Valoración y mejora de la extracción del genoma del VIH usando nanopartículas magnéticas

Departamento de Microbiología y Parasitología VALORACION Y MEJORA DE LA EXTRACCION DEL GENOMA DEL VIH USANDO NANOPARTICULAS MAGNETICAS Maria Carmen Grussu Santiago de Compostela, 2012 VALORACION Y MEJORA DE LA EXTRACCION DEL GENOMA DEL VIH USANDO NANOPARTICULAS MAGNETICAS TESIS DOCTORAL Maria Carmen Grussu 2012 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Microbiología y Parasitología BENITO JOSÉ REGUEIRO GARCÍA, CATEDRATICO DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA CERTIFICA: Que la presente Tesis titulada: “Valoración y mejora de la extracción del genoma del VIH usando nanopartículas magnéticas” ha sido realizada, bajo mi dirección, por Dña Maria Carmen Grussu en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela y, estimado que se encuentra finalizada, solicita sea admitida a trámite para su lectura y defensa pública. Santiago de Compostela, 2012 Fdo: Prof. Dr. Benito Regueiro García Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MAT2008-06503) de España y por el programa Master and Back de la “Regione Autonoma della Sardegna”. A mi familia INDICE 1. INTRODUCCION............................................................................................ - 1 - 1.1.Resumen general .......................................................................................... - 3 - 1.2. Antecedentes y estado actual del tema ...................................................... - 4 - 1.3.Los Plásmidos .............................................................................................. - 5 - 1.3.1.Clonaje de DNA .......................................................................................... - 5 - 1.3.2.Transformación de Escherichia coli con un plásmido recombinante ... - 6 - 1.3.3.Mutagénesis dirigida ................................................................................. - 8 - 1.3.4.Purificación y análisis de los vectores recombinantes .......................... - 9 - 1.4. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ....................................... - 10 - 1.4.1.Antecedentes históricos del VIH ............................................................ - 10 - 1.4.2.Epidemiología .......................................................................................... - 10 - 1.4.3.Taxonomía y clasificación ....................................................................... - 11 - 1.4.4.Morfología del virión maduro del VIH-1 ................................................. - 12 - 1.4.5.El genoma viral ........................................................................................ - 14 - 1.4.5.1.Genes estructurales ............................................................................. - 17 - 1.4.5.1.1.El gen Gag .......................................................................................... - 17 - 1.4.5.1.2.El gen pol ............................................................................................ - 18 - 1.4.5.1.3.El gen env ........................................................................................... - 20 - 1.4.5.2.Genes reguladores ............................................................................... - 22 - 1.4.5.2.1.Tat (Transactivador transcripcional) ................................................ - 22 - 1.4.5.2.2.Rev (Regulador de la expresión viral) .............................................. - 23 - 1.4.5.3.Genes accesorios ................................................................................. - 23 - 1.4.5.3.1.Nef (factor negativo, negative factor) ............................................... - 23 - 1.4.5.3.2.Vif (Factor de infectividad viral, viral infectivity factor) .................. - 23 - 1.4.5.3.3.Vpr ....................................................................................................... - 23 - 1.4.5.3.4.Vpu ...................................................................................................... - 24 - 1.5. Detección de resistencias ......................................................................... - 24 - 1.5.1.Técnicas genotípicas ............................................................................... - 25 - 1.5.1.1.Interpretación del genotipo .................................................................. - 25 - 1.5.2.Técnicas fenotípicas ................................................................................ - 25 - 1.6. Extracción de ácidos nucleicos ................................................................ - 26 - 1.6.1.Métodos cromatográficos ....................................................................... - 27 - 1.6.1.1.Extracción de ácidos nucleicos con una fase estacionaria solida ... - 27 - 1.6.1.1.1.Cromatografía de intercambio iónico .............................................. - 28 - 1.6.1.1.2.Cromatografía de adsorción (membranas de sílica gel) ................ - 30 - 1.6.2.Bolas magnéticas .................................................................................... - 32 - 1.7. Nanopartículas magnéticas ....................................................................... - 32 - 1.8. Magnetismo ................................................................................................ - 33 - 1.8.1.Propiedades magnéticas de las nanopartículas de oxido de hierro ... - 33 - 1.9.Nanopartículas magnéticas de oxido de hierro recubiertas con sílica .. - 37 - 1.10.Síntesis de nanopartículas magnéticas recubiertas de sílica ............... - 38 - 1.11. La microemulsión inversa ....................................................................... - 39 - 1.12.Los polímeros sintéticos .......................................................................... - 41 - 1.12.1.El PAA ..................................................................................................... - 41 - 1.13.Funcionalización de nanopartículas ....................................................... - 42 - 1.13.1.Los organosilanos y la silanización de superficies ............................ - 42 - 2. OBJETIVOS ................................................................................................. - 47 - 3. MATERIALES .............................................................................................. - 51 - 3.1. Aspectos generales .................................................................................... - 53 - 3.2. El pNL4.3 ..................................................................................................... - 54 - 3.3. Mutaciones del pNL4.3 ............................................................................... - 55 - 3.3.1.Mutación p4254 ........................................................................................ - 55 - 3.3.2.Mutación p4411 ........................................................................................ - 56 - 3.3.3.Mutación p4696 ........................................................................................ - 56 - 3.3.4.Mutación p4634 ........................................................................................ - 57 - 3.4. Enzimas de restricción .............................................................................. - 57 - 3.5. Soluciones .................................................................................................. - 59 - 3.5.1.Medios de cultivo ..................................................................................... - 60 - 3.6. Partículas Magnéticas ................................................................................ - 61 - 3.6.1.Partículas FeO-2202-W ............................................................................ - 61 - 3.6.2.Partículas TEOS-07B ............................................................................... - 62 - 3.6.3.Partículas TEOS-07 .................................................................................. - 63 - 3.6.4.Partículas FeO-2204-W ............................................................................ - 63 - 3.6.5.Partículas FeO-2207-APS ........................................................................ - 64 - 3.6.6.Partículas FeO-2206-W 5 mg/ml ............................................................. - 65 - 3.6.7.Partículas FeO-2206-APS ........................................................................ - 66 - 3.6.8.Partículas FeO-2206 10 mg/ml ................................................................ - 66 - 3.6.9.Aspectos generales de las partículas paramagnéticas comerciales (Siemens) ................................................................................................... -- 67 - 4. MÉTODOS ................................................................................................... - 69 - 4.1. Mutagénesis in vitro del gen pol ............................................................... - 71 - 4.2. Generación de secuencias de restricción que no afecten la secuencia de aminoácidos de POL .................................................................................. - 73 - 4.2.1.Secuencia CIaI ......................................................................................... - 74 - 4.2.1.1.Mutación p4254 ..................................................................................... - 74 - 4.2.1.2.Mutación p4696 ..................................................................................... - 74 - 4.2.2.Secuencia XmaI ....................................................................................... - 75 - 4.2.2.1.Mutación p4411 ..................................................................................... - 75 - 4.3. Preparación de Soluciones ........................................................................ - 76 - 4.3.1.Ampicilina (100 mg/mI) ............................................................................ - 76 - 4.3.2.Etanol al 70% ............................................................................................ - 76 - 4.3.3.TAE 50x ..................................................................................................... - 76 - 4.3.4.TAE 1x ....................................................................................................... - 76 - 4.3.5.T.E. ............................................................................................................. - 77 - 4.4. Logro del objetivo 1 ................................................................................... - 77 - 4.4.1.Construcción del estándar de plásmidos .............................................. - 77 - 4.4.2.Obtención de los plásmidos ................................................................... - 77 - 4.4.2.1.Fase a medio solido para miniprep ..................................................... - 77 - 4.4.2.2.Sembrar las Placas de Petri ................................................................. - 78 - 4.4.2.3.Fase a medio liquido para miniprep y plasmiprep ............................. - 78 - 4.4.2.4.Miniprep ................................................................................................. - 78 - 4.4.2.5.Cortes con enzimas de restricción ...................................................... - 79 - 4.4.2.6.Gel de agarosa ...................................................................................... - 80 - 4.4.2.7.Plasmiprep ............................................................................................ - 82 - 4.4.3.Valoración basal de la extracción........................................................... - 82 - 4.5.Capacidad de recuperación de especies minoritarias ............................. - 83 - 4.5.1.Análisis de integridad .............................................................................. - 83 - 4.5.1.1.Secuencias de los primers usados en la pirosecuenciación ............ - 84 - 4.5.1.2.Resultados de la pirosecuenciación ................................................... - 84 - 4.6. Logro del objetivo 2 ................................................................................... - 86 - 4.6.1.Síntesis de las nanopartículas (MNPs) .................................................. - 86 - 4.6.2.Revestimientos de las nanopartículas: (C@S NPs) .............................. - 87 - 5. RESULTADOS ............................................................................................. - 89 - 5.1. Aspectos generales .................................................................................... - 91 - 5.2. Evaluación de la extracción en el Ampliprep™ (Roche) ......................... - 91 - 5.3. Comparación de la extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp™ (QIAGEN) ..................................................................................................... - 96 - 5.3.1.Comparación de extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp™ (QIAGEN) tras corte con la enzima Apa I. ................................................. - 96 - 5.3.2.Comparación de la extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp® (QIAGEN) sin corte con la enzima Apa I ................................................... - 99 - 5.4. Pruebas de Reproducibilidad .................................................................. - 104 - 5.4.1.QIAGEN ................................................................................................... - 104 - 5.4.2.Hamilton ................................................................................................. - 106 - 5.4.3.Ampliprep ............................................................................................... - 108 - 5.5. Pruebas con las nanopartículas magnéticas de Nanogap.................... - 110 - 5.5.1.Prueba con las partículas FeO-2202-W ................................................ - 110 - 5.5.2.Nueva prueba con las partículas FeO-2202-W .................................... - 112 - 5.5.3.Prueba con las partículas TEOS-07B ................................................... - 114 - 5.5.4.Nueva prueba con las partículas TEOS 07 B ....................................... - 115 - 5.5.5.Prueba con las partículas TEOS-07B y BSA ........................................ - 116 - 5.5.6.Prueba con las partículas TEOS-07B y el Buffer del Versant® kPCR, Siemens (1:4) ............................................................................................ - 118 - 5.5.7.Prueba con las partículas TEOS 07 ...................................................... - 119 - 5.5.8.Prueba con las partículas TEOS-07 y BSA .......................................... - 121 - 5.5.9.Prueba con partículas TEOS-07 y el Buffer del Versant® kPCR, ................. Siemens (1: 3) ......................................................................................... - 122 - 5.5.10.Prueba con las partículas TEOS 07 y TEOS 07 B (1:1) en el Buffer .......... del Versant® kPCR (Siemens) ............................................................... - 124 - 5.5.11.Prueba con las partículas TEOS 07 y TEOS 07 B originales ...................... mezcladas 1:1 ......................................................................................... - 126 - 5.5.12.Prueba con las partículas TEOS-07 y las partículas paramagnéticas comerciales,Siemens (1:1) ...................................................................... - 127 - 5.5.13.Prueba con las partículas TEOS 07 y las partículas del ............................. MagNa Pure (1:1) .................................................................................... - 129 - 5.5.14.Prueba con las partículas TEOS 07 y las partículas del ............................. MagNa Pure (1:1) en el MagNa Pure ..................................................... - 130 - 5.5.15.Nueva extracción con las partículas TEOS-07 B ............................... - 133 - 5.5.16.Extracción con las partículas TEOS-07 a pH=10 ............................... - 134 - 5.5.17.Prueba con las partículas FeO-2204-W .............................................. - 137 - 5.5.18.Segunda prueba con las partículas FeO-2204-W .............................. - 138 - 5.5.19.Prueba con las partículas FeO-2207-APS .......................................... - 140 - 5.5.20.Prueba con las partículas FeO2206 5mg/ml ...................................... - 141 - 5.5.21.Segunda prueba con las partículas FeO2206 5mg/ml ...................... - 143 - 5.5.22.Prueba con las partículas FeO-2206 5mg/mI y las partículas paramagnéticas comerciales, Siemens (1:1) ......................................... - 146 - 5.5.23.Segunda prueba con las partículas FeO-2206 5mg/mI y las partículas paramagnéticas comerciales, Siemens (1:1) ......................................... - 148 - 5.5.24.Prueba con las partículas FeO-2206-APS .......................................... - 150 - 5.5.25.Prueba con las partículas FeO-2206 10 mg/ml .................................. - 153 - 5.5.26.Segunda prueba con las partículas FeO-2206 10 mg/mI .................. - 154 - 6. DISCUSIÓN ............................................................................................... - 157 - 6.1. Nanopartículas magnéticas ..................................................................... - 160 - 6.2.La microemulsión inversa ........................................................................ - 161 - 6.3. Síntesis de partículas por la separación de ácidos nucleicos ............. - 162 - 6.3.1.Partículas de oxido de hierro ................................................................ - 162 - 6.3.2.Tipos de revestimientos ........................................................................ - 163 - 6.3.2.1.Revestimientos inorgánicos .............................................................. - 164 - 6.3.2.1.1.Revestimientos de sílica ................................................................. - 164 - 6.3.2.2.Revestimientos orgánicos ................................................................. - 165 - 6.3.2.2.1.Polímeros sintéticos: el PAA .......................................................... - 165 - 6.3.3.Funcionalización de nanopartículas .................................................... - 166 - 6.3.3.1.Silanos Organofuncionales ............................................................... - 167 - 6.4. Aplicabilidad y utilidad práctica de los resultados ............................... - 169 - 6.5. Perspectivas futuras ................................................................................ - 169 - 6.6.Posibilidad de que la investigación propuesta conduzca a patentes y otros resultados explotables comercialmente ................................................. - 169 - 7. CONCLUSIONES....................................................................................... - 171 - 8. ANEXOS .............................................................................................................. 8.1. ANEXO I ............................................................................................................. I Fluorometría Qubit ............................................................................................ I 8.2. ANEXO II ........................................................................................................... IV Cobas Ampliprep® (CAP, Roche) .................................................................... IV MagNa Pure Compact (Roche) ....................................................................... VI Hamilton (Versant® kPCR, Siemens) ............................................................ VII 8.3. ANEXO III ......................................................................................................... IX Pirosecuenciación ........................................................................................... IX 8.4. ANEXO IV ........................................................................................................ XI Protocolo Miniprep .......................................................................................... XI 8.5. ANEXO V ....................................................................................................... XIV Protocolo Plasmiprep ................................................................................. XIV 8.6. ANEXO VI ...................................................................................................... XVI Protocolo de la extracción manual de ácidos nucleicos (QIAGEN®) ..... XVI 9. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................... I 1. INTRODUCCION Introducción - 3 - 1.1. Resumen general El proceso de extracción de los ácidos nucleicos es un paso preliminar en todo el proceso diagnóstico molecular, en el trabajo clínico con el VIH; dicho proceso condiciona el flujo de trabajo y la respuesta de los distintos sistemas y plataformas que se usan con el virus. Nuestro trabajo consistirá en establecer los parámetros de funcionamiento de los sistemas automáticos de extracción más frecuentemente utilizados. Para ello utilizaremos un estándar, constituido por varias construcciones alternativas, generadas por mutaciones dirigidas sobre el plásmido pNL4.3, que tienen como base la estructura genómica del VIH-1. De esta forma podremos estudiar el proceso de extracción, y valorar las concentraciones, la pureza y la integridad de los ácidos nucleicos extraídos con los distintos sistemas y químicas empleados. La mayor parte de los sistemas automáticos en uso utilizan nanopartículas magnéticas y absorción inespecífica. Nuestra intención es desarrollar nanopartículas alternativas y estudiar sus propiedades de magnetismo. Para ello las recubriremos con materiales inorgánicos u orgánicos que puedan mejorar sus rendimientos y mantener la integridad de las hebras obtenidas; también las funcionalizaremos para mejorar sus condiciones de estabilidad, absorción y protección frente a las nucleasas. De esta forma podremos conseguir lotes de partículas estándar, que eviten variabilidad en nuestro trabajo con el VIH. Introducción - 4 - 1.2. Antecedentes y estado actual del tema Los métodos de diagnostico del SIDA se basan en la amplificación de regiones relevantes del genoma del VIH; la sensibilidad de estos métodos depende del paso preliminar de extracción del acido nucleico del virus, de tal forma que es importante evaluar los distintos sistemas disponibles para este fin, y generar posibles mejoras de su rendimiento y diseño. Nuestra mayor experiencia hasta 1993, se centraba en la producción de monoclonales y en el uso de técnicas de citometría de flujo. Tenemos experiencia en el trabajo con proteínas, acoplamiento de marcadores, etc. La Estancia del Investigador principal en el laboratorio del Prof. B. Roizman (Universidad de Chicago), durante un año sabático (1993), aprendiendo técnicas de construcción de virus recombinantes, y los proyectos concedidos desde 1993, nos han permitido familiarizarnos con la manipulación genetica y conseguir las dotaciones para el trabajo en dos modelos virales: herpes simplex y VIH. En los últimos años hemos trabajado en condiciones de biseguridad BP-3, en infección con VIH recombinantes, desarrollando nuevas herramientas y vectores para el análisis de resistencias fenotipica y "fitness de VIH". En anteriores proyectos: FIPSE 3074/99, en colaboración con el Instituto de Salud Carlos III (Dr. Alcami Pertejo), y FIPSE 36272/02, nuestro laboratorio ha desarrollado diversos reactivos de utilidad para el análisis de la infección por VIH. Hemos colaborado con varios grupos de trabajo tanto en la Red RIS o La Marató, como con industrias VIRCO. En el año 2007 iniciamos una colaboración estable con el grupo “Nanomag” (www.nanomag.org) de la Universidad de Santiago, con el que previamente habíamos colaborado en el proyecto: Obtención, caracterización y estudio de micropartículas Nd-Fe-B y su aplicación en la separación de moléculas y poblaciones celulares. Introducción - 5 - En el 2008 empezamos nuestra colaboración con Nanogap (www.nanogap.es), que hemos utilizado como recurso para la obtención de las nanopartículas magnéticas utilizadas en este trabajo de investigación. 1.3. Los Plásmidos El genoma bacteriano se organiza en un único cromosoma circular con un sólo origen de replicación. Aunque el cromosoma bacteriano contiene todos los genes necesarios para el crecimiento y reproducción de la célula, virtualmente todos los tipos de bacteria contienen moléculas de DNA adicionales conocidas como plásmidos. Al igual que el cromosoma bacteriano son circulares y autorreplicantes1. Son elementos extracromosómicos bacterianos circulares de ADN, con un número variable de pares de bases (de 1.500 a 400.000)2. 1.3.1. Clonaje de DNA Una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética de bacterias, es su uso para desarrollar vectores o vehículos que permitan el clonado de cualquier secuencia de ADN. Los vectores más usados con este fin son los plásmidos bacterianos. Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector3, y la posterior introducción de la molécula recombinante en la célula huésped (generalmente la bacteria Escherichia Coli), donde podrá avanzar un número elevado de copias conocidas como “clones”4. Mediante el cultivo de la bacteria hospedadora se obtiene gran 1 Curtis H y cols., 2006. 2 Murray PR ycols., 2009. 3 Betancor L y cols., 2008. 4 Cultek S.L.U., 2006. Introducción - 12 - A4, B, C, D, F1, F2, G, H, J y K son los que actualmente están reconocidos. Los subtipos del VIH-1 están unidos geográfica y epidemiológicamente. (Ver Figura 317). Figura 3: Distribución mundial de los subtipos del VIH. (Ariën KK y cols., 2007). 1.4.4. Morfología del virión maduro del VIH-1 Los viriones maduros de VIH tienen una forma esférica de diámetro de 100-120 nm, con espículas de 8 nm. Consisten de una membrana de doble capa de natura lipídica, dentro de la cual se encuentra la cápside (core), a forma de cono truncado, que contiene el RNA genómico, la proteasa viral (PR), la transcriptasa inversa (TR), la integrasa (IN), Vpu, Vif, Vpr y Vef, y algunos factores celulares18. (Ver Figura 419). 17 Ariën KK y cols., 2007. 18 Sierra S y cols., 2005. 19 Freed EO, 2001. Introducción - 13 - Figura 4: Representación esquemática del virión maduro del VIH-1. (Freed EO, 2001, modificada). Desde el exterior hacia el interior observamos la envoltura lipídica, la matriz y la cápside. En la envoltura lipídica están integrados 72 complejos glicoproteícos (o espículas). Cada uno está compuesto por trímeros de una glicoproteína transmembranal de menor peso molecular (TM, gp41), implicada en los procesos de fusión de membranas durante la penetración viral. Esta interactúa, no-covalentemente, con una glicoproteína de superficie de mayor peso molecular (SU, gp120), responsable de la interacción del virión con su receptor celular (el CD4)19, 20, 21 y un correceptor19, 20. (Véase también pág.- 20 -). La unión entre gp120 y gp41 es débil y puede deshacerse de manera espontánea en el ambiente local. Inmediatamente por debajo de la envoltura se encuentra una estructura amorfa, de naturaleza proteica, denominada matriz, que comprende aproximadamente 2000 copias de una proteína no glicosilada de 17 kD (MA, p17). Por debajo de esta capa, en la zona central del virus, se encuentra la cápside, formada por aproximadamente 2000 copias de una proteína de 24 kD (CA, p24). En su interior están 2 moléculas idénticas de ARN de 9,2 Kb, en íntima asociación con una proteína de bajo peso molecular, denominada nucleocápside (NC, p7), que lo estabiliza (hay 20 Weissenhorn W y cols., 1997. 21 Sattentau QJ y cols., 1995. Introducción - 14 - aproximadamente 2000 copias de NC). El ARN es de polaridad positiva22, pero se replica a través de un DNA intermediario, DNA de doble banda, que puede integrarse en el DNA genómico de la célula huésped. Además en el interior de la cápside se encuentran dos moléculas de retrotranscriptasa (RT, p66/p51), necesarias para la replicación (cataliza el paso de RNA monocatenario a DNA bicatenario), la proteasa (PR, p11), y la integrasa (IN, p31). 1.4.5. El genoma viral El genoma del VIH está constituido por tres genes/proteínas estructurales, al igual que todos los retrovirus: gag, pol y env23 (gag significa antígeno de grupo, pol representa la polimerasa y env se refiere a la envoltura). Además presenta otros seis genes accesorios/reguladores: tat, rev, nef, vif, vpr y vpu, que codifican para proteínas no estructurales. Tat y rev codifican para las proteínas reguladoras que reciben el mismo nombre, y los genes vpu, vpr, vif y nef, codifican para las proteínas accesorias, que también tienen el mismo nombre24, 25. Nef, Vif y Vpr están incluidas en el virión maduro, mientras Rev, Tat y Vpu, que funcionan en la célula huésped, no están incluidas; vendrán sintetizadas en la fase tardía del ciclo de replicación del VIH26. (Las funciones de todos los genes están resumidas en la Tabla 127). Figura 5: Organización del genoma del VIH-1. (Adamson CS.y cols., 2010.) 22 Lázaro Lázaro E y cols., 2002. 23 Varmus H, 1988. 24 Úsuga X y cols., 2009. 25 Adamson CS y cols., 2010. 26 Turner BG y cols., 1999. 27 Alcamí J, 2004. Introducción - 15 - En el genoma del VIH-1 encontramos también las LTRs (Repeticiones Terminales Largas), que como en otros Retrovirus, están compuestas por 3 regiones: U3, R y U5, que van del extremo 5’ al 3’28. Estas regiones: son esenciales para la integración del ADN vírico en el ADN de la célula huésped; contienen zonas de unión para las proteínas reguladoras que participan en la replicación del virus29. 28 Mandell GL y cols., 2006. 29 Passarge E, 2007. Introducción - 16 - Gen Proteína Función gp 160 Poliproteína precursora Env SU/gp120 Proteína de la envuelta viral; Interacción con el receptor CD4 y correceptores. TM/gp41 Fusión de membranas p55 Poliproteína precursora CA/p24 Proteína de la cápside Gag MA/p17 Proteína de la matriz NC/p7 Proteína de la nucleocápside p6 Ribonucleoproteína, esencial para la encapsidación viral Transcriptasa inversa Retrotranscripción Pol Integrasa Integración Proteasa Procesamiento postraduccional de las poliproteínas gag y gag-pol Tat Tat Elongador del ARNm; Transactivador; Inducción de apoptosis. Rev Rev Regulador del transporte y procesamiento del ARNm Nef Nef Aumento de la infectividad viral; Incremento de la retrotranscripción; Regulación negativa de CD4; Inducción de apoptosis en CTL. Vif Vif Aumenta la infectividad viral; Interacción y neutralización de factores celulares antivirales: APOBEC. Vpr Vpr Transactivador viral; Transporte del complejo de preintegración al núcleo; Parada del ciclo celular. Inducción de Apoptosis. Vpu Vpu Secuestro de CD4 en el retículo endoplásmico; Aumenta la generación de viriones. Tabla 1: Genes del VIH y propiedades de las proteínas que codifican. (Alcami J, 2004, modificada). Introducción - 17 - 1.4.5.1. Genes estructurales 1.4.5.1.1. El gen Gag La proteína gag es inicialmente sintetizada en forma de poliproteína precursora, que por su peso molecular ha sido llamada Pr55gag, suficiente para producir partículas virales no infecciosas en ausencia de otras proteínas virales o ARN viral30. La poliproteína se sintetiza en los ribosomas a partir de un ARNm inmaduro26. Durante o inmediatamente después de la salida de las vesículas, desde la membrana de la célula huésped, sufre un proceso proteolítico mediado por la proteasa (PR), codificada por el gen pol31, y da origen a las proteínas maduras de Gag, que contribuyen a la formación del virión: la proteína de la matriz (MA, p17), la proteína de la cápside (CA, p24), el péptido espaciador 1” (SP1), la nucleocápside (NC, p7), el “péptido espaciador 2” (SP2), y p625, 32. Aproximativamente desde 1200 hasta 2000 copias de gag contribuyen a la formación del virión inmaduro del VIH26. La producción de partículas infecciosas requiere la co-expresión de Gag, con la glicoproteína env, y los enzimas codificados por pol: PR, RT, IN. Todavía no ha sido aprobado ningún medicamento capaz de inhibir Gag o alguna etapa del ensamblaje viral. Pero, como los conocimientos sobre el ensamblaje viral están creciendo, están aumentando también las posibles dianas de nuevas terapias antivirales25. 30 Freed EO, 1998. 31 Chen SW y cols., 2004. 32 Checkley MA y cols., 2010. Introducción - 18 - 1.4.5.1.2. El gen pol El gen pol codifica las enzimas víricas proteasa (PR, p11), retrotranscriptasa (RT, p66/p51), e integrasa (IN, p31). El precursor Gag-Pol (Pr160gag-pol) sufre un proceso proteolítico mediado por la proteasa (PR), para generar las proteínas de Gag (MA, CA, NC, p6) y las enzimas de pol33. La secuencia del gen pol, que carece del codón de inicio34, solapa parcialmente la secuencia codificante por el gen gag. Durante la traducción de Gag ocurre un cambio en el patrón de lectura ribosomial (con una frecuencia del 5-10 %), que termina en la traducción de pol en una poliproteína Pr160gag-pol (31). Como consecuencia, pol es sintetizado únicamente como una parte de la proteína Gag-Pol34. - La proteasa ha sido la primera proteína del VIH-1 que ha sido caracterizada26. Es indispensable para la maduración y capacidad infectiva del virión, y tiene utilidad como diana de los antirretrovirales35. Su función en el virión inmaduro es escindir la poliproteína viral durante el ciclo replicativo. Sin su acción las partículas víricas resultantes no resultan infectivas7. El sitio activo de esta enzima está localizado en la unión de sus dos subunidades, recubierto de subdominios plegados18. Figura 6: Estructura cristalográfica de un homodimero de la proteasa del VIH-1. (Serra S y cols., 2005). 33 Freed EO, 2004. 34 Hill M y cols., 2005. 35 Barrie KA y cols., 1996. Introducción - 19 - - La RT es una DNA polimerasa dependiente de RNA (lo que dio origen a la palabra retrovirus36), responsable de convertir el RNA monocatenario de los retrovirus en DNA de doble cadena (dsDNA)37. Esta enzima, por lo tanto es capaz de hacer que el flujo de la información genética vaya en el sentido RNA→DNA, contrariamente a lo que sucede en el flujo normal de la información genética en las células (DNA→RNA)22. En su forma activa es un heterodímero de dos subunidades: la más grande, p66, tiene 560 aminoácidos (está compuesta por dos dominios: polimerasa y RNasa H), y la más pequeña, p51, contiene los primeros 440 residuos de la p6637 (corresponde al dominio polimerasa de la subunidad p6638). La RT actúa como diana de muchos medicamentos anti VIH-1, que la inhiben37. Los dominios p66 y p51 de la polimerasa, contienen cada uno 4 subunides: “fingers”, “palm”, “thumb”, y “connection”38 (que une el domino de la polimerasa al RNasa H). Fue descrito por Kohlstaedt y sus colaboradores en 1992, en un estudio de cristalografía a rayos X, a 3.5 A. Figura 7: Estructura cristalográfica de la RT del VIH-1. (Serra S y cols., 2005). - La integrasa es esencial para la integración del DNA viral en el cromosoma de la célula huésped; reconoce las LTRs en los extremos 5’ y 3’ del DNA viral de doble cadena recién sintetizado, y corta dos, y a veces tres bases, desde el extremo 3’ terminal; 36 Temin, HM y cols., 1970. 37 Peletskaya EN y cols., 2001. 38 Jacobo-Molina A y cols., 1993. Introducción - 20 - posteriormente une el extremo 3’ terminal al DNA de la célula huésped26. En el 2007 ha sido aprobado un nuevo medicamento antirretroviral (el raltegravir), que la inhibe. (Los inhibidores de RT y PR son los más numerosos y eficaces, y la combinación de los dos se suele utilizar en la fase inicial del tratamiento)25. Estudios de cristalografía localizaron el sitio catalítico de la enzima en los residuos 50-212, y después del 288. La forma activa de la enzima se piensa sea un tetrámero, con el sitio activo localizado en la zona central18. Figura 8: Estructura cristalográfica de un homodímero de la integrasa del VIH-1. (Serra S y cols., 2005.). 1.4.5.1.3. El gen env El gen env (envoltura) deriva de una poliproteína precursora (gp160) sintetizada en retículo endoplasmático (RE) utilizando el ARNm de env. Es postraduccionalmente modificada en el RE y aparato del Golgi y proteolíticamente (por acción de proteasas celulares durante su camino hacia la membrana plasmática39), produce un complejo glicoproteíco trimerico, (TM-SU)3, que viene posteriormente transportado a la membrana celular por el ensamblaje del virus26. El complejo está compuesto por una glicoproteína externa (de superficie) gp120 (SU, surface glycoprotein), que está unida no covalentemente al dominio transmembrana gp41 (TM, transmembran protein), organizado en una simetría triangular18. 39 Murakami T y cols., 2004. Introducción - 21 - Figura 9: Representacion del complejo gp120/gp41 de Env. (Freed EO, 2002, modificada). En la superficie de las células infectadas env es un trímero compuesto por tres protómeros homodiméricos de gp120/gp4140, como se puede observar en la Figura 9. - La gp 120 está organizada en 5 regiones constantes (C1-C5) y 5 dominios variables (V1-V5)19. La región V3 es el principal determinante de la especificidad de los receptores de quimiocinas (tropismo del VIH-1). Consiste en 35 aminoácidos (entre 31 y 39), y no solo es crítica para la unión con el correceptor, pero determina también cual correceptor41 (un receptor especifico de quimiocinas40: CXCR4 o CCR5) será utilizado para la entrada del virus41. El maraviroc actúa como un antagonista de CCR5 y, actualmente es el único antirretroviral aprobado que tiene como diana un factor de la célula huésped25. Figura 10: Glicoproteina env del VIH-1. (Serra S y cols., 2005, modificada). - Gp41 está compuesta por tres dominios principales: extracelular, transmembranal y citoplasmático42. 40 Salzwedel K y cols., 2009. 41 Huang CC y cols., 2005. 42 He Y y cols., 2008. Introducción - 28 - 1.6.1.1.1. Cromatografía de intercambio iónico Actualmente es la tecnología más utilizada para la separación de ácidos nucleicos52. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución). Los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente, que no se unen a la fase estacionaria, posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta, y luego las de mayor carga negativa neta. Figura 13: Mecanismo del intercambio reversible entre la resina y el ácido nucleico. (http://www.cultek.com). Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores aniónicos en los kits comerciales: el metilaminoetanol (MAE) o el dietilaminoetil (DEAE). La unión del ADN depende principalmente del componente estérico de los grupos funcionales y de la afinidad del intercambiador aniónico por el respectivo ácido nucleico. El grupo MAE es menos voluminoso y más hidrofílico que el DEAE, y por lo tanto, la unión de los ácidos nucleicos a los primeros es más efectiva que a los segundos. 52 Cultek S.L.U. http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_AN_Purificacion&opc=tecnicas Introducción - 29 - Figura 14: Ejemplos de intercambiadores aniónico. (http://www. Cultek. com/aplicaciones, modificada). Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones, empaquetada en columnas de polipropileno. La unión de los ácidos nucleicos se produce en condiciones de baja salinidad. Durante los pasos de lavado se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes, por lo que las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión. De esta forma se obtienen una purificación de los ácidos nucleicos (ADN y/o ARN) rápida y eficiente. Al final los ácidos nucleicos se eluyen con un tampón de máxima salinidad; por último, se precipita con isopropanol, para lavar y eliminar todos los restos de impurezas y, Figura 16: Mecanismo de unión.(www. Cultek. com/aplicaciones, modificada). Figura 17: Mecanismo de elución. (http://www. Cultek. com/aplicaciones, modificada). Figura 15: Pasos de la extracción, en la cromatografía a intercambio iónico. (http://www. Cultek. com/aplicaciones, modificada). Introducción - 30 - finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampón de baja salinidad, para su posterior utilización o almacenamiento (Buffer TE, pH 8.0 o 10 mM Tris-CI, pH 8.5). Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con esta tecnología, la principal aplicación de este tipo de cromatografía es la purificación de ADN plasmídico. En nuestro trabajo utilizamos la cromatografía a intercambio iónico en las plasmipreps usando el protocolo de QIAGEN por el QIAGEN plasmid maxi kit. (Véase también, ANEXO V). 1.6.1.1.2. Cromatografía de adsorción (membranas de sílica gel) La mayoría de los productos comerciales relacionados con la purificación de los ácidos nucleicos se basan en la capacidad que tienen las matrices de sílica de unirse al DNA52. Estas matrices se preparan con reflujo de dióxido de silicón en hidróxido de sodio o de potasio en proporción entre 2:1 y 10:1, por al menos 48 horas. Luego se pueden usar para purificar el DNA. El principio de la purificación se basa en la elevada afinidad de las moléculas de DNA, hacia las partículas de sílica51. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua (las sales caotrópicas atraen las moléculas de agua, lo cual permite que membrana de sílica y ADN interactúen por medio de diferentes mecanismos), por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA52. El sodio de la matriz, en forma de catión (Na+), hace de puente que atrae el oxigeno de los grupos fosfato del DNA, cargados negativamente (PO32-). Introducción - 31 - Figura 18: Comportamiento de las sales caotrópicas con el agua. (http://www.cultek.com/aplicaciones, modificada). El DNA, bajo estas condiciones hidrofóbicas52, está atrapado fuertemente a la matriz51de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, se eliminan de la muestra durante los pasos de lavado52. Figura 19: Unión de las matrices de sílica y los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. (http://www.cultek. com/aplicaciones, modificada). Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos), T.E.51, o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana52. En nuestro trabajo utilizamos la cromatografía de adsorción en las minipreps, usando el protocolo de Macherey-Nagel por el NucleoSpin® plasmid y en la extracción de ADN, usando el protocolo de QIAGEN por el QIAmp® DNA mini (Spin Protocol), por la purificación de ADN desde muestras de sangre. (Véase también, ANEXO IV y ANEXO VI). Introducción - 32 - 1.6.2. Bolas magnéticas Los ácidos nucleicos se unen selectivamente a las bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra52. Las bolas actúan como una fase estacionaria, y por esto no necesitan de centrifugaciones o filtraciones sucesivas. Después de una fase de lisis inicial, se verifica la unión del DNA a las bolas53. Se remueven las partículas, con el ácido nucleico a estas unido, utilizando un imán permanente, y después, se someten a varios lavados para eliminar ulteriores contaminantes y sales. Los ácidos nucleicos purificados (unidos a las bolas paramagnéticas) se eluyen de la solución, en condiciones de baja salinidad y están listos para ser utilizados en posteriores aplicaciones52. (Ver Figura 2054). Figura 20: Varios pasos de la extracción usando nanopartículas magnéticas. (Berensmeier S, 2006, modificada). 1.7. Nanopartículas magnéticas La literatura de las nanopartículas de hierro, así como la de las nanopartículas, es un poco confusa por falta de coherencia en definiciones y terminología55. No se está muy de acuerdo sobre lo que califica a una nanopartícula. Ha sido argumentado, basándose en el sistema SI, 53 Cassará F, 2005. 54 Berensmeier S, 2006. 55 Huber DL, 2005. Introducción - 33 - que solo partículas entre 1 y 10 nm sean consideradas nanopartículas, o también que cualquier cosa entre 1 y 1000 nm puede ser considerada una nanopartícula. Estos representan los dos extremos de lo que puede ser considerado “nanopartícula”; sin embargo muchos científicos no sostienen una interpretación tan estricta. De todas formas, todos estarían de acuerdo en que una partícula cuyas dimensiones superen 1000nm, ya no es una nanopartícula. 1.8. Magnetismo Entre los distintos tipos de magnetismo, se incluyen el diamagnetismo, paramagnetismo y ferromagnetismo; junto a estos el antiferromagnetismo y el ferrimagnetismo se consideran subclases del ferromagnetismo. Todos los materiales presentan por lo menos uno de estos tipos de magnetismo y, el comportamiento depende de la respuesta de los dipolos magnéticos atómicos y electrónicos a la aplicación de un campo magnético externo56. 1.8.1. Propiedades magnéticas de las nanopartículas de oxido de hierro Las partículas de oxido de hierro se pueden clasificar en base a su respuesta a un campo magnético externo aplicado57. La descripción de la orientación de los momentos magnéticos en una partícula, ayuda a identificar los diferentes tipos de magnetismo presentes en la naturaleza. 9 Las partículas cuyos espines de los electrones impares se alinean espontáneamente, de manera que el material puede exhibir magnetización sin estar en un campo magnético, exhiben 56 Callister WD, 1996. 57 Gupta AK y cols., 2005. Introducción - 34 - ferromagnetismo. Es un fenómeno cooperativo, así que las propiedades ferromagnéticas se presentan cuando un cierto número de átomos se unen. Cuando a las partículas magnéticas se las retira del campo, muestran magnetización permanente. Presentan estas características los metales de transición, como por ejemplo el hierro56, pero también el cobalto, el níquel y algunas aleaciones o compuestos, que contienen uno o más de estos elementos. Lo más frecuente es que, en un material ferromagnético un espín58 (movimiento de un electrón alrededor de su proprio eje59), se alinea en una dirección, la del campo, si la hay, o aleatoria, si no la hay. Este dipolo magnético interacciona suficientemente para que los espines vecinos, se alineen como el primero, formando dominios (grupos de átomos alineados60) magnéticos en los que la magnetización neta es no nula. ↑↑↑↑↑↑ Ferromagnetismo 9 El diamagnetismo es una forma muy débil y no permanente de magnetismo; persiste solo mientras el campo externo esté presente. Cuando se colocan entre los polos de un fuerte electroimán, los materiales diamagnéticos son atraídos hacia las regiones donde el campo es débil. Se encuentra en todos los materiales; siendo tan débil, puede ser observado solo cuando otros tipos de magnetismo están totalmente ausentes56. 9 Algunas sustancias exhiben las propiedades del paramagnetismo, que contrariamente a los materiales ferromagnéticos, no manifiestan magnetización permanente si se retiran del campo magnético. Puesto que los dipolos, en un sistema paramagnético, no se influencian entre sí en ausencia de un flujo magnético, pueden 58 González Viñas W y cols., 2003, 59 Vidaurre A y cols., 1996. 60 Hewitt PG, 2004. Introducción - 35 - estar orientados al azar. Si la sustancia se coloca en un flujo magnético, los dipolos intentaran alinearse en la dirección del flujo exterior61. 9 Los materiales ferrimagnéticos están formados por iones que tienen espines diferentes, sobre todo de dos tipos: s ≠ S62. El ferrimagnetismo es un tipo de magnetización permanente; las características macroscópicas de los materiales ferromagnéticos y ferrimagnéticos son similares, la diferencia reside en el origen de los momentos magnéticos56. Las sustancias ferrimagnéticas exhiben magnetización espontanea, debida al alineamiento no paralelo de sus momentos atómicos63. Debido a estos alineamientos, tienen fuerza magnética menor que los materiales ferromagnéticos puros, como el hierro. ↑↓↑↓↑↓ Ferrimagnetismo El prototipo de la ferrita es el Fe3O4, el mineral magnetita, a veces denominado piedra imán56; es un oxido de hierro común (magnético), con la estructura cubica de una espinela inversa 57, 64, 65, como se puede observar en la Figura 2166. 61 Collieu AM y cols., 1977. 62 Sznajd J, 2006. 63 Wolf WP, 1961. 64 Pol VG y cols., 2010. 65 Fonin M y cols., 2005. 66 Bino A y cols., 1998. Introducción - 36 - Figura 21: Molécula de Fe3O4. (Bino A y cols., 1998). Los electrones pueden transferirse entre los iones Fe2+ y Fe3+ en el octaedro64, a temperatura ambiente, haciendo de la magnetita una clase importante de materiales semi-metálicos65. La fórmula química general de una ferrita es MO×Fe2O3, donde M es un catión de valencia 2 como Zn, Cd, Fe, Ni, Co, Cu o Mg. Para cada uno de los iones Fe2+ y Fe3+ existe un momento magnético (los iones O2son magnéticamente neutros). Entre los dos tipos de iones del Fe se producen interacciones de acoplamiento de los espines en las direcciones antiparalelas. Sin embargo se produce un momento ferrimagnético neto, debido a que los momentos de espín no se cancelan completamente. 9 Si los espines apuntan en direcciones contrarias se obtiene antiferromagnetismo; todos los espines son del mismo tipo. Los momentos magnéticos elementales forman dos subconjuntos de valores iguales, orientados en dos direcciones opuestas67, por lo que un cuerpo antiferromagnetico no tendrá imanación espontanea68. ↑↓↑↓↑↓ Antiferromagnetismo 9 Las nanopartículas compuestas por materiales ferromagnéticos o ferrimagnéticos y de un cierto tamaño (menos de 30 nm69, 67 Lévy E, 2004. 68 Hlawiczka P, 1977. 69 Chiang CL y cols., 2006. Introducción - 37 - generalmente entre 10 y 20 nm), manifiestan una forma única de magnetismo llamada superparamagnetismo55. La palabra superparamagnetismo ha sido elegida porque estas sustancias tienen una magnetización parecida a las paramagnéticas. Este fenómeno está presente solo en las nanopartículas55 (que son parte fundamental de nuestro trabajo de investigación), cuyo tamaño es inferior a los que normalmente causan las interacciones de espín (están compuestas de un solo dominio)70. Con estos tamaños, algunas partículas son tan pequeñas que el fenómeno cooperativo del ferromagnetismo no se puede observar y, si se retiran del campo magnético no conservan magnetización permanente57, 69, 71. De todas formas aún exhiben fuertes propiedades paramagnéticas57. Las partículas de oxido de hierro se comportan diferentemente en el campo magnético cuando pasan del micrómetro al nanómetro. Por ejemplo entre 6 y 15 nm actúan como superparamagnéticas, mientras cuando el tamaño pasa al rango del micrómetro, actúan como ferromagnéticas. 1.9. Nanopartículas magnéticas de oxido de hierro recubiertas con sílica La síntesis de fluidos magnéticos estables, que contengan pequeñas partículas, distribuidas de manera uniforme, con una elevada magnetización es muy importante72. En la práctica, las partículas magnéticas por si solas, no son muy útiles y están sujetas a las siguientes limitaciones: 9 tienden a formar agregados; 9 si no son lo suficientemente estables, su estructura original puede cambiar, causando una alteración de las propiedades 70 Kumar CSSR, 2009. 71 Lu AH y cols., 2007. 72 Santra S y cols., 2001. Introducción - 44 - Modificar las superficies por silanización es un proceso complejo, influenciado por varios parámetros como el tiempo de reacción, la temperatura, la concentración del silano y el tipo de grupo funcional89. En un esquema simplificado, este proceso se puede resumir en dos puntos: 9 El organosilano se mete en una solución acuosa en presencia de un acido, que actúa como catalizador. Se hidroliza, y se verifica una reacción de condensación que produce un polímero del silano. Los grupos alcóxido (-OC2H5) vienen sustituidos por los grupos hidroxilo (-OH), para formar grupos silanol reactivos, que condensan con otros grupos silanol, para formar enlaces siloxanicos (Si-O-Si). Como productos de condensación se producen alcohol (C2H5OH) y agua. (Ver Figura 28). Figura 28: Reacción simplificada de hidrólisis y condensación del APTS, con la formación de un polímero del silano. (Yamaura y cols., 2004). 9 Los polímeros se unen a la magnetita formando enlaces covalentes con los grupos OH. (Ver Figura 29). Figura 29: Reacción de silanización simplificada entre el APTES y la superficie de la magnetita. (Yamaura y cols., 2004). En la Figura 30 se describe el mismo fenómeno, pero utilizando otro trialcoxysilano: el (3 -mercaptopropil) trimetoxisilano (3-MPTS). 89 Yamaura M y cols., 2004. Introducción - 45 - Figura 30: Silanización del vidrio con 3-MPTS. (Halliwell CM y cols., 2001). 2. OBJETIVOS Objetivos - 49 - El uso de partículas magnéticas, basadas en la absorción inespecífica de ácidos nucleicos, en los métodos de extracción de VIH condiciona nuestra capacidad de detección de especies minoritarias, introduciendo sesgos en las técnicas genotípicas, que podemos utilizar para la evaluación de antirretrovirales, p. ejem., análisis del uso de correceptores. El uso de una población estándar de especies VIH nos permitiría evaluar los diferentes sistemas de extracción, y su tolerancia a la hora de detectar la presencia porcentual de dichas especies. Además podríamos establecer si, tras amplificación, los métodos de extracción disponibles, con sus distintas químicas y calidad de nanopartículas, son o no irrelevantes en su aplicación diagnóstica, como a veces parece desprenderse en la literatura científica90. Al disponer de un sistema que permite comparar los rendimientos en la extracción, es posible tratar de mejorar el diseño de las nanopartículas, mejorar los tiempos y las capacidades de los sistemas actualmente disponibles, que marcan los flujos de trabajo en los laboratorios de diagnóstico clínico. Por estas razones nos proponemos los siguientes objetivos: 1.- Diseñar un estándar basado en construcciones del plásmido pNL4.3, que tiene la estructura genómica del VIH-1, y que usaremos para valorar los procesos de extracción automática y comparar las concentraciones de los ácidos nucleicos extraídos. 2.- Validación y comparación de nanopartículas magnéticas que puedan mejorar los procesos de extracción de ácidos nucleicos en equipos automáticos en uso. 90 Delobel P y cols., 2007. 3. MATERIALES Materiales - 53 - 3.1. Aspectos generales - Todos los procesos fueron realizados con matraces de vidrio o tubos de plástico estériles. - Las medidas fueron realizados con pipetas de vidrio de 5 o 10 ml o micropipetas con puntas estériles de 0.1 μI hasta 1000 μI. - Todas las medidas de peso fueron realizadas con la balanza electrónica de precisión de marca Precisa 620 C. - El pH ha sido determinado con un indicador universal de pH (pHindikatorpapier Universal indikator, pH 1-10), Merck. - Para la construcción de una población estándar de plásmidos (para conseguir el objetivo 1) se utilizó una mezcla de los siguientes pseudotipos: NL4.3, NL4.3 4254C, NL4.3 4411X, NL4.3 4634X, NL4.3 4696C, como plásmidos circulares, o linearizados mediante corte con enzimas de restricción. - La extracción de las mezclas se realizó en los siguientes equipos automáticos basados en nanopartículas magnéticas: Ampliprep™ (Roche), Hamilton (Versant® kPCR, Siemens), MagNa Pure Compact™ (Roche). - Como control se utilizaron columnas QIAmp™ (QIAGEN), que se basan en cartuchos de filtración. - Las concentraciones de los ácidos nucleicos fueron determinadas por fluorometría Qubit™ (Invitrogen). - La centrifuga utilizada para precipitar y recuperar las células, para su posterior utilización en la plasmiprep, fue Labofuge 400 Heraeus, a 4000 x g por 15 minutos. - La centrifuga utilizada en las plasmipreps fue Beckman Coulter Alegra 25 R centrifuge, a ≥ 15000 x g por 30 minutos y por 10 minutos. Materiales - 60 - Etanol al 70%, gel de agarosa, TAE 50x, TAE1x, T.E. a pH 8. - Utilizamos ampicilina (Sigma-Aldrich), como sal sódico, conservada en la nevera entre 2°C y 8°C. - El bromuro de etidio (Amresco®) lo utilizamos en solución, a una concentración de 0.625 mg/ml. - El Etanol absoluto utilizado fue producido por Merck y conservado a temperatura ambiente. - La agarosa utilizada fue producida por Sigma-Aldrich y conservada a temperatura ambiente. 3.5.1. Medios de cultivo Hemos utilizado dos tipos de medio de cultivo: LB Broth, Lennox (DifcoTM), para la fase a medio liquido para miniprep y plasmiprep, y LB Agar, Lennox (DifcoTM), para la fase a medio solido para miniprep. (Los dos están suministrados por Becton, Dickinson and Company). A ambos les añadimos 500 μl de ampicilina (obtuvimos así LB-A), de concentración 100 mg/ml; nuestros plásmidos llevan el gen de resistencia a dicho antibiótico y de esta manera pudimos seleccionar el crecimiento de aquellas bacterias que tenían el plásmido incorporado. Î La composición de LB Broth, Lennox (DifcoTM), por litro de disolución es: - Triptona 10g - Extracto de levadura 5.0g - Cloruro de Sodio (NaCI) 5.0g El pH final es 7±0.2. Î La composición de LB Agar, Lennox (DifcoTM), por litro de disolución es: - Triptona 10g Materiales - 61 - - Extracto de levadura 5.0g - Cloruro de Sodio (NaCI) 5.0g - Agarosa 15g El pH final es 7±0.2. 3.6. Partículas Magnéticas Hemos utilizado varios tipos de partículas magnéticas de tamaños y composiciones diferentes: FeO-2202-W, TEOS-07B, TEOS-07, FeO-2204W, FeO-2207-APS, FeO-2206-W 5 mg/ml, FeO-2206-APS, FeO-2206-W 10mg/mI, producidas por Nanogap (www.nanogap.es). Hemos comparado los resultados obtenidos en la extracción manual utilizando columnas QIAmp™ (QIAGEN), con otros sistemas automáticos como el Ampliprep™ (Roche), el Hamilton (Versant® kPCR, Siemens), el MagNa Pure Compact™ (Roche). 3.6.1. Partículas FeO-2202-W Son nanopartículas de magnetita que tienen las siguientes características: Tamaño: 17 ± 4 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 13,33 (TMAOH); Concentración: 1,95% wt/wt; Color: negro; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1 g/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Materiales - 62 - Figura 36: Imágen TEM (transmission electron microscopy) de las partículas FeO-2202-W. 3.6.2. Partículas TEOS-07B Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica que tienen las siguientes características: Tamaño: 41 ± 6 nm, con un core de 8 ± 2 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 8.4 (NH4OH); Concentración: 35 mg/mI (con un 5-6% de oxido de hierro y un 9495% de sílica); Color: marrón; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1 g/mI; Densidad del las partículas: ≈ 1.5 x 1015 partíc/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Figura 37 y Figura 38: Imágenes TEM de las partículas TEOS-07B. Materiales - 63 - 3.6.3. Partículas TEOS-07 Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica que tienen las siguientes características: Tamaño: 20 ± 4 nm, con un core de 8 ± 2 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 9.9 (NH4OH); Concentración: 10 mg/mI (con un 25-30% de oxido de hierro y un 7075% de sílica); Color: marrón oscuro; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1 g/mI; Densidad del las partículas: ≈ 2.2 x 1015 partíc/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Figura 39 y Figura 40: Imágenes TEM de las partículas TEOS-07. 3.6.4. Partículas FeO-2204-W Son nanopartículas de magnetita recubiertas de PAA que tienen las siguientes características: Tamaño: 10,5 ± 4 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 10; Concentración: 20,2 mg/mI; Color: negro; Materiales - 64 - Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1 g/mI; Densidad del las partículas: ≈ 5,25 x 1018 partíc/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Figura 41: Imagen TEM de las partículas FeO2204-W. 3.6.5. Partículas FeO-2207-APS Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica y funcionalizadas con APS; tienen las siguientes características: Tamaño: 47 ± 4 nm, con un core de 10,5 ± 3 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 9.40; Concentración: 24,86 mg/mI; Color: marrón; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1,01 g/mI; Densidad del las partículas: ≈ 1,71 x 1017 partíc/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Materiales - 65 - Figura 42: Imagen TEM de las partículas FeO2207-APS. 3.6.6. Partículas FeO-2206-W 5 mg/ml Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica que tienen las siguientes características: Tamaño: 26 ± 3 nm, con un core de 10 ± 2 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 8,66; Concentración: 5,25 mg/mI; Color: marrón oscuro; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 0,99 g/mI; Densidad del las partículas: ≈ 2,04 x 1017 partíc/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Figura 43: Imagen TEM de las partículas FeO2206 5mg/ml. Materiales - 66 - 3.6.7. Partículas FeO-2206-APS Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica que tienen las siguientes características: Tamaño: 24,2 ± 3,4 nm, con un core de 10 ± 2 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 8,22; Concentración: 4,99 mg/mI; Color: marrón oscuro; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1,00 g/mI. Se guardan a temperatura ambiente. Figura 44: Imagen TEM de las partículas FeO2206-APS. 3.6.8. Partículas FeO-2206 10 mg/ml Son nanopartículas de magnetita recubiertas de sílica que tienen las siguientes características: Tamaño: 20,7 ± 3,1 nm, con un core de 10 ± 2 nm; Forma del producto: disperso en agua, pH= 9,08; Concentración: 10,45 mg/mI; Color: marrón oscuro; Volumen: vienen en botes de 5 mI; Densidad del producto: 1,00 g/mI. Materiales - 67 - Se guardan a temperatura ambiente. Figura 45: Imagen TEM de las partículas FeO2206 10 mg/ml. 3.6.9. Aspectos generales de las partículas paramagnéticas comerciales (Siemens) Son partículas pequeñas (< 1μm)92 y homogéneas, pero son mucho más grandes que las de Nanogap. Tienen un elevado porcentaje de hierro, un paramagnetismo muy bueno y se pueden guardar quedándose estables. Figura 46: Imagen de las partículas paramagnéticas comerciales (Siemens). 92 Hennig G, 2008. 4. MÉTODOS Métodos - 76 - - Se extrae el casete ApaI/PfIMI y se reintroduce en pNL4.3. - Se obtendrán los plásmidos pNLC4254, pNLC4696, pNLX4411 (o pNL 4.3 4254C, pNL4.3 4696 C, pNL4.3 4411X). 4.3. Preparación de Soluciones 4.3.1. Ampicilina (100 mg/mI) Para preparar una solución de ampicilina de concentración 100 mg/mI, pesamos 0.60g de Ampicilina (Sigma-Aldrich), y disolvemos en 6 mI de Agua inyectable (Meinsol®). De esta manera obtuvimos una cantidad suficiente por 12 alícuotas de 500 μI cada una, que guardamos en tubos Eppendorf y congelado a -20°C. 4.3.2. Etanol al 70% Hemos utilizado 70 mI de Etanol Absoluto (Merck), y 30 mI de agua destilada (Grifols®), y guardado a temperatura ambiente. 4.3.3. TAE 50x Para preparar un litro de TAE 50x hemos disuelto: - Tris Acetato (0.4 M) 242 g - Acido Acético 57.1 ml - EDTA (0.5 M) 100 mI y guardado a temperatura ambiente. 4.3.4. TAE 1x Para preparar un litro de TAE 1x hemos mezclado 980 mI de agua destilada (Grifols®) y 20 mI de TAE 50x, y guardado a temperatura ambiente. Métodos - 77 - 4.3.5. T.E. Para preparar 50 mI de T. E. a pH 8 hemos mezclado: - Tris-Cloridrico (1 M) 500 μI - EDTA (0.5 M) 100μI - Agua destilada (Grifols®) 49.4 mI y guardado a temperatura ambiente. 4.4. Logro del objetivo 1 4.4.1. Construcción del estándar de plásmidos Para obtener una población estándar de plásmidos hemos utilizado una mezcla de los cinco plásmidos ya mencionados: pNL4.3, pNL4.3 4254C, pNL4.3 4411X, pNL4.3 4634X, pNL4.3 4696C. Esta mezcla de construcciones se pudo obtener como: - plásmidos circulares (pNL4.3, pNL4.3 4254C, pNL4.3 4411X, pNL4.3 4634X, pNL4.3 4696C); - plásmidos linearizados (mediante corte común con Apa I); 4.4.2. Obtención de los plásmidos 4.4.2.1. Fase a medio solido para miniprep El primer paso es preparar la fase a medio solido. Hemos disuelto 17,5 g de LB Agar, Lennox (DifcoTM) en 500 mI de agua destilada (Grifols®), y sometido a esterilización en autoclave; dejamos atemperar pero sin que se solidifique, y añadimos 500 μl de ampicilina con concentración de 100 mg/mI (así obtuvimos LB Agar-Ampicilina). Antes de que se solidifique, vertemos el medio así preparado en las Placas de Petri y dejamos solidificar a temperatura ambiente. Las conservamos en la nevera ente 2 y 8°C. Métodos - 78 - 4.4.2.2. Sembrar las Placas de Petri En las Placas Petri sembramos las bacterias, que tienen integrado el respectivo plásmido (en cada placa un plásmido distinto), a partir de stocks en glicerol de estas bacterias que están guardados a -80°C. Las dejamos toda la noche en estufa a 37°C. 4.4.2.3. Fase a medio liquido para miniprep y plasmiprep Hemos disuelto 10 g de LB Broth, Lennox (DifcoTM), en 500 mI de agua destilada (Grifols®), y sometido a esterilización en autoclave. Dejamos atemperar y añadimos 500 μI de Ampicilina de concentración 100 mg/mI (obtuvimos así LB-A). 4.4.2.4. Miniprep A este punto pudimos escoger de la Capsula de Petri, una a una, cuatro colonias de cada plásmido y verter, por separado, en tubos que contenían ~4 mI de LB-A. Así, hemos preparado 4 tubos por cada plásmido. Estos tubos los dejamos toda la noche en agitación en estufa a 37°C. Al día siguiente realizamos la miniprep utilizando el protocolo por la preparación de ADN plasmídico de NucleoSpin® Plasmid (MachereyNagel, Cultek), por el protocolo véase ANEXO IV. Con el método NucleoSpin® Plasmid, las bacterias precipitadas por centrifugación se resuspenden (Buffer A1) y el DNA plasmídico se libera desde las células E. Coli por lisis SDS/alcalina (Buffer A2)93. El Buffer A3 neutraliza el lisado y crea las condiciones apropiadas para que el DNA se una a la membrana de sílica de la columna NucleoSpin® Plasmid. Las proteínas precipitadas, el DNA genómico y los restos celulares se centrifugan, y el sobrenadante se pone en la columna NucleoSpin® Plasmid. 93 Machery-Nagel, 2009. Métodos - 79 - Con este tipo de kit, las contaminaciones (sales, metabolitos, componentes celulares macromoleculares) se eliminan con un simple lavado con el Buffer A4, al que se le añadió etanol. El DNA plasmídico puro es eluido bajo fuerzas iónicas débiles con el Buffer alcalino AE (5 mM Tris/HCI, pH 8.5). 4.4.2.5. Cortes con enzimas de restricción Para comprobar las minipreps y plasmipreps, hemos utilizado cortes específicos con las enzimas de restricción. Por cada plásmido hemos preparado una mezcla específica. Î Por el pNL 4.3 hemos utilizado: - pNL 4.3 10 μI - Agua (Meinsol®) 10 μI - Buffer B 2.5 μI - Hind III 0.5 μI Î Por el p4254 hemos utilizado: - p4254 10 μI - Agua (Meinsol®) 10 μI - NEB4 2.5 μI - BSA 2.5 μI - ApaI 0.1 μI - ClaI 1 μI Î Por el p441 hemos utilizado: - p4411 10 μI - Agua (Meinsol®) 10 μI - NEB4 2.5 μI Métodos - 80 - - BSA 2.5 μI - ApaI 0.1 μI - XmaI 1 μI Î Por el p4696 hemos utilizado: - p4696 10 μI - Agua (Meinsol®) 10 μI - NEB4 2.5 μI - BSA 2.5 μI - ApaI 0.1 μI - ClaI 1 μI Î Por el p4634 hemos utilizado: - p4634 10 μI - Agua (Meinsol®) 10 μI - NEB4 2.5 μI - BSA 2.5 μI - ApaI 0.1 μI - XmaI 1 μI Para que las enzimas actúen dejamos las mezclas en un baño a 37°C, por ~1.30-2h. 4.4.2.6. Gel de agarosa Para comprobar el corte con las enzimas de restricción, hemos utilizado el gel de agarosa, que preparamos añadiendo 0.5 g de Agarosa (SigmaAldrich) a 50 mI de TAE 1x. Este preparado lo pusimos por ~ 2 minutos al microondas para poderlo disolver. Cuando atemperó añadimos una gota Métodos - 81 - del colorante BrEt (Amresco®) y dejamos solidificar en la nevera, con un peine que nos marca los pocillos donde cargaremos las muestras. Una vez solidificado, y al pasar ~ 2 horas (tiempo necesario para que los enzimas actúen en el baño 37°C), pusimos el gel en un aparato de electroforesis horizontal y cargamos las muestras en los pocillos. En nuestros experimentos hemos mezclado 10 μI de muestra con 2.5 μI de tampón de carga (Sample Loading Buffer 5x, Biorad), guardado a temperatura ambiente. En un solo pocillo hemos cargado 2x2.5 μI de marcador de peso molecular (HyperLadder I 100 lines, Bioline), guardado en la nevera entre 2 y 8°C. A este punto empezamos la electroforesis a 70 V y 500 mA, por 1.40 h. Para visualizar el gel hemos utilizado luz ultravioleta en un transiluminador, con el software Quantity One. El marcador de peso molecular produce 14 bandas distanciadas en un rango entre 200 pb y 10.000 pb. El tamaño de cada banda es un múltiplo exacto de 100 pb. Las bandas más intensas (y que permiten una muy fácil identificación) son la de 1.000 pb y la de 10.000 pb. Figura 47: Bandas visualizadas con HiperLadderI. Figura 48: Ilustración de los cinco plásmidos con sus bandas características. Métodos - 82 - 4.4.2.7. Plasmiprep Después de haber comprobado los resultados de las minipreps (mediante cortes con enzimas de restricción), pudimos proceder a la producción de los plásmidos (pasmiprep), siguiendo el protocolo por la purificación del ADN plasmídico de QIAGEN® (QIAGEN Plasmid Maxi Kit). (Por el protocolo de la plasmiprep véase, ANEXO V). El kit de QIAGEN por la purificación del DNA plasmídico, se basa en una resina patentada por QIAGEN, de elevada selectividad94. El principio de la técnica es el intercambio aniónico. Se verifica primero una lisis alcalina, seguida por la unión del DNA plasmídico a la resina de intercambio aniónico, bajo débiles condiciones salinas y de pH. RNA y proteínas precipitan y las impuridades de bajo peso molecular se eliminan con un lavado de concentración salina intermedia. El DNA plasmídico es eluido con un Buffer a elevada concentración salina y luego desalado por precipitación en isopropanol. Lavamos con etanol al 70 %, y dejamos secar. Resuspendemos en 1 mI de TE (pH 8). También después de la plasmiprep fue importante asegurarnos de haber producido los plásmidos correctos. Volvimos a cortar con las enzimas de restricción, como hicimos después de la miniprep. 4.4.3. Valoración basal de la extracción. Los plásmidos así producidos y resuspendidos en TE, están listos para ser utilizados. La extracción de las mezclas las realizamos en los siguientes equipos automáticos, basados en nanopartículas magnéticas: Ampliprep™ (Roche), Hamilton (Siemens), MagNa Pure Compact™ (Roche); como control hemos utilizado columnas QIAmp™ (QIAGEN), que se basan en cartuchos de filtración. 94 QIAGEN, 2005. Métodos - 83 - Para cada caso establecimos condiciones iguales de operación. El rendimiento en cuanto a concentración lo establecimos por fluorometría Qubit™ (Invitrogen). (Véase ANEXO I). Para los principios de funcionamiento de estos sistemas de extracción véase ANEXO II. 4.5. Capacidad de recuperación de especies minoritarias Cambiando las condiciones de la mezcla de construcciones de NL4.3, diluyendo seriadamente tres de los plásmidos, hemos tratado de ver la tolerancia de los distintos métodos para la recuperación de las cuatro diferentes especies por pirosecuenciación. 4.5.1. Análisis de integridad El factor que previsiblemente condiciona el proceso de extracción de una forma más evidente es la fragmentación de los ácidos nucleicos por agitación, en los procesos de lavado y cambio de reactivos del proceso automatizado. Para valorar si este es un proceso aleatorio o no y la importancia en la recuperación de las especies minoritarias hemos realizado un análisis de este proceso en tres pasos: - Transformación de E. coli DH5 - Análisis clonal (seleccionamos al menos 20 minipreps de las colonias transformadas) utilizando cortes con las enzimas de restricción seleccionadas (Apa I, Xma I y Cla I) - Pirosecuenciación (Véase también ANEXO III). Este procedimiento es alternativo y más rápido que el análisis con cortes por enzimas de restricción; lo realizamos en un pirosecuenciador PyroMark ™(ISOGEN). Las secuencias de los primers diseñados para la caracterización de los SNPs de nuestra población VIH fueron las siguientes: Métodos - 84 - 4.5.1.1. Secuencias de los primers usados en la pirosecuenciación SET 1: F1 (biotinilado): ACA AAG GAA TTG GAG GAA ATG AAC R1: CTC ATG TTC TTC TTG GGC CTT AT S1 (←): TTC TTC TTG GGC CTT A Secuencia a analizar: TCG/T ATT CCA TCT AAA AAT AGT ACT TTC C SET 1.2: F1 (biotinilado): ATG TCA GCT AAA AGG GGA AGC C R1: GCT GTT TCT TGC CCT GTC TCT S1(←): TCT AGC TGC CAT ATT CC Secuencia a analizar: C/TGG GCT ACA GTC TAC TTG TCC ATG CA SET 1.3: F1: TAC AGA CAA TGG CAG CAA TTT CAC R1 (biotinilado): ATG CCA AAT TCC TGC TTG ATC C S1 (→): TTA AGG CCG CCT GTT Secuencia a analizar: GGT G G/C G/C C GGG GAT CAA GCA GGA ATT TGGC SET 1.4: F1: AGC AGA GAC AGG GCA AGA AAC A R1 (biotinilado): CTG CCA TTT GTA CTG CTG TCT TAA S1 (→): AGT CAA GGA GTA ATA GAA TC Secuencia a analizar: T/G ATG AAT AAA GAA TTA AAG AAA ATT A 4.5.1.2. Resultados de la pirosecuenciación Los resultados de la secuenciación de cada plásmido, por separado y con los distintos juegos de primers, utilizando el pirosecuenciador fueron los siguientes: pNL 4.3 - S1 TCT ATT CCA TCT AAA Métodos - 85 - p4411 -S1 TCT ATT CCA TCT AAA AAT A p4254 -S1 TCG ATT CCA TCT AAA AAT AG p4634 -S1 TCT ATT CCA TCT AAA AAT A p4696 -S1 TCT ATT CCA TCT AAA AAT A pNL 4.3 - S1.2TGG GCT ACA GTC p4411 - S1.2 CGG GCT ACA GTC p4254 S1.2 TGG GCT ACA GTC p4634 - S1.2 TGG GCT ACA GTC p4696 - S1.2 TGG GCT ACA GTC pNL 4.3 -S1.3 GGT GGG CGG GGA TCA AGC A p4411 -S1.3 GGT GGG CGG GGA TCA AGC A p4254 -S1.3 GGT GGG CGG GGA TCA AGC A p4634 -S1.3 GGT GCC CGG GGA TCA AGC A p4696 -S1.3 GGT GGG CGG GAT CAA GCA pNL 4.3 - S1.4 TAT GAA TAA AGA ATT AAA GAA p4411 - S1.4 TAT GAA TAA AGA ATT AAA GAA p4254 S1.4 TAT GAA TAA AGA ATT AAA GAA p4634 - S1.4 TAT GAA TAA AGA ATT AAA GAA A p4696 - S1.4 GAT GAA TAA AGA ATT AAA GAA Se hizo la mezcla de los plásmidos a igual concentración, y se pirosecuenció por SNP. Los resultados preliminares obtenidos al analizar una mezcla de las construcciones y previos al proceso de extracción, analizando por cuantificación (AQ mode), fueron los siguientes: Mezcla con SET 1: T=83.2%; G=16.8%. Mezcla con SET 1.2: T=83.7%; C=16.3%. Resultados - 92 - Extracción 1: [ μg /ml ] DE PARTIDA μg TOTALES EN 210 μl μg /mI TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS EN 70 μI RENDIMIENTO % A1 423,33 88,90 6,283 0,4398 0,49 A2 202,00 42,42 5,243 0,3670 0,87 A3 94,57 19,86 5,013 0,3509 1,77 A4 44,67 9,38 3,340 0,2338 2,49 A5 21,33 4,48 1,790 0,1253 2,80 A6 10,47 2,20 0,757 0,0530 2,41 A7 4,88 1,02 0,305 0,0214 2,09 A8 2,52 0,53 0,167 0,0117 2,22 A9 1,27 0,27 0,101 0,0071 2,66 A10 0,57 0,12 0,052 0,0036 3,02 A11 0,25 0,05 0,034 0,0023 4,42 A12 0,11 0,02 0,018 0,0013 5,39 Tabla 2: Extracción automática en el Ampliprep. Grafico 1: Ilustración de la extracción automática en el Ampliprep. Se puede observar que los rendimientos de la extracción mejoran a bajas concentraciones de muestra. Resultados - 93 - Extracción 2: [μg /mI] DE PARTIDA μg TOTALES EN 210 μI μg /mI TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS EN 70 μI RENDIMIENTO % A1 423,33 88,90 6,283 0,4398 0,49 A2 202,00 42,42 5,243 0,3670 0,87 A3 94,57 19,86 5,013 0,3509 1,77 A4 44,67 9,38 3,340 0,2338 2,49 A5 21,33 4,48 1,790 0,1253 2,80 A6 10,47 2,20 0,757 0,0530 2,41 A7 4,88 1,02 0,305 0,0214 2,09 A8 2,52 0,53 0,167 0,0117 2,22 A9 1,27 0,27 0,101 0,0071 2,66 A10 0,57 0,12 0,052 0,0036 3,02 A11 0,25 0,05 0,034 0,0023 4,42 A12 0,11 0,02 0,018 0,0013 5,39 Tabla 3: Extracción automática en el Ampliprep. Grafico 2: Ilustración de la extracción automática en el Ampliprep. También en este experimento observamos que los rendimientos de la extracción mejoran a bajas concentraciones de muestra. Resultados - 94 - Extracción 3 [ μg /ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 210 μI μg /ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 70 μI) RENDIMIENTO % A1 386,67 81,20 9,57 0,670 0,83 A2 164,67 34,58 7,51 0,525 1,52 A3 77,73 16,32 6,44 0,451 2,76 A4 39,13 8,22 3,94 0,276 3,35 A5 17,90 3,76 2,33 0,163 4,34 A6 9,02 1,89 0,99 0,070 3,67 A7 4,29 0,90 0,65 0,046 5,05 A8 2,06 0,43 0,22 0,016 3,59 A9 1,01 0,21 0,16 0,011 5,23 A10 0,48 0,10 0,08 0,006 5,57 Tabla 4: Extracción automática en el Ampliprep. Grafico 3: Ilustración de la extracción automática en el Ampliprep. También en este experimento se observa que los rendimientos de la extracción mejoran a bajas concentraciones de muestra. Resultados - 95 - Extracción 4: [μg /ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 210 μI μg /ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 70 μI) RENDIMIENTO % A1 386,67 81,20 9,57 0,670 0,83 A2 164,67 34,58 7,51 0,525 1,52 A3 77,73 16,32 6,44 0,451 2,76 A4 39,13 8,22 3,94 0,276 3,35 A5 17,90 3,76 2,33 0,163 4,34 A6 9,02 1,89 0,99 0,070 3,67 A7 4,29 0,90 0,65 0,046 5,05 A8 2,06 0,43 0,22 0,016 3,59 A9 1,01 0,21 0,16 0,011 5,23 A10 0,48 0,10 0,08 0,006 5,57 Tabla 5: Ilustración de la extracción automática en el Ampliprep. Grafico 4: Ilustración de la extracción automática en el Ampliprep. También en este experimento se confirman los datos obtenidos en los experimentos precedentes: los rendimientos de la extracción mejoran a bajas concentraciones de muestra. Resultados - 96 - 5.3. Comparación de la extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp™ (QIAGEN) En estos experimentos vamos a comparar dos distintos métodos de extracción: el de QIAGEN y el del Hamilton (Siemens). El primero es un método manual, que se basa en los principios de la cromatografía de adsorción, mientras el segundo es un método automático, que utiliza partículas magnéticas. 5.3.1. Comparación de extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp™ (QIAGEN) tras corte con la enzima Apa I Vamos a comparar las dos técnicas de extracción (automática y manual respectivamente), cortando los plásmidos con la enzima de restricción Apa I, que los lineariza. ¾ Para trabajar con el Hamilton empezamos con una concentración inicial de plásmido de ~100 μg/mI, que vamos a diluir 1: 2 con T.E. Trabajamos con 8 muestras (que van de H1 a H8), que cortamos con la enzima Apa I. ¾ Medimos la concentración también después del corte: MEDIDAS ANTES DEL CORTE CON APA I MEDIDAS DESPUES DEL CORTE CON APA I 107,33 74,03 46,97 37,47 25,50 19,93 11,13 11,57 5,40 6,53 2,51 6,33 1,10 3,96 0,44 3,74 Tabla 6: Medidas de concentración antes y después del corte con Apa I. Resultados - 97 - Podemos observar que, después del corte, disminuye la concentración de aquellas muestras que tenían un concentración inicial más elevada (~100 μg/mI), mientras que, aquellas que tenían concentraciones más bajas (~11 μg/mI), tienen una concentración más elevada. ¾ Tras linearización, se extrajeron las muestras en el Hamilton: [μg /ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 600 μI μg /ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 60 μI) RENDIMIENTO % H1 74,03 44,42 12,80 0,77 1,73 H2 37,47 22,48 10,77 0,65 2,87 H3 19,93 11,96 9,74 0,58 4,89 H4 11,57 6,94 7,00 0,42 6,05 H5 6,53 3,92 0,00 0,00 0,00 H6 6,33 3,80 3,20 0,19 5,06 H7 3,96 2,37 1,94 0,12 4,89 H8 3,74 2,25 1,04 0,06 2,79 Tabla 7: Extracción automática en el HAMILTON, tras corte con la enzima APAI (plásmido linearizado). Podemos observar que, con el plásmido linearizado los rendimientos no crecen de manera proporcional a la cantidad de muestra introducida. Se verifica un aumento del rendimiento a una concentración intermedia (~ 11 μg/mI), pero vuelve a disminuir a concentraciones inferiores. Grafico 5: Ilustración de la extracción en el Hamilton, tras corte con la enzima APAI (plásmido linearizado). Resultados - 98 - ¾ Para trabajar con QIAGEN empezamos con una concentración de plásmido de ~230 μg/mI que vamos a diluir 1: 2 con T.E. Trabajamos con 8 muestras (que van de Q1 a Q8), que cortamos con la enzima Apa I. ¾ Medimos la concentración también después del corte: MEDIDAS ANTES DEL CORTE CON APA I MEDIDAS DESPUES DEL CORTE CON APA I 333,33 230 141,67 107 64,50 47,70 31,73 24,60 15,40 13,63 7,48 7,48 3,67 3,77 1,98 2,29 Tabla 8: Medidas de concentración antes y después del corte con Apa I. Se observan también diferencias de concentración entre antes y después del corte, pero parece que a bajas concentraciones sean menores. ¾ Tras linearización, se extrajeron las muestras con el método manual (QIAGEN): [μg /ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 200 μI μg /ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 200 μI) RENDIMIENTO % Q1 230,00 46,00 103,33 20,67 44,93 Q2 107,00 21,40 70,77 14,15 66,14 Q3 47,70 9,54 37,93 7,59 79,52 Q4 24,60 4,92 18,13 3,63 73,71 Q5 13,63 2,73 9,87 1,97 72,37 Q6 7,48 1,50 4,31 0,86 57,69 Q7 3,77 0,75 2,21 0,44 58,76 Q8 2,29 0,46 1,19 0,24 51,74 Tabla 9: Extracción manual con QIAGEN, tras corte con la enzima APAI (plásmido linearizado). Resultados - 99 - Grafico 6: Ilustración de la extracción manual con QIAGEN, tras corte con la enzima APAI (plásmido linearizado). Podemos observar que a concentraciones muy altas (230 μg/mI) de plásmido no tenemos un rendimiento tan grande en la extracción, como cuando introducimos cantidades menores. Se observa que a partir de una concentración de ~107 μg/mI, los rendimientos empiezan a bajar proporcionalmente a las cantidades de muestra introducidas. 5.3.2. Comparación de la extracción entre el Hamilton (Siemens) y QIAmp® (QIAGEN) sin corte con la enzima Apa I Vamos a comparar las dos técnicas de extracción (automática y manual respectivamente), pero trabajando con los plásmidos circulares (sin cortar con la enzima de restricción Apa I). ¾ Para trabajar con el Hamilton empezamos con una concentración inicial de plásmido de ~400 μg/mI, que diluimos 1: 2 con T.E. ¾ Trabajamos con 11 muestras (que van de H1 a H11), que introducimos en este sistema automático: Resultados - 100 - [μg/ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 600 μl μg /ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 50 μl) RENDIMIENTO % H1 356,67 214,00 24,40 1,22 0,57 H2 146,67 88,00 16,80 0,84 0,95 H3 72,87 43,72 16,90 0,85 1,93 H4 33,63 20,18 14,97 0,75 3,71 H5 16,87 10,12 11,93 0,60 5,90 H6 8,14 4,88 8,46 0,42 8,66 H7 3,99 2,40 6,08 0,30 12,69 H8 2,00 1,20 3,50 0,17 14,57 H9 1,07 0,64 1,47 0,07 11,51 H10 0,55 0,33 0,86 0,04 13,10 H11 0,24 0,15 0,46 0,02 15,85 Tabla 10: Extracción automática en el HAMILTON, con el plásmido circular. Se puede observar que, trabajando con el plásmido circular, los rendimientos de la extracción aumentan de manera proporcional a la menor concentración de muestras introducidas. A bajas concentraciones de muestra (0.24 μg/mI), tenemos un rendimiento del 15.85%, pero a elevadas concentraciones (356.67 μg/mI), el rendimiento es de solo un 0.57%. Grafico 7: Ilustración de la extracción en el Hamilton (plásmido circular). ¾ También para trabajar con QIAGEN empezamos con una concentración de plásmido de ~400 μg/mI, que diluimos 1: 2 con T.E. Resultados - 101 - ¾ Trabajamos con 12 muestras (que van de Q1 a Q12) que extraemos manualmente: [μg/ml] DE PARTIDA μg TOTALES EN 190 μI ug/ml TRAS EXTRACCION μg TOTALES EXTRAIDOS (EN 200 μI) RENDIMIENTO % Q1 486,67 92,47 98,70 19,74 21,35 Q2 253,33 48,13 110,00 22,00 45,71 Q3 116,00 22,04 67,00 13,40 60,80 Q4 57,27 10,88 37,87 7,57 69,60 Q5 28,70 5,45 22,20 4,44 81,42 Q6 13,77 2,62 10,20 2,04 77,99 Q7 7,38 1,40 5,00 1,00 71,24 Q8 3,59 0,68 2,42 0,48 70,96 Q9 1,88 0,36 1,31 0,26 73,53 Q10 0,99 0,19 0,58 0,12 61,83 Q11 0,52 0,10 0,27 0,05 55,60 Q12 0,24 0,04 0,14 0,03 64,34 Tabla 11: Extracción manual con QIAGEN, con el plásmido circular. En este experimento, también se observa que los rendimientos más elevados se verifican a concentraciones menores, pero de manera menos evidente que con el Hamilton. A la concentración inicial (~400 μg/mI), tenemos un rendimiento de solo el 20 %, pero a partir de ~100 μg/mI de concentración observamos rendimientos del ~60 %, hasta obtener un máximo de 80 % a la concentración de ~30 μg/mI. Grafico 8: Ilustración de la extracción con QIAGEN (plásmido circular). Resultados - 108 - 5.4.3. Ampliprep En este caso también, para poder evaluar la reproducibilidad de este aparato automático, introducimos 20 muestras de concentración parecida (~150 μg/mI). μg/ml TRAS EXTRACCION μg EN 70 μI DE ELUCION A1 6,50 0,45 A2 6,08 0,43 A3 6,50 0,46 A4 5,64 0,39 A5 6,56 0,46 A6 6,50 0,45 A7 6,99 0,49 A8 6,16 0,43 A9 6,51 0,46 A10 6,31 0,44 A11 6,65 0,47 A12 6,82 0,48 A13 7,05 0,49 A14 6,19 0,43 A15 6,28 0,44 A16 6,76 0,47 A17 6,44 0,45 A18 6,36 0,45 A19 6,27 0,44 A20 5,54 0,39 Tabla 16: Prueba de reproducibilidad en el AMPLIPREP, utilizando 20 muestras de concentración parecida. Se puede observar que en las 12 muestras, los extraídos tienen una concentración bastante constante. Resultados - 109 - Observamos que la reproducibilidad es más o menos constante, como se puede observar también en el Grafico 13. Grafico 13: Ilustración de la reproducibilidad en el AMPLIPREP utilizando 20 muestras de concentración parecida. Resultados - 110 - 5.5. Pruebas con las nanopartículas magnéticas de Nanogap Tenemos a disposición varios tipos de nanopartículas magnéticas de características y tamaños diferentes: FeO-2202-W (17 nm), TEOS-07 B (41 nm), TEOS-07 (20 nm), FeO-2204- (10,5 nm), FeO-2207-APS (47 nm), FeO-2206-W 5mg/mI (26 nm), FeO-2206-APS (24 nm), FeO-2206 10 mg/mI (20 nm). Con estas partículas realizamos varios experimentos para evaluar su funcionamiento en los sistemas de extracción de ácidos nucleicos utilizados en la práctica clínica. Como sistema automático se utilizó el Hamilton, y el protocolo fue el número 4. Hemos comprobado que este aparato tiene una reproducibilidad bastante constante y, además es un sistema abierto. Esta es una gran ventaja, que nos permite poder introducir en el sistema las partículas que queremos estudiar. 5.5.1. Prueba con las partículas FeO-2202-W Utilizamos el protocolo número 4 del Hamilton. Introducimos 8 muestras de plásmido (que van de H1 a H8), de concentración decreciente. Queremos trabajar con una concentración inicial de plásmido de ~ 200 μg/ml, que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 4 μg/ml. El Hamilton por cada muestra necesita de ~ 500-600 μl. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μI MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μI RENDIMIENTO % H1 220,00 110,00 0,8193 0,04097 0,037 H2 117,33 58,67 0,6033 0,03017 0,051 H3 66,20 33,10 0,6077 0,03038 0,092 H4 39,50 19,75 0,4620 0,02310 0,117 H5 23,70 11,85 0,4170 0,02085 0,176 H6 13,73 6,87 0,3053 0,01527 0,222 H7 8,02 4,01 0,0000 0,00000 0,000 H8 4,67 2,34 0,0000 0,00000 0,000 Tabla 17: Extracción con el HAMILTON utilizando 8 muestras, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: FeO-2202-W; medidas efectuadas con el kit BR (Qubit). Resultados - 111 - Como se puede observar en la Tabla 17, el kit BR (Broad Range) del Qubit no lee todos los extraídos (debido a sus bajas concentraciones). Por esta motivación tuvimos que volver a medir sus concentraciones con el kit HS (High Sensitivity), como se puede observar en la Tabla 18. (Por el Qubit véase también el ANEXO I). MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 220,00 110,00 1,1700 0,05850 0,053 H2 117,33 58,67 0,9220 0,04610 0,079 H3 66,20 33,10 0,9640 0,04820 0,146 H4 39,50 19,75 0,7170 0,03585 0,182 H5 23,70 11,85 0,6160 0,03080 0,260 H6 13,73 6,87 0,4633 0,02317 0,337 H7 8,02 4,01 0,2507 0,01253 0,312 H8 4,67 2,34 0,1643 0,00822 0,352 Tabla 18: Extracción con el HAMILTON utilizando 8 muestras, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: FeO-2202-W; medidas tras extracción efectuadas con el kit HS (Qubit). Los eluidos de la extracción salen totalmente claros. En la placa de mezcla se ve claramente una buena retención de partículas en todos los pocillos. Grafico 14: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 8 muestras, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: FeO-2202-W. Se comparan los datos obtenidos con el kit BR y HS. Resultados - 112 - Grafico 15: En este grafico se ilustra el rendimiento % de la extracción. Se comparan los datos obtenidos con el kit BR y HS. Si observamos los datos obtenidos midiendo las concentraciones con el Qubit HS, se nota que los rendimientos son bastante bajos, aunque a concentraciones menores tenemos una pequeña mejora. 5.5.2. Nueva prueba con las partículas FeO-2202-W Repetimos el experimento anterior, utilizando siempre 8 muestras de plásmido (que van de H1 a H8) de concentración decreciente. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 300 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~7 μg/ml. Fuimos capaces de leer todos los extraídos con el kit BR (Broad Range) del Qubit. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 290,00 145,00 0,742 0,037 0,026 H2 155,33 77,67 0,490 0,025 0,032 H3 88,63 44,32 0,464 0,023 0,052 H4 52,73 26,37 0,348 0,017 0,066 H5 30,77 15,38 0,264 0,013 0,086 H6 18,37 9,18 0,220 0,011 0,120 H7 10,93 5,47 0,146 0,007 0,134 H8 6,91 3,46 0,127 0,006 0,184 Tabla 19: Extracción con el HAMILTON utilizando 8 muestras, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: FeO-2202-W; medidas efectuadas con el kit BR (Qubit). Resultados - 113 - Los eluidos de la extracción salen totalmente claros. En la placa de mezcla se ve una buena retención de partículas en todos los pocillos. Grafico 16: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 8 muestras, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: FeO-2202-W. Grafico 17: En este grafico se ilustra el rendimiento % de la extracción. En este caso también, se puede observar que los rendimientos son bastante bajos, aunque a concentraciones menores hay una pequeña mejora. Probablemente los bajos rendimientos se pueden explicar mirando la composición de las partículas. El hecho de que estén compuestas por sola magnetita, significa que tienen capacidad de adsorber el DNA, Resultados - 114 - pero los agregados que se forman, no ayudan a obtener una buena retención del mismo, porque reducen enormemente la superficie útil por su adsorción, como ha sido precedentemente demostrado en la literatura científica54. La modificación de estas partículas con rivestimientos pasivos, puede ayudar a prevenir su agregación76. Continuamos los experimentos, analizando y comparando varias partículas de magnetita, pero recubiertas de sílica. 5.5.3. Prueba con las partículas TEOS-07B Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (que van de H1 a H8) que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). Queremos trabajar con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 128,00 64,00 0,2103 0,01052 0,016 H2 57,93 28,97 0,0092 0,00046 0,002 H3 27,60 13,80 0,0128 0,00064 0,005 H4 14,83 7,42 0,0078 0,00039 0,005 H5 128,00 64,00 0,0516 0,00258 0,004 H6 57,93 28,97 0,0093 0,00047 0,002 H7 27,60 13,80 0,0088 0,00044 0,003 H8 14,83 7,42 0,0079 0,00040 0,005 Tabla 20: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B. Resultados - 115 - Grafico 18: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B. En general podemos observar rendimientos muy bajos en todo el rango de concentraciones. 5.5.4. Nueva prueba con las partículas TEOS 07 B Repetimos el experimento anterior, utilizando siempre 8 muestras de plásmido (que van de H1 a H8) que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~20 μg/ml. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 120,67 60,33 21,63 1,08 1,79 H2 56,07 28,03 29,17 1,46 5,20 H3 27,27 13,63 65,10 3,26 23,88 H4 13,23 6,62 21,90 1,10 16,55 H5 121,00 60,50 54,60 2,73 4,51 H6 53,93 26,97 66,43 3,32 12,32 H7 26,43 13,22 35,63 1,78 13,48 H8 13,27 6,63 17,57 0,88 13,24 Tabla 21: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B. Resultados - 116 - Grafico 19: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B. N.B.: salieron muestras turbias con restos de partículas. En este experimento se puede notar una mejora consistente de los rendimientos en comparación con el primer experimento. En general observamos que los rendimientos mejoran a concentraciones menores. 5.5.5. Prueba con las partículas TEOS-07B y BSA En estas pruebas vamos e repetir los experimentos precedentes pero a 4 de las muestras con concentraciones iguales por duplicado les añadimos 60 μl de BSA. El BSA nos ayuda a crear condiciones parecidas a las muestras de la práctica clínica, (que pueden contener restos de proteínas u otros contaminantes); evaluamos así si el BSA interfiere en la extracción. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8), las muestras que van de H1 a H4 llevan BSA añadido. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 100 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 15 μg/ml. Resultados - 117 - MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 95,40 47,70 1,07 0,054 0,11 H2 47,80 23,90 2,47 0,124 0,52 H3 25,10 12,55 9,99 0,500 3,98 H4 13,23 6,62 0,78 0,039 0,59 H5 93,50 46,75 16,30 0,815 1,74 H6 45,23 22,62 0,99 0,049 0,22 H7 23,57 11,78 0,76 0,038 0,32 H8 11,93 5,97 1,08 0,054 0,91 Tabla 22: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07B. (De H1 a H4 le añadimos 60 ul de BSA). Grafico 20: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B. (De H1 a H4 le añadimos 60 μl de BSA). OBSERVACIONES: La muestra H5 tras extracción resultó manchada con restos de partículas. Los rendimientos de la extracción se mantienen bajos y las muestras que llevan el BSA añadido tienen rendimientos aún peores. Resultados - 124 - partículas en el Buffer de Nanogap, se puede observar que la extracción mejora si cambiamos el Buffer por el del Versant® kPCR (Siemens). Además en este caso trabajamos con una cantidad menor de partículas, que están 3 veces más diluidas que en su Buffer original. 5.5.10. Prueba con las partículas TEOS 07 y TEOS 07 B (1:1) en el Buffer del Versant® kPCR (Siemens) Mezclamos en partes iguales (1:1) las partículas TEOS 07 y TEOS 07 B y las resuspendemos en el Buffer del Versant® kPCR (Siemens). Trabajamos con 1,5ml de partículas TEOS 07, y 1,5 mI de partículas TEOS 07B por separado; las centrifugamos para que se separen del Buffer en que están suspendidas y las disolvemos en el Buffer del Versant® kPCR, Siemens (que obtenemos de la misma forma: por centrifugación). Para resuspenderlas hicieron falta 3 y 4 mI de Buffer, respectivamente. Una vez resuspendidas las mezclamos en partes iguales. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). A las muestras que van de H1 a H4 les añadimos~ 60 μl de BSA. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. Resultados - 125 - MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 142,00 71,00 33,17 1,658 2,34 H2 64,23 32,12 21,87 1,093 3,40 H3 32,43 16,22 18,20 0,910 5,61 H4 16,20 8,10 12,63 0,632 7,80 H5 149,67 74,83 28,50 1,425 1,90 H6 67,77 33,88 21,97 1,098 3,24 H7 34,70 17,35 24,77 1,238 7,14 H8 16,20 8,10 15,77 0,788 9,73 Tabla 27: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con los dos tipos de partículas de Nanogap: TEOS-07 y TEOS-07B, en el Buffer del Versant® kPCR, Siemens. (De H1 a H4 le añadimos 60 μl de BSA). Grafico 25: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con los dos tipos de partículas de Nanogap: TEOS-07 y TEOS-07B, en el Buffer del Versant® kPCR, Siemens. (De H1 a H4 le añadimos 60 μl de BSA). En este caso también observamos mejoras a bajas concentraciones y alrededor de 15 μg/mI, pero no se observan mejoras respecto a los experimentos de las dos partículas por separado. El BSA parece que no interfiera en la extracción. Resultados - 126 - 5.5.11. Prueba con las partículas TEOS 07 y TEOS 07 B originales mezcladas 1:1 Mezclamos en cantidades iguales (1:1) los dos tipos de partículas; cada una la dejamos en su Buffer original. Usamos 1,5 ml de cada partícula. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). Queremos trabajar con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. A las muestras que van de H1 a H4 les añadimos ~ 60 μl de BSA. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 135,00 67,50 6,29 0,315 0,47 H2 64,73 32,37 4,89 0,245 0,76 H3 32,60 16,30 9,87 0,493 3,03 H4 16,43 8,22 3,10 0,155 1,88 H5 149,67 74,83 32,43 1,622 2,17 H6 68,27 34,13 13,97 0,698 2,05 H7 32,90 16,45 4,96 0,248 1,51 H8 16,47 8,23 3,01 0,150 1,83 Tabla 28: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con los dos tipos de partículas de Nanogap: TEOS-07 y TEOS-07B, en su Buffer original. (De H1 a H4 llevan 60 μl de BSA añadido). Resultados - 127 - Grafico 26: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con los dos tipos de partículas de Nanogap: TEOS-07 y TEOS-07B, en su Buffer original. (De H1 a H4 le añadimos 60 μl de BSA). Comparando este experimento con el anterior, en el que estas 2 partículas mezcladas se resuspendian en el Buffer del Versant® kPCR (Siemens), se puede observar que la extracción mejora si cambiamos el Buffer y no trabajamos con el Buffer original. 5.5.12. Prueba con las partículas TEOS-07 y las partículas paramagnéticas comerciales, Siemens (1:1) Utilizamos las mismas cantidades (1:1) de partículas TEOS 07 y partículas paramagnéticas comerciales (Siemens), cada una en su Buffer original. Usamos con 1,5 ml de cada partícula. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). A las muestras que van de H1 a H4 les añadimos ~ 60 μl de BSA. Resultados - 128 - Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 106,00 53,00 28,53 1,427 2,69 H2 49,00 24,50 24,87 1,243 5,07 H3 24,87 12,43 9,99 0,500 4,02 H4 12,83 6,42 9,94 0,497 7,75 H5 107,33 53,67 33,83 1,692 3,15 H6 48,47 24,23 24,27 1,213 5,01 H7 21,53 10,77 18,53 0,927 8,61 H8 11,77 5,88 8,22 0,411 6,99 Tabla 29: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 y las pramagnéticas comerciales (Siemens), cada una en su Buffer original. (De H1 a H4 llevan 60 μl de BSA añadido). Grafico 27: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 y las paramagnéticas comerciales (Siemens), cada una en su Buffer original. (De H1 a H4 llevan 60 μl de BSA añadido). En los experimentos anteriores se observó que con las partículas TEOS 07 se obtenían rendimientos mayores, pero en esta prueba podemos observar que mezclando estas partículas con las paramagnéticas comerciales (Siemens) no se observan mejoras evidentes. Resultados - 129 - 5.5.13. Prueba con las partículas TEOS 07 y las partículas del MagNa Pure (1:1) Utilizamos siempre las partículas TEOS 07, pero esta vez mezcladas con las del MagNa Pure. Trabajamos con las mismas cantidades (1:1) de los dos tipos de partículas, cada una en su Buffer original. Usamos 1,5 ml de cada partícula. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). Las muestras no llevan BSA añadido. Queremos trabajar con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 129,00 64,50 5,70 0,285 0,44 H2 48,90 24,45 6,41 0,321 1,31 H3 26,87 13,43 1,79 0,090 0,67 H4 14,50 7,25 1,88 0,094 1,30 H5 109,33 54,67 4,94 0,247 0,45 H6 53,47 26,73 3,36 0,168 0,63 H7 26,70 13,35 2,18 0,109 0,82 H8 12,17 6,08 1,31 0,066 1,08 Tabla 30: Extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 y las del MagNa Pure, cada una en su Buffer original. Resultados - 130 - Grafico 28: Ilustración de la extracción con el HAMILTON utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 las del MagNa Pure, cada una en su Buffer original. Mezclando estas partículas con las del MagNa Pure, tampoco se observan mejoras evidentes respecto a los otros experimentos. 5.5.14. Prueba con las partículas TEOS 07 y las partículas del MagNa Pure (1:1) en el MagNa Pure Mezclamos de nuevo las partículas TEOS 07 y las partículas del MagNa Pure utilizando la misma cantidad de cada una (1:1). Utilizamos 0,250 ml de cada partícula. La diferencia entre este experimento y el anterior es que como aparato de extracción, en vez que utilizar el Hamilton como en todos los experimentos precedentes, utilizamos el MagNa Pure. Una de las ventajas del MagNa Pure es que reduce a la mitad el tiempo necesario por la extracción; en el Hamilton necesitamos de ~ una hora y en el MagNa Pure de 35 minutos. El MagNa Pure utiliza un volumen inicial de ~ 400 μl de muestra; mientras el Hamilton utiliza ~ 500 μl. También los volúmenes de elución son diferentes: El MagNa Pure eluye ~ 100 μl y el Hamilton ~ 50 μl. Utilizamos el protocolo Total NA External Lysis del MagNa Pure y Resultados - 131 - trabajamos con 8 muestras de plásmido (que van de MP1 a MP8) que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (MP1 tiene la misma concentración que MP5, MP2 la misma que MP6, MP3 la misma que MP7, MP4 la misma que MP8). En los cartuchos que van de 1 a 4 mezclamos los dos tipos de partículas en igual cantidad (1:1), cada una en su Buffer original; En los cartuchos que van de 5 a 8 utilizamos solo las partículas TEOS 07 originales. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % MP1 158,00 63,20 0,1227 0,01227 0,019 MP2 71,57 28,63 46,0000 4,60000 16,069 MP3 35,33 14,13 32,3000 3,23000 22,854 MP4 16,57 6,63 22,1000 2,21000 33,350 MP5 163,33 65,33 0,0425 0,00425 0,007 MP6 73,40 29,36 0,0132 0,00132 0,004 MP7 35,07 14,03 0,0160 0,00160 0,011 MP8 16,97 6,79 0,0082 0,00082 0,012 Tabla 31: Extracción con el MagNa Pure utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 y las del MagNa Pure, cada una en su Buffer original. (De MP1 a MP4 utilizamos los dos tipos de partículas mezcladas, mientras de MP5 a MP8 solo las TEOS 07). Grafico 29: Ilustración de la extracción con el MagNa Pure utilizando las partículas de Nanogap: TEOS07 y las partículas del MagNa Pure mezcladas, cada una en su Buffer original. (De MP1 a MP4). Resultados - 132 - OBSERVACIONES: MP2, MP3 y MP4 resultaron turbios y con restos de partículas; esto puede haber interferido con las medidas de concentración (las partículas pueden tener restos de DNA). De hecho con el kit BR del Qubit pudimos medir solo las concentraciones de estos tres eluidos (que son los únicos 3 que dan rendimientos altos, como se puede también observar en la Tabla 31 y en el Grafico 29). Las otras medidas de concentración de los eluidos, solo se pudieron efectuar con el kit HS (que, como se explicó, se utiliza para medir bajos rangos de concentración). Grafico 30 : Ilustración de la extracción con el MagNa Pure utilizando solo las partículas de Nanogap: TEOS-07 en su Buffer original. (De MP5 a MP8). Se observan rendimientos mejores cuando se usan las dos partículas mezcladas, pero el hecho que queden restos de las mismas y que los rendimientos sean superiores a todos los experimentos efectuados hasta hora nos hace pensar que esto pueda haber influido a la hora de medir las concentraciones. Resultados - 133 - 5.5.15. Nueva extracción con las partículas TEOS-07 B Repetimos algunos de los experimentos anteriores para consolidar los datos obtenidos. En la placa de elución del Hamilton quedan restos de partículas, como si el imán no tuviese potencia suficiente para atraerlas. Trabajamos con una concentración inicial de plásmido de ~ 150 μg/ml, que diluimos 1:2 con T. E. hasta una concentración de ~ 20 μg/ml. Introducimos en el Hamilton 8 muestras de plásmido (H1-H8), que tienen 4 concentraciones iguales por duplicado (H1 tiene la misma concentración que H5, H2 la misma que H6, H3 la misma que H7, H4 la misma que H8). MEDIDA ANTES DE EXTRACCION μg TOTALES INICIALES EN 500 μl MEDIDA TRAS EXTRACCION μg TOTALES FINALES EN 50 μl RENDIMIENTO % H1 161,33 80,67 0,1033 0,00517 0,006 H2 72,03 36,02 0,0075 0,00037 0,001 H3 35,87 17,93 0,0154 0,00077 0,004 H4 17,17 8,58 0,00000 0,000 H5 159,00 79,50 0,1340 0,00670 0,008 H6 72,40 36,20 0,1417 0,00708 0,020 H7 35,47 17,73 0,0292 0,00146 0,008 H8 17,10 8,55 0,00000 0,000 Tabla 32: Extracción con el Hamilton utilizando 4 muestras, por duplicado, de concentración decreciente, con las partículas de Nanogap: TEOS-07 B.