Seroprevalencia de Fasciola hepatica en ganado ovino y caprino en Galicia y análisis de los principales factores de riesgo

TESIS DOCTORAL “SEROPREVALENCIA DE Fasciola hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO EN GALICIA Y ANÁLISIS DE LOS PRINCIPALES FACTORES DE RIESGO” Ana Pérez Creo DEPARTAMENTO DE PATOLOXÍA ANIMAL FACULTADE DE VETERINARIA LUGO 2015 DÑA. Mª PATROCINIO MORRONDO PELAYO, Catedrática del Área de Sanidad Animal de la Facultade de Veterinaria de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela, DÑA. ROSARIO PANADERO FONTÁN, Profesora Titular del Área de Sanidad Animal de la Facultade de Veterinaria de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela, D. PABLO DÍAZ FERNÁNDEZ, Profesor Interino del Área de Sanidad Animal de la Facultade de Veterinaria de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela, DÑA. CEFERINO MANUEL LÓPEZ SÁNDEZ, Profesor Titular del Área de Sanidad Animal de la Facultade de Veterinaria de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela, Como Directores de la Tesis Doctoral titulada “SEROPREVALENCIA DE Fasciola hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO EN GALICIA Y ANÁLISIS DE LOS PRINCIPALES FACTORES DE RIESGO” presentada por Dña. ANA PÉREZ CREO para optar al Título de Doctora en Veterinaria, Autorizan la presentación de la Tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorando, y que como Directores de la misma no incurre en las causas de abstención establecidas en la ley 30/1992. Y para que conste a los efectos oportunos, firman en Lugo, a 25 de septiembre de 2015 Patrocinio Morrondo Rosario Panadero Pablo Díaz Ceferino López UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Patoloxía Animal Facultad de Veterinaria Campus Universitario, s/n. 27002 LUGO (España) Tfno. 982 252 231 – 982 223 996 Fax 982 252 195 FINANCIACIÓN: Este trabajo se ha realizado gracias a la concesión de los proyectos de investigación: Consolidación e estructuración de unidades de investigación competitivas (GPC) (2012-PG243). Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria (17/06/2012-30/11/2014). Investigador responsable: Pablo Díez Baños. Consolidación e Estruturación de Unidades de Investigación Competitivas del Sistema Universitario de Galicia: Redes (R2014/005). Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria. Investigador responsable: Rosario Panadero Fontán. PUBLICACIONES: Parte de los resultados obtenidos en el desarrollo de esta Tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones: A. Artículos de investigación: PÉREZ-CREO, A.; DÍAZ, P.; LÓPEZ, C.; BÉJAR, J.P.; MARTÍNEZ-SERNÁNDEZ, V.; PANADERO, R.; DÍEZ-BAÑOS, P.; UBEIRA, F.M.; MORRONDO, P. (2015). Fasciola hepatica in goats from north-western Spain: Risk factor analysis using a capture ELISA. The Veterinary Journal, DOI: 10.1016/j.tvjl.2015.07.033. PÉREZ-CREO, A.; LÓPEZ, C.; DÍAZ, P.; VIÑA, M.; MARTÍNEZ-SERNÁNDEZ, V.; PANADERO, R.; DÍEZ-BAÑOS, P.; UBEIRA, F.M.; MORRONDO, P. (2015). Fasciola hepatica in sheep from north-western Spain: Risk factor analysis using a capture ELISA. Veterinary Parasitology, (enviado para su publicación). C. Contribuciones a Congresos: PEREZ-CREO, A.; DÍAZ, P.; MARTÍNEZ-SERNANDEZ, V.; PANADERO, R.; LÓPEZ, C.; DÍEZ-BAÑOS, P.; MORRONDO, P.; UBEIRA, F.M. Seroprevalence of Fasciola hepatica in galician sheep by using a capture ELISA. Congreso de la Sociedad Española de Parasitología; Gran Canaria, 17-20 Septiembre 2013. (Comunicación oral) LÓPEZ, C.M.; PANADERO, R.; DÍAZ, P.; PÉREZ, A.; CABANELAS, E.; DÍEZBAÑOS,P.; MORRONDO, P. The goat as a risk factor for parasitic infections in ovine flocks. Congreso de la Sociedad Española de Parasitología; Gran Canaria, 17-20 Septiembre 2013. (Comunicación oral) PÉREZ, A.; DÍAZ,P.; LÓPEZ,C.; MARTÍNEZ-SERNÁNDEZ, V.; PANADERO, R.; UBEIRA, F.; MORRONDO, P.; DÍEZ-BAÑOS, P. Assessment of some potential risk factors for Fasciola hepatica infection in goats by using a capture ELISA. WWVIII Congreso Nacional SOIPA; Roma 24-27 Junio 2014. (Comunicación oral). A mi hermano Sabi 4.2.2.2. Procedimiento del ensayo ........................................................... 72 4.2.2.3. Expresión e interpretación de los resultados obtenidos .............. 74 4.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ........................................................................ 74 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................ 81 5.1. SEROPREVALENCIA INDIVIDUAL Y POR REBAÑO DE Fasciola hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO DE GALICIA ............................................ 81 5.2. DETERMINACIÓN DE LOS DISTINTOS FACTORES DE RIESGO EN LA SEROPREVALENCIA POR F. hepatica............................................... 87 5.2.1. En ganado ovino ............................................................................... 87 5.2.2. En el ganado caprino ...................................................................... 100 5.3. MEDIDAS A ADOPTAR PARA REDUCIR LAS INFECCIONES POR F. hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO DE GALICIA. .................................................. 113 6. CONCLUSIONES .................................................................... 119 7. RESUMEN ................................................................................ 123 8. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................... 131 INTRODUCCIÓN Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN En Galicia, la ganadería constituye el pilar fundamental de la actividad agraria, siendo la explotación del ganado vacuno de actitud lechera el más importante, representando el 39% de la producción española (MAGRAMA, 2013). No obstante, el elevado precio de los cereales, debido a su empleo como biocombustibles, junto con el descenso del precio de la leche ha causado una importante disminución del número de explotaciones de vacuno de leche en Galicia. Este hecho, unido a que las nuevas orientaciones de la Política Agraria Común (PAC) desincentivan la producción intensiva de alimentos, la desaparición de las cuotas lácteas y el apoyo a medidas agroambientales que sean más respetuosas con el entorno natural, ha ocasionado que muchos ganaderos se hayan decantado por la explotación de ganado ovino y caprino como una alternativa válida a la cría de ganado vacuno lechero. En las últimas décadas, se ha considerado la contribución de los pequeños rumiantes en la gestión eficaz de la superficie agraria de Galicia; en este sentido se desarrolló un Convenio Silvopastoril en los años 2007-2009 en el que intervinieron la Consellería do Medio Rural y la Asociación de Defensa Sanitaria de Ovino y Caprino de Galicia “ACIVO”, que tuvo como objetivos fundamentales: - Poner en valor la producción agroganadera y forestal, así como del territorio, contribuyendo a fijar y mantener la población del medio rural, al tiempo que se compatibilizaba la explotación de la ganadería extensiva y de la fauna silvestre. - Ordenar el territorio a través de la gestión de la superficie infrautilizada, incrementando la extensión de los pastos de las explotaciones. - Utilizar el ganado ovino y caprino para controlar la biomasa y, de esta forma, prevenir los incendios, al tiempo que, se revaloriza la producción ganadera y forestal. 4 ANA PÉREZ CREO En la actualidad en España existe un importante nicho de mercado para la comercialización de la carne de cordero y cabrito; sin embargo, a pesar de que en Galicia se dispone de importantes zonas de pasto y de suficiente cantidad de forraje para la explotación de estos pequeños rumiantes, solo se produce el 30% de la carne de cordero que se consume. Para fortalecer la producción de carne de ovino y caprino en Galicia, al tiempo que se aumenta su competitividad en el mercado español, se debe disponer de unas explotaciones con un correcto estado sanitario que permita optimizar su rendimiento. En este sentido resulta imprescindible determinar cuáles son las principales infecciones parasitarias que afectan a los pequeños rumiantes en esta Comunidad Autónoma, para así poder instaurar las correspondientes pautas de control y, de esta forma, reducir las importantes pérdidas económicas, tanto directas como indirectas, que ocasionan las parasitosis. No obstante, el adecuado desarrollo y posterior aplicación de programas estratégicos de control se basa en la elaboración previa de estudios epidemiológicos de los procesos parasitarios que afectan a los animales de una determinada zona (González-Lanza et al., 1993; Jithendran y Bhat, 1999; Dimander et al., 2003). De hecho, se ha constatado que la aplicación de tratamientos antihelmínticos incorrectos y sin base epidemiológica, además de resultar poco eficaces y muy costosos, provoca problemas de resistencias antihelmínticas (Álvarez-Sánchez et al., 2006a; Díez-Baños et al., 2008; Torres-Acosta et al., 2012; Papapoulus et al., 2012; Geurden et al., 2014; Martínez-Valladares et al., 2015). En Galicia, debido a que existen las condiciones climáticas y edáficas que favorecen el desarrollo del ciclo biológico de Fasciola hepatica, las infecciones por este trematodo hepático son frecuentes en los animales, especialmente en los rumiantes. Nuestro grupo de Investigación en Sanidad Animal en Galicia (INVESAGA), en estudios previos, ha comprobado que existe una elevada prevalencia de infección en el ganado vacuno (Morrondo et al., 1994, 1997, 2003; Sánchez-Andrade et al., 2000, 2002; Díaz, 2006; Arias et al., 2011); asimismo, en estos trabajos se analizó la influencia de diversos factores intrínsecos (edad, sexo, raza) y extrínsecos (condiciones edafoclimáticas, tipo de manejo, etc.). Sin embargo, los estudios epidemiológicos sobre la prevalencia de infección por F. hepatica en ganado ovino y caprino son escasos en esta comunidad (Paz-Silva et al., 2003; Vázquez et al., 2008). Introducción 5 Con el avance de las técnicas de inmunodiagnóstico se han puesto a punto nuevas técnicas serológicas como el ELISA MM3-SERO, que utiliza antígenos de excreciónsecreción de F. hepatica y que según Muiño et al. (2011) tiene una especificidad y sensibilidad del 100% y 99%, respectivamente. Este test de inmunodiagnóstico ha demostrado ser de gran utilidad para determinar, en encuestas seroepidemiológicas, la prevalencia de infección por F. hepatica en ganado vacuno (Mezo et al., 2004). OBJETIVOS 14 ANA PÉREZ CREO En la época en la que el ganado ovino tenía un importante protagonismo en la economía nacional, el caprino tenía un papel más modesto. No obstante, el clima y la orografía de España, junto con la capacidad de las cabras para aprovechar los pastos de menor calidad, hicieron que la explotación de este ganado fuese una importante fuente de recursos para las familias (Gallego, 1993). La situación privilegiada del ganado ovino decae a finales del S. XV, debido a que los agricultores presionan a los ganaderos roturando los pastos e invadiendo las cañadas. Así, mientras que en Europa se empezaba a definir el modelo mixto agrícola-ganadero, en España se consolidaba el desmantelamiento del sector ganadero (Doménech y Barco, 1994), obligando a instaurar un sistema de explotación extensivo que alejaba a los ovinos de las tierras más productivas. En consecuencia, se obstaculizó el desarrollo tecnológico del sector ovino justo en el momento en el que se tenía que haber favorecido la producción de carne o de leche y, por tanto, la explotación del ganado ovino quedó relegada a granjas familiares poco tecnificadas. A mediados del siglo XX la producción de pequeños rumiantes queda relegada al olvido debido al incremento de la explotación de otras especies cárnicas, como el porcino y las aves, más tecnificadas y desligadas totalmente de la tierra. Además, fue el ganado caprino el que experimentó mayor regresión, debido a la falsa idea de que producía graves daños a las zonas forestales españolas (Romagosa, 1975). En la actualidad, en España, la explotación de ganado ovino y caprino es esencial para mantener la actividad agraria en zonas con limitaciones agroclimáticas, debido a la gran adaptación de estos animales, en especial de los de razas autóctonas, al medio en el que viven. La explotación de estos rumiantes en régimen extensivo o semiextensivo hace que esta sea una ganadería sostenible. Además, el manejo tradicional de los rebaños favorece la presencia humana en zonas rurales poco favorecidas y, en consecuencia, frena el despoblamiento del medio rural y ayuda a la conservación del medio, puesto que se mantiene el entorno en buenas condiciones agroambientales. Revisión bibliográfica 15 Galicia tuvo en el pasado una relevante importancia en la explotación de pequeños rumiantes; a mediados del siglo XIX tenía un censo aproximado de dos millones de efectivos, de los que el 75% correspondían al ganado ovino. En la tercera década del siglo XX el censo se había reducido a la mitad, aunque se mantuvo la proporción de ambas especies. No obstante, Bouhier (1979) sugiere que estos censos no son fiables, debido fundamentalmente a que los ganaderos no declaraban el número real de animales que tenían en su explotación. El verdadero inicio de una drástica reducción del censo se llevó a cabo con el comienzo de las repoblaciones forestales masivas en los años 50. 3.1.1. Censo y producción de ovino En el año 1970 había en España unos 17.000.000 efectivos que, debido a la incorporación de España a la Comunidad Económica Europea (CEE), aumentaron en más de 3 millones, siendo el censo en 1986 de 20.310.000 de cabezas. Posiblemente parte de este incremento se debió a que dentro del marco de la Política Agraria Común (PAC) se concedieron primas por la explotación de ganado lanar. En el año 2013, según el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA, 2014), en España estaban censadas más de 16 millones de cabezas, lo que le confiere una importante relevancia dentro de la actual Unión Europea (UE), ya que es el segundo país con mayor censo ovino, representando el 20% del total comunitario, únicamente superado por el Reino Unido (Figura 3.2). Respecto a la estructura y número de las explotaciones, se aprecia un ligero descenso en los últimos años, puesto que había 122.694 en el 2007 y en el 2013 estaban censadas 111.787. Sin embargo, según el MAGRAMA, la cifra provisional de explotaciones a 1 de enero del 2014 (Datos SITRAN; Sistema Integral de Trazabilidad Animal) era de 114.902, lo que implica que desde enero del 2013 se ha registrado un aumento del 0,38% y, por lo tanto, se está deteniendo la tendencia de reducción registrada en los últimos años, siendo las explotaciones de producción mixta las que más se han incrementado (3,6%). 16 ANA PÉREZ CREO Figura 3.2. Distribución del censo ovino en los países de la UE (MAGRAMA, 2014) En los últimos años ha aumentado la producción de leche, en especial la de oveja (9,7% en el período 2011-2012), debido al incremento de la fabricación de quesos y de otros productos derivados de la leche. Castilla y León es la Comunidad con mayor producción (366.537.000 de litros), lo que supone el 66,3% del total español. Por el contrario, la carne de ovino experimentó, a principios del año 2000, el máximo de producción registrándose posteriormente, un descenso continuado hasta nuestros días. Dentro de España existen diferencias notables (Figura 3.3) en la extensión y localización de las explotaciones ovinas, siendo Extremadura la comunidad con mayor censo (21%), seguida de Castilla y León (19%), Castilla la Mancha (15%) y Andalucía (13,3%). En Galicia, el ganado ovino no tiene la misma importancia que en otras regiones del país. En el año 2013 estaban censadas 204.492 cabezas, distribuidas en 23.619 rebaños (Consellería do Medio Rural, 2014), lo que representa el 1,2% del censo nacional (Figura 3.3). Revisión bibliográfica 17 Figura 3.3. Distribución del censo ovino en España (MAGRAMA, 2014) Entre los diversos motivos que han incidido sobre el bajo censo de ganado ovino en Galicia, cabe señalar el abandono progresivo del aprovechamiento del monte y la repoblación forestal claramente opuesta a los intereses ganaderos. En este contexto, extensas áreas ocupadas en otro tiempo por el ganado ovino dejaron de utilizarse para este fin. Además, las tierras más productivas se han destinado a la producción de ganado vacuno de leche y de carne. En la actualidad los principales rebaños se localizan en las provincias de Ourense y Lugo, en las que está censado el 68% de la ganadería ovina gallega (Tabla 3.1). En Galicia, el ganado ovino se explota fundamentalmente para producir carne; no obstante, solo representa el 0,1% de la producción total de carne en nuestra Comunidad. La Consellería do Medio Rural (2013) estima que se producen 350 toneladas de carne de cordero, si bien esta cifra podría ser superior si se tiene en cuenta que un importante número de ovinos se sacrifican en matanzas domiciliarias. 18 ANA PÉREZ CREO Tabla 3.1. Análisis provincial del censo de ovinos (MAGRAMA, 2014) Provincia Corderos Sementales Hembras % ovino respecto al total español % ovino respecto al total gallego A Coruña 1.081 2.914 29.493 0,24% 17,4%% Lugo 1.931 3.334 51.484 0,43% 29,4% Ourense 5310 3.396 68.471 0,53% 38,6% Pontevedra 497 1.678 25.433 0,2% 14,6% GALICIA 8.819 11.022 174.881 1,4% ESPAÑA 2.777.241 399.192 13.162.940 La mayoría de los rebaños gallegos son de pequeño tamaño y tan solo el 1% de las explotaciones tienen más de 100 cabezas, siendo la media de 263 animales por rebaño (Tabla 3.2). Tabla 3.2. Estructura productiva por tamaño de explotación (Consellería do Medio Rural, 2014). Cabezas Explotación <10 10 a 49 50 a 99 100 a 249 > 249 TOTALES A Coruña Explot. 5.899 817 28 8 7 6.759 Cabezas 21.575 13.247 1.737 1.226 2.760 40.545 Lugo Explot. 5.579 1.534 151 68 16 7.348 Cabezas 22.540 28.475 10.521 10.153 5.267 76.956 Ourense Explot. 2.252 1.305 184 150 51 3.942 Cabezas 10.856 25.422 12.608 23.901 19.901 92.688 Pontevedra Explot. 5.473 724 36 24 - 6.257 Cabezas 19.183 11.597 2.356 3.623 - 36.759 Galicia Explot. 19.203 4.380 399 250 74 24.306 Cabezas 74.154 78.741 27.222 38.903 27.928 246.948 * Explot.: número de explotaciones Los propietarios de los rebaños más grandes, en general, están integrados en la Asociación de Defensa Sanitaria Ganadera (ADSG) de ovino y caprino de Galicia ACIVO, la única que cuenta con un equipo de veterinarios especializados y responsable de llevar a cabo los distintos programas sanitarios en los pequeños rumiantes gallegos. Asimismo, como se refleja en la Tabla 3.3, es frecuente observar la presencia de cabras conviviendo en un contacto más o menos estrecho con las ovejas. Revisión bibliográfica 19 Tabla 3.3. Tipos de rebaños en Galicia (Consellería do Medio Rural, 2014). EXPLOTACIONES Nº DE OVEJAS Nº DE CABRAS Solo ovejas 154.059 - Solo cabras - 22.224 Mixtas 47.728 22.937 TOTALES 201.787 45.161 3.1.2. Censo y producción de caprino En España la explotación de las cabras ha estado vinculada a las áreas más desfavorecidas, como las zonas de montaña y las áreas agrícolas en las que había terrenos de baldío y restos de cultivos. Según el MAGRAMA (2014), son los países mediterráneos (Grecia, España, Italia, Francia) los que tienen el 75% de la cabaña caprina censada en la UE, siendo Grecia (35%) y España (21%) los que tienen mayor número de cabras (Figura 3.4). Figura 3.4. Censo caprino en la UE (MAGRAMA, 2014). 20 ANA PÉREZ CREO En los últimos años la explotación del ganado caprino en España se ha profesionalizado, aunque sigue siendo bastante heterogénea respecto a los sistemas de explotación, razas utilizadas y nivel de formación de los ganaderos. La mayoría de las cabras se explotan para producción leche que se utiliza, básicamente, en la elaboración de quesos. En la actualidad, la producción de leche de cabra en nuestro país es de 330.500 toneladas anuales (MAGRAMA, 2014), lo que nos permite competir con Francia y Holanda en la producción de quesos frescos y maduros. Por el contrario, la producción de carne se considera, en general, un producto secundario hasta el punto que desde el año 2000 se ha reducido drásticamente el número de explotaciones de caprino de carne. En cuanto al régimen de manejo, las razas de caprino de alta producción lechera y, por tanto, con altas exigencias nutritivas, se crían en intensivo o en semiextensivo en áreas topográficas poco accidentadas y con elevada disponibilidad forrajera; sin embargo, las razas de menor producción lechera se mantienen en pastoreo extensivo o semiextensivo en zonas de montaña o de cultivos marginales, en los que aprovechan los subproductos agrícolas. En España el número de cabras y de explotaciones ha experimentado un notable ascenso en los últimos años (MAGRAMA, 2014), siendo Andalucía (28%), Castilla la Mancha (15%) y Canarias (11%) las comunidades autónomas que tienen mayor censo de ganado caprino (Figura 3.5). En Galicia, los rebaños de cabras siempre han estado ligados a zonas de montaña, donde hace años se explotaban en “veceiras” (rebaños comunitarios), normalmente de forma conjunta con ganado ovino. Este pequeño rumiante resulta óptimo para el aprovechamiento de los recursos naturales de nuestra Comunidad, debido a su rusticidad y adaptación a la orografía y climatología de las montañas gallegas. En la actualidad este sector se está profesionalizando, y cada vez son más las explotaciones en las que se cría exclusivamente ganado caprino. El tamaño de estas ganaderías es variable, siendo frecuente los rebaños con menos de 100 animales, aunque excepcionalmente hay explotaciones con más de 400 cabezas. Revisión bibliográfica 21 Figura 3.5. Distribución del censo caprino en España (MAGRAMA, 2014). La “Cabra Galega” es la única raza autóctona originaria de Galicia. Su importancia radica en su excepcional rusticidad y en su capacidad de adaptación a las zonas con pastos en los que difícilmente se podrían mantener otros animales. Su ancestro es la especie Capra aegagrus que, dentro del denominado tronco pirenaico, en España dio lugar a un importante número de razas que se dispersaron por las zonas montañosas, especialmente en el norte de la península. No obstante, determinados caracteres étnicos de la raza, como son los cuernos tipo Aegagrus en las hembras y los cuernos tipo Prisca en los machos, pueden haber derivado de un tronco distinto. La adaptación que experimentó la raza a las condiciones orográficas y climatológicas gallegas le otorgó las cualidades y características que observamos hoy en día. Dentro de las características morfológicas de la raza Cabra Galega podemos destacar su perfil recto o subcóncavo, eumétrico, sublongilíneo y el gran dimorfismo sexual. En lo concerniente a la capa, presenta diferentes tonalidades que van del color caoba al rojizo y, a veces, se pueden observar pelos largos y abundantes en las distintas regiones del tercio anterior y posterior, o distribuidos por todo el cuerpo. Los cuernos se sitúan en arco hacia atrás y se caracterizan, como ya comentamos anteriormente, por ser de tipo Aegagrus en las hembras y frecuentemente de tipo Prisca en los machos (Figura 3.6). 22 ANA PÉREZ CREO Figura 3.6. Rebaño de Cabra Galega. Se calcula que en el siglo XVIII había 600.000 ejemplares, mientras que en la actualidad su censo es de 50.000. Este drástico descenso se produjo, entre otras razones, porque hasta hace poco esta raza no estaba reconocida y no había ninguna asociación de criadores preocupada por su conservación. Además, con objeto de evitar problemas de consanguinidad se importaron sementales de otras razas autóctonas de otras Comunidades Españolas y de Portugal. Cuando en el año 2010 se iniciaron los programas de recuperación de esta raza autóctona, y debido a que en Galicia estos animales siempre estuvieron ligados a zonas montañosas, se encontraron ejemplares de cabra galega en los Ancares lucenses y en la Baixa Limia en Ourense. En el último censo realizado en 2012, el número de animales había aumentado considerablemente, debido a que se había incrementado el número de criadores que apostaban por esta raza (Tabla 3.4). Tabla 3.4. Censo de ejemplares adultos de raza cabra galega en el libro genealógico (BOAGA, 2012) GANADERÍAS MACHOS HEMBRAS TOTAL DE EJEMPLARES A CORUÑA 6 6 42 48 LUGO 18 32 237 269 OURENSE 21 25 163 189 PONTEVEDRA 9 5 29 34 Revisión bibliográfica 23 El principal objetivo de la explotación de cabra galega es la producción de carne de cabrito. Estos se crían de dos formas; en extensivo, donde las crías salen al monte desde el primer día de vida y únicamente se alimentan con leche materna, o en semiextensivo, siendo también alimentados por sus madres, pero cuando las condiciones climatológicas son adversas se estabulan y su alimentación se suplementa con cereales. 3.2. FASCIOLOSIS Esta enfermedad está causada por parásitos trematodos Digenea que pertenecen al género Fasciola, y cuya difusión geográfica es cosmopolita, puesto que su distribución es prácticamente mundial. Se han descrito varias especies dentro del género Fasciola, pero sólo se reconocen como válidas desde el punto de vista taxonómico a Fasciola hepatica, Linneo (1758) y Fasciola gigantica, Cobbold (1855). La primera predomina en zonas de climas templados, en tanto que la segunda se encuentra con mayor prevalencia en regiones tropicales o subtropicales, sin excluir su presencia en otras regiones. F. hepatica parasita a numerosas especies de mamíferos, si bien se consideran hospedadores más adecuados los rumiantes, tanto domésticos como silvestres. Así pues, en España se ha encontrado parasitando ovejas, cabras, vacas, gamos, ciervos, corzos, asnos, caballos, cerdos, jabalíes, conejos, liebres y también al hombre (Rojo y Ferre, 1999; RojoVázquez et al., 2012). Los ejemplares adultos de F. hepatica tienen forma lanceolada y su tamaño oscila entre 2,5-5,0 y 0,4-1,3 cm; en el polo anterior se aprecia un cono cefálico bien diferenciado, que finaliza en una ventosa oral, fácilmente visible y muy cercana a otra ventosa ventral o acetábulo más grande. 30 ANA PÉREZ CREO 3.2.2.1. Factores extrínsecos A. Condiciones edafoclimáticas Como se ha señalado anteriormente, en las infecciones por F. hepatica tienen una gran importancia las condiciones que haya en el medio, fundamentalmente la temperatura y, sobre todo, la humedad y/o las precipitaciones, que permiten la supervivencia de los huevos en el exterior y propician la presencia de hospedadores intermediarios. Los parámetros climáticos que más influyen sobre la supervivencia y desarrollo de los huevos en el medio ambiente son la temperatura y la humedad. Diversos autores (Luzón et al., 1991, 1992; Rojo-Vázquez et al., 2012) señalan que para que los huevos prosigan su desarrollo deben ser liberados de las heces, ya que si quedan incluidos en éstas, no evolucionan aunque la temperatura y humedad sean óptimas. Sin embargo, en el seno de las heces los huevos pueden permanecer viables desde unas semanas hasta varios meses, dependiendo del grado de humedad que tenga la materia fecal. Se ha observado que en condiciones de campo los huevos de F. hepatica permanecen viables durante bastante tiempo con temperaturas bajas e incluso soportan el invierno si las temperaturas mínimas no son extremas (Luzón et al., 1991, 1992; Rojo y Ferre, 1999); posteriormente, durante la primavera y si las condiciones ambientales son favorables, continuarán su desarrollo. No obstante Luzón et al. (1991, 1992), señalan sobre el desarrollo del huevo que, además de la temperatura, debe existir una humedad mínima constante que permita a éste estar rodeado de una película de agua, ya que la desecación destruye los huevos. Las temperaturas inferiores a 0º y superiores a 30ºC limitarán las posibilidades de desarrollo de los huevos excretados durante los meses de otoño y primer tercio estival en relación con aquellos que hayan sido eliminados en zonas encharcadas. Otros factores que influyen sobre el desarrollo de los huevos son el pH y la tensión de oxígeno. Si ésta última es elevada, se favorece la viabilidad de los huevos y la eclosión del miracidio. Asimismo, se ha comprobado que el pH entre 4,2 y 9 permite la evolución del huevo, siendo los suelos ácidos muy favorables (Rojo y Ferre, 1999). Revisión bibliográfica 31 La temperatura también resulta esencial para el desarrollo de los miracidios dentro de los huevos, de modo que la velocidad con que embrionan los huevos hasta formar el miracidio depende de este parámetro (Díez-Baños, 2011). Además, la eclosión del miracidio depende de la luz, siendo la idónea una banda de 650 nm, que estimula la producción de una enzima proteolítica fotoactiva que debilita la unión del opérculo con la cubierta del huevo. A 26 °C se completa el proceso en 12 días, aunque en condiciones naturales se requieren varias semanas (hasta 2 meses) cuando la temperatura oscila entre 10-12 °C. La vida del miracidio depende de sus reservas energéticas, debiendo encontrar un molusco hospedador adecuado antes de 24 horas. En la búsqueda del hospedador intermediario están implicados estímulos quimiotácticos e intervienen la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto, la composición iónica, la salinidad y la turbidez del agua, entre otros factores (Rojo y Ferre, 1999). Asimismo, la presencia y abundancia de los moluscos hospedadores intermediarios (G. trucatula) dependen de la temperatura y de la humedad. Morrondo et al. (1994) observaron que con humedad suficiente y temperaturas por encima de los 10ºC los caracoles siguen activos, mientras que se entierran si la humedad baja en exceso. Además, estos mismos autores comprobaron que en el noroeste de España las temperaturas suaves y las precipitaciones elevadas favorecen la proliferación de los hospedadores intermediarios y el aumento de la contaminación del pasto por metacercarias. Por ello, los hospedadores definitivos pueden infectarse durante todo el año, lo que coincide con las observaciones de González-Lanza et al. (1989) en León. En este sentido, diversos autores (Díez-Baños et al., 1989 b,c; Rojo y Ferre, 1999; Abrous et al., 1999; Szmidt-Adjidé et al., 2000; Silvestre et al., 2000; Paz-Silva et al., 2003; Otranto y Traversa, 2003; Arias et al., 2011) han señalado que las infecciones por Fasciola son enzoóticas en áreas donde haya elevadas precipitaciones anuales y terrenos mal drenados, ya que constituyen el hábitat idóneo para G. truncatula. No obstante, también se ha comprobado que en la prevalencia de infección por F. hepatica, más que de las condiciones climáticas registradas ese año, influyen las del año anterior (Rojo-Vázquez et al., 1989; Gónzalez-Lanza et al., 1989; Manga et al., 1991; Sánchez-Andrade et al., 1995; SzmidtAdjidé et al., 2000; Arias et al., 2011). 32 ANA PÉREZ CREO Respecto a la supervivencia de las metacercarias se ha comprobado que se mantienen viables durante períodos prolongados, siempre que la humedad sea superior al 70%. Sin embargo, la desecación y la acción directa de la luz solar son muy perjudiciales (Rojo-Vázquez et al., 1989, 2012; Rojo y Ferre, 1999). En este sentido, en la provincia de León, Manga et al. (1991) obtuvieron el máximo de metacercarias en la hierba entre septiembre y diciembre, por lo que consideran este periodo como el de mayor riesgo para la infección de los hospedadores definitivos. Sin embargo, en su opinión los animales podrían infectarse durante todo el año, porque los moluscos se mostraban activos durante todo el año y albergaban redias con cercarias maduras en mayor o menor cuantía. No obstante, en lugares más áridos, como en la provincia de Madrid, Luzon et al. (1991) señalaron que la existencia de metacercarias en los pastos en el otoño está condicionada por la pluviosidad de septiembre y por las temperaturas habidas en octubre y noviembre, situándose la época de mayor riesgo de infección para los hospedadores definitivos entre noviembre y febrero/marzo. Respecto a la influencia de las características orográficas, en la bibliografía consultada se han encontrado resultados dispares y, en general, siempre están asociados a las condiciones ambientales de la zona. Además, la mayoría están referidos a datos de prevalencia de infección de F. hepatica en distintas especies de rumiantes domésticos, especialmente en ganado vacuno. Empleando técnicas inmunoenzimáticas (ELISA directo e indirecto), diversos autores (Marín, 1992; Morrondo el al., 1997; Paz et al., 1998; Sánchez-Andrade et al., 1995, 2001a, 2002) observaron en vacuno explotado en Galicia mayores seroprevalencias en zonas de montaña, con bajas temperaturas y elevadas precipitaciones, que en animales que pastaban en zonas de costa, donde había menor altitud y temperaturas más elevadas. Además, Paz et al. (1998) concluyeron que la seroprevalencia de las infecciones por F. hepatica estaba directamente relacionada con la altitud y humedad de las áreas donde pastaban los animales. Morrondo el al. (1997) comprobaron que la seroprevalencia y la temperatura estaban inversamente relacionadas; por el contrario, había una relación directa con la humedad y la altitud de la zona, probablemente debido a que en las zonas húmedas y con temperaturas más bajas la densidad del hospedador intermediario G. truncatula era mayor y, por tanto, también lo sería el número de metacercarias a disposición de los hospedadores definitivos. Por el Revisión bibliográfica 33 contrario, en ganado de raza Rubia Gallega, Arias et al. (2004) comprobaron que la seroprevalencia más elevada correspondía a vacas explotadas en zonas del centro de la provincia de Lugo con altitudes de 350-500 m y precipitaciones inferiores a 1200 mm. En ganado caprino y ovino, Martínez-Cruz et al. (1995) obtuvieron mayor seroprevalencia (3,5%) en cabras que pastaban en áreas de montaña (Sierra Morena) que las que lo hacían en zonas más llanas situadas en la rivera del Guadalquivir (0,36%). Por el contrario, Ferre et al. (1995), en ovejas de la Provincia de León, no observaron diferencias entre los animales muestreados en las cuatro regiones naturales (Montaña, Bierzo, Tierras de León y Tierras Bajas). Asimismo, Painceira (2012) en ovinos explotados en diversas localidades de Galicia, comprobó que no existían diferencias significativas respecto al porcentaje de ovinos que eliminaban huevos de F. hepatica. Sin embargo, en países del Norte de Europa (Noruega), mediante necropsia y análisis coprológicos realizados en cabras y ovejas, se encontraron mayores prevalencias en los animales que pastaban en la costa, donde el invierno es más corto y suave que en otras zonas del país (Domke et al., 2013). En resumen, y de acuerdo con los diferentes autores antes citados, la epidemiología de las infecciones por F. hepatica depende básicamente de las condiciones meteorológicas de la zona de estudio y que, tras primaveras y veranos muy lluviosos, los brotes de fasciolosis se manifiestan en otoño. B. Manejo de los pastos y de los animales En ganado vacuno de Francia, Rondelaud y Mage (1991) señalaron que existían distintos periodos de riesgo para la infección de los animales por F. hepatica, que a su vez dependían de la climatología y de la abundancia de los pastos. Al inicio de la primavera, el riesgo de infección era bajo, ya que los animales disponían de pastos abundantes y no estaban forzados a aprovechar las zonas húmedas y residuales, que son las que entrañan más peligro. Por el contrario, al inicio del verano las praderas están bastante agostadas y el ganado se ve obligado a pastar en las zonas húmedas, donde hay más hierba pero también está más contaminada con metacercarias. No obstante, el periodo de mayor riesgo es el otoño, porque 34 ANA PÉREZ CREO los hospedadores intermediarios, tras un período de estivación, reinician su actividad con las primeras lluvias otoñales y liberan numerosas cercarias. Diversos autores (Uriarte et al., 1985; Luzón et al., 1997; Otranto y Traversa, 2003) han señalado que en ganado ovino la prevalencia de infección por F. hepatica era superior cuando pastaban en terrenos de regadío que cuando lo hacían en pastos de secano. Además, Otranto y Traversa (2003) han señalado que en los últimos 50 años el hombre ha realizado cambios en el medio, mediante la construcción de presas, diversos sistemas de irrigación, etc., de modo que ha transformado lugares secos en húmedos, contribuyendo notablemente a la expansión geográfica de la fasciolosis. Respecto al régimen de explotación y al número de animales que integran los rebaños, la mayoría de los estudios se han realizado en ganado vacuno. Sánchez-Andrade et al. (2001a) obtuvieron mayores seroprevalencias de infección por F. hepatica en animales en pastoreo extensivo o semi-extensivo, debido a que estos sistemas de explotación favorecen la ingestión de metacercarias. Díez-Baños et al. (1989a) y Morrondo et al. (1994), en vacuno de raza frisona de Galicia, comprobaron que los porcentajes de infección por F. hepatica, así como los recuentos de huevos en heces, eran más elevados en granjas de mediano tamaño, de carácter familiar, que en las explotaciones másgrandes, probablemente debido, en este último caso, a un mejor manejo de los animales. Como señalábamos anteriormente, en Galicia es frecuente que haya rebaños mixtos de ovejas y cabras. No obstante, son escasas las referencias bibliográficas relativas a la posible influencia de este hecho en la prevalencia de infección por F. hepatica. López et al. (2011), en estudios realizados en Galicia, demostraron que el hecho de que existan cabras en los rebaños de ovejas constituye un factor de riesgo en las infecciones por nematodos Protostrongylidae. Posteriormente, López et al. (2013) comprobaron que la convivencia de ovejas y cabras también constituía un factor de riesgo para la primeras en relación a las infecciones por Eimeria, Dictyocaulus filaria y nematodos gastrointestinales, aunque no lo era para las infecciones por Moniezia, F. hepatica, Paramphistomum o Dicrocoelium dendriticum. Por el contrario Cabanelas et al. (2014) observaron que la Revisión bibliográfica 35 presencia de ovejas en los rebaños de cabras constituye un factor de riesgo en las infecciones por Toxoplasma gondii. 3.2.2.2. Factores intrínsecos A. Raza En ganado vacuno, Sánchez-Andrade et al. (1995) y Morrondo et al. (1997) señalaron que las razas autóctonas, como la Rubia Gallega, presentaban seroprevalencias significativamente inferiores que otras razas, debido probablemente a que, en zonas endémicas como el noroeste de España, las razas autóctonas se han adaptado al contacto continuo con F. hepatica. Posteriormente, SánchezAndrade et al. (2000, 2002) comprobaron que en los bovinos procedentes de cruces la seroprevalencia era superior a la hallada en razas más seleccionadas como la Frisona o la Parda Alpina. En un estudio realizado en pequeños rumiantes de Pakistán, Afshan et al. (2013) observaron que en las razas autóctonas de cabras (Local Hairy o Beetal) y de ovejas (Salt Range) la prevalencia de infección de F. hepatica era menor que en los cruces. Preston y Allomby (1979), al igual que Roberts et al. (1997 a, b), señalan que las diferencias en la prevalencia por diversos helmintos en distintas razas de ovejas podrían tener una base genética, relacionada con genes de dominancia incompleta, al encontrar diferencias entre razas de ovejas sometidas a iguales condiciones de manejo. B. Sexo La mayoría de los autores (Pal y Qayyum, 1992; Valcárcel y García Romero et al., 1999; Phiri et al., 2005 a, b; Khan et al., 2009) coinciden en señalar que el sexo de los animales influye sobre la prevalencia de infección por diversos endoparásitos, ya que el estrés al que se ven sometidas las hembras durante la gestación y el periparto produce un descenso del estado inmunitario. En este sentido, en vacuno de Zambia y Pakistán, diferentes autores (Phiri et al., 2005 a, b; Khan et al., 2009, 2010) comprobaron que, aunque el manejo de los machos y de las hembras fuera similar, estas últimas presentaban mayor prevalencia e intensidad de infección. 36 ANA PÉREZ CREO C. Edad En ganado vacuno la mayoría de los autores (González-Lanza et al., 1989; Waruiru et al., 1993; Morrondo et al., 1994, 1997; Sánchez-Andrade et al., 2002) observaron una correlación positiva entre la edad y la prevalencia de infección por F. hepatica, debido a que los animales más jóvenes, al haber permanecido menor tiempo en los pastos, habían tenido menos oportunidades de infectarse que los de mayor edad. En ganado ovino también se ha observado esta correlación positiva entre la edad y la prevalencia. Ferre et al. (1991), en ovejas de la provincia de Segovia, observaron que los animales que habían pastado sólo una temporada no eliminaban huevos de F. hepatica mientras que un pequeño porcentaje (0,9%) de los que lo habían hecho durante 2 o más temporadas sí lo hacían. Asimismo, Vázquez et al. (2008) y Painceira (2012) señalaron que la prevalencia de infección por F. hepatica era superior en los animales de mayor edad, aunque estas diferencias no fueron significativas. En ovejas y cabras explotadas en México, Munguía et al. (2007) observaron mayores porcentajes de seroprevalencia en los animales mayores de 6 años (46,6%) que en los menores de 5 (34,6%). Gebeyehu et al. (2013), mediante ELISA indirecto, no detectaron ningún animal seropositivo en cabras menores de 2 años, siendo la seroprevalencia de 1,6% en animales mayores de esta edad. Afshan et al. (2013) en Pakistán, mediante ELISA y coprología, observaron que las ovejas mayores de dos años presentaban mayores prevalencias de infección por F. hepatica que las de menor edad. Por el contrario, Khan et al. (2010) en ovejas y cabras explotadas en Pakistán, no observaron diferencias significativas entre los animales jóvenes (< de 6 meses) y los adultos (> de 6 meses). Revisión bibliográfica 37 D. Respuesta inmunitaria Al igual que otros helmintos, F. hepatica puede sobrevivir en su hospedador durante períodos de tiempo relativamente largos. Por tanto, estos parásitos necesitan disponer de ciertos mecanismos que les permitan evadir el sistema inmune del hospedador. Mientras que en otros helmintos se produce la “inmunidad concomitante”, que se caracteriza por la producción de antioxidantes o estrategias de evasión inmunitaria, como la secreción de enzimas divisorias de anticuerpos y/o agentes antiinflamatorios, F. hepatica no desencadena este tipo de defensa en el hospedador (Mulcahy et al., 1999). Esta resistencia frente a los efectos del sistema inmune se debe, en parte, a la localización de los adultos en los conductos biliares, ya que esta localización es poco accesible al sistema inmunitario. Los antígenos y huevos liberados por los adultos alcanzan el intestino con los ácidos biliares, lo que limita la estimulación del sistema inmunitario y la inmunopatología del proceso. Además, F. hepatica durante su desarrollo y migración en el hospedador definitivo sufre un importante cambio en la superficie tegumentaria, que constituye un mecanismo de evasión de la respuesta inmune del hospedador (Hanna y Jura, 1977; Bennett, 1978; Hanna, 1980b). Algunos estudios mediante inmunoelectroforesis (Bennett et al., 1982) han puesto de manifiesto la existencia de antígenos específicos para cada fase del desarrollo, aunque otros permanecen intactos desde la fase de metacercaria hasta adulto y sirven para el diagnóstico temprano de la infección. Como ya se ha apuntado, la migración del trematodo hacia los conductos biliares se acompaña de una serie de cambios morfológicos y fisiológicos. Algunas de las variaciones más importantes son las alteraciones del glucocálix y del tegumento externo, compuesto por un sincitio anucleado y cuyas células basales y apicales están unidas mediante túbulos (Threadgold, 1963; Bennett y Threadgold, 1975; Hanna, 1980b). En el tegumento del parásito se han identificado unos gránulos secretores que pasan del tipo T0, característicos de la adolescaria, a gránulos T1 y T2 típicos de las formas inmaduras y maduras, respectivamente. Durante la migración hacia el parénquima hepático los gránulos T0 se transforman en células tipo 1, que comienzan a secretar los T1. El tipo celular 2, que se observa en los adultos de F. hepatica, surge de diferentes células embrionarias parenquimatosas al cabo de 2-3 días p.i., pero no libera sus gránulos hasta que el parásito no penetra en los conductos biliares (Bennett y Threadgold, 1975). Según Hanna (1980b) los gránulos T0 y T1 son antigénicamente diferentes a los de tipo T2 de los adultos. 38 ANA PÉREZ CREO Acompañando a los cambios en la composición del glucocálix exterior, durante el proceso de maduración, se produce un cambio en la membrana, puesto que el trematodo se despoja de su viejo glucocálix y lo reemplaza por una cubierta producida por la primera capa de células tegumentarias. Este rápido recambio se observa en las formas inmaduras durante la migración y se ha propuesto como un mecanismo de protección frente a la reacción inmunitaria del hospedador (Bennett et al.; 1982; Hanna, 1980b; Duffus y Franks, 1980 y 1981). Una vez que el parásito alcanza el estadio adulto, el paso de T1 a T2 en la composición del glucocálix se acompaña de una disminución en el ritmo de recambio de la membrana, lo cual podría estar relacionado con la localización de los adultos en los conductos biliares (Hanna, 1979, 1980a). Estas estructuras fisiológicamente diferentes poseen componentes antigénicos comunes muy relacionados con los antígenos de excreción-secreción, que en cada estadio el parásito libera al medio en el que se encuentra (Bennett y Threadgold, 1975). En la década de los 80 se desarrollaron hibridomas productores de anticuerpos monoclonales altamente reactivos a células tegumentarias del parásito adulto (Hanna y Trudgett, 1983). Con posterioridad se demostró que las sustancias secretadas eran antígenos de excreción-secreción que poseen comunidad antigénica con el mismo tipo de productos del parásito adulto. Tras el análisis por inmunodifusión en gel de antígenos excretados por los diferentes estadios de F. hepatica se encontró que los antígenos, que forman líneas de precipitación alrededor de las formas inmaduras, eran también producidos por los adultos (Sandeman y Howell, 1981). El aparato digestivo del trematodo también experimenta cambios durante la maduración y migración. Inicialmente las células del tracto intestinal aparentan tener una función exclusivamente excretora y son morfológicamente diferentes de las de los adultos; de hecho, las células de las formas inmaduras presentan microvellosidades pequeñas e irregulares en comparación con las más numerosas, de forma regular y mayor tamaño de las formas adultas (Bennett, 1978). Las células intestinales poseen numerosos aparatos de Golgi, aunque no son evidentes en los parásitos recién desenquistados. Las secreciones de las formas inmaduras son, principalmente, sustancias hidrolíticas que facilitan el desenquistamiento y las migraciones dentro del hospedador. Una vez que F. hepatica llega a la cavidad abdominal, aproximadamente 24 horas p.i., las células cecales muestran cierta actividad de absorción; sin Revisión bibliográfica 39 embargo, hasta que no alcanzan el parénquima hepático, dichas células son diferentes morfológicamente a las observadas en los adultos (Bennett and Threadgold, 1975). Igualmente destacan los cambios sufridos en el aparato reproductor durante el proceso de maduración (Dawes, 1962). Las gónadas masculinas son los primeras en desarrollarse de forma gradual desde el primer día de la infección hasta la maduración definitiva del parásito. Por el contrario, el desarrollo de las gónadas femeninas no comienza hasta los 8 días p.i. y, coincidiendo con el asentamiento en los conductos biliares, se observan varios centenares de huevos en el útero para su posterior salida al exterior con las heces. Todo lo expuesto da una idea de la inmensa variabilidad antigénica demostrada por F. hepatica desde su entrada en el hospedador definitivo hasta su asentamiento en los conductos biliares. La necesidad de confirmar precozmente la infección ha propiciado la realización de numerosos estudios encaminados a determinar qué antígenos son los más apropiados para el diagnóstico y a identificar aquellos comunes a todos los estadios. En la década de los setenta, se utilizaron antígenos obtenidos de los huevos para comprobar si estos eran capaces de producir resistencia a la infección por F. hepatica en ratas (Ericksen y Flagstad, 1974; Rajasekariah y Howell, 1978). Esta idea fue descartada a principios de la década siguiente (Burden y Hammet, 1980), ya que poseen poca capacidad inmunógena. Posteriormente se utilizaron antígenos obtenidos de adolescarias obtenidas de ovinos infectados con este trematodo; se comprobó mediante difusión en gel que estos antígenos eran secretados tanto por las formas inmaduras como por las maduras, fundamentalmente en la carboxicolesterasa, acetilcolinesterasa y fosfatasa alcalina (Sandeman y Howel, 1981; Hughes et al., 1981). Los antígenos de excreción-secreción parecen tener un papel importante en la formación de anticuerpos, tanto por su especificidad como por su utilidad diagnóstica (Sandeman y Howel, 1981; Pfister et al., 1984; Espino et al., 1987; Mezo et al., 1998, 2003; Sánchez-Andrade et al., 2000, 2001 a, b, 2002; Paz Silva et al., 1998, 2002, 2003, 2005; Arias et al., 2007, 2009, 2010, 2012, 2013). 46 ANA PÉREZ CREO Rodríguez-Pérez y Hillyer, 1995; Espino et al., 1997; Abdel-Rahman et al., 1998; Mansour et al., 1998; Hegab y Hassan, 2003; Mezo et al., 2004). El ELISA sándwich o doble (ELISA-d) se basó inicialmente en el empleo de dos anticuerpos policlonales (IgG), obtenidos de conejos inmunizados con un antígeno del parásito (Rodríguez-Pérez y Hillyer, 1995; Sánchez-Andrade et al., 2000; Paz-Silva et al., 2002, 2003); asimismo, mediante un proceso más complejo, se desarrollaron los anticuerpos monoclonales (Duménigo et al., 1996; Espino et al., 1997) que detectan antígenos de F. hepatica en suero a partir de la primera s.p.i. (Almazán et al., 2001). Paz-Silva et al. (2002) reinfectaron dos grupos de ratas en periodos diferentes de la infección y, mediante un ELISA-d con IgG policlonal, comprobaron que en los animales reinfectados en la fase aguda, los coproantígenos se detectaban antes que en las reinfectadas en fase crónica, concluyendo que el periodo en el que se reinfectan los animales modifica la cinética de coproantígenos. Rodríguez-Pérez y Hillyer (1995) en ovejas infectadas experimentalmente detectaron, mediante ELISA-d e IgG policlonal anti-F.hepatica, antígenos circulantes del trematodo entre la 2ª y 6ª semana p.i., obteniendo las cifras más elevadas a la 8ª s.p.i. Asimismo, en infecciones experimentales de ovinos, nuestro grupo de investigación (Paz-Silva et al., 1999, 2003; Morrondo et al., 2000, 2005; Sánchez-Andrade et al., 2001; Arias et al., 2004) demostraron la validez de un ELISA-d basado en el uso de anticuerpos policlonales para el diagnóstico de infecciones activas de F. hepatica, al tiempo que comprobaron su utilidad para evaluar los tratamientos antihelmínticos. Duménigo et al. (1996) desarrollaron un ELISA-d utilizando un anticuerpo monoclonal (ES78) para detectar coproantígenos de F. hepatica en heces de ganado vacuno. Posteriormente Duménigo et al. (2000), utilizaron esta misma prueba para la detección de antígenos en suero y en heces de ovejas infectadas experimentalmente. Al comparar los resultados obtenidos con la detección de antígenos y de anticuerpos observaron que a la 1ª s.p.i., todos los animales habían desarrollado anticuerpos anti-Fasciola, mientras que los Revisión bibliográfica 47 primeros antígenos séricos y coproantígenos se detectaron a partir de la 3ª s.p.i. e incluso en algunos animales no llegaron a detectarse. Espino et al. (1997) pusieron a punto un ELISA-d empleando un anticuerpo monoclonal, y en suero de ratas infectadas de forma experimental observaron antígenos circulantes entre la 1ª y la 3ª s.p.i., lo que coincidía con la migración de las fasciolas por el parénquima hepático. Mezo et al. (2004) desarrollaron un ELISA-d basado en el empleo de un anticuerpo monoclonal (MM3), obtenido por inmunización de ratones con una fracción purificada de antígenos de excreción/secreción (ESAs) de F. hepatica de 7 a 40 KDa. La sensibilidad de este ELISA sándwich o de doble anticuerpo fue del 100% y 28,5% en ovejas y en vacas, respectivamente, que albergaban un único trematodo en el hígado, aumentando este porcentaje hasta el 100% en vacas infectadas con 2 fasciolas. Por consiguiente, estos autores consideraron que la concentración de coproantígenos se correlaciona positivamente con la carga parasitaria y negativamente con el tiempo transcurrido entre la infección y la detección del coproantígeno. Además, en este mismo estudio, se comprobó la utilidad del ELISA-d (MM3) en la monitorización de la eficacia de los tratamientos antiparasitarios, ya que en ovinos a los que se les había administrado triclabendazol dejaron de detectarse coproantígenos entre la 1ª y la 3ª semana post-tratamiento (s.p.t.), mientras que en las ovejas no tratadas se siguieron detectando coproantígenos durante todo el estudio. Valero et al (2009), empleando este mismo test, detectaron antígenos en heces de ovejas a las 4 s.p.i., alcanzando los niveles más elevados a las 12 s.p.i. 3.2.3.2. Técnicas indirectas Hasta hace algunos años las pruebas indirectas para detectar infecciones por F. hepatica se basaban fundamentalmente en la determinación de la actividad de algunas enzimas séricas, como la glutamato deshidrogenasa (GLDH) o la γ-glutamil-transferasa (γGT) (Barnouin et al., 1981; Díaz et al., 1998; Mezo et al., 1994; Ferre et al., 1997). También se empleó la técnica e inmuno-electro-transferencia (EITB) o western-blotting. En la 48 ANA PÉREZ CREO actualidad se utiliza fundamentalmente la técnica inmunoenzimática ELISA, debido a su menor complejidad de realización. A. Inmunoelectrotransferencia La inmunoelectrotransferencia (EITB) también denominada Western-blotting o “immunoblotting” consiste en la separación de los diferentes componentes polipéptidos de los antígenos de F. hepatica mediante electroforesis y la evaluación de su posible antigenicidad a través de un revelado similar al que se realiza en el ELISA indirecto, pero en este caso el soporte es una membrana de nitrocelulosa. Se han llevado a cabo diversos estudios mediante esta técnica en animales de laboratorio infectados de forma experimental con metacercarias. En ratas, Poitou et al. (1992), utilizando un antígeno de excreción/secreción para evaluar la respuesta IgG, comprobaron que en la 2ª s.p.i. se reconocían péptidos de peso molecular bajo (30-20 kDa) y a partir de la 3ª s.p.i. los de peso molecular alto (94 kDa) e intermedio (67-43 kDa). Díez et al. (1997), estudiaron los principales componentes del antígeno de excreciónsecreción de F. hepatica (FhES), empleando sueros de ratas infectadas experimentalmente, comprobando que se detectaban 31 fracciones con pesos moleculares de 11 a 136 kDa. Además, Paz-Silva (1997) y Sánchez-Andrade et al. (1997) estudiaron la respuesta inmunitaria en un lote de ratas primoinfectadas y en otros 2 grupos reinfectadas a las 4 y 11 s.p.i., respectivamente; señalaron que a partir de la 1ª s.p.i. se detectaban IgG y que durante las 5 s.p.i. en el antígeno de ES se reconocían fracciones de alto peso molecular (190 kDa) y, a partir de la 7ª s.p.i. además de estas fracciones proteicas se detectaban un mayor número de bandas, con pesos moleculares de menos de 35 kDa y de 37, 43, 52, 75-80, 126, 155 y 170 kDa. A partir de la semana 11ª p.i. no se observó un aumento en el reconocimiento de bandas, excepto en el grupo de ratas reinfectadas, en el que se detectaron bandas de 98 y 118 kDa. Esta técnica también se ha utilizado para el diagnóstico de la fasciolosis en animales de renta. Santiago y Hillyer (1998), utilizando sueros de ganado ovino y vacuno infectado con F. hepatica, reconocieron en el antígeno somático del trematodo un grupo de proteínas de 38- Revisión bibliográfica 49 30 kDa y otros péptidos de 25-20 kDa a las 4 s. p. i. En los bovinos se obtuvo un reconocimiento difuso de bandas de 69, 64 y 56 kDa, que no habían sido visualizadas previamente con los sueros de los ovinos. Después de reinfectar estos animales no apreciaron cambios significativos en el reconocimiento de los diferentes péptidos hallados en el antígeno somático de F. hepatica. Ruiz-Navarrete et al. (1993) en ovinos infectados experimentalmente comprobaron que todos los sueros reaccionaban frente a la fracción proteica de 20-23 kDa del antígeno somático y frente a la de 23-27 kDa del antígeno de ES, detectando anticuerpos frente a estos componentes antigénicos a partir de la 2ª s.p.i. En ovejas infectadas de forma experimental, Ferre (1994) comprobó que a partir de las semana 6ª p.i. las bandas reconocidas con mayor intensidad tenían un peso molecular de 3014 y < 14 kDa. Además, en las semanas 8, 14 y 16 p.i., y coincidiendo con la respuesta máxima obtenida por ELISA, detectó péptidos de 25 y 19 kDa. También en ovejas infectadas con F. hepatica, Chauvin et al. (1995) apreciaron un reconocimiento secuencial de proteínas de alto a bajo peso molecular, sugiriendo la liberación de productos de excreción/secreción por parte de las fasciolas juveniles durante su migración por el parénquima hepático. Díaz et al. (2007a), en ganado ovino infectado de forma natural por F. hepatica, detectaron polipéptidos de 93, 85, 64, 51, 45 y 30 KDa, comprobando que el de 30 KDa era útil para valorar la eficacia de los tratamientos a la segunda semana de su administración. B. ELISA indirecto Es una de las técnicas más utilizadas debido a su rapidez, simplicidad, sensibilidad, especificidad y bajo costo (Muñoz et al., 1986). Algunas de estas ventajas, como la sensibilidad y especificidad, dependen de las características del antígeno empleado, ya que la concentración y calidad de este son factores cruciales que determinarán la sensibilidad del ensayo (Coltori, 1986; Vargas et al., 1995). Como se ha comentado anteriormente, las fracciones antigénicas somáticas y de excreción-secreción de F. hepatica inducen en los animales con infección aguda y crónica la producción de inmunoglobulinas IgE e IgG, especialmente de la subclase IgG1 (Clery et al., 1996; Bossaert et al., 2000). Por tanto, son 50 ANA PÉREZ CREO diversos los estudios que indican la aptitud de estas técnicas para el diagnóstico de la infección por F. hepatica respecto a los métodos tradicionales (Vargas et al., 2001). La técnica más utilizada es el ELISA indirecto (ELISA-i) con antígenos somáticos o de excreción-secreción del parásito (Price et al., 1993). Con la mejora de los métodos de purificación antigénica se ha incrementado la sensibilidad y especificidad de la prueba, tanto a nivel individual como de rebaño. A lo largo de los años, muchos investigadores han diseñado métodos para el diagnóstico de la fasciolosis mediante ELISA-i utilizando diferentes fracciones antigénicas (Espino et al., 1987; Rivera Marrero et al., 1988; Itagaki et al., 1995; Ortiz et al., 2000; Salimi-Bejestani et al., 2005). Los antígenos más utilizados para identificar la infección por F. hepatica son los de excreción-secreción (ES), debido a que el extracto antigénico se puede obtener de forma económica y sencilla (Hillyer, 1986, 1993). El empleo de estos antígenos en un ELISA-i permite un diagnóstico precoz de la infección, pues se detectan IgG1 a partir de la 2ª s.p.i. (Bossaert et al., 2000). Además, según Hillyer (1993) el test tiene mayor sensibilidad cuando se utilizan estos extractos proteicos que cuando se emplean los antígenos somáticos del parásito. Los antígenos de superficie también se han utilizado para el inmunodiagnóstico de la fasciolosis, debido a que incrementan la especificidad significativamente, aunque el proceso de obtención es más complicado (Levieux et al., 1992). También se han desarrollado antígenos recombinantes a partir de genes de F. hepatica que codifican para antígenos específicos, cuya expresión en un sistema heterólogo permite su obtención en cantidad suficiente, a la vez que aumenta la especificidad y sensibilidad de la prueba, permitiendo además la comparación entre los resultados de diferentes grupos de investigación (Corenelissen et al., 2001). En este sentido, diversos estudios se centraron en el uso de las catepsinas recombinantes purificadas como agentes antigénicos (O´Neill et al., 1999; Cornelissen et al., 2001; Neyra et al., 2002; Espinoza et al., 2005; Sriveny et al., 2006). Revisión bibliográfica 51 En nuestro laboratorio a partir de una biblioteca de ADNc de F. hepatica se obtuvieron 3 clones que codifican para la expresión de proteínas de 16, 12,3 y 2,9 kDa, comprobando que, en ovejas infectadas experimentalmente con metacercarias de este trematodo, la proteína expresada por el clon de 2,9 kDa permitía detectar anticuerpos a la 2ª s.p.i. por ELISA-i (Paz-Silva et al., 2005; Arias et al., 2006). Asimismo, Arias et al. (2007) comprobaron que el ELISA-i, utilizando la proteína recombinante de 2,9 kDa también detectaba precozmente los anticuerpos anti F. hepatica en ovinos infectados naturalmente. Posteriormente, se comprobó que esta proteína también era útil para valorar la eficacia de los tratamientos (albendazol y netobimin) tanto en ganado ovino como vacuno infectados naturalmente (Arias et al. 2009). Con objeto de mejorar la sensibilidad y especificidad de los antígenos de ES, Mezo et al. (2003) fraccionaron un antígeno FhES por FPLC y obtuvieron 4 picos; en el I y en el II se detectaron péptidos cuyo peso molecular osciló entre 7 y 208 kDa, el pico III se correspondió con péptidos de 131 a 153 kDa y el IV con péptidos de menos de 40 kDa. Estas fracciones proteicas se valoraron frente a sueros de ovinos infectados naturalmente, comprobando que los picos III y IV mostraban una buena discriminación entre animales infectados y no infectados, obteniendo una especificidad del 100%. Además, al realizar el ELISA-i con los péptidos del pico IV (7-40 kDa), detectaron animales infectados, incluso con 10 metacercarias, desde la 3ª-5ª s.p.i. hasta el final del estudio (14 spi). Posteriormente, estos mismos autores (Mezo et al., 2007) desarrollaron un ELISA-i (MM3 SERO ELISA) basado en el uso del anticuerpo monoclonal MM3 que captura parte de los antígenos presentes en el pico IV y de esta forma poder detectar los anticuerpos (IgG) específicos frente a los epítopos reconocidos por el MabMM3. Este ELISA presentó una especificidad del 100% en suero de ovino, incluso en corderos infectados con Dicrocoelium dendriticum (trematodo que posee antígenos con una gran reactividad cruzada con F. hepatica). La sensibilidad de esta técnica es también elevada, siendo capaz de detectar anticuerpos a las 3 s.p.i. en animales que albergaban 1 o 2 ejemplares de F. hepatica y a las 4 s.p.i. en animales con más de 2 tremados. 52 ANA PÉREZ CREO Muíño et al. (2011) realizaron una caracterización molecular e inmunológica de la fracción IV y observaron que el MabMM3 reacciona con un epítopo localizado en las catepsinas L1 y L2, señalando que, probablemente también lo esté en la L5 que representa el 5% de las catepsinas producidas por los trematodos adultos. Dixit et al. (2008) constataron que, este grupo de proteínas se caracterizan por ser altamente antigénicas y por tanto pueden ser útiles para el inmunodiagnóstico de las infecciones por F. hepatica tanto en humanos (Rokni et al., 2002; Intapan et al., 2005) como en animales (Cornelissen et al., 2001; Sriveny et al., 2006), así como para el desarrollo de vacunas (Mulcahy y Dalton, 2001; Golden et al., 2010). Con el fin de abaratar los costes de diagnóstico y causar la menor molestia y estrés durante el muestreo de los animales, en los últimos años se han aplicado los ELISA-i para determinar la prevalencia de F. hepatica en tanques de leche. Estos ELISA se caracterizan por presentar una gran sensibilidad y especificidad en los diagnósticos individuales y también en el diagnóstico en tanque, aunque se necesita un número mínimo de animales positivos para que los resultados sean fiables (Mezo et al., 2010; Duscher et al., 2011). En este sentido, Reichel et al. (2005) indicaron que prevalencia mínima intrarrebaño debería ser del 60%. Posteriormente otros autores (Salimi-Bejestani et al., 2005; Mezo et al., 2010; Duscher et al., 2011) señalaron que era suficiente con que la prevalencia intrarrebaño fuese del 15 al 20%. No obstante, Duscher et al. (2011) comprobaron que los resultados del análisis en tanque de leche pueden variar dependiendo de la fase de la infección, ya que ésta cursa normalmente con un descenso de la producción de leche y, por tanto, puede haber niveles más bajos de anticuerpos en el tanque, dificultando la detección de las infecciones por F. hepatica mediante este test. 3.2.4. Fasciolosis en pequeños rumiantes Esta enfermedad es una de las infecciones parasitarias más frecuente y de mayor trascendencia económica en los rumiantes, en especial en los lugares en los que las condiciones edáficas y climáticas favorecen el desarrollo del ciclo de F. hepatica, como sucede en Galicia. Revisión bibliográfica 53 3.2.4.1. Cuadro clínico y pérdidas económicas Las pérdidas causadas por la fasciolosis son considerables, especialmente en ganado ovino cuando cursa de forma aguda. A. Cuadro clínico En el ganado ovino la fasciolosis puede cursar de forma aguda, subaguda y crónica. Estos 3 tipos de presentaciones se relacionan con la época del año, la disponibilidad de metacercarias en los pastos y el número de estas que ingieran los animales (Rojo y Ferre, 1999). La fasciolosis aguda se origina cuando hay un gran número de adolescarias migrando por el parénquima hepático o porque ya se han establecido un elevado número de adultos en los conductos biliares. La sintomatología, cuando se presenta, se caracteriza por debilidad, palidez de las mucosas, hepatomegalia palpable, dolor abdominal y ascitis. El curso de la enfermedad es rápido y los animales pueden morir entre las 2 y 8 s.p.i. Los animales afectados presentan un cuadro de anemia hemorrágica aguda de tipo normocítico y normocrómico, pudiendo producirse muertes repentinas ocasionadas por la enorme pérdida de sangre y por fallo de la función hepática. También se observa marcada eosinofilia, elevada actividad plasmática de la aspartato aminotransferasa, hiperglobulinemia y, en los casos terminales, los animales muestran un valor hematocrito de 7 a 10%. Además, la migración de las adolescarias a través del parénquima hepático pueden propiciar las infecciones por Clostridium oedematiens (Rojo y Ferre, 1999). La forma subaguda se presenta a finales de otoño e inicio de la estación invernal, cuando los animales ingieren un número elevado de metacercarias durante un período de tiempo suficientemente largo como para no provocar un proceso agudo (Behm y Sangster, 1999). Se observa pérdida de peso 1-2 semanas antes de la aparición de los síntomas y algunos animales pueden mostrar edema submandibular (papo) y ascitis. Este tipo de fasciolosis cursa con anemia hipocrómica y macrocítica, y el valor del hematocrito es inferior al 25%. Las modificaciones de los valores sanguíneos se acompañan con alteraciones de las proteínas séricas, observándose una hiperproteinemia como consecuencia del incremento de 54 ANA PÉREZ CREO inmunoglobulinas en respuesta a los antígenos parasitarios. Posteriormente se produce hipoproteinemia, debido a la disminución de los valores plasmáticos de albúmina. Los ovinos, generalmente, sobreviven 1 o 2 semanas desde la aparición de los síntomas. El ganado ovino y en menor grado el caprino, en ocasiones, pueden superar la fasciolosis aguda y la subaguda y dar lugar a la forma crónica (Reddington et al., 1986; Rojo y Ferre, 1999), aunque normalmente este tipo de presentación de la enfermedad se produce tras la ingesta diaria de un pequeño número de metacercarias en los pastos en los que los rumiantes permanecen durante largos períodos de tiempo (Rojo y Ferre, 1999). En los animales afectados se observa una marcada colangitis e hiperplasia del epitelio biliar, además de fibrosis de los conductos biliares (Behm y Sangster, 1999; Marcos et al., 2008). Como en la fasciolosis subaguda, la anemia es hipocrómica y macrocítica; puediendo llegar el valor hematocrito a 11-19%. Los animales enfermos pueden sobrevivir durante varias semanas e incluso años, aunque no hayan recibido el correspondiente tratamiento (Rojo y Ferre, 1999). Como ya se ha mencionado anteriormente, la fasciolosis crónica es la forma más habitual de aparición en las cabras. En infecciones experimentales se ha comprobado que la primoinfección provoca una fasciolosis subclínica crónica, al tiempo que no se establece una respuesta inmunitaria protectora, puesto que en las reinfecciones se establecen un número similar de adultos que en las primoinfecciones (Martínez et al., 1996 y Martínez-Moreno et al., 1997). B. Pérdidas económicas Como se indicó previamente la forma aguda de la fasciolosis puede ocasionar una importante mortalidad, especialmente en el ganado ovino. No obstante, es en la forma crónica cuando se producen tanto la mayoría de las pérdidas directas (decomiso de hígados) como indirectas (pérdida de peso, descenso en la producción de lana y leche y alteración de los índices de fertilidad). Aunque es muy difícil de cuantificar las pérdidas económicas ocasionadas por la fasciolosis, Torgerson y Claxton (1999) señalan pérdidas de billones de dólares, incluso cuando la intensidad de parasitación es moderada. Las pérdidas indirectas están relacionadas con el descenso de energía metabolizable que, junto con la disminución del apetito y la reducción de la retención de nitrógeno, Revisión bibliográfica 55 repercuten negativamente sobre la ganancia de peso y posteriormente sobre la producción de carne, lana y leche, así como sobre la fertilidad de los animales (Hope Cawdery, 1984). En relación con la pérdida de peso, Coop y Sykes (1977) observaron que esta era del 26%, 22% y 33% en animales que albergaban 87, 157 y 233 ejemplares adultos de F. hepatica, respectivamente. López-Abán et al. (2007) comprobaron en corderos infectados con 100 metacercarias que la reducción de la ganancia de peso era aproximadamente del 70% respecto al grupo no infectado. Asimismo, en ovinos infectados por Fasciola se han señalado porcentajes de la reducción de la producción de lana del 13,6 al 40% (Roseby, 1970; Edwards et al., 1976; Torgerson y Claxton, 1999). También se han observado pérdidas en la producción de leche, aunque según Hope Cawdery y Conway (1972) depende de la intensidad de parasitación y de si el animal puede compensarla con una mayor ingestión de alimentos. Además, Sinclair (1972) asoció las menores tasas de crecimiento observadas en los corderos con la reducción de la producción de leche en las madres infectadas con F. hepatica. En relación con la reducción de los índices de fertilidad, Crossland et al (1977) observaron un aumento del 9% en la fecundidad de ovejas que pastaban en zonas en las que había programas de control de esta infección parasitaria. Asimismo, Hope (1984) observó un descenso en el número de nacimientos en granjas en las que las ovejas estaban parasitadas por este trematodo hepático. 3.2.4.2. Prevalencia de parasitación Como se señaló en el apartado de diagnóstico, las técnicas más utilizadas para la determinación de la prevalencia de infección por Fasciola, son los análisis coprológicos, la necropsia y el inmunodiagnóstico. Material y métodos 63 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. CARACTERÍSTICAS DE LAS EXPLOTACIONES Para la realización de este estudio se recogieron un total de 1.666 muestras de sangre de cabras y ovejas pertenecientes a 98 granjas localizadas en la Comunidad gallega y que se explotaban en régimen extensivo o semi-extensivo. Aunque un elevado porcentaje de las granjas gallegas de ovino y caprino son de pequeño tamaño y de carácter familiar, orientadas al autoconsumo, todas las explotaciones muestreadas (n= 98) pertenecían a la Asociación de Defensa Sanitaria de Ovino y Caprino de Galicia “ACIVO”, que engloba rebaños tanto semiprofesionales como profesionales que tiene, por lo general, más de 100 cabezas. Esta ADSG cuenta, además, con un equipo de veterinarios especializados responsables de llevar a cabo distintos programas sanitarios. Todas las cabras de raza "Cabra Galega" estaban inscritas en el libro genealógico gestionado por la Asociación de Gandeiros da Raza Cabra Galega (CAPRIGA). El muestreo se realizó de forma que los rebaños incluidos finalmente en el estudio representaran a todas las zonas agroganaderas de Galicia. Una característica diferencial de las granjas de nuestra Comunidad Autónoma es la presencia de un importante número de rebaños mixtos (n= 2.756 sobre un total de 24.306), integrados por cabras y ovejas; estas explotaciones suponen el 23,6% de las granjas de ganado ovino y el 50,8% de las de caprino (Consellería do Medio Rural, 2013). De este modo, se muestrearon 51 rebaños donde solo había ovejas, 13 rebaños compuestos únicamente por cabras y 34 rebaños en los que convivían ambas especies de pequeños rumiantes. La mayoría del ganado ovino y caprino explotado en Galicia es el producto del cruce de diferentes razas; no obstante, en el presente trabajo, únicamente se recogieron muestras de la raza pura, la “Cabra Galega”, que es la raza autóctona de caprino originaria en Galicia. 64 ANA PÉREZ CREO Con objeto de analizar la presencia de animales seropositivos a F. hepatica, en cada rebaño se recogieron muestras de sangre de un porcentaje representativo de la población. Para calcular el número de muestras necesarias para realizar el presente estudio, con una potencia del 97% y un intervalo de confianza del 95%, se empleó la función n.for.survey del paquete epicalc en el programa estadístico R (Chongsuvivatwong, 2012) y se tuvo en cuenta que, según el Anuario de Estadística Agraria del año 2006 (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente), la población de ovinos de Galicia era de 276.302 cabezas. En un estudio previo realizado en ganado ovino explotado en pastoreo semiextensivo en Galicia se comprobó, mediante ELISA-indirecto y antígeno de secreción/secreción, que la seroprevalencia de F. hepatica era del 56% (Paz-Silva et al., 2003); la sensibilidad y especificidad de este ELISA fue del 92% y 94%, respectivamente. Teniendo en cuenta que el MM3-sero ELISA presenta mayores valores de sensibilidad y especificidad (Mezo et al., 2007), para el cálculo del tamaño de la muestra se tuvo en cuenta una prevalencia estimada del 50%; por lo que el número mínimo de muestras que se deberían recoger era de 1063. El número medio de ovejas muestreadas por granja fue de 14,4±7,6, con un rango que osciló entre los 4 y los 42 animales. Para estimar el número necesario de muestras de cabras, y considerando la ausencia de datos de seroprevalencia en ganado caprino de Galicia, se tuvieron en cuenta los valores señalados previamente en ganado vacuno (Sánchez-Andrade et al., 1995) y ovino (Ferre et al., 1995; Paz-Silva et al., 2003) del noroeste de España. Así, y considerando que la prevalencia por F. hepatica en cabras es mucho menor que en ovejas (Afshan et al., 2013), se estimó que la seroprevalencia en ganado caprino sería del 15%. Empleando las mismas condiciones que en el ganado ovino, y considerando un tamaño de muestra de 52.899 animales (MAGRAMA, 2006), el número mínimo de muestras de cabras que se debían recoger era de 539. Finalmente, se tomaron 603 muestras de sangre de cabras pertenecientes a 46 granjas; el número medio de animales muestreados por granja fue de 12,8±17,4, con un rango que osciló entre 1 y 101 cabras/rebaño. Material y métodos 65 Tabla 4.1. Media aritmética del número de animales y el tamaño medio de las granjas muestreadas Número de animales muestreados/granja ( ± D.E.) Tamaño medio de la granja ( ) GRANJAS DE OVEJAS 14,3 ± 7,6 195 (rango 50-1231) GRANJAS MIXTAS 14,0 ± 19,9 177 (rango 30-718) GRANJAS DE CABRAS 8,8± 8,9 188 (rango 2-520) Para evitar posibles interferencias con anticuerpos calostrales, todos los animales muestreados eran mayores de seis meses. 4.1.1. Zona de estudio Galicia está situada en el Noroeste de España y posee una superficie total de 29.574 km². Su latitud está comprendida entre 43º 47' N (Estaca de Bares) y 41º 49' N (frontera con Portugal en el Parque del Xurés) y su longitud, entre 6º 42' O (límite entre Ourense y Zamora) y 9º 18' O (Cabo Touriñán). Además, Galicia limita al Norte con el Mar Cantábrico, al Sur con Portugal, al Este con las provincias de León, Zamora y Asturias y al Oeste con el Océano Atlántico. La geografía gallega se caracteriza por el contraste entre el relieve costero y el del interior, existiendo una marcada diferencia entre las elevadas llanuras septentrionales y las sierras y depresiones meridionales. La orografía del interior de Galicia se caracteriza la presencia por montañas bajas y romas, con multitud de ríos en el interior. Las principales cadenas montañosas de Galicia son las sierras de O Xistral (norte de Lugo), Os Ancares (frontera con León y Asturias), O Courel (frontera con León), O Eixo (frontera entre Ourense y Zamora; a 2.124 metros se encuentra Pena Trevinca, el pico más alto de Galicia), Macizo de Manzaneda (centro de la provincia de Ourense), O Faro (frontera entre Lugo y Pontevedra), Cova da Serpe (frontera Lugo y A Coruña), Montemaior (provincia de A Coruña), Montes do Testeiro (entre Pontevedra y Ourense), A Peneda, y las de O Xurés y O Larouco (frontera entre Ourense y Portugal). A Galicia, por su situación en el noroeste de la Península Ibérica, le corresponde un clima oceánico que, según Rodríquez Rajo et al. (2003), se caracteriza por ligeras variaciones 66 ANA PÉREZ CREO de temperatura, siendo la temperatura media anual de 14,3º C y las medias de las temperaturas máximas y mínimas de 20,0º C y 9,6º C, respectivamente. Las precipitaciones anuales (1584 mm) son abundantes aunque irregulares, registrándose los valores más elevados en los meses de invierno y los más bajos en verano (Meteogalicia, 2007). No obstante, dentro de esta Comunidad existen variaciones edafoclimáticas ostensibles que permiten definir varias zonas (Carballeira et al., 1983). Para facilitar la exposición de los resultados, así como su interpretación, el área de estudio se dividió en dos zonas: Costa-Centro y Montaña (Fig. 4.1). Figura 4.1. Zonas (1= Costa-Centro, 2= Montaña) en las que se divide Galicia según las principales condiciones edafoclimáticas. 2 2 2 1 Material y métodos 67 La zona de la costa-centro comprende los municipios costeros de las provincias de A Coruña, Lugo y Pontevedra y la meseta central. La altura media se sitúa entre 0 y 650 metros a nivel del mar; la pendiente es moderada en las zonas costeras, y más suave en las áreas del centro. El clima es marítimo-templado, caracterizado por una temperatura media anual de 13ºC, precipitaciones anuales inferiores a los 1500 mm y déficit hídrico moderado (-100 mm). La zona de montaña está formada por las principales cadenas montañosas de Galicia (O Xistral, Ancares, O Courel, O Eixo, Manzaneda, O Faro, Cova da Serpe, Montemaior y O Xurés). La altitud oscila entre 650 y 1500 m, con pendientes muy acusadas. El clima es pirenaico y se caracteriza por bajas temperaturas (10ºC de media anual), elevadas precipitaciones (>1500 mm) y ausencia de déficit hídrico (0 a -50 mm). 4.1.2. Manejo de las explotaciones Las diferencias edafoclimáticas que existen en Galicia condicionan de manera notable el manejo de los animales y de las explotaciones de ganado ovino y caprino. La gran mayoría de las granjas en nuestra comunidad (86,7%) presentan un manejo del ganado en semiextensivo con diferencias en el tamaño de los pastos y densidad de animales en los mismos según la zona climática. En la zona Costa-Centro los animales pastan en pequeños prados localizados cerca del establo durante las horas de luz y se estabulan al anochecer. Por el contrario, los animales explotados en la Montaña pastan en prados de gran tamaño debido a que el forraje es menos abundante que en otras áreas y, aunque las condiciones climáticas sean adecuadas, los animales se estabulan siempre al anochecer para defenderlos de sus depredadores; asimismo, se estabulan cuando las condiciones meteorológicas son adversas para la alimentación y supervivencia del ganado, ya que en estas latitudes suele nevar copiosamente varios meses al año. También hay un número reducido de granjas (13,3%) que manejan sus animales en régimen totalmente extensivo; en este caso, se trata de zonas que se caracterizan por la fertilidad de sus suelos y, por tanto, tienen parcelas donde se producen grandes cantidades de 68 ANA PÉREZ CREO pasto. Estas diferencias de manejo nos van a condicionar la densidad de animales en los pastos y el riesgo de infección de los animales. El manejo de la recría del ovino y del caprino, cuando se encuentra en la misma explotación, es el típico de rebaños semiextensivos de carne, de modo que los corderos/cabritos permanecen estabulados con sus madres en grupos de 5-10 animales durante 3-7 días tras el parto. Posteriormente se integran dentro del rebaño con los adultos o, por el contrario, se mantienen sin salir al pasto, en un redil separado del resto de animales hasta que son destetados a los 2-3 meses de edad. Todos los animales son amamantados por sus madres y cuando las crías se mantienen en un grupo independiente de los adultos, se les permite el contacto con su madre una o dos veces al día para que se alimenten. En todas las explotaciones se administraban tratamientos antihelmínticos, dirigidos fundamentalmente al control de las infecciones por nematodos gastrointestinales. Así, en la mayoría de los rebaños gallegos con orientación productiva se aplica, de forma rutinaria, un fármaco antiparasitario a los animales, al menos una vez al año y generalmente en otoño, empleando bencimidazoles y, en menor medida, lactonas macrocíclicas e imidazotiazoles (Pedreira et al., 2006). Por ello, en la desparasitación de estos animales no siempre se emplean fármacos con actividad fasciolicida. Cabe destacar que ningún ganadero de los incluidos en el estudio había llevado a cabo, al menos de manera consciente, alguna medida manejo de animales o pastos orientado hacia la prevención y/o control de las infecciones por el trematodo. 4.2. RECOGIDA Y PROCESADO DE LAS MUESTRAS La toma de muestras se realizó entre los años 2007 y 2011. La sangre se extrajo mediante punción en la vena yugular empleando tubos estériles al vacío Vacutainer® CAT (Becton and Dickinson, Nueva Jersey, EE.UU.) de 10 ml, sin anticoagulante. La localización de las granjas muestreadas se señala en la Figura 4.2. Material y métodos 69 Figura 4.2. Distribución de las granjas muestreadas en las dos zonas edafoclimáticas: costa-centro y montaña Al tiempo que se extraía la sangre a los animales, se registró para cada uno de ellos su número de identificación oficial, así como la especie, género y número asignado por el laboratorio. Las muestras se anotaron de forma consecutiva y siempre constaba el número de referencia de la explotación de origen. Una vez obtenidas, las muestras sanguíneas se trasladaron al laboratorio de Enfermedades parasitarias de la Facultad de Veterinaria de Lugo donde, para favorecer la retracción del coágulo y el posterior desuerado, se mantuvieron 24 horas en refrigeración. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 3000 x g durante 10 minutos en una centrífuga modelo Mixtasel (P SELECTA®, España) y el suero se congeló a -20 ºC hasta su empleo. 70 ANA PÉREZ CREO 4.2.1. Registro de datos de los animales y de las explotaciones En cada una de las granjas se realizó una encuesta epidemiológica al propietario, donde se recogieron datos acerca del titular de la granja, código de explotación agraria, localización de la misma, tipo y orientación productiva, censo de animales, proximidad a otras explotaciones y presencia o ausencia de otras especies de pequeños rumiantes. También se tomaron datos relativos a la realización de desparasitaciones y, en su caso, de los productos empleados; también se anotó si se había detectado algún problema de etiología infecciosa o parasitaria en los últimos años. A través de las hojas de calificación sanitaria de la explotación, se verificó el censo y se obtuvo la edad de los individuos expresada en meses, tomando como referencia su fecha de nacimiento y la fecha del muestreo. 4.2.2. Procesado de las muestras Para determinar la presencia de anticuerpos frente a F. hepatica, las muestras de suero se analizaron mediante ELISA MM3-SERO, basado en el empleo del anticuerpo monoclonal MM3 (Figura 4.3). Figura 4.3. Componentes presentes en la reacción de un suero positivo en el ELISA MM3-SERO empleado en nuestro estudio Material y métodos 71 Este test emplea antígenos de excreción-secreción (AESs) del trematodo presentes en un solo epítopo conformacional presente en el pico IV tras un fraccionamiento FPLC (Mezo et al., 2004). Estas fracciones proteicas, identificadas posteriormente por Muíño et al. (2011) como catepsinas L1 y L2, presentan un 100% de especificidad, incluso en corderos infectados con Dicrocoelium dendriticum, y una sensibilidad elevada, siendo esta técnica capaz de detectar anticuerpos a las 3 semanas post-infección (s.p.i.) en animales que albergaban 1 o 2 ejemplares de F. hepatica y a las 4 s.p.i. en animales con más de 2 tremados. Además, el ELISA MM3-SERO detecta como positivas muestras de suero de animales con una baja dosis de infección incluso en diluciones de 1:12.500 (Mezo et al., 2007). 4.2.2.1. Equipos, materiales y reactivos empleados en el test ELISA Para la realización del test ELISA se emplearon los materiales y equipos citados a continuación (Figura 4.4): 1. Espectrofotómetro modelo 680 de Bio Rad (Microplate Reader Model 680, Bio Rad, Hercules, California, EE.UU.) 2. Agitador de tubos ZX3 (Advanced Vortex Mixer ZX3, Velp Scientiphica, Usmate, Milán, Italia) 3. Micropipetas de precisión, simples y multicanal (Eppendorf Research plus, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) 4. Puntas de pipetas desechables 5. Agua destilada 6. Estufa de incubación RAYPA (Mod. IRE-160) 7. Microplacas sensibilizadas (cedidas por el Dr. Martínez Ubeira) 8. Solución de lavado PBS-Tween (0,2%) (PBS-T) 9. Tampón de dilución PBS-T/leche desnatada (1%) (PTL) para las muestras y el conjugado 10. Monoclonal sheep-goat IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich Química SA; EEUU) 11. Solución de revelado Ortofenilendiamina Dihidroclorito (OPD) (SIGMAFAST™ OPD, Sigma-Aldrich Química SA; Madrid, España). 12. Solución de parada (H2SO4, solución 3 N) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión 81 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. SEROPREVALENCIA INDIVIDUAL Y POR REBAÑO DE Fasciola hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO DE GALICIA Al considerar el total de los animales analizados, el porcentaje individual de animales seropositivos fue del 24,3%; mientras que, el porcentaje de granjas que tenían al menos un animal positivo fue del 67,7%. Como se observa en la Figura 5.1, la seroprevalencia fue ligeramente superior en los rebaños de ovejas (25,3%) que en los de cabras (22,7%), aunque estas diferencias no fueron significativas (χ2= 0,154; p= 0,695). Figura 5.1. Seroprevalencia individual por F. hepatica en pequeños rumiantes de Galicia (IC 95%) Los valores de odds ratio que se representan gráficamente en la Figura 5.2 muestran que las ovejas solo tienen una probabilidad de ser seropositivas 1,06 veces superior que las cabras. 0 20 40 60 80 100 Ovejas Cabras Seroprevalencia (%) 82 ANA PÉREZ CREO Figura 5.2. Diferencia entre la probabilidad de que un animal sea seropositivo a F. hepatica al considerar la especie de rumiante Figura 5.3. Seroprevalencia de F. hepatica al considerar los rebaños (IC 95%) 0 20 40 60 80 100 Ovino Caprino Seroprevalencia (%) de rebaños Resultados y discusión 83 Respecto al porcentaje de rebaños que presentaban al menos un animal seropositivo, se constató que este era superior en los de ovino que en los de caprino (Figura 5.3), siendo estas diferencias significativas (χ 2=4,598; p=0,032). Además, los valores de odds ratio indican que las granjas de ovino muestran una mayor probabilidad de tener animales seropositivos (OR=2,64; 1,07-6,63) que las de caprino (Fig. 5.4). Fig. 5.4. Diferencia entre la probabilidad de que una granja tenga un animal seropositivo teniendo en cuenta la especie que maneja Nuestros resultados indican que F. hepatica es un parásito muy prevalente y ampliamente distribuido en los rebaños de ovino y caprino de Galicia. Este elevado grado de exposición al parásito puede deberse a las condiciones climáticas y al manejo de los animales en nuestra Comunidad. Así, las temperaturas suaves, las abundantes precipitaciones y las características del suelo de la región gallega suponen un hábitat muy adecuado para el 84 ANA PÉREZ CREO desarrollo de los caracoles G. truncatula que actúan como hospedadores intermediarios del trematodo (Morrondo et al., 1994) y para la supervivencia de las fases infectantes en el medio (Andrews, 1999; Arias et al., 2011). Asimismo, el manejo en extensivo o semiextensivo de los rebaños de pequeños rumiantes, típico en la Comunidad gallega, favorece la ingestión de metacercarias del trematodo. La elevada exposición a F. hepatica observada en este estudio coincide con los resultados obtenidos mediante técnicas directas en ganado vacuno explotado en semiextensivo en Galicia. Nuestro grupo de investigación (Díez-Baños et al., 1994; Morrondo et al., 2003; Díaz, 2006) comprobó mediante coprología que el porcentaje de infección individual oscilaba el 24% y el 27,1% y que el de explotaciones positivas variaba entre el 61,8% y el 63,9%. Además, mediante ELISA directo y análisis post mortem, se obtuvieron prevalencias individuales del 28% y del 20,4%, respectivamente (Sánchez Andrade et al., 2002; Arias et al., 2011). Asimismo, mediante ELISA indirecto y antígeno de excreción-secreción, se hallaron en ganado vacuno en Galicia seroprevalencias de 54,8% a 88,8%, de lo que se deduce que en los pastos gallegos debe existir un elevado número de metacercarias de F. hepatica a disposición de los animales (Morrondo et al., 1994, 1997; Sánchez-Andrade et al., 1995). Al comparar la seroprevalencia hallada en ganado ovino con las obtenidas mediante coprología se comprobó que los valores obtenidos en el presente estudio eran superiores a los obtenidos en Galicia por Vázquez et al. (2008; 6%) y Cienfuegos et al. (2009b; 9,5%), así como a los señalados en Castilla-León (9,3-14,7%) por diversos autores (Manga et al., 1990; Ferre et al., 1995; Díez-Baños et al., 2006). Sin embargo, es necesario señalar que las técnicas coprológicas muestran una menor sensibilidad (30-70%) en relación con el ELISA (Charlier et al., 2008), puesto que no permiten detectar animales infectados en fase de prepatencia; además, la coprología no resulta adecuada para detectar animales con reducidos niveles de infección, puesto que, a veces, la cantidad de huevos en las heces no alcanza el límite de detección de la técnica. Por ello es normal que un porcentaje considerable de animales infectados se identifiquen como falsos negativos mediante métodos coprológicos. Resultados y discusión 85 Por el contrario, los niveles de seropositividad hallados en este trabajo resultan inferiores a los de otras investigaciones realizadas con otras técnicas de ELISA. Paz-Silva et al. (2003) detectaron una seroprevalencia individual del 56% en ganado ovino de Galicia, similar a la observada en otras zonas húmedas de España, donde el 35-58% de las ovejas presentaban anticuerpos frente a F. hepatica (Ferre et al., 1995; Luzón et al., 1997). Estas importantes diferencias pueden deberse a los desiguales valores de rendimiento diagnóstico de las técnicas, que están estrechamente relacionados con el antígeno empleado para detectar los anticuerpos anti-Fasciola. Así, la mayoría de los ELISA indirectos, empleados en estudios epidemiológicos, presentan valores de sensibilidad y especificidad que oscilan entre el 86100% y el 83-100%, respectivamente (Anderson et al., 1999; Corneslissen et al., 1999; Salimi-Bejestani et al., 2005; Charlier et al., 2008; Kuerpick et al., 2013). En este sentido, Mezo et al. (2007) destacan que aproximadamente el 5% de las muestras serológicas contienen anticuerpos heterófilos que pueden generar falsos positivos. Otro factor a tener en cuenta son las reacciones cruzadas con otros parásitos; por ejemplo, en el ELISA desarrollado a partir del total de productos de excreción-secreción de F. hepatica se han observado reacciones cruzadas con otros helmintos como Dictyocaulus viviparus (Cornelissen et al., 2001) y Dicrocoelium dendriticum (Mezo et al., 2007), lo que reduce notablemente su especificidad, que alcanzaría un 83-96%. Por el contrario, estos últimos autores, comprobaron mediante el fraccionamiento de AESs, que la fracción antigénica del ELISA MM3 utilizada en este estudio tenía una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100%. Los valores de seroprevalencia individual en el ganado caprino contrastan con los obtenidos mediante sedimentación en cabras en Galicia, puesto que no se había detectado ningún animal que eliminase huevos de F. hepatica (Cienfuegos et al., 2009a y Béjar, 2011). No obstante, la mayoría de los estudios sobre infecciones por F. hepatica en ganado caprino señalan porcentajes muy reducidos, independientemente de la técnica utilizada. En cabras de Andalucía, Martínez-Cruz et al. (1995) obtuvieron prevalencias del 1,86% mediante ELISA indirecto; en la cabra pirenaica (Capra pyrenaica), Alaasad et al. (2007) hallaron valores del 0,53% mediante necropsia y del 1,87% mediante sedimentación. En otros países asiáticos, como Corea del Sur y Pakistán, los porcentajes de seropositividad, mediante ELISA indirecto, fueron del 1,1% y 4,08%, respectivamente (Afshan et al., 2013; Gebeyehu et al., 2013). 86 ANA PÉREZ CREO Por el contrario, Munguía et al. (2007) en México, obtuvieron valores de prevalencia en cabras muy superiores a los obtenidos en el resto de los estudios realizados hasta el momento, tanto mediante ELISA indirecto (43%) como por sedimentación (24,5%). Martínez-Moreno et al. (1997, 1999) han señalado que las cabras son más susceptibles a las reinfecciones, ya que no adquieren una respuesta inmunitaria protectora, pudiendo F. hepatica evadir los mecanismos defensivos del sistema inmunitario del ganado caprino; por lo que, los niveles de anticuerpos en las reinfecciones son similares a los observados en la primoinfección. No obstante, la elevada prevalencia hallada en México por Munguía et al. (2007) contrasta con la observada por la mayoría de las investigaciones en las que se comparan los datos de prevalencia por F. hepatica en ganado ovino y caprino. Así, en Polonia, Gorski et al. (2004) obtuvieron mediante sedimentación prevalencias de infección por F. hepatica del 11% en ovejas, pero no hallaron cabras infectadas. En Noruega, Domke et al. (2013) observaron mediante necropsia que el 18% de las ovejas albergaban adultos de este trematodo, mientras que no observaron cabras infectadas. Asimismo, en Pakistán, tanto por sedimentación (Gadahi et al., 2009) como por ELISA indirecto (Afshan et al., 2013), el porcentaje de cabras positivas (0,64% y 4,08%) fue netamente inferior al de ovejas (4,44% y 39,2%). Otra posible explicación al hecho de observar menor seroprevalencia de infección en cabras que en ovejas puede ser el diferente tipo de alimentación entre las dos especies. Según Benavides et al. (2009), las cabras pasan más tiempo ramoneando (68%) que las ovejas (35%); de hecho, en Galicia, el 28% de la dieta de las cabras es a base de tojo (Ulex europaeus). En este sentido, Arias et al. (2013) señalan que los mayores porcentajes de seroprevalencia der F. hepatica hallados en ganado vacuno que en corzo se deben a que este último se alimenta principalmente de arbustos, matorrales y bayas. Asimismo, Afshan et al. (2013) concluyeron que el mayor grado de infección por F. hepatica observado en las ovejas respecto a las cabras se debe probablemente a que estas últimas son ramoneadoras. Resultados y discusión 87 5.2. DETERMINACIÓN DE LOS DISTINTOS FACTORES DE RIESGO EN LA SEROPREVALENCIA POR F. hepatica. La prevalencia de infección por F. hepatica, cuyo ciclo presenta una fase exógena, está muy influenciada, al igual que ocurre con otros parásitos, no solo por factores dependientes del hospedador (edad, raza, sexo) sino también por factores ambientales como el área climática, orografía, sistema de manejo, etc. 5.2.1. En ganado ovino En cada granja se completó una encuesta epidemiológica con objeto de estudiar la posible influencia de determinados factores intrínsecos y extrínsecos sobre la seroprevalencia de F. hepatica. En primer lugar se realizó una descripción de los porcentajes obtenidos teniendo en cuenta las diferentes categorías para cada uno de los factores que se recogen en la Tabla 5.1. Al considerar los factores intrínsecos, respecto a la edad, los porcentajes más bajos de seroprevalencia se observaron en los animales más jóvenes, y a partir del año, la prevalencia se mantuvo estable. En relación al sexo, las hembras y los machos presentaron porcentajes de seropositividad similares. Al considerar la posible influencia de los factores extrínsecos, se apreció que la seroprevalencia disminuía a medida que se incrementaba el tamaño del rebaño. Además, los porcentajes de animales seropositivos fueron muy similares, independientemente del sistema de manejo empleado para su cría (semiextensivo o extensivo) o de la zona climática (costacentro o montaña). Sin embargo, se observaron valores de seroprevalencia más elevados en los animales en los que en sus rebaños había por lo menos una cabra entre sus efectivos. 94 ANA PÉREZ CREO Por el contrario, Khan et al. (2010) observaron que las ovejas en extensivo presentaban mayores prevalencias de infección que las que se estabulan, puesto que las que se explotan en extensivo, tienen mayores posibilidades de ingerir metacercarias en los pastos. Al considerar la zona edafoclimática, se observó que los porcentajes de seroprevalencia eran ligeramente superiores en la Costa-Centro (25,4%) que en la Montaña (24,7%), aunque con Chi-cuadrado se constató que estas diferencias no eran significativas (χ2= 0,492; p= 0,782). En este sentido, los resultados del odds ratio nos indican que la probabilidad de ser seropositivo a F. hepatica es prácticamente igual, independientemente de la zona climática en la que pasten los animales (Figura 5.10). Figura 5.10. Diferencia entre la probabilidad de ser seropositivo a F. hepatica al considerar la zona climática donde se encontraban los rebaños de ovino Resultados y discusión 95 Aunque se ha demostrado que las condiciones de temperatura y humedad influyen notablemente sobre los porcentajes de infección por el trematodo (Domke et al., 2013), nuestros datos coinciden con los señalados por Díaz (2006) en ganado vacuno de raza Rubia Gallega explotado en semi-extensivo en la provincia de Lugo, puesto que no halló diferencias significativas en las prevalencias de infección por F. hepatica entre los animales que pastaban en la montaña y en el centro de la provincia lucense. Aunque las zonas montañosas de Galicia se caracterizan por registrar mayores precipitaciones, las zonas del centro poseen una menor pendiente, lo que favorece el encharcamiento de los pastos incluso con bajas precipitaciones, constituyendo así hábitats adecuados para el desarrollo y la supervivencia del molusco hospedador intermediario G. truncatula. Asimismo, Díaz et al. (2007b), comprobaron que el porcentaje de infección por Calicophoron daubneyi, trematodo que comparte el mismo hospedador intermediario con F. hepatica, era significativamente superior en la zona centro. La ausencia de diferencias entre la seroprevalencia observada en los ovinos que pastaban en la montaña y en el centro coincide con los reultados obtenidos por Ferre et al. (1995), quienes tampoco observaron diferencias entre el porcentaje de animales que eliminaban huevos de F. hepatica al considerar las diferentes zonas edafoclimáticas (montaña y centro) de la provincia de León. Por el contrario, en Andalucía, Martínez-Cruz et al. (1995) hallaron mayor seroprevalencia en ovinos explotados en áreas de montaña (3,5%) que en los que pastaban en la rivera del Guadalquivir (0,36%). La presencia de cabras en los rebaños de ovino repercutió significativamente y de forma positiva sobre el porcentaje de seroprevalencia (χ2= 6,120; p= 0,013); así, la probabilidad de ser seropositivo fue 1,44 veces más elevada en los ovinos en los que al menos había una cabra en la granja (Figura 5.11). Diversos estudios han puesto de manifiesto los riesgos que entraña el manejo conjunto de ovejas y cabras sobre los porcentajes de infección por diversos agentes infecciosos y parasitarios. En este sentido, Lago et al. (2012) observaron que la presencia de cabras en las explotaciones de ovino de carne es un factor de riesgo para la infección por el virus Maedi Visna, incluso cuando el número de cabras en la granja es reducido; asimismo, López et al. (2011), comprobaron que la presencia de ganado caprino en las granjas de ovino constituye un importante riesgo para que las ovejas se infecten por protostrongílidos. 96 ANA PÉREZ CREO Figura 5.11. Diferencia entre la probabilidad de ser seropositivo a F. hepatica al considerar la presencia de cabras en las explotaciones de ovino Tras analizar cada una de las variables de manera individual, se realizó un CHAID exhaustivo (Figura 5.12) para clasificar la influencia de los diferentes factores estudiados sobre la seroprevalencia. Así, se constató que el factor de riesgo que más influye sobre la seroprevalencia de F. hepatica era el tamaño del rebaño, debido a que este factor genera grupos más homogéneos y una mayor diferencia entre grupos tras la segmentación; así, en los ovinos de los rebaños pequeños y medianos se observó mayor seroprevalencia (30,9%) que en los de las explotaciones grandes (19,1%). Como se señaló anteriormente, este hecho se puede deber a que los animales de las explotaciones de menor tamaño, debido a la escasez de pasto, a veces se ven obligados a aprovechar áreas en las que suele haber pocos abrevaderos y estos son naturales. Estos lugares presentan un alto riesgo de infección por F. hepatica, ya que en ellos se dan varios factores determinantes; son las zonas más húmedas y por lo tanto donde hay mayor densidad de G. truncatula, por lo que hay mayor número de metacercarias enquistadas en la hierba de alrededor (Morrondo et al., 1994) e incluso libres en el agua (Mas- Resultados y discusión 97 Coma et al., 2005); además, son lugares de paso obligado tanto para animales de pastoreo como silvestres, que dejan allí sus heces perpetuándose el ciclo en un área de reducido tamaño. Figura 5.12. Árbol de clasificación obtenido mediante CHAID exhaustivo que muestra los factores determinantes sobre la seroprevalencia de F. hepatica El árbol de clasificación muestra que en el nodo de rebaños de menor tamaño (nodo 1), el segundo factor en importancia es la presencia de cabras en la explotación; así, los ovinos de aquellas granjas que poseen al menos una cabra presentan mayores porcentajes de 98 ANA PÉREZ CREO seroprevalencia. Además de que el ganado caprino constituye un importante riesgo para que las ovejas adquieran determinadas parasitosis, este incremento en la seroprevalencia podría deberse a que los rebaños mixtos son, por lo general, los menos tecnificados y en los que se realiza un control sanitario menos estricto. Finalmente, en las granjas de tamaño pequeño y mediano en las que hay cabras (nodo 4), la seroprevalencia fue significativamente superior en los rebaños de la zona costa-centro (42,4%) que en los de la montaña (20,0%). Como se comentó anteriormente, las características edafoclimáticas de la zona costa-centro favorecen la supervivencia y desarrollo de los caracoles que actúan como hospedadores intermediarios del trematodo, lo que supone que haya mayor número de metacercarias en los pastos y por tanto un mayor riesgo de infección para los animales. Teniendo en cuenta la segmentación que muestra el árbol de clasificación, parece como si la presencia de cabras en los rebaños potenciara el efecto de la zona climática. Por otro lado, en los rebaños más grandes (nodo 2), se observa que el segundo factor determinante sobre la seroprevalencia por Fasciola en el ganado ovino es la edad de los animales. Si bien, como se ha comprobado anteriormente, esta variable no parecía influir sobre la infección al considerarla de forma aislada, los ovinos mayores de 48 meses muestran una seroprevalencia significativamente superior (21,6%) que los más jóvenes (6,2%). En las granjas más pequeñas y tradicionales, no se detecta el efecto de este factor, probablemente debido a que el menor control sanitario de estas explotaciones implica que no se realicen desparasitaciones o estas no sean las correctas. Por el contrario, en las granjas grandes y profesionales, la instauración de medidas sanitarias y de manejo de pastos, así como la suplementación con alimentos libres de metacercarias (heno y ensilado de calidad), reducen en gran medida la ingestión de metacercarias, lo que se traduce en un incremento menos acusado del porcentaje de animales positivos. Además, otro factor que puede estar influyendo en este aspecto es que las explotaciones con un gran número de animales pueden verse obligadas, debido al medio agreste del clima montañoso, a la transformación de los pastos toscos y poco productivos en lugares más húmedos (mediante presas, sistemas de irrigación, etc.) para así poder mantener una buena alimentación del rebaño y favorecer al mismo tiempo, la expansión y la continuidad del ciclo de F. hepatica en los pastos (Rojo y Ferre, 1999). Resultados y discusión 99 El árbol de clasificación muestra que la presencia de cabras en las granjas grandes solo se hace patente en el grupo de animales jóvenes; sin embargo, est efecto se diluye en los ovinos de mayor edad. Finalmente, y con objeto de determinar los factores que contribuyen en mayor medida sobre la seroprevalencia por F. hepatica, y para corregir el efecto de la segmentación del muestreo en rebaños, que puede generar una dependencia entre grupos de individuos, se realizó un análisis multivariante mixto. Este análisis estadístico considera la agregación de datos individuales (los animales están agrupados en rebaños) que pueden derivar en conclusiones erróneas en el análisis univariante. Por ello, para paliar el posible efecto que tuviera sobre los factores estudiados, se introdujo el rebaño como factor aleatorio. Al realizar el análisis, se eliminaron, uno a uno, cada uno de los factores con menor significación hasta obtener el mejor modelo. Así, los resultados de la regresión logística de efectos mixtos (Tabla 5.2) indicaron que la edad y el tamaño de la granja son los factores que influyen de forma más significativa sobre la seropositividad de los ovinos. Las diferencias observadas con los otros métodos estadísticos empleados posiblemente estén provocadas por el efecto de algunos rebaños en particular. Estos resultados también revelan que hay que interpretar con cautela los resultados de estudios que realicen un análisis de factores de riesgo empleando únicamente métodos estadísticos univariantes. Tabla 5.2. Último paso de la regresión logística de efectos mixtos. Los factores se han eliminado paso a paso hasta la obtención del mejor modelo. IC 95% Estimación E. E. p OR inferior superior Paso 4 Intercept -1,472 0,427 <0,001 0,229 0,099 0,530 Edad < 13 m - - - - - - Edad 13-48 m 0,737 0,294 0,012 2,090 1,174 3,720 Edad >48 m 0,804 0,286 0,005 2,235 1,276 3,918 Tamaño granja <96 - - - - - - Tamaño granja 96-194 -0,663 0,486 0,173 0,515 0,198 1,337 Tamaño granja >194 -0,971 0,476 0,041 0,378 0,149 0,962 E.E. – Error estándar OR – Odds ratio calculado mediante el exponencial de B IC 95% - Intervalo de confianza al 95% del OR 100 ANA PÉREZ CREO Los resultados del análisis multivariante confirman algunos de los datos obtenidos con Chi-cuadrado y con CHAID, al identificar el tamaño de granja como uno de los factores determinantes en la seropositividad a F. hepatica en las ovejas. La probabilidad de que los ovinos de las granjas pequeñas sean seropositivos (Tabla 5.2) es más de doble (2,6= 1/0,378) que los de las grandes, es decir, como ya se comentó anteriormente, la instauración de medidas sanitarias y de manejo de pastos, así como la suplementación con alimentos libres de metacercarias (heno y ensilado) evita la infección de las ovejas con F. hepatica. La regresión logística de efectos mixtos también identificó la edad como un factor significativo sobre los porcentajes de seroprevalencia frente a F. hepatica. Este resultado contrasta con la ausencia de significación mediante Chi-cuadrado, mientras que el CHAID solo lo identificaba como determinante en los rebaños de gran tamaño. Asimismo, en la Tabla 9 se puede apreciar que los animales de mayor edad tienen una probabilidad de ser seropositivos entre 2,1 y 2,2 veces superior a la de los animales menores de un año, pues al haber permanecido durante más tiempo en los pastos, han tenido más posibilidades de ingerir metacercarias. 5.2.2. En el ganado caprino En el análisis de factores de riesgo en el ganado caprino, se emplearon las mismas variables utilizadas en el ganado ovino y, además, se añadió el factor raza, puesto que un número importante de cabras pertenecía a la raza “Cabra Galega”. Los porcentajes de seropositividad a F. hepatica considerando los diferentes factores y categorías, se muestran en la tabla 5.3. Los resultados obtenidos en el ganado caprino coincidieron, en general, con los obtenidos en ovino. Dentro de los factores intrínsecos, se observó que la seroprevalencia en las cabras se incrementó con la edad; los animales de Pura Raza Galega y las hembras presentaron los porcentajes más elevados. Al considerar los factores extrínsecos, se apreció una relación negativa entre los porcentajes de seropositividad y el tamaño de granja, mientras que la seroprevalencia fue superior en aquellos rebaños del área costa-centro, con manejo en extensivo, donde las cabras conviven con ovejas. Resultados y discusión 101 Tabla 5.3. Seropositividad a F. hepatica en cabras de Galicia. Resultados en las diferentes categorías de factores de riesgo FACTOR DE RIESGO CATEGORÍA SEROPREVALENCIA Edad < 13 meses 7/64 (10,9%) 13-48 meses 21/123 (17,1%) > 48 meses 109/425 (25,6%) Sexo Hembras 131/570 (23,0%) Machos 6/33 (18,2%) Raza Cruce 112/420 (26,7%) Cabra Galega 25/183 (13,7%) Tamaño del rebaño < 96 55/169 (32,5%) 96-194 38/153 (24,8%) > 194 44/281 (15,7%) Área climática Centro-Costa 105/439 (23,9%) Montaña 32/164 (19,5%) Sistema de manejo Extensivo 16/63 (25,4%) Semiextensivo 121/540 (22,4%) Presencia de ovejas Al menos una oveja 118/482 (24,5%) Rebaño puro de cabras 19/121 (15,7%) TOTAL 137/603 (22,7%) Al considerar la edad de los animales, se constató que la seroprevalencia se incrementaba significativamente (χ2= 8,126; p= 0,017) con la edad, oscilando entre el 10,9% en los más jóvenes y el 25,6% en los de mayor edad (Tabla 5.3); los resultados de odds ratio mostraron que los animales de entre 13 y 48 meses y los mayores de 48 meses presentan una probabilidad 1,85 y 2,6 veces superior, respectivamente, de ser seropositivos a F. hepatica que los menores de un año (Figura 5.13). 102 ANA PÉREZ CREO Figura 5.13. Odds ratio de los animales de más de 13 meses en comparación con el de las cabras de menor edad Aunque Khan et al. (2010) no observaron diferencias estadísticas entre los animales menores de 6 meses y aquellos de mayor edad, los resultados de la mayoría de los estudios realizados en cabras concuerdan con los hallados en este trabajo, como por ejemplo las investigaciones llevadas a cabo en México y Corea del Sur por Munguía et al. (2007) y Gebeyehu et al. (2013). Al igual que en ovino, estos resultados podrían deberse a que la posibilidad de ingerir metacercarias del trematodo se incrementa con la edad (González-Lanza et al., 1989; Scala et al., 1997, 2001; Waruiru et al., 2000; Cringoli et al., 2002; Otranto y Traversa, 2003). Además, Asfhan et al. (2013) señalan que este incremento en la prevalencia de infección por F. hepatica podría estar relacionado con una menor eficiencia del sistema inmunitario de los animales a medida que aumenta la edad. Martínez-Moreno (1997) y Zafra et al. (2013) observaron una escasa reacción de las cabras frente a F. hepatica, comprobando que los títulos de IgG y de linfocitos eran similares en las primoinfecciones que en las reinfecciones. Resultados y discusión 103 En relación al sexo de los animales, y de modo similar a lo observado en las ovejas, la seroprevalencia fue similar en los machos y en las hembras, aunque fue ligeramente superior en estas últimas (Tabla 5.3); no obstante, con Chi-cuadrado se constató que estas diferencias no eran estadísticamente significativas (χ2= 0,182; p= 0,670). Los valores de odds ratio (Figura 5.14) muestran que la probabilidad de ser seropositivo es 1,34 veces superior en las hembras, valor que no es significativo (IC 95%= 0,53-4,08). Este hecho se debe a que, en Galicia, al igual a lo observado en las ovejas, los machos se manejan de manera similar a las hembras y por lo tanto presentan el mismo riesgo de infección por F. hepatica. Figura 5.14. Diferencia entre la probabilidad de ser seropositivo a F. hepatica al considerar el sexo de las cabras Esta ausencia de diferencias respecto al sexo de las cabras también ha sido observada por Raza et al. (2007) y Afshan et al. (2013). Por el contrario, en cabras de Pakistán, Khan et al. (2010) apreciaron tasas de infección significativamente superiores en las hembras. 110 ANA PÉREZ CREO Figura 5.19. Diferencia entre la probabilidad de ser seropositivo a F. hepatica al considerar la presencia de ovejas en los rebaños de ganado caprino El resultado del algoritmo CHAID (Figura 5.20) reflejó que únicamente la raza y el tamaño de rebaño se consideran factores que influyen sobre el porcentaje de seropositividad a F. hepatica. El efecto del resto de factores, algunos de ellos identificados como significativos mediante Chi-cuadrado, se diluyó al clasificar las variables por su orden de significación. Así, la variable determinante fue la raza de cabra, observándose una seroprevalencia más elevada en los cruces (22,4%) que en las de raza gallega (7,7%). El árbol de clasificación muestra que en las cabras procedentes de cruces el tamaño de granja es un factor determinante en la seropositividad por el trematodo; así, la seroprevalencia más elevada se halló en las cabras pertenecientes a explotaciones pequeñas y medianas, debido principalmente a su menor profesionalidad y manejo tradicional. Por el contrario, el nodo constituido por los animales de raza “Cabra Galega” (nodo 1) no se dividió en más subgrupos, es decir, ninguno de los factores estudiados influyó de manera determinante sobre la seroprevalencia por F. hepatica en estos animales. Resultados y discusión 111 Figura 5.20. Árbol de clasificación obtenido mediante un análisis CHAID exhaustivo que muestra los factores determinantes sobre la seroprevalencia de F. hepatica en cabras. Al igual que en el ganado ovino, en el análisis de los resultados obtenidos en el ganado caprino se empleó una regresión logística de efectos mixtos, introduciendo el rebaño como factor aleatorio para evitar el efecto de agregación. Se fueron excluyendo del análisis uno a uno los factores hasta hallar el mejor modelo posible. Los resultados de este análisis 112 ANA PÉREZ CREO permitieron determinar que en las cabras de Galicia los principales factores que influyen sobre el porcentaje de seropositividad a F. hepatica eran la edad y la raza (Tabla 5.4). Tabla 5.4. Último paso de la regresión logística de efectos mixtos. Los factores se han eliminado uno a uno hasta alcanzar el mejor modelo IC 95% Estimación E. E. p OR Lim. inf Lim. sup Paso 6 Intercept -2,453 0,572 0,000 Edad < 13 meses - - - - - - Edad 13-48 meses 0,.942 0,573 0,100 2,566 0,833 7,899 Edad >48 meses 1,461 0,503 0,003 4,312 1,609 11,552 Cabra Gallega -1,129 0,508 0,026 0,323 0,119 0,875 E.E. – Error estándar OR – Odds ratio calculado mediante el exponencial de B IC 95% - Intervalo de confianza al 95% del OR Como se observa en la Tabla 5.4, los datos del análisis multivariante confirman los resultados del Chi-cuadrado y del CHAID, pues identifica la raza como uno de los factores determinantes en la seropositividad a F. hepatica en las cabras. Así, los cruces tienen una probabilidad 3 veces superior (1/0,323= 3,09) de ser seropositivos que los de la raza autóctona “Cabra Galega”. Aunque se necesitan nuevos estudios para determinar las razones de esta menor seroprevalencia, esta característica puede ser de gran interés en la aplicación de planes de control del trematodo. La regresión logística de efectos mixtos también identificó la edad como un factor que influye significativamente sobre los porcentajes de seroprevalencia frente a F. hepatica. Este resultado contrasta con la ausencia de significación mediante CHAID. En la Tabla 5.4 se puede apreciar que los animales de mayor edad tienen una probabilidad de ser seropositivos entre 2,5 y 4,3 veces superior a la de los animales menores de un año, pues al haber permanecido durante más tiempo en los pastos, han tenido más posibilidades de ingerir metacercarias. Resultados y discusión 113 5.3. MEDIDAS A ADOPTAR PARA REDUCIR LAS INFECCIONES POR F. hepatica EN GANADO OVINO Y CAPRINO DE GALICIA. Nuestros resultados ponen de manifiesto que F. hepatica es un parásito muy común y ampliamente distribuido en las granjas de pequeños rumiantes de Galicia. Los elevados porcentajes de seroprevalencia confirman que las medidas empleadas por los ganaderos frente al trematodo no son totalmente eficaces, por lo que es necesario revisar y mejorar los programas de control. Los resultados obtenidos en el presente estudio nos han permitido identificar los principales factores de riesgo que influyen sobre la seroprevalencia de F. hepatica en ganado en ovino y caprino de Galicia, siendo estos el tamaño de las explotaciones, la edad de los animales y la presencia de cabras en las explotaciones ovinas. En consecuencia, y como se expondrá a continuación, en las explotaciones de ganado ovino y caprino en Galicia, para minimizar algunos factores de riesgo no se deben utilizar las mismas pautas de control recomendadas para otras especies animales como el ganado vacuno. Los factores de riesgo identificados en este estudio, deberían tenerse en cuenta en el diseño de nuevos planes de control o cuando se adopten nuevas medidas en los ya existentes, por lo que se proponen las siguientes medidas: 1ª. Las explotaciones de ganado ovino y caprino, en general, y las de menor tamaño en particular, deben profesionalizarse y realizar un adecuado manejo de los pastos. Los ganaderos deben conocer que, para el control de esta trematodosis y de las parasitosis en general, no es suficiente la aplicación de antihelmínticos, incluso cuando estos son los adecuados. En este sentido, Paz-Silva et al. (1999) comprobaron que no existían diferencias entre la prevalencia de infección por F. hepatica en ovejas tratadas con diferentes fasciolicidas y las no tratadas; de hecho, los animales desparasitados nunca alcanzaron valores de absorbancia considerados como negativos, y al cabo de unas semanas volvían a eliminar huevos de F. hepatica, lo que es lógico, si se tiene en cuenta que los animales continuaban pastando en pastos contaminados con metacercarias de F. hepatica y, por lo tanto, se reinfectaban. Por ello, es imprescindible evitar el pastoreo en los pastos que se encharcan con 114 ANA PÉREZ CREO facilidad o cercar las zonas más húmedas, en las que habrá mayor número de metacercarias viables. Cuando sea necesario complementar la alimentación de los animales con heno o ensilado, este se ha debe elaborar de forma que se garantice que está libre de metacercarias; también es aconsejable añadir algún conservante a los forrajes que reduzca la viabilidad de las metacercarias (Andrews, 1999). 2ª. Para reducir la prevalencia de infección en los animales de mayor edad, estos deben pastar en las praderas menos contaminadas. Nuestros resultados demuestran que los animales de mayor edad presentan seroprevalencias significativamente más elevadas que los más jóvenes. Además, el ganado ovino y caprino no desarrolla una respuesta inmunitaria protectora frente a F. hepatica, y las reinfecciones repetitivas, aunque sean con un número reducido de metacercarias, producen un aumento de la intensidad de las lesiones, sobre todo en las cabras (Pérez et al., 2002), comprobándose incluso que estas pueden ocasionar la muerte de los animales (MartínezMoreno et al., 2006). En consecuencia, se recomendaría que los animales de mayor edad utilicen las parcelas menos contaminadas con metacercarias de F. hepatica. 3ª. Se recomienda que no se exploten conjuntamente el ganado ovino y el caprino. Aunque no se ha constatado que sea un factor de riesgo determinante del incremento de la prevalencia de infección por F. hepatica; sin embargo, se ha comprobado que en las granjas de mayor tamaño, la presencia de cabras incrementa la seroprevalencia de infección en los ovinos más jóvenes. 4ª. Incrementar el número de efectivos de la raza autóctona “Cabra Gallega”. Esta raza, además de su rusticidad y adaptación al medio, se ha constado que tiene un menor riesgo de infección por F. hepatica que las cabras procedentes de cruces. Asimismo, de esta forma se contribuiría al fomento y conservación de las razas de autóctonas de nuestra Comunidad. Resultados y discusión 115 5ª. Realizar un correcto diagnóstico de esta y otras infecciones parasitarias antes de realizar los tratamientos antihelmínticos. En la actualidad, el control de las infecciones por F. hepatica se basa, fundamentalmente, en el uso de antihelmínticos; sin embargo, en estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación (Pedreira et al., 2006) se comprobó que, en granjas de ganado ovino de Galicia, la elección del producto antihelmíntico se basaba, en la mayoría de los casos, en la experiencia personal del ganadero o en el consejo de la comercial farmacéutica y solo un pequeño porcentaje de ganaderos seguían el consejo del veterinario. Además, en la mayoría de los rebaños donde se administran tratamientos antihelmínticos, éstos se llevan a cabo sin conocer las infecciones parasitarias que afectan a los animales, debido a que no es frecuente la realización de análisis coprológicos previos o posteriores a su aplicación, por lo que en la mayoría de los casos no se emplean los fármacos adecuados. Asimismo, la inadecuada utilización de los antihelmínticos de mayor uso ha ocasionado la aparición de resistencias frente a este trematodo (Moll et al., 2000; Alvarez-Sánchez et al., 2006; Vara del Río, 2007) y otros helmintos (Coles et al., 2005; Díez Baños et al., 2008; Papadopoulos et al., 2012; Torres-Acosta et al., 2012; Geurden et al., 2014; MartínezValladares et al., 2015). 6ª. Incrementar la formación de los ganaderos y concienciarles de que es imprescindible el asesoramiento veterinario en las explotaciones de ganado ovino y caprino. Se deben impartir charlas formativas sobre las principales infecciones parasitarias que afectan a estos pequeños rumiantes, entre las que se encuentra las infecciones por F. hepatica, puesto que en este estudio se ha comprobado que estos animales y, en especial los ovinos, son muy receptivos a este trematodo. El profesional veterinario es el único que puede realizar el control de las infecciones que afectan a la cabaña ganadera y de esta forma garantizar que el estado sanitario de las explotaciones es el óptimo para que estas sean más rentables. CONCLUSIONES Conclusiones 119 6. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos en este estudio se concluye: 1ª. La técnica de inmunodiagnóstico ELISA MM3-SERO, basada en el empleo del anticuerpo monoclonal MM3, nos ha permitido demostrar que F. hepatica es un parásito muy prevalente y ampliamente distribuido en los rebaños de ovino y caprino de Galicia. 2ª. La influencia de los diferentes factores de riesgo sobre la seroprevalencia se debe interpretar con cautela cuando se utilizan únicamente métodos estadísticos univariantes, siendo necesario complementar estos análisis con otros multivariantes, como el algoritmo CHAID y el análisis de regresión logística múltiple de efectos mixtos. 3ª. Uno de los factores de riesgo más importantes en las infecciones por F. hepatica en ganado ovino y caprino fue el tamaño del rebaño, siendo la seroprevalencia significativamente superior en las explotaciones pequeñas, debido a que se utilizan métodos de manejo tradicionales y no se aplican medidas adecuadas de control y prevención de las enfermedades infecciosas y parasitarias. 4ª. La edad de los animales fue también un factor determinante en ambas especies, constatándose que la seroprevalencia se incrementaba en los animales de mayor edad, lo que manifiesta el contacto continuo que los pequeños rumiantes tienen con el parásito en esta región. 5ª. Se constató que la presencia de cabras en los rebaños de ovejas incrementaba significativamente la seroprevalencia de infección por este trematodo, probablemente debido a que en los rebaños mixtos se realiza un control sanitario menos estricto. 126 ANA PÉREZ CREO de p, ajustándose hasta que todas las variables presentaban un valor de p significativo (p< 0,05). Al considerar el total de los animales analizados, el porcentaje individual de seropositivos fue del 24,3%, mientras que el porcentaje de granjas que tenían al menos un animal positivo fue del 67,7%. La seroprevalencia fue ligeramente superior en los rebaños de ovejas (25,3%) que en los de cabras (22,7%), aunque estas diferencias no fueron significativas. El porcentaje de rebaños que presentaban al menos un animal seropositivo fue superior en las explotaciones de ovino que en las de caprino, siendo estas diferencias significativas (χ2= 4,598; p=0,032). Además, los valores de odds ratio indican que las granjas de ovino muestran una mayor probabilidad de tener animales seropositivos (OR= 2,64; 1,076,63) que las de caprino. En el ganado ovino, mediante análisis univariante, se constató que la seroprevalencia era inferior en los animales menores de un año, pero que esta se mantenía estable a partir de esta edad. No se hallaron diferencias en la seroprevalencia al considerar el sexo. Por el contrario, se comprobó que el porcentaje de animales seropositivos disminuía a medida que se incrementaba el tamaño del rebaño. La seroprevalencia fue más elevada en los rebaños en los que había por lo menos una cabra entre sus efectivos; por el contrario, el porcentaje de animales seropositivos no varió con el sistema de manejo empleado para su cría (semiextensivo o extensivo) ni con la zona climática. Cuando se utilizó un CHAID exhaustivo para clasificar la influencia de los diferentes factores estudiados sobre la seroprevalencia, se constató que el factor de riesgo que más influía era el tamaño del rebaño, siendo significativamente superior en las explotaciones pequeñas (30,9%) que en las grandes (19,1%). Además, el árbol de clasificación muestra que en los rebaños de menor tamaño el segundo factor en importancia era la presencia de cabras en la explotación; este incremento en la seroprevalencia podría deberse a que los rebaños mixtos son, en general, los menos tecnificados y en los que se realiza un control menos estricto. Asismismo, se constató que en las granjas de tamaño pequeño y mediano en las que había cabras, la seroprevalencia era significativamente superior en los rebaños de la zona costa-centro (42,4%) que en los de la montaña (20,0%). En las explotaciones de mayor Resumen 127 tamaño, se observó que el segundo factor determinante sobre la seroprevalencia por Fasciola era la edad de los animales, observándose que esta era significativamente superior en los mayores de 48 meses (21,6%) que en los de menor edad (6,2%). Por el contrario, el efecto de este factor no se observó en las granjas más pequeñas. Al aplicar el análisis multivariante de regresión logística, se comprobó que la edad y el tamaño de la granja eran los factores que influían de forma más significativa sobre la seroprevalencia de infección por F. hepatica. Estos resultados confirman los datos obtenidos con el CHAID y ponen en evidencia que hay que interpretar con cautela la valoración de los factores de riesgo empleando únicamente métodos estadísticos univariantes. En el ganado caprino se obtuvieron resultados similares a los hallados en el ovino. Mediante análisis univariante se observó que la seroprevalencia se incrementaba con la edad y en los rebaños del área costa-centro, en los que se realizaba un manejo en extensivo, así como en las explotaciones en las que las cabras convivían con las ovejas. Por el contario, se apreció una relación inversa entre los porcentajes de seropositividad y el tamaño de granja. Además, en el ganado caprino, se observó la influencia de la raza como factor determinante, constatándose que los animales pertenecientes a la raza autóctona “Cabra Galega” presentaban seroprevalencias inferiores a las halladas en los cruces. Al estudiar la influencia de los diferentes factores de riesgo mediante el algoritmo CHAID se observó una seroprevalencia significativamente más elevada en los cruces (22,4%) que en las de raza gallega (7,7%). Además, el árbol de clasificación muestra que en las cabras procedentes de cruces el tamaño de granja es un factor determinante sobre la seroprevalencia por F. hepatica; así, el mayor porcentaje de cabras seropositivas se halló en las explotaciones de pequeño y mediano tamaño. Por el contrario, en los animales de raza “Cabra Galega” ninguno de los factores estudiados afectó de manera determinante sobre la seroprevalencia por F. hepatica en estos animales. Con el análisis multivariante se comprobó que la raza y la edad eran los principales factores que influían sobre la seroprevalencia de infección por F. hepatica. Así, los cruces tienen una probabilidad 3 veces superior de ser seropositivos que los de la raza autóctona 128 ANA PÉREZ CREO “Cabra Galega”. Respecto a la influencia de la edad, se comprobó que las cabras de mayor edad tienen una probabilidad de ser seropositivos entre 2,5 y 4,3 veces superior a la de los animales menores de un año; estos resultados contrastan con la ausencia de significación mediante CHAID. Los resultados obtenidos en el presente estudio nos han permitido identificar los principales factores de riesgo que influyen sobre la seroprevalencia de F. hepatica en ganado en ovino y caprino de Galicia, siendo estos el tamaño de las explotaciones, la edad de los animales y la presencia de cabras en las explotaciones ovinas; además, sobre la seroprevalencia de infección por F. hepatica en ganado caprino en Galicia, se ha comprobado que influye la raza, siendo las “Cabras de raza pura gallega” las que presentan menores porcentajes de seropositividad. Los factores de riesgo identificados en ganado ovino y caprino en Galicia deben tenerse en cuenta en el diseño de nuevos planes de control de las infecciones por F. hepatica o cuando se adopten nuevas medidas en los ya existentes. Para minimizar el efecto de los principales factores de riesgo identificados en este estudio, es necesario utilizar pautas de control específicas, no siendo extrapolables algunas de las recomendadas para el ganado vacuno. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 131 8. BIBLIOGRAFÍA ABDEL-RAHMAN, S.M.; O´REILLY, K.; MALONE, J.B. (1998). Evaluation of a diagnostic monoclonal antibody-based capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of a 26 to 28 kd Fasciola hepatica coproantigen in cattle. American Journal Veterinary Research, 59: 533-537. ABROUS, M.; RONDELAUD, D.; DREYFUSS, G.; CABARET, J. (1999). Infection of Limnaea Truncatula and Lymnea glabra by Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi in farms of central France. Veterinary Research, 30: 113-118. 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