Uso de la biopsia líquida para la selección de tratamientos en oncología

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Elena María Brozos Vázquez Tesis doctoral USO DE LA BIOPSIA LÍQUIDA PARA LA SELECCIÓN DE TRATAMIENTOS EN ONCOLOGÍA Santiago de Compostela, 2024 Programa de doctorado en Investigación Clínica en Medicina TESIS DOCTORAL USO DE LA BIOPSIA LÍQUIDA PARA LA SELECCIÓN DE TRATAMIENTOS EN ONCOLOGÍA Autora Elena María Brozos Vázquez Directores: Rafael López López y Luis Ángel León Mateos PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2024 DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERÉS Dña. Elena María Brozos Vázquez, autora de esta tesis, no tiene conflictos de interés que deba declarar para la realización y presentación de esta tesis doctoral. A vosotros. AGRADECIMIENTOS Este es el capítulo que más me aporta de forma personal, porque es la forma de compartir todos vosotros la alegría que el realizar una tesis doctoral conlleva después del esfuerzo llevado a cabo entre todos. Además, es necesario para mí expresar de manera universal la gratitud a todos aquellos que han sumado tanto con su enorme grano de arena depositado en este trabajo. Debo comenzar agradeciendo a los directores de tesis, Dr. López y Dr. León, Rafa y Luis, primero al haber aceptado compartir esta aventura conmigo; y después, por su ayuda, ánimo, empuje y soporte continuos a lo largo de la elaboración de esta tesis. Asimismo, a todos aquellos que también me han echado sus dos manos para aspectos formales y normativos, en especial referencia a Pablo Taboada Antelo, por su paciencia, acercamiento y continua disponibilidad para todas mis dudas. Me dirijo al personal de la Unidad de Análisis de Biopsia Líquida de ONCOMET por haber sido mis faros científicos en materia traslacional. Agradezco de forma especial su implicación a Laura Muinelo, por su enorme capacidad profesional y personal de haber estado a mi lado escuchando, científica y emocionalmente, todas mis inquietudes. Gracias por ser tan buena compañera y amiga. En el aspecto clínico, he contado con el incondicional apoyo de mis compañeros de la Unidad de Tumores Digestivos, Sonia Candamio, Francis Vázquez, Yolanda Vidal, Vanesa Varela y Juan Ruiz; que de forma totalmente altruista me han ayudado con la selección de pacientes y la recogida de datos clínicos, así como la discusión de resultados y su aplicación a nuestro terreno favorito, la consulta diaria. Es un placer compartir patología con vosotros. Los autores de los artículos han sido tremendamente generosos por permitir que un trabajo realizado en equipo pueda reflejarse aquí como mi tesis doctoral. Ellos han tirado adelante para que esto hoy vea la luz, con su esfuerzo y conocimientos ha salido mucho más enriquecido. Especialmente, un gracias a Isabel Ferreirós, por su tesón y fuerza a la hora de sacar adelante el estudio de cáncer de colon. De forma personal, esta tesis supone un crecimiento y aprendizaje inesperados, además de haber estrechado lazos con personas que me han aportado mucho más allá de la ciencia. Los Servicios de Oncología Médica de Santiago de Compostela y de A Coruña son equipos en donde uno crece, se forma como persona, desarrolla habilidades y, sobre todo, disfruta. Gracias por hacer que tantas horas en el hospital sean maravillosas. Gracias de forma especial a tantos amigos que me rodean, así como sus hombros y oídos, siempre dispuestos y abiertos, ante todo tipo de circunstancias. Merce, María, Lucía, Marta, María, Manuel, Laura, Carmen, Pau, Eva, Manolo…y muchos más que siempre habéis estado en aquellos días que comienzan malos, pero que, tras un ratito con vosotros, mejoran exponencialmente. Es un privilegio teneros cerca. A mi familia; comenzando por mis padres, por su amor infinito y su fuerza para seguir adelante cuando el cáncer les tocó allí donde más duele. Gracias por transmitirme los valores y principios morales que ahora llevo conmigo, son los bastones que me sostienen en mis debilidades. Además, me enseñasteis la disciplina y fuerza de voluntad necesarias para alcanzar las recompensas. A todos mis abuelos, Miguel y Amable, Manolo y Elena, Adela: gracias por ser la bondad personificada y la sonrisa permanente que transmite paz. A mis hermanos Miguel, Ana, Rita y Juan, sois los mejores compañeros en cualquier travesía que la vida nos ponga por delante, sean los metros que sean. A nuestros sobrinos, Roi, Erea, Aine, Noela y Anxo: por vosotros haré todo lo posible para que tengáis un mundo mejor. Sois mi motivación para ser feliz cada día. A Pablo, siempre a mi lado: eres lo mejor que tengo para caminar sin dificultades, salvando los tropiezos y celebrando los triunfos juntos. Contigo no necesito nada más para recorrer esta vida con éxito. Y por supuesto, gracias a todos los pacientes que, colaborando con la investigación, hacen posible que sueños como este se cumplan. Vosotros sois la energía que nos impulsa hacia adelante. Por vosotros, seguiré soñando. ÍNDICE ABREVIATURAS………………………………………………………………………7 RESUMEN………………………………………………………………………………8 SUMMARY…………….………………………………...…………………………….10 INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...12 HIPÓTESIS……………………………………………………………………………..18 OBJETIVOS…………………………………….………………………………………19 METODOLOGÍA…………………………………………………………………….....20 CAPÍTULO 1……………………………………………………………………………22 CAPÍTULO 2……………………………………………………………………………35 CAPÍTULO 3……………………………………………………………………………56 DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….75 CONCLUSIONES……………………………………………………………………....85 REFERENCIAS…………………………………………………………………………86 ANEXOS……………………………………………………………………………......92 7 ABREVIATURAS ADN Ácido Desoxirribonucleico ARN Ácido Ribonucleico ALK Kinasa del linfoma anaplásico BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 cEVs Vesículas Extracelulares circulantes cfDNA Cell-free Desoxiribonucleic Acid ctDNA Circulating tumour Desoxiribonucleic Acid CPNM Carcinoma de Pulmón no Microcítico CPCP Carcinoma de Pulmón Célula Pequeña CPNCP Carcimoma de Pulmón no Célula Pequeña CPM Carcinoma de Pulmón Microcítico CRC Carcinoma Colorrectal CRCm Carcinoma Colorrectal metastásico CTCs Células Tumorales Circulantes ddPCR Digital drop Polymerase Chain Reaction DNA Desoxiribonucleic Acid EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EMT Epitelial Mesenquinal Transition GPA Graded Prognostic Assessment HER2 Human Epidermal Growth factor Receptor 2 ICIs Immune Checkpoint Inhibitors KRAS Kristen Rat Sarcoma viral oncogene homolog LCR Líquido Cefalorraquídeo MAFs Mutant Allele Fraction MRD Minimal Residual Disease MSI Microsatellite Instability NGS Next Generation Sequencing NRAS Neuroblastoma Rat Sarcoma viral oncogene homolog PCR Polymerase Chain Reaction PD-1 Programmed Cell Death Protein 1 PD-L1 Programmed Cell Death Protein 1 Ligand RAS Rat Sarcoma viral oncogene homolog RNA Ribonucleic Acid ROS1 ROS Proto-Oncogene 1, receptor tyrosin Kinase SoC Standard of Care SNC Sistema Nervioso Central TMB Tumor Molecular Burden TCR T-cell receptor 8 RESUMEN El cáncer es una de las enfermedades con mayor mortalidad en situación avanzada, siendo actualmente la segunda causa de muerte a nivel global, lo que pone de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevos y mejores enfoques diagnósticos y terapéuticos. La Medicina de Precisión comprende aquellas actuaciones para el tratamiento y prevención de enfermedades que tiene en cuenta la variabilidad individual de los pacientes. De forma más específica, la Oncología de Precisión comprende el uso de terapias dirigidas para el tratamiento de tipos específicos de células cancerosas. Hoy en día el estudio de un paciente oncológico pasa por un diagnóstico molecular, para ofrecer opciones terapéuticas adaptadas a sus características individuales, considerando aquellas alteraciones genómicas para acceder al uso de fármacos específicos para esa diana molecular. La biopsia líquida es una herramienta diagnóstica que está emergiendo como imprescindible para realizar un estudio molecular integral a lo largo de la enfermedad del paciente. Es una técnica no invasiva que permite detectar y analizar células tumorales y material genético en muestras de sangre u otro tejido corporal. En este sentido, el objetivo principal de esta tesis es presentar el desarrollo de la biopsia líquida en aquellos tumores en situación de pronóstico ensombrecido como herramienta útil para ofrecer a los pacientes una terapia dirigida de forma personalizada en base a la biología molecular de su tumor. El uso de esta técnica diagnóstica ha demostrado utilidad para la personalización de tratamientos en determinados tumores avanzados que presenten siembra al torrente sanguíneo, como son el cáncer de pulmón y colorrectal, donde también está establecida la administración de terapias dirigidas con resultados positivos en cuanto a supervivencia. En el primer capítulo se presenta en forma de revisión narrativa la utilidad de la biopsia líquida en el uso de inmunoterapia en el de cáncer de pulmón metastásico. Este tipo de tratamiento bloquea la inhibición del sistema inmune favoreciendo así una acción antineoplásica, con beneficios clínicos en determinados tumores. Todavía a día de hoy no disponemos de biomarcadores de respuesta tumoral a estos fármacos, ni de capacidad de predicción de desarrollo de resistencias o toxicidades inmunomediadas. Tras un análisis exhaustivo de numerosos estudios traslacionales, la detección de células tumorales circulantes (CTCs) o ácido dexoxirrubonicleuico libre celular (cfDNA) se muestran como herramientas prometedoras para la selección de pacientes y la monitorización de respuesta a terapias. En el segundo capítulo, se profundiza en la utilidad de la biopsia líquida en enfermos con aquellos tumores sólidos (pulmón, mama y melanoma, tumores que presentan diseminación sanguínea de material oncológico) que han metastatizado a nivel del sistema nervioso central (SNC). Esta es una de las situaciones clínicas más complejas que afrontamos en nuestro día a día en la clínica, debido a las altas tasas de mortalidad y comorbilidades añadidas que presenta el paciente. Se ha llevado a cabo una revisión de aquellos estudios con inmunoterapia en estos cánceres, y sus resultados en el subgrupo concreto de pacientes que presentan metástasis en SNC. Además, se ha focalizado la revisión en aquellos ensayos que de forma exploratoria emplean la biopsia líquida como técnica predictiva de respuesta a terapia inmune en este contexto de especial mal pronóstico. Varios trabajos presentan la biopsia líquida en fluido cerebral como una herramienta útil para caracterizar el perfil genómico de las metástasis y así poder conocer mejor la biología molecular de estas lesiones. Introducción 15 pulmón avanzado, asociado o no al tratamiento con quimioterapia y recomendado por las principales guías clínicas de manejo de esta enfermedad (20-23). Desafortunadamente, no todos los pacientes responden, siendo tan solo un subgrupo (aproximadamente 20-30%) los que se benefician de la inmunoterapia a largo plazo. Debido a esto, hay una necesidad clara de detectar perfiles de pacientes respondedores a estas terapias antiPD-1/antiPD-L1, a la vez que tratamos de identificar aquellas subpoblaciones en las que son ineficaces para evitar un tratamiento con potenciales eventos adversos graves. Por otro lado, escenarios de especial mal pronóstico como el diagnóstico de metástasis cerebrales en pacientes con cáncer de pulmón ocurren en un 20-30% de los casos de CPNCP (24,25). En el caso de CPCP la incidencia es de 10-14% al diagnóstico, incrementándose durante el curso de la enfermedad hasta un 50% (26). Esta situación supone un desafío clínico, ya que su presencia en tumores sólidos se relaciona con un pronóstico infausto y complicaciones graves con un empeoramiento de la calidad de vida de los pacientes oncológicos que las presentan. En global, la metastatización al cerebro se estima en un 20-40% de todos los tumores (27,28). El tratamiento de la enfermedad a nivel cerebral se basa en el uso de cirugía, radioterapia esterotáxica u holocraneal (29,30). Sin embargo, las indicaciones de estas prácticas están cambiando en los últimos años en el cáncer de pulmón, y en otros tumores como el melanoma, debido al uso de inhibidores tirosina quinasa empleados como terapia dirigida debido a su buena penetrancia en el sistema nervioso central con una buena tasa de respuesta a nivel intracraneal objetivada en determinados ensayos clínicos (31-34). Sin embargo, en los estudios con inmunoterapia, carecemos de datos sólidos que nos ayuden a identificar qué pacientes se pueden beneficiar del uso de antiPD1/antiPD-L1 en presencia de enfermedad cerebral, ya que clásicamente esta población estaba excluida de la participación en los mismos. La herramienta GPA (Graded Prognostic Assessment) ha tratado de estimar la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón con metástasis cerebrales teniendo en cuenta variables clínicas, pero no moleculares, por lo que hoy en día su uso ha quedado obsoleto al no contemplar factores con implicaciones tanto pronósticas como predictivas ya que influyen en la elección de un tratamiento personalizado con terapia dirigida (35). Hay, por lo tanto, una necesidad no cubierta de descubrir mediante biomarcadores que puedan ayudar en la práctica clínica habitual a seleccionar pacientes en situación oncológica con pronóstico desfavorable. Además, dado que el perfil molecular puede cambiar a lo largo de la evolución tumoral, por alteraciones genéticas que causen mecanismos de resistencia a fármacos, o conlleven un comportamiento diferente en un momento dado con avidez por metastatizar en determinadas localizaciones, el estudio dinámico de estas situaciones supone un reto atractivo para los investigadores. Al mismo tiempo, la herramienta que cumpla esta misión debe ser no-invasiva para mantener en la medida de lo posible la buena calidad de vida de los pacientes. Además, dada la complejidad que supone obtener tejido tumoral cerebral para su estudio, por la morbilidad para realizar una biopsia en este órgano, el estudio molecular llevado a cabo mediante otras técnicas es de crucial importancia. Elena María Brozos Vázquez 16 A.2 CÁNCER COLORRECTAL El cáncer colorrectal es uno de los tumores más frecuentes en ambos sexos, con diagnóstico más frecuente en hombres que en mujeres. Es la segunda causa de muerte por cáncer en Europa (14), siendo España uno de los países con una de las tasas de incidencia y mortalidad más elevadas. Su etiología se asocia a factores en relación con estilos de vida, tales como dieta o sedentarismo (36). La fisiopatología y caracterización molecular son altamente heterogéneas. El adenocarcinoma, subtipo histológico más común, tiene el potencial de originarse en todo el marco colónico y el recto, pero es bien conocido hoy en día que los rasgos genéticos del colon derecho son distintos si los comparamos con el lado izquierdo y recto. Estas diferencias tienen un rol crucial en el escenario metastásico de esta enfermedad, siendo los patrones de diseminación a órganos dependientes de la localización del tumor primario. Como consecuencia de esta heterogeneidad, el tratamiento sistémico de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico debe ser personalizado y dependiente de biomarcadores predictivos específicos de esta enfermedad. El estado mutacional del RAS (rat sarcoma viral oncogene homolog) es utilizado hoy en día en la práctica clínica habitual para seleccionar pacientes respondedores a terapia dirigida, y con ello mejorar los resultados oncológicos (37). Cetuximab y panitumumab son anticuerpos monoclonales contra el receptor de factor de crecimiento (EGFR) que han demostrado beneficio clínico en pacientes con cáncer colorrectal con estatus nativo de RAS administrado con quimioterapia en primera línea de tratamiento (38-40),!especialmente en aquellos pacientes cuyo tumor primario se ha originado en el lado izquierdo del colon, incluido el recto (41-46). El 40% de los pacientes presentan mutaciones missense en el gen Kristen RAS (KRAS) y 3-5% en el neuroblastoma RAS (NRAS), representando un evento precoz en el desarrollo de la carcinogénesis del cáncer colorrectal avanzado (47,48). Por tanto, aproximadamente un 50% de los pacientes con esta enfermedad presentan resistencia a inhibidores de EGFR. Es por ello, que las guías clínicas para el manejo clínico de estos pacientes recomiendan la determinación de la evaluación del estatus mutacional del RAS previo a establecer una estrategia de tratamiento (49-52). El estándar para este diagnóstico en práctica clínica habitual es evaluar la presencia de mutaciones KRAS y NRAS somáticas en tejido tumoral procedente de una biopsia o pieza quirúrgica, mediante el uso de tecnologías basadas en secuenciación específica de mutación, o más recientemente, mediante el uso de plataformas de secuenciación masiva (NGS, next-generation sequencing) (53). Sin embargo, la evaluación del estatus mutacional del RAS utilizando DNA tumoral circulante (ctDNA) mediante la técnica de biopsia líquida se ha establecido como un enfoque alternativo para diagnosticar y monitorizar esta alteración de una forma no invasiva, dinámica y en tiempo real, pudiendo así guiar decisiones terapéuticas de una forma más eficiente (54-57). Se ha demostrado un nivel de concordancia elevado, con ratios mayores del 85%, entre los procedimientos de secuenciación llevados a cabo en tejido tumoral, y OncoBEAMâ RAS CRC (cáncer colorrectal), tecnología que usa dPCR (digital polymerase chain reaction) aprobada por la EMA como una herramienta válida para detección de estas mutaciones (58). Introducción 17 En posteriores estudios prospectivos con largas cohortes de pacientes se han determinado algunas de las causas de discordancia entre ambas técnicas de análisis, destacando el impacto de las características clínicas que influencian la detección del ctDNA en plasma. Pequeñas cantidades de ctDNA en sangre de pacientes con previa resección del tumor primario o ausencia de metástasis hepáticas llevan a una disminución en la identificación de mutaciones RAS mediante esta técnica, y a resultados inciertos de concordancia (59-62). Además, la fracción alélica mutada (MAF, mutant allele fraction) en población con cáncer colorrectal metastásico exclusivamente en pulmón ha sido menor que en pacientes con enfermedad hepática, por lo que este factor supone un aumento en la tasa de falsos negativos (13, 63). La discordancia en estos resultados puede llevar a comprometer la selección de los mejores candidatos a recibir terapia dirigida con anti-EGFR, impidiendo el acceso a una terapia adecuada a nuestros pacientes. Como resultado, se ocasiona un detrimento en la calidad asistencial de nuestra práctica clínica. No cabe duda de que un mejor conocimiento de las características moleculares de los tumores colorrectales es necesario para identificar correctamente subpoblaciones susceptibles de beneficiarse de un tratamiento personalizado. Un estudio estratificado mediante factores clínicos puede ayudar a establecer el correcto uso de biopsia líquida en la rutina clínica. 18 HIPÓTESIS En base al conocimiento actual y lo previamente expuesto, planteamos la posibilidad de que la biopsia líquida se establezca como una herramienta de utilidad en pacientes con tumores sólidos en situación avanzada y de pronóstico especialmente desfavorable para ofrecer al paciente alternativas terapéuticas en el marco de la oncología de precisión. CAPÍTULO 1 Hipótesis 1: La biopsia líquida es una herramienta útil para la selección de pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña respondedores a inmunoterapia. CAPÍTULO 2 Hipótesis 2: La detección de biomarcadores predictivos mediante biopsia líquida puede ayudar a seleccionar perfiles de pacientes con tumores sólidos y metástasis cerebrales que se beneficien de terapias específicas. CAPÍTULO 3 Hipótesis 3: El diagnóstico del estatus mutacional de biomarcadores en sangre en cáncer colorrectal metastásico es de utilidad para establecer estrategias de tratamiento personalizada en estos pacientes. 19 OBJETIVOS Basándonos en las hipótesis establecidas, el objetivo principal de esta tesis consiste en la demostración de que la búsqueda de biomarcadores mediante biopsia líquida tiene implicaciones pronósticas y predictivas de respuesta a tratamientos en cáncer de pulmón y cáncer colorrectal estadios avanzados. Este objetivo general puede dividirse en los siguientes objetivos parciales: CAPÍTULO 1 Objetivo 1: Revisar el potencial del uso de la biopsia líquida en la selección de pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña avanzado respondedores a inmunoterapia. CAPÍTULO 2 Objetivo 2: Analizar biomarcadores de eficacia mediante biopsia líquida en pacientes con tumores sólidos con enfermedad metastásica cerebral. CAPÍTULO 3 Objetivo 3: Identificar mediante biopsia líquida perfiles de pacientes con cáncer colorrectal estadio IV que se asocien a respuesta a tratamientos dirigidos. Objetivo 4: Establecer factores clínicos que condicionan una discordancia entre el análisis mutacional del gen RAS realizado en tejido tumoral y biopsia líquida. Objetivo 5: Determinar el impacto de las características clínico-patológicas en la carga mutacional del gen RAS mediante ctDNA. 20 METODOLOGÍA Para cumplir el primer y segundo objetivos hemos llevado a cabo dos revisiones narrativas de la literatura existente en el año 2020 la primera y 2022 la segunda. Para ello, el método de proceder fue realizar la búsqueda en Pubmed datados dentro de los últimos 10 años, de artículos científicos correspondientes a trabajos originales con muestras de pacientes que cumplían las características clínicas de nuestro grupo de interés (cáncer de pulmón no microcítico avanzado en el primer trabajo; y cánceres de pulmón, mama y melanoma con enfermedad metastásica cerebral en el segundo). Los criterios de búsqueda mediante términos MeSH fueron “advanced non-small cell lung cancer AND immnotherapy”, “lung cancer AND liquid biopsy”, “predictive biomarkers AND immunotherapy”, “lung cancer AND brain metastasis AND immunotherapy”, “melanoma AND brain metastasis AND immunotherapy”, “breast cancer AND brain metastasis AND immunotherapy”. Tras una exhaustiva búsqueda, aquellos artículos originales, metaanálisis y revisiones sistemáticas en lengua inglesa fueron seleccionados, siempre y cuando representaran nuestra población diana y el tema de interés, descartando series de casos clínicos y editoriales. Una vez realizado este cribado, se hizo un análisis de todos los resultados con biomarcadores en biopsia líquida que se presentaban y fueron ordenados en texto y tablas para su correcta exposición. El tercer estudio es un trabajo llevado a cabo en varios centros de Galicia (Complejo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS), Hospital Universitario Lucus Augusti (HULA), Complejo Hospitalario Universitario de Ourense (CHOU), Complejo Hospitalario Universitario de Ferrol (CHUF)), de carácter retrospectivo-prospectivo (ambispectivo) observacional. El estudio comenzó tras el visto bueno del Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia). La selección de pacientes se llevó a cabo por parte de los facultativos responsables de los pacientes tratados en los Servicios de Oncología previamente mencionados, diagnosticados tanto histológica como radiológicamente de cáncer colorrectal estadio IV en el momento de inclusión en el estudio y recogida de sangre. Un total de 366 pacientes fueron seleccionados entre noviembre 2015 y julio 2019. En la mayoría de los casos (79%) la biopsia líquida fue obtenida en los cuatro meses siguientes al diagnóstico de la enfermedad metastásica. El intervalo medio entre la obtención de la biopsia de tejido tumoral sólido y la biopsia de sangre líquida fue inferior a 3 meses (70 días de media) para los pacientes diagnosticados de enfermedad metastásica sincrónica, y de año y medio (535 días de media) para los pacientes diagnosticados de enfermedad metastásica metacrónica recurrente. La información relativa al estado mutacional de RAS en la muestra de tejido tumoral estaba disponible en el 83% de los pacientes. Por otra parte, el genotipado de RAS se consiguió en el 99,5% de las muestras de plasma sanguíneo. La realización del diagnóstico del estatus mutacional RAS se realizó mediante BEAMingâ ddPCR en el caso del plasma, y mediante la técnica estándar de determinación establecida en cada hospital (Therascreenâ KRAS RGQ PCR kit Qiagen; COBAS KRAS mutation test (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland) or pyrosequencing (PyroMarkâ Q24, Qiagen). 21 Los análisis estadísticos se realizaron con subpoblaciones de CCRm predefinidas clínicamente. La concordancia entre los análisis basados en plasma y en tejido tumoral se determinó mediante el estadístico Kappa (kappa) con un intervalo de confianza (IC) del 95%. También se calcularon la concordancia global, la sensibilidad (concordancia porcentual positiva) y la especificidad (concordancia porcentual negativa) entre los análisis basados en plasma y tejido y sus IC del 95%. Se utilizó una regresión logística binaria para modelizar la relación entre las características clínico-patológicas del CCRm y el estado mutacional del RAS (discordante frente a concordante) tomado como variable dependiente dicotómica. El resultado principal del análisis fueron las probabilidades de discordancia frente a concordancia entre las pruebas estándar (análisis en tejido) y el análisis de ctADN en plasma. Se utilizó un modelo lineal generalizado y una función logit para estimar las odds ratio (OR) de discordancia y sus intervalos de confianza (IC) del 95%, y para calcular la probabilidad de asociación con la localización del tumor primario, la resección del tumor primario, la localización metastásica y el número de localizaciones metastásicas tomadas como variables independientes. Los pacientes con CCRm originado en el colon izquierdo, sin resección del tumor primario, con metástasis hepáticas, metástasis en ganglios linfáticos, metástasis pulmonares o metástasis peritoneales, y con múltiples localizaciones metastásicas se utilizaron como referencia para las variables independientes. Se utilizó la regresión logística univariable para estimar el efecto de cada una de las características clínico-patológicas sobre las probabilidades de discordancia, individualmente. También se utilizaron modelos de regresión logística multivariable para estimar el efecto conjunto o la interacción de un grupo de variables clinicopatológicas sobre la probabilidad de que se produjera el resultado. Por último, se realizaron análisis de regresión logística univariable en subpoblaciones de CCRm estratificadas por la localización del tumor primario (colon izquierdo, recto y colon derecho) para modelizar el efecto de la resección del tumor primario, la localización metastásica y el número de localizaciones metastásicas sobre las probabilidades de que se produjera la discordancia. Se calcularon la mediana y el rango intercuartílico (25-75%; IQR) de los niveles de cfADN y las distribuciones de MAF para las distintas subpoblaciones de mCRC. Se aplicaron los enfoques no paramétricos de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis para las comparaciones estadísticas entre dos o más poblaciones, respectivamente. Todas las pruebas estadísticas se realizaron en R versión 3.6.3, GraphPad Prism 6 y VassarStats: Website for Statistical Computation. Las odds ratio ≥ 2 y los valores p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. 22 CAPÍTULO 1 Immunotherapy in non small‐cell lung cancer: current status and future prospects for liquid biopsy 23 Immunotherapy in non small‐cell lung cancer: current status and future prospects for liquid biopsy Elena María Brozos‐Vázquez1,2 · Roberto Díaz‐Peña2,3,4 · Jorge García‐González1,2,3 · Luis León‐ Mateos1,2,3 · Patricia Mondelo‐Macía2 · María Peña‐Chilet5,6,7 · Rafael López‐López1,2,3 1 Department of Medical Oncology, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, 15706 Santiago de Compostela, Spain. 2 Liquid Biopsy Analysis Unit, Translational Medical Oncology (Oncomet), Health Research Institute of Santiago (IDIS), Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, 15706 Santiago de Compostela, Spain 3 Instituto de Salud Carlos III, Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 28029 Madrid, Spain 4 Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma de Chile, Talca 3460000, Chile 5 Bioinformatics in Rare Diseases (BiER), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), 41013 Sevilla, Spain 6 Clinical Bioinformatics Area, Fundación Progreso y Salud (FPS), Hospital Virgen del Rocío, 41013 Sevilla, Spain 7 Institute of Biomedicine of Sevilla (IBiS, CSIC, Universidad de Sevilla), 41013 Sevilla, Spain 24 Immunotherapy in non small‐cell lung cancer: current status and future prospects for liquid biopsy Abstract Immunotherapy has been one of the great advances in the recent years for the treatment of advanced tumors, with non smallcell lung cancer (NSCLC) being one of the cancers that has benefited most from this approach. Currently, the only validated companion diagnostic test for first-line immunotherapy in metastatic NSCLC patients is testing for programmed death ligand 1 (PD-L1) expression in tumor tissues. However, not all patients experience an effective response with the established selection criteria and immune checkpoint inhibitors (ICIs). Liquid biopsy offers a noninvasive opportunity to monitor disease in patients with cancer and identify those who would benefit the most from immunotherapy. This review focuses on the use of liquid biopsy in immunotherapy treatment of NSCLC patients. Circulating tumor cells (CTCs), cell-free DNA (cfDNA) and exosomes are promising tools for developing new biomarkers. We discuss the current application and future implementation of these parameters to improve therapeutic decision-making and identify the patients who will benefit most from immunotherapy. Keywords Lung cancer · NSCLC · Liquid biopsy · Immunotherapy · CTC · cfDNA Capítulo 1 31 Table 2. Summary of liquid biopsy studies in NSCLC treated with immunotherapy. Bi-PAP bidirectional-pyrophosphorolysis-activated polymerization, bTMB blood tumor mutational burden, CAPP-seq cancer personalized profiling by deep sequencing, CK cytokeratin, ddPCR droplet digital PCR, MSAF maximum somatic allele frequency, NGS next-generation sequencing, OS overall-survival, PFS progression-free survival, qPCR quantitative polymerase chain reactions, SNVs single-nucleotide variants, tdEV tumor derived extracellular vesicles, TML tumor mutation load, tTMB tissue tumor mutational burden, TTP time to progression, WES whole exome sequencing. 4.2.1 CTCs isolation platforms In most of the current assays for the detection of CTCs, the platforms are based on the expression of epithelial markers such as EPCAM and cytokeratins. Both biomarkers are not expressed on mesenchymal cells; therefore, new CTC isolation platforms were developed [48]. Elena María Brozos Vázquez 32 Currently, the methods to detect and isolate CTCs are based on different aspects: (1) the surface presence of specific antigens (EpCAM is the most common), such as what is used in the CellSearch® system (Menarini), Epic platform (Epic sciences) or GILUPI CellColector (GILUPI); or (2) size and deformability, such as what is used in Parsortix (Angle), ISET (ISET, Rarecells Diagnostics), Vortex VTX-1 (Vortex Bioscience), and the ClearCell FX device (Biolidics). 4.2.2 CTCs and PD‐L1 expression In the field of immunotherapy, the expression of PD-L1 in tissue samples is the gold-standard biomarker to choose the treatment. Pilot studies in lung cancer have shown PD-L1 as a predictive factor. However, the PD-L1 status can be underestimated in small biopsies, which may not be representative of the entire tumor, causing some to not receive ICI treatment due to tissue sampling bias [49]. PD-L1 analyses in CTCs could be a good option to solve this problem. The possibility of measuring the expression of PD-L1 in CTCs before and during treatment has been analyzed in several studies (Table 2). Some authors have studied the relationship between baseline CTCs and overall survival, finding an association between a high number of CTCs and an increased risk of death and progression [50]. In addition, the presence of CTCs with positive PD-L1 expression (≥ 1% of cells) before ICI treatment was correlated with poor prognosis and survival [50, 51], and the persistence of PD-L1 on CTCs after 6 months of ICI therapy may represent the occurrence of tumor escape, which results in disease progression. It may also be a reflection of the aggressiveness of these CTCs, which may show characteristics of the mesenchymal phenotype (via EMT) [52]. In a stage-adjusted Cox model, it was concluded that a high proportion of PD-L1-positive cells was a predictor of mortality [51]. 4.2.3 CTCs vs. tissue The concordance between PD-L1 expression by CTCs and PD-L1 expression in tissue has been evaluated in several studies, showing controversial results [50, 53]. Iliè et al. showed a concordance of 93% between tissue and CTCs regarding PD-L1 expression in a cohort of 106 patients treated with chemotherapy [53], using the platform ISET. Dhar et al. also showed a good correlation between tissue and CTCs using a different isolation platform (Vortex isolation). However, the sample size in this study was only 4 patients [54]. Other studies reveal the opposite situation. Guibert et al., reported no correlation between CTCs and tissue in a cohort of 96 patients treated with nivolumab in 2nd line, isolating the CTCs with the ISET platform [50]. Recently, other two studies reported the same conclusion using two different approaches to isolate the CTCs (Microcavity array and Parsortix system) [55, 56]. It is important to remark that in these studies, the expression of PD-L1 was analyzed using different methods, therefore, different phenotypes of CTCs could be obtained in each study. Also, different antibodies and unbalanced populations were employed, so comparisons between them must be interpreted with caution. More studies are needed to assess a standardized method and PD-L1 antibody to detect and analyze CTCs. Capítulo 1 33 4.3 Other blood biomarkers There are other markers in the field of liquid biopsy with great potential for future clinical applications. Extracellular vesicles (EVs) are nanosized particles with membranes released by any cell type, including cancer cells. The most common subtypes of EVs are exosomes. Exosomes have a size between 50 and 150 nm, are very abundant, express proteins on their surface and contain several particles, such as proteins, nucleic acids, and lipids [60]. For this reason, exosomes are also a promising biomarker for analyzing the expression of PD-L1. One study in NSCLC patients concluded that PD-L1 expression in exosomes was correlated with disease progression, tumor size, lymph node status, metastasis, and TNM stage. However, no association was demonstrated between PD-L1 expression in exosomes and tissue [61]. In addition, the standardization of methodologies for exosome isolation remains a challenge [49]. Numerous studies have also reported a correlation between immunotherapy and the neutrophilto-lymphocyte ratio (NLR) [62]. The NLR is defined as the neutrophil count in blood divided by the lymphocyte count in blood and is a marker for the general immune response to distinct stress stimuli. Recently, a meta-analysis concluded that high NLR values were correlated with shorter PFS and OS in NSCLC patients under ICI treatment [63]. Other elements, such as circulating microRNA (miRNA), circulating RNA, platelets, and circulating proteins, have not been included in this review because they are at the early stages of use for tumor genotyping and more specifically for the use in immunotherapy of NSCLC patients [62]. 5. Conclusion and future perspectives Liquid biopsy is being incorporated as a useful procedure in many situations in oncology due to its minimal invasiveness and its great capacity to indicate cancer tumorigenesis. The search for new biomarkers will help us to manage our patients in a personalized way, something that constitutes a clear objective for the implementation of precision oncology. Over the past few years, several integrated biological strategies have been used to find noninvasive markers to predict response to the administration of immunotherapy in NSCLC. The existence of promising results from observational studies, together with the continued development of analysis platforms, has propelled cfDNA-based liquid biopsy diagnostics into the next developmental phase. Because of its potential to select populations for specific immunotherapy (alone or combined) and predict responders/nonresponders or the appearance of resistance, we foresee that cfDNA analysis will become increasingly important. In the case of lung cancer, cfDNA methods are particularly useful because they minimize the need for tumor tissue biopsy. The capability of cfDNA to guide the choice and follow the response to immune therapy is just beginning to be assessed. Recently, Chabon et al. established the potential of cfDNA for lung cancer screening, underlining the importance of risk-matching cases, and controls in cfDNA-based screening studies [64]. However, we cannot ignore that cfDNA isolation and analysis are still a challenge. Plasma cfDNA is a complex mixture of DNA from many sources, including germline, fetal, infectious, and malignant [31], but there are also mutations in the cfDNA of hematopoietic origin with risk being mistaken as tumor-derived mutations [65]. Because a large proportion of cfDNA is derived from peripheral blood cells, the impact of clonal haematopoiesis represents a relevant limitation in the implementation of Elena María Brozos Vázquez 34 liquid biopsy for analysing cfDNA. Paired plasma–peripheral blood cells sequencing should be implemented as the standard practice for NGS genomic analysis of cfDNA to prevent misinterpretation of results [66]. Moreover, cfDNA is not tumor-specific and its measurement is prone to false positive results. In fact, the level of cfDNA can increase under some conditions, such as inflammation, infection, and even exercise [30]. The sensitivity and specificity of cfDNA measurement are also affected by the variability of ctDNA, which may vary through tumor evolution, have different origins (primary tumor vs. metastasis; tumor heterogeneity) and be affected by different treatments. We are in a situation in which there are rapidly evolving technologies supporting the use of liquid biopsy, while there is a need for standardization procedures for collecting and processing cfDNA samples. Another aspect to standardize should be the size of the panels for appraising specific cancer mutations and genomic metrics (MRD and TMB), since they vary greatly across assays. On the other hand, CTCs are intact viable cells with tumor-specific information and can also enable cancer diagnosis and treatment evaluation. Analyses of the presence or absence of proteins, such as PD-L1 or PD-1 on the surface promise to be good options in the future to guide and select treatment, but the strategies will need to be validated in robust studies [49]. In addition, due to methods that allow the preservation and capture of intact CTCs, single-cell analyses or cluster analyses are possible. Singleor cluster-cell characterization of CTCs will allow more precise characterization of the entire cancer in each patient. RNA and DNA analyses are possible and could show the intertumoral and intratumoral heterogeneity in each patient [67]. In contrast, a good and standardized platform to capture CTCs and rigorous validation remain a challenge. Owing to the effects of EMT, a new marker to detect tumor cells undergoing this transition is needed. Recent studies have focused on the peripheral blood T-cell receptor (TCR) repertoire, as an emergent biomarker to select the most suitable ICI treatment [68]. The analysis of T-cell clonality may reveal the degree of tumor-antigen driven T-cell expansions and help to understand mechanisms underlying T-cell tolerance to cancer antigens. Recently, Reuben et al. showed the heterogeneity of tissue T-cell repertoire in localized NSCLC [69], proposing a positive relation between T-cell density and clonality. They demonstrated an association between higher T-cell density in the blood and improved outcome following surgery. These findings suggest that the peripheral T cell repertoire in NSCLC patients may be reflective of increased systemic immunity. TCR sequencing might be applicable for the treatment selection in patients with EGFR mutations by evaluating the proportions of TCRβ clones in the tumor. Miyauchi et al. provided relevant information for understanding the molecular mechanism behind EGFR-mutant patients [70], showing that the low clonal T-cell expansion in NSCLC with EGFR mutations might be a critical factor related to the unfavorable response to ICI. Tcell clonality in the circulation may have predictive value for antitumor responses from checkpoint inhibition. However, since there are very preliminary results, continue this line of research is essential in order to know if it has practical application in the clinic. In conclusion, liquid biopsy through CTCs and cfDNA analyses could be a promising tool for diagnosis, selection of ICI treatment and monitoring of NSCLC patients under immunotherapy. 35 CAPÍTULO 2 Immunotherapy in patients with brain metastasis: advances and challenges for the treatment and the application of circulating biomarkers 36 Immunotherapy in patients with brain metastasis: advances and challenges for the treatment and the application of circulating biomarkers E. M. Brozos-Vázquez 1,2,3,4*, C. Rodríguez-López 1,3,4, A. Cortegoso-Mosquera 1,3,4, S. LópezLandrove 3 , L. Muinelo-Romay 3,4, J. García-González 1,3,4 , R. López-López 1,3,4* and L. LeónMateos 1,3,4 1 Medical Oncology Department, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain, 2 Medical Oncology Department, Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña, Santiago de Compostela, Spain, 3 ONCOMET, Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago, Santiago de Compostela, Spain, 4 CIBERONC, Madrid, Spain 37 Immunotherapy in patients with brain metastasis: advances and challenges for the treatment and the application of circulating biomarkers Abstract The central nervous system (CNS) is one of the most frequent metastatic sites of various cancers, including lung cancer, breast cancer and melanoma. The development of brain metastases requires a specific therapeutic approach and is associated with high mortality and morbidity in cancer patients. Advances in precision medicine and the introduction in recent years of new drugs, such as immunotherapy, have made it possible to improve the prognosis of these patients by improving survival and quality of life. New diagnostic techniques such as liquid biopsy allow real-time monitoring of tumor evolution, providing molecular information on prognostic and predictive biomarkers of response to treatment in blood or other fluids. In this review, we perform an exhaustive update of the clinical trials that demonstrate the utility of immunotherapy in patients with brain metastases and the potential of circulating biomarkers to improving the results of efficacy and toxicity in this subgroup of patients. Keywords solid tumors, brain metastasis, biomarkers, immunotherapy, liquid biopsy. Elena María Brozos Vázquez 38 1. Clinical challenge The brain is one of the most frequent sites of metastases from some types of solid tumors, such as lung, breast cancers and melanoma. The presence of disease in the brain represents a dismal prognosis and devastating complications for the quality of life of oncological patients and can lead to a different evolution in relation to the histological and molecular type, and clinical characteristics of the tumor. Recent advances in Oncology have improved survival rates, with the incidence of brain metastases now estimated at around 20%-40% (1,2). Actually, in recent years overall survival in these cancers has increased significantly due to the introduction of new drugs, including immunotherapy. This treatment has been used in routine clinical practice since phase III clinical trials have demonstrated its efficacy in advanced tumors such as lung cancer (3,4) or melanoma (5,6). However, there is no extensive literature on the subgroup of patients with cerebral or leptomeningeal disease because these patients have traditionally been excluded from the clinical trials. The mainstays of the treatment in cases with secondary brain involvement are surgery and stereotactic radiosurgery if the patient has a single brain metastasis (BM) or limited number; and radiotherapy and symptomatic management with corticosteroids and/or antiepileptic drugs on patients with extensive number or volume of brain lesions. Classical chemotherapy has played a limited role due to its limited passage through the blood-brain barrier. However, targeted therapy is effective in the presence of oncoaddictive molecular alterations, and immunotherapy is nowadays crucial in the landscape treatment of lung cancer and melanoma. Moreover, we already know the fact that a drug could be effective in controlling metastatic disease at the systemic level, but not necessarily imply that it is active on synchronous disease in the central nervous system (CNS). On the other hand, the genetic characteristics of the primary tumor and different metastatic sites might differ (7,8), and the response to the same treatment may therefore be different. Genetic, epigenetic, and transcriptomic changes in brain metastases lead to changes in the tumor microenvironment, making this disease immunologically more inactive with respect to the primary tumor (9-11). Besides, there is an unmet clinical need for discovering biomarkers that can help to predict a high risk of brain metastases in certain tumor types, as well as to individualize management once they are present. We have the GPA (Graded Prognostic Assessment) prognostic tool whose objective is to estimate survival in patients with lung cancer based on clinical variables, without considering molecular factors, which nowadays must be considered due to the demonstrated relevance of molecular biology in cancer (12). Given the complexity of obtaining a biopsy of brain tissue, the development of non-invasive biomarkers is of high relevance in the context of secondary brain lesions. The aim of this review is to analyze published data on the efficacy of immunotherapy as a treatment for patients with metastatic brain disease, focusing on lung, breast, and melanoma tumors. We make an overview of the most relevant clinical trials performed to explore the efficacy of immunotherapy to treat brain metastasis and comment on the current knowledge and the potential of liquid biopsy-based biomarkers to predict the therapy response and monitor the disease evolution. Capítulo 2 39 2. Immunotherapy in lung cancer patients with brain dissemination Lung cancer (LC) is a heterogeneous disease, histologically and molecularly (13,14). There are two main subtypes of LC, small cell lung carcinoma (NSCLC) and small cell lung carcinoma (SCLC), accounting for 76% and 13%, respectively. LC remains the most common cause of cancer-related death (15). However, in the last decade, mortality associated with NSCLC has decreased due to a reduction in the incidence of LC and an increase in the overall survival of patients with NSCLC (16). Furthermore, the improvement in LC survival is related to a deeper understanding of the genomic profile of NSCLC that has allowed progress in LC treatment in two directions: on the one hand, the introduction of targeted therapies against mutations in driver oncogenes, and, on the other hand, immune checkpoint inhibitors (ICIs) (16). 2.1 Non-small cell lung cancer BMs are common in patients with advanced NSCLC and occur in 20-30% of patients (17,18). Currently, treatment of cerebral disease is based on surgery, holocranial radiotherapy (WBRT) or stereotactic radiosurgery (SBRT) (19,20). However, this practice is changing in patients with NSCLC and driver oncogene mutations, as tyrosine kinase inhibitors have shown good CNS penetrance and a high response rate of intracranial disease (21-24). Immunotherapy with inhibitors against the programmed death 1 (PD-1) receptor, its ligand (PDL1) or cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) has revolutionized the therapeutic scenario for patients with advanced NSCLC (aNSCLC) without driver mutations (25). Today, the current therapeutic approach to an individual patient with aNSCLC is based on tumor expression of PD-L1. Thus, in tumors with 50% PD-L1 expression, the use of ICIs as monotherapy is an effective option (26-28). While the combination of ICI plus platinum-based chemotherapy has been shown to improve efficacy parameters regardless of the percentage of PD-L1 expression (29-32). Although most of the clinical trials in this setting allowed the inclusion of patients with pre-treated and clinically asymptomatic CNS metastases, there are few data about the efficacy of the immunotherapy at the CNS level (Table 1). Elena María Brozos Vázquez 40 Table 1. Outcomes of ICI in the treatment of NSCLC with basal BMs. In the CheckMate 817 clinical trial (33), the efficacy of nivolumab plus ipilimumab was prospectively evaluated in first-line treatment of special populations with NSCLC, including 49 patients with untreated brain metastases. In this subgroup the median OS was 12.8 months, with a 3-year survival rate of 21%. In addition, the median PFS was 2.8 months, with a 3-year PFS rate of 14.2% (42). To reinforce these data, post-hoc analysis data with a minimum fiveyear follow-up of patients with baseline brain disease included in the CheckMate 227 (Part 1) clinical trial have recently been published (34). In this population, the treatment with the combination of nivolumab plus ipilimumab prolongs OS versus treatment with platinum-based chemotherapy in those patients with CNS metastases at baseline. In addition, less patients with cerebral disease at the inclusion developed new brain metastases with nivolumab and ipilimumab versus chemotherapy (4% and 20%, respectively) (34). Following this treatment rationale, the nivolumab plus ipilimumab combo was combined with 2 cycles of platinum-based chemotherapy in the CheckMate 9LA clinical trial, which included 101 patients with brain metastases (35). In a post-hoc study of this population, the combination of nivolumab plus ipilimumab chemotherapy showed a hazard ratio for the risk of death of 0.43, with a median OS of 19. 3 months versus 6.8 months in patients treated with chemotherapy alone; plus, a 2-year alive rate of 35% (35). Capítulo 2 47 or leptomeningeal disease, to receive nivolumab monotherapy. The best intracranial response at 12 weeks or later was 51%, 20% and 6% respectively in each cohort. PFS at 24 months was 49%, 15% and 6%, respectively. OS at 24 months was 63%, 51% and 19% respectively. The phase II CheckMate 204 study enrolled asymptomatic patients to receive nivolumab and ipilimumab every 3 weeks, 4 doses, followed by nivolumab every 2 weeks (79). The intracranial clinical benefit rate (defined as the percentage of patients had stable disease at 6 months, complete or partial response) was 57%, with 26% complete responses. The combination seemed to prevent intracranial progression for more than 6 months in 64% of patients (150). The treatment with ipilimumab and nivolumab achieved higher intracranial response rates in the different clinical trials compared to anti-PDL1 monotherapy (nivolumab or pembrolizumab) at the cost of higher toxicity (Table 2). Table 2. Clinical Trials with immunotherapy in patients with melanoma and BM. Elena María Brozos Vázquez 48 5. Liquid biopsy to characterize brain metastases and guide immunotherapy. There is a clear interest in addressing the study of liquid biopsy in tumors that have metastasized to the brain. Surgery, in patients with BM located in eloquent or deep brain area, could be difficult and may cause neurological sequelae. Therefore, the possibility of characterizing the disease non-invasively represents a window of opportunity to guide the diagnosis, treatment, and monitoring of the therapeutic response when there is brain dissemination. Likewise, the focal study of a brain lesion by traditional biopsy may not fully capture intertumoral heterogeneity (81). In addition, it is known that BM may have different genomic alterations than primary extracranial tumors, and it is important to analyze genomic alterations specific to brain lesions in order to select the optimal therapeutic approach (72). To overcome these limitations, the study of circulating markers provides us with a more global vision of the molecular features of different regions within the same lesion and the possibility of approaching the study of BM in a non-invasive way (82). In the era of precision oncology, the ability to analyze liquid biopsies represents an important element to guide the selection of the treatment and supervise tumor evolution in real time. Any biofluid containing tumor material that can be molecularly characterized, represents a liquid biopsy. This term therefore includes blood, but also other corporal fluids like saliva, urine, bile, pleural effusion, or cerebrospinal fluid, among others. The tumor material present in these biofluids consists mainly of circulating tumor cells (CTCs), nucleic acids (cNAs) including DNA and RNA, and circulating extracellular vesicles (cEVs). Through the characterization of these circulating elements, we can obtain valuable information on mechanisms that favor tumors dissemination and progression, also in the context of brain lesions (82) (Figure 1). Knowledge about the application of each of these tumor elements in the context of BM is described in more detail below. Figure 1. Brain metastases shed to blood or CSF, and biomarkers could be studied (ctDNA, CTCs or EV). CSF, cerebrospinal fluid; ctDNA, circulating tumoral DNA; EV, extracellular vesicles.! Capítulo 2 49 5.1 Circulating tumor DNA Free tumor DNA can be released from primary tumor cells, CTCs, micrometastases, or macrometastases. Most of this DNA comes from tumor cells that enter apoptosis or necrosis and release their DNA with varying degrees of fragmentation into the bloodstream. The fraction of ctDNA in the total free circulating DNA (cfDNA) released by healthy cells is usually low, less than 1%, but can vary from less than 0.1% to more than 90% (83). ctDNA is characterized by the presence of somatic genetic alterations such as SNVs (single-nucleotide variants), CNVs (copy number variants) or Indels, as well as a tendency to be more fragmented, showing sizes that ranks from 90 to 170 base pairs (84). ctDNA is also known to reflect the epigenetic signatures of nuclear DNA (85, 86). In order to detect ctDNA, it is necessary to apply highly sensitive techniques that can target a small panel of mutations such as digital PCR or BEAMing or cover a large panel of genes and even the whole exome/genome (NGS, Next-generation Sequencing; WGS, Whole-genome sequencing, or WES, Whole-exome sequencing). Generally, higher genome coverage is associated with lower sensitivity of the analysis (87). There is already a great deal of evidence on the value of cfDNA analysis to genotype advanced stage tumors for personalized therapy selection, but also as a tool to monitor response to treatment or detect the presence of minimal residual disease (MRD) post-surgery and guide adjuvant treatment. In fact, the FDA (Food and Drug Administration) has approved several diagnostic tests to detect EGFR or PIK3CA mutations in lung and breast tumors. The FoundationOne Liquid CDx and Guardant360 liquid CDx panels (using free circulating DNA, cfDNA) have also recently been approved as companion diagnostic tests for several targeted therapies and immunotherapy (88). In the context of immunotherapy treatment, numerous studies have demonstrated the possibility of analyzing both tumor mutational rate and microsatellite instability (MSI) status in circulating free DNA samples, two biomarkers that predict response to checkpoint inhibitors (89). On the other hand, TMB has traditionally been tested in tumor tissue samples. However, Gandara et al. reported an analysis of TMB by NGS in a subgroup of patients from the POPLAR and OAK studies, comparing tumor sample with pretreatment plasma in the same patient cohort (90). A positive correlation (0.64 Spearman rank) was found between tissue and blood sample, so that plasma TMB (bTMB) by liquid biopsy is considered a predictive biomarker of progression-free survival in patients treated with Atezolizumab monotherapy, when the value is higher than 16 mutations per megabase, as a clinically meaningful and technically robust threshold (90). A biomarker analysis with bTMB was also conducted in the phase III MYSTIC study, demonstrating its association with OS, PFS and ORR in patients treated with ICIs (91). Although blood is the most used fluid for the study of cfDNA, several studies have shown that the concentration of tumor free DNA in brain and central nervous system lesions is higher in cerebrospinal fluid (CSF), which could be the preferred biofluid for the molecular characterization of these lesions, regardless of their origin (42,92). This is because CSF is in more direct contact with brain lesions, so shedding may be more evident in this fluid by a contiguity mechanism (93). For example, Pan et al. analyzed cfDNA samples from plasma and CSF of 7 patients with brain tumors, including metastatic lesions, using a combined digital PCR (polymerase chain reaction) and sequencing strategy and found a higher concentration of somatic mutations characteristic of primary tumors such as EGFR or PI3KCA in the CSF (94). Elena María Brozos Vázquez 50 Of note, a postmortem analysis of patients with BCBM in which ctDNA was evaluated in CSF identified truncal mutations from the tumors of origin but also variants unique to the brain lesions, highlighting the potential for diagnosing this type of lesion in breast tumors (92). Using targeted sequencing, Liang et al. analyzed the somatic variants present in CSF from 21 patients with glioma and 7 patients with cerebral disease with primaries located mainly in the lung and digestive tract (95). The results of the study showed that the genes altered in primary and metastatic brain tumors are different. Specifically, the ctDNA of metastatic brain lesions was characterized by the presence of alterations in ALK and MDM2. The authors suggest that this differential profile could be of interest for the diagnosis and therapy of BM (95). Rubio-Pérez et al. characterized the immune composition of brain lesions and matched CSF by means of single-cell RNA sequencing and also genotyped the T cell receptors+ (96). The results obtained showed that tumor immune infiltration and specifically CD8+ T cell infiltration can be assessed in CSF samples (96). Consistently, the same T cell receptor clonotypes were present in brain lesions and CSF, demonstrating immune cell exchange between the tissue and the CSF (96). Overall, these data support the use of CSF to analyze the immune composition in a minimally invasive sample and represent a promising tool to anticipate the response to ICI (96).There is another in which single cell RNA sequencing (scRNASeq) was performed to characterize cell types in CSF from 19 patients with leptomeningeal metastases from different solid tumors, mostly breast cancer, who received treatment with ICIs, found a significant increase in CD8+ T lymphocyte population and higher levels of IFN-g after treatment in the patients who obtained the greatest clinical benefit (97). As it was previously commented, there are currently active treatments to treat metastatic brain lesions such as immunotherapy or targeted therapies, such as ALK, MEK, BRAF or HER2 inhibitors. Studies have shown that clinically relevant variants in these genes can be detected by studying ctDNA in CSF from lung, melanoma, or breast tumors, among others (92,94,98). As with these targeted therapies, the study of ctDNA in CSF samples has shown value in determining the tumor mutational burden (TMB) which, as mentioned above, is a predictive biomarker of response to immunotherapy (89). Thus, Guao et al. described a high correlation between TMB measured in tumor DNA present in CSF and tumor tissue of patients with gliomas, and the result may be transferable to the characterization of BM (99). Despite the lower concentration of ctDNA in the blood released by cerebral metastatic lesions, several studies have demonstrated the possibility of genotyping these lesions using this strategy. For example, in patients diagnosed with advanced lung cancer with BM, EGFR status has been successfully characterized in plasma ctDNA, showing good levels of concordance with the original primary tumor (100). Also, in plasma DNA from BC patients with brain lesions, Pangeni et al. have recently demonstrated the presence of differentially methylated markers (CTD-2028 M8, CCDC8, miR3193 and miR124-2) already present in primary tumors, showcasing that plasma can provide valuable information also in this patient profile (101). On the other hand, in the BREAK2 clinical trial, patients with BRAF-mutated metastatic melanoma were evaluated for response to oral dabrafenib. This study included a comparative analysis of BRAF status in cfDNA in plasma and tissue. Data obtained from plasma analysis showed good concordance with tissue and predictive value for response, including patients with brain lesions (102). Capítulo 2 51 In addition to point mutations, numerous studies have demonstrated the possibility to analyze both TMB and MSI in plasma cfDNA and select immunotherapy in patients with advanced tumors regardless of metastatic location, although it is important to determine the possibility of false negatives (90, 103). ctDNA monitoring may be helpful in distinguishing progression during immunotherapy treatment, although no studies have addressed this utility particularly in patients with BM (104, 105). Exceptionally, in a study published by Lee et al. the role of ctDNA in monitoring melanoma patients with BM treated with anti-PD1 immunotherapy was examined (106). They analyzed BRAF, NRAS mutations and c-KIT in cfDNA in serial plasma samples during the first 12 weeks of treatment and assessed both intracranial and extracranial disease using the RECIST criteria. Of the 72 patients included, 13 had intracranial metastases exclusively and 59 had intra and extracranial metastases. Detection of ctDNA was 0% and 64%, respectively (106). Detection of ctDNA in plasma was associated with disease volume, while absence of ctDNA detection during treatment was associated with extracranial but not with intracranial response (106). The median OS in those patients with undetectable ctDNA versus detectable ctDNA at baseline was 39.2 and 10.6 months, respectively (106). These results suggest that ctDNA could be considered a strong prognostic biomarker in patients with melanoma and cerebral disease, especially in the subgroup with extracranial disease. In addition, our research group demonstrated the value of monitoring total cfDNA levels in 46 patients with non-small cell lung cancer who received antiPD1 treatment but only 3 patients in this cohort had cerebral metastatic lesions (107). 5.2 Circulating tumor cells The development of metastasis is a multistep procedure during which tumor cells must gradually detach from the primary tumoral lesion and locally occupy the stroma and surrounding tissues to reach the circulatory or lymphatic system. At this point, intravasated tumor cells or CTCs represent a valuable element in understanding the process of malignant dissemination but also as a reflection of tumor burden and the dynamic evolution of tumors (108,109). The low proportion of CTCs in the bloodstream together with the molecular heterogeneity that characterizes these cells is the principal challenge for CTCs isolation and detection. All technologies isolate these cells focusing on differential features between CTCs and blood cells, such as protein expression, morphology, and biophysical properties. These technologies can be categorized based on the method of isolation as antigendependent or antigen-independent (110). The most employed strategy is usually carried out using antibodies that recognize epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) conjugated with magnetic nanoparticles (111). Among the current EpCAM-based technologies, CellSearch® system is the “gold standard” for the CTC detection methods (112). Antigen-independent methods are based on the physical properties of CTCs such as density, electric charges (DEP, dielectrophoresis), size and deformability, among others. The principal advantage in comparison with the antigen-dependent methods is the isolation of CTCs with a low epithelial phenotype. Size-based methods are the most common antigen independent strategies. They are since tumor cells are larger than blood cells and they can be isolated using filter-based strategies such as ISET assay microfluidic chips, Parsortix system and methods based on centrifugal forces (56,113,114). Independently of the isolation strategy, CTCs main clinical utility has been demonstrated in patients with advanced neoplasia where its validity as a prognostic biomarker has been demonstrated in numerous studies with different solid tumors, such as breast, colon, prostate, Elena María Brozos Vázquez 52 or lung cancer (115). In addition to its value as a prognostic and monitoring biomarker, the molecular characterization of the population of CTCs present in different biofluids is a very useful tool when tumor lesions are not accessible, as in the case of BM. This molecular characterization has provided a better comprehension of the mechanisms that facilitate the appearance of BM. Thus, for example, analyzing CTCs from lung cancer patients in comparison with the original tumor and metastatic disease describes the appearance of mutations in genes involved in the response to cellular stress, such as Keap-1, Nrf2 and P300, which are key players in the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway and which could provide a survival mechanism for CTCs when they are in the process of distant tumor dissemination (116). On the other hand, Boral et al. characterized the population of CTCs associated with the presence of BM in patients with advanced breast cancer (117). This study identified the activation of an important Notch signaling pathway, which is associated with the appearance of brain lesions, as well as the identification of new inflammatory and immunomodulatory networks, whose role in immune evasion could favor the appearance of brain metastases (117). Prior to this work, the same research group associated the existence of a HER2+/EGFR+/HPSE+/Notch1+ population in tumor lines generated from patient CTCs with the generation of BM (118). Another relevant study characterizing CTCs from patients with advanced breast cancer identified cyclooxygenase COX2 (PTGS2), the epidermal growth factor receptor (EGFR) ligand HBEGF and the alpha2,6-sialyltransferase ST6GALNAC5 as key players for tumor cells to cross the blood-brain barrier (119). Finally, also in breast cancer, the characterization of CTCs in the subtype named triple negative breast cancer patients, which frequently metastasize to the brain, identified HER2 positivity as a hallmark of tumor progression (120). In addition to the study in blood, the presence of CTCs has been described in CSF in patients with brain dissemination. For example, Ruan et al. established an efficient procedure for collecting CTCs from CSF in five patients with leptomeningeal metastases of lung adenocarcinoma and characterized the CTCs at the transcriptomic level (121). These cells showed increased expression of genes regulating cell adhesion mechanisms such as MMP7, CLDN7 and ICAM1, as well as genes associated with a primarily epithelial phenotype (121). The detection of CTCs in CSF also represents a diagnostic tool of great interest to confirm the presence of leptomeningeal disease in tumors of different origin (122). Also, Darlix et al. analyzed the presence of CTCs in 40 breast cancer patients with suspected leptomeningeal metastases obtaining a good diagnostic sensitivity (100%) and specificity (78%) (123). Despite all these studies demonstrating the value of CTCs analysis to characterize primary tumors located at central nervous system or BM, their utility to predict or monitor the activity of immunotherapy in this tumor context is still unexplored. 5.3 Extracellular vesicles Extracellular vesicles (EVs) are known to play a relevant role as communicative mediators favoring the preparation of the premetastatic niche, including BM (124, 125). In addition to this communicative role, the analysis of Evs levels and their molecular cargo in different body fluids represents a promising strategy to obtain a liquid biopsy from the tumor (126). Besides, Capítulo 2 53 tumorsecreted Evs have the intrinsic ability to breach the brain barrier and therefore can participate in the brain colonization by cells originated from other tumor location (127). Evs isolation can be addressed with different strategies based on their biochemical composition, size, and density, among other properties (128). The most employed strategies are ultracentrifugation, ultrafiltration, and immunoaffinity capture, size exclusion chromatography and density gradient separation. Ultracentrifugation employees high speed centrifugation to separate the Evs while size exclusion chromatography and density gradient isolation separate Evs from other debris. Affinity-based methods for EV isolation are known to produce highly specific isolation results. Immunoaffinity strategies are based on the use of antibody-coated beads to specifically recognize surface antigens (129,130). The selection of the isolation method should be mainly made based on the sample requirements for downstream analyses. Taking this into account the study of Evs in plasma or CSF from patients with BM has gained interest in the last years. Thus, a recent work by Carretero-González et al. compared the levels of plasmatic Evs in patients with different solid tumors with or without BM and described lower number of cEVs levels while higher protein concentration in patients with brain affectation (131). In particular, melanoma patients with cerebral disease have decreased STAT3 activation and increased PD-L1 content in plasma Evs. In this sense, release of Evs PD-L1+ has been described as a resistance mechanism in patient treated with immune checkpoint inhibitors, thus the presence of Evs PD-L1+ in patients with BM may potentially have an impact on the response to immunotherapy (132). In addition to the cEV levels or the total Evs protein content different molecules have been described in plasma cEVs as potential biomarkers or biological mediators in tumors with brain dissemination. For instance, different miRNAs contained in cEVs have shown to be specifically increased in tumors with BM. Thus, Wei and collaborators described the presence of MicroRNA-550a3-5p in plasma Evs from lung cancer patients as an important factor promoting BM thanks to the direct regulation of YAP1 (133). Also in lung cancer patients, the characterization of Evs associated miRNAs present in CSF samples served to identify miR34b-3p and miR-335-5p as specially expressed in lung cancer patient with brain dissemination (134). Also, in CSF high levels of miR-200 family members were found in BC patients with brain secondary disease (135). In a recent study, Catelan et al. compared a panel of genes in serum exosomes isolated in tumor with brain dissemination and high-grade gliomas, finding a common increase of miR-21 levels in both cancer groups in comparison with healthy controls and a specific increment of miR-124-3p in the tumors with brain dissemination (136). Another non-coding RNAs such as LncRNA XR_429159.1 or LncRNA GS1-600G8.5 expressed in Evs were reported as relevant for the brain barrier disruption in the context of SCLC and BC (137, 138). Also, XIST LncRNA has been described associated with brain dissemination in BC patients. It was found to be downregulated in BM and this downregulation was associated with increased exosomal miR-503 secretion, which regulates microglia polarization and suppresses T cell growth (139). All these data exemplify the interest of cEVs in the context of BM to better understand the mechanisms favoring brain colonization but also in the modulation of the response to therapy, especially in the context of immunotherapy. Elena María Brozos Vázquez 54 6. Conclusions and future directions In recent decades, solid tumors have made significant advances in the treatment of advanced disease, increasing survival and quality of life. New treatments such as immunotherapy and targeted therapy are the cause of this improvement. However, there are still scenarios, such as metastatic disease at the brain level, which remain a challenge due to high morbidity and mortality. Traditionally, antineoplastic drugs do not penetrate brain tissue because of the bloodbrain barrier. In this review, we summarize results obtained in patients with brain disease recruited in the principal studies evaluating immunotherapy strategies, who represent a small cohort of patients due to the low representation of these patients in phase III clinical trials and the limited number of specific studies in this population. Derived from this factor, the present review has the limitation of the small number of patients, the heterogeneity of the population which includes limited and extensive cerebral disease and diverse types of primary tumors. In addition, we noticed that this group of patients is not always described in the articles, which makes it difficult to extrapolate to clinical practice. Besides is important to mention the fact that our work is not a systematic review, but a narrative comprehensive qualitative study. Although these limitations the review highlights the benefit of using immunotherapy to treat breast, lung, and melanoma tumor with BM, opening new therapeutic options to manage disseminated disease. However, immunotherapy has some serious toxicity that must be monitored and treated. Therefore, it is crucial to be able to accurately select patients who will benefit most of the immunotherapy at brain level and avoid endangering vital organs. In this clinical context, the application of liquid biopsy may have special relevance, as a tool that avoids invasive procedures and provides molecular information in real time for the monitoring of the disease throughout its evolution. As it was detailed in this review, there is evidence supporting the utility of liquid biopsy analyses for immunotherapy selection and monitoring in lung, breast, and melanoma cancers. Combined use of immunotherapy and liquid biopsy have a proven benefit, making them important achievements in the therapeutic and diagnosis arsenal of the mentioned tumors. Several works have demonstrated that liquid biopsy analysis (mainly CSF and blood markers) in the context of BM from breast, lung, and melanoma tumors, allow to molecularly characterize the disease taking into account the tumor evolution and heterogeneity and determine the status of well stablished immune biomarkers such as PDL1, TMB or MSI condition. In this sense, cfDNA analyses in CSF have demonstrated special value to interrogate the tumors located in CNS, including BM. However, our review showed the general lack of information about the specific utility of the cfDNA assessment and other markers such as CTCs and EVs in patients with BM receiving immunotherapy. In this regard, it is important to mention that all the phase III trials described in advanced tumors (NSCLC, SCLC, breast, melanoma) were not associated with translational studies, so there is no analysis of liquid biopsy that could serve as secondary endpoints. This makes it difficult to draw conclusions about the behavior of circulating biomarkers during immunotherapy treatment, but at the same time it creates the need and challenge to improve the design in future clinical trials focused on a subgroup of patients of particular concern due to their poor prognosis. Of note, the present review englobes for the first time the results regarding the combined value of immunotherapy and liquid biopsy in the context of BM and provides comprehensive knowledge that might open the door to the creation of specific clinical trials to interrogate value of circulating biomarkers for the diagnosis, prognosis, and monitoring of the response to immunotherapy in patients with brain lesions. Fortunately, there are ongoing studies and preliminary results in lung, breast, and melanoma cancer, which aim to provide more molecular Capítulo 2 55 information in this setting to better meet the needs of this subgroup of patients. Further research is warranted to make progress in the application of immunotherapy to treat solid tumors with BM and liquid biopsy to guide the treatment in a cohort of patients with poor therapeutic alternatives. 56 CAPÍTULO 3 Clinicopathological Profiles Associated with Discordant RAS Mutational Status between Liquid and Tissue Biopsies in a Real-World Cohort of Metastatic Colorectal Cancer Capítulo 3 63 Elena María Brozos Vázquez 64 Table 1. Clinicopathological characteristics of the mCRC patients included in the study. Table 1 contains the clinical and pathological information of the 366 patients and samples recruited for the study. a Stage at the first diagnosis of CRC disease. b,c Surgery performed previous to plasma collection. d Systemic treatment received previous to plasma collection. e Anti-EGFR therapy received after plasma collection at any line of treatment. f A total of 55% (166/303) of the RAS mutations of the 303 tissue samples successfully genotyped with the SoC techniques were found in KRAS gene, and 3% (7/303) were found in NRAS gene. g BEAMing analysis showed KRAS mutations in 45% (165/366) of plasma samples and NRAS mutations in 5% (18/366). Capítulo 3 65 All mCRC patients had at least one blood liquid biopsy taken in the metastatic stage. At blood biopsy collection, 60% of patients had undergone surgical resection of the primary tumour and 12% had undergone resection of metastasized tumour lesion due to any local complication. A total of 69% of patients were chemotherapy naïve, 22% had received adjuvant chemotherapy after primary tumour resection, and 15% had received systemic chemotherapy (+anti-VEGF in three of the cases) for palliative or life-extending care. Thirtythree percent of patients received anti-EGFR therapy after blood sample collection. 3.2. Concordance of RAS Mutational Status between Analyses Based on Solid Tumour Tissue and Analysis Based on Plasmatic ctDNA RAS mutations were found in 47% of solid tumour tissue samples genotyped with SoC techniques and in 49% of plasma ctDNA samples analysed by BEAMing ddPCR (Table 1). The overall concordance of the RAS mutational status between the tests in 301 mCRC samples with genotyping information in both solid tumour tissue and plasma liquid biopsies was 84.4%, CI 79.9–88.1 (Cohen’s Kappa = 0.69; 95% CI 0.61–0.77), with a sensitivity of 81.3% and a specificity of 88.5% (Table 2). The highest overall concordance ratios of the study were observed in the mCRC population with multiple metastatic sites when the liver was present (89.7%, CI 84.8–93.2), in patients with synchronous mCRC that was not previously treated with resection of the primary tumour (newly diagnosed synchronous mCRC) (90.2%, CI 83.6–94.3) and in patients with mCRC originating in the left colon (91.3%, CI 85.0–95) (Table 2). Elena María Brozos Vázquez 66 Table 2. Concordance of RAS mutational status between SoC analysis in tumour tissue samples and ctDNA analysis in tumour tissue samples and ctDNA analysis using BEAMing technology. Table 2 includes information on 301 patients with available RAS status in solid tumour tissue and plasmatic ctDNA samples. 1 Overall percentage agreement; 2 positive percentage agreement; 3 negative percentage agreement; 4 Cohen’s kappa coefficient (95% confidence interval); 5 odds ratio (95% confidence interval); 6 n.s. = p-value > 0.05. a Discordant outcomes between SoC and BEAMing analyses were observed in 47 (15.6%) of 301 patients with RAS status available in tumour tissue and in plasma ctDNA samples: 10.6% of cases showed exclusive RAS mutations in the tumour tissue sample, and in 5% of cases, RAS was found to be mutated in the ctDNA sample of a patient with a wild-type RAS genotype in the tumour tissue sample. b Information about the location of the primary tumour was available in 288 patients. Patients with mixed locations were excluded from this analysis. Left Colon refers to primary tumours located at the descending and sigmoid colon. Right Colon refers to primary tumours located at the cecum or the ascending and transverse colon. All ORs were calculated in reference to the left colon location. c Information about surgical resection of tumour tissue was available in 299 cases. The time of presentation of the metastatic disease was known in 299 patients. Not, patients diagnosed with synchronous mCRC who had not undergone surgery or any treatment before the collection of the liquid biopsy sample. Yes, patients who had been treated with resection of the primary tumour before the collection of the liquid biopsy sample (33 patients had also been treated with resection of metastatic tissue). Synchronous refers to cases diagnosed with synchronous mCRC who had undergone resection of the primary tumour before the collection of the liquid biopsy sample (17 patients had also been treated with resection of metastatic tissue). All patients with metachronous metastases had undergone resection of the primary tumour (16 patients had also been treated with resection of metastatic tissue). ORs were calculated in reference to cases with no resection. d Site of metastases. Numbers included mCRC cases with (Yes) or without (Not) the metastases at the indicated site. ORs were referred to cases with the specified metastatic site. e Number of metastatic sites was obtained in 292 cases. Multiple sites include all cases showing metastases in more than one anatomical location. All ORs were calculated in reference to cases with multiple metastatic sites. n.s. indicates not significant p-values. 3.3. Association of the mCRC Clinicopathological Features with Discordance of RAS Mutational Status between Analysis Based on Tumour Tissue and Analysis Based on Plasmatic ctDNA We used logistic regression analyses to decipher the clinicopathological characteristics with the most significant association with discordance in our mCRC cohort (Table 2). The metastatic pattern was a main factor predictor of the discordance between assays. In patients with metastases at more than one anatomical location, the absence of liver metastases significantly increased the probability of discordance (OR = 2.7, 95% CI [1.4–5.3]; p-value = 0.003). We observed that the sensitivity rates were significantly decreased among tests of patients with only one metastatic site (76.84% vs. 89.09%; p-value = 0.044), mainly when this site was located at the lung (63.2%) or the peritoneum (53.8%). Consistent with this observation, patients with only metastases in the lung (OR = 3.2, 95% CI [1.1–8.8]; p-value = 0.029) or the peritoneum (OR = 3.3, 95% CI [1.1–9.5]; p-value = 0.035) showed the highest probability of having a mutational status of RAS discordant between analyses based on tissue and on plasma. In addition to the absence of liver metastases, the resection of tumour tissue was also significantly associated with a lack of concordance. The probability of having discordant results between assays increased when patients had undergone the resection of tumour tissue before the collection of the blood liquid biopsy (OR = 1.9, 95% CI [1.0–3.9]; p-value = 0.073), mostly noticeable in profiles with metachronous mCRC (OR = 2.9, 95% CI [0.4–2.5]; p-value = 0.007) than in profiles with synchronous mCRC (OR = 1.5, 95% CI [0.6–3.4]; p-value = 0.365) (Tables 2 and S1). Discordance associated with metachronous mCRC populations was also dependent Capítulo 3 67 on the metastatic locations since multivariable logistic regression analyses showed that the probability of showing discordance was reduced in the metachronous mCRC population with liver metastases (OR = 1.9, 95% CI [0.8–4.6]; p-value = 0.127). 3.4. Association of the mCRC Origin Site with Discordance of RAS Mutational Status between Analysis Based on Tumour Tissue and Analysis Based on Plasmatic ctDNA The probability of discrepancies between both assays was strongly associated with the anatomical location of the primary tumour. Patients with mCRC originating in the right colon had a likelihood of presenting discordant genotypes three times higher than patients with primary tumours located in the left colon (OR = 3.1, 95% CI [1.4–7.5]; p-value = 0.008). Moreover, patients with primary tumours originating in the rectum showed discordant assays twice as frequently as patients with primary tumours in the left colon (OR = 2.1, 95% CI [0.9– 4.8]; p-value = 0.083) (Table 2). The probability of discrepancies between assays in both populations, the mCRC originated at the right colon (OR = 6.1, 95% CI [1.7–26.5]; p-value = 0.006) and the mCRC originated at the rectum (OR = 5.0, 95% CI [1.5–17.8]; p-value = 0.009), increased significantly among patients without liver metastases (Table 3). More specifically, the highest frequencies of discordant RAS status in the mCRC originating in the right colon were observed in patients with only peritoneal metastases (OR = 7.7, 95% CI [1.3–54.5]; p-value = 0.030), and in cases with mCRC originated in the rectum, discordant results increased in patients with only lung metastases (OR = 5.8, 95% CI [1.3–2.6]; p-value = 0.018). In addition, the resection of the tumour before the collection of the blood liquid biopsy significantly increased the chances of obtaining discordant results between assays, particularly among patients with metachronous mCRC originated in the rectum (OR = 8.8, 95% CI [2.6– 36]; p-value = 0.001) and in the right colon (OR = 2.9, 95% CI [0.6–16.2]; p-value = 0.187) (Tables 3 and S2). Table 3. Discordance of RAS mutational status between SoC and ctDNA analyses associated with the mCRC origin site. Elena María Brozos Vázquez 68 Table 3 includes information from 288 patients with known clinicopathological data. The location of the primary tumour was unknown in 13 of the 301 patients with available RAS status in solid tumour tissue and plasmatic ctDNA samples. a Information on the location of the primary tumour was available in 288 patients. Patients with mixed locations were excluded from this analysis. ORs were calculated in reference to cases with no resection. b The site of metastases was available in 281 patients. The numbers included mCRC cases with (Yes) or without (Not) metastases at the indicated anatomical site. ORs were referred to cases with the specified metastatic site. c The number of metastatic sites was obtained in 281 cases. Multiple sites included all cases with metastases in more than one anatomical location. All ORs were calculated in reference to cases with multiple metastatic sites. n.a., statistical power was not enough for calculation. n.s, not significant p-values. These two mCRC populations, patients with metachronous mCRC originated in the rectum (56.3%) or in the right colon (54.6%), showed the lowest sensitivity ratios as well as the lowest confidence ratios to predict true plasmatic WT RAS genotypes, as reflected by their negative predicted value (NPV) (Table 4). Thus, compared to a 13.6% (95% CI 3.6–36.0) probability of showing a false-negative plasmatic WT RAS genotype in the population with metachronous mCRC originating in the left colon, this probability was 50.0% (95% CI 20.1–79.9) and 53.8% (95% CI 26.1–79.6) in cases with right-sided and rectal metachronous mCRC, respectively (Table 4). Table 4. Concordance of RAS mutational status between SoC and ctDNA analyses related to tumour surgery. Table 4 includes information from 288 patients with known clinicopathological data. The location of the primary tumour was unknown in 13 of the total 301 patients with available RAS status in solid tumour tissue and plasmatic ctDNA samples. Discordant outcomes between SoC and BEAMing analyses were observed in 23 cases (12.1%) with synchronous metastases and 19 cases (24.7%) with metachronous metastases. 1 Overall percentage agreement; 2 positive percentage agreement; 3 negative percentage agreement; 4 Cohen’s kappa coefficient (95% confidence interval); 5 positive predictive value (95% confidence interval); 6 negative predictive value (95% confidence interval). a Primary tumour resection was performed in 43.5% of patients with synchronous metastases. b Primary tumour resection was performed in 100% of patients with metachronous metastases. Additionally, 12% of cases with metachronous mCRC originating in the rectum showed RAS mutations in plasma, despite RAS mutations not being observed in their tumour tissue assays, demonstrating that the plasma assays from patients with metachronous mCRC originating in the rectum showed the lowest specificity of the study as well (Table 4). Capítulo 3 69 3.5. Impact of the mCRC Clinicopathological Characteristics on the ctDNA RAS Mutational Load The plasmatic RAS mutational load has been shown to be lower in patients without liver metastases [32,37,41] and to decrease upon primary tumour resection [34,40] or systemic chemotherapy [32]. The median of RAS MAFs in plasmatic ctDNA from 165 patients with RAS mutated genotypes was 0.029, IQR [0.005–0.104], ranging from a minimum level of 0.0002 to a maximum of 0.58. This wide dispersion suggested that the RAS MAF levels were highly variable among the mCRC patients. According to the above-cited studies, we observed that the ctDNA RAS MAFs were significantly higher in patients with at least one liver metastasis than in patients without liver metastases but with metastases at other anatomical locations (median = 0.044, IQR [0.007– 0.129] vs. median = 0.011, IQR [0.003–0.039]; p-value < 0.001) (Figure 1a). In line with these observed ctDNA levels, fluorometric quantification of plasmatic cfDNA estimated that the mCRC subpopulation with at least one liver metastasis showed significantly higher levels of cfDNA in plasma than patients who did not have any liver metastases but had metastases at other sites (median = 36.7 ng/mL, IQR [17.7–87.3] vs. median = 12.9 ng/mL, IQR [9.8–18.9]; p-value < 0.001). cfDNA levels were also higher in patients who had metastases only at the liver than in patients with lung metastases alone (median = 37.1 ng/mL, IQR [20.4–80.4] vs. 13.2 ng/mL, IQR [12.5–17.2], p-value = 0.004) or exclusive peritoneal metastatic disease (median = 37.1 ng/mL, IQR [20.4–80.4] vs. 12.4 ng/mL, IQR [9.8–20.5], p-value = 0.031). Furthermore, we observed that patients diagnosed with synchronous mCRC, who had not been treated either with tumour resection or with systemic chemotherapy at the moment of the blood biopsy extraction, had higher ctDNA RAS MAFs than patients with synchronous mCRC who were naïve to systemic chemotherapy but treated with resection of the primary tumour (8.9% had also been subjected to resection of metastasized tissue), (median = 0.057, IQR [0.016– 0.125] vs. median = 0.025, IQR [0.003–0.079]; p-value = 0.010) and also significantly higher than the plasmatic RAS MAFs that were observed in patients with a metachronous presentation of the metastases (median = 0.009, IQR [0.003–0.028]; p-value < 0.001) (Figure 1b). Elena María Brozos Vázquez 70 Figure 1. Impact of the mCRC clinicopathological characteristics on the detection of plasmatic RAS mutations. (a) Impact of the metastatic site on the plasmatic RAS MAFs. Dark blue dots (column 1) represent ctDNA RAS MAFs of patients with at least one liver metastasis. Light blue dots (column 2) represent ctDNA RAS MAFs of patients with at least one metastatic site at other anatomical locations than the liver. Lines represent the median and the 25–75% IQR. (b) Impact of surgical treatment and palliative/life-extending systemic chemotherapy on the ctDNA RAS MAFs. Plasmatic RAS mutations were detected in 113 patients with synchronous metastases and chemotherapy-naive and in 43 patients with metachronous metastases who had been at least previously treated by tumour surgery. Dark orange dots (column 1) represent ctDNA RAS MAFs of 69 patients with newly diagnosed synchronous mCRC who had not received surgical treatment. Light orange dots (column 2) represent ctDNA RAS MAFs of patients with synchronous metastases treated with resection of the primary tumour (4 had also been subjected to the removal of metastatic tissue). Yellow dots represent (column 3) ctDNA RAS MAFs of 43 patients with metachronous metastases; 34 had only been treated with resection of the primary tumour and 9 had been treated with resection of primary and metastatic tumour tissue. Adjuvant systemic chemotherapy had been administered to 24 of the cases before plasma collection. Lines represent the median and the 25–75% IQR. (c) Plasmatic RAS MAFs in patients with synchronous mCRC and different origins of the primary tumour who were not subjected to previous tumour surgery or systemic chemotherapy. Blue, green and red dots represent ctDNA RAS MAFs of patients with mCRC that originated in the left colon, rectum and right colon, respectively. Lines represent the median and the 25–75% IQR. Capítulo 3 71 (d) Plasmatic RAS MAFs from patients with primary tumours in different locations and treated with surgical resection. Blue, green and red dots represent ctDNA RAS MAFs of patients with mCRC that originated in the left colon, rectum and right colon, respectively. Colour gradients were used to show the decrease in the RAS MAFs in the mCRC subpopulations treated with resection of the primary tumour. Lines represent the median and the 25– 75% IQR. (e) Correlation of primary tumour location with the metastatic pattern of mCRC. Plots showed the number of metastatic sites (e) and the anatomical location of the metastases. (f) in 242 patients with synchronous tumours. All patients were naive to surgery or chemotherapy. The frequency of only one single site of metastasis was higher in patients with primary tumours located in the right colon. The liver was the predominant site of metastasis in mCRC with left colon origin, whereas lung metastases were more frequent in mCRC originating at the rectum. Peritoneal metastases and metastases to other sites were frequent in right-sided mCRC. Non-parametric Mann–Whitney U and Kruskal–Wallis tests were used to calculate p-values when two or more groups were compared. Lower ctDNA RAS MAF medians were observed in all mCRC populations treated with surgery independently of the location of the primary tumour (Figure 1d). However, the population with mCRC originating in the right colon showed the most significant differences in the fractions of circulating RAS mutations between patients treated and patients not treated with tumour resection (Figure 1d). We observed that those patients diagnosed with synchronous mCRC originating in the right colon who had not yet received any treatment showed the highest ctDNA RAS MAF medians (Figure 1c). Conversely, the population with mCRC originating in the right colon treated with resection of the tumour contained the highest number of patients carrying plasmatic RAS MAFs closer to the 0.01% limit of detection of the BEAMing technology (Figure S1a,b). Among them, patients with metachronous mCRC originating in the right side of the colon showed the lowest RAS MAF medians (Figure 1d), coinciding with the lowest sensitivity ratios and NPVs (Table 4). 4. Discussion The mutational status of RAS genes is a well-known prognostic and predictive mCRC biomarker conferring poor prognosis and a lack of response to anti-EGFR antibodies. Therefore, guidelines strongly recommend the evaluation of the RAS mutational status before the choice of the first line of therapy [44–47]. Alternatively to the invasive SoC analyses carried out in locally restricted tumour tissue specimens obtained by surgery or throughout a biopsy at the time of the diagnosis of the disease, the evaluation of the RAS mutational status using plasmatic ctDNA isolated from peripheral blood allows a spatial-temporal view of the tumour [32]. Therefore, ctDNA assays have emerged as a promising minimally invasive tool with the potential to improve the management and therapy outcomes of the CRC patient by guiding clinical decisions [40,48]. Actually, ctDNA genotyping technologies and, more in particular, the OncoBEAM RAS CRC test, have demonstrated to be highly accurate tools, detecting down to 0.01% RAS allelic fractions in plasma samples from mCRC patients [32,40]. Hence, the detection of somatic RAS mutations through the analysis of plasmatic ctDNA in mCRC has been shown to be reliable and highly concordant with that observed in tumour tissue samples analysed with the gold standard tests [32,33]. In our study, using the mentioned technology to genotype plasmatic ctDNA from a real-world and heterogenous cohort of 366 mCRC patients, representative of the day-to-day care at four different hospitals in Galicia, we observed a concordance of 84.4% with the gold Elena María Brozos Vázquez 72 standard approach (SoC analysis in tumour tissue specimens). Similar to previous studies [32,49,50], the concordance ratios in our study were significantly higher in patients with liver metastases (89.7%) than in patients with metastases at other sites (76.1%), and in patients who had not been treated by resection of the primary tumour, as those with newly diagnosed synchronous tumours (90.2%), compared to those patients with synchronous (86.2%) and metachronous metastases (75.9%) who had already been treated by resection of the primary tumour. In addition, binary logistic regression models, used to explore the odds of presenting discordant versus concordant assays depending on the mCRC clinicopathological characteristics, showed that the origin of the primary tumour was also an important predictor of discordant outcomes between the SoC and ctDNA tests. In fact, we observed that more than 91% of ctDNA genotypes from patients with mCRC originated in the left colon concorded with SoC tests. However, ctDNA tests carried out in samples from patients with mCRC originated in the rectum or right colon assigned the same genotype as SoC analysis in 84% and 77% of the cases, respectively. Up to 80% of the genotyping discrepancies observed in mCRC originated in the right colon and 63% of the discrepancies observed in mCRC originated in the rectum resulted from the failure of the ctDNA assay to detect any mutated RAS allele in the plasma of mCRC patients. The accuracy of the liquid biopsy tests to detect ctDNA isolated from peripheral blood depends on the fraction of mutated DNA within the whole cell-free DNA released to the bloodstream, mainly through cell death processes [51,52]. Although the characteristics of tumours known to be highly cfDNA shedders are still poorly understood, the anatomical location of the tumour lesions has been demonstrated to be an important factor determining the presence and, therefore, the detection of ctDNA in the plasma of patients with mCRC and other tumours [50,53,54]. In line with these observations, it has been proposed that the good vascularisation [40] and usually high volume of liver metastatic lesions [41,49] would contribute to increased cfDNA shedding into the bloodstream and, therefore, explain why mCRC patients diagnosed with liver metastases are frequently associated with higher plasmatic RAS MAFs, as we have also reported here. In this study, the mCRC subpopulation with at least one metastatic lesion in the liver showed significantly higher levels of cfDNA in plasma than patients without liver metastases but with metastases located at other anatomical sites. Consistent with this observation, the OncoBEAM assay detected higher fractions of mutated RAS alleles in plasma samples of patients with at least one liver metastasis than in patients without liver metastases. In addition, our results showed that the accuracy of the ctDNA assays was dramatically reduced to almost 50% when plasma samples belonged to mCRC cases with only metastases at the peritoneum, and to approximately 60% if samples had been obtained from cases with only lung metastases. These new data obtained in a real-world cohort are in line with previous works addressed by ddPCR assays and also NGS and represent new evidence about the already known importance of the presence of liver metastases [32,37,41] to assess the plasmatic fractions of RAS mutations with enough sensitivity in mCRC patients. Importantly, the plasmatic fraction of RAS mutations has also been shown to decrease after surgical resection of the primary tumour [34,36,40]. In agreement with these previous findings, Discusión 79 inmunoterapia en cánceres de pulmón, mama y melanoma. El uso combinado de inmunoterapia y biopsia líquida tiene un beneficio claro, lo que los convierte en importantes logros en el arsenal terapéutico y diagnóstico de los tumores mencionados. Varios trabajos han demostrado que el análisis de biopsia líquida (principalmente marcadores de fluidos como líquido cefalorraquideo, LCR; y sangre) en el contexto de enfermedad a nivel cerebral derivado de tumores con origen en pulmón, mama y melanoma, permitiendo así la caracterización molecular de la enfermedad teniendo en cuenta la evolución y heterogeneidad tumoral. Esto se llevaría a cabo determinando en sangre el estado de biomarcadores inmunológicos bien establecidos como PD-L1, TMB o la condición MSI (inestabilidad de microsatélites). Sin embargo, nuestra revisión evidenció la escasa información sobre la utilidad específica de la evaluación del cfDNA y otros marcadores como las CTCs y las vesículas extracelulares circulantes (cEVs) en pacientes con metástasis cerebrales que reciben inmunoterapia. En este sentido, es importante mencionar que todos los ensayos de fase III descritos en tumores avanzados (CPNM, CPM, mama o melanoma) no estaban asociados a estudios traslacionales con toma de biopsia líquida, por lo que no hay análisis de plasma ni otros fluidos que puedan servir como criterios de valoración secundarios. Esto dificulta extraer conclusiones sobre el comportamiento de los biomarcadores circulantes durante el tratamiento con inmunoterapia, pero al mismo pone de relieve la necesidad y el reto de mejorar el diseño en futuros ensayos clínicos centrados en este subgrupo de pacientes de especial interés por su mal pronóstico vital. Cabe destacar que la presente revisión engloba por primera vez los resultados relativos al valor combinado del uso de la inmunoterapia como tratamiento y la biopsia líquida como técnica diagnóstica en el contexto de enfermedad cerebral, proporcionando así un conocimiento exhaustivo que podría abrir la puerta a la creación de ensayos clínicos específicos para estudiar el valor de los marcadores biológicos en plasma u otros fluidos con utilidad para establecer el diagnóstico, pronóstico y monitorización de respuesta a la inmunoterapia en pacientes con lesiones cerebrales. Afortunadamente, existen estos estudios en curso y con los resultados preliminares en cáncer de pulmón, mama y melanoma obtendremos más información. El objetivo es proporcionar más conocimiento a nivel molecular en este contexto para satisfacer mejor las necesidades de este subgrupo de pacientes. Es de interés seguir investigando en la línea de la aplicación de la inmunoterapia al tratamiento de tumores sólidos con metástasis cerebrales y el uso de biopsia líquida podría guiar el tratamiento en una subpoblación de pacientes con escasas alternativas terapéuticas. Uno de los tumores en los que se ha implementado de una forma más temprana el uso de tratamiento personalizado mediante el diagnóstico molecular es el cáncer colorrectal metastásico, ya que al momento del diagnóstico está recomendado realizar el estatus del gen RAS para el diseño de la mejor estrategia terapéutica en primera y sucesivas líneas de tratamiento desde hace ya unos años. El estado mutacional de los genes RAS es un biomarcador pronóstico y predictivo bien establecido en nuestra práctica clínica asistencial, sabiendo que confiere un mal pronóstico y una falta de respuesta a los anticuerpos anti-EGFR. Por lo tanto, las directrices internacionales recomiendan encarecidamente la evaluación del estado mutacional RAS antes de la elección de la primera línea de tratamiento (49-52). Este estudio se obtiene con procedimientos invasivos para la toma de biopsia para el estudio del perfil molecular realizado en muestras de tejido tumoral conseguidas mediante la cirugía de resección del tumor primario, o a lo largo de una biopsia mediante colonoscopia en el momento del Elena María Brozos Vázquez 80 diagnóstico. La evaluación del estado mutacional del gen RAS utilizando ctDNA plasmático aislado en sangre periférica permite una visión tanto espacial como temporal del tumor (74) y su evolución a lo largo del tiempo. Por lo tanto, los ensayos de ctDNA han surgido como una prometedora herramienta mínimamente invasiva con el potencial de mejorar la gestión y los resultados de la terapia del paciente con CCRm mediante la orientación de las decisiones clínicas (13,75) en base a estos resultados moleculares para poder ofrecer al paciente la mejor alternativa terapéutica posible. De hecho, las tecnologías de genotipado de ctDNA y, en particular, el test OncoBEAMâ RAS CRC, han demostrado ser herramientas muy precisas y eficaces, detectando hasta un 0,01% de fracciones alélicas del gen RAS en muestras de plasma de pacientes con CRCm (74,13). Por lo tanto, la detección de mutaciones somáticas de RAS mediante el análisis de ctDNA plasmático en CRCm ha demostrado ser fiable y altamente concordante con la observada en muestras de tejido tumoral analizadas con las pruebas en tejido tumoral, todavía hoy en día considerado el gold standard (74, 76) para el análisis mutacional en esta población de pacientes. En nuestro estudio presentado como tercer capítulo de esta tesis hemos querido trasladar el uso de la biopsia líquida en un tumor frecuente en la población, con alta capacidad de siembra a torrente sanguíneo y con implicaciones en el diseño de la terapia personalizada para alcanzar mejores resultados en la evolución tumoral. En nuestro trabajo de campo hemo utilizado la tecnología mencionada para genotipar el ctDNA plasmático de una cohorte real y heterogénea de 366 pacientes con CRCm, representativa de la asistencia diaria en cuatro hospitales diferentes de Galicia, nuestro medio. Se observa una concordancia del 84,4% del análisis mutacional del RAS con el enfoque de referencia (análisis de standar of care, SoC, en muestras de tejido tumoral). Al igual que en estudios previos (74,77,78) los ratios de concordancia en nuestro trabajo fueron significativamente más elevados en los pacientes con metástasis a nivel hepático (89,7%) que en los pacientes con lesiones metastásicas de otras localizaciones (76,1%). También en los pacientes que no han sido tratados mediante cirugía de resección del tumor primario, así como aquellos con tumores metastásicos al debut (90,2%), en comparación con aquellos pacientes con metástasis sincrónicas (86,2%) y metacrónicas (75,9%) a los que se les ha realizado resección del tumor primario. Además, los modelos de regresión logística binaria llevados a cabo en este estudio para explorar las probabilidades de presentar resultados discordantes frente a concordantes en función de las características clínico-patológicas del CCRm, mostraron que el origen del tumor primario también es un factor predictivo importante de los resultados discordantes entre las pruebas de análisis del gen RAS mediante SoC y de ctDNA. De hecho, observamos que más del 91% de los genotipos de ctDNA de pacientes con CCRm originados en el colon izquierdo concordaban con las pruebas realizadas en tejido. Sin embargo, las pruebas de ctDNA realizadas en muestras de plasma de pacientes con CCRm de origen primario en el recto o el colon derecho asignaron el mismo genotipo que el análisis de tejido en el 84% y el 77% de los casos, respectivamente. Hasta el 80% de las discrepancias de genotipado observadas en el CRCm con tumor primario en el colon derecho y el 63% de las discrepancias observadas en el CRCm originado en el recto se debieron a que el estudio de ctDNA no detectó ningún alelo RAS mutado en el plasma de los pacientes con CRCm. La precisión de las pruebas de biopsia líquida realizadas para detectar ctDNA aislado de sangre periférica depende de la fracción de DNA mutado dentro del DNA libre de células enteras Discusión 81 liberado al torrente sanguíneo, principalmente a través de procesos de muerte celular (79,80); bien sea por apoptosis, necrosis u otros mecanismos. Aunque todavía no se conocen bien las características que presentan los tumores altamente excretores de cfDNA, se ha demostrado que la localización anatómica de las lesiones tumorales es un factor importante que determina la presencia y, por tanto, la detección de cfDNA en el plasma de pacientes con CCRm y otros tumores (78, 81,82). En consonancia con estas observaciones, se ha propuesto que la buena vascularización (58) y el volumen generalmente elevado de las lesiones metastásicas hepáticas (63,77) contribuirían a un mayor vertido de cfDNA al torrente sanguíneo y, por tanto, explicarían por qué los pacientes con CCRm diagnosticados con lesiones hepáticas se asocian con frecuencia a MAFs RAS plasmáticos más elevados, como también hemos demostrado en nuestro estudio. Además, en nuestro trabajo, destacamos que la subpoblación de CCRm con al menos una lesión metastásica en el hígado mostró niveles significativamente más altos de cfDNA en plasma que los pacientes sin metástasis hepáticas, pero con lesiones presentes en otras localizaciones anatómicas. En línea con esta idea, el ensayo OncoBEAM detectó fracciones más elevadas de alelos RAS mutados en muestras de plasma de pacientes con al menos una metástasis hepática que en pacientes sin ninguna metástasis a nivel de hígado. Además, nuestros resultados mostraron que la precisión de los ensayos de ctDNA se reducía drásticamente a casi el 50% cuando las muestras de plasma pertenecían a casos de CRCm con enfermedad únicamente presente en el peritoneo, y a aproximadamente el 60% si las muestras se habían obtenido de casos con metástasis únicamente a nivel pulmonar. Estos nuevos datos obtenidos en nuestra cohorte están en consonancia con trabajos anteriores abordados mediante ensayos de ddPCR (digital drop polymerasa chain reaction) y también mediante secuenciación masiva con la tecnología NGS (next generation sequencing). Representan nuevas pruebas sobre la importancia ya conocida previamente de la presencia de metástasis hepáticas (60,63,74) para evaluar las fracciones plasmáticas de mutaciones del gen RAS con suficiente sensibilidad en pacientes con CRCm. Es importante destacar que también se ha demostrado que la fracción plasmática de mutaciones (MAF) del gen RAS disminuye tras la resección quirúrgica del tumor primario (58,59,83). En consonancia con estos hallazgos previos, los pacientes de nuestra cohorte tratados con resección quirúrgica del primario mostraron MAFs RAS en plasma significativamente más bajas que los pacientes no operados, observándose el contenido más bajo de ctDNA a nivel plasmático en el caso de CRCm metacrónico con origen tumoral en el colon derecho y en recto. En concordancia con los resultados, estas poblaciones mostraron valores negativos inferiores al 50% y, por tanto, las mayores probabilidades de mostrar genotipos RAS considerados como falsos negativos en nuestro estudio. Por lo tanto, nuestro trabajo también ha puesto de relieve la importancia de la localización del tumor primario para comprender nuestra capacidad de detectar ctDNA en el plasma de los pacientes con CRCm. Está bien aceptado entre la comunidad clínica y científica que la localización anatómica del tumor primario precede a la diseminación anatómica de las lesiones metastásicas, y que los cánceres originados en diferentes localizaciones intestinales predisponen a distintos patrones metastásicos (84). Así, el CCRm del lado izquierdo, conocido por propagarse a través del sistema portal hepático a sitios distales por la circulación sanguínea, es más propenso a las metástasis primero en el hígado, y luego en los pulmones. Sin embargo, estas metástasis en Elena María Brozos Vázquez 82 órganos torácicos se han observado con más frecuencia en cánceres de recto como un único foco metastásico que en cáncer de colon izquierdo con metástasis únicas (85). Por otra parte, los pacientes con CCRm derecho presentan metástasis peritoneales con mayor frecuencia que los pacientes con origen izquierdo o rectal (84,86), siguiendo así un patrón de diseminación tumoral más concordante con mecanismo de propagación local que a nivel del torrente sanguíneo. Comparando estos resultados con otros similares, son varios los grupos de investigación que han realizado comparativas entre su determinación en tejido y plasma, apreciando en general un alto nivel de concordancia entre los dos métodos. Nuestro estudio multicéntrico con 366 pacientes con características clínicas heterogéneas muestra una concordancia global del 84,4%, presentando variaciones según factores clínicos, como son la presencia de metástasis hepáticas (con una concordancia del 89,7%) o el diagnóstico metastásico de forma sincrónica (con una concordancia del 90,2%), siendo estas situaciones dos condiciones frecuentes en nuestro día a día. Por lo tanto, en relación con la asociación de las ratios de concordancia con el origen del tumor primario en el cáncer colorrectal avanzado, sugerimos que las mayores ratios de concordancia observadas entre los ensayos de pacientes con tumores primarios localizados en el colon izquierdo podrían estar relacionados con el hecho de que estos pacientes presentan características clínicopatológicas que se han asociado significativamente con mayores fracciones de RAS mutado en el ctDNA plasmático. Así, más del 40% de estos pacientes presentaban más de una localización metastásica cuando se les diagnosticó la enfermedad en situación avanzada y, como hemos mencionado anteriormente, los pacientes con CCRm originado en el colon izquierdo tienen una mayor preferencia a desarrollar metástasis a nivel hepático (84). Además, mientras que el pulmón y el peritoneo también fueron localizaciones que presentaron metástasis con frecuencia en pacientes con CCRm rectal y colon derecho con un solo foco metastásico, el hígado es el lugar más frecuente de metástasis en pacientes con CCRm originado en el colon izquierdo con un único lugar de metástasis. Basándonos en estas observaciones, cabe esperar que el CCRm izquierdo sea una enfermedad con una mayor diseminación de ctDNA y que, en general, presente genotipos del gen RAS altamente concordantes entre los análisis de tejido y plasma. Analizando las características que podrían influenciar una discordancia entre ambos tests, la localización tumoral primaria se postula como un predictor de la misma. El cáncer originado en colon derecho o recto muestran una concordancia del 77% y del 84%, respectivamente. Uno de los motivos de discrepancia es derivado de la no detección de alelos RAS en ctDNA en el plasma de los pacientes. Se sugiere que la localización tumoral y la presencia de metástasis en órganos muy vascularizados son condiciones que mejoran la detección de ctDNA (debido a un mayor shedding), de ahí que el lado izquierdo y las lesiones hepáticas sean las que mayor descarga de alelos RAS al torrente sanguíneo presenten. Otro de los factores que condicionan menores niveles de ctDNA en sangre es la resección del tumor primario, especialmente si es realizada con anterioridad a la aparición de enfermedad metastásica (situación metacrónica). Por el contrario, los pacientes con CCRm metacrónico originado en el colon derecho o en el recto, normalmente tratados con resección del tumor primario y que presentaban mayores Discusión 83 frecuencias de metástasis únicas en el peritoneo o en el pulmón, mostraron las fracciones más bajas de mutaciones RAS a nivel circulante. A pesar de la alta sensibilidad de la tecnología BEAMingâ ddPCR, la evaluación de las mutaciones del RAS en plasma de pacientes con CRCm originado en el colon derecho o el recto, cuando fueron operados, mostró una alta probabilidad de reportar resultados falsos negativos y discordancias con los procedimientos realizados en tejido tumoral mediante la técnica estándar. Aproximadamente sólo el 50% de las pruebas de ctDNA negativas en esta población de CRCm se predicen como verdaderas negativas y, por lo tanto, muestran un resultado concluyente de estatus mutacional del gen RAS como no mutado. Así, teniendo en cuenta estos factores, debemos presentar especial atención a aquellos pacientes con origen del tumor en colon derecho y recto operados, particularmente en la aparición de metástasis de forma metacrónica y en otros órganos diferentes al hígado. Estos son las situaciones que suponen un reto a la hora de establecer el método de diagnóstico para el análisis del estado mutacional del gen RAS, que debe ser lo más adecuado posible para ofrecer a los pacientes terapias dirigidas de forma apropiada. Así las cosas y acorde con nuestros resultados, ofrecemos la recomendación a la comunidad científica y clínica de que se preste especial atención a los CCRm originados en el colon derecho y el recto, y que han sido tratados mediante resección del tumor primario, en particular en el contexto de situación metacrónica, ya que la sensibilidad significativamente reducida observada en los ensayos de ctDNA de estos pacientes podría dar lugar a resultados del estatus mutacional del gen RAS no concluyentes. Además, el hecho de que el 12% de los pacientes con tumores primarios con perfil molecular RAS nativo y originados en el recto hubiesen presentado mutaciones plasmáticas RAS cuando se diagnosticaron de metástasis en momento metacrónico es sugestivo de la existencia de mecanismos moleculares de evolución tumoral a través de la aparición de mutaciones en el gen RAS en este subgrupo de pacientes, que, si no se seleccionan de forma adecuada, podrían reducir potencialmente las respuestas terapéuticas a fármacos de terapias dirigidas que aportan toxicidad a nuestros pacientes. Nuestro estudio tiene algunas limitaciones, como por ejemplo, el diferente momento de la recogida del plasma para realizar la biopsia líquida en nuestra cohorte de pacientes, cuestión que dificulta la interpretación del análisis dada la escasa homogeneidad de la población y consecuentemente, el traslado de resultados para la toma de decisiones clínicas respecto a los datos obtenidos. Sin embargo, la potencia estadística post hoc observada basada en el gran tamaño de la muestra fue alta, y el genotipado mediante BEAMingâ ddPCR se llevó a cabo en el mismo laboratorio y por el mismo personal, lo que hace que los resultados sean fiables y reproducibles. En conclusión, nuestro estudio confirmó que las fracciones de mutaciones del gen RAS a nivel de plasma circulante y la concordancia entre los ensayos de estudio de tejido y ctDNA en plasma fueron mayores en el CRCm con metástasis hepáticas y cuando no se reseca el tumor primario. En base al conocimiento actual creemos que la biopsia líquida podrá establecerse como una herramienta de utilidad en pacientes con tumores sólidos en situación metastásica y con pronóstico desfavorable, para ofrecer al paciente alternativas terapéuticas dentro de la Elena María Brozos Vázquez 84 Oncología de Precisión. Además, el trabajo de campo realizado en pacientes de nuestro medio demuestra de forma empírica la utilidad de esta técnica para una situación habitual en nuestro día a día como oncólogos. 85 CONCLUSIONES En esta tesis, la utilidad de la biopsia líquida queda demostrada para la búsqueda de biomarcadores circulantes con capacidad para el uso de fármacos basados en terapia dirigida, con beneficio clínico en pacientes con cáncer de pulmón, mama y melanoma con metástasis cerebrales, así como en cáncer colorrectal metastásico, situaciones especialmente preocupantes en nuestro día a día. Los datos obtenidos de nuestro estudio experimental nos llevan a presentar las siguientes conclusiones: CAPÍTULO 1 1. La biopsia líquida se postula como una herramienta para la selección de pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña respondedores a inmunoterapia. CAPÍTULO 2 2. La detección de biomarcadores predictivos mediante biopsia líquida selecciona perfiles de pacientes con tumores sólidos estadio IV cerebral candidatos a tratamientos dirigidos. CAPÍTULO 3 3. La determinación de biomarcadores circulantes es de utilidad para establecer estrategias de tratamientos personalizados en cáncer colorrectal metastásico. 4. La ausencia de metástasis hepáticas y la presencia de enfermedad avanzada metacrónica con tumor primario localizado en colon derecho y recto condicionan mayor discordancia entre el estado mutacional del gen RAS realizado en tejido tumoral y biopsia líquida. 5. La enfermedad metastásica a nivel hepático y el tumor primario no resecado son características clínico-patológicas que influyen en mayor carga mutacional del gen RAS detectado mediante ctDNA. REFERENCIAS 1. Schwartzberg L, Kim ES, Liu D, Schrag D. Precision Oncology: Who, How, What, When, and When Not? Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2017;37:160-169. 2. 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Oncol. 2017, 28, 1713–1729). Anexos 95 INFORMACIÓN Y CONSENTIMIENTO INFORMADO - PACIENTES TÍTULO DEL ESTUDIO: Idenficación de marcadores de diagnósco, pronósco y seguimiento mediante el análisis de biopsia líquida en pacientes con cáncer PROMOTOR: Rafael López López NOMBRE DE INVESTIGADORES PRINCIPALES: Rafael López López, Roberto Díaz Peña, Laura Muinelo Romay CENTRO: Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela VERSIÓN UNO (31 de octubre de 2017) Este documento tiene por objeto informarle y solicitar su consentimiento escrito antes de comenzar un estudio de investigación en el que se le invita a participar; y que se llevará a cabo por los profesionales del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS). Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Investigación con medicamentos de Galicia. Si decide participar en el mismo, recibirá información personalizada del investigador. Antes, debe Usted leer este documento y hacer todas las preguntas que precise para comprender los detalles del mismo. Si así lo desea, puede llevarse el documento, consultarlo con otras personas y tomarse el tiempo necesario para decidir si se participa o no. La participación en este estudio es completamente voluntaria. Usted puede decidir no participar o, de hacerlo, cambiar de idea retirando su consentimiento en cualquier momento sin obligación de dar explicaciones. Esta decisión no afectará a la relación con su médico ni a la asistencia sanitaria a la que usted tiene derecho. ¿Cuál es el objetivo del estudio? El objetivo general del estudio es encontrar nuevas formas de analizar tumores como el suyo a través de una muestra de sangre, de obtención menos invasiva que la de tejido. De esta forma esperamos comprender mejor los cambios que puedan presentarse en el tumor en respuesta al tratamiento, y que esto finalmente pueda ayudar a los oncólogos a proponer un tratamiento más dirigido o personalizado. Además, de este conocimiento pueden derivarse biomarcadores tanto con utilidad diagnóstica y pronóstica, como para monitorizar la evolución de la enfermedad. ¿Por qué me ofrecen participar? Se le ofrece participar en el estudio porque ha sido diagnosticado/a de un cáncer, con el objeto de mejorar la identificación de moléculas (biomarcadores) que sean de utilidad a la hora de diagnosticar y escoger el mejor tratamiento en tumores como el suyo. En concreto, en este este estudio en el que va a participar se pretende caracterizar el tumor durante el tratamiento para reconocer de forma temprana si los pacientes responden al mismo y también para entender mejor por qué dejan de responder a él. Elena María Brozos Vázquez 96 ¿En qué consiste mi participación? Coincidiendo con una analítica de rutina asistencial se le extraerán tres tubos adicionales de sangre con los que analizar biomarcadores en biopsia líquida. A mayores, si por rutina hospitalaria el facultativo realiza una biopsia tumoral del tejido de interés, esa muestra podrá ser utilizada con el objetivo de valorar la concordancia con las diferentes alteraciones genómicas descritas mediante biopsia líquida. Su tratamiento será el mismo que se le administre de forma estándar al resto de pacientes que tienen su mismo tumor. No se le hará ningún seguimiento especial ni se le pedirán más datos de los necesarios para hacer el seguimiento habitual de su enfermedad, aunque sí se consultarán los datos de su historia médica. El investigador puede decidir finalizar el estudio antes de lo previsto o interrumpir su participación. En todo caso se le informará de los motivos de su retirada. ¿Qué molestias o inconvenientes puede generarle la participación en el estudio? Su participación en el estudio no implicará ninguna molestia adicional a mayores de la derivada de la propia extracción de sangre y de las de la práctica asistencial habitual. ¿Cuáles son los beneficios esperables y los riesgos potenciales de este estudio? Usted no obtendrá ningún beneficio por permitir el análisis de sus muestras biológicas. La cesión de muestras para investigación es voluntaria y altruista. Su único beneficio es el que corresponde al avance de la medicina en beneficio de la sociedad, y el saber que ha colaborado en este proceso. Las muestras no podrán ser objeto directo de actividades con ánimo de lucro. No obstante, la información generada a parr de los estudios realizados sobre su muestra podría ser fuente de beneficios comerciales. En tal caso, están previstos mecanismos para que estos beneficios reviertan en la salud de la población, aunque no de forma individual en el donante. ¿Recibiré la información que se obtenga del estudio? Si usted lo desea, se le facilitará un resumen de los resultados del estudio. También podrá recibir los resultados de las pruebas que se realicen con sus muestras si así lo solicita dirigiéndose al investigador. Estos resultados pueden no tener aplicación clínica ni una interpretación clara, por lo que, si quiere disponer de ellos, debería ser comentado previamente con el médico del estudio. ¿Se publicarán los resultados del estudio? Los resultados de este estudio serán remitidos a publicaciones científicas para su difusión, pero no se transmitirá ningún dato que pueda llevar la identificación de los pacientes. ¿Como se protegerá la confidencialidad de mis datos y mis muestras? Los datos personales que se recojan sobre Usted, únicamente serán tratados y accedidos por el personal médico y sanitario que realizará el estudio. Dicha información será confidencial y procesada de acuerdo con la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal y la legislación vigente. En todo momento, usted podrá acceder a sus datos, corregirlos o cancelarlos, solicitándoselo al investigador del estudio. Anexos 97 El equipo investigador y las autoridades sanitarias, que tienen el deber de guardar la confidencialidad, tendrán acceso a los datos recogidos en el estudio. Se podrá transmir la información a terceros siempre que no pueda ser identificado/a el/la paciente. En el caso de que alguna información sea transmitida a otros países, se hará con el nivel de protección de datos equivalente, como mínimo, a lo exigido por la normava de nuestro país. Sus datos y muestras biológicas serán recogidos y conservados hasta acabar el estudio de modo codificado, que quiere decir que poseen un código con el cual sólo el equipo investigador podrá conocer a quien corresponden. Los responsables de la custodia de los datos y las muestras serán los investigadores principales del estudio Rafael López López, Roberto Díaz Peña y Laura Muinelo, y el lugar de realización de los análisis será la Unidad de Análisis de Biopsia Líquida del Complejo Hospitalario de Santiago de Compostela. Hasta la realización de los análisis correspondientes, las muestras serán custodiadas en la Unidad de Análisis de Biopsia Líquida del CHUS. Al terminar el estudio sus muestras se guardarán codificadas en la colección de muestras con fines de investigación registrada en el registro de biobancos con el número C0003811 y cuyo titular es el Dr. Rafael López López. Usted podrá‘ solicitar la destrucción o anonimización de sus muestras en cualquier momento dirigiéndose al investigador principal. Tiene que saber que esto no será‘ de aplicación a los datos resultantes de los análisis que ya fueran efectuados ¿Existen intereses económicos en este estudio? Usted no será‘ retribuido por participar. Es posible que de los resultados del estudio se deriven productos comerciales o patentes. En este caso, usted no podrá participar en los beneficios económicos originados. El investigador no recibirá retribución específica por su dedicación al estudio. ¿Cómo contactar con el equipo investigador del estudio? Usted puede contactar con el equipo investigador en el teléfono 981955451 o dirección de correo electrónico [email protected], [email protected] y [email protected]. Muchas gracias por su colaboración. Elena María Brozos Vázquez 98 CONSENTIMIENTO INFORMADO Yo, ___________________________________________________________________ He leído la hoja de información al paciente del estudio arriba mencionado que se me entregó, pudiendo hablar con el investigador............................................... y hacer todas las preguntas sobre el estudio necesarias. Comprendo que mi participación es voluntaria, y que puedo retirarme del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. Accedo a que se utilicen mis datos en las condiciones detalladas en el presente documento. Presto libremente mi conformidad para participar en este estudio. A continuación indique si da su consentimiento o no: ___ El participante autoriza que se guarden sus muestras en la colección. ___ El participante no lo autoriza y desea que se destruyan. ___ El participante autoriza a que se guarden las muestras anonimizadas. Fdo.: la/el participante, Fdo.: El investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos:____________ Nombre y apellidos:__________________ Fecha: Fecha: Anexos ANEXO 2: LISTA DE PUBLICACIONES PRESENTADAS EN ESTA TESIS Y PERMISOS DE PUBLICACIÓN A. Immunotherapy in nonsmall-cell lung cancer: current status and future prospects for liquid biopsy. Brozos-Vázquez EM*, Díaz-Peña R*, García-González J, León-Mateos L, MondeloMacía P, Peña-Chilet M, López-López R. *Corresponding authors. Cancer Immunol Immunother. 2021 May;70(5):1177-1188. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113004. Texto completo disponible: https://doi.org/10.1007/s00262-020-02752-z Permission: Open access Creative Commons CC BY license; no special permission is required to reuse all or part of article published under that license, including figures and tables. Journal Citation Reports (JCR) category rank (2020): Q1 (46/242): Oncology field. Journal Impact factor (2020) – 6.968 Contribución de Brozos-Vázquez EM a este trabajo: La autora ha realizado la conceptualización de este artículo, metodología, investigación, redacción y borrador original, así como su revisión y edición para su visualización en la publicación final. Elena María Brozos Vázquez 100 B. Immunotherapy in patients with brain metastasis: advances and challenges for the treatment and the application of circulating biomarkers. Brozos-Vázquez EM*, Rodríguez-López C, Cortegoso-Mosquera A, López-Landrove S, Muinelo-Romay L, García-González J, López-López R*, León-Mateos L. *Corresponding authors. Front Immunol. 2023 Nov 3;14:1221113. PMID: 38022574 PMCID: PMC10654987. Texto completo disponible: doi: 10.3389/fimmu.2023.1221113. Permission: Frontiers is fully compliant with open access mandates, by publishing its articles under the Creative Commons Attribution license (CC-BY); no special permission is required to reuse all or part of article published under that license, including figures and tables. Journal Citation Reports (JCR) category rank (2022): Q1 (44/177): Immunology field. Journal Impact factor (2020) – 7.3 Contribución de Brozos-Vázquez EM a este trabajo: La autora ha realizado la conceptualización de este artículo, metodología, investigación, redacción y borrador original, así como su revisión y edición para su visualización en la publicación final. Anexos 101 C. Clinicopathological Profiles Associated with Discordant RAS Mutational Status between Liquid and Tissue Biopsies in a Real-World Cohort of Metastatic Colorectal Cancer. Brozos-Vázquez E, Lago-Lestón RM, Covela M, de la Cámara Gómez J, FernándezMontes A, Candamio S, Vidal Y, Vázquez F, Abalo A, López R, Blanco C, MuineloRomay L, Ferreirós-Vidal I*, López-López R*. *Corresponding authors. Cancers (Basel). 2023 Jul 12;15(14):3578. doi: 10.3390/cancers15143578. PMID: 37509239 PMCID: PMC10377339. Permission: Open access Creative Commons CC BY license; no special permission is required to reuse all or part of article published under that license, including figures and tables. Journal Citation Reports (JCR) category rank (2022): Q1 (44/177): Oncology field. Journal Impact factor (2022) – 5.2 Contribución de Brozos-Vázquez EM a este trabajo: La autora ha realizado la conceptualización de este artículo, recogida de datos clínicos, análisis formal, investigación, redacción y preparación del borrador original, así como su revisión y edición para su visualización en la publicación final. Elena María Brozos Vázquez 102 D. Permiso de reproducción de imagen 1. Referencia: Mondelo-Macía P, García-González J, León-Mateos L, Castillo-García A, López-López R, Muinelo-Romay L, et al. Current Status and Future Perspectives of Liquid Biopsy in Small Cell Lung Cancer. Biomedicines. 2021 Jan 7;9(1):48. Permission: Open access Creative Commons CC BY license; no special permission is required to reuse all or part of article published under that license, including figures and tables. La terapia dirigida y la inmunoterapia han revolucionado el tratamiento de los pacientes oncológicos en los últimos años. En tumores como el cáncer de pulmón y cáncer de colon cobra especial importancia el estudio molecular para adaptar el tratamiento en el marco de la Oncología de Precisión. La biopsia líquida se ha posicionado como una herramienta útil para el diagnóstico de alteraciones moleculares de una forma no invasiva, dinámica, rápida y fiable. Esta tesis investiga el valor de los biomarcadores en sangre para ofrecer a los pacientes tratamientos personalizados en situaciones clínicas complejas, con una mejor caracterización molecular y así mejorar su supervivencia y calidad de vida.