Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente

Tesis doctoral TESIS MICOTERAPIA APLICADA EN ONCOLOGÍA INTEGRATIVA. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente La micoterapia oncológica, es decir, el uso de los hongos como nutracéuticos en el campo de la oncología integrativa, responde a una demanda social, clínica y económica de incuestionable envergadura. La presente tesis doctoral presenta y analiza resultados preclínicos que muestran las propiedades antitumorales de los extractos fúngicos desarrollados por la empresa Hifas da Terra, y su potencialidad como terapia coadyuvante en pacientes con cáncer colorrectal. Así mismo, delinea el protocolo de un ensayo clínico para evaluar los efectos beneciosos de los extractos de hongos en la calidad de vida de los pacientes oncológicos. 2021 Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente Santiago de Compostela, 2021 Catalina Fernández de Ana Portela Catalina Fernández de Ana Portela PD en Investigación Clínica en Medicina ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC TESIS DE DOCTORADO MICOTERAPIA APLICADA EN ONCOLOGÍA INTEGRATIVA La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente Catalina Fernández de Ana Portela ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN INVESTIGACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2021 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Catalina Fernández de Ana Portela Título de la tesis: Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente. Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Pontevedra, 3 de mayo del 2021. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente. Prof. Dr. D. Manuel Pereiro Ferreirós INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. Catalina Fernández de Ana Portela, bajo mi dirección y tutela, y autorizo su presentación, considerando que reúne l os requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, a 24 de abril de 2021. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente. Prof. Dr. D. Jaime Antonio Fabregas Casal INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. Catalina Fernández de Ana Portela, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne l os requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, a 24 de abril de 2021. Firma electrónica 15 Agradecimientos Quiero agradecer la posibilidad de haber llegado a la realización de esta tesis, en primer lugar, a mis directores de tesis Jaime Fábregas y Manuel Pereiro por haberme apoyado desde el final de la carrera hasta el depósito de la misma. A todo el equipo de Hifas da Terra, por trabajar por esta ciencia; la micoterapia, investigando, estudiando y aplicando todo su potencial. Gracias, por haber hecho posible que me fuese a vivir a Reino Unido y dedicarme en exclusividad a escribir esta tesis. A todos los pacientes que buscan mejorar su calidad de vida y pronóstico con la integración de la micoterapia en sus tratamientos. Este ha sido uno de los trayectos más bonitos e intensos de mi vida profesional, en el que el estudio y la aplicación de lo aprendido me ha permitido ayudar a mucha gente en una patología tan compleja como el cáncer. Me siento muy afortunada por tener el gran privilegio de aprender, desarrollar, y enseñar micoterapia, que da vida, sobre todo calidad de vida. Por supuesto, agradecer a mis padres por todo, empezando por darme la vida. Ser mis guías, referencia y maestros. A mis hermanas por ser mis compañeras de viaje, aventuras y aprendizaje. A mis hijos, Nuno y Lucas por acompañarme y animarme cada día. A mi marido Esteban por apoyarme siempre, incondicionalmente. Por ser mi roca, mis cimientos, tanto a nivel personal como profesional, en el precioso proyecto científico llamado Hifas da Terra. 17 Resumen Como modificadores de la respuesta biológica (MRB), los hongos han demostrado en numerosos estudios clínicos y preclínicos tener importantes propiedades terapéuticas, incluyendo actividad antioxidante, inmunoestimuladora, antiinflamatoria y antitumoral, a lo que se suman las capacidades de los hongos de actuar como prebióticos. Surge así el término de Micoterapia, entendido como el uso de los hongos y sustancias fúngicas aplicados a la prevención y el tratamiento de enfermedades. El cáncer es la enfermedad mortal número uno en el mundo actual. En el caso concreto del cáncer colorrectal (CCR), esta enfermedad supone aproximadamente el 15 % de los casos totales de cáncer, siendo el segundo tipo de cáncer en incidencia en los países occidentales, donde es una de las principales causas de mortalidad. Las limitaciones de las terapias oncológicas disponibles, como la quimioterapia, la radioterapia o la cirugía, están favoreciendo el uso creciente de productos medicinales complementarios y alternativos (CAM). Estos productos actuarían como coadyuvantes, tanto para incrementar la eficacia de la terapia convencional, como para paliar los efectos secundarios y reducir el riesgo de recidiva. En este sentido, los extractos ricos en polisacáridos obtenidos de ciertas especies de hongos medicinales han mostrado efectos antitumorales en diferentes modelos experimentales. Por lo tanto, el uso de los hongos como nutracéuticos, sobre todo en oncología integrativa, responde a una demanda social, clínica y económica de incuestionable envergadura. La presente tesis doctoral pretende evidenciar y determinar la capacidad anticancerígena y prebiótica de diversos extractos de hongos medicinales, respondiendo así de una manera múltiple a la arriba mencionada demanda. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 18 Por un lado, se hace una revisión del conocimiento generado en los últimos veinte años en el campo de la Micoterapia, en particular de la micología aplicada a la oncología. Por otro lado, se presentan y analizan los efectos citotóxicos y antitumorales de diferentes extractos de hongos medicinales, observados in vitro sobre líneas celulares humanas de CCR. También se muestran in vivo, en un modelo murino (ratones) de colitis ulcerosa y CCR, los efectos de los extractos de origen fúngico con capacidad prebiótica sobre los marcadores de inflamación y la microbiota intestinal. Los resultados preclínicos confirmaron las propiedades prebióticas de los extractos fúngicos ensayados (Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Agaricus blazei Murrill, Lentinula edodes, Polyporus umbellatus y Ophiocordyceps sinensis) y su potencialidad como terapia coadyuvante. El extracto de Hericium erinaceus mostró propiedades prebióticas in vitro. Todos los extractos mostraron baja o nula capacidad de inhibición de las enzimas CYP450 (IC50 > 800 μg/ml), indicando una baja posibilidad de interacciones medicamentosas. In vivo, la fórmula Mico-Digest 2.0® indujo en ratones con CCR una reducción de los niveles de IL-6 y TNF-α en suero, así como una modificación significativa de la microbiota intestinal. En función de los resultados preclínicos obtenidos, se ha diseñado el protocolo de un ensayo clínico aleatorizado, en doble ciego, que se llevará a cabo en pacientes diagnosticados con CCR candidatos a tratamiento quirúrgico con intención curativa. Este ensayo evaluará el efecto beneficioso de la administración del nutracéutico Mico-Digest 2.0®. Se evaluarán también los efectos sobre la microbiota intestinal, el patrón inflamatorio sistémico y la calidad de vida de los pacientes. 19 Resumo Como modificadores da resposta biolóxica (MRB), os fungos demostraron en numerosos estudos clínicos e preclínicos posuíren importantes propiedades terapéuticas, incluída a actividade antioxidante, inmunoestimuladora, antiinflamatoria e anticancerosa, á que se engaden as habilidades dos fungos para actuar como prebióticos. Xorde así o termo Micoterapia, entendido como o uso de fungos e substancias fúngicas aplicadas á prevención e tratamento de enfermidades. O cancro é a enfermidade mortal número un no mundo actual. No caso específico do cancro colorrectal (CCR), esta enfermidade representa aproximadamente o 15% do total de casos de cancro, sendo o segundo tipo de cancro en incidencia nos países occidentais, onde é unha das principais causas de mortalidade. As limitacións das terapias contra o cancro dispoñibles, como a quimioterapia, a radioterapia ou a cirurxía, están a favorecer o uso crecente de medicamentos complementarios e alternativos (CAM). Estes produtos actuarían como coadxuvantes, tanto para aumentar a eficacia da terapia convencional como para aliviar os efectos secundarios e reducir o risco de recorrencia. Neste sentido, os extractos ricos en polisacáridos obtidos de certas especies de cogomelos medicinais demostraron ter efectos anticancerosos en diferentes modelos experimentais. Polo tanto, o uso de fungos como nutracéuticos, especialmente na oncoloxía integradora, responde a unha demanda social, clínica e económica de indubidable importancia. A presente tese de doutoramento ten como obxectivo demostrar e determinar a capacidade anticancerosa e prebiótica de varios extractos CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 20 de cogomelos medicinais, respondendo así dun xeito múltiple á mencionada demanda. Por unha banda, faise unha revisión do coñecemento xerado nos últimos vinte anos no mundo da Micoterapia, en particular da micoloxía aplicada á oncoloxía. Tamén se amosan in vivo, nun modelo múrido (ratos) de colite ulcerativa e CCR, os efectos de extractos de fungos con capacidade prebiótica sobre os marcadores inflamatorios e a microbiota intestinal. Os resultados preclínicos confirmaron as propiedades prebióticas dos extractos de fungos ensaiados (Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Agaricus blazei Murrill, Lentinula edodes, Polyporus umbellatus y Ophiocordyceps sinensis) e o seu potencial como terapia coadxuvante. O extracto de Hericium erinaceus mostrou propiedades prebióticas in vitro. Todos os extractos mostraron baixa ou nula capacidade de inhibición dos encimas CYP450 (IC50 > 800 μg/ml), o que indica una baixa posibilidades de interaccións medicamentosas. In vivo, a fórmula Mico-Digest 2.0® induciu unha redución dos niveis séricos de IL-6 e TNF-α en ratos con CCR, así como unha modificación significativa da microbiota intestinal. Baseándose nos resultados preclínicos obtidos, deseñouse o protocolo para un ensaio clínico aleatorio de dobre cego, que se levará a cabo en pacientes diagnosticados de CCR que son candidatos a tratamento cirúrxico con intención curábel. Este ensaio avaliará o efecto beneficioso da administración do nutracéutico Mico-Digest 2.0®. Tamén se avaliarán os efectos sobre a microbiota intestinal, o patrón inflamatorio sistémico e a calidades de vida dos pacientes. 21 Abstract As modifiers of the biological response (MBR), fungi have shown in numerous clinical and preclinical studies to have important therapeutic properties, including antioxidant, immunostimulatory, antiinflammatory and anti-tumor activity, besides to their prebiotic capabilities. Arises thus the term of Micotherapy, understood as the use of fungi and fungal substances applied to the prevention and treatment of diseases. Cancer is the number one deadly disease in the world today. In the specific case of colorectal cancer (CRC), this disease accounts for approximately 15% of total cancer cases, being the second most frequent type of cancer in Western countries, and one of the main causes of mortality. The limitations of available anti-cancer therapies, such as chemotherapy, radiotherapy, or surgery, favor the increasing use of complementary and alternative medicinal (CAM) products. These products would act as treatment’s adjuvants, to increase efficacy of the conventional therapy, to alleviate side effects, and to reduce recurrence risk. In this sense, extracts rich in polysaccharides obtained from certain species of medicinal mushrooms have shown antitumor effects in different experimental models. Therefore, the use of fungi as nutraceuticals, especially in integrative oncology, responds to a social, clinical, and economic demand of unquestionable importance. This doctoral thesis aims to demonstrate and determine the anticancer and prebiotic capacity of various medicinal mushrooms extracts, thus responding in a multiple way to the aforementioned demand. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 22 On the one hand, the knowledge generated in the last twenty years in the field of Micotherapy, particularly on mycology applied to oncology, is reviewed. The effects of fungal extracts with prebiotic capacity on inflammatory markers and the intestinal microbiota are also shown in vivo in a murine (mice) model of ulcerative colitis and CRC. The preclinical results confirmed the prebiotic properties of the fungi extracts tested (Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Agaricus blazei Murrill, Lentinula edodes, Polyporus umbellatus y Ophiocordyceps sinensis) and their potential as adjuvant therapy. Hericium erinaceus extract showed prebiotic properties in vitro. All extracts showed low or no inhibition capacity of CYP450 enzymes (IC50 > 800 μg/ml), indicating a low possibility of drug-to-drug undesirable interactions. In vivo, the Mico-Digest 2.0® formula induced a reduction of IL-6 and TNF-α serum levels in mice with CRC, as well as a significant modification of the intestinal microbiota. Based on the preclinical results obtained, a protocol for a randomized, double-blind clinical study has been designed. This trial will be carried out in patients diagnosed with CRC who are candidates for surgical treatment with curative intent. This trial will evaluate the beneficial effects of the nutraceutical Mico-Digest 2.0® administration. The effects on the patients’ intestinal microbiota, systemic inflammatory pattern and quality of life will also be evaluated. 23 Resumen esquemático de resultados A) Resultados preclínicos in vitro.  El extracto de Hericium erinaceus aumentó el crecimiento de bacterias probióticas (efecto prebiótico).  Los extractos de Trametes versicolor, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Agaricus blazei Murrill, Lentinula edodes y Polyporus umbellatus presentaron baja o nula inhibición de las enzimas CYP450. B) Resultados preclínicos in vivo en un modelo murino de CCR:  La fórmula Mico-Digest 2.0® mostró una tendencia a reducir los marcadores inflamatorios (IL-6 y TNF-α en suero, peso del bazo).  Los ratones con CCR tratados con Mico-Digest 2.0® mostraron diferencias estadísticamente significativas (diversidad beta) en la composición de la microbiota intestinal con respecto a los grupos control en las Familias Bifidobacteriaceae, Erysipelotrichaceae y Clostridiaceae (concretamente el género Candidatus Arthromitus). C) Resultados clínicos:  Diseño detallado del protocolo de un ensayo clínico en Fase II para el tratamiento con micoterapia coadyuvante (fórmula MicoDigest 2.0®) en pacientes oncológicos de CCR sometidos a cirugía curativa. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 30 materiales orgánicos a partir del dióxido de carbono, minerales y agua. Sólo pueden ingerir los nutrientes necesarios en solución por absorción. En general, requieren unas condiciones ambientales (aireación, luz, humedad, temperatura, pH, etc.) adecuadas. Además de agua y oxígeno, esenciales para su crecimiento, también requieren microelementos (N, P, K, Mg, Ca, Ga, Fe, Zn, Cu, Mn, Mb). Los hongos saprófitos son netamente ecológicos pues constituyen un elemento clave de la biodiversidad. Juegan un papel ecológico importante como recicladores de nutrientes en el ecosistema. 70 Sintetizan sus propios nutrientes a partir de residuos agrícolas que, de no ser degradados, supondrían un riesgo para la salud. 56 Aunque el término hongo es muy genérico, pues agrupa, entre otros, a los basidiomicetos, los ascomicetos y las levaduras, en la presente tesis doctoral el término hongo hará referencia en su mayor parte a los hongos superiores, es decir, a los basidiomicetos. Si bien existen otros hongo superiores con propiedades medicinales que no pertenecen a la división de los basidiomicetes. Este sería el caso de Ophiocordyceps sinensis, que pertenece a la división de los ascomicetos (Ascomycota). Los hongos viven en el nivel más hostil del ecosistema, caracterizado por sustancias en descomposición y por estar en contacto con muchos agentes patógenos, con un mayor riesgo de enfermedad en relación con otras formas de vida: un suelo cargado de microorganismos y de otros hongos muy competitivos. Por estas razones, para poder sobrevivir, han tenido que desarrollar sistemas «inmunitarios» preventivos. Es precisamente la presencia de poderosas enzimas y la abundancia de múltiples sustancias con propiedades antimicrobianas lo que sustenta la importancia del uso terapéutico de los hongos. 219, 249 Una misma especie de hongo puede poseer una gran variedad de compuestos bioactivos y, por lo tanto, de posibles efectos farmacológicos. 219 Los hongos representan una mezcla compleja de ingredientes individuales, cada uno de los cuales puede contribuir a su actividad biológica. 278 Los hongos se han utilizado durante siglos como nutrientes en la dieta humana, como agentes de fermentación en la producción de Introducción 31 alimentos y bebidas y, desde luego, como medicinas. 216, 251, 337, 367, 418 De hecho, los hallazgos arqueológicos han demostrado el uso de los hongos medicinales desde el Paleolítico y, ya en épocas históricas, la aplicación de hongos en heridas abiertas aparece en jeroglíficos egipcios de hace más de 4.600 años. 109, 216, 251, 253 Existen, sin embargo, importantes diferencias culturales en cuanto al uso medicinal de los hongos. En Oriente, las setas con propiedades curativas han sido muy apreciadas desde la más remota antigüedad. 6, 249 De hecho, el conocimiento más amplio de las propiedades terapéuticas de los hongos proviene de Oriente, en particular de China, Japón, Corea y Rusia septentrional y oriental, donde la tradición los ha considerado como una maravilla culinaria y un recurso importante de la medicina popular y la Medicina Tradicional China (MTC). 253, 299, 417 Un ejemplo de la importancia cultural de los hongos en las civilizaciones orientales es que, en el primer tratado de materia médica, el Pen Ts’ao Kang Mu, escrito en el año 1578 por el emperador, médico y literato Li Shih-chên, se recogen los efectos del hongo Ganoderma lucidum (llamado reishi en Japón o Linh Chi en China), que conocían como seta de la inmortalidad y la eterna juventud. Los emperadores de las grandes dinastías chinas bebían los extractos de este hongo para aumentar su vitalidad y longevidad. 105, 219 Por el contrario, los hongos han gozado históricamente de muy mala fama en Occidente. Tenemos constancia del gran uso y conocimiento que hubo en las primeras etapas de desarrollo de la humanidad. A principios del Neolítico pertenece la momia Ötzi, recuperada en los Alpes tiroleses y datada de 5300 años de antigüedad. Esta momia pertenece a un cazador neolítico que en su zurrón cargaba 3 tipos distintos de hongos empleados con distintos fines: como tizón para empezar un fuego, como alucinógeno para poder establecer conexión con sus dioses, y como antiparasitario. A partir de la Edad Media se fue reduciendo el uso de los hongos dada su relación con los fines curativos, la elaboración de pócimas y la persecución de las brujas por la Santa Inquisición. Además del efecto de la persecución a aquellos que utilizaban hierbas y hongos para curar, y el intento de proteger a la población contra las confusiones en la recolección de setas y sus consecuencias, ocurrieron distintos CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 32 eventos que no ayudaron a la popularización de los hongos. Así, el «cornezuelo del centeno» diezmó la población europea en la Edad Media; en 1850 el «tizón de la patata» causó años de hambruna en Irlanda y miles de muertes por desnutrición; y el «mildiu» asoló los viñedos europeos a finales del siglo XIX. 6, 249 Por otra parte, la medicina occidental moderna hasta el siglo pasado ha hecho escaso uso de los hongos medicinales, principalmente por la complejidad de la estructura que les caracteriza y por la dificultad de aislar las sustancias puras con propiedades farmacológicas. Pero a partir de 1960 la MTC empezó a despertar gran interés en Occidente y propulsó la investigación de las setas utilizadas con fines terapéuticos. Es a partir de la década de 1990 cuando realmente eclosiona el interés en el mundo occidental por comprobar y transmitir los efectos de los hongos y sus capacidades a nivel farmacológico. 219, 249, 337, 379, 396 Un número creciente de estudios han identificado las propiedades terapéuticas y el potencial farmacológico de diversas sustancias aisladas de diferentes especies de hongos. 6, 80, 216, 299, 448 En las últimas décadas, los hongos se han convertido en una maravillosa fuente de nutracéuticos, antioxidantes, anticancerígenos, prebióticos, inmunomoduladores, antiinflamatorios, diuréticos, cardioprotectores, antimicrobianos y antidiabéticos, constituyéndose así en la nueva generación de productos «bioterapéuticos». 236, 299, 337, 351, 482 Los productos fúngicos y sus derivados constituyen más del 50 % de los medicamentos clínicos usados en la actualidad en el mundo. 351 Los compuestos anticancerígenos extraídos de estos hongos desempeñan un papel crucial como inductores antioxidantes, antimitóticos, inhibidores de la angiogénesis, inductores de la apoptosis y controladores de la proliferación cancerígena. 299, 429, 443 En esta Introducción revisaremos en detalle las propiedades anticancerígenas de los hongos medicinales. 1.1.1 El concepto de micoterapia El término «Micoterapia», entendido como el uso de los hongos y sustancias fúngicas en la prevención y el tratamiento de enfermedades, fue acuñado en 1997 por el profesor eslovaco Jan I. Lelley. 26 Aunque Introducción 33 el término fue utilizado desde entonces por algunos expertos en el campo de la micología, el concepto de micoterapia fue puesto en boga en España por el grupo de investigación de la compañía Hifas da Terra a partir del año 2007, que también acuñó el término micoinmunoterapia. Este último hace referencia a las propiedades inmunoreguladoras de los extractos de hongos, como se explicará más adelante. Las primeras publicaciones científicas internacionales que utilizan el término «mycotherapy» aparecen en 2011 y hasta la actualidad ha aparecido en apenas unas pocas docenas de publicaciones. La etimología del término procede del griego «myke», que significa hongo y de «therapeía», terapia, y haría referencia a la terapia basada en la aplicación sinérgica de distintas especies de hongos (o fracciones de estos) en el tratamiento, prevención, cura o mantenimiento de una patología en concreto. Es decir, la micoterapia consiste en la utilización de los hongos como elementos medicinales, en la mayoría de los casos como suplemento terapéutico integrador añadido al tratamiento convencional de la patología. 124 La estrategia convencional de la industria farmacéutica consiste en investigar el mundo fungi buscando componentes activos, moléculas específicas de bajo peso molecular (metabolitos secundarios) que sirvan para combatir una determinada enfermedad. Una vez extraída dicha molécula, aislada y ensayada para probar su efectividad, la industria farmacéutica busca la forma más rentable para poder producirla masivamente y llevarla al mercado (previa patente del método de producción y de la efectividad terapéutica). 83, 96, 105, 176, 249 En la actualidad, universidades y centros de investigación a nivel nacional e internacional centran su interés sobre la actividad concreta de un tipo de molécula procedente de un hongo concreto. Este sería el caso de las erinacinas y hericenonas, presentes en el hongo Hericium erinaceus, de las que se ha descrito interesantes propiedades como activadores de la síntesis de la vaina de mielina y, por lo tanto, recuperadores de la actividad neuronal. 187, 225 En micoterapia, por el contrario, lo que se investiga es el efecto del hongo en su totalidad (por lo general, del cuerpo fructífero o seta, CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 34 aunque a veces también del micelio), con todos sus principios activos. Las razones de esta estrategia alternativa son fundamentalmente dos. Por un lado, las moléculas actúan en sinergia, es decir, sumando la acción específica de una a la similar o complementaria de otra. Así, si en una seta tenemos un compuesto antitumoral y otro antiinflamatorio, la acción combinada de ambos será mucho más efectiva contra un determinado cáncer que cada uno de los compuestos actuando por separado. En segundo lugar, porque muchas setas medicinales que se utilizan para tratar determinadas enfermedades han demostrado su efectividad de forma empírica a lo largo de siglos de utilización. 249 Aún conocemos muy poco sobre los hongos y cada día se descubren nuevos hechos sorprendentes acerca de estos organismos. 249 Pero, antes de alcanzar la generalización del uso clínico de los hongos, se requiere conseguir una producción estandarizada y aportar evidencias científicas de sus efectos beneficiosos, como sería el uso de hongos como terapia coadyuvante en los enfermos oncológicos. 1.1.2 El uso de los hongos medicinales en la actualidad Resulta difícil definir qué es la medicina complementaria y alternativa hoy en día, pues se trata de un campo relativamente nuevo, muy amplio y en constante evolución. 263 El Centro Nacional de Medicina Complementaria y Alternativa (NCCIH, por sus siglas en inglés, National Center for Complementary and Integrative Health), dependiente del NIH (National Institutes of Health) es el principal organismo del gobierno federal de los Estados Unidos para la investigación científica sobre este tipo de medicina. Según este organismo, podemos distinguir diversos tipos de medicina en la actualidad: 263, 337  La «medicina convencional», también denominada medicina occidental, alopática, formal, ortodoxa, ordinaria o biomedicina. Sería la medicina ejercida por aquellos que poseen un título de doctor en medicina y los profesionales sanitarios asociados, como fisioterapeutas, psicólogos y enfermeros. Esta medicina convencional abarca una serie de terapias y prácticas que difieren mucho de un país a otro. Introducción 35  La «medicina complementaria» haría referencia a la medicina que se utiliza conjuntamente con la medicina convencional. Un ejemplo sería el empleo de la acupuntura como método adicional de alivio del dolor, o el uso de la aromaterapia para ayudar a mitigar la falta de comodidad del paciente después de la cirugía. Sin embargo, la eficacia y validez de muchas de las terapias de esta «medicina complementarias» está aún por demostrar.  La «medicina alternativa», por el contrario, sería la medicina que se utiliza en lugar de la medicina convencional. Un ejemplo de terapia de medicina alternativa es el empleo de una dieta especial para el tratamiento del cáncer en lugar de la cirugía, la radiación o la quimioterapia recomendados por un médico convencional. Llevada al extremo, esta práctica puede acarrear serias y graves consecuencias para la salud.  Por último, tenemos el término de «medicina integrativa», que haría referencia al empleo combinado de terapias médicas convencionales y terapias más propias de la medicina complementaria y alternativa. En el caso de estas últimas, se trataría de aquellas terapias para las cuales existen datos científicos de alta calidad sobre su seguridad y eficacia. 263, 337 El concepto de utilizar los hongos medicinales, es decir, la micoterapia, como complemento en oncología integrativa, constituye el fundamento de la presente tesis doctoral. Las prácticas de medicina complementaria y alternativa suelen agrupar categorías amplias y no definidas formalmente. 263 Una de estas amplias categorías sería el empleo de los llamados «productos naturales», que comprendería la ingesta de hierbas y medicamentos derivados de las mismas, vitaminas, minerales, probióticos (microorganismos vivos, en general bacterias, similares a los microorganismos que normalmente se encuentran en el tracto digestivo del ser humano y que pueden tener efectos beneficiosos), prebióticos (ingredientes alimenticios no digeribles que estimulan de forma selectiva el desarrollo o la actividad de los microorganismos presentes en el cuerpo), suplementos dietéticos y, por supuesto, CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 36 hongos, que tradicionalmente se han incluido dentro de las «plantas medicinales». 263, 324, 367 A estas prácticas y suplementos también se les conoce de forma laxa como «productos medicinales complementarios y alternativos» (CAM, complementary and alternative medicine). 337 Desde un punto de vista preventivo, las razones principales para tomar un producto natural como suplemento terapéutico son el mantener una buena salud, mejorar la homeostasis y crear las condiciones adecuadas para reducir el riesgo de enfermedad. 336 La falta de nuevas terapias convencionales disponibles y el deseo de empoderamiento ha llevado a muchos pacientes (más del 20 % según los estudios) a explorar el uso de medicamentos complementarios y alternativos. 341, 375 Por ejemplo, se ha publicado que los pacientes oncológicos a menudo toman suplementos dietéticos, tales como vitamina D, vitamina B6, vitamina C y magnesio, tras el diagnóstico. Un estudio ha establecido que en Europa el 62 % de las mujeres y el 29 % de los hombres, entre los supervivientes al cáncer, toman algún tipo de suplemento dietético. 310 Sin embargo, la información acerca de los beneficios específicos para la salud de estas prácticas es a menudo escasa y poco contrastada. Esta creciente demanda del mercado ha hecho que la búsqueda de compuestos naturales y suplementos efectivos, no tóxicos, con propiedades antioxidantes y ergogénicas se haya convertido en un tema de gran interés. 336 Se entiende aquí el término «suplemento» como compuestos que pueden usarse junto con el medicamento convencional para el tratamiento de una enfermedad, que conducen a un mejor resultado general de dicho tratamiento, o a una reducción de los efectos secundarios indeseables causados por el medicamento primario. 375 Las medicinas complementarias y alternativas (CAM) han surgido en las últimas décadas como una estrategia prometedora para tratar una amplia cantidad de enfermedades, incluido el cáncer. 109, 331, 337 La medicina complementaria y alternativa se ha asociado en un buen número de estudios con un impacto positivo en los pacientes con cáncer, en lo que se refiere a respuesta al tratamiento convencional, reducción de los efectos secundarios y mejora de la calidad de vida. 337 En este sentido, los hongos y sus extractos serían una de las opciones de la medicina integrativa que ofrecen en la actualidad un Introducción 37 mayor número de posibilidades terapéuticas. Las setas medicinales serían así consideradas no como un medicamento, ni como una alternativa excluyente a la terapia convencional, sino como un complemento nutricional y farmacológico (nutracéutico) que podrían ejercer una acción coadyuvante con el correspondiente tratamiento médico de la enfermedad diagnosticada. 249 Un nutracéutico, neologismo formado por la fusión de las palabras «nutrición» y «farmacéutico», se define como un alimento o parte de un alimento que proporciona beneficios médicos para la salud, incluyendo la prevención o el tratamiento de enfermedades. 169 Los «complementos alimenticios» se encuentran recogidos en la Directiva 2002/46/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 10 de junio de 2002 relativa a la aproximación de las legislaciones de los estados miembros de la UE en materia de complementos alimenticios. En esta directiva se define a los complementos alimenticios como: «Los productos alimenticios cuyo fin sea complementar la dieta normal y consistentes en fuentes concentradas de nutrientes o de otras sustancias que tengan un efecto nutricional o fisiológico, en forma simple o combinada, comercializados en forma dosificada, es decir, cápsulas, pastillas, tabletas, píldoras y otras formas similares, bolsitas de polvos, ampollas de líquido, botellas con cuentagotas y otras forma similares de líquidos y polvos que deben tomarse en pequeñas cantidades unitarias». La etiqueta, presentación y publicidad no atribuirán a los complementos alimentarios la propiedad de prevenir, tratar o curar una enfermedad humana, ni se referirá en absoluto a dichas propiedades. Además, la Directiva es tajante: «En la fabricación de los complementos alimenticios pueden asimismo emplearse las sustancias que hayan sido aprobadas por el comité científico de la alimentación humana sobre la base de los criterios mencionados, para su utilización en la fabricación de alimentos destinados a lactantes y a niños de corta edad, y otros alimentos para usos nutricionales particulares.» Esta Directiva europea no regula la concentración de nutrientes, dosis ni forma química de muchos de los productos naturales necesarios para la salud humana, como pueden ser la coenzima Q10, la cúrcuma, los carotenoides, etc. Tampoco están regulados, ni en la CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 38 Directiva 2002/46/CE ni en los Reglamentos 1952/2006 y 1170/2009, ya que estos hacen sólo referencia a vitaminas y minerales. Incluso la Directiva 2008/100/CE, dirigida específicamente a la cantidad diaria recomendada (CDR) está incompleta, ya que, por ejemplo, indica que la CDR del ácido fólico es de 200 μg diarios, y no reconoce que para la prevención de la espina bífida en bebés es necesario que la madre tome 400 μg de ácido fólico al día. El Reglamento (UE) N.º 432/2012 de la Comisión de 16 de mayo de 2012, por el que se establece una «lista de declaraciones autorizadas de propiedades saludables de los alimentos distintas de las relativas a la reducción del riesgo de enfermedad y al desarrollo y la salud de los niños», está algo más desarrollado y adecuado a la demanda científica y social actual. En conclusión, ninguna directiva europea hace referencia a los términos «suplemento alimenticio», «alimento funcional» o «nutracéutico». Por lo tanto, en la presente tesis doctoral no se utilizará el término «complemento alimenticio», cuya base es exclusiva para vitaminas y minerales. Cuando se haga referencia a los extractos de hongos superiores utilizados en los distintos ensayos se utilizarán los términos «suplemento alimenticio» o «nutracéutico». En los últimos tiempos, la cultura occidental ha empezado a valorar la gran potencialidad del hongo medicinal como recurso natural para combatir diferentes enfermedades ante las problemáticas que presenta el abuso de fármacos. Por lo tanto, no es de extrañar que el número de estudios científico-médicos en esta materia aumente rápidamente. De esta manera, a finales del siglo XX y comienzos del XXI, las producciones de hongos crecieron de forma exponencial, tanto por el desarrollo de nuevas y modernas tecnologías (cultivo estéril, cultivo de micelios, etc.) como por el crecimiento de la aceptación popular de las propiedades nutricionales y saludables de los hongos. 6 Diversos organismos nacionales e internacionales han emitido diversas directrices para el uso de los hongos como nutracéuticos, como es el caso de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la FDA (Food and Drug Administration) estadounidense y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, por sus siglas en inglés, Introducción 39 European Food Safety Authority) el organismo responsable de la normativa para la comercialización de componentes alimentarios con fines sanitarios en la Unión Europea (UE). Aunque la medicina occidental en el siglo pasado ha hecho escaso uso de los hongos medicinales, las investigaciones realizadas en las últimas décadas han cambiado por completo ese panorama. De hecho, se espera que el impacto de la industria de los hongos continúe creciendo significativamente, tanto por su producción y comercialización, como por el descubrimiento de nuevas sustancias de origen fúngico con propiedades farmacológicas. 412 Con una tasa de incremento de la producción anual estimada en un 11 %, la producción mundial de los hongos cultivados supera los 6 millones de toneladas anuales, con un valor cercano a los 30 mil millones de dólares. 45 En EE.UU., las ventas de hongos como suplementos medicinales se incrementaron en más de un 40 % en 2018 con respecto al año anterior, con un valor de mercado de 7,8 mil millones de dólares. 362 La mayor parte de este incremento en la producción industrial de hongos se debe a la confirmación y difusión de sus propiedades medicinales y nutritivas. 45 El valor mundial del comercio de hongos cultivados se calculó para 2013 en aproximadamente 63 mil millones de dólares estadounidenses, de los cuales un 38 % (24 mil millones de dólares) correspondieron a hongos medicinales. 338 En la actualidad se ha recuperado en gran medida el uso medicinal de las setas, y multitud de centros de investigación micológica rescatan el antiguo acervo de muchos usos tradicionales, a la vez que confirman con rigor científico el valor terapéutico de los hongos y sus derivados. Además, se investigan nuevas especies y variedades de las que se extraen sustancias con actividades farmacológicas y terapéuticas (antitumorales, inmunomoduladoras, antiinflamatorias, anti-coagulantes, etc.). Como ejemplos tenemos la «ciclosporina», molécula inmunosupresora que se aisló hace pocos años de un hongo ascomiceto que se desarrolla en los suelos: Tolypocladium inflatum. 34 También hace poco se aisló la «flutamida», de un extracto de Delitschia confertaspora, una seta tropical originaria de Namibia, que es un poderoso antiviral contra la gripe A. 383 Más recientemente se obtuvo la «aparicina», del hongo Fusarium sp., un CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 46 trastornos inflamatorios y cáncer. Los efectos anticancerígenos de los hongos medicinales y sus extractos se han asociado principalmente con la modulación del sistema inmune ejercida por los polisacáridos, glucanos, sesquiterpenos y glicoproteínas. 157, 337 Los resultados obtenidos hasta la fecha parecen indicar que la mayor parte de las propiedades terapéuticas de los hongos son debidas a la estimulación de la inmunidad innata, un efecto «de amplio espectro» que principalmente implica la estimulación del sistema inmune no específico. Es decir, los hongos ejercen su actividad antitumoral principalmente mediante la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped. 92, 219, 341 En líneas generales, los principales efectos terapéuticos atribuidos a los hongos son los siguientes: 7, 56, 139, 180, 219, 236, 249, 291, 292, 320, 353, 364, 416, 418, 429, 480, 488  Actividad estimuladora del sistema inmunitario.  Actividad reguladora del sistema inmunitario (inmunomoduladora).  Actividad bactericida, fungicida y antiviral.  Actividad antitumoral.  Actividad citotóxica.  Actividad antiaterogénica (previene la acumulación de lípidos en las paredes arteriales).  Actividad hipocolesterolemizante.  Actividad antihipertensiva.  Actividad hepatoprotectora.  Actividad nefroprotectora.  Actividad antitrombótica.  Actividad antidiabética.  Actividad adaptógena de respuesta al estrés. Introducción 47  Actividad antiinflamatoria.  Actividad antioxidante.  Actividad antialérgica.  Actividad genoprotectora.  Actividad estimuladora de la regeneración de las células nerviosas.  Actividad hematopoyética.  Actividad estimuladora de la libido.  Actividad aumentadora de la fertilidad. Estas actividades se explican gracias a los contenidos de diversas sustancias con propiedades farmacológicas (ver epígrafe 1.1.3). 105, 176, 278, 418 Dentro de estas sustancias, los β-glucanos son probablemente el metabolito más versátil de los hongos medicinales debido a su amplio espectro de actividades biológicas. 60, 278, 299, 406 Existen publicados más de 6.000 artículos que describen dichas actividades. 278 El funcionamiento del sistema inmunitario se involucra de manera crítica en la progresión tumoral, lo que hace que la inmunoterapia sea una estrategia de primer orden en el tratamiento del cáncer. 337 El efecto inmunoestimulador de los β-glucanos ha sido observado tanto en animales como en humanos. 195 De hecho, diversos estudios in vitro y con modelos animales in vivo han mostrado que los β-glucanos derivados de hongos y levaduras tienen propiedades inmunomoduladoras, siendo los efectos evaluados con mayor frecuencia aquellos ejercidos sobre las poblaciones de leucocitos. 253, 401 Los βglucanos son capaces de aumentar la actividad de macrófagos 42 y de inducir la producción de óxido nítrico (ON) en macrófagos 342 y leucocitos. 14 Promueven el aumento de la capacidad citostática frente a células tumorales en modelos animales, 348 presentan capacidad hematopoyética y estimulan la proliferación de monocitos y macrófagos. 298 La ingestión oral de los β-glucanos presentes en los hongos medicinales son capaces de activar diversos componentes del sistema inmunitario, incluyendo macrófagos, células NK, células CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 48 dendríticas (DC, del inglés dendritic cells) y linfocitos T, lo que afecta a la viabilidad tumoral. 346 Los β-glucanos estimulan también la producción de componentes proinflamatorios del complemento como la IL-1 α/β, TNF-α, IL-2, IFN-γ, IL-10, e IL-4 tanto in vitro como in vivo. 16, 106, 150,175 (revisar Novak et al., 2009 para los mecanismos de acción de los β-glucanos). 278 Su mecanismo de acción implica que se les reconozca como moléculas ajenas al organismo, por lo que el sistema inmunológico se ve estimulado ante su presencia. 299, 337 La evidencia que proporcionan los estudios en animales indica que la acción antitumoral de los polisacáridos de los hongos está mediada principalmente por la regulación inmunomoduladora de estos compuestos y, en menor medida, por una acción citotóxica directa sobre las células tumorales. 375 Por ejemplo, se ha demostrado que el polisacárido K (PSK, también llamado krestin) de Trametes versicolor (anteriormente denominado Coriolus versicolor) regula las citoquinas y activa el sistema del complemento de las células NK en pacientes con cáncer colorrectal. 286 Este aumento de la actividad de las células NK, así como de la fagocitosis, pueden conducir a una mayor destrucción del tumor. 109 Además, la presencia de múltiples tipos de moléculas podría inducir múltiples actividades terapéuticas, ya que los polímeros derivados de distintas fuentes pueden activar distintos receptores y rutas celulares específicas. 398 Se ha descrito que el incremento de células NK es dependiente de la dosis, hasta un máximo de 6 g de extracto por día, de Trametes versicolor. En el caso de las células T, la dependencia de la dosis se mantiene incluso para dosis de 9 g por día. 385 Un glucano aislado del micelio de Pleurotus ostreatus mostró capacidad antitumoral e inmunomoduladoras en modelos de ratón. 76 Un extracto acuoso de Pleurotus eryngii mostró una inhibición significativa de las células HCT116 (línea tumoral humana de cáncer de colon) y promovió la apoptosis. También tuvo un efecto negativo en la migración y la adhesión celulares de esta línea tumoral. 94 La seta en polvo de Pleurotus eryngii es capaz de reducir el número de lesiones precancerosas inducidas tanto en colon como en recto de modelos animales. 172 Extractos solubles del hongo Agaricus blazei Murrill favorecieron la proliferación de linfocitos T y aumentaron la actividad de células NK, la fagocitosis ejercida por Introducción 49 macrófagos y monocitos, así como la proliferación de citoquinas proinflamatorias IL-1b, IL-6 e IFN-γ en ratones. 217, 250 Una proteína aislada del cuerpo fructífero de Grifola frondosa mostró capacidad de activar las células NK y DC en ratones, a través de mecanismos dependientes del INF-γ y los receptores TLR4 (toll-like receptors tipo 4). 390 Los efectos inmunomoduladores de los polisacáridos de los hongos afectan a la mitogenicidad y a la activación de las células efectoras del sistema inmunitario, como son las células T, macrófagos y células NK, lo que resulta en la producción de citoquinas, incluyendo interleucinas, factor de necrosis tumoral e interferones. 25, 236 También se ejercerían estos efectos, entre otras vías, a través de la activación de las células dendríticas, la inducción de la respuesta antitumoral de las células T a través de la activación de la dectina-1, el incremento de la infiltración de las células T activadas y la disminución del número de células inmunosupresoras causadas por el tumor, como las células T reguladoras. Esta activación e inactivación celular se ha demostrado en estudios preclínicos con modelos animales. 50, 236, 241, 316 El sistema inmunológico protege al cuerpo humano contra la invasión de organismos patógenos como bacterias, virus y parásitos, pero también participa en la lucha contra células tumorales. Este sistema es el resultado de dos sistemas que interactúan mutuamente: el sistema inmunitario innato o inespecífico y el adaptativo o específico. 253, 401 La respuesta inmune innata depende en gran medida del reconocimiento de estructuras microbianas conservadas, los llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, pathogenassociated molecular patterns). Los β-glucanos de los hongos serían un ejemplo de PAMP. 253 Estas pequeñas secuencias de moléculas son reconocidas por los receptores tipo toll (TLR) y otros receptores de reconocimiento de patrón (pattern-recognition receptors, PRR) presentes en las células del sistema inmune , como por ejemplo la dectina-1. Algunos estudios sugieren que las sustancias bioactivas de los β-glucanos y proteoglicanos modulan el sistema inmunológico principalmente por medio de su interacción con los receptores TLR2 y TLR4 de los leucocitos periféricos, lo que activaría las rutas CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 50 intracelulares que darían lugar a la síntesis de las citoquinas antes mencionadas. 84, 210, 209, 216, 226, 261, 278, 284, 306, 316, 409, 449, 484 En este sentido, estudios in vitro 449 y con modelos de ratones in vivo 413 han demostrado que el polisacárido P (PSP, también llamado coriolan) de Trametes versicolor ejerce sus efectos inmunomoduladores a través de mecanismos dependientes de la ruta intracelular del TLR4, además de otras vías de señalización celular, como las MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos), las inmunoglobulinas, el NF-κB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas) 449 o las proteínas adaptadoras de transducción de la señal. 408 Este polisacaropéptido induce la producción de muchas citoquinas de efecto pleiotrópico, aunque predominan las de perfil proinflamatorio, con acciones tanto locales como sistémicas. 341 Varios estudios in vitro, usando células leucémicas HL-60 como modelo, han demostrado las propiedades antitumorales del PSP, que es capaz de reducir la proliferación celular, interrumpir el ciclo celular e inducir la apoptosis. 133, 341, 470 Estudios in vitro con macrófagos de ratón mostraron que el PSK de Trametes versicolor estimula la producción de IL-6 y TNF-α a través de la activación del receptor TLR4, 312 así como la producción de inmunoglobulina M en una línea celular de linfoma humano. 240 Como las interleucinas o los interferones, el PSK 92 y el PSP 347 son inmunoestimuladores no específicos, es decir, que aumentan la respuesta inmune natural sin dirigirla contra ningún antígeno tumoral específico. Otros hongos también parecen activar rutas intracelulares similares. Así, los extractos polisacáridos de Ganoderma lucidum incrementan la actividad fagocítica de neutrófilos humanos en cultivo a través de rutas dependientes de la proteína quinasa C (PKC) y la MAPK. 138 En resumen, una vez que los compuestos fúngicos se unen a sus receptores específicos en la membrana celular, se activan diversas vías intracelulares que eventualmente inducen la activación del NF-κB. Esto a su vez conlleva la estimulación de citocinas que provocan el fortalecimiento de las respuestas inmunes y ayudará en la batalla contra tumores y agentes patógenos. 351 Parece haber un consenso general de que los efectos moduladores inmunitarios reportados de los β-glucanos de hongos y levaduras Introducción 51 dependen de la dectina-1, aunque también otros receptores podrían jugar un papel. Los receptores alternativos involucrados pueden ser TLR2 y TLR6, el CR3, los receptores del secuestrador o la lactosilceramida. El receptor dectin-1 (en humanos también llamado receptor de β-glucano, βGR) se expresa altamente en células inmunes, tales como células dendríticas, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y algunas células T y en humanos también en células B. Además, las células intestinales pueden expresar dectina-1 en cantidades más bajas, aunque esta expresión es cuestión de debate. 50, 71, 209, 226, 253, 316, 401 En el intestino, los β-glucanos administrados por vía oral son capturados por diversas células en las placas de Peyer , el tejido linfático que recubre las mucosas y el intestino. 241 En estudios en líneas celulares se ha visto que determinados receptores de estas células del epitelio intestinal facilitan el transporte de los β-glucanos hacia el bazo, los nódulos linfáticos y la médula ósea, donde interactúan con los macrófagos para activar la función inmune. 50 En resumen, los efectos antitumorales de los β-glucanos in vivo están asociados a una inducción de la respuesta antitumoral de los linfocitos T a través de la activación de la ruta de la dectina-1, a un incremento de la infiltración de linfocitos T en el tumor, y a una disminución de la inmunosupresión causada por el tumor. 241 Se ha propuesto un mecanismo en dos etapas para explicar las propiedades anticancerígenas de los β-glucanos. Una primera etapa estaría mediada por la activación de macrófagos y células dendríticas (DC), cuando los β-glucanos se unen a los receptores TLR de estos tipos celulares. Los β-glucanos son fragmentados en los endosomas celulares, para luego ser liberados en los nódulos linfáticos, la médula espinal y el bazo. La segunda estaría mediada por granulocitos y células NK que expresan el receptor CR3 en su superficie. Los fragmentos de β-glucanos liberados por los macrófagos son reconocidos por los receptores CR3, lo que activa las rutas intracelulares que conducen a la liberación de citoquinas estimuladoras de la respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto, la actividad antitumoral de los β-glucanos estaría generada por la cooperación coordinada entre la respuesta inmune innata y la adaptativa 341, 418. En este sentido, el complejo proteico inflamasoma CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 52 es esencial en la activación de la inmunidad tanto innata como adaptativa. 82 En células THP-1 (una línea leucémica de monocitos humanos) el extracto PSK de Trametes versicolor es capaz de activar el complejo inflamasoma a través de mecanismos dependientes de la IL-1β. En ratones C57BL/6, el incremento en la IL-1β depende del receptor TLR2 y de la criopirina, uno de los componentes del complejo inflamasoma. 451 Los efectos terapéuticos de los hongos se producen también a través de su capacidad para estimular la producción de citoquinas. De hecho, se ha demostrado que diferentes especies de hongos modulan la producción de citoquinas, tanto en modelos in vitro como in vivo [consultar Guggenheim et al., 2014 para una revisión sobre los efectos moduladores sobre las citoquinas de distintas especies de hongos medicinales]. 109 Por ejemplo, extractos acuosos de Agaricus blazei Murrill indujeron la secreción de TNF-α, IL-8 y óxido nítrico (ON) en macrófagos de rata en cultivo. 366 Un extracto heteropolisacárido de Lentinula edodes estimuló la producción de ON, IL-6 y TNF-α en células RAW 264.7 (macrófagos de ratón) en cultivo. 446 Las citocinas son proteínas pequeñas y solubles que actúan como mediadores intracelulares en una respuesta inmune. 109, 253 Cada conjunto de citoquinas responde a diferentes situaciones. Las citoquinas involucradas en diferentes tipos de respuestas se definen como patrones de citoquinas. El patrón de citoquinas asociado a una estimulación de la respuesta inmune celular al cáncer tiene a IFN-γ, IL-12 y TNF-α como citoquinas dominantes. Por lo tanto, las terapias, que incluyan el uso de hongos que aumentan este patrón de citoquinas serán beneficiosas para los pacientes con cáncer. 109 Otras vías de citoquinas están asociadas con alergias y asma (que involucran a las citoquinas IL-4, IL-5, IL-13 y algunas veces IL-10) o tienen propiedades proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α). Las diferentes vías de citoquinas se modulan entre sí, con lo que las citoquinas proinflamatorias pueden contribuir a los síntomas de inflamación asociados al cáncer. Muchos síntomas relacionados con la enfermedad (malestar, ansiedad y hostilidad) son el resultado de la activación de las rutas de estas citoquinas. Por ejemplo, se ha descrito que la radioterapia aumenta la IL-1, la IL-6 y el TNF-α. 109 Introducción 53 En definitiva, la principal acción antitumoral que ejercen los polisacáridos de los hongos medicinales sería indirecta, a través de la estimulación del sistema inmune. Sin embargo, los efectos directos sobre las células tumorales no deben ser excluidos. 398 Se ha descrito que el polisacárido K (PSK) de Trametes versicolor alcanza el tejido tumoral en su forma activa y muestra efecto antitumoral en un modelo de fibrosarcoma de ratón. 132 La melanoidina aislada del PSK mostró efectos inhibidores directos del crecimiento tumoral en células HCT15, una línea de células de cáncer de colon humano. 170 La inducción de apoptosis por polisacáridos de hongos como Agaricus blazei Murrill, 434, 464 Trametes versicolor, 125, 404 Ganoderma lucidum 58 o Grifola frondosa 73 podría estar relacionada con los efectos positivos observados en pacientes con cáncer. 5, 83, 99, 184 Por ejemplo, se ha descrito que el extracto de Trametes versicolor induce la apoptosis in vitro a través de la modulación de la expresión de las proteínas p53 y Bcl-2 127 y del incremento en la producción de citoquinas activadoras de células Th1. 128 El polisacárido PSP de Trametes versicolor es capaz de inhibir la angiogénesis tumoral in vivo en un modelo de ratón mediante la inhibición de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). 129 Similares efectos se han descrito para un extracto rico en polisacáridos de bajo peso molecular de Agaricus blazei Murrill 275 y de un extracto etílico de Ganoderma lucidum. 365 En modelos murinos de cáncer inducido (ratas Walker-256), el tratamiento con extractos Agaricus blazei Murrill durante 14 días redujo significativamente el tamaño de los tumores y mejoró los síntomas de caquexia (pérdida de peso corporal, masa muscular y debilidad, que se puede presentar en los pacientes con cáncer u otras enfermedades crónicas). Estos efectos beneficiosos podrían estar relacionados, al menos en parte, con la actividad antioxidante del hongo. 168 En cultivos celulares de células HT-29, una línea tumoral humana derivada de adenocarcinoma de colon, un extracto soluble en agua y rico en glucanos del cuerpo fructífero de Pleurotus ostreatus tuvo efectos antiproliferativos y proapoptóticos. 198 Los extractos etílicos de Ganoderma lucidum y Ganoderma sinense mostraron también efectos antiproliferativos y apoptóticos sobre distintas líneas celulares cancerígenas. 223 Varios estudios han asociado el efecto CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 54 inhibidor del crecimiento de células tumorales humanas con una inhibición de la actividad de la telomerasa de estas células. Por ejemplo, el extracto de Ganoderma lucidum inhibe la actividad de la telomerasa en células MCF-7, una línea celular de cáncer de mama, 104 y en células HUC-PC, una línea premaligna de cáncer urotelial. 482 Extracto de Hericium erinaceus induce la apoptosis en células de hepatocarcinoma humano a través de mecanismos que implican la activación de la JNK y la inhibición del NF-κB. 202 Es necesario tener en cuenta que, en la actualidad, la literatura es heterogénea y aún no permite afirmar con rotundidad generalizaciones estructura-función en los efectos terapéuticos de los hongos medicinales. 320 Además de los polisacáridos, otras sustancias presentes en los hongos medicinales tienen también acciones terapéuticas. Así, los triterpenos retardan el ciclo celular e inducen la apoptosis y la autofagia mediante la inhibición de las vías de señalización de distintas proteínas quinasas: ciclina D1, quinona oxidorreductasa 1, glutatión S-transferasa P1, ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK (c-Jun N-terminal kinases), AMPK (5´ AMP-activated protein kinases), FAK (focal adhesion kinase) y AKT (serine/threonine-protein kinase), así como mediante la activación de caspasas y proteínas Bax, p53 y p21. Además, la regulación a la baja del factor de transcripción NF-κB inhibe la migración y la invasión celular y suprime la inflamación. 66, 137, 435, 450 El ácido ganodérico de Ganoderma lucidum inhibe las rutas de señalización intracelular de las células tumorales, principalmente mediante la inhibición de la proteína de traslocación nuclear NF-κB y la activación de los procesos de apoptosis, adhesión celular, proliferación y migración. 103 El extracto metílico de Trametes versicolor, rico en terpeniodes y polifenoles, tiene efectos antiproliferativos y citotóxicos in vitro en células B16 de melanoma de ratón, así como efectos antitumorales in vivo en ratones gracias a la estimulación de macrófagos. 113 En 2004, Kimura y colaboradores describieron otro principio contenido en Agaricus blazei Murrill con significativas propiedades antiangiogénicas y antimetastásicas: el piroglutamato sódico. 179 La proteína recombinante (proteína fúngica inmunomoduladora, FIP) Introducción 55 rLz-8 de Ganoderma lucidum disminuye la viabilidad de células de cáncer gástrico humano, 214 presumiblemente a través de un mecanismo dependiente de la IL-2. 19 Aunque menos investigada que las propiedades inmunomoduladoras y antitumorales, los hongos medicinales también han mostrado tener capacidades terapéuticas frente a los virus. 219 Los efectos antivirales directos de los hongos están probablemente causados por el bloqueo, por parte de pequeñas moléculas como los triterpenos, de la síntesis de ARN y ADN. 37, 219, 311 Por ejemplo, el ácido ganodérico, un triterpeno extraído de Ganoderma lucidum, es capaz de inhibir la replicación del virus de la hepatitis B 213 y del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) 85 in vitro. En un ensayo clínico aleatorizado se investigó la eficacia de tres hongos medicinales, Trametes versicolor, Ganoderma lucidum y Laetiporus sulphureus en la desaparición de varias cepas del virus del papiloma humano (VPH). Los autores describieron una reducción del virus del 88 %. 80 Una lacasa (enzima oxidasa) aislada del hongo Hericium coralloides mostró actividad significativa contra la transcriptasa inversa del virus HIV-1. 494 A pesar de estos resultados prometedores, las propiedades antivirales de los hongos, así como sus mecanismos de acción, requieren de posteriores investigaciones que mejoren el conocimiento de dichos mecanismos y propiedades. Diversos extractos de hongos medicinales han demostrado sus propiedades antiinflamatorias en modelos animales, con actividades comparables a la de los analgésicos comerciales, 219 por lo general gracias a la modulación de ciertas citoquinas e isoleucinas, entre otros factores. 164, 337 Por ejemplo, la fracción de ácidos grasos extraída del hongo Grifola frondosa, que contiene ergosterol entre otros compuestos, presenta capacidad inhibitoria de las enzimas COX-1 y COX-2 (ciclooxigenasa) así como actividad antioxidante. 478 Estas propiedades antioxidantes (incremento de la actividad y los niveles de expresión de la SOD) también se ha observado en macrófagos de ratón en cultivo tratados con el PSK de Trametes versicolor, 296 o con extractos polisacáridos de Ganoderma lucidum, 463 y en modelos murinos de cáncer in vivo. 421 El peróxido de ergosterol aislado de Grifola frondosa mostró efectos protectores frente a la toxicidad CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 62 mostrado capacidades prebióticas en ratones tratados con altas dosis de ciclofosfamida (un agente quimioterapéutico). 78 En un modelo xenográfico de cáncer colorrectal en ratones, la administración de un extracto proteico de Hericium erinaceus junto con 5-fluorouracilo (5Fu; tratamiento quimioterápico) redujo el crecimiento tumoral y la expresión de marcadores inflamatorios, tales como IFN, IL y TNFα. Además, el extracto fúngico mejoró la disbiosis inducida por el 5-Fu, inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas (Parabacteroides, Flavobacteriaceae, Christensenellaceae, Anoxybacillus, Aggregatibacter, Comamonadaceae, Planococcaceae, Desulfovibrionaceae, Sporosarcina, Staphylococcus, Aerococcaceae y Bilophila), mientras que estimuló el crecimiento de bacterias probióticas (Bifidobacterium, Gemellales, Blautia, Sutterella, Anaerostipes, Roseburia, Lachnobacterium, Lactobacillus y Desulfovibrio). 403 En este estudio, el extracto demostró, por lo tanto, un doble efecto beneficioso. Por un lado, aumentó la eficacia antitumoral del 5-Fu, mientras que, por otro, mejoró la microbiota intestinal, la respuesta inflamatoria inmune y la homeostasis. 403 De hecho, la actividad prebiótica de los hongos podría explicar la plétora de efectos beneficiosos para la salud, así como el hecho de que en la MTC hayan sido utilizados para una amplia variedad de enfermedades. 466 En definitiva, existen grandes ventajas en incorporar los hongos y sus extractos a la dieta normal, ya que además de las propiedades inmunomoduladoras y antitumorales de los polisacáridos fúngicos, tenemos que añadir su papel beneficioso como prebióticos. Se trata, por lo tanto, de una estrategia emergente de gestión dietética con extractos fúngicos de los enfermos oncológicos, con el fin de manipular la microbiota intestinal y así mejorar los resultados terapéuticos de los tratamientos anticancerígenos o, al menos, aumentar la calidad de vida del paciente durante dichos tratamientos. No obstante, los datos son todavía escasos y es necesario realizar investigaciones más exhaustivas para caracterizar el papel prebiótico de los hongos y las setas. Se requieren ensayos clínicos bien diseñados, aleatorizados, en doble ciego y controlados mediante placebo en el uso de prebióticos (y probióticos) para dilucidar por Introducción 63 completo las interacciones de la flora intestinal con factores genéticos, epigenéticos, inmunológicos, dietéticos, etc. 350 La empresa Hifas da Terra identificó estas necesidades y en 2015 activó una estrategia de investigación y desarrollo (I+D) orientada a la realización de ensayos clínicos en pacientes con cáncer tratados, como coadyuvante, con una nueva formulación específica basada en extractos de hongos medicinales: Mico-Digest®. Nacieron así los proyectos MicroMarker y CRC-Folfox, en los que se evaluará la relación existente entre la progresión del cáncer colorrectal, la modulación de la microbiota intestinal y el desarrollo de neuropatías periféricas. 1.2 LOS HONGOS EN ONCOLOGÍA INTEGRATIVA El cáncer es la enfermedad mortal número uno en el mundo actual. Según la OMS, el cáncer es ya la segunda causa de muerte a nivel global, y se estima que fue responsable de la muerte de 9,6 millones en 2018, lo que supone que 1 de cada 6 muertes en el mundo es causada por algún tipo de cáncer. 38, 325, 351, 425, 427 En el año 2018 (últimos datos disponibles) se diagnosticaron 18,1 millones de nuevos casos de cáncer, y las estimaciones indican que el número aumentará hasta los casi 30 millones en 2040. 38, 351, 361, 427 En España, la predicción para 2020 estimó la incidencia en más de 277.000 casos anuales. 349 Las principales modalidades de tratamiento del cáncer hasta la fecha son la cirugía, la radioterapia, la quimioterapia y la inmunoterapia. 62, 91, 102 Sin embargo, muchos son los efectos secundarios que surgen de la quimioterapia o la radioterapia. Estos efectos secundarios pueden ser subjetivos, lo que incluye náusea, vómitos, llagas en la boca, diarrea, pérdida del apetito, pérdida de peso, del cabello, malestar, fatiga; o pueden ser efectos secundarios objetivos (medibles mediante pruebas de laboratorio), como anemia, trombocitopenia, leucopenia, hepatotoxicidad, supresión de la médula ósea e inmunodepresión en general. 83, 243 Además, estas terapias sólo tienen éxito cuando el cáncer se detecta en una etapa temprana o bien CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 64 se limita a ciertos tipos de cáncer, como la leucemia. Debido a los medios de diagnóstico limitados para detectar estas etapas tempranas del cáncer, o incluso estados precarcinoma, la mayoría de los pacientes son diagnosticados cuando ya el cáncer está en una etapa avanzada o con una extensa infiltración local. Para los tumores avanzados, en particular aquellos desarrollados a partir de tejidos epiteliales como el pulmón, el colon, la mama, la próstata o el páncreas, las terapias convencionales tienen un éxito relativo. La quimioterapia puede fallar también debido a resistencia a los fármacos antitumorales o a la toxicidad de los mismo, lo que limita la dosis utilizada. 62, 400 Estos hechos revelan la urgente necesidad de encontrar nuevos enfoques terapéuticos más eficaces y menos tóxicos. 299, 325 La búsqueda exhaustiva de nuevas formas de tratar y prevenir el cáncer ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos basados en productos naturales o análogos inspirados en ellos. Así, se han investigado algunas matrices naturales como fuentes de agentes contra el cáncer, con resultados alentadores. Los hongos son ejemplos de estas matrices naturales que parecen tener una amplia gama de beneficios potenciales para la salud, tanto como alimentos funcionales, como nutracéuticos, y como fuente de compuestos para el desarrollo de nuevos medicamentos. 176, 269, 289, 400 Además de moléculas de bajo peso molecular, diversas macromoléculas derivadas de hongos han demostrado su potencial como anticancerígenos, incluyendo polisacáridos, polisacáridos unidos a proteínas y ácidos grasos. 325 Aunque los hongos y sus extractos han mostrado tener una fuerte actividad citotóxica directa contra las células tumorales, 331, 325 su mayor efecto parece ser debido a sus propiedades inmunomoduladoras. 109, 236, 367 A la unión del tratamiento convencional con naturopatía en pacientes oncológicos se le denomina oncología integrativa. 368 Muchos estudios han demostrado que los polisacáridos de hongos basidiomicetos (filo más evolucionado y conocido del reino Fungi, que incluye a los hongos productores de las clásicas setas) tienen efectos terapéuticos altamente beneficiosos que incluyen: 1) prevenir la oncogénesis, 2) actividad antitumoral directa en diversos Introducción 65 tipos de tumores, 3) actividad inmunosinérgica en combinación con quimioterapia, y 4) efectos preventivos frente a la metástasis tumoral. 57, 109, 183, 200, 268, 270, 293 Sin embargo, todavía no se entiende por completo si sus amplios efectos bioactivos son causados por un solo componente o si son el resultado de una acción aditiva o sinérgica de varios compuestos fúngicos. 47, 48, 62, 289, 473 De hecho, el uso de productos botánicos en oncología se basa en la hipótesis sinérgica: la combinación de diferentes compuestos activos bien seleccionados de una o más especies botánicas tendrá un efecto antineoplásico más acusado. 367 En este sentido, se ha reportado que la ingesta de cuatro o más agentes CAM, incluido Ophiocordyceps sinensis, prolonga la supervivencia de pacientes con carcinoma hepático. 276 Diversas especies de hongos han mostrado tener actividades anticancerígenas. 269 Por ejemplo, pacientes con cáncer esofágico, gástrico y pulmonar que han sufrido radio o quimioterapia presentan una mejora de los síntomas y una mejor capacidad inmune tras la administración del PSP aislado de Trametes versicolor (Coriolus versicolor). 270 Diversos ensayos clínicos en Fase I, II y III han estudiado los compuestos bioactivos aislados a partir de hongos medicinales en el tratamiento de enfermos oncológicos. 353 Compuestos presentes en Grifola frondosa inhiben el crecimiento en múltiples líneas celulares de cáncer gástrico promoviendo la apoptosis 360 y además son capaces de reducir el número de nódulos metastásicos en pulmón de modelos animales. 243 Extractos de Cordyceps sp., Ganoderma sp. y Trametes versicolor, además de otros hongos y plantas medicinales, han demostrado tener propiedades apoptóticas y anticancerígenas mediadas por mecanismos mitocondriales. 430 Igualmente, compuestos de Ganoderma lucidum inhiben el crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico 289 y cáncer de colon, 149 e incluso inducen mejoras en el sistema inmune de pacientes de cáncer colorrectal, particularmente en los niveles de linfocitos CD3, CD4, CD8, CD56, actividad de células NK y concentraciones plasmáticas de IL-2, IL-6 e INF-γ. 62 El extracto hidroalcohólico de Ganoderma lucidum es capaz de inducir aumentos significativos en la actividad de las células NK, así como en las concentraciones plasmáticas de las citoquinas IL-2, IL-6 e IFN-γ en CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 66 pacientes de cáncer. 100 Extractos de este hongo inhiben el crecimiento de líneas celulares tumorales de leucemia, linfoma y mieloma múltiple, 227, 260 y además antagoniza los efectos negativos producidos sobre linfocitos en contacto con líneas celulares de melanoma. 372 Un extracto hídrico rico en polisacáridos de Pleurotus ostreatus presentó actividad citotóxica dependiente de la dosis en células HeLa in vitro. 384 En un ensayo clínico en fase II, la ingesta de 3 mg/kg dos veces al día durante 12 semanas de extracto de maitake (Grifola frondosa) provocó un incremento de la función de neutrófilos y monocitos en pacientes con síndrome mielodisplásico. 424 Las células tumorales producen factores como la IL-10, el TGF-β1 y el VEGF que suprimen la función de las células inmunitarias o inducen la apoptosis de las mismas. 370 Uno de los objetivos más importantes de la inmunoterapia de tumores es antagonizar esta supresión en las células inmunitarias. El polisacárido P (PSP) aislado de Trametes versicolor aumenta la expresión de citoquinas y quimioquinas como el TNF-α, la IL-1β, la IL-6, histamina y prostaglandina E, además de incrementar la infiltración de células T en los tumores y mejorar los efectos secundarios de la quimioterapia. 57, 71, 307, 314 Los polisacáridos de Ganoderma lucidum han mostrado esta capacidad supresora in vitro. 370 Los efectos terapéuticos de Ganoderma lucidum en el tratamiento de pacientes oncológicos y sus propiedades antiinflamatorias se han asociado con sus efectos inmunomoduladores y coadyuvantes. 54, 99, 100 Se ha descrito que el tratamiento de pacientes de cáncer colorrectal en estadio III con PSK como tratamiento coadyuvante a la quimioterapia con tegafur/uracilo incrementa la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad en los pacientes. 286 El mismo polisacárido también incrementó la supervivencia en pacientes con cáncer de estómago tratados con quimioterapia. 176 Los resultados hasta la fecha señalan los beneficios de los hongos medicinales debidos principalmente a su riqueza en polisacáridos (como los β-glucanos), que son los principales principios activos de las propiedades inmunoestimuladoras y antitumorales de los hongos. 47, 48, 62, 289, 299, 473 Por lo tanto, los hongos medicinales surgen como una terapia novedosa que puede mejorar el tratamiento del cáncer y la supervivencia de los pacientes oncológicos. Los oncólogos y Introducción 67 farmacólogos se han dado cuenta de que las propiedades antitumorales, citotóxicas e inmunomoduladoras de los hongos y sus principios activos, junto con su baja toxicidad, los convierten en unos excelentes candidatos para paliar los severos efectos adversos de la quimioterapia y la radioterapia convencionales. 218, 475 El alivio de los efectos secundarios como la leucopenia, trombocitopenia, vómito, etc., causados por la quimioterapia es probablemente uno de los mayores papeles que pueden jugar los hongos medicinales en su papel de coadyuvantes en los tratamientos oncológicos. Aunque algunos extractos de hongos muestran efectos citotóxicos sobre células tumorales in vitro, su principal función es como MRB (modificador de la respuesta biológica), principalmente a través de sus propiedades inmunoreguladoras. Por ejemplo, la desregulación de los linfocitos Th1 y Th2 se ha descrito como una de las causas importantes en el fracaso de la quimioterapia. Los proteoglicanos de los hongos, como el lentinano de Lentinula edodes, presentan un gran potencial para paliar este fracaso, gracias a sus propiedades inmunopotenciadoras, su baja toxicidad y su bajo coste. 475 De hecho, ya existe un considerable número de estudios que avalan el uso de los hongos medicinales como suplemento para contrarrestar los efectos secundarios de los tratamientos oncológicos, 299 e incluso para incrementar la eficacia de estos. 109 Por ejemplo, en células de hepatocarcinoma humano en cultivo, la adición de un extracto de Agaricus blazei Murrill rico en β-glucanos incrementa la apoptosis inducida por doxorrubicina, 201 y la adición de ácido ganodérico extraído de Ganoderma lucidum incrementa la quimiosensibilidad de las células al cisplatino. 453 Muchos polisacáridos de hongos, como el lentinano, el esquizofilán, el PSK (krestin) o el PSP (coriolan), la lectina o el ácido ganodérico inhiben eficazmente el crecimiento de tumores trasplantados en modelos murinos y aumentar la tasa de supervivencia. 70, 162, 207, 211, 299, 475 La ingesta de 10 mg/kg al día de PSP retrasa la progresión de la metástasis en perros con hemangiosarcoma. 40 El PSP de Trametes versicolor incrementa la capacidad apoptótica y citotóxica de ciertas drogas antileucémicas en células HL-60 en cultivo. 142 Polisacáridos y proteoglicanos aislados de Agaricus blazei Murrill han demostrado en CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 68 diversos estudios ser principios activos muy útiles en el tratamiento y la prevención del cáncer. 434 Los hongos afectan a las células madre hematopoyéticas, a los linfocitos, los macrófagos, las células T, las células dendríticas y las células NK. 109, 253 El PSK de Trametes versicolor ejerce sus efectos tumorales in vivo e in vitro a través de diversos mecanismos, incluyendo la activación de las células NK y células T. 422 GLIS, un proteoglicano aislado del cuerpo fructífero de Ganoderma lucidum ha demostrado tener efectos antitumorales en ratones gracias a la estimulación de la respuesta inmune tanto humoral como celular. 472 Estos efectos inmunoestimuladores sobre distintos tipos celulares del sistema inmune proporcionan efecto protector frente a la mielosupresión quimioterapéutica, uno de los efectos más graves de la quimioterapia. 109 Este efecto protector ha sido ya descrito en modelos murinos, en concreto a través de la acción ejercida por los β-glucanos del hongo maitake en ratones tratados con cisplatino, un agente quimioterapéutico. 242 El β-glucano aislado de Ganoderma lucidum tuvo un efecto protector, aumentando la supervivencia (hasta un 66 %) de ratones sometidos a radioterapia. 305 En definitiva, los datos preclínicos y clínicos de las últimas dos décadas muestran un sólido efecto de los hongos medicinales y sus extractos en la mejora de la calidad de vida y de la eficacia de la quimio y radioterapia durante los tratamientos oncológicos. Los hongos y sus extractos pueden utilizarse en oncología integrativa de varias maneras: 367  Para prevenir el cáncer y la metástasis en pacientes de alto riesgo.  Para controlar los efectos secundarios de la terapia convencional contra el cáncer.  Para mejorar la eficacia y seguridad de los agentes quimioterapéuticos.  Para contrarrestar el efecto inmunodepresor y prevenir la recaída tras el tratamiento oncológico convencional. Introducción 69 La medicina basada en hechos o medicina basada en pruebas (EBM, del inglés evidence-based medicine) que avala la utilización de los hongos en oncología ha aumentado considerablemente en la última década. Muchos investigadores están trabajando para purificar y estudiar los componentes individuales de los hongos y comprender sus efectos sobre la apoptosis, la parada del ciclo celular y la modulación inmunológica. 109, 299 Todas estas investigaciones han permitido pasar de la poyata del laboratorio a la cama del hospital, y nos han ofrecido una visión de los hongos como coadyuvantes muy versátiles en oncología integrativa. Los ensayos clínicos con hongos medicinales como coadyuvantes están todavía en sus primeros pasos, pero los resultados implican posibilidades muy prometedoras. Sin embargo, si bien los hallazgos inmunológicos son prometedores, en última instancia estos descubrimientos deben aplicarse a los pacientes y a los resultados clínicos, ya que el objetivo final al tratar cualquier paciente oncológico es mejorar su calidad de vida y su supervivencia. 109 Hasta la fecha se han realizado pocos estudios que examinen los resultados inmunológicos de la micoterapia dentro del marco del ensayo clínico, a lo que se añade la dificultad de comparar resultados con métodos de administración muy distintos (oral, inyección) y la gran variedad de extractos y especies de hongos utilizados. 109 Pero este marco es la clave para trasladar de forma efectiva el conocimiento sobre los efectos terapéuticos de los hongos fuera del laboratorio y de los modelos animales hasta las poblaciones humanas, tanto sanas como enfermas. 109 Es evidente, por lo tanto, la necesidad de nuevos enfoques terapéuticos integrativos para el tratamiento de pacientes con cáncer. La presente tesis doctoral se centra en determinar y confirmar los efectos antitumorales de los hongos medicinales y sus extractos en el cáncer colorrectal (CCR). Para ello se ensayará in vitro la fórmula Mico-Digest 2.0®, desarrollada por Hifas da Terra, tanto en líneas celulares de CCR como en un modelo murino de este tipo de cáncer. Además, se planteará un protocolo para el ensayo como coadyuvante de esta fórmula en el tratamiento oncológico integrativo de pacientes con CCR. Mico-Digest 2.0® es un complemento alimenticio que contiene la más alta concentración de sustancias bioactivas CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 70 procedentes de los hongos medicinales ecológicos; Hericium erinaceus, Lentinula edodes, Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, Polyporus umbellatus, Ophiocordyceps sinensis, Inonotus obliquus y Agaricus blazei Murrill. Aunque ya se ha mencionado en cierta medida en las secciones anteriores de este trabajo, en los subepígrafes siguientes se realiza un resumen de los hallazgos hasta la fecha en relación con el uso de la micoterapia en los principales tipos de cáncer, conocidos como «Big Killers». 1.2.1 Cáncer de mama A nivel global, el cáncer de mama fue el tumor diagnosticado con mayor frecuencia en mujeres en el año 2018 (2,1 millones, el 11,6 % del total de diagnósticos de cáncer), y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres (627.000 muertes, el 11,6 % de todos los fallecimientos por cáncer). 38, 332, 427 Se calcula que una de cada 8 mujeres desarrollará cáncer de mama en algún momento de su vida. 337 En España, se diagnosticaron 32.953 pacientes con cáncer de mama en 2019 (un 16,8% del total de cánceres diagnosticados) con una mortalidad de 6.621 pacientes. 349 Los tratamientos convencionales del cáncer de mama incluyen quimioterapia, radioterapia, terapias hormonales o inmunoterapia. Estos tratamientos están asociados a una amplia variedad de EA asociados, como son mielosupresión, problemas gastrointestinales, alopecia, fatiga, infecciones, toxicidad respiratoria, náusea, insomnio, etc. Todos estos efectos secundarios disminuyen la calidad de vida del paciente. 337 Una de las estrategias que posee la medicina integrativa para paliar estos efectos es la micoterapia. De hecho, diversos estudios apoyan el concepto de que una dieta rica en hongos ayuda a prevenir el cáncer de mama. 429 Mediante la micoterapia, la manera de afrontar un carcinoma mamario reside, por un lado, en la inmunoterapia, es decir, la capacidad de los extractos de hongos para estimular diferentes tipos celulares del sistema inmune del propio organismo con el fin de dirigir Introducción 71 o restaurar las defensas naturales del cuerpo contra el cáncer. Además, de manera indirecta diversos extractos de hongos pueden inhibir la angiogénesis o formación de vasos sanguíneos, lo que puede contribuir a comprometer el crecimiento de tumores, así como intervenir a nivel de receptores hormonales presentes en determinados tipos de tumores dificultando o bloqueando estas vías de señalización. Por otro lado, el interés de la micoterapia se extiende también a la actividad citotóxica directa que presentan algunos extractos de hongos sobre diferentes tipos de células tumorales. Muchos extractos fúngicos han demostrado su capacidad inhibitoria sobre el cáncer de mama, tanto en cultivos celulares como en estudios animales y ensayos clínicos. 429 Ganoderma lucidum y Grifola frondosa son dos de los hongos medicinales, procedentes de la MTC, que más se han estudiado como producto CAM (medicina complementaria y alternativa) en las pacientes con cáncer de mama. 337 Diversos estudios celulares muestran la capacidad del extracto de Ganoderma lucidum de inhibir la expresión del receptor de estrógenos alfa (ERα), así como la activación del mismo por estrógenos en líneas células de cáncer de mama hormono-dependientes y hormonoindependientes. 158 Esto es interesante ya que muchos cánceres de mama parecen progresar desde una fase inicial estrógeno-dependiente a otra fase más maligna estrógeno-independiente con potencial metastásico. 339 Ganoderma lucidum también inhibe la activación del receptor de estrógeno alfa (ERα) inducida por 17β-estradiol, inhibe la activación de NF-κB inducida por TNF-α, e inhibe la posible interacción entre NF-κB y ERα, resultando en una regulación a la baja de la expresión de c-myc y en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de mama humanas. Estos datos demuestran que Ganoderma lucidum contiene compuestos biológicamente activos contra el sistema de señalización mediado por estrógenos en células tumorales. 159 A nivel inmunoterapéutico es útil el extracto de Trametes versicolor en los casos en los que las células tumorales son hormono-dependientes, ya que existen estudios que indican que este extracto posee actividad citostática sobre células ER(+). 13 En ratones inoculados con células humanas de cáncer de mama, el tratamiento con extracto acuoso de Trametes versicolor como coadyuvante disminuye el crecimiento CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 78 colonizado en los casos de metástasis de cáncer de próstata. 165 Compuestos excretados por Agaricus brasiliensis inhiben la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata dependientes e independientes de andrógenos. Los mecanismos por los que el hongo induce estos efectos parecen implicar a la ruta apoptótica de la caspasa 3. 464 Extractos 313 y polisacáridos 98 de Grifola frondosa son capaces de inhibir el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata. Además, si se combina el β-glucano con vitamina C, se obtiene el mismo efecto sobre las células de cáncer de próstata en cultivo que con cantidades de polisacáridos 10 veces menores. Los autores sugieren que este efecto potenciador puede tener implicaciones clínicas, lo que ello refuerza el interés de combinar vitamina C y extracto polisacarídico de Grifola frondosa en el tratamiento del cáncer de próstata. Además, los polisacáridos de este hongo son capaces de inducir mortalidad celular elevada (>95 %) en cáncer de próstata independiente de andrógenos. 98 El PSP extraído del hongo Trametes versicolor es capaz de inhibir la capacidad tumoral de células de cáncer de próstata in vitro, así como en modelos en ratones de este tipo de cáncer. 229 Extractos etílicos de Trametes versicolor redujeron el crecimiento celular in vitro de cáncer de próstata dependiente de andrógenos. 134 Ophiocordyceps sinensis es capaz de estimular la producción de testosterona en células Leydig de ratón, tanto células normales como tumorales. 140 No se han encontrado trabajos sobre ensayos clínicos en pacientes con cáncer de próstata sometidos a algún tipo de micoterapia coadyuvante. Sin embargo, un estudio de seguimiento en hombres mayores de 40 años en Japón estableció una relación inversa entre el consumo de hongos y la incidencia de cáncer de próstata. 477 1.2.4 Cáncer gástrico A nivel global, el cáncer de estómago sigue siendo uno de los más frecuentes, con más de un millón de casos diagnosticados en 2018 (5,7 % del total de cánceres), si bien en los países occidentales se ha registrado una tendencia al descenso en la incidencia de este tipo de cáncer. Aun así, este tipo de cáncer causó 783.000 muertes en 2018. 38, Introducción 79 427 Este descenso está relacionado con la reducción de las infecciones por Helicobacter pylori, con las modificaciones dietéticas, una mejor preservación de los alimentos, y un descenso del consumo de tabaco y alcohol. No obstante, el número de nuevos casos de cáncer gástrico en España para el año 2020 se estimaban en 7.577, con una incidencia superior en varones. 349 Los cánceres gastrointestinales representan en la actualidad un problema de salud de gran importancia en lo relativo al número de nuevos casos anuales y al número de muertes anuales debido a la pobre supervivencia de estos pacientes. 427 Concretamente, los cánceres colorrectal y gástrico ocupan el tercer y cuarto lugar entre los cánceres más frecuentes. Además, cuatro de los seis tipos de cáncer que más muertes causan anualmente afectan al aparato digestivo, siendo estos el gástrico, de hígado, colorrectal, y de esófago. 38, 48349, 350, 358, 427 A nivel preclínico, extractos acuosos de Hericium erinaceus protegen el estómago de ratas ante la ulceración inducida por etanol. 1, 431 Estos efectos parecen estar ejercidos, al menos en parte, a través del incremento de la proteína Hsp70 (una proteína de shock térmico con importantes funciones citoprotectoras) y la inhibición de la proteína Bax (implicada en rutas proapoptóticas). 431 Los extractos podrían además ser beneficiosos en cuanto a la reducción de efectos secundarios en pacientes con cáncer gástrico, actuando como regenerador del epitelio gastrointestinal. 431 Las especies de hongos Ganoderma lucidum y Hericium erinaceus son igualmente capaces de inhibir el crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico, 204, 289 y por este motivo presentan interés en el tratamiento, especialmente Hericium erinaceus, cuyos beneficios a nivel gástrico se extienden a otras patologías. Ciertos estudios muestran que el extracto acuoso de Agaricus blazei Murrill es capaz de ejercer un efecto antiproliferativo sobre líneas celulares de cáncer gástrico, 145, 163 o sobre células de cáncer de próstata, 464 mediante apoptosis inducida a través de la caspasa 3. Grifola frondosa es igualmente un hongo de gran interés para el tratamiento del cáncer de estómago, ya que se ha demostrado que los extractos acuosos de esta especie son capaces de inhibir el crecimiento en múltiples líneas celulares de cáncer gástrico al promover la apoptosis por vías dependientes e independientes de la CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 80 caspasa 3. 360 Diversas mejoras, aunque en algunos casos no estadísticamente significativas, se han observado igualmente a nivel clínico en pacientes que presentaban cáncer gástrico. 184 El PSP de Trametes versicolor induce apoptosis en células leucémicas HL-60 en cultivo a través de la activación de las caspasas 3, 8 y 9. 450 La administración en la dieta de extracto de Trametes versicolor en ratones redujo la incidencia de tumores intestinales inducidos por la inyección subcutánea de dimetilhidrazina (DMH), aunque las diferencias no llegaron a ser estadísticamente significativas. 69 Ratas con tumores en el tracto digestivo, así como pacientes con cáncer gastrointestinal, que sufrían de estrés oxidativo presentaron alivio sintomático con una única inyección intraperitoneal (en ratas) o una única administración oral (en pacientes) del PSK aislado de Trametes versicolor. 173 En cuanto a estudios a nivel clínico en relación con el uso de hongos medicinales en pacientes con cáncer gástrico, múltiples trabajos muestran el interés de los extractos del hongo Lentinula edodes en el tratamiento de estos pacientes. Ya en el año 1969, la prestigiosa revista Nature publicó un estudio donde se mostraba la actividad antitumoral en modelos animales de los polisacáridos de Lentinula edodes. 64 Desde entonces numerosos estudios han sido realizados incluyendo algunos ensayos clínicos. Así, el lentinano, un 1,3 β-glucano aislado de Lentinula edodes, aumenta la supervivencia en pacientes de cáncer gástrico tratados con quimioterapia. 143, 280 Un estudio retrospectivo en 963 pacientes japoneses que sufrieron resección por cáncer gástrico, la supervivencia tras la cirugía fue mayor en aquellos pacientes que recibieron tratamiento coadyuvante con PSK junto con quimioterapia. 232 Un metaanálisis incluyó a 8009 pacientes de cáncer gástrico sometidos a resección curativa, procedentes de ocho ensayos clínicos aleatorizados y controlados. Los resultados del análisis concluyeron que el uso de PSK como inmunoterapia coadyuvante aumentó la supervivencia de los pacientes. 281 Una reciente revisión de 135 estudios independientes realizados en China con el lentinano durante los 12 últimos años, lo que incluye más de 9000 pacientes, recapituló una mejor respuesta a la quimioterapia en los pacientes que utilizaron este polisacárido como Introducción 81 coadyuvante. Por ejemplo, la respuesta total a la quimioterapia más lentinano para pacientes con cáncer de pulmón, cáncer gástrico y cáncer hepático fue del 29-87 %, 11-88 % y 51-76 %, respectivamente, comparados con un 15-83 %, 61-71 % y 32-52% en los grupos con únicamente quimioterapia. Similares resultados fueron recopilados para pacientes con cáncer colorrectal. 475 En un estudio en Japón, 262 pacientes de cáncer de estómago fueron sometidos de forma aleatoria a tratamiento de quimioterapia (mitomicina + fluorouracilo) con o sin el PSK de Trametes versicolor como coadyuvante. La administración del PSK mejoró de forma estadísticamente significativa el porcentaje de ausencia de enfermedad a los 5 años (70,7 % en el grupo tratado con el hongo, frente a un 59,4 % en el grupo con sólo quimioterapia). 262 En un metaanálisis se evaluaron 13 ensayos clínicos aleatorizados sobre el tratamiento coadyuvante del hongo Trametes versicolor en pacientes de distintos tipos de cáncer. Los resultados mostraron que la adición del hongo al tratamiento oncológico convencional (radioterapia o quimioterapia) incrementaba en un 9 % la supervivencia a 5 años de los pacientes de cáncer de mama, colorrectal y cáncer gástrico. 83 Los efectos secundarios de la quimioterapia se redujeron en pacientes con cáncer gastrointestinal avanzado que tomaron extractos de Lentinula edodes vía oral. 288 Un estudio en doble ciego con pacientes afectados por la gastritis atrófica crónica mostró que Hericium erinaceus indujo alivio del dolor abdominal superior y displasia además de la reducción de la infiltración inflamatoria. 445 Un estudio con 349 pacientes con cáncer gástrico en estadio II/III recibieron tras la resección curativa quimioterapia oral con o sin PSK de Trametes versicolor como coadyuvante. El grupo que recibió el PSK mostró un porcentaje de supervivencia sin recidiva superior al grupo con sólo quimioterapia. 144 Otra manera en que los hongos medicinales pueden ayudar al tratamiento de cáncer gástrico es mediante la erradicación de Helicobacter pylori. Esta bacteria es uno de los patógenos humanos más prevalentes, infecta al 50 % de la población global y está relacionada con el desarrollo de enfermedades gástricas, incluido el cáncer de estómago. 17, 174, 203 Los hongos son una fuente de CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 82 compuestos anti-Helicobacter pylori. 114 Algunos basidiomicetos utilizados en la MTC presentan actividad inhibidora contra esta bacteria, sobre todo Hericium erinaceus. 352 Lentinula edodes posee actividad antibacteriana in vitro contra diferentes microorganismos potencialmente patógenos. 119, 192, 294, 399 Estos efectos podrían estar relacionados con la capacidad prebiótica descrita para este hongo. 63, 65 Ganoderma lucidum también posee actividad inhibidora del crecimiento de Helicobacter pylori. 8, 25, 177, 441 Los efectos positivos de Ganoderma lucidum sobre pacientes con infección bacteriana podrían estar mediados a través de las capacidades inmunoreguladoras y antiinflamatorias del hongo. 54 Proyecciones iniciales, realizadas por Hifas da Terra mediante la prueba de difusión en agar en laboratorio, revelaron actividad antibacteriana para tres de los extractos comercializados: Mico-Leo® (Hericium erinaceus), Mico-Shii® (Lentinula edodes) y Mico-Rei® (Ganoderma lucidum) (datos no publicados, para más información consultar en: https://hifasdaterra.com/blog/patologias/gastritis/). De acuerdo con publicaciones de otros grupos de investigación, estos resultados refuerzan el interés de la combinación de extractos de estas tres especies de hongos para el tratamiento de Helicobacter pylori en individuos infectados. 1.2.5 Cáncer colorrectal En el año 2018, el cáncer colorrectal (CCR) fue el tercer tipo de cáncer más diagnosticado (10.2 % del total), lo que supuso 1,8 millones de personas en todo el mundo. Se registraron 880.792 fallecimientos debidos a tumores colorrectales, es decir, un 9,2 % del total de muertes por cáncer. 38, 427 En ese mismo año, se diagnosticaron en Europa casi medio millón de casos de CCR, con 250.000 fallecimientos. 432 En España, este tipo de carcinoma es también uno de los más frecuentes, con una estimación del número de casos para el año 2020 de 44.231. La prevalencia en nuestro país en el año 2018 fue del 15,3 %, algo más de 65.000 casos para varones, mientras que se diagnosticaron 42.000 casos en mujeres (11,8 %). 349 El cáncer colorrectal es una de las enfermedades más comunes en los Introducción 83 países desarrollados. 153, 361 Aunque el 70 % de los pacientes diagnosticados son tratables con cirugía, aproximadamente el 50 % desarrollan recurrencia, que es casi siempre incurable. 286 Por otra parte, alrededor del 90 % de las muertes relacionadas con cáncer colorrectal son debidas a metástasis. 483 Además de sus elevadas prevalencia, incidencia y recurrencia, el cáncer colorrectal hace que las personas que lo sufren tengan a menudo una cualidad de vida y un índice de supervivencia limitados. 153, 361 En este sentido, el estilo de vida y la nutrición son factores que pueden jugar un papel esencial en la gestión de esta enfermedad. Como nutracéuticos, los hongos medicinales pueden jugar este papel. A nivel preclínico, el extracto de Agaricus blazei Murrill retrasa el crecimiento tumoral de células de cáncer de colon humano (células HT-29) implantadas en ratones. 439 En ratas, el extracto hidrosoluble de Ganoderma lucidum es capaz de prevenir las lesiones en el intestino delgado causadas por quimioterápicos como el 5fluorouracilo (5-FU) [419]. El ganodermanontriol, un triterpeno aislado de Ganoderma lucidum, inhibe la proliferación de células tumorales de colon in vitro, y en un modelo de ratones in vivo. 149 El extracto de Lentinula edodes es capaz de inhibir el crecimiento de tumores en ratones injertados con células de carcinoma de colon humano. 268 El PSK reduce la capacidad invasiva de varias líneas de células tumorales de colon, mediante la reducción de los niveles de ARNm de las metaloproteinasas de matriz extracelular MMP2 y MMP9. 395 Con efectos dependientes del tiempo de incubación y de la dosis utilizada, se ha descrito que un extracto rico en polisacáridos de Ganoderma lucidum inhibe la proliferación de células de cáncer de colon humano (LoVo), 215 y un extracto del hongo rico en triterpenoides inhibe la proliferación de células de cáncer colorrectal (células SW 480). 444 La administración oral de YM-2A, un α-glucano aislado de Grifola frondosa, inhibe el crecimiento tumoral y mejora la supervivencia en un modelo murino de cáncer colorrectal. Según los autores, la capacidad anticancerígena es debida a la mejora de la respuesta inmune mediante el incremento de los niveles de IFN-γ en células CD4+ y CD8+ del bazo y de los nódulos linfáticos. 244 CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 84 A nivel de ensayos clínicos, los resultados de un metaanálisis (1.094 pacientes de 3 ensayos clínicos) sugieren que la inmunoquimioterapia adyuvante con el PSK obtenido de Trametes versicolor puede mejorar tanto la supervivencia como la supervivencia sin enfermedad de los pacientes con cáncer colorrectal con resección curativa. Esta mejora puede ser no solo estadísticamente sino también clínicamente significativa. Los autores postulan que la acción del PSK puede ser debida a su efecto inmunopotenciador no específico (producción de interleucinas e interferón) que estimularía a las células NK y las células LAK. 340 En otro estudio con pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en estadios II y III, la ingesta del PSK como coadyuvante a la quimioterapia con tegafur/uracilo produjo una reducción de la recurrencia (43,6 %) y de la mortalidad (40,2 %), mientras que incrementaba la supervivencia a 5 años de un 72,1 % a un 81,8 %. En los pacientes tratados con PSK se observó además un aumento porcentual de las células NK. 286 El PSK fue ensayado de manera combinada con quimioterapia (5-fluorouracilo) en pacientes de cáncer colorrectal en estadios II y III, observándose un aumento en la supervivencia de estos a 5 años. 83, 286 En un estudio con 7 pacientes de cáncer colorrectal (más 1 pacientes con cáncer gástrico) en estadio avanzado, la ingesta de extractos de micelio de Lentinula edodes administrados oralmente disminuyó la incidencia de efectos adversos provocados por la quimioterapia. Además, la producción de IFN-γ por células CD4+, CD8+ y CD56+ presentó una tendencia al aumento en los pacientes tratados con el extracto. 288 En 47 pacientes con cáncer colorrectal avanzado, el tratamiento con extracto rico en polisacáridos de Ganoderma lucidum vía oral durante 12 semanas dio lugar a una disminución de los niveles de TNF-α e IL-1 en el 73,2 % de los pacientes del estudio, mientras que se elevaron los niveles de IL-2, IL-6 e IFN-γ. También si midieron diferencias en los recuentos celulares de diversas células del sistema inmunitario (CD3, CD4, CD8, CD56 y NK). Aunque los cambios entre pacientes tratados y no tratados con el hongo no fueron estadísticamente significativos, los resultados apuntan a la capacidad inmunomoduladora de Ganoderma lucidum en pacientes con cáncer Introducción 85 colorrectal avanzado. 62. En este sentido, se ha descrito que el aumento de ciertas citoquinas durante el proceso cancerígeno (TNF-α, IL-1, entre otras), contribuye a la caquexia que se manifiesta en como pérdida de peso, náuseas crónicas, fatiga, insomnio y sudoración profusa en estos pacientes. La disminución de esta citoquina podría mejorar los síntomas de la caquexia. 62 Por lo tanto, este hongo medicinal puede suponer un enfoque útil como terapia coadyuvante para mejorar el estado de salud y la calidad de vida del paciente. También el lentinano, un β-glucano derivado de Lentinula edodes, es conocido por su efecto positivo contra la caquexia en pacientes con tumores malignos. 377 En una revisión sistemática, se evaluaron 13 ensayos clínicos aleatorizados, controlados con placebo y en doble ciego, para determinar la eficacia de este Trametes versicolor en la supervivencia de pacientes con cáncer. 83 Los resultados del metaanálisis mostraron que este hongo supone una ventaja en cuanto a la supervivencia en comparación con el tratamiento convencional sin el hongo. Los pacientes a los que se les administró el extracto presentaron una reducción absoluta de la mortalidad a 5 años del 9 %, lo que resultó en un paciente vivo adicional por cada 11 pacientes tratados. En pacientes con cáncer de mama, cáncer gástrico o cáncer colorrectal tratados con quimioterapia, los efectos de la combinación con preparados de Trametes versicolor en la tasa de supervivencia fueron más evidentes, pero no así en los casos de cáncer de esófago y carcinoma nasofaríngeo, donde las diferencias no fueron significativas. 83 Por último, podemos considerar las capacidades protectoras del epitelio gastrointestinal mostradas por el extracto de Hericium erinaceus en modelos murinos in vivo. 431 Aunque sería necesario un ensayo clínico en humanos, estos datos preclínicos apoyan la idea de usar este hongo como terapia coadyuvante en los enfermos con cáncer gastrointestinal. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 86 1.3 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DE LA MICOTERAPIA En las culturas orientales, los hongos han sido usados como alimento y como fármacos desde hace milenios, pues los hongos medicinales son un componente esencial de la MTC. Por el contrario, en la cultura occidental, los hongos fueron vistos a menudo y desde tiempos antiguos con un cierto miedo y desconfianza, dada la dificultad que entrañaba a veces el reconocimiento de especies distintas y la peligrosidad que entrañaba una desafortunada equivocación. A los ojos del neófito, dos especies completamente distintas parecen iguales, mientras que una es un manjar la otra puede ser un veneno mortal a dosis tan bajas como 20 gramos de setas para una persona de 70 kg. De ahí que, desde antiguo, por la prueba de ensayo y error, se recomendaba gran precaución y cuidado con las setas. Pero aquel que las conocía bien, podía disfrutar de este gran manjar sin recato. Los hongos y su uso han sufrido también los avatares de la Historia. Existen evidencias de que en Occidente la iglesia (lugar de formación y de concienciación comunal durante siglos) desaconsejaba con insistencia su aprovechamiento por el riesgo de envenenamiento, a pesar de las hambrunas recurrentes que sufría la población. Arrastrando esta complicación de aprovechamiento, la micología fue relegada a científicos, naturalistas o gente de alta alcurnia que tenía buenos asesores. A nivel de pueblo llano, existen zonas de Occidente en las que las setas han sido más aprovechadas que en otras, un uso por lo general unido al aprovechamiento forestal o bien a un uso terapéutico en botica. Estos pueblos que han mantenido su sabiduría popular son hoy los que más disfrutan de la recolección silvestre de setas para disfrute propio, no para la venta. Galicia, pese a ser un lugar rico en biodiversidad y producción, no gozaba de esta sabiduría popular más allá de una especie que es hoy la más reconocida y aprovechada a nivel de pueblo: la Macrolepiota procera. Si bien es cierto que Galicia ha sido un lugar prolífico en investigadores y micólogos (Carlos Valencia, Antonio Odriozola, Luis Freire, Marisa Castro, Francisco Fernández de Ana Magán, Antonio Rigueiro, etc.) que en este último siglo han realizado una enorme labor de enseñanza tanto teórica como práctica, en el aula, el monte y la cocina, para acercar a la población al conocimiento y disfrute de la micología. Introducción 87 Esta labor de investigación ha hecho que, por fortuna, los tiempos del miedo y la ignorancia hayan quedado atrás. Hoy día la micología es una ciencia y como tal de ser utilizada, aplicando el método científico a la mejora y perfeccionamiento de esta rama de la biología. Paralelamente al desarrollo del conocimiento de la micología y la naturaleza en general, es a partir de los años 70-80 del siglo pasado cuando se desarrolla de forma masiva el interés por los remedios llamados «naturales», tanto por parte de los profesionales de la salud como de la sociedad en general. Esta última, quizá cansada de la fuerte medicación social y en la búsqueda de nuevos remedios que pudiesen ofrecer una forma de prevención y de minoración de los síntomas en patologías crónicas o degenerativas. Algunos autores consideran que es a partir de 1990 cuando se desarrolla el interés científico por las setas como remedios naturales. 251 Pero es fundamentalmente con el año 2000 y el cambio de siglo cuando surge el interés generalizado por las terapias naturales, entre las que se incluye la micoterapia. 396 Las terapias disponibles en la actualidad contra el cáncer son mayormente eficaces en fases tempranas de la enfermedad. Pero en fases avanzadas, especialmente a partir de tumores desarrollados en tejidos epiteliales como el cáncer colorrectal, la eficacia se reduce considerablemente. Esta limitada eficacia y los importantes efectos secundarios de las mismas han favorecido en los últimos años el uso creciente de productos medicinales complementarios y alternativos (CAM, complementary and alternative medicine) por parte de los pacientes. En algunos países industrializados, los estudios sugieren que al menos el 20 % de los pacientes oncológicos han utilizado algún tipo de estos productos, 299, 337, 375 mientras que otros autores dan cifras de entre el 45 y el 60 %. 341 Se estima que el 38 % del público general en los EE.UU. utiliza productos CAM. 264 En este país, la venta de suplementos herbológicos (lo que incluye a los hongos medicinales) se ha incrementado de forma sostenida desde el 2004. En el año 2018, estos suplementos supusieron un gasto para los consumidores estadounidenses de casi nueve mil millones de dólares. 362 En Australia, se calcula que el 69 % de la población utiliza productos CAM. 447 En Italia, un estudio reciente estima que un 49 % de los 95 3 OBJETIVOS La presente tesis doctoral tiene los siguientes objetivos: Objetivo principal: Determinar las capacidades anticancerígenas y prebióticas de los extractos de los hongos medicinales: Trametes versicolor, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus, Agaricus blazei Murrill, Lentinula edodes, Polyporus umbellatus y Ophiocordyceps sinensis. Objetivos secundarios. a. Realizar una revisión exhaustiva del conocimiento generado hasta la fecha en el campo de la micoterapia oncológica. b. Determinar in vitro la actividad prebiótica de los extractos de hongos medicinales. c. Determinación de la posible toxicidad farmacológica de los extractos fúngicos (inhibición CYP450). d. Determinar las capacidades anticancerígenas in vivo de los extractos fúngicos en un modelo murino de colitis ulcerosa y CCR. e. Determinar las capacidades prebióticas in vivo de los extractos fúngicos en un modelo murino de colitis ulcerosa y CCR CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 96 f. Delinear un protocolo de ensayo clínico en Fase II para el tratamiento con micoterapia coadyuvante en pacientes oncológicos de CCR sometidos a cirugía curativa. 97 4 METODOLOGÍA 4.1 CULTIVOS Y EXTRACTOS DE HONGOS El cultivo de las distintas cepas de hongos y la preparación de los extractos se realizó según las metodologías (know-how) desarrolladas por Hifas da Terra. Algunas de estas metodologías han sido publicadas en detalle con anterioridad (ver Anexos). 297, 335 En cuanto a la preparación de los extractos de hongos, se han elegido dos métodos principales que ya han sido descritos anteriormente en detalle (ver Anexos):  Extracción hídrica en agua caliente, descrito en RodríguezSeoane et al., 2019. 335  Extracción mixta hidroalcohólica, descrito en Parada et al., 2015. 297 El proceso de extracción mixto se utilizó con el hongo reishi (Ganoderma lucidum) a fin de obtener la fracción de triterpenoides de este hongo. Para el resto de los hongos se utilizó el proceso de extracción acuoso. Ambos procesos de extracción suponen tecnologías ecológicas y respetuosas con el medio ambiente, sin las limitaciones de la producción de solventes tóxicos, y sin disminuir las propiedades farmacológicas de los extractos de hongos medicinales. Los métodos ecológicos (green methods) de extracción que se han desarrollado en Hifas da Terra suponen una serie secuencial en diferentes etapas, que incluyen extracción en agua, extracción por hidrodifusión con microondas y gravedad (MHG, microwave hydrodiffusion and gravity), autohidrólisis y extracción supercrítica con dióxido de carbono. 297, 335 CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 98 Una vez obtenidos los extractos secos, estos se encapsularon en cápsulas vegetales con sulfato cálcico (SO4Ca) como excipiente al 1 % para evitar el apelmazamiento y facilitar el movimiento en la máquina encapsuladora. Las cápsulas se conservaron en frascos de 62 unidades cerradas con sello interior de seguridad y brida externa de protección a violación del envase. Este envase se introdujo a su vez en una caja de cartón para proteger las cápsulas de la acción de la luz y aislarlas del efecto del calor. Una vez producidas las cajas fueron guardadas en frío, en cámara de 2 a 4ºC. Todos los procesos realizados en este estudio tienen el certificado de buenas prácticas de fabricación (GMP, good manufacturing practice). 4.2 ENSAYO IN VITRO SOBRE ACTIVIDAD PREBIÓTICA El objetivo principal de estos experimentos es determinar in vitro la posible actividad prebiótica de los extractos de origen fúngico, en concreto, del extracto del hongo Hericium erinaceus, sobre distintas especies bacterianas. Los extractos liofilizados de Hericium erinaceus se resuspendieron en medio de cultivo MRS o M9, según el ensayo, a una concentración de 100 mg/ml. Tras mantenerlos en agitación a temperatura ambiente durante una hora, se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se esterilizó a través de un filtro de 0,22 μm para ser utilizado como suplemento de los medios de cultivo en los que posteriormente se cultivaron las bacterias. El ensayo se basó en los cambios en la biomasa (crecimiento bacteriano), tras un tiempo establecido de cultivo, de determinadas bacterias probióticas en presencia de un 1 % del extracto fúngico (prebiótico a analizar) o en presencia de un 1 % de glucosa (prebiótico estándar), y en relación con el crecimiento de bacterias entéricas cultivadas en las mismas condiciones. Como bacterias probióticas se utilizaron cepas de Bifidobacterium adolescentis (CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) 5781), Lactobacillus plantarum (CECT 9567) y un probiótico comercial, Lactobacillus rhamnosus GG Metodología 99 (ATCC (American Type Culture Collection) 53103), comercializado bajo la marca Kaelidon 6 por TC Pharma. Como bacterias entéricas se utilizaron dos cepas de Escherichia coli (CECT 516 y CECT 343). Las bacterias se reactivaron en medio de cultivo líquido MRS (bacterias lácticas y probióticas) o medio M9 (bacterias entéricas). Para el ensayo de actividad prebiótica se utilizaron cultivos de 18 h de edad ajustados a una turbidez de 0,5 MacFarland. El proceso de ajuste de turbidez se realizó mediante la fórmula: 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 𝑥 𝑉𝑓 𝐶𝑖 ; donde Ci es la turbidez inicial, Cf es la turbidez deseada (0,5), Vf es el volumen final de medio necesario para inocular todos los tratamientos y Vi es el volumen de cultivo que hay que añadir para obtener 0,5 MacFarland en el Vf. Los medios utilizados para ajustar la turbidez fueron medio M9 para las bacterias entéricas o medio MRS sin glucosa para las bacterias lácticas. Los diferentes suplementos (glucosa, insulina y extracto fúngico) se diluyeron en agua destilada a una concentración de 100 mg/ml y se esterilizaron por filtración con un filtro de 0,22 μm STERIFLIP® antes de añadirlos al medio de cultivo al 1 %. El grupo control se suplementó con un 1 % de agua destilada estéril para mantener la misma proporción de nutrientes en todos los tratamientos. Los tubos de tratamiento con sus correspondientes suplementos fueron inoculados con cultivos bacterianos al 1 % (100 μl de bacterias en 9,9 ml de medio líquido). Los cultivos bacterianos estaban previamente ajustados a una turbidez de 0,5 MacFarland. Los tiempos y temperaturas de incubación se detallan en la Tabla 1. Cada tratamiento se ensayó por triplicado. Dos tubos de cada tratamiento se incubaron sin inocular para controlar posibles contaminaciones de los medios de cultivo o los suplementos. En el caso de Bifidobacterium adolescentis, se prepararon 3 réplicas por cada tiempo de muestreo y los tubos se sellaron con parafina justo después de añadir el inóculo para cultivar en anaerobiosis. Las condiciones de los cultivos de las distintas especies de bacterias, así como los grupos experimentales ensayados, se resumen en la Tabla 1. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 100 Tabla 1. Condiciones de cultivo y grupos de tratamiento de las bacterias entéricas y probióticas. Tiempos, temperatura y medio de cultivo de las distintas cepas de bacterias ensayadas. Lactobacillus sp. Bifidobacterium adolescentis Escherichia coli Temperatura de cultivo 37 ºC 37 ºC 37 ºC Tiempo de cultivo 24-48 h 48-72 h 24-48 h Medio de cultivo MRS MRS M9 Grupos de tratamiento  MRS o M9 sin glucosa (control)  MRS o M9 + 1 % glucosa  MRS o M9 + 1 % extracto fúngico M9, medio de cultivo mínimo, suplementado con Ca2CL 1 M (0,1 ml/l) y con MgSO4 1 M (2 ml/l). MRS, medio de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe. A los diferentes tiempos de muestreo (0, 24 y 48 h) se retiró una alícuota de 250 μl de cada tubo y se midió la absorbancia a 600 nm en placa de 96 pocillos. En el caso de Bifidobacterium adolescentis, para no romper la anaerobiosis, se midió la absorbancia en diferentes tubos a cada tiempo de muestreo tras retirar la parafina. No se detectó crecimiento medible de esta bacteria hasta las 48 h, por lo que se prologó el tiempo de cultivo hasta las 72 h. El índice de actividad prebiótica se calculó según la fórmula desarrollada por Huebner et al., 2007: 141 Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑝𝑟𝑒𝑏𝑖ó𝑡𝑖𝑐𝑎 = 𝐴 − 𝐵 Donde: 𝐴 = (𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑝 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 24 ℎ − 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑝 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 0 ℎ) (𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑝 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 24 ℎ − 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑝 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 0 ℎ) Metodología 101 𝐵 = (𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 24 ℎ − 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 0 ℎ) (𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 24 ℎ − 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 0 ℎ) 𝐴𝑏𝑠, 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑏𝑝, 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑖ó𝑡𝑖𝑐𝑎𝑠 𝑏𝑒, 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑡é𝑟𝑖𝑐𝑎𝑠 4.3 ENSAYO DE TOXICOLOGÍA FARMACOLÓGICA (CYP450) Las isoenzimas de la familia CYP450 son esenciales en las fases iniciales del metabolismo de xenobióticos, lo que incluye a los fármacos de la medicina convencional y los compuestos complementarios. 120 La manera más común de determinar posibles interacciones entre nuevos fármacos o substancias bioactivas es mediante la medición de la acción del nuevo compuesto sobre distintas enzimas de la familia CYP450. 120, 282, 301 En el presente estudio, se evaluó el potencial inhibitorio de los extractos fúngicos incluidos en la formulación de Mico-Digest 2.0® sobre las principales isoformas del CYP450 (CYP3A4, CYPP2D6 y CYP2CP), responsables de la mayoría de los procesos metabólicos conocidos. 426 Los extractos fúngicos en su forma comercial (píldora o cápsula) se molieron y disolvieron en agua y DMSO (dimetilsulfóxido) en proporción 80/20. La dosis diaria recomendada de cada hongo se tomó como base para el tratamiento. Consultar Hellum et al., 2007 para más detalles. 120 Las soluciones madre de los extractos de hongos se mantuvieron a 4 ºC y en la oscuridad. Las concentraciones ensayadas in vitro se supone que cubren el rango de concentraciones que puedan ocurrir in vivo en el intestino delgado y en el torrente sanguíneo. Para el ensayo enzimático propiamente dicho, microsomas de hígado humano (0,25 mg/ml) fueron incubados en placas de 96 pocillos durante 15 minutos a 37 ºC con el sustrato de prueba CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 102 específico para cada enzima disuelto en tampón salino 0,1 mM (pH 7,4). Estos sustratos específicos fueron: testosterona 50 μM para la CYP3A4, dextrometorfano 10 μM para la CYP2D6 y diclofenaco 20 μM para la CYP2C9. Además, la solución contiene un sistema de regeneración de NADPH (1,25 mM NADP+, 3,3 mM glucosa-6fosfato, 3,3 mM MgCl2 y 0,4 U/ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). Los extractos de hongos se disolvieron en DMSO/agua (20/80) en la concentración adecuada y se agregaron en volúmenes de 2 μl. Como controles positivos se utilizaron inhibidores específicos para cada enzima: ketoconazol para la CYP3A4, quinidina para la CYP2D6 y sulfafenazol para la CYP2C9, también disueltos en DMSO/agua y añadidos en volúmenes de 2 μl. Todas las incubaciones se realizaron en DMSO al 0,2 %, en un volumen total de 200 μl. La reacción se terminó mediante la adición de 90 μl de acetonitrilo. La formación de productos de reacción específicos (6-beta-hidroxitestosterona, dextrorfano y 4´-hidroxi-diclofenaco) se cuantificó mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, tal y como se ha descrito previamente. 301 4.4 ENSAYOS PRECLÍNICOS IN VIVO El objetivo principal de estos experimentos es estudiar los efectos de los extractos de origen fúngico con capacidad prebiótica sobre los marcadores de inflamación y la microbiota intestinal, en un modelo murino (ratones) de colitis ulcerosa y cáncer colorrectal (CCR). Para ello se realizó la selección de los extractos con mayor potencial prebiótico de Hifas da Terra. Como modelo animal se indujo en los ratones un estado de inflamación intestinal crónica que derivó en cáncer colorrectal mediante la suministración de azoximetano (AOM) y sodio sulfato de dextrano (DSS). El tratamiento con AOM/DSS genera en ratones tumores de colon de forma rápida y consistente, con similitudes morfológicas y moleculares a las que se observan en la colitis humana y el cáncer colorrectal. Este modelo murino ha sido previamente caracterizado y es utilizado con frecuencia en estudios in Metodología 103 vivo de carcinogénesis e intervención mediante quimioterapia. 287, 373 La combinación del carcinógeno AOM con el DSS, un polisacárido sulfato extremadamente tóxico, provoca una inflamación crónica de la mucosa del colon, lo que favorece la aparición de colitis severa y la producción de tumores inducidos por el AOM. 373 La empresa cuenta con los permisos correspondientes, incluidos los del comité ético, para el cuidado y uso de animales destinados a la investigación biológica. A pesar de que los datos preclínicos in vitro se realizaron con extractos de hongos individuales, en este modelo murino de CCR se ha ensayado la fórmula Mico-Digest 2.0®, desarrollada en Hifas da Terra, basándose en la bibliografía existente y la propia experiencia de la empresa. Los efectos de los extractos fúngicos se evaluaron mediante la monitorización de los cambios en biomarcadores relacionados con la inflamación y la microbiota intestinal. En la Tabla 2 se detalla la composición cualitativa de la fórmula Mico-Digest 2.0® administrada a animales del grupo experimental. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 110 molecular basada en el ARNr 16S permite la identificación de bacterias de una forma rápida y eficaz. 333 Se empleó la plataforma Ion Torrent. Inicialmente se realizó la extracción del ADN y la preparación de librerías de metagenómica empleando el 16S Metagenomics kit (Thermofisher Ref. A26216), siguiendo en todo momento las indicaciones del fabricante. Este kit amplifica 7 de las 9 regiones hipervariables del gen 16S que luego serán secuenciadas. Finalmente, los datos obtenidos se comparan con una base de datos que permite determinar el grado de similitud de las secuencias obtenidas con un amplio rango de genomas bacterianos. Para el análisis de los resultados se ha usado el paquete de programas de Qiime2. Se realizó un análisis en conjunto de todos los amplicones (secuencias de ADN amplificadas en el proceso de preparación de las librerías genómicas) que se secuenciaron en cada uno de los ratones. A través de una sucesión de pasos con Qiime2 se obtuvieron las llamadas amplicon sequence variant (ASVs), antes denominados como OTUs (Operational Taxonomic Units), con las que finalmente se han podido realizar análisis tales como los de diversidad alfa y beta, así como perfiles taxonómicos. Para la asignación taxonómica de esas ASVs, se probaron tres estrategias todas ellas integradas en el programa de Qiime2. La que mejor funcionó fue la que usa el algoritmo de Vsearch, y con estos resultados se continuó el análisis. Para el análisis estadístico de abundancias de taxones, se han empleado cuatro tipos de estadísticos (ANCOM, gneiss, songbird y STAMP) y los resultados obtenidos en cada uno de ellos fueron muy similares. Todos ellos excepto STAMP, se han analizado con Qiime2. 4.4.5 Análisis estadístico La significación estadística de los valores obtenidos en los grupos (unidad de análisis) control y el grupos experimental se calculó con el software GraphPad Prism aplicando los test ANOVA o KruskalWallis. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (SD). La significación estadística (p<0,05, p<0,01 o p<0,001) se Metodología 111 determinó mediante el test de la distribución t de Student para comparar dos grupos de tratamiento o el test de Dunnett para comparar ambos grupos de tratamiento con el grupo control. 4.5 ENSAYO CLÍNICO – ESTUDIO PILOTO A pesar de todos los estudios mencionados en la Introducción de esta tesis doctoral, la acción prebiótica de los constituyentes de los hongos basidiomicetos no se ha estudiado en individuos sanos ni enfermos. Si bien algunos estudios han demostrado que los extractos fúngicos pueden tener, entre otras, acciones antiinflamatorias mediante la acción sobre citoquinas en pacientes con cáncer colorrectal (CCR) avanzado, los ensayos presentan importantes limitaciones. 62 Tampoco se ha establecido la relación entre el tratamiento coadyuvante con hongos medicinales y los cambios en la estructura de la microbiota intestinal, la progresión de la enfermedad o la calidad de vida de los pacientes. Aunque ciertos estudios han realizado la evaluación clínica de extractos fúngicos utilizados como coadyuvantes en pacientes con cáncer colorrectal (véase Introducción), en la mayor parte de estudios se ensayó un único hongo (o el componente biológico de un hongo, como es el caso de los polisacáridos PSK y PSP obtenidos de Trametes versicolor). 57, 367, 438 Preparaciones más complejas, como la fórmula Mico-Digest 2.0® desarrollada por Hifas da Terra necesitan todavía ser mejor evaluadas a nivel clínico. Para suplir esta deficiencia nace el proyecto MicroMarker, un proyecto colaborativo de I+D, liderado por Hifas da Terra, en el que se evaluará la relación existente entre la modulación de la microbiota intestinal (acción prebiótica) de extractos de hongos medicinales y la progresión del cáncer colorrectal, así como los posibles efectos en la calidad de vida de estos enfermos oncológicos. Una vez realizados los estudios in vitro en líneas celulares y los estudios en modelos animales de cáncer colorrectal, se realizará un ensayo clínico en Fase II para evaluar el efecto de la administración del nutracéutico Mico-Digest 2.0® (Ganoderma lucidum, Agaricus CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 112 blazei Murrill, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus y Myrciaria dubia) previo a la intervención en las complicaciones asociadas a la cirugía colorrectal del CCR tratado con intención curativa (estudio COGOMELO 1.0). El estudio se realizará en el Hospital Universitario de Ourense (CHUO), bajo la dirección del doctor Joaquín Cubiella Fernández como investigador principal. Dada la probada no toxicidad de los extractos fúngicos utilizados, se obvia la necesidad de realizar la Fase I previa típica de un ensayo clínico. Se tratará de un ensayo clínico aleatorizado, en doble ciego, prospectivo y multicéntrico con dos brazos: grupo control (placebo) y grupo experimental (fórmula Mico-Digest 2.0®). El estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética de Investigación con Medicamentos de Galicia. Se incluirán en este estudio un grupo relativamente homogéneo de pacientes con diagnóstico reciente de CCR en el CHUO candidatos a tratamiento quirúrgico con intención curativa (estadios I-III). Como variable principal del estudio se considerarán las complicaciones globales durante el ingreso hospitalario. Como variables secundarias se considerarán los posibles efectos adversos (EA) asociados al tratamiento, las modificaciones en la microbiota intestinal, el perfil inflamatorio y nutricional, así como la calidad de vida durante la administración del tratamiento. 4.6 FINANCIACIÓN Y COLABORACIONES Para el presente proyecto se ha solicitado ante organismos nacionales financiación para la realización del mismo, en el marco de convocatorias competitivas como el Programa Interconecta del Centro para el Desarrollo Tecnológico e Industrial (CDTI). También se cuenta con la financiación privada de la empresa Hifas da Terra. Para la ejecución de la Fase II del ensayo clínico se cuenta con la colaboración del Hospital Universitario de Ourense (CHUO). La investigación clínica es promovida por Hifas da Terra con fondos aportados por el Centro para el Desarrollo Tecnológico e Metodología 113 Industrial (https://hifasdaterra.com/blog/micromarker-proyecto-id-rolmodulador-hongos-microbiota-y-cancer-colorrectal/). 4.7 CONFLICTO DE INTERESES La doctoranda forma parte del cuadro de personal de la empresa Hifas da Terra. Este trabajo ha sido financiado según se detalla en el epígrafe anterior. 115 5 RESULTADOS 5.1 CAPACIDAD PREBIÓTICA IN VITRO Los sustratos con un índice alto de actividad prebiótica estimulan el crecimiento de las bacterias probióticas, obteniendo absorbancias similares a las obtenidas cuando dichas bacterias son cultivadas en presencia de glucosa. Por el contrario, el crecimiento de las bacterias entéricas debería ser, en teoría, mucho más bajo en presencia del sustrato a analizar que en presencia de glucosa. Usando la ecuación descrita en el epígrafe 4.3, 141 la actividad de un determinado extracto se calcula específicamente para una bacteria probiótica determinada. En la Figura 11 se muestran gráficamente los resultados obtenidos en el ensayo de capacidades prebióticas del extracto de Hericium erinaceus. Tanto para Lactobacillus plantarum (Figura 11A) como para Lactobacillus rhamnosus (Figura 11B), la suplementación del medio de cultivo con glucosa (suplemento prebiótico) produjo un aumento significativo del crecimiento bacteriano con respecto al medio control no suplementado. Este crecimiento se mantiene estable a partir de las 24 h de incubación. En el caso de Bifidobacterium adolescentis, el crecimiento no fue apreciable hasta las 48 h de cultivo (Figura 11 C). Similar incremento, aunque en menor medida, se observó en el cultivo de Escherichia coli suplementado con glucosa (Figura 11D). La adición del extracto fúngico en el cultivo de Lactobacillus plantarum produjo un incremento del crecimiento bacteriano con valores cercanos a los obtenidos con la adición de glucosa, y muy por encima de los valores del grupo control con medio no suplementado (Figura 11A). Similares efectos, aunque no tan CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 116 acusados, se observaron con la adición del extracto fúngico al cultivo de Lactobacillus rhamnosus (Figura 11B), donde el efecto prebiótico del extracto de Hericium erinaceus fue sólo visible a las 48 h de incubación. El extracto del hongo también indujo un aumento del crecimiento de Bifidobacterium adolescentis, aunque el efecto prebiótico del extracto no fue apreciable hasta las 48 h de cultivo y se mantuvo muy por debajo del crecimiento inducido por glucosa (Figura 11C). El extracto de hongo también produjo un incremento del crecimiento de las bacterias entéricas (Escherichia coli), pero apenas llegó al 50 % de la estimulación causada por glucosa (Figura 11D). En la Tabla 4 se muestran los índices de actividad prebiótica del extracto de Hericium erinaceus en las bacterias ensayadas. Estos valores se calcularon para cada especie de bacteria probiótica respecto a cada una de las bacterias entéricas por separado. Tabla 4. Índice de actividad prebiótica. Actividad prebiótica del extracto de Hericium erinaceus en dos especies de bacterias probióticas con respecto a dos cepas de bacterias entéricas a las 24 y 48 h de cultivo. Bacteria probiótica Bacteria entérica 24 h 48 h 72 h* Lactobacillus plantarum Escherichia coli 343 0,379 0,157 -- Escherichia coli 516 0,4244 0,310 -- Lactobacillus rhamnosus Escherichia coli 343 0,059 0,278 -- Escherichia coli 516 0,006 0,432 -- Bifidobacterium adolescentis Escherichia coli 343 -- 0,238 0,219 Escherichia coli 516 -- 0,188 0,169 *, El índice de actividad prebiótica de Bifidobacterium adolescentis se calculó a las 72 h respecto al crecimiento de las bacterias entéricas a las 48 h. Resultados 117 Figura 1. Actividad prebiótica in vitro del extracto de Hericium erinaceus en cultivos de las bacterias probióticas Lactobacillus plantarum (panel A) y Lactobacillus rhamnosus (panel B). Las bacterias fueron cultivadas hasta 48 horas en medio de cultivo sin suplementar (Control) o suplementado con glucosa (suplemento probiótico) o con extracto fúngico. El crecimiento bacteriano se cuantificó mediante absorbancia a 600 nm de alícuotas de los cultivos a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 118 Figura 1. (Continuación) Actividad prebiótica in vitro del extracto de Hericium erinaceus en cultivos de las bacterias probióticas Bifidobacterium adolescentis (panel C), así como sobre la bacteria entérica Escherichia coli (panel D). Las bacterias fueron cultivadas hasta 48 horas en medio de cultivo sin suplementar (Control) o suplementado con glucosa (suplemento prebiótico) o con extracto fúngico. El crecimiento bacteriano se cuantificó mediante absorbancia a 600 nm de alícuotas de los cultivos a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. Resultados 119 En general, los valores de actividad prebiótica fueron relativamente bajos para el extracto de Hericium erinaceus. Un valor bajo o negativo del índice de actividad probiótica indica que la cepa bacteriana crece peor en el extracto fúngico que en el prebiótico estándar (glucosa), o que crece menos que las bacterias entéricas en el mismo extracto. Similares valores, tanto de crecimiento bacteriano como de índice de actividad prebiótica, se obtuvieron con otros cinco extractos distintos del hongo, extraídos con la misma metodología en Hifas da Terra. Estos datos nos permiten concluir que los extractos del hongo Hericium erinaceus promueven en mayor medida el crecimiento de bacterias lácticas (probióticas) frente a enterobacterias. 5.2 RESULTADOS CON EL CITOCROMO P450 Los resultados, expresados en valores de la concentración inhibitoria media (IC50), se detallan en la Tabla 5. Los resultados de este estudio demostraron una baja posibilidad de interacciones medicamentosas in vivo entre los fármacos convencionales y los extractos fúngicos por inhibición de las enzimas CYP450. Estos resultados están en concordancia con la ausencia de notificaciones relacionadas con reacciones alérgicas, efectos adversos de gravedad o interacciones medicamentosas asociadas a la ingesta de los diversos productos lanzados al mercado por Hifas da Terra, entre los que se encuentran productos elaborados a partir de extractos de uno o varios de los hongos analizados en este ensayo. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 126 Figura 6. Valores de colesterol en suero en ratones sanos (control), ratones a los que se les indujo cáncer colorrectal (CCR) y ratones tratados con prebiótico. Los datos se expresan como media ± SD de todos los animales en cada grupo experimental (dos medidas replicadas para cada animal). N = 4 para control. N = 11 para CCR y CCR + prebiótico. **, p<0,01 vs. grupo control. Los niveles de corticosterona detectados en el suero de los ratones fueron, por lo general, muy variables, incluso entre los individuos de un mismo grupo experimental. Aunque se pueda apreciar una ligera disminución en los niveles de corticosterona en los animales con CCR inducido (Figura 7), y similares entre el grupo control de animales sanos y el grupo de animales con cáncer tratados con prebiótico, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (cáncer vs. sanos, p = 0,23; cáncer vs. cáncer + prebiótico, p = 0,15; t de Student). Resultados 127 Figura 7. Valores de corticosterona en suero en ratones sanos (control), ratones a los que se les indujo cáncer colorrectal (CCR) y ratones tratados con prebiótico. Los datos se expresan como media ± SD de todos los animales en cada grupo experimental (dos medidas replicadas para cada animal). N = 5 para control. N = 12 para CCR. N = 11 para CCR + prebiótico. 5.3.3 Análisis de la microbiota intestinal Tras el análisis por secuenciación masiva de las muestras de intestino se obtuvieron las secuencias en formato FASTQ. Inicialmente se confirmó que la calidad de las lecturas (reads) obtenidas era la adecuada. Para ello se utilizó el software FastQC2 (Babraham Bioinformatics). Los resultados del análisis demostraron que las secuencias eran de alta calidad y se mantenían estables hasta las 280 bases. A partir de ahí se observó una ligera disminución en la calidad de los reads, aunque dentro de la normalidad en este tipo de análisis. A continuación, se procedió a cortar las secuencias terminales o repetidas que podrían corresponder con los primers o cebadores necesarios para poder secuenciar las muestras, para evitar CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 128 interferencias. Concretamente fue necesario recortar las secuencias de adaptadores que flanquean ambos extremos de las secuencias FASTQ. Para eso, se usó el algoritmo BBDuk del paquete bioinformático (suite) BBTools 3 (DOE Joint Genome Institute) que combina las operaciones de recorte, filtrado y enmascaramiento más comunes relacionadas con la calidad de los datos en una única herramienta de alto rendimiento. Para este análisis, el algoritmo BBDuk recortó las 21 bases más a la izquierda y las 24 bases en el extremo derecho de cada secuencia (trimming process). Se recuperó aproximadamente el 90 % de las lecturas de cada muestra. Estas secuencias recortadas se migraron al software para el análisis metagenómico. Para este análisis de metagenómica se utilizó el software Qiime26, que es un paquete bioinformático que permite realizar análisis de microbiomas a partir de datos de secuenciación de ADN sin procesar. 32 Qiime2 está inicialmente diseñado para procesar datos de secuenciación generados en Illumina u otras plataformas mediante la publicación de gráficos y estadísticas de calidad. En nuestro caso, dado que los datos de secuenciación provienen de bibliotecas preparadas con el kit IonTorrent 16S Metagenomics y luego secuenciadas con la plataforma IonTorrent, los desarrolladores de Qiime2 sugieren una pipeline particular que ha sido la seguida para conseguir obtener la información relevante a partir de los amplicones secuenciados. A mayores, se empleó el algoritmo DADA27 44 para eliminar ruido, des-replicar secuencias y filtrar quimeras, como paso de control de calidad. Las secuencias no quiméricas fueron las que se emplearon finalmente para el análisis con Qiime 2. Dicho análisis, con las 29 muestras de intestino, permitió obtener un total de 6397 ASV (amplicon sequence variant). Con el fin de poder obtener medidas de diversidad filogenética, se construyó con los fragmentos de las secuencias 16S obtenidas un árbol filogenético. Dicho árbol permite tener una idea de las distancias filogenéticas entre las diferentes muestras analizadas. Este árbol se utilizó para los análisis posteriores, como el análisis de diversidad alfa y beta. La diversidad alfa permite analizar la distribución o proximidad dentro del propio grupo experimental, mientras que la Resultados 129 diversidad beta estudia la distribución o proximidad entre los diferentes grupos experimentales. Tras los análisis de diversidad alfa (Figura 8), se aplicó el estadístico H de Kruskal-Vallis. Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 6. Figura 8. Diversidad alfa filogenética en la microbiota intestinal de ratones sanos (control), ratones a los que se les indujo cáncer colorrectal (CCR) y ratones tratados con prebiótico. N = 5 para control. N = 12 para CCR y CCR + prebiótico. u.a., unidades arbitrarias según métricas de Faith Phylogenetic Diversity. El análisis de la Diversidad Alpha de Kruskal Wallis H estableció que no había diferencias significativas en la distribución de la diversidad filogenética entre los distintos grupos de tratamiento (p=0,319). Estos resultados indican que no se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre los individuos correspondientes al mismo grupo. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 130 Tabla 6. Estadísticos del análisis de la diversidad alfa. El análisis se realizó entre cada 2 grupos mediante el test de Kruskal-Wallis H. Grupos experimentales (número de animales) H p-value q-value CCR + Prebiótico (n = 12) Control sanos (n = 5) 1,600 0,206 0,309 CCR + Prebiótico (n = 12) CCR (n = 12) 1,613 0,204 0,309 Control sanos (n = 5) CCR (n = 12) 0,000 1,000 1,000 CCR, cáncer colorrectal. A continuación, se construyeron las curvas de rarefacción alfa, en las que se representa la diversidad alfa en función de la profundidad de muestreo. Esto permite comprobar si el muestreo realizado a la profundidad de secuencias indicada fue el idóneo para registrar toda la diversidad filogenética de las muestras analizadas. Para ello se utilizó Qiime2 Alpha-rarefaction visualizer, que permite calcular una o más métricas de diversidad alfa a múltiples profundidades de muestreo y determinar así la riqueza de las muestras secuenciadas. En este caso, la profundidad de muestreo se estableció en 222000 secuencias por muestra. Todas las muestras llegaron al nivel de saturación a las 40000 secuencias, lo que indicó que se trató de un muestreo adecuado para estimar correctamente la riqueza taxonómica total presente en las muestras. Es decir, aunque se incrementara el número de lecturas de las muestras no se obtendría una mayor diversidad porque se ha alcanzado el máximo de variabilidad. Se observó que el número de ASVs u OTUs para el grupo experimental CCR + Prebiótico era ligeramente inferior que el observado en los grupos CCR y control sanos. Resultados 131 A diferencia de la diversidad alfa, el parámetro diversidad beta permite conocer la diversidad filogenética entre grupos de tratamiento. Para calcular este parámetro se analizó la composición de la muestra en el contexto de metadatos categóricos utilizando el Permutational analysis of variance (PERMANOVA). Esta metodología permite determinar si las distancias entre las muestras dentro de un grupo son más similares entre sí que las muestras de los otros grupos. Para calcular este parámetro, se utilizaron medidas filogenéticas de distancias UniFrac ponderadas (Weighted UniFrac Distances) y no ponderadas (Unweighted UniFrac Distances). La métrica UniFrac incorpora información filogenética calculando las longitudes totales de las ramas «no compartidas» entre dos muestras divididas por la longitud total de las ramas. La distancia UniFrac no ponderada es una medida cualitativa, que utiliza la presencia/ausencia de datos para comparar la composición de la comunidad, mientras que la distancia UniFrac ponderada es una medida cuantitativa, que también tiene en cuenta la abundancia relativa de cada tipo de organismo. El PERMANOVA se basa en permutaciones y repite cada análisis unas 999 veces. El PERMANOVA realiza un análisis similar a test Fisher’s Fratio (pseudo-F), que se emplea en los análisis ANOVA. El análisis de las secuencias de los 3 grupos de tratamiento (ratones sanos, ratones con CCR y ratones con CCR tratados con prebiótico) rindió un valor de p=0,002 Estos resultados indicaron que existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos experimentales estudiados. Cuando estos 3 grupos se analizaron de forma pareada se obtuvieron diferencias significativas entre los grupos CCR + Prebiótico y Sanos (p=0,005); así como entre los grupos CCR + Prebiótico y CCCR (p=0,016); pero no entre los grupos CCR y Sanos. Además, el PERMANOVA proporciona un valor «q» adicional (valor p ajustado para pruebas múltiples) que nos indica la probabilidad de obtener un falso positivo, siendo baja para la comparativa entre CCR + Prebiótico y Sanos (q=0,015) y CCR + Prebiótico y CCCR (q=0,024); y un poco más alta para la comparativa entre CCR y Sanos (q=0,091). Los estadísticos de este análisis se resumen en la Tabla 7. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 132 Tabla 7. Estadísticos del análisis de la diversidad beta. El análisis se realizó entre cada 2 grupos mediante el análisis PERMANOVA (999 permutaciones). Grupos experimentales N pseudo-F p-value q-value CCR + Prebiótico Control sanos 17 1,891 0,005 0,015 CCR + Prebiótico CCR 24 1,527 0,016 0,024 Control sanos CCR 17 1,324 0,091 0,091 CCR, cáncer colorrectal; N, tamaño de la muestra (número de animales incluidos en el análisis por parejas de grupos). En definitiva, la prueba PERMANOVA confirmó que las comunidades microbianas en el intestino de los ratones del grupo CCR + Prebiótico son estadísticamente diferentes de las comunidades microbianas de los otros dos grupos, en cuanto a la diversidad beta representada por distancias UniFrac no ponderadas. A continuación, se realizó el llamado Análisis de Coordenadas Principales (PCoA), también conocido como Multidimensional Scaling (MDS), generado en el Core-Metrics-Phylogenetic, para comparar la estructura de las comunidades de microbiomas utilizando diversidad beta. Al examinar las distancias de diversidad beta entre las veintinueve muestras a través de los gráficos de PCoA, se observó una tendencia general a que las muestras de CCR + Prebiótico se separen de las muestras pertenecientes a los otros dos grupos experimentales, lo que sugiere que la composición microbiana del grupo CCR + Prebiótico está filogenéticamente más relacionada con la de los ratones pertenecientes a su propio grupo. Finalmente se realizó un análisis taxonómico, comparando las secuencias obtenidas en nuestro análisis con la versión más reciente de la base de datos Greengenes 248 (versión 13_8). Una vez identificados los distintos taxones, en el nivel de género, en cada grupo de ratones, se realizó una prueba de abundancia diferencial mediante el uso de 4 Resultados 133 estadísticos distintos: ANCOM (Analysis of Composition of Microbiomes), 233 GNEISS, SONGBIRD y STAMP. Todos ellos buscan diferencias entre muestras y tratan de identificar aquellos taxones cuya abundancia difiere significativamente entre los grupos. Tabla 8. Variación de la composición de microbiota tras la suplementación con Mico-Digest 2.0 ® durante 3 meses. Grupos experimentales Proteobacteria Bacteroidetes Firmicutes Otras CCR 21,7% 38,5% 38,6% 1,3% CCR+Prebiótico 18,3% 39,1% 42,2% 0,4% CCR, cáncer colorrectal A modo de conclusión sobre el ensayo de secuenciación de la microbiota, se puede afirmar que los resultados obtenidos tras una serie de análisis y estadísticos para el estudio de abundancias taxonómicas diferenciales muestran que el grupo de ratones con cáncer que han sido tratados con el compuesto prebiótico difiere de forma estadísticamente significativa de los otros dos grupos (Sanos y CCR). Las familias que se expresan de forma diferencial parecen ser Bifidobacteriaceae, Erysipelotrichaceae y Clostridiaceae (concretamente el género Candidatus Arthromitus). Tras 3 meses de suplementación con prebióticos fúngicos observamos una reducción en proteobacterias de un 3%. Los pacientes de CCR presentan un incremento de la abundancia relativa de Proteobacteria de hasta un 22,3% (Liu, 2020), por lo que una reducción en la misma supone un inicio hacia una normalización de la microbiota del indivíduo. Un análisis más detallado de los resultados obtenidos podría ser útil para caracterizar en más profundidad el efecto del compuesto prebiótico sobre la composición microbiana intestinal de los animales con cáncer. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 134 5.4 RESULTADOS CLÍNICOS Basados en previos estudios in vitro, se demostró la actividad antitumoral de los extractos de hongos medicinales fabricados por la empresa en diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal 331 (ver resultados, epígrafe 5.1). Las propiedades beneficiosas, en micología aplicada a la oncología integrativa, de los extractos de hongos desarrollados por Hifas da Terra también se han evaluado en un modelo animal de cáncer colorrectal (ver resultados, epígrafe 5.4). El siguiente paso obvio sería trasladar estos resultados preclínicos al entorno clínico para determinar los efectos de los extractos de hongos como terapia coadyuvante en enfermos oncológicos. Con la colaboración del Hospital Universitario de Ourense (CHUO), se realizará un estudio piloto con un grupo relativamente homogéneo de pacientes de CCR. Se trata de un ensayo clínico aleatorizado, en doble ciego, con un grupo control, prospectivo y multicéntrico. Dentro del proyecto MicroMarker, se estudiará la estructura de la microbiota intestinal presente en el colon de estos pacientes, así como la modulación de esta, como consecuencia de una dieta coadyuvante con el prebiótico desarrollado por Hifas da Terra (Mico-Digest 2.0®). También se monitorizarán biomarcadores de inflamación, calidad de vida del paciente, progresión de la enfermedad oncológica y complicaciones tras la cirugía colorrectal curativa. En la Tabla 9 se ofrece una sinopsis del protocolo del ensayo clínico. El reclutamiento de los pacientes para este ensayo clínico comenzará en abril de 2021. A continuación. se desarrolla una breve descripción del protocolo propuesto para dicho ensayo. 5.4.1 Protocolo del ensayo clínico 5.4.1.1 Hipótesis La administración del nutracéutico Mico-Digest 2.0® a través de su efecto modulador en la microbiota y de la reducción de la inflamación sistémica puede reducir el riesgo de complicaciones de la cirugía durante el ingreso en pacientes con CCR candidatos a resección quirúrgica con intención curativa de primera intención. Resultados 135 5.4.1.2 Objetivos  Objetivo principal: o Evaluar la tasa de complicaciones tras la cirugía del CCR tratado con intención curativa durante el ingreso hospitalario.  Objetivos secundarios: o Determinar el perfil de seguridad de la administración de Mico-Digest 2.0® en los pacientes o Evaluar los efectos que la administración del nutracéutico tiene en la microbiota intestinal antes del ingreso. o Determinar el efecto que tiene Mico-Digest 2.0® en el patrón inflamatorio sistémico o Analizar el impacto de Mico-Digest 2.0® en el perfil nutricional y en la calidad de vida o Analizar el impacto de la microbiota, el patrón inflamatorio sistémico y el perfil nutricional sobre las complicaciones asociadas a la intervención quirúrgica. 5.4.1.3 Diseño del estudio Se realizará un estudio piloto multicéntrico, aleatorizado, en doble ciego, prospectivo y en paralelo con 144 pacientes. El estudio constará de 2 brazos:  Brazo A: Grupo control. Se le instruirá en la dieta previa a la intervención quirúrgica más el placebo.  Brazo B: Grupo experimental. Se le instruirá en la dieta previa a la intervención quirúrgica más Mico-Digest 2.0®. La dosis será de 10 ml por cada 70 kg de peso corporal. La Tabla 9 detalla los componentes del nutracéutico utilizado en el ensayo. A cada participante se le asignará secuencialmente un número según entre en el ensayo. Los participantes serán asignados al grupo control o experimental usando un método de aleatorización por bloques balanceada (para asegurar que los dos grupos tienen el mismo número de participantes) y estratificada (para asegurar que los dos grupos tienen pacientes de las mismas características) asistida por CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 142 en comisión de tumores. A los pacientes que cumplan los criterios de inclusión se les informará respecto a la realización del estudio clínico, así como de las características de este. Se revisarán los criterios de inclusión y exclusión, se le dará una hoja de información al paciente, un formulario de consentimiento informado y un dispositivo para recoger una muestra de heces a nivel domiciliario.  Visita 1 o de inicio del tratamiento. Esta consulta se realizará a la semana de la visita 0 coincidiendo con la cita en la Consulta de Cirugía Colorrectal tras la evaluación y la decisión tomada en la comisión de tumores. Si el paciente acepta participar en el estudio, se recogerá la historia clínica previa, se realizará la evaluación nutricional, la calidad de vida, se tomará una muestra sanguínea para la determinación del perfil nutricional e inflamatorio y se recogerá la muestra fecal que el paciente habrá traído. Se procederá a la aleatorización del paciente a uno de los dos brazos del estudio (placebo o experimental).  Visitas de seguimiento. Las visitas de seguimiento tendrán periodicidad semanal y se realizarán de modo no presencial. En dichas visitas se revisará el cumplimiento del tratamiento, así como los efectos adversos que hayan aparecido. Resultados 143 Figura 9. Esquema de seguimiento del estudio clínico. ASA, American Society of Anesthesiologists’ Physical Status Classification; CCR, cáncer colorrectal; ECOG, Eastern Cooperative Oncology Group; TNM, estadio Tumor-Node-Metastases. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 144  Visita de cierre. La visita de cierre coincidirá con el ingreso hospitalario. En esta visita, se realizará una analítica sanguínea, se recogerá la muestra fecal, el tratamiento restante no utilizado, se realizará una nueva evaluación nutricional y se determinará la presencia de efectos adversos. En este momento se cerrará la intervención.  Alta hospitalaria. En el momento del alta, se recogerá el tiempo de ingreso, el status vital al alta (vivo/muerto), el tipo de cirugía realizada, las complicaciones desarrolladas (tipo, fecha) y clasificadas mediante la clasificación Clavien-Dindo 68 y, finalmente, el estadio TNM final (histología para la invasión mural y adenopática y por pruebas de imagen/histología para la enfermedad metastásica) 5.4.1.8 Actividades y determinaciones Durante las distintas etapas del estudio se realizarán las siguientes actividades y determinaciones:  Historia clínica. En el momento de la valoración inicial se recogerán los datos referidos a los criterios de inclusión/exclusión, las variables demográficas, el motivo de diagnóstico, el tipo y duración de los síntomas y la ubicación y estadio previo a la intervención del tumor. En el momento del alta hospitalaria se recogerá el tipo de intervención, tiempo de ingreso, aparición de complicaciones, tipo de clasificaciones (fallo de anastomosis, infección quirúrgica, íleo prolongado, complicaciones sistémicas y otras), clasificación de la gravedad de las mismas usando la clasificación Clavien-Dindo 68 (leves, I-II; graves, III-V) y la situación del paciente en el momento del alta hospitalaria. Resultados 145  Examen físico. Se realizarán valoraciones antropométricas para evaluar el grado de nutrición: peso, talla, índice de masa corporal y porcentaje de masa grasa.  Evaluación nutricional. La evaluación nutricional se realizará en base a la PG-SGA, la evaluación antropométrica y la determinación sérica de albúmina, prealbúmina, linfocitos totales y hemoglobina.  Encuesta de calidad de vida. Utilizaremos para evaluar la calidad de vida el cuestionario SF-36® validado en nuestro medio y utilizado para evaluar la calidad de vida de pacientes con CCR. 308  Evaluación del cumplimiento del tratamiento. En el momento de la inclusión se entregarán tres cajas del tratamiento asignado con una duración estimada de tratamiento de 48 días. En las visitas de seguimiento, se interrogará al paciente sobre el cumplimiento y el número de tomas y cápsulas restantes. En la visita de cierre, el paciente deberá devolver los envases suministrados no utilizados, procediéndose al registro en el cuaderno de recogida de datos.  Eventos adversos (EA). Se registrará cualquier circunstancia que pudiera ser considerada como evento adverso, así como sus características (inicio, fin, etc.). Se recogerán los eventos adversos, así como su gravedad utilizando las indicaciones de la Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) versión 5.0. 265  Análisis de sangre. Se procederá a la extracción de la muestra sanguínea, manipulación, alicuotación y conservación a -20 ºC hasta su análisis. Se determinarán factores asociados a la respuesta inmune: hemograma y citoquinas para establecer indicadores CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 146 de respuesta inflamatoria sistémica: proteína C reactiva, índice Neutrófilo/Linfocito, TNF-alfa e IL-6.  Microbiota en heces. Con el objetivo de preservar la microbiota anaerobia, utilizaremos el kit de recogida GutAlive® diseñado para preservar la flora anaerobia. Esta muestra se recogerá y se almacenará a -20ºC hasta su análisis. Para cada una de las muestras se realizará una extracción de ADN total, y se secuenciará la región 16S del ARNr bacteriano, mediante la plataforma MiSeq de Illumina. El análisis bioinformático posterior permitirá identificar y clasificar las secuencias y extraer las OTUs (operational taxonomic units), antes de determinar los índices de diversidad, la abundancia relativa, y realizar un análisis de componentes principales. 5.4.1.9 Consideraciones éticas y confidencialidad El estudio se llevará a cabo de acuerdo con las normativas internacionales sobre estudios clínicos: la declaración de Helsinki en su última versión revisada y normas de buena práctica clínica. El estudio sólo comenzará tras haber obtenido por escrito la autorización del Comité Ético de Investigación Clínica correspondiente antes del comienzo del estudio. Con la excepción de aquellas situaciones de emergencia, no se permitirán cambios o desviaciones del protocolo sin la aprobación documentada. El Comité Ético de Investigación Clínica deberá ser informado de los posibles cambios y enmiendas y aprobará por escrito cualquier cambio o desviación que pueda aumentar los riesgos del sujeto y/o pueda afectar adversamente los derechos del paciente o la validez de la investigación. Toda la información relativa a los datos de los pacientes incluidos en el estudio será estrictamente confidencial conforme con al reglamento general de protección de datos. Resultados 147 5.4.1.10 Cronograma El ensayo clínico empezó en 2021, de acuerdo con el siguiente cronograma:  Periodo de inclusión: abril de 2021 a septiembre de 2022. Tabla 10. Sinopsis del protocolo del ensayo clínico. Descripción del estudio Ensayo clínico multicéntrico, aleatorizado, en doble ciego para evaluar el efecto de la administración del nutracéutico Mico-Digest 2.0® previo a la intervención en las complicaciones asociadas a la cirugía colorrectal del cáncer colorrectal tratado con intención curativa. Código COGOMELO 1.0 Promotor Hifas da Terra Nombre del producto: Mico-Digest 2.0® Principio activo: Extractos ecológicos certificados de hongos medicinales (Hericium erinaceus, Lentinula edodes, Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, Polyporus umbellatus, Ophiocordyceps sinensis, Inonotus obliquus, Agaricus blazei Murrill) y Myrciaria dubia. Centros Complejo Hospital Universitario de Orense (CHUO) Investigador principal Dr. Joaquín Cubiella Fernández CEIC Comité de Ética de Investigación con Medicamentos de Galicia Duración del estudio 6 meses Fecha de inicio 04/2021 Fecha de finalización 09/2021 Fase fase II Objetivos Principal:  Evaluar la tasa de complicaciones tras la cirugía del CCR tratado con intención curativa durante el ingreso. Secundarios:  Evaluar los efectos que la administración del nutracéutico tiene en la microbiota intestinal antes del ingreso.  Determinar el efecto que tiene Mico-Digest 2.0® en el patrón inflamatorio sistémico. CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 148  Analizar el impacto de Mico-Digest 2.0® en el perfil nutricional y en la calidad de vida.  Analizar el impacto de la microbiota, el patrón inflamatorio sistémico y el perfil nutricional sobre las complicaciones asociadas a la intervención quirúrgica. Diseño Ensayo clínico aleatorizado doble ciego con aleatorización por bloques y estratificada (CCR proximal/distal al ángulo esplénico). Patología en estudio Cáncer colorrectal (CCR) candidato al tratamiento quirúrgico de primera intervención con intención curativa. Población a estudio Pacientes con diagnostico reciente en el CHUO Número de sujetos 72 pacientes en cada grupo Criterios de inclusión  Pacientes con CCR (estadios I-III) candidatos a tratamiento quirúrgico con intención curativa.  Riesgo quirúrgico evaluado mediante la escala de la American Society of Anesthesiologists’ Physical Status Classification (ASA) <3.  Individuos mayores de 18 años y menores de 85 años.  ECOG 0-2.  Función cognitiva conservada.  Autorización tras lectura de hoja de información del estudio. Criterios de exclusión  Paciente candidato a tratamiento neoadyuvante.  Paciente con patología tumoral concomitante.  Paciente con alergia al producto suministrado o síndrome malabsortivo.  Pacientes con enfermedad mental.  Paciente con infección activa o tratamiento con antibióticos.  Cirugía colorrectal previa. Tratamiento El grupo de tratamiento recibirá el nutracéutico Mico-Digest 2.0® y el grupo control recibirá un placebo. Dosis y posología 10,5 ml de nutracéutico por cada 70 kg de peso corporal. Cada paciente tomará la primera semana 1 toma de 10,5ml y 1 cápsula (de Mico-Digest 2.0® o placebo) al día antes del desayuno o la comida, las siguientes semanas tomará 2 tomas de 10,5ml y 2 cápsulas al día (1 toma de 10,5ml y 1 cápsula antes del desayuno y otra toma de 10,5ml y otra cápsula antes de la cena). El tratamiento se prolongará hasta el ingreso para la intervención (4-6 semanas). Régimen de visita: 1. Visita de reclutamiento. 2. Visita de inicio del tratamiento. Resultados 149 3. Visitas de seguimiento. 4. Visita de cierre. 5. Alta hospitalaria Tratamiento de rescate No se contempla Variables del estudio Variable principal:  Complicaciones globales durante el ingreso hospitalario. Variables secundarias:  Complicaciones (graves/leves, fallo anastomosis/ infección del sitio quirúrgico).  Efectos adversos asociados al tratamiento.  Modificaciones en la microbiota intestinal, perfil inflamatorio, perfil nutricional y calidad de vida durante la administración del tratamiento. Seguridad: Registro de eventos adversos (EA) Control de calidad: Según la normativa interna del promotor y el centro del estudio. Tratamiento estadístico: Análisis descriptivo de los pacientes incluidos/excluidos/ tratamiento realizado y de las variables de los pacientes incluidos. Análisis inferencial según la intención de tratar y por tratamiento realizado. Principal:  Tasa de complicaciones: Chi-cuadrado, RR y RAR. Secundarios:  Perfil de seguridad: Chi cuadrado, RR y RAR.  Microbiota intestinal: Medidas de cambio intrasujeto.  Patrón inflamatorio sistémico: ídem.  Perfil nutricional y calidad de vida: ídem.  Factores asociados a las complicaciones quirúrgicas: regresión logística. Aspectos éticos y legales: El estudio se realizará de acuerdo con las normativas internacionales sobre estudios clínicos: declaración de Helsinki, normas de Buena Práctica Clínica y autorización del CEIC correspondiente. Se seguirán las guías de la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM). CCR, cáncer colorrectal; CEIC, comité ético de investigación clínica; RAR, reducción absoluta del riesgo; RR, riesgo relativo. 151 6 DISCUSIÓN 6.1 PRÓLOGO Cada año, más de 10 millones de personas son diagnosticadas de cáncer. El pronóstico para el año 2020 calculó 6 millones de defunciones anuales debidas al cáncer, lo que supone el 12 % de las muertes en todo el mundo. El cáncer se ha convertido en la enfermedad mortal más importante de la actualidad. Dentro del total de muertes por cáncer, el cáncer colorrectal (CCR) supone el 9,2 %. 83, 176, 299, 349, 350, 361, 418, 425 De hecho, el CCR es una de las enfermedades más comunes en los países desarrollados y una de las principales causas de mortalidad, 154, 331, 361 un fenómeno asociado entre otros factores a la ingesta excesiva de calorías y al incremento de la obesidad en las sociedades occidentales. 172 Además de la quimioterapia y la radioterapia, la mayoría de los pacientes con CCR son sometidos a cirugía. Pero aproximadamente el 50 % desarrollan recurrencia 286 y alrededor del 90 % de las muertes relacionadas con cáncer colorrectal son debidas a metástasis. 483 Por lo tanto, resulta evidente que se requieren nuevas estrategias para el tratamiento de esta enfermedad. Una de estas nuevas estrategias es la que ofrece la micoterapia aplicada a la oncología integrativa. Desde sus albores, la humanidad ha utilizado los hongos como nutrientes, como agentes de fermentación y como medicinas. 109, 216, 251, 253, 367, 418 Pero en las últimas décadas los hongos han demostrado su capacidad de actuar como nutracéuticos, como complementos nutricionales y farmacológicos que proporcionan beneficios médicos para la salud, actuando como coadyuvantes a la terapia convencional. 169, 249, 362 Los hongos se han convertido gracias a las investigaciones más recientes en una maravillosa fuente de compuestos CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 254 485. Zhou G, Han C. The co-effect of vanadium and fermented mushroom of Coprinus comatus on glycaemic metabolism. Biol Trace Elem Res. 2008;124(1):20-27. DOI: 10.1007/s12011-0088118-7. 486. Zjalic S, Reverberi M, Ricelli A, Mario Granito V, Fanelli C, Adele Fabbri A. Trametes versicolor: a possible tool for aflatoxin control. Int J Food Microbiol. 2006;107(3):243-249. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2005.10.003. 487. Zjalic S, Reverberi M, Ricelli A, Scarpari M, Fabbri AA, Fanelli C. Control of mycotoxins in feeds by novel more environmental friendly strategies. In: Casasús I, Rogošiç J, Rosati A, Štokoviç I, Gabiña D, editors. Animal farming and environmental interactions in the Mediterranean region. EAAP – European Federation of Animal Sciences. Wageningen: Wageningen Academic Publishers; 2012. Vol 131. DOI: https://doi.org/10.3920/978-90-8686-741-7_23. 488. Zjawiony JK. Biologically active compounds from Aphyllophorales (polypore) fungi. J Nat Prod. 2004;67(2):300310. DOI: 10.1021/np030372w. 489. Zmitrovich IV, Belova NV, Balandaykin ME, Bondartseva MA, Wasser SP. Cancer without Pharmacological Illusions and a Niche for Mycotherapy (Review). Int J Med Mushrooms. 2019;21(2):105-119. DOI: 10.1615/IntJMedMushrooms.2019030047. 490. Zmitrovich IV, Bondartseva MA, Arefyev SP, Ezhov ON, Wasser SP. Profiles of Little-Known Medicinal Polypores: Funalia trogii (Agaricomycetes). Int J Med Mushrooms. 2018;20(7):657-664. DOI: 10.1615/IntJMedMushrooms.2018026564. 491. Zmitrovich IV, Ezhov ON, Ranadive KR, Wasser SP. Profiles of Little-Known Medicinal Polypores: Earliella scabrosa (Agaricomycetes). Int J Med Mushrooms. 2017;19(11):10231027. DOI: 10.1615/IntJMedMushrooms.2017024496. Bibliografía 255 492. Zong A, Cao H, Wang F. Anticancer polysaccharides from natural resources: a review of recent research. Carbohydr Polym. 2012;90(4):1395-1410. DOI: 10.1016/j.carbpol.2012.07.026. 493. Zou X, Jiang H, Lin J, Tang K. Cytotoxic activities of Coriolus versicolor (Yunzhi) extracts on human liver cancer and breast cancer cell line. African J Biotech. 2007;6(15):1740-1743. DOI: https://doi.org/10.5897/AJB2007.000-2255. 494. Zou YJ, Wang HX, Ng TB, Huang CY, Zhang JX. Purification and characterization of a novel laccase from the edible mushroom Hericium coralloides. J Microbiol. 2012;50(1):72-78. DOI: 10.1007/s12275-012-1372-6. 257 Glosario de siglas y abreviaturas 5-FU  5-fluorouracilo ADN  ácido desoxirribonucleico AKT  serina/treonina proteína quinasa ALT  alanina aminotransferasa AMPK  proteínas quinasas activadas por cAMP ANEFP  Asociación para el Autocuidado de la Salud AOM  azoximetano ARN  ácido ribonucleico ARNm  ARN mensajero ARNr  ARN ribosomal ARTOI  Asociación de la Investigación de Terapias Oncológicas Integrativas AST  aspartato aminotransferasa ATCC  American Type Culture Collection BrdU  bromodesoxiuridina CAM  productos medicinales complementarios y alternativos CAPOX  capecitabina + oxaliplatino CCR  cáncer colorrectal CD  cúmulo de diferenciación CDR  cantidad diaria recomendada CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 258 CECT  Colección Española de Cultivos Tipo CIPN  neuropatía periférica inducida por la quimioterapia COX  ciclooxigenasa CR  receptor del complemento CRD  cuaderno de recogida de datos CTL  linfocito T citotóxico CYP450  citocromo P450 DC  células dendríticas DHT  dihidrotestosterona DMH  dimetilhidrazina DMSO  dimetilsulfóxido DSS  sodio sulfato de dextrano EA  evento adverso EBM  medicina basada en hechos (evidence based medicine) ECOG  Eastern Cooperative Oncology Group EFSA  Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (UE) ELISA  enzyme-linked immunosorbent assay ERK  quinasas reguladas por señales extracelulares ERα  receptor de estrógeno alfa ESMO  European Society for Medical Oncology FAK  quinasa de adhesión focal FDA  Food and Drug Administration (EE.UU.) FIP  proteína fúngica inmunomoduladora GMP  good manufacturing practices IC50  concentración inhibitoria media IFN-α  interferón alfa Glosario de siglas y abreviaturas 259 IFN-γ  interferón gamma IL  interleucina IP  intraperitoneal JNK  quinasa c-Jun N-terminal LAK  células NK activadas por linfoquinas LSN  límite superior de normalidad MAPK  proteína quinasa activada por mitógenos MASCC  Multinational Association for Supportive Care in Cancer MHG  microwave hydrodiffusion and gravity MMP  metaloproteinasa de matriz extracelular MNM  medio nutritivo Melin-Norkranks modificado MRB  modificador de la respuesta biológica MTC  medicina tradicional china MTT  3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro NADP  nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NCCIH  National Center for Complementary and Integrative Health (EE.UU) NF-κB  factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas NGF  factor de crecimiento nervioso NIH  National Institutes of Health (EE.UU.) NK  células natural killer NOS  óxido nítrico sintasa OMS  Organización Mundial de la Salud ON  óxido nítrico CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 260 OTC  medicamentos no financiados sin receta PAMP  patrones moleculares asociados a patógenos PDA  potato dextrose agar PG-SGA  Patient-Generated Subjective Global Assessment PRR  receptor de reconocimiento de patrones PSK  polisacárido K obtenido de Trametes versicolor (krestin) PSP  polisacárido P obtenido de Trametes versicolor (coriolan) SD  desviación estándar SEOM  Sociedad Española de Oncología Médica SM  síndrome metabólico SOD  superóxido dismutasa TGF-β  factor de crecimiento transformante beta Th  linfocito T helper TLR  receptor tipo toll TNF-α  factor de necrosis tumoral alfa UE  Unión Europea VEGF  factor de crecimiento endotelial vascular VIH  virus de la inmunodeficiencia humana VPH  virus del papiloma humano w/w  weight to weight (porcentaje en peso) βGR  receptor de β-glucano (dectina-1) Anexos Innovative technologies for the extraction of saccharidic and phenolic fractions from Pleurotus eryngii Paula Rodriguez-Seoanea, Beatriz Diaz-Reinosob,∗, Ma Jesus Gonzalez-Munozab, Catalina Fernandez de Ana Portelac, Herminia Domingueza,b a Departamento de Enxeñería Química, Universidade de Vigo (Campus Ourense), Edificio Politécnico. As Lagoas, 32004, Ourense, Spain b CITI-Universidade de Vigo, Parque Tecnolóxico de Galicia, Rúa Galicia Nº 2, 32900, Ourense, Spain c Hifas da Terra SL, Portamuiños, 7, 36154, Bora, Pontevedra, Spain https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S002364381831 0235?via%3Dihub Anexos 291 Lista de verificación para Tesis con animales de experimentación. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL ARRIVE Sí/no/NA página Título Sí Proporcionar una descripción tan exacta y concisa como sea posible sobre el contenido del trabajo. 1 Resumen Sí Proporcionar un resumen preciso de los antecedentes, los objetivos de la investigación, incluyendo detalles de la especie y cepa de los animales utilizados, métodos relevantes, hallazgos principales y conclusiones del estudio. 10 Antecedentes Sí Incluir suficientes antecedentes científicos (incluyendo las referencias pertinentes al trabajo anterior) a fin de comprender la motivación y el contexto para el estudio, y explicar las bases y el enfoque experimental. 21-82 Sí Explicar cómo y por qué la especie y el modelo animal utilizados permiten abordar los objetivos científicos y, cuando sea apropiado, la relevancia del estudio para la biología humana. 21-82, 85-86, 96-97 Objetivos Sí Describir claramente los objetivos primarios y secundarios del estudio, o las hipótesis específicas que se van a probar. 85-86 Declaración Ética Sí Indicar el permiso del comité ético, y las leyes o decretos pertinentes para el cuidado y uso de animales, bajo las que se realiza la investigación. 96-97 Diseño del estudio Sí Número de grupos experimentales y control. 99-100 Sí Cualquier medida adoptada para minimizar los efectos de sesgo subjetivo al asignar los animales a los grupos de tratamiento (por ej., procedimiento aleatorio) y al evaluar los resultados (por ej., si se hace, describir quiénes eran ciegos y cuándo). 99-100 Sí La unidad experimental (por ej., un solo animal, grupos o jaulas de animales). Un diagrama cronológico o de flujo pueden ser útiles para ilustrar cómo se realizaron los diseños de estudio complejos. 99-100 Procedimientos experimentales Sí Cómo (por ej., formulación y dosis del tratamiento, el sitio y la vía de administración, anestesia y analgesia utilizadas [incluyendo la monitorización], procedimiento quirúrgico, el método de eutanasia). Proporcionar detalles de cualquier equipo especializado utilizado, incluyendo proveedor(es). 99-100 NA Cuándo (por ej., la hora del día). NA Dónde (por ej., jaula de alojamiento, laboratorio, prueba del laberinto acuático). NA Por qué (por ej., fundamentos para la elección del anestésico específico, la vía de administración, dosis del fármaco utilizado). CATALINA FERNÁNDEZ DE ANA PORTELA 292 Sí/no/NA página Animales de experimentación Sí Proporcionar detalles de los animales utilizados, incluyendo especie, cepa, sexo, etapa de desarrollo (por ej., edad media o mediana de edad y rango) y peso (por ej., media o mediana más rango de peso). 99 NA Proporcionar otra información pertinente, como la procedencia de los animales, nomenclatura internacional de la cepa, modificación genética (por ej., animal deficiente o transgénico), genotipo, estado de salud/inmune, si los animales han sido incluidos en estudios o recibido tratamientos anteriormente, procedimientos previos, etc. Animales NA Alojamiento (tipo de instalación por ej., libre de patógenos específicos [SPF], tipo de jaula o habitáculo, material del lecho, número de animales por jaula, forma y material del tanque, etc. para peces). NA Condiciones de cría (por ej., programa de reproducción, ciclo de luz/oscuridad, temperatura, calidad de agua, etc. para peces, el tipo de alimentación, el acceso a los alimentos y al agua, enriquecimiento ambiental). Sí Evaluaciones e intervenciones relacionadas con el bienestar que se llevaron a cabo antes, durante o después del experimento 99 Tamaño de la muestra Sí Especificar el número total de animales utilizados en cada experimento, y el número de animales en cada grupo experimental. 99 Sí Explicar cómo se determinó el número de animales. Proporcionar detalles del cálculo del tamaño muestral utilizado. 99 NA Indicar el número de repeticiones independientes de cada experimento, si es pertinente. Asignación de animales a grupos experimentales Sí Proporcionar detalles completos de la forma en que los animales fueron asignados a grupos experimentales, incluyendo distribución aleatoria o asignación específica, si así se hizo. 99-100 NA Describir el orden en el que los animales en los diferentes grupos experimentales fueron tratados y evaluados. Sí Resultados experimentales 12 Definir claramente los resultados primarios y secundarios evaluados (por ej., muerte celular, marcadores moleculares, cambios de comportamiento). 96-104 Métodos estadísticos Sí Proporcionar detalles sobre los métodos estadísticos utilizados para cada análisis. 104 Sí Especificar la unidad de análisis para cada grupo de datos (por ej., un solo animal, grupo de animales, neurona individual). 104 Sí Describir los métodos utilizados para evaluar si los datos corroboran las suposiciones del método estadístico. 104 Anexos 293 Sí/no/NA página Datos basales Sí Para cada grupo experimental, indicar las características relevantes y estado de salud de los animales (por ej., peso, estado microbiológico, si los animales han sido incluidos en estudios o recibido drogas anteriormente) antes de iniciar el tratamiento o prueba. (Esta información puede ser a menudo tabulada). 99-100 Cantidades analizadas Sí Indicar el número de animales en cada grupo incluido en cada análisis. Presentar números absolutos (por ej., 10/20, no 50 %2). 99 Sí Si alguno de los animales o datos no fue incluido en el análisis, explicar por qué. 130 Resultados y Discusión Sí Indicar los resultados de cada análisis llevado a cabo, con una medida de precisión (por ej., error estándar o intervalo de confianza). 131-136 Eventos adversos Sí Dar detalles de todos los eventos adversos importantes en cada grupo experimental. 130 Sí Describir las modificaciones a los protocolos experimentales realizadas para reducir los eventos adversos. 130 Interpretación /implicaciones científicas Sí Interpretar los resultados, teniendo en cuenta los objetivos y las hipótesis del estudio, la teoría actual y otros estudios pertinentes en la literatura. 130142, 174-178 Sí Comentar las limitaciones del estudio incluyendo cualquier fuente potencial de sesgo, cualquier limitación del modelo animal y la imprecisión asociada con los resultados 174-178 NA Describir cualquier implicación de los métodos experimentales o hallazgos para el reemplazo, refinamiento o reducción (las 3 R) del uso de los animales en investigación. Capacidad de generalización/aplicabilidad Sí Comentar si, y de qué forma, los hallazgos de este estudio son aplicables a otras especies o sistemas, incluyendo cualquier relevancia para la biología humana. 174-178 Financiación Sí Listar todas las fuentes de financiación (incluyendo el número del proyecto) y el papel de la fuente(s) de financiación en el estudio. 106 Basado en The ARRIVE guidelines: Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments. Firma doctorando Visto bueno CAPD Catalina Fernández de Ana Portela Tesis doctoral TESIS MICOTERAPIA APLICADA EN ONCOLOGÍA INTEGRATIVA. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente La micoterapia oncológica, es decir, el uso de los hongos como nutracéuticos en el campo de la oncología integrativa, responde a una demanda social, clínica y económica de incuestionable envergadura. La presente tesis doctoral presenta y analiza resultados preclínicos que muestran las propiedades antitumorales de los extractos fúngicos desarrollados por la empresa Hifas da Terra, y su potencialidad como terapia coadyuvante en pacientes con cáncer colorrectal. Así mismo, delinea el protocolo de un ensayo clínico para evaluar los efectos beneciosos de los extractos de hongos en la calidad de vida de los pacientes oncológicos. 2021 Micoterapia aplicada en oncología integrativa. La aplicación de extractos de hongos con capacidad medicinal en el tratamiento de cáncer colorrectal para mejorar la calidad de vida y el pronóstico del paciente Santiago de Compostela, 2021 Catalina Fernández de Ana Portela Catalina Fernández de Ana Portela PD en Investigación Clínica en Medicina ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC