Adaptacións ás alteracións da parede celular en Arabidopsis Thaliana

1 TRABALLO DE FIN DE GRAO GRAO EN BIOLOXÍA ADAPTACIÓNS ÁS ALTERACIÓNS DA PAREDE CELULAR EN Arabidopsis thaliana Kai Lois Baltrusch Montero Curso 2019-2020 2 ÍNDICE 1. RESUMO ................................................................................................................................... 3 2. INTRODUCIÓN ....................................................................................................................... 3 2.1. Compoñentes da parede celular primaria ................................................................ 3 2.2. Dinámica e función da parede celular primaria ...................................................... 5 2.3. Modelos estruturais da parede celular primaria ...................................................... 6 2.4. Efectos da alteración e disrupción de compoñentes da parede celular primaria ... 8 3. OBXECTIVOS .......................................................................................................................... 9 4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 10 4.1. Material vexetal e técnicas de cultivo ..................................................................... 10 4.2. Extracción de ARN, RT-PCR e clonación dos xenes de interese no vector pMDC7 ......................................................................................................................................... 10 4.3. Transformación de Agrobacterium e Arabidopsis thaliana .................................. 11 4.4. Selección das liñas transxénicas............................................................................. 12 4.5. Experimentos de indución por estradiol ................................................................. 12 4.7. Análise estatística .................................................................................................... 13 5. RESULTADOS E DISCUSIÓN ............................................................................................. 13 5.1. Obtención de liñas transxénicas de sobreexpresión inducible por estradiol ........ 13 5.2. Efectos sobre a lonxitude dos hipocótilos da complementación inducida pMDC7:XXT2 sobre xxt1xxt2 ....................................................................................... 13 5.3. Cuantificación de XiG en liñas transxénicas pMDC7:XXT2 sobre xxt1xxt2 ...... 15 5.4. Efectos da expresión inducida indPGX2 sobre Col e xxt1xxt2 sobre a lonxitude dos hipocótilos ................................................................................................................ 16 6. CONCLUSIÓNS ..................................................................................................................... 17 7. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 18 3 1. RESUMO As paredes celulares primarias de plantas conforman unha estrutura moi dinámica e versátil implicada na regulación do crecemento. Están compostas principalmente por celulosa, pectinas e hemicelulosas como o xiloglucano (XiG). Analizar os efectos da alteración ou eliminación experimental dun ou varios destes compoñentes, permite achegarnos á comprensión da estrutura, dinámica e función da parede primaria. É obxecto deste estudo investigar as respostas de Arabidopsis thaliana fronte ás alteracións da parede primaria, producidas mediante mutantes sen XiG e liñas de sobreexpresión inducible por estradiol. Constatáronse diferenzas significativas claras no crecemento de hipocótilos etiolados, entre mutantes sen XiG e liñas complementadas, o que indica posibles efectos do XiG sobre a extensibilidade (aínda que os resultados non descartan que poida deberse a outros factores). Ademais observouse que o debilitamento moderado da rede de pectinas leva a un crecemento de hipocótilos etiolados significativamente maior respecto ao silvestre. Resultados pouco congruentes suxeriron tamén que a disrupción combinada de XiG e pectinas podería aumentar o crecemento de hipocótilos por un debilitamento maior da parede, o que indicaría a existencia dun posible efecto compensatorio entre as redes de pectina e XiG. Por outra banda, foi implementado con éxito un protocolo de extracción e cuantificación de XiG. 2. INTRODUCIÓN A día de hoxe, moitos aspectos da estrutura tridimensional das paredes celulares primarias de plantas continúan sen estar de todo dilucidados. Isto débese tanto á constitución amorfa, insoluble e complexa dos compoñentes contidos nas paredes, como ás interaccións, xeralmente non-covalentes, dos seus polímeros (Cosgrove, 2018). O papel clave das paredes no crecemento celular sitúa as investigacións entorno a este ámbito baixo o foco dun interese biotecnolóxico innegable (Albersheim, 2011). Este estudo trata de analizar o rol de determinados compoñentes da parede celular primaria e o seu encaixe nos modelos estruturais propostos até o momento. 2.1. Compoñentes da parede celular primaria A parede primaria de Arabidopsis thaliana está formada por un 42% de pectinas, 24% de hemicelulosas e un 14% de celulosa (Zablackis et al., 1995). As microfibras de celulosa da parede primaria constitúen o principal soporte mecánico. Cada unha das microfibras está composta por 18 cadeas lineais de β(1,4)-glucano. Son sintetizadas por unha asociación de complexos proteicos hexaméricos en roseta (proteínas CESA) embebidos na membrana plasmática. Xunto con outras proteínas asociadas, conforman o Complexo Celulosa Sintase (CCS) (McFarlane et al., 2014). Cada microfibra orixínase do enfeixamento e cristalización espontánea das cadeas de glucano que son secretadas polo CCS ao apoplasto. É probable que neste proceso de secreción, moléculas hemicelulosas e pectinas 4 queden atrapadas entre as microfibras (Cosgrove, 2005; Lampugnani et al., 2018). As pectinas son un grupo diverso e complexo de polisacáridos interconectados e sintetizados no aparello de Golgi. Están compostas principalmente por tres polisacáridos: Homogalacturonano (HG), rhamnogalacturonano I (RG-I) e rhamnogalacturonano II (RG-II). O compoñente principal destes polisacáridos é o ácido galacturónico (GalA). En Arabidopsis thaliana, a pectina máis abundante é o HG (23%), seguida de RG-I (11%) e RG-II (8%). HG e RGII presentan un esqueleto polimérico de α(1,4)-GalA. RG-I consiste nun motivo repetido de α(1,4)-GalA e α(1,2)- rhamnosa. Estes esqueletos poliméricos poden presentar ramificacións de diferentes heteropolisacáridos ou oligosacáridos como α(l,5)-arabinanos e β(1,4)-galactanos, así como distintos graos de acetilación e metilación. A complexidade química das pectinas supón a implicación na súa síntese dun amplo número de transferases, moitas delas aínda sen describir (Gigli-Bisceglia et al., 2019). As pectinas están interconectadas formando unha matriz de enlaces covalentes e non covalentes. Probablemente están conectadas de xeito covalente a través dos seus esqueletos centrais, como se suxeriu para HG e RG-I (Saffer, 2018). Por outra banda, os HGs transportados dende o aparello de Golgi á parede deesterifícanse de maneira selectiva, permitindo a formación de enlaces cruzados entre os grupos carboxilos resultantes vía Ca2+ e promovendo unha estrutura de xel (Hongo et al., 2012). RG-II pode presentar enlaces cruzados entre si, vía borato (Funakawa e Miwa, 2015). As pectinas están en íntimo contacto e interactúan amplamente coa celulosa e en menor medida coas hemicelulosas, principalmente a través das súas ramificacións, tanto por un bloqueo físico como por interaccións non covalentes (Gigli-Bisceglia et al., 2019). En conxunto, todos estes enlaces e interaccións dotan a matriz dunha maior rixidez permitindo estabilizar a estrutura da parede (Lampugnani et al., 2018). Desta maneira, as pectinas inflúen sobre a dinámica da parede mediante o control da súa flexibilidade e son, polo tanto, determinantes no crecemento e na proliferación celular. A variación na composición e modificación de pectinas entre distintas células e tecidos pode influír sobre diferentes dinámicas de crecemento que guían o desenvolvemento (Saffer, 2018). En canto á sinalización celular, as pectinas destacan por ser dianas de ataque de moitos patóxenos. Os produtos da súa degradación son importantes elicitores nas respostas de defensa de plantas. A modificación e degradación controlada de pectinas é fundamental en procesos de maduración de froitos así como en procesos de abscisión e de separación de células (Gigli-Bisceglia et al., 2019). Poligalacturonases (PG) e pectato liases (PL) son enzimas degradantes de pectinas que interveñen na modulación destes procesos e durante o desenvolvemento e a morfoxénese, polo que alteran a estrutura da parede (Xiao et al., 2017). As hemicelulosas son polisacáridos secretados ao apoplasto e sintetizados por glicosiltranferases localizadas na membrana do aparello de Golgi. A hemicelulosa máis abundante das paredes primarias de espermatófitas (excepto 5 gramíneas e familias próximas) é o XiG, que representa un 10-20% das hemicelulosas da parede primaria de dicotiledóneas como Arabidopsis thaliana. Presenta o mesmo esqueleto central que a celulosa, β(1,4)-glucano, pero diferénciase en que 3 de cada 4 residuos de glicosa (2 de cada 4 en monocotiledóneas comelínidas) presentan ramificacións laterais de xilosa. Á súa vez, a xilosa pode presentar substitucións de fucosa e galactosa. Estas ramificacións dotan o XiG de solubilidade. As ramificacións e modificacións que presentan evitan o enfeixamento lateral e a formación de microfibras, que si se observan na celulosa. A complexidade da biosíntese do XiG e das súas ramificacións implica a participación de moitas enzimas diferentes. Sintases da familia Celulose Synthase-Like C (CSLC) actúan como β(1,4)-glucano sintases (utilizando UDP-glicosa como substrato) e producen o esqueleto central. XiG-xilosiltransferases (XXTs) levan a cabo substitucións de xilosa no XiG (Scheller e Ulvskov, 2010; Gigli-Bisceglia et al., 2019). As cadeas de XiG poden atoparse atrapadas entre as microfibras de celulosa ou unirse á celulosa mediante pontes de hidróxeno in vivo especialmente en zonas hidrofóbicas, i.e., nos puntos de enfeixamento lateral das microfibras de celulosa, constituíndo conexións XiG-celulosa cuxas modificacións probablemente afecten á rixidez da parede e desta forma ao crecemento celular (Zhang et al., 2016). Tamén se propuxeron enlaces covalentes entre XiG-celulosa (Shinohara et al., 2017) e XiG-pectinas (Popper e Fry, 2008). Outras hemicelulosas menos abundantes en espermatófitas en xeral, e Arabidopsis thaliana en concreto, son os xilanos e os mananos; excepto no caso de gramíneas e familias próximas, nas que os xilanos son a hemicelulosa máis abundante. Xilanos, mananos e XiGs, igual que as pectinas, presentan distintos graos de acetilación (Scheller e Ulvskov, 2010). A renovación de XiG parece xogar un papel na remodelación da parede e a expansión celular. En Arabidopsis thaliana, estes procesos están mediados por determinadas XiG-endotransglicosidases/hidrolases (XTH) (Gigli-Bisceglia et al., 2019). Fragmentos de XiG liberados por degradación, de maneira semellante ás pectinas, funcionan como elicitores nas respostas de defensa fronte a patóxenos (Claverie et al., 2018). 2.2. Dinámica e función da parede celular primaria A parede primaria atópase sometida a estímulos do ambiente e ao control de programas de desenvolvemento. É unha estrutura o suficientemente forte como para resistir ás forzas de tensión xeradas pola presión de turxescencia. O crecemento celular ocorre acorde co balance entre a presión de turxescencia e as propiedades mecánicas da parede. Cando a célula crece, a parede estira de forma irreversible nun proceso de expansión mediado por cambios do seu pH que inflúen sobre a acción distensora de axentes modificantes como as expansinas. A proximidade física entre a membrana e a parede primaria permite unha rápida modulación da súa extensibilidade por vía de H+- ATPases da membrana que inflúen sobre o pH da parede (Cosgrove, 2018). 6 O crecemento celular require unha modificación selectiva da estrutura da parede celular que relaxe a presión de turxescencia, permitindo a entrada de auga para facer medrar a célula até restaurar dita presión. Enténdense como "afrouxamento" os procesos moleculares que permiten este relaxamento e que determinan unha extensión irreversible da parede, o cal sempre precisa de intervención proteica; as expansinas serían os axentes afrouxantes mellor coñecidos. Por outra banda, enténdese como "abrandamento" os procesos que converten a parede en moldeable baixo forzas mecánicas (i.e. alteración da plasticidade e elasticidade), o que non significa necesariamente un maior crecemento celular (e.g. en estadios tardíos da maduración, moitos froitos abrandan a medida que as pectinas das súas paredes comezan a desintegrarse, sen que isto supoña crecemento). Plasticidade e extensibilidade implican deformacións irreversibles, mentres que a elasticidade implica deformacións reversibles (Cosgrove, 2018). A extensión da parede implica deslizar, separar e reorientar as microfibras de celulosa, e tanto o xiloglucano (XiG) como as pectinas parecen xogar un papel importante na regulación deste proceso (Zhang et al., 2016). Por outra banda, compoñentes coma as glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs) tamén teñen certa influencia sobre o crecemento e morfoloxía da parede (Nguema-Ona et al., 2014). O crecemento celular non só vén determinado por factores bioquímicos que remodelan a parede, senón que tamén depende de factores como a presión de turxescencia, a xeometría celular ou as células veciñas. As propiedades anisotrópicas entre diferentes zonas da parede de células individuais, ou entre paredes de células diferentes, son claves para orixinar a diversidade morfolóxica observada en células e tecidos de plantas. Conceptualizar e entender o impacto de todos estes factores no contexto tisular é fundamental para dilucidar a maneira na que se modula o crecemento durante a morfoxénese dos tecidos multicelulares (Bassel et al., 2014; Saffer, 2018). 2.3. Modelos estruturais da parede celular primaria Un dos primeiros modelos estruturais propostos entendía a parede celular primaria como unha complexa e única macromolécula, composta por polisacáridos e proteínas, na que os seus compoñentes estarían interconectados por enlaces covalentes, excepto as unións entre XiG-celulosa (Keegstra et al., 1973). Porén, dado que este modelo non explicaba a extracción secuencial dos polisacáridos da parede, xurdiron novos modelos coma o denominado "modelo multicapa" (multicoat model), no cal as hemicelulosas formarían a capa máis profunda e estreitamente enlazada, seguida de capas externas menos interconectadas e de maior facilidade de extracción, coma as pectinas. Outro modelo contemporáneo a este, coñecido como "modelo de rede pegañenta" (sticky network model), e baseado tamén nas interaccións non-covalentes, destacaba a posible importancia de "glucanos interconectantes" (tethering glicans) como elementos de interconexión entre microfibras de celulosa; chegou a converterse no modelo aceptado 7 de forma máis ampla durante varios anos (Cosgrove, 2000). En base a el, fóronse desenvolvendo estudos que suxerían a existencia dunha rede de microfibras de celulosa con enlaces cruzados non covalentes mediados por hemicelulosas (principalmente XiG) e que constituiría o soporte principal da parede primaria, embebido nunha matriz separada de pectinas (Carpita e Gibeaut, 1993). Segundo este modelo, a modificación de XiG ou da rede XiG-celulosa sería un dos principais mecanismos de control do crecemento da parede, a través da acción de expansinas-α, XiG-endotransglicosidases ou β-1,4-endoglicanases (Cosgrove, 2005). Con todo, estudos posteriores puxeron en dúbida este modelo: Mutantes de Arabidopsis thaliana sen XiG son viables e presentan un fenotipo de crecemento reducido ( Cavalier et al., 2008; Park e Cosgrove, 2012a). Estudos nos cales se realizou unha retirada enzimática de XiG (Park e Cosgrove, 2012b) e estudos de microscopía de forza atómica, nos que se analizaron os movementos de paredes primarias en expansión (Zhang et al., 2017), tamén cuestionan este modelo. Isto suxire que o papel das hemicelulosas na estruturación da parede celular non resulta ser tan esencial como se supuña inicialmente (Wang et al., 2015). En contraste co modelo anterior, propúxose recentemente un modelo de parede celular primaria que consistiría nunha rede fibrilar interconectada vía un enfeixamento lateral, no que a transferencia de forzas entre as microfibras da parede ocorrería a través de unións estreitas celulosa-celulosa; zonas onde as microfibras de celulosa presentarían o referido enfeixamento lateral (Zhang et al., 2016; Daniel J. Cosgrove, 2018). Adicionalmente, algunhas destas unións celulosa-celulosa están mediadas por XiG, a través de pontes de hidróxeno unidas preferentemente a zonas hidrofóbicas. Isto converte estas unións en susceptibles a afrouxamentos da tensión de parede, mediante enzimas ou outras proteínas que selectivamente se dirixan a estes sitios e que inducirían unha rápida extensión irreversible das paredes (Park e Cosgrove, 2012b; Zhang et al., 2016). Estudos recentes suxiren que o afrouxamento, o abrandamento e outras propiedades da parede celular son procesos independentes, que se atopan definidos por distintos aspectos da estrutura e, seguramente, por diferentes compoñentes da parede celular. Seguindo esta liña, sinálase que a mecánica de tensións da parede (producidas dentro do plano lamelar) depende principalmente das redes de celulosa, mentres que a mecánica de indentación (deformacións que se saen do plano lamelar) depende tanto das redes de celulosa coma do homogalacturonano. Polo tanto, as zonas de enfeixamento lateral celulosa-celulosa, serían puntos quentes biomecánicos, e o seu afrouxamento liberaría as tensións e permitiría a extensión irreversible da parede celular (Zhang et al., 2019). En definitiva, o modelo de parede primaria actual describe unha parede cunha organización lamelar de redes microfibrilares de celulosa máis ou menos estables, rodeadas dunha matriz de polisacáridos metabolicamente máis activos. Cada lamela presenta microfibras dispostas paralelamente e interconectadas nalgúns puntos a través de 8 enfeixamentos laterais, formando unha reticulación anisótropa. En cada lamela a dirección das microfibras de celulosa varía, estando separadas entre si uns 40nm e embebidas nunha matriz de pectinas que estabilizan a súa mobilidade lateral. Hemicelulosas e pectinas estarían unidas en distinta proporción ás microfibras, sendo de maior importancia as unións pectina-celulosa. Hemicelulosas como o XiG intervirían nalgunhas das unións entre estas microfibras (Fig. 1) (Cosgrove, 2018; Zhang et al., 2019). 2.4. Efectos da alteración e disrupción de compoñentes da parede celular primaria En condicións silvestres, as plantas en xeral e Arabidopsis thaliana en concreto, sofren modificacións da súa parede primaria. Unha vez segregadas ao apoplasto ou integradas na parede, tanto celulosa, hemicelulosas como pectinas poden ser modificadas in vivo. En comparación cos demais compoñentes da parede celular, as pectinas degrádanse con maior facilidade ante situacións de estrés ambiental. Exemplo disto son a mobilización de carbohidratos dende as pectinas durante períodos de desnutrición ou a degradación de pectina inducida por patóxenos. Tanto pectinas intactas como fragmentos de pectina presentan receptores quinase na membrana plasmática, indicando que a integridade das pectinas está notablemente monitoreada polas células (Gigli-Bisceglia et al., 2019). A perda de función do xen PGX1 resulta en hipocótilos máis curtos e a sobreexpresión de PGX2 aumenta lixeiramente a lonxitude dos mesmos; ambos son xenes codificantes de poligalacturonases, o que indica que estas enzimas xogan un papel importante na modulación da dinámica e función da parede (Xiao et al., 2014; Xiao et al., 2017). A inactivación artificial de XXT1 e XXT2, dous xenes redundantes de Arabidopsis thaliana que codifican para a XiG-xilosiltransferase XXT, causa fenotipos sen XiG. Observouse que plántulas mutantes de Arabidopsis thaliana sen XiG (xxt1xxt2) presentaban pelos radicais anómalos e inchados, ademais de hipocótilos máis curtos. Plantas Figura 1. Modelo gráfico dunha lamela da parede primaria. As microfibras de celulosa están representadas con caras hidrofóbicas (azul) e caras hidrofílicas (laranxa). O XiG (verde) atópase unido ás zonas hidrofóbicas das microfibras. As frechas vermellas indican zonas de enfeixamento lateral celulosa-celulosa nas que intervén o XiG. As pectinas (amarelo) ocupan o espazo entre microfibras e únense ás superficies hidrofílicas. Adaptado de Cosgrove, 2018. 9 xxt1xxt2 adultas carecen de XiG detectable e presentan fenotipos de crecemento reducido, tipicamente con rosetas de menor tamaño e pecíolos máis curtos, xunto con paredes celulares con máis plasticidade e elasticidade, pero menor extensibilidade; en comparación cos controis salvaxes (Park e Cosgrove, 2012a). Ademais, presentan alteracións na mecánica estomatal (Rui e Anderson, 2016), desorganización nos microtúbulos corticais, hipocótilos curtos (Xiao et al., 2016), irregularidade na disposición das microfibras de celulosa (Anderson et al., 2010) e unha resposta a pH ácido ou a expansina-α reducida. Todo isto posiblemente tamén indique un certo rol do XiG na modulación das propiedades biomecánicas da parede (Park e Cosgrove, 2012a). A expresión de OsXXT1 en Arabidopsis thaliana rescata os defectos nos pelos radicais de mutantes xxt1xxt2, indicando que os xenes XXT están altamente conservados (Gigli-Bisceglia et al., 2019). A influencia do XiG sobre a extensibilidade podería deberse ao seu papel clave en zonas de enfeixamento lateral de microfibras de celulosa, consistindo nunha diana para proteínas que permitan o afrouxamento dos puntos quentes biomecánicos e que liberarían as tensións necesarias para permitir unha maior extensión irreversible da parede celular (Zhang et al., 2019). A ausencia de XiG, xunto coa aparición de mecanismos compensatorios, podería ser o motivo polo que se reduce a extensibilidade (Park e Cosgrove, 2012a). Estudos nos que se ensaiaron tratamentos combinados de hidrolases, que degradaban celulosa ou XiG, resultaron en alteracións na elasticidade e na plasticidade da parede pero non na extensibilidade. Concluíuse que para afectar este parámetro, é precisa a acción de enzimas bifuncionais (e.g. Cel12A, unha β-1-4-endoglicanase de fungos) ou proteínas como expansinas-α que actúen selectivamente sobre XiG e celulosa, en zonas estruturalmente inaccesibles para outras enzimas; que se corresponderían con puntos quentes biomecánicos descritos anteriormente (Zhang et al., 2019). A sobreexpresión de XiG-hidrolases (XTH31-XTH32) por si soa non ten efectos notorios sobre a extensibilidade da parede xa que é preciso un proceso de afrouxamento dos puntos quentes biomecánicos que require unha acción enzimática bifuncional (endoglicanase e celulase) ou de proteínas especializadas como as expansinas-α (Kaewthai et al., 2013; Park e Cosgrove, 2015). As alteracións de pectinas e XiG posiblemente sexan percibidas pola célula e poderían resultar en axustamentos compensatorios no programa de desenvolvemento (Park e Cosgrove, 2012a; Saffer, 2018). 3. OBXECTIVOS O principal obxectivo deste traballo é estudar diferentes modos de disrupción ou complementación inducible de compoñentes da parede celular, para caracterizar as respostas fenotípicas de Arabidopsis thaliana no marco teórico 16 chegan aos valores do silvestre (Col). En cambio, os mutantes sen XiG ou as liñas transxénicas non inducidas, presentan valores de absorbancia baixos, asociados á ausencia de XiG. 5.4. Efectos da expresión inducida indPGX2 sobre Col e xxt1xxt2 sobre a lonxitude dos hipocótilos Para analizar o efecto de perturbacións moderadas da rede XiG-pectinas, empregouse a sobreexpresión inducida da poligalacturonase PGX2. Comparáronse as plántulas etioladas de 6 días de idade, de liñas transxénicas pMDC7:PGX2 sobre Col e sobre xxt1xxt2, cos controis Col e xxt1xxt2, respectivamente. As plántulas foron cultivadas con DMSO ou estradiol. As liñas transxénicas utilizadas tiñan un número descoñecido de insercións, podendo ser isto unha explicación para a variación das lonxitudes entre as mesmas. No caso de pMDC7:PGX2 sobre Col obsérvanse diferenzas significativas entre todas as liñas transxénicas crecidas con estradiol fronte ás que se creceron con DMSO (L1: **P=0,0064; L2: **P=0,0096; L3: *P=0,0478) (Fig. 3A). Probablemente isto indique un éxito na indución da expresión de PGX2, que produciría o afrouxamento da parede celular e favorecería a extensibilidade. Estes resultados son consistentes coas conclusións doutros estudos similares nos que marcaxes de activación (activation tagging) de PGX2 en Col, que implicaban a sobreexpresión deste xen, producían hipocótilos un pouco máis longos (Xiao et al., 2017). Polo tanto, confirmaríase a hipótese de que este debilitamento moderado da parede celular está asociado a un maior crecemento celular. No caso das liñas pMDC7:PGX2 sobre xxt1xxt2, non se observaron diferenzas significativas entre os tratamentos (L1: P=0,2785; L2: P=0,0632) (Fig. 3B). Aínda así, as mostras crecidas con estradiol presentan lonxitudes lixeiramente maiores. Cabe destacar que os valores mostrais foron extremadamente baixos (n≤6), polo que non se pode chegar a ningunha conclusión clara. En xeral, en todos os experimentos, as sementes do control xxt1xxt2 ou as transxénicas cun fondo xxt1xxt2 mostraron taxas de xerminación moi baixas, posiblemente debido á falta de XiG que produciría algún efecto descoñecido. Á vista dos resultados, non se pode comprobar a hipótese de que a perturbación combinada da rede XiG-pectinas dificultase máis o crecemento por activación dun posible efecto compensatorio que aumente a rixidez da parede. Si se pode intuír que este debilitamento engadido podería producir Táboa 2. Resultados do experimento de cuantificación de XiG. 3 e 8 son mostras de dúas liñas transxénicas distintas de pMDC7:XXT2 sobre xxt1xxt2 que foron cultivadas con DMSO (D) ou estradiol (E). Liña [XiG] estimada (µg/mL) Col 201,92 indXXT2-3E 69,71 indXXT2-8E 52,88 indXXT2-3D 24,04 indXXT2-8D -14,42* *O valor negativo débese á normalización da absorbancia con respecto ao branco (extracto de xxt1xxt2). 17 unha maior extensibilidade da parede, e polo tanto, maior crecemento dos hipocótilos inducidos (a pesar de que o control xxt1xxt2 tamén mostre estas diferenzas). Para comprobar cal das hipóteses plantexadas podería ser correcta (crecemento maior por un debilitamento maior da parede, ou ben crecemento menor por activación dun mecanismo compensatorio) será preciso optimizar o experimento, por exemplo con sementes máis frescas que dén taxas de xerminación maiores. Os resultados agardados das liñas inducibles sobre un fondo xxt1xxt2 deberían ser consistentes con estudos in vitro nos que se observa unha maior extensibilidade da parede en mutantes xxt1xxt2 (en comparación co silvestre) cando a rede de pectinas se degrada enzimaticamente ou se modifica con quelantes de Ca2+ (Park e Cosgrove, 2012a). O que podería suxerir tamén que en ausencia de XiG as pectinas xogan un papel máis importante na manutención da rixidez, soporte e dinámica da parede, exercendo un efecto compensatorio. Existen varias evidencias noutros estudos que apoian a hipótese dos mecanismos compensatorios da rede XiG-pectinas: plántulas xxt1xxt2 etioladas teñen unha moi baixa proporción de residuos de rhamnosa substituídos cunha cadea lateral (Cavalier et al., 2008), indicando que en ausencia de XiG a estrutura de RG-I é remodelada en prol dun efecto compensatorio (Saffer, 2018); de xeito análogo, plantas con niveis anormalmente baixos de HG presentan XiGs máis ríxidos, suxerindo que o XiG tamén podería ser modificado para adaptarse aos defectos na función das pectinas (Phyo et al., 2017). 6. CONCLUSIÓNS Á vista dos resultados, non podemos comprobar completamente a hipótese de que o XiG estea xogando algún papel na extensibilidade da parede e que inflúa no crecemento celular, pero si observamos diferenzas significativas claras Figura 3. Cuantificación da lonxitude de hipocótilos de plántulas etioladas de 6 días de idade. Os datos foron presentados como media ± desviación estándar (DE), as barras de erro representan a DE. As letras indican diferenzas significativas. A, Col (silvestre) e L1/L2/L3 (distintas liñas transxénicas pMDC7:PGX2 sobre Col) foron cultivadas con estradiol ou con DMSO. B, xxt1xxt2 (mutante sen XiG) e L1/L2 (distintas liñas transxénicas pMDC7:PGX2 sobre xxt1xxt2) foron cultivadas con estradiol ou con DMSO. 18 no crecemento de hipocótilos etiolados, entre mutantes sen XiG e liñas complementadas, que indican posibles efectos do XiG sobre a extensibilidade. Confírmase a hipótese de que o debilitamento moderado da rede de pectinas leva a un crecemento de hipocótilos etiolados significativamente maior respecto ao silvestre. Sen embargo, non se obtiveron resultados congruentes sobre a disrupción combinada de XiG e pectinas. Si foi implementado con éxito un protocolo de extracción e cuantificación de XiG. En definitiva, a obtención exitosa de liñas transxénicas de expresión inducible por estradiol, servirá para futuros cruces que xeren mutantes combinados con maiores efectos disruptores sobre a parede e que axuden a dilucidar a función dos seus compoñentes. Xunto a isto, será preciso investigar a síntese e modificación da parede e a maneira na que responde fronte a estímulos do desenvolvemento e do ambiente, para poder comprender mellor a súa estrutura e a regulación do seu crecemento. 7. BIBLIOGRAFÍA Albersheim, P. (Ed.), 2011. Plant cell walls: from chemistry to biology. Garland Science, New York, NY. Anderson, C.T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C., 2010. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787–796. Bassel, G.W., Stamm, P., Mosca, G., Barbier de Reuille, P., Gibbs, D.J., Winter, R., Janka, A., Holdsworth, M.J., Smith, R.S., 2014. Mechanical constraints imposed by 3D cellular geometry and arrangement modulate growth patterns in the Arabidopsis embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 8685–8690. Carpita, N.C., Gibeaut, D.M., 1993. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1–30. Cavalier, D.M., Lerouxel, O., Neumetzler, L., Yamauchi, K., Reinecke, A., Freshour, G., Zabotina, O.A., Hahn, M.G., Burgert, I., Pauly, M., Raikhel, N.V., Keegstra, K., 2008. Disrupting Two Arabidopsis thaliana Xylosyltransferase Genes Results in Plants Deficient in Xyloglucan, a Major Primary Cell Wall Component. Plant Cell 20, 1519–1537. Claverie, J., Balacey, S., Lemaître-Guillier, C., Brulé, D., Chiltz, A., Granet, L., Noirot, E., Daire, X., Darblade, B., Héloir, M.-C., Poinssot, B., 2018. The Cell Wall-Derived Xyloglucan Is a New DAMP Triggering Plant Immunity in Vitis vinifera and Arabidopsis thaliana. Front. Plant Sci. 9, 1725. Cosgrove, D.J., 2018. Diffuse Growth of Plant Cell Walls. Plant Physiol. 176, 16–27. Cosgrove, D.J., 2005. Growth of the plant cell wall. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 850–861. Cosgrove, D.J., 2000. Expansive growth of plant cell walls. Plant Physiol. Biochem. 38, 109–124. Curtis, M.D., Grossniklaus, U., 2003. A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis 19 of Genes in Planta. Plant Physiol. 133, 462–469. Funakawa, H., Miwa, K., 2015. Synthesis of borate cross-linked rhamnogalacturonan II. Front. Plant Sci. 6. Gigli-Bisceglia, N., Engelsdorf, T., Hamann, T., 2019. Plant cell wall integrity maintenance in model plants and crop species-relevant cell wall components and underlying guiding principles. Cell. Mol. Life Sci. Hongo, S., Sato, K., Yokoyama, R., Nishitani, K., 2012. Demethylesterification of the Primary Wall by PECTIN METHYLESTERASE35 Provides Mechanical Support to the Arabidopsis Stem. Plant Cell 24, 2624–2634. Kaewthai, N., Gendre, D., Eklöf, J.M., Ibatullin, F.M., Ezcurra, I., Bhalerao, R.P., Brumer, H., 2013. Group III-A XTH Genes of Arabidopsis Encode Predominant Xyloglucan Endohydrolases That Are Dispensable for Normal Growth. Plant Physiol. 161, 440–454. Keegstra, K., Talmadge, K.W., Bauer, W.D., Albersheim, P., 1973. The Structure of Plant Cell Walls: III. A Model of the Walls of Suspension-cultured Sycamore Cells Based on the Interconnections of the Macromolecular Components. Plant Physiol. 51, 188–197. Kooiman, P., 1960. A method for the determination of amyloid in plant seeds. Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 79, Lampugnani, E.R., Khan, G.A., Somssich, M., Persson, S., 2018. Building a plant cell wall at a glance. J. Cell Sci. 131, jcs207373. McFarlane, H.E., Döring, A., Persson, S., 2014. The Cell Biology of Cellulose Synthesis. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 69–94. Nguema-Ona, E., Vicré-Gibouin, M., Gotté, M., Plancot, B., Lerouge, P., Bardor, M., Driouich, A., 2014. Cell wall O-glycoproteins and N-glycoproteins: aspects of biosynthesis and function. Front. Plant Sci. 5. Park, Y.B., Cosgrove, D.J., 2015. Xyloglucan and its Interactions with Other Components of the Growing Cell Wall. Plant Cell Physiol. 56, 180–194. Park, Y.B., Cosgrove, D.J., 2012a. Changes in cell wall biomechanical properties in the xyloglucan-deficient xxt1/xxt2 mutant of Arabidopsis. Plant Physiol. 158, 465–475. Park, Y.B., Cosgrove, D.J., 2012b. A Revised Architecture of Primary Cell Walls Based on Biomechanical Changes Induced by Substrate-Specific Endoglucanases. Plant Physiol. 158, 1933–1943. Pauly, M., Albersheim, P., Darvill, A., York, W.S., 1999. Molecular domains of the cellulose/xyloglucan network in the cell walls of higher plants. Plant J. 20, 629–639. Phyo, P., Wang, T., Xiao, C., Anderson, C.T., Hong, M., 2017. Effects of Pectin Molecular Weight Changes on the Structure, Dynamics, and Polysaccharide Interactions of Primary Cell Walls of Arabidopsis thaliana : Insights from Solid-State NMR. Biomacromolecules 18, 2937–2950. 20 Popper, Z.A., Fry, S.C., 2008. Xyloglucan−pectin linkages are formed intra-protoplasmically, contribute to wallassembly, and remain stable in the cell wall. Planta 227, 781–794. Rui, Y., Anderson, C.T., 2016. Functional Analysis of Cellulose and Xyloglucan in the Walls of Stomatal Guard Cells of Arabidopsis. Plant Physiol. 170, 1398–1419. Saffer, A.M., 2018. Expanding roles for pectins in plant development: Pectins and plant development. J. Integr. Plant Biol. 60, 910–923. Scheller, H.V., Ulvskov, P., 2010. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263–289. Shinohara, N., Sunagawa, N., Tamura, S., Yokoyama, R., Ueda, M., 2017. The plant cell-wall enzyme AtXTH3 catalyses covalent cross-linking between cellulose and cello-oligosaccharide. Sci. Rep. 7, 46099. Wang, T., Park, Y.B., Cosgrove, D.J., Hong, M., 2015. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to NeverDried Arabidopsis Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State Nuclear Magnetic Resonance. Plant Physiol. 168, 871–884. Xiao, C., Barnes, W.J., Zamil, M.S., Yi, H., Puri, V.M., Anderson, C.T., 2017. Activation tagging of Arabidopsis POLYGALACTURONASE INVOLVED IN EXPANSION2 promotes hypocotyl elongation, leaf expansion, stem lignification, mechanical stiffening, and lodging. Plant J. Cell Mol. Biol. 89, 1159–1173. Xiao, C., Somerville, C., Anderson, C.T., 2014. POLYGALACTURONASE INVOLVED IN EXPANSION1 Functions in Cell Elongation and Flower Development in Arabidopsis. Plant Cell 26, 1018–1035. Xiao, C., Zhang, T., Zheng, Y., Cosgrove, D.J., Anderson, C.T., 2016. Xyloglucan Deficiency Disrupts Microtubule Stability and Cellulose Biosynthesis in Arabidopsis, Altering Cell Growth and Morphogenesis. Plant Physiol. 170, 234–249. Xu, P., Cai, X.-T., Wang, Y., Xing, L., Chen, Q., Xiang, C.-B., 2014. HDG11 upregulates cell-wall-loosening protein genes to promote root elongation in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 65, 4285–4295. Zablackis, E., Huang, J., Muller, B., Darvill, A.G., Albersheim, P., 1995. Characterization of the Cell-Wall Polysaccharides of Arabidopsis thaliana Leaves. Plant Physiol. 107, 1129–1138. Zhang, T., Tang, H., Vavylonis, D., Cosgrove, D.J., 2019. Disentangling loosening from softening: insights into primary cell wall structure. Plant J. 100, 1101–1117. Zhang, T., Vavylonis, D., Durachko, D.M., Cosgrove, D.J., 2017. Nanoscale movements of cellulose microfibrils in primary cell walls. Nat. Plants 3, 17056. Zhang, T., Zheng, Y., Cosgrove, D.J., 2016. Spatial organization of cellulose microfibrils and matrix polysaccharides in primary plant cell walls as imaged by multichannel AFM. Plant J. 85, 179–192.