A modificación postraducional neddilación e o seu rol no metabolismo humano

TRABALLO DE FIN DE GRAO A modificación postraducional neddilación e o seu rol no metabolismo humano La modificación postraduccional neddylación y su rol en el metabolismo humano Neddylation: a post-translational modification with a role in human metabolism Autor/a/es/as: Jose Antonio López Franco Titor/a: Carlos Diéguez González Cotitor/a: María Jesús González Rellán Departamento: Fisioloxía Setembro 2024 Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en medicina 2 Resumo O termo “modificacións postraducionais” fai referencia a todo proceso bioquímico sofrido por unha proteína trala súa biosíntese. Estas alteracións sobre a estrutura nativa da proteína, xeralmente mediante proteólise e adición de grupos modificadores, teñen a potestade de alterar a súa funcionalidade e características, polo que constitúen un mecanismo molecular fundamental á hora de entender a bioloxía da proteína. Un avance no coñecemento das diferentes modificacións postraducionais en contextos fisiolóxicos e fisiopatolóxicos ten o potencial de abrir novas opcións terapéuticas orientadas a modificar ou previr a ocorrencia dos efectos asociados á súa acción sobre os substratos proteicos. Mentres que algunhas modificacións postraducionais, como a fosforilación ou a metilación, foron descritas en profundidade e coñecidas detalladamente en canto ós seus efectos e implicacións, outras; porén, están aínda comezando a entenderse e estudarse. Un destes casos é o da neddilación. Recentes estudos preclínicos veñen de demostrar unha forte implicación da neddilación no metabolismo enerxético, particularmente no contexto da obesidade, esteatose hepática, resistencia á insulina e diabetes. Este traballo tentará dilucidar a través dunha revisión sistemática da literatura e dun repaso ad hoc da fisioloxía que liga os puntos anteriores o potencial papel fisiolóxico e fisiopatolóxico da neddilación no metabolismo enerxético. Palabras chave: Modificacións postraducionais, neddilación, diabetes mellitus tipo 2, hiperglicemia doenza hepática graxa non alcólica Abstract The term “post-translational modifications” refers to any biochemical process that a protein goes through after its biosynthesis. These alterations of a protein’s native structure, usually comprising either proteolysis or the attachment of a modifier group, allow for a change in functionality and characteristics, thus being a fundamental molecular mechanism to understand in order to understand a protein’s biology as a whole. By advancing our knowledge of post-translational modifications in health and disease, we might open new therapeutic options aiming to modify or prevent their effects entirely. While some post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, have already been described and studied extensively and are known both in terms of their implications and effects, there are some others, however, that are still in the process of being properly understood. Neddylation is one of the latter, and recent preclinical findings have shown its strong involvement in energy metabolism, especially when it comes to obesity, hepatic steatosis, insulin resistance and diabetes. This paper aims to define the potential role of neddylation within energy metabolism through a systematic review of related literature. Keywords: Post-translational modifications, neddylation, type 2 diabetes mellitus, hyperglycemia, non-alcoholic fatty liver disease Resumen El término “modificaciones postraduccionales” hace referencia a todo proceso bioquímico sufrido por una proteína tras su biosíntesis. Estas alteraciones sobre su estructura nativa, generalmente mediante proteólisis y adición de grupos modificadores, tienen la potestad de alterar su funcionalidad y características, constituyendo un mecanismo molecular fundamental a la hora de entender la biología de la proteína. Un avance en el conocimiento de las modificaciones postraduccionales en contextos fisiológicos y fisiopatológicos posee el 3 potencial de abrir nuevas opciones terapéuticas orientadas a modificar o prevenir la ocurrencia de los efectos asociados a su acción. Mientras que algunas modificaciones postraduccionales, como la fosforilación o la metilación, han sido descritas en profundidad y conocidas detalladamente en cuanto a efectos e implicaciones, otras; sin embargo, aún están comenzando a entenderse y estudiarse. Uno de estos casos es el de la neddilación. Estudios preclínicos recientes han demostrado una implicación notable de la neddilación en el metabolismo energético, particularmente en el contexto de esteatosis hepática, obesidad, resistencia insulínica y diabetes. Este trabajó tratará de dilucidar mediante una revisión sistemática de la literatura y un repaso ad hoc de la fisiología que une los puntos anteriores el potencial papel fisiológico y fisiopatológico de la neddilación en el metabolismo energético. Palabras clave: Modificaciones postraduccionales, neddylación, diabetes mellitus tipo 2, hiperglucemia, enfermedad de hígado graso no alcohólico. 4 Índice 1. Introdución ...................................................................................................................................... 8 2. Metodoloxía do traballo .................................................................................................................. 9 3. Marco teórico ................................................................................................................................ 10 3.1. As modificacións postraducionais: importancia, clases e funcións ..................................... 10 3.2. A vía das ligasas Cullin-Ring e o papel de NEDD8 .................................................................. 14 3.3 Fármacos inhibidores da neddilación: estrutura, fisioloxía e usos .............................................. 16 3.3.1 MLN4924/pevonedistat: pioneiro na inhibición de NAE .................................................... 17 3.4. Breve fisiopatoloxía da diabetes mellitus tipo 2 ........................................................................ 21 4. Estudos revisados e resultados ...................................................................................................... 26 4.1. Limiar á revisión .................................................................................................................. 26 4.2. A neddilación regula a adipoxénese do tecido adiposo branco, favorece a inflamación do mesmo e facilita a obesidade ............................................................................................................ 28 4.3. A neddilación promove a progresión da doenza hepática graxa non alcólica e a súa inhibición mellóraa ........................................................................................................................... 31 4.4. A neddilación fomenta a gliconeoxénese hepática, e a súa inhibición diminúe a resistencia á insulina e a hiperglicemia patolóxicas ........................................................................................... 34 5. Discusión....................................................................................................................................... 39 6. Conclusións ................................................................................................................................... 45 7. Bibliografía ................................................................................................................................... 46 5 Índice de figuras Fig. 1: Esquema da vía da neddilación.................................................................................. 15 Fig. 2: Táboa de elaboración propia ilustrando a totalidade dos ensaios clínicos rexistrados nos que participou un inhibidor de NAE................................................................................ 20 Fig. 3: Esquema da fisiopatoloxía da DM2, dende a dieta hipercalórica á insulinopenia.... 25 Fig. 4: Táboa resumo dos artigos revisados........................................................................... 28 Fig. 5: Esquema dos mecanismos polos que a neddilación exerce a súa acción biolóxica nos artigos revisados..................................................................................................................... 38 Fig. 6: Táboa resumo de biomoléculas implicadas nos artigos revisados, coas súas funcións biolóxicas e relación coa neddilación.................................................................................... 40 Figuras 1, 3 e 5 creadas con BioRender. Todas as figuras son de elaboración propia. 6 Glosario de termos empregados: -MPT: Modificación postraducionais, calquera proceso bioquímico sofrido por unha proteína despois da súa biosíntese, e.g. ubiquitinación ou fosforilación. -NEDD8: Neural precursor cell Expressed, Developmentally Down-regulated 8 protein, pequena proteína da familia das ubiquitine-likes, cun alto grao de homoloxía coa ubiquitina e que serve de ligando actuando en modificacións postraducionais. -UBL: Ubiquitine-like, familia de pequenas proteínas con parentesco evolutivo e funcional coa ubiquitina. Están involucradas no fenómeno das modificacións postraducionais e comparten semellanzas funcionais e fisiolóxicas entre elas. -SUMO: Small Ubiquitine-like Modifier, pequena proteína da familia das ubiquitine likes. Participa en modificacións postraducionais. -E1/E2/E3: concepto que fai referencia ao feito de precisaren todas as ubiquitine-likes a participación secuencial de tres enzimas para seren ligadas a un substrato. O paso E1 corresponde aos enzimas activadores, o paso E2 aos conxugadores e o paso E3 aos ligadores. -NAE: NEDD8 activating enzyme, enzima responsábel do paso E1 na vía da neddilación. A súa importancia radica en ser un enzima que só cataliza esta reacción e en non poder a neddilación usar outro enzima para o paso E1, polo que resulta o enzima a bloquear polos fármacos inhibidores da neddilación. -CRL: cullin-RING ligases, familia de enzimas involucrados no paso E3 dun número importante de modificacións postraducionais que involucran á familia das ubiquitine-likes. Son o principal substrato da neddilación, que as activa. -MPTe/MPTn: distinción entre as modificacións postraducionais en virtude de se están mediadas por enzimas. As MPTe son aquelas mediadas por enzimas e as MPTn aquelas que non o están. -EGF: Epidermal Growth Factor, proteína que estimula o crecemento e diferenciación celular ao unirse ao seu receptor, o EGFR. -Siglecs: Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins, proteínas que se atopan na superficie das células inmunitarias humanas. Contan con funcións coma a sinalización celular. -PTEN: Phosphatase and tensin homolog, proteína fosfatase humana. O xene actúa coma un supresor de tumores, e a súa mutación vese habitualmente no cancro humano. -IL-6: interleucina 6, citocina proinflamatoria segregada entre outras células polos macrófagos. No contexto deste traballo, foi vinculada á obesidade como factor que perpetua a resistencia á insulina no tecido adiposo branco. - DHGNA: Doenza hepática graxa non alcólica. -PPARγ: Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, receptor nuclear involucrado na formación e maduración do tecido adiposo. -PRDM16: PR domain-containing 16, proteína encargada de dirixir a adipoxénese cara un tecido adiposo pardo, máis metabolicamente activo. -TRIM21: Tripartite motif-containing protein 21, un enzima ubiquitina ligase (E3) 7 -HIF-1α: Hypoxia-inducible factor 1-alpha, factor de transcrición relacionado coa adaptación sistémica á hipoxia, aínda que tamén na proliferación celular. -SRSF3: Serine-rich splicing factor 3, factor proteico que promove o splicing do ARN. - NRF2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, factor nuclear con función antioxidativa e con capacidade para ser neddilado. -SREBP1c: Sterol regulatory element-binding transcription factor 1, factor de transcrición asociado á lipoxénese e que pode ser neddilado. -mTOR: mammalian Target of Rapamycin, enzima quinase relacionado coa proliferación celular. -DEPTOR: DEP domain-containing mTOR-interacting protein, proteína que regula á baixa a acción de mTOR. Á súa vez está regulada pola neddilación a nivel da súa ubiquitinación por un enzima CRL. -EFTA/EFTB: Electron flavoprotein Transfer alpha/beta, flavoproteínas implicadas no transporte electrónico. - IRS1: Insulin receptor substrate 1, proteína estimulada polo receptor de insulina para levar os efectos da hormona ás súas vías efectoras. - PCK1: Piruvato carboxiquinase 1, enzima fundamental na gliconeoxénese hepática por mediar o paso de oxalacetato a fosfoenolpiruvato. 8 1. Introdución O termo “modificacións postraducionais” (MPT) fai referencia a todo proceso bioquímico sofrido por unha proteína trala súa biosíntese dende un ARN mensaxeiro, ben sexa mediante unha escisión proteolítica e/ou a adición de xeito covalente dun grupo modificador a un ou máis aminoácidos da súa secuencia, coa posibilidade de seren ou non reversíbeis1 . As MPT cumpren unha infinidade de funcións na célula eucariota, como poden ser a transdución de sinais entre células, a interacción coa matriz extracelular, a regulación da función hormonal, o desenvolvemento embrionario ou o progreso tumoral. 2,3 Nun primeiro momento histórico pensábase que era posíbel inferir as características e funcións dunha proteína simplemente ollando para a secuencia de nucleótidos que a codificaba no ADN. Porén, os nosos coñecementos actuais indican que unha parte crucial da bioloxía proteica provén de todo aquilo que sucede despois do paso de ADN a ARN e proteína. As MPT son o principal destes factores, modificando a proteína de tal xeito que tódalas súas propiedades se poden ver alteradas de forma crucial polas MPT4. No entanto, esta importancia biolóxica está aínda comezando a ser estudada en detalle, con novas MPT cobrando relevancia e novas funcións e interaccións aparecendo entre elas nos últimos anos. Deste xeito, mentres que algunhas son ben coñecidas en canto ós seus efectos e implicacións, caso da metilación5, a glicosilación6 ou a ubiquitinización7; máis de 400 clases diferentes de MPT foron descritas sen que a maioría delas sexan ben comprendidas8. En virtude da sinalada importancia das MPT á hora de capacitar as proteínas, unha mellor comprensión daquelas coñecidas en menor detalle podería redundar nunha visión máis precisa da fisiopatoloxía humana e por ende incluso na aparición de novas dianas farmacolóxicas. A familia de proteínas similares á ubiquitina, ou ubiquitine-likes(UBL), constitúe un grupo de moléculas susceptíbeis de participar en MPT actuando como ligando. Entre elas, NEDD8 é con moito a que comparte unha maior similitude coa ubiquitina, a pesar do cal a súa respectiva MPT (denominada neddilación) foi vinculada non a funcións intracelulares proteolíticas; senón á regulación do ciclo celular9. Malia ser a molécula descrita orixinalmente no ano 199210, as implicacións da súa función dentro do organismo humano na saúde e na enfermidade están aínda no seu albor como tema de investigación. Así, nos últimos anos foi estudada a súa relación con doenzas tan diferentes entre si como a fibrose hepática11, o cancro de pulmón12, o cancro de fígado13 ou mesmo a enfermidade de Alzheimer14 . Ademais do anteriormente exposto, NEDD8 semella tamén estar fortemente implicada no metabolismo da glicosa, particularmente no relativo á neoglicoxénese, a esteatose hepática, a resistencia á insulina e máis ao nexo das anteriores coa obesidade; e ser en consecuencia unha potencial diana terapéutica de futuro á hora de abordar os trastornos deste eixe fisiolóxico. Este traballo tentará como obxectivo último esclarecer o rol da neddilación no metabolismo enerxético, tentando en función dos resultados dilucidar a viabilidade de empregar esta MPT nos anos vindeiros co fin de tratar as desregulacións patolóxicas do mesmo. 9 2. Metodoloxía do traballo Co gallo de cumprir o obxectivo deste traballo, isto é, resumir e avaliar a evidencia científica dispoñíbel en torno ao rol da neddilación no metabolismo humano; con especial énfase na súa implicación no metabolismo da glicemia, revisarei de xeito sistemático a literatura científica ao respecto tentando extraer no camiño todo indicio sobre as posíbeis aplicacións terapéuticas nun futuro deste coñecemento. Con esta finalidade, o presente traballo contará coas seguintes características: 1. A división do mesmo en dúas partes ben diferenciadas dende o punto de vista metodolóxico. A primeira delas adicarase á ilustración bibliográfica dos coñecementos precisos para poder contextualizar e avaliar os achados da segunda parte do traballo. Esta última será unha revisión sistemática daquelas publicacións científicas que buscasen nos últimos anos definir o papel de NEDD8 na fisioloxía e fisiopatoloxía do metabolismo extendido da glicosa. 2. A primeira parte do traballo, ou marco teórico, estará dividida en catro apartados, un primeiro que describa o noso coñecemento actual das MPT no seu conxunto; un segundo que se centre detalladamente na vía da neddilación, un terceiro que expoña a experiencia cos fármacos inhibidores da neddilación e un cuarto que faga un resumo ad hoc da fisioloxía e fisiopatoloxía do metabolismo da glicemia. A importancia do marco teórico radica en contextualizar a segunda parte do traballo, aportando a información precisa para poderse interpretar e calibrar os resultados achados. A información obterase en todo caso de servidores co aval da comunidade científica, con especial énfase nas revisións sistemáticas de publicación recente que poidan achegar un coñecemento actualizado sobre os temas en cuestión, aínda que remitindo sempre aos artigos orixinais. 3. A devandita segunda parte basearase na lectura crítica de artigos científicos mediante o uso de ferramentas en liña de busca e xestión bibliográfica, especialmente PubMed. Todos os servidores empregados contan co aval da comunidade científica, e todos os artigos empregados foron revisados por pares. A busca empregará termos descritores relacionados co tema, do tipo “NEDD8 inhibitors and diabetes”, “neddylation and hyperglicemia”, “neddylation and obesity” ou “neddylation and non-alcoholic fatty liver disease”. Incluiranse na revisión aqueles artigos primarios nos que se aporte información que relacione a neddilación coa fisiopatoloxía do metabolismo enerxético humano. 16 de arredor do 20% da ubiquitinación nas células humanas64. Neste contexto, o rol da neddilación sería regular a ubiquitinación e outras MPT dependentes do complexo CRL, estimulando a función deste último65. Así, poderíamos figurarnos que as CRL’s contan cun estado activo mediado pola neddilación, e que a función da ubiquitinación depende en boa medida dos constantes ciclos de neddilación e desneddilación exercidos sobre os enzimas E3 que a median66. A vía da neddilación regúlase á súa vez mediante varios mecanismos56, dos cales destacan especialmente dous: a regulación a nivel do paso E3 por parte das proteínas DCNL e a desneddilación por parte de CSN5. As DCNL son 5 proteínas que actuan como ”co-E3” favorecendo a cinética da neddilación ao servir de ponte entre o enzima E2 e a cullin67. Pola súa parte, CSN5 é unha metaloprotease encargada de desneddilar as cullin das CRL’s, pois a correcta actividade destas últimas depende dun balance constante entre un estado neddilado activo pero inestable e un estado desneddilado inactivo pero estable68. Ademais do anterior, cabe lembrar aquí proteína DEN1, que como se mencionou anteriormente pode non só mediar a proteólise inicial de NEDD8; senón tamén certas desneddilacións. Concretamente, DEN1 actúa en caso de hiperneddilación dunha cullin até deixala mononeddilada69 ou sobre outras dianas non cullin da neddilación70. Este segundo tipo de desneddilación pode indicar un mecanismo preventivo, tanto perante a hiperneddilación como perante a neddilación aberrante de substratos que non o precisan56. A pesar de que existen na literatura científica numerosos casos de neddilación acontecendo en substratos diferentes á cullin, a funcionalidade biolóxica dos mesmos está aínda en moitos casos pendente de confirmación experimental71. Así, aínda que se rexistrou a capacidade de NEDD8 para unirse de xeito covalente a numerosos substratos diferentes á cullin; algúns deles de tanta sona como TP5372 ou EGFR73, non existe polo momento evidencia conclusiva de que a mesma teña relevancia biolóxica in vivo en todos eles. Así, existe a posibilidade de que a neddilación xogue un papel sobre unha multitude de substratos diferentes en adición á flexibilidade que a propia vía das cullin lle confire. Deste tema tratarase en maior detalle nun apartado posterior, a colación do rol da neddilación no metabolismo enerxético. Sobre esta identificación de novos substratos cómpre mencionar que existe sempre como factor confundidor o feito de que a neddilación detectada nun substrato pode ser causada simplemente pola semellanza estrutural coa ubiquitina. Isto, xunto á dúbida de se mesmo nalgúns casos unha neddilación ou unha ubiquitinación sobre o mesmo substrato poden dar resultados funcionais idénticos, son algunhas das principais dificultades á hora de asignarlle funcionalidade biolóxica in vivo aos substratos da neddilación diferentes da cullin56. 3.3 Fármacos inhibidores da neddilación: estrutura, fisioloxía e usos Como vén de expoñerse no apartado previo, a neddilación é unha MPT que acontece mediante a actuación secuencial de tres complexos enzimáticos, E1, E2 e E3. Algúns destes enzimas poden ser compartidos na vía da ubiquitinación ou en MPT que impliquen outras UBL’s, mais no complexo E1 para NEDD8 existe un único e exclusivo enzima efector posíbel, NAE (Figura 1), o cal representa unha evidente vantaxe á hora de interceptar a neddilación de xeito selectivo sen interromper ningunha outra vía fisiolóxica no organismo. Así sendo, a continuación versarase sobre os fármacos inhibidores da neddilación, que son na súa grande maioría fármacos inhibidores da acción do enzima NAE. A pesar de existiren outros fármacos descritos con efectos inhibidores sobre NAE, entre os cales destacan TAS4464 e SOMCL-19133, este epígrafe centrarase case exclusivamente no MLN4924 ou Pevonedistat por un motivo fundamental: que só el e máis TAS4464 chegaron a estar implicados en ensaios clínicos.74Ademais disto, o único ensaio clínico de fase I no que TAS4464 foi partícipe sufriu 17 unha suspensión precoz, cos resultados sendo publicados no ano 2021. O ensaio, realizado en dous hospitais xaponeses e que tiña por obxectivo describir os perfís farmacolóxicos e a seguridade do fármaco en pacientes con diferentes cancros, tivo que ser detido por causa de achárense indicios de dano hepático nos usuarios; con elevacións pronunciadas dos enzimas hepáticos ALT, AST e APT nun 68,8%, 62,5% e 43,8% dos suxeitos, respectivamente75. Así, TAS4464, que fora orixinalmente presentado coma un fármaco de mecanismo de acción idéntico e máis potente ca o Pevonedistat76, perdeu na actualidade presenza no ámbito investigador. No tocante ao SOMCL-19-133, esta molécula vén de ser presentada aínda no ano 2022 polo grupo de Ao Zhang77, que xa no 2021 mostrara estar buscando inhibidores de NAE máis potentes do que o pevonedistat78. Tanto o fármaco descrito no 2021 coma o presentado no 2022 teñen como característica principal unha alteración común na súa estrutura química con respecto aos outros inhibidores de NAE, en concreto a de estaren baseados nun núcleo de pirimidotriazol. Os autores do novidoso SOMCL-19-133 afirman nos seus resultados unha mellor potencia antitumoral da obtida co Pevonedistat tanto in vitro sobre estirpes celulares de cancro de colon como in vivo en modelos animais murinos con xenoenxertos subcutáneos de cancros humanos con tres liñas celulares (unha de cancro colorrectal tratada con doses de 10 mg/kg e 20 mg/kg, outra de cancro de pulmón non microcítico tratada con dose de 3mg/kg e unha terceira de leucemia tratada con doses de 5mg/kg e 10 mg/kg). Os resultados foron definidos como satisfactorios, lográndose boa resposta tumoral nos tres casos cunha tolerabilidade aceptable, e cun perfil farmacocinético favorábel tanto por vía oral como subcutánea 77. Malia isto, a novidade da molécula (que non leva presentada na comunidade científica nin dous anos no momento da redacción deste parágrafo) coa conseguinte ausencia de artigos e evidencia imposibilita dicir nada máis de signicativo ao respecto. Finalmente, sería cabal citar tamén como posíbel alternativa de futuro ao pevonedistat os fármacos inhibidores dos enzimas E2 responsábeis na vía da neddilación, UBE2M e UBE2F. Malia non seren estes enzimas totalmente específicos ao 100% por poder actuar tamén na vía da ubiquitinación, si contan cun alto grao de especifidade e a súa expresión celular correlaciónase mesmo mellor que NAE cos niveis de neddilación proteica. A causa disto, estes enzimas, particularmente o UBE2M; foron propostos como dianas terapéuticas dentro da vía da neddilación, e os seus xenes correspondentes como oncoxenes. A novidade deste enfoque impide, máis unha vez, saber se será finalmente factíbel poñer a inhibición dos enzimas E2 en práctica, pero reforza a importancia da vía da neddilación para entendermos a progresión tumoral71,79. Por todo o anteriormente explicado, tratarase a continuación polo miúdo do MLN4924 ou Pevonedistat, primeiro inhibidor de NAE descrito e do que xa se posúe unha certa bagaxe experimental. Do parágrafo previo, porén, é importante reincidir no concepto da posibilidade de sintetizar novos inhibidores de NAE, UBE2M ou UBE2F similares ao Pevonedistat e que melloren a súa eficacia; concepto importante de lembrar á hora de avaliar un futuro posíbel da interceptación da neddilación dentro da farmacopea na práctica clínica habitual. 3.3.1 MLN4924/pevonedistat: pioneiro na inhibición de NAE MLN4924, tamén coñecido polo nome de pevonedistat, foi o primeiro fármaco inhibidor de NAE en ser descrito no ano 2009. O seu mecanismo de acción é relativamente sinxelo: actúa coma un análogo do AMP que, como se vén de explicar no apartado 3.2, media a trasferencia de NEDD8 dende o enzima NAE a un dos enzimas E2. Porén, algunhas diferenzas químicas entre ambas moléculas, exempli gratia a substitución da base de adenina 18 por unha deazapurina; dan como resultado que a unión entre o MLN4924 e NAE non sexa reversíbel, bloqueando por tanto a vía da neddilación dende case o seu comezo80 Por estes motivos, o MLN4924 foi un fármaco enormemente popular na última década e media no ámbito investigador, xa que posuía tres características altamente tentadoras: uns indicios robustos de aportar un beneficio terapéutico, un grande grao de especifidade polo seu enzima e unha enorme flexibilidade en canto a potenciais novos usos debido á enorme variedade de substratos das CRL. A esta última característica podemos sumar tamén o noso coñecemento actual da posíbel existencia doutros substratos da neddilación (Figura 5), razón que reforzaría a percepción de potenciais terapéuticos da neddilación noutras patoloxías diferentes ao cancro56. Alén dos ámbitos do cancro e do metabolismo da glicosa, dos que se tratará máis adiante en profundidade, podemos citar por exemplo que o fármaco foi descrito en estudos preclínicos como posíbel: neuroprotector por diminuír o dano oxidativo81, cardioprotector nas lesións por isquemia-reperfusión82, amortiguador da neovascularización coroidea83, etc. Evidentemente, a novidade do asunto esixe prudencia antes de vincularmos de forma definitiva a inhibición da neddilación a calquera destas patoloxías, mais fica así exposta a polivalencia do pevonedistat que ben podería desembocar nun futuro de seu noutras áreas distintas á patoloxía tumoral. Voltando ao cancro, feudo clásico do MLN4924 dende a súa presentación, existe unha maior evidencia en canto ás súas propiedades antitumorais. Até o momento, foron un total de 41 ensaios clínicos (Figura 2) nos que o pevonedistat foi involucrado, incluidos 15 de fase II e 2 de fase III74. De entre estes 41 estudos, a mor parte centrouse en patoloxía neoplásica hematolóxica, aínda que achamos tamén tumores sólidos coma o melanoma, o cancro de vías biliares ou o cancro de pulmón non microcítico. De igual xeito, o fármaco contou cun grande número de compañeiros nos ensaios: pembrolizumab, venetoclax, carboplatino, paclitaxel,ibrutinib... De xeito especial, compartiu ensaio coa azacitidina nos dous estudos de fase III nos que se viu involucrado. En ambos casos se comparaba a combinación azacitidina + pevonedistat contra a azacitidina en solitario. 19 Ano inicio Combinación Doenza Código do ensaio Fase Nº pacientes Estado do estudo 2008 Non Cancros non hematolóxicos NCT00677170 I 62 Completado 2008 Non Mieloma múltiple, linfoma Hodgkin, cancro hematolóxico, linfoma NCT00722488 I 56 Completado 2009 Azacitidina Leucemia linfobl. aguda, síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide aguda NCT00911066 I 72 Completado 2009 Non Melanoma metastásico NCT01011530 I 37 Completado 2013 Azacitidina Leucemia mieloide aguda NCT01814826 I 64 Completado 2013 Docetaxel, Gemcitabina, Carboplatino, Paclitaxel Tumor sólido NCT01862328 I 64 Completado 2014 Fluconazol, Itraconazol, Carboplatino, Docetaxel, Paclitaxel Tumor sólido NCT02122770 I 51 Completado 2017 Docetaxel, Carboplatino, Paclitaxel Tumor sólido NCT03057366 I 8 Completado 2017 Temozolamida, Irinotecan Tumor sólido ou linfoma recurrente ou refractario NCT03323034 I 30 Activo (sen recrutamento) 2017 Docetaxel, Carboplatino, Paclitaxel Neoplasia sólida avanzada NCT03330106 I 68 Completado 2018 Docetaxel, Carboplatino, Paclitaxel, Rifampicina Neoplasia sólida avanzada NCT03486314 I 20 Completado 2018 Citarabina Leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica NCT03459859 I 12 Completado 2017 Ruxolitinib Mielofibrose NCT03386214 I 8 Interrompido 2018 Ibrutinib Leucemia linfobl. aguda, linfoma non Hodgkin NCT03479268 I 18 Activo (sen recrutamento) 2017 Decitabina Leucemia mieloide aguda NCT03009240 I 30 Activo (sen recrutamento) 2017 Vincristina, Dexametasona, PEGasparaginasa, Doxorubicina, Citarabina, Metotrexato, Hidrocortisona Leucemia linfoblástica aguda NCT03349281 I 6 Completado 2016 Azacitidina Leucemia mieloide NCT02782468 I 23 Completado 2018 Belinostat Leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica NCT03772925 I 30 Activo (sen recrutamento) 2019 Azacitidina Leucemia mielomonocítica crónica, síndrome mielodispásica, leucemia mieloide aguda NCT03814005 I 17 Completado 2018 Citrato de Ixazomib Mieloma múltiple NCT03770260 I 8 Activo (sen recrutamento) 2019 Azacitidina, Fludarabina, Fosfato, Citarabina Leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica NCT03813147 I 12 Activo (sen recrutamento) 2019 Azacitidina (ou Decitabina) e Venetoclax Leucemia mieloide aguda NCT04172844 I 24 Activo (sen recrutamento) 20 2015 Azacitidina Leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica crónica, síndrome mielodisplásica NCT02610777 II 120 Completado 2017 Docetaxel Cancro de pulmón non microcítico NCT03228186 II 31 Interrompido 2017 Azacitidina Neoplasia mieloproliferativa, síndrome mielodisplásica NCT03238248 II 71 Activo (sen recrutamento) 2018 Azacitidina Leucemia mieloide aguda refractaria ou recurrente NCT03745352 II 0 Abortado 2018 Azacitidina Leucemia mieloide aguda que non entra en remisión NCT03709576 II 3 Interrompido 2019 Carboplatino, Paclitaxel Cancro de vías biliares NCT04175912 II 52 Activo (sen recrutamento) 2019 Carboplatino, Paclitaxel Cancro de pulmón non microcítico avanzado NCT03965689 II 24 Activo (sen recrutamento) 2020 Azacitidina Síndrome mielodisplásica NCT04484363 Pr. Expans. Intermedio Non dispoñíbel 2021 Pembrolizumab Tumor sólido non resecábel localmente avanzado NCT04800627 I/II 2 Rematado 2021 Decitabina, Cedazuridina Síndrome mielodisplásica NCT04985656 II 0 Abortado 2021 Azacitidina Leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica NCT04712942 II 14 Completado 2020 Azacitidina, Venetoclax Leucemia mieloide aguda en adultos sen indicación de quimioterapia intensiva NCT04266795 II 164 Activo (sen recrutamento) 2019 Azacitidina, Venetoclax Leucemia mieloide aguda de novo diagnóstico NCT03862157 I/II 51 Activo (sen recrutamento) 2017 Citarabina, Idarubicina Leucemia mieloide aguda NCT03330821 I/II 53 Activo (sen recrutamento) 2011 Etopósido, Prednisona, Vincristina, Ciclofosfamida, Doxorubicina, Rituximab, Filgrastim Linfoma NCT0141576 I/II 0 Abortado 2017 Pemetrexed Mesotelioma NCT03319537 I/II 9 Activo (sen recrutamento) 2017 Azacitidina Leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásica, leucemia mielomonocítica crónica NCT03268954 III 454 Activo (sen recrutamento) 2019 Azacitidina Leucemia mieloide aguda onde non está indicada a quimioterapia estándar NCT04090736 III 302 Activo (sen recrutamento) Figura 2: Táboa de elaboración propia ilustrando a totalidade dos ensaios clínicos rexistrados nos que participou un inhibidor de NAE, baseada na do artigo de Dong-Jun Fu e Ting Wang74. Foron excluídos dous ensaios, un deles o centrado no TAS4464 do que se tratou previamente, outro deles por contar cun código xaponés e non ser comprobábel 21 Á súa vez, as propiedades antitumorais do MLN4924 explícanse pola concorrencia de varios factores simultáneos: a indución da apoptose ao evitar que sufran ubiquitinación e se degraden proteínas proapoptóticas do tipo das caspases84, a activación dun estado de senescencia nas células tumorais mediado por p2185, a detención na fase G2 do ciclo celular das células tumorais (o cal contribúe á radiosensibilización das mesmas)86, a alteración da función e fisión das mitocondrias87, a coartación da anxioxénese tumoral88, a regulación do microambiente tumoral favorábel creado polos mediadores producidos polas células neoplásicas (e por tanto regulando tamén a función dos endotelios, as células inmunitarias no seu conxunto ou os fibroblastos)89, etc. Como se pode apreciar, a polivalencia terapéutica da vía da neddilación non abrangue apenas unha multitude de posíbeis patoloxías, senón tamén unha multitude de mecanismos moleculares diferentes mediante os que actuar no panorama celular grazas á multitude de substratos das CRL. Porén, os fármacos inhibidores da neddilación non están exentos tampouco de dificultades. En primeiro lugar, debemos sinalar o xa mencionado fracaso do único ensaio clínico de TAS4464, que non satisfixo as expectativas postas sobre el coma unha alternativa máis potente do pevonedistat75. Esta procura dunha maior potencia, á súa vez, alértanos doutra debilidade actual do pevonedistat como fármaco antitumoral, que non conta con taxas de éxito particularmente boas nos ensaios clínicos até o momento se non é en combinación con outros fármacos74. A isto súmanse a pesar da súa boa tolerancia en seres humanos outros desafíos, coma a resistencia intrínseca dos tumores que non expresan PTEN ao pevonedistat90, unha tendencia do pevonedistat a favorecer a glicólise e alterar o metabolismo enérxetico87,91 (o cal pode favorecer o crecemento de certos tumores, mais representando á vez unha oportunidade terapéutica para a fisiopatoloxía da glicemia, tema deste traballo), unha inhibición demostrada na formación dos cilios 92(o cal novamente pode verse coma un efecto secundario ou coma unha oportunidade terapéutica en doenzas que cursen con disfunción ciliar) ou a promoción das células nai en doses inferiores ás habituais (que, máis unha vez, serve a un tempo de efecto nocivo ao favorecer a proliferación celular tumoral e de posíbel vía terapéutica no campo da rexeneración tisular)74,93. 3.4. Breve fisiopatoloxía da diabetes mellitus tipo 2 A diabetes mellitus é sen dúbida unha das enfermidades que condicionou a saúde global da especie humana no último medio século e que o continuará a facer previsibelmente no próximo. No ano 2021 a International Diabetes Federation cifrou no seu atlas nun 10,5% a prevalencia de diabetes mellitus en adultos de entre 20 e 79 anos, o cal equivalería a uns 536.6 millóns de seres humanos, dos cales unha maioría avasaladora pertencía ao subgrupo da diabetes mellitus tipo 2, cuns custos sanitarios globais estimados duns 966 mil millóns de dólares estadounidenses. As proxeccións para o 2045 da mesma axencia prevén ademais un crecemento nestes números, cunha prevalencia que chegue ao 12,2% e un gasto que supere o billón de dolares para o devandito ano94. Estes datos dan boa conta dun feito: a diabetes mellitus de tipo 2 é unha das enfermidades do momento, e a minimización dos seus efectos sobre a esperanza e calidade de vida dos pacientes, sobre o gasto sanitario e máis sobre as outras enfermidades con que se relaciona representa un dos grandes desafíos actuais da saúde humana. Isto levou nas últimas décadas a unha carreira desfreada por entender pormenorizadamente a súa fisiopatoloxía co gallo de encontrar novos xeitos de tratala. A diabetes mellitus no seu conxunto defínese por ser un estado deficitario de acción da insulina, ben sexa por unha escaseza absoluta ou case absoluta de produción (caso da diabetes 22 mellitus tipo 1) ou ben por un estado de resistencia aos efectos da hormona, combinada ou non cun déficit da súa producción95. Este último caso é o da diabetes mellitus de tipo 2 (DM2 de aquí en diante), na que o metabolismo do organismo non reacciona de xeito fisioloxicamente normal a cantidades fisiolóxicas de insulina. A etioloxía da mesma é multifactorial pero, malia existiren numerosas variantes xenéticas descritas que se relacionan con ela mediante os tres mecanismos de diminuír a produción de insulina, a acción da mesma ou aumentar a tendencia á obesidade do individuo96; a maior parte do risco de padecer DM2 asóciase ao estilo de vida e o envellecemento, representando o factor xenético menos do 20% da carga causal. Ademais do anterior, dentro dos condicionantes adquiridos para desenvolver a enfermidade existe tamén unha ampla variabilidade: son algúns factores de risco descritos como de alta ou moi alta evidencia nunha metaanálise do 2018 a obesidade (tanto en pacientes metabolicamente sans como naqueles metabolicamente enfermos), o hábito tabáquico, as dietas ricas en carnes vermellas e procesadas, un baixo nivel socieconómico, o consumo de bebidas azucradas, a polución ambiental ou o baixo peso ao nacer97. Dos anteriores, a obesidade resultaba quizais o máis importante, ao punto de existiren varios subfactores relacionados con ela que mostraban tamén unha asociación positiva co risco de desenvolver DM2, tales como: o Índice de Masa Corporal, baixos niveis de vitamina D, hábitos de vida sedentarios ou os parámetros antropométricos propios da obesidade (como a razón entre cintura e altura ou o perímetro do cadeira). Para máis disto, existían tamén asociacións estatísticas coa síndrome metabólica ou a elevación dos enzimas hepáticos ALT e GGT. Estes últimos dous achados casan ben coa actual comprensión da DM2, que a ve como unha manifestación parcial dun patrón metabólico patolóxico, e que ten como resultados posíbeis a propia DM2, a síndrome metabólica ou a doenza hepática graxa non alcólica (DHGNA). Neste patrón complexo as tres condicións relaciónanse interdependentemente agravándose as unhas as outras, de xeito que a doenza hepática graxa non alcólica comparte etiopatoxenia coa DM2 até o extremo de poder mesmo unha inducir a outra98, ao tempo que a síndrome metabólica se correlaciona mesmo mellor co risco de desenvolver DM2 que co risco de padecer un evento cardiovascular99. En consecuencia, unha boa comprensión da fisioloxía integrada destas enfermidades constitúe un compoñente imprescindíbel á hora de avaliar as posíbeis novas estratexias terapéuticas a desenvolver nos próximos anos. Nun primeiro lugar é preciso entender o metabolismo enerxético humano no seu conxunto, para o cal resulta chave unha descrición do que acontece durante os períodos de inanición, xa que é esa a situación de crise para a que evolucionaron os diferentes mecanismos do metabolismo enerxético por seren as fontes de calorías impredecíbeis e escasas na mor parte dos ecosistemas100. Así, durante os períodos prolongados de non inxesta o metabolismo enerxético adáptase progresivamente á situación priorizando a glicosa para aqueles órganos que a precisan como única fonte de enerxía aproveitábel, exempli gratia a médula renal, o cerebro, os glóbulos vermellos ou a médula ósea. Por tanto, e despois dun primeiro momento de entre 4 e 6 horas no que a normoglicemia se mantén a expensas da glicoxenólise, comezan a cobrar máis relevancia a gliconeoxénese hepática, a oxidación de lípidos e a síntese de corpos cetónicos; fundamentais todos eles á hora de manter o metabolismo funcionando sen aportes esóxenos de glícidos. Esta transición entre o estado ben alimentado e o estado de xaxún está provocado por dous factores coincidentes: a caída da glicemia (acompañada dunha caída da insulinemia e un aumento do glicagonemia) xunto cunha caída da leptinemia. A diminución da insulina e o aumento do glicagón levan ao organismo a un estado catabólico que prime a obtención de glicosa dende os depósitos hepáticos de glicóxeno, ademáis de facilitar a lipólise e a gliconeoxénese por déficit de acción da insulina (así como pola acción directa das hormonas contrarreguladoras coma o glicagón, a insulina ou a adrenalina). A diminución da leptina, que actúa como unha sorte de medidor dos depósitos enerxéticos en forma de tecido adiposo do 23 organismo, demostrou pola súa parte ser fundamental no cambio cara o metabolismo do xaxún, pois ao baixar dunhas determinadas concentracións sanguíneas activa o eixe hipotalámicohipofisario-suprarrenal e promove a produción de glicocorticoides. Estes producen un estado de lipólise xeral no tecido adiposo branco, o cal á súa vez fornece ao organismo de ácidos graxos libres en plasma como molécula enerxética alternativa e ao fígado de abundantes moléculas de acetil-coA e glicerol. O glicerol pode actuar directamente como substrato da neoglicoxénese, mentres que as moléculas hepáticas de acetil-coA promoven alostericamente a gliconeoxénese mediante a estimulación do enzima piruvato carboxilase, o cal resulta un mecanismo fundamental á hora de manter uns niveis de glicemia mínimos para os órganos que usan glicosa de xeito exclusivo cando o xaxún se mantén no tempo101. En definitiva, no estado de saciedade posterior á inxesta o combustível enerxético fundamental do organismo é a glicosa extraída do alimento, mais é a medida que as fontes esóxenas de glícidos se van facendo escasas que o organismo se adapta progresivamente; primeiro favorecendo a glicoxenólise mediante o descenso da insulinemia e o aumento da glicagonemia, e posteriormente mediante a lipólise xeral no tecido adiposo branco e a gliconeoxénese hepática reforzada polos aumentos de acetilCoA derivados do aumento de ácidos graxos libres. Isto é, como se falou, a situación fisiolóxica para a que evolucionaron os mecanismos do metabolismo enerxético. No entanto, coa creación dun novo ecosistema exclusivamente humano no que abundan os alimentos cun alto grao de densidade enerxética, pouco saciantes e altamente saborosos; estes mecanismos de preservación pensados para a escaseza poden tornarse en contra do organismo. Como efecto dos estilos de vida diabetóxenos, o organismo desenvolve progresivamente unha resistencia ao efecto da insulina. Esta perda de efecto sobre os seus órganos diana ocorre paulatinamente dende mesmo décadas antes da instauración clínica da enfermidade, e constitúe un círculo de feedback positivo no que a falta de sensibilidade á insulina leva á adaptación de músculo esquelético, fígado e tecido adiposo branco; que comezan a fraquexar na súa función de depurar o sangue dun exceso de glicosa102. A exposición do individuo a glicemias elevadas e continuas a través da dieta leva a un aumento da adiposidade mediante a acción da insulina no tecido adiposo branco, que inhibe a lipólise e fomenta a formación de acidos graxos complexos. O aumento de adiposidade pode levar, por mecanismos non enteiramente coñecidos aínda, a unha predisposición á inflamación no tecido adiposo branco; con aumentos das concentracións locais da IL-6 e infiltración de macrófagos103. Esta inflamación redunda nunha resistencia do tecido adiposo aos efectos da insulina, que en individuos sans inhibe a lipólise no tecido graxo. Ben polo contrario, o tecido adiposo inflamado atópase nun estado de lipólise constante, causando un aumento nos ácidos graxos non esterificados libres no plasma sanguíneo. Os ácidos graxos no plasma, á súa vez, levan ao fígado a un estado de resistencia á insulina secundario ao favoreceren a gliconeoxénese hepática mediante os mecanismos mencionados previamente. Como consecuencia, a insulina perde a súa capacidade para inhibir a gliconeoxénese hepática, e isto redunda nunha hiperglicemia basal por ser a produción hepática de glicosa moi potente, de até un 90% da produción endóxena da mesma104. A resistencia do fígado á insulina remata de fechar o seu ciclo coa acumulación intrahepática de lípidos derivada da lipólise xeral, rematando en DHGNA. Nesta enfermidade a resistencia á insulina reforzase tanto polo aporte local de lípidos que favorecen a gliconeoxénese hepática como mediante a inhabilitación do substrato do receptor de insulina (IR) mediado pola acumulación local de diacilglicerol. O diacilglicerol causa este efecto promovendo a translocación á membrana do enzima PKCε, un quinase que fosforila o IR no seu residuo Thr1160. Esta MPT conta coa potestade de inhibir a función do receptor, explicando este mecanismo polo menos en parte a vinculación etiolóxica entre o fígado graxo e a DM2105. De xeito chamativamente similar acontece no músculo esquelético a instauración da resistencia á 24 insulina de xeito secundario á acumulación ectópica de lípidos. Neste caso, a acumulación de diacilglicerol no músculo implica unha traslocación á membrana do enzima quinase PKCθ, que fosforila o IRS1 no seu residuo de Ser1011, diminuindo a súa actividade e por tanto o efecto da insulina sobre o músculo106. A importancia do músculo esquelético como órgano metabólico neste caso non pode infravalorarse, pois existe evidencia de que o exercicio físico posúe a capacidade de fomentar, incluso de forma independente á insulina; a retirada de glicosa dende o sangue ao músculo para formar glicóxeno, reducindo así a súa resistencia á insulina e máis a acumulación ectópica de lípidos no fígado á vez que se mellora o perfil metabólico xeral do individuo107. No músculo resistente á insulina e en persoas sedentarias, pola contra, pérdese en boa parte esta vía para a depuración do exceso de glicosa no sangue. Finalmente, e a pesar de que nun primeiro momento o individuo logra manter niveis normais de glicosa en sangue a expensas dunha hiperinsulinemia compensadora, as illotas de Langerhans comezan a claudicar e a sumar unha insulinopenia relativa á resistencia contra a propia insulina, exacerbando os resultados do déficit. En resumo, a DM2 é unha doenza que comeza por un déficit de acción da insulina causado por dietas excesivamente calóricas. Estas dietas favorecen un estado de hiperinsulinemia posterior á inxesta, procurando retirar da circulación o exceso de nutrientes mediante a expansión do tecido adiposo branco, mais derivando asemade nunha acumulación ectópica de lípidos. A perpetuación do estado de hiperinsulinemia leva ao esgotamento da súa acción sobre os órganos diana, o cal é especialmente significativo no caso do tecido adiposo branco, que ingresa nun estado de inflamación e lipólise continuo que fornece o plasma cun fluxo constante de ácidos graxos non esterificados; agravando a infiltración adiposa en fígado e músculo esquelético e favorecendo a gliconeoxénese hepática. Isto convértese nun verdadeiro ciclo de feedback positivo no que a resistencia á insulina xera aínda máis resistencia á insulina108. Por último, súmase a insuficiencia das células β no páncreas, polo menos en parte debida á glicolipotoxicidade directa109; así fechando un ciclo que conclúe con hiperglicemia tanto despois da inxesta como en repouso95.(Figura 3) Resulta obrigado remarcar que esta é unha simplificación sumaria dunha vía fisiopatolóxica verdadeiramente complexa, cunha énfase evidente en indicar os nexos de unión entre fígado; tecido adiposo, músculo esquelético e páncreas que converten á DM2 nunha enfermidade multisistémica. Obviouse por exemplo o feito de que o sistema nervioso central pode xogar tamén un papel na regulación da glicemia de xeito independente á insulina110, e tamén se minimizaron os papeis das catecolaminas e o glicagón104. Tamén, e a pesar da importancia da infiltración inflamatoria do tecido adiposo branco na cronificación da resistencia á insulina, cómpre aclarar que este mecanismo cobra relevancia ao medio e longo prazo, mentres que existe evidencia de que mesmo unha única dose oral de aceite de palma pode comezar a inducir resistencia á insulina en fígado, tecido adiposo graxo e no organismo en xeral111. Do mesmo xeito, fica fóra do rango deste traballo explicar exhaustivamente os efectos da insulina como hormona, que se estenden moi para alén do pretendido neste marco teórico. Omitíronse igualmente boa parte dos detalles a nivel subcelular, incluídos os mecanismos biomoleculares da regulación epixenética do metabolismo enerxético ou o posíbel rol das variantes xenéticas mitocondriais á hora de entender a patoxénese das doenzas metabólicas112. Ausentáronse igualmente as MPT deste apartado, a pesar do cal estas si se relacionan coa regulación do metabolismo da glicosa, como se pode ver no feito de que o complexo piruvato deshidroxenase se vexa inactivada por unha fosforilación na súa subunidade E1α113. Finalmente, cómpre incidir en que os achados da última década nos orientan cara un desdobramento da DM2 como patoloxía. Isto quere dicir que, se ben existen vías dffisiopatolóxicas comúns que desembocan na perpetuación da resistencia á insulina e despois na hiperglicemia patolóxica, a diversidade de fenotipos observados semellan suxerir unha 25 diferente importancia de cada unha destas vías en diferentes doentes, condicionadas pola xenética e estilos de vida de cadaquén95. Figura 3: Esquema da fisiopatoloxía da DM2, dende a dieta hipercalórica á insulinopenia. O esquema comeza á esquerda cunha dieta occidental, que causa resistencia á insulina en tecido adiposo branco, fígado e músculo esquelético; rematando nun déficit global da acción da insulina e finalmente en insulinopenia e DM2 instaurada. 32 a resposta ao estrés oxidativo en caso de non ser degradado pola vía da ubiquitinación142. Por engadidura, demostrouse que a neddilación resultaba chave á hora de mediar a degradación de NRF2, dado que activaba a CUL3 que forma parte do complexo ubiquitina ligase responsábel de ubiquitinizar NRF2. Isto foi comprobado ao demostrar que a aplicación do pevonedistat en hepatocitos expostos a un dano hepático evitaba a degradación de NRF2 e AGER1120. Aínda sendo a participación de NEDD8 neste estudo modesta serviu para establecer un primeiro vínculo entre neddilación e NRF2 que, como se verá despois; se vería ampliado en estudos posteriores. Os tres seguintes artigos a analizar comparten en común un resultado experimental fundamental á hora de esclarecer o rol da neddilación no metabolismo enerxético: nos tres casos se comprobou que, en modelos murinos alimentados mediante dietas capaces de provocar DHGNA, o tratamento farmacolóxico con pevonedistat tiña un efecto terapéutico reducindo en grande medida a acumulación de lípidos en fígado; ademais de non observárense efectos sobre aqueles animais alimentados con dietas normais e tratados con pevonedistat fronte aos controis. Inclúense aquí o estudo do grupo de Uk-Il Ju, do ano 2020, o do grupo de Mengxiao Ge; do ano 2022, e o do grupo de Marina Serrano-Maciá, no ano 2021. En primeiro lugar, no artigo do 2020 detectáronse aumentos dos niveis do mRNA para NEDD8 nunha base de datos para pacientes con esteatose hepática130. Este achado foi ratificado e reforzado posteriormente no artigo do 2021 ao comparárense biopsias dunha cohorte de pacientes con DHGNA ben caracterizada con controis sans de idades similares. Neste caso non só se comprobou un aumento dos niveis xerais de neddilación nos fígados graxos, senón que se demostrou unha correlación positiva entre os mesmos e o NAS score, un score histopatolóxico que predí a severidade da esteatose hepática127. No primeiro dos dous estudos, ademais, identificouse un novo substrato da neddilación: o SREBP1c. Este é un factor promotor da adipoxénese inducíbel en hepatocitos mediante ácido oleico, e durante a investigación comprobouse que se podía regular á alza a súa expresión ao aumentar a concentración de NEDD8 e á baixa mediante o knockdown de NEDD8, APPBP1 ou simplemente administrando pevonedistat. Por engadidura, esta inhibición da neddilación derivaba nunha diminución da acumulación lipídica nos hepatocitos ao expoñelos ao ácido oleico. De xeito similar ao descrito no apartado anterior co PPARγ, a competición polos mesmos puntos de unión coa ubiquitinación foi proposto como mecanismo de acción da neddilación para SREBP1c, diminuíndo deste xeito a súa degradación no proteasoma ao evitar que sexa ubiquitinizado. Por último, comprobaron que en ratos alimentados cunha dieta rica en graxas o tratamento con pevonedistat inxectado intraperitonealmente, en doses de 30 mg/kg dúas veces á semana, tiña un efecto terapéutico sobre a esteatose hepática, a acumulación hepática de triglicéridos e reducía ademais os niveis de SREBP1c; tanto se iniciaban o tratamento no mesmo momento ca a dieta graxa como se o iniciaban en diferido 8 semanas despois130. No estudo do 2021 avalouse este efecto positivo do pevonedistat sobre a DHGNA, pois observouse unha mellora compatíbel coa anterior en ratos expostos a dúas dietas esteatoxénicas diferentes tratados con 60 mg/kg orais ou subcutáneos unha ou dúas veces á semana (dependendo da dieta) durante 3 semanas. Ademais disto, neutralizaron factores de confusión ao repetir as dietas con ratos que tiñan silenciado NEDD8 exclusivamente no fígado, e que mostraron igualmente resistencia a desenvolver esteatose hepática. Por último, propuxeron unha serie de mecanismos para explicar a acción terapéutica da inhibición da neddilación: algúns xa mencionados, como a diminución de citoquinas proinflamatorias do tipo IL-1β ou o alivio do estrés oxidativo mediante a indución de NRF2, outro completamente novo neste traballo; a indución da oxidación hepática dos ácidos graxos mediante a vía de DEPTOR-mTOR. Neste caso, a inhibición da neddilación brindaría o seu efecto terapéutico ao impedir a neddilación activadora dun enzima ubiquitina ligase que marca a DEPTOR para a súa degradación no proteasoma. O conseguinte aumento 33 de DEPTOR regularía á baixa mTOR. Esta regulación á baixa de mTOR por DEPTOR contaba xa con evidencia previa na literatura de poder evitar a esteatohepatite alcólica ao levar a célula por un camiño máis catabólico143. Apréciase neste estudo de novo, por ende, a idea de que a neddilación e a súa inhibición poden impactar o metabolismo por múltiples vieiros sen que sexa sempre doado precisar cal deles é o principal.127 O terceiro dos artigos neste grupo, o publicado no 2022, describiu tamén o papel da inhibición da neddilación mellorando o patrón metabólico perante dietas esteatoxénicas. Neste caso reportouse o efecto terapéutico en ratos sometidos a dietas ricas en graxas e tratados con pevonedistat sobre unha multitude de parámetros metabólicos: fígados menos graxos e tecido adiposo branco con células de menor tamaño en biopsias, menores pesos, menor intolerancia á glicosa, maior sensibilidade á insulina e menor proporción corporal de graxa foron detectados despois de 12 semanas de tratamento dúas veces á semana con pevonedistat a doses intraperitoneais de 30 mg/kg. Ademais do anterior, tamén se detectaron maiores consumos de O2 e CO2 diúrnos, así como maior produción de calor dos animais durante o mesmo período; datos que daban máis unha vez indicios de que o efecto terapéutico do pevonedistat podía estar relacionado, entre outros mecanismos, cun aumento da oxidación dos ácidos graxos. Para comprobar isto último, examinouse baixo tintura inmunohistoquímica as biopsias hepáticas dos animais experimentais, observándose un aumento na expresión de carnitina palmitoiltransferase I, un enzima mitocondrial chave na oxidación dos ácidos graxos. O conxunto destes feitos levou a que se interpretase que en boa medida o mecanismo terapéutico da inhibición da neddilación na DHGNA tiña que ver cun aumento da oxidación dos lípidos a nivel mitocondrial. Tamén se observou un patrón lipidómico diferencial naquelas células hepáticas tratadas con pevonedistat e expostas a ácido oleico.126 O último dos artigos revisados neste apartado foi publicado no ano 2020 polo grupo de Xueying Zhang, e serve como contrapunto ao anteriormente exposto. Nel observouse que o knockout específico para o fígado de NEDD8 ou UBA3, un dos compoñentes de NAE (Figura 1), levaba en ratos á morte neonatal a poucos días do nacemento, con senescencia marcada nos hepatocitos e acumulación lipídica no fígado. O fenotipo exhibido polas crías, ademais, era similar ao da aciduria glutárica tipo II, unha doenza metabólica causada por un mal funcionamento das flavoproteínas da cadea de transporte electrónico. Este sistema resulta fundamental á hora de levar a cabo a oxidación dos ácidos graxos presentes no leite, polo que se teorizou que a neddilación era necesaria para a oxidación dos ácidos graxos en neonatos. Posteriormente, identificáronse as flavoproteínas EFTA e EFTB como substratos da neddilación, propoñendo a competición coa ubiquitinación polas mesmas lisinas como mecanismo para facilitar a súa supervivencia e en consecuencia a oxidación dos ácidos graxos. Obsérvese a contradición co exposto en anteriores artigos, onde se postulaba a inhibición da neddilación como promotora da oxidación dos ácidos graxos, impedindo a súa acumulación ectópica. Porén, compre sinalar que estes achados non foron replicábeis en ratos adultos, que ao seren inducidos a non expresar UBA3 no fígado mediante un adenovirus recombinante non mostraron diferenzas iniciais en canto a peso corporal, glicemias ou peso do fígado con respecto aos controis. Isto é plenamente compatíbel co mostrado en artigos anteriores, nos que a inhibición da neddilación non derivaba en efectos perxudiciais en ratos adultos que seguían unha dieta normal. O cambio chegou ao someter os animais a un xaxún de 48 horas, onde si se empezaron a notar maiores acumulacións hepáticas de lípidos naqueles coa neddilación inhibida, mais sen diferenzas notábeis aínda nas glicemias, colesterolemias, trigliceridemias e transaminasemias. Ademais disto, observouse que o xaxún aumentaba os niveis de EFTA e EFTB nos controis, pero que isto non acontecía naqueles animais coa neddilación inhibida. Ao prolongar o xaxún ata as 96 horas, os ratos con UBA3 bloqueada pereceron na súa totalidade con niveis indetectábeis de glicosa en sangue fronte a unha maioría de sobreviventes no grupo 34 control125. En consecuencia, resulta lóxico concluír da oposición entre este artigo e os anteriores que a neddilación conta cun rol diferente en adultos fronte a neonatos e en situacións de inanición fronte a situacións de sobreinxesta. 4.4. A neddilación fomenta a gliconeoxénese hepática, e a súa inhibición diminúe a resistencia á insulina e a hiperglicemia patolóxicas Neste derradeiro subapartado da revisión analizaranse aqueles artigos que aporten información sobre o rol da neddilación na resistencia aos efectos da insulina e máis na regulación da glicemia. Do total de seis estudos dous deles aportan evidencia limitada respecto do tema da revisión, por motivos diferentes en cada caso, polo que serán analizados en primeiro lugar. O primeiro dos artigos relacionou a neddilación coa resistencia á insulina, mais as indagacións limitáronse ao sistema nervioso central. Trátase do estudo do ano 2022 realizado polo grupo de Alessandro Dario Confettura, que tiña por obxectivo establecer o papel que tiña a resistencia á insulina mediada pola neddilación nas enfermidades neurodexenerativas. En primeiro lugar construiron un modelo celular simple no que induciron resistencia á insulina nun cultivo de neuronas murinas a través de estimulación simultánea con insulina e TNFα. Nestas células corroborouse un déficit de IRS1, e que este tiña a súa causa na degradación proteasómica. Posteriormente, observouse que o tratamento co pevonedistat impedía o desenvolvemento de resistencia á insulina na neurona, e que este fenómeno se debía a que a degradación de IRS1 era dependente dun enzima ubiquitina ligase activado pola neddilación. A continuación entrou en xogo o modelo animal, unha cepa transxénica de ratos caracterizada por presentar acumulación temperá de amiloide e síntomas tipo Alzheimer144. O relevante aquí é que estes animais mostraron despois de seren sometidos a unha dieta rica en graxas unha marcada resistencia á insulina en hipocampo e córtex, acompañados de caídas nos niveis de IRS1. Ao tratar os ratos co pevonedistat en inxección intraperitoneal a dose de 2 mg/kg unha vez ao día durante 14 días os ratos melloraron os seus ratios de IRS1 e a súa memoria, o cal foi interpretado como unha confirmación da capacidade de mellorar a resistencia sináptica á insulina mediante a inhibición da neddilación. Cómpre destacar, porén, que neste caso non se encontraron datos de mellora dos parámetros periféricos de síndrome metabólica; ao contrario do que se expuxo xa en varios artigos, aínda que isto ben puido deberse a que a duración do tratamento non excedeu as dúas semanas, á menor dosificación do fármaco e a que unha maioría dos grupos de investigación non comezaban a medir melloras metabólicas significativas con respecto aos controis até as tres semanas. No entanto, este artigo si viría dar evidencia do rol da neddilación favorecendo a degradación de IRS1, causando deste xeito resistencia á insulina polo menos no tecido nervioso 131. No outro artigo, un estudo do 2024 por parte do grupo de Daewon Lee, a limitación vén do feito de se ter realizado en modelos animais de Drosophila. Neste caso propuxeron o enzima deubiquitinase UCH (homólogo do enzima humano UCHL1) como posibelmente relacionado coa DM2 e a neuropatía diabética, motivo polo que crearon cepas de mosca knockout para este enzima e knockin para unha versión sen actividade enzimática do mesmo, observándose en ambos casos aumentos pronunciados na glicosa; glicóxeno, triglicéridos e trehalosa (un disacárido propio de fungos, plantas e invertebrados) en hemolinfa con respecto aos controis non mutados. Ademais do anterior, comprobáronse niveis elevados dos péptidos insuline-like de Drosophila, polo cal que se deduciu que o knockout de UCH era capaz de crear na mosca un fenotipo análogo á DM2. Por engadido, os mutantes manifestaban tamén síntomas nerviosos 35 similares aos da neuropatía diabética. O achado verdadeiramente chave para entendermos o rol da neddilación foi o comprobarse que este efecto do knockout de UCH se debía a que o enzima prolongaba a vida funcional de IRS1 ao desubiquitinizalo e impedir a súa degradación nos proteasomas, mentres que a neddilación promovía a ubiquitinación e degradación do mesmo mediante a promoción dun enzima ubiquitina ligase que contiña unha proteína cullin, CUL1. Deste xeito, os aumentos de niveis na hemolinfa e os danos neuronais das moscas sen efecto da deubiquitinase UCH podíanse reverter mediante un knockout de CUL1 ou de compoñentes dos complexos enzimáticos E1(UBA3), E2(UBE2M) ou E3(RBX1) para a vía da neddilación (Figura 1). Este mesmo efecto puido observarse ao alimentar as moscas knockdown para UCH con 20 µM de pevonedistat ou TAS4464, inhibindo a neddilación de forma farmacolóxica. En definitiva, o fenotipo tipo DM2 con hiperglicemolinfemia e neuropatía periférica en Drosophila respondía tamén á inhibición da neddilación para mellorar os seus síntomas, presumibelmente ao evitar a degradación do IRS1 mediante a vía das ubiquitina ligases. 124 Desta capacidade da inhibición da neddilación para estabilizar IRS1 trata tamén un estudo do ano 2022 publicado polo grupo de Cheng Chen. Neste estudo comprobouse en hepatocitos humanos e murinos que o tratamento con pevonedistat ou TAS4464 contaba coa propiedade dose dependente de aumentar os niveis de IRS1 e IRS2, prolongando a cantidade de tempo de exposición á insulina necesario para que se extinguise o seu efecto coa degradación de IRS1 pola via de mTOR. Posteriormente comprobouse o efecto in vivo ao tratar a ratos sometidos a unha dieta normal con 60 mg/kg subcutáneos de pevonedistat separados por 16 horas e sacrificar os animais 6 horas despois, observándose un nivel reducido de proteínas cullin hepáticas neddiladas e un aumento do IRS1 hepático. Ademais, comparando un grupo de ratos que fora alimentado con dieta normal e outro que fora sometido a unha “dieta occidental” durante catro semanas, comprobouse unha mellor tolerancia á glicosa en ambos grupos usando tests de tolerancia á glicosa e ao piruvato en ratos tratados con pevonedistat. Posteriormente, identificáronse como responsábeis da degradación do IRS1 ás cullin CUL1 e CUL3 en cultivos celulares de células hepáticas murinas, observándose que era preciso o knockdown de ambas para abolir os efectos do pevonedistat sobre o IRS1. Porén, ao reproducir o knockdown in vivo en ratos, comprobouse a primacía de CUL3 sobre CUL1, pois ao inhibir a segunda non se obtiñan os efectos similares ao tratamento co pevonedistat que si se obtiñan ao inhibir a acción de CUL3. Ademais, deseñouse un experimento no que se comparaban os catro grupos habituais de ratos: dous expostos a unha dieta normal e dous expostos a unha dieta occidental durante 12 semanas, dous expostos ao pevonedistat a dose de 60 mg/kg cada dous días subcutánea (vía escolleita ad hoc para evitar os efectos sobre a prevención da obesidade que se expuxeron nun subapartado anterior coa vía intraperitoneal) e dous sen tratamento. Despois das 12 semanas, observouse nos ratos sometidos á dieta occidental sen pevonedistat a presenza de fígados graxos con niveis reducidos de IRS1, con aumentos tamén do CUL3 neddilado e do UBE2M; todo isto en consonancia co esperado pola hipótese experimental. Mercede á vía subcutánea de administración, o impacto sobre a obesidade foi mínima nos ratos tratados con pevonedistat e dietas occidentais, a pesar do cal se cuantificou neste grupo menores glicemias basais, fígados menos graxos e niveis menores do enzima hepático ALT. De xeito análogo ao observado noutros artigos xa expostos, o tratamento non diminuíu o peso nin as glicemias dos ratos sometidos a dietas normais, nin causou hepatotoxicidade detectábel dende os puntos de vista histolóxico ou enzimático (tamén comprobado mediante o ALT). Deste xeito, o artigo achega evidencia do papel hipoglicemiante da inhibición da neddilación, con independencia do factor da obesidade, e concorda igualmente na idea de relación inversa entre neddilación e estabilidade do IRS1121. 36 No seguinte dos artigos a analizar ratificouse este efecto hipoglicemiante da inhibición da neddilación pero aportándose ademais unha cantidade sobranceira de información sobre os mecanismos do fenómeno. Trátase do estudo do ano 2023 publicado polo grupo de M. Jesús González-Rellán. Nel, replicáronse os efectos da inhibición da neddilación en ratos adultos usando catro modelos: un tratado con pevonedistat, outro heterocigoto para o xene de NAE, outro cun knockdown específico no fígado de NAE e outro cun knockdown específico no fígado de NEDD8. Despois dun xaxún de 24 horas, todos eles mostraron glicemias inferiores aos controis, e igualmente demostraron unha menor capacidade para a gliconeoxénese hepática tanto ao seren sometidos ó xaxún como a unha restrición calórica do 60%. Ademais, expór aos catro modelos a unha dieta rica en graxas de só 4 días foi suficiente para comprobar glicemias menores con respecto aos controis perante un test de tolerancia ao piruvato, ao mesmo tempo que un grupo de ratos nos que se sobreexpresou artificialmente NAE no fígado mostrou glicemias maiores ás 24 horas de xaxún mesmo ao seren tratados con insulina. Todos estes datos vencellaban de novo a neddilación coa resistencia hepática aos efectos da insulina. Por engadidura, observouse que nos ratos control sometidos a xaxún durante 24 horas aumentaban os niveis hepáticos de NEDD8, NAE e cullins neddiladas, pero que este aumento era menos marcado ao suministrarlle unha única dose de azucre aos ratos ou tratalos con leptina, o cal xunto á anterior experiencia cos ratos so restrición calórica suxería que a neddilación hepática se vía estreitamente regulada pola dispoñibilidade de nutrientes. Buscando a explicación mecanicista para este fenómeno, descartouse en primeiro lugar que a inhibición da neddilación alterase os niveis hepáticos dos enzimas encargados da neoglicoxénese, do acetil-coA ou dos aminoácidos. Pola contra, si se observou que en tódolos catro modelos murinos de inhibición da neddilación se daba unha atenuación dos efectos de glicagón, adrenalina e glicocorticoides; todos eles factores hiperglicemiantes como se expuxo no marco teórico. Finalmente, achouse que a causa deste efecto pro-gliconeoxénico se debía á neddilación directa do enzima PCK1, un enzima chave na gliconeoxénese hepática. En condicións de déficit nutricional, este enzima neddilaríase nos residuos de lisina 278, 342 e 387, sendo a neddilación deste último a máis importante por (segundo unha simulación bioinformática das propiedades fisicoquímicas de PCK1) causar un cambio conformacional imprescindíbel para a entrada dun ión Mn2+ no centro catalítico; permitindo a súa actividade enzimática. In vitro, confirmouse este efecto ao incubar hepatocitos nun medio sen nutrientes, observándose un aumento da actividade de PCK1 que era porén abolido ao inhibir a neddilación, ben xenicamente, mediante o pevonesdistat ou ao mutar os tres residuos de lisina anteriores; todo isto malia non rexistrarse unha diminución nos niveis de PCK1. In vivo, confirmouse o efecto ao inducir o knockout de PCK1 en ratos e comprobar niveis baixos de glicosa despois de administrarlles piruvato, que eran invertidos ao inducir neles a expresión da PCK1 pero non ao inducir a expresión dunha PCK1 coas tres lisinas mutadas. Isto non acontecía ao lles administrar glicerol, que entra nun punto distal ao enzima PCK1 na vía da gliconeoxénese, corroborando así que o bloqueo se producía exclusivamente a este nivel. Por último, cómpre resaltar que tamén se comprobou nunha cohorte de pacientes obesos que aqueles que ademais contaban cun diagnóstico de DM2 presentaban niveis hepáticos de NEDD8, NAE e cullins neddiladas máis elevados. En definitiva, este estudo representa evidencia sobre un novo mecanismo de regulación do metabolismo enerxético mediado pola neddilación: a neoglicoxénese hepática hiperactivada pola neddilación de PCK1128. A relación entre a DM2 e o cancro conta cunha historia de seu, pois as funcións anabólicas e como factor de crecemento da insulina fan dela unha hormona con implicacións na patoloxía tumoral, e os diferentes intermediarios da súa vía (coma o IR ou os IRS) son moléculas susceptíbeis de ser estudadas para comprender a progresión de varios tipos de 37 cancro145,146. O grupo de Jun Bum Park publicou no ano 2024 un artigo que precisamente pesquisaba a relación entre a neddilación, os sinais hormonais da insulina e o cancro. O tema resulta se cadra tanxencial ao desta revisión, mais os achados da investigación si aportan evidencia sobre a interacción entre a neddilación e a vía da insulina. Por este motivo non se tratará aquí do estudo polo miúdo, senón só do achado de que, en liñas celulares de cancro de ovario; cancro renal e glioblastoma tratadas con pevonedistat se observaba un descenso nos niveis de IRS1 e IRS2 dependente da degradación proteosómica. Obsérvese que isto é plenamente compatíbel co indicado previamente neste mesmo subapartado. A principal diferenza radica en que neste caso non foi proposto como mecanismo de acción a actuación mediante a neddilación activadora dun enzima ubiquitina ligase E3, senón que IRS1 e IRS2 serían neddilados directamente e este paso precedería dalgún xeito a ubiquitinación. No entanto débese sinalar que, aínda con esta discrepancia no xeito exacto no que o fenómeno acontece, neste estudo se verificou novamente unha relación entre a neddilación e a degradación destes mediadores da acción da insulina. Das limitacións á hora de albergar certeza sobre verdadeiros substratos e mecanismos exactos da función biolóxica da neddilación tratarase na discusión deste traballo127. O último artigo desta revisión é tamén o máis recente, publicado aínda en abril deste 2024, e actúa coma un certo contrapunto a toda a evidencia exposta anteriormente a favor da inhibición da neddilación como posíbel terapia para as doenzas metabólicas. Trátase do estudo do grupo de Lijle Gu, no que pesquisaron os efectos da inhibición da función da cullin CUL3 hepática en ratos adultos circunnavegando a dificultade da mortalidade asociada a esta inhibición durante o período de desenvolvemento147. Para este fin foi creada unha cepa de ratos xa adultos cun knockdown de CUL3 selectivo para fígado mediante un adenovirus recombinante. Con isto pretendíase contrastar os efectos de carecer de CUL3 sobre o metabolismo con aqueles observados nos outros estudos desta revisión ao inhibir a neddilación. Sorprendentemente, os ratos con knockdown de CUL3 exhibiron fenotipos metabólicos máis patolóxicos ao seren expostos a unha dieta occidental durante 8 semanas do que os controis a pesar de, e isto si en consonancia con estudos anteriores; contaren con fígados menos graxos cara o final do experimento. Deste xeito, e malia o menor grao de esteatose hepática, os ratos knockdown sufriron dano hepático lipotóxico de todas formas, de xeito probábel por acumulación de ceramidas. Ademais, tamén comezaron a padecer de hiperglicemia e hiperinsulinemia despois de tan só 5 semanas de dieta occidental, así como resistencia periférica á insulina en tecido adiposo branco e músculo esquelético, posibelmente a expensas do aumento marcado dos ácidos graxos libres en plasma que se rexistrou neles. Ao se repetir o experimento prolongando a dieta até as 16 semanas, comprobouse tamén que os ratos knockout para CUL3 hepática desenvolvían un grao similar de obesidade que os controis e unha hiperglicemia basal peor ca deles. As biopsias hepáticas, pola súa parte, non mostraban infiltración hepática graxa pero si focos limitados de inflamación e fibrose. Ao investigar este efecto paradóxico responsabilizouse do mesmo a NRF2, que como se expuxo previamente é un factor protector contra o estrés oxidativo cunha degradación mediada pola neddilación a través dun enzima ubiquitina ligase. En oposición ao observado nun artigo anterior, a activación excesiva de NRF2 foi xulgada neste caso como prexudicial para o patrón metabólico pois, se ben reducía a acumulación lipídica e o estrés oxidativo no fígado, causaba pola contra estrés redutor ao orientar o equilibrio redox do hepatocito en demasía nesa dirección,148 ao tempo que fomentaba a resistencia periférica á insulina ao permitir a liberación de ácidos graxos libres ao torrente sanguíneo. En harmonía con esta hipótese constatouse en ratos cun dobre knockout hepático para NRF2 e CUL3 sometidos a unha dieta occidental durante 8 semanas unha reversión parcial do fenotipo observado en ratos con knockout simple de CUL3, presentando os primeiros unha acumulación de triglicéridos hepáticos a medio camiño entre os 38 controis e os de knockout simple, así como niveis de ácidos graxos libres en plasma e glicemias basais intermedias. Tamén se comprobou que o fenotipo para o knockout de CUL3 era reproducíbel cun knockout de Keap 1, outro dos compoñentes do enzima ubiquitina ligase encargado de degradar NRF2, sendo confirmada así a preponderancia de NRF2 no efecto da perda de CUL3 sobre o metabolismo. Isto semellaría indicar que, aínda resultando habitualmente desexábel un descenso na adiposidade do fígado para mellorar o patrón metabólico, a acumulación hepática de lípidos conta cunha función de seu impedindo a libre circulación periférica dos ácidos graxos e non convén por ende inhibila a calquera prezo. Con todo, chama a atención o feito de que neste estudo non se contradigan a totalidade dos achados beneficiosos para o metabolismo enerxético relacionados coa inhibición da neddilación, senón só aqueles relativos ao funcionamento de CUL3 e máis especificamente NRF2; pois a propia existencia dun fenotipo intermedio nos ratos con dobre knockout para NRF2 e CUL3 implica a existencia doutros substratos de CUL3 participantes na redución da esteatose hepática. Alén disto, neste estudo tamén se constatou un aumento dos IRS1 e IRS2 hepáticos co knockout de CUL3, o cal harmoniza á perfección co resto de estudos na revisión que propoñían a neddilación como factor desestabilizador destes mediadores da acción da insulina120. Neste e outros puntos afondarase na discusión que segue. Figura 5: Esquema resumo dos mecanismos polos que a neddilación exerce a súa acción biolóxica nos artigos revisados. Reprodúcese no recanto inferior esquerdo a vía da neddilación abreviada (Figura 1 para maior detalle). Ao seguir co esquema, obsérvanse os diferentes tipos de substratos aos que pode unirse NEDD8, así como a interacción coa vía da ubiquitinación (que comeza no recanto superior esquerdo). 39 5. Discusión Nesta revisión púxose de manifesto un feito xeral para o que existe un certo consenso: a neddilación xoga un papel relevante no metabolismo enerxético, pois a inhabilitación farmacolóxica ou xenética da súa vía, de igual xeito á sobreexpresión dos seus compoñentes e substratos no sentido oposto; conta coa capacidade de alterar sistemas metabólicos fundamentais en modelos preclínicos. Entre estes encóntranse a adipoxénese133, a regulación da glicemia129 ou a progresión da doenza hepática graxa non alcólica126. Unha síntese do coñecemento actualizado ao respecto podería ser a seguinte: en concordancia coa literatura científica do momento, a neddilación semella ser unha MPT hiperactivada, por mecanismos aínda non enteiramente comprendidos, naquelas situacións metabolicamente patolóxicas causadas polas dietas excesivamente calóricas que caracterizan a sociedade moderna. Como consecuencia desta hiperactivación, que é particularmente marcada no fígado graxo e en pacientes obesos ou diagnosticados con DM2, a neddilación contribúe a fomentar o perfil metabólico propio destas enfermidades. Esta achega non parece en cambio darse a través dunha vía efectora única, senón que a neddilación conta coa flexibilidade para alterar o estado metabólico da célula como consecuencia da modificación de varios substratos, algúns deles modificados directamente por unha molécula de NEDD8 e outros que se poderían denominar secundarios por vérense afectados por un substrato primario (Figura 5) da neddilación. A nivel do tecido adiposo, a neddilación promove a acumulación lipídica, a diferenciación dos preadipocitos cara un tecido graxo branco menos metabolicamente activo e saudábel e a infiltración inflamatoria do tecido adiposo. Algunhas proteínas propostas como mediadores chave destes efectos serían PPARγ, PRDM16, TRIM21 e SREBP1c. A nivel hepático a neddilación promovería a acumulación ectópica de lípidos e o desenvolvemento da DHGNA, ademais do cal activaría directamente a neoglicoxénese hepática e promovería a resistencia local á insulina, redundando como resultado nun peor control da DM2. Algunhas das proteínas implicadas neste caso serían PCK1, AGER1, as flavoproteínas ETF, DEPTOR, SRSF3, NRF2 ou o IRS1. No caso deste último NEDD8 semella tamén implicado na súa degradación noutros tecidos e órganos, fomentando a resistencia aos efectos da insulina no global do organismo. 40 Proteína Tipo de substrato Correlación con NEDD8 Función da proteína no contexto do metabolismo Resultado da inhibición da neddilación DEPTOR/m TOR Secundarios -/+ DEPTOR media a degradación de mTOR, que en caso de non ser degradada promove a acumulación hepática de lípidos O enzima encargado de ubiqutinizar DEPTOR non se activa, máis mTOR é degradado, os hepatocitos toman un camiño máis catabólico e hai menos esteatose hepática ETFA/ ETFB Primario + Flavoproteínas mitocondriais encargadas da cadea de transporte electrónico e da oxidación de lípidos Ao non seren neddiladas, poden ser ubiquitinadas e degradadas en maior medida, derivando en mortalidade neonatal e peor tolerancia ao xaxún en adultos (ratos) IRS1 Secundario - Media a vía de sinalización da insulina Menos IRS1 é degradado, a resistencia á insulina é menor NRF2 Secundario - Reduce o estrés oxidativo hepático, impide a acumulación hepática de lípidos NRF degrádase menos, menos lípidos se almacenan no fígado e este sofre menos dano oxidativo, pero os ácidos graxos circulan libres e aumentan a resistencia periférica á insulina PCK1 Primario + Enzima chave na neoglicoxénese hepática O enzima non é funcional, a neoglicoxénese hepática vese mermada e a glicemia basal diminúe PPARγ Primario + Favorece a maduración dos preadipocitos a tecido adiposo branco maduro O PPARγ vese máis ubiquitinizado e degradado ao non haber competencia con NEDD8 polos residuos de lisina. Menos formación de tecido adiposo branco PRDM16 Secundario - Favorece a maduración dos preadipocitos cara un tecido de características pardas, máis metabolicamente activo Menos PRDM16 é marcado para a súa ubiquitinación. En consecuencia, máis tecido adiposo se diferencia cara un tecido tipo pardo e menos cara tecido adiposo branco SREBP1c Primario + Inducíbel pola exposición a ácidos graxos, favorece a adipoxénese O SREBP1c vese máis ubiquitinizado e degradado ao non haber competencia con NEDD8 polos residuos de lisina. Menos formación de tecido adiposo branco SRSF3 Primario - Factor protector contra o dano hepático e a esteatoheptatite que é degradado directamente ao ser marcado por NEDD8 Menos SRSF3 é degradado, os hepatocitos sofren menores danos e acumulan menos lípidos TRIM21 Primario + Marca para a súa degradación a outro enzima ubiquina ligase, que normalmente degrada HIF-1α. Como consecuencia, HIF-1α sobrevive e promove a inflamación HIF-1α é degradado. A resposta inflamatoria no tecido adiposo diminúe e o patrón metabólico mellora Figura 6: Táboa resumo de biomoléculas implicadas nos artigos revisados, coas súas funcións biolóxicas e relación coa neddilación. A correlación marca se un aumento dos niveis de NEDD8 aumenta (+) ou diminúe (-) os niveis/actividade da proteína descrita. Primario ou secundario indica se NEDD8 modifica directamente a proteína (neste caso é primario) ou se actúa sobre ela mediante outro substrato primario (neste caso é secundario). 41 Porén, é preciso salientar igualmente algunha das principais limitacións comúns aos estudos analizados. Non debe obviarse, por exemplo, o feito de que a excepción das cullin e por tanto CRL’s un número importante dos substratos da neddilación obtidos en laboratorio poderían non ser susceptíbeis de neddilarse en condicións fisiolóxicas. Isto débese sobre todo a que os estudos opten habitualmente por enfoques do tipo knockdown ou sobreexpresión de xenes, que non sempre reflicten de forma adecuada a realidade fisiolóxica, así como pola homoloxía estrutural e evolutiva entre NEDD8 e ubiquitina que posibilita a confusión entre ambas moléculas en determinadas situacións117,149. Esta razón impulsou na revisión de Enchev, Schulman e Peter do 2014, que precisamente procuraba avaliar a evidencia dispoñíbel naquel momento no tocante aos substratos da neddilación diferentes das CRL’s; a propoñer un conxunto de 5 criterios para aseverar a autenticidade dun substrato da neddilación56. Estes son, sendo os 3 primeiros criterios fundamentais e os dous últimos desexábeis: a unión covalente demostrada entre o extremo C-terminal de NEDD8 e un residuo de lisina do substrato, a detección da neddilación a niveis de NEDD8 e substrato propios das condicións homeostáticas, que a neddilación do substrato sexa bloqueada polo pevonedistat sen bloqueo simultáneo da ubiquitinación, a identificación dos enzimas E2 e E3 participantes no proceso e a posibilidade de definir a regulación e función biolóxica da neddilación no substrato candidato. Mesmo adecuándose como regra xeral bastante os artigos analizados que propuxeron novos substratos da neddilación a estes criterios, en poucos deles se procurou cumprilos todos. Por esta causa, e sen ser isto razón para desestimalos, deben tomarse cun grao adicional de prudencia aqueles artigos que expliquen o efecto da neddilación propoñendo un substrato primario diferente ás CRL, particularmente se non hai probas adicionais que o referenden, como por exemplo a comprobación nunha simulación bioinformática de cambios conformacionais mediados pola neddilación no substrato congruentes coa función biolóxica proposta129 ou a existencia de máis dun estudo que documente a neddilación da biomolécula candidata. Como factor de confusión adicional debe contemplarse o feito de que a vía das CRL’s conta xa de por si coa flexibilidade suficiente como para dirixir numerosos procesos biolóxicos, dotando deste xeito á neddilación de incontábeis substratos secundarios que poden actúar ao unísono. Por este motivo, resulta verdadeiramente fragoso ao inhibir a neddilación e observar un efecto biolóxico atribuírlle unha proporción exacta do mesmo a un substrato concreto, sexa este primario ou secundario. Outro problema xorde ao examinar o paradoxo presentado polo artigo de Lilje Gu, no que se comproba que a abolición da CUL3 conta a medio e longo prazo cos efectos opostos aos descritos noutros estudos. Neste caso os fígados presentaban efectivamente depósitos lipídicos moi reducidos ao inactivar este substrato da neddilación, pero a costa dunha resistencia periférica á insulina marcada, niveis elevados de ácidos graxos libres no plasma e glicemias basais máis elevadas ca nos controis119. Deste estudo pode extraerse a interesante conclusión de que, se ben a doenza hepática graxa agrava a resistencia in situ á insulina, conta tamén coa función de evitar a liberación de ácidos graxos libres ao torrente sanguíneo que poidan inducir resistencia periférica. Porén, resta de todos xeitos a consideración de que neste traballo non se observaron tales efectos tóxicos ao inhibir a neddilación no seu conxunto, senón só a CUL3 mediante knockdown hepático selectivo; obviándose deste xeito os efectos que a inhibición da vía de NEDD8 poida producir no metabolismo mediante outras proteínas cullin ou mesmo outros substratos primarios. De feito, neste estudo inclusive se constatou que a ablación da CUL3 producía un aumento da cantidade de IRS1 hepático, o cal sería un mecanismo sensibilizador aos efectos da insulina indiscutíbel e ben documentado noutros estudos da revisión122. 48 29. Johnson LN. The regulation of protein phosphorylation. Biochem Soc Trans. 2009;37(4). doi:10.1042/BST0370627 30. Hunter T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 2000;100(1). doi:10.1016/S00928674(00)81688-8 31. Brognard J, Hunter T. Protein kinase signaling networks in cancer. Curr Opin Genet Dev. 2011;21(1). doi:10.1016/j.gde.2010.10.012 32. Goto A, Endo Y, Yamashita H. CREG1 stimulates AMPK phosphorylation and glucose uptake in skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 2023;641. doi:10.1016/j.bbrc.2022.12.028 33. Dai X, Ren T, Zhang Y, Nan N. Methylation multiplicity and its clinical values in cancer. Expert Rev Mol Med. 2021;23. doi:10.1017/erm.2021.4 34. Robertson KD, A.Jones P. DNA methylation: past, present and future directions. Carcinogenesis. 2000;21(3). doi:10.1093/carcin/21.3.461 35. Frye M, Harada BT, Behm M, He C. RNA modifications modulate gene expression during development. Science (1979). 2018;361(6409). doi:10.1126/science.aau1646 36. Lanouette S, Mongeon V, Figeys D, Couture J. The functional diversity of protein lysine methylation. Mol Syst Biol. 2014;10(4). doi:10.1002/msb.134974 37. Espada J, Ballestar E, Fraga MF, et al. Human DNA Methyltransferase 1 Is Required for Maintenance of the Histone H3 Modification Pattern. Journal of Biological Chemistry. 2004;279(35). doi:10.1074/jbc.M404842200 38. Sabbattini P, Sjoberg M, Nikic S, et al. An H3K9/S10 methyl-phospho switch modulates Polycomb and Pol II binding at repressed genes during differentiation. Mol Biol Cell. 2014;25(6). doi:10.1091/mbc.e13-10-0628 39. Drazic A, Myklebust LM, Ree R, Arnesen T. The world of protein acetylation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2016;1864(10). doi:10.1016/j.bbapap.2016.06.007 40. Aksnes H, Hole K, Arnesen T. Molecular, Cellular, and Physiological Significance of N-Terminal Acetylation. In: ; 2015. doi:10.1016/bs.ircmb.2015.01.001 41. Glozak MA, Sengupta N, Zhang X, Seto E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 2005;363. doi:10.1016/j.gene.2005.09.010 42. Verdone L, Caserta M, Mauro E Di. Role of histone acetylation in the control of gene expression. Biochemistry and Cell Biology. 2005;83(3). doi:10.1139/o05-041 43. Narita T, Weinert BT, Choudhary C. Functions and mechanisms of non-histone protein acetylation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(3). doi:10.1038/s41580-018-0081-3 44. Zhang R, Shen M, Wu C, et al. HDAC8-dependent deacetylation of PKM2 directs nuclear localization and glycolysis to promote proliferation in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis. 2020;11(12). doi:10.1038/s41419-020-03212-3 49 45. Mevissen TET, Komander D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annu Rev Biochem. 2017;86(1). doi:10.1146/annurev-biochem-061516044916 46. Swatek KN, Komander D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 2016;26(4). doi:10.1038/cr.2016.39 47. Nguyen HC, Wang W, Xiong Y. Cullin-RING E3 Ubiquitin Ligases: Bridges to Destruction. In:; 2017. doi:10.1007/978-3-319-46503-6_12 48. Rajalingam K, Dikic I. Expanding the Ubiquitin Code. Cell. 2016;164(5).e1. doi:10.1016/j.cell.2016.02.019 49. Liu B, Ruan J, Chen M, et al. Deubiquitinating enzymes (DUBs): decipher underlying basis of neurodegenerative diseases. Mol Psychiatry. 2022;27(1). doi:10.1038/s41380021-01233-8 50. Pradeep P, Kang H, Lee B. Glycosylation and behavioral symptoms in neurological disorders. Transl Psychiatry. 2023;13(1). doi:10.1038/s41398-023-02446-x 51. Reily C, Stewart TJ, Renfrow MB, Novak J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019;15(6). doi:10.1038/s41581-019-0129-4 52. Zhu S, Gu H, Peng C, Xia F, Cao H, Cui H. Regulation of Glucose, Fatty Acid and Amino Acid Metabolism by Ubiquitination and SUMOylation for Cancer Progression. Front Cell Dev Biol. 2022;10. doi:10.3389/fcell.2022.849625 53. Gabellier L, De Toledo M, Chakraborty M, et al. SUMOylation inhibitor TAK-981 (subasumstat) synergizes with 5-azacitidine in preclinical models of acute myeloid leukemia. Haematologica. Published online August 24, 2023. doi:10.3324/haematol.2023.282704 54. Dehnavi, Sadeghi, Penson, Banach, Jamialahmadi, Sahebkar. The Role of Protein SUMOylation in the Pathogenesis of Atherosclerosis. J Clin Med. 2019;8(11). doi:10.3390/jcm8111856 55. Rao-Naik C, delaCruz W, Laplaza JM, Tan S, Callis J, Fisher AJ. The Rub Family of Ubiquitin-like Proteins. Journal of Biological Chemistry. 1998;273(52). doi:10.1074/jbc.273.52.34976 56. Enchev RI, Schulman BA, Peter M. Protein neddylation: beyond cullin–RING ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16(1). doi:10.1038/nrm3919 57. Kamitani T, Kito K, Nguyen HP, Yeh ETH. Characterization of NEDD8, a Developmentally Down-regulated Ubiquitin-like Protein. Journal of Biological Chemistry. 1997;272(45). doi:10.1074/jbc.272.45.28557 58. Wada H, Kito K, Caskey LS, Yeh ETH, Kamitani T. Cleavage of the C-Terminus of NEDD8 by UCH-L3. Biochem Biophys Res Commun. 1998;251(3). doi:10.1006/bbrc.1998.9532 50 59. Gan-Erdene T, Nagamalleswari K, Yin L, Wu K, Pan ZQ, Wilkinson KD. Identification and Characterization of DEN1, a Deneddylase of the ULP Family. Journal of Biological Chemistry. 2003;278(31). doi:10.1074/jbc.M302890200 60. Walden H, Podgorski MS, Huang DT, et al. The Structure of the APPBP1-UBA3NEDD8-ATP Complex Reveals the Basis for Selective Ubiquitin-like Protein Activation by an E1. Mol Cell. 2003;12(6). doi:10.1016/S1097-2765(03)00452-0 61. Huang DT, Hunt HW, Zhuang M, Ohi MD, Holton JM, Schulman BA. Basis for a ubiquitin-like protein thioester switch toggling E1–E2 affinity. Nature. 2007;445(7126). doi:10.1038/nature05490 62. Ohki Y, Funatsu N, Konishi N, Chiba T. The mechanism of poly-NEDD8 chain formation in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2009;381(3). doi:10.1016/j.bbrc.2009.02.090 63. Singh RK, Zerath S, Kleifeld O, Scheffner M, Glickman MH, Fushman D. Recognition and Cleavage of Related to Ubiquitin 1 (Rub1) and Rub1-Ubiquitin Chains by Components of the Ubiquitin-Proteasome System. Molecular & Cellular Proteomics. 2012;11(12). doi:10.1074/mcp.M112.022467 64. Soucy TA, Smith PG, Milhollen MA, et al. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature. 2009;458(7239). doi:10.1038/nature07884 65. Duda DM, Borg LA, Scott DC, Hunt HW, Hammel M, Schulman BA. Structural Insights into NEDD8 Activation of Cullin-RING Ligases: Conformational Control of Conjugation. Cell. 2008;134(6). doi:10.1016/j.cell.2008.07.022 66. Lydeard JR, Schulman BA, Harper JW. Building and remodelling Cullin–RING E3 ubiquitin ligases. EMBO Rep. 2013;14(12). doi:10.1038/embor.2013.173 67. Scott DC, Sviderskiy VO, Monda JK, et al. Structure of a RING E3 Trapped in Action Reveals Ligation Mechanism for the Ubiquitin-like Protein NEDD8. Cell. 2014;157(7). doi:10.1016/j.cell.2014.04.037 68. Wu JT, Lin HC, Hu YC, Chien CT. Neddylation and deneddylation regulate Cul1 and Cul3 protein accumulation. Nat Cell Biol. 2005;7(10). doi:10.1038/ncb1301 69. Wu K, Yamoah K, Dolios G, et al. DEN1 Is a Dual Function Protease Capable of Processing the C Terminus of Nedd8 and Deconjugating Hyper-neddylated CUL1. Journal of Biological Chemistry. 2003;278(31). doi:10.1074/jbc.M302888200 70. Chan Y, Yoon J, Wu JT, et al. DEN1 deneddylates non-cullin proteins in vivo. J Cell Sci. 2008;121(19). doi:10.1242/jcs.030445 71. Zhou L, Lin X, Zhu J, et al. NEDD8-conjugating enzyme E2s: critical targets for cancer therapy. Cell Death Discov. 2023;9(1). doi:10.1038/s41420-023-01337-w 72. Xirodimas DP, Saville MK, Bourdon JC, Hay RT, Lane DP. Mdm2-Mediated NEDD8 Conjugation of p53 Inhibits Its Transcriptional Activity. Cell. 2004;118(1). doi:10.1016/j.cell.2004.06.016 51 73. Oved S, Mosesson Y, Zwang Y, et al. Conjugation to Nedd8 Instigates Ubiquitylation and Down-regulation of Activated Receptor Tyrosine Kinases. Journal of Biological Chemistry. 2006;281(31). doi:10.1074/jbc.M513034200 74. Fu DJ, Wang T. Targeting NEDD8-activating enzyme for cancer therapy: developments, clinical trials, challenges and future research directions. J Hematol Oncol. 2023;16(1). doi:10.1186/s13045-023-01485-7 75. Yamamoto N, Shimizu T, Yonemori K, et al. A first-in-human, phase 1 study of the NEDD8 activating enzyme E1 inhibitor TAS4464 in patients with advanced solid tumors. Invest New Drugs. 2021;39(4). doi:10.1007/s10637-020-01055-5 76. Yoshimura C, Muraoka H, Ochiiwa H, et al. TAS4464, A Highly Potent and Selective Inhibitor of NEDD8-Activating Enzyme, Suppresses Neddylation and Shows Antitumor Activity in Diverse Cancer Models. Mol Cancer Ther. 2019;18(7). doi:10.1158/15357163.MCT-18-0644 77. Zhou LN, Xiong C, Cheng YJ, et al. SOMCL-19-133, a novel, selective, and orally available inhibitor of NEDD8-activating enzyme (NAE) for cancer therapy. Neoplasia. 2022;32. doi:10.1016/j.neo.2022.100823 78. Xiong C, Zhou L, Tan J, et al. Development of Potent NEDD8-Activating Enzyme Inhibitors Bearing a Pyrimidotriazole Scaffold. J Med Chem. 2021;64(9). doi:10.1021/acs.jmedchem.1c00242 79. Kim JH, Jung JH, Lee HJ, et al. UBE2M Drives Hepatocellular Cancer Progression as a p53 Negative Regulator by Binding to MDM2 and Ribosomal Protein L11. Cancers (Basel). 2021;13(19). doi:10.3390/cancers13194901 80. Soucy TA, Smith PG, Milhollen MA, et al. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature. 2009;458(7239). doi:10.1038/nature07884 81. Andérica-Romero AC, Hernández-Damián J, Vázquez-Cervantes GI, Torres I, PedrazaChaverri J. The MLN4924 inhibitor exerts a neuroprotective effect against oxidative stress injury via Nrf2 protein accumulation. Redox Biol. 2016;8. doi:10.1016/j.redox.2016.02.008 82. Zhang J, Cui J, Zhao F, et al. Cardioprotective effect of MLN4924 on ameliorating autophagic flux impairment in myocardial ischemia-reperfusion injury by Sirt1. Redox Biol. 2021;46. doi:10.1016/j.redox.2021.102114 83. Xie L, Ji X, Tu Y, et al. MLN4924 inhibits hedgehog signaling pathway and activates autophagy to alleviate mouse laser-induced choroidal neovascularization lesion. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2020;130. doi:10.1016/j.biopha.2020.110654 84. Zhang W, Liang Y, Li L, et al. The Nedd8‐activating enzyme inhibitor MLN4924/ TAK924/ Pevonedistat induces apoptosis via c‐Myc‐Noxa axis in head and neck squamous cell carcinoma. Cell Prolif. 2019;52(2). doi:10.1111/cpr.12536 85. Jia L, Li H, Sun Y. Induction of p21-Dependent Senescence by an NAE Inhibitor, MLN4924, as a Mechanism of Growth Suppression. Neoplasia. 2011;13(6). doi:10.1593/neo.11420 52 86. Wang X, Zhang W, Yan Z, et al. Radiosensitization by the investigational NEDD8activating enzyme inhibitor MLN4924 (pevonedistat) in hormone-resistant prostate cancer cells. Oncotarget. 2016;7(25). doi:10.18632/oncotarget.9526 87. Zhou Q, Li H, Li Y, et al. Inhibiting neddylation modification alters mitochondrial morphology and reprograms energy metabolism in cancer cells. JCI Insight. 2019;4(4). doi:10.1172/jci.insight.121582 88. Mao W, Zhang L, Rong Y, et al. NEDD8-Activating Enzyme Inhibitor MLN4924 Inhibits Both the Tumor Stroma and Angiogenesis in Pancreatic Cancer via Gli1 and REDD1. Dig Dis Sci. 2023;68(4). doi:10.1007/s10620-022-07671-w 89. Zhou L, Jiang Y, Luo Q, Li L, Jia L. Neddylation: a novel modulator of the tumor microenvironment. Mol Cancer. 2019;18(1). doi:10.1186/s12943-019-0979-1 90. Du M ge, Peng Z qiang, Gai W bin, et al. The Absence of PTEN in Breast Cancer Is a Driver of MLN4924 Resistance. Front Cell Dev Biol. 2021;9. doi:10.3389/fcell.2021.667435 91. Zhou Q, Sun Y. MLN4924: additional activities beyond neddylation inhibition. Mol Cell Oncol. 2019;6(5). doi:10.1080/23723556.2019.1618174 92. Mao H, Tang Z, Li H, et al. Neddylation inhibitor MLN4924 suppresses cilia formation by modulating AKT1. Protein Cell. 2019;10(10). doi:10.1007/s13238-019-0614-3 93. Zhou X, Tan M, Nyati MK, Zhao Y, Wang G, Sun Y. Blockage of neddylation modification stimulates tumor sphere formation in vitro and stem cell differentiation and wound healing in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016;113(21). doi:10.1073/pnas.1522367113 94. Sun H, Saeedi P, Karuranga S, et al. IDF Diabetes Atlas: Global, regional and countrylevel diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045. Diabetes Res Clin Pract. 2022;183. doi:10.1016/j.diabres.2021.109119 95. Roden M, Shulman GI. The integrative biology of type 2 diabetes. Nature. 2019;576(7785). doi:10.1038/s41586-019-1797-8 96. Mahajan A, Wessel J, Willems SM, et al. Refining the accuracy of validated target identification through coding variant fine-mapping in type 2 diabetes. Nat Genet. 2018;50(4). doi:10.1038/s41588-018-0084-1 97. Bellou V, Belbasis L, Tzoulaki I, Evangelou E. Risk factors for type 2 diabetes mellitus: An exposure-wide umbrella review of meta-analyses. PLoS One. 2018;13(3). doi:10.1371/journal.pone.0194127 98. Binet Q, Loumaye A, Preumont V, Thissen JP, Hermans MP, Lanthier N. Non-invasive screening, staging and management of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD) in type 2 diabetes mellitus patients : what do we know so far? Acta Gastro Enterologica Belgica. 2022;85(2). doi:10.51821/85.2.9775 99. Ford ES, Li C, Sattar N. Metabolic Syndrome and Incident Diabetes. Diabetes Care. 2008;31(9). doi:10.2337/dc08-0423 53 100. Samuel VT, Shulman GI. The pathogenesis of insulin resistance: integrating signaling pathways and substrate flux. Journal of Clinical Investigation. 2016;126(1). doi:10.1172/JCI77812 101. Perry RJ, Wang Y, Cline GW, et al. Leptin Mediates a Glucose-Fatty Acid Cycle to Maintain Glucose Homeostasis in Starvation. Cell. 2018;172(1-2). doi:10.1016/j.cell.2017.12.001 102. Samuel VT, Shulman GI. The pathogenesis of insulin resistance: integrating signaling pathways and substrate flux. Journal of Clinical Investigation. 2016;126(1). doi:10.1172/JCI77812 103. Perry RJ, Camporez JPG, Kursawe R, et al. Hepatic Acetyl CoA Links Adipose Tissue Inflammation to Hepatic Insulin Resistance and Type 2 Diabetes. Cell. 2015;160(4). doi:10.1016/j.cell.2015.01.012 104. Petersen MC, Vatner DF, Shulman GI. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 2017;13(10). doi:10.1038/nrendo.2017.80 105. Petersen MC, Madiraju AK, Gassaway BM, et al. Insulin receptor Thr1160 phosphorylation mediates lipid-induced hepatic insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 2016;126(11). doi:10.1172/JCI86013 106. Szendroedi J, Yoshimura T, Phielix E, et al. Role of diacylglycerol activation of PKCθ in lipid-induced muscle insulin resistance in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111(26). doi:10.1073/pnas.1409229111 107. Rabøl R, Petersen KF, Dufour S, Flannery C, Shulman GI. Reversal of muscle insulin resistance with exercise reduces postprandial hepatic de novo lipogenesis in insulin resistant individuals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011;108(33). doi:10.1073/pnas.1110105108 108. DeFronzo RA, Tripathy D. Skeletal Muscle Insulin Resistance Is the Primary Defect in Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 2009;32(2). doi:10.2337/dc09-S302 109. Poitout V, Amyot J, Semache M, Zarrouki B, Hagman D, Fontés G. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 2010;1801(3). doi:10.1016/j.bbalip.2009.08.006 110. Schwartz MW, Seeley RJ, Tschöp MH, et al. Cooperation between brain and islet in glucose homeostasis and diabetes. Nature. 2013;503(7474). doi:10.1038/nature12709 111. Hernández EÁ, Kahl S, Seelig A, et al. Acute dietary fat intake initiates alterations in energy metabolism and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 2017;127(2). doi:10.1172/JCI89444 112. Kraja AT, Liu C, Fetterman JL, et al. Associations of Mitochondrial and Nuclear Mitochondrial Variants and Genes with Seven Metabolic Traits. The American Journal of Human Genetics. 2019;104(1). doi:10.1016/j.ajhg.2018.12.001 54 113. Li X, Jiang Y, Meisenhelder J, et al. Mitochondria-Translocated PGK1 Functions as a Protein Kinase to Coordinate Glycolysis and the TCA Cycle in Tumorigenesis. Mol Cell. 2016;61(5). doi:10.1016/j.molcel.2016.02.009 114. Zeng R, Lv B, Lin Z, et al. Neddylation suppression by a macrophage membrane-coated nanoparticle promotes dual immunomodulatory repair of diabetic wounds. Bioact Mater. 2024;34. doi:10.1016/j.bioactmat.2023.12.025 115. Yao J, Liang X, Liu Y, Zheng M. Neddylation: A Versatile Pathway Takes on Chronic Liver Diseases. Front Med (Lausanne). 2020;7. doi:10.3389/fmed.2020.586881 116. Nomura Y, Nakano M, Woo Sung H, Han M, Pandey D. Inhibition of HDAC6 Activity Protects Against Endothelial Dysfunction and Atherogenesis in vivo: A Role for HDAC6 Neddylation. Front Physiol. 2021;12. doi:10.3389/fphys.2021.675724 117. Zhang S, Yu Q, Li Z, Zhao Y, Sun Y. Protein neddylation and its role in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1). doi:10.1038/s41392-024-01800-9 118. Yu M, Qian X, Wang Y, et al. Emerging role of NEDD8-mediated neddylation in agerelated metabolic diseases. Ageing Res Rev. 2024;94. doi:10.1016/j.arr.2024.102191 119. Gu L, Du Y, Chen J, et al. Cullin 3 RING E3 ligase inactivation causes NRF2-dependent NADH reductive stress, hepatic lipodystrophy, and systemic insulin resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2024;121(17). doi:10.1073/pnas.2320934121 120. Dehnad A, Fan W, Jiang JX, et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. Published online July 13, 2020. doi:10.1172/JCI133051 121. Dubiel D, Bintig W, Kähne T, Dubiel W, Naumann M. Cul3 neddylation is crucial for gradual lipid droplet formation during adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2017;1864(8). doi:10.1016/j.bbamcr.2017.05.009 122. Chen C, Gu L, Matye DJ, et al. Cullin neddylation inhibitor attenuates hyperglycemia by enhancing hepatic insulin signaling through insulin receptor substrate stabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2022;119(6). doi:10.1073/pnas.2111737119 123. Kumar D, Das M, Sauceda C, et al. Degradation of splicing factor SRSF3 contributes to progressive liver disease. Journal of Clinical Investigation. 2019;129(10). doi:10.1172/JCI127374 124. Lee D, Yoon E, Ham SJ, et al. Diabetic sensory neuropathy and insulin resistance are induced by loss of UCHL1 in Drosophila. Nat Commun. 2024;15(1). doi:10.1038/s41467-024-44747-9 125. Zhang X, Zhang YL, Qiu G, et al. Hepatic neddylation targets and stabilizes electron transfer flavoproteins to facilitate fatty acid β-oxidation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2020;117(5). doi:10.1073/pnas.1910765117 55 126. Ge M, Huang L, Ma Y, et al. MLN4924 Treatment Diminishes Excessive Lipid Storage in High-Fat Diet-Induced Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) by Stimulating Hepatic Mitochondrial Fatty Acid Oxidation and Lipid Metabolites. Pharmaceutics. 2022;14(11). doi:10.3390/pharmaceutics14112460 127. Serrano-Maciá M, Simón J, González-Rellan MJ, et al. Neddylation inhibition ameliorates steatosis in NAFLD by boosting hepatic fatty acid oxidation via the DEPTOR-mTOR axis. Mol Metab. 2021;53. doi:10.1016/j.molmet.2021.101275 128. Park JB, Moon GH, Cho A, et al. Neddylation of insulin receptor substrate acts as a bona fide regulator of insulin signaling and its implications for cancer cell migration. Cancer Gene Ther. 2024;31(4). doi:10.1038/s41417-024-00729-z 129. Gonzalez-Rellan MJ, Fernández U, Parracho T, et al. Neddylation of phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 controls glucose metabolism. Cell Metab. 2023;35(9). doi:10.1016/j.cmet.2023.07.003 130. Ju UI, Jeong DW, Seo J, et al. Neddylation of sterol regulatory element-binding protein 1c is a potential therapeutic target for nonalcoholic fatty liver treatment. Cell Death Dis. 2020;11(4). doi:10.1038/s41419-020-2472-6 131. Confettura AD, Cuboni E, Ammar MR, et al. Neddylation-dependent protein degradation is a nexus between synaptic insulin resistance, neuroinflammation and Alzheimer’s disease. Transl Neurodegener. 2022;11(1). doi:10.1186/s40035-02100277-8 132. Wang Q, Li H, Tajima K, et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 2022;609(7925). doi:10.1038/s41586-022-05067-4 133. Park HS, Ju UI, Park JW, et al. PPARγ neddylation essential for adipogenesis is a potential target for treating obesity. Cell Death Differ. 2016;23(8). doi:10.1038/cdd.2016.6 134. Lu X, Kong X, Wu H, et al. UBE2M-mediated neddylation of TRIM21 regulates obesity-induced inflammation and metabolic disorders. Cell Metab. 2023;35(8). doi:10.1016/j.cmet.2023.05.011 135. Steger DJ, Grant GR, Schupp M, et al. Propagation of adipogenic signals through an epigenomic transition state. Genes Dev. 2010;24(10). doi:10.1101/gad.1907110 136. Chen K, He H, Xie Y, et al. miR-125a-3p and miR-483-5p promote adipogenesis via suppressing the RhoA/ROCK1/ERK1/2 pathway in multiple symmetric lipomatosis. Sci Rep. 2015;5(1). doi:10.1038/srep11909 137. Wang W, Ishibashi J, Trefely S, et al. A PRDM16-Driven Metabolic Signal from Adipocytes Regulates Precursor Cell Fate. Cell Metab. 2019;30(1). doi:10.1016/j.cmet.2019.05.005 138. Kajimura S, Spiegelman BM, Seale P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metab. 2015;22(4). doi:10.1016/j.cmet.2015.09.007 56 139. Elizalde M, Urtasun R, Azkona M, et al. Splicing regulator SLU7 is essential for maintaining liver homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 2014;124(7). doi:10.1172/JCI74382 140. Kumar D, Das M, Sauceda C, et al. Degradation of splicing factor SRSF3 contributes to progressive liver disease. Journal of Clinical Investigation. 2019;129(10). doi:10.1172/JCI127374 141. Vlassara H, Uribarri J. Advanced Glycation End Products (AGE) and Diabetes: Cause, Effect, or Both? Curr Diab Rep. 2014;14(1). doi:10.1007/s11892-013-0453-1 142. Calkins MJ, Johnson DA, Townsend JA, et al. The Nrf2/ARE Pathway as a Potential Therapeutic Target in Neurodegenerative Disease. Antioxid Redox Signal. 2009;11(3). doi:10.1089/ars.2008.2242 143. Chen H, Shen F, Sherban A, et al. DEP domain–containing mTOR–interacting protein suppresses lipogenesis and ameliorates hepatic steatosis and acute‐on‐chronic liver injury in alcoholic liver disease. Hepatology. 2018;68(2). doi:10.1002/hep.29849 144. Alexandru A, Jagla W, Graubner S, et al. Selective Hippocampal Neurodegeneration in Transgenic Mice Expressing Small Amounts of Truncated Aβ Is Induced by Pyroglutamate–Aβ Formation. The Journal of Neuroscience. 2011;31(36). doi:10.1523/JNEUROSCI.1794-11.2011 145. Otokozawa S, Tanaka R, Akasaka H, et al. Associations of Serum Isoflavone, Adiponectin and Insulin Levels with Risk for Epithelial Ovarian Cancer: Results of a Case-control Study. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2015;16(12). doi:10.7314/APJCP.2015.16.12.4987 146. Mardilovich K, Pankratz SL, Shaw LM. Expression and function of the insulin receptor substrate proteins in cancer. Cell Communication and Signaling. 2009;7(1). doi:10.1186/1478-811X-7-14 147. Kossatz U, Breuhahn K, Wolf B, et al. The cyclin E regulator cullin 3 prevents mouse hepatic progenitor cells from becoming tumor-initiating cells. Journal of Clinical Investigation. 2010;120(11). doi:10.1172/JCI41959 148. Goodman RP, Markhard AL, Shah H, et al. Hepatic NADH reductive stress underlies common variation in metabolic traits. Nature. 2020;583(7814). doi:10.1038/s41586020-2337-2 149. Zhou L, Zhang W, Sun Y, Jia L. Protein neddylation and its alterations in human cancers for targeted therapy. Cell Signal. 2018;44. doi:10.1016/j.cellsig.2018.01.009 150. Rizza RA. Pathogenesis of Fasting and Postprandial Hyperglycemia in Type 2 Diabetes: Implications for Therapy. Diabetes. 2010;59(11). doi:10.2337/db10-1032 151. Riddle MR, Aspiras AC, Gaudenz K, et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 2018;555(7698). doi:10.1038/nature26136 152. Powell EE, Wong VWS, Rinella M. Non-alcoholic fatty liver disease. The Lancet. 2021;397(10290). doi:10.1016/S0140-6736(20)32511-3 57 153. Li L, Wang M, Yu G, et al. Overactivated Neddylation Pathway as a Therapeutic Target in Lung Cancer. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 2014;106(6). doi:10.1093/jnci/dju083 154. Ying J, Zhang M, Qiu X, Lu Y. Targeting the neddylation pathway in cells as a potential therapeutic approach for diseases. Cancer Chemother Pharmacol. 2018;81(5). doi:10.1007/s00280-018-3541-8 155. Dalton W. The proteasome. Semin Oncol. 2004;31. doi:10.1053/j.seminoncol.2004.10.012 156. Richardson PG, Sonneveld P, Schuster M, et al. Extended follow-up of a phase 3 trial in relapsed multiple myeloma: final time-to-event results of the APEX trial. Blood. 2007;110(10). doi:10.1182/blood-2006-08-036947 157. Wu S, Yu L. Targeting cullin-RING ligases for cancer treatment: rationales, advances and therapeutic implications. Cytotechnology. 2016;68(1). doi:10.1007/s10616-0159870-0 158. Ruegsegger GN, Creo AL, Cortes TM, Dasari S, Nair KS. Altered mitochondrial function in insulin-deficient and insulin-resistant states. Journal of Clinical Investigation. 2018;128(9). doi:10.1172/JCI120843 159. Rohm T V., Meier DT, Olefsky JM, Donath MY. Inflammation in obesity, diabetes, and related disorders. Immunity. 2022;55(1). doi:10.1016/j.immuni.2021.12.013 160. Zhou Q, Zheng Y, Sun Y. Neddylation regulation of mitochondrial structure and functions. Cell Biosci. 2021;11(1). doi:10.1186/s13578-021-00569-6 161. Chang FM, Reyna SM, Granados JC, et al. Inhibition of Neddylation Represses Lipopolysaccharide-induced Proinflammatory Cytokine Production in Macrophage Cells. Journal of Biological Chemistry. 2012;287(42). doi:10.1074/jbc.M112.397703