Oxaciclos inspirados en productos naturales: versatilidad químico-farmacológica

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Anónimo. Por eso, la llegada a este puerto sólo ha sido posible gracias a la maravillosa tripulación que me ha ayudado a gobernar mi barco, mientras navegaba por el temido Poseidón, capeando temporales y disfrutando de los días soleados. Y es que yo nací en una burbuja y viví en mi mundo de cristal… A toda mi tripulación… A los profesores Eugenio Uriarte y Lourdes Santana, o como siento que debo llamarlos, a Eugenio y Lourdillas, o al “jefe” y a la “jefa”, por abrirme las puertas no sólo de su laboratorio, sino también de su amistad. A Eugenio por las mil y una horas “discutiendo, debatiendo, arreglando y destruyendo” este país (y suma y sigue), por su espíritu siempre deportivo, por su vitalidad y energía constante, por su capacidad para visualizar la “U.M.P.”, y por animarme siempre a volar. A Lourdillas, por las incalculables horas de conversación, hablando de lo divino y lo humano, por su insaciable espíritu aventurero de Willy Fog que comparto hasta las entrañas, por el apoyo y ánimo en los momentos duros, por ese carácter único y por ser la reina del “Scifinder” que de tantos apuros nos ha sacado!. A los dos, porque juntos formáis un gran equipo. A vosotros, Papá y Mamá, que lo sois TODO para mí. Por haberme dado la vida, en más de una ocasión... Por estar a mi lado en los momentos más difíciles, sufriendo conmigo pero manteniendo siempre el barco a flote, y por disfrutar de mis éxitos como si fuesen los vuestros. Porque sin vosotros NADA de lo que soy y seré, sería posible. Porque me habéis dado siempre más de lo que necesitaba e incluso de lo que podíais, anteponiendo siempre a “la nena” antes que a vosotros mismos. Porque vosotros sí que formáis el mejor equipo que conozco… A ti, Mamá, por haberme dado siempre las fuerzas que en muchos momentos me han faltado, por demostrarme con hechos el significado de la palabra “valiente”, por luchar como nadie día a día con el único fin de ver una sonrisa en la cara de los tuyos y por la generosidad y el altruismo infinito que demuestras en todos los aspectos de la vida. A ti, Papá, por haberme levantado del suelo con garra y decisión, por enseñarme a descubrir no sólo lo mejor de las personas siempre, sino también “el lado bueno de las cosas”; por tener siempre presente que todo es “cuestión de principios”, por hacerme ver qué es lo importante y por inculcarme los mejores valores que existen. Por tu capacidad de diálogo y análisis, acompañada siempre del amor infinito que me transmites constantemente y por ii haberme dedicado tantas y tantas horas, aguantando mis “al borde del abismo”… A los dos, porque siempre trabajáis de la mano y porque es imposible que existan padres que se entreguen más a sus hijos que vosotros. A mi hermano Marcos, que desde que tengo uso de razón ha sido un referente personal y profesional. Gracias a él he aprendido a vivir y disfrutar de una de las cosas que siempre hace que todos los males desaparezcan: el mar. Por su capacidad indestructible para escalar paredes como las de “El Capitán”, y franquear los obstáculos más difíciles con arte y pericia. Por los sueños, inquietudes y experiencias compartidas; por la determinación que presenta a la hora de tomar decisiones, y porque me demuestra siempre que el que quiere puede. “Do or do not, there is no try” A mis abuelos (en memoria) Mercedes, Rafael, Alicia y Pepe. Ellos han sido siempre, sin saberlo, el motor de que me haya sumergido en esta aventura. Porque lo han dado todo, literalmente, por un futuro mejor para nosotros. A mi pilar número dos: “Villachunguita” a.k.a. Laura, Reyes y Ana. A todas ellas como uno, porque cuando estamos juntas funcionamos como tal. Por todas las vivencias compartidas (las que se pueden contar y las que no!). Por los viajes, la “calceta”, las mañanas, tardes y noches y por el “al matadero con castañuelas!”. Por las “broncas”, los consejos, los llantos y las risas, las merecidas y las irracionales. Porque sin duda alguna, ellas han sufrido conmigo no sólo este viaje rumbo a todavía no sé dónde, sino todas mis idas y venidas a todos los niveles, estando SIEMPRE al pie del cañón. Por ver, escuchar y sentir conmigo. Por SER y ESTAR. A Laura por transmitirme su fuerza para superar hasta el mayor de los obstáculos, siempre con una sonrisa. A Reyes por su capacidad para “desnudar mis entrañas” sin necesidad de contarlas y por ser la gestora de mis sentimientos. A Ana por su vitalidad y predisposición constante para tender la mano y enseñarme el significado de “yonqui de la felicidad”. A Villachunguita por darme lo que necesito, por estar siempre a mi lado, y por enseñarme y demostrarme cada día que son únicas. A mis tíos Tito, Luchi, Fernando, Fernanda, Nena, Pili y, Tante y Abdón (en memoria). Unas palabras especiales se merecen Tito y Luchi, por ser mis segundos padres desde que tengo uso de razón, y por tratarme como una hija en todos los aspectos. A Marina y Jose, que ellos saben que para mí son también mi familia, por preocuparse por cada uno de mis pasos, seguirlos de cerca, y haber hecho que sacase mi espíritu “revolucionario”. A mis primos Hugo, Jorge y Adri, porque han hecho posible que viviese la infancia más feliz que un niño puede desear. Por compartir ilusiones, preocupaciones y sueños, y por descubrir juntos el significado de la palabra “crecer”. iii A mis frikímicos Lucía, Dani, Diego, Iria, Lara, Olalla y Ainara, por compartir no sólo las aulas, sino también la vida del día a día durante la carrera, y grandes responsables de que la universidad haya pasado por mí, y no yo por ella. A Ainara por su predisposición para “la rampa”. A Olalla por su sentido del humor y su buena voluntad para la amistad a pesar de “las piedras del camino”. A Lara por compartir las inquietudes y preocupaciones científicas y seguir de cerca mi camino durante el doctorado estando siempre “ahí”. A Diego por estar siempre dispuesto a compartir cualquier instante, con un buen “danone”. A Iria por transmitirme su ilusión por las pequeñas cosas, y por ser la bondad en persona. A Dani por compartir lo que con pocos he compartido. Y a Lucía, mi cuca, por estar SIEMPRE a mi lado de forma incondicional, con razón o sin ella, proporcionándome la calma (o la euforia!) en el momento oportuno. A la mafia del 5ºC, mis otras compañeras de batallas universitarias, Adri “Spunyyyyy”, Marta, Cris, y Elena, por compartir altruistamente una de las mejores etapas de mi vida y formar parte de historias inolvidables grabadas a fuego. “¡¿Quiénme-ha-robado-la-mochilaaaaaa?!”. A Marta (de la Toweeeeerrr!!), por ser la compañía y amiga perfecta en nuestros “zulos”. A “Juanchu”, por su cariño infinito, las conversaciones hasta altas horas de la madrugada (chilena o española), y por las cañas que se van de las manos. Gracias por aparecer. A los niños de Santiago Jano, Nacho, Juli, Fraga, Rilo y Rebo. Unas palabras en especial para Fraga, por compartir inquietudes y parte de nuestra vida en el “exilio” en Newcastle. Y por supuesto, a Jano, por todo lo que él ya sabe… A los limensianos en general como “clan”, ya sea el de los mayores, los medianos, o los pequeños de una saga que encierra mucho más que la pasión por el mar y un rincón especial que representa mi pequeño paraíso ( 42º15’ N, 8º48’ O). Sois tantos que espero que os deis todos por aludidos! Pero en especial a todos aquellos que comparten las eternas noches de verano alrededor de una hoguera de “piñas con sal” o un “baño”, desafiando ciclogénesis explosivas, temperaturas extremas y “chuzos como pelotas”. Porque la alianza de Eolo y Poseidón es el mejor matrimonio para nosotros. Un huequecito especial tienen: Víctor, el Gurú, porque fue el primero que me metió en el agua cuando era una enana, entre una jauría de machos alpha dominantes, y me puso encima de una tabla, tratándome siempre como la “protegida” pero “dándome caña”. A Iaguiño, Nanus y Ra, por las charlas y delirios compartidos en tantas y tantas noches de verano. A Laura, Carmen, Erea y Sara, por las incalculables horas viendo más allá, por los bautizos de “Charlie” y de “Harry”, y porque siempre están en el paraíso. A los hermanos Rivas, Alex y Du, por sus ideas, inventos y esa iv actitud incansable de revolucionar el mundo. A Alex “2”, quién en cierto modo me ha inculcado el espíritu insaciable de recorrer mundo. A Gus, por ser amigo en momentos clave. A los hermanos Montouto Escudeiro (y familia), en especial a Samu, por enseñarme, soportarme y compartir momentos inolvidables; y a Dieguito “Cu”, porque pasó de ser “el enano”, a ser amigo, confidente y compañero de batallas varias, en mayúsculas. A la familia Ortega Villalón, por el apoyo y cariño transmitido a lo largo de los años, en especial, a Lúa, por su amistad de tantos y tantos años que tanto me ha aportado. A mis compañeros de laboratorio: Al equipo Sardo de Silvia, Giulio y Ricci, que ha estado al pie del cañón (“aquí no duerme ni dios!”). A Javi, Dolo, Santi, Chachi, Edu, André y Tati, por soportarme día a día entre reactivos y disolventes y mantenerse con una sonrisa ante mis altos y bajos. Un rincón especial me lo reservo para Elías, que supo entenderme desde el minuto dos (en el minuto uno todavía tenía dudas de si mordías…!!!) y para María, por ser amiga y compañera de viajes, por apoyarme y escucharme entre cafés y congresos, y porque desde luego, sin duda alguna, esta Tesis no habría sido posible sin su ayuda. GRACIAS. A Xosé, por tener ese carisma entrañable y la predisposición indiscutible para echar una mano en cualquier cosa y en cualquier momento. Una mención se merecen los “niños” que han pasado por nuestro laboratorio: Pablo, Andrea (Dr. Bucci), Miguel, Veronika, Carla, Mannuel, Jose, João, Francesco, Nicolo, María, Andrea, Rita y Gabriel, que de algún modo han contribuido al desarrollo de este trabajo, o al menos, a hacerlo mucho más ameno. A todos aquellos profesores e investigadores que han empleado un poco de su tiempo en transmitirme tanto los conocimientos, como la pasión y motivación por esta especie en peligro de extinción que es la ciencia. A Roger Griffin, Ian Hardcastle y Bernard Golding, de la University of Newcastle upon-Tyne, por iniciarme en este mundo. A Antonio Figueras y Beatriz Novoa, del Instituto de Investigaciones MarinasCSIC de Vigo por acogerme y sumergirme entre peces y PCRs. A Marcus Tius, de la University of Hawai’i at Manoa, por abrirme las puertas de su grupo durante mi estancia y enseñarme los secretos de la química sintética. A los profesores e investigadores que han contribuido de forma activa al desarrollo de esta tesis gracias a su incesante colaboración, especialmente a Fernanda Borges de la Universidade do Porto, Karl-Norbert Klotz de la Universität Wurzbürg, Claudio Olea-Azar de la Universidad de Chile, Giovanna Delogu de la Università degli Studi di Cagliari y a Dolores Viña, Ángeles Muñoz e Ysabel Santos, de la Universidad de Santiago de Compostela. v A la tripulación del IIM-CSIC: Ana Mato, Iván, Pep, Sonia, Laura, Ariana, Rubén, Jorge y María, quienes me han mostrado de cerca el maravilloso mundo de la inmunología y la genómica de organismos marinos. Una mención especial se merece Marimar, quién se preocupó y me enseñó todo lo que sé a nivel científico de la genética de “peixes e bivalvos” con una paciencia infinita a la par que un cariño muy típico del “Morrazo”. A la compañía insaciable de Villachunguita: Mago (villachunguito… con lo que eso implica! jeje), Laura Barrera, Jaime, Cris, Nanes, Flo, Sabela y Rubi, por las cenas que se van de las manos, las fiestas temáticas, las churrascadas y picnics contra viento y marea, y por compartir su alegría. A los “bomberitos” Mario Richards “rock star”, porque aunque no lo crea, sé que está ahí (pero paga tus deudas con “Globetrotter”!) y a David “cuñaaaaaoooo”, porque sin quererlo, pasó de ser “el de Laura”, a ser un amigo. A Amelia “gunilla” por los “saraos”, el “von biiiiisssssssmmmaaarrrkkk!”, las charlas, el cariño y los “buboletos” hechos con tanto amor!. Ya sabes que eres de la Jet Set! A los vecinos, y casi familia, Fuji, Nanda, Pili y Sergio, que me han visto crecer. A los “niños” de Hispanidad, Álvaro “chiquipulpi”, Zapa, Carmen, María Porto, Sonia y Marina, porque me acogieron como una más en una etapa de transición. Al verdadero Team T, el gran descubrimiento de la última temporada, que apareció en un momento crítico y me inyectó una dosis peligrosa de “ganas de comerme el mundo”. A Evelyn, por su apoyo constante, por su capacidad de análisis y por esa inocencia y corazón infinito que mezclada con su afán de superación la hacen única. A Fer, por ser “una mente maravillosa” y transmitir la calma y sosiego a cualquier persona que esté a menos de dos metros de él. Y a Diego, por el cariño, el apoyo y la preocupación incesantes, por las “bombas” que siempre sacan una sonrisa, y por las confidencias compartidas (“nos vemos en las trincheras de Vietnam…que quiero saber a qué huele el Napalm…”). To my Ohana “always Alo)(a spirit”: Philip, Peter, Anais, Sandra, Félix, Lucho, Daniela, Paviça, Patrick, Florian, Silvia “italian”, Silvia “swiss”, Johannes, Marcelo, Charito and Bruno “Abuelo”. Special thanks to Johannes, for taking care of the friendship even from the distance and who always tries harder to set a reunion. To Philip, because he was a key support every time I was in Hawai’i. To “Abueeeelooooo”, because of all the shooting stars we dreamt of. To Anais, for being my “training leader” during my PhD stay in Hawai’i, but overall, for her friendship. To Patrick, because he appeared at the right time and at the right moment and he showed me the magnificent world of the “alternative music”.  En la presente Memoria se describe una selección del trabajo realizado de diseño, síntesis y estudio preliminar de compuestos oxacíclicos con interés farmacológico inspirados en productos naturales. De la amplia quimioteca preparada, se presenta más en detalle los resultados de aquellos compuestos que hasta el momento han sido publicados o están en fase de publicación. La mayoría de los compuestos presentados son híbridos con núcleo cumarínico sobre el cual se incorpora el esqueleto de estilbeno o de chalcona en 3 y 8 de la cumarina, o bien con modificaciones en los anillos aromáticos de los mismos. Se presentan también metodologías sintéticas para la preparación de derivados de la rocaglamida. Respecto de los híbridos cumarina-chalcona, se presentan 4 series principales de compuestos sintetizados, en las que se han realizado modificaciones sencillas como la introducción de sustituyentes de distinta naturaleza, en distinto número y en diferentes posiciones de modo que nos fuese posible obtener una relación estructura-actividad para cada serie y para cada diana estudiada. Las metodologías y rutas sintéticas empleadas han sido seleccionadas de manera que nos permitiesen acceder a las estructuras diseñadas de la forma más sencilla, eficiente, directa y versátil posible en la cantidad y con la pureza necesaria para la realización de los estudios estructurales y biológicos. Hasta el presente, fueron realizados estudios preliminares de series seleccionadas de los compuestos sintetizados como inhibidores enzimáticos (MAO-A y MAO-B), ligandos de receptores de adenosina, antioxidantes, antiparasitarios y antibacterianos. # In the present dissertation a selection of works on the design, synthesis and preliminary studies of oxacyclic compounds with pharmacological interest inspired in natural products is described. From the extended prepared compound library, more in detail results are presented for those compounds that have been published so far or are in publication process. Most of the compounds presented are hybrid compounds with a coumarinic nucleus, in which the stilbene or chalcone scaffolds are incorporated in positions 3 or 8 of the coumarin. Synthetic methodologies for the preparation of rocaglamide derivatives are also presented. Four main series of synthesized coumarinchalcone compounds are shown, each of them having undergone simple modifications such as the introduction of substituents of different nature, in different number and positions. Those modifications made possible to establish structure-activity relationships for each series and for each studied target. The methodologies and the synthetic routes employed have been selected in order to access to the designed structures in the most simple, efficient, versatile and direct way, in the amount and with the purity required to carry out the biological studies. To date, preliminary studies on selected series of the synthesized compounds were carried out as enzymatic inhibitors (MAO-A and MAO-B), adenosine receptors ligands, as antioxidants, as antiparasitic and as antibacterial agents. Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez   Relación de abreviaturas 1 1 Introducción 3 3 Antecedentes y Objetivos 4 49 Resultados y discusión 5 57 Parte Experimental 9 93 Conclusiones 2 289 Bibliografía 2 293  Relación de Abreviaturas 1  !0%(+(%*!/0!./  !!,0+.!/ ! 6% + αC)%*+CNC$% .+3%CPC)!0%(C %/+35+(,.+,%;*%+  !!,0+. ! !*+/%*  7(1(/!* +0!(%(!/ !+.0+2%* -/ !0/!.!0/L  7(1(/ !+2.%+ !$6)/0!.$%*+  +),1!/0+(8 !.  +!*5%)  % + !/+3%..%+*1(!%+  *"!.)!   !(5$!%)!.  +)%*%;* +/%/"%&  % +γC)%*+108.%+  !!,0+.+,( +,.+0!8*  %.1/ !(%*)1*+ !"%%!*%$1)*  %#$!."+.)*!%-1% $.+)0+#.,$4 0. +*!*0.%;* ! +),1!/0+@ -1! %* 1! 1* .! 1%;* !(.!%)%!*0+!(1(. !(PKS  +*+)%*++3% /  /,!0.+/+,8 !)//  %#* +/ %.%#% +/)1(0%C %*/  !/+**%#*70%1(!.  ,%   !/+.%;* !. %(!/+38#!*+  !*%((*%*)+*%+(%/  !(%;*!/0.101.C0%2%  1*0%00%2  /,!%!/. %(.%/ !+38#!*+  !(%;*!/0.101.C0%2%   ",, !),!.01.)%!*0!  1(0.2%+(!0  1   Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 3 '  1. Productos naturales y desarrollo de fármacos 5 5 2. Las Cumarinas 9 9 2.1. Origen de las cumarinas 9 9 2.2. Biosíntesis de cumarinas 1 11 2.3. Síntesis de cumarinas 1 13 2.4. Actividad biológica de las cumarinas 2 20 3. Las Chalconas 2 25 3.1. Origen de las chalconas 2 25 3.2. Biosíntesis de chalconas 2 26 3.3. Síntesis de cumarinas 2 28 3.4. Actividad biológica de las chalconas 3 30 4. Los Estilbenos 3 36 5. La Rocaglamida 3 38 6. Farmacomodulación 4 42 6.1. Hibridación molecular y terapia multi-diana 4 42 6.2. Bioisosterismos 4 44 6.3. Vinilogía 4 46 3 Introducción 2. Las Cumarinas 10 Además del aislamiento de cumarinas procedentes de cientos de especies de plantas y otros microorganismos, cabe destacar los derivados de origen sintético, que aumentan significativamente el número de estructuras de cumarina conocidos hasta hoy,14 así como la complejidad de las mismas.15 La diversidad estructural de los compuestos derivados de las cumarinas permite su clasificación en cumarinas simples, furocumarinas, piranocumarinas, biscumarinas, cumarinolignanos, triscumarinas, etc. (Figura 4). Figura 4. Cumarina, como núcleo central para la obtención de derivados de interés farmacológico Además, las cumarinas simples más importantes, pueden ser divididas a su vez en función de sus sustituyentes más característicos (Figura 5). 16 Según el tipo de sustituyentes que posean dichas cumarinas, la finalidad para la que pueden ser utilizadas varía: aditivos alimentarios, perfumes, cosméticos, productos agroquímicos o fármacos, entre otros.17 O OOOO O OO OO OO c f g h n O AngelicinasPsoralenos n = 0 n = 1 O O Piranocumarinas (c-h) O W O H N O Furocumarinas O OH O R O R O R O Azucar 4-Hidroxicumarinas 3-amidocumarinas 10 Introducción 2. Las cumarinas 11 Figura 5. Cumarina, como núcleo central para la obtención de cumarinas simples Teniendo en cuenta el avance tecnológico que ha permitido facilitar la determinación de estructuras químicas, uno se ve obligado a preguntarse cuál es el factor que despierta interés en los compuestos de esta familia. Entre varios que podrían ser enumerados, se hará hincapié en uno, que sin duda es de gran importancia: la diversidad de actividades biológicas que estos compuestos exhiben. Prácticamente desde el inicio del estudio de las cumarinas, la atención de su investigación se centró en la posibilidad de su actividad terapéutica.18 2.2 Biosíntesis de cumarinas La biosíntesis de las cumarinas empieza con la L-fenilalanina como precursor en plantas como la Melilotus alba, (Figura 6), conocida coloquialmente como trébol de olor. La L-fenilalanina es convertida en ácido trans-cinámico mediante la acción de la fenilalanina amonioliasa (PAL, de sus siglas en inglés), y posteriormente convertida a ácido orto-cumárico mediante la acción de la ácido cinámico orto-hidroxilasa. La orto hidroxilación de ácidos cinámicos es un paso crucial para la formación de cumarinas. Los ácido orto-cinámicos sufren posteriormente un cambio de la configuración de la cadena lateral, transformándose del isómero trans, al isómero cis, menos estable. O O cumarina O O O O O O O O O O O O O O O O (R)O OH COR R X HS O 2 N Tiocumarinas Alcoxi/hidroxicumarinas Formil y carboxicumarinas arilcumarinas alquilcumarinas halocumarinas nitrocumarinas 11 Introducción 2. Las Cumarinas 12 Figura 6 .Biosíntesis de cumarinas simples encontradas en plantas. Mientras que la isomerización cis/trans sería desfavorable en el caso de un solo doble enlace aislado, en el caso de los ácidos cinámicos el sistema altamente conjugado permite que este proceso ocurra fácilmente, y que la radiación ultravioleta, como por ejemplo la luz del sol, sea suficiente para producir mezclas en equilibrio. Por último, tiene lugar una lactonización, que da lugar a el esqueleto final de cumarina. Tanto la isomerización cis/trans, como la lactonización, son procesos que en la naturaleza están mediados por enzimas, y la luz no es necesaria para la biosíntesis de las cumarinas. Aunque el ácido cinámico sirve como precursor directo de la propia cumarina, la mayoría del resto de las cumarinas simples derivan del ácido paracumárico y de la umbeliferona. Los grupos hidroxilo adicionales presentes en otras cumarinas se suelen añadir a la molécula una vez que el núcleo de la cumarina haya sido construido. A pesar de que la cumarina en sí se encuentra en plantas como la anteriormente mencionada Melilotus alba o trébol de olor, hay evidencias de que las plantas realmente contienen los glucósidos de el trans y cis ácido orto-cumárico, y que la cumarina sólo se libera como resultado de una hidrólisis enzimática y lactonización mediante el daño del tejido de la planta durante los procesos de cosecha. O 2 C NH 3 L-fenilalanina CO 2 H ácido trans-cinámico CO 2 H OH PAL o-hidroxilasa ácido trans-orto-cumárico CO 2 H OH O O cumarina CO 2 H HO ácido para-cumárico CO 2 H HO OH CO 2 H OHHO O OHO umbeliferona O O HO HO esculetina O OHO MeO escopoletina ácido cis-orto-cumárico o-hidroxilasa isomerización cis/trans lactonización lactonización 12 Introducción 2. Las cumarinas 13 2.3. Síntesis de cumarinas Por otra parte, la síntesis de cumarinas y de sus derivados es un área de gran y permanente interés por el gran número de compuestos de esta familia y el amplio espectro de actividades biológicas que presentan. En otros casos, el esqueleto cumarínico es utilizado como intermedio en la síntesis de compuestos más complejos19 tales como piranocumarinas,20 furocumarinas o 2-acil-resorcinoles.21,22 Si estudiamos los procedimientos sintéticos para la preparación de cumarinas, nos encontramos con una amplia variedad de reacciones clásicas que permiten obtener el núcleo cumarínico.23,24 Entre estos procedimientos clásicos, destacan las reacciones de Perkin, 25 Pechman 26 o Knoevenagel, 27 aunque otros procedimientos como la reacción de Wittig, 28 Kostanechi-Robisnson o Reformatsky 29 han sido también convenientemente aplicados para la síntesis de estos heterociclos (Figura 7). Sin embargo, es necesario adecuarlos a síntesis específicas y los rendimientos no siempre son satisfactorios,30 haciendo que el desarrollo de nuevos y fiables métodos de alto rendimiento para la síntesis de las cumarinas sea un tema importante. Entre estas reacciones clásicas, la que ha sido más utilizada es la reacción de Pechmann debido a la sencillez y disponibilidad de los materiales de partida, es decir, fenoles y β-cetoésteres en presencia de agentes ácidos, así como por los satisfactorios rendimientos obtenidos en ciertos casos.31,12 El uso de diversos reactivos, tales como H2SO4, P2O5, FeCl3, ZnCl2, POCl3, AlCl3, PPA, HCl, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, montmorillonita y otras arcillas está bien documentada en la literatura.32 13 Introducción 2. Las Cumarinas 14 F Figura 7. Reacciones clásicas para la síntesis de cumarinas. La reacción original de Pechmann se lleva a cabo a temperatura elevada. Como se emplean condiciones fuertemente ácidas, la reacción produce aguas residuales ácidas dañinas. Además, las condiciones severas implican limitaciones en los reactivos posibles o requieren la aplicación de los grupos protectores. Varias mejoras han sugerido el empleo de ácidos de Brönsted (libres, o con soporte sólido): HCl, HCl/CH3CO2H, HCl/CH3CH2OH, H3PO4,33 disoluciones acuosas de líquidos iónicos,34 resinas de intercambio iónico,35 así como ácidos de Lewis, tales como AlCl3, ZnCl233 o InCl3.36 A pesar de la importancia de las cumarinas y de la relevancia tecnológica de su producción, el mecanismo subyacente es poco conocido. Anteriormente se habían propuesto dos mecanismos diferentes para esta reacción33, 37 que han sido posteriormente adaptados aunque con ligeras modificaciones. O O R 4 R 3 R 5 R 6 R 7 R 8 O O O CHO OH R 4 O O O R 3 OH R 7 CHO OH RO OR O O CHO OH R Ph 3 PCHCO 2 Et R 4 O OH R 3 OR 3 O O OH R 4 O Br O O + + + + + + Pechmann Perkin Knoevenagel Wittig Kostanechi-Robinson Reformatsky 14 Introducción 2. Las cumarinas 15 F Figura 8. Mecanismo de la reacción de Pechmann propuesto por Robertson et al. El mecanismo propuesto por Robertson et al. (Figura 8) empieza por un ataque electrofílico por el grupo β-carbonílico del acetoacetato de etilo al anillo aromático. Ellos se apoyan en esta propuesta mediante el aislamiento del ácido cinámico como intermedio de reacción, y convierten los ácidos cinámicos en cumarinas.33,37 Recientemente, también ha sido observado otro intermedio (2,4-dihidroxi-etil-trans-βcinamato de metilo), apoyando esta secuencia.38 Por otro lado, la propuesta mecanística de Ahmed y Desai (Figura 9), tiene como característica la esterificación como primer paso, seguido por un ataque electrofílico para cerrar el anillo.33 Este mecanismo también tiene en cuenta la posible formación de la cromona como producto secundario, asumiendo que también puede tener lugar una migración de Fries después del paso de la esterificación. Ambas propuestas mecanísticas han sido afirmadas como “el mecanismo de la reacción” en la literatura. Algunos artículos se prefieren el mecanismo propuesto por Robertson,39 otros se han referido al mecanismo de Ahmed y Desai39,40,35,41 y otros mencionan y aceptan ambos.33,42 HO O O O RHO O O H HOH H HO H 2 O RHO O O O R HOH H H -H 2 O HO O O R HH HO H HO O O R O O O R H H OH 2 OR HO EtO H OH 2 OR O H OH 2 OR O HO -C 2 H 5 OH H H 2 O OR O 15 Introducción 2. Las Cumarinas 16 Figura 9. Mecanismo de la reacción de Pechmann propuesto por Ahmed y Dasai. Otra de las reacciones clásicas empleadas para la síntesis de cumarinas y que destacaremos en esta memoria por ser la metodología elegida para el desarrollo de gran parte de la misma, es la reacción de Knoevenagel. La reacción de condensación de Knoevenagel es una reacción clásica en química orgánica empleada para la formación de enlaces carbono-carbono. 43 El prototipo de la reacción de Knoevenagel44,45 es la condensación de un aldehído o una cetona con un éster malónico para generar un éster carboxílico α,β-insaturado. Sin embargo, el término de reacción de Knoevenagel también se utiliza para reacciones análogas en las que un aldehído o una cetona reaccionan con varios tipos de compuestos que poseen un metileno activado, y cuya reacción está mediada por una amina primaria o secundaria que actúa como catalizador en disolventes orgánicos. La reacción de Knoevenagel está considerada como una modificación de la reacción aldólica; la principal diferencia entre ambas aproximaciones es la elevada acidez del hidrógeno activo del metileno cuando se compara con un hidrógeno α-carbonílico.46 Para evitar que reacciones aldólicas compitan con la reacción de Knoevenagel, el aldehído empleado no debe tener protones en la posición α. Además, con el fin de O O O O R C 2 H 5 H H OH 2 O HO O O C 2 H 5 H OH 2 -C 2 H 5 OO O H H 2 O Migración Fries OO OH R R H HOH R OO O H R H H HO OO O H R HO H HOO R H H HO H -H 2 O OO R HOH HOO R HO OO O O RR 16 Introducción 2. Las cumarinas 17 mejorar los rendimientos de la reacción, en los últimos años se han desempeñado la reacción en microondas47,48 o empleado líquidos iónicos.49 Posteriormente a la primera descripción de la reacción de Knoevenagel, se introdujeron cambios en las condiciones de reacción y el los reactivos empleados. De este modo, cuando la base empleada es piridina con trazas de piperidina (en lugar de dietilamina) y el ácido malónico es el precursor del enolato, la reacción pasa a llamarse condensación de Doebner o modificación de Doebner.50,51 La reacción de Henry,52,53 también conocida como la reacción de Kamlet,54 es otra modificación de la condensación de Knoevenagel que utiliza compuestos con un α-nitro metileno activo, y por ello es frecuentemente llamada reacción nitro aldólica. Supone la condensación de nitrometano (u otro nitroalcano) con aldehídos o cetonas. Un resumen esquemático de la reacción de Knoevenagel y y las modificaciones de Doebner y Henry se representa en la Figura 10. Un amplio número de cumarinas han sido sintetizadas empleando esta metodología, como por ejemplo los ácidos 3-cumarincarboxílicos55,56 y amidas,57,58 amino y alquilamino cumarinas,48 3-acetil 59 y trifluoroacetil cumarinas, 60 3-ciano y azidocumarina, 61 aril y arilsulfonamido cumarinas, 62 , 63 éteres corona 3benzoilcumarinas64 y heterociclos puente unidos a cumarinas.65 Esta estrategia también se ha aplicado para la obtención de derivados de 4-hidroxicumarinas.66 Bodwell y colaboradores también han presentado la síntesis de 3-aminocumarinas de forma rápida y sencilla empleando la reacción de Knoevenagel. 67 Las cumarinas 3carboxamidas también has sido obtenidas mediante una reacción de condensación de tipo Knoevenagel, con o sin radiación de microondas.68,69 La reacción de Knoevenagel también se ha llevado a cabo con metilenos activados por heterociclos.70,71 Además, derivados C-glicosílicos de cumarina también han sido sintetizados mediante una reacción de condensación de Knoevenagel en una sola etapa.72 17 Introducción 2. Las Cumarinas 18 Figura 10. Esquema general de las reacciones de Knoevenagel, Doebner y Henry. Podemos encontrar en la bibliografía, propuestas de varias modificaciones del método que han tomado una gran importancia. Así, los ácidos 3-cumarincarboxílicos se pueden obtener con elevados rendimientos a partir de los correspondientes ortobenzaldehídos y ácidos de Meldrum. 73 La isofraxidina (7-hydroxy-6,8dimetoxicumarina), por ejemplo, una cumarina ampliamente conocida, ha sido obtenida mediante este rápido procedimiento sintético utilizando un derivado del siringaldehído y el ácido de Meldrum en presencia de ZnO. El ácido 3-cumarincarboxílico obtenido es posteriormente descarboxilado con cobre (Figura 11a).74 Otro proceso similar pero que emplea una metodología en fase sólida, y en la que el malonato de etilo unido a la resina de Wang y los orto-hidroxialdehídos se emplean como materiales de partida, permite obtener también 3-carboxicumarinas sustituidas, tras la descarboxilación térmica de los intermedios (Figura 11b).75,76 RO OR O O R 1 R 2 O HO OH O O R 1 R 2 O RO OR O O R 2 R 1 HO R 1 OR 2 R 3 NO 2 R 1 R 2 OR 2 R 1 R 3 O 2 N Reacción de Knoevenagel clásica Reacción de Doebner Reacción de Henry metileno activado (ésteres malónicos) ácido malónico α−nitroalcano cat. amina/base N -CO 2 cat. amina/base + + + 18 Introducción 2. Las cumarinas 19 Figura 11. Síntesis de ácidos 3-cumarincarboxílicos mediante a) ácido de Meldrum y b) resinas. Algunos procedimientos sintéticos también se basan en la ciclación directa de ácidos cinámicos propiamente sustituídos. Estos reactivos están disponibles comercialmente, o bien se obtienen por ciclación de Knoevenagel o mediante la ruptura del anillo de pirona de la cumarina correspondiente.77 La síntesis de nitrocumarinas,78 de 3-fenilcumarinas79 o de 6-acilcumarinas80 ha sido posible también empleando esta metodología. Respecto del mecanismo general de la reacción de Knoevenagel (Figura 12), el proceso comienza con la desprotonación del derivado malónico por la piperidina, generando el carbanión correspondiente, resonante con sus correspondientes enolatos. A continuación, se produce el ataque nucleófilo del carbanión sobre el carbono carbonílico del aldehído o cetona que da lugar a la formación de un nuevo enlace carbono-carbono, generando un intermedio que tras pasos de transferencia protónica con la base protonada generan un intermedio aldólico que sufre deshidratación para dar el compuesto final α,β-insaturado. OR 2 COR 1 R 1 , R 2 = H, Me OR 2 O O O O OO COOH OO RRRR ácido de Meldrum catalizador H + Cu a) CHO OH R 1 R 2 O O O O Resina piridina, piperidina 1) 2) TFA, CH 2 Cl 2 R 1 R 2 OO COOH b) 19 Introducción 3. Las Chalconas 26 Figura 19. Isómeros trans y cis del esqueleto básico de chalcona La presencia del dobles enlaces conjugados en las chalconas, así como la existencia de un sistema π-electrónico completamente deslocalizado en ambos anillos bencénicos, hace que estas moléculas suelan poseer bajos potenciales redox y una elevada probabilidad de que den lugar a reacciones de transferencia electrónica. Las chalconas de origen natural, así como sus análogos sintéticos, muestran un amplio espectro de actividades biológicas.118,119 Por esta razón, las chalconas se han convertido en objeto de interés continuo tanto en el mundo académico como en la industria. Se cree que el fragmento cetónico α,β-insaturado es probable que sea el responsable de muchas de las actividades biológicas observadas, ya que la eliminación de esta característica estructural resulta en la pérdida de bioactividad. Con este fragmento intacto, se han sintetizado nuevas moléculas derivadas realizando modificaciones en ambos anillos.120 3.2. Biosíntesis de chalconas Las chalconas actúan como precursores de un vasto número de derivados de flavonoides encontrados en todo el reino vegetal los cuales, en su mayoría, contienen un anillo heterocíclico de 6 miembros, que se forma a partir de ataques nucleófilos de tipo Michael por parte de un grupo fenol sobre la cetona insaturada, dando lugar a flavanonas. Como se muestra el la Figura 20, la biosíntesis de las chalconas empieza con la L-fenilalanina. A continuación, la condensación de la cinamoil-CoA derivada de la L-fenilalanina con tres moléculas de malonil-CoA catalizada por la chalcona sintetasa, O O trans-chalcona cis-chalcona A B AB 2' 3' 4' 5' 6' 2 3 4 5 6 2' 3' 4' 6' 5' 2 3 4 5 6 26 Introducción 3. Las chalconas 27 da lugar a la chalcona. La flavanona correspondiente es posteriormente sintetizada por la enzima chalcona isomerasa, que cataliza la reacción de forma estereoespecífica.121,122 Figura 20. Ruta biosintética general de las chalconas El continuo y exhaustivo estudio de las distintas rutas biosintéticas (en especial la del ácido shikímico y la del malonato) ha permitido explicar tanto la formación como muchas de las transformaciones metabólicas que experimentan estas moléculas. Se observó que en estos procesos, juegan un papel fundamental enzimas como la chalcona-sintetasa y la chalcona-isomerasa, que se encargan de la biosíntesis y de las trasformaciones biosintéticas de diversificación estructural que experimentan las chalconas naturales, y que conducen a diversos miembros de la familia de los flavonoides. (Figura 21) Figura 21. Núcleos estructurales de los principales grupos de flavonoides O2C NH3 S O CoA S OH O O CoA3 X chalcona sintetasa 3 CO 2 + 3 CoA-SH OO O S O CoA OOH OHHO CoA-SH chalcona O OOH HO flavanona L-fenilalanina chalcona isomerasa O O O FlavonasChalconas O O Flavonoles O O Flavanonas OH O O Auronas O Antocianinas O O Isoflavonas 27 Introducción 3. Las Chalconas 28 3.3. Síntesis de chalconas Desde el punto de vista preparativo, tradicionalmente las chalconas se obtienen mediante la condensación de Claisen-Schmidt en medio ácido o básico, que actúa como catalizador, bajo condiciones homogéneas.123,124 (Figura 22). A pesar de tratarse de una de las reacciones más clásicas de la química orgánica, destaca por su sencillez experimental y por su robustez, permitiendo la formación de forma eficiente del doble enlace carbono-carbono independientemente de la complejidad estructural de las moléculas a ensamblar. Figura 22. Reacción de Claisen-Schmidt para la síntesis de chalconas. Esta reacción ha sido ampliamente utilizada no solo para la preparación de chalconas, sino también para la síntesis de flavanonas, derivados del 1,3-diarilpropano y para la síntesis de una nueva familia de macrociclos, todas ellas en un único paso. En cuanto al mecanismo, la reacción de Claisen-Schmidt pertenece al grupo de las condensaciones aldólicas,125,126 transformaciones catalíticas que pueden transcurrir a través de dos mecanismos distintos. Dependiendo del tipo de catalizador que se emplee en la reacción, de su naturaleza ácida o básica, la reacción trascurre vía enol o enolato respectivamente (Figura 23). Cuando lo que se emplea es un catalizador ácido, la etapa inicial en el mecanismo de reacción conlleva la tautomerización de la cetona para formar el enol. Además, el ácido también activa el grupo carbonílico del aldehído mediante su protonación, haciendo altamente electrófilo dicho átomo de carbono. El enol formado actúa como nucleófilo en su carbono-α, permitiéndole atacar al aldehído protonado y conduciendo posteriormente a la formación del aldol, que sufre una deshidratación para dar lugar al compuesto carbonílico insaturado final. H OO R R O Catalizador R R 28 Introducción 3. Las chalconas 29 Sin embargo, cuando lo que se emplea es una base moderada, el mecanismo de reacción transcurre vía enolato produciéndose el ataque nucleófilo del mismo al carbono carbonílico del aldehído. El producto resultante es la sal del alcóxido del producto aldólico, que tras dar lugar al aldol, puede sufrir fácilmente una deshidratación para generar el compuesto carbonílico insaturado, en este caso la chalcona. F Figura 23. Mecanismos de la reacción de Claisen-Schmidt en condiciones ácidas (via enol) o básicas (vía enolato). A pesar de que los agentes de catálisis básica para la reacción de ClaisenSchmidt son abundantes, el uso de catalizadores ácidos puede tener la ventaja de evitar que ocurra tanto la reacción competitiva de Cannizzaro del aldehído como otras reacciones laterales secundarias no deseadas cuando existen grupos sensibles a las condiciones básicas. Además de los catalizadores clásicos, existe un amplio y heterogéneo arsenal de sustancias químicas capaces de servir como catalizadores en esta reacción. Entre los catalizadores más novedosos se encuentran las hidrotalcitas activadas, 127 hidroxipatita,128 zeolitas,129 sílica aminopropilada sol-gel,130 BiCl3,131 K2CO3 anhidro132 o líquidos iónicos ácidos133 entre otros. R OOH HR' O R R' O OH R R' O H + enol aldol producto de condensación aldólica H H H 2 O R R' O OH 2 H -H 2 O VÍA ENOL VÍA ENOLATO R O HB R O - enolato H O R' R R' O O - H tautomería ceto-enólica H + R R' O HB R R' O OH H aldol B 29 Introducción 3. Las Chalconas 30 Aunque como se ha dicho anteriormente la reacción de Claisen-Schmidt es la más utilizada, otras técnicas de renombre también han sido empleadas para la síntesis de chalconas.134 Así, podemos encontrar métodos como la reacción de acoplamiento de Suzuki,135 la reacción de cross-coupling directa,136 la reacción de Heck,137,138 las reacciones mediante radiación microondas,139 la acilación de Friedel-Crafts140 o la olefinación de Julia-Kocienski,141 representadas de forma esquemática en la Figura 24. Figura 24. Reacciones clásicas empleadas para la síntesis de chalconas 3.4. Actividad biológica de las chalconas La actividad biológica de las chalconas es tan relevante y variada como la metodología sintética previamente mencionada. De hecho, no muchos patrones estructurales manifiestan un rango tan amplio de actividades farmacológicas. Dimmock y colaboradores realizaron una profunda revisión de las propiedades de las chalconas en 1999.142 Desde entonces, las chalconas han seguido siendo una de las áreas de O X O B HO OH Suzuki Cl O KF 3 B Cross-coupling O X X = B(OH) 2 ; I Heck O X RO Friedel-Crafts O SO 2 Het O H Julia-Kocienski + + + ++ 30 Introducción 3. Las chalconas 31 investigación más activas, y prueba de ello son las múltiples revisiones que se pueden encontrar actualmente y en las que se recoge el potencial farmacológico de las mismas.143,144,145,146,120 La mayor parte de los estudios farmacológicos realizados sobre esta familia de compuestos orgánicos han estado dirigidos hacia la identificación de nuevos agentes antibacterianos, 147 , 148 antiprotozoarios, 149 antifúngicos, 150 antivirales, 151 , 152 , antineoplásicos153 o antioxidantes154 entre otros. Además de las actividades farmacológicas mencionadas, cabe destacar que estas moléculas también presentan múltiples propiedades derivadas de su capacidad de interacción con biomoléculas. Dentro de este grupo, es de recalcar el potencial de las chalconas como analgésicos, 155 anti-inflamatorios, 156 , 157 antihistamínicos, 158 antimitóticos159 o inmunomoduladores.160 Respecto a la actividad antioxidante, se sabe que las plantas producen una gran variedad de antioxidantes como respuesta al daño molecular que producen las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), y que los compuestos fenólicos forman la mayor clase de antioxidantes derivados del mundo vegetal. Entre los múltiples compuestos fenólicos, los flavonoides son quizá el grupo más importante, ya que tienen la capacidad de atrapar radicales libres y prevenir la peroxidación lipídica. 161 , 162 Muchas hidroxichalconas tanto simples como con sustituyentes isoprenílicos en sus anillos fenílicos poseen un elevado potencial antioxidante (Figura 25).163 Figura 25. Estructuras químicas de chalconas antioxidantes de origen natural O HO R1 ROH OH Buteína, R = OH; R1 = H Sappanchalcona, R = OCH3; R1 = H Okanina, R = R1 = OH OOH HO OH OH Broussochalcona A OOH OOHO R2 R1 Xanthohumol, R1 = H; R2 = CH3 Desmetilcanthohumol, R1 = R2 = H 31 Introducción 3. Las Chalconas 32 Así, podemos encontrar 3,4-dihidroxichalconas como la buteína, la sappanchalcona o la okanina, que son antioxidantes particularmente efectivos y en los que la presencia tanto de un grupo hidroxilo en C-2’ en el anillo A como del grupo catecol en el anillo B, parecen ser favorables para su actividad anti-radicalaria, mientras que la falta del enlace α,β-insaturado hace que su eficacia disminuya.164 Muy estrechamente relacionada con la actividad antioxidante, la actividad antiinflamatoria es también un campo en el que las chalconas presentan resultados muy prometedores165,166 si bien igual que ocurre con aquella, es muy difícil establecer una relación estructura-actividad. La inflamación es una respuesta biológica compleja asociada a múltiples condiciones fisiopatológicas. Como respuesta a un estímulo inflamatorio, los macrófagos liberan varias moléculas pro-inflamatorias, entre las que se incluye el radical libre de corto periodo de vida como el óxido nítrico (NO). Una serie de derivados de chalcona con posibles efectos anti-inflamatorios fueron ensayados por Heredia y colaboradores 167 y entre los que encontraron un compuesto significantemente activo como atrapador de aniones superóxido. Además, estudios in vitro de dimetilamino-chalconas168 analizaron la actividad inhibidora en la producción de NO y de los mediadores de la prostaglandina E2 (PGE2) y se observó que se producía una inhibición de la producción de NO dependiente de la concentración. Además de las dimetil-aminochalconas, 3,4-dihidroxichalconas fluoradas, 3’,4’,5’-trimetoxichalconas o la 2’,4’,6’-tris(metoximetoxi)chalcona (TMMC), presentaron potentes efectos antiinflamatorios (Figura 26). Figura 26. Estructuras químicas de derivados de chalcona con actividad anti-inflamatoria. O OMe MeO NMe Me dimetilamino-chalconas OOMe MeO FOH OH 3,4-dihidroxichalcona fluorada OO O MeO MeO O MeO 2',4',6'-Tris(metoximetoxi)chalcona (TMMC) OOMe MeO OMe 3',4',5'-trimetoxichalcona 32 Introducción 3. Las chalconas 33 Estudios recientes se han centrado en las actividades anti-proliferativa y de reducción tumoral de algunas chalconas, e incluso se ha observado que una ingesta de flavonoides presentes en una dieta vegetal es segura y no está asociada con ningún efecto de salud adverso, de modo que se ha vuelto a generar un elevado interés en esta clase de moléculas.169 Entre los actuales agentes antitumorales identificados, las chalconas representan una importante clase de moléculas pequeñas útiles en la quimioterapia del cáncer.170 El Xanthohumol por ejemplo (Figura 25), que es uno de los mayores ingredientes presentes en la cerveza, puede ser potencialmente útil no sólo como antioxidante, sino como agente quimioprotector durante la hiperplasia y carcinogénesis de próstata y decrece su proliferación.171 Otras chalconas (Figura 27), como algunas chalconas borónicas, chalconas C-metiladas aisladas de la pulpa y las semillas de los frutos de Syzygium samarangense, conocida como la manzana de java, bases de Mannich de chalconas heterocíclicas o chalconas aril o aroil sustituidas, representan también compuestos con potencial actividad antitumoral. Figura 27. Chalconas con actividad antitumoral. a) chalcona borónica; b) chalcona C-metilada extraída de de los frutos de Syzygium samarangense; c) base de Mannich de una chalcona; d) chalcona aril-sustituída. O N Me BB OH OH HO OH OOH Me HO Me OMe OOH MeO OH N O O MeO MeO OMe OMe OMe OH a) b) c) d) 33 Introducción 3. Las Chalconas 34 Respecto a la actividad anti-infecciosa, la estructura de chalcona puede considerarse como un importante cabeza de serie a partir del cual se han obtenidos derivados con actividad muy diversa: antibacteriana,147 antifúngica, 172 antiviral, 173 antimalárica174,175 o anti-leishmania entre otras. Algunos ejemplos de chalconas que muestran este tipo de actividades se muestran en la Figura 28. F Figura 28. Estructuras químicas de derivados de chalcona con diferentes actividades antiinfecciosas. Por último, debemos hacer una breve referencia a la actividad inhibidora de ciertos sistemas enzimáticos. Además de la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 (COX-2)176 relacionada con su acción antiinflamatoria ya mencionada, nos referimos a la actividad inhibidora MAO encontrada por primera vez en 2009 para estos prototipos177, así como para algunas furano-chalconas178 (Figura 29). En otros casos se da cuenta de dicha actividad en los vinil isósteros, 179 o de la elevada actividad iMAO-B en isoflavonoides estructuralmente próximas. 180 Por último, queremos mencionar la actividad sobre la tirosinasa 181 , 182 encontrada en determinadas chalconas, muy relacionadas con sus análogos cumarínicos y otros flavonoides naturales y sintéticos, motivo por el cual es muy difícil poder establecer de forma inequívoca y predictiva la OCl S N O O COOH antibacteriano O Me Me OH HO OH antifúngico OOH Me MeO CHO OH OH antiviral N Cl O Cl Cl OMe OMe antimalárico O SO ONH OMe anti-leishmania 34 Introducción 3. Las chalconas 35 relación estructura–actividad sobre las múltiples dianas farmacológicas sobre las que pueden interaccionar. F Figura 29. Derivados de chalconas como inhibidores enzimáticos. Toda esta información justifica que varios autores incluyan a esta familia de compuestos en la lista de estructuras privilegiadas, un concepto enunciado originalmente por Evans183 y que agrupa a aquellos núcleos que por su alta bioactividad constituyen estructuras de alto interés farmacológico. O MeO iMAO-B OH Cl iMAO A/B O O NMe 2 OOH HO HO H, OH Inhibidor tirosinasa 35 Introducción 6. Farmacomodulación 42 6. Farmacomodulación 6.1. Hibridación molecular y terapia multi-diana. En base a lo anteriormente mencionado, y teniendo en cuenta la gran variedad de actividades farmacológicas que pueden mostrar los prototipos descritos, es importante considerar el diseño de compuestos multi-diana en los que sobre el esqueleto cumarínico se incorporan grupos farmacóforos distintos con objeto de obtener estructuras híbridas. La naturaleza multifactorial de gran número de enfermedades y la resistencia a los fármacos antimicrobianos han motivado la aparición de la metodología multi-diana MTDL (multitarget-directed-ligands) en el descubrimiento de fármacos como una clara alternativa a la polifarmacología mediante combinación de varios fármacos FDC (Fixed dose combination). La metodología MTDL permite utilizar una única entidad química que pueda actuar sobre varias dianas terapéuticas. Esta técnica puede tener efectos beneficiosos en varios aspectos farmacológicos tales como el disminuir problemas asociados a dosificación múltiple, interacciones medicamentosas, disminuir o retardar la aparición de resistencias, etc. Mediante esta técnica de diseño, se han preparado derivados de naturaleza flavonoide multi-diana que presentan una actividad dual inhibidora de la BACE 1/AChE, o bien MAO/AChE, todos con interés en la terapia de la EA.218 En otros casos productos naturales de estructura flavonoide como la linarina muestran actividad neuroprotectora debido a su capacidad antioxidante y a la vez inhibidora de la AChE (Figura 17). En otros casos, nuestro grupo de investigación utiliza esta técnica e incrementa las propiedades cardiovasculares de la cumarina mediante la incorporación del esqueleto resveratrol con propiedades también también cardioprotectoras.237 En el mismo campo destacan híbridos de chalcona, flavona así como cumarinas que incorporan en su estructura el anillo pirimidínico presente en el vasodilatador minoxidilo (Figura 34).219,220 42 Introducción 6. Farmacomodulación 43 F Figura 34. Híbridos multi-diana con actividad cardiovascular. Por su parte, la elevada morbilidad y mortalidad originada por la infecciones protozoarias demanda cada vez más nuevas estrategias terapéuticas, y en este campo la terapia multidiana se compite cada vez más con la terapia multifármaco221. Destacan entre los compuestos más importantes el híbrido chalcona-benzoxaborol, farmacóforos con demostrada actividad frente a Tripanosoma brucei y Trapanosoma cruzi,222 el híbrido chalcona-cloroquina activo frente a Plasmodium falciparum.223 Finalmente, el híbrido cumarina-PABA eficaz antibacteriano224 o el antiviral híbrido chalcona-anilida inhibidor dual de la integrasa y del receptor de transmenbrana viral CCR5 (C-C quimiocina receptor)239 de son ejemplos que ilustran la aplicación de la metodología multidiana en el diseño de nuevos prototipos (Figura 35). Figura 35. Híbridos multi-diana empleados como antimicrobianos. O H2N MeO O B OH Chalcona/benzoxaborol Antitripanosoma O O Chalcona/cloroquina Antimalarico OMe MeO Chalcona/anilida Antiviral HIV O NH HO O OH S O O MeO MeO N H CO2H O Cumarina/PABA Antibacteriano N N N N Cl O HO OH O OH OH OH Isoprenil-flavona O HO O O OH O ONO 2 Chalcona/nitrato O O OH Cumarina/resveratrol HO OH O Cumarina/minoxidilo O HNN N R 43 Introducción 6. Farmacomodulación 44 6.2. Bioisosterismo. Fue en 1919 cuando Langmuir,225 estudiando el comportamiento químico y la reactividad de determinadas sustancias que poseían átomos o grupos con el mismo número de electrones de valencia, por ejemplo, isoelectrónicos, creó el concepto de isosterismo para definir átomos o moléculas orgánicas o inorgánicas que poseían el mismo número y/o la misma distribución de electrones. Años más tarde, en 1932, Erlenmeyer226 propuso ampliar el término isosterismo, definiendo los isósteros como elementos, moléculas o iones que presentaban el mismo número de electrones en el nivel de valencia. Su contribución incluye la propuesta de que los elementos de la misma columna de la tabla periódica son isósteros entre ellos (por ejemplo, carbono, Silicio y Germanio), y la creación del concepto de anillos electrónicamente equivalentes, que sería posteriormente ampliado al término bioisosterismo de anillos. El término bioisosterismo fue acuñado por Friedman y Thornber a principios de los años 50. Friedman introdujo el término bioisosterismo para describir el fenómeno observado entre sustancias relacionadas estructuralmente que presentaban propiedades biológicas similares o antagónicos. 227 Más tarde, Thornber propuso ampliar el término de bioisósteres, definiéndolos como subunidades, grupos, o moléculas que poseían propiedades fisicoquímicas de efectos biológicos similares.228 A lo largo de los años, se han identificado innumerables relaciones bioisostéricas en compuestos tanto de origen natural como sintético. En la naturaleza, se han identificado muchos ejemplos de isosterismo como una manera de ampliar la quimiodiversidad (Figura 36), siendo notables las relaciones bioisostéricas clásicas que se encuentran entre los aminoácidos esenciales serina y cisteína, o tirosina y cisteína; entre las bases de purina y pirimidina como citosina y uracilo, o adenina y guanina; o entre los ácidos salicílicos y antranílicos, que originaron dos importantes clases de fármacos antiinflamatorios no esteroideos como el ácido acetilsalicílico y los ácidos mefenámicos, respectivamente. Además, también podemos encontrar ejemplos en la naturaleza de la aplicación de bioisosterismo no clásico, tal y como la relación bioisostérica existente entre el ácido γaminobutírico (GABA) y el muscimol (Figura 36), o entre los neurotransmisores glutamato y AMPA. 44 Introducción 6. Farmacomodulación 45 F Figura 36. Ejemplos de bioisosterismo clásico y no clásico encontrados en compuestos naturales Por tanto, el bioisosterismo es una estrategia empleada en química medicinal para el diseño racional de nuevos fármacos, aplicada sobre un compuesto líder (CL) como un proceso especial de modificación.229 El éxito de esta estrategia para el desarrollo de nuevas sustancias que sean atractivas terapéuticamente ha experimentado un crecimiento significativo en distintas clases terapéuticas, siendo HO OH O NH 2 HS OH O NH 2 OH O NH 2 OH O NH 2 HO HN N serina cisteína tirosina histidina Bioisosterismo clásico N N O NH 2 H N N O OH H citosina uracilo N NN N H NH 2 adenina guanina HN NN N H O HN N O O H OH O OH OH O NH 2 ácido salicílico ácido antranílico Bioisosterismo no clásico HO NH 2 O HO NH 2 NO GABA muscimol HO OH O O NH 2 HO O NH 2 O N OH glutamato AMPA 45 Introducción 6. Farmacomodulación 46 ampliamente utilizada por la industria farmacéutica para descubrir nuevos análogos de innovaciones terapéuticas comercialmente atractivas, y también como una herramienta muy útil en la modificación molecular. Existen innumerables razones para emplear el bioisosterismo para diseñar nuevos fármacos, incluyendo la necesidad de mejorar la actividad biológica , ganar selectividad frente a un determinado receptor o subtipo de isoforma enzimática, o incluso para optimizar la farmacocinética que un CL puede presentar. 6.2.1 Vinilogía. El principio de vinilogía fue formulado por Claisen en 1926230 al observar la similar acidez de la formil acetona y del ácido acético. Hoy día, la vinilogía es explicada por el efecto mesomérico que puede ser aplicado a otros sistemas conjugados tales como grupos imino y etinil y sistemas aromáticos. Este principio tiene importantes aplicaciones en el diseño de fármacos si bien es de aplicación cuando la actividad farmacológica dependa de aspectos electrónicos y no esté determinada por la distancia entre los grupos sobre los que se aplica. Frecuentemente, los vinílogos originados son más sensibles a la degradación metabólica como ocurre con los vinílogos de la fenilbutazona 231 (Figura 37). Sin embargo, en otros casos, como el de la acetilcolina, la formación de su vinílogo origina un derivado menos sensible a la acción de la acetilcolinesterasa.232 Por su parte, la introducción de un anillo bencénico en la procainamida xantina origina análogos que conservan su actividad anestésica local de la misma. Más relacionado con nuestro trabajo, debemos mencionar que la aplicación de la vinilogía a la chalcona con actividad inhibidora sobre la MAO-B, origina un biosóstero que conserva dicha actividad.179 Así pues y teniendo en cuenta que nuestro trabajo parte de tres farmacóforos: la estructura de chalcona, el anillo cumarínico (su análogo cíclico), y el resveratrol, reconocidos compuestos líder por todo lo expuesto, emplearemos como punto de partida la hibridación estructural cumarina-resveratrol, y posteriormente centraremos el trabajo en los híbridos cumarina-chalcona. Sobre los prototipos generados, haremos 46 Introducción 6. Farmacomodulación 47 uso de la bioisostería y vinilogía para el diseño y la síntesis algunos compuestos que se presentan en la presente Memoria. Figura 37. Principio de vinilogía aplicada al diseño de nuevos fármacos. H 2 N N H NEt 2 O Procainamida H 2 N N H O Benzólogo NEt 2 N N OH O nBut N N OH O nBut Fenilbutazona Estirilbutazona Acción mas corta O O N O O ACh Resistente a la AChE N O ClOHMeO O OHMeO Cl Chalcona Vinil chalcona 47 Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 49 #   1. Antecedentes 5 51 2. Objetivos 5 53 49 Antecedentes y objetivos 1. Antecedentes 51   1. Antecedentes Desde hace tiempo, nuestro grupo de investigación ha estado trabajando en el campo de las cumarinas, no sólo buscando nuevas metodologías sintéticas e intentando optimizar sus efectos vasodilatadores y/o cardioprotectores, sino también con el fin de encontrar nuevas aplicaciones en el campo de la química médicinal. Por tanto, el estudio del esqueleto cumarínico94,82,233, y sus modificaciones estructurales dirigidas a diferentes actividades farmacológicas 234 , 235 , 236 ha sido una línea de investigación en la que hemos profundizado ampliamente, y en la que se han realizado revisiones recientes.16,17 En los últimos tiempos, nuestro grupo de investigación de ha centrado en la preparación de compuestos híbridos cumarina-resveratrol (3-arilcumarinas) en los cuales el anillo cumarínico comparte el anillo bencénico y el doble enlace de la pirona, con el resveratrol, de modo que el resveratrol queda fijado como isómero trans (Figura 38). 237 Los estudios de actividad de estos prototipos llevados a cabo por el grupo de Farmacología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela, con el que mantenemos una estrecha colaboración, han demostrado que presentan una muy buena actividad vasodilatadora e inhibidora de la agregación plaquetaria.238 F Figura 38. Compuestos híbtridos cumarina-resveratrol sintetizados en nuestro laboratorio. Estudios más recientes han revelado además que estos prototipos muestran una gran actividad como inhibidores de monoamino oxidasa (MAO)111,239 presentando además una elevada selectividad por la isoenzima MAO-B, lo que permite que sean O O OH OH HO cumarina resveratrol OO R R híbridos cumarina-resveratrol 51 Resultados y discusión 1. Generalidades 59 1. Generalidades En el trabajo que a continuación se presenta en esta Memoria se incluye la descripción de las metodologías sintéticas empleadas para la preparación de series de compuestos seleccionadas, su correspondiente purificación y caracterización estructural, la evaluación biológica frente a diferentes dianas farmacológicas y estudios de modelización molecular. Dado el carácter multidisciplinar que supone trabajar en el campo de la química farmacéutica, es importante mencionar que muchos estudios aquí presentados han sido fruto de incesantes e interesantes colaboraciones con diversos grupos de investigación tanto nacionales como internacionales. En la Universidad de Santiago de Compostela, los estudios de iMAO han sido realizados por la Profesora Dolores Viña, y los ensayos de la actividad antibacteriana han sido realizados por las Profesoras Ysabel Santos y Ángeles Muñoz. En la Universidad de Santiago de Chile se han llevado a cabo los estudios de la actividad y propiedades antioxidantes a cargo del Profesor Claudio Olea-Azar, y los estudios de la actividad antitripanocida, por el grupo del profesor Juan Diego Maya. Los estudios de citotoxicidad y citoprotección han sido realizados por el grupo del Profesor Frederick Villamena, de la Ohio State University. En la Universidad de Wurzbürg se han realizado los estudios de interacción con receptores de adenosina, en colaboración con el grupo del Profesor Karl-Norbert Klotz. En la University of Hawai’i at Manoa en colaboración con el grupo del Profesor Marcus Tius se ha llevado a cabo el desarrollo y optimización de metodologías sintéticas empleando la reacción de Nazarov para la aplicación en la preparación de compuestos oxacíclicos basados en productos naturales como los derivados de la rocaglamida. Y por último, los estudios de docking han sido realizados por Giulio Ferino y Santiago Vilar. Sin todas estas colaboraciones, este trabajo no hubiese sido posible. La versatilidad de las diferentes vías sintéticas nos ha permitido obtener amplias series de derivados, muchos de los cuales han sido posteriormente estudiados frente a diversas dianas farmacológicas y que nos han permitido establecer interesantes relaciones de estructura y actividad (SAR) y que nos permiten un diseño racional de nuevos fármacos basados en las estructuras de los receptores y en las estructuras de los ligandos de los mismos. 59 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 60 2. Estrategia Sintética  Para la consecución de los objetivos sintéticos anteriormente expuestos, ha sido necesario estudiar la metodología sintética que resultaría más apropiada para la obtención de los distintos tipos de esqueletos planteados. Estos procedimientos, tal y como es preceptivo en estos primeros estudios de diseño de nuevos prototipos, deben ser sencillos, directos, rápidos, eficientes y de gran versatilidad. Hemos buscado las rutas sintéticas más rápidas y cuyos reactivos, preferentemente de bajo coste, se adaptaban mejor a nuestras necesidades. Las reacciones más empleadas se describen brevemente a continuación, y la descripción se realizará en función del tipo de esqueleto híbrido a preparar. Con el objetivo de disponer de una amplia quimioteca de compuestos que facilite la exploración de las relaciones estructura-actividad, así como el establecimiento de comparaciones con derivados afines previamente obtenidos en nuestro laboratorio, se han preparado series de compuestos en cuya estructura general, para el caso de los híbridos más ampliamente estudiados en esta memoria (híbridos cumarina-chalcona), tendremos tres puntos de variabilidad: el anillo bencénico de la cumarina, y los anillos aromáticos A y B de la chalcona. 2.1. Síntesis de 3-arilcumarinas. Las 3-arilcumarinas, o híbridos cumarina-resveratrol, han sido las primeras estructuras que han sido objeto de nuestro estudio dada la prometedora actividad encontrada como inhibidores de la MAO. Se amplió la serie de 3-arilcumarinas que estaba siendo sintetizada por la Dra. Maria Matos, quien puso a punto las metodologías sintéticas desarrolladas. Las reacciones empleadas para la síntesis de los distintos derivados fueron la reacción de Perkin,242,243 la reacción de Perkin modificada244 y la reacción de Suzuki245 (Figura 43) y se encuentran amplia y detalladamente descritas en la Tesis Doctoral de la Dra. Maria Matos.241 60 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 61 F Figura 43. Rutas sintéticas empleadas para la síntesis de 3-arilcumarinas. 2.2. Síntesis de “endo” cumarina-chalconas. Las “endo” cumarina-chalconas fueron las siguientes estructuras que han sido objeto de nuestro estudio dada su relación estructural con las 3-arilcumarinas previamente sintetizadas en nuestro laboratorio como ya se ha comentado en el apartado de antecedentes. En el diseño de estas estructuras, hemos tenido en cuenta que la sustitución sobre el anillo de cumarina se realizaría en la posición 3. Incorporaríamos un grupo benzoílico en dicha posición, de modo que en la estructura final, el anillo B de la chalcona correspondería al anillo bencénico del núcleo de cumarina, mientras que el anillo A se encontraría como grupo benzoilo en la posición 3. De este modo, la configuración trans de la chalcona quedaría fijada a través del enlace α,β-insaturado del anillo de pirona (Figura 44). O O R' R HO O OH H O R R' DCC, DMSO 110 ºC, 24h Perkin NaH, Ac 2 O Perkin modificada HO O OH H O R R' Pd(OAc) 2 -salen Na 2 CO 3 , DMF/H 2 O (1:1) 110ºC, 4h Suzuki OO X(HO) 2 B R' t.a., 3h R R ó R' = NO 2 61 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 62 F Figura 44. Diseño de híbridos 3-endo cumarina-chalcona. 2.2.1. Síntesis de 3-benzoilcumarinas. Las 3-benzoilcumarinas han sido las primeras estructuras que nos hemos planteado diseñar. La etapa clave para la obtención de este tipo de compuestos tiene como base la reacción de Knoevenagel44 entre un salicilaldehído y un β-cetoester aromático. La reacción puede llevarse a cabo en medio ácido o básico, pero en este caso las reacciones fueron llevadas a cabo en medio básico siguiendo la literatura.246,91 Dada la sencillez y la versatilidad de esta reacción, hemos podido obtener una amplia familia de compuestos con rendimientos satisfactorios de entre el 42 y el 98%, siendo los derivados que contenían anillos heteroaromáticos aquellos que presentaron un menor rendimiento (Figura 45). Figura 45. Esquema de reacción para la síntesis de 3-benzoilcumarinas. Esta síntesis vía reacción de Knoevenagel ha sido llevada a cabo en etanol y en presencia de piperidina, dejando la reacción a reflujo de 2 a 8 horas, dependiendo del tipo de derivado sintetizado. Sólo en el caso de los derivados que contenían grupos hidroxilo y/o grupos amino, fue necesaria la síntesis de los precursores etoxi/metoxilados y/o con grupos nitro que fueron posteriormente derivatizados mediante procesos de hidrólisis y/o reducción. La purificación de todos los compuestos CHO OH EtO Ar/Het O O OO Ar/Het O RR EtOH, piperidina reflujo, 2-8h + 32-98% OO sustitución en 3 O A B O A B OO "endo" cumarina-chalcona 62 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 63 finales se realizó bien mediante cromatografía en columna o bien mediante recristalización. La síntesis de los derivados hidroxilados se llevó a cabo en condiciones drásticas, tratando los éteres precursores con BBr3 en diclorometano (DCM) durante 48 horas a 80 ºC. En el caso de los derivados amino, los compuestos híbridos precursores con grupos nitro fueron tratados con cloruro de estaño dihidrato (SnCl2.2H2O) en etanol a reflujo durante 3-7 h (Figura 46). Figura 46. Síntesis de hidroxi/amino-3-benzoilcumarinas. La caracterización de todos los compuestos obtenidos se ha realizado mediante resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) tanto de protón como de carbono, por espectrometría de masas, análisis elemental y puntos de fusión. La identificación estructural de este tipo de compuestos resulta bastante clara debido a las señales características del anillo cumarínico. Se realizó también un estudio estructural mediante Rayos X de una cumarina seleccionada de esta serie de compuestos (compuesto 1 16 , Tabla 1). De este modo el análisis de este compuesto nos ayuda a contribuir a la elucidación de los requisitos estructurales necesarios para entender la planaridad parcial del núcleo de cumarina en este tipo de compuestos, y la torsión del grupo 3-benzoilo respecto a este núcleo.247 OO O RO OR OO O HO OH OO O O2N NO2 OO O H2N NH2 BBr3, DCM 80 ºC, 48h SnCl2, EtOH reflujo, 2-7h 63 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 64 2.2.2. Síntesis de 3-benzoil-4-hidroxicumarinas. La presencia en la posición 4 del anillo de la cumarina de un grupo hidroxilo hace que el planteamiento sintético varíe respecto de las 3-benzoilcumarinas no sustituidas en esta posición. Para la síntesis de este tipo de derivados, se siguió una ruta de dos etapas: una primera etapa en la que generamos el éster aromático en la posición 4, y una segunda etapa en la que, mediante una transposición de Fries, dejamos el hidroxilo libre en la posición 4 y el grupo benzoilo se transpone a la posición 3 de la cumarina (Figura 47) Figura 47. Síntesis de 3-benzoil-4-hidroxicumarinas. Para la síntesis del éster, se trata la 4-hidroxicumarina propiamente sustituida con el correspondiente cloruro de ácido en diclorometano a 0 ºC en presencia de trietilamina (Et3N) durante un periodo de entre 1 y 4 horas.248 La reacción transcurre en la mayoría de los casos con rendimientos casi cuantitativos. En la segunda etapa, el éster obtenido se trata con tricloruro de aluminio (AlCl3), preparando una mezcla triturada de ambos reactivos, y la reacción transcurre a 160 ºC durante un tiempo de entre 2 y 4 horas en ausencia de disolvente.249 Los rendimientos globales para la obtención de los compuestos finales, teniendo en cuenta ambas etapas, oscilan entre un 42 y un 93%. 2.3. Síntesis de “exo” cumarina-chalconas”. El siguiente objetivo sintético que nos planteamos fue la preparación de híbridos cumarina-chalcona “exo”, que como ya se ha comentado anteriormente en el apartado de objetivos, suponía otorgar una mayor grado de libertar conformacional a la molécula. Estudiamos las posiciones 3 y 8 de la cumarina para la incorporación del núcleo de chalcona. De este modo, nos planteamos preparar 3 tipos de derivados “exo”: una clase de 8-exo(cumarina-chalconas), y dos clases de 3-exo(cumarinachalconas) (Figura 48). OO OH R OO O R OO OH R Ar/Het O Ar/Het O Ar/Het Cl O +Et 3 N, DCM 0 ºC, 1-4h AlCl 3 160 ºC, 2-4h 64 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 65 F Figura 48. Diseño de híbridos cumarina-chalcona tipo “exo”. Se estudió primeramente la sustitución en la posición 3 del esqueleto cumarínico en la que realizaríamos la sustitución bien del anillo benzílico A, o bien del anillo benzílico B de la chalcona, por el anillo de pirona de la cumarina. Posteriores modificaciones llevarían a la sustitución bioisostérica de ambos anillos benzílicos por anillos heteroaromáticos. En el caso de las 8-exo(cumarina-chalconas), se conservaría la estructura clásica de chalcona, y sólo se harían modificaciones en el anillo B de la chalcona por anillos heteroaromáticos en casos puntuales. Cabe destacar que en prácticamente la totalidad de los derivados preparados, los isómeros obtenidos para este tipo de compuestos híbridos han sido los isómeros trans. 2.3.1. Síntesis de 3-cinamoilcumarinas. La síntesis de 3-cinamoilcumarinas se ha llevado a cabo siguiendo una ruta en dos etapas en la que el primer paso conlleva la preparación de 3-acetilcumarinas propiamente sustituidas, seguida de la síntesis de los compuestos finales mediante una reacción de Claisen-Schmidt como se muestra en la Figura 49. OO O O AB AB OO sustitución en 3 cambio de fenilo por pirona OO BA O OO O sustitución en 8 A B Derivados 8-exo(cumarina-chalcona) Derivados 3-exo(cumarina-chalcona) 65 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 66 Figura 49. Síntesis de derivados 3-cinamoilcumarina. Para la síntesis de las 3-acetilcumarinas sustituidas se empleó la reacción de Knoevenagel en la que se trataron el correspondiente salicilaldehído propiamente sustituido y el acetoacetato de etilo con piperidina a temperatura ambiente durante 30 minutos en ausencia de disolvente.59 Se obtuvieton así las 3-acetilcumarinas con excelentes rendimientos (entre 78 y 94%). A continuación, las 3-acetilcumarinas se mezclaron con los benzaldehídos apropiados y se trataron con piperidina en etanol a reflujo durante 4-12 horas,250 lo que dio lugar a las 3-cinamoilcumarinas deseadas con rendimientos (entre 58 y 91%). 2.3.2. Síntesis de 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas. Al igual que en el caso de las 3-benzoil-4-hidroxicumarinas, cuando se planteó la síntesis de las 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas, hubo que recurrir a una ruta sintética alternativa respecto de las 3-cinamoilcumarinas. Esta ruta también constaría de dos etapas. Una primera etapa en la que en lugar de preparar mediante reacción de Knoevenagel las 3-acetilcumarinas, empleamos 4-hidroxicumarinas sustituidas que darían lugar a las correspondientes 3-acetil-4-hidroxicumarinas, y una segunda etapa en la que sobre las 3-acetil-4-hidroxicumarinas emplearíamos la misma reacción de Claisen-Schmidt que la utilizada en la segunda etapa de la síntesis de 3cinamoilcumarinas (Figura 50). Figura 50. Ruta sintética para la preparación de 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas CHO OH R EtO O O R OO O R OO O Ar/Het +piperidina t.a., 30 min piperidina, EtOH reflujo, 4-12h Ar/Het H O R OO OH R OO OH O R OO O Ar/Het piperidina, EtOH reflujo, 4-12h Ar/Het H O POCl3, Ac2O reflujo, 30 min OH 66 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 67 Para preparar las 3-acetil-4-hidroxicumarinas se trataron las 4-hidroxicumarinas sustituidas con oxicloruro de fósforo (POCl3) en ácido acético glacial (Ac2O) a reflujo durante 30 minutos,251 con rendimientos del 72 al 93%. La última etapa del proceso sintético para este tipo de estructuras correspondió a la condensación de ClaisenSchmidt mencionada previamente en la síntesis de 3-cinamoilcumarinas, con rendimientos que oscilan entre 52 y 97 %. 2.3.3. Síntesis de 3-(3-aril-3-oxo-propernil)-4-clorocumarinas. Para la preparación de 3-(3-aril-3-oxo-propenil)-4-clorocumarinas se ha empleado la reacción de Wittig, ampliamente utilizada para la síntesis de alquenos o compuestos α,β-insaturados, y en la que reaccionan un aldehído o una cetona, con un iluro de fósforo. La síntesis de los compuestos finales consta de dos etapas: una primera etapa en la que se prepara el iluro de fósforo a partir de una α-haloarilcetona, y una segunda etapa en la que se produce el acoplamiento entre el iluro de fósforo y la 3formilcumarina para formar el oxafosfetano intermedio que se rompe liberando el alqueno final (Figura 51). Figura 51. Síntesis de 3-(3-aril-3-oxo-propenil)-4-clorocumarinas. Para sintetizar el iluro precursor, se disolvieron la α-haloarilcetona y la trifenilfosfina (PPh3) en diclorometano y la reacción se dejó bajo agitación en atmósfera de argón entre 12 y 24 horas.252 Tras la elaboración y purificación, se obtuvieron los iluros con rendimientos cuantitativos. A continuación, el iluro obtenido se mezcló con la 3-formil-4-clorocumarina propiamente sustituida en presencia de metóxido sódico (NaOMe) en tolueno, y la mezcla resultante se dejó a 80 ºC durante 12-18 horas.253 El compuesto final fue aislado y purificado con rendimientos de entre el 61 y el 83%. R OO Cl H O Br O R PPh 3 O R PPh 3 + Br DCM t.a., 12-24 h NaOMe, tolueno 80ºC, 12-18h R OO Cl O R 67 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 74 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 46 OCH3 H OCH3 H H NO2 H 47 H Cl H H H NO2 H 48 H H OCH3 H H NO2 H 49 H OCH3 H H H Cl H 50 H Br H H H Cl H 51 H H H OCH3 H Cl H 52 H Br H OCH3 H Cl H 53 H CH3 H H H Cl H 54 H NO2 H H H Cl H 55 OCH3 H OCH3 H H Cl H 56 H Cl H H H Cl H 57 H H H H H CH3 H 58 H OCH3 H H H CH3 H 59 H Br H H H CH3 H 60 H NO2 H H H CH3 H 61 OCH3 H OCH3 H H CH3 H 62 H H OCH3 H H CH3 H O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 74 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 75 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 63 H H H H OCH3 OCH3 OCH3 64 H OCH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 65 H Br H H OCH3 OCH3 OCH3 66 H H H OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 67 H H H OCH2CH3 OCH3 OCH3 OCH3 68 H Br H OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 69 H CH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 70 H H H CH3 OCH3 OCH3 OCH3 71 H NO2 H H OCH3 OCH3 OCH3 72 OCH3 H OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 73 H Cl H H OCH3 OCH3 OCH3 74 H H OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 75 H H H H NO2 H H 76 H OCH3 H H NO2 H H 77 H Br H H NO2 H H 78 H H H OCH3 NO2 H H 79 H H H OCH2CH3 NO2 H H O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 75 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 76 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 80 H Br H OCH3 NO2 H H 81 H CH3 H H NO2 H H 82 H H H CH3 NO2 H H 83 H NO2 H H NO2 H H 84 OCH3 H OCH3 H NO2 H H 85 H Cl H H NO2 H H 86 H H OCH3 H NO2 H H 87 H OH H H H H H 88 H Br H OH H H H 89 H H H OH H H H 90 OH H OH H H H H 91 H H OH H H H H 92 H H H H H OH H 93 H OH H H H OH H 94 H Br H H H OH H 95 H H H CH3 H OH H 96 H Br H OH H OH H O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 76 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 77 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 97 OH H OH H H OH H 98 H CH3 H H H OH H 99 H H H OH H OH H 100 H H OH H H OH H 101 H H H H OH OH H 102 H OH H H OH OH H 103 H Br H H OH OH H 104 H CH3 H H OH OH H 105 H H H OH OH OH H 106 H Br H OH OH OH H 107 OH H OH H OH OH H 108 H H H CH3 OH OH H 109 H H OH H OH OH H 110 H H H H OH OH OH 111 H OH H H OH OH OH 112 H Br H H OH OH OH 113 H CH3 H H OH OH OH O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 77 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 78 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 114 H Cl H H OH OH OH 115 H Br H OH OH OH OH 116 H H H OH OH OH OH 117 H H H CH3 OH OH OH 118 OH H OH H OH OH OH 119 H H OH H OH OH OH 120 H OH H H H CH3 H 121 H H OH H H CH3 H 122 OH H OH H H CH3 H 123 H H H H H NH2 H 124 H Br H H H NH2 H 125 H OCH3 H H H NH2 H 126 H CH3 H H H NH2 H 127 H NH2 H H H NH2 H 128 H Cl H H H NH2 H 129 H H H CH3 H NH2 H 130 H H H OCH2CH3 H NH2 H O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 78 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 79 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 131 H H H OCH3 H NH2 H 132 H Br H OCH3 H NH2 H 133 H H OCH3 H H NH2 H 134 OCH3 H OCH3 H H NH2 H 135 H H H H NH2 H H 136 H Br H H NH2 H H 137 H OCH3 H H NH2 H H 138 H CH3 H H NH2 H H 139 H Cl H H NH2 H H 140 H H H CH3 NH2 H H 141 H H H OCH2CH3 NH2 H H 142 H H H OCH3 NH2 H H 143 H Br H OCH3 NH2 H H 144 H H OCH3 H NH2 H H 145 OCH3 H OCH3 H NH2 H H 146 H NH2 H H H H H 147 H NH2 H H H OCH3 H O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 79 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 80 Compuesto R5 R6 R 7 R8 R3’ R 4’ R5’ 148 H NH2 H H OCH3 OCH3 H Tabla 2. 3-benzoil-4-hidroxicumarinas. Compuesto R6 R 7 R 149 H H 150 H H 151 H H 152 H H 153 H H 154 H H 155 H H OCH 3 Cl NO 2 CH3 Cl Cl S O O O OH R R6 R7 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 80 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 81 Compuesto R6 R 7 R 156 H H 157 CH3 158 CH3 159 CH3 CH3 Tabla 3. 3-cinamoilcumarinas y análogos. 160-183 184-186 Compuesto R6 R8 R 2’ R3’ R4’ R5’ R6’ 160 H H H H H H H 161 H H H H OCH3 H H 162 H H H H Cl H H 163 H H H H CH3 H H 164 H H OCH3 H OCH3 H H 165 H H OCH3 H OCH3 OCH3 H O S OO O R 6 R 8 R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' O Het O O R6 R8 O O O OH R R6 R7 81 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 82 160-183 184-186 Compuesto R6 R8 R 2’ R3’ R4’ R5’ R6’ 166 H H OCH3 H OCH3 H OCH3 167 H H OCH3 H NO2 H H 168 H H H NO2 H H H 169 H H H OCH3 OCH3 H H 170 H H OCH3 OCH3 H H H 171 H H OCH3 H H OCH3 H 172 Cl H H H OCH3 H H 173 Cl H H H CH3 H H 174 Cl H OCH3 H OCH3 H H 175 Cl H OCH3 H OCH3 OCH3 H 176 Cl H OCH3 H OCH3 H OCH3 177 Cl H OCH3 H H OCH3 H 178 Cl H H OCH3 H OCH3 H 179 H OCH3 H H OCH3 H H 180 H OCH3 OCH3 H OCH3 H H 181 H OCH3 OCH3 H OCH3 OCH3 H OO O R 6 R 8 R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' O Het O O R6 R8 82 Resultados y discusión 2. Estrategia Sintética 83 160-183 184-186 Compuesto R6 R8 R 2’ R3’ R4’ R5’ R6’ 182 H OCH3 OCH3 H H OCH3 H 183 H OCH3 H OCH3 H OCH3 H 184 H H 185 H H 186 Cl H Tabla 4. 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas y derivados. 187-202 203-206 Compuesto R2’ R3’ R4’ R5’ R6’ 187 H H H H H 188 H H OCH3 H H 189 H H Cl H H 190 H H CH3 H H OO O R 6 R 8 R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' O Het O O R6 R8 S N S OO O R2' R4' R3' R5' R6' OH O Het O OOH 83 Resultados y discusión 3. Estudios biológicos 90 Otras series de derivados cumarínicos hidroxi-sustituidos como las 3arilcumarinas preparadas en nuestro grupo también han sido estudiadas, obteniéndose también resultados prometedores que verifican el elevado potencial del núcleo cumarínico como esqueleto para agentes antioxidantes.267,268 3.3. Estudio de la actividad tripanocida. La enfermedad de Chagas está causada por el parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y representa un problema de salud importante en la mayoría de los países de Latinoamérica y el sur de Estados Unidos. Durante el transcurso de la infección por T. cruzi y del desarrollo de la enfermedad, se pueden producir ROS como consecuencia de la destrucción de tejido causada por secreciones tóxicas del parásito, por reacciones citotóxicas mediadas por el sistema inmune y por daño secundario en el miocardio. Por tanto, la intervención con compuestos antioxidantes que puedan reducir las ROS, pueden presentar efectos beneficiosos para prevenir o detener el estrés oxidativo generado por el parásito tras la infección.269,270 Por tanto, dada la posible relación entre las propiedades antioxidantes y la actividad tripanocida, se realizaron estudios de la actividad tripanocida sobre la serie de compuestos previamente mencionados que contenían grupos catecol (compuestos 101 , 1 102 , 1 104 , 1 106 y 1 107 ). Todos los compuestos, a excepción del compuesto 1 106 , presentaron una actividad tripanocida moderada. Sin embargo, se observó que aquellos compuestos que presentaban mayor actividad, eran aquellos que tenían valores de ORAC más bajos, de modo que estos resultados pueden ser tomados en cuenta para futuros estudios a cerca del mecanismo de acción de este tipo de compuestos frente a T. cruzi. 3.4. Estudio como ligandos de receptores de adenosina. Los receptores de adenosina (ARs) son receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) que exhiben un enorme número de actividades fisiológicas a través de la activación de cuatro subtipos diferentes de receptores: A1, A2A, A2B y A3.271 La mayoría de los antagonistas de los receptores de adenosina son nuevos y prometedores candidatos a fármacos para un gran número de procesos patológicos, tales como inflamación, fallos renales y cardíacos o desórdenes neurológicos como las enfermedades de Parkinson y Alzheimer.272,273 Entre los antagonistas no clásicos, los derivados de flavonas e isoflavonas presentan un papel destacado, como el caso de la genisteina, que ha sido descrita como un antagonista competitivo frente al receptor A1 90 Resultados y discusión 3. Estudios biológicos 91 en células FRTL (tiroides),274 o como la galanginina, que presenta actividad micromolar para el receptor A3.275 Por tanto, dada la similitud estructural entre flavonas, cumarinas, y chalconas, hemos considerado evaluar la actividad de algunos tipos de híbridos cumarinachalcona frente a los cuatro subtipos de receptores de adenosina humanos expresados en células ováricas de hámster chino (CHO cells). Los compuestos estudiados en este tipo de ensayos poseen el esqueleto de chalcona como núcleo estructural principal, y los diferentes derivados han sido preparados basándonos en la sustitución de uno o ambos anillos bencílicos (anillos A y/o B) de la chalcona por una cumarina y/o un grupo tiofeno con diferentes sustituyentes. Los compuestos estudiados y sobre los que hemos hecho el estudio de relación estructura-actividad han sido los compuestos 1 161 , 184 , 1 188,203 , 2 214 y 2 224 , llegando a la conclusión de que una selectividad hacia el receptor de adenosina hA3 se conseguía fundamentalmente cuando el anillo B de la chalcona era sustituido por un tiofeno, y el anillo A era sustituido por el anillo de pirona incluido en el esqueleto de cumarina (compuesto 1 184 ).276 Siguiendo la línea del trabajo anterior, decidimos seguir estudiando el potencial de los híbridos cumarina-chalcona como ligandos de adenosina. Realizamos un estudio sobre híbridos metoxi/hidroxi-3-benzoilcumarina (compuestos 1 19 , 2 25 , 2 26 , 3 30 y 9 97 , 101 , 1 102 y 1 107 , respectivamente). Un estudio preliminar de la relación estructuraactividad de los derivados estudiados mostró que, en general, los derivados metoxi sustituídos (1 19 , 2 25 , 2 26 , 3 30 ) presentaron buenas afinidades de unión y selectividad hacia el hA3AR, mientras que los derivados hidroxi sustituídos (1 101 , 1 102 y 1 107 ) presentaron una actividad moderada pero selectividad hacia el hA1AR. Se observó también que las posiciones 5 y 7 del anillo de cumarina resultaban cruciales par la potencia y selectividad de ambas series de compuestos.277 3.5. Estudio de la actividad antibacteriana. Se conocen múltiples ejemplos de cumarinas278 y chalconas144 que presentan un amplio rango de actividades antibacterianas. Estudios realizados en nuestro grupo, muestran que tanto el núcleo cumarínico simple, como derivados de 3-arilcumarinas, presentan interesantes actividades frente a bacterias patógenas humanas.279,280 Con la intención de ampliar el tipo de estudios antibacterianos no sólo sobre patógenos humanos, y teniendo en cuenta la importancia de la acuicultura tanto en nuestra región como sobre la economía mundial, se realizaron ensayos antibacterianos 91 Resultados y discusión 3. Estudios biológicos 92 con patógenos marinos con el fin de encontrar candidatos para tratamientos en acuicultura. Así, además del estudio con bacterias humanas como Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa o Staphylococcus aureus, los patógenos marinos a estudiar fueron aquellos pertenecientes al género Tenacibaculum, siendo Tenacibaculum maritimum el más estudiado. Esta bacteria es la causante de la tenacibaculosis, una enfermedad que produce desagradables lesiones sobre la superficie del cuerpo de los peces tales como úlceras, necrosis, malformaciones en la boca, o aletas y colas de aspecto putrefacto, entre otras,281,282 por lo que aunque estos patógenos son inocuos para el ser humano, sus efectos sobre los organismos marinos producen daño y hacen que su aspecto no sea bueno para su comercialización. Los compuestos empleados para estos estudios y sobre los que hemos hecho el estudio de relación estructura-actividad han sido los compuestos 1 1 , 3 3-5 y 1 123, 124 , 1 130, 131, 135, 136, 141 y 142 . Observamos que de la serie estudiada, ninguno de los compuestos fue activo frente a las bacterias patógenas humanas estudiadas. Sin embargo, los compuestos que poseían un grupo amino en su estructura (1 123, 124 , 1 130, 131, 135, 136, 141 y 142 ), mostraban de moderada a gran actividad frente a todas las cepas de Tenacibaculum maritimum, con órdenes iguales o superiores a los patrones empleados y que actualmente se emplean para el tratamiento de la tenacibaculosis, como la enrofloxacina, cuya actividad no es selectiva frente a T. maritimum, ya que también es altamente activa frente a las bacterias humanas ensayadas. La presencia de este grupo amino resultó ser clave para la actividad de los compuestos, así como la sustitución en la posición 8 del núcleo de cumarina, siendo los compuestos 1 130 , 131 , 141 y 1 142 los más activos.283 Por tanto, la elevada actividad de estos compuestos y su selectividad solo frente a distintas cepas de la bacteria marina T. maritimum pueden evitar futuros problemas de resistencia en patógenos humanos, haciendo a estos compuestos buenos candidatos para el tratamiento de la tenacibaculosis. 92 Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 93 " "      1. Artículos publicados o en fase de publicación9 97 2. Compuestos preparados bajo estudio y pendientes de publicación2 257      93   Parte experimental Generalidades 95  La presentación de esta Memoria incluye los artículos publicados, enviados y en fase de preparación. Las rutas sintéticas utilizadas para los compuestos ya publicados, la caracterización de los mismos, los ensayos farmacológicos y electroquímicos realizados, así como los estudios estructurales y de SAR se presentan a continuación de forma detallada y discutida en cada uno de los respectivos manuscritos. Por tanto, dichos artículos serán incluidos en este apartado de parte experimental de esta Memoria. Aquellos compuestos que a la hora de presentar esta Memoria todavía no han sido publicados pero que han sido preparados y se encuentran bajo estudio, se encuentran caracterizados en la sección 2 del apartado de Parte Experimental. 95 Parte Experimental 1. Artículos 97 1.1. Artículos publicados. 1. “Diastereospecific Nazarov Cyclization of Fully Substituted Dienones: Generation of Vicinal All-Carbon-Atom Quaternary Stereocenters” (Jolit, A.*; VazquezRodriguez, S.; Yap, G.P.A.; Tius, M.A.) – Angewandte Chemie International Edition 2013 , 52, 1-5. 2. Synthesis of 3-Arylcoumarins via Suzuki-cross-coupling Reactions of 3Chlorocoumarin” (Matos, M.J.*; Vazquez-Rodriguez, S.; Borges, F.; Santana, L.; Uriarte, E.) – Tetrahedron Letters 2011 , 52, 1225-1227. 3. “3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin” (Vazquez-Rodriguez, S.*; Uriarte, E.; Santana, L. Acta Cryst. 2 2013 , E69, o345. 4. “Focusing on New Monoamine Oxidase Inhibitors: Differently Substituted Coumarins As An Interesting Scaffold” (Matos, M.J.; Viña, D.; Vazquez-Rodriguez, S.; Uriarte, E.; Santana, L.*) – Current Topics in Medicinal Chemistry 2 2012 , 12, 2210-2239. 5. “MAO Inhibitory Activity Modulation: 3-Phenylcoumarins versus 3Benzoylcoumarins” (Matos, M.J.; Vazquez-Rodriguez, S.; Uriarte, E.; Santana, L.; Viña, D.*) – Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2011 , 21, 4224-4227. 6. “Hydroxycoumarins as Selective MAO-B Inhibitors” (Serra, S.*; Ferino, G.; Matos, M.J.; Vázquez-Rodríguez, S.; Delogu, G.; Viña, D.; Cadoni, E.; Santana, L.; Uriarte, E.) – Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2 2012 , 22, 258-261. 7. "Synthesis, electrochemical and biological studies on novel coumarinchalcone hybrid compounds" (Pérez-Cruz, F.; Vazquez-Rodriguez, S.*; Matos, M.J.; Herrera-Morales, A.; Villamena, F.; Das, A.; Gopalakrishnan, B.; Olea-Azar, C.; Santana, L.; Uriarte, E.) – Journal of Medicinal Chemistry, 2 2013 , 56, 6136-6145. 8. “Synthesis of coumarin-chalcone hybrids and evaluation of their antioxidant and trypanocidal properties“ (Vazquez-Rodriguez, S.*; Figueroa-Guíñez, R.; Matos, M.J.; Santana, L.; Uriarte, E.; Lapier, M.; Maya, J.D.; Olea-Azar, C.*) – MedChemComm 2013 , 4, 993-1000. 97 Parte Experimental 1. Artículos 98 9. “Synthesis and evaluation of antioxidant and trypanocidal properties of a selected series of coumarin derivatives” (Figueroa Guíñez, R.; Matos, M.J.*; VazquezRodriguez, S.; Santana, L.; Uriarte, E.; Olea-Azar, C.*; Maya, J.D.) – Future Medicinal Chemistry, 2 2013 , 5, 1911-1922. 10. “Remarkable antioxidant properties of a series of hydroxy-3-arylcoumarins” (Matos, M.J.*; Pérez-Cruz, F.; Vazquez-Rodriguez, S.; Uriarte, E.; Santana, L.; Borges, F.; Olea-Azar, C.) – Bioorganic & Medicinal Chemistry 2 2013 , 21, 3900–3906. 11. “Chalcone-based derivatives as new scaffolds for hA3 adenosine receptor antagonists” (Vazquez-Rodriguez, S.*; Matos, M.J.; Santana, L.; Uriarte, E.; Borges, F.; Kachler, S.; Klotz, K.-N.) – Journal of Pharmacy & Pharmacology 2 2013 , 65, 697-703. 12. “Synthesis and Structure-Activity Relationships of Novel Amino/Nitro Substituted 3-Arylcoumarins as Antibacterial Agents” (Matos, M.J.*; VazquezRodriguez, S.; Santana, L.; Uriarte, E.; Fuentes-Edfuf, C.; Santos, Y.; Muñoz-Crego, A.) - Molecules 2 2013 , 18, 1394. 13. “Looking for New Targets: Simple Coumarins as Antibacterial Agents” (Matos, M.J.;* Vazquez-Rodriguez, S.; Santana, L.; Uriarte, E.; Fuentes-Edfuf, C.; Santos, Y.; Muñoz-Crego, A.) – Medicinal Chemistry 2 2012 , 8, 1140-1145. 98 Parte Experimental 1. Artículos 99 1.2. Artículos en fase de publicación. 14. “Synthesis and Antibacterial Evaluation of Coumarin-Chalcone Hybrids as New and Potent Agents for Tenacibaculosis” (Vazquez-Rodriguez, S.*; Díaz, A.; Matos, M.J.; Serra, S.; Uriarte, E.; Santana, L.; Muñoz-Crego, A.; Santos, Y.) –Enviado. 15. “3-Benzoylcoumarins as new selective scaffolds for modulation of the hA1 and hA3 binding affinity. Synthesis, Biological assays and docking studies.” (VazquezRodriguez, S.*; Serra, S.; Uriarte, E.; Santana, L.; Kachler, S.; Klotz, K.N.; Vilar, S.) – Enviado. 99 acids via C–OH bond activation. 29 Accordingly, the 4-hydroxy group is converted in pseudohalides, such as triflates or tosylates which are used instead of halides in a coupling reaction with arylboronic acids (via a Suzuki type reaction). In other cases, the aryl substituents have been successfully incorporated in 4-position of the hydroxycoumarin using organostannanes 30 or organozinc compounds 31 under Stille or Negishi conditions, respectively. However, the formation of the aryl C–C bond using coumarin as starting material is till now an uncommon subject. 32,33 To our knowledge, few papers have been published so far concerning the 3-arylation of coumarin nucleus by direct coupling under Suzuki conditions: in all these cases, the halide was 3-bromocoumarin. And the catalysts were the classic palladium acetate (Pd(OAc) 2 ), tetrakis(triphenylphosphine)palladium (0) Pd(PPh3) 434,35 , and [1,1 0 - bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II) dichloride. 36,37 Salen ligand has been found to be a highly active catalyst for the Suzuki reaction performed with aryl iodides, bromides, and chlorides, giving excellent yields, in a short reaction time. 38,39 Salen ligand is a brightyellow solid, solublein polar organic solvents,and effective in C–C bond forming reactions with high selectivity. This symmetrical palladium(II) complex was a product of the reaction of the Salen ligand with palladium acetate (for 20 h at room temperature) in a good yield. This complex promotes a catalytic activity in a low concentration (0.5 mol %). 40 Noteworthy to mention that Salenis a chelating ligand generally used in coordination chemistry and homogeneous catalysis. 41 Althoughsignificantadvanceshavebeenperformedinthemetalcatalyzed synthesis, the palladium-catalyzed cross-coupling reaction using 3-chlorocoumarin to afford 3-arylcoumarins has never been described. This constraint encourages us to explore this syntheticstrategy.Accordingly,preliminaryexperimentsweredone to examine the effect of various ligands for Pd-based coupling. 42,43 The most promising one was N,N 0 -bis(salicylidene)-ethylenediamino-palladium (salen-Pd). In fact, Pd(OAc) 2 -salen couple in presence of a Na 2 CO 3 in DMF/H 2 O (1:1) was found to be an efficient catalytic system to obtain a variety of 3-arylcoumarin derivatives (Scheme 1). 40 As coumarins are sensitive substrates to alkaline conditions, and may result in the cleavage of the lactone ring, the solvent, and base for the coupling reaction were carefully studied. To optimize the reaction the influence of the palladium source in the catalytic activity was also performed. Pd(OAc) 2 was found to be the best option. 40 After reaction optimization, the influence of the Pd-salen complexin theSuzukireaction involvingcross-coupling ofa coumarin halide and different arylboronic acids was investigated. The Suzuki reaction developed herein was found to be effective when using arylboronic acids with a variety of functional groups. Furthermore the reaction works with iodo-, bromoor chloro-coumarin substrates. Different reaction times are required for each coumarin halide type. Although it is well-known that in Suzuki reaction the chloride derivatives are less reactive than the bromide or the iodide ones, the use of the 3-chlorocoumarin as starting material in the reaction is related with its commercial availability. The synthesis of 3-iodocoumarin and 3-bromocoumarin involves the introduction of other synthetic steps in the overall reaction. Comparing the synthetic route herein proposed with the classic one, previously reported by us, 7,8 one can verify that both are easy and not too expensive methodologies. The main advantage of this new synthetic approach is that it can afford 3-arylcoumarins with different substitution patterns. By means of the traditional methodology, hydroxyl and nitro derivatives could not be obtained and/or purified. The reaction was not clean and the obtained crude product was a complex mixture with several sub-products and the purification process was worthless. The reaction versatility is the main advantage of this synthetic strategy comparing to the classic Perkin reaction. Compounds 4–7 44–46 and 10 47 are exclusively prepared by the Suzuki methodology while compounds 1–3,8, and 9 can be prepared by both methods (Table 1). 48–50 The proposed synthetic strategy operates from microto macro-scale and avoids the formation of undesired sub-products. The palladium complex can be easily and almost totally recuperated at the end of the process. The catalyst is recovered from the reaction mixture when the product is purified by flash chromatography and it is ready to be reused. This subject has great interest because of the toxicity and the cost of palladium complexes. In conclusion, a novel and versatile route for the synthesis of 3arylcoumarins is proposed. The palladium cross-coupling reaction can be applied to obtain a series of different functionalized derivatives. In addition, we have shown that N,N 0 -bis(salicylidene)-ethylenediamino-palladium proved to be a good catalyst for the Suzuki reaction of heterocyclic activated chlorides with arylboronic acids, under aerobic conditions. This methodology is an efficient synthetic route for obtaining different 3-arylcoumarins. Acknowledgments The authors thank the Spanish Ministry (PS0900501) and Xunta da Galicia (INCITE09E2R203035ES and PGIDIT09CSA030203PR) for the financial support. M.J.M. thanks Fundação de Ciência e Tecnologia for the SFRH/BD/61262/2009 scholarship. References and notes 1. Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E. Curr. Med. Chem. 2005,12, 887–916. O OO O Cl 1-9 (a) R O O N 10 60 % Cl 1: R=H 2: R=p-OMe 3: R=m-OMe 4: R=m-OH 5: R=p-NO2 6: R=m-NO2 7: R=m-NH2 8: R=p-Me 9: R=p-Cl (a) 61 % 58 % 56 % 64 % 65 % 55 % 59 % 63 % 61 % Scheme 1. Synthesis of 3-arylcoumarin derivatives. Reagents and conditions: (a) 3chlorocoumarin (1.0 equiv), phenylboronic acid/2-chloro-5-pyridineboronic acid (1.25 equiv), sodium carbonate (2.0 equiv), palladium complex (0.5 mol %), DMF/ H 2 O (1:1), 110 C, 120–180 min. Table 1 Synthesis of 3-arylcoumarins (1–10) by Perkin reaction and/or via Suzuki-crosscoupling reaction Compounds Perkin reaction a Suzuki reaction b Time (min) Yield (%) Time (min) Yield (%) 11440 60 120 61 21440 65 120 58 31440 68 120 56 4⁄⁄180 64 5⁄⁄160 65 6⁄⁄160 55 7⁄⁄160 59 81440 70 120 63 92160 63 140 61 10 ⁄⁄140 60 * Compounds 4–7and 10 are exclusively prepared by the Suzuki methodology. a Conditions: phenylacetic acids, DCC, DMSO, 110 C, 24–36 h. b Reactions with 3-chlorocoumarin. Compound 1was synthesized using 3-bromocoumarin—reaction time: 100 min; yield: 70%. 1226 M. J. Matos et al. /Tetrahedron Letters 52 (2011) 1225–1227  106 2. Kontogiorgis, C.; Hadjipavlou-Litina, D. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2003,18, 63–69. 3. 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The obtained crude product was purified by column chromatography (hexane/ethyl acetate 9:1) to give the coumarins (1–9). 3-(3 0 -Nitrophenyl)coumarin (6): yellow solid, yield 55%; mp 252–3 C. 1 H NMR (CDCl 3 ): d= 7.17–7.22 (m, 2H, H-7, H-8), 7.39–7.48 (m, 3H, H-5, H-6, H-5 0 ), 7.52–7.54 (m, 1H, H-6 0 ), 7.60–7.71 (m, 2H, H-4, H-4 0 ), 8.44 (s, 1H, H-2 0 ). 13 C NMR (CDCl 3 ): d= 110.0, 114.2, 116.7, 117.6, 119.3, 122.8, 125.5, 128.5, 131.1, 132.6, 132.7, 141.4, 149.1, 152.8, 158.6. MS: m/z (%) = 268 (26), 267 (M + , 100), 239 (24), 221 (38), 193 (17) 165 (52), 164 (16), 163 (19), 139 (12), 82 (11). Anal. calcd. for C 15 H 9 NO 4 (267.24): C, 67.42; H, 3.39. Found: C, 67.38; H, 3.36. 3-(3 0 -aminophenyl)coumarin (7): white solid, yield 59%; mp 154–5 C. 1 H NMR (CDCl 3 ): d= 4.12 (s, 2H, –NH 2 ), 7.27–7.38 (m, 4H, H-2 0 , H-4 0 , H-6 0 , H-8), 7.47 (dd, 2H, H-6, H-7, J= 7.74, J= 1.31), 7.53–7.58 (m, 2H, H-5, H5 0 ), 7.88 (s, 1H, H-4). 13 C NMR (CDCl 3 ): d= 116.8, 118.8, 122.4, 125.0, 125.2, 127.2, 127.8, 128.7, 131.9, 133.3, 140.1, 152.6, 155.2, 157.3, 158.8. MS: m/z (%) = 239 (10), 238 (19), 237 (M + , 100), 182 (36), 181 (12), 152 (50), 124 (18), 89 (45), 63 (28), 62 (18). Anal. calcd. for C 15 H 11 NO 2 (237.25): C, 75.94; H, 4.67. Found: C, 76.00; H, 4.72. 47. 3-(4 0 -Chloropyridin-3 0 -yl)coumarin (10): white solid, yield 60%; mp 234–5 C. 1 H NMR (CDCl 3 ): d= 7.32–7.37 (m, 2H, H-5 0 , H-8), 7.46 (d, 2H, H-6, H-7, J= 7.51), 7.52–7.58 (m, 2H, H-5, H-6 0 ), 7.88 (s, 1H, H-4), 8.58 (s, 1H, H-2 0 ). 13 C NMR (CDCl 3 ): d= 116.8, 118.8, 122.3, 124.7, 125.0, 125.2, 127.2, 131.8, 137.0, 140.0, 147.7, 149.6, 152.7, 157.3. MS: m/z (%) = 260 (5), 259 (32), 258 (15), 257 (M + , 100), 223 (18), 182 (34), 152 (44) 123 (13), 89 (40), 85 (23), 71 (30), 63 (18), 57 (35). Anal. calcd. for C 14 H 8 ClNO 2 (257.57): C, 65.26; H, 3.13. Found: C, 65.24; H, 3.10. 48. Castaneda, F. Rendiconti Istituto Superiore di Sanita (Italian Edition) 1964,27, 99. 49. Sabitha, G.; Rao, A. V. Synth. Commun. 1987,17, 341–354. 50. Archer, J. F.; Grimshaw, J. J. Chem. Soc., Sect B: Phys. Org. 1969,3, 266–270. M. J. Matos et al. / Tetrahedron Letters 52 (2011) 1225–1227 1227  107 electronic reprint Acta Crystallographica Section E Structure Reports Online ISSN 1600-5368 Editors: W. T. A. Harrison, H. Stoeckli-Evans, E. R. T. Tiekink and M. Weil 3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin Saleta Vazquez-Rodriguez, Eugenio Uriarte and Lourdes Santana Acta Cryst. (2013). E69, o345 This open-access article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Licence http://creativecommons.org/licenses/by/2.0/uk/legalcode, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original authors and source are cited. Acta Crystallographica Section E: Structure Reports Online is the IUCr’s highly popular open-access structural journal. It provides a simple and easily accessible publication mechanism for the growing number of inorganic, metal-organic and organic crystal structure determinations. The electronic submission, validation, refereeing and publication facilities of the journal ensure very rapid and high-quality publication, whilst key indicators and validation reports provide measures of structural reliability. The journal publishes over 4000 structures per year. The average publication time is less than one month. Crystallography Journals Online is available from journals.iucr.org Acta Cryst. (2013). E69, o345 Vazquez-Rodriguez et al. ·C17H11NO6  109 3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin Saleta Vazquez-Rodriguez,* Eugenio Uriarte and Lourdes Santana Department of Organic Chemistry, University of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, A Coruna, Spain Correspondence e-mail: [email protected] Received 21 January 2013; accepted 29 January 2013 Key indicators: single-crystal X-ray study; T= 100 K; mean (C–C) = 0.003 A ˚; Rfactor = 0.043; wR factor = 0.126; data-to-parameter ratio = 13.1. In the title coumarin derivative (also known as 2H-chromen-2one or 2H-1-benzopyran-2-one), C 17 H 11 NO 6 , the coumarin ring system is nearly planar, with a dihedral angle of 3.35 (9) between the pyrone and the benzene rings. The dihedral angle between the planes formed by the coumarin ring system and the benzene substituent is 54.60 (7), clearly showing the noncoplanarity of the whole aromatic system. The crystal studied was a non-merohedral twin; the minor component refined to approximately 0.44. Related literature For the synthesis of the title compound, see: Raju et al. (2010). For examples of the biological activity of coumarin derivatives, see: Borges et al. (2009), Matos et al. (2011a,b,c), Vin ˜aet al. (2012a,b); Vazquez-Rodriguez et al. (2013). Experimental Crystal data C 17 H 11 NO 6 M r = 325.27 Monoclinic, P21=n a= 8.875 (3) A ˚ b= 17.266 (5) A ˚ c= 9.174 (3) A ˚ = 95.401 (15) V= 1399.6 (7) A ˚ 3 Z=4 Mo Kradiation = 0.12 mm 1 T= 100 K 0.67 0.14 0.03 mm Data collection Bruker APEXII CCD diffractometer Absorption correction: multi-scan (SADABS; Bruker, 2007) T min = 0.604, T max = 0.745 30736 measured reflections 2864 independent reflections 2200 reflections with I>2(I) R int = 0.054 Refinement R[F 2 >2(F 2 )] = 0.043 wR(F 2 ) = 0.126 S= 0.91 2864 reflections 219 parameters H-atom parameters constrained  max = 0.39 e A ˚ 3  min =0.26 e A ˚ 3 Data collection: APEX2 (Bruker, 2007); cell refinement: SAINT (Bruker, 2007); data reduction: SAINT; program(s) used to solve structure: SIR97 (Altomare et al., 1999); program(s) used to refine structure: SHELXL97 (Sheldrick, 2008); molecular graphics: ORTEP-3 for Windows (Farrugia, 2012); software used to prepare material for publication: WinGX (Farrugia, 2012). This work was partially supported by the funds of the Xunta da Galicia (09CSA030203PR) and the Ministerio de Sanidad y Consumo (PS09/00501). SVR thanks the FPU program for her PhD grant AP2008–04263. Supplementary data and figures for this paper are available from the IUCr electronic archives (Reference: GO2080). References Altomare, A., Burla, M. C., Camalli, M., Cascarano, G. L., Giacovazzo, C., Guagliardi, A., Moliterni, A. G. G., Polidori, G. & Spagna, R. (1999). J. Appl. Cryst. 32, 115–119. Borges, F., Roleira, F., Milhazes, N., Uriarte, E. & Santana, L. (2009). Front. Med. Chem. 4, 23–85. Bruker (2007). APEX2,SAINT and SADABS. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA. Farrugia, L. J. (2012). J. Appl. Cryst. 45, 849–854. Matos, M. J., Santana, L., Uriarte, E., Delogu, G., Corda, M., Fadda, M. B., Era, B. & Fais, A. (2011c). Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 3342–3345. Matos, M. J., Tera ´n, C., Pe ´rez-Castillo, Y., Uriarte, E., Santana, L. & Vin ˜a, D. (2011a). J. Med. 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E69, o345 supplementary materials Acta Cryst. (2013). E69, o345 [doi:10.1107/S1600536813002948] 3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin Saleta Vazquez-Rodriguez, Eugenio Uriarte and Lourdes Santana Comment Coumarin derivative compounds present a great interest in the medicinal chemistry field due to the displayed biological properties that they present (Borges et al. 2009, Matos et al. 2011a, Matos et al. 2011b, Matos et al. 2011c, VazquezRodriguez et al. 2013, Viña et al. 2012a and Viña et al. 2012b). The title structure is a 3-substituted coumarin derivative containing a 4-methoxybenzoyl ring at the mentioned position and a nitro group at position 6 of the coumarin scaffold. Therefore, the X-ray analysis of this compound (figure 1) aims to contribute to the elucidation of structural requirements needed to understand the partial planarity of the compound (coumarin nucleus) and the torsion of the 3-benzoyl moiety regarding to this nucleus. From the single-crystal diffraction measurements one can conclude that both the pyrone and benzene rings in the coumarin motif are essentially planar, presenting dihedral angle of 3.35 (9)°. The planarity of the coumarin moiety is also evident by the torsion angle value between their carbons C3—C2—C7—C8 (-175.89 (18)°). In addition, the torsion angles of the carbonyl group versus the coumarin moiety and the phenyl ring are C10—C9— C15—O16 (43.2 (2)°) and O16—C15—C17—C18 (-152.9 (2)°) respectively. These values are typical of the torsion permitted by the rotation present at position 3. Presence of the carbonyl group at position 3 provokes a non coplanarity of the benzoyl moiety regarding to the coumarin scaffold. This fact is evident taking into account the dihedral angles formed by the planes of the coumarin, the carbonyl and the phenyl groups. Dihedral angle between the coumarin moiety and the carbonyl group is 38.66 (9)°; between the carbonyl and the phenyl group is 25.76 (10)° and between the coumarin scaffold and the phenyl group is 54.60 (7)°. Experimental 3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin was prepared according to the following protocol: to a solution of 2-hydroxy-5nitrobenzaldehyde (1 mmol) and ethyl 4-methoxybenzoylacetate (1 mmol) in ethanol (4 ml), a catalytic amount of piperidine (5%) was added dropwise and the reaction was stirred at refluxed for 4 h. The precipitated was filtered and the solid obtained was recrystallized in dichlomethane/methanol in a 73% yield. Mp 257–259 °C. Refinement H atoms were treated as riding atoms with C—H(aromatic), 0.95Å with Uiso = 1.2Ueq(C), C—H(methyl) = 0.98Å, with Uiso = 1.5Ueq(C). The positions of methyl hydrogens were checked on a final difference map. The structure was refined as a two-component non-merohedral twin with a BASF parameter of 0.4374. Computing details Data collection: APEX2 (Bruker, 2007); cell refinement: SAINT (Bruker, 2007); data reduction: SAINT (Bruker, 2007); program(s) used to solve structure: SIR97 (Altomare et al., 1999); program(s) used to refine structure: SHELXL97 (Sheldrick, 2008); molecular graphics: ORTEP-3 for Windows (Farrugia, 2012); software used to prepare material for publication: WinGX (Farrugia, 2012).  111 supplementary materials sup-2 Acta Cryst. (2013). E69, o345 Figure 1 Molecular structure of the title compound with the atom-numbering scheme. Displacement ellipsoids are drawn at the 50% probability level. Figure 2 Packing diagram of the title structure viewed along the b axis. 3-(4-Methoxybenzoyl)-6-nitrocoumarin Crystal data C17H11NO6 Mr = 325.27 Monoclinic, P21/n a = 8.875 (3) Å b = 17.266 (5) Å c = 9.174 (3) Å β = 95.401 (15)° V = 1399.6 (7) Å3 Z = 4 F(000) = 672 Dx = 1.544 Mg m−3 Mo Kα radiation, λ = 0.7107 Å  112 supplementary materials sup-3 Acta Cryst. (2013). E69, o345 Cell parameters from 1848 reflections θ = 2.4–26.2° µ = 0.12 mm−1 T = 100 K Prism, colourless 0.67 × 0.14 × 0.03 mm Data collection Bruker APEXII CCD diffractometer Radiation source: fine-focus sealed tube Graphite monochromator ω and phi scans Absorption correction: multi-scan (SADABS; Bruker, 2007) Tmin = 0.604, Tmax = 0.745 30736 measured reflections 2864 independent reflections 2200 reflections with I > 2σ(I) Rint = 0.054 θmax = 26.5°, θmin = 2.4° h = −11→11 k = 0→21 l = 0→11 Refinement Refinement on F2 Least-squares matrix: full R[F2 > 2σ(F2)] = 0.043 wR(F2) = 0.126 S = 0.91 2864 reflections 219 parameters 0 restraints Primary atom site location: structure-invariant direct methods Secondary atom site location: difference Fourier map Hydrogen site location: inferred from neighbouring sites H-atom parameters constrained w = 1/[σ2(Fo2) + (0.0871P)2 + 0.3903P] where P = (Fo2 + 2Fc2)/3 (Δ/σ)max < 0.001 Δρmax = 0.39 e Å−3 Δρmin = −0.26 e Å−3 Special details Experimental. 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ p.p.m. 8.29 (d, J = 3.2 Hz, 1H, H-4), 7.75 (dd, J = 9.8, 3.1 Hz, 1H, H-7), 7.69–7.56 (m, 3H, H-5, o-H-2, o-H-6), 7.04 (d, J = 8.3 Hz, 2H, m-H-3, m-H5), 6.08 (d, J = 9.6 Hz, 1H, H-8), 3.83 (s, 3H, –OMe); 13C NMR (63 MHz, DMSO-d6) δ p.p.m. 192.91, 177.98, 166.65, 162.34, 138.75, 131.40, 130.83, 130.47, 129.32, 128.05, 127.28, 121.24, 120.67, 113.84, 55.61; MS EI m/z (%): 326 ([M+1]+, 25), 325 ([M]+, 93), 190 (34), 135 (100), 92 (27), 77 (37); Elem. Anal. Calcd. for C17H11NO6: C, C, 62.77; H, 3.41; Found: C, 62.72; H, 3.32. Geometry. All s.u.'s (except the s.u. in the dihedral angle between two l.s. planes) are estimated using the full covariance matrix. The cell s.u.'s are taken into account individually in the estimation of s.u.'s in distances, angles and torsion angles; correlations between s.u.'s in cell parameters are only used when they are defined by crystal symmetry. An approximate (isotropic) treatment of cell s.u.'s is used for estimating s.u.'s involving l.s. planes. Refinement. Refinement of F2 against ALL reflections. The weighted R-factor wR and goodness of fit S are based on F2, conventional R-factors R are based on F, with F set to zero for negative F2. The threshold expression of F2 > 2σ(F2) is used only for calculating R-factors(gt) etc. and is not relevant to the choice of reflections for refinement. R-factors based on F2 are statistically about twice as large as those based on F, and Rfactors based on ALL data will be even larger. Fractional atomic coordinates and isotropic or equivalent isotropic displacement parameters (Å2) xyzU iso*/Ueq C2 0.0307 (2) 0.13803 (12) 0.5978 (2) 0.0137 (4) C3− 0.0864 (2) 0.16362 (12) 0.6744 (2) 0.0153 (5) H3− 0.1256 0.2145 0.6595 0.018* C4− 0.1455 (2) 0.11473 (12) 0.7723 (2) 0.0164 (5) H4− 0.2265 0.1310 0.8257 0.020* C5− 0.0842 (2) 0.04053 (13) 0.7918 (2) 0.0156 (5) C6 0.0352 (2) 0.01480 (13) 0.7193 (2) 0.0147 (5) H6 0.0751 −0.0358 0.7364 0.018* C7 0.0969 (2) 0.06452 (12) 0.6200 (2) 0.0131 (4)  113 supplementary materials sup-4 Acta Cryst. (2013). E69, o345 C8 0.2244 (2) 0.04597 (12) 0.5416 (2) 0.0135 (4) H8 0.2701− 0.0036 0.5544 0.016* C9 0.2809 (2) 0.09697 (11) 0.4506 (2) 0.0131 (4) C10 0.2034 (2) 0.17126 (12) 0.4186 (2) 0.0149 (5) C15 0.4152 (2) 0.07478 (12) 0.3707 (2) 0.0146 (5) C17 0.5336 (2) 0.13255 (12) 0.3473 (2) 0.0147 (5) C18 0.5631 (2) 0.19667 (12) 0.4378 (2) 0.0144 (5) H18 0.5055 0.2041 0.5189 0.017* C19 0.6746 (2) 0.24980 (13) 0.4121 (2) 0.0154 (5) H19 0.6941 0.2928 0.4756 0.018* C20 0.7579 (2) 0.23946 (12) 0.2922 (2) 0.0154 (5) C21 0.7319 (2) 0.17463 (12) 0.2022 (2) 0.0171 (5) H21 0.7901 0.1671 0.1216 0.021* C22 0.6222 (2) 0.12166 (12) 0.2302 (2) 0.0146 (5) H22 0.6064 0.0773 0.1694 0.018* C24 0.9071 (3) 0.35368 (12) 0.3471 (2) 0.0205 (5) H24A 0.9528 0.3331 0.4406 0.031* H24B 0.8180 0.3847 0.3641 0.031* H24C 0.9809 0.3862 0.3027 0.031* N11− 0.1513 (2)− 0.01184 (11) 0.89252 (19) 0.0186 (4) O1 0.08130 (16) 0.18773 (8) 0.49739 (15) 0.0152 (3) O12− 0.11434 (19)− 0.08064 (9) 0.89156 (18) 0.0273 (4) O13− 0.24056 (19) 0.01484 (9) 0.97419 (17) 0.0248 (4) O14 0.23187 (18) 0.21826 (9) 0.32929 (17) 0.0224 (4) O16 0.42438 (17) 0.00770 (9) 0.32955 (17) 0.0196 (4) O23 0.86233 (17) 0.29040 (8) 0.24994 (16) 0.0185 (4) Atomic displacement parameters (Å2) U11 U22 U33 U12 U13 U23 C2 0.0131 (10) 0.0141 (10) 0.0138 (10) −0.0044 (9) 0.0010 (8) 0.0002 (8) C3 0.0147 (11) 0.0139 (11) 0.0172 (11) 0.0022 (9) 0.0008 (9) −0.0025 (8) C4 0.0141 (11) 0.0192 (11) 0.0163 (11)− 0.0001 (9) 0.0030 (9)− 0.0046 (9) C5 0.0140 (10) 0.0202 (11) 0.0127 (10) −0.0056 (9) 0.0020 (8)− 0.0014 (9) C6 0.0145 (11) 0.0150 (11) 0.0143 (11)− 0.0009 (9) 0.0004 (9)− 0.0011 (8) C7 0.0102 (10) 0.0157 (10) 0.0132 (10) −0.0015 (9) 0.0003 (8) −0.0033 (8) C8 0.0139 (10) 0.0110 (10) 0.0154 (10) 0.0009 (9) −0.0006 (8) −0.0031 (8) C9 0.0120 (10) 0.0137 (11) 0.0140 (10) −0.0018 (9) 0.0023 (8) −0.0032 (8) C10 0.0112 (11) 0.0165 (11) 0.0172 (11)− 0.0016 (9) 0.0034 (9)− 0.0018 (9) C15 0.0134 (11) 0.0176 (12) 0.0130 (10) 0.0009 (9) 0.0017 (8) 0.0011 (8) C17 0.0132 (11) 0.0170 (12) 0.0143 (10) 0.0037 (9) 0.0038 (8) 0.0031 (8) C18 0.0120 (11) 0.0180 (12) 0.0136 (10) 0.0028 (9) 0.0037 (8) 0.0011 (8) C19 0.0155 (11) 0.0161 (10) 0.0145 (11) 0.0022 (9) 0.0014 (8) −0.0008 (9) C20 0.0112 (10) 0.0180 (12) 0.0171 (11) 0.0019 (9) 0.0020 (8) 0.0054 (9) C21 0.0154 (11) 0.0212 (12) 0.0155 (11) 0.0034 (9) 0.0063 (8) 0.0008 (9) C22 0.0163 (11) 0.0129 (11) 0.0149 (10) 0.0034 (9) 0.0020 (8)− 0.0015 (8) C24 0.0198 (12) 0.0183 (11) 0.0232 (12)− 0.0040 (10) 0.0013 (9) 0.0031 (9) N11 0.0188 (10) 0.0222 (11) 0.0151 (10)− 0.0038 (8) 0.0033 (8)− 0.0001 (8) O1 0.0138 (8) 0.0141 (7) 0.0183 (8) 0.0015 (6) 0.0047 (6) 0.0019 (6) O12 0.0319 (10) 0.0213 (9) 0.0304 (10)− 0.0009 (7) 0.0119 (7) 0.0048 (7)  114 supplementary materials sup-5 Acta Cryst. (2013). E69, o345 O13 0.0268 (9) 0.0303 (9) 0.0195 (8)− 0.0015 (8) 0.0134 (7)− 0.0017 (7) O14 0.0203 (9) 0.0209 (8) 0.0271 (9) 0.0003 (7) 0.0076 (7) 0.0086 (7) O16 0.0204 (8) 0.0160 (8) 0.0234 (9) 0.0007 (7) 0.0070 (7)− 0.0037 (6) O23 0.0174 (8) 0.0188 (8) 0.0200 (8)− 0.0043 (7) 0.0060 (6) 0.0018 (6) Geometric parameters (Å, º) C2—O1 1.365 (2) C15—C17 1.479 (3) C2—C3 1.381 (3) C17—C18 1.394 (3) C2—C7 1.405 (3) C17—C22 1.403 (3) C3—C4 1.372 (3) C18—C19 1.386 (3) C3—H3 0.9500 C18—H18 0.9500 C4—C5 1.397 (3) C19—C20 1.393 (3) C4—H4 0.9500 C19—H19 0.9500 C5—C6 1.377 (3) C20—O23 1.361 (3) C5—N11 1.459 (3) C20—C21 1.397 (3) C6—C7 1.400 (3) C21—C22 1.377 (3) C6—H6 0.9500 C21—H21 0.9500 C7—C8 1.433 (3) C22—H22 0.9500 C8—C9 1.343 (3) C24—O23 1.442 (3) C8—H8 0.9500 C24—H24A 0.9800 C9—C10 1.472 (3) C24—H24B 0.9800 C9—C15 1.506 (3) C24—H24C 0.9800 C10—O14 1.197 (3) N11—O13 1.230 (2) C10—O1 1.387 (3) N11—O12 1.233 (2) C15—O16 1.223 (3) O1—C2—C3 116.95 (18) C18—C17—C22 118.4 (2) O1—C2—C7 120.40 (19) C18—C17—C15 123.04 (19) C3—C2—C7 122.65 (19) C22—C17—C15 118.55 (19) C4—C3—C2 119.25 (19) C19—C18—C17 121.4 (2) C4—C3—H3 120.4 C19—C18—H18 119.3 C2—C3—H3 120.4 C17—C18—H18 119.3 C3—C4—C5 118.7 (2) C18—C19—C20 119.3 (2) C3—C4—H4 120.7 C18—C19—H19 120.3 C5—C4—H4 120.7 C20—C19—H19 120.3 C6—C5—C4 122.8 (2) O23—C20—C19 124.6 (2) C6—C5—N11 118.98 (19) O23—C20—C21 115.35 (19) C4—C5—N11 118.18 (19) C19—C20—C21 120.0 (2) C5—C6—C7 118.8 (2) C22—C21—C20 120.1 (2) C5—C6—H6 120.6 C22—C21—H21 119.9 C7—C6—H6 120.6 C20—C21—H21 119.9 C6—C7—C2 117.68 (19) C21—C22—C17 120.7 (2) C6—C7—C8 124.40 (19) C21—C22—H22 119.6 C2—C7—C8 117.91 (19) C17—C22—H22 119.6 C9—C8—C7 121.61 (19) O23—C24—H24A 109.5 C9—C8—H8 119.2 O23—C24—H24B 109.5 C7—C8—H8 119.2 H24A—C24—H24B 109.5 C8—C9—C10 120.03 (19) O23—C24—H24C 109.5 C8—C9—C15 119.64 (18) H24A—C24—H24C 109.5  115  ! "  #$ !"     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Environment Journal of Agricultural and Food Chemistry  239    &$0-"9BNCDMFCB989F=J5H=J9G7IFF9BH@MIG985GDCH9BH5BH=657H9F=5@5;9BHG   Page 21 of 25 ACS Paragon Plus Environment Journal of Agricultural and Food Chemistry  240        &$0-"*5H=CB5@89G=;BC:H<97CIA5F=B7<5@7CB9<M6F=87CADCIB8G            Page 22 of 25 ACS Paragon Plus Environment Journal of Agricultural and Food Chemistry  241     %")" +MBH<9G=GC:H<9H5F;9HAC@97I@9G#+'-+287'2*)32*/8/327=H'  D=D9F=8=B9F9:@IL<==+B@    'H' F9:@IL<  Page 23 of 25 ACS Paragon Plus Environment Journal of Agricultural and Food Chemistry  242  ("2:/8635BH=657H9F=5@57H=J=HM 5 C:H5F;9H7CADCIB8G9LDF9GG985G=B<=6=H=CB NCB9GAA 6  +),+0*! )30/ $'96+97 "'+69-/237' ,%$  ,%<=@9 ,%$   & & &  & &  & & & & 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Protein pockets in hA2A and hA3 were superimposed. b) Pose extracted for compound 3 inside the hA3 after docking. Hydrogen bonds are represented in yellow color. c) Hypothetical 10 binding mode for compound 5 (pink carbons) in the hA3. d) Pose obtained through docking simulations for compound 7 (green carbons) in the hA1 protein pocket. 15 Transformation of methoxy into hydroxy substituents resulted in a completely different selectivity, showing affinity for the hA1 instead of affinity for the hA3. The only compound of the hydroxylated series (5-8) that showed putative 20 affinity for both receptors was compound 5 (hA1 Ki = 39,500 and hA3 Ki = 34,500 nM), which bears a catechol group at positions 3’ and 4’ and no substituents in the coumarin moiety. The hypothetical binding mode for compound 5 in the 25 hA3 according to docking calculations is shown in Figure 2c. The compound can establish hydrogen bonds with residues Asn250, Ala69 and His272. As it was shown in the hA2A crystallized structure and previous molecular modeling studies,41,42 the 30 corresponding residue Asn250 seems to play an important role in ligand recognition. The pose shown by compound 5 inside the hA1 is similar to the described pose in the hA3. However, the pose was slightly shifted and calculations were not 35 able to retrieve a hydrogen bond with the residue Asn250. Introduction of an additional hydroxyl group at position 6 of the coumarin (compound 6), resulted in an increase of the binding affinity and selectivity for the hA1AR (Ki = 54,000 nM). 40 As well as in the case of the methoxy derivatives, the best binding affinities were found for compounds with hydroxyl substituents at positions 5 and 7 of the coumarin. Thereby, compound 7, with the same pattern of substitution 45 than quercetin, that is, hydroxyl groups at positions 5, 7, 3’ and 4’, presented selectivity for the hA1, and the best binding affinity, with a Ki value of 17,700 nM. Compound 8, with the same pattern of substitution than genistein (hydroxyl 50 substituents at positions 5, 7 and 4’) presented also selectivity for the hA1, with a Ki value of 29,100 nM. The pose obtained through docking for compound 7 in the hA1 protein pocket showed hydrogen bonds with residues Glu172, Asn254 55 and Thr277 (see Figure 2d). From these preliminary results, one can conclude that the nature and position of the substituents play a key role in both potency and selectivity for the hA1 or hA3 ARs. Positions 5 and 7 of the 60 coumarin moiety resulted to be important for the selectivity and potency. In the case of the methoxylated derivatives 1-4, only compounds presenting substituents at these positions (compounds 3 and 4) showed not only activity, 65 but also selectivity for the hA3AR. For the hydroxylated series (5-8), compounds with higher potency and selectivity for the hA1 were also those which bear the hydroxyl groups at positions 5 and 7 (compounds 7 and 8). There are different 70 residues in both hA1 and hA3 that can be important to explain selectivity. Hydrophobic residues in the hA3, such as the residues Val169 and Leu264 can contribute to ligand stabilization when the compounds bear hydrophobic 75 substituents like methoxy groups (compounds 3 and 4) (see Figure 3). However, the corresponding residues in the hA1, the Glu172 and Thr270 with hydrophilic characteristics, contribute to the binding of compounds with 80 polar substituents, such as hydroxyl groups (compounds 6-8). Nevertheless, compound 5 does not present substitutions in the coumarin ring and could adapt to the pocket in both proteins. Figure 3 shows the molecular surface originated by the 85  250 This journal is © The Royal Society of Chemistry [year] combination of both different residues that could be responsible for protein selectivity. Finally, analyzing the obtained theoretical results of the ADME properties, it can be observed that no violations of Lipinski’s rule (molecular 5 weight, logP, number of hydrogen donors and acceptors) were found for the described coumarins. Also, TPSA, described to be a predictive indicator of membrane penetration, was also found to be positive for these drug 10 candidates. 15 Figure 3. Molecular surface showing favoured interaction areas generated in the hA1(a) and hA3 (b). Red color represents hydrogen-bond areas, 20 green color shows hydrophobic areas and blue represents mild polar. Protein structures are viewed from the extracellular side. 25 7. Experimental 7.1. General methods 30 Starting materials and reagents were obtained from commercial suppliers and were used without purification. Melting points (mp) are uncorrected and were determined with a Reichert Kofler thermopan or 35 in capillary tubes in a Buchi 510 apparatus. 1H NMR (300 MHz) and 13C NMR (75.4 MHz) spectra were recorder with a Bruker AMX spectrometer using DMSO-d6 or CDCl3 as solvent. Chemical shifts (δ) are expressed in parts 40 per million (ppm) using TMS as an internal standard. Coupling constants J are expressed in hertz (Hz). Spin multiplicities are given as s (singlet), d (doublet), dd (doublet of doublets) and m (multiplet). Mass spectrometry was carried out 45 with a Kratos MS-50 or a Varian MAT-711 spectrometer. Elemental analyses were performed by a Perkin-Elmer 240B microanalyzer and were within ±0.4 % of calculated values in all cases. The analytical results were ≥ 95% purity for all 50 compounds Flash Chromatography (FC) was performed on silica gel (Merck 60, 230-400 mesh); analytical TLC was performed on precoated silica gel plates (Merck 60 F254). Organic solutions were dried over anhydrous 55 sodium sulfate. Concentration and evaporation of the solvent after reaction or extraction was carried out on a rotary evaporator (Büchi Rotavapor) operating at reduced pressure. 60 7.2. Synthesis 7.2.1. General procedure for the synthesis of methoxy-3-benzoylcoumarins 1-4. To a solution of the appropriate β -ketoester (1 mmol) and the corresponding salicylaldehyde (1 mmol) in 65 ethanol (5 mL) was added piperidine in catalytic amount (0.10 mL). The reaction mixture was refluxed for 2–6 h and after completion (followed by TLC), the reaction was cooled and the precipitated was filtered and washed with cold 70 ethanol and ether. The obtained solid was recrystallized in DCM to afford the corresponding methoxy-3-benzoylcoumarin compounds. 75 5.2.2. General procedure for the synthesis of hydroxy-3-benzoylcoumarins 5-8. The appropriate methoxy derivative compound 1-4 (1  251 8 | Journal Name, [year], [vol], 00–00 mmol) was dissolved in DCM (1 mL) and BBr3 in DCM (20 mmol, 1M) was added dropwise in a Schlenk tube. Tube was sealed, and the reaction mixture was heated at 80 ºC for 48 h. The resulting crude was treated with MeOH and 5 rotated to dryness. The obtained crude was recrystallized in MeOH or purified by flash chromatography using hexane/ethyl acetate mixtures as eluent, to afford the desired hydroxy derivatives. 10 3-(3’,4’-Dimethoxybenzoyl)coumarin (1) 85% yield; white solid; mp 190-191 ºC; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 8.01 (s, 1H, H-4), 7.71 – 7.52 (m, 3H, 3xAr-H), 7.50 – 7.29 (m, 3H, 15 3xAr-H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5’), 3.95 (s, 6H, 2xOCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ ppm 190.27, 154.83, 154.42, 149.53, 144.62, 133.55, 129.34, 129.20, 127.76, 125.71, 125.15, 118.46, 117.15, 111.24, 110.19, 56.38, 56.32; EI-MS m/z 20 (%): 311 ([M+1]+, 59), 310 (M+, 100), 173 (41), 166 (25), 165 (99), 79 (22), 77 (22); Ana. Calcd. For C18H14O5: C 69.67, H 4.55. Found: C 69.69, H 4.58. 25 6-Methoxy-3-(3’,4’- dimethoxybenzoyl)coumarin (2) 97% yield; beige solid; mp 202-203 ºC; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 7.78 (s, 1H, H-4), 7.38 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-2’), 7.26 (dd, J = 8.4, 2.0 30 Hz, 1H, H-6’), 7.16 (d, J = 9.1 Hz, 1H, H-8), 7.04 (dd, J = 9.1, 2.9 Hz, 1H, H-7), 6.82 (d, J = 2.9 Hz, 1H, H-5), 6.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5’), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3), 3.69 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ ppm 190.41, 156.60, 154.40, 35 149.51, 149.31, 144.43, 129.36, 128.02, 125.73, 121.56, 118.77, 118.18, 111.24, 110.75, 110.18, 56.39, 56.32, 56.14; EI-MS m/z (%): 341 ([M+1]+, 58), 340 ([M]+, 94), 165 (100), 77 (22); Ana. Calcd. For C19H16O6: C 67.05, H 4.74. 40 Found: C 67.09, H 4.75. 5,7-Dimethoxy-3-(3’,4’- Dimethoxybenzoyl)coumarin (3) 91% yield; pale yellow solid; mp 210-211 ºC; 1H 45 NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 8.19 (s, 1H, H4), 7.34 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-2’), 7.26 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H, H-6’), 6.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5’), 6.29 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-6), 6.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-8), 3.77 (bs, 6H, 2x OCH3), 3.72 50 (bs, 6H, 2x OCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ ppm 190.91, 165.76, 159.37, 158.37, 157.97, 153.89, 149.28, 141.54, 130.03, 125.35, 121.28, 111.54, 110.11, 103.91, 95.37, 93.01, 56.32; EIMS m/z (%): 371 ([M+1]+, 24), 370 (M+, 100), 55 339 (21), 233 (30), 165 (63); Anal. Calcd. For C20H18O7: C 64.86, H 4.90. Found: C 64.88, H 4.93. 5,7-Dimethoxy-3-(4’- 60 Dimethoxybenzoyl)coumarin (4) 97% yield; pale yellow solid; mp 174-175 ºC; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 8.21 (s, 1H, H4), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 6.77 (d, J = 8.9 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 6.29 (d, J = 2.1 Hz, 65 1H, H-6), 6.13 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-8), 3.76-3.67 (m, 9H, 3x OCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ ppm 190.69, 165.61, 163.80, 159.14, 158.21, 157.81, 141.54, 132.08, 129.79, 121.16, 113.73, 103.81, 95.17, 92.81, 56.13, 56.05, 55.54; EI-MS 70 m/z (%): 341 ([M+1]+, 33), 340 (M+, 88), 325 (28) 312 (30), 309 (45), 297 (20), 233 (48), 135 (100), 92 (27), 77 (38). Anal. Calcd. For C19H16O6: C 67.05, H 4.74. Found: C 67.08, H 4.76. 75 5,7-Dihydroxy-3-(4’- dihydroxybenzoyl)coumarin (8) 80 7.3. Binding affinity assays The binding affinity for the human AR subtypes hA1, hA2A, hA3 of the compounds was determined using radioligand competition 85 experiments in Chinese hamster ovary (CHO) cells that were stably transfected with the individual receptor subtypes.30,31 The radioligands used were 1 nM [3H]CCPA for hA1, 10 nM [3H]NECA for hA2A, and 1 nM 90 [3H]HEMADO for hA3 receptors. Due to the lack of a suitable radioligand for hA2B receptors the potency of antagonists at hA2B receptor (expressed on CHO cells) was determined by inhibition of NECA-stimulated adenylyl cyclase 95 activity.30 The IC50 for inhibition of cAMP  252 This journal is © The Royal Society of Chemistry [year] (cyclic adenosine monophosphate) production was determined and converted to Ki values using the Cheng and Prusoff equation.30 For all the tested compounds no measurable activity for the hA2B or hA2A (Ki > 30,000 nM) was detected. 5 7.4. Statistical methods Ki values (dissociation constants) were determined in radioligand competition experiments with 7-8 different concentrations of 10 test compound and each concentration was tested in duplicate. Ki values are given as geometric means of three independent experiments with 95% confidence intervals. For analysis of the competition curves the program SCTFIT was 15 used.33 7.5. Theoretical evaluation of the ADME properties. LogP was calculated by the methodology 20 developed by Molinspiration as a sum of fragment-based contributions and correction factors. Topological Polar Surface Area (TPSA) was calculated based on the methodology published by Ertl et al. as a sum of fragment 25 contributions.43 Oxygen and nitrogen centered polar fragments are considered. PSA has been shown to be a very good descriptor characterizing drug absorption, including intestinal absorption, bioavailability, Caco-2 permeability and blood30 brain barrier penetration. Method for calculation of molecule volume developed at Molinspiration is based on group contributions. These have been obtained by fitting sum of fragment contributions to "real" 3D volume for a training set of about 35 twelve thousand, mostly drug-like molecules. 3D molecular geometries for a training set were fully optimized by the semiempirical AM1 method. 7.6. Molecular modeling 40 Homology modeling was carried out using the Molecular Operating Environment (MOE) suite.44 Molecular docking simulations were performed with the Schrodinger package.37,38 45 7.6.1. Homology models of hA1 and hA3 ARs. We constructed homology models of the hA1 and hA3 adenosine receptors. As a template we used the crystallized structure of the hA2A receptor 50 (PDB: 3EML).39 Protein sequence alignment of the 3 receptors (hA1, hA2A and hA3) used to generate the homology models was performed as described by Katritch et al.36 The alignment was made considering the highly conserved residues 55 in the different TM helices. Homology models were generated using the MOE software.44 Protein geometry was evaluated for the models taking into account Phi-Psi plots, bond lengths, bond angles, dihedrals, rotamers, atom clashes 60 and contact energies. Presence of different conserved disulfide bridges was manually checked in the models, such as the bridge between the corresponding residues Cys166 and Cys77 in the hA2A. The final models were 65 optimized using Induce Fit Docking Workflow in the Schrodinger package.45 We used selective high affinity ligands (compounds coll_11 and jaco_mre3008_f20 of a previous publication)36 to adapt the protein pocket for the hA1 and hA3 70 respectively. This procedure involved three steps: 1) Glide-based docking of the ligands using SP mode (standard-precision); 2) Protein pocket optimization using Prime and considering the residues within 5Å from the ligand poses; 3) 75 Glide-based docking of the ligands in the refined pocket using XP mode (Extra-precision). As described previously,36 homology models were tested for their capability to discriminate ligands from decoys and between known subtype80 selective compounds. ROC curves were performed and the best models were selected for further molecular docking studies. 7.6.2. Molecular docking of hA1 and hA3 ARs. 85 We carried out molecular docking studies using the hA1 and hA3 homology models selected in the previous step. Compounds were docked using Glide SP mode.37 Ten poses for each ligand were collected and optimized using MM-GBSA in 90 Prime38 taking into account a flexible protein region defined by 5 Å from the ligand. Final binding modes were selected taking into account number of similar poses extracted from the calculations and geometrical correspondence to 95 co-crystallized ligands in the hA2A.  253 10 | Journal Name, [year], [vol], 00–00 Conclusions A series of methoxy and hydroxy-coumarinchalcone hybrid compounds were synthesized and their binding affinity towards the four subtypes of adenosine receptors was studied. A preliminary 5 structure-activity relationship (SAR) of the synthesized derivatives showed that in general, methoxy substituted derivatives (1-4) presented good binding affinity and selectivity for the hA3AR, whereas hydroxy substituted derivatives 10 (5-8) presented moderate but selective binding affinity for the hA1AR. Positions 5 and 7 of the coumarin ring were crucial for the potency and selectivity in both series of compounds. Methoxy derivative 4 and hydroxy derivative 7 were the 15 most active compounds, being selective for hA3 (Ki = 2,490 nM) and hA1 (Ki = 17,700 nM) respectively. We also performed molecular docking simulations to study the binding mode of the compounds. 20 In addition, from the data obtained for the theoretical evaluation of the ADME properties, one can notice that all the hybrid compounds 1-8 do not break any point of the Lipinski’s rule of five, making them promising leads for drug 25 candidates. Therefore, according to our findings, coumarinchalcone hybrid compounds proved to be interesting scaffolds as ARs ligands worth to deepen study. 30 Acknowledgements This work was partially supported by the Ministerio de Sanidad y Consumo (PS09/00501) and Xunta de Galicia (PGIDIT09CSA030203PR 35 and 10PXIB203303PR). SVR thanks to Ministerio de Educación y Ciencia for her PhD grant FPU (AP2008-04263). 40 Notes and references a Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain. Fax: +34 981 544912; Tel: +34 981 563100; E-mail: 45 [email protected] b Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Würzburg, 97078, Würzburg, Germany   1 G.L. Stiles, J. Biol. Chem., 1992, 267, 6451. 2 S.A. Poulsen and R.J. Quinn, Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 619. 3 B.B. Fredholm, A.P. IJzerman, K.A. Jacobson, K.N. Klotz and J. Linden, J. Pharmacol. Rev., 2001, 53, 527. 4 B.B. Fredholm, G. Arslan, L. Halldner, B. Kull, G. Schulte and W. Wasserman, Arch. Pharmacol. 2000, 362, 364. 5 K.A Jacobson, P.J.M. Van Galen, M. Williams, J. Med. Chem. 1992, 35, 407. 6 Q.Y. Zhou,; C.Y. Li, M.E. Olah, R.A. Johnson, G.L. Stiles and O. Civelli, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 7432. 7 C.A. Salvatore, M.A. Jacobson, H.E. Taylor, J. Linden and R-GJohnson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 10365. 8 V. Ramkumar, G.L. Stiles, M.A. Beaven and H. Ali, J. Biol. Chem., 1993, 268, 16887. 9 J. Linden, Trends Pharmacol. Sci., 1994, 15, 298. 10 J.P. Hannon, H.J. Pfannkuche and J.R. Fozard, J. Pharmacol. 1995, 115, 945. 11 K.A. Jacobson, O. Nikodijevic, D. Shi, C. GalloRodriguez, M.E. Olah, G.L. Stiles and J.W. Daly, FEBS Lett., 1993, 336,57. 12 T.M. Palmer, T.W. Gettys and G.L. Stiles, J. Biol. Chem., 1995, 270, 16895. 13 Y. Kim, S. De Castro, Z.G. Gao, A.P. IJzerman and K.A. Jacobson. J. Med. Chem., 2009, 52, 2098. 14 L.V. Lopes, A.M. Sebastiao and J.A. Ribeiro, Curr. Top. Med. Chem., 2011, 11, 1087. 15 A. El-Tayeb, S. Michael, A. Abdelrahaman, A. Behrenswerth, S. Gollos, K. Nieber and C.E. Müller, ACS Med. Chem. Lett., 2011, 2, 890. 16 R.H. Shah and W.H. Frishmanet, Cardiol. Rev., 2009, 17, 125. 17 B.C. Shook, S. Rassnick, N. Wallace, J. Crooke, M. Ault, D. Chakravarty, J.K. Barbay, A. Wang, M.T. Powell, K. Leonard, V. Alford, R.H. Scannevin, K. Carroll, L. Lampron, L. Westover, H.K. Lim, R. Russell, S. Branum, K.M. Wells, S. Damon, S. Youells, X. Li, D.A. Beauchamp, K. Rhodes, and Paul F. Jackson, J. Med. Chem., 2012, 55, 1402. 18 T. Armentero, A. Pinna, S. Ferré, J.L. Lanciego and C.E. Müller Pharmacol. Ther., 2011, 132, 280. 19 T.W. Stone, S. Ceruti and M.P. Abbracchio, Handb. Exp. Pharmacol. 2009, 193, 535. 20 P.G. Baraldi, M.A. Tabrizi, S. Gessi and P.A. Borea, Chem. Rev., 2008, 108, 238. 21 S. Moro, Z.G. Gao, K.A. Jacobson and G. Spalluto, Med. Res. Rev. 2006, 26, 131. 22 F. Okajima, M. Akbar, M.A. Majid, K. Sho, H. Tamura and Y. Kondo Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 203, 1488.    254 This journal is © The Royal Society of Chemistry [year]   23 K.A. Jacobson, S. Moro, J.A. Manthey, P.L. West and X.D. Ji, Adv. Exp. Med. Biol., 2002, 505, 163. 24 F. Borges, F. Roleira, N. Milhazes, L. Santana and E. Uriarte, Curr. Med. Chem., 2005, 12, 887. 25 M.L. Go, Z. Wu and X.L. Liu, Curr. Med. Chem., 2005, 12, 483. 26 Z. Nowakowska, Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 125. 27 C.J. Langmead, S.P. Andrews, M. Congreve, J.C. Errey, E. Hurrell, F.H. Marshall, J.S. Mason, C.M. Richardson, N. Robertson, A. Zhukov and M. Weir, J. Med. Chem., 2012, 55, 1904. 28 A. Gaspar, J. Reis, S. Kachler, S. Paoletta, E. Uriarte, K.N. Klotz, S. Moro and F. Borges, Bioch. Pharm. 2012, 84, 21. 29 A.Gaspar, J. Reis, M.J. Matos, E. Uriarte and F. Borges, Eur. J. Med. Chem., 2012, 54, 914. 30 K.N. Klotz, J. Hessling, J. Hegler, C. Owman, B. Kull, B.B. Fredholm and M.J. Lohse, N-S Arch. Pharmacol. 1997, 357, 1. 31 K.N. Klotz, N. Falgner, S. Kachler, C. Lambertucci, S. Vittori, R. Volpini and G. Cristalli, Eur. J. Pharmacol., 2007, 556, 14. 32 Y.C. Cheng and W.H. Prusoff, Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099. 33 A. De Lean, A.A. Hancock and R.J. Lefkowitz, Mol. Pharmacol., 1982, 21, 5. 34 M cheminformatics, Bratislava, Slovak Republic, http://www.molinspiration.com/services/properties.html 2009. 35 J.J. Irwin and B.K. Shoichet, J. Chem. Inf. Model. 2005, 45, 177. 36 V. Katritch, I. Kufareva and R. Abagyan, Neuropharmacology. 2011, 60, 108. 37 Glide, version 5.7, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011. 38 Prime, version 3.0, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011. 39 V.P. Jaakola, M.T. Griffith, M.A. Hanson, V. Cherezov, E.Y. Chien, J.R. Lane, A.P. Ijzerman and R.C. Stevens, Science, 2008, 322, 1211. 40 M. Congreve, S.P. Andrews, A.S. Doré, K. Hollenstein, E. Hurrell, C.J. Langmead, J.S. Mason, I.W. Ng, B. Tehan, A. Zhukov, M. Weir and F.H. Marshall, J. Med. Chem., 2012, 55, 1898. 41 O. Lenzi, V. Colotta, D. Catarzi, F. Varano, D. Poli, G. Filacchioni, K. Varani, F. Vincenzi, P.A. Borea, S. Paoletta, E. Morizzo and S. Moro, J. Med. Chem., 2009, 52, 7640 42 A. Gaspar, J. Reis, S. Kachler, S. Paoletta, E. Uriarte, K.N. Klotz, S. Moro and F. Borges, Biochem. Pharmacol. 2012, 84, 21. 43 P. Ertl, B. Rohde and P. Selzer, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714.     44 MOE, version 2011.10; Chemical Computing Group, Inc.: www.chemcomp.com. 45 W. Sherman, T. Day, M.P. Jacobson, R.A. Friesner and R. Farid, J. Med. Chem. 2006, 49, 534.  255 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 257 2. Compuestos preparados bajo estudio y pendientes de publicación. Para los compuestos que no se encuentran descritos en publicaciones en el momento de la presentación de esta Memoria, pero que están bajo estudio y cuyos resultados están pendientes de ser publicados, se describirá de forma breve su caracterización estructural así como los rendimientos obtenidos en la síntesis de los mismos. Al igual que anteriormente (apartado 2.5. de Resultados y discusión), se presentan los datos de: 3-benzoilcumarinas (Tabla 7), 3-benzoil-4-hidroxicumarinas (Tabla 8), 3-cinamoilcumarinas (Tabla 9), 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas (Tabla 10), 3-(3aril-3-oxo-propenil)-4-clorocumarinas (Tabla 11) y 8-cinamoilcumarinas (Tabla 12). Tabla 7. 3-Benzoilcumarinas no publicadas. C Compuesto NMR MS Rdto. (%) 7 7 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.87 (s, 1H, H-4), 7.71 (d, J = 7.0 Hz, 2H, H2’, H-6’), 7.45 (t, J = 7.4 Hz, 1H, H-4’), 7.39-7.12 (m, 5H, H-5, H-7, H-8, H-3’, H5’), 2.27 (s, 3H, CH3). m/z (%): 265 ([M+1]+, 18), 264 ([M]+, 75), 235 (52), 221 (39), 105 (85), 77 (100) 82 8 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 8.07 (s, 1H, H-4), 7.94-7.85 (m, 2H, H-2’, H6’), 7.67-7.38 (m, 5H, H-3’, H-4’, H-5’, H5, H-6), 7.27 (d, J = 7.50 Hz, 1H, H-7 ), 2.51 (s, 3H, CH3). m/z (%): 265 ([M+1]++, 39), 264 ([M]++, 98), 235 (67), 221 (48), 105 (100), 77 (95). 94 9 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.35 (d, J = 9.3 Hz, 2H, H-7, H-8), 7.94 (s, 1H, H-4), 7.71 (d, J = 7.7 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.60-7.24 (m, 3H, H-3’, H-4’, H-5’), 7.09 (s, 1H, H-5). m/z (%): 296 ([M+1]++, 22), 295 ([M]++, 100), 288 (31), 190 (21), 105 (55), 77 (81). 57 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 257 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 258 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 10 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 8.44 (s, 1H, H-4), 7.91-7.77 (m, 2H, Ar), 7.677.52 (m, 1H, Ar), 7.52-7.37 (m, 2H, aromatic0), 6.45 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-6), 6.30 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-8), 3.89 (m, 6H). m/z (%): 311 ([M+1]++, 28), 310 ([M]++, 100), 282 (37), 281 (31), 233 (84), 105 (53), 77 (54). 88 11 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.35 (s, 1H), 7.99-7.89 (m, 3H), 7.80-7.63 (m, 2H), 7.60-7.46 (m, 3H). m/z (%): 285 ([M+1]++, 4), 284 ([M]+, 24), 256 (10), 255 (19), 221 (11), 105 (97), 77 (100), 69 (16). 69 12 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.08 (s, 1H), 7.84 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.677.37 (m, 4H), 7.00-6.78 (m, 2H), 3.90 (s, 3H). m/z (%): 281 ([M+1]++, 18), 280 ([M]++, 100), 252 (22), 251 (46), 221 (16), 203 (53), 119 (20), 105 (62), 77 (69). 82 20 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.80 (s, 1H, H-4), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H2’, H-6’), 7.34-7.05 (m, 3H, H-5, H-7, H8), 6.77 (d, J = 10.2 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 3.69 (s, 3H, OCH3), 2.24 (s, 3H, CH3). m/z (%): 295 ([M+1]++, 18), 294 ([M]++, 74), 250 (16), 135 (100), 77 (26). 97 21 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.83 (s, 1H, H-4), 7.71 (d, J = 9.0 Hz, 2H, H2’, H-6’), 7.13-6.92 (m, 3H, H-5, H-6, H7), 6.77 (d, J = 9.0 Hz, 2H, H-3’, H-5’) 4.04 (q, J = 6.99 Hz, 2H, CH32, (OCH2CH3)), 3.68 (s, 3H, OCH3) 1.35 (t, J = 6.99 Hz, 3H, CH3 (-OCH2CH3). m/z (%): 325 ([M+1]++, 31), 324 ([M]++, 88), 188 (34), 135 (100), 92 (30), 77 (40). 98 22 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.81 (s, 1H, H-4), 7.72 (d, J = 8.78 Hz, 2H, H2’, H-6’) 7.22-6.99 (m, 2H, H-3’, H-5’) 6.86-6.72 (m, 3H, H-5, H-6, H-7) 3.71 (s, 3H, 4’-OCH3) 3.69 (s, 3H, 8-OCH3). m/z (%): 311 ([M+1]++, 23), 310 ([M]++, 87), 135 (100), 92 (27), 77 (63). 93 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 258 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 259 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 23 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.25 (s, 1H, H-4), 8.05 (s, 1H, H-5), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-7), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-8), 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 3.85 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 316 ([M+2]++, 23), 314 ([M]++, 66), 135 (100), 77 (26). 83 24 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.28 (s, 1H, H-4), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.75 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H, H-6), 7.14-6.94 (m, 4H), 3.88 (s, 3H, OCH3), 3.84 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 311 ([M+1]++, 47), 330 ([M]++, 80), 295 (23), 282 (29), 281 (26), 251 (35), 203 (41), 135 (100), 119 (19), 107 (28), 92 (54), 77 (74), 76 (23). 96 31 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.78 (s, 1H), 7.38 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.337.03 (m, 4H), 6.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 0.8 Hz, 6H), 2.26 (s, 3H). m/z (%): 325 ([M+1]++, 36), 324 ([M]++, 99), 165 (100), 77 (20). 96 32 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.30 (s, 1H, H-4), 7.73-7.40 (m, 4H, aromático), 7.30 (t, J = 7.6 Hz, 1H, H-6’), 7.04 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-5’), 3.85 (s, 3H, OCH3), 3.81 (s, 3H, OCH3), 2.40 (s, 3H, CH3). m/z (%): 325 ([M+1]++, 16), 324 ([M]++, 73), 187 (13), 165 (100), 77 (23). 98 33 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.80 (d, J = 2.6 Hz, 1H, H-4), 8.55-8.37 (m, 2H, ), 7.70 (d, J = 9.1 Hz, 1H, H-5), 7.62 (dd, J = 8.4, 1.7 Hz, 1H, H-6’), 7.49 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-2’), 7.06 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-5’), 3.86 (s, 3H, OCH3), 3.81 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 356 ([M+1]++, 31), 355 ([M]++, 97), 218 (18), 165 (100). 99 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 259 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 266 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 67 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 8.02 (s, 1H, H-4), 7.29-7.12 (m, 3H, H-5, H-6, H-7), 7.11 (s, 2H, H-2’, H-6’), 4.19 (q, J = 6.9 Hz, 2H, -CH2), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.85 (s, 6H, 2x OCH3), 1.47 (s, J = 6.9 Hz, 3H, CH3). m/z (%): 385 ([M+1]++, 36), 384 ([M]++, 100), 369 (31), 195 (69). 99 68 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.29 (s, 1H, H-4), 7.66 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-5), 7.58 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7), 7.26 (s, 2H, H2’, H-6’), 3.99 (s, 3H, OCH3), 3.84 (s, 6H, 2x OCH3), 3.80 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 450 ([M+2]++, 84), 448 ([M]++, 84), 283 (11), 281 (11), 196 (15), 195 (100). 92 69 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 7.99 (s, 1H, H-4), 7.52-7.23 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 7.12 (s, 2H, H-2’, H-6’), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 6H, 2x OCH3), 2.43 (s, 3H, CH3). m/z (%): 355 ([M+1]++, 37), 354 ([M]++, 100), 339 (36), 283 (13), 195 (47), 187 (34). 95 70 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.03 (s, 1H, H-4), 7.50 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-5), 7.43 (dd, J = 7.4, 1.5 Hz, 1H, H-7), 7.307.18 (m, 1H, H-6), 7.14 (s, 2H, H-2’, H6’), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 6H, 2x OCH3), 2.50 (s, 3H, CH3). m/z (%): 355 ([M+1]++, 31), 354 ([M]++, 100), 339 (42), 283 (14), 195 (39), 187 (31). 96 71 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.82 (s, 1H, H-4), 8.67-8.38 (m, 2H, H-5, H-7), 7.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H, H-8), 7.27 (s, 2H, H-2’, H-6’), 4.07-3.60 (m, 9H, 3x OCH3). m/z (%): 386 ([M+1]++, 34), 385 ([M]++, 100), 370 (31), 314 (17), 218 (30), 195 (32). 51 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 266 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 267 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 72 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 7.97 (s, 1H, H-4), 7.02 (s, 2H, H-2’, H-6’), 6.31 (d, J = 2.7 Hz, 1H, H-6), 6.26 (d, J = 2.7 Hz, 1H, H-8), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 6H, 2x OCH3). m/z (%): 401 ([M+1]++, 10), 400 ([M]++, 45), 191 (18), 135 (13), 134 (100). 95 73 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 7.94 (s, 1H, H-4), 7.66-7.53 (m, 2H, H-5, H-7), 7.36 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-8), 7.11 (s, 2H, H-2’, H-6’), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 6H, 2x OCH3). m/z (%): 376 ([M+2]++, 34), 374 ([M]++, 100), 359 (32), 207 (25), 195 (40). 94 74 1H-NMR (250 MHz, CDCl33) δ ppm 8.06 (s, 1H, H-4), 7.50 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-5), 7.11 (s, 2H, H-2’, H-6’), 6.95-6.83 (m, 2H, H-6, H-8), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 6H, 2x OCH3). m/z (%): 371 ([M+1]++, 22), 370 ([M]++, 100), 355 (23), 327 (16), 203 (28), 195 (28). 97 75 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.65 (s, 1H, H-4), 8.57 (s, 1H), 8.49 (dd, J = 8.2, 2.2 Hz, 1H, H-2’), 8.35 (d, J = 6.9 Hz, 1H, H-4’), 7.95-7.69 (m, 3H, Ar), 7.56-7.38 (m, 2H, Ar). m/z (%): 296 ([M+1]++, 19), 295 ([M]++, 100), 278 (24), 266 (47), 250 (23), 248 (25), 220 (21), 173 (74), 150 (44), 145 (36), 104 (32), 89 (25), 76 (28). 89 76 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.63 (s, 1H, H-4), 8.44 (dt, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H, H-6’), 8.24 (s, 1H, H-5), 8.16 (d, J = 7.3 Hz, 1H, H-4’), 7.68 (t, J = 8.0 Hz, 1H, H5’), 7.41-7.21 (m, 2H, Ar), 7.05 (d, J = 2.8 Hz, 1H, H-7), 3.88 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 326 ([M+1]++, 45), 325 ([M]++, 100), 297 (18), 296 (35), 203 (51), 175 (41), 150 (73), 119 (32), 104 (48), 76 (46). 94 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 267 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 268 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 77 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.65 (s, 1H, H-4), 8.55-8.42 (m, 2H, H-2’, H-4’), 8.35 (d, J = 7.1 Hz, 1H, H-6’), 8.14 (dd, J = 4.9, 2.5 Hz, 1H, H-5’), 7.97-7.75 (m, 2H, H-5, H-6), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-8). m/z (%): 375 ([M+2]++, 99), 373 ([M]++, 100), 346 (26), 344 (25), 253 (36), 251 (37), 225 (23), 223 (23), 150 (89), 104 (46), 76 (40) 90 78 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.64 (s, 1H, H-4), 8.58-8.39 (m, 2H, Ar), 8.34 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.82 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.57-7.24 (m, 3H, Ar), 3.94 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 326 ([M+1]++, 21), 325 ([M]++, 100), 296 (24), 203 (27), 175 (30), 150 (43), 104 (28), 76 (26). 82 79 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.64 (td, J = 4.5, 3.9, 1.9 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar), 8.34-8.22 (m, 1H, Ar), 8.15 (d, J = 9.2 Hz, 1H, Ar), 7.68 (qd, J = 7.8, 3.9 Hz, 1H, Ar), 7.42-7.06 (m, 3H, Ar), 4.21 (q, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 1.571.45 (t, 3H, CH3). m/z (%): 340 ([M+1]++, 29), 339 ([M]++, 100), 312 (21), 311 (88), 283 (23),, 282 (42), 266 (27), 264 (25), 188 (45), 160 (40), 150 (98), 120 (19), 105 (18), 104 (56), 92 (17), 76 (42). 91 80 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.70-8.56 (m, 1H, Ar), 8.56-8.39 (m, 2H, Ar), 8.34 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.83 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 405 ([M+2]++, 97), 403 ([M]++, 97), 253 (23), 150 (100), 104 (50), 76 (43). 77 81 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.68-8.56 (m, 1H), 8.49 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 8.33 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.82 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H). m/z (%): 310 ([M+1]++, 27), 309 ([M]++, 100), 281 (21), 280 (56), 264 (22), 262 (30), 234 (22), 187 (74), 159 (50), 150 (52), 104 (45), 103 (27), 77 (20), 76 (40). 88 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 268 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 269 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 82 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.64 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-4), 8.44 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-4’), 8.28 (s, 1H, H-2’), 8.228.06 (m, 1H), 7.68 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61-7.39 (m, 2H), 7.40 -7.18 (m, 1H), 2.51 (s, 3H, CH3). m/z (%): 310 ([M+1]++, 55), 309 ([M]++, 100), 281 (36), 280 (70), 263 (26), 262 (44), 235 (28), 234 (36), 187 (85), 159 (51), 150 (64), 104 (51), 76 (50). 79 84 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.53 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 8.48-8.30 (m, 2H), 8.22 (dt, J = 7.1, 1.2 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.92 (s, 4H), 3.90 (s, 3H). m/z (%): 356 ([M+1]++, 32), 355 ([M]++, 100), 327 (36), 326 (25), 325 (26), 234 (20), 233 (93), 150 (21), 104 (16), 76 (17). 89 85 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.71 (s, 1H, H-4), 8.63-8.51 (m, 2H, H-2’, H-4’), 8.42 (d, J = 7.1 Hz, 1H, H-6’), 8.14 (dd, J = 4.9, 2.5 Hz, 1H, H-5’), 7.98-7.77 (m, 2H, H-5, H-6), 7.57 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-8). m/z (%): 331 ([M+2]++, 50), 329 ([M]++, 100), 302 (20), 301 (22), 300 (47), 284 (39), 282 (32), 255 (22), 254 (25), 209 (27), 207 (65), 181 (18), 151 (17), 150 (99), 123 (39), 104 (65), 76 (57), 75 (23). 80 86 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.57 (s, 1H, H-4), 8.52 (s, 1H, H-2’), 8.45 (dd, J = 8.0, 2.6 Hz, 1H, H-4’), 8.27 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-6’), 7.89-7.70 (m, 2H, H5, H-5’), 7.16-6.93 (m, 2H, H-6, H-8), 3.89 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 326 ([M+1]++, 37), 325 ([M]++, 100), 297 (34), 296 (36), 203 (85), 150 (23), 104 (21), 76 (24). 85 89 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.38 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.96-7.81 (m, 2H), 7.69 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.61-7.47 (m, 2H), 7.33-7.09 (m, 3H). m/z (%): 267 ([M+1]++, 7), 266 ([M]++, 42), 105 (100), 77 (60) 82 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 269 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 270 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 90 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.11 (s, 1H), 10.86 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.71-7.33 (m, 3H), 6.28 (s, 1H), 6.24 (s, 1H). m/z (%): 283 ([M+1]++, 29), 282 ([M]++, 100), 254 (30), 253 (69), 205 (72), 105 (88), 77 (72). 75 91 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.95 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.84 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.75-7.58 (m, 2H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.92-6.66 (m, 2H). m/z (%): 267 ([M+1]++, 31), 266 ([M]++, 100), 238 (35), 237 (68), 189 (63), 161 (22), 105 (97), 77 (79). 79 98 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.58 (sa, 1H, OH), 8.23 (s, 1H, H-4), 7.80 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.64 – 7.46 (m, 2H, H-5, H-7), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-8), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H3’, H-5’). m/z (%): 280 ([M]++, 65), 251 (21), 237 (14), 93 (19), 76 (15), 65 (24). 89 99 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.56 (sa, 1H, -OH, 4’-OH), 10.33 (sa, 1H, -OH, 8-OH), 8.22 (s, 1H, H-4), 7.79 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.29-7.06 (m, 3H, H-5, H-6, H-7), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-3’, H-5’). m/z (%): 283 ([M+1]++, 9), 282 ([M]++, 49), 252 (46), 120 (100). 71 100 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.80 (s, 1H), 10.41 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 6.77 (s, 1H). m/z (%): 283 ([M+1]++, 22), 282 ([M]++, 92), 254 (18), 253 (30), 237 (19), 189 (22), 121 (100), 98 (26), 93 (25), 73 (19), 71 (19), 55 (30). 68 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 270 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 271 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 108 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.06 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 8.24 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.71-7.49 (m, 2H), 7.42-7.19 (m, 3H), 6.82 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H). m/z (%): 297 ([M+1]++, 28), 296 ([M]++, 93), 268 (15), 267 (21), 187 (63), 137 (100), 109 (28), 81 (18), 77 (15). 77 109 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.85 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 9.42 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.35-7.15 (m, 2H), 6.90-6.68 (m, 3H). m/z (%): 299 ([M+1]++, 16), 298 ([M]++, 85), 269 (15), 189 (69), 161 (19), 137 (100), 109 (25). 74 111 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.85 (s, 1H, -OH), 9.29 (d, J = 19.0 Hz, 3H, 3X -OH), 8.17 (s, 1H, H-4), 7.33 (d, J = 9.6 Hz, 1H, H-8), 7.18-7.06 (m, 2H, H5, H-7), 6.87 (s, 2H, H-2’, H-6’). m/z (%): 315 ([M+1]++, 31), 314 ([M]++, 92), 189 (73), 161 (39), 153 (100), 125 (21), 79 (16). 81 112 1H-NMR (250 MHz DMSO-d6) δ ppm 9.33 (bs, 3H, 3x OH), 8.19 (s, 1H, H-4), 8.06 (s, 1H, H-5), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 7.45 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-8), 6.90 (s, 2H, H-2’, H-6’). m/z (%): 377 ([M+2]++, 27), 375 ([M]++, 32), 297 (41), 251 (59), 249 (63), 153 (100), 125 (25), 79 (18). 70 113 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.34 (bs, 3H, 3x-OH), 8.18 (s, 1H, H-4), 7.59 (s, 1H, H-5), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-8), 6.88 (s, 2H, H-2’, H-6’), 2.37 (s, 3H, CH3). m/z (%): 313 ([M+1]++, 29), 312 ([M]++, 100), 283 (15), 187 (85), 153 (94), 125 (24), 79 (15). 57 114 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.32 (bs, 3H, 3x OH), 8.20 (s, 1H, H-4), 7.93 (d, J = 3.1 Hz, 1H, H-5), 7.73 (d, J = 9.2, 2.9 Hz, 1H, H-7), 7.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H, H-8), 6.90 (s, 2H, H-2’, H-6’). m/z (%): 334 ([M+2]++, 24), 332 ([M]++, 70), 266 (18), 207 (48), 153 (100), 125 (21), 79 (15). 58 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 271 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 272 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 115 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.88 (s, 1H, OH), 9.29 (s, 3H, 3x OH), 8.14 (s, 1H, H-4), 7.46 (s, 1H, H-5), 7.27 (s, 1H, H-7), 6.88 (s, 2H, H-2’, H-6’). m/z (%): 394 ([M+2]++, 54), 392 ([M]++, 47), 378 (13), 348 (12), 269 (12), 153 (100), 125 (18), 79 (13). 82 116 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.34 (s, 1H, OH), 9.31 (s, 3H, 3x OH), 8.20 (s, 1H, H-4), 7.35-7.04 (m, 3H, H-5, H-6, H-7), 6.88 (s, 2H, H-2’, H-6’). m/z (%): 315 ([M+1]++, 19), 314 ([M]++, 88), 299 (21), 298 (95), 288 (42), 270 (63), 253 (21), 189 (27), 153 (100), 139 (18), 125 (20), 79 (14). 54 117 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.31 (bs, 3H, 2x-OH ), 8.24 (s, 1H, H-4), 7.72-7.48 (m, 2H, H-5, H-6), 7.44-7.15 (m, 1H, H-7), 6.89 (s, 2H, H-2’, H-6’), 2.45-2.13 (m, 3H). m/z (%): 313 ([M+1]++, 22), 312 ([M]++, 97), 187 (92), 153 (100), 125 (27), 77 (13). 70 118 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.15 (s, 1H, OH), 11.01 (s, 1H, OH), 10.74 (s, 1H, OH), 9.30 (s, 2H, 2xOH), 8.05 (s, 1H, H-4 ), 6.80 (s, 2H, H-2’, H6’), 6.29 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-6), 6.24 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-8). m/z (%): 331 ([M+1]++, 12), 330 ([M]++, 18), 223 (47), 211 (41), 181 (100), 180 (39), 152 (18), 115 (19), 103 (51), 91 (24), 77 (17), 69 (15). 62 120 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.88 (s, 1H, -OH), 8.28 (s, 1H, H-4), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.39-7.24 (m, 3H, H-8, H-3’, H-5’), 7.20-7.04 (m, 2H, H-5, H-7), 2.38 (s, 3H, CH3). m/z (%): 281 ([M+1]++, 20), 280 ([M]++, 80), 279 (15), 265 (17), 252 (17), 251 (18), 237 (28), 119 (100), 91 (56), 65 (16). 72 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 272 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 273 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 121 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.96 (s, 1H, OH), 8.29 (s, 1H, H-4), 7.74 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5), 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 6.84 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H, H-6), 6.77 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-8), 2.37 (s, 3H, CH3). m/z (%): 281 ([M+1]++, 20), 280 ([M]++, 100), 265 (26), 252 (28), 189 (26), 119 (99), 105 (16), 91 (61), 65 (18). 74 122 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.03 (s, 1H), 10.79 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.69 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.27 (dd, J = 12.6, 2.0 Hz, 2H). m/z (%): 297 ([M+1]++, 12), 296 ([M]++, 63), 281 (22), 267 (19), 205 (25), 204 (18), 119 (100), 91 (63), 65 (18). 68 125 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.11 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.44-7.18 (m, 3H), 6.57 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.34 (s, 2H), 3.79 (s, 3H). m/z (%): 296 ([M+1]++, 21), 295 ([M]++, 71), 121 (15), 120 (100), 92 (28), 65 (20). 62 126 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.10 (s, 1H), 7.69-7.53 (m, 3H), 7.49 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.31 (s, 2H), 2.36 (s, 3H). m/z (%): 280 ([M+1]++, 26), 279 ([M]++, 55), 187 (16), 120 (100), 92 (31), 65 (20). 55 127 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.99 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.27 (s, 2H), 5.29 (s, 2H). m/z (%): 281 ([M+1]++, 19), 280 ([M]++, 57), 120 (100), 92 (26), 65 (15). 92 128 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.11 (s, 1H), 7.88 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.77-7.58 (m, 3H), 7.48 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.31 (s, 2H). m/z (%): 301 ([M+2]++, 31), 299 ([M]++, 59), 121 (19), 120 (100), 92 (33), 65 (25). 34 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 273 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 274 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 129 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.16 (s, 1H), 7.71-7.45 (m, 4H), 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.31 (s, 2H), 2.39 (s, 3H). m/z (%): 280 ([M+1]++, 19), 279 ([M]++, 79), 120 (100), 92 (26), 65 (17). 42 133 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.12 (s, 1H), 7.70 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 2H), 7.126.86 (m, 2H), 6.57 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.24 (s, 2H), 3.87 (s, 3H). m/z (%): 296 ([M+1]++, 52), 295 ([M]++, 87), 267 (23), 266 (24), 203 (26), 121 (27), 120 (100), 92 (56), 65 (44). 57 134 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.00 (s, 1H), 7.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.65 (s, 1H), 6.55 (d, J = 8.6 Hz, 3H), 6.23 (s, 2H), 3.88 (s, 6H). m/z (%): 326 ([M+1]+, 28), 325 ([M]+, 93), 310 (25), 233 (46), 120 (100), 92 (28). 71 137 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.25 (s, 1H), 7.48-7.35 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 9.0, 3.1 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.09-6.92 (m, 2H), 6.84 (dd, J = 7.9, 2.4 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 3.79 (s, 3H). m/z (%): 296 ([M+1]++, 32), 295 ([M]++, 100), 266 (22), 251 (17), 120 (74), 92 (52), 65 (29). 65 138 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.24 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.52 (dd, J = 7.4, 2.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.09-6.94 (m, 2H), 6.85 (dd, J = 7.7, 2.6 Hz, 1H), 5.38 (s, 2H), 2.36 (s, 3H). m/z (%): 280 ([M+1]++, 31), 279 ([M]++, 100), 250 (26)187 (21), 120 (68), 92 (51), 65 (29). 87 139 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.27 (s, 1H), 7.94 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.23-6.98 (m, 3H), 6.86 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H). m/z (%): 301 ([M+1]++, 68), 299 ([M]++, 100), 270 (21), 121 (23), 120 (99), 92 (95, 65 (68).). 59 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 274 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 275 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 140 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.30 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.24-6.97 (m, 3H), 6.85 (dd, J = 7.7, 2.5 Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 2.40 (s, 3H). m/z (%): 280 ([M+1]++, 60), 279 ([M]++, 100), 250 (48), 223 (28), 187 (42), 120 (95), 92 (96), 65 (66). 64 143 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.23 (s, 1H), 7.58 (d, J = 15.8 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.10-6.94 (m, 2H), 6.85 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.38 (s, 2H), 3.95 (s, 3H). m/z (%): 375 ([M+1]++, 77), 373 ([M]++, 77), 121 (16), 120 (100), 92 (66), 65 (37). 61 144 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.28 (s, 1H), 7.75 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.23-6.92 (m, 6H), 6.83 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.39 (s, 2H), 3.88 (s, 3H). m/z (%): 296 ([M+1]++, 32), 295 ([M]++, 100), 266 (28), 203 (55), 187 (42), 120 (75), 92 (68), 65 (39). 60 145 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.13 (s, 1H), 7.14 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.93 (dt, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 7.4, 2.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 3.89 (s, 6H). m/z (%): 326 ([M+1]++, 29), 325 ([M]++, 100), 310 (16), 297 (18), 296 (17), 233 (55), 120 (32), 92 (35), 65 (20). 59 146 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.23 (s, 1H), 7.87 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.67 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.61-7.45 (m, 2H), 7.19 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H). m/z (%): 266 ([M+1]++, 25), 265 ([M]++, 94), 237 (18), 236 (32), 105 (100), 77 (67). 72 O O O R 4 ' R 3 ' R 5 R 6 R 7 R 8 R 5 ' 275 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 282 Tabla 10. Caracterización de 3-cinamoil-4-hidroxicumarinas no publicadas. Compuesto NMR MS Rdto. (%) 187 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.23 (d, J = 14.5 Hz, 1H), 8.07-7.91 (m, 2H), 7.85-7.66 (m, 3H), 7.53-7.33 (m, 5H). m/z (%): 293 ([M+1]++, 20), 292 ([M]++, 89), 291 (72), 290 (21), 289 (34), 272 (20), 247 (30), 215 (100), 171 (42), 144 (32), 121 (55), 103 (67), 77 (43). 75 189 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.41 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.74-7.58 (m, 3H), 7.44-7.24 (m, 4H). m/z (%): 328 ([M+2]++, 53), 326 ([M]++, 97), 281 (20), 216 (100), 205 (36), 178 (30), 167 (34), 165 (92), 139 (21), 138 (21), 137 (50), 121 (93), 102 (42), 101 (46), 92 (22), 57 (25). 83 190 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.41 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 8.157.96 (m, 2H), 7.75-7.54 (m, 3H), 7.40-7.16 (m, 4H), 2.40 (s, 3H). m/z (%): 307 ([M+1]++, 22), 306 ([M]++, 100), 305 (50), 215 (43), 189 (20), 185 (37), 158 (31), 145 (43), 121 (34), 117 (26), 115 (23). 79 191 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.43 (s, 2H), 8.09 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.80-7.59 (m, 2H), 7.397.21 (m, 3H), 6.56 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H). m/z (%): 353 ([M+1]++, 20), 352 ([M]++, 100), 321 (31), 191 (33), 149 (41), 121 (50), 92 (21), 77 (16). 82 192 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.49 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 8.08 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.66 (ddd, J = 8.8, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.38-7.14 (m, 3H), 6.48 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H). m/z (%): 382 ([M]++, 34), 351 (16), 61 (100). 87 OO O R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' OH O Het O OOH 282 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 283 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 193 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.75 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.62 (ddd, J = 8.7, 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.35-7.19 (m, 2H), 6.09 (s, 2H), 3.95 (s, 6H), 3.84 (s, 3H). m/z (%): 383 ([M]++, 12), 382 ([M]++, 57), 380 (22), 351 (48), 350 (69), 349 (100), 192 (21), 179 (63), 178 (34), 121 (31), 92 (21), 91 (29), 69 (27). 84 196 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.35-7.11 (m, 3H), 7.03 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 6.99-6.74 (m, 2H), 3.77 (s, 6H). m/z (%): 352 ([M]++, 39), 321 (50), 268 (21), 267 (26), 239 (30), 134 (30), 121 (26), 112 (25), 111 (21), 99 (21), 98 (58), 97 (26), 85 (54), 84 (57), 74 (33), 71 (65), 69 (33), 57 (100), 56 (25), 55 (55). 70 197 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.44 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 8.08 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.67 (ddd, J = 8.7, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.36-7.23 (m, 2H), 7.11 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 3.89 (s, 3H). m/z (%): 352 ([M]++, 24), 322 (28), 321 (100), 319 (23), 121 (24). 68 199 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.52 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.67 (ddd, J = 8.3, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.45-7.23 (m, 3H), 7.07-6.89 (m, 2H), 3.94 (s, 3H). m/z (%): 323 ([M+1]++, 15), 322 ([M]++, 100), 291 (75), 215 (33), 204 (19), 189 (26), 161 (49), 121 (50), 105 (24), 96 (28), 95 (24), 77 (30), 69 (52). 64 OO O R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' OH O Het O OOH 283 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 284 Compuesto NMR MS Rdto. (%) 200 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.43 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.437.18 (m, 5H), 7.05 -6.94 (m, 1H), 3.87 (s, 3H). m/z (%): 323 ([M+1]++, 19), 322 ([M]++, 97), 321 (40), 304 (26), 278 (49), 277 (82), 215 (80), 204 (25), 202 (70), 201 (94), 200 (33), 189 (29), 174 (77), 162 (22), 161 (100), 133 (43), 121 (93), 120 (30), 118 (41), 92 (38), 90 (26), 89 (20), 77 (40), 65 (22). 55 202 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.39 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.69 (td, J = 8.5, 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.39-7.27 (m, 2H), 6.84 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.55 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H). m/z (%): 353 ([M+1]++, 19), 352 ([M]++, 92), 308 (43), 307 (78), 232 (44), 231 (62), 230 (21), 215 (32), 205 (100), 191 (34), 189 (44), 176 (25), 165 (27), 148 (34), 121 (79), 120 (39), 77 (22). 79 204 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.81-8.66 (m, 2H), 8.10 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.83-7.62 (m, 3H), 7.417.21 (m, 3H). m/z (%): 294 ([M+1]++, 18), 293 ([M]++, 100), 291 (38), 264 (27), 215 (33), 145 (55), 132 (39), 121 (26), 120 (37), 117 (26), 104 (42), 92 (31), 78 (34). 63 206 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.31 (s, 1H), 8.08-7.93 (m, 3H), 7.88-7.73 (m, 2H), 7.48-7.35 (m, 2H), 6.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H). m/z (%): 283 ([M+1]++, 13) 282 ([M]++, 48), 254 (65), 239 (27), 134 (23), 121 (100), 120 (20), 97 (27), 93 (33), 92 (21), 85 (33), 71 (42), 65 (31). 56 OO O R 2 ' R 4 ' R 3 ' R 5 ' R 6 ' OH O Het O OOH 284 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 285 Tabla 11. Caracterización de 3-(3-aril-3-oxo-propenil)-4-clorocumarinas no publicadas. Compuesto NMR MS Rendimiento (%) 207 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.60 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 8.20-7.97 (m, 4H), 7.72-7.23 (m, 7H). m/z (%): 312 ([M+2]++, 12) 310 ([M]++, 30), 207 (34), 205 (100), 187 (15), 105 (41), 77 (30). 62 208 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.59 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 8.17-8.04 (m, 3H), 8.00 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.65 (ddd, J = 8.9, 7.3, 1.6 Hz, 1H), 7.40 (td, J = 7.6, 1.1 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H). m/z (%): 326 ([M+2]++, 10) 324 ([M]++, 29), 289 (51), 207 (41), 205 (100), 119 (28), 91 (26). 68 209 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.58 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.3 Hz, 3H), 7.65 (ddd, J = 8.8, 7.3, 1.5 Hz, 1H), 7.45-7.24 (m, 4H), 2.43 (s, 3H). m/z (%): 342 ([M+2]++, 7) 340 ([M]++, 18), 305 (57), 207 (36), 205 (100), 135 (74), 77 (14). 71 210 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.59 (dd, J = 15.7, 1.8 Hz, 1H), 8.37 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 2H), 8.29-8.11 (m, 3H), 8.04 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.70 (td, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 8.3 Hz, 2H). m/z (%): 357 ([M+2]++, 9) 355 ([M]++, 23), 321 (25), 320 (93), 274 (28), 207 (96), 205 (100), 149 (27), 76 (22). 54 211 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.57 (d, J = 15.4 Hz, 1H, Hβ), 8.12 (d, J = 15.4 Hz, 1Hα), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H-5), 7.77-7.54 (m, 3H), 7.48-7.33 (m, 3H), 7.15 (dd, J = 8.2, 2.7 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H, OCH3). m/z (%): 342 ([M+2]++, 5), 340 ([M]++, 15), 306 (20), 305 (56), 207 (47), 205 (100), 135 (42), 77 (17) 47 OO Cl O R 2 ' R 4 ' R 5 ' R 3 ' 285 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 286 Compuesto NMR MS Rendimiento (%) 213 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 8.44 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 8.09-7.90 (m, 2H), 7.63 (ddd, J = 7.2, 5.5, 3.3 Hz, 1H), 7.49-7.31 (m, 2H), 7.317.19 (m, 1H), 7.13-7.00 (m, 1H), 7.00-6.88 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.82 (s, 3H). m/z (%): 372 ([M+2]++, 9) 375 ([M]++, 23), 335 (21), 207 (16), 205 (48), 165 (100). 62 Tabla 12. Caracterización de 8-cinamoilcumarinas no publicadas. Compuesto NMR MS Rdto.(%) 215 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 14.30 (s, 1H), 8.25 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.58 -7.39 (m, 2H), 7.32 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.11 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.70 (s, 3H). m/z (%): 353 ([M+1]++, 14), 352 ([M]++, 100), 321 (45), 191 (52), 149 (29), 121 (63), 92 (19), 77 (12). 95 217 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.54 (s, 1H), 7.98 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.36-6.16 (m, 3H), 3.81 (s, 9H). m/z (%): 383 ([M+1]++, 24), 382 ([M+1]++, 84), 352 (30), 351 (100), 349 (39), 194 (31), 191 (15), 189 (15), 181 (27), 179 (56), 168 (16). 93 OO Cl O R 2 ' R 4 ' R 5 ' R 3 ' O HO O O R 2 ' R 3 ' R 4 ' R 5 ' R 6 ' O HO O O Het 286 Parte Experimental 2. Compuestos bajo estudio 287 Compuesto NMR MS Rdto.(%) 218 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 14.30 (s, 1H, OH), 8.29 (d, J = 15.3 Hz, 1H, Hβ), 7.92 (d, J = 15.3 Hz, 1H, Hα), 7.65 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-4), 7.50 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H-5), 7.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-6’), 7.22 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2), 6.90 (m, 2H, H5’, H-6), 6.26 (d, J = 9.6 Hz, 1H, H-3), 4.00 (s, 3H, 4’-OCH3), 3.93 (s, 3H, 3’- OCH3). m/z (%): 353 ([M+1]++, 81), 352 ([M]++, 100), 292 (53), 291 (100), 191 (27), 161 (32), 148 (17), 89 (30), 69 (18). 81 221 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.53 (s, 1H), 8.30-8.14 (m, 2H), 7.97 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.78-7.49 (m, 3H), 7.35 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 9.7 Hz, 1H). m/z (%): 338 ([M+1]++, 17), 337 ([M]++, 49), 291 (100), 274 (62), 176 (34) 161 (23). 63 222 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 13.94 (s, 1H), 8.34 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 9.6, 2.6 Hz, 1H), 7.56-7.36 (m, 2H), 7.22-7.05 (m, 1H), 7.05-6.83 (m, 2H), 6.28 (dd, J = 9.5, 2.6 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.89 (s, 3H). m/z (%): 352 ([M+1]++, 18), 322 ([M]++, 100), 321 (35), 319 (21), 121 (42) 92 (25), 77 (18). 85 223 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ ppm 14.04 (s, 1H), 8.32 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.99-6.74 (m, 3H), 6.52 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 3.86 (s, 6H). m/z (%): 353 ([M+1]++, 27), 352 ([M]++, 100), 351 (33), 350 (16), 335 (19), 334 (51), 321 (33), 319 (24), 164 (53), 98 (17). 90 O HO O O R 2 ' R 3 ' R 4 ' R 5 ' R 6 ' O HO O O Het 287 Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 289  • Se han desarrollado y puesto a punto múltiples metodologías sintéticas para la preparación de forma sencilla, rápida y versátil de las series de compuestos híbridos seleccionadas. Todos los compuestos híbridos contienen como núcleo principal el esqueleto de cumarina, al que se le incorporan los farmacóforos derivados de estilbenos (3-arilcumarinas) o de chalconas (“endo” cumarina-chalcona y “exo” cumarina-chalconas), obteniéndose una amplia quimioteca que ha sido completamente caracterizada. • Se han obtenido series de compuestos con sustituyentes de distinta naturaleza, en diferente número y en distintas posiciones de los esqueletos que nos han permitido realizar estudios de la relación estructura-actividad sobre aquellas dianas estudiadas. • Las 3-arilcumarinas estudiadas resultaron ser excelentes inhibidores selectivos de la MAO-B (en concreto, 6-bromo-8-metoxi-3-(4’- metoxifenil)cumarina, IC50 = 1.35 nM), mientras que las 3-benzoilcumarinas presentaban una moderada pero selectiva actividad frente a MAO-A (en concreto, 6-bromo-8-hidroxi-3-(4’-hidroxibenzoil)cumarina, IC50 =19.17 μM). • Los compuestos híbridos hidroxilados mostraron una muy buena actividad antioxidante, con excelentes valores de ORAC, buena capacidad para atrapar radicales, bajos potenciales de oxidación, baja citotoxicidad y elevados valores de citoprotección. En particular, la 6-hidroxi-3-(4’-hidroxibenzoil)cumarina resultó ser el compuesto más prometedor de la serie estudiada con un ORAC de 14.1 y un 100% de viabilidad celular en BAEC. • Los híbridos “exo” cumarina-chalcona presentaron buena afinidad como ligandos de uno o varios receptores de adenosina. En concreto, el compuesto (E)-3-(3-(tiofen-3-il)acriloil)cumarina presentó la mejor actividad y selectividad (hA3 = 5.16 μM) siendo clave la sustitución del anillo B de la chalcona por un grupo tiofeno. • Los compuestos estudiados presentaron moderadas actividades antibacterianas frente a un gran número de patógenos humanos y excelentes 289 Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 290 frente a otros de origen marino. En particular, los derivados aminados de las 3benzoilcumarinas resultaron ser tan activos frente al patógeno marino Tenacibaculum maritimum como los actuales fármacos empleados, sin afectar a las cepas bacterianas humanas estudiadas. • Se ha desarrollado una nueva metodología sintética que permite llevar a cabo la reacción de ciclación de Nazarov de dienonas completamente sustituidas de forma diastereoespecífica, generando estereocentros vecinales con todos los átomos de carbono cuaternarios. Dicha metodología sintética presenta una gran aplicación para la síntesis total de compuestos derivados de productos naturales de estructura oxacíclica. • El carácter multidisciplinar de este trabajo deja patente la importancia y la necesidad de la colaboración entre grupos de distintas áreas. Sin estas colaboraciones, los resultados y conclusiones de este trabajo no hubiesen sido posibles. 290 Tesis Doctoral 2014 Saleta Vázquez Rodríguez 291  • Multiple synthetic methodologies have been developed and tuned up in order to prepare hybrid compounds series in a simple, fast and versatile way. All the hybrid compounds contain the coumarin scaffold as the main nucleus. Stilbene (3-arylcoumarin) and chalcone (“endo” and “exo” coumarin-chalcones) pharmacophores have been incorporated into the coumarin core, obtaining a broad compound library fully characterized. • Series of compounds with a wide variety of substituents of different nature number and in various positions of the scaffolds have been obtained. This allowed us to conduct a study of the structure-activity relationship on the considered targets. • The studied 3-arylcoumarins were found to be excellent selective MAO-B inhibitors (in particular, 6-bromo-8-methoxy-3-(4’-methoxyphenyl)coumarin, IC50 = 1.35 nM), while the 3-benzoulcoumarins showed a moderated but selective MAO-A inhibitory activity (in particular, 6-bromo-8-hydroxy-3-(4’- hydroxybenzoyl)coumarin, IC50 =19.17 μM). • The hydroxylated hybrid compounds showed very good antioxidant activity, presenting excellent ORAC values, good scavenging capacity, low oxidation potential, low cytotoxicity and high citoprotective properties. In particular, 6hydroxy-3-(4’-hydroxybenzoyl)coumarin was the most promising compound, with an ORAC value of 14.1 and 100% of cell viability in BAEC. • The "exo" coumarin-chalcone hybrids showed good affinity as ligands for one or more adenosine receptors. Specifically, compound (E)-3-(3-(thiophen-3yl)acryloyl)coumarin presented the best activity and selectivity (hA3 = 5.16 mM) being essential the substitution of the chalcone ring B by a thiophene. • Some of the studied compounds showed moderated antibacterial activities against human pathogens pathogens and some others excellent activities against marine origin pathogens. In particular, amino-3-benzoylcoumarin derivatives proved to be as active as the current drugs used against the marine pathogen Tenacibaculum maritimum, with no effect on human bacteria strains. 291 Bibliografía 298 79 Anjaneyulu, A.S.R.; Sudharani, G.; Mallavadhani, U.V.; Murthy, Y.L.N. Indian J. Chem. 1991 , 30B, 707. 80 Cairns, N.; Harwood, L.M.; Astles, D.P. Tetrahedron 1 1992 , 48, 7581. 81 Raviña, E. The evolution of drug discovery. From traditional medicines to modern drugs. Wiley-VCH (Eds), Germany, 2 2011 . 82 Campos-Toimil, M.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. Bioorg. Med. 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