Efecto de los agonistas del receptor GUCY2C sobre la esteatosis hepática en modelos in vitro e in vivo y mecanismos moleculares implicados

TESIS DE DOCTORADO EFECTO DE LOS AGONISTAS DEL RECEPTOR GUCY2C SOBRE LA ESTEATOSIS HEPÁTICA EN MODELOS IN VITRO E IN VIVO Y MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS Patricia E. González Sáenz ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN ENDOCRINOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2020 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Efecto de los agonistas del receptor GUCY2C sobre la esteatosis hepática en modelos in vitro e in vivo y mecanismos moleculares implicados Dña Patricia Esther González Sáenz Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, Mayo de 2020 Fdo. Patricia E. González Sáenz AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Efecto de los agonistas del receptor GUCY2C sobre la esteatosis hepática en modelos in vitro e in vivo y mecanismos moleculares implicados Dña. Luisa María Seoane Camino D. Rubén Nogueiras Pozo INFORMAN: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por Dña. Patricia Esther González Sáenz, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, Abril de 2020. Fdo. Luisa María Seoane Camino Fdo. Rubén Nogueiras Pozo “Nada en la vida debe ser temido, solamente comprendido. Ahora es el momento de comprender más. para temer menos.” Marie Curie A toda mi familia por todo su apoyo y cariño ABSTRACT This doctoral thesis is based on the study of the action exerted by the agonists of the transmembrane receptor GUCY2C on the hepatic lipid metabolism and the mechanisms involved in this process. Specifically, at the molecular level, in vitro and in vivo treatments with these agonists, uroguanylin and linaclotide respectively, activate the mechanism of β-oxidation of hepatic fatty acids mediated by peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) thanks to the specific binding to its receptor. The modifications on either the GUCY2C receptor or PPARα produce a blockage in the molecular mechanism, generating an excess of fat in the cytoplasm of the hepatocytes. Moreover, the oral treatment of linaclotide leads to a reduction of body weight and adiposity in murine models independently of food intake. However, a pharmacological treatment of antagonizing the β3 adrenergic receptor can block the linaclotide effect at this level without affecting its hepatic oxidative effect. KEY WORDS: steatosis, liver, uroguanylin, GUCY2C, linaclotide, PPARα. AGRADECIMIENTOS Según decía el poeta Antonio Machado en sus versos: “Verás la maravilla del Camino; camino de soñada Compostela” y como al andar se hace camino, ha llegado el momento de su destino. Pero antes, es necesario mostrar mi agradecimiento a todas las personas que han formado parte de este camino hasta el final de sus pasos. Primeramente, me gustaría agradecer a mis directores, Sisi Seoane y Rubén Nogueiras por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo de tesis doctoral. Muchas gracias, Sisi por todo lo que me has ayudado en este trabajo, toda la experiencia y el apoyo constante en todo momento y también la ilusión que nos ha permitido alcanzar grandes objetivos. Muchas gracias, Rubén por todos los consejos aportados que me han ayudado a crecer en conocimiento, por todo el apoyo para seguir adelante y por tu gran disposición. Muchas gracias también a Sulay Tovar y a Carlos Diéguez por la ayuda mostrada. A Rosaura Leis por su amabilidad y cercanía. A Miguel Fidalgo y a todo su equipo por la elaboración de los vectores lentivirales. Otra parte importante de los agradecimientos corresponde a todos los compañeros que han formado parte de este trabajo. Muchas gracias a mis compañeras de laboratorio en el IDIS. A Cintia por sus ánimos, disponibilidad y gran esfuerzo constante. A Silvia por la ayuda brindada en todo momento. A Ceci por su experiencia y conocimiento. A Vero por su ayuda y disposición y a Raquel por todo su apoyo constante. También me gustaría acordarme de Rocío de la Unidad de Nutrición Pediátrica por su amabilidad y disponibilidad. Gracias a todos los compañeros del IDIS por vuestros ánimos, amabilidad y ayuda en todo este período. Además, tengo que agradecer a todos los compañeros del CiMUS porque también han participado en este camino. A Cintia y a Dani, por su ayuda con los experimentos y todo su apoyo. A Marcos por toda su ayuda constante y todas sus palabras de ánimo en todo este período. A Chusa por su disponibilidad, su alegría y ánimos. A Cris, muchas gracias por su confianza y por enseñarme tantas cosas. Muchas gracias a todos los compañeros que pasaron por POLES por toda la ayuda, los consejos y las palabras de aliento: Natalia, Amparo, Violeta, Mar, Omar, Bego, Mónica, Leonardo, René, Patricia, Eva, Uxía, Juan, Sabela, Javi, Eva, Laura, Pamela. A todos los compañeros del CiMUS que con sus palabras me animaron en muchas ocasiones. Gracias a Ana Senra por su trabajo en las tinciones histológicas y celulares. A Pili, por toda su ayuda y por su generosidad. Gracias a Bernardo y a Ana por todo el cuidado de los animales y por sus consejos. A Esther y a Ebel que junto con Cris habéis sido uno de mis pilares en Santiago. Muchas gracias por todo, ha sido increíble compartir esta experiencia con vosotras. Llegando a esta última parte me queda agradecer a todas esas personas que desde la distancia han estado presentes. Gracias a todos los amigos por toda su paciencia, su comprensión y el gran apoyo mostrado en todo momento. Por último, agradecer a toda mi familia, especialmente a mis padres todo el cariño, la ayuda y los consejos que me han permitido luchar y seguir adelante siempre. También agradecer a mi hermano por estar muy presente a pesar de la distancia que nos separa. Con todo mi cariño y afecto y por hacer que todo esto se haga posible. Muchas gracias. Índice 21 ÍNDICE ACRÓNIMOS .................................................................... 27 INTRODUCCIÓN ............................................................. 37 1. CONTROL HOMEOSTÁTICO DEL BALANCE ENERGÉTICO ... 39 1.1. Disfunción de la homeostasis energética: fisiopatología de la obesidad y enfermedades asociadas ................................................ 40 1.2. Tratamientos frente a la obesidad: efectos de los fármacos y la cirugía bariátrica ........................................................................... 41 2. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA POR EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL .................................................... 43 2.1. Hipotálamo: núcleos, funciones y regulación ............................... 43 2.2. Sistema nervioso autónomo: composición y funciones ................ 46 3. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA POR LA ACCIÓN DE DIFERENTES ÓRGANOS ........................................... 47 3.1. Regulación de la homeostasis energetica por el tracto gastrointestinal: sistema nervioso entérico y señales hormonales .................................................................................... 47 3.2. Regulación de la homeostasis energética por el tejido adiposo: tipos, función y señales endocrinas ............................................... 51 3.2.1. Tejido adiposo blanco (WAT) ............................................ 52 3.2.2. Tejido adiposo marrón (BAT) ............................................ 54 3.3. Hormona gastrointestinal uroguanilina (UGN) ............................ 56 3.3.1. Mecanismo de accion de la uroguanilina ........................... 57 3.3.2. Regulación de la producción intestinal de uroguanilina ..... 60 3.3.3. Efectos farmacológicos de la administración de uroguanilina ........................................................................ 61 3.3.4. Otros agonistas del receptor GUCY2C .............................. 63 3.3.5. Disfunciones en la señalización intestinal del receptor GUCY2C asociadas a enfermedades .................................. 64 PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 22 3.4. Regulación de la homeostasis energética por el hígado: funciones y metabolismo............................................................... 66 3.4.1. Regulación del metabolismo de la glucosa ......................... 66 3.4.2. Regulación del metabolismo de lípidos .............................. 67 3.4.2.1. Fuentes de energía hepatica: origen y funciones principales................................................................... 68 3.4.2.2. Asimilación de ácidos grasos y transporte ................. 69 3.4.2.3. Síntesis de ácidos grasos: lipogénesis de novo (LDN) 70 3.4.2.4. Oxidación de ácidos grasos y cetogénesis .................. 71 3.4.2.4.1. Componentes clave en el desarrollo de la βoxidación ........................................................ 74 Receptores activados por proliferador de peroxisomas (PPARs) ............................................ 74 Familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) ................................................ 81 Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21).................................................................. 83 Sistema carnitina palmitoiltransferasa (CPT) ........ 85 Función principal de CPT1A en la β-oxidación de ácidos grasos e impacto en el metabolismo hepático .................................................................. 87 OBJETIVOS ..................................................................... 89 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................ 93 1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTACIÓN IN VITRO .................. 95 1.1. Cultivos celulares .......................................................................... 95 1.2. Tratamientos celulares .................................................................. 96 1.2.1. Tratamiento con ácido oleico .............................................. 96 1.2.2. Tratamiento con el antagonista de PPARα (GW6471) ....... 96 1.2.3. Tratamiento con la hormona uroguanilina (UGN) .............. 97 1.3. Diseños experimentales in vitro .................................................... 97 1.3.1. Efecto del tratamiento con la uroguanilina en un modelo de esteatosis hepática y mecanismos moleculares implicados ........................................................................... 98 Índice 23 1.3.1.1. Establecimiento de un modelo de esteatosis hepatica en la línea celular humana, HepG2 .............. 98 1.3.1.2. Efecto del tratamiento de la hormona gastrointestinal uroguanilina sobre el modelo de esteatosis hepática in vitro.......................................... 98 1.3.1.3. Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la acción de la uroguanilina sobre el metabolismo lipídico hepático ................................ 99 1.3.2. Papel del receptor GUCY2C hepático en el efecto de la UGN sobre la esteatosis hepática. .................................... 100 1.3.2.1. Tratamiento del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C con un siRNA específico ......................... 100 1.3.2.2. Efecto del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C en el mecanismo molecular activado por la UGN en la línea celular hepática HepG2 ............. 101 1.3.3. Papel de PPARα sobre la oxidación de ácidos grasos activada por la hormona uroguanilina .............................. 103 2. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTACIÓN IN VIVO .................. 104 2.1. Legislación y ética en los procedimientos con animales de experimentación .......................................................................... 104 2.2. Modelo de experimentación animal utilizado en los procedimientos. condiciones de mantenimiento y cuidado ........ 105 2.3. Procedimientos Experimentales .................................................. 106 2.3.1. Vías de administración de sustancias ............................... 106 2.3.1.1. Vía intraperitoneal (IP)............................................. 106 2.3.1.2. Via intravenosa por la vena de la cola (IV) .............. 107 2.3.1.3. Vía oral ..................................................................... 108 2.3.1.4. Vía subcutánea (SC) ................................................. 109 2.3.2. Monitorización del peso corporal, la ingesta y la composición corporal ....................................................... 110 2.3.3. Sacrificio, extracción de tejidos y recogida de las muestras ............................................................................ 111 2.4. Diseños experimentales .............................................................. 112 2.4.1. Modelo in vivo de obesidad inducida por dieta (DIO) ..... 112 PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 24 2.4.2. Efecto de la administración del fármaco linaclotide (oral) y del antagonista del receptor β3-adrenérgico (SC) en modelos murinos .......................................................... 113 2.4.3. Efecto del silenciamiento del receptor GUCY2C (IV) y del tratamiento oral con linaclotide sobre el modelo de experimetación in vivo, DIO ............................................. 116 2.4.4. Efecto del tratamiento con el antagonista (GW6471) de PPARα (IP)y del tratamiento oral con linaclotide sobre el modelo de experimentación in vivo DIO ...................... 118 3. TÉCNICAS ANALÍTICAS ................................................................ 120 3.1. Análisis de expresión proteica: Western Blot ............................. 120 3.1.1. Extracción de proteína ...................................................... 120 3.1.2. Cuantificación de proteínas .............................................. 122 3.1.3. Preparación de las muestras .............................................. 124 3.1.4. Electroforesis SDS-PAGE ................................................ 125 3.1.4.1. Elaboración de los geles de poliacrilamida .............. 125 3.1.4.2. Electroforesis SDS-PAGE ........................................ 127 3.1.5. Transferencia húmeda ....................................................... 128 3.1.6. Comprobación de la transferencia gel-membrana: Tinción rojo Ponceau ........................................................ 130 3.1.7. Inmunodetección ............................................................... 131 3.1.7.1. Bloqueo .................................................................... 131 3.1.7.2. Hibridación de los anticuerpos ................................. 131 3.1.7.3. Detección .................................................................. 133 3.1.7.4. Análisis de las bandas proteicas detectadas .............. 134 3.2. Análisis de expresión génica: pcr cuantitativa (Q-PCR) ............. 135 3.2.1. Extracción de RNA: método Tiocianato de GuanidinaFenol-Cloroformo ............................................................. 135 3.2.2. Cuantificación del RNA aislado de las muestras .............. 138 3.2.3. Retrotranscripción ............................................................. 139 3.2.4. PCR en tiempo real (Q-PCR) ............................................ 140 3.3. Análisis del perfil lipídico en sangre y en hígado ....................... 144 3.4. Técnica de tinción de ácidos grasos in vitro: Oil-Red-O ............ 145 3.5. Estudios histológicos ................................................................... 146 3.5.1. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) ......................... 146 3.5.2. Tinción de Oil Red O ........................................................ 147 Índice 25 3.6. Análisis estadístico ..................................................................... 148 RESULTADOS ................................................................ 149 ESTUDIOS IN VITRO .................................................... 151 1. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON LA HORMONA UROGUANILINA EN UN MODELO CELULAR DE ESTEATOSIS HEPÁTICA Y MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS . 151 1.1. Identificación del receptor de la uroguanilina, GUCY2C en el hígado ......................................................................................... 151 1.2. Establecimiento de un modelo de esteatosis hepatica en la línea celular humana, HepG2 ...................................................... 152 1.3. Efecto del tratamiento con la hormona gastrointestinal uroguanilina en un modelo de esteatosis hepática in vitro.......... 153 1.4. Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la acción de la uroguanilina sobre el metabolismo lipídico hepático ....................................................................................... 155 1.5. Papel del receptor GUCY2C hepático en la acumulación de lípidos citoplasmáticos en la línea celular humana, HepG2 ....... 156 1.6. Efecto del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C en el mecanismo molecular activado por la uroguanilina en presencia del tratamiento con ácido oleico ................................................. 158 1.7. Papel de PPARα sobre la oxidación de ácidos grasos activada por uroguanilina .......................................................................... 160 ESTUDIOS IN VIVO ...................................................... 163 2. EFECTO DEL TRATAMIENTO ORAL CON UN AGONISTA DE GUCY2C SOBRE EL HÍGADO DE RATONES Y MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS ..................................................... 163 2.1. Efecto de la administración oral del fármaco linaclotide sobre el fenotipo de ratones DIO .......................................................... 163 2.2. Efecto del tratamiento con linaclotide sobre la esteatosis hepática y sobre los niveles de ácidos grasos libres y de triglicéridos ................................................................................. 165 PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 32 IMC: Índice de Masa Corporal. IP: IntraPeritoneal. IV: IntraVenosa. KO: KnockOut. KRH: Krebs-Ringer-HEPES. LBD: Región de unión al ligando (“Ligand Binding Domain”). LCFAs: Ácidos grasos de cadena larga (“Long-Chain Fatty Acids”). LDL: Lipoproteína de baja densidad (“Low Density Lipoprotein”). LDN: Lipogénesis De Novo. L-FABP: Proteína de unión a ácidos grasos hepáticos (“LiverFatty Acid Binding Protein”). LHA: Núcleo lateral (“Lateral Hypothalamic Area”). LPL: LipoProteina Lipasa. MAPKs: Proteínas quinasas activadas por mitógeno (“Mitogen-Activated Protein Kinases”). MB: Cuerpos mamilares (“Mammillary Bodies”). MCH: Hormona concentradora de melanina (“Melanin-Concentrating Hormone”). MCP-1: Proteína quimioatrayente de monocitos-1 (“Monocyte Chemoattractant Protein -1”). ME: Eminencia Media (“Median Eminence”). M-MLV RT: Transcriptasa reversa del virus de leucemia murino Moloney (“Moloney-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase”). MMTT: Prueba de tolerancia a alimentos mixtos (“Mixed Meal Tolerance Test”). MRI: Imagen por resonancia magnética (“Magnetic Resonance Imaging”). mRNA: Ácido ribonucleico mensajero (“messenger RiboNucleicAcid”). Acrónimos 33 NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido (“Nicotinamide Adenine Dinucleotide”). NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (“Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate”). NAFLD: Enfermedad del hígado graso no alcohólico (“Non-Alcoholic Fatty Liver Disease”). NASH: Esteatohepatitis no alcohólica (“Non-Alcoholic SteatoHepatitis”). NEFAs: Ácidos grasos no esterificados (“Non-Esterified Fatty Acids”). NHE: intercambiador sodio hidrógeno (“Na+–H+ Exchanger”). NPY: Neuropéptido Y (“NeuroPeptide Y”). NTD: Dominio N terminal (“N Terminal Domain “). NTS: Núcleo del Tracto Solitario. OA: Ácido oleico (“Oleic Acid”). OMS: Organización Mundial de la Salud. ORO: Rojo oleoso O (“Oil Red O”). OX: Orexinas (“OreXins”). OXM: OXintoModulina. OWAT: Tejido adiposo blanco omental (“Omental White Adipose Tissue”). PBS: Tampón fosfato salino (“Phosphate-Buffered Saline”). PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction”). PDE: Fosfodiesterasa (“PhosphoDiEsterase”). PFA: Área PeriFornical (“PeriFornical Area”). PGC-1α/ β: Receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas coactivador-1alfa/ beta (“Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1alpha/ betha”). PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 34 PI3K: Fosfatidilinositol 3-quinasa (“PhosphatidylInositol 3-Kinase”). PKA: Proteína kinasa dependiente de cAMP (“Protein Kinase cAMP-dependent”). PKGII: proteína kinasa dependiente de cGMP tipo 2 (“Protein Kinase cGMP-dependent type 2”). POA: Área preótpica (“PreOptic Area”). POMC: ProOpioMelanoCortina. PP: Polipéptido Pancreático. PPARs: Receptores activados por proliferador de peroxisomas (“Peroxisome Proliferator-Activated Receptors”). PPRE: Elemento de respuesta al proliferador de peroxisomas (“Peroxisome Proliferator Response Element”). PVH/PVN: Núcleo paraventricular (“ParaVentricular Nucleus”). PVDF: Difluoruro de polivinilideno (“PolyVinylidene DiFluoride”). PYY: Péptido YY. Q-PCR: PCR cuantitativa (“Quantitative-Polymerase Chain Reaction”). RBP-4: Proteína de unión al retinol-4 (“Retinol Binding Protein-4”). RD: Real Decreto. RMN: Resonancia Magnética Nuclear. RNA: Ácido Ribonucleico (“RiboNucleic Acid “). RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (“Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction”). RXR: Receptor X Retinoide. RYGB: Baipás Gástrico (“Roux en-Y, Gastric Bypass”). SC: SubCutánea. SCN: Núcleo supraquiasmático (“SupraChiasmatic Nucleus”). Acrónimos 35 SCP-2: Proteína transportadora de esteroles-2 (“Sterol Carrier Protein-2”). SD: Dieta Standard (“Standard Diet”). SDS: Sodio Dodecil Sulfato. SDS-PAGE: Sodio Dodecil SulfatoElectroforesis en gel de poliacrilamida (“Sodium Dodecyl SulfatePolyAcrylamide Gel Electrophoresis”). SEM: Error estándar de la media (“Standard Error of the Mean”) SF1: Factor esteroidogénico (“Steroidogenic Factor 1”). shRNA; Ácido ribonucleico de horquilla pequeña (“short hairpin RNA”). siRNA: Ácido ribonucleico pequeño de interferencia (“small interference RNA”). SIRT-1: SIRTuina-1. SNA: Sistema Nervioso Autónomo. SNC: Sistema Nervioso Central. SNE: Sistema Nervioso Entérico. SNP: Sistema Nervioso Parasimpático. SNS: Sistema Nervioso Simpático. SON: Núcleo supraóptico (“SupraOptic Nucleus”). SPF: Sala libre de patógenos (“Specific Pathogen Free”). STs: Enterotoxinas bacterianas termoestables (“heat-Stable enteroToxins”). STAT: Transductora de señal y activadora de transcripción (“Signal Transducer and Activator of Transcription”). TBL: Transducina beta tipo 1 (“Transducin Betha Like 1”). TBLR1: Receptor de la TBL1 (“TBL Receptor1”). TBS-T: Tampón de lavado tris salino-tween (“Tris Buffer Saline-Tween”). TEMED: TEtraMEtiletilenDiamina. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 36 TGs: TriGlicéridos. TNF-α: Factor de necrosis tumoral-α (“Tumor Necrosis Factorα”). TVI: Inyección por la vena lateral de la cola (“Tail Vein Injection”). UCP1: Proteína desacoplante 1 (“UnCoupling Protein1”). UGN: UroGuaNilina. UV: Unidades Virales. V: Vehículo. VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad (“Very Low Density Lipoproteins”). VMH/VMN: Núcleo ventromedial (“VentroMedial Nucleus”). WAT: Tejido adiposo blanco (“White Adipose Tissue”). INTRODUCCIÓN Introducción 39 1. CONTROL HOMEOSTÁTICO DEL BALANCE ENERGÉTICO Como es bien conocido, la habilidad de los organismos para mantener un ambiente metabólico interno homeostático1 que permite regular el peso corporal, constituye un requerimiento fundamental para la supervivencia de los mismos. La homeostasis energética constituye un proceso biológico altamente regulado definido como el equilibrio entre la energía consumida (ingesta), energía almacenada y el gasto de energía (actividad física, metabolismo basal y termogénesis adaptativa) necesario para llevar a cabo las funciones básicas fisiológicas2 (Imagen 1). Este proceso de gestión energética necesita de una regulación muy estricta por parte del sistema nervioso central (SNC) junto con diversos órganos periféricos (hígado, páncreas, tejido adiposo, tracto gastrointestinal, etc) la cual permite mantener este equilibrio. Esta regulación requiere de una gran variedad de señales que proporcionan información acerca del estado de los órganos periféricos cruciales en el consumo energético, la absorción de alimentos y la acumulación energética. Imagen 1. Control del balance energético. Representación gráfica del equilibrio de energía entrante (Consumo de energía) y la energía saliente (Gasto de energía). El consumo de energía se encuentra representado por la ingesta de alimentos y el gasto de energía está representado por la actividad física, el metaboslimo basal y la termogénesis adaptativa. Imagen procedente de la referencia (2). Con permiso de Elsevier, número de licencia 4684331051603. Actividad Física Consumo de energía Gasto de energía Metabolismo Basal Termogénesis Adaptativa Ingesta PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 40 1.1. DISFUNCIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA: FISIOPATOLOGÍA DE LA OBESIDAD Y ENFERMEDADES ASOCIADAS La obesidad se produce como consecuencia de un desequilibrio positivo del proceso homeostático. La Organización Mundial de la Salud (OMS)3 define este desequilibrio como un exceso de acumulación de grasa que puede ser perjudicial para la salud y se diagnostica con un índice de masa corporal (IMC) superior a 30 kg/m2. Por lo tanto, se trata de una enfermedad crónica progresiva de constante riesgo para la salud de las personas. Además, esta patología incrementa de forma sustancial el riesgo de desarrollar otras patologías de diversa naturaleza como por ejemplo enfermedades metabólicas, entre las que se encuentran la diabetes tipo 2 y el hígado graso no alcohólico, enfermedades cardiovasculares como la hipertensión o el infarto de miocardio, enfermedades músculoesqueléticas como la osteoartritis e incluso el desarrollo de algunos tipos de cáncer como el cáncer de mama, de ovario, de próstata, de hígado, de riñón o de colon. Al mismo tiempo, se producen cambios en la apariencia física de los individuos que pueden desembocar en problemas en las relaciones sociales y en una menor calidad de vida4. Durante los últimos 50 años la prevalencia de la obesidad se ha incrementado notablemente, no sólo en el número de individuos que la padecen, sino también en la notoria expansión por todos los países del mundo en proporciones pandémicas5,6,7. Hay que destacar que el incremento de la obesidad en niños y adolescentes resulta ser de vital importancia ya que permite realizar una predicción verosímil de cómo va a afectar esta patología a la población del futuro8. Por tanto, teniendo en cuenta toda esta información acerca de la obesidad como enfermedad multifactorial crónica que se está convirtiendo en un problema de salud de primera magnitud, la investigación actual en este campo se centra en analizar los factores involucrados en la enfermedad con el fin de desarrollar tratamientos específicos y personalizados que ayuden a combatirla. Introducción 41 1.2. TRATAMIENTOS FRENTE A LA OBESIDAD: EFECTOS DE LOS FÁRMACOS Y LA CIRUGÍA BARIÁTRICA Los tratamientos más importantes que se han desarrollado en la actualidad para combatir la obesidad se agrupan en 2 bloques, los tratamientos farmacológicos y los tratamientos quirúrgicos. En relación a los tratamientos farmacológicos, existen muchos tipos y normalmente permiten alcanzar el equilibrio energético supliendo las deficiencias hormonales (por ejemplo, tratamientos de leptina recombinante en humanos deficientes en esta hormona), antagonizando los inhibidores de las rutas moleculares que promueven el desarrollo de la obesidad9,10 o bien activando determinadas moléculas capaces de regular mecanismos involucrados en la homeostasis energética11. En la actualidad el número de fármacos comercializados para el tratamiento de la obesidad es reducido, además algunos de ellos presentan efectos adversos no deseados lo cual hace necesario un estudio particular de cada individuo para poder llevar a cabo una terapia personalizada11. A pesar del creciente número de fármacos en estudio para el tratamiento de la obesidad, la terapia más efectiva para tratar esta patología en la actualidad, la constituye el tratamiento quirúrgico. Este tratamiento consiste en llevar a cabo una cirugía bariátrica que permite la manipulación del tracto gastrointestinal que se traduce en una profunda pérdida de peso y una mejora de las condiciones fisiológicas. De esta manera, se producen cambios en las señales que envía el tracto gastrointestinal al hipotálamo en cuanto al tamaño de las comidas y en la regulación de la homeostasis energética a largo plazo12. Existen varios tipos de cirugías, entre las que destacan el bypass yeyunoileal, la derivación biliopancreática (DBP), la gastroplastia vertical con banda y el bypass gástrico (RYGB)11 (Imagen 2). El procedimiento de cirugía que se utiliza con mayor asiduidad y cuya efectividad es más alta, es el bypass gástrico (RYGB) que permite PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 48 esplácnicos. Además, el tracto gastrointestinal posee su propio sistema nervioso denominado sistema nervioso entérico (SNE) que regula todas las funciones intestinales además de la motilidad del tracto gastrointestinal, la secreción exocrina pancreática y la liberación de las hormonas, entre otras11,48. El SNE se va a encargar de integrar la información procedente del tracto gastrointestinal y proyectarla a través del SNA para que pueda llegar a las diversas áreas del SNC48. El principal estímulo que recibe el tracto GI es la ingesta de alimentos que va a permitir estimular factores metabólicos, neuronales y endocrinos junto con factores visuales, olfatorios, emocionales y cognitivos para modificar y transformar el comportamiento con respecto a la ingesta20. Postprandialmente se van a incrementar los niveles de secreción de señales hormonales intestinales cuya función consiste en regular la saciedad a corto plazo alterando el tamaño y la frecuencia de las comidas. Algunas de ellas se describen a continuación (Imagen 4): Ghrelina: Se trata de una hormona clave en la regulación de la homeostasis energética que es secretada principalmente por las células oxínticas gástricas y por el intestino (células del duodeno, íleon, ciego y colon)49. Además, se ha detectado expresión de esta hormona en otros tejidos como testículos50, ovario51, corazón52, pituitaria53 y placenta49. La administración central y periférica de la ghrelina en roedores produce un balance energético positivo que incrementa la ingesta produciendo una acumulación de los depósitos de grasa54,55,56. De esta manera, los niveles circulantes de ghrelina disminuyen tras la ingesta y se incrementan en situaciones de ayuno57,58. El efecto orexigénico de la ghrelina se lleva a cabo gracias a su unión con el receptor de secretagogos de la hormona de crecimiento (GHS-R)56. Se ha demostrado en experimentos realizados en roedores que la administración de ghrelina produce hiperfagia y genera obesidad59. Además, diversos estudios en humanos demuestran que la Introducción 49 administración intravenosa de esta hormona incrementa la ingesta60. La administración central de ghrelina actúa fundamentalmente en el núcleo ARC donde incrementa la expresión de los neuropétidos NPY y AgRP expresados por las neuronas orexigénicas que también presentan el GHS-R54,55. Las acciones de la ghrelina también se encuentran reguladas por las neuronas del núcleo LHA que expresan OX y las neuronas del NTS del tronco encefálico54. En experimentos realizados en roedores deficientes (KO) en ghrelina o en su receptor (GHS-R) se demostró que, ante la presencia de una dieta alta en grasa, se encontraban protegidos frente al desarrollo de obesidad con un incremento del gasto energético y de la actividad locomotora61. Colecistoquinina (CCK): Secretada por las células del duodeno y del yeyuno en respuesta a la ingesta de alimentos11,62 presentando un efecto anorexigénico ya que cuando se bloquea el efecto de esta hormona mediante la administración farmacológica de un antagonista de CCK, se incrementa la ingesta en humanos63. Esta hormona se encuentra involucrada en el control a corto plazo en la ingesta regulando el tamaño y la duración de las comidas. Péptido similar al glucagón -1 (GLP-1) y oxintomodulina (OXM): El gen preproglucagón es tejido específico, de tal manera que se procesa como glucagón en el páncreas, y, por otro lado, como los péptidos saciantes GLP-1 y la OXM en el intestino y en el NTS11,64. GLP-1 y OXM cuando son administrados de forma crónica disminuyen la ganancia de peso y la adiposidad en roedores65. Los efectos de estas hormonas se producen gracias a su unión con el receptor de GLP-1 presente en el hipotálamo y el tronco encefálico66. Péptido YY(PYY): Secretado principalmente por las células de las partes distales del intestino, concretamente del íleon, colon y recto64. Su efecto anorexigénico se demuestra tras su administración periférica produciendo varios efectos como es el lento vaciado gástrico y el incremento de la absorción en el íleon promoviendo una reducción de la ingesta y del peso corporal67. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 50 Polipéptido inhibidor gástrico (GIP): Secretado por las células duodenales en presencia de dietas con alto contenido en grasa. En experimentos realizados en roedores que no expresan el receptor de GIP se encuentran protegidos frente a la obesidad y la resistencia a insulina en presencia de una dieta alta en grasa. Este potencial resulta de vital importancia en el desarrollo de nuevos tratamientos antiobesidad68. Además de todas estas hormonas que llevan a cabo la regulación de la ingesta a corto plazo, hay que destacar a la hormona gastrointestinal uroguanilina (UGN), de gran importancia en el desarrollo del presente proyecto. En el punto 3.3. se van a presentar con más detalle las principales características y funciones de la UGN. Por otro lado, es preciso destacar la acción de los sistemas de control a largo plazo que a través de determinadas señales periféricas se encargan de evaluar el estado en el que se encuentran los depósitos de energía almacenada2. Por ejemplo, la hormona insulina en el páncreas o las adipoquinas leptina, adiponectina o resistina producidas por el tejido adiposo (Imagen 4). Por último, es importante mencionar los estudios que demuestran que la manipulación genética o farmacológica de GLP-1 y PYY también tienen acciones de regulación a largo plazo. Por ejemplo, los ratones (KO) para PYY son obesos, y estos efectos se revierten con la administración de PYY69. Introducción 51 Imagen 4. El hipotálamo es capaz de integrar la información que recibe de las señales periféricas, ya sea para llevar a cabo una regulación tanto a corto plazo (GLP-1, CCK, UGN, Ghrelina) como la regulación a largo plazo (Insulina, Leptina). DVC: Complejo Vagal Dorsal; UGN: Uroguanilina; PYY3-36: Péptido YY; OXM: Oxintomodulina; GLP-1: Péptido tipo Glucagón-1; GIP: Polipéptido Inhibidor Gástrico; PP: Polipéptido Pancreático. Imagen procedente de la referencia (11). Con el permiso de AAAS (“The American Association for the Advancement of Science”). 3.2. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA POR EL TEJIDO ADIPOSO: TIPOS, FUNCIÓN Y SEÑALES ENDOCRINAS El estudio del tejido adiposo y de los adipocitos es fundamental para poder entender la disfunción metabólica que se produce en el estado patofisiológico de la obesidad. Es importante destacar que el adipocito actúa como una célula endocrina y funcional ya que es capaz de Aferencias vagales Frecuencia comidas Tamaño comidas Gasto energético Competencia reproductiva Entrada señales hedónicas Ghrelina Quimiosensores UGN Insulina Tejido adiposo Visfatina Adiponectina Resistina Hipotálamo Leptina Acción de las incretinas Receptores de nutrientes Recpetores mecánicos Amilina PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 52 integrar y enviar señales comunicándose con el SNC70. Las funciones principales de los adipocitos son: regular el metabolismo lipídico estableciendo un equilibrio entre los triglicéridos (TGs) que acumula y los ácidos grasos (FAs) que libera, catabolizar los TGs en FAs y glicerol necesarios en el metabolismo de la glucosa que realizan otros tejidos y secretar adipoquinas que llevan a cabo funciones biológicas específicas71. En la obesidad se produce un exceso de acumulación de masa grasa que genera una pérdida de funcionalidad del adipocito hipertrofiándose y desarrollando un desequilibrio entre los procesos de lipogénesis y lipólisis. Esta disfunción no se produce únicamente en los adipocitos, sino que el uso anormal de los ácidos grasos puede afectar a otros tejidos como el hígado, el páncreas o el corazón, entre otros70. Existen dos tipos de tejidos adiposos que presentan diferente estructura celular, localización, color, vascularización y función: el tejido adiposo blanco (White Adipose Tissue, WAT) y el tejido adiposo marrón (Brown Adipose Tissue, BAT). 3.2.1. Tejido adiposo blanco (WAT) Los adipocitos que conforman el tejido adiposo blanco son capaces de liberar numerosas hormonas (Imagen 5), destacando la leptina, resistina, adiponectina, serpina, visfatina, quemerina, entre otras. Junto con ellas también se liberan citoquinas como TNF-α, IL-6, and MCP-1 participando en la migración celular y en procesos inflamatorios72. De entre todas las adipoquinas secretadas, es necesario destacar de forma especial a la leptina. Leptina Descubierta por Friedman y cols. fue la primera adipoquina caracterizada y descrita codificada por el gen ob73. El producto proteico consta de 167 aminoácidos y de un peso molecular de 16 kDa y su función va a ser la de incrementar el gasto energético disminuyendo la ingesta. Esta función metabólica fue establecida a partir de estudios en los que se llevaban a cabo daños en diferentes Introducción 53 regiones hipotalámicas en ratones obesos74. Por lo tanto, esta hormona va a ser capaz de controlar el crecimiento del tejido adiposo a través de su acción en el SNC. Además, administraciones locales en determinadas regiones hipotalámicas dan lugar a una disminución de la ingesta y del peso corporal en modelos murinos75. Los estudios del mRNA (Ácido RiboNucleico mensajero) de la leptina la sitúan principalmente en el tejido adiposo, pero también se encuentra presente en otros tejidos como el ovario, el intestino y el hígado75. Los receptores de la leptina se encuentran en numerosas localizaciones entre las que destacan: diferentes regiones del hipotálamo, hígado, músculo esquelético, corazón, riñón y páncreas76,77,78. Es importante destacar que esta hormona presenta acciones endocrinas enviando señales al SNC, por un lado, pero también paracrinas y autocrinas gracias a la presencia de su receptor en los propios adipocitos que la secretan70. De tal manera que, en su función autocrina, la secreción de leptina permite activar la producción interna de mitocondrias adipocíticas que favorecen la oxidación de los lípidos acumulados. Además, esta hormona se encuentra involucrada en otros procesos como la hematopoyesis, la angiogénesis, la regulación de la respuesta inmune, etc79. En condiciones de obesidad en las que se produce un exceso de acumulación de lípidos en el tejido adiposo, se produce una resistencia a la acción de la leptina ya que la excesiva acumulación supera la capacidad de la hormona para activar el proceso de oxidación. En este punto, hay que destacar además el efecto que se produce en otros órganos como en el hígado, en el que el exceso de acumulación lipídica impide a la leptina activar los mecanismos de oxidación mediante la activación de PPARα, generando por tanto esteatosis hepática. Además, el exceso de acumulación lipídica también afecta a otros órganos como el músculo esquelético, el corazón y el páncreas en los que la leptina no es capaz de ejecutar su acción80,81,82,83. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 54 Imagen 5. Los adipocitos secretan numerosas moléculas con funciones endocrinas a las que se les denomina adipoquinas, que son capaces de regular tanto el metabolismo de la glucosa y de los lípidos en tejidos periféricos como la homeostasis del gasto energético, la respuesta inflamatoria y la presión sanguínea, entre otras. En condiciones de obesidad y síndrome metabólico, se produce un desequilibrio en la secreción de algunas de las adipoquinas que es capaz de secretar el adipocito. Imagen procedente de la referencia (70). Con permiso de Elsevier, número de licencia 4698231477313. 3.2.2. Tejido adiposo marrón (BAT) En la búsqueda de los tratamientos para combatir la obesidad, se sugieren intervenciones que permitan incrementar el gasto energético que es una de las funciones llevada a cabo por el tejido adiposo pardo. Este tejido fue localizado inicialmente en embriones y adultos de ratón. Concretamente, en los animales adultos lo podemos encontrar en la zona dorsal interescapular, en las regiones subescapulares, en regiones axilares y también pequeños depósitos en la zona cervical del cuello entre la escápula y la cabeza, así como alrededor de la aorta y alrededor de los riñones84,85,86. El tejido adiposo pardo humano, se encuentra localizado en la región supraclavicular, en regiones cervicales, paravertebrales, mediastínicas y perirenales (región en la que también está presente en roedores)86,87,88. Secreción d In ae sulin P sanguínearesión Balanceener gético Infl acam ión Hom de ucosaeostasis la gl Cat olism de ác os ab o id grasos Re te a insis ncia sulina Re te a insusis ncia lina visfatina apelina Leptina adiponectina resistina RBP-4 TNF , MCP-1a Secreción d In ae sulin P sanguínearesión Balanceener gético Infl acam ión Hom de ucosaeostasis la gl Cat olism de ác os ab o id grasos Re te a insis ncia sulina Re te a insusis ncia lina visfatina apelina Leptina adiponectina resistina RBP-4 TNF , MCP-1a Introducción 55 La función principal de este tejido consiste en mantener la temperatura corporal de forma significativamente alta en relación con la temperatura ambiente gracias a la producción de calor mediante el proceso de termogénesis. Este proceso esta mediado por la expresión de una proteína desacoplante tejido específica, también denominada UCP1(“Uncoupling Protein-1”) que se sitúa en la membrana interna de las mitocondrias que son las que le proporcionan esa tonalidad marrón. Por tanto, la función principal del BAT va a ser la de la termogénesis adaptativa mediante el desacoplamiento de la producción de ATP y la oxidación de sustrato, desembocando en una producción de calor y un incremento de la tasa metabólica89,90,91. Se ha comprobado que la actividad del BAT es cuatro veces mayor en individuos delgados que en individuos con sobrepeso u obesos92, lo que sugiere que el BAT presenta un control del peso corporal. En general, se requiere la activación de todos los receptores adrenérgicos (Adrenergic Receptors, AR: α1, α2, β1, β2, β3) para integrar las señales de las catecolaminas procedentes del SNC e inducir la termogénesis, pero más exclusivamente del tipo β3-AR que también se encuentra expresado en otros tejidos como en el músculo esquelético, liso o cardiaco, y en niveles bajos en el WAT93,94,95. El efecto denominado browning o amarronamiento se ha comprobado en numerosos estudios en roedores, en los que determinados adipocitos del tejido adiposo blanco son UCP1 positivos y presentan propiedades muy similares a los adipocitos del BAT denominándose así, células beige o brite (beige+white). Este efecto es muy importante ya que supone que estos adipocitos adquieren un fenotipo termogénico ante estímulos como la exposición al frío, o a determinados factores endocrinos o incluso a compuestos químicos96,97,98,99. Además, se ha comprobado en diversos experimentos en roedores que el ejercicio induce el efecto browning en los depósitos del tejido adiposo blanco subcutáneo100. Hay que destacar, que en humanos adultos también se ha logrado caracterizar este tipo de tejido adiposo brite101. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 56 Las diferencias estructurales importantes que existen entre el WAT, el tejido adiposo brite y el BAT (Imagen 6) son las siguientes: el WAT presenta adipocitos con gotas lipídicas extensas con núcleos periféricos; por otro lado, los adipocitos del BAT presentan un núcleo central, un citoplasma con pequeñas gotas lipídicas y gran cantidad de mitocondrias; y, por último, los adipocitos del brite presentan una mezcla de características entre las que tiene el WAT y el BAT102. Hay que destacar que el WAT y el brite se localizan principalmente en localizaciones viscerales (mesentérica, perigonadal u omental rodeando a los órganos) y subcutáneas103. Imagen 6. Tipos de adipocitos. De izquierda a derecha; el adipocito característico del BAT, que presenta pequeñas gotas lipídicas y mitocondrias que dan el color pardo; en el centro el adipocito característico del tejido “Brite” que presenta características de los adipocitos del BAT y del WAT a la vez; a la derecha, el adipocíto característico del WAT, con gotas lipídicas de gran tamaño. 3.3. HORMONA GASTROINTESTINAL UROGUANILINA (UGN) En 1993, se descubrió la hormona uroguanilina (UGN) como ligando endógeno del receptor transmembrana GUCY2C (Guanilato Ciclasa 2C, también se denomina GC-C) que había sido identificado tres años antes en 1990104,105. La uroguanilina (UGN), también denominada GUCA2B (Activador del guanilato ciclasa 2B), es un péptido de 16 CARACTERÍSTICAS DE LOS ADIPOCITOS BAT “BRITE” WAT Introducción 57 aminoácidos al que recientemente se ha atribuido un papel importante en la regulación de la homeostasis energética106. La principal acción descrita hasta hace poco para la UGN era la natriuresis, de tal manera que una elevada ingesta de productos salados condicionaba la secreción endocrina de la hormona desde el intestino, actuando en los túbulos renales para ser capaz de regular el balance de los electrolitos107,108 .Se ha descrito en roedores, que la administración tanto de proUGN como de UGN induce la excreción de sodio y, por el contrario los ratones deficientes en la hormona presentan hipertensión por poseer altas concentraciones del ion sodio que no son excretadas109. En los casos de los pacientes que poseen insuficiencia cardiaca podrían ser tratados con la UGN, ya que presentan funciones renales reducidas que consisten en una disminución del efecto natriurético y como consecuencia una reducida diuresis108,110. Por otro lado, los efectos de la UGN sobre la homeostasis de la glucosa no se han esclarecido hasta el momento. Únicamente en el estudio de Begg y cols, se demostró que los ratones deficientes en UGN alimentados con dieta alta en grasa no mostraban alteración alguna en la tolerancia a glucosa. Sin embargo, cuando estos ratones se sometían a una prueba de tolerancia a alimentos mixtos (MMTT) mostraban niveles elevados de glucosa en sangre y resistencia a la insulina111. En los siguientes puntos se llevará a cabo un estudio más pormenorizado sobre la función de la UGN en la regulación de la homeostasis energética. 3.3.1. Mecanismo de accion de la uroguanilina La uroguanilina es secretada por las células epiteliales del duodeno como prohormona (proUGN) que sufre una conversión enzimática como UGN para unirse a su receptor GUCY2C y activar diversas cascadas intracelulares. Por su parte, el dominio catalítico del receptor es capaz de transformar el guanosín trifosfato en guanosín PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 64 Por otro lado, es necesario destacar a los agonistas sintéticos creados por parte de la industria farmacéutica, como el linaclotide que presenta una conformación estructural similar a la de la enterotoxina bacteriana termoestable130 o el plecanatide y el dolcanatide que presentan características estructurales y funcionales más similares al ligando endógeno uroguanilina130,135,136. Se han realizado numerosos estudios empleando tratamientos con estos agonistas sintéticos. Concretamente, estudios realizados en modelos preclínicos murinos demuestran que una administración oral de linaclotide de forma crónica provoca una reducción del peso corporal y de la adiposidad de forma independiente del tipo de dieta137. Además, es destacable que los ratones con obesidad inducida por dieta que eran tratados con linaclotide oral presentaban un elevado gasto energético que se veía reforzado por el incremento significativo de la temperatura interescapular del BAT acompañado de una reducción del tamaño de los adipocitos del WAT y una disminución de la esteatosis hepática137. Los efectos del linaclotide sobre el BAT y el peso corporal estaban mediados por el sistema nervioso simpático ya que los ratones tratados con el antagonista del receptor β3 adrenérgico eran capaces de revertir los efectos llevados a cabo por el linaclotide. Al mismo tiempo, se ha demostrado que la acción del linaclotide sobre la obesidad generada en los ratones que consumían una dieta alta en grasa, se interrumpía cuando el receptor GUCY2C hipotalámico, se encontraba parcialmente silenciado137. 3.3.5. Disfunciones en la señalización intestinal del receptor GUCY2C asociadas a enfermedades El epitelio del intestino se encuentra sometido a un proceso de renovación constante en el que los enterocitos siguen un eje criptavellosidades con ciclos continuos de proliferación, migración, diferenciación, apoptosis y pérdida final de las células en el lumen. La señalización generada por GUCY2C permite mantener el equilibrio entre las células más diferenciadas localizadas en las vellosidades Introducción 65 próximas a la apoptosis y la regeneración por parte de las células situadas en la cripta. De hecho, el tratamiento llevado a cabo con dolcanatide permite mantener ese equilibrio celular disminuyendo la inflamación y la infiltración celular136,138. Los pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales crónicas (CIBD, Chronic Inflamatory Bowel Diseases) como son la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa presentan una disminución de la señalización de la ruta que es activada por el receptor de la uroguanilina, GUCY2C. Esta señalización juega un papel relevante en la regulación de balance de electrolitos que permiten una hidratación óptima de la mucosa intestinal secretando agua, cloruro sódico (NaCl) y bicarbonato (HCO3-)139,140. Por lo tanto, la búsqueda de los tratamientos se centra en reactivar la señalización de la ruta140. En los casos en los que exista un exceso de inflamación pueden llegar a desarrollar cáncer de colon. De tal manera que, se considera que el receptor GUCY2C se va a encargar de mantener principalmente la integridad del intestino regulando su mecanismo de regeneración gracias a su acción como supresor de tumores141. Los roedores con una deficiencia en el gen Gucy2c, presentan cambios en la arquitectura de las criptas intestinales142 conduciendo a una inestabilidad genómica y a una apoptosis atenuada141. Entre los tratamientos utilizados para tratar estas enfermedades destacan los agonistas sintéticos del receptor GUCY2C, como el linaclotide en el tratamiento de la enfermedad crónica de intestino irritable143 o el plecanatide y el dolcanatide como tratamientos que suprimen la producción de citoquinas proinflamatorias en modelos murinos de colitis y también para que puedan controlar la patofisiología de la tumorogénesis colorectal 135,136,144. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 66 3.4. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA POR EL HÍGADO: FUNCIONES Y METABOLISMO El hígado es el segundo órgano más grande después de la piel, representando entre un 1.5 y un 2.5 % de la masa corporal magra. Supone uno de los órganos más importantes ya que lleva a cabo una gran variedad de funciones, entre las que se encuentran funciones vasculares, inmunológicas, metabólicas, secretoras y excretoras. Centrándonos exclusivamente en las funciones metabólicas, el hígado juega un papel destacado en la regulación de la homeostasis energética gracias a su importante acción en el metabolismo de proteínas, glucosa, y lípidos145. Esta regulación varía dependiendo del estado nutricional del individuo. 3.4.1. Regulación del metabolismo de la glucosa Los mecanismos involucrados en el metabolismo de la glucosa por parte del hígado son la glucolisis, la gluconeogenesis, la glucogenolisis y la glucogenogénesis146. En condiciones normales de alimentación, todos los carbohidratos que se consumen son digeridos y procesados en el tracto gastrointestinal hasta convertirse en unidades de glucosa para posteriormente ser transportada como fuente de energía primaria a varios tejidos (Imagen 8), como por ejemplo el hígado, para generar energía en forma de ATP147. En la mayoría de los tejidos de los mamíferos y en concreto en los hepatocitos, se lleva a cabo el catabolismo de la glucosa (glucólisis) obteniendo como producto el piruvato. Posteriormente, en las mitocondrias, el piruvato va a transportarse al interior de la matriz mitocondrial y se convierte en acetil-CoA gracias a la reacción enzimática del complejo piruvato deshidrogenasa. Dentro de la mitocondria el acetil-CoA se va a incorporar al ciclo de ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs, generando energía en forma de ATP. Además, también se va a generar nicotín adenín dinucleótido (NADH) y flavín adenín dinucleótido Introducción 67 (FADH2) que se incorporaran posteriormente a la cadena transportadora de electrones presente en la membrana interna mitocondrial que permite generar finalmente un aporte extra de energía en forma de ATP146. Cuando existe demanda energética en células que no presentan mitocondrias o están bajo condiciones de isquemia, el piruvato a partir de glicolisis anaeróbica da lugar al lactato, que finalmente también genera ATP146. El exceso de carbohidratos en el hígado se va a acumular en forma de glucógeno gracias al mecanismo de glucogénesis148. Por el contrario, en condiciones de ayuno, el hígado se encarga principalmente de movilizar la glucosa para que esté disponible como principal fuente de energía para consumir por parte de tejidos como el cerebro o el músculo esquelético. Para ello, se produce un incremento de la hormona pancreática glucagón que inicia la cascada de quinasas que permite convertir el glucógeno en glucosa, gracias al mecanismo de la glucogenólisis147. Normalmente, este mecanismo se activa durante el período de ayuno nocturno para poder mantener la homeostasis de la glucosa. En los períodos de ayuno prolongado (más de 30 horas), los depósitos de glucógeno en el hígado se agotan y, por tanto, es necesario que otros precursores como el lactato (generado en el músculo esquelético) o el glicerol (liberado en la lipólisis del tejido adiposo en condiciones de ayuno), se presenten como una nueva fuente de generación de energía en forma de glucosa vía gluconeogénesis146. 3.4.2. Regulación del metabolismo de lípidos El hígado tiene un papel clave en la regulación del metabolismo lipídico y representa el eje de la síntesis de ácidos grasos y de lipoproteínas que permiten la circulación de los lípidos por el torrente sanguíneo. Disfunciones en estas rutas de síntesis y en las rutas moleculares relacionadas con la oxidación de ácidos grasos provocan la acumulación de gotas lipídicas en los hepatocitos originando la condición patológica de la esteatosis hepática. Esta patología, además, PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 68 se suele encontrar acompañada por un incremento de los niveles de ácidos grasos no esterificados (NEFAs) circulantes149. 3.4.2.1. Fuentes de energía hepatica: origen y funciones principales Las fuentes de energía en el hígado son fundamentalmente los ácidos grasos y los triglicéridos (TGs). Las formas más comunes circulantes y de almacenamiento son los ácidos grasos mientras que los TGs son las formas más comunes no tóxicas de ácidos grasos, que se obtienen precisamente de la esterificación de los mismos junto con el glicerol-3-fosfato. Ambas fuentes de energía presentan su origen en varias vías moleculares como la lipogénesis de novo (LDN), los almacenes citoplásmicos de TGs, los ácidos grasos derivados de los restos de TGs unidos a lipoproteina o de los NEFAs circulantes que se liberan a partir del tejido adiposo (Imagen 8). Todo esto depende de la especie, del estado nutricional a corto o a largo plazo y del balance energético149,150. El contenido de TGs en los hepatocitos se encuentra regulado por la actividad de determinadas rutas moleculares que facilitan la síntesis y esterificación de ácidos grasos, así como, la oxidación y la exportación a otros tejidos149 (Imagen 8). Además, los TGs y los esteres de colesterol (originados de la esterificación del colesterol con los ácidos grasos) son los que se almacenan en gotas lipídicas en los hepatocitos o se secretan a la circulación sanguínea como partículas de lipoproteínas de muy baja densidad (“Very Low Density Lipoproteins”, VLDL) (Imagen 8). Por otro lado, los ácidos grasos son capaces de incorporarse a los fosfolípidos que son las principales moléculas que componen las membranas celulares, y la capa superficial de las gotas lipídicas y de las partículas biliares. En las situaciones de ayuno, los ácidos grasos y los TGs almacenados son oxidados (Imagen 8) principalmente en la mitocondria generando tanto fuentes de energía que consumen las células como cuerpos cetónicos150. Introducción 69 3.4.2.2. Asimilación de ácidos grasos y transporte Tras la ingesta de comida, la grasa que se consume es principalmente digerida en el intestino delgado y posteriormente absorbida por los enterocitos en los que los ácidos grasos se esterifican en TGs para ser secretados al sistema linfático intestinal en forma de quilomicrones (Imagen 8). Posteriormente viajan a través de la circulación sanguínea hasta alcanzar el hígado donde se liberan los NEFAs por lipólisis mediada por la lipoproteína lipasa (“LipoProteinLipase”, LPL) (Imagen 8). Algunos estudios en ratones que presentan una sobreexpresión de LPL específica de hígado, terminan desarrollando esteatosis hepática y resistencia a insulina150,151. Estos NEFAs entran en el hepatocito gracias a las proteínas de transporte de ácidos grasos, principalmente a través de CD36/FATP2 (“Fatty Acid Transporter Protein2”), FATP4 (“Fatty Acid Transporter Protein4”) y FATP5(“Fatty Acid Transporter Protein5”). Curiosamente en estudios in vivo se ha comprobado que tanto la deleción del gen Fatp5 como la supresión parcial de Fatp2 producen una disminución de la absorción de NEFAs por los hepatocitos, reduciendo de esta manera, la esteatosis hepática inducida por la dieta alta en grasa152,153. Además, los transportadores FATP2 y FATP4 son capaces de mediar el transporte de ácidos grasos de cadena larga (“Long-Chain Fatty Acids”, LCFAs)153,154. Estos LCFAs por su parte, se unen a las proteínas de unión a ácidos grasos que en el hígado específicamente son las L-FABP (“LiverFatty Acid Binding Protein”) que las transportan al núcleo para activar a una de las moléculas clave en el proceso de la β-oxidación que es PPARα 154,155 (Imagen 9). En los ratones que con el gen L-Fabp delecionado, presentan una disminución de la absorción de estos ácidos grasos suprimiéndose el mecanismo de β-oxidación, con una tendencia al incremento de los niveles de NEFAs y TGs155,156,157. Aunque hay estudios que demuestran que en estos ratones se produce un incremento de la expresión de la proteína transportadora de esteroles, SCP-2 (“Sterol Carrier Protein-2”) que se va a encargar de suplir PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 70 parcialmente la ausencia de L-FABP uniéndose a los LCFAs para incorporarlos al proceso de oxidación155. 3.4.2.3. Síntesis de ácidos grasos: lipogénesis de novo (LDN) Para sintetizar ácidos grasos de novo, el hepatocito emplea la acetil-CoA procedente del catabolismo de la glucosa para convertirse gracias al enzima acetil-CoA carboxilasa (ACC, “Acetyl-CoA Carboxilase”) dando lugar a malonil-CoA150 (Imagen 8). La inhibición transitoria de ACC produce una disminución de los niveles de malonil-CoA y por ende de la lipogénesis158. Conjuntamente el compuesto malonil-CoA junto con el NADPH generado en el catabolismo de la glucosa actúan como precursores para formar el ácido palmítico de dieciséis carbonos, gracias a la actuación de la enzima sintasa de ácidos grasos, FAS (“Fatty Acid Synthase”)150. A partir de este momento, gracias a la presencia de determinadas enzimas se produciría la elongación del ácido palmítico dando lugar a LCFAs de mayor número de carbonos, además de otros enzimas cuya actuación va a permitir generar ácidos grasos mono y poliinsaturados150,159. Otra vía por la que se incorporan LCFAs se produce en presencia de una dieta rica de carbohidratos, en la que un exceso de los mismos activa el mecanismo de lipogénesis generando nuevos ácidos grasos150 (Imagen 8). Introducción 71 Imagen 8. Representación esquemática del metabolismo lipídico. La interacción entre el intestino, el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo blanco en el contexto del metabolismo lipídico. LDN: Lipogénesis De Novo; AG:Ácidos Grasos; Ox.: Oxidación de ácidos grasos; TG: TriGlicéridos; NEFAs: Ácidos grasos no esterificados (“NonEsterified Fatty Acids”) GLUT: Transportador de glucosa (“GLUcose Transporter”); LPL: LipoProteinLipasa. Imagen procedente de la referencia (160). Con permiso de Elsevier, número de licencia 4803300660698. 3.4.2.4. Oxidación de ácidos grasos y cetogénesis El proceso de oxidación de ácidos grasos se lleva a cabo principalmente en la mitocondria, pero también, en los peroxisomas y en los microsomas. Concretamente en la mitocondria, este mecanismo va a proporcionar energía a los hepatocitos además de generar cuerpos cetónicos (β-hidroxibutirato, acetoacetato y acetona) que son exportados a la circulación para proporcionar las fuentes de energía metabólicas a los tejidos extrahepáticos150. Una de las moléculas clave en el mecanismo de oxidación es PPARα (“Peroxisome proliferator-activated receptor alpha”), que es capaz de regular este proceso tanto en la mitocondria como en los tejido adiposo blanco enterocitos quilomicrones glucosa glucosa LDN carbohidratos grasa glucosa LDN tejido adiposo blanco hígado glucosa músculo AG AG AG NEFAs s Esteresde colesterol PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 72 peroxisomas161. La acción de esta molécula en la oxidación de ácidos grasos se va a desarrollar más adelante ya que supone una pieza fundamental en el desarrollo de este trabajo. A continuación, es importante destacar las moléculas que actúan como coactivadores de PPARα, como PGC-1α (“Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha”) que es capaz de promover también la β-oxidación162 (Imagen 9). Por encima de PPARα y PGC-1α situamos a SIRT-1 (Sirtuina-1) que es capaz de activarlos ya sea por interacción física, como ocurre con PPARα, o por deacetilación como ocurre en PGC-1α, promoviendo la activación del proceso de oxidación hepática163,164 (Imagen 9). Estudios demuestran que la deleción específica del gen SIRT1 en los hepatocitos disminuye la expresión de los genes que intervienen en la β-oxidación promoviendo un incremento de la acumulación de lípidos que da a lugar a la generación de una esteatosis hepática164. Otros coactivadores para destacar son PGC-1β (“Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator 1-betha”) y TBL (“Transducina beta tipo 1”). La sobreexpresión específica en los hepatocitos murinos de PGC-1β va a incrementar la expresión de los genes β-oxidativos desarrollándose como factor de protección frente a la esteatosis hepática. Por otro lado, en el modelo de ratones KO para TBL en el hígado, se inhibe la actividad de PPARα, disminuyendo de esta manera el proceso de oxidación y de cetogénesis, desarrollando esteatosis hepática 165,166. También la lipina hepática 1 es capaz de unirse a PPARα y PGC-1α promoviendo la β-oxidación167. Existen muchas moléculas que regulan la β-oxidación activadas por PPARα. Entre ellas se encuentra FGF21 que a su vez es capaz de estimular la expresión de PGC-1α en el hígado incrementando, por tanto, la oxidación de ácidos grasos (Imagen 9) y la cetogénesis168. Esta molécula presenta una expresión muy ligada al hígado ya que también es clave en la oxidación y, por tanto, se desarrollará en más profundidad, ya que resulta de especial interés en el desarrollo de este proyecto de tesis. Introducción 73 Los ácidos grasos presentan diferente longitud en sus cadenas. En general, se clasifican en ácidos grasos de cadena corta, de cadena media y de cadena larga (LCFAs). Todos ellos son metabolizados por β-oxidación hepática para poder eliminar dos carbonos del extremo carboxilo de la molécula por cada ciclo de oxidación. En concreto, cada LCFA va a ser activado uniéndose a la coenzima A formando el LCFA-CoA y de esta manera, va a ser posible que se transloque al interior de la mitocondria gracias al sistema Carnitina PalmitoilTransferasa (CPT) (Imagen 9). Por otro lado, la presencia de malonil-CoA (procedente del mecanismo de lipogénesis) es capaz de inhibir al sistema CPT, interrumpiendo de esta manera el proceso oxidativo169,170 (Imagen 9). Por su parte, los ácidos grasos de cadena corta y media no necesitan ser activados por el sistema CPT para atravesar la doble membrana mitocondrial171. El sistema CPT resulta de bastante interés en el estudio de la β-oxidación ya que supone la entrada de los ácidos grasos para llevar a cabo su oxidación y, por tanto, su estudio se prolonga más adelante al resultar de vital importancia en este proyecto de tesis. Imagen 9. Representación esquemática de las principales funciones llevadas a cabo por marcadores moleculares que intervienen en el proceso de β-oxidación de ácidos grasos hepáticos. PGC1α PPARαRXR PPRE FGF21 CPT1a LCFA-CoA CPT1a CPT1a CPT1a β-Oxidación CPT1a CPT1a Mitocondria SIRT1 FGF21 FGFR LCFA P P P P KLB Hepatocito Núcleo Citoplasma Circulación sanguínea Mecanismo autocrino Mecanismo endocrino PGC1α CPT1a Hígado LCFA-L-FABP PPARα Malonil-CoA Lipólisis FGF21 PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 80 Acciones de los PPARs en el estado de obesidad En los últimos 20 años, los PPARs han pasado de ser receptores desconocidos a poder tomar partido en los principales procesos fisiológicos y en diferentes situaciones, incluyendo las patológicas. En el caso de la obesidad, estos receptores son capaces de interaccionar con las proteínas desacopladoras que van a participar en la regulación del gasto energético. Además, los co-activadores y los co-represores presentan funciones fisiológicas y moleculares relacionadas con el metabolismo energético del adipocito199. De los isotipos conocidos, el que más importancia cobra es PPARα ya que es capaz de regular la dislipidemia reduciendo los niveles de TGs y HDL en plasma. Además, cabe destacar su potencial en la regulación de la oxidación de ácidos grasos ya descrito en lo relativo a la regulación del metabolismo hepático, que va a permitir menores niveles circulantes de TGs evitando de esta manera que se acumulen en el tejido adiposo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos efectos se pueden ver afectados por la presencia de estrógenos lo que genera un dimorfismo sexual que permite una regulación diferencial del metabolismo lipídico en función del sexo. Con relación a la acción de los estrógenos, éstos son capaces de inhibir las acciones de PPARα en la regulación del metabolismo lipídico en presencia de obesidad200. En cuanto al proceso de adipogénesis, los receptores participantes son PPARβ/δ y PPARγ. De tal manera, que el receptor PPARγ es el encargado de activar los genes que se encuentran principalmente involucrados en el proceso de crecimiento celular y la progresión del pre-adipocito hacia la generación de un adipocito maduro y diferenciado. Por su parte, PPARβ/δ promueve una estimulación de la diferenciación de los adipocitos201. Teniendo en cuenta estas acciones realizadas por ambos receptores, se propone la modulación de este mecanismo del tejido adiposo en el estado de obesidad. Introducción 81 Familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) La superfamilia de FGFs (“Fibroblast Growth Factors”) está compuesta por 23 proteínas que a su vez se encuentran divididas en 7 subfamilias según su similitud filogenética. Las funciones que desarrollan son muy diversas entre las que se encuentran: crecimiento celular, organogénesis, diferenciación, supervivencia y metabolismo202. Estructura de los FGFs Esta superfamilia está formada por dos grandes grupos. Por un lado, el grupo de 18 ligandos secretados que se pueden dividir a su vez en dos subfamilias: los FGF tipo hormona (FGF19, FGF21, FGF23) y los FGF canónicos (FGF1-10, FGF16-18, FGF20)203. Por otro lado, se encuentran los receptores de los FGFs (FGFRs) que son receptores transmembrana formados por 3 dominios extracelulares tipo inmunoglobulinas (D1-D3), y un dominio intracelular tipo tirosina quinasa. Estos receptores se encuentran codificados por 7 isoformas: 1b,1c,2b,2c,3b,3c y 4204,205 (Imagen 12). = Regulador negativo Genes diana Núcleo Imagen 12. Estructura y señalización de FGFR. Estrutura básica de FGFR y su señalización molecular(A). FGFRs son receptores transmembrana de tipo tirosina quinasa que se componen de un dominio extracelular compuesto por tres dominios tipo inmunoglobulina (IgI-III) y un dominio tirosina quinasa intracelular. Su activación consiste en formar un complejo entre el ligando FGF, los proteoglicanos heparán sulfato o las proteínas transmembrana βKlotho y FGFR para dar lugar a la dimerización y transfosforilación de varios residuos de tirosina en la porción intracelular de FGFR. Imagen procedente de la referencia (203). Con permiso de la American Association for Cancer Research. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 82 Mecanismo de acción de los FGFs Los FGFs se encuentran secuestrados por proteoglicanos heparán sulfato (HPSGs) en la matriz extracelular. Para activarse, es necesaria la acción de las proteasas o proteínas específicas de unión a FGF que permiten liberarlos para que se puedan unir a la superficie de los receptores FGFRs formando el complejo ternario: FGF-FGFRHPSG y se produzca la propagación de la señal206. Los FGFs tipo hormona presentan mayor afinidad por las proteínas transmembrana β-Klotho que, por los HPSGs, para poder unirse a los receptores FGFRs y formar el complejo207. La señalización se produce cuando se dimeriza el complejo ternario dando lugar a una modificación conformacional resultando en una transfosforilación intermolecular producida en el dominio tirosina quinasa intracelular208. Como consecuencia, se produce la activación de la señalización de numerosas cascadas intracelulares como la de las MAPKs (“MitogenActivated Protein Kinases”), la ruta PI3K/Akt o también la ruta de señalización dependiente de STAT208. Además, existe una regulación muy estricta, lo que supone un sistema de señalización multifactorial y de formación del complejo que involucra a múltiples funciones biológicas203. A partir de este punto, se van a desarrollar más en profundidad los FGFs endocrinos, entre los cuales se encuentra FGF21 que resulta de interés en este trabajo. FGFS endocrinos o tipo hormona Los FGFs endocrinos según se han descrito son FGF19, FGF21 y FGF23 y se encargan de jugar un papel muy importante en la regulación de la homeostasis metabólica. Los dos primeros, FGF19 (FGF15 en roedores) y FGF21 son los responsables del mantenimiento del peso corporal y la homeostasis metabólica gracias a la regulación del metabolismo de la glucosa y de los lípidos. Por su Introducción 83 parte, FGF23 se encarga de la regulación en el equilibrio de los minerales y la homeostasis de la vitamina D3 en la salud ósea209. De estos tres, el que alcanza mayor relevancia en este proyecto es FGF21 por su papel en la regulación de la homeostasis energética. Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) Origen FGF21 fue descubierto por primera vez en el año 2000 por Nishimura y cols. que consiguió aislar el cDNA del gen codificante a partir de embriones murinos y de muestras humanas. En sus estudios pudo definir que la mayor expresión de mRNA de FGF21 se encontraba en el hígado, y también en niveles más bajos, en el timo210. Funciones fisiológicas de FGF21 Existen numerosos estudios que demuestran la faceta multifactorial que presenta FGF21 cuando actúa como regulador metabólico. En experimentos de ratones que son KO para Fgf21, la falta de esta molécula sugiere acciones de regulación del metabolismo glucídico, lipídico y de la homeostasis energética de gran importancia211. Por otra parte, hay que destacar que los niveles circulantes de FGF21 son elevados en pacientes obesos, con diabetes tipo 2212, y también en pacientes que se encuentran afectados a nivel hepático desde etapas tempranas de esteatosis hepática, generando NAFLD por el exceso de acumulación lipídica y llegando a desarrollar cirrosis y cáncer hepático213. Además, en estudios con modelos de ratones DIO, ratones genéticamente obesos conocidos como ob/ob y los genéticamente diabéticos db/db, también presentan niveles elevados de FGF21. Por lo tanto, se trata de una característica fisiológica ligada al estado de obesidad, el hecho de presentar niveles endógenos de FGF21 elevados que no son capaces de activar los mecanismos moleculares que permitan una mejora de la condición fisiológica. Sin embargo, en los estudios con ratones obesos a los que se les administró posteriormente FGF21 a dosis farmacológicas se produjo una PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 84 activación molecular de los mecanismos que permitían una pérdida de peso corporal y una mejora de los parámetros metabólicos214. Por tanto, se puede decir que en un estado de obesidad existe una resistencia a la acción de FGF21 sugiriendo que, su papel principal es llevar a cabo la restauración la homeostasis metabólica214. Tras comprobar todos estos efectos podemos decir que FGF21 se trata de una molécula que se va a producir principalmente en el hígado, pero que también tiene presencia en el músculo esquelético, tejido adiposo blanco y pardo, intestino, corazón, riñones y páncreas215. Concretamente en el WAT, FGF21 es capaz de incrementar la expresión de GLUT1 y por tanto mejorar la absorción de glucosa216. Además, FGF21 se puede considerar como una adipoquina, ya que es sintetizada y liberada por el propio WAT, y también presenta acciones complementarias a la adiponectina217, incrementando la sensibilidad a la insulina, mejorando el perfil lipídico reduciendo de esta forma los niveles de glucosa y asegurando la disponibilidad de la energía en los períodos de ayuno218,219. Otro de los mecanismos de FGF21 que han tomado gran importancia, es la capacidad de inducir el proceso de “browning” en el WAT presentando un gran potencial para el tratamiento de enfermedades como la obesidad y la diabetes tipo 2220. En los estados de resistencia a insulina en humanos, los niveles de FGF21 presentan una correlación positiva con el desarrollo del síndrome metabólico, el estrés oxidativo severo y la presencia de la diabetes tipo 2221,222,223. Otras condiciones fisiológicas capaces de incrementar los niveles circulantes de FGF21 son la lactancia224, el ejercicio225, el tratamiento con la hormona de crecimiento226 y la anorexia nerviosa227. De esta manera, FGF21 es considerado como una buena opción terapéutica en el tratamiento de enfermedades metabólicas. De hecho, existen numerosos análogos de FGF21 que se encuentran en ensayos clínicos en fase 2 y fase 3228,229. Introducción 85 Sistema carnitina palmitoiltransferasa (CPT) Origen En 1977, se llevaron a cabo estudios in vitro en los que se describió la inhibición de la oxidación de ácidos grasos por el sustrato malonil-CoA en mitocondrias aisladas y su correlación con la inhibición de la actividad del sistema CPT, que podía ser medida de forma intacta 230,231. De esta manera, se pudo destacar el importante papel que ejerce el compuesto malonil-CoA que es el primer intermediario de la lipogénesis, para evitar que dos procesos como la síntesis y la oxidación de ácidos grasos se produzcan de forma simultánea232,233. De esta manera, se logró estudiar el mecanismo del sistema CPT que se encuentra formado por dos enzimas (CPT1 en la membrana externa y CPT2 en la membrana interna) que son capaces de catalizar dos reaccciones de transesterificación de tal forma que los LCFAs marcados con la coenzima A se convierten en ácidos grasos de cadena larga portando el grupo carnitina por la acción de CPT1. Gracias a este grupo, los ácidos grasos son capaces de atravesar la doble membrana mitocondrial para llegar a la matriz gracias a la acción de una acilcarnitina translocasa (CACT o CPT2) la cual elimina finalmente el grupo carnitina quedando el ácido graso de cadena larga con el grupo CoA que ya dentro de la mitocondria comenzaría su proceso de oxidación233. Isoformas del sistema CPT-1 Los mamíferos expresan tres isoformas del sistema CPT1: CPT1a, CPT1b y CPT1c codificadas por diferentes genes y que presentan diferentes características bioquímicas y una distribución tejido dependiente. De las tres la más ampliamente distribuida es CPT1a ya que está presente en las mitocondrias de los siguientes tejidos: hígado, pulmones, páncreas, intestino, riñones, ovarios y cerebro233. El gen que codifica para CPT1a se localiza en el PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 86 cromosoma 11 y codifica una proteína con un peso molecular de 88kDa234,235 (Imagen 13). Por su parte, CPT1b se trata de la isoforma que no está presente en el cerebro, pero sí se puede encontrar en el músculo esquelético, el corazón, los testículos, el tejido adiposo blanco y el tejido adiposo pardo236. El gen que codifica a la proteína se encuentra en el cromosoma 22. La última isoforma, CPT1c, se expresa fundamentalmente en el cerebro, pero también está presente en los testículos. El gen que codifica a la proteína se encuentra en el cromosoma 19237,238. A diferencia de las otras dos isoformas, CPT1c se encuentra incrustado en el retículo endoplasmático y presenta una baja actividad catalítica de transesterificación in vitro238. Imagen 13. Mecanismo conformacional de CPT1a. La conformación de CPT1a se va a encontrar modificada en función a su sensibilidad al malonil-CoA, ya que los residuos localizados en el extremo N-terminal actúan como determinantes positivos o negativos en función de su sensibilidad a este metabolito239,240,241. Además, estos cambios de la sensibilidad también se han asociado con la homo-oligomerización o heteroasociación con otras proteínas242. Pero también su conformación va a depender de la composición y la curvatura de la membrana243. Imagen procedente de la referencia (244). Con permiso de Elsevier, número de licencia 4706060928396. Introducción 87 A continuación, de las tres isoformas se va a desarrollar la función que lleva a cabo la isoforma CPT1a en el proceso de oxidación de ácidos grasos hepáticos, ya que su estudio resulta de bastante interés en este proyecto de tesis. Función principal de CPT1A en la β-oxidación de ácidos grasos e impacto en el metabolismo hepático En general, el sistema CPT ocupa una posición importante en la regulación del metabolismo. Centrándonos en la actividad de la isoforma CPT1a, su acción consiste en mantener el equilibrio de los ácidos grasos ya que es capaz de regular la concentración de LCFAs presentes en el citosol, gracias a que les facilita su procesamiento introduciéndolos en la mitocondria232. De hecho, en condiciones en las que existen disfunciones en la mitocondria se produce un escaso o deficiente mecanismo de oxidación, dando lugar, por ejemplo, a una acumulación de esteres de cadena corta y media en el músculo generando una condición de resistencia a la insulina245. La esteatosis hepática consiste en una acumulación de lípidos en el citoplasma de los hepatocitos. En el hígado al menos el 5% de su peso o el 5% de los hepatocitos contienen vacuolas lipídicas en ausencia de factores secundarios como un exceso en la ingesta de alcohol, infección viral o tratamiento de fármacos246. Inicialmente una acumulación de grasa intrahepática suele provocar hepatoprotección, pero el exceso de grasa puede suponer un factor de riesgo247. Para evaluar la gravedad de esta enfermedad existe un sistema de grados: grado 0 (higado con menos del 5% de grasa), grado 1 (entre un 5% y un 33% de grasa), grado 2 (entre un 34% y un 66% de grasa) y grado 3 (más del 66% de grasa)248. Por tanto, se puede evolucionar desde un hígado graso no alcóholico (NAFLD) hasta una esteatohepatitis no alcohólica (NASH), y en casos más severos hasta una fibrosis, cirrosis e incluso llegar a generar hepatocarcinoma (Imagen 14)246. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 88 Imagen 14. La progresión y las etapas del NAFLD. A partir del estado de esteatosis se puede evolucionar hacia un estado de NASH que finalmente desemboca en cirrosis y hepatocarcinoma celular (HCC) o directamente HCC. Imagen procedente de la referencia (254). Con permiso de Frontiers in Physiology. El NAFLD se suele desarrollar en presencia de obesidad lo que conlleva una resistencia a insulina, diabetes tipo 2, hiperlipidemia, hiperglicemia y una hipertensión arterial. Algunos estudios demuestran una asociación entre el hígado graso no alcohólico y la resistencia a insulina no necesariamente en presencia de obesidad, al igual que también se asocia a un incremento de la gluconeogénesis246,249. Actualmente no existe ningún fármaco aprobado para el tratamiento de NAFLD. En la actualidad, se están estudiando nuevas terapias que se encuentran en el estado de ensayo clínico en humanos. Entre ellas, el agente GS-9450 (Inhibidor de la caspasa: permite inhibir la apoptosis que se produce en los hepatocitos mejorando las condiciones fisiológicas), el agente GFT-505 (Agonistas de PPARα y PPAR β/δ que en modelos animales han mostrado una reducción en la esteatosis y en la expresión de los genes proinflamatorios)250. Por último, en los casos en los que los tratamientos farmacológicos no permitan una mejora en los pacientes con una condición avanzada de la enfermedad, se puede llevar a cabo la cirugía bariátrica. Muchos estudios mostraron que una cirugía bariátrica provoca una pérdida de peso que permitió resolver hasta un 75% los casos que presentaban esteatosis, hasta un 90% los casos con esteatohepatitis y un rango de 3050% en los casos en los que existía fibrosis, dependiendo del grado en el que se situaba la patología 251,252,253. NAFLD Cirrosis Acumulación de grasa Hígado sano Inflamación Esteatosis+ Inflamación Cicatrices fibróticas Presencia del tumor OBJETIVOS PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 96 Las células se crecieron en condiciones de 37ºC con un 5% de CO2. Cuando alcanzaban una confluencia del 70-80% se llevaba a cabo un pase 1:2 o 1:4 usando tripsina/EDTA 0.05% en rojo fenol (101525300054, Gibco Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Para la congelación de estas células en Nitrógeno líquido se utilizó DMSO (D8418, DiMetilSulfóxidO, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) preparado al 10% en medio de cultivo. 1.2. TRATAMIENTOS CELULARES 1.2.1. Tratamiento con ácido oleico Para llevar a cabo un tratamiento que induzca la acumulación de ácidos grasos citoplasmáticos en las células hepáticas se utilizó el ácido oleico (O1383, OA, Oleic Acid, Sigma-Aldrich, Misuri, USA). En todos los experimentos en los que se llevó a cabo este tipo de tratamiento se utilizó a una concentración de 1mM unido a BSA (A7906, Bovine Serum Albumine, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) siguiendo una proporción 2:1. En el grupo control las células únicamente se trataron con BSA. El tratamiento de ácido oleico se llevaba a cabo durante 24 horas en un incubador a 37ºC y un 5% de CO2. La tinción que se realizó para poder observar la acumulación de grasa citoplasmática es la tinción Oil Red O de tipo diazol con solubilidad lipídica y es capaz de teñir lípidos neutros y ésteres de colesterol. Esta técnica se explicará con más detalle en el punto 3.4 de Material y métodos. 1.2.2. Tratamiento con el antagonista de PPARα (GW6471) Para llevar a cabo el tratamiento con el antagonista de PPARα, GW6471 (4618, CAS Number: 880635-03-0, ToCris Bioscience, Bristol, UK) en los cultivos celulares HepG2, este compuesto fue disuelto en DMSO para ser preparado a una concentración de 2 µM. Materiales y métodos 97 Este tratamiento se realizó en aquellos grupos de células en los que se quería antagonizar la expresión de esta proteína ya que se considera principal en el metabolismo concretamente, en el proceso de βoxidación de ácidos grasos. El tratamiento se realizó durante 24 horas en un incubador a 37ºC y un 5% de CO2 y normalmente al mismo tiempo que el tratamiento con ácido oleico. Posteriormente para comprobar el efecto del tratamiento, se realizaron experimentos de análisis proteico por Western Blot y de tinción de ácidos grasos utilizando la tinción de Oil Red O. 1.2.3. Tratamiento con la hormona uroguanilina (UGN) El tratamiento con la hormona gastrointestinal uroguanilina (421661000, UGN, Bachem Holding, Bubendorf, Suiza) se llevó a cabo sobre los grupos de células HepG2, en los que se quería estudiar la acción de esta hormona en el metabolismo lipídico. Los grupos de células tratados con UGN presentaban el medio DMEN libre de FBS con una concentración de la hormona de 100nM. Tras el tiempo de tratamiento, se realizaba un doble lavado con PBS y posteriormente, se llevaba a cabo la experimentación correspondiente para estudiar el efecto que producía esta hormona en las células, ya sea con estudios de análisis proteico por Western-Blot o de tinción de ácidos grasos con Oil Red O para determinar su efecto sobre la acumulación lipídica. 1.3. DISEÑOS EXPERIMENTALES IN VITRO Los tratamientos descritos en el punto 1.2 fueron desarrollados en diversos experimentos en los que se combinaron varios tratamientos dentro de un mismo diseño experimental. Por tanto, los diseños experimentales que se desarrollaron fueron los siguientes: PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 98 1.3.1. Efecto del tratamiento con la uroguanilina en un modelo de esteatosis hepática y mecanismos moleculares implicados 1.3.1.1. Establecimiento de un modelo de esteatosis hepatica en la línea celular humana, HepG2 En primer lugar, quisimos reproducir el exceso de acumulación lipídica en los hepatocitos empleando el ácido oleico. Por ello el primer experimento se llevó a cabo en los siguientes grupos experimentales: grupo vehículo (V) y grupo ácido oleico (OA). Se empleó la técnica de tinción Oil Red O para poder analizar la acumulación lipídica citoplásmica. DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 1 Tinción Oil Red O DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 V Siembra de células Tratamiento Vehículo OA Lavado y fijación Tinción ORO OA Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Lavado y fijación Tinción ORO Tabla 1: Diseño experimental modelo esteatosis hepática in vitro. 1.3.1.2. Efecto del tratamiento de la hormona gastrointestinal uroguanilina sobre el modelo de esteatosis hepática in vitro Tras haber establecido el modelo de esteatosis hepática in vitro en la línea celular hepática HepG2, se llevó a cabo un experimento con varios grupos experimentales para poder estudiar el efecto de la hormona gastrointestinal uroguanilina sobre la esteatosis hepática. Por ello se aplicaron tratamientos de uroguanilina (100nM) durante tres tiempos diferentes: treinta minutos, noventa minutos y ciento ochenta minutos. Posteriormente se realizó la tinción Oil Red O para teñir los lípidos citoplásmicos. Materiales y métodos 99 DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 2 Tinción Oil Red O DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 OA (30 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 30 mins Lavado y fijación Tinción ORO OA+UGN (30 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 30 mins Lavado y fijación Tinción ORO OA (90 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO OA+UGN (90 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO OA (180 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 180 mins Lavado y fijación Tinción ORO OA+UGN (180 mins) Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 180 mins Lavado y fijación Tinción ORO Tabla 2: Diseño experimental del tratamiento de la uroguanilina [100nM] a distintos tiempos. 1.3.1.3. Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la acción de la uroguanilina sobre el metabolismo lipídico hepático Una vez se ha comprobado que el efecto lipolítico de la hormona gastrointestinal uroguanilina (100nM) se produce a los 90 minutos sobre las gotas lipídicas acumuladas en el citoplasma de las células, realizamos un estudio de las dianas moleculares que participan en el metabolismo lipídico hepático, para comprobar cuáles de ellas presentaban cambios en la expresión proteica en presencia del tratamiento con uroguanilina. Para poder estudiar la expresión proteica se utiliza la técnica de Western-Blot que se describe con más detalle en el punto 3.1 de este apartado de Material y métodos. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 100 DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 3 Expto Western-Blot DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 V Siembra de células Tratamiento Vehículo OA Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lisis celular y Western-Blot OA Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lisis celular y Western-Blot OA+UGN Siembra de células Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lisis celular y Western-Blot Tabla 3: Diseño experimental para evaluar el efecto del tratamiento de la uroguanilina sobre los marcadores moleculares del metabolismo lipídico hepático. 1.3.2. Papel del receptor GUCY2C hepático en el efecto de la UGN sobre la esteatosis hepática. 1.3.2.1. Tratamiento del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C con un siRNA específico Para estudiar el efecto que producía la uroguanilina a través de su unión con el receptor GUCY2C, se decidió bloquear parcialmente la expresión del receptor y estudiar el efecto que producía en la ruta molecular que era capaz de activar. Para poder interferir en la expresión del gen que codifica para el receptor utilizamos un siRNA (“small interference RNA”, Ácido RiboNucleico de interferencia). En la Tabla 4 se detallan las características de los siRNAs empleados. siRNA Concentración Composición Referencia y casa comercial siControl negativo 5 nM Pool de cuatro siRNAs que no se dirigen a una secuencia específica D-001810-1005, GE Healthcare Dharmacon Inc., Colorado, USA siGUCY2C ON-TARGET plus 5 nM siRNA que interfiere en la secuencia GUCY2C L-0053 28000005, GE Healthcare Dharmacon Inc., Colorado, USA Tabla 4: RNAs de interferencia empleados en los experimentos in vitro Los siRNA fueron transfectados en las células HepG2 con Lipofectamina 2000(10151166830, InvitrogenTM,California, USA). A partir de este punto de transfección, se realizaron diversos tratamientos en función de los objetivos de los experimentos, pero en todos garantizando una actuación de los siRNA de 48 horas. Tras ese Materiales y métodos 101 tiempo, las células fueron procesadas de diversas maneras según la finalidad de los experimentos: ya sea para experimentos de tinción de lípidos con Oil Red O, análisis génico por Q-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa) o proteico por Western Blot. En primer lugar, para comprobar el silenciamiento génico de la expresión del receptor GUCY2C se llevó a cabo un estudio mediante PCR Cuantitativa (Q-PCR) por SYBR Green cuyo método completo se describe más adelante en el punto 3.2. DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 5 Expto Q-PCR DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 V Siembra de células Transfección siRNA (Control negativo) [100nM] Lavado y cambio de medio Extracción RNAm y Q-PCR siGUCY2C Siembra de células Transfección siGUCY2C [100nM] Lavado y cambio de medio Extracción RNAm y Q-PCR Tabla 5: Diseño experimental de la comprobación del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C por la acción del siRNA. 1.3.2.2. Efecto del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C en el mecanismo molecular activado por la UGN en la línea celular hepática HepG2 Una vez comprobado el silenciamiento producido por el siRNA del receptor GUCY2C, se realizó una tinción de ácidos grasos Oil Red O para estudiar este efecto sobre la acumulación de gotas lipídicas. DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 6 TINCIÓN OIL RED O DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 V Siembra de células Transfección Vehículo siRNA Lavado y cambio de medio Lavado y fijación Tinción ORO si (-) Siembra de células Transfección si (-) [100nM] Lavado y cambio de medio Lavado y fijación Tinción ORO siGUCY2C Siembra de células Transfección siGUCY2C [100nM] Lavado y cambio de medio Lavado y fijación Tinción ORO Tabla 6: Diseño experimental del efecto del silenciamiento parcial del receptor GUCY2C sobre la acumulación lipídica citoplasmática. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 102 A continuación, teniendo en cuenta el efecto del silenciamiento del receptor GUCY2C sobre las gotas lipídicas que se acumulaban en el citoplasma de las células tras el tratamiento con ácido oleico, se quería determinar si el efecto observado para la UGN sobre la acumulación de lípidos estaba mediado por el receptor GUCY2C. Para ello, se realizó una tinción Oil Red O. Paralelamente se llevó a cabo un experimento para estudiar el efecto de estos tratamientos sobre la expresión proteica de los marcadores activados por la UGN que intervienen en el proceso de oxidación de ácidos grasos. Por ello, empleamos la técnica de Western-Blot (descrito en el punto 3.1.) para estudiar la expresión proteica de las dianas moleculares. DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 7 Tinción Oil Red O Expto Western-Blot DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 V Siembra de células Transfección Vehículo siRNA Tratamiento Vehículo OA Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot OA Siembra de células Transfección Vehículo siRNA Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot si(-)+OA Siembra de células Transfección si(-) [100nM] Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot siGUCY2C+OA Siembra de células Transfección siGUCY2C [100nM] Tratamiento OA [1mM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot OA+UGN Siembra de células Transfección Vehículo siRNA Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot siGUCY2C+OA+UGN Siembra de células Transfección siGUCY2C [100nM] Tratamiento OA [1mM] Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y Western Blot Tabla 7: Diseño experimental del efecto del tratamiento del siGUCY2C y también del tratamiento con uroguanilina sobre la acumulación lipídica citoplasmática y la activación de los mecanismos moleculares implicados en presencia de ácido oleico. Materiales y métodos 103 1.3.3. Papel de PPARα sobre la oxidación de ácidos grasos activada por la hormona uroguanilina Dentro de las vías moleculares analizadas en los experimentos anteriores, una de las dianas moleculares que interviene en la cascada de oxidación de ácidos grasos es PPARα. Por tanto, se planteó antagonizar farmacológicamente esta molécula para poder estudiar su implicación cuando queda bloqueada en presencia del tratamiento con UGN en el contexto del metabolismo lipídico hepático. Para ello, se realizaron estudios basados en el efecto de la UGN cuando la vía PPARα se encuentra bloqueada tanto sobre la acumulación de lípidos citoplasmáticos (tinción Oil Red O) como sobre la expresión proteica de las dianas moleculares que participan en la β-oxidación de ácidos grasos hepáticos (Western-Blot). DISEÑO EXPERIMENTAL descrito en la Tabla 8 Tinción Oil Red O Expto Western-Blot DÍA 0 DÍA 1 DÍA 2 V Siembra de células Tratamiento Vehículos (OA y GW6471) Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y WesternBlot OA Siembra de células Tratamiento OA [1mM] +Vehículo (GW6471) Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y WesternBlot OA+UGN Siembra de células Tratamiento OA [1mM] +Vehículo (GW6471) Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y WesternBlot OA+GW6471 Siembra de células Tratamiento OA [1mM]+ Antagonista PPARα(GW6471) [2 μM] Tratamiento Vehículo UGN durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y WesternBlot OA+GW6471+UGN Siembra de células Tratamiento OA [1mM]+ Antagonista PPARα(GW6471) [2 μM] Tratamiento UGN [100nM] durante 90 mins Lavado y fijación Tinción ORO Lisis celular y WesternBlot Tabla 8: Diseño experimental del efecto del tratamiento con el antagonista de PPARα(GW6471) y también del tratamiento con uroguanilina sobre la acumulación lipídica citoplasmática y la activación de los mecanismos moleculares implicados en presencia de ácido oleico. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 104 2. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTACIÓN IN VIVO 2.1. LEGISLACIÓN Y ÉTICA EN LOS PROCEDIMIENTOS CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Todos los procedimientos experimentales y protocolos de manipulación de animales que se realizaron en este proyecto de tesis han sido aprobados por el jefe de servicio provincial de ganadería del departamento territorial de la Consellería do Medio Rural e do Mar de la provincia de A Coruña, siendo responsable la Dra. Luisa María Seoane Camino y el Prof. Rubén Nogueiras Pozo. Los experimentos se realizaron bajo el número de procedimiento 15010/17/007 (Prof. Rubén Nogueiras Pozo), según la legislación vigente, el Real Decreto 53/2013 por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia255; la Directiva Europea 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2010 relativa a la protección de animales utilizados para fines científicos256. Dentro de la Comunidad Autónoma de Galicia, la Consellería do Medio Rural ha establecido las condiciones de manipulación animal en el Decreto 296/2008, de 30 de diciembre, de protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia257, y por el que se crea el Registro de los centros de cría, de suministradores y usuarios y la Comisión Gallega de Bienestar de los Animales de Experimentación. Además, hay que destacar la ejecución del concepto de las tres erres258 que establecieron William Russel y Rex Burch en 1959, y en el que se establecen tres normas básicas: Materiales y métodos 105 - Reemplazamiento: aplicar siempre que sea posible un método alternativo para evitar el uso de animales. - Reducción: en el caso de que se lleve a cabo experimentación con animales, evitar utilizar un número excesivo sin que ello comprometa a la investigación científica. - Refinamiento: evitar el sufrimiento producido en los animales para mejorar su bienestar y la calidad de los resultados. Todos los procedimientos experimentales y protocolos de manipulación de animales llevados a cabo durante la realización de esta tesis han sido revisados y aprobados previamente por el comité ético de la Universidad de Santiago de Compostela. Con todo ello, podemos garantizar que los procedimientos experimentales desarrollados en este proyecto de tesis son los adecuados y los procedentes y nos han permitido desarrollar un trabajo de investigación óptimo y de calidad. 2.2. MODELO DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL UTILIZADO EN LOS PROCEDIMIENTOS. CONDICIONES DE MANTENIMIENTO Y CUIDADO En este proyecto de tesis se utilizó como modelo de experimentación animal, el ratón (Mus musculus) de la cepa C57BL/6 procedente del Animalario General de la Universidad de Santiago de Compostela. Todos los ratones eran del género macho con un peso aproximado de 20-25 gramos, con 3-4 semanas de edad y fueron estabulados a su llegada en jaulas acondicionadas en la sala de SPF (Specific Pathogen Free) de las instalaciones del Animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela con número de registro REGA: ES150780263401. Los animales se repartieron en grupos de cinco por jaula teniendo en cuenta el comportamiento social de la especie y tuvieron un período de aclimatación de siete días tras su llegada, con acceso libre a agua y PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 112 COMPOSICIÓN TAMPÓN KREBS-RINGER-HEPES (KRH) pH 7.4 Reactivo Concentración NaCl 125 mM KCl 5 mM MgSO4 1.2 mM KH2PO4 1.3 mM CaCl2 2 mM Glucosa 6 mM HEPES 25 mM Penicilina 100 U/mL Estreptomicina 100 U/mL Tabla 9: Composición tampón de lavado KRH 2.4. DISEÑOS EXPERIMENTALES 2.4.1. Modelo in vivo de obesidad inducida por dieta (DIO) El modelo de obesidad inducida por dieta (DIO) permite reflejar la condición fisiológica de carácter patológico, que es la obesidad. Este proyecto de tesis implica el estudio de las causas fisiológicas que provocan la esteatosis hepática asociada a la obesidad y una vez generada, comprobar el efecto de aquellos tratamientos que permiten activar los mecanismos fisiológicos necesarios para combatirla. Tras el proceso de aclimatación de los animales en las instalaciones del animalario, se sometieron a la alimentación de una dieta rica en grasa al 60% (HFD, High Fat Diet, Rodent Diet With 60 kcal% Fat, D12492, Research Diets Inc., New Jersey, USA) cuya composición se describe en la Tabla 10. De esta manera, los animales desarrollaron obesidad debido al consumo de la dieta hipercalórica. Los animales se mantuvieron con esta alimentación durante todo el período de experimentación hasta su sacrificio y a la vez, se llevó a cabo un seguimiento del peso corporal e ingesta. Materiales y métodos 113 En la tabla 10 se describe tanto la composición de la dieta estándar (SD)de Animalario como la alta en grasa (HFD) al 60%. COMPOSICIÓN DIETAS RATONES Tipo de dieta Componentes Información Calórica (%kcal) Densidad Energética (kcal/g) Dieta Estándar (SD) Proteína 23 3.3 Carbohidrato 55 Grasa 22 Dieta alta en grasa (HFD) al 60 % Proteína 20 5.21 Carbohidrato 20 Grasa 60 Tabla 10: Composición de las dietas de los ratones 2.4.2. Efecto de la administración del fármaco linaclotide (oral) y del antagonista del receptor β3-adrenérgico (SC) en modelos murinos Hemos demostrado previamente que el efecto del tratamiento de la hormona gastrointestinal uroguanilina en un modelo celular de esteatosis hepática activa el mecanismo de β-oxidación de ácidos grasos cuando es capaz de unirse a su receptor GUCY2C. Esto supone un avance importante en el tratamiento de esta patología y por tanto resulta de interés llevar a cabo un experimento en modelos murinos con un fenotipo obeso inducido por dieta (ratones DIO) en los que se pueda estudiar el efecto que tiene el tratamiento farmacológico linaclotide (agonista del receptor GUCY2C). Por tanto, se emplearon ratones C57BL/6 macho adultos que fueron alimentados con dieta alta en grasa (composición descrita en la tabla 10) y durante todo este tiempo de alimentación se realizó una toma de datos del peso corporal de todos los individuos y de la ingesta hasta que desarrollaron el fenotipo obeso. En este momento, los ratones se individualizaron y se dividieron en dos grupos, a los que se PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 114 les administró oralmente el linaclotide o el vehículo del linaclotide durante 11 días seguidos en los que se hizo un seguimiento del peso corporal y la ingesta. El primer día antes de comenzar el tratamiento y el último día tras el tratamiento se midió la composición corporal de los animales por EchoMRI. En este caso, se generaron directamente 2 grupos experimentales que fueron los siguientes: o Vehículo (Oral) o Linaclotide (Oral) DISEÑO EXPERIMENTAL En el caso del experimento realizado en ratones C57BL/6 macho adultos alimentados con dieta SD (composición de la dieta en la tabla 10), se realizó primeramente un seguimiento durante todo el tiempo de alimentación, tomando datos del peso corporal de todos los individuos y de la ingesta. Concretamente en estos ratones, se quería estudiar si el efecto del linaclotide en el peso corporal estaba mediado por el SNS, de forma independiente a la dieta. Para ello, se llevó a cabo un tratamiento empleando el antagonista del receptor β3-AR para poder VHFD(60%) 11 días Vehículo ó Linaclotide oral (5mg/kg/día) VHFD(60%) Administración oral Vehículo ó Linaclotide Aclimatación 1 semana C57BL/6 Llegada Animalario Sacrificio y recogida de tejidos Seguimiento peso e ingesta RMN RMN Seguimiento peso e ingesta Materiales y métodos 115 bloquear la acción del linaclotide mediada por el SNS. En este caso, se hizo un seguimiento de peso corporal e ingesta durante el periodo completo de tratamiento y además el primer día antes de comenzar el tratamiento y el último día tras el tratamiento se midió la composición corporal de los animales por EchoMRI. Por lo tanto, se generaron tres grupos experimentales: o Vehículo (Oral y SC) o Linaclotide (Oral)+ Vehículo (SC) o Linaclotide (Oral)+antagonista del β3-AR(SC) DISEÑO EXPERIMENTAL Al final de los períodos de tratamiento en ambos experimentos, se llevó a cabo el sacrificio de los animales recolectando todos los tejidos de interés para realizar posteriormente en ellos estudios bioquímicos, moleculares (Western Blot, Q-PCR) e histológicos junto con el análisis del efecto sobre el peso corporal y la ingesta. Durante este último período de tratamiento, se comprobó el estado de salud en el que se encontraban los ratones para asegurar que los efectos observados se debían a la administración de los tratamientos y no Vehículo ó Linaclotide oral(5mg/kg/día)/ Vehículo ó SR59230A SC (3mg/kg/día) SD Aclimatación 1 semana C57BL/6 Llegada Animalario Sacrificio y recogida de tejidos SD 8 días Seguimiento peso e ingesta Seguimiento peso e ingesta Administración oral Vehículo ó Linaclotide Administración SC Vehículo ó SR59230A RMN RMN PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 116 existían otros efectos que pudieran influir de forma negativa sobre el bienestar de los animales o sobre los resultados. 2.4.3. Efecto del silenciamiento del receptor GUCY2C (IV) y del tratamiento oral con linaclotide sobre el modelo de experimetación in vivo, DIO Con el fin de reconfirmar in vivo los resultados obtenidos en los estudios in vitro, los cuales se determinaba que el receptor GUCY2C hepático está mediando el efecto de la UGN sobre la esteatosis hepática, se diseñó un experimento donde se silenciaba la expresión génica del receptor GUCY2C en el hígado murino DIO y se sometía a los animales al tratamiento con linaclotide para determinar su efecto sobre la acumulación de lípidos en el hígado. Se emplearon ratones C57BL/6 macho adultos que generaron obesidad tras ser alimentados con dieta alta en grasa (composición descrita en la tabla 10) junto con un seguimiento durante todo el tiempo de alimentación en el que se tomaron datos del peso corporal y de la ingesta de todos los individuos. Posteriormente, se individualizaron y se les administró a través de la vena de la cola los vectores lentivirales. Por ello se dividieron inicialmente, en 2 grupos experimentales: o shLuciferasa(IV)(grupo control) o shGucy2c(IV) (grupo “GUCY2C knockdown”) Al ser vectores lentivirales presentaban un período de infección largo y por tanto para procurar su efecto esperamos 5 semanas hasta el comienzo del posterior tratamiento. Durante este período se prosiguió con la obtención de datos de peso corporal e ingesta de los individuos. Tras ese tiempo, se comenzó con la administración oral del linaclotide, o del vehículo del linaclotide durante 8 días junto con el seguimiento del peso corporal y de la ingesta. Por ello, los ratones de cada grupo a la vez se dividieron en 2 subgrupos experimentales, dando lugar en total a 4 grupos experimentales: Materiales y métodos 117 o shLuciferasa(IV)+ Vehículo (Oral) o shLuciferasa(IV)+ Linaclotide(Oral) o shGucy2c(IV)+ Vehículo (Oral) o shGucy2c(IV)+ Linaclotide (Oral) DISEÑO EXPERIMENTAL Al final del periodo de tratamiento con linaclotide se llevó a cabo el sacrificio de los animales recolectando todos los tejidos de interés para realizar posteriormente en ellos estudios bioquímicos, moleculares (Western Blot, Q-PCR) e histológicos junto con el análisis del efecto sobre el peso corporal y la ingesta. Durante este último período de tratamiento, se comprobó el estado de salud en el que se encontraban los ratones para asegurar que los efectos observados se debían a la administración de los tratamientos y no existían otros efectos que pudieran influir de forma negativa sobre el bienestar de los animales o sobre los resultados. shLuciferasa óshGucy2c IV (1x109UV/mL) /Vehículo ó Linaclotide oral(5mg/kg/día) VHFD(60%) shLuciferasa ó shGucy2c(IV) Administración oral Vehículo ó Linaclotide Aclimatación 1 semana C57BL/6 Llegada Animalario Sacrificio y recogida de tejidos VHFD(60%) 5 semanas Seguimiento peso e ingesta VHFD(60%) 8 días Seguimiento peso e ingesta shLuciferasa óshGucy2c IV (1x109UV/mL) /Vehículo ó Linaclotide oral(5mg/kg/día) VHFD(60%) shLuciferasa ó shGucy2c(IV) Administración oral Vehículo ó Linaclotide Aclimatación 1 semana C57BL/6 Llegada Animalario Sacrificio y recogida de tejidos VHFD(60%) 5 semanas Seguimiento peso e ingesta VHFD(60%) 8 días Seguimiento peso e ingesta PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 118 2.4.4. Efecto del tratamiento con el antagonista (GW6471) de PPARα (IP)y del tratamiento oral con linaclotide sobre el modelo de experimentación in vivo DIO Este experimento trata de mimetizar en un modelo de experimentación in vivo los experimentos realizados in vitro relacionados con el papel del factor PPARα en el efecto del tratamiento con uroguanilina sobre la acumulación lipídica citoplasmática y sobre el metabolismo lipídico de los hepatocitos. De la misma manera que el experimento descrito anteriormente, se emplearon ratones C57BL/6 macho adultos que fueron alimentados con dieta alta en grasa (composición descrita en la tabla 10) y se tomaron datos del peso corporal de todos los individuos y de la ingesta durante todo el período de alimentación hasta que generaron un fenotipo obeso. Luego, se individualizaron y se llevó a cabo una doble administración de sustancias. Por un lado, se administró por vía intraperitoneal (IP) el antagonista de PPARα (GW6471) o el vehículo del antagonista, y por otro lado se administró oralmente el linaclotide como agonista del receptor GUCY2C, o el vehículo del linaclotide. Este doble tratamiento se llevó a cabo durante 8 días seguidos junto con la toma de datos del peso corporal y la ingesta de todos los individuos. Por tanto, en este caso, se generaron directamente 4 grupos experimentales que fueron los siguientes que se describen a continuación: o Vehículo (IP) + Vehículo (oral) o Vehículo (IP) + Linaclotide (oral) o GW6471(IP) + Vehículo (oral) o GW6471(IP) + Linaclotide (oral) Materiales y métodos 119 DISEÑO EXPERIMENTAL Al final del periodo del doble tratamiento, se llevó a cabo el sacrificio de los animales recolectando todos los tejidos de interés para analizar posteriormente en ellos estudios bioquímicos, moleculares (Western Blot, Q-PCR) e histológicos junto con el análisis del efecto sobre el peso corporal y la ingesta. Durante este último período de tratamiento, se comprobó el estado de salud en el que se encontraban los ratones para asegurar que los efectos observados se debían a la administración de los tratamientos y no existían otros efectos que pudieran influir de forma negativa sobre el bienestar de los animales o sobre los resultados. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 120 3. TÉCNICAS ANALÍTICAS 3.1. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN PROTEICA: WESTERN BLOT Para estudiar la expresión proteica de los marcadores moleculares de interés se utilizó la técnica de Western Blot que requiere de varias fases: 3.1.1.- Extracción de proteína. 3.1.2.- Cuantificación de proteínas. 3.1.3.- Preparación de las muestras. 3.1.4.- Electroforesis SDS-PAGE. 3.1.5.- Transferencia húmeda. 3.1.6.- Tinción Rojo Pounceau. 3.1.7.- Inmunodetección. 3.1.1. Extracción de proteína Para llevar a cabo la extracción de proteína total se emplearon distintos métodos en función del tipo de muestras, ya sean cultivos celulares o tejidos. En el caso de los cultivos celulares, la extracción de la proteína citoplásmica se producía al final del experimento cuando culminaba el período de tratamiento correspondiente. Por tanto, se llevaba a cabo el siguiente protocolo: 1.- Se retiraba por aspiración el medio de cultivo en el que se habían tratado las células. 2.- Se realizaron dos lavados con tampón de lavado (PBS) a 4ºC en todos los pocillos de las placas. Materiales y métodos 121 3.- Se situaron las placas sobre hielo y se añadió el tampón de lisis cuya composición se encuentra descrita en la Tabla 11. 4.- Se incubaron las placas con el tampón durante 10 minutos en hielo y se agitaron para extender el tampón por toda la base de la placa. 5.- Posteriormente con una rascador o scrapper (353089, CorningTM BD Falcon, Massachusetts, USA) se despegaron las células y se recogió el lisado en tubos de polipropileno 1,5 mL (11326144, AxygenTMMCT-150-C-S, Corning Inc., New York, USA) 6.- Se centrifugaron los lisados a máxima velocidad (18000 RCF) a 4ºC durante 30 minutos. 7.- Se recogió el sobrenadante cuidadosamente y sin tocar el pellet precipitado, en una nueva tanda de tubos y se almacenó a -80ºC o en el caso de que se vaya a seguir el protocolo del Western-Blot mantenerlos a 4ºC en hielo. Para los tejidos animales el protocolo a llevar a cabo es el siguiente: 1.- A partir de los tejidos almacenados a -80ºC, se cortó un trozo del tejido en frío para que no se degrade y se introdujo en un tubo de polipropileno de 2 mL con cierre de seguridad (T2795, Safe Lock tubes 2.0 mL, Eppendorf, Hamburg, Germany) dejándolo en frío. Sobre esos tubos se agregó posteriormente una bolita de acero y tampón de lisis (composición Tabla 11) que se encontraba a 4ºC. A partir de este momento todo el protocolo se ejecutó con los tubos a 4ºC. 2.- Una vez añadido el tampón de lisis, se comienza la extracción de proteína mediante el proceso químico de lisis celular realizado por los detergentes presentes en el tampón de lisis. Pero este proceso resulta insuficiente y el tejido necesita de un proceso mecánico para la disrupción de toda la matriz celular. Por ello se emplea un aparato PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 128 COMPOSICIÓN TAMPÓN ELECTROFORESIS Reactivo Concentración Propósito Casa Comercial Tampón Tris 25 mM Solución tamponante que permite mantener el pH adecuado Tris: Trizma base (T1503, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) Glicina 192 mM Aminoácido esencial que permite movilidad de proteínas por el gel Glicina: Glicina para electroforesis ≥99% (G8898, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) SDS 0,1% (P/V) Detergente desnaturalizante: Es capaz de mantener la carga negativa y la linearidad de las proteinas en la electroforesis SDS: Sodium-Dodecyl Sulfato (L3771, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) Tabla 16: Composición del tampón de electroforesis En el primer pocillo se situó un marcador de peso molecular (mezcla de proteínas purificadas y teñidas de peso molecular conocido; 1610374 Precision Plus ProteinTM -Dual Color Standards, Bio-Rad, California, USA). En el resto de los pocillos, se cargaron 25 µL de cada muestra. Todas las muestras cargadas por gel representan a todos los grupos experimentales para poder obtener resultados comparables entre los distintos grupos de estudio. A continuación, se iniciaba la electroforesis y las muestras comenzaban a migrar por ambas fases de los geles hasta que el frente de migración se situaba a los últimos centímetros del final del gel, momento en el cual finalizaba el proceso. 3.1.5. Transferencia húmeda Una vez terminada la electroforesis, el siguiente paso consiste en transferir las proteínas presentes en la fase separadora del gel a una membrana de PVDF (IPVH00010, PVDF Immobilon-P membrane, Millipore, Massachusetts, USA). De esta manera, podemos tener un soporte sólido en el que se encuentran las proteínas inmovilizadas para que el anticuerpo pueda detectarlas. En primer lugar, es necesario activar la membrana de PVDF siguiendo el siguiente procedimiento: se embebe la membrana en metanol durante 5 minutos, posteriormente se lava en agua destilada Materiales y métodos 129 otros 5 minutos y finalmente 5 minutos en tampón de transferencia húmeda pre-enfriado (composición del tampón en la Tabla 17). COMPOSICIÓN TAMPÓN TRANSFERENCIA HÚMEDA Reactivo Concentración Propósito Casa Comercial Tampón Tris 25 mM Solución tamponante que permite mantener el pH adecuado Tris: Trizma base (T1503, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) Glicina 192 mM Aminoácido esencial que permite movilidad de proteínas por el gel Glicina: Glicina para electroforesis ≥99% (G8898, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) Metanol 20% (V/V) Alcohol que actúa eliminando todas las moléculas de SDS que se han unido a las proteínas en la electroforesis e incrementa su hidrofobicidad permitiendo una mejor fijación de las proteínas en la membrana, evitando que se difundan. Metanol: Metanol para análisis (1060091000, Merck Millipore, Massachusetts, USA) Tabla 17: Composición del tampón de transferencia Una vez activada la membrana, ésta se mantiene en el tampón de transferencia mientras se empieza a preparar la estructura a la que llamamos “sándwich de transferencia”. Por otro lado, se abren los cristales del gel y éste se mantiene también húmedo en la solución tampón de transferencia pre-enfriada. Para preparar el sándwich de transferencia, necesitamos mantener en tampón de transferencia frío todo el material que se va a emplear, por tanto, las bases, las esponjas y los papeles de filtro Whatman se encuentran sumergidos en este tampón. Para comenzar a construir el “sándwich” de transferencia, abrimos una base que presenta una cara de color negro y otra cara transparente. Sobre la cara negra se colocará una esponja, seguido de dos papeles de filtro Whatman, el gel de electroforesis, la membrana de PVDF activada, otros dos papeles de filtro Whatman y finalmente una esponja, cerrando la base. Se sitúa la cubeta sobre un agitador magnético, ya que se añade un imán en el fondo. A continuación, se coloca el soporte de transferencia y se rellena con tampón de transferencia húmeda la cubeta. Posteriormente se encaja el sándwich dentro del soporte, se añade un frigolín para mantener todo el proceso en frío y se coloca la tapadera sobre los electrodos del soporte de transferencia. Finalmente, se enciende el PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 130 agitador magnético ajustando las revoluciones con una rueda y se conectan los electrodos a la fuente de alimentación. Las condiciones establecidas en la transferencia son de 200 mA por cubeta y el tiempo de duración depende según el tamaño de la proteína. De tal manera que, proteínas de peso molecular inferior a 25 kDa se transferían en 1 hora; proteínas de un peso molecular que se encontraban en un rango desde 25 kDa hasta un peso de 250kDa se transferían en 1 hora y 30 minutos; por último, proteínas que presentaban un peso molecular por encima de 250 kDa se transferían en 2 horas 30 minutos. 3.1.6. Comprobación de la transferencia gel-membrana: Tinción rojo Ponceau La solución de Ponceau S preparada al 0.1% P/V en ácido acético 5% (Pounceau S Red Solution, P7170, Sigma-Aldrich, Misuri, USA) permite teñir la membrana tras la transferencia para comprobar que el proceso se haya producido correctamente y las proteínas del gel estén presentes en la membrana. Se trata de una tinción reversible, por lo tanto, una vez teñida, la membrana se lavaba con solución de lavado de Pounceau, (ácido acético al 1%) para eliminar el exceso de reactivo y poder distinguir mejor las bandas en la membrana. Posteriormente, para terminar de desteñir las membranas se empleó la solución de lavado TBS-T (Tris Buffer Saline-Tween) que se describe en la Tabla 18. COMPOSICIÓN TAMPÓN DE LAVADO (TBS-T) Reactivo Concentración Propósito Tris-HCl pH 7.6 20 mM Solución tamponante que permite mantener el pH adecuado NaCl 146 mM Cloruro sódico que permite mantener la concentración de iones de la solución de lavado Tween-20 0,1% (V/V) Detergente surfactante cuya función va a ser la de impedir uniones no específicas del anticuerpo. Tabla 18: Composición del tampón de lavado TBS-T Materiales y métodos 131 3.1.7. Inmunodetección 3.1.7.1. Bloqueo El bloqueo de la membrana consiste en la incubación de ésta en una solución de BSA (Albúmina de Suero Bovino) en TBS-T al 5% P/V durante 1 hora a temperatura ambiente. En este caso, la solución de BSA va a bloquear los lugares de unión inespecíficos del anticuerpo, favoreciendo una unión de éste a su antígeno específico y evitando niveles de ruido de fondo. 3.1.7.2. Hibridación de los anticuerpos Tras el bloqueo de la membrana, se lleva a cabo la incubación de ésta con el anticuerpo primario que es específico para reconocer el epítopo de la proteína de estudio que queda en la membrana en su estructura lineal en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Esta incubación se realizó a 4ºC en agitación durante toda la noche. Las diluciones de los anticuerpos primarios se realizaron en solución de bloqueo BSA al 5%. En este caso, se utilizaron anticuerpos de naturaleza monoclonal y policlonal. Los anticuerpos primarios utilizados en este proyecto se describen en detalle en la Tabla 19. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 132 TABLA ANTICUERPOS PRIMARIOS Anticuerpo Peso Molecular Dilución Origen Especie hospedadora Referencia Casa Comercial ACC 280kDa 1:1000 Policlonal Conejo 3662 Cell Signaling Technology Inc., Massachusetts, USA pACC (Ser79) 280kDa 1:1000 Policlonal Conejo 3661 Cell Signaling Technology Inc., Massachusetts, USA FAS (G-11) 270kDa 1:1000 Monoclonal Ratón sc-48357 Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA GUCY2C 123kDa 1:1000 Policlonal Conejo ABIN5997862 Antibodies-online.com, Germany CPT1A 88kDa 1:1000 Monoclonal Ratón ab-128568 Abcam, Cambridge, UK HSL 90kDa 1:1000 Policlonal Conejo ab-45422 Abcam, Cambridge, UK pHSL (Ser 660) 83kDa 1:1000 Policlonal Conejo 4126 Cell Signaling Technology Inc., Massachusetts, USA PPARγ 57kDa 1:1000 Policlonal Conejo ab-59256 Abcam, Cambridge, UK LPL (F-1) 56kDa 1:1000 Monoclonal Ratón sc-373759 Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA PPARα (H-2) 55kDa 1:1000 Monoclonal Ratón sc-398394 Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA β-Actina 42kDa 1:5000 Monoclonal Ratón A5316 Sigma Aldrich, Misuri, USA FGF21 20 kDa 1:1000 Policlonal Conejo ab-64857 Abcam, Cambridge, UK Tabla 19: Anticuerpos primarios empleados en este proyecto de tesis Tras la incubación con el anticuerpo primario, se retira de la membrana y se realizan 3 lavados de 10 minutos cada uno en agitación a temperatura ambiente con TBS-T para eliminar el excedente. Posteriormente, se incuba la membrana con el anticuerpo secundario contra la especie del anticuerpo primario reconociendo la parte constante de éste y que presenta un marcaje detectable de peroxidasa. Por lo tanto, mediante este método indirecto de detección, se van a unir múltiples anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario permitiendo una amplificación de la señal y por lo tanto una detección mejor de las proteínas de estudio. Materiales y métodos 133 La incubación con el anticuerpo secundario se lleva a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, se retira el anticuerpo secundario y se realizan 3 lavados de 10 minutos cada uno en agitación con TBS-T. Los anticuerpos secundarios utilizados en este proyecto se describen en la tabla 20. TABLA ANTICUERPOS SECUNDARIOS Anticuerpo Dilución Origen Especie hospedadora Conjugado Referencia Casa Comercial AntiConejo 1:5000 Policlonal Cabra Peroxidasa de rábano (HorseRadish Peroxidase, HRP) 111-035-144 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK AntiRatón 1:10000 Policlonal Cabra Peroxidasa de rábano (HorseRadish Peroxidase, HRP) 115-035-003 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK Tabla 20: Anticuerpos secundarios utilizados en este proyecto de tesis 3.1.7.3. Detección El último paso consiste en detectar la señal procedente del anticuerpo secundario que determinará la presencia de la conjugación epítopo-anticuerpo primario-anticuerpo secundario y por tanto el resultado final de la expresión proteica por muestra de estudio. El método de detección utilizado es el de quimioluminiscencia ya que los anticuerpos secundarios se encuentran conjugados con peroxidasa HRP (Horsedish Peroxidase). Por tanto, para detectar la señal se emplea un kit (PierceTM Western Blotting Substrate,32106, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) de dos reactivos que incluyen, por un lado, el sustrato del enzima peroxidasa que se encuentra en el anticuerpo secundario y el luminol que es un potenciador de quimioluminiscencia. La reacción catalizada PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 134 por la peroxidasa produce una emisión de luz que va a ser detectada por autorradiografía de rayos X en películas. La membrana se incuba con la mezcla de ambos reactivos a volúmenes iguales (proporción 1:1) durante 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Tras los 5 minutos se elimina el exceso de reactivo y se coloca la membrana cubierta por una lámina de acetato transparente dentro de un cassette de autorradiografía. En una sala oscura se procede a la exposición de las películas radiográficas Mamoray (Película RX Agfa MAMORAY HT 18x24 cms,351KY, Agfa Gevaert, Mortsel, Belgium) introduciéndolas en el cassette encima de las membranas que se encuentran cubiertas por una lámina de acetato transparente para evitar el contacto directo de los reactivos con la película. Se cierra el cassette y se lleva a cabo la exposición. Las exposiciones de las proteínas podían llegar a durar desde segundos a minutos dependiendo de la proteína a detectar y el anticuerpo empleado. Tras el tiempo de exposición, se sacaba la película del cassette y se introducía en una máquina de revelado automática (Procesador de películas CURIX 60, Agfa Gevaert, Mortsel, Belgium) en la que las películas atravesaban a través de un sistema de rodillos 3 bandejas: una bandeja que contenía líquido revelador, una segunda bandeja con líquido fijador y una última bandeja con agua destilada. Finalmente, las películas se secaban mediante un secador infrarrojo y se obtenían las proteínas reveladas correspondientes a la exposición realizada. Tras la obtención de las imágenes, las membranas podían ser tratadas de nuevo para la detección de otra proteína diferente de estudio o la proteína referente utilizada como control de carga, que en nuestro proyecto de tesis resulta ser la β-actina. 3.1.7.4. Análisis de las bandas proteicas detectadas Tras el revelado de las proteínas en las películas radiográficas, se llevaron a cabo las imágenes digitalizadas de las Materiales y métodos 135 bandas proteicas en alta resolución mediante un escáner (G4010 HP Scanjet, California, USA). Para llevar a cabo el análisis de cuantificación de las bandas se utilizó el software de procesamiento de imagen Image J (Image J versión 1.50i programado en Java, NIH, Bethesda, Maryland, USA). La medición de la cantidad de proteína por muestra se lleva a cabo ajustando un área rectangular que es el mismo para todas las muestras y permite detectar el número de píxeles por área que presenta cada muestra por cada película radiográfica. Cada medida obtenida por muestra debe ser corregida con respecto a la medida obtenida del fondo de la membrana. Posteriormente esos valores se relativizan con las medidas de cuantificación proteica obtenidas de la proteína utilizada como control de carga, y éstas a su vez se normalizan y se llevan a porcentaje con respecto al grupo vehículo en cada experimento. Estos valores obtenidos se presentan gráficamente representando la media por grupo ± desviación estándar del conjunto de datos porcentuales por grupo. En todos los experimentos de Western-Blot se empleó un número representativo de muestras procedentes de diferentes grupos experimentales. De tal manera, que en cada experimento podíamos analizar la expresión proteica de todos los grupos de estudio. 3.2. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA: PCR CUANTITATIVA (Q-PCR) Para poder determinar los niveles de expresión génica de las muestras de estudio se llevaron a cabo las siguientes fases: 3.2.1. Extracción de RNA: método Tiocianato de GuanidinaFenol-Cloroformo Para llevar a cabo la extracción de RNA total se emplearon distintos métodos en función del tipo de muestra, ya sean cultivos PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 136 celulares o tejidos. Todos los pasos se realizaron manteniendo las muestras en frío para evitar la degradación del RNA. En el caso de los cultivos celulares, la extracción del RNA se producía una vez se culminaba con el período de tratamiento correspondiente. Por tanto, se llevaba a cabo el siguiente protocolo: 1.- Se retiraba por aspiración el medio de cultivo en el que se habían tratado las células y se realizaron dos lavados con el tampón de lavado PBS a 4ºC en todos los pocillos de las placas. 2.- Se situaron las placas sobre hielo y se añadió el reactivo TRIzol (15596026, TRIzol TM Reagent, InvitrogenTM, California, USA). El TRIzol es un reactivo que contiene, por un lado, tiocianato de guanidina que permite desnaturalizar las proteínas y, por otro lado, fenol para separar los ácidos nucleicos de las proteínas y de los lípidos. 3.- Se incubaron las placas con el TRIzol durante 10 minutos en hielo y se agitaron para recoger lo máximo posible del lisado. Esa suspensión celular en TRIzol se recogió en tubos de polipropileno 1,5mL rotulados (11326144, AxygenTMMCT-150-C-S A Corning Brand, Corning Inc., New York, USA). Posteriormente, se agitaron vigorosamente todos los tubos. 4.- Se centrifugaron los tubos a 12000 RCF a 4ºC durante 10 minutos. 5.- Se recogió el sobrenadante en una nueva tanda de tubos de 1.5 mL rotulados y se añadió cloroformo (131252.1611, Triclorometano estabilizado con etanol para análisis, ACS, ISO, Riqueza mínima (C.G.):99%, Panreac Applichem, ITW Reagents, Illinois, USA), se agitaron los tubos por inversión y se incubaron cinco minutos a temperatura ambiente para diferenciar bien las dos fases. 6.- Tras ese tiempo, se centrifugaron a 12000 RCF durante 15 minutos a 4ºC en la que se separan las siguientes fases: una fase Materiales y métodos 137 orgánica con lípidos y proteínas, una interfase de color blanquecino en la que se encuentra el DNA y la última fase acuosa en la que se encuentra el RNA. 7.- Se recogió cuidadosamente el sobrenadante con RNA en una nueva tanda de tubos de 1.5 mL rotulados a la que se añadió isopropanol (MFCD00011674, 2-Propanol (Certified ACS), Fisher Chemical, Fisher Scientific, New Hampshire, USA) para favorecer la precipitación del RNA, se agitaron los tubos vigorosamente y se incubaron 10 minutos a -20ºC. 8.- Se centrifugaron los tubos a 12000 RCF 10 minutos a 4ºC, se descartó el sobrenadante por decantación. 9.- Se añadió etanol al 75% diluido en agua DEPC (agua bidestilada con dietilpirocarbonato 0.1%), se agitaron los tubos y se centrifugaron a 7500 RCF durante 5 minutos a 4 ºC. 10.- Se eliminó el sobrenadante por decantación de forma cuidadosa y se dejó secar el pellet. 11.- Por último, una vez se había secado bien, el pellet se resuspendió en agua DEPC. En el caso de que no se logre disolver el pellet en agua, se realizaron 3 ciclos a 60 ºC durante 3 minutos y con agitaciones intermedias entre ciclos para asegurar la resuspensión. En el caso de los tejidos de los animales de experimentación, el protocolo se realizó con los tejidos que se encontraban guardados a - 80ºC y fue el siguiente: 1.- Se toma un pequeño fragmento por muestra del tejido y se colocan en frío en tubos de polipropileno de 2 mL rotulados con cierre de seguridad (Safe Lock tubes 2.0 ml, Eppendorf, Hamburg, Germany). 2.- Una vez preparados todos los tubos con las muestras de tejido cortadas, se les añade una bolita de acero y el reactivo TRIzol. PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 144 En Taqman, se cargan 10 μL en cada pocillo del mix de reactivos final a los que se añaden 2 μL del cDNA obtenido de la RTPCR. Todas las muestras se cargan por duplicado ya sea el gen control o el gen de interés. Las condiciones de la Q-PCR para Taqman fueron las siguientes: 1.- 40 ciclos: (50ºC durante 2 minutos) x40. 2.- 95ºC durante 10 minutos. 3.- 95ºC durante 10 minutos. 4.- 95ºC durante 15 segundos. 5.- 60ºC durante 1 minuto. El equipo que se empleó para realizar la Q-PCR tanto por SYBR Green como por Taqman fue StepOnePlus™ Real-Time PCR System (437660, Applied Biosystems™ Fisher Scientific, Thermo Scientific, New Hampshire, USA). Para determinar la concentración de cDNA se emplea el término de CT que refleja el número del ciclo en el que la señal de fluorescencia supera los niveles de fondo. Este valor es inversamente proporcional a la concentración de cDNA. Los niveles de expresión de los genes de interés se normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen control HPRT en humanos o Hprt en roedores. Los resultados se expresan como unidades arbitrarias relativas al valor medio del grupo control. En ocasiones, estos valores también se han expresado en porcentaje. 3.3. ANÁLISIS DEL PERFIL LIPÍDICO EN SANGRE Y EN HÍGADO Para determinar cuantitativamente los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres (NEFAS en inglés: Non Esterified Fatty Acids) y los Materiales y métodos 145 niveles de triglicéridos plasmáticos y hepáticos (los triglicéridos hepáticos a partir de las muestras de extracción de lípidos de los hígados murinos), se utilizaron kits (NEFAS: HR Series NEFA-HR (2), FUJIFILM Wako Diagnostics, USA; Triglicéridos: 1001310, Triglycerides GPO-POD. Enzymatic-colorimetric, SpinReact, Girona, Spain) comerciales con protocolos descritos por el fabricante. El principio del método se basa en una serie de reacciones enzimáticas dependientes de temperatura(37ºC) cuya reacción final libera una coloración detectada por un espectrofotómetro (Epoch 2 microplate reader, Biotek Instruments Inc., Vermont, USA). Por lo tanto, la intensidad del color formado es proporcional a la concentración presente en la muestra ensayada. 3.4. TÉCNICA DE TINCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS IN VITRO: OIL-RED-O Se colocaron unos cubreobjetos previamente esterilizados sobre los pocillos de las placas multipocillo de 24 pocillos (CLS3527, Corning® Costar® TC-Treated Multiple Well Plates, Corning Inc., New York, USA) y posteriormente estos cubreobjetos se trataron con Poli-LLisina (P4707, Sigma Aldrich, Misuri, USA) durante 5 minutos a 37ºC para poder asegurar la adherencia de las células a ellos. Posteriormente, se recuperaba la Poli-L-Lisina y se realizaron 2 lavados con tampón de lavado PBS y se dejó secar la placa en el incubador durante 3 horas a 37ºC. Después, se sembraron las células en los pocillos y se cultivaron en el incubador a 37ºC y un 5% de CO2. Cuando existía una confluencia cercana al 70% se llevaron a cabo los tratamientos correspondientes. Tras finalizar estos tratamientos se realizó el siguiente protocolo: PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 146 o Se aspiró el medio de tratamiento y se realizaron dos lavados con tampón de lavado PBS. o Se fijaron las células con formaldehído 4% a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron 3 lavados con PBS para finalmente llevar a cabo la tinción con Oil Red O. o Tratamiento para tinción Oil Red O: las muestras de células fijadas en los cubreobjetos fueron incubadas con el compuesto Oil Red-O durante 10 minutos. Posteriormente se lavaron con agua destilada y se contratiñeron con hematoxilina durante tres minutos y se montaron sobre un portaobjetos con medio de montaje acuoso. o Análisis gotas lipídicas con software de imagen FRIDA (FRamework for Image Dataset Analysis, Johns Hopkins University, Maryland, USA). 3.5. ESTUDIOS HISTOLÓGICOS En la experimentación in vivo se llevaron a cabo estudios de las histologías del hígado que nos permitieron comprobar la morfología y la estructura de los hepatocitos, además del estado de esteatosis hepática. Para ello, se utilizaron distintas técnicas de tinción de tejidos que permitieron apreciar estas características y que se desarrollan a continuación: 3.5.1. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) Esta tinción se emplea fundamentalmente para el estudio de la morfología, ya que permite visualizar de forma bastante clara las estructuras, por un lado, la hematoxilina de naturaleza básica va a teñir estructuras ácidas (basófilas) como es el núcleo de tonos azul y púrpura y, por otro lado, la eosina de naturaleza ácida va a teñir Materiales y métodos 147 componentes básicos (acidófilos) de color rosa como por ejemplo el citoplasma. Para llevar a cabo el protocolo de tinción, el trozo tejido que fue extraído del animal y guardado en un cassette de inclusión, fue inmerso en formaldehído al 4%. Posteriormente, tras ser fijado, el tejido se incluye en un bloque de parafina. Sobre ese bloque se realizan cortes y posteriormente se sumergen en xilol para eliminar el exceso de parafina. Luego se pasan por una serie de alcoholes de concentración decreciente para rehidratar la muestra (100º, 96º y 70º). Se realiza un lavado con agua destilada para eliminar el exceso de alcohol y se sumergen 10 minutos en hematoxilina. Posteriormente se lavan con agua destilada para eliminar el exceso y se pasan por un alcohol ácido. Se lavan de nuevo con agua destilada y se sumergen 30 segundos en eosina. Después se pasan por una serie de alcoholes en orden creciente (70º, 95º, 100º) que permiten deshidratar las muestras para poder realizar el montaje. Finalmente, se dejan remojar 10 minutos en xilol y se montan las preparaciones empleando medio de montaje. Una vez secas, ya estarían listas para ser observadas por el microscopio óptico (Axio Lab.A1, Zeiss, Oberkochen, Germany) que se encuentra conectado a una cámara para poder realizar fotos de las preparaciones. 3.5.2. Tinción de Oil Red O Esta solución de tinción permite detectar lípidos neutrales en cortes de tejido congelados ya que, el colorante Oil Red O es de naturaleza lipófila y puede difundirse hacia los lípidos del tejido tiñéndolos de color rojo. Por tanto, una vez se lleva a cabo la extracción de los tejidos del animal, se reserva un trozo para congelar inmediatamente y se emplea para esta tinción. El protocolo consiste en el corte de secciones de tejido congelado de uno 5-10 μm de espesor que se fijan al portaobjetos. Se dejan secar durante 60 minutos a temperatura ambiente y se fijan con formaldehído al 4% en frío durante 5-10 minutos. Posteriormente se dejan secar durante 60 minutos, se lavan con agua destilada y se vuelven a dejar secar. Se PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 148 colocan en isopropanol al 60% durante 20 segundos, luego en solución Oil Red O durante 10 minutos y de nuevo en isopropanol al 60% durante 30 segundos. Se enjuagan las preparaciones con agua destilada y se aplica la contratinción con hematoxilina durante 5 minutos para poder teñir de azul los núcleos. De nuevo se realiza un lavado con agua destilada y se montan en medio de montaje. Se dejan secar y ya estarían listas para ser observadas por el microscopio óptico (Axio Lab.A1, Zeiss, Oberkochen, Germany) que se encuentra conectado a una cámara para poder realizar fotos de las preparaciones. Finalmente, las fotos fueron analizadas empleando el software ImageJ (Image J versión 1.50i programado en Java, NIH, Bethesda, Maryland, USA), en el que se cuantificaron las gotas lipídicas teñidas de rojo. 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos obtenidos de todos los experimentos se representaban como el valor promedio del grupo de individuos ± la desviación típica. El tamaño muestral de los grupos en cada experimento se detalla en los pies de figura de los resultados. En primer lugar, se llevó a cabo un estudio de la normalidad de los datos mediante el test de Shapiro-Wilk según nuestro tamaño muestral. Después, se llevó a cabo un análisis de la homogeneidad de varianzas (ANOVA). Si era homogénea se llevaba a cabo test posthoc Tukey. Pero si era “no homogenea” se realizaban los test no paramétricos, el de Krustal-Wallis junto con el test Mann-Whitney. Para el estudio de la significancia, se consideraba que un p-valor por debajo de 0.05 ya era estadísticamente significativo, y se indicaba de esta manera: * p<0.05. En ocasiones el p-valor era menor de 0.01 o incluso menor de 0.001, por lo tanto, en estos casos, se indicaba de esta manera: **p<0.01; ***p<0.001. RESULTADOS Resultados 151 ESTUDIOS IN VITRO 1. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON LA HORMONA UROGUANILINA EN UN MODELO CELULAR DE ESTEATOSIS HEPÁTICA Y MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS 1.1. IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE LA UROGUANILINA, GUCY2C EN EL HÍGADO Como ya hemos descrito en el apartado de introducción, la hormona uroguanilina (UGN) forma parte del eje hipotálamo-intestino de gran importancia en la regulación de la homeostasis energética. Si bien para poder efectuar su acción, es necesario que se una a su receptor transmembrana GUCY2C presente en ambos tejidos106,112,115,118,121. Con el fin de conocer la localización de dicho receptor se llevó a cabo el estudio de la expresión génica de Gucy2c en diversos tejidos de rata (Figura 1). Como se puede observar en la figura 1, la mayor expresión del receptor se encuentra en el intestino delgado y en la mucosa gástrica ya que es donde la hormona uroguanilina lleva a cabo su función principalmente. Por otro lado, hay que destacar la presencia del receptor en algunos núcleos del hipotálamo (ARC, VMH y LHA) y en el hígado. Precisamente, fijamos nuestra atención en la expresión génica del receptor en el hígado ya que, no existe ningún estudio acerca del efecto que puede producir esta hormona una vez lleva a cabo su unión con el receptor GUCY2C a este nivel. Por ello, nuestra investigación PATRICIA E. GONZÁLEZ SÁENZ 152 comienza enfocándose en el estudio del efecto de la acción de la uroguanilina en el hígado y los mecanismos metabólicos involucrados. Figura 1. Estudio de la expresión génica del receptor transmembrana Gucy2c en varios tejidos de rata. Los valores se representan como Media ± Error Estándar de la Media (SEM). Valor “n” por grupo es de 3-5 muestras. mRNA: Ácido RiboNucleico mensajero; ARC: Núcleo Hipotalámico Arcuato; VMH: Núcleo Hipotalámico Ventromedial, LHA: Núcleo Hipotalámico Lateral, BAT: Tejido Adiposo Pardo (“Brown Adipose Tissue”); GWAT: Tejido Adiposo Blanco Gonadal (“Gonadal White Adipose Tissue”); ND: no detectable. 1.2. ESTABLECIMIENTO DE UN MODELO DE ESTEATOSIS HEPATICA EN LA LÍNEA CELULAR HUMANA, HEPG2 Se ha descrito recientemente el efecto lipolítico de la uroguanilina en adipocitos humanos regulando el peso corporal y la adiposidad124. Dado que en este trabajo se demuestra la presencia de receptor GUCY2C en el hígado junto con la capacidad lipolítica que presenta la UGN en el estudio de adipocitos, se planteó la idea de estudiar el efecto de esta hormona en un modelo de esteatosis hepática empleando la línea celular humana, HepG2. N iveles d e m R N A d e G u cy2 c (u n id a d es a rb itrarias) Intestino d elgado M ucosa gástrica A R C V M H L H A H ígado B A T G W A T 0.00 0.05 0.10 0.15 0.5 1.0 1.5 2.0 Resultados 153 Con este fin, en las líneas celulares se realizaron dos grupos experimentales: el grupo vehículo (vehículo del ácido oleico) y el grupo experimental tratado con ácido oleico (OA) 1mM, durante 24 horas. Posteriormente, se realizó una tinción Oil Red O de ácidos grasos y se cuantificaron las gotas lipídicas (Figura 2). Figura 2. Modelo de esteatosis hepática en la línea celular humana HepG2. Tinción Oil Red O en los dos grupos experimentales: grupo Vehículo y grupo ácido oleico (OA). Barra de escala 50 µm(A). Cuantificación de las gotas lipídicas de ambos grupos(B). Los valores se representan como Media ± Error Estándar de la Media (SEM). Valor “n” por grupo es de 5 muestras. **p<0.01 frente a Vehículo. OA: Ácido oleico (“Oleic Acid”). Como podemos comprobar en las imágenes y la cuantificación lipídica de la tinción, las células tratadas con ácido oleico presentan una elevada acumulación lipídica en el citoplasma estadísticamente significativa en comparación con el grupo vehículo. Por tanto, de esta forma se puede confirmar que ha sido posible generar un modelo de esteatosis hepática in vitro gracias al tratamiento con ácido oleico. 1.3. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON LA HORMONA GASTROINTESTINAL UROGUANILINA EN UN MODELO DE ESTEATOSIS HEPÁTICA IN VITRO En este momento se llevó a cabo el estudio del efecto del tratamiento con la uroguanilina sobre la esteatosis generada en el modelo celular HepG2. Para ello, se realizó un experimento que se 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Área Oil Red O (%) Tinción Oil Red O Vehículo OA ** Vehículo OA AB