os tratamentos máis comunmente utilizados na corrección da dispersión son: a transformación que estandariza e centra os datos de absorbancia de cada lonxitude de onda (SNV: standard normal variate), a corrección de efectos aditivos ou multiplicativos causados pola dispersión (MSC: multiplicative scatter correction) e a transformación para reducir os efectos de desprazamento da liña base e a modificación da pendente da curva espectral causada pola dispersión (D: detrending). Normalmente se utilizan combinacións de pretratamentos espectrais para mellorar a calidade dos resultados, como por exemplo SNV+D que permite eliminar en maior medida o ruído espectral respecto do uso individualizado de calquera dos métodos. Non tódolos pretratamentos conseguen reducir as interferencias causadas pola dispersión de forma simultánea, de modo que a selección do máis apropiado é puramente experimental, debendo ser avaliado en cada caso cales son os tratamentos máis axeitados para a corrección dos datos (Cozzolino et al., 2011b). En ocasións estas correccións poden non mellorar a exactitude das ecuacións NIRS, como indican Shenk e Westerhaus (1994) para a corrección do efecto do tamaño de partícula. Así, De la Roza et al. (1995) estudaron o efecto do pretratamento dos datos espectrais (ningún, SNV+D e W-MSC) e das derivadas (0, 1, 2 e 3) sobre os erros estándar dos modelos preditivos NIRS para estimar os valores de composición química de mostras de planta enteira de millo, sinalando a alta fiabilidade deste método con tal propósito e reportando que non REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 51 foi posíbel xeneralizar as condicións óptimas para a obtención dunha ecuación de regresión que minimice os erros para MS, PB, FND e dixestibilidade enzimática da materia orgánica. 1.9.4 Análise de compoñentes principais O método máis utilizado como etapa inicial da análise multivariante, en paralelo aos pretratamentos espectrais, é a ACP ou Análise de Compoñentes Principais (Martens e Martens, 2001). A ACP é un algoritmo que permite realizar unha análise exploratoria dos datos espectrais coa finalidade de reducir a dimensionalidade da matriz de datos da poboación. A información espectral se simplifica a través do centrado da poboación, seguido do cálculo de distancias entre mostras (datos espectrais) nun espazo ndimensional, a través xeralmente da distancia de Mahalanobis (Shenk e Westerhaus, 1995b,c). Por medio da ACP se obtén un número reducido de novas variábeis ortogonais, denominadas compoñentes principais (CP) que recollen a maior cantidade posíbel de varianza espectral da poboación orixinal, e que posúen as características de non estar correlacionadas. Cada CP contén información diferente e describe as fontes de variabilidade máis importantes do conxunto de mostras, de maneira que a primeira CP explica a maior porcentaxe de variabilidade que a seguinte e así sucesivamente. Como se citou anteriormente, os datos espectrais NIR presentan una grande cantidade de información redundante (colinealidade) a cal é eliminada ao transformar os datos espectrais orixinais en novas variábeis ortogonais (Martens e Martens, 2001; Næs et al., 2002). 1.9.5 Detección de mostras anómalas ou outliers A detección de mostras espectralmente anómalas (outliers) é un punto critico no desenvolvemento de modelos de calibración NIRS, xa que poden influír na capacidade preditiva dos modelos obtidos. As mostras consideradas como anómalas espectrais son aqueles que presentan uns datos espectrais significativamente diferentes do resto do colectivo de mostras. O método máis utilizado para a detección de anómalos espectrais é o cálculo de distancia de Mahalanobis (1936) no espazo n-dimensional. Shenk e Westerhaus (1995b) desenvolveron o algoritmo “Center”, incluído no paquete estatístico WinISI (Intrasoft International, Port Matilda, PA,USA) que permite calcular a distancia global estandarizada de Mahalanobis (𝐺𝐻) a partir da ACP dos datos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 52 espectrais. Neste novo espazo vectorial, cada unha das mostras estará representada por un punto a partir das súas coordenadas (scores) sobre cada un dos eixos definidos polos compoñentes principais, sendolle asignada unha distancia 𝐺𝐻 ao centroide da poboación. As mostras con valores de 𝐺𝐻>3 se consideran espectralmente anómalas (Shenk e Westerhaus, 1995b,c). Valores elevados de 𝐺𝐻 poden ser debidos, entre outros factores, a diferenzas extremas na composición da mostra ou unha diferente distribución no tamaño de partícula, entre outras razóns (Mark, 1991). Por outra banda, no desenvolvemento de modelos de predición NIRS é importante detectar aquelas mostras que son anómalos químicos. O procedemento máis habitual para a súa detección basease no cálculo do estatístico 𝑇 de Student, calculado como a diferenza entre o valor de referencia e o valor predito, sendo considerados anómalos químicos as mostras que presentan un valor de 𝑇 > 2,5 (Mark e Workman, 2003). Unha vez detectada a presenza de anómalos espectrais e/ou químicos, se debe realizar a interpretación das posíbeis causas que puideron provocar ditas diferenzas, repetindo, se é posíbel, o rexistro do espectro e a análise mediante o método de referencia sobre as mostras problema (Shenk e Westerhaus, 1995c; Næs et al., 2002). A detección, interpretación e posíbel eliminación destas mostras anómalas é unha etapa crítica no desenvolvemento de modelos de predición, debido a influencia que provoca a súa presenza nos resultados do modelo (Williams e Norris, 2001). 1.9.6 Análise cuantitativa Baseada na Lei de Lambert-Beer, a análise cuantitativa é a máis estendida dentro das aplicacións da tecnoloxía NIRS (Hruschka, 2001), mediante a cal se establece unha relación lineal entre os valores de absorbancia do instrumento NIRS e os valores de concentración dun determinado analito, determinado mediante un método de referencia. Este proceso denomínase etapa de calibración, sendo a ecuación de calibración a relación matemática obtida como resultado, a traveso da cal é posíbel predicir o contido doutras mostras con características similares ás incluídas no colectivo de calibración (Shenk e Westerhaus, 1995c; Williams e Sobering, 1996). Os métodos de regresión máis utilizados nas aplicacións cuantitativas NIRS son a Regresión Lineal Múltiple (MLR: Multiple Lineal Regression), a Regresión por Compoñentes Principais (PCR: Principal Component Regression), a Regresión REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 53 mediante Mínimos Cadrados Parciais (PLS: Partial Least Squares Regression) e a Regresión mediante Mínimos Cadrados Parciais Modificada (MPLS: Modified Partial Least Squares Regression), sendo estas dúas últimas as máis utilizadas en aplicacións agroalimentarias (Shenk e Westerhaus, 1996). O método de regresión MPLS é unha variante do PLS e achega a vantaxe da estandarización, é dicir, cada dato de lonxitudes de onda ten o seu correspondente coeficiente e o seu peso depende da proporción de varianza do parámetro explicada pola lonxitude de onda. Os residuos NIR son estandarizados (divididos pola desviación estándar dos residuos en cada iteración) e mediante validación cruzada se minimiza o sobreaxuste (excesivo número de compoñentes) da ecuación de calibración (Shenk e Westerhaus, 1995b). Unha etapa de gran importancia no desenvolvemento dunha ecuación de calibración NIRS é a selección de mostras que van a constituír o colectivo de calibración. De maneira xeral, canto maior sexa o número de mostras que constitúan a poboación de calibración, maior capacidade de predición presentará unha ecuación. Ademais do número, un aspecto clave é a variabilidade espectral e química que presenta a colección de mostras (Shenk e Westerhaus, 1995c e 1996). As mostras da poboación de calibración deben ser representativas de toda a variabilidade existente do produto a analizar, que posteriormente pode ser encontrada na análise de rutina de mostras futuras. As calibracións deben ser actualizadas periodicamente con novas mostras para recoller as fontes de variación impostas tanto polos novos xenotipos das especies cultivadas como pola modificación das condicións de medio e de manexo que puideran acontecer. Segundo Marten et al. (1989), idealmente cada ano as coleccións de mostras deberían ampliarse con novos valores de referencia coñecidos (10-12 mostras), para manter a robustez e a funcionalidade das calibracións obtidas inicialmente. A este respecto, numerosos autores indican que as características que definen á poboación de calibración utilizada determinan tanto a robustez como a exactitude das ecuacións desenvoltas (Shenk et al., 2001; Williams, 2001). O valor preditivo das ecuacións de calibración tende a ser mellor cando se obteñen a partir de coleccións de mostras de semellante natureza ou tipo de produtos. Cando se desenvolven sobre poboacións heteroxéneas, procedentes de distintos produtos, a súa exactitude e precisión tenden a diminuír (Alomar e Fuchslocher, 1997). A recomendación xeral é construír poboacións de calibración específicas para cada tipo de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 54 forraxe analizada. Sen embargo, na práctica, a cantidade de mostras dispoñíbeis nalgunhas categorías ás veces é insuficiente para desenvolver unha calibración específica, e algunhas mostras poden ser intermedias entre varias categorías. Un exemplo sería o caso dos pastos, nos que ao tratarse de mesturas multiespecies, é moi importante a construción de poboacións de calibración o máis extensas e variábeis que sexa posíbel (Bastianelli et al., 2018). O tamaño óptimo que deben ter as bases de datos de calibración está suxeita a controversia. Shenk et al. (1976) indicaron que a resposta máis simple era utilizar tantas mostras como sexa posíbel para cubrir tódalas variábeis que poidan afectar á composición química e física da forraxe, suxerindo que, na práctica, sería necesario un número mínimo de 50 mostras no conxunto de calibración. Pola súa parte, Williams (1987) suxire un mínimo de 35 a 40 para calibracións simples, mentres que en outros casos se esixe un mínimo de 100 mostras. Shenk e Westerhaus (1993a) conclúen que cando se pretende analizar entidades químicas simples en produtos relativamente homoxéneos, por exemplo o contido en PB nos graos de cereais, 30 a 40 mostras cun rango de variación adecuado poden ser suficientes, pero se o obxectivo é predicir o mesmo parámetro en produtos máis heteroxéneos, como ensilaxes de herba, serán necesarias máis de 100 mostras. Neste sentido, Murray (1993) indica que é pouco probábel obter calibracións robustas para análise de forraxes se o número de mostras da colección é inferior a 100, a non ser que se pretenda predicir unicamente compoñentes simples como o contido en humidade e en PB. Windham et al. (1989) indican que o número mínimo de mostras necesarias para a predición de calquera parámetro de calidade das forraxes en poboacións pechadas sería de 50, en tanto que o número máximo requirido sería dependente do número de factores que afecten á variabilidade espectral da poboación, pero que raramente existe avantaxe de incrementar o número de mostras por riba de 250. Na Táboa 9 se indican os tamaños do colectivo de calibración utilizados por diversos autores no desenvolvemento de ecuacións NIRS para estimación do valor nutricional de forraxes. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 61 Sinnaeve et al. (1994) e Williams e Sobering (1996) suxiren que valores de 𝑅𝑃𝐷>2,5 indican que a ecuación é válida para realizar unha clasificación cualitativa, e que valores de 𝑅𝑃𝐷>3 indican que a ecuación pode ser utilizada para análises cuantitativas, mentres que valores maiores de 10 se consideran equivalentes aos do método de referencia. Pola súa parte, Saeys et al. (2005) indican que modelos con valores de 𝑅𝑃𝐷<1,5 presentan baixa capacidade preditiva e non son de utilidade; se o valor 𝑅𝑃𝐷 está entre 1,5 e 2,0 a predición se considera aceptábel; para valores de 𝑅𝑃𝐷 entre 2,5 e 3,0 a predición é de boa calidade e para os modelos con valor 𝑅𝑃𝐷> 3,0 a predición se considera excelente. - Ratio do rango a erro (𝑅𝐸𝑅) que cuantifica a relación entre o rango de valores de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición (𝑅𝐸𝑅= 𝑅𝑎𝑛𝑔𝑜/𝑆𝐸𝐶𝑉 ou 𝑅𝐸𝑅=𝑅𝑎𝑛𝑔𝑜/𝑆𝐸𝑃). Os valores de 𝑅𝐸𝑅 son aproximadamente de catro a cinco veces superiores aos de 𝑅𝑃𝐷, pero a relación exacta dependerá da distribución de mostras no conxunto de validación (Fearn, 2002). Para cualificar este parámetro Millmier et al. (2000) indican catro níveis de calidade na predición, que se indican na Táboa 12 e subliñan a importancia de revisar a presenza de mostras anómalas, xa que o valor do 𝑅𝐸𝑅 é moi sensíbel á súa presenza, podendo resultar en valores elevados que non representan realmente a exactitude da predición. En xeral se admite que os valores de 𝑅𝐸𝑅 das calibracións con boa capacidade preditiva deben ser superiores a 10 (Williams e Sobering, 1996; Williams, 2001). Os valores de 𝑆𝐸𝐶 e 𝑆𝐸𝐶𝑉 non poden ser comparados en termos absolutos, dado que dependen do valor medio do parámetro a predicir, polo cal os estatísticos 𝑆𝐸𝑃 e 𝑅𝐸𝑅 permiten a estandarización dos erros de predición e a comparación dos resultados cos obtidos por outros autores que utilizaron diferentes conxuntos de datos (Williams, 2001). Táboa 12.- Calidade da predición das ecuacións NIRS en función do parámetro 𝑹𝑬𝑹 Valor de 𝑹𝑬𝑹 Calidade da calibración Utilidade 𝑅𝐸𝑅 ≤ 4,0 Mala Sen utilidade 4,0 < 𝑅𝐸𝑅 ≤ 8,0 Mediocre Clasificación en rangos (alto, medio e baixo) 8,0 < 𝑅𝐸𝑅 ≤ 12,0 Aceptábel Predición cuantitativa 𝑅𝐸𝑅 > 12,0 Boa Predición cuantitativa Fonte: Millmier et al. (2000) As indicacións doutros autores sobre os criterios de calidade das ecuacións non son sempre coincidentes. Williams (2001) establece o rango de valores para os estatísticos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 62 𝑅𝑃𝐷 e 𝑅𝐸𝑅 que se indican na Táboa 13, claramente máis exixentes que os anteriores, mentres que Hayes (2011) sinala, como criterios de calidade das predicións NIRS para a análise de material lignocelulósico, que valores de 𝑅𝐸𝑅 ≥ 4,0 indican que a calibración é adecuada para una clasificación preliminar, mentres que un valor 𝑅𝐸𝑅 ≥ 10 indica que a calibración é aceptábel para control de calidade e un valor 𝑅𝐸𝑅 ≥ 15 indica que a calibración pode ser usada para análise cuantitativo. Coincidindo co indicado por Williams (2001), cando se utiliza de forma alternativa o estatístico 𝑅𝑃𝐷, valores ≥ 2,5 permitirían utilizar a ecuación para clasificación en programas de mellora, valores 𝑅𝑃𝐷 ≥ 5 indicarían que a calibración é adecuada para control de calidade, mentres que valores 𝑅𝑃𝐷 ≥ 8 mostrarían que a calibración é de utilidade para o control de procesos e investigación aplicada. Táboa 13.- Clasificación de valores dos estatísticos de 𝑹𝑷𝑫 e 𝑹𝑬𝑹 nas calibracións NIRS para o control de produtos e procesos 𝑹𝑷𝑫 𝑹𝑬𝑹 Clasificación Aplicación 0-2,3 <6 Moi pobre Non recomendada 2,4-3 7-12 Pobre Clasificación grosera 3,1-4,9 13-20 Pasábel Clasificación 5,0-6,4 21-30 Boa Control de calidade 6,5-8,0 31-40 Moi boa Control de proceso >8,0 >41 Excelente Calquera aplicación Fonte: Williams (2001) Outro estatístico de uso tradicional en química analítica e de utilidade para a interpretación de datos NIRS é o coeficiente de variación (𝐶𝑉), calculado como a proporción que representa o erro estándar de predición e a media (𝑌) dos valores de referencia (𝑆𝐸𝐶𝑉 𝑥 100/𝑌 ou 𝑆𝐸𝑃 𝑥100/𝑌). O tamaño e interpretación dos 𝐶𝑉 depende parcialmente da fonte dos datos e do parámetro a analizar, indicándose na Táboa 14 os criterios de interpretación deste valor para as análises de referencia e as predicións NIRS (Williams, 2001). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 63 Táboa 14.- Criterios de interpretación dos valores do coeficiente de variación en relación co control NIRS de produtos e procesos 𝑪𝑽 (%) Análises de referencia Predición NIRS de parámetros Químicos Funcionais ≤0,5 Excepcional Imposíbel de obter Imposíbel de obter 0,6-1,0 Excelente Excepcional Imposíbel de obter 1,1-2,0 Moi bo Excelente Excepcional 2,1-3,0 Bo Moi bo Excelente 3,1-4,0 Pasábel Bo Moi bo 4,1-5,0 Mediocre Pasábel Bo >5,0 Necesita investigación Mediocre Pasábel 𝐶𝑉: coeficiente de variación; Fonte: Williams (2001) Os criterios de Windham et al. (1989) indican que a pendente da regresión entre os valores observados e preditos debe ter un valor próximo á unidade, estando os valores razoabelmente distribuídos no entorno da liña 𝑦=𝑥. Por outra banda, se debe estudar a relación entre o erro estándar de predición 𝑆𝐸𝑃 e o valor de 𝑆𝐸𝑃 corrixido por 𝑏𝑖𝑎𝑠 (𝑆𝐸𝑃𝑐). Calculado como 𝑆𝐸𝑃𝑐=∑( )  , este valor indica o comportamento da ecuación corrixida pola diferenza entre a media dos valores NIRS e a dos valores de referencia (𝑏𝑖𝑎𝑠= ∑() ). O desprazamento da liña de regresión que relaciona NIRS cos valores de referencia respecto da recta 𝑦=𝑥 pode ser debido a un cambio na preparación da mostra ou no procesado do método de referencia ou no instrumento desde a calibración. Sen embargo, se o valor do 𝑏𝑖𝑎𝑠 é constante ao longo de 𝑦=𝑥 e o valor de 𝑆𝐸𝑃c é substancialmente menor que 𝑆𝐸𝑃 para as mostras de validación e está dentro do rango de 2 veces o valor de 𝑆𝐸𝐿 para o método de referencia, a ecuación NIRS pode ser usada unha vez corrixido o 𝑏𝑖𝑎𝑠 (Windham et al., 1989). 1.9.9 Estandarización de instrumentos e transferencia de calibracións A consecución dun modelo de calibración robusto require de esforzo, gasto económico e tempo. Polo tanto, os modelos de predición NIRS nestas condicións posúen un elevado valor científico e económico, sendo desexábel polo xeral utilizalos noutros instrumentos localizados no mesmo ou en diferentes emprazamentos. Actualmente, a pesar dos grandes avances instrumentais acontecidos nos últimos anos, existen diferenzas entre instrumentos debido a existencia de pequenas diferenzas derivadas da configuración ou da óptica dos instrumentos, e imposibilitan a transferencia directa de ecuacións NIRS entre eles, mesmo que se trate de aparatos do mesmo fabricante e REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 64 modelo (Shenk et al., 2001). Polo tanto, é necesario realizar diferentes axustes (estandarización ou clonación) previos á transferencia entre instrumentos NIRS, para que o modelo proporcione resultados precisos (Bergman et al., 2006). Tradicionalmente, dito axuste consistía na corrección da pendente e/ou 𝑏𝑖𝑎𝑠 das ecuacións a cada equipo “satélite” (instrumento ao que desexa transferir as ecuación) en particular mediante axuste de coeficientes e lonxitudes de onda. Este procedemento considerase tedioso, resolvendo o problema só de maneira transitoria, e imposibilita a transferencia de espectros entre instrumentos para realizar calibracións comúns (Dardenne et al., 1992). Posteriormente, durante a 3ª Conferencia Internacional NIRS celebrada en Bélxica no ano 1990, Shenk e Westerhaus presentaron un procedemento que permita levar a cabo a corrección das diferenzas existentes entre espectros das mesmas mostras obtidos en instrumentos diferentes. Este procedemento, denominado estandarización ou clonación de instrumentos, basease na utilización dun “set de mostras universais” composto por 30 mostras de diferentes produtos agrícolas (cereais, alimentos proteicos, forraxes, subprodutos, etc.), as cales se encontran incluídas en cápsulas seladas para evitar alteracións (Shenk, 1990). Este método, patentado por Shenk e Westerhaus (1989) realiza unha corrección univariante do espectro completo mediante dúas etapas independentes. Una primeira etapa de corrección das lonxitudes de onda e unha segunda de corrección dos valores de absorbancias (Shenk e Westerhaus, 1989). O proceso de clonación require obter os espectros destas mostras seladas no instrumento onde as ecuacións de calibración se desenvolveron (instrumento Master) así como no instrumento onde se desexa transferir ditas ecuacións (instrumento Satélite). Mediante o uso das citadas cápsulas seladas, se asegura que ambos instrumentos obteñen idénticos espectros da mesma mostra, e as diferenzas encontradas son debidas a diferenzas instrumentais. Unha vez realizado o proceso de estandarización, as ecuacións desenvolvidas nun aparato serían válidas noutro, se ben en ocasións é necesario realizar algún axuste posterior de pendente e do 𝑏𝑖𝑎𝑠. 1.9.10 Monitorización da validez das ecuacións NIRS Despois de finalizar o proceso de construción e validación dunha ecuación NIRS, durante o uso en rutina da mesma, é necesario facer comprobacións para asegurar a exactitude dos resultados obtidos sobre novas mostras. A posibilidade de cambios no REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 65 funcionamento do aparato así como, en particular, a aplicación da ecuación a mostras non representadas na colección de calibración son causas da perda de calidade nas predicións. Valores altos do estatístico 𝐺𝐻 en mostras individuais indican falta de exactitude na estimación NIRS, indicando Westerhaus (1989) que se durante o uso en rutina da calibración NIRS o valor medio de 𝐺𝐻 das mostras problema analizadas é superior a 3,0, a ecuación deberá ser recalibrada incorporando a variabilidade da nova poboación. Un método práctico para probar se unha ecuación é apropiada para unha nova poboación de mostras é determinar intervalos de confianza ao 90% para o 𝑏𝑖𝑎𝑠 e o 𝑆𝐸𝑃𝑐 obtidos ao aplicar a ecuación á nova poboación. Shenk et al. (1989) indican que o 𝑏𝑖𝑎𝑠 debe estar dentro do intervalo ±0,65 𝑆𝐸𝐶 e que o valor do 𝑆𝐸𝑃𝑐 debe estar dentro do intervalo ±1,30 𝑆𝐸𝐶, en tanto que as ecuacións con valores de 𝑏𝑖𝑎𝑠 superiores a 𝑆𝐸𝐶 e de valores 𝑆𝐸𝑃𝑐 superiores a 2 veces 𝑆𝐸𝐶 non son dunha calidade aceptábel para a predición de mostras externas. En forraxes pode ser importante ter en conta o efecto do ano en que se recolleron as mostras na aplicabilidade do modelo de calibración a mostras diferentes. Cando as ecuacións de predición se obteñen a partir de coleccións de mostras recollidas durante un espazo temporal dun único ano e son aplicadas a mostras doutro ano diferente, os coeficientes de correlación son polo xeral máis baixos e os erros estándar das predicións son máis altos que cando as predicións se circunscriben a mostras do mesmo ano (Blosser et al., 1988). A ecuación se mellora substancialmente cando se engade un número limitado de mostras da nova poboación á calibración existente. 1.10 Utilización da tecnoloxía NIRS para a caracterización dos alimentos para o gando A potencialidade do método NIRS para a determinación fiábel e rápida da calidade da forraxe é coñecida desde o século pasado. Desde a súa primeira aplicación para estimar a humidade dos grans de cereais en 1960, en pouco tempo se desenvolveu a aplicación da tecnoloxía NIRS para estimar o valor nutricional de forraxes (Norris et al., 1976). Desde entón a técnica NIRS é usada para analizar de forma precisa a composición química e determinados parámetros do valor nutricional das forraxes de forma rápida, REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 66 non destrutiva e económica, evitando os problemas de manipulación e reciclaxe de reactivos, sendo por tanto un método seguro para o persoal operador (Mark et al., 2002). Aínda que inicialmente o alto custo dos dispositivos e as limitacións de ferramentas informáticas asociadas limitaron a expansión desta tecnoloxía, a súa relevancia é cada vez máis importante. O desenvolvemento de calibracións para estimar a composición química de forraxes e alimentos, está ao alcance de laboratorios que dispoñan da tecnoloxía de análise por vía húmida tradicional, mentres que a construción e mantemento de calibracións para estimación da dixestibilidade e da degradabilidade ruminal está reservado a institucións que teñan capacidade de obter as coleccións de mostras avaliadas in vivo e in situ que se necesitan para desenvolver calibracións NIRS. 1.10.1 Predición de compoñentes químicos O contido en PB, FND, FAD e carbohidratos non estruturais e solúbeis en auga (CNET e CSA) son os parámetros de calidade nutricional máis importante que determinan a inxestión e dixestibilidade polo gando (Van Soest et al., 1991). Unha vez debidamente calibrado, a tecnoloxía NIRS permite a predición da composición química de compostos orgánicos das forraxes con aceptábel exactitude e precisión. As estimacións para PB están asociadas polo xeral con valores de 𝑅2>0,90, mentres que os constituíntes da parede celular (FND, FAD, LAD) son preditos de forma lixeiramente menos fiábel (Dryden, 2003a). Por outra banda, a técnica NIRS parece ser tan precisa como os métodos convencionais de análise da composición química das forraxes. Estas características fan ao NIRS un aceptábel método analítico alternativo ao alcance dos laboratorios que teñan capacidade de realizar as análises de referencia necesarias para a construción e validación das calibracións. A modo de exemplo, na Táboa 15 se indican os estatísticos de calibración e validación de ecuacións NIRS para estimación da composición química de forraxes, que foron tomados de diversos traballos de referencia realizados neste área de estudos. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 67 Táboa 15.- Comparación da calidade preditiva de parámetros químicos de distintas forraxes mediante NIRS en mostras secas e moídas Tipo de forraxe Parámetro Calibración Validación 𝑺𝑫 𝑹𝑬𝑹 𝑹𝑷𝑫 Referencia 𝑹 2 𝑺𝑬𝑪𝑽 𝒓 2 𝑺𝑬𝑷 Ensilaxes, xeral PB 0,98 - - 1,07 5,98 - 5,59 Norris et al. (1976) FAD 0,92 - - 2,50 5,60 - 2,24 Alfalfa PB 0,98 - - 0,42 - - - Marten et al. (1984) FAD 0,94 - - 1,30 - - - FND 0,95 - - 1,46 - - - Fenos de gramíneas e leguminosas CZ 0,84 0,80 0,64 1,20 2,00 5,00 1,67 Redsaw et al. (1986) PB 0,90 1,00 0,95 1,00 3,30 12,80 3,30 FAD 0,88 2,00 0,71 2,20 4,00 6,91 1,82 FND 0,88 3,30 0,90 2,90 9,20 11,79 3,17 LAD 0,83 0,90 0,50 1,10 1,50 5,27 1,36 Cana e follas de millo FAD 0,90 1,38 0,94 1,43 5,69 - 3,98 Zimmer et al. (1990) FND 0,92 1,71 0,95 1,78 7,72 - 4,34 LAD 0,78 0,43 0,77 0,42 0,82 - 1,95 Grao de millo PB 0,96 - - 0,29 - - - Melchinger et al. (1986) FB 0,90 - - 0,25 - - - ALM 0,94 - - 1,29 - - - CSA 0,73 - - 0,59 - - - Planta enteira de millo PB 0,97 - 0,80 0,50 - 9,80 - Valdés et al. (1990) FAD 0,98 - 0,88 1,60 - 15,50 - Ensilaxes, xeral PB 0,99 - 0,99 0,36 2,70 - 4,43 Reeves e Blosser (1991) FAD 0,96 - 0,96 1,48 5,40 - 3,65 Pastos mixtos FND 0,95 - - 2,17 - 18,89 - Smith e Flinn (1991) PB 0,97 - - 0,85 - 25,18 - Pastos mixtos PB 0,95 0,57 0,93 0,90 - 11,78 - García-Ciudad et al. (1993) FAD 0,87 1,42 0,85 1,56 - 9,87 - FND 0,93 2,06 0,92 2,37 - 13,54 - LAD 0,94 0,45 0,90 0,59 - 10,85 - Ensilaxe de herba PB 0,90 - - 0,63 - 17,62 - O' Keeffe et al. (1987) Fenolaxe MS 0,84 0,76 - - 1,36 - 1,79 Shenk (1993) PB 0,97 0,71 - - 3,37 - 4,75 FAD 0,90 1,63 - - 2,12 - 1,30 Pastos diversos MS 0,68 0,58 - - 3,34 - 5,76 Shenk (1993) PB 0,97 1,41 - - 7,73 - 5,48 FAD 0,95 1,96 - - 7,75 - 3,95 Planta enteira de millo CZ 0,69 0,37 - - 0,66 9,70 1,80 De la Roza et al. (1995) PB 0,85 0,34 - - 0,87 12,62 2,56 FND 0,91 1,49 - - 4,93 19,07 3,31 ALM 0,90 1,78 - - 5,59 21,50 3,15 Ensilaxe de sorgo PB 0,91 0,39 - - - - - Budiongo et al. (1996) FAD 0,91 1,50 - - - - - FND 0,95 0,92 - - - - - Pastos semiáridos CZ 0,88 0,45 0,94 0,51 1,25 9,25 2,45 Vázquez-Aldana et al. (1996) Ensilaxes de millo CZ 0,55 0,70 - 0,70 1,00 8,71 1,42 De Boever et al. (1997) PB 0,85 0,30 - 0,60 0,90 6,16 1,50 FB 0,80 1,30 - 1,30 2,00 6,07 1,53 FND 0,88 1,60 - 1,50 2,40 7,26 1,60 FAD 0,88 1,30 - 1,10 2,10 7,27 1,90 LAD 0,47 0,30 - 0,40 0,40 4,25 1,00 AMD 0,92 2,00 - 2,70 5,50 8,44 2,03 Trevo branco CZ 0,92 0,65 0,95 0,41 2,34 32,44 5,71 Berardo (1997) PB 0,92 0,97 0,97 0,61 3,36 24,75 5,51 FB 0,92 0,75 0,97 0,63 2,60 22,06 4,13 FND 0,94 1,62 0,97 1,15 6,86 24,96 5,94 FAD 0,92 1,01 0,96 0,71 3,82 22,54 5,38 LAD 0,83 0,93 0,89 0,79 2,42 12,91 3,06 Planta enteira de cereais CZ 0,88 0,80 - - 2,30 11,63 2,88 Bruno-Soares et al. (1998) PB 0,97 0,76 - - 4,25 22,76 5,59 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 68 FB 0,90 1,23 - - 4,01 12,28 3,26 FND 0,95 1,77 - - 7,62 17,12 4,31 FAD 0,95 1,68 - - 7,46 15,65 4,44 LAD 0,83 0,56 - - 1,35 11,07 2,41 Ensilaxe de herba PB 0,99 0,95 - - - 32,84 - Corson et al. (1999) FAD 0,95 2,79 - - - 21,58 - CSA 0,87 1,38 - - - 17,39 - Ensilaxe de millo PB 0,67 0,61 - - - 14,26 - Corson et al. (1999) FND 0,95 2,10 - - - 25,43 - CSA 0,88 4,79 - - - 12,63 - Planta enteira de millo MS 0,72 0,95 0,61 4,25 - - - Cozzolino et al. (2001) CZ 0,98 0,61 0,64 0,38 - - - PB 0,96 0,77 0,86 1,04 - - - FAD 0,98 1,65 0,98 1,85 - - - FND 0,96 3,43 0,83 2,43 - - - Feno de alfalfa CZ 0,77 0,44 - - - 10,88 - Andueza et al. (2001) PB 0,93 0,93 - - - 19,27 - FND 0,92 1,56 - - - 15,56 - Alfalfa CZ 0,95 0,41 - - - 23,00 - Andueza et al. (2001) PB 0,99 0,76 - - - 41,21 - FND 0,97 0,82 - - - 27,76 - Ensilaxe de herba PB 0,96 0,64 0,96 0,56 - 18,95 5,00 Villamarín et al. (2002) FAD 0,92 1,50 0,93 1,42 - 13,92 3,60 FND 0,95 2,04 0,96 1,80 - 20,76 4,80 Ensilaxe de millo CZ 0,71 0,50 - - 0,98 15,20 1,96 Cozzolino et al. (2003) PB 0,89 0,50 - - 1,50 22,20 3,00 FAD 0,85 1,80 - - 4,20 15,06 2,33 FND 0,80 3,80 - - 8,80 11,03 2,32 Ensilaxe de millo CZ 0,51 0,61 - - 1,10 10,16 1,80 Lundberg et al. (2004) PB 0,97 0,26 - - 1,40 33,85 5,38 FAD 0,88 2,19 - - 6,10 15,07 2,79 FND 0,96 1,67 - - 8,40 26,41 5,03 Ensilaxe de herba CZ 0,73 1,01 - - 2,20 13,96 2,18 Lundberg et al. (2004) PB 0,93 0,80 - - 3,20 19,13 4,00 FAD 0,91 1,38 - - 5,00 17,83 3,62 FND 0,94 1,81 - - 7,60 19,12 4,20 Alfalfa CZ 0,98 0,50 0,99 0,50 - 50,00 - Colombini et al. (2005) PB 0,96 0,61 0,95 0,65 - 24,62 - FND 0,95 1,55 0,93 2,07 - 16,43 - Ensilaxe de herba PB 0,97 0,90 - - - - - Znidaršic et al. (2006) FB 0,96 1,08 - - - - - CZ 0,94 1,42 - - - - - Unifeed CZ 0,77 0,49 - - 1,10 12,86 2,24 Mentink et al. (2006) PB 0,87 0,48 - - 1,40 18,13 2,92 EE 0,81 0,40 - - 1,00 16,75 2,50 FND 0,90 1,32 - - 4,20 21,21 3,18 ALM 0,89 3,16 - - 9,80 13,45 3,10 Fenos de pradeira CZ 0,60 0,82 - - - 16,95 3,00 Cozzolino et al. (2006) PB 0,93 1,54 - - - 10,13 3,00 FAD 0,75 5,00 - - - 7,86 1,50 FND 0,95 4,97 - - - 10,66 2,00 Ensilaxe de xirasol PB 0,88 1,01 - - - 9,50 2,30 Fassio et al. (2007) CZ 0,94 0,82 - - - 14,24 2,90 FND 0,65 5,77 - - - 5,40 1,40 FAD 0,50 2,91 - - - 7,85 1,70 EE 0,94 1,53 - - - 16,34 4,40 Planta enteira de xirasol PB 0,86 0,99 - - - 15,56 2,90 Fassio et al. (2007) CZ 0,85 1,12 - - - 13,13 2,20 FND 0,62 5,34 - - - 5,49 1,20 FAD 0,64 2,60 - - - 11,98 1,80 Ensilaxe de herba CZ 0,89 0,51 - - - - 3,03 Ibañez e Alomar (2008) PB 0,95 0,67 - - - - 4,76 FND 0,95 1,60 - - - - 4,46 FAD 0,96 0,91 - - - - 4,87 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 69 Festuca PB 0,98 0,65 0,96 0,79 3,32 15,44 4,20 Poblaciones et al. (2008) FAD 0,91 0,83 0,85 0,93 1,81 8,81 1,94 FND 0,94 2,17 0,91 3,36 5,67 7,29 1,68 LAD 0,57 1,21 0,12 1,35 1,36 4,64 1,00 Dactilo PB 0,98 0,85 0,93 0,98 4,22 17,44 4,30 Poblaciones et al. (2008) FAD 0,93 0,86 0,93 0,98 3,03 16,12 3,09 FND 0,93 1,97 0,87 2,02 4,64 9,90 2,29 LAD 0,58 1,40 0,04 1,40 1,61 4,93 1,15 Ensilaxe de herba CZ 0,73 1,20 0,71 1,30 1,90 5,32 1,46 Restaino et al. (2009) PB 0,81 2,00 0,91 1,70 4,30 10,82 2,53 FAD 0,80 4,00 0,73 4,80 8,30 9,58 1,73 FND 0,75 6,60 0,71 8,10 10,40 4,80 1,28 Pastos mixtos PB 0,93 1,68 - - 6,58 17,41 3,93 Alomar et al. (2009) FAD 0,90 1,40 - - 4,59 15,27 3,29 FND 0,80 3,36 - - 7,71 12,86 2,30 Ensilaxe de grao de millo húmido CZ 0,84 0,33 - - 1,1 21,81 3,3 Fassio et al. (2009) PB 0,85 0,52 - - 1,1 12,50 2,1 FAD 0,90 1,80 - - 5,5 16,39 3,0 Pastos mixtos CZ 0,86 0,99 - - 2,57 - 2,60 Decruyenaere et al. (2009) PB 0,98 0,86 - - 5,90 - 6,86 Pastos mixtos PB 0,98 0,67 - - - 33,09 6,61 Andueza et al. (2011) CZ 0,88 0,74 - - - 20,59 2,80 Planta enteira de millo MO 0,88 0,26 0,88 0,20 0,69 7,32 3,45 Campo et al. (2013) PB 0,92 0,32 0,83 0,33 0,84 6,23 2,55 FAD 0,91 1,68 0,88 1,10 3,15 4,82 2,86 FND 0,91 1,03 0,89 1,52 4,54 4,81 2,99 CSA 0,89 1,38 0,95 0,74 3,49 5,37 4,72 ALM 0,87 2,99 0,85 2,26 5,82 5,08 2,58 Pastos de montaña PB 0,98 0,87 - 5,65 - - 6,46 Dale et al. (2013) CZ 0,87 1,45 - 3,98 - - 2,74 EE 0,60 0,78 - 1,24 - - 1,59 FB 0,95 1,97 - 8,68 - - 4,41 FAD 0,95 3,36 - 15,21 - - 4,53 LAD 0,90 2,60 - 8,30 - - 3,19 Ensilaxe de herba PB 0,95 0,80 - - - 23,68 4,04 Dias (2015) FND 0,86 1,79 - - - 18,01 3,00 FAD 0,91 1,39 - - - 15,22 3,11 LAD 0,51 5,85 - - - 6,30 1,24 CZ 0,90 0,70 - - - 16,09 3,07 EE 0,46 0,45 - - - 8,40 1,29 Ensilaxe de millo PB 0,85 0,26 - - - 16,88 3,16 Dias (2015) FND 0,87 1,79 - - - 13,82 3,03 FAD 0,84 1,16 - - - 12,37 3,03 LAD 0,51 0,35 - - - 9,29 1,96 CZ 0,93 0,26 - - - 14,08 3,58 EE 0,73 0,25 - - - 6,72 1,83 Pastos mixtos PB 0,98 0,59 - - 3,35 9,78 5,64 Vranić et al. (2016) MO 0,53 0,76 - - 1,27 7,65 1,68 FND 0,87 2,44 - - 7,19 11,36 2,95 FAD 0,45 1,88 - - 2,82 9,32 1,51 Gramíneas diversas PB 0,98 0,47 - - - - - Juan et al. (2016) FND 0,95 1,93 - - - - - Planta enteira de millo e sorgo e as súas fraccións (folla, talo e inflorescencias) PB 0,97 0,54 - - - 38,93 5,63 Juan et al. (2016) FND 0,96 2,51 - - - 22,23 4,99 Raigrás italiano PB 0,99 0,68 0,99 0,57 5,36 35,72 9,37 Yang et al. (2017) FND 0,94 2,23 0,91 2,60 8,95 12,03 3,44 FAD 0,92 1,68 0,95 1,32 5,81 15,64 4,40 CSA 0,88 3,11 0,91 2,56 8,68 13,50 3,39 Pastos naturais PB 0,88 2,14 - - - 4,34 2,26 Parrini et al. (2019) CZ 0,64 1,05 - - - 10,48 1,87 EE 0,45 0,28 - - - 3,96 1,18 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 70 FND 0,76 4,00 - - - 7,50 1,54 FAD 0,82 2,79 - - - 9,84 2,57 LAD 0,729 1,83 - - - 6,62 1,61 Pastos de montaña CZ 0,83 0,63 0,71 0,79 - - 1,87 Berauer et al. (2020) EE 0,86 0,23 0,73 0,37 - - 1,69 PB 0,42 3,32 0,30 3,36 - - 1,10 FB 0,93 0,64 0,83 1,06 - - 2,40 𝑆𝐷: desviación estándar; 𝑅𝐸𝑅: relación entre o rango de valores de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅𝑃𝐷: relación entre a 𝑆𝐷 do conxunto de mostras para o valor de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; 𝑆𝐸𝐶𝑉: erro estándar de validación cruzada; 𝑟2: coeficiente de determinación en validación externa; 𝑆𝐸𝑃: erro estándar de predición; CZ: cinzas (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); LAD: lignina ácido deterxente (%MS); FB: fibra bruta (%MS); EE: extracto etéreo (%MS); ALM: amidón (%MS); CSA: carbohidratos solúbeis en auga (%MS) 1.10.1.1 Cinzas NIRS mide a absorción da radiación polos enlaces moleculares, de maneira que as formas minerais non iónicas non presentan bandas de absorción. Sen embargo, os complexos orgánicos que forman determinados minerais (fitatos e quelatos, por exemplo) poden ser detectados por NIRS. Por outra banda, algunhas substancias iónicas presentan absorbancia na rexión NIR incluíndo sulfatos, carbonatos e fosfatos, o que permite o desenvolvemento de calibracións NIRS para estimar o contido mineral total (cinzas) ou diversos compoñentes minerais maiores nas mostras de forraxes (Shenk e Westerhaus, 1993). No traballo de Vázquez de Aldana et al. (1996) sobre a estimación mediante NIRS do contido en cinzas de mostras de pastos de climas semiáridos, se indican para o modelo de calibración un valor de ±0,46% para 𝑆𝐸𝐶 e de 0,88 para 𝑅2 e un valor de ±0,51% para o erro de predición 𝑆𝐸𝑃 en validación externa. Para pastos de alfalfa e festuca Windham et al. (1991) desenvolveron satisfactoriamente calibracións NIRS para estimar o contido en cinzas, obtendo valores de ±1,44 e ±1,42% para 𝑆𝐸𝐶 e 𝑆𝐸𝑃, respectivamente. De forma similar, Andueza et al. (2001) desenvolveron calibracións NIRS para estimar o contido en cinzas de mostras de fenos e de forraxe verde de alfalfa, que permitiron explicar, respectivamente, o 77 e o 95% da variabilidade. Tamén para mostras de alfalfa, Colombini et al. (2005) reportan a capacidade de NIRS para predicir adecuadamente o contido en cinzas, con valores de 0,98 para o coeficiente de determinación e un erro estándar de predición en validación cruzada de ±0,50%. Para unha colección de ensilaxes de planta enteira de millo cun valor medio en CZ de 4,5 %MS, De la Roza et al. (1995) indican que a estimación NIRS do contido en cinzas non foi satisfactoria, indicando valores de 1−𝑉𝑅 e 𝑆𝐸𝐶𝑉 no proceso de validación cruzada de, respectivamente, 0,61 a 0,69 e de ±0,36 a ±0,42%. Coincidindo con esta REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 77 Ensilaxe de millo N-NH3 (%NT) 0,82 0,24 0,75 0,16 0,30 - 1,88 Reeves III et al. (1989) pH 0,14 0,49 0,72 0,14 0,24 - 1,71 ACET (%MS) 0,75 0,47 0,52 0,59 0,66 - 1,12 PROP (%MS) 0,60 0,28 0,37 0,31 0,33 - 1,06 ISOBUT (%MS) 0,44 0,06 0,22 0,08 0,09 - 1,13 BUT (%MS) 0,36 0,06 0,16 0,07 0,04 - 0,57 ISOVAL (%MS) 0,40 0,04 0,20 0,04 0,03 - 0,75 LACT (%MS) 0,59 0,97 0,66 0,89 1,53 - 1,72 VAL (%MS) 0,12 0,05 0,23 0,04 0,05 - 1,25 Todas as ensilaxes N-NH3 (NT) 0,87 0,35 0,82 0,39 0,90 - 2,31 Reeves III et al. (1989) pH 0,85 0,28 0,55 0,45 0,65 - 1,44 ACET (%MS) 0,74 0,56 0,57 0,79 1,08 - 1,37 PROP (%MS) 0,63 0,25 0,51 0,27 0,30 - 1,11 ISOBUT (%MS) 0,57 0,08 0,33 0,12 0,14 - 1,17 BUT (%MS) 0,68 0,18 0,57 0,29 0,43 - 1,48 ISOVAL (%MS) 0,38 0,03 0,26 0,04 0,05 - 1,25 LACT (%MS) 0,71 1,41 0,74 1,30 2,49 - 1,92 VAL (%MS) 0,33 0,07 0,27 0,07 0,08 - 1,14 Ensilaxe de millo LACT (%MS) 0,82 0,85 - - - 12,59 - Corson et al. (1999) pH 0,38 0,08 - - - 7,50 - Ensilaxe de millo pH 0,75 0,20 - - 0,40 11,00 2,00 Cozzolino et al. (2003) Ensilaxe de herba N-NH3 (%MS) 0,89 0,02 - 0,03 - - 2,50 Sørensen (2004) LACT (%MS) 0,96 0,71 - 0,54 - - 6,30 ACET (%MS) 0,68 0,97 - 0,65 - - 2,50 pH 0,92 0,11 - 0,11 - - 4,80 EtOH (%MS) 0,89 0,22 - 0,20 - - 2,80 Ensilaxe de millo N-NH3 (%MS) 0,77 0,01 - 0,01 - - 2,90 Sørensen (2004) LACT (%MS) 0,95 0,36 - 0,39 - - 3,80 ACET (%MS) 0,72 0,52 - 0,40 - - 2,00 pH 0,78 0,06 - 0,07 - - 2,20 EtOH (%MS) 0,92 0,11 - 0,10 - - 3,70 Ensilaxe de millo ACET (%MS) 0,82 0,23 0,73 0,21 - - - Park et al. (2005) PROP (%MS) 0,50 0,14 0,32 0,11 - - - BUT (%MS) 0,19 0,15 0,00 0,00 - - - LACT (%MS) 0,73 0,81 0,80 0,58 - - - Ensilaxe de xirasol pH 0,86 0,44 - - - 5,91 2,50 Fassio et al. (2007) Ensilaxe de herba pH 0,74 0,14 - - - - 1,89 Ibañez e Alomar (2008) N-NH3 (%NT) 0,72 1,49 - - - - 1,64 Ensilaxe de herba pH 0,70 0,34 0,51 0,67 0,87 7,31 1,30 Restaino et al. (2009) Ensilaxe de grao de millo húmido pH 0,91 0,30 - - 0,61 8,33 2,03 Fassio et al. (2009) N-NH3 (%NT) 0,90 1,07 - - 2,30 9,40 2,15 Ensilaxe de herba pH 0,46 0,39 - - - 7,95 1,44 Dias (2015) N-NH3 (%NT) 0,11 3,60 - - - 5,54 1,08 Ensilaxe de millo pH 0,56 0,15 - - - 8,67 1,48 Dias (2015) N-NH3 (%NT) 0,25 2,71 - - - 5,28 1,23 𝑆𝐷: desviación estándar; 𝑅𝐸𝑅: relación entre o rango de valores de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅𝑃𝐷: relación entre a 𝑆𝐷 do conxunto de mostras para o valor de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; 𝑆𝐸𝐶𝑉: erro estándar de validación cruzada; 𝑟2: coeficiente de determinación en validación externa; 𝑆𝐸𝑃: erro estándar de predición; MS: materia seca; LACT: ácido láctico (%MS); ACET: ácido acético (%MS); PROP: ácido propiónico (%MS); VAL: ácido valérico (%MS); BUT: ácido butírico (%MS); ISOVAL: ácido isovalérico (%MS); ISOBUT: ácido isobutírico (%MS); EtOH: etanol (%MS); NT: nitróxeno total; N-NH3: nitróxeno amoniacal REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 78 1.10.3 Predición de parámetros biolóxicos A diferenza das ecuacións NIRS para a predición da composición química de forraxes, que polo xeral mostran coeficientes de determinación elevados e erros estándar baixos, as ecuacións baseadas en resultados de bioensaios son tipicamente baixas en precisión pero poden ser igualmente útiles para a estimación do verdadeiro valor do atributo da forraxe. Entre as razóns que explicarían a menor fiabilidade das calibracións NIRS baseadas en bioensaios, Windham e Coleman (1989), indicaban o efecto das condicións ambientais, das características inherentes ao alimento (tamaño de partícula, por exemplo) que, sen modificar a estrutura química das mostras, afectan aos resultados, así como que determinados factores que afectan aos resultados do bioensaio poden ou non ser entidades químicas claramente definidas, como é o caso da lignina ou da fibra, que condicionan, por exemplo, os valores da dixestibilidade in vivo. Sen embargo, usualmente a precisión da predición da calidade da forraxe mediante NIRS é maior que a precisión das análises de dixestibilidade in vitro ou in vivo, polo que os erros de predición destes parámetros son máis unha función da calidade da execución do ensaio polo cal se determinan os valores de referencia que dos erros cometidos na análise NIRS. Normalmente os erros nas determinacións de parámetros biolóxicos son comparativamente máis elevados que as determinacións de parámetros químicos no laboratorio. Shenk (datos non publicados, citado en Windham e Coleman, 1989) estableceu unha relación entre o valor do coeficiente de determinación da calibración NIRS para un parámetro dado, o erro cometido na súa determinación polo método de referencia no laboratorio e a variabilidade da colección de calibración para este parámetro dado, indicando a ecuación 𝑅=1−(   ) onde 𝑅 é o coeficiente de determinación por NIRS, 𝑆𝐸𝐿 é o erro estándar medio de laboratorio para o procedemento ou determinación in vivo e 𝑆𝐷 é a desviación estándar do parámetro para os valores da colección. Esta ecuación é de utilidade para estimar inicialmente a fiabilidade da calibración NIRS a partir dos datos da colección de calibración, toda vez que con valores altos de 𝑆𝐸𝐿 e baixos de 𝑆𝐷, o valor de 𝑅 é insignificante e a calibración NIRS non sería de utilidade, pero a medida que o 𝑆𝐷 das mostras aumenta pódese obter un valor aceptábel para o coeficiente de determinación. Por outra parte, a partir da fórmula se pode obter o valor de 𝑆𝐸𝐿 a partir de 𝑆𝐷 e de 𝑅 xa que, polo xeral, REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 79 o valor do erro estándar de calibración 𝑆𝐸𝐶 é aproximadamente 2 veces o valor do erro estándar de laboratorio 𝑆𝐸𝐿. 1.10.3.1 Predición da dixestibilidade A dixestibilidade é un compoñente funcional do tecido vexetal que reflicte o valor nutritivo da forraxe para o ruminante e influencia, asemade, o nível de inxestión potencial (Stuth et al., 2003). Na bibliografía existen numerosas referencias de calibracións NIRS para a estimación do valor de dixestibilidade de forraxes, sendo este valor asociado coas absorcións da radiación NIR na rexión de 2270 nm correspondente á celulosa e á lignina, así como na banda de arredor de 1670 nm única para a lignina (Murray, 1990). As calibracións NIRS para dixestibilidade se basean en procedementos efectuados por métodos de referencia tanto de determinacións in vivo (por exemplo De Barber et al., 1990; Baker et al., 1994, Boever et al., 1996; Park et al., 1997 e Park et al., 1998 para ensilaxes de herba e Dardenne et al., 1993 para planta enteira de millo) como de determinacións in vitro por métodos baseados na dixestión con inóculo ruminal (por exemplo, Zimmer et al., 1990; Liu et al., 2008; Campo et al., 2013) ou mediante métodos enzimáticos (por exemplo Jones e Hayward, 1975; Clarke et al., 1982; De Boever et al., 1986; Bughara et al., 1992; De Boever et al., 1994; Albanell et al., 1997 e De la Roza et al., 1995). Os traballos de Norris et al. (1976) utilizando un instrumento monocromador de varrido foron os primeiros en reportar que NIRS podía predicir razoabelmente ben a dixestibilidade in vivo de forraxes, indicando un coeficiente de determinación 𝑟2 de 0,78 para a dixestibilidade da MS de mostras de gramíneas e leguminosas pratenses avaliadas in vivo con ovinos. Burdick et al. (1981) observaron erros de predición da dixestibilidade in vivo de fenos de gramíneas entre ±1,78 e ±2,54%, que eran inferiores aos obtidos nos ensaios de alimentación animal. Nesta liña, os traballos de Shenk et al. (1982) demostraron que a predición da dixestibilidade de fenos de pradeira por NIRS era tan fiábel como a proporcionada por regresións múltiples baseadas no contido en fibra e a dixestibilidade in vitro das mostras. Outros traballos, como os de Lindgren (1983) mostraron que NIRS podía realizar satisfactoriamente a predición da dixestibilidade in vivo de gramíneas forraxeiras pratenses, indicando a conveniencia de desenvolver ecuacións específicas para forraxes frescas, fenos e ensilaxes. Por outra banda, Eckman et al. (1983) utilizaron datos de experimentos con ovinos alimentados REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 80 con dietas de forraxes mixtas e monoespecíficas para comparar a capacidade preditiva de NIRS e de análises de laboratorio (PB, FND e dixestibilidade in vitro) para estimar a dixestibilidade e inxestión voluntaria in vivo, reportando que os erros estándar de calibración para NIRS eran menores ou iguais que os das ecuacións que utilizaban os datos de laboratorio como preditores. O interese de desenvolver calibracións directas a partir de coleccións de dixestibilidade in vivo coñecida se basea na avantaxe de eliminar técnicas de laboratorio intermedias, pero ten a dificultade de requirir datos de amplas series de mostras avaliadas mediante ensaios in vivo que deben ser realizados en condicións estandarizadas e repetíbeis (Barber et al., 1990; Baker et al., 1994; Flinn et al., 2000a,b). Dado que a dixestibilidade é unha propiedade da forraxe e non un parámetro químico, a predición por NIRS pode ser máis dificultosa, xa que as medidas de dixestibilidade in vivo introducen un "factor animal" nos procesos de calibración. O erro adicional pode ser resolto mediante a ampliación do número de animais en cada ensaio para reflectir a variabilidade ou ben, debido aos problemas intrínsecos das determinacións, aceptar unha menor precisión nas ecuacións. Diversos traballos indican que a tecnoloxía NIRS permite estimar a dixestibilidade das forraxes de forma precisa e repetíbel, polo menos en igual medida que as estimacións realizadas por métodos de laboratorio como a dixestión in vitro con líquido ruminal ou por métodos enzimáticos, e de forma moito máis rápida (Dryden, 2003b). A precisión da estimación da dixestibilidade das forraxes é, globalmente, algo inferior á observada para a composición química, sendo o valor medio do 𝑆𝐸𝑃 aproximadamente o duplo do correspondente valor para os constituíntes químicos orgánicos (Dryden, 2003b). Na Táboa 17 se mostra a orde de magnitude dos erros de predición mediante NIRS observada nos laboratorios do INRA para os principais parámetros do valor nutricional determinados nas forraxes (Bastianelli et al., 2018), mostrando que os valores de 𝑆𝐸𝐶𝑉 ou de 𝑆𝐸𝑃 para a determinación do valor enerxético (rango 1,9-3,0) son superiores aos parámetros dos compoñente químicos (rango 0,3-2,1). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 81 Táboa 17.- Rango de variación para os erros de predición dos principais parámetros determinados en forraxes e alimentos destinados aos ruminantes no INRA Parámetro Erro de predición ( 𝑺𝑬𝑪𝑽 ou 𝑺𝑬𝑷 ) Cinzas (%MS) 0,3 - 1,8 Proteína bruta (%MS) 0,4 - 1,4 Fibra nutro deterxente (%MS) 1,2 - 2,1 Fibra ácido deterxente (%MS) 0,7 - 1,5 Lignina ácido deterxente (%MS) 0,3 - 0,7 Azucres solubles (%MS) 0,3 - 1,0 Amidón (%MS) 0,8 - 1,8 Graxa bruta (%MS) 0,4 - 0,8 Dixestibilidade in vitro método pepsina-celulasa (%) 1,6 - 2,5 Dixestibilidade in vivo (%) 1,9 - 3,0 MS: materia seca; 𝑆𝐸𝐶𝑉: erro estándar de validación cruzada; 𝑆𝐸𝑃: erro estándar de predición; Fonte: Bastianelli et al. (2018) Robert et al. (1986) avaliaron a capacidade de NIRS para a predición da dixestibilidade in vivo dunha colección de forraxes diversas con valor medio de DMO de 66,2%, obtendo uns estatísticos de validación externa de 0,93 para 𝑟2, de ±2,51% para 𝑆𝐸𝑃 e de 2,53 para 𝑅𝑃𝐷ve, mostrando unha precisión intermedia na estimación. Para unha colección de 82 mostras de fenos de gramíneas e de leguminosas de DMS in vivo determinada con gando vacún e ovino, Redshaw et al. (1986) obtiveron valores de 𝑆𝐸𝑃 de ±2,4% para as calibracións NIRS cando utilizaban valores de referencia obtidos con vacún e de ±4,4% cando as determinacións in vivo se realizaron con ovinos. A variabilidade dos datos de referencia procedentes de gando vacún explicou aproximadamente a metade da variabilidade na predición de dixestibilidade por NIRS, mentres que esta proporción se reduciu a 1/6 cando se trataba de valores obtidos con ovino. Para unha colección de 182 mostras de ensilaxes de herba Baker et al. (1994), estudando o efecto do método de calibración para controlar os efectos da humidade residual e do tamaño de partícula, reportan valores de 𝑟2 = 0,82 e 𝑆𝐸𝑃 = ±2,3% para o conxunto de validación externa. Barber et al. (1990) compararon a predición de DMO in vivo a partir de determinacións de DMO in vitro polos métodos Tilley-Terry e celulasas, mediante parámetros químicos baseados en lignina e FADM e mediante análise NIRS, resultando que NIRS era o método máis preciso, con valores do coeficiente de determinación en validación externa de 𝑟2 = 0,76, comparado con 𝑟2 entre 0,14 e 0,64 para os outros métodos. No estudo de Givens et al. (1991) realizado con pallas de cereal tratadas ou non con amoníaco, a espectroscopía NIR superou os métodos convencionais in vitro obtendo REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 82 valores do coeficiente de determinación no conxunto de validación externa 𝑟2 de 0,64 para NIRS comparados con 0,60 para o método Tilley-Terry e de entre 0,48 e 0,58 para métodos enzimáticos de dixestión con celulasas. De Boever et al. (1996) usando un conxunto de 64 ensilaxes de herba comparou a capacidade preditiva da DMO in vivo a partir de ecuacións empíricas baseadas na composición química, da espectroscopía NIR e da dixestión in vitro con líquido ruminal e con celulasas, reportando que o poder preditivo das ecuacións baseadas en parámetros químicos era relativamente baixo (𝑅2 = 0,52 a 0,64), sendo lixeiramente superior para os métodos in vitro con líquido ruminal (𝑅2 = 0,66) e con celulasas (𝑅2 = 0,68), que eran mellorados pola combinación en ecuacións de regresión múltiples dos valores in vitro con líquido ruminal, MS e proteína (𝑅2 = 0,77) ou dos valores de dixestibilidade enzimática, PB, fibra e MS (𝑅2 = 0,84), mentres que a predición por NIRS mostrou un grao de precisión intermedio entre os dos dous últimos modelos (𝑅2 = 0,79). Amari e Abe (1997) desenvolveron calibracións NIRS a partir dunha colección de 503 mostras de fenos, ensilaxes de herba e ensilaxes de millo (388 para calibración e 115 para validación) para estimar a composición química e a dixestibilidade (expresada como nutrientes dixestíbeis totais ou TDN). Cando os valores de referencia se obtiveron a partir de ecuacións baseadas nos contidos en fibra e proteína, a varianza explicada polos modelos NIRS en validación externa para as mostras de fenos e de ensilaxes de herba foi do 70% e o erro estándar de predición foi de ±1,5 e de ±3,8%. Para as ensilaxes de millo a bondade das predicións NIRS foi inferior, con valores de 𝑟2< 0,50 e de 𝑆𝐸𝑃 próximos a ±4,0%. Cando os valores de referencia de TDN procedían de ensaios in vivo, o valor da varianza explicada polas ecuacións NIRS se aproximaba ao 80% e os valores do 𝑆𝐸𝑃 se mantiveron no rango de ±2,3 a ±3,4% para tódolos grupos de mostras. Flinn e Heazlewood (2000a,b) usando 16 forraxes de Australia (7 leguminosas, 4 fenos de cereal, 2 fenos de sorgo e 3 fenos de pastos) compararon a capacidade preditiva da espectroscopía NIR con outros métodos para predicir DMS in vivo. A bondade da predición NIRS foi semellante á da dixestión con pepsina-celulasa, mostrando un valor do coeficiente de correlación 𝑟=0,95, e mellor que as ecuacións baseadas nos parámetros químicos FAD e PB. O comportamento de NIRS foi sorprendentemente alto, toda vez que os valores de referencia de DMO in vivo non foron determinados directamente senón que foron preditos a partir dos resultados da dixestión pepsina- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 83 celulasa corrixidos por estándares de DMO in vivo coñecida. De la Roza et al. (1995) obtiveron calibracións NIRS que permitiron estimar satisfactoriamente o valor da dixestibilidade enzimática de mostras de planta enteira de millo, obtendo valores en validación cruzada de 0,91 para o coeficiente de determinación e de ±1,39% para 𝑆𝐸𝐶𝑉. Na predición de DMO in vitro dunha colección de mostras de planta enteira de millo (rango 58,0-81,5%), Campo et al. (2010) desenvolveron calibracións NIRS con valores de 1−𝑉𝑅 de 0,70 e 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±2,2%, obtendo en validación externa valores de 0,60 para 𝑟2, de ±1,8% para 𝑆𝐸𝑃 e de 1,70 para 𝑅𝑃𝐷, manifestando unha mediocre capacidade preditiva do modelo de predición na estimación de DMO in vitro de mostras independentes, inferior á observada na estimación da concentración de parámetros de composición química do mesmo conxunto de mostras, o cal se atribúe fundamentalmente á menor repetibilidade na determinación de DMO polo método de referencia. Andueza et al. (2011) estudaron a capacidade preditiva de NIRS para estimar a dixestibilidade in vivo e parámetros de composición química de forraxes pratenses utilizando unha ampla colección de mostras de gramíneas e leguminosas, considerada como representativa da variabilidade esperada en zonas temperadas e constituíndo a base das táboas de valor nutricional do INRA para estas especies. Mentres que as ecuacións desenvolvidas permitiron predicir satisfactoriamente a composición química, as ecuacións para a predición de DMO non acadaban o valor de 𝑅𝑃𝐷>3,0 que permitiría o seu uso en aplicacións cuantitativas, debido ao comparativamente alto erro do método de referencia na determinación do valor in vivo. Williams e Sobering (1996) subliñan que ás veces é difícil obter valores de 𝑅𝑃𝐷>3 na predición de parámetros medidos en animais, propoñendo nestes casos utilizar 𝑅𝐸𝑅 como criterio de valoración das ecuacións de calibración e sinalando un valor umbral de 𝑅𝐸𝑅>10 como indicativo dunha calidade aceptábel na predición. Por outra banda, os anteriores autores indicaban que nestes casos é habitualmente necesario ampliar a variabilidade nas coleccións de calibración para o cal suxiren a inclusión de forraxes moi novos e dixestíbeis e de forraxes moi maduros e pouco dixestíbeis, tanto frescos como conservados, para aumentar a variabilidade e por tanto o 𝑅𝑃𝐷 das calibracións. Na Táboa 18 se indican os estatísticos de calibración e validación de ecuacións NIRS para estimación da dixestibilidade e valor enerxético de distintas de forraxes, que foron tomados de diversos traballos de referencia realizados neste área de estudos. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 84 Táboa 18.- Comparación da calidade preditiva da dixestibilidade e valor enerxético de distintas forraxes mediante NIRS Tipo de forraxe Parámetro Calibración Validación 𝑺𝑫 𝑹𝑬𝑹 𝑹𝑷𝑫 Referencia 𝑹 2 𝑺𝑬𝑪𝑽 𝒓 2 𝑺𝑬𝑷 Pastos mixtos DMO in vivo 0,95 - 0,93 2,51 - - 2,53 Robert et al. (1986) Cana e follas de millo DoTT 0,91 2,52 0,88 2,24 6,43 - 2,87 Zimmer et al. (1990) Palla de cereal DMO in vivo 0,64 - - - 3,71 - - Givens et al. (1991) Planta enteira de millo DoNDC 0,91 1,39 - - 4,60 18,11 3,30 De la Roza et al. (1995) Ensilaxe de herba DMO in vivo 0,95 1,65 0,85 2,70 7,13 27,60 2,64 Park et al. (1997) Ensilaxe de millo DMO in vivo 0,38 2,10 - 1,50 1,97 7,20 1,31 De Boever et al. (1997) Ensilaxe de trigo DMO in vivo 0,72 1,90 - - - 7,89 - Adesogan et al. (1998) Planta enteira de cereais DMO in vivo 0,73 3,49 - - 6,79 8,25 1,95 Bruno-Soares et al. (1998) Ensilaxe de herba DMO in vivo 0,78 3,45 0,79 3,01 7,20 9,14 2,10 De la Roza et al. (1999) DoNDC 0,92 2,79 0,89 2,29 9,70 17,82 3,48 Ensilaxe de herba DMO in vivo 0,90 3,37 - - - 8,90 - Corson et al. (1999) Planta enteira de millo DoTT 0,98 1,78 - - 9,55 20,80 5,37 Cozzolino et al. (2000) Ensilaxe de millo DFND 0,19 3,62 - - 4,00 4,70 - Lundberg et al. (2004) DoGas 0,85 1,47 - - 3,90 15,71 - Ensilaxe de herba DFND 0,69 3,93 - - 6,90 16,96 - Lundberg et al. (2004) DoGas 0,82 2,07 - - 5,30 15,36 - Ensilaxe de millo DMSTT 0,74 1,20 - - 2,20 - 1,83 Lovett et al. (2004) Alfalfa DoTT 0,89 2,00 0,92 2,00 - 15,00 - Colombini et al. (2005) Unifeed DoGas 0,80 1,44 - - 3,30 11,60 2,29 Mentink et al. (2006) DFND 0,59 3,81 - - 6,40 7,98 1,68 Ensilaxe de xirasol DoTT 0,83 3,50 - - - 7,66 2,10 Fassio et al. (2007) Planta enteira de xirasol DoTT 0,61 2,10 - - - 14,76 2,80 Fassio et al. (2007) Festuca DoPC 0,93 2,26 0,91 2,27 5,18 9,60 2,28 Poblaciones et al. (2008) Dactilo DoPC 0,98 1,65 0,94 1,88 7,86 18,62 4,18 Ensilaxe de herba DMSTT 0,60 3,60 0,54 4,50 6,90 6,16 1,53 Restaino et al. (2009) Pastos mixtos DMO in vivo 0,86 2,31 - - 6,06 - 2,62 Decruyenaere et al. (2009) Ensilaxe de grao de millo húmido DoTT 0,91 2,0 - - - 12,50 2,40 Fassio et al. (2009) Pastos e cultivos diversos DMO in vivo 0,88 0,74 0,84 0,99 - 20,59 2,80 Andueza et al. (2011) Ensilaxes (alfalfa, pradeira, millo) DMO in vivo 0,91 2,80 - - - 15,07 3,30 Krizsan et al. (2012) DoTT 0,88 2,40 - - - 12,83 2,80 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 85 Planta enteira de millo DoTT 0,72 2,53 0,62 1,68 2,62 12,66 1,56 Campo et al. (2013) Pastos de montaña DoPC 0,94 3,48 - - 14,21 - 4,08 Dale et al. (2013) Pastos mixtos DMO in vivo 0,92 2,07 - 2,83 6,98 - 2,47 Decruyenaere et al. (2015) 𝑆𝐷: desviación estándar; 𝑅𝐸𝑅: relación entre o rango de valores de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅𝑃𝐷: relación entre a 𝑆𝐷 do conxunto de mostras para o valor de referencia e o erro estándar de validación cruzada ou de predición; 𝑅2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; 𝑆𝐸𝐶𝑉: erro estándar de validación cruzada; 𝑟2: coeficiente de determinación en validación externa; 𝑆𝐸𝑃: erro estándar de predición; DMO: dixestibilidade da MO; DoTT: DMO método Tilley-Terry: DMS: dixestibilidade da materia seca; DMSTT: DMS método Tilley-Terry; DoNDC: dixestibilidade enzimática da materia orgánica método Fibra Neutro DeterxenteCelulasa; DoPC: dixestibilidade enzimática da materia orgánica método Pepsina-Celulasa; DoGas: dixestibilidade da MO método produción de gas; DFND: dixestibilide da fibra neutro deterxente 1.10.3.2 Predición de parámetros de degradabilidade ruminal Diversos autores avaliaron a capacidade de NIRS para predicir adecuadamente os parámetros de degradación ruminal de distintos alimentos. Waters e Givens (1992) compararon a capacidade de NIRS coa de ecuacións baseadas en parámetros químicos para estimar os parámetros de degradabilidade ruminal dunha colección de mostras de pastos con diferentes ciclos e estados de madurez, demostrando a potencialidade de NIRS e indicando que os datos espectrais estaban significativamente relacionados con tódolos parámetros tanto nos primeiros cortes como nos rebrotes, mentres que as ecuacións baseadas en parámetros químicos só explicaban unha proporción significativa da varianza de ditos parámetros no primeiro ciclo de crecemento do pasto. A ecuación NIRS para estimar a degradabilidade ruminal efectiva da PB (𝐷𝑇PB, valor medio 68,0 % e rango 53,0 a 74,0 %) mostrou en calibración un valor de 0,75 para 𝑅2 e de ±3,40% para 𝑆𝐸𝐶, apuntando unha capacidade preditiva moderada. Similares resultados reportan Todorov et al. (1994) que examinaron a capacidade de NIRS para estimar a degradabilidade ruminal efectiva da MS (𝐷𝑇MS, rango 16,9 a 80,1%) e da 𝐷𝑇PB (rango 56,9 a 80,7%) dun conxunto de mostras de forraxes de diferentes características, obtendo ecuacións de regresión para 𝐷𝑇MS e 𝐷𝑇PB con valores para o conxunto de calibración de, respectivamente, 0,93 e 0,76 para 𝑅2 e de ±4,3 e ±3,8 % para 𝑆𝐸𝐶, que denotan unha aceptábel calidade da predición para a estimación da degradabilidade da MS pero non da PB. De Boever et al. (1998) mostraron a superior capacidade preditiva de NIRS comparada coa de ecuacións que utilizaban como variábeis independentes parámetros químicos e data de colleita para predicir a degradabilidade ruminal da PB en mostras de pastos de gramíneas diversas, corroborando os resultados dos anteriores autores. O valor medio de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 86 𝐷𝑇PB e o rango de variación foi de 72,8% (51,0 a 91,2%) para as gramíneas e de 82,1% (61,8 a 90,8%) para a alfalfa. A calidade da predición foi superior para a ecuación NIRS construída para pastos de gramíneas comparado coa de mostras de alfalfa, con valores do coeficiente de determinación e erro estándar de predición en validación cruzada de, respectivamente, 0,93 e ±2,5% no primeiro grupo de mostras e de 0,93 e ±1,4% para o segundo. Herrero et al. (1997) indican a dificultade de predicir a taxa de degradación ruminal dos nutrientes debido, entre outros factores, á natureza exponencial dos modelos usados na súa parametrización unido a que, dado que NIRS mide indirectamente o parámetro a predicir, é dependente das imprecisións cometidas nas determinacións directas efectuadas polo método de referencia. A este respecto, a variabilidade dos valores obtidos para os parámetros de degradabilidade ruminal dun conxunto de mostras polo método de referencia dependen, ademais das súas características intrínsecas, do procedemento seguido na determinación in situ. Como indican Vanzant et al. (1998) entre outros autores, o pretratamento das mostras, o tipo de bolsas utilizadas, os animais, o tipo e nível de alimentación e as quendas ou días de determinación son factores que, entre outros, contribúen significativamente á varianza dos resultados que constituirán os valores de referencia. A dificultade de obter estimacións precisas por NIRS da degradabilidade ruminal da FND foi comprobada por distintos estudos, como o realizado por Andrés et al. (2005a), que compararon a capacidade de ecuacións NIRS coas baseadas en parámetros químicos para a estimación da dixestibilidade in vitro e a degradabilidade in situ da FND dunha colección de pastos permanentes con diferentes xenotipos e estados de madurez diversos, indicando que en ambos casos a fiabilidade das predicións foi insatisfactoria para aconsellar o seu uso analítico. Unicamente se puido comprobar a utilidade das calibracións NIRS para estimar aceptabelmente a proporción de FND que desaparece no rume con tempos longos de incubación (>48 h) acadándose valores de 𝑟2 entre 0,92 e 0,96 e de 𝑅𝑃𝐷 entre 2,30 e 2,46 que permitirían o seu uso en análise cualitativo. Ohlsson et al. (2007) estudaron a utilidade de NIRS para estimar os parámetros que describen a cinética de degradabilidade ruminal e a degradabilidade efectiva da MS, PB e FND dunha colección de mostras (n=61) de diferentes xenotipos de raigrás inglés e dactilo, colleitadas en diferentes estados fenolóxicos, sobre das que se tiña efectuado unha avaliación in situ para obter os valores de referencia. Indican que a limitación para a estimación dos parámetros 𝒂, 𝒃 e 𝒄 é que están interrelacionados e por tanto non OBXECTIVOS 93 2. OBXECTIVOS O obxectivo xenérico da Tese de Doutoramento é contribuír á mellora da utilización das forraxes para a produción de leite de vacún en Galiza a traveso da obtención de métodos analíticos fiábeis, robustos e precisos para ser aplicados en análises de rutina para servizo ás explotacións, así como con propósito de apoio á investigación e ás actividades de selección e mellora xenética de forraxes. O presente traballo está enmarcado no proxecto colaborativo de innovación FEADER 2013/22 titulado Aplicacións analíticas avanzadas en forraxes para racións de vacas de leite de baixo custe e reducido impacto ambiental levado a cabo polo LIGAL e CIAM. O citado proxecto estaba focalizado a incrementar a capacidade analítica de ambas institucións mediante a predición directa por NIRS da composición química e da dixestibilidade dun amplo rango de forraxes frescas e conservadas e de mesturas unifeed así como da degradabilidade ruminal e calidade fermentativa das ensilaxes máis utilizadas na alimentación das vacas de leite de Galiza. Os obxectivos específicos son os que se indican a continuación: a) Describir as características da composición química e dixestibilidade da materia orgánica (DMO) das principais forraxes frescas e forraxes conservadas como fenos e ensilaxes utilizadas nas explotacións leiteiras galegas. b) Desenvolver e validar modelos preditivos NIRS para estimar a composición química e DMO das forraxes e mesturas completas comunmente usadas para a alimentación das vacas de leite. c) Avaliar a capacidade da tecnoloxía NIRS para estimar os parámetros de degradabilidade ruminal de ensilaxes de herba e de millo. d) Actualizar as ecuacións baseadas en parámetros químicos para a estimación da DMO de forraxes ensiladas e desenvolver novos modelos empíricos para forraxes frescas, fenos e mesturas unifeed así como da degradabilidade ruminal das ensilaxes de herba e de millo, comparando a súa capacidade preditiva coa obtida por NIRS. e) Desenvolver e validar modelos de predición NIRS para estimar a calidade fermentativa de ensilaxes de herba e de millo. 94 95 Material e Metodos 96 MATERIAL E MÉTODOS 97 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material vexetal As mostras que conforman as coleccións utilizadas para a construción das calibracións NIRS para a predición do valor nutritivo de forraxes en estado fresco proceden de explotacións gandeiras, maioritariamente de produción de leite de vacún, de diversas localidades de Galiza así como de ensaios realizados no CIAM nas fincas experimentais adscritas, representativas da zona costeira atlántica (Mabegondo-Abegondo-A Coruña) e da zona interior de Galiza (A Veiga-Pobra do Brollón-Lugo), ascendendo a un total de 4.645 mostras. As calibracións NIRS para estimar a composición química se construíron e validaron sobre un total de 3.470 mostras e, dentro deste grupo, se utilizaron 1.844 para estimar a dixestibilidade da materia orgánica e outras 84 mostras para estimar a dixestibilidade da FND mediante ecuacións empíricas e NIRS. A estimación dos parámetros de degradabilidade ruminal mediante ecuacións empíricas e NIRS se realizou sobre un conxunto de 132 mostras de ensilaxes de herba e de millo que foran avaliadas in situ e, finalmente, se utilizaron 1.043 mostras de ensilaxes para estimar os parámetros fermentativos mediante NIRS. Coa excepción das 125 mostras de racións unifeed representativas das dietas completas consumidas nas granxas de leite, as restantes mostras correspondían a forraxes, das que 2.181 eran forraxes frescas, 1.262 eran ensilaxes de herba, 996 eran ensilaxes de millo e 81 fenos de pradeira. A colección de mostras de forraxes integra unha ampla representación das diferentes tipoloxías consumidas nas explotacións leiteiras galegas, presentando unha elevada variabilidade en canto o estado de madurez, localidade, manexo agronómico e xenotipos así como de composición botánica e ciclos de crecemento, no caso da herba de pradeiras e pastos permanentes. 3.1.1 Forraxes frescas 3.1.1.1 Herba de pradeiras, pastos permanentes e cultivos de inverno de trevos anuais e as súas mesturas con raigrás O colectivo de mostras engloba material vexetal procedente de diversos proxectos (Fernández-Lorenzo et al., 2007; Piñeiro et al., 2008; Piñeiro et al., 2010; Flores et al., MATERIAL E MÉTODOS 98 2011a; Flores et al., 2011b; Piñeiro et al., 2011; Flores et al., 2012; Pereira-Crespo et al., 2012; Flores et al., 2013; Flores et al., 2014; Veiga et al., 2016; Veiga, 2019) levados a cabo por investigadores do CIAM durante 17 anos (1997-2013), realizados nas fincas experimentais e contando coa colaboración de explotacións gandeiras de diversas localidades galegas. Dentro desta poboación se inclúen mostras de herba de pradeiras sementadas e pastos permanentes cunha ampla variabilidade en canto á composición botánica, ciclos de crecemento, estados de madurez e manexo agronómico, así como mostras de trevos anuais e as súas mesturas con raigrás procedentes de distintos aproveitamentos como cultivos de inverno. Na Táboa 20 indícanse o tamaño e as características da composición botánica da colección, cun total de 1.255 mostras, das que se dispuña de datos de dixestibilidade da materia orgánica dun total de 593 mostras. Táboa 20.- Tamaño e características da composición botánica do colectivo de mostras Especies Número de mostras Pradeira mixta (L. perenne, T. repens e T. pratense) 296 Lolium multiflorum 164 Trifolium resupinatum 107 Dactylis glomerata 95 Mestura de gramíneas e leguminosas 78 Trifolium vesiculosum 75 Lolium perenne 64 Ornithopus sativus 63 Trifolium michelianum 49 Trifolium incarnatum 31 Mestura de 9 especies de Trifolium sp. 28 Lolium x boucheanum 25 Lolium multiflorum e Trifolium incarnatum 25 Trifolium repens 22 Lolium multiflorum e 5 Trifolium sp. 22 Festuca arundinacea 17 Lolium perenne e Trifolium repens 18 Trifolium pratense 16 Mestura de 5 especies de Trifolium sp. 15 Lolium x boucheanum e 5 especies de Trifolium sp. 11 Medicago sativa 10 Phalaris aquatica 7 Lolium multiflorum e Trifolium michelianum 6 Trifolium subterraneum 5 Trifolium fragiferum 2 Secale cereale 2 Biserrula pelecinus 1 Vicia sativa 1 MATERIAL E MÉTODOS 99 3.1.1.2 Chícharo, triticale e as súas mesturas As mostras proveñen de diferentes ensaios de campo desenvolvidos no CIAM entre 2002 e 2008 (Flores et al., 2003; Fernández-Lorenzo et al., 2007; Pereira et al., 2009; Pereira et al., 2010a; Pereira et al., 2010b). Os citados ensaios realizáronse en 2 localidades (Mabegondo e Pobra do Brollón) con diferentes xenotipos de chícharo (Pisum sativum L.) e triticale (x Triticosecale Wittm.), cultivados en monocultivo e en cultivo asociado e colleitados en diferentes estados fenolóxicos. Para este estudo se utilizou unha colección de 452 mostras (303 de chícharo, 68 de triticale e 60 da mestura chícharo e triticale en diferentes proporcións), das que 431 tiñan datos de dixestibilidade da materia orgánica. 3.1.1.3 Planta enteira de millo As 156 mostras que conforman o colectivo de planta enteira de millo en estado fresco (129 mostras con valores de dixestibilidade da materia orgánica) procedían dos estudos de comportamento agronómico das variedades de millo forraxeiro realizada desde o CIAM no ano 2013 en catro zonas xeográficas de Galiza (Bande-Castro, 2013), así como de ensaios realizados no CIAM desde 2012 a 2018 (Botana et al., 2016b; PlataReyes et al., 2018; Gómez-Miranda et al., 2018) nas localidades de Mabegondo, Pobra de Brollón e Cartelos (Carballedo-Lugo) e mostras de explotacións gandeiras recibidas no LIGAL para a súa análise desde 2015 até 2019, procedentes de distintas localidades de Galiza. 3.1.1.4 Planta enteira e compoñentes morfolóxicos de sorgo A poboación de sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) está formada por mostras que proveñen de diferentes traballos realizados polo CIAM desde 2012 até 2018 (Resch et al., 2013; Botana et al., 2016a; Botana et al., 2017; Gómez-Miranda et al., 2018; Pereira-Crespo et al., 2018a; Pereira-Crespo et al., 2018b) nas localidades de Mabegondo e Pobra do Brollón. A colección está constituída por 171 mostras (120, 28 e 23 mostras de planta enteira, parte vexetativa e inflorescencia, respectivamente), sendo coñecidos os valores de dixestibilidade da materia orgánica de 71 mostras. 3.1.1.5 Planta enteira e compoñentes morfolóxicos de xirasol As mostras proveñen de diferentes ensaios realizados polo CIAM durante o ano 2004 (Pereira-Crespo et al., 2014) e posteriormente desde 2013 até 2017 (Flores et al., 2016; MATERIAL E MÉTODOS 100 Botana et al., 2017; Valladares et al., 2017; Sainz-Ramírez et al., 2017a; Sainz-Ramírez et al., 2017b; Gómez-Miranda et al., 2018; Sainz-Ramírez et al., 2020) nas localidades de Mabegondo e Pobra do Brollón. O material vexetal da colección (n=147) inclúe mostras de planta enteira de xirasol (n=14) e dos diferentes compoñentes morfolóxicos que constitúen a planta (n=133): parte vexetativa (constituída por talo e follas), capítulo (constituída por receptáculo, brácteas e inflorescencias ou sementes), talo, follas, receptáculo e froito. O conxunto de mostras con valores de dixestibilidade da materia orgánica in vitro coñecida era de 112. 3.1.2 Forraxes ensiladas 3.1.2.1 Ensilaxes de herba A colección de ensilaxes de herba utilizadas no presente traballo ascendeu a 868 en total, correspondendo maioritariamente a mostras de ensilaxes de herba de pradeira, incluíndo tamén mostras de ensilaxes de triticale, de chícharo e as súas mesturas, así como de ensilaxes de trevos anuais e as súas mesturas con raigrás e de ensilaxes de alfalfa. As mostras procedían de diferentes ensaios (Flores, 2004; Veiga, 2019) realizados no CIAM desde 1997 até 2015 nas localidades de Mabegondo e Pobra do Brollón e mostras recibidas no LIGAL procedentes de explotacións leiteiras de diversas áreas xeográficas de Galiza en distintos anos. O número de mostras con datos de dixestibilidade da materia orgánica ascendía a 256, das que 31 correspondían a ensilaxes de cultivos de inverno e o resto a ensilaxes de herba de pradeira. Outro grupo de 325 mostras das que se dispuñan de datos fermentativos, nas que estaban representadas maioritariamente ensilaxes de herba de pradeira pero que incluían tamén ensilaxes de cultivos de inverno (51 mostras), procedían de distintos ensaios realizados na estación experimental do CIAM en Mabegondo (Flores, 2004; PereiraCrespo et al., 2015b; Botana, 2019) e de mostras recibidas no LIGAL para a súa análise desde 1997 até 2013. As calibracións NIRS para predicir os parámetros de degradabilidade ruminal construíronse a partir dun conxunto de 69 mostras que foron avaliadas in situ durante tres proxectos de investigación realizados nas instalacións do CIAM en Mabegondo entre 2003 e 2014 con mostras procedentes de explotacións leiteiras de diferentes localidades de Galiza e de mostras producidas na propia estación experimental. MATERIAL E MÉTODOS 101 3.1.2.2 Ensilaxes de millo A poboación de mostras de ensilaxes de millo (n=215) está constituído por mostras procedentes de diferentes ensaios realizados no CIAM entre 1997 e 2015 (Flores, 2004; Fernández-Lorenzo et al., 2007a; Fernández-Lorenzo et al., 2007b; Botana, 2019) e obtidas de cultivos realizados na estación experimental de Mabegondo e en diversas explotacións leiteiras colaboradoras, así como de mostras recibidas no LIGAL para a súa análise en diversos anos, procedentes de explotacións leiteiras de diversas zonas xeográficas de Galiza. Do total da colección, se coñecía o valor da dixestibilidade da materia orgánica de 129 mostras, dentro das que se dispuña de información adicional sobre os valores da dixestibilidade da parede celular de 84 mostras. A construción das calibracións NIRS para a estimación dos parámetros fermentativos de ensilaxes de millo se realizou utilizando unha colección de 718 mostras, procedentes de diferentes estudos realizados no CIAM (Flores, 2004; Fernández-Lorenzo et al., 2007a; Fernández-Lorenzo et al., 2007b; Latorre, 2017) desde 1997 até 2012. Para o desenvolvemento das ecuacións NIRS para estimar os parámetros de degradabilidade ruminal, o colectivo de mostras estaba formado por 63 mostras procedentes de explotacións leiteiras, que foron avaliadas in situ no decurso de dous proxectos realizados no CIAM entre os anos 2003 e 2005 e 2013 e 2015. 3.1.3 Fenos de herba A poboación de fenos (n=81) está constituída na súa totalidade por mostras de herba secadas no campo, procedentes de pradeiras e prados de explotacións leiteiras de distintos puntos de Galiza, parte das cales se recolleron durante un proxecto realizado no CIAM entre os anos 2003 e 2004, e outra parte procede de mostras enviadas ao LIGAL para a súa análise entre os anos 2005-2015. Eran coñecidos os valores da dixestibilidade da materia orgánica de 52 mostras. 3.1.4 Mesturas unifeed O colectivo de mostras (n=125) de racións completas unifeed proceden de explotacións leiteiras de diferentes localidades de Galiza que foron recibidas no LIGAL para a súa análise durante os anos 2005-2015 e dun ensaio de avaliación in vivo realizado no CIAM para a obtención de mostras de referencia. Do total da colección, se dispuña de valores de dixestibilidade da materia orgánica para 71 mostras. MATERIAL E MÉTODOS 102 3.2 Métodos analíticos de referencia As mostras utilizadas no presente traballo se analizaron por métodos de referencia nas instalacións do CIAM para determinar a composición química, dixestibilidade in vitro e in vivo e degradabilidade in situ, sendo realizadas as análises fermentativas das ensilaxes no Laboratorio Agrario e Fitopatolóxico de Galicia (LAFIGA). 3.2.1 Análises químicas por vía húmida A preparación das mostras de forraxes frescas e ensiladas e ración unifeed para as posteriores determinacións por vía húmida realizouse mediante secado en estufa de aire forzado (Unitherm, Russell-Lindsey Engineering, Birmingham, Inglaterra) a 80 ºC durante 16 horas (Castro, 1996) para realizar a determinación do contido en materia seca por gravimetría, sendo posteriormente moídas a 1 mm nun muíño de martelos (Christy e Norris Ltd., Chelmsford, Inglaterra). Todas as determinación analíticas se realizaron por duplicado, repetíndose a análise cando a diferenza entre resultados superaba o 5% do valor medio. Os resultados expresáronse en porcentaxe sobre MS corrixida por humidade residual. No caso das mostras de ensilaxes non se realizou a corrección do contido en materia seca pola perda de volátiles durante o secado en estufa. Os procedementos utilizados na obtención dos valores de referencia foron os descritos a continuación: - O contido en humidade residual das mostras secas e moídas realizouse mediante desecación a 102 ºC até peso constante. - O contido en materia orgánica (MO) realizouse mediante a combustión en mufla a 550 ºC até peso constante. - A proteína bruta (PB) cuantificouse a partir do nitróxeno total multiplicado por 6,25. A determinación de N total en mostras secas e moídas realizase mediante dixestión micro Kjeldahl por ebulición con ácido sulfúrico e peróxido de hidróxeno, seguida da determinación colorimétrica do ión amonio, segundo o método descrito por Castro et al. (1990) adaptado aos autoanalizadores de fluxo continuo AAIII (Bran+Luebbe, Analyzer Division, Norderstedt, Alemaña). RESULTADOS 205 aceptábel, con valores respectivos de 0,89, 0,85, 0,77 e 0,77 para 1−𝑉𝑅, de 2,70, 1,63, 1,89 e 2,25 para 𝑆𝐸𝐶𝑉 e de 2,6, 2,6, 2,1 e 2,1 para 𝑅𝑃𝐷. No caso da ecuación de estimación do contido en lignina, o valor do coeficiente de determinación en validación cruzada (1−𝑉𝑅=0,47) foi inferior ao límite de 0,50 indicado por Shenk et al. (2001) para que un modelo de predición se poida considerar válido con propósitos preditivos. Os valores da relación entre 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑆𝐸𝐶 oscilaron entre 0,65 e 1,02, situados dentro do intervalo recomendado por Burns e Ciurczak (1992), indicativo da robustez das ecuacións de calibración NIRS. No proceso de validación dos modelos de calibración sobre o conxunto de mostras independentes, os valores do coeficiente de determinación 𝑟2, do erro de predición 𝑆𝐸𝑃 e do estatístico 𝑅𝑃𝐷ve foron, respectivamente, de 0,86, ±1,81% e 2,6 para MO, de 0,91, ±1,07% e 3,3 para PB, de 0,91, ±2,37% e 3,3 para FND, de 0,94, ±1,55% e 3,9 para FAD, de 0,57, ±2,92% e 1,3 para FB, de 0,77, ±2,34% e 1,7 para CEL, de 0,53, ±1,71% e 1,2 para LAD e de 0,89, ±2,83% e 2,6 para DMO. Windham et al. (1989) indican que os valores de 𝑆𝐸𝑃 non deberían superar ao dobre do erro do método de referencia do parámetro a predicir, sendo cumprida esta condición para as ecuacións NIRS que estiman o contido en PB, FND, FAD, LAD e o valor de DMO, mentres que no caso dos modelos de predición de MO, FB e CEL os valores de 𝑆𝐸𝑃 superan o límite recomendado. Atendendo aos criterios de Williams (2014) para xulgar a calidade preditiva das ecuacións en base aos valores de 𝑅𝑃𝐷ve e 𝑅𝐸𝑅ve en validación externa, aquela foi boa (𝑅𝑃𝐷ve>3) para PB, FND e FAD, permitindo para estas ecuacións unha predición cuantitativa, sendo aceptábel (𝑅𝑃𝐷ve entre 2,5 e 3,0) para MO, e sendo consideradas sen utilidade para seren utilizadas con propósitos preditivos (𝑅𝑃𝐷ve<2) a ecuación NIRS para estimar o contido en CEL, FB e LAD. A ecuación para a predición de DMO se categoriza como aceptábel para realizar unha predición cualitativa en rangos atendendo ao seu valor de 𝑅𝑃𝐷ve, situado entre 2,5 e 3,0. Sen embargo, Williams e Sobering (1996) indican que no caso das ecuacións de predición de parámetros biolóxicos con valores de 𝑅𝑃𝐷ve próximos a 3, cando o estatístico 𝑅𝐸𝑅ve é superior a 10 pode considerarse que a ecuación pode ser útil para a predición cuantitativa, o cal é o caso da ecuación NIRS para a predición de DMO no conxunto de mostras de forraxes de ensilaxes de herba, que acadou un valor de 𝑅𝐸𝑅ve de 11,5 en validación externa. RESULTADOS 206 A representación gráfica dos resultados obtidos na etapa de validación externa para os parámetros químicos e dixestibilidade da materia orgánica das ecuacións de calibración de ensilaxes de herba se mostra nas Figuras 15a e 15b e na Figura 16. Os valores da pendente da regresión entre os valores de referencia e os valores preditos polas ecuacións NIRS para a estimación dos diferentes parámetros estivo entre 1,0 e 0,90 para MO, PB, FND, FAD e DMO, estando próxima ao valor inferior do intervalo recomendado no caso da ecuación para a predición de FB (0,89). Os valores da pendente correspondentes a CEL (0,71) e LAD (0,65), claramente por debaixo dos anteriores, indican a subestimación dos valores baixos e a sobreestimación dos valores altos na aplicación dos modelos de predición o cal confirma a escasa utilidade con propósitos preditivos cando se aplican sobre un conxunto de mostras externas observado para estes parámetros. A aplicación dos criterios de Shenk et al. (2001) e Shenk e Westerhaus (1991b) para xulgar acerca da robustez e fiabilidade das ecuacións NIRS en análises de rutina sobre mostras externas, confirmaron a utilidade dos modelos de predición de MO, PB, FND, FAD e DMO, para os que se cumpriron os criterios dos autores citados (𝑟2 ≥0,60; 𝑏𝑖𝑎𝑠 =±0,60 𝑆𝐸𝐶; 𝑆𝐸𝑃c ≤1,30 𝑆𝐸𝐶 e pendente entre 0,9 e 1,1), mentres que para CEL, FB e LAD o comportamento dos modelos de predición non foron satisfactorios. O comparativamente menor tamaño da colección de mostras de ensilaxes con valores coñecidos para estes tres últimos parámetros, coa correspondente parte de variabilidade existente na colección de mostras de validación externa non representada no conxunto de calibración pode explicar parcialmente a falta de axuste dos modelos NIRS para estimar CEL, FB e LAD de ensilaxes de herba obtidos no presente traballo. RESULTADOS 207 Táboa 63.- Estatísticos de calibración e validación cruzada das ecuacións NIRS para estimación da composición química e da dixestibilidade da materia orgánica de mostras de ensilaxes de herba Parámetro Scatter Tratamento matemático Calibración Validación cruzada n Outliers T Media SD Min Max Rango R2 SEC 1-VR SECV RPDvc RERvc MO SNV+D 2,5,5,1 674 24 7 87,2 4,2 72,7 95,3 22,6 0,91 1,36 0,85 1,63 2,6 13,9 PB SNV+D 2,6,4,1 674 19 12 12,6 3,5 4,6 26,6 22,1 0,93 0,91 0,92 1,01 3,5 21,9 FND SNV+D 2,5,5,1 674 26 8 54,0 7,8 27,6 78,3 50,7 0,94 1,95 0,91 2,32 3,4 21,8 FAD SNV+D 2,5,5,1 674 27 9 38,5 5,7 21,7 56,6 34,9 0,96 1,23 0,93 1,58 3,6 22,1 FB SNV+D 2,4,4,1 150 6 8 28,8 3,9 18,6 41,1 22,5 0,83 1,60 0,77 1,89 2,1 11,9 CEL SNV+D 1,5,5,1 151 8 5 27,8 4,7 14,0 39,6 25,6 0,82 1,92 0,77 2,25 2,1 11,4 LAD SNV+D 2,5,5,1 151 7 4 6,4 2,5 2,3 14,5 12,2 0,52 1,49 0,47 1,74 1,4 7,0 DMO W-MSC 2,4,4,1 196 11 9 67,1 7,0 48,6 80,2 31,6 0,92 2,17 0,89 2,70 2,6 11,7 Parámetro Validación externa n Media SD Min Max Rango r2 SEP SEPc Bias Pend. RPDve RERve GH NH MO 167 87,2 4,7 68,3 94,0 25,7 0,86 1,81 1,80 -0,15 0,93 2,6 14,2 0.93 0.43 PB 167 12,7 3,6 5,5 24,5 19,0 0,91 1,07 1,08 -0,04 0,99 3,3 17,7 0.93 0.43 FND 167 53,1 7,9 34,3 71,8 37,4 0,91 2,37 2,38 0,15 1,00 3,3 15,8 0.93 0.43 FAD 167 37,9 6,1 23,4 54,4 31,0 0,94 1,55 1,55 0,05 0,98 3,9 20,0 0.93 0.43 FB 45 28,9 3,7 19,2 36,7 17,5 0,57 2,92 2,92 0,46 0,89 1,3 6,0 0.85 0.36 CEL 46 27,8 3,9 20,4 38,6 18,1 0,77 2,34 2,37 -0,11 0,71 1,7 7,7 0.85 0.36 LAD 46 6,1 2,1 2,0 13,1 11,1 0,53 1,71 1,72 0,19 0,65 1,2 6,5 0.85 0.36 DMO 60 66,1 7,4 48,7 81,1 32,4 0,89 2,83 2,84 0,31 0,90 2,6 11,5 0.85 0.37 W-MSC: multiplicative scatter correction; SNV+D: standard normal variate+detrend; n: número de observacións; Outliers: número de mostras anómalas eliminadas; T: número de factores da regresión; SD: desviación estándar; Min: valor mínimo; Max: valor máximo; SEC: erro estándar de calibración; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; RPDvc: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación cruzada; RERvc: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; SEPc: erro estándar de predición corrixido por bias; Bias: diferencia media entre os valores observados e os preditos pola ecuación; Pend: pendente da regresión; RPDve: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa; RERve: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación externa; GH e NH: distancias de Mahalanobis; MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FB: fibra bruta; CEL: celulosa (%MS); LAD: lignina ácido deterxente (%MS); DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%) RESULTADOS 208 Figura 15a.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba RESULTADOS 209 Figura 15b.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba (Continuación) Figura 16.- Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba RESULTADOS 210 4.2.3 Ensilaxes de planta enteira de millo 4.2.3.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO Valores medios da colección Na Táboa 64 se mostra a media, a desviación estándar, o coeficiente de variación e rango de valores para a composición química e dixestibilidade do colección de mostras de planta de millo enteira en estado fresco que foron usadas para construír e validar as ecuacións empíricas para a predición de DMO a partir de constituíntes químicos. Os valores medios (e rango de variación) da colección, expresados en porcentaxe sobre %MS foron, respectivamente, MO: 96,0 (91,8 a 91,5), PB: 6,7 (3,9 a 10,0), FND: 44,0 (30,2 a 64,7), FAD: 24,8 (14,4 a 36,7), CEL: 20,2 (8,6 a 33,7), HCEL: 19,2 (14,7 a 29,2), LAD: 2,2 (1,0 a 3,5), FB: 22,2 (13,7 a 33,1) e ALM: 27,5 (0,0 a 47,1). O valor medio de DMO foi de 68,8%, con rango entre 59,1 a 76,8%. Táboa 64.- Composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de ensilaxes de planta enteira de millo Parámetro n Media SD CV Max Min MO 129 96,0 1,06 1,11 97,8 91,5 PB 129 6,72 1,10 16,4 10,0 3,91 FND 129 44,0 5,92 13,5 64,7 30,2 FAD 129 24,8 3,97 16,0 36,7 14,4 CEL 129 20,2 4,95 24,5 33,7 8,6 HCEL 129 19,2 2,78 14,5 29,2 14,7 LAD 129 2,21 0,48 21,4 3,52 1,03 FB 129 22,2 3,59 16,2 33,1 13,7 ALM 129 27,5 8,40 30,5 47,1 0,0 DMO 129 68,8 3,39 4,9 76,8 59,1 MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); CEL: celulosa (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); LAD: lignina ácido deterxente; FB: fibra bruta (%MS); ALM: amidón (%MS); DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%); n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; Max: valor máximo; Min: valor mínimo A poboación de mostras de ensilaxe de planta enteira de millo mostra unha elevada heteroxeneidade, sobre todo en canto ao contido en amidón, reflectindo distintos momentos de madurez das mostras, desde o estado vexetativo até as proximidades da madurez fisiolóxica das plantas. Ordenados de maior a menor variabilidade, o parámetro con maior coeficiente de variación foi ALM (30,5%), seguido de CEL (24,5%) e LAD (21,4%) e de PB, FB, FAD e FND, que mostraron valores de 𝐶𝑉 entre 13 e 16%, mentres que a concentración de MO foi moi pouco variábel (1,1%). Os RESULTADOS 211 valores medios da colección de ensilaxes de millo foron comparábeis cos da colección de mostras de planta enteira de millo en estado fresco, se ben o rango de variación da DMO das mostras de ensilaxes foi lixeiramente inferior, mostrando un valor do coeficiente de variación (4,9%), sinaladamente máis baixo que o observado para o resto das coleccións dos distintos tipos de forraxes utilizadas no presente traballo. Correlacións entre composición química e dixestibilidade Na Táboa 65 se mostra a matriz de correlacións entre os parámetros de composición química e a dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de ensilaxes de planta enteira de millo. Foi observada a existencia dunha moderada, aínda que significativa (p<0,001) correlación negativa entre DMO e as diferentes fraccións da parede celular, e unha baixa correlación positiva (p<0,05) entre DMO e os contidos en proteína e amidón. Táboa 65.- Matriz de correlacións entre parámetros de composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de ensilaxes de planta enteira de millo PB FND FAD CEL HCEL LAD FB ALM DMO MO 𝑟 -0,09 0,00 -0,07 0,02 0,11 -0,03 -0,09 0,00 -0,09 𝑝 NS NS NS NS NS NS NS NS NS PB 𝑟 - 0,38 0,34 0,29 0,33 0,21 0,40 -0,58 0,17 𝑝 *** *** *** *** * *** *** * FND 𝑟 - - 0,92 0,64 0,82 0,64 0,71 -0,86 -0,39 𝑝 *** *** *** *** *** *** *** FAD 𝑟 - - - 0,78 0,52 0,77 0,83 -0,80 -0,45 𝑝 *** *** *** *** *** *** CEL 𝑟 - - - - 0,24 0,56 0,74 -0,69 -0,30 𝑝 ** *** *** *** *** HCEL 𝑟 - - - - - 0,27 0,32 -0,68 -0,19 𝑝 ** *** *** * LAD 𝑟 - - - - - - 0,68 -0,50 -0,57 𝑝 *** *** *** FB 𝑟 - - - - - - - -0,77 -0,44 𝑝 *** *** ALM 𝑟 - - - - - - - - 0,20 𝑝 * MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); CEL: celulosa (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); LAD: lignina ácido deterxente; FB: fibra bruta (%MS); ALM: amidón (%MS); DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%); 𝑟: coeficiente de correlación de Pearson; 𝑝: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) Os valores do coeficiente de correlación 𝑟 entre a DMO e os diferentes constituíntes químicos, ordenados polo seu valor absoluto, foron de -0,57 para LAD, de -0,45 para FAD, de -0,44 para FB, de -0,39 para FND, de -0,30 para CEL, de 0,20 para ALM e de RESULTADOS 212 0,17 para PB. A correlación entre DMO e o contido en MO foi practicamente nula (- 0,09) e non acadou significación estatística (p>0,05). Tomando o contido en ALM como un indicador do estado de madurez da planta, se destaca a ausencia de correlación entre este constituínte e o valor de MO (𝑟=0,00; p>0,05) así como as correlacións negativas cos contidos en proteína e as fraccións da fibra, con valores de 𝑟 de -0,58 para PB, de -0,86 para FND, de -0,80 para FAD e de -0,77 para FB todas elas altamente significativas (p<0,001) ilustrando o incremento en carbohidratos non estruturais e un descenso do contido en proteína, en paredes celulares e lignocelulosa entre as proximidades da floración e da madurez fisiolóxica da planta. Ecuacións de predición de DMO baseadas en parámetros químicos Na Táboa 66 se mostran as ecuacións de predición da dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de ensilaxes de planta enteira de millo construídas con preditores químicos, que foron seleccionadas en base ao valor do seu coeficiente de determinación en calibración (𝑅2). A mellor ecuación de predición, baseada en LAD, PB e FB, permitiu explicar en validación cruzada unha porcentaxe do 41% da varianza da DMO, cun erro estándar de predición 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±2,58%. A eliminación de FB do modelo, deixando LAD e PB como preditores na ecuación, reduciu lixeiramente a porcentaxe de varianza explicada (1−𝑉𝑅=0,40) e incrementou tamén lixeiramente o erro de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉= ±2,59). As ecuacións univariábeis baseadas en LAD e en FAD mostraron en validación cruzada, respectivamente, valores de 1−𝑉𝑅 de 0,33 e 0,20 e de 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±2,78 e ±3,04%, mentres que a ecuación univariábel baseada en FND mostrou unha porcentaxe de varianza explicada en calibración inferior ao 20%. A aplicación dos modelos seleccionados ao conxunto de validación externa mostrou un pobre axuste na estimación de DMO, con valores de 𝑟2 inferiores a 0,30 para tódalas ecuacións, erros de predición (𝑆𝐸𝑃) entre ±2,97 e ±3,64%, valores de 𝑅𝑃𝐷ve entre 1,6 e 1,4; de 𝑅𝐸𝑅ve entre 6,7 e 5,0 e coeficientes da pendente entre os valores de referencia e os preditos polas ecuacións entre 0,75 e 0,83. Se ben os valores de 𝑆𝐸𝑃 están por debaixo do valor umbral recomendado de 2 veces o erro estándar do método de referencia (±2,33% para DMO in vivo e ±1,94% para DMO in vitro), o resto dos valores están lonxe dos límites mínimos que permiten o uso das ecuacións en rutina para a predición fiábel da DMO de mostras independentes. RESULTADOS 213 Táboa 66.- Ecuacións de predición da dixestibilidade da materia orgánica en base a parámetros químicos da colección de mostras de ensilaxes de planta enteira de millo Ecuación Calibración Validación cruzada Validación externa R 2 SEC 1-VR SECV r 2 SEP SEPc Bias Pend DMO = 74,06 - 3,34 LAD +1,17 PB -0,25 FB 0,45 2,52 0,41 2,58 0,27 2,97 2,95 -0,331 0,796 s.e. ±1,63 ±0,617 ±0,217 ±0,088 P *** *** *** ** *** *** ** DMO = 72,55 -4,50 LAD +0,96 PB 0,42 2,59 0,40 2,61 0,28 2,94 2,92 -0,363 0,839 s.e. ±1,58 ±0,476 ±0,209 P *** *** *** *** *** ** DMO = 77,91 -4,04 LAD 0,33 2,78 0,32 2,79 0,21 3,07 3,06 -0,022 0,795 s.e. ±1,14 ±0,499 P *** *** *** *** * DMO = 78,33 -0,383 FAD 0,20 3,04 0,18 3,07 0,12 3,64 3,63 0,192 0,756 s.e. ±1,66 ±0,066 P *** *** *** *** NS DMO = 78,69 -0,224 FND 0,15 3,13 0,13 3,15 0,07 3,24 3,23 -0,234 0,809 s.e. ±2,02 ±0,045 P *** *** *** *** NS DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%); MS: materia seca; LAD: lignina ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FB: fibra bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); s.e: erro estándar; P: significación (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS non significativo P>0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; SEPc: erro estándar de predición corrixido por bias; Bias: diferencia media entre os valores observados e os preditos pola ecuación; Pend: pendente da regresión entre valores observados e preditos pola ecuación RESULTADOS 214 4.2.3.2 Ecuacións empíricas para a predición de DFND Sobre un conxunto de 84 mostras de ensilaxes de millo dos que se coñecían os valores da dixestibilidade da parede celular, determinada in vivo, se explorou a relación entre o valor de DFND e a composición química das mostras, avaliando a capacidade preditiva das ecuacións empíricas construídas a tal efecto. Na Táboa 67 se mostran os valores medios e a variabilidade dos parámetros químicos e do valor DFND da colección, así como o coeficiente de correlación entre ditos valores. Os valores medios e rango de variación dos parámetros de composición química son aproximadamente semellantes aos da colección xeral de mostras de ensilaxes de millo, xa que forman parte da mesma. O valor medio da dixestibilidade da fibra neutro deterxente foi de 51,4%, oscilando entre 32,8 a 67,6% e mostrando un coeficiente de variación (𝐶𝑉=15,1%) que foi algo máis do triplo do observado para o valor de DMO (𝐶𝑉= 4,5%) neste grupo de mostras. Foi observada unha moderada correlación positiva (p<0,001) da DFND cos contidos en proteína (𝑟=0,65) e coas diferentes fraccións da fibra (valores de 𝑟 entre 0,47 para FND e 0,31 para LAD) e unha correlación negativa co contido en ALM (𝑟= -0,54; p<0,001) e en MO (𝑟= -0,24; p<0,05). Táboa 67.- Características da colección de mostras de ensilaxes de millo utilizadas para estimar a dixestibilidade in vivo da fibra neutro deterxente mediante ecuacións empíricas baseadas en parámetros químicos Correlación con DFND Parámetro n Media SD CV Max Min r p MO 84 96,1 0,85 0,89 97,1 91,5 -0,24 * PB 84 6,7 1,20 17,9 10,0 3,9 0,65 *** FND 84 44,2 6,11 13,8 64,7 35,7 0,47 *** FAD 84 25,4 4,07 16,1 36,7 19,7 0,42 *** CEL 84 22,8 3,67 16,1 33,7 17,9 0,42 *** HCEL 84 18,9 2,55 13,5 29,2 15,1 0,46 *** LAD 84 2,3 0,50 21,9 3,5 1,5 0,31 *** FB 84 23,0 3,83 16,6 33,1 16,2 0,37 *** ALM 84 26,1 8,54 32,7 37,5 0,0 -0,54 *** DFND 84 51,4 7,75 15,1 67,6 32,8 - - MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); CEL: celulosa (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); LAD: lignina ácido deterxente; FB: fibra bruta (%MS); ALM: amidón (%MS); DFND: dixestibilidade da FND (%); n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; Max: valor máximo; Min: valor mínimo (%); 𝑟: coeficiente de correlación de Pearson; 𝑝: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) RESULTADOS 221 Figura 17a.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo RESULTADOS 222 Figura 17b.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo (Continuación) Figura 18.- Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo RESULTADOS 223 Figura 19.- Plot de valores de dixestibilidade da fibra neutro deterxente medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de planta enteira de millo RESULTADOS 224 4.3 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de fenos de herba 4.3.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO Valores medios da colección Na Táboa 70 se mostran os valores da colección de fenos de herba que foron utilizados para desenvolver as ecuacións de predición da dixestibilidade da materia orgánica en base á composición química das mostras. Os contidos medios (e rango de variación), expresados en %MS, foron MO: 94,1 (87,8 a 99,6), PB: 6,8 (3,9 a 16,7), FND: 70,1 (43,9 a 84,9), FAD: 40,8 (29,8 a 53,8) e HCEL: 29,3 (14,1 a 35,7). O valor medio de DMO foi de 50,8%, oscilando entre un valor mínimo de 28,4% e un máximo de 66,9%. A variabilidade observada para os diferentes parámetros da colección de fenos, ordenada de maior a menor en función do seu coeficiente de variación (𝐶𝑉) foi PB (32,9%), HCEL (15%), FND (10,4%), FAD (9,9%) e MO (2,2%), mentres que o valor correspondente á DMO (𝐶𝑉=14%) se considera alto, comparado co observado para os distintos grupos de forraxes estudados no presente traballo. Táboa 70.- Composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de fenos de herba utilizadas na obtención de ecuacións empíricas para a predición de DMO Parámetro n Media SD CV Max Min MO 52 94,1 2,04 2,16 93,2 87,8 PB 52 6,8 2,23 32,95 16,7 3,8 FND 52 70,1 6,96 9,92 84,9 43,9 FAD 52 40,8 4,27 10,47 53,8 29,8 HCEL 52 29,3 4,43 15,11 35,7 14,1 DMO 52 50,8 7,14 14,04 66,9 28,4 MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); DMO: dixestibilidade da MO (%); n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; Max: valor máximo; Min: valor mínimo Correlacións entre composición química e dixestibilidade A matriz de correlacións entre os parámetros de composición química e a dixestibilidade da materia orgánica para o conxunto de mostras de feno de herba se mostra na Táboa 71. Foi observada a existencia dunha alta correlación negativa (p<0,001) entre o valor de DMO e as diferentes fraccións da fibra, especialmente co contido en FND (𝑟= -0,85) e FAD (𝑟= -0,75), sendo inferior, en valor absoluto, para o RESULTADOS 225 contido en HCEL (𝑟= -0,61). A correlación de DMO co contido en MO foi tamén de signo negativo (𝑟= -0,61), mentres que co contido en PB foi de moderada intensidade e de signo positivo (𝑟=0,69), altamente significativas (p<0,001) en ambos casos. Se detectaron, por outra parte, a existencia de correlacións significativas de signo negativo entre o contido en PB e o das diferentes fraccións da fibra, con valores de 𝑟 de -0,76 para FND, -0,64 para FAD e de -0,57 para HCEL (p<0,001). A pesar de que os fenos proveñen polo xeral de cortes máis ou menos tardíos de herba no seu segundo ou terceiro ciclo de crecemento, as asociacións descritas ilustran a típica evolución dos valores de dixestibilidade e proteína, por unha banda, e os de fibra, por outra, co avance da madurez da herba, con valores de DMO e PB máis altos e valores de fibra máis baixos na herba de menor idade e o contrario na herba máis madura. Táboa 71.- Matriz de correlacións entre parámetros de composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de fenos de herba utilizada para a obtención de ecuacións empíricas para a predición de DMO PB FND FAD HCEL DMO MO 𝑟 -0,50 0,55 0,31 0,56 -0,59 𝑝 *** *** * *** *** PB 𝑟 - -0,76 -0,64 -0,57 0,69 𝑝 *** *** *** *** FND 𝑟 - - 0,79 0,81 -0,85 𝑝 *** *** *** FAD 𝑟 - - - 0,28 -0,75 𝑝 * *** HCEL 𝑟 - - - - -0,61 𝑝 *** MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); DMO: dixestibilidade da MO (%); 𝑟: coeficiente de correlación de Pearson; 𝑝: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) Ecuacións de predición de DMO baseadas en parámetros químicos As ecuacións de regresión seleccionadas, así como os estatísticos de calibración e de validación cruzada se mostran na Táboa 72, estando aquelas ordenadas de maior a menor pola porcentaxe de varianza explicada en calibración. Dado o relativamente pequeno tamaño da colección, non se realizou unha validación externa das ecuacións. Unha ecuación con FND como único preditor explicou o 70% da varianza en validación cruzada, cun erro de predición 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±3,91%, non véndose mellorada a súa predición pola inclusión de ningún outro parámetro químico. A varianza explicada pola ecuación de dúas variábeis, con FAD e PB como preditores foi considerabelmente máis RESULTADOS 226 baixa (1−𝑉𝑅=0,57) e o erro de predición 𝑆𝐸𝐶𝑉 máis elevado (±4,70%) comparado co modelo anterior. A ecuación con FAD como único preditor empeorou ulteriormente os resultados da predición, cun valor de 1−𝑉𝑅 de 0,53 e de 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±4,86%. Os valores dos estatísticos 𝑅𝑃𝐷vc e de 𝑅𝐸𝑅vc para as tres ecuacións foron, respectivamente, de 1,82 e 9,84 para a primeira, de 1,51 e 8,19 para a segunda e de 1,46 e 7,92 para a terceira. Seguindo a Shenk et al. (2001) valores do coeficiente de determinación en validación cruzada (1−𝑉𝑅) entre 0,70 e 0,89 mostran un razoábel axuste para o modelo de predición, mentres que valores entre 0,50 e 0,69 permitirían só unha predición cualitativa básica. Por outra parte, Williams (2001) indican que valores de 𝑅𝑃𝐷 entre 1,5 e 2,0 permiten unha predición cualitativa básica. Atendendo a estes criterios, as dúas primeiras ecuacións terían utilidade para realizar unha predición aproximada cualitativa da dixestibilidade, estando a ecuación baseada en FAD no límite da utilidade práctica para a estimación da DMO en coleccións de fenos de pradeira cunha composición semellante á da colección utilizada para obter os modelos de predición. Táboa 72.- Ecuacións de predición da dixestibilidade da materia orgánica de fenos de herba en base a parámetros químicos Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC 1-VR SECV DMO = 111,83 - 0,86 FND 0,71 3,82 0,70 3,91 s.e. ±5,41 ±0,076 P *** *** *** *** DMO = 79,30 -0,88 FAD +1,11 PB 0,63 4,38 0,57 4,70 s.e. ±9,39 ±0,18 ±0,35 P *** *** ** *** *** DMO = 102,09 -1,25 FAD 0,56 4,75 0,53 4,86 s.e. ±6,38 ±0,15 P *** *** *** *** DMO: dixestibilidade da materia seca (%); MS: materia seca; FND: fibra ácido deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación do coeficiente da ecuación de regresión (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada 4.3.2 Ecuacións NIRS para a predición da composición química e DMO As características descritivas dos parámetros de composición química e DMO do colectivo de mostras utilizadas para o desenvolvemento de modelos de predición NIRS se indican na Táboa 73. Os valores medios (e rango de variación) da composición química das mostras do colectivo de calibración (en %MS) foron MO: 93,2 (87,5 a RESULTADOS 227 93,2), PB: 8,0 (3,8 a 17,4), FND: 65,7 (36,6 a 84,9) e FAD 38,4 (17,7 a 53,8). O valor medio de DMO foi de 50,8%, cun rango de variación de 28,4 a 66,9%. O colectivo presenta unha elevada variabilidade para todos os parámetros estudados, indicando a diversidade de mostras incluídas neste produto. Os modelos de predición NIRS obtidos a partir da segunda derivada permitiron obter estimacións máis precisas e exactas para a estimación dos parámetros de contido en PB, FND e a DMO, mentres que para MO e FAD obtivéronse coa primeira derivada. As ecuacións NIRS para a estimación de MO, FND e DMO se construíron utilizando o método SNV+D como pretratamento espectral, mentres que para a predición do contido en PB e FAD o procedemento W-MSC permitiu optimizar o modelo de predición. O número de mostras eliminadas como anómalas oscilou entre 1,2% e 6,1% do total de mostras iniciais da colección na construción das ecuacións de predición de parámetros químicos e foi do 3,8% para o caso da predición de DMO. Os coeficientes de determinación no proceso de validación cruzada (1−𝑉𝑅) foron superiores a 0,90 para todos os parámetros, a excepción do contido en MO (1−𝑉𝑅= 0,87), indicando unha excelente ou boa calidade na predición de tódalas variábeis (Shenk et al., 2001) cando as ecuacións se aplican a coleccións de mostras de similares características que as da colección de calibración utilizada neste traballo. As ecuacións cos maiores valores de 1−𝑉𝑅 foron as obtidas para a predición de PB e FND (0,97 en ambos casos), seguidas de FAD (0,92) e DMO (0,91). Os valores dos erros de predición 𝑆𝐸𝐶𝑉 foron ±0,78% para MO, ±0,58% para PB, ±1,79% para FND, ±1,77% para FAD e ±1,93% para DMO. A relación entre 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑆𝐸𝐶 oscilou entre 1,18 e 1,30, situándose dentro do intervalo sinalado por Burns e Ciurczak (1992) como indicativo de calibracións NIRS robustas. Os valores dos estatísticos 𝑅𝑃𝐷vc e 𝑅𝐸𝑅vc foron, respectivamente, de 3,2 e 7,4 para MO, de 5,9 e 23,3 para PB, de 5,5 e 26,9 para FND, de 3,4 e 20,4 para FAD e de 3,7 e 19,9 para DMO. Os valores de 𝑅𝑃𝐷vc de tódalas ecuacións foron superiores ao valor de 3,0 o que indica unha boa capacidade preditiva cuantitativa, seguindo os criterios de Williams (2014) e de Williams e Sobering (1996). RESULTADOS 228 Táboa 73.- Estatísticos de calibración e validación cruzada das ecuacións NIRS para a estimación da composición química e da dixestibilidade da materia orgánica de mostras de fenos de pradeira Parámetro Scatter Tratamento matemático Calibración Validación cruzada n Outliers T Media SD Min Max Rango R2 SEC 1-VR SECV RPDvc RERvc MO SNV+D 1,10,10,1 81 5 8 93,2 2,5 87,5 93,2 5,7 0,93 0,60 0,87 0,78 3,2 7,4 PB W-MSC 2,10,10,1 81 2 5 8,0 3,4 3,8 17,4 13,5 0,97 0,50 0,97 0,58 5,9 23,3 FND SNV+D 2,10,5,1 81 3 5 65,7 9,9 36,6 84,9 48,3 0,97 1,53 0,97 1,79 5,5 26,9 FAD W-MSC 1,10,10,1 81 1 7 38,4 6,0 17,7 53,8 36,0 0,95 1,38 0,92 1,77 3,4 20,4 DMO SNV+D 2,10,5,1 52 2 5 50,8 7,1 28,4 66,9 38,5 0,94 1,53 0,91 1,93 3,7 19,9 W-MSC: multiplicative scatter correction; SNV+D: standard normal variate+detrend; n: número de observacións; Outliers: número de mostras anómalas eliminadas; T: número de factores da regresión; SD: desviación estándar; Min: valor mínimo; Max: valor máximo; SEC: erro estándar de calibración; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; RPDvc: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación cruzada; RERvc: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación cruzada; MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); DMO: dixestibilidade da materia orgánica (%) RESULTADOS 229 4.4 Modelos preditivos para determinar o valor nutricional de mesturas unifeed 4.4.1 Ecuacións empíricas para a predición de DMO Valores medios da colección Na Táboa 74 se mostran os valores medios e a variabilidade dos parámetros de composición química e da dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de mesturas unifeed que foron utilizadas para a obtención das ecuacións de predición de DMO baseadas en constituíntes químicos como preditores. Os contidos medios (e rango de variación), expresados en %MS, foron MO: 93,1 (88,2 a 96,5), PB: 14,6 (8,2 a 18,9), FND: 41,2 (31,3 a 58,6), FAD: 23,1 (16,7 a 33,6), FB: 19,7 (14,2 a 30,1), HCEL: 18,1 (13,6 a 25,0), EE: 3,3 (1,9 a 5,5) e ALM: 21,8 (5,1 a 34,6). O valor medio de DMO foi de 70,0%, oscilando no rango entre 58,0 e 77,5%. Táboa 74.- Composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de mesturas unifeed utilizadas na obtención de ecuacións empíricas para a predición de DMO Parámetro n Media SD CV Max Min MO 71 93,1 1,86 2,0 96,5 88,2 PB 71 14,6 3,04 20,8 18,9 8,2 FND 71 41,2 4,87 11,8 58,6 31,3 FAD 71 23,1 3,49 15,1 33,6 16,7 FB 71 19,7 3,23 16,4 30,1 14,2 HCEL 71 18,1 1,99 11,0 25,0 13,6 ALM 71 21,8 7,07 32,4 34,6 5,1 EE 71 3,3 0,81 24,7 5,5 1,9 DMO 71 70,0 4,01 5,7 77,5 58,0 MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); EE: extracto etéreo (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FB: fibra bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); ALM: amidón (%MS); DMO: dixestibilidade da MO (%); n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; Max: valor máximo; Min: valor mínimo A colección representa unha ampla variabilidade de racións completas, desde mesturas para vacas en lactación con alto contido en concentrados até mesturas forraxeiras para vacas secas. Os parámetros que mostraron máis variabilidade foron o amidón (𝐶𝑉=32,4%), seguido do extracto etéreo (𝐶𝑉=24,7%) e a proteína bruta (𝐶𝑉=20,8%), mentres que o parámetro que presentou a menor variabilidade foi o contido en MO (𝐶𝑉=2,0%), mostrando os distintos parámetros da fibra unha variabilidade intermedia, RESULTADOS 230 con valores de CV de 16,4% para FB, de 15,1% para FND e de 11,8 e 11,0% para FAD e HCEL, respectivamente, mentres que DMO mostrou un baixo valor do coeficiente de variación (5,7%). Correlacións entre composición química e dixestibilidade Como se observa na Táboa 75, onde se indican os coeficientes de correlación dos parámetros de composición química e a DMO, se observa unha correlación altamente significativa (p<0,001) de signo negativo para os compoñentes da fracción fibra e de signo positivo para o contido en proteína, reflectindo parcialmente as asociacións para estes parámetros nas forraxes que compoñen as mesturas e a proporción de concentrados nas mesmas, con baixo contido en fibra e altos en proteína e dixestibilidade. O valor do coeficiente de correlación 𝑟 entre DMO e os distintos parámetros foi de -0,84 para FND, -0,79 para FAD, -0,74 para FB, -0,66 para HCEL e 0,59 para PB. Se salienta tamén a elevada correlación entre FND con FB e con FAD (𝑟=0,94 en ambos casos) e entre FAD e FB (𝑟=0,98). Táboa 75.- Matriz de correlacións entre parámetros de composición química e dixestibilidade da materia orgánica da colección de mostras de mesturas unifeed utilizadas para a obtención de ecuacións empíricas de predición de DMO EE PB FB FND FAD HCEL ALM DMO MO 𝑟 -0,06 -0,62 0,01 0,13 -0,01 0,32 0,64 -0,23 𝑝 NS *** NS NS NS ** *** NS EE 𝑟 - 0,28 -0,55 -0,36 -0,47 -0,05 0,37 0,08 𝑝 * *** ** *** NS ** NS PB 𝑟 - - -0,49 -0,54 -0,47 -0,49 -0,31 0,59 𝑝 *** *** *** *** ** *** FB 𝑟 - - - 0,94 0,98 0,58 -0,53 -0,74 𝑝 *** *** *** *** *** FND 𝑟 - - - - 0,94 0,80 -0,41 -0,84 𝑝 *** *** *** *** FAD 𝑟 - - - - - 0,55 -0,52 -0,79 𝑝 *** *** *** HCEL 𝑟 - - - - - - -0,10 -0,66 𝑝 NS *** ALM 𝑟 - - - - - - - 0,10 𝑝 NS MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); EE: extracto etéreo (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FB: fibra bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); HCEL: hemicelulosa (%MS); ALM: amidón (%MS); DMO: dixestibilidade da MO (%); 𝑟: coeficiente de correlación de Pearson; 𝑝: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) RESULTADOS 237 Figura 20a.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed RESULTADOS 238 Figura 20b.- Plot de valores de composición química medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed (Continuación) Figura 21.- Plot de valores de dixestibilidade da materia orgánica medidos polo método de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de mesturas unifeed RESULTADOS 239 4.5 Modelos preditivos para estimación dos parámetros de degradabilidade ruminal in situ de ensilaxes de herba e de millo 4.5.1 Predición da degradabilidade ruminal de ensilaxes de herba 4.5.1.1 Ecuacións empíricas Valores medios da colección As características da composición química e dos parámetros que describen a cinética da degradabilidade ruminal da MS, da FND e da PB da colección de ensilaxes de herba que foron avaliados in situ se mostran na Táboa 78, mostrando unha ampla variabilidade das mostras da colección. Os contidos medios (e rango de variación) dos constituíntes químicos, expresados sobre %MS, foron: MO: 84,1 (75,4 a 93,8), PB: 11,9 (5,6 a 22,6); FND: 51,8 (36,0 a 71,7) e FAD: 35,0 (22,7 a 48,5). O parámetro químico que presentou unha maior variabilidade foi o contido en PB (𝐶𝑉=31,9%), seguido de FAD (𝐶𝑉=16,5%), FND (𝐶𝑉=15,8%) e MO (𝐶𝑉=5,6%). Os valores medios (e rangos de variación) dos parámetros 𝒂: fracción inmediatamente degradábel (%), 𝒃: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄: velocidade de degradación da fracción 𝑏 (h-1), 𝑫𝑷: degradabilidade potencial (%), 𝑫𝑻: degradabilidade teórica (%) a unha taxa de paso do rume k=0,06 h-1 para as compoñentes MS, FND e PB foron como se indica a continuación. Materia seca.- Os valores correspondentes á degradabilidade ruminal da materia seca foron 𝒂MS: 29,7 (8,7 a 47,2), 𝒃MS: 51,5 (25,3 a 64,6), 𝒄MS: 0,058 (0,031 a 0,087), 𝑫𝑷MS: 81,2 (63,3 a 94,3) e 𝑫𝑻MS: 54,5 (36,3 a 71,1), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 28,4%, 17,1%, 22,6%, 9,0% e 14,8%. Parede celular.- Os valores correspondentes á degradabilidade ruminal da parede celular foron 𝒃FND e 𝑫𝑷FND: 74,0 (32,6 a 91,6), 𝒄FND: 0,045 (0,027 a 0,062) e 𝑫𝑻FND: 32,0 (15,1 a 43,9), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 19,2%, 16,6% e 20,3%. Proteína bruta.- Os valores correspondentes á degradabilidade ruminal da proteína bruta foron 𝒂PB: 46,0 (6,6 a 75,5), 𝒃PB: 36,8 (5,53 a 65,0), 𝒄PB: 0,075 (0,022 a 0,195), 𝑫𝑷PB: 82,0 (62,5 a 96,0) e 𝑫𝑻PB: 65,5 (33,7 a 86,3), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 37,4%, 36,1%, 34,2%, 9,2% e 18,5%. RESULTADOS 240 Táboa 78.- Variabilidade dos parámetros de composición química e da cinética de degradabilidade ruminal das mostras de ensilaxes de herba determinados polos métodos de referencia Parámetro n Media SD CV Mínimo Máximo Rango Composición química MO 69 84,1 4,7 5,6 75,4 93,8 18,4 PB 69 11,9 3,8 31,9 5,6 22,6 17,0 FND 69 51,8 8,2 15,8 36,0 71,7 35,7 FAD 69 35,0 5,8 16,5 22,7 48,5 25,8 Degradabilidade in situ Materia seca 𝒂 MS 69 29,7 8,4 28,4 8,7 47,2 38,5 𝒃 MS 69 51,5 8,8 17,1 25,3 64,6 39,3 𝒄 MS 69 0,058 0,013 22,6 0,031 0,087 0,056 DP MS 69 81,2 7,3 9,0 63,3 94,3 31,0 DT MS (k=0, 06) 69 54,5 8,1 14,8 36,3 71,1 34,8 Fibra neutro deterxente b FND ( DP FND ) 69 74,0 12,3 16,6 32,6 91,6 59,0 c FND 69 0,045 0,009 19,3 0,027 0,062 0,035 DT FND (k=0, 06) 69 32,0 6,5 20,3 15,1 43,9 28,8 Proteína bruta 𝒂 PB 69 46,0 17,2 37,4 6,6 75,5 68,9 𝒃 PB 69 36,8 13,3 36,1 5,5 65,0 59,5 𝒄 PB 69 0,075 0,026 34,2 0,022 0,195 0,173 𝑫𝑷 PB 69 82,8 7,6 9,2 62,5 96,0 33,5 𝑫𝑻 PB (k=0, 06) 69 65,5 12,1 18,5 33,7 86,3 52,7 n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); PB: proteína bruta (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); 𝒂: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄: velocidade de degradación ruminal da fracción b (h-1); 𝑫𝑷: degradabilidade potencial (%); 𝑫𝑻: degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1) Correlacións entre composición química e parámetros de degradabilidade ruminal in situ Na Táboa 79 se indican os coeficientes de correlación entre a composición química e os parámetros de degradabilidade ruminal in situ das ensilaxes de herba. En xeral, a correlación da fracción inmediatamente degradábel mostrou unha moderada correlación de signo positiva co contido en PB e de signo negativo coa fibra e o contido en MO, que se reproduce de forma aproximada para a fracción insolúbel pero potencialmente degradábel e a velocidade de degradación de MS, FND e PB e para os valores de degradabilidade potencial e degradabilidade efectiva dos citados parámetros. Materia seca.- O valor do coeficiente de correlación da fracción 𝒂MS cos contidos en FND, FAD e PB foi de 𝑟= -0,78, -0,50 e -0,51, respectivamente (p<0,001). Para a fracción 𝒃MS a correlación foi máis moderada, con valores de 𝑟= 0,36 (p<0,01) para RESULTADOS 241 FND e de 𝑟= -0,29 (p<0,05) para PB. As correlacións máis elevadas da velocidade de degradación 𝒄MS se observaron con PB e FND (𝑟= 0,71 e -0,69 respectivamente, p<0,001), mentres que para a degradabilidade potencial 𝑫𝑷MS o foron cos contidos de FAD e FND (𝑟= -0,86 e -0,46 respectivamente, p<0,001) e para o valor da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻MS os valores do coeficiente de correlación cos parámetros FND, FAD e PB foi de 𝑟= -0,87, -0,78 e 0,61, respectivamente (p<0,001). Parede celular.- As correlacións entre os parámetros de degradabilidade da FND e os constituíntes químicos foron, en xeral, dunha intensidade máis moderada que a observada para a degradabilidade da MS. A correlación máis elevada para a fracción 𝒃FND foi observada co contido en FAD (𝑟= -0,65; p<0,001), mentres que para a velocidade de degradación da parede celular 𝒄FND se observou unha correlación positiva co contido en PB (𝑟= 0,60) e negativa cos de FND e FAD (𝑟= -0,56 e -0,44) todas elas altamente significativas (p<0,001). Para o valor da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻FND os constituíntes químicos cun maior valor absoluto do coeficiente de correlación foron FAD e MO con valores de 𝑟= -0,69 e -0,41, respectivamente (p<0,001). Proteína bruta.- As correlacións das fraccións 𝒂PB, 𝒃PB e 𝒄PB coa concentración dos constituíntes químicos foron de moderada ou baixa intensidade. Para 𝒂PB, a maior correlación se observou con PB e con FND (𝑟= 0,43 e -0,43 respectivamente, p<0,001), mentres que para 𝒃PB o foi con MO (𝑟= -0,48; p<0,001) e para 𝒄PB se observou unha baixa correlación con PB e FND (𝑟= 0,25 e -0,24 respectivamente, p<0,001). A intensidade das correlacións foron comparativamente máis elevadas entre os contidos en PB, FND e FAD das mostras e, respectivamente, os valores da degradabilidade potencial 𝑫𝑷PB (𝑟= 0,67, -0,69 e -0,67 p<0,001) e da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻PB (𝑟= 0,59, p<0,001; -0,60, p<0,001 e -0,36, p<0,01). RESULTADOS 242 Táboa 79.- Correlación entre parámetros de degradabilidade ruminal in situ e composición química de ensilaxes de herba Parámetro n MO PB FND FAD Materia seca 𝒂 MS 𝑟 69 0,00 0,51 -0,78 -0,50 𝑝 NS *** *** *** 𝒃 MS 𝑟 69 -0,29 -0,29 0,36 -0,23 𝑝 * * ** NS 𝒄 MS 𝑟 69 -0,30 0,71 -0,69 -0,31 𝑝 * *** *** ** 𝑫𝑷 MS 𝑟 69 -0,35 0,24 -0,46 -0,86 𝑝 ** * *** *** 𝑫𝑻 MS ( k=0, 06) 𝑟 69 -0,28 0,61 -0,87 -0,78 𝑝 * *** *** *** Fibra neutro deterxente 𝒃 FND ( 𝑫𝑷 FND ) 𝑟 69 -0,36 -0,13 -0,03 -0,65 𝑝 ** NS NS *** 𝒄 FND 𝑟 69 -0,35 0,60 -0,56 -0,44 𝑝 ** *** *** *** 𝑫𝑻 FND (k=0, 06) 𝑟 69 -0,41 0,20 -0,28 -0,69 𝑝 *** NS * *** Proteína bruta 𝒂 PB 𝑟 69 0,26 0,43 -0,43 -0,18 𝑝 * *** *** NS 𝒃 PB 𝑟 69 -0,48 -0,17 0,17 -0,15 𝑝 *** NS NS NS 𝒄 PB 𝑟 69 0,12 0,25 -0,24 0,12 𝑝 NS * * NS 𝑫𝑷 PB 𝑟 69 -0,25 0,67 -0,69 -0,67 𝑝 * *** *** *** 𝑫𝑻 PB (k=0 , 06) 𝑟 69 0,07 0,59 -0,60 -0,36 𝑝 NS *** *** ** MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta; 𝒂: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄: velocidade de degradación ruminal da fracción b (h-1); 𝑫𝑷: degradabilidade potencial (%); 𝑫𝑻: degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑟: coeficiente de correlación de Pearson; 𝑝: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) Ecuacións de predición baseadas en parámetros químicos Nas Táboas 80 a 81 se mostran as ecuacións de regresión obtidas para a predición dos parámetros que describen a degradabilidade ruminal da materia seca, da parede celular e da proteína bruta da colección de mostras de ensilaxes de herba, así como os estatísticos de calibración e validación cruzada das ecuacións. Se incluíron unicamente os modelos construídos para cada parámetro que mostraron os maiores coeficientes de determinación en calibración. RESULTADOS 243 Materia seca.- Como se pode observar na Táboa 80, as ecuación seleccionadas para a predición dos diferentes parámetros de degradabilidade da MS eran modelos lineares simples que incluían as concentracións de FAD e MO para a estimación de 𝒂MS, de FAD e FND para a estimación de 𝒃MS, de PB e FND para a estimación de 𝒄MS, de FAD para a estimación de 𝑫𝑷MS e de PB e FAD para a estimación de 𝑫𝑻MS. Os valores do coeficiente de determinación (1−𝑉𝑅) e do erro de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉) en validación cruzada das ecuacións foron, respectivamente, para 𝒂MS 0,68 e ±4,78%, para 𝒃MS 0,36 e ±7,03%, para 𝒄MS 0,52 e ±0,0089 h-1, mentres que para 𝑫𝑷MS foron 0,71 e ±4,29% e para 𝑫𝑻MS 0,71 e ±3,88%. Os valores do estatístico 𝑅𝑃𝐷vc para as ecuacións de estimación dos parámetros 𝒂MS (1,7), 𝒃MS (1,2) e 𝒄MS (1,4) foron inferiores aos obtidos para as ecuacións de estimación de 𝑫𝑷MS e para 𝑫𝑻MS (1,9 en ambos casos), mostrando unha maior precisión na estimación destes dous últimos valores en comparación coa dos restantes parámetros. Parede celular.- Os parámetros da ecuacións seleccionadas para a estimación dos valores de 𝒃FND foron a concentración de FAD e de FND, para a estimación de 𝒄FND se utilizaron as de PB e FAD e para a de 𝑫𝑻FND se utilizou unicamente o valor de FAD (Táboa 81). Os valores dos estatísticos 1−𝑉𝑅, 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑅𝑃𝐷vc para as diferentes ecuacións en validación cruzada foron, respectivamente, para 𝒃FND de 0,58, ±7,92% e 1,50, para 𝒄 FND de 0,37, ±0,0069 h-1 e 1,30, e para 𝑫𝑻FND de 0,45, ±4,78% e 1,35, mostrando unha maior fiabilidade da ecuación para a estimación da fracción da parede celular lentamente degradábel, comparada coa das outras ecuacións. Proteína bruta.- As ecuación seleccionadas para a predición dos diferentes parámetros de degradabilidade de PB das mostras de ensilaxes incluían como preditores a concentración de FAD para a estimación de 𝒂PB, de FND e de MO para a estimación de 𝒃PB, de PB para a estimación de 𝒄N, de PB e FAD para a estimación de 𝑫𝑷PB e de PB e FND para a estimación de 𝑫𝑻PB (Táboa 82). En validación cruzada, a ecuación para estimación de 𝒄N non acadou significación, cunha porcentaxe de varianza explicada de tan só o 4%. Para as restantes ecuacións, os valores de 1−𝑉𝑅, 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑅𝑃𝐷vc foron, respectivamente, para 𝒂PB 0,12, ±15,9% e 1,0; para 𝒃PB 0,30, ±11,1% e 1,2; para 𝑫𝑷PB 0,64, ±4,53% e 1,6 e para 𝑫𝑻PB 0,34, ±9,82% e 1,2. Os resultados mostran unha maior precisión na estimación da degradabilidade potencial da proteína bruta, en comparación co resto dos parámetros. RESULTADOS 244 Shenk et al. (2001) indican que valores do coeficiente de determinación en validación cruzada (1−𝑉𝑅) entre 0,70 e 0,89 mostran un razoábel axuste para o modelo de predición, mentres que valores de 1−𝑉𝑅 entre 0,50 e 0,69 só permitirían realizar unha predición cualitativa básica. Por outra parte, Williams (2001) indican que valores de 𝑅𝑃𝐷 entre 1,5 e 2,0 permiten unha predición cualitativa básica, non sendo útiles para realizar predicións aquelas ecuacións con valores de 𝑅𝑃𝐷 inferiores a 1,5. Atendendo a estes criterios, as ecuacións empíricas para a predición de 𝒂MS, 𝑫𝑷MS e 𝑫𝑻MS, de 𝒃FND e de 𝑫𝑷PB terían unha moderada utilidade preditiva, non sendo de utilidade práctica o resto de ecuacións baseadas en constituíntes químicos para a estimación dos parámetros de degradabilidade ruminal de ensilaxes de herba. RESULTADOS 245 Táboa 80.- Ecuacións de predición dos parámetros de degradabilidade ruminal da materia seca de ensilaxes de herba en base a parámetros químicos Parámetro Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC CV 1-VR SECV CV 𝒂 MS 26,7 -0,932 FAD +0,610 MO 0,70 4,66 15,6 0,68 4,78 16,0 s.e ±10,09 ±0,074 ±0,129 P * *** *** *** *** 𝒃 MS 45,1 -1,059 FAD +0,838 FND 0,44 6,68 12,9 0,36 7,03 13,6 s.e ±5,67 ±0,174 ±0,123 P *** *** *** *** *** 𝒄 MS 0,069 +0,0015 PB -0,00057 FND 0,56 0,0087 15,1 0,52 0,0089 15,6 s.e ±0,014 ±0,00042 ±0,00019 P *** *** ** *** *** 𝑫𝑷 MS 119,1 -1,083 FAD 0,73 3,76 4,63 0,71 3,88 4,77 s.e ±2,80 ±0,078 P *** *** *** *** 𝑫𝑻 MS (k=0, 06) 76,4 -0,904 FAD +0,810 PB 0,74 4,16 7,64 0,71 4,29 6,14 s.e ±4,19 ±0,093 ±0,141 P *** *** ** *** *** MS: materia seca; FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); MO: materia orgánica (%MS); 𝑫𝑻MS degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷MS: degradabilidade potencial (%); 𝒂MS: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃MS: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄MS: velocidade de degradación ruminal da fracción 𝒃MS (h-1); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación (*** P<0,001, ** P<0,01, * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; CV: coeficiente de variación RESULTADOS 246 Táboa 81.- Ecuacións de predición dos parámetros de degradabilidade ruminal da fibra neutro deterxente de ensilaxes de herba en base a parámetros químicos Parámetro Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC CV 1-VR SECV CV 𝒃 FND ( 𝑫𝑷 FND ) 103,9 -2,11 FAD +0,847 FND 0,63 7,58 10,2 0,58 7,92 10,7 s.e ±6,44 ±0,19 ±0,140 P *** *** ** *** *** 𝒄 FND 0,045 +0,0011 PB -0,0004 FAD 0,41 0,0067 14,9 0,37 0,0069 15,3 s.e ±0,0068 ±0,0002 ±0,00015 P *** *** *** *** *** 𝑫𝑻 FND (k=0, 06) 59,3 -0,781 FAD 0,48 4,70 14,7 0,45 4,78 14,9 s.e ±3,50 ±0,098 P *** *** *** *** MS: materia seca; FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); 𝑫𝑻FND degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷FND: degradabilidade potencial (%); 𝒂FND: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃FND: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄FND: velocidade de degradación ruminal da fracción bFND (h-1); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; CV: coeficiente de variación RESULTADOS 253 4.5.2 Predición da degradabilidade ruminal de ensilaxes de millo 4.5.2.1 Ecuacións empíricas Valores medios da colección Na Táboa 84 se expoñen as características da composición química e dos parámetros que describen a cinética da degradabilidade ruminal da materia seca, fibra neutro deterxente, proteína bruta e amidón da colección de ensilaxes de millo avaliadas in situ. Os contidos medios (e rango de variación), expresados sobre %MS foron, respectivamente, MO: 96,3 (91,4 a 97,4), FND: 45,8 (37,6 a 71,4), FAD: 26,1 (19,6 a 44,7), PB: 6,12 (4,32 a 9,43), CNET: 33,1 (5,14 a 45,6) e ALM: 30,2 (2,87 a 42,8). O valor medio (e rango de variación) do nitróxeno ligado á fibra ácido deterxente (NFAD), expresado en porcentaxe sobre FAD foi de 0,25 (rango 0,20 a 0,30). Os constituíntes químicos que presentaron a maior variabilidade foron o contido en ALM (𝐶𝑉=25,7%) e de CNET (𝐶𝑉=22,8%), seguidos de FAD (𝐶𝑉=16,1%), PB (𝐶𝑉=15,2%), NFAD (𝐶𝑉=12,5%) e FND (𝐶𝑉=12,2%), mentres que a menor variabilidade correspondeu a MO (𝐶𝑉=0,94%). Os valores medios (e rangos de variación) dos parámetros que describen a degradabilidade ruminal dos constituíntes MS, FND, PB e ALM mostraron unha ampla variabilidade, que se indica a continuación. Materia seca.- Os valores dos parámetros que describen a degradabilidade ruminal da MS foron 𝒂MS: 44,6 (15,0 a 55,5), 𝒃MS: 42,1 (32,9 a 64,1), 𝒄MS: 0,039 (0,016 a 0,060), 𝑫𝑷MS: 86,7 (79,1 a 100,0) e 𝑫𝑻MS: 60,5 (40,8 a 70,2), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 14,5%, 13,9%, 21,0%, 5,0% e 7,9%. Parede celular.- Os valores de degradabilidade ruminal da FND foron 𝒃FND e 𝑫𝑷FND: 80,2 (71,7 a 99,3), 𝒄FND: 0,029 (0,012 a 0,043) e 𝑫𝑻FND: 28,2 (16,2 a 36,3), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 7,6%, 23,4%, e 18,5%. Proteína bruta.- Os valores correspondentes á degradabilidade ruminal da PB foron 𝒂PB: 70,5 (56,1 a 81,2), 𝒃PB: 19,4 (8,0 a 36,4), 𝒄PB: 0,034 (0,009 a 0,107), 𝑫𝑷PB: 90,0 (83,7 a 100,0) e 𝑫𝑻PB: 76,6 (67,1 a 84,3), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 8,0%, 29,0%, 50,3%, 4,5% e 5,5%. RESULTADOS 254 Amidón.- Os valores correspondentes á degradabilidade ruminal do ALM foron 𝒂ALM: 74,1 (0,0 a 91,6), 𝒃ALM: 23,9 (6,9 a 100,0), 𝒄ALM: 0,112 (0,009 a 0,217), 𝑫𝑷ALM: 98,0 (84,6 a 100,0) e 𝑫𝑻ALM: 90,8 (73,9 a 96,3), con valores do coeficiente de variación de, respectivamente, 25,3%, 72,6%, 34,4%, 2,4% e 5,1%. Táboa 84.- Variabilidade dos parámetros de composición química e da cinética de degradabilidade ruminal das mostras de ensilaxes de planta enteira de millo determinados polos métodos de referencia Parámetro n Media SD CV Mínimo Máximo Rango Composición química MO 62 96,3 0,91 0,94 91,4 97,4 5,99 PB 62 6,12 0,93 15,2 4,32 9,43 5,11 FND 62 45,8 5,62 12,2 37,6 71,4 33,7 FAD 62 26,1 4,22 16,1 19,6 44,7 25,0 N FAD 46 0,25 0,03 12,5 0,20 0,30 0,10 CNET 62 33,1 7,58 22,8 5,14 45,6 40,5 ALM 62 30,2 7,78 25,7 2,87 42,8 39,9 Degradabilidade in situ Materia seca 𝒂 MS 62 44,6 6,5 14,5 15,0 55,5 40,5 𝒃 MS 62 42,1 5,9 13,9 32,9 64,1 31,2 𝒄 MS 62 0,039 0,008 21,0 0,016 0,060 0,044 𝑫𝑷 MS 62 86,7 4,3 5,0 79,1 100,0 20,9 𝑫𝑻 MS (k=0, 06) 62 60,5 4,8 7,9 40,8 70,2 29,4 Fibra neutro deterxente a FND - - - - - - - b FND ( 𝑫𝑷 FND ) 62 80,2 6,1 7,6 71,7 99,3 27,6 c FND 62 0,029 0,007 23,4 0,012 0,043 0,032 𝑫𝑻 FND (k=0, 06) 62 28,2 5,2 18,5 16,2 36,3 20,2 Proteína bruta 𝒂 PB 62 70,5 5,6 8,0 56,1 81,2 25,1 𝒃 PB 62 19,4 5,6 29,0 8,0 36,4 28,3 𝒄 PB 62 0,034 0,017 50,3 0,009 0,107 0,098 𝑫𝑷 PB 62 90,0 4,1 4,5 83,7 100,0 16,3 𝑫𝑻 PB (k=0.06) 62 76,6 4,2 5,5 67,1 84,3 17,3 Amidón 𝒂 ALM 62 74,1 18,8 25,3 0,0 91,6 91,6 𝒃 ALM 62 23,9 17,4 72,6 6,9 100,0 93,1 𝒄 ALM 62 0,112 0,039 34,4 0,009 0,217 0,208 𝑫𝑷 ALM 62 98,0 2,4 2,4 84,6 100,0 15,5 𝑫𝑻 ALM (k=0, 06) 62 90,8 4,6 5,1 73,9 96,3 22,4 n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); N: nitróxeno; N-FAD: N ligado á FAD (% FAD); CNET: carbohidratos non estruturais (%MS); ALM: amidón; n: número de mostras; SD: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; 𝒂: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄: velocidade de degradación ruminal da fracción 𝒃 (h-1); 𝑫𝑷: degradabilidade potencial (%); 𝑫𝑻: degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1) RESULTADOS 255 Correlacións entre composición química e e parámetros de degradabilidade ruminal in situ Na Táboa 85 se indican os coeficientes de correlación entre a composición química e os parámetros de degradabilidade ruminal in situ das ensilaxes de planta enteira de millo. En xeral, as correlacións foron máis altas para os parámetros de degradabilidade da materia seca, sendo comparativamente inferiores para a degradabilidade da parede celular, da proteína bruta e do amidón. Dentro dos parámetros que describen a cinética de degradabilidade ruminal, as correlacións tenderon a ser máis altas para a fracción inmediatamente degradábel 𝒂 e a degradabilidade efectiva 𝑫𝑻 en comparación coa observada para as fraccións lentamente degradábel 𝒃 e sobre todo a velocidade de degradación 𝒄 de cada constituínte. Materia seca.- O valor do coeficiente de correlación da fracción 𝒂MS mostrou unha elevada correlación negativa cos contidos en FND e FAD e positiva cos de CNET e ALM, con valores de 𝑟= -0,90, -0,82, 0,81 e 0,78, respectivamente (p<0,001). Para a fracción 𝒃MS a correlación foi máis moderada e de sentido contrario, con valores de 𝑟=0,70 e 0,69 para FND e FAD e de 𝑟= -0,61 e -0,61 para CNET e ALM, sendo en todos casos altamente significativa (p<0,001). A velocidade de degradación 𝒄MS unicamente mostrou unha baixa correlación co contido en FAD (𝑟= -0,28; p<0,05), mentres que para a degradabilidade potencial 𝑫𝑷MS se observou tamén unha baixa correlación de signo negativo cos contidos de FAD e FND e de signo positivo cos de CNET e ALM, con valores respectivos do coeficiente de correlación 𝑟 de -0,40 (p<0,01), -0,30 (p<0,05), 0,38 (p<0,01) e 0,35 (p<0,01). A asociación entre estes constituíntes químicos e o valor da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻MS foi máis elevada e do mesmo sentido, con valores de 𝑟 de -0,88 para FND, de -0,90 para FAD, de 0,78 para CNET e de 0,73 para ALM (p<0,001), indicando un incremento do valor da degradabilidade ruminal da materia seca das ensilaxes de millo co incremento do contido na planta en carbohidratos non estruturais, en particular de amidón, conforme avanza a madurez. Parede celular.- As correlacións entre os parámetros de degradabilidade da FND e os constituíntes químicos foron, en xeral, de baixa intensidade en tódolos casos. A correlación máis elevada para a fracción 𝒃FND foi observada co contido en NFAD (𝑟= - 0,5; p<0,001) seguida co contido en PB, de signo positivo (r=0,36; p<0,01). Para a RESULTADOS 256 velocidade de degradación da parede celular 𝒄FND se observou unha baixa correlación negativa co contido en FAD (𝑟= -0,38; p<0,01) mentres que para o valor da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻FND se observou unha baixa correlación de signo negativo coas concentracións de N (𝑟= -0,44; p<0,001), de FAD (𝑟= -0,42; p<0,001) e de FND (𝑟= -0,30; p<0,05), reflectindo a maior degradabilidade ruminal da parede celular co descenso da concentración da fracción fibra e da PB na materia seca da planta. Proteína bruta.- Ao igual que para a parede celular, as correlacións entre os parámetros de degradabilidade ruminal da PB e os constituíntes químicos das mostras de ensilaxes de millo foron baixas e polo xeral non significativas. Para a fracción inmediatamente degradábel 𝒂PB, unicamente se observou unha correlación significativa (p<0,001), de signo positivo, coa concentración de PB (𝑟= 0,42). Os coeficientes de correlación entre os valores da fracción lentamente degradábel 𝒃PB e da velocidade de degradación ruminal 𝒄PB cos constituíntes químicos non acadaron significación (p>0,05) en ningún caso. O valor da degradabilidade potencial 𝑫𝑷PB mostrou unha correlación de signo positivo coa concentración de PB e negativo coa de NFAD, en ambos casos de baixa intensidade (𝑟= 0,33; p<0,01 e 𝑟= -0,31; p<0,05, respectivamente), mentres que o valor da degradabilidade efectiva 𝑫𝑻PB mostrou un baixo coeficiente de correlación, de signo positivo (𝑟= 0,41; p<0,001) co contido en PB. Amidón.- O valor do coeficiente de correlación da fracción 𝒂ALM mostrou unha moderada correlación negativa cos contidos en FND, FAD e PB (𝑟= -0,65, -0,55, -0,47 respectivamente, p<0,001) e positiva cos de CNET e ALM (𝑟= 0,67 e 0,71 respectivamente, p<0,001). Para a fracción 𝒃ALM a correlación foi aproximadamente da mesma intensidade pero de signo contrario, con valores de 𝑟=0,67, 0,58 e 0,45 para FND, FAD e PB e de 𝑟= -0,68 e -0,72 para CNET e ALM, sendo en todos casos altamente significativa (p<0,001). A velocidade de degradación 𝒄ALM unicamente mostrou unha correlación no mesmo sentido, pero de menor intensidade, da observada para a fracción inmediatamente degradábel, con valores de 𝑟 de -0,40 (p<0,01) para FND, de -0,41 (p<0,001) para FAD, de -0,53 (p<0,001) para PB, de 0,37 (p<0,01) para CNET e de 0,38 (p<0,01) para ALM. O valor da degradabilidade potencial 𝑫𝑷ALM mostrou tamén unha baixa correlación negativa co contido en N (𝑟= -0,43; p<0,01), sendo de igual magnitude pero de signo contrario co contido en NFAD (𝑟= 0,43; p<0,01). RESULTADOS 257 Táboa 85.- Correlacións entre parámetros de degradabilidade ruminal in situ e composición química de ensilaxes de planta enteira de millo Parámetro MO FND FAD PB NFAD CNET ALM Materia seca 𝑎 MS 𝑟 0,33 -0,90 -0,82 -0,34 0,17 0,81 0,78 𝑝 ** *** *** ** NS *** *** 𝒃 MS 𝑟 -0,20 0,70 0,69 0,37 -0,25 -0,61 -0,61 𝑝 NS *** *** ** NS *** *** 𝒄 MS 𝑟 -0,05 -0,09 -0,28 -0,18 -0,16 0,06 0,02 𝑝 NS NS * NS NS NS NS 𝑫𝑷 MS 𝑟 0,23 -0,40 -0,30 -0,02 -0,07 0,38 0,35 𝑝 NS ** * NS NS ** ** 𝑫𝑻 MS (k=0, 06) 𝑟 0,32 -0,88 -0,90 -0,37 0,05 0,78 0,73 𝑝 * *** *** ** NS *** *** Fibra neutro deterxente 𝒃 FND ( 𝑫𝑷 FND ) 𝑟 0,05 0,25 0,29 0,36 -0,51 -0,14 -0,14 𝑝 NS * * ** *** NS NS 𝒄 FND 𝑟 0,00 -0,24 -0,38 -0,22 -0,03 0,14 0,08 𝑝 NS NS ** NS NS NS NS 𝑫𝑻 F ND (k=0, 06) 𝑟 -0,05 -0,30 -0,42 -0,44 0,14 0,19 0,12 𝑝 NS * *** *** NS NS NS Proteína bruta 𝒂 PB 𝑟 0,03 -0,04 -0,04 0,42 -0,12 -0,03 -0,03 𝑝 NS NS NS *** NS NS NS 𝒃 PB 𝑟 0,03 0,10 0,17 -0,18 -0,04 -0,01 -0,02 𝑝 NS NS NS NS NS NS NS 𝒄 PB 𝑟 -0,21 -0,02 -0,10 -0,08 0,20 -0,02 -0,01 𝑝 NS NS NS NS NS NS NS 𝑫𝑷 PB 𝑟 0,08 0,10 0,17 0,33 -0,31 -0,06 -0,07 𝑝 NS NS NS ** * NS NS 𝑫𝑻 PB (k=0, 06) 𝑟 -0,03 -0,06 -0,10 0,41 -0,08 -0,04 -0,04 𝑝 NS NS NS *** NS NS NS Amidón 𝒂 ALM 𝑟 0,27 -0,65 -0,55 -0,47 0,33 0,67 0,71 𝑝 * *** *** *** * *** *** 𝒃 ALM 𝑟 -0,29 0,67 0,58 0,45 -0,29 -0,68 -0,72 𝑝 * *** *** *** * *** *** 𝒄 ALM 𝑟 -0,04 -0,40 -0,41 -0,53 0,35 0,37 0,38 𝑝 NS ** *** *** * ** ** 𝑫𝑷 ALM 𝑟 0,04 -0,24 -0,13 -0,43 0,43 0,32 0,39 𝑝 NS NS NS *** ** * ** 𝑫𝑻 ALM (k=0, 06) 𝑟 -0,12 -0,06 0,09 -0,09 0,38 -0,06 0,03 𝑝 NS NS NS NS * NS NS MS: materia seca; MO: materia orgánica (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta; ALM: amidón (%MS); 𝑫𝑻: degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷: degradabilidade potencial (%); 𝒂: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); c: velocidade de degradación ruminal da fracción 𝒃 (h-1); 𝒓: coeficiente de correlación de Pearson; 𝒑: significación (*** p<0,001; ** p<0,01; * p<0,05; NS p>0,05: non significativo) O valor da degradabilidade efectiva do amidón 𝑫𝑻ALM mostrou unicamente unha pobre correlación negativa co valor NFAD (𝑟= 0,38; p<0,05). Os resultados mostran que a RESULTADOS 258 degradabilidade efectiva do amidón na planta de millo se ve pouco afectada polos cambios nos constituíntes químicos da planta, mentres que a ausencia de correlacións significativas co contido en carbohidratos non estruturais parece indicar un escaso efecto da madurez da planta sobre a degradabilidade do amidón. Ecuacións de predición baseadas en parámetros químicos Nas Táboas 86 a 87 se mostran as ecuacións de regresión obtidas para a predición dos parámetros que describen a degradabilidade ruminal da materia seca, da parede celular, da proteína bruta e do amidón da colección de mostras de ensilaxes de millo, así como os estatísticos de calibración e validación cruzada das ecuacións. Se incluíron unicamente os modelos construídos para cada parámetro que mostraron os maiores coeficientes de determinación en calibración. Materia seca.- Como se mostra na Táboa 86, as ecuación seleccionadas para a predición dos diferentes parámetros de degradabilidade da MS foron modelos lineares simples que incluían as concentracións de FND para a estimación de 𝑫𝑷MS, 𝒂M e 𝒃MS, de ALM e FND para a estimación de 𝒄MS e de PB e FAD para a estimación de 𝑫𝑻MS, Os valores do coeficiente de determinación (1−𝑉𝑅) e do erro de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉) en validación cruzada das ecuacións foron, respectivamente, para 𝒂MS 0,78 e ±2,98%, para 𝒃MS 0,46 e ±4.28%, para 𝒄MS 0,05 e ±0,0079 h-1, mentres que para 𝑫𝑷MS foron 0,14e ±3,98% e para 𝑫𝑻MS 0,78 e ±2,21%, sendo de salientar que a ecuación de estimación de 𝒄MS non acadou significación no proceso de validación cruzada. Os valores do estatístico 𝑅𝑃𝐷vc para as ecuacións de estimación dos parámetros 𝑫𝑷MS (1,0), 𝒄MS (1,0) e 𝒃MS (1,3) foron inferiores aos obtidos para as ecuacións de estimación de 𝒂MS e para 𝑫𝑻MS (2,1 en ambos casos), mostrando unha maior precisión na estimación destes dous últimos valores en comparación coa dos restantes parámetros. Parede celular.- A ecuación seleccionada para a estimación de 𝒃FND utilizou o contido en PB como único preditor, sendo utilizados os contidos de FAD e ALM para a estimación de 𝒄FND e os contidos en PB, FAD e ALM para a estimación de 𝑫𝑻FND (Táboa 87). Os valores dos estatísticos de 1−𝑉𝑅, 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑅𝑃𝐷vc para as diferentes ecuacións en validación cruzada foron, respectivamente, para 𝒃FND de 0,12, ±5,71% e 1,0; para 𝒄FND de 0,34, ±0,0054 h-1 e 1,3 e para 𝑫𝑻FND de 0,50, ±3,71% e 1,40 o que RESULTADOS 259 indica unha pobre capacidade preditiva dos parámetros de degradabilidade da FND en ensilaxes de millo utilizando preditores químicos. Proteína bruta.- As ecuación seleccionadas para a predición dos diferentes parámetros de degradabilidade da proteína bruta das mostras de ensilaxes incluían como preditores a concentración de PB e FAD para a estimación de 𝒂PB, de PB e FND para a estimación de 𝒃PB, de PB para a estimación de 𝑫𝑷PB e de PB e FAD para a estimación de 𝑫𝑻PB (Táboa 88). Ningún constituínte químico acadou a significación mínima do 5% en calibración para ser incluído nun modelo de predición da velocidade de degradación 𝒄PB. En validación cruzada a ecuación para a predición do valor da fracción lentamente degradábel 𝒃PB non foi significativa. Para os restantes parámetros de degradabilidade, os valores de 1−𝑉𝑅, 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑅𝑃𝐷vc foron, respectivamente, para 𝒂PB 0,23, ±4,96% e 1,1; para 𝑫𝑷PB 0,07, ±3,93% e 1,0 e para 𝑫𝑻PB 0,28, ±3,54% e 1,1. Os resultados mostran unha baixa precisión na estimación da degradabilidade da proteína en ensilaxes de millo. Amidón.- Ningún dos preditores constituíntes químicos acadaron a mínima significación do 5% para seren incluídos como preditores do valor de degradabilidade efectiva do amidón nin das fraccións rapidamente degradábel 𝒂ALM e lentamente degradábel 𝒃ALM (Táboa 89). Unicamente para a estimación da velocidade de degradación 𝒄ALM e o valor da degradabilidade potencial 𝑫𝑷ALM se obtiveron ecuacións con PB como único preditor que explicaron en calibración unha significativa fracción da variabilidade dos respectivos parámetros. En validación cruzada os valores de 1−𝑉𝑅, 𝑆𝐸𝐶𝑉 e 𝑅𝑃𝐷vc foron, respectivamente, para 𝒄ALM 0,27, ±0,033 h-1 e 1,1 e para 𝑫𝑷ALM 0,18, ±2,12% e 1,1, mostrando unha baixa precisión na estimación da degradabilidade potencial do amidón. Atendendo aos criterios de Shenk et al. (2001) e de Williams (2001) que exixen, respectivamente, valores mínimos do coeficiente de determinación en validación cruzada 1 − 𝑉𝑅 >0,50 e de RPD >1,5 para que unha ecuación teña utilidade preditiva unicamente as ecuacións químicas seleccionadas para a predición de 𝒂MS e 𝑫𝑻MS poden ser usadas para estimar estes parámetros en coleccións de mostras de millo con características semellantes ás da colección de calibración utilizada neste traballo. Ningún dos restantes modelos empíricos para a predición da degradabilidade da parede celular, da proteína e do amidón da colección de ensilaxes de millo mostraron utilidade preditiva. RESULTADOS 260 Táboa 86.- Predición dos parámetros de degradabilidade ruminal da materia seca de ensilaxes de planta enteira de millo en base a parámetros químicos Parámetro Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC CV 1-VR SECV CV 𝑫𝑻 MS (k=0, 06) 56,9 +4,58 PB -0,150 PB x FAD 0,80 2,14 3,53 0,78 2,21 3,65 s.e ±2,10 ±0,540 ±0,010 P *** *** *** *** *** 𝑫𝑷 MS 100,7 -0,30 FND 0,15 3,98 4,58 0,14 3,98 4,59 s.e ±4,19 ±0,09 P *** *** *** *** 𝒂 MS 91,9 -1,034 FND 0,80 2,86 6,41 0,78 2,98 6,68 s.e ±3,01 ±0,065 P *** *** *** *** 𝒃 MS 8,75 +0,728 FND 0,48 4,24 10,0 0,46 4,28 10,1 s.e ±2,46 ±0,096 P ** *** *** *** 𝒄 MS 0,0475 +0,00103 ALM -0,000028 ALM x FND 0,09 0,0079 20,2 0,05 0,0079 20,2 s.e ±0,0049 ±0,00042 ±0,000011 P *** * * * NS MS: materia seca; FAD: fibra ácido deterxente (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); ALM: amidón (%MS); 𝑫𝑻MS degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷MS: degradabilidade potencial (%); 𝒂MS: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃MS: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄MS: velocidade de degradación ruminal da fracción 𝒃MS (h-1); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; CV: coeficiente de variación RESULTADOS 261 Táboa 87.- Predición dos parámetros de degradabilidade ruminal da fibra neutro deterxente de ensilaxes de planta enteira de millo en base a parámetros químicos Parámetro Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC CV 1-VR SECV CV 𝑫𝑻 FND (k=0, 06) 47,6 +6,04 PB -0,216 PB x FAD -0,117 PB x ALM 0,58 3,46 12,2 0,50 3,71 13,1 s.e ±3,58 ±1,32 ±0,030 ±0,016 P *** *** *** *** *** *** 𝒃 FND ( 𝑫𝑷 FND ) 65,6 +2,37 PB 0,13 5,70 7,10 0,12 5,71 7,11 s.e ±4,85 ±0,78 P *** ** *** ** 𝒄 FND 0,103 -0,0190 FAD -0,00081 ALM 0,38 0,0053 18,9 0,34 0,0054 19,2 s.e ±0,013 ±0,00031 ±0,00017 P *** *** ** *** *** MS: materia seca; PB: proteína bruta (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); ALM: amidón (%MS); 𝑫𝑻FND degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷FND: degradabilidade potencial (%); 𝒂FND: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃FND: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄FND: velocidade de degradación ruminal da fracción bFND (h-1); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; CV: coeficiente de variación RESULTADOS 262 Táboa 88.- Predición dos parámetros de degradabilidade ruminal da proteína bruta de ensilaxes de planta enteira de millo en base a parámetros químicos Parámetro Ecuación Calibración Validación cruzada R 2 SEC CV 1-VR SECV CV 𝑫𝑻 PB (k=0, 06) 58,8 +4,61 PB -0,064 PB x FAD 0,32 3,49 4,55 0,28 3,54 4,61 s,e ±3,44 ±0,88 ±0,017 P *** *** *** *** *** 𝑫𝑷 PB 81,1 + 1,437 PB 0,10 3,88 4,31 0,07 3,93 4,37 s,e ±3,30 ±0,533 P *** *** ** * 𝒂 PB 47,55 + 5,75 PB - 0,0754 PB x FAD 0,29 4,82 6,83 0,23 4,96 7,03 s,e ±4,75 ±7,61 ±0,023 P *** *** ** *** *** 𝐛 PB 31,6 -3,91 PB + 0,0416 PB x FND 0,10 4,82 27,9 0,05 6,05 31,1 s,e ±5,31 ±9,54 ±0,0195 P *** * * * NS 𝒄 PB Ningún parámetro acada a significación mínima do 5% - - - - - - MS: materia seca; FND: fibra ácido deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); PB: proteína bruta (%MS); 𝑫𝑻PB degradabilidade teórica (%); 𝒌: taxa fraccional de paso no rume (h-1); 𝑫𝑷PB: degradabilidade potencial (%); 𝒂PB: fracción inmediatamente degradábel (%); 𝒃PB: fracción insolúbel pero potencialmente degradábel (%); 𝒄PB: velocidade de degradación ruminal da fracción bPB (h-1); s.e: erro estándar do coeficiente da ecuación de regresión; P: significación (*** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05); R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; CV: coeficiente de variación RESULTADOS 269 4.6 Modelos preditivos para a estimación de parámetros fermentativos de ensilaxes 4.6.1 Modelo xeral Valores medios da colección O total da colección de mostras de ensilaxes das que se dispuña das analíticas dos parámetros fermentativos determinados por métodos de referencia foi de 1043, das cales 325 eran ensilaxes de herba e cultivos anuais de inverno e 718 eran ensilaxes de planta enteira de millo, sendo seleccionados finalmente 1006 mostras para a construción das calibracións NIRS. Na Táboa 91 se mostran os valores medios, a desviación estándar, o coeficiente de variación e o rango de valores de pH, ácidos láctico e acético e os contidos en N solúbel e N amoniacal do grupo de calibración (n= 770) e validación externa (n= 236), así como os estatísticos de calibración e validación cruzada e externa das ecuacións. Os valores medios (e rango de variación) dos diferentes parámetros nos conxuntos de calibración e de validación externa foron, respectivamente, pH: 3,98 (3,40 a 5,70) e 3,94 (3,19 a 5,40), LACT (%MS): 4,52 (0,10 a 18,31) e 4,54 (0,01 a 16,29), ACET (%MS): 1,93 (0,02 a 8,14) e 1,85 (0,10 a 8,61), N-Solúbel (%N total): 48,0 (15,7 a 95,8) e 48,62 (18,7 a 76,4) e N-NH3 (%N total): 7,8 (1,4 a 39,1) e 7,4 (2,1 a 14,9). O coeficiente de variación dos valores de pH foi do 9,7%, sendo considerabelmente máis alto para os produtos da fermentación, con valores de 𝐶𝑉 de 67,8% para LACT, de 72,8% para ACET, de 21,9% para N-solúbel e de 52,0% para N-NH3, reflectindo a diferente intensidade da fermentación na colección de mostras de ensilaxes de herba e de millo como resposta á diversidade xenotípica, de estados de madurez, tratamentos post-colleita e condicións ambientais. Ecuacións NIRS para a predición de parámetros fermentativos Os modelos de predición obtivéronse con SNV+D como pretratamento espectral para corrixir o efecto da dispersión da luz, sendo optimizados polo uso da segunda derivada do espectro para tódolos parámetros coa excepción do pH, no que o uso da primeira derivada proporcionou mellores resultados. O número de outliers eliminados do conxunto de calibración respecto do número inicial de mostras oscilou entre 5,5 e 6,4%, RESULTADOS 270 estando estas porcentaxes por debaixo do valor máximo do 20% recomendado por Shenk e Westerhaus (1995a) no desenvolvemento de ecuacións de calibración NIRS. Os coeficientes de determinación (1−𝑉𝑅) e os erros de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉) no proceso de validación cruzada foron, respectivamente, de 0,90 e ±0,06 para pH, de 0,90 e ±0,88% para LACT, de 0,87 e ±0,36% para ACET, de 0,85 e ±3,75% para N-Solúbel e de 0,86 e ±0,76% para N-NH3. O ratio 𝑆𝐸𝐶𝑉/𝑆𝐸𝐶 oscilou entre 1,09 e 1,17 o que o sitúa dentro do intervalo entre 0,5 e 1,5 sinalado por Burns e Ciurczak (1992) como indicativo de calibracións NIRS robustas. Segundo o criterio definido por Shenk et al. (2001) para xulgar a calidade do axuste das ecuacións en función do valor do coeficiente de determinación en validación cruzada, esta foi excelente (1−𝑉𝑅 ≥0,90) para a predición do valor de pH e do contido de LACT. As ecuacións para a predición do resto dos parámetros mostrou, a este respecto, un axuste categorizado como bo (1−𝑉𝑅 entre 0,70 e 0,89) estando o valor do coeficiente de determinación en valores moi próximos ao límite superior. Por outra banda, atendendo aos criterios de Williams (2014) e de Williams e Sobering (1996) para xulgar a calidade preditiva das ecuacións en base aos valores de 𝑅𝑃𝐷vc e 𝑅𝐸𝑅vc en validación cruzada, aquela foi boa (𝑅𝑃𝐷vc>3 e 𝑅𝐸𝑅ve>10) para tódolos parámetros agás para o contido en N-Solúbel, que obtivo un valor de 𝑅𝑃𝐷vc lixeiramente inferior a 3,0 pero cun alto valor de 𝑅𝐸𝑅vc que, ao igual que para o resto dos parámetros, indicaría que as ecuacións NIRS permitirían unha predición cuantitativa da calidade fermentativa atendendo aos resultados neste proceso de validación. A representación gráfica dos valores de referencia e dos valores preditos cando se aplican os modelos de calibración NIRS sobre un conxunto de mostras independentes se mostra na Figura 22. Os valores do coeficiente de determinación 𝑟2 e do erro de predición 𝑆𝐸𝑃 obtidos no proceso de validación externa foron, respectivamente, de 0,83 e ±0,16 para pH, de 0,87 e ±1,39 % para LACT, de 0,71 e ±0,89 % para ACET, de 0,79 e ±5,38% para N-Solúbel e de 0,51 e ±2,27% para N-NH3. Os correspondentes valores de 𝑅𝑃𝐷ve e de 𝑅𝐸𝑅ve para estes parámetros foron, respectivamente, de 2,0 e 13,6 para pH, de 2,2 e 11,7 para LACT, de 1,6 e 9,6 para ACET, de 1,9 e 10,7 para N-Solúbel e de 1,1 e 5,6 para N-NH3, indicando unha notábel perda de precisión das ecuacións cando se aplican ao conxunto de validación externa. RESULTADOS 271 Atendendo aos criterios de Williams (2014) e de Williams e Sobering (1996) a calidade preditiva dos modelos de calibración en base ao valores de 𝑅𝑃𝐷ve e 𝑅𝐸𝑅ve en validación externa foi mediocre (𝑅𝑃𝐷ve entre 2,0 e 2,5) para a estimación dos valores de pH e LACT, permitindo unha predición cualitativa básica, se ben os valores de 𝑅𝐸𝑅ve para estes parámetros excede o valor mínimo de 10 suxerindo utilidade das ecuacións para realizar unha predición cuantitativa de moderada fiabilidade. As ecuacións de estimación de ACET e de N-Solúbel, con valores de 𝑅𝑃𝐷ve no intervalo entre 1,50 e 2,0 e de 𝑅𝐸𝑅ve >10 terían certa utilidade para clasificar en rangos de calidade (alto, medio, baixo) ditos parámetros, mentres que a ecuación de predición de N-NH3, non sería de utilidade para a predición fiábel deste parámetro en coleccións de mostras independentes. Os criterios establecidos por Shenk et al. (2001) e Shenk e Westerhaus (1991b) para xulgar acerca da súa robustez e fiabilidade en análises de rutina sobre mostras externas, (𝑟2 ≥0,60; 𝑏𝑖𝑎𝑠 =±0,60 𝑆𝐸𝐶; 𝑆𝐸𝑃c ≤1,30 𝑆𝐸𝐶 e pendente entre 0,9 e 1,1) non se cumpriron na súa totalidade para ningunha das ecuacións, indicando que no conxunto de calibración non estaba incorporada toda a variabilidade existente no conxunto de validación externa. Se ben para as ecuacións de predición de pH, LACT, ACET e NSolúbel os valores de 𝑟2 e 𝑏𝑖𝑎𝑠 estaban dentro dos límites de calidade indicados, unicamente para as ecuacións de estimación dos dous primeiros parámetros se cumpría que o valor da pendente estivese dentro do intervalo requirido e en tódolos casos o valor do erro de predición 𝑆𝐸𝑃c excedía o límite necesario para considerar robusta e fiábel a ecuación aplicada a mostras externas. RESULTADOS 272 Táboa 91.- Estatísticos de calibración e validación das ecuacións universais NIRS para a predición dos parámetros fermentativos de ensilaxes de herba e de planta enteira de millo Parámetro Scatter Tratamento matemático Calibración Validación cruzada n Outliers T Media SD Min Max Rango R2 SEC 1-VR SECV RPDvc RERvc pH SNV+D 1,10,5,1 770 49 15 3,98 0,39 3,40 5,70 2,30 0,93 0,05 0,90 0,06 6,1 36,1 LACT SNV+D 2,10,5,1 770 44 14 4,52 3,06 0,10 18,31 18,21 0,92 0,80 0,90 0,88 3,5 20,6 ACET SNV+D 2,10,5,1 770 44 15 1,93 1,39 0,02 8,14 8,12 0,91 0,31 0,87 0,36 3,9 22,6 N-Solúbel SNV+D 2,10,10,1 770 42 12 48,1 10,5 15,7 95,8 80,1 0,87 3,43 0,85 3,75 2,8 21,3 N-NH3 SNV+D 2,10,10,1 770 45 14 7,87 4,09 1,39 39,1 37,7 0,89 0,68 0,86 0,76 5,4 49,9 Parámetro Validación externa n Outliers Media SD Min Max Rango r2 SEP SEPc Bias Pend. RPDve RERve GH NH pH 236 11 3,94 0,32 3,19 5,40 2,21 0,83 0,16 0,16 0,02 1,08 2,0 13,6 1,16 0,33 LACT 236 11 4,54 3,00 0,01 16,2 16,3 0,87 1,39 1,36 0,13 0,90 2,2 11,7 1,16 0,33 ACET 236 11 1,85 1,43 0,10 8,61 8,51 0,71 0,89 0,89 0,09 1,13 1,6 9,6 1,16 0,33 N-Solúbel 236 11 48,6 10,1 18,8 76,5 57,7 0,79 5,38 5,39 0,05 0,84 1,9 10,7 1,16 0,33 N-NH3 236 11 7,44 2,39 2,18 14,9 12,7 0,51 2,27 2,27 0,04 0,77 1,1 5,6 1,16 0,33 SNV+D: standard normal variate+detrend; n: número de observacións; Outliers: número de mostras anómalas eliminadas; T: número de factores da regresión; SD: desviación estándar; Min: valor mínimo; Max: valor máximo; SEC: erro estándar de calibración; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; RPDvc: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación cruzada; RERvc: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; SEPc: erro estándar de predición corrixido por bias; Bias: diferencia media entre os valores observados e os preditos pola ecuación; Pend: pendente da regresión; RPDve: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa; RERve: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación externa; GH e NH: distancias de Mahalanobis; MS: materia seca; LACT: ácido láctico (%MS); ACET: ácido acético (%MS); N: nitróxeno; N-Solúbel: N solúbel (% N total); N-NH3: N amoniacal (% N total) RESULTADOS 273 Figura 22.- Plot de valores de parámetros fermentativos medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións universais NIRS para mostras de ensilaxes de herba e de planta enteira de millo N-NH3 (% N total) N - NH 3 (% N total) RESULTADOS 274 4.6.2 Ensilaxes de herba Valores medios da colección A colección inicial estaba formada por 325 mostras de ensilaxes de herba das que se dispuña das analíticas dos parámetros fermentativos determinados por métodos de referencia. Estaba composta na súa maior parte por ensilaxes de herba de pradeira (n=274) e ensilaxes de cultivos de inverno incluíndo mesturas de trevos anuais con raigrás italiano e híbrido, así como de cultivos de triticale, de chícharo forraxeiro e as súas mesturas (n=51). Foron seleccionadas finalmente 311 mostras para a construción das calibracións NIRS para a predición dos parámetros fermentativos das ensilaxes, representando unha ampla variabilidade en canto a xenotipos, ciclos de crecemento, estados de madurez, tratamentos post-colleita, localidades e condicións ambientais para este tipo de forraxe. Na Táboa 92 se mostran os valores medios, a desviación estándar, o coeficiente de variación e o rango de valores de pH, ácidos láctico e acético e os contidos en N solúbel e N amoniacal do grupo de calibración (n= 246) e validación externa (n= 65), así como os estatísticos de calibración e validación cruzada e externa das ecuacións. Os valores medios (e rango de variación) dos diferentes parámetros nos conxuntos de calibración e de validación externa foron, respectivamente, pH: 4,37 (3,50 a 5,70) e 3,45 (3,19 a 5,66), LACT (%MS): 5,91 (0,0 a 18,3) e 5,82 (0,31 a 16,2), ACET (%MS): 2,83 (0,02 a 8,14) e 2,82 (0,0 a 8,77), N-Solúbel (%N total): 46,8 (15,7 a 85,1) e 45,7 (18,8 a 69,0) e N-NH3 (%N total): 10,2 (1,3 a 39,1) e 9,38 (2,1 a 32,7). Os valores do coeficiente de variación no conxunto de calibración foron de 10,5% para pH, 65,5% para LACT, de 62,9% para ACET, de 23,5% para N-Solúbel e de 58,3% para N-NH3, reproducindo de forma aproximada a variabilidade observada para o total da colección de ensilaxes de herba e de millo. Ecuacións NIRS para a predición de parámetros fermentativos Ao igual que acontecera na construción de ecuacións para o conxunto de ensilaxes de herba e de millo, os modelos de predición de parámetros fermentativos de ensilaxes de herba se obtiveron utilizando o método SNV+D como pretratamento espectral e mediante a segunda derivada do espectro para tódolos parámetros coa excepción do pH, no que se utilizou a primeira derivada con mellor resultado. O número de mostras anómalas eliminadas do conxunto de calibración respecto do número inicial de mostras RESULTADOS 275 oscilou entre 3,7 e 5,7%, estando estas porcentaxes por debaixo do valor máximo do 20% recomendado por Shenk e Westerhaus (1995a) no desenvolvemento de ecuacións de calibración NIRS. Os coeficientes de determinación (1−𝑉𝑅) e os erros de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉) no proceso de validación cruzada foron, respectivamente, de 0,86 e ±0,17 para pH, de 0,85 e ±1,49% para LACT, de 0,86 e ±0,64% para ACET, de 0,81 e ±4,44% para N-Solúbel e de 0,85 e ±2,02% para N-NH3. O ratio 𝑆𝐸𝐶𝑉/𝑆𝐸𝐶 oscilou entre 1,02 e 1,26 o que o sitúa dentro do intervalo entre 0,5 e 1,5 sinalado por Burns e Ciurczak (1992) como indicativo de calibracións NIRS robustas. Segundo o criterio definido por Shenk et al. (2001) para xulgar a calidade do axuste das ecuacións en función do valor do coeficiente de determinación en validación cruzada, esta foi considerada como boa (1−𝑉𝑅 entre 0,70 e 0,89) en tódolos casos, estando dito valor próximo ao límite superior deste intervalo para todos os parámetros. Por outra banda, atendendo aos criterios de Williams (2014) e de Williams e Sobering (1996) para xulgar a calidade preditiva das ecuacións en base aos valores de 𝑅𝑃𝐷vc e 𝑅𝐸𝑅vc en validación cruzada, aquela foi boa (𝑅𝑃𝐷vc >3 e 𝑅𝐸𝑅vc >10) para a estimación de N-NH3 e aceptábel (𝑅𝑃𝐷vc entre 2,5 e 3,0 e 𝑅𝐸𝑅vc >10) para os restantes parámetros, o que indicaría que as ecuacións NIRS permitirían unha predición cuantitativa da calidade fermentativa atendendo aos resultados neste proceso de validación. A representación gráfica dos valores de referencia e dos valores preditos cando se aplican os modelos de calibración NIRS sobre un conxunto de mostras independentes se mostra na Figura 23. Os valores do coeficiente de determinación 𝑟2 e do erro de predición 𝑆𝐸𝑃 obtidos no proceso de validación externa foron, respectivamente, de 0,84 e ±0,20 para pH, de 0,89 e ±1,36% para LACT, de 0,89 e ±0,81% para ACET, de 0,88 e ±3,74% para N-Solúbel e de 0,86 e ±1,85% para N-NH3. Os correspondentes valores de 𝑅𝑃𝐷ve e de 𝑅𝐸𝑅ve para estes parámetros foron, respectivamente, de 2,5 e 12,4 para pH, de 3,0 e 11,7 para LACT, de 2,7 e 10,9 para ACET, de 2,9 e 13,4 para N-Solúbel e de 2,6 e 16,6 para N-NH3, o que indica que cando as ecuacións de predición dos distintos parámetros se aplican a un conxunto de validación externa se mantén un bo axuste dos modelos cunha reducida perda na precisión das estimacións. Por outra parte, considerando os criterios establecidos por Windham et al. (1989), o valor do erro de predición 𝑆𝐸𝑃 das ecuacións obtidas para estimar o contido en LACT, N solúbel e NNH3 foi ≤ 2 veces o valor do erro estándar do método de referencia, indicativo de que as RESULTADOS 276 ecuacións NIRS serían aceptábeis para a predición de ditos parámetros. No caso dos modelos de predición do pH (𝑆𝐸𝐿=±0,07; 𝑆𝐸𝑃=±0,20) e o contido en ácido acético (𝑆𝐸𝐿=±0,32; 𝑆𝐸𝑃=±0,81), os valores do 𝑆𝐸𝑃 superan lixeiramente o limite máximo recomendado. Atendendo aos criterios de Williams (2014) e de Williams e Sobering (1996) a calidade preditiva dos modelos de calibración en base ao valores de 𝑅𝑃𝐷ve e 𝑅𝐸𝑅ve en validación externa foi boa (𝑅𝑃𝐷ve ≥3,0) para a estimación dos valores de LACT e aceptábel (𝑅𝑃𝐷ve entre 2,5 e 3,0) para a estimación dos restantes parámetros, tendo sempre as ecuacións un valor de 𝑅𝐸𝑅ve superior ao valor mínimo de 10, o que suxire que todas as ecuacións serían de utilidade para realizar unha predición cuantitativa das características fermentativas das ensilaxes de herba. O cumprimento das condicións establecidas por Shenk et al. (2001) e Shenk e Westerhaus (1991b) en validación externa (𝑟2 ≥0,60; 𝑏𝑖𝑎𝑠 =±0,60 𝑆𝐸𝐶; 𝑆𝐸𝑃c ≤1,30 𝑆𝐸𝐶 e pendente entre 0,9 e 1,1) confirman que as ecuacións de predición son suficientemente fiábeis para ser utilizadas en rutinas analíticas sobre mostras independentes. Os estatísticos das diferentes ecuacións NIRS obtidas no presente traballo para a predición da calidade fermentativa de ensilaxes de herba estiveron dentro dos intervalos indicados, mostrando a súa robustez e aplicación para a análise fermentativa de mostras de ensilaxes de herba. RESULTADOS 277 Táboa 92.- Estatísticos de calibración e validación das ecuacións NIRS para a predición dos parámetros fermentativos de ensilaxes de herba Parámetro Scatter Tratamento matemático Calibración Validación cruzada n Outliers T Media SD Min Max Rango R2 SEC 1-VR SECV RPDvc RERvc pH SNV+D 1,10,5,1 246 12 9 4,37 0,46 3,50 5,70 2,20 0,88 0,15 0,86 0,17 2,7 12,9 LACT SNV+D 2,10,5,1 246 9 5 5,91 3,87 0,00 18,3 18,3 0,86 1,46 0,85 1,49 2,6 12,3 ACET SNV+D 2,10,5,1 246 14 8 2,83 1,78 0,02 8,14 8,12 0,88 0,60 0,86 0,64 2,8 12,8 N-Solúbel SNV+D 2,10,10,1 246 11 9 46,8 11,0 15,7 85,1 69,3 0,86 3,80 0,81 4,44 2,5 15,6 N-NH3 SNV+D 2,10,10,1 246 14 12 10,2 5,95 1,39 39,1 37,7 0,91 1,60 0,85 2,02 3,0 18,7 Parámetro Validación externa n Outliers Media SD Min Max Rango r2 SEP SEPc Bias Pend, RPDve RERve GH NH pH 65 0 4,45 0,50 3,19 5,66 2,47 0,84 0,20 0,20 0,03 1,02 2,5 12,4 1,18 0,43 LACT 65 0 5,82 4,07 0,31 16,2 16,0 0,89 1,36 1,37 -0,09 1,02 3,0 11,7 1,18 0,43 ACET 65 0 2,82 2,22 0,00 8,77 8,77 0,89 0,81 0,80 0,10 1,15 2,7 10,9 1,18 0,43 N-Solúbel 65 0 45,7 10,8 18,8 69,0 50,2 0,88 3,74 3,76 -0,18 1,01 2,9 13,4 1,18 0,43 N-NH3 65 0 9,38 4,86 2,18 32,7 30,5 0,86 1,85 1,84 -0,24 0,93 2,6 16,6 1,18 0,43 SNV+D: standard normal variate+detrend; n: número de observacións; Outliers: número de mostras anómalas eliminadas; T: número de factores da regresión; SD: desviación estándar; Min: valor mínimo; Max: valor máximo; SEC: erro estándar de calibración; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SEC: erro estándar de calibración; 1-VR: coeficiente de determinación en validación cruzada; SECV: erro estándar de validación cruzada; RPDvc: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación cruzada; RERvc: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; SEPc: erro estándar de predición corrixido por bias; Bias: diferencia media entre os valores observados e os preditos pola ecuación; Pend: pendente da regresión; RPDve: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa; RERve: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación externa; GH e NH: distancias de Mahalanobis; MS: materia seca; LACT: ácido láctico (%MS); ACET: ácido acético (%MS); N: nitróxeno; N-Solúbel: N solúbel (% N total); N-NH3: N amoniacal (% N total) RESULTADOS 278 Figura 23.- Plot de valores de parámetros fermentativos medidos polos métodos de referencia e de valores preditos polas ecuacións NIRS para mostras de ensilaxes de herba 285 Discusion 286 DISCUSIÓN 287 5. DISCUSIÓN 5.1 - Modelos xerais para a estimación da composición química e dixestibilidade de forraxes Nun detallado estudo sobre a composición química e a dixestibilidade in vivo das forraxeiras clásicas de Francia, Demarquilly e Andrieu (1992) describiron as principais características de máis de 1800 mostras de forraxes en estado fresco incluíndo pratenses e outros cultivos forraxeiros anuais, obtendo valores medios e rango de variación (en % MS) de 89,0 (79,5 a 95,5) para MO, de 15,7 (5,5 a 30,7) para PB e de 30,2 (17,8 a 40,8) para FAD, sendo o valor medio de DMO de 70,4%, oscilando entre un valor mínimo de 52,0% e máximo de 84,0%. A partir dun volume de mostras moito máis reducido, na base de datos de forraxes verdes e ensilados contida nas Táboas FEDNA (2016) se refiren valores medios e rango de variación (en %MS) de 90,3 (84,5 a 90,3) para MO, de 12,2 (7,0 a 22,3) para PB, de 55,5 (39,2 a 79,2) para FND e de 35,6 (22,6 a 53,3) para FAD, mentres que a estimación do valor de DMO a partir dos datos tabulares en ENL e o valor de MO, foi de 68,7% de media, cun rango de variación do 50,9 ao 82,6%. En ambas bases de datos o parámetro co valor do coeficiente de variación (𝐶𝑉) máis alto foi o contido en proteína bruta, seguido das fraccións da fibra e o menos variábel foi o contido en materia orgánica, sendo intermedio entre estes últimos o coeficiente de variación da dixestibilidade da materia orgánica, con valores de 𝐶𝑉 para a colección de forraxes francesa e española, respectivamente, de 31,2 e 32,4% para PB, de 14,8 e 16,9% para FAD, de 2,7 e 2,7% para MO e de 9,2 e 9,8% para DMO. Os valores das máis de 1800 mostras de forraxes frescas e ensiladas que se utilizaron no presente traballo para desenvolver as calibracións NIRS para a predición da dixestibilidade mostraron valores medios e rangos de variación da composición química (en %MS) de 90,9 (68,3 a 98,3) para MO, de 13,0 (3,2 a 31,2) para PB, de 45,6 (14,5 a 79,2) para FND e de 30,9 (13,0 a 51,8) para FAD, sendo o valor medio para DMO 70,2%, cun rango de variación de 45,2 a 87,3%, mostrando que os rangos de variación son algo máis amplos aos das anteriores coleccións, mentres que os valores dos coeficientes de variación para os distintos parámetros (44,9% para PB, 21,4% para FAD, 4,2% para MO e 10,0% para DMO) son, así mesmo, algo máis elevados que os das táboas de forraxes citadas no anterior parágrafo. DISCUSIÓN 288 Ecuacións empíricas Os métodos químicos da análise composicional das mostras de forraxe non ofrecen unha estimación directa do valor nutritivo, senón que descansan na existencia de asociacións estatísticas entre a composición química e a dixestibilidade in vivo, que en moitos casos non teñen significación biolóxica (Cherney, 2000). Unha das consecuencias desta aproximación empírica é que o amplo número de ecuacións existentes na bibliografía difiren significativamente tanto nas variábeis preditoras, como nos coeficientes de regresión para os mesmos preditores, así como no erro de predición. As diversas ecuacións obtidas para estimar a dixestibilidade in vivo dos distintos tipos de forraxes en diferentes institucións e laboratorios son polo regular diferentes, como consecuencia das características específicas da colección de mostras da que se derivan, polo que só son útiles cando as condicións en que se realiza a predición son semellantes ás da colección orixinal (López et al., 2000). Alén da fiabilidade estatística dos modelos empíricos de predición de dixestibilidade in vivo brindada, as limitacións ao seu uso están relacionadas coa variabilidade xenotípica e ambiental, a interacción entre as especies de plantas nas mesturas e a dificultade en representar nos modelos preditivos as relacións causa-efecto entre a dixestión ruminal e a composición da planta (Van Soest, 1994). Sen embargo, as ecuacións empíricas seguen a ser utilizadas amplamente, moitas veces sen contrastar a súa adecuada validez ás particulares condicións do medio onde se pretende a súa aplicación. Na literatura existe un vasto número de traballos de diferentes autores orientados á obtención de ecuacións para predicir a dixestibilidade da MO de diferentes forraxes en base a súa composición química. En xeral, o contido en proteína bruta nas forraxes funciona como unha fracción uniforme para a maior parte dos alimentos (Weiss, 1993), estando correlacionada positivamente coa dixestibilidade e inversamente co contido en fibra. O valor do coeficiente de correlación 𝑟 entre PB e dixestibilidade varía amplamente, situándose na revisión de (Minson, 1982) entre 0,15 e 0,90. Tradicionalmente a fibra é a fracción alimentaria máis comunmente utilizada en ecuacións empíricas para predicir a dixestibilidade e o contido enerxético das forraxes, mostrando de forma habitual unha correlación negativa coa dixestibilidade. A súa natureza non uniforme, unido ao seu uso tradicional nas ecuacións, son causa da extraordinaria variabilidade de modelos de regresión que é posíbel atopar na bibliografía para a predición da dixestibilidade das forraxes e alimentos dos ruminantes en xeral. DISCUSIÓN 289 Por exemplo, nos traballos de Minson (1990), Carro et al. (1994) e de Van Soest (1994) para a predición da DMO dun amplo rango de forraxes, se citan valores do coeficiente de correlación 𝑟 entre DMO e distintos preditores químicos de entre 0,44 a 0,79 para PB, entre - 0,45 a -0,80 para FND e de -0,75 a -0,83 para FAD. Coincidindo coas anteriores indicacións, a partir dos valores de DMO e de diversos constituíntes químicos da base de datos de forraxes das Táboas INRA (1989) se pode observar unha alta correlación de signo negativo entre DMO e as fraccións da fibra (𝑟= -0,78 para FAD e 𝑟= -0,77 para FB), sendo esta positiva e de media intensidade para PB (𝑟= 0,57) e MO (𝑟= -0,47). Do mesmo signo, pero diferente magnitude, son os valores dos coeficientes de correlación entre DMO e os contidos en PB (𝑟= 0,72), FND (𝑟= -0,65), FAD (𝑟= -0,52) e MO (𝑟= -0,24) da colección de mostras das Táboas FEDNA (2016). Os valores do coeficiente de correlación entre DMO e os distintos constituíntes químicos obtidos no presente traballo para o conxunto de mostras de forraxes frescas e ensiladas foi, respectivamente, de 0,49 e 0,23 para PB, de -0,71 e -0,50 para FND e de -0,64 e -0,44 para FAD, sendo máis parecidos aos derivados das Táboas INRA (1989), sobre todo no que se refire ao conxunto de forraxes frescas. Os resultados obtidos no presente estudo para a construción dos modelos de predición da dixestibilidade baseados en constituíntes químicos concordan, en xeral, coas observacións de diversos autores recollidas na bibliografía que reportan unha maior fiabilidade na utilización de modelos específicos para os distintos tipos de forraxes comparados co uso de modelos universais. Así, por exemplo, Demarquilly et al. (1980) indican que os modelos de predición da dixestibilidade da materia orgánica adoitan ser máis precisos cando se obteñen por separado para as distintas especies e ciclos de crecemento e se aplican nunha zona agroclimática semellante onde se obtiveron as ecuacións, sendo menos precisos cando se trata da predición da dixestibilidade de mesturas de diferentes especies e estados de crecemento. O mellor modelo xeral baseado en compoñentes químicos obtido para a predición de DMO de forraxes frescas mostrou en validación externa un erro de predición (𝑆𝐸𝑃) de ± 4,3%, que foi superior ao observado por separado para os grupos de pastos frescos e de millo, con valores respectivos de 𝑆𝐸𝑃 de ± 3,6 e ± 3,8% respectivamente, pero inferior ao observado para o sorgo (± 5,7%) o que se atribúe á inclusión na colección de diversas fraccións da planta con diferente valor de dixestibilidade. Da mesma forma, para o conxunto de ensilaxes, o comportamento do modelo universal para a estimación de DMO observado no noso traballo, comparado co dos modelos específicos para ensilaxes de herba e para ensilaxes de millo, mostra un peor comportamento preditivo, mostrando en validación externa un valor de DISCUSIÓN 290 𝑆𝐸𝑃 de ± 4,9% para o modelo xeral, superior ao valor de ± 4,6% para o grupo das ensilaxes de herba e cultivos de inverno e de ± 2,9% para ensilaxes de millo. Os valores do erro de predición dos modelos universais se comparan cos resultados doutros autores referenciados na bibliografía. Por exemplo, os valores do erro estándar residual dos modelos de calibración baseados en parámetros químicos para a estimación de DMO dunha colección de mostras de forraxes diversas, indicados nos citados traballos de Minson (1990), de Carro et al. (1994) e de Van Soest (1994) oscilaron entre ±2,0 e ±6,5% para as ecuacións baseadas no contido en PB, mentres que eran de entre ±2,4 e ±5,1% para a baseada en FND e entre ±3,6 a ±9,0% cando era FAD o preditor. Así mesmo, para a predición de DMO dun conxunto de ensilaxes de herba e de millo, Murray (1986) reportaron valores do erro estándar residual en calibración de ±4,2% para unha ecuación con FAD como único preditor e de ±2,7% para unha ecuación baseada en LAD. No modelo universal obtido no traballo da Rede Española de Alimentación animal (REDALAN, 2006) para a predición de dixestibilidade da materia orgánica a partir dos constituíntes químicos das mostras, o mellor modelo con PB e FND como preditores para o conxunto universal de mostras obtivo, en calibración, un valor do coeficiente de determinación 𝑅2= 0,55 e do erro estándar residual 𝑅𝑆𝐷= ±4,81%, comparábeis cos obtidos cos modelos xerais no presente traballo (𝑅2 de 0,63 a 0,53 para forraxes frescas e de 0,42 a 0,25 para ensilaxes e 𝑅𝑆𝐷 de ±4,1 a ±4,7% para forraxes frescas e de ±4,8 a ±5,5% para o conxunto de ensilaxes). Os valores das ecuacións de regresión para a predición de dixestibilidade en base ao contido en proteína bruta mostran, polo xeral, un erro de predición relativamente alto, no entorno de 6-7 unidades porcentuais de dixestibilidade, debido ao efecto de factores de variación como o tipo de forraxe (gramíneas ou leguminosas), momento de corte, madurez da planta e condicións ambientais (Minson, 1982). En ocasións, como indican Ribeiro e Moreira (1998) o valor de PB é un bo preditor de DMO en forraxes de especies gramíneas de climas temperados porque a súa concentración diminúe cando a planta madura e tamén varía inversamente coa fracción indixestíbel da fibra, pero para seren suficientemente precisas, as ecuacións deben ser obtidas individualmente para distintas especies, ciclos ou estacións e tipos de solos (Aufrère e Guérin, 1996). Na revisión de Minson (1982) o coeficiente de determinación das ecuacións baseadas en FAD ou FND e a dixestibilidade son relativamente altas (𝑅2>0,60) pero os erros de predición da dixestibilidade se sitúan no rango entre 2 e 8 unidades porcentuales, sen grandes diferenzas cando se usa un ou outro preditor. DISCUSIÓN 291 Como se mostrou no anterior apartado, os métodos químicos son menos fiábeis que a técnica NIRS para a estimación do valor de DMO de forraxes, pero en ocasións son a única opción posíbel. Neste caso, como indican entre outros autores Weiss (1993) e (Ribeiro e Moreira, 1998) se deben tomar dúas precaucións: a primeira é relativa ao uso de ecuacións debidamente validadas e en segundo lugar e conectado con esta, dado o efecto dos factores relacionados co tipo de especies de pasto, clima, solo, manexo do cultivo e post-colleita sobre os coeficientes das ecuacións, debe ser tomada a precaución de non realizar a súa aplicación fóra das condicións en que foron obtidos os modelos de predición, baixo pena de incrementar o erro das estimacións nunha magnitude non coñecida a priori, sendo necesarias ecuacións específicas para cada tipo de forraxe. Ecuacións NIRS para a estimación da composición química e DMO Como resumo dos resultados dos traballos de investigación referidos á capacidade preditiva mediante ecuacións NIRS da composición química de diversas forraxes en estado fresco e ensilados que foron citados no apartado de revisión bibliográfica do presente traballo, na Táboa 94 se mostran os valores medios dos estatísticos que definen a calidade da predición NIRS dos diferentes parámetros. Ordenados estes de maior a menor polo valor do coeficiente de determinación en calibración (𝑅2) das respectivas ecuacións, se observa que o parámetro predito con maior precisión foi o contido en PB (𝑅2= 0,92; 𝑅𝑃𝐷= 4,2), seguida de FND, FAD e FB (𝑅2= 0,87-0,91; 𝑅𝑃𝐷= 3,0-3,1), de ALM e CSA (𝑅2= 0,85-0,90; 𝑅𝑃𝐷= 2,7-4,0) e de CZ (𝑅2= 0,82, 𝑅𝑃𝐷= 2,5, indicando unha boa calidade para proteína, fibra e carbohidratos non estruturais e moderada para o contido en cinzas. Táboa 93.- Calidade das ecuacións NIRS para a predición da composición nutricional de forraxes diversas, en estado fresco e conservados, procedentes dos traballos de diversos autores n 𝑹 2 𝑺𝑬𝑪𝑽 𝒓 2 𝑺𝑬𝑷 𝑹𝑷𝑫 𝑹𝑬𝑹 PB 49 0,92 0,86 0,88 1,09 4,20 19,01 ALM 5 0,90 2,48 0,85 2,08 2,72 12,12 FND 36 0,90 2,47 0,90 2,48 3,11 14,75 FAD 35 0,87 1,92 0,89 2,44 3,02 12,89 CSA 5 0,85 2,67 0,93 1,30 4,06 12,22 CZ 28 0,82 0,74 0,80 1,09 2,54 15,70 n: número de estudos; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SECV: erro estándar de validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; RPD: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa; RER: ratio entre rango de valores e o erro de predición en validación externa; MS: materia seca; PB: proteína bruta (%MS); ALM: amidón (%MS); FND: fibra neutro deterxente (%MS); FAD: fibra ácido deterxente (%MS); CSA: carbohidratos solúbeis en auga (%MS); CZ: cinzas (%MS) DISCUSIÓN 292 Os resultados obtidos no presente traballo en canto á calidade das estimacións NIRS dos parámetros químicos das mostras de forraxes frescas mostraron valores comparábeis aos referidos na bibliografía, toda vez que as ecuacións NIRS de estimación de PB, FND, FAD, CSA e ALM mostraron valores de 𝑅𝑃𝐷>3, mentres que a ecuación para a predición de MO mostrou un valor de 𝑅𝑃𝐷 entre 2,0 e 2,5. En cambio para o conxunto de mostras de ensilaxes, a calidade das ecuacións NIRS para a predición da composición química foi netamente inferior á observada para o conxunto de mostras frescas, toda vez que unicamente para os contidos en MO, FAD e ALM os valores de 𝑅𝑃𝐷 das ecuacións estiveron no intervalo entre 2,0-2,5, sendo inferiores a 2,0 para PB e FND, o cal se atribúe a que na colección de mostras utilizadas no proceso de validación externa existía variabilidade que non estaba adecuadamente representada no conxunto de calibración. A maior precisión da estimación do contido en PB por NIRS está amplamente referenciada na bibliografía, como se fixo notar noutros apartados do presente traballo. En estudos cun grupo restrinxido de especies se reportan valores de 𝑅𝑃𝐷 de 1,8 e 2,2 nas ecuacións NIRS elaboradas para cereais (Deaville et al., 2009; Stubbs et al., 2010), de 5,0 para fenos de cebada (Durmic et al., 2010) e de 7,1 para alfalfa (Hsu et al., 2000). Noutros estudos con máis de 5 especies de polo menos dúas familias, o 𝑅𝑃𝐷 para PB era máis alto, chegando a 6,6 no traballo de Andueza et al. (2011) con pastos de zonas temperadas de Francia e a 10,3 no de Lobos et al. (2013) con pastos de Chile. Os resultados obtidos con pastos australianos de Norman et al. (2020) concordan cos de Andueza et al. (2011), que indican que cando se incrementa a diversidade da colección de mostras se aumenta a capacidade preditiva do contido en PB. Da mesma forma, para a estimación da concentración de FND e FAD, se reportan na literatura valores de 𝑅𝑃𝐷 de 3,5 e 3,4 (Hsu et al., 2000; Stubbs et al., 2010) e de 4,5 (Parrini et al., 2018). Algúns traballos como o de Abrams et al. (1987) indican que para a estimación de FND os modelos desenvolvidos para especies concretas adoitan mellorar a calidade da predición, advertindo que no caso de mostras de leguminosas perennes estas mostran consistentemente unha maior variación nos valores de referencia do laboratorio que as leguminosas anuais ou as mostras de gramíneas. Outros traballos mencionaron os problemas na determinación da FND en mostras con alto contido en amidón, proteína ou material mucilaxinoso como é o caso dalgunhas leguminosas perennes (Goering e Van Soest, 1970; McRoberts e Cherney, 2014). Os resultados obtidos no presente traballo mostraron que os modelos de predición NIRS da composición química construídos para cada grupo particular de forraxes se mostraron polo xeral máis precisos que os elaborados sobre o conxunto xeral, DISCUSIÓN 293 tanto para o conxunto de mostras frescas e sobre todo para as forraxes ensiladas, corroborando as observacións da bibliografía. Da revisión dos traballos citados no apartado de revisión bibliográfica referidos á capacidade preditiva das ecuacións NIRS para estimar a dixestibilidade de diversos tipos de forraxes, na Táboa 94 se indican os valores medios dos estatísticos que definen a calidade das ecuacións. As ecuacións NIRS para a predición do valor de DMO in vivo ou de DMO in vitro polo método Tilley-Terry mostraron, de media, unha calidade aceptábel, con valores respectivos, en validación cruzada, para o coeficiente de determinación (1−𝑉𝑅) de 0,80 (rango de 0,38 a 0,95) e de 0,81 (rango de 0,60 a 0,98), para o erro estándar de predición (𝑆𝐸𝐶𝑉) de ±2,4% (rango 0,7 a 3,5) e de ±2,4% (rango 1,2 a 3,6) e para o 𝑅𝑃𝐷ve de 2,4 (rango de 1,3 a 2,6) e de 2,5 (rango de 1,5 a 5,3). Os resultados obtidos no presente traballo en canto ao comportamento preditivo das ecuacións NIRS para a estimación do valor de DMO das coleccións de forraxes frescas, por un lado, e as de forraxes ensilados, por outro, se sitúan dentro dos intervalos citados na bibliografía, con respectivos valores do coeficiente de determinación en validación cruzada (1 − 𝑉𝑅) de 0,91 e de 0,75, mentres que o erro estándar de predición 𝑆𝐸𝐶𝑉 e o estatístico 𝑅𝑃𝐷 eran de ±2,1% e 3,2 para a ecuación de predición de DMO de forraxes frescas e de ±2,9% e 2,0 para a de forraxes ensiladas. Táboa 94.- Calidade das ecuacións NIRS para a predición da dixestibilidade de forraxes diferentes, en estado fresco e conservados, procedentes dos traballos de diversos autores Parámetro n 𝑹 2 𝑺𝑬𝑪𝑽 𝒓 2 𝑺𝑬𝑷 𝑹𝑷𝑫 DMO Tilley-Terry 10 0,81 2,4 0,74 2,6 2,6 DMO in vivo 12 0,80 2,4 0,85 2,3 2,4 DFND in vivo 3 0,49 3,8 - - 1,7 n: número de estudos; R2: coeficiente de determinación do modelo de calibración; SECV: erro estándar de validación cruzada; r2: coeficiente de determinación en validación externa; SEP: erro estándar de predición; RPD: ratio entre a desviación estándar e o erro de predición en validación externa Como indican Alomar e Fuchslocher (1997), citando a Reeves III (1994), as ecuacións de calibración tenden a ter un mellor valor preditivo cando se desenvolven sobre mostras de natureza relativamente homoxénea ou correspondentes a un mesmo tipo de produto, tendendo a diminuír a precisión e a exactitude cando as calibracións se desenvolven sobre conxuntos heteroxéneos. Shenk (1989) demostrou que as ecuacións derivadas de especies ou forraxeiras concretas non proporcionaban resultados suficientemente precisos cando se aplicaban sobre outras especies diferentes, pero que ecuacións universais contendo tódalas fontes de variación DISCUSIÓN 294 mostraban un aceptábel nível de exactitude e precisión cando se aplicaban sobre mostras independentes, o cal concorda cos resultados dos diversos traballos discutidos anteriormente neste apartado. Algúns traballos evidencian a utilidade de calibracións NIRS realizadas sobre coleccións diversas para a creación de ecuacións robustas, de uso xeral, obtendo unha exactitude comparábel á de ecuacións máis locais. Por exemplo, Norris et al. (1976) desenvolveron calibracións NIRS para estimar a composición química e valor nutricional dunha colección de forraxes frescos e conservados de diversas especies, podendo explicar entre o 92 e o 98% da varianza da concentración de PB e fraccións da fibra na MS e un 77% da varianza da dixestibilidade das mostras. A validación externa das ecuacións mostraron un erro de predición de ±0,91% para PB, de ±3,1% para FND e de ±5,1% para DMO, sendo demostrada a utilidade da tecnoloxía NIRS para o seu uso na avaliación rápida da calidade nutricional das forraxes mediante ecuacións de uso xeral. Coincidindo con estes resultados, Reeves (1988a,b) desenvolveu ecuacións NIRS para estimar a composición química e a dixestibilidade a partir dunha colección de 67 mostras de forraxes (alfalfa, varias gramíneas e a fracción vexetativa de plantas de millo e de trigo) reportando resultados satisfactorios para a predición mediante NIRS de FAD e FND, con valores de 𝑅2 superiores a 0,94 para o conxunto de validación. Nun recente traballo, Norman et al. (2020) investigaron a posibilidade de desenvolver calibracións NIRS para predicir o valor nutricional da maioría das forraxes que se utilizan na alimentación de ruminantes domésticos en Australia. A partir dunha selección de 1086 mostras elixidas en base á súa variabilidade espectral dunha colección máis ampla de máis de 4 mil mostras procedentes de forraxes diversas, o comportamento preditivo das ecuacións NIRS en validación cruzada foi excelente ou boa para a predición de PB, FAD, FND con valores, respectivamente, de 𝑅𝑃𝐷 de 6,6, 4,3 e 4,8 e de 𝑆𝐸𝐶𝑉 de ±1,1, ±2,1 e ±3,5 %MS e ±2,6%, así como para a de DMS (𝑅𝑃𝐷= 4,0 e 𝑆𝐸𝐶𝑉= ±2,6%), mentres que a estimación da concentración de MO foi algo menos precisa (𝑅𝑃𝐷= 3,2 e 𝑆𝐸𝐶𝑉= ±1,5%), observando que cando se desenvolvían modelos de predición por distintos grupos taxonómicos non se melloraba a calidade das predicións. Sen embargo, cando se trata de desenvolver calibracións universais NIRS para estimar a composición e dixestibilidade dunha ampla mostra de forraxes frescas e conservadas, os resultados non son polo xeral satisfactorios. Reeves et al. (1989) desenvolveron ecuacións NIRS para estimar o valor nutricional dun conxunto de 120 ensilaxes de alfalfa e de planta enteira de millo indicando que para o conxunto das ensilaxes, a porcentaxe de varianza DISCUSIÓN 301 coeficiente de determinación en validación externa, próximo a 0,90, o erro de predición 𝑆𝐸𝑃 ±2,3% e o valor de 𝑅𝑃𝐷ve, próximo a 3,0 permitirían unha predición cuantitativa fiábel seguido os criterios de Saeys et al. (2005) e de Williams (2014). Por outra parte, cando se compara a capacidade preditiva de NIRS para a estimación do valor de DMO da colección de pastos coa dos mellores modelos empíricos baseados na composición química das mostras, se observa unha clara superioridade da técnica NIRS. Os valores do coeficiente de determinación en validación cruzada e externa para o mellor modelo empírico (1−𝑉𝑅= 0,71 e 𝑟2= 0,69) son inferiores aos da ecuación NIRS (1−𝑉𝑅= 0,91 e 𝑟2= 0,88) e os erros de predición de DMO da ecuación química (𝑆𝐸𝐶𝑉= ±3,5% e 𝑆𝐸𝑃= ±3,6%) son máis elevados que os da ecuación NIRS (𝑆𝐸𝐶𝑉= ±2,0% e 𝑆𝐸𝑃= ±2,3%). A aplicación da metodoloxía NIRS permitiu, por tanto, a redución do erro de predición externa da DMO en 1,3 unidades respecto do erro cometido pola mellor das ecuacións empíricas, obtendo unha redución do 36% no erro de predición da DMO cando as ecuacións se aplican a un conxunto de mostras independentes. Os resultados obtidos no presente traballo se comparan favorabelmente cos reportados por diversos autores na bibliografía, tanto na estimación dos diferentes parámetros de composición química como do valor de DMO, sobre todo cando as ecuacións NIRS se obteñen a partir de colección cun alto número de mostras. Como resumo dos resultados obtidos por diversos autores que estudaron a capacidade preditiva das ecuacións NIRS para estimar a composición química de pastos frescos que se expuxeron no apartado de revisión bibliográfica, se observa unha excelente calidade das ecuacións para a estimación dos contidos en proteína, fibra e carbohidratos non estruturais, e mediocre para o contido en materia orgánica, con valores medios do coeficiente de determinación en calibración 𝑅2 superiores a 0,90 e do estatístico 𝑅𝑃𝐷 en validación cruzada ou externa superiores a 3,0 para as ecuacións de predición de PB, FND, FAD e CSA, e valores de 𝑅2= 0,83 e 𝑅𝑃𝐷= 1,8 para o contido en CZ, todos eles coincidentes co observado no presente traballo. Da mesma forma, a revisión dos resultados mostrados na Táboa 18 para os traballos dos diferentes autores que estudaron a capacidade preditiva de NIRS para estimar a DMO de mostras de pastos frescos se observa unha calidade aceptábel das ecuacións NIRS, con valores medios do coeficiente de determinación 𝑅2 de 0,91 e, en validación cruzada ou externa, valores do erro de predición de ±2,4% e de 𝑅𝑃𝐷 de 2,7, sendo lixeiramente mellores os obtidos no presente traballo (𝑅2= 0,92; 𝑆𝐸𝐶𝑉= ±2,0%; 𝑆𝐸𝑃= ±2,3% e 𝑅𝑃𝐷= 3,3 ou 2,8). [Document text truncated for crawler view.]