Evaluación de parámetros físico-químicos en grelo (Brassica rapa, L.) tras la optimización y aplicación del proceso de congelación

EVALUACIÓN DE PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS EN GRELO (Brassica rapa, L.) TRAS LA OPTIMIZACIÓN Y APLICACIÓN DEL PROCESO DE CONGELACIÓN UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA TESIS DOCTORAL 2006 Alicia del Carmen Mondragón Portocarrero Alicia del Carmen Mondragón Portocarrero 2006 TESIS DOCTORAL UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS EN GRELO (Brassica rapa, L.) TRAS LA OPTIMIZACIÓN Y APLICACIÓN DEL PROCESO DE CONGELACIÓN Alicia del Carmen Mondragón Portocarrero TESIS DOCTORAL 2006 Dra. PILAR BERMEJO BARRERA, Catedrática de Universidad y Directora del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela INFORMA QUE: ALICIA DEL CARMEN MONDRAGÓN PORTOCARRERO ha realizado en este departamento, bajo la dirección de la Dra. Mª ANGELES ROMERO RODRÍGUEZ, Dra. Mª LOURDES VÁZQUEZ ODÉRIZ y Dr. ENRIQUE ARBONES MACIÑEIRA, el trabajo titulado “Evaluación de parámetros físico-químicos en grelo (Brassica rapa, L.) tras la optimización y aplicación del proceso de congelación”, que presenta para optar al grado de Doctora en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Y para que así conste, firma la presente en Santiago de Compostela, en abril de 2006. __________________________ Fdo. Dra. Pilar Bermejo Barrera Dra. Mª ANGELES ROMERO RODRIGUEZ y Dra. Mª LOURDES VÁZQUEZ ODÉRIZ, Profesoras Titulares de Universidad del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología y Dr. ENRIQUE ARBONES MACIÑEIRA, Profesor Titular del Departamento de Ingeniería Agroforestal, de la Universidad de Santiago de Compostela AUTORIZAN: A la presentación de la memoria titulada “Evaluación de parámetros físicoquímicos en grelo (Brassica rapa, L.) tras la optimización y aplicación del proceso de congelación”, realizada bajo su dirección, por ALICIA DEL CARMEN MONDRAGÓN PORTOCARRERO, en los laboratorios de Tecnología de los Alimentos, de Nutrición y Bromatología y en la nave de Industrias Agrarias y Alimentarias, del Campus de Lugo, para optar al grado de Doctora en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Y para que así conste, firman la presente en Lugo, en abril de 2006. _____________________ Fdo. Dra. Mª Angeles Romero Rodríguez _____________________ Fdo. Dra. Mª Lourdes Vázquez Odériz ______________________ Fdo. Dr. Enrique Arbones Maciñeira ________________________________________ Fdo. Alicia del Carmen Mondragón Portocarrero Dedicatorias ________________________________________________________________________ DEDICATORIAS ♣A DIOS, por darme la oportunidad de vivir, por brindarme momentos buenos para sonreír, y momentos no tan buenos para luchar, porque nunca te olvidas de mí...gracias Señor ♣ ♥♥A mis padres, Carmelita y Mario, por ser un ejemplo constante de amor y superación para mi persona, por todos los momentos compartidos y por brindarme siempre todo su amor, cariño, apoyo y ayuda. Los amo y los admiro muchísimo. Gracias a mi estupenda y amada amiga Chaparrita, tú sabes que eres la mejor y lo vales todo para mí ♥♥ ♥A mi querido José Manuel, porque ha sabido estar conmigo en las buenas y en las malas, por el día a día, por su amor y porque se ha convertido en una persona importantísima en mi vida. Tuve que salir a buscarte muy lejos, pero...te encontré, gracias corazón. ¡Muac....I love! ♥ ♪A Rodolfo Darío, Delia Angélica, Mario Alberto y Mario Chicas, mis hermanos queridos, por todo lo que hemos vivido juntos, por el cariño y amor que nos tenemos. A July, mi cuñada y amiga, por sus consejos, su cariño y su excelente trato hacia toda la familia ♪ ♫A Vanessa, Grace, Chabelita, Paulina, Galilea y Mario Alberto, mis preciosos sobrinos, por sus regalitos, sus travesuras, sus recuerdos y su cariño inmenso. Los quiero mucho ♫ Agradecimientos ________________________________________________________________________ AGRADECIMIENTOS A PROMEP-SEP (Programa de Mejoramiento del Profesorado de la Secretaría de Educación Pública, en México) por la beca de 3 años concedida para llevar a cabo mis estudios de doctorado y a la Universidad del Estado de Hidalgo, por otorgarme el permiso laboral y continuar apoyándome económicamente cuando mi beca finalizó. A la Dra. Mª Ángeles Romero Rodríguez y Dra. Mª Lourdes Vázquez Odériz, muchas gracias por haberme aceptado para trabajar en su laboratorio, por la confianza depositada en mi persona y por la independencia que me dejaron tener, ya que eso hizo más sólida mi formación científica. Asimismo, gracias por su rapidez y eficacia en revisar la tesis. Al Dr. Enrique Arbones Maciñeira, por su trato tan cordial y por su ayuda en la puesta a punto e industrialización de los grelos. A José Manuel Miranda López, por ayudarme en el día a día, en la industrialización de los grelos, en los experimentos, en el APPCC, en la microbiología, en el lavado de material, en la escritura, en la impresión y en todo lo relacionado con la tesis, la cual también es un logro suyo. Mil gracias porque vales muchísimo, por ser como eres. A las personas integrantes del Tribunal de Tesis, gracias por leer mi tesis y realizar los comentarios pertinentes, todo sirve para acrecentar mi formación. Al Dr. Jesús Simal Lozano, por ser mi primer contacto con la Universidad de Santiago de Compostela, por su cortesía y trato amable. Al Dr. Paulo Cartaxana, investigador del Instituto de Oceanografía de la Universidad de Lisboa, por su asesoramiento en la extracción de pigmentos y por el material bibliográfico que me envió, aún más, por su amabilidad al contestar mis correos electrónicos. Agradecimientos ________________________________________________________________________ Al Dr. Ramiro Barcia Vieitez, por su asesoría en la extracción y determinación de actividad enzimática, por prestarme reactivos y por su trato tan agradable. A los Drs. del LHICA: Dr. Alberto Cepeda Sáez, por permitirme usar algunos de sus equipos. A la Dra. Cristina Fente Sampayo, por su cordialidad y asesoramiento en resolver algunos problemas del HPLC, y por prestarme material de laboratorio. A la Dra. Beatriz Vázquez Belda, por su asesoría y excelente disposición en ayudarme con el tema del APPCC, muchas gracias Bea por tu amabilidad. Al Dr. Carlos M. Franco Abuín, por prestarme reactivos y material de laboratorio, pero más por su simpatía y buen trato hacia mi persona. A la Dra. Pilar Calo Mata, por ser tan agradable, por sus consejos y por la amistad. Al Dr. Manuel Vázquez Vázquez, por sus charlas y consejos en el desarrollo de experimentos y demás. Al Dr. Juan Manuel Mesas Mesas, por su afabilidad, sus comentarios y por permitirme usar sus equipos. Al Dr. Luciano Sánchez García, por dejarme usar el rotavapor y por su simpatía. Al Dr. Manuel Lolo, por ser la primera persona que me orientó en el manejo correcto del HPLC, mil gracias por toda su ayuda, sus recomendaciones y su paciencia en enseñarme. A Noelia, porque juntas nos convertimos en procesadoras de grelos, porque siempre tuvo ánimo para trabajar en equipo conmigo, y porque nunca perdió la sonrisa y el optimismo, gracias por todo Noe. Al recién Doctor Javier Añorve Morga, Javi, mi amigo y compañero de trabajo en la Universidad del Estado de Hidalgo, porque juntos iniciamos esta aventura en el doctorado, gracias por los viajes, los consejos y la amistad que espero perdure por muchísimo tiempo. Agradecimientos ________________________________________________________________________ A la Sra. Mercedes Varela González, por permitirme vivir en su casa y tratarme como de su familia, por todos sus consejos, su ayuda, su generosidad, por su cariño hacia mí y por dejarme disfrutar sus ricos guisos y pastelitos, por todo lo estupenda persona que es. A la Sra. Pilar, al Sr. Manuel y a Justo, por haberme abierto las puertas de su casa en Ribeira y dejarme ser una más de la familia, por su ayuda, su cariño, su apoyo y por permitirme saborear sus deliciosos mariscos gallegos. A mis amigas y ex compañeras de laboratorio: Sonia, porque fue la primer amiga que encontré en Lugo, por las charlas, por su apoyo y amistad; Estibaliz, por su optimismo, su cariño, su ayuda y por su orientación en lo relacionado al APPCC; Silvia, por su sonrisa permanente y por escucharme en momentos difíciles, Jeannette, por la amistad y los momentos compartidos; y Cristina, por sus charlas tan amenas y simpáticas. A la amiga española más pequeñita, Paula, gracias por sus dibujos, sus flores y su dulzura. A Mar Mojio Flores, representante de LEBORIZ, y una amiga encantadora, gracias por los consejos, la ayuda y las conversaciones tan amenas, por toda su sencillez y simpatía. A Manuel Miguélez Vila, responsable de CIENYTECH, por toda su ayuda en lo relacionado a HPLC y demás material de laboratorio. Por su excelente disposición, pero aún más importante, por su amistad, sus mensajes de ánimo, por permitirme ser su amiga y ser tan agradable. Gracias, gracias, gracias. A Rubén Seara Escudero, también responsable de CIENYTECH, por su apoyo y consejos en el tema de HPLC, por su amabilidad y excelente trato. Agradecimientos ________________________________________________________________________ A José Luis Fernández Perejón, por su colaboración en el transporte de los grelos, en las catas de los mismos y en general, por su apoyo y compañerismo. A Suso, Elena y muy en especial a Belén, por ayudarme a optimizar la industrialización de los grelos. A Marlene (en especial), Alberto,Arancha,Luis Eduardo y Loli, mis últimos compañeros de laboratorio, por el trabajo compartido, y porque de cada uno aprendí algo más. A los chicos del servicio técnico de la USC: Eduardo y Gonzalo, por sus consejos y ayuda con el HPLC, y por su disposición y trato tan respetuoso y amable; Fran por su simpatía y sonrisa contagiosa, Santi y Javier por su cordialidad. Casi formaron parte del laboratorio por todas las semanas que nos visitaron, mil gracias por arreglar los equipos y demás desperfectos, también por las charlas tan amenas. A las chicas del FEDER, Lucía, Marién y Noelia, por toda su ayuda con el liofilizador y demás experimentos, pero aún más, por su simpatía y amabilidad. A Alba, por su cordialidad y por permitirme usar la ultracentrífuga y enseñarme su funcionamiento. A Nacho, encargado del servicio de informática, por su ayuda con los ordenadores y programas informáticos, más aún, por su buen trato y simpatía. A Rafael, responsable de la Secretaría del Departamento de Química Analítica, por su gran amabilidad y paciencia, por toda su ayuda. A las señoras Elsa, Inés, Mercedes, Teresa, Teresa Camaño, Esther, Lola y Manolita porque siempre tuvieron un momentito para saludarme y brindarme una sonrisa. A Victor Vázquez Patiño, representante de BOENTE, por su servicio en el aporte de reactivos y material de laboratorio. A Jordi Traveset y Maika López, representantes de TEKNOKROMA, por su orientación con las columnas cromatográficas y en general, con lo relacionado al HPLC. A Carlos Pérez y Alessandro Scapoli, representantes de JASCO, por su Índice de figuras ________________________________________________________________________ iii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. El nabo (Brassica rapa, L.)............................................................. 4 Figura 2. Platos típicos gallegos..................................................................... 6 Figura 3. Recolección de grelos...................................................................... 10 Figura 4. Estructura de vitamina B1................................................................ 34 Figura 5. Fuentes de vitamina B1.................................................................... 36 Figura 6. Estructura de vitamina B2................................................................ 37 Figura 7. Fuentes de vitamina B2.................................................................... 39 Figura 8. Estructura del ácido ascórbico......................................................... 40 Figura 9. Oxidación del ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico................ 41 Figura 10. Fuentes de vitamina C..................................................................... 43 Figura 11. Estructura del β-caroteno................................................................. 46 Figura 12. Estructura de luteína........................................................................ 47 Figura 13. Fuentes de carotenoides................................................................... 48 Figura 14. Estructuras de clorofila a y clorofila b............................................. 49 Figura 15. Fuentes de clorofilas........................................................................ 51 Figura 16. Sistema de generación de aire comprimido..................................... 60 Figura 17. Cámaras frigoríficas......................................................................... 63 Figura 18. Caldera............................................................................................. 64 Figura 19. Quemadores-paelleros..................................................................... 64 Figura 20. Equipo de lavado............................................................................. 65 Figura 21. Equipo de escaldado........................................................................ 67 Figura 22. Equipo de prensado.......................................................................... 69 Figura 23. Equipo de centrifugado.................................................................... 71 Figura 24. Equipo de envasado......................................................................... 74 Figura 25. Representación del espacio de color CIEL*a*b*................................. 93 Figura 26. Evolución del contenido de vitamina C en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado................................................................. 121 Figura 27. Evolución del pH en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado.......................................................................................... 123 Figura 28. Evolución de la acidez titulable en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado...................................................................... 125 Figura 29. Evolución del contenido de humedad en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado................................................................... 127 Figura 30. Evolución de la luminosidad (L*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado...................................................................... 128 Figura 31. Evolución de la cromaticidad (C*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado...................................................................... 130 Figura 32. Evolución del tono (Hº) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado..................................................................................... 132 Figura 33. Recepción......................................................................................... 140 Figura 34. Selección y clasificación.................................................................. 140 Figura 35. Corte................................................................................................. 141 Figura 36. Limpieza y lavado............................................................................ 141 Índice de figuras ________________________________________________________________________ iv Figura 37. Escaldado......................................................................................... 142 Figura 38. Cocción............................................................................................ 142 Figura 39. Enfriado............................................................................................ 143 Figura 40. Prensado........................................................................................... 143 Figura 41. Envasado.......................................................................................... 144 Figura 42. Producto envasado al vacío.............................................................. 144 Figura 43. Almacenamiento en congelación..................................................... 145 Figura 44. Diagrama de flujo del proceso de fabricación de grelo escaldado y congelado......................................................................................... 150 Figura 45. Diagrama de flujo del proceso de fabricación de grelo cocido y congelado......................................................................................... 157 Figura 46. Efecto del pH de la fase móvil sobre los tiempos de retención y las áreas de vitaminas B1 y B2.......................................................... 165 Figura 47. Cromatogramas de a) una mezcla patrón de vitaminas B1 y B2 y b) 1 mL de agua milli-Q tratado como una muestra........................ 167 Figura 48. Determinación a) simultánea y b) por separado, de tiamina y riboflavina........................................................................................ 170 Figura 49. Recta de calibración para tiamina.................................................... 172 Figura 50. Recta de calibración para riboflavina.............................................. 175 Figura 51. Cromatograma de un patrón de tiamina........................................... 176 Figura 52. Cromatograma de un patrón de riboflavina..................................... 176 Figura 53. Cromatogramas de tiamina en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido................................................ 177 Figura 54. Cromatogramas de riboflavina en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido................................................ 177 Figura 55. Espectro de absorción del ácido ascórbico...................................... 178 Figura 56. Recta de calibración para ácido ascórbico....................................... 181 Figura 57. Cromatograma de un patrón de ácido ascórbico.............................. 182 Figura 58. Cromatogramas de ácido ascórbico en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.................................... 183 Figura 59. Espectro de absorción de luteína...................................................... 184 Figura 60. Espectro de absorción del β-caroteno.............................................. 184 Figura 61. Espectros de absorción de clorofila a y clorofila b.......................... 185 Figura 62. Espectros de absorción de feofitina a y feofitina b.......................... 185 Figura 63. Recta de calibración para luteína..................................................... 191 Figura 64. Recta de calibración para β-caroteno............................................... 192 Figura 65. Recta de calibración para clorofila a................................................ 193 Figura 66. Recta de calibración para clorofila b............................................... 193 Figura 67. Recta de calibración para feofitina a................................................ 194 Figura 68. Recta de calibración para feofitina b............................................... 195 Figura 69. Cromatogramas de patrones de luteína, β-caroteno, clorofila a y clorofila b......................................................................................... 196 Figura 70. Cromatogramas de patrones de feofitina a y feofitina b.................. 196 Figura 71. Cromatogramas a 450 nm en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.............................................................. 197 Figura 72. Cromatogramas a 430 nm en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.............................................................. 197 Índice de figuras ________________________________________________________________________ v Figura 73. Cromatogramas a 460 nm en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.............................................................. 198 Figura 74. Cromatogramas a 405 nm en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.............................................................. 198 Figura 75. Cromatogramas a 432 nm en muestras de a) grelo fresco, b) grelo escaldado y c) grelo cocido.............................................................. 199 Figura 76. Recta de calibración para ácido tánico............................................. 200 Figura 77. Aspecto de los grelos escaldados y cocidos tras la descongelación................................................................................. 201 Figura 78. Cinética enzimática de la peroxidasa en grelo fresco y grelo escaldado.......................................................................................... 203 Figura 79. Evolución en la actividad de la peroxidasa en grelo escaldado durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 205 Figura 80. Evolución en la actividad de la lipoxigenasa en grelo escaldado durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 207 Figura 81. Evolución de la actividad de agua en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación... 214 Figura 82. Evolución de la humedad en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 215 Figura 83. Evolución del pH en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación............................... 217 Figura 84. Evolución de la acidez titulable en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.... 218 Figura 85. Evolución de la vitamina B1 en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 221 Figura 86. Evolución de la vitamina B2 en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 223 Figura 87. Evolución del AA y DHAA en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 227 Figura 88. Evolución de L* en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación............................... 230 Figura 89. Evolución de a*/b* en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación............................... 232 Figura 90. Evolución de Hº en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación............................... 234 Figura 91. Evolución de C* en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación............................... 235 Figura 92. Evolución de la luteína en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación........................... 238 Figura 93. Evolución del -caroteno en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 240 Figura 94. Evolución de la clorofila a en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 243 Figura 95. Evolución de la clorofila b en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 244 Figura 96. Evolución de la feofitina a en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 246 Índice de figuras ________________________________________________________________________ vi Figura 97. Evolución de la feofitina b en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 247 Figura 98. Evolución de fenoles totales en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación.............. 251 Figura 99. Evolución de la actividad reductora en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación... 252 Índice de tablas ________________________________________________________________________ vii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición de grelos y nabizas...................................................... 11 Tabla 2. Enzimas responsables del deterioro de la calidad de las hortalizas no escaldadas..................................................................................... 18 Tabla 3. Contenido en ácido ascórbico expresado en mg/kg en función de la forma de escaldado............................................................................ 19 Tabla 4. Comparación del contenido en vitamina C de algunas hortalizas antes y después de hervirlas............................................................... 25 Tabla 5. Estabilidad de las vitaminas............................................................... 25 Tabla 6. Contenido en vitamina B1 de distintos alimentos.............................. 36 Tabla 7. Contenido en vitamina B2 de distintos alimentos.............................. 39 Tabla 8. Contenido en vitamina C de distintos alimentos............................... 43 Tabla 9. Nomenclatura para definir la variable “Nº de muestreo”.................. 117 Tabla 10. Cenizas en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado............................................................................................ 117 Tabla 11. ANOVA de dos factores (tiempo de almacenamiento y método de escaldado, con interacción)................................................................ 118 Tabla 12. ANOVA de un factor (método de escaldado).................................... 119 Tabla 13. Vitamina C en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado............................................................................................ 120 Tabla 14. pH en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado............................................................................................ 122 Tabla 15. Acidez titulable en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado........................................................................................... 124 Tabla 16. Humedad en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado............................................................................................ 126 Tabla 17. Luminosidad (L*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado........................................................................................... 128 Tabla 18. Cromaticidad (C*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado........................................................................................... 129 Tabla 19. Tono (Hº) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado............................................................................................ 131 Tabla 20. Resultados de la prueba de actividad de la peroxidasa...................... 133 Tabla 21. Valores de presión (P) y fuerza (F) ejercidos en las cubetas en función de la presión de trabajo………………………………….…136 Tabla 22. Velocidad de giro de la polea y del tambor en función de la frecuencia del motor……………………………………………….. 137 Tabla 23. CUADRO DE GESTIÓN: Puntos Críticos de Control aplicables en la línea de producción de grelo escaldado y envasado a vacío.......... 151 Tabla 24. CUADRO DE GESTIÓN: Puntos Críticos de Control aplicables en la línea de producción de grelo cocido y envasado a vacío............... 158 Tabla 25. Contenido en vitaminas B1 y B2 de muestras de nabizas (primer ensayo)…………………………………………..........................…. 168 Índice de tablas ________________________________________________________________________ viii Tabla 26. Contenido en vitaminas B1 y B2 de muestras de nabiza (segundo ensayo)……………………………………………………………... 169 Tabla 27. Datos de la recta de calibración para tiamina……………………… 172 Tabla 28. Datos de la recta de calibración para riboflavina………………….. 174 Tabla 29. Datos de la recta de calibración para ácido ascórbico……………... 181 Tabla 30. Datos de las rectas de calibración para luteína y β-caroteno………. 191 Tabla 31. Datos de las rectas de calibración para clorofila a y clorofila b…… 192 Tabla 32. Datos de las rectas de calibración para feofitina a y feofitina b…… 194 Tabla 33. Datos de la recta de calibración para ácido tánico……………….…200 Tabla 34. Actividad de peroxidasa en grelo escaldado...................................... 204 Tabla 35. Actividad de lipoxigenasa en grelo escaldado................................... 206 Tabla 36. ANOVA de dos factores (tratamiento térmico y tiempo de almacenamiento, con interacción)………………………................. 208 Tabla 37. ANOVA de un factor (tiempo de almacenamiento) en grelo escaldado………................................................................................ 209 Tabla 38. ANOVA de un factor (tiempo de almacenamiento) en grelo cocido…………................................................................................. 210 Tabla 39. Test t-Student entre el grelo fresco y el grelo escaldado................... 211 Tabla 40. Test t-Student entre el grelo fresco y el grelo cocido........................ 212 Tabla 41. aw y humedad en grelo escaldado y grelo cocido.............................. 213 Tabla 42. pH y acidez en grelo escaldado y grelo cocido.................................. 216 Tabla 43. Tiamina y riboflavina en grelo escaldado y grelo cocido…….......... 220 Tabla 44. Ácido ascórbico y ácido dehidroascórbico en grelo escaldado y grelo cocido....................................................................................... 224 Tabla 45. Luminosidad y a*/b*en grelo escaldado y grelo cocido…………… 230 Tabla 46. Tono y cromaticidad en grelo escaldado y grelo cocido………...…233 Tabla 47. Luteína y β-caroteno en grelo escaldado y grelo cocido………...…237 Tabla 48. Clorofila a y clorofila b en grelo escaldado y grelo cocido……....... 242 Tabla 49. Feofitina-a y feofitina-b en grelo escaldado y grelo cocido.............. 245 Tabla 50. Cenizas y proteína en grelo escaldado y grelo cocido………..……. 248 Tabla 51. Fenoles totales y actividad reductora en grelo escaldado y grelo cocido................................................................................................. 250 Tabla 52. Resultados microbiológicos obtenidos en grelo escaldado............... 254 Tabla 53. Resultados microbiológicos obtenidos en grelo cocido..................... 254 Abreviaturas ________________________________________________________________________ i ABREVIATURAS AA ácido ascórbico ác. ácido AISI American Iron and Steel Institute ANOVA análisis de varianza AOAC Association of Official Analytical Chemists APPCC Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control awactividad de agua BHI Agar Infusión-Cerebro-Corazón BHT 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol BOE Boletín Oficial del Estado C* cromaticidad CAE Código Alimentario Español CE Comunidad Europea CIE Commission Internationale de L´Eclairage Cód. código col. colaboradores cont. continuación CPH/M correctas prácticas de higiene y/o manipulación CV coeficiente de variación D dextrógiro D+D desinsectización mas desratización DHAA ácido dehidroascórbico DIN Deustch Industrie Normative DOUE Diario Oficial de la Unión Europea DS desviación estándar DTT ditiotreitol E método de escaldado EFS extracción en fase sólida eq. equivalentes etc. etcétera EVA copolímero etilenoacetato de vinilo Ffuerza FAD flavin adenin dinucleótido FAO Food Agriculture Organization of the United Nations FDA Food Drug Administration FMN flavin mononucleótido FP fluorescencia Hº tono HPLC High Performance Liquid Chromatography HR humedad relativa HTST High TemperatureShort Heating Time IOM Institute of Medicine ISO International Organization for Standardization Abreviaturas ________________________________________________________________________ ii L levógiro L. Linneo L* luminosidad L+D limpieza mas desinfección LC cromatografía líquida LOX lipoxigenasa LSAMM Agar Listeria Medio Selectivo Modificado n número de muestras Nº número OBIS Oxoid Biochemical Identification System ODS Octadecyl Silane Ppresión PA poliamida PCA Agar Cuenta en Placa PCC Punto Crítico de Control PE polietileno PDA photo diode array detector PM peso molecular POD peroxidasa PP polipropileno PS poliestireno PVC policloruro de vinilo PVCD policloruro de vinilideno r coeficiente de correlación RD Real Decreto RDA ración diaria recomendada rpm revoluciones por minuto SPS Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina t tiempo de almacenamiento tª temperatura TIG gas inerte tungsteno TMP tiamina monofosfato TPP tiamina pirofosfato TTP tiamina trifosfato U unidades ufc unidades formadoras de colonias UNE Una Norma Española UNE-EN Una Norma Española-Europe Normative UV ultravioleta v/v proporción volumen/volumen VIS visible VRBD Agar Bilis-Rojo-Violeta-Dextrosa XLD Agar Xilosa Lisina Desoxicolato INTRODUCCIÓN Introducción ________________________________________________________________________ 3 1.1. HORTALIZAS La hortaliza se define como cualquier planta herbácea hortícola en sazón que se puede utilizar como alimento, ya sea en crudo o cocinada (CAE, 2001). La denominación de “verdura” distingue a un grupo de hortalizas en las que la parte comestible está constituida por sus órganos verdes (hojas, tallos o inflorescencia) y la de “legumbres frescas” a los frutos y semillas no maduros de las hortalizas leguminosas (CAE, 2001). Valor nutritivo de las hortalizas La mayoría de las hortalizas contienen como mínimo un 60 % de agua y generalmente, más del 80 %. Su valor como fuente de macronutrientes (proteína, grasa, carbohidratos) es limitado aunque existen excepciones importantes. Las leguminosas, por ejemplo, son ricas en almidón y en proteína, mientras que los tubérculos son ricos en almidón. Con la excepción de leguminosas y tubérculos, el principal valor nutritivo de las hortalizas deriva de su contenido en micronutrientes (vitaminas y minerales), y de carbohidratos complejos difíciles de digerir (fibra), que tienen muy poco valor nutritivo aunque son importantes para la función intestinal (Conning, 1992; Candela y Astiasarán, 2000). Como ya se ha mencionado, las hortalizas son preciadas fuentes de vitaminas como por ejemplo, de vitaminas del grupo B (B1 o tiamina, B2 o riboflavina, B3 o niacina, B6 o piridoxina, B9 o ácido fólico, B12 o cobalamina), de vitamina C (ácido ascórbico) y de βcaroteno; asimismo aportan vitamina E y K. Estas vitaminas podrían jugar un papel preventivo frente a ciertos tipos de cáncer y, en el caso del β-caroteno, la actividad podría ser doble: por una parte la actividad vitamínica de su derivado, la vitamina A, y por otra la actividad antioxidante del mismo β-caroteno, que, frenando la oxidación del αtocoferol (vitamina E), permitiría proteger algunos procesos de oxidación de los ácidos grasos insaturados de las membranas. Los tratamientos industriales destruyen una parte de las vitaminas, pero no más que las preparaciones culinarias habituales, de forma que Introducción ________________________________________________________________________ 10 cultivo del nabo se adelanta en muchas plantaciones para poder atender la demanda del mercado (Parrilla, 1991). Cordeiro y col. (1998) señalan que si se desea tener una buena cosecha de grelos, es mejor no hacer el aprovechamiento previo de las nabizas. Figura 3. Recolección de grelos Valor nutritivo Los grelos y nabizas son hortalizas con un alto contenido de agua por lo que su valor calórico es muy bajo (Tabla 1). Además poseen un interesante aporte de fibra, por lo que suponen una alternativa muy apropiada para formar parte de platos sanos y ligeros, especialmente indicados para personas con problemas de exceso de peso. En cuanto a su contenido en vitaminas, destaca su contenido en vitamina C y folatos (ácido fólico), asimismo estas hortalizas contienen cantidades muy importantes de provitamina A, que en nuestro organismo se transforma en vitamina A. Esta vitamina posee interesantes funciones ya que participa en el mantenimiento de los tejidos, en la resistencia frente a las infecciones y en el correcto funcionamiento del sistema nervioso. Además contribuye al desarrollo normal de los dientes, del tejido blando y esquelético óseo y es necesaria para l a visión nocturna (http://www.consumer.es/web/es/alimentacion/aprender_a_comerbien, 06/01/2006). Con respecto a los minerales, los grelos contienen tres veces más hierro que las espinacas y cuatro más de calcio, así como abundante sodio y cinc. Un aporte adecuado Introducción ________________________________________________________________________ 11 de vitaminas y minerales es garantía de tener un sistema inmunitario más resistente frente a las infecciones (http://www.marronglace.net/grelosdegalicia.htm, 06/01/2006). Tabla 1. Composición de grelos y nabizas (en 100 g de materia fresca) (Mataix y col., 2003, http://perso.wanadoo.es/conservaslou/p44.html, 06/01/2006). Componente Cantidad Agua (g) 92.0 Energía (kcal) 11.18 Proteínas (g) 2.70 Grasa (g) 0.00 Hidratos de carbono (g) 0.10 Fibra (g) 3.90 Colesterol (mg) 0.00 Calcio (mg) 98.0 Hierro (mg) 3.10 Iodo (µg) 0.05 Magnesio (mg) 10.00 Zinc (mg) 0.40 Sodio (mg) 10.00 Potasio (mg) 80.00 Fósforo (mg) 35.00 Piridoxina (B6) (mg) 0.16 Vitamina E (mg) 1.00 Tiamina (B1) (mg) 0.06 Riboflavina (B2) (mg) 0.20 Equiv. de niacina (mg) 1.1 Ácido fólico (µg) 110.00 Ácido ascórbico (mg) 40.00 Vitamina A (µg eq.) 1000 Vitamina D (µg) 0 Vitamina E (mg) 2 Un factor a tener en cuenta en este cultivo es el de la presencia de glucosinolatos (Ordás, 2001). Estos compuestos tienen efectos beneficiosos para la salud ya que los productos resultantes de su hidrólisis actúan como agentes protectores frente al cáncer Introducción ________________________________________________________________________ 12 (Rosa y col., 1997; Font y col., 2005); sin embargo también presentan ciertos efectos negativos ya que son compuestos causantes del bocio (Font y col., 2005). Los grelos y las nabizas se caracterizan por su sabor amargo, sin embargo éste puede reducirse si antes de cocinarlos se escaldan en agua hirviendo durante unos min. Admiten las mismas formas de preparación que las espinacas (http://www.consumer.es/web/es/ali mentacion/aprender_a_comerbien/ 06/01/2006). 1.2. EL PROCESADO DE LAS HORTALIZAS Muchas hortalizas son cultivos estacionales que abundan en determinados períodos del año, y no pueden obtenerse con facilidad en otros. Para poder disponer de las mismas durante todo el año resultan necesarios los métodos de conservación. Para almacenamiento a largo plazo, que es de meses hasta años, las principales técnicas de conservación son el enlatado y la congelación. Esta suele ser preferida al enlatado, porque las alteraciones de los tejidos, tales como reblandecimiento y cambios de color, son menos intensos (Reid, 1992). La tecnología de las hortalizas congeladas permite una larga conservación de los productos a una temperatura muy baja (-18 ºC). La gama de hortalizas congeladas que hoy día existen en el mercado está muy diversificada. Esta tecnología, que ha adquirido un gran desarrollo durante estos últimos veinte años, proporciona productos fácilmente utilizables y seguros en su empleo (Biton, 2002a; Barbosa y col., 2005). Las principales etapas en la elaboración de hortalizas congeladas son la preparación, el escaldado, la congelación y el almacenamiento. Cada etapa conlleva la elección de diferentes tecnologías dependiendo de la hortaliza de que se trate (Biton, 2002a). 1.2.1. Las operaciones preliminares La preparación de hortalizas para su tratamiento industrial tiene suma importancia si han de elaborarse productos de calidad. La alteración de las hortalizas se inicia en el Introducción ________________________________________________________________________ 13 momento de su recolección y solamente puede reducirse al mínimo mediante una manipulación y unas técnicas de tratamiento correctas. Las mismas incluyen recepción, transporte, limpieza, lavado, inspección, recorte, pelado, corte y escaldado. Existen métodos generales para la realización de estas operaciones aunque para algunas hortalizas se precisa maquinaria especial (Rutledge, 1992). Cuando se diseña y se construye una línea de tratamiento para la preparación de hortalizas, la principal consideración económica es el coste de operación y la cantidad de tiempo que se va a utilizar el equipo. Los costes de fabricación del equipo son casi siempre secundarios a los costes de funcionamiento. Los costes de funcionamiento por unidad de producto vegetal tratado tienen en cuenta el tipo y el uso de energía, la mano de obra empleada, la cantidad y el tipo de agua empleada y el coste de la eliminación del efluente (Rutledge, 1992). 1.2.1.1. Recepción de hortalizas Las hortalizas son transportadas normalmente hasta la industria en camiones o remolques. En este momento se toman muestras de los productos para determinar si alcanzan o no la calidad requerida. Antes de la admisión del producto debe comprobarse que cumple con las normas requeridas para factores tales como grado de maduración de las hortalizas, tiempo y temperatura durante el transporte, contenido de materiales vegetales y/o animales extraños, cantidades de tierra adherida o alteración de los productos (Rutledge, 1992). La materia prima debe ser procesada lo antes posible (entre 4 y 48 h después de la cosecha) con el fin de evitar el deterioro (Sánchez, 2004a). 1.2.1.2. Limpieza y lavado La utilización habitual de máquinas para la recolección de hortalizas conduce a la presencia de una mayor o menor cantidad de impurezas (tierra, sustancias extrañas, hojas, etc.) (Biton, 2002b). Introducción ________________________________________________________________________ 14 Limpieza Las hortalizas que son recolectadas de zonas de las plantas que crecen por encima del nivel del suelo suelen contener grandes cantidades de materia vegetal extraña que debe ser eliminada antes del proceso industrial. Un método común para realizar esta limpieza consiste en hacer pasar una corriente de aire a gran velocidad a través del producto de forma que el material más ligero no deseado sea arrastrado por la corriente de aire y eliminado. Este método solamente se aplicará cuando las hortalizas sean más densas que el material extraño (Rutledge, 1992). Lavado El lavado es una operación que generalmente constituye el punto de partida de cualquier proceso de producción de hortalizas. La operación consiste en eliminar la suciedad que el material trae consigo antes de que entre a la línea de procesado, evitando así complicaciones derivadas de la contaminación que la materia prima pueda contener. Se recomienda utilizar unos 8 a 10 L de agua por cada kg de producto procesado. El agua utilizada debe ser controlada periódicamente para saber si su uso es apto o no, por eso se revisan las plantas de instalaciones de agua por posibles deterioros de ésta (Sánchez, 2004a). El lavado se puede realizar por dos métodos: Por aspersión Esta operación se efectúa haciendo pasar el producto por chorros de agua a presión. Para algunas hortalizas, el lavado se mejora por medio de la rotación de un cilindro por el que avanza el producto (Biton, 2002b). Por inmersión Las hortalizas ricas en hojas crean un problema para su lavado ya que forman capas cuando se almacenan a granel. La operación del lavado debe realizarse sobre todas las superficies incluyendo las situadas en el interior de las capas. Las hojas son lavadas Introducción ________________________________________________________________________ 15 mediante inmersión en sistemas de agua con agitación. Existe un sistema típico en el que las hojas son lavadas mediante chorros de agua a gran presión y mantenidas bajo la superficie mediante un sistema de paletas. Otros métodos utilizan chorros de aire comprimido en el agua como procedimiento de agitación para separar las hojas y lavar todas las superficies (Rutledge, 1992; Biton, 2002b). 1.2.1.3. Selección Una vez que la materia prima está limpia, se procede a la selección, es decir, a separar el material que realmente se utilizará en el proceso, del que presenta algún defecto. Éste último se transforma en material de segunda por lo que será destinado a un uso diferente o simplemente eliminado (Sánchez, 2004a). Esta selección se realiza en una mesa adecuada a tal propósito o en una cinta transportadora en el caso de contar con una instalación de pequeña escala semimecanizada. Se trata, entonces, de separar toda hortaliza que no presente uniformidad con el lote, en cuanto a madurez, color, forma, tamaño, o presencia de daño mecánico o microbiológico (Sánchez, 2004a). 1.2.1.4. Recorte Algunas hortalizas requieren un recorte antes de ser sometidas a procesos industriales. Estas operaciones de recorte son similares a las realizadas cuando las mismas hortalizas son preparadas en los hogares. Por ejemplo, el tallo fibroso es eliminado de los espárragos, de las judías verdes se cortan los extremos, así como los tallos de la coliflor y los brotes del brócoli, y de las zanahorias son cortadas las coronas (Rutledge, 1992). 1.2.2. El escaldado Los productos hortícolas son partes vivas de las plantas que siguen respirando tras la recolección. Cuando las hortalizas son recolectadas experimentan cambios como consecuencia de alteraciones, iniciadas con frecuencia por los enzimas de la planta, que Introducción ________________________________________________________________________ 16 comienzan a descomponer los tejidos vegetales. El tiempo transcurrido entre la recolección y la inactivación de estos enzimas puede ser crítico para la calidad del producto final. Este lapso de tiempo es más importante con hortalizas ricas en hojas con un crecimiento activo tales como espinacas. Para prevenir la alteración enzimática y microbiana los productos hortícolas reciben un tratamiento térmico que inactiva los enzimas y mata el tejido vegetal. Este proceso se denomina escaldado (Reid, 1992; Rutledge, 1992; Tucker, 2004; Barbosa y col., 2005). El escaldado es, por tanto, un tratamiento térmico de corta duración a alta temperatura (95 a 100 ºC) seguido de un rápido enfriamiento. El escaldado, además de inactivar los enzimas y eliminar los gases contenidos en los tejidos, también evita la decoloración y el reblandecimiento de las hortalizas durante el almacenamiento posterior; asimismo ejerce también un efecto adicional de limpieza y reduce la carga microbiana de las células vegetativas del producto (Rutledge, 1992). Inactivación de las enzimas Biton (2002a) señala que a -18 ºC las actividades enzimáticas están muy ralentizadas pero no son nulas. Por ejemplo, las judías verdes congeladas no escaldadas adquieren un aroma a heno muy intenso al cabo de algunas semanas de almacenamiento (Williams y col., 1986). Estos cambios intensos del aroma, son una consecuencia de la rotura de las estructuras celulares internas, que origina una reacción incontrolada catalizada por enzimas. Algunos de los productos derivados de estas reacciones determinan los malos olores y sabores (Reid, 1992). Por consiguiente, debe efectuarse un tratamiento previo del tejido para conseguir un alimento más estable, y la inactivación de las enzimas es la clave para lograr esa estabilidad (Rutledge, 1992; Barret y col., 2000). Varias enzimas han sido propuestas como indicadoras para determinar la efectividad de un proceso de escaldado. Entre ellas, la peroxidasa ha sido la más utilizada (Hemedia y Klein, 1991) debido a que es considerada como una de las más resistentes al calor en vegetales. Es por ello, que generalmente se piense que si la peroxidasa es inactivada Introducción ________________________________________________________________________ 17 durante un tratamiento térmico, entonces será muy difícil que existan otras enzimas que puedan quedar activas (Halpin y Lee, 1987). Williams y col. (1986) investigaron los enzimas indicadores del escaldado en la elaboración de hortalizas congeladas. Señalaron que la inactivación de la catalasa precisa solamente el 50-70 % del tratamiento térmico necesario para la inactivación de la peroxidasa. También indicaron que la alteración de las hortalizas congeladas no sometidas a escaldado no era consecuencia de la peroxidasa, sino principalmente de la lipoxigenasa (Tabla 2). Esta enzima es menos estable que la peroxidasa, por lo que un escaldado más corto o con menor temperatura podría ser suficiente para su inactivación. Llegaron a la conclusión de que el tratamiento térmico podía ser reducido hasta el punto en que era inactivada la lipoxigenasa, particularmente en el caso de guisantes y judías verdes. En consecuencia, sería necesario disponer de una prueba fiable de la actividad residual de lipoxigenasa para aplicarla en el control de calidad de los alimentos escaldados. Dicha prueba ha sido puesta a punto y se ha demostrado que, realmente, para conseguir un producto estable se precisa un escaldado más corto que el necesario para inactivar la peroxidasa (Reid, 1992). Trabajos más recientes han corroborado que es más interesante controlar la actividad enzimática de la lipoxigenasa, generadora de sabores anormales durante el almacenamiento, y conservar una actividad residual de las peroxidasas, que son poco molestas. De esta manera se puede obtener una optimización del escaldado. Por ejemplo, en judías verdes almacenadas a -18 ºC, un corto escaldado que destruye la lipoxigenasa (12 s a 100 ºC) tiene el mismo efecto en la evolución del sabor que un escaldado largo (63 s a 100 ºC) que bloquea toda actividad enzimática (Barret y Theerakulkait, 1995). Es importante mencionar que en algunas ocasiones la catalasa ha sido empleada como enzima indicador. La comprobación de este enzima resulta sencilla, aunque su estabilidad es menor, por lo que se precisa un tratamiento térmico menos intenso para su Introducción ________________________________________________________________________ 18 inactivación. Un aspecto negativo del empleo de la catalasa como marcador es que no aparece en cantidades importantes en muchas hortalizas (Reid, 1992). Tabla 2. Enzimas responsables del deterioro de la calidad de las hortalizas no escaldadas (Williams y col., 1986). Defectos Enzimas Aroma anormal  Lipoxigenasa  Lipasa  Proteasa Cambio de color  Polifenol oxidasa  Oxidasa  Peroxidasa Destrucción de nutrientes  Ácido ascórbico oxidasa  Tiaminasa Desgasificación de las hortalizas Como la mayoría de los vegetales, las hortalizas contienen una importante cantidad de gas encerrado en los tejidos. Si no se elimina el oxígeno que está presente entre estos gases, las oxidaciones más o menos importantes ocasionan principalmente coloraciones anormales (Biton, 2002a). Modificación de la estructura El escaldado permite suavizar las hortalizas y reducir el volumen aparente de las hortalizas de hoja (espinacas, acelgas). Facilita las operaciones y las manipulaciones posteriores (llenado-envasado, etc.) (Biton, 2002b). 1.2.2.1. Problemas ligados al escaldado Pérdidas por disolución El escaldado ocasiona la disolución de elementos solubles (azúcares, nitratos, vitaminas, etc.). Estas pérdidas dependen mucho del fluido utilizado (agua o vapor), de la temperatura, del tiempo de escaldado y de la carga orgánica del fluido (Biton, 2002b). Introducción ________________________________________________________________________ 19 Además de las pérdidas por disolución, el escaldado en agua puede aportar a la hortaliza cantidades nada despreciables de agua libre, que cristaliza durante la congelación dañando los tejidos. Esta alteración entraña un importante riesgo de que aumente la flora microbiana al utilizar posteriormente las hortalizas congeladas (Biton, 2002a). Pérdidas debidas a la termolabilidad de ciertos compuestos Algunos compuestos, principalmente vitaminas, se destruyen por el calor. La pérdida en ácido ascórbico (vitamina C) es la más importante ya que ésta molécula es muy sensible al calor en presencia de oxígeno (Biton, 2002b). Incluso, algunos investigadores la han usado como indicador cuando determinan los efectos del escaldado sobre las hortalizas (Rutledge, 1992). La Tabla 3 muestra el contenido en ácido ascórbico de dos hortalizas dependiendo de la forma de escaldado. Tabla 3. Contenido en ácido ascórbico expresado en mg/kg en función de la forma de escaldado (Descamps, 1987). Hortalizas Guisantes Espinacas Testigos de hortalizas crudas 23.3 36.0 Escaldado con agua a 90 ºC 16.0 9.9 Escaldado con agua a 100 ºC 19.6 10.6 Escaldado con vapor a 100 ºC 15.6 18.9 Escaldado con vapor a 120 ºC 20.2 22.7 Las vitaminas del grupo B son relativamente estables, con la excepción de la tiamina y de los folatos, cuya sensibilidad térmica es comparable a la de la vitamina C, lo que explica que a veces se utilicen los tres como indicadores de la intensidad de un tratamiento térmico (Adragna-Bourgeois y Bourgeois, 2002). Las clorofilas son también sensibles al calor y más, en particular, la clorofila a, cuya degradación en feofitina ocasiona un pardeamiento más o menos pronunciado de las hortalizas verdes (Biton, 2002b). Introducción ________________________________________________________________________ 26 Fibra Zyren y col. (1983) no encontraron grandes pérdidas de fibra en vegetales y frutas durante la cocción. Por el contrario, Herranz y col. (1983) sí observaron variaciones en el contenido de las diferentes fracciones de fibra dietética en vegetales, las cuales fueron diferentes según la tecnología aplicada. Minerales Miyoshi y col. (1995) estudiaron los cambios en el contenido de minerales durante la cocción de vegetales. Estos autores observaron correlaciones significativas entre los cambios en el peso de los vegetales tras el hervido y escurrido y los contenidos residuales de elementos minerales para cada vegetal y elemento. Proteínas La cocción, en muchos casos, mejora la digestibilidad de las proteínas. La aplicación de calor suave puede provocar la desnaturalización de las proteínas, lo que tiende a aumentar su valor nutricional porque su susceptibilidad al ataque enzimático se ve aumentada. Si se considera también que se ha producido una pérdida de la funcionalidad de la proteína nativa, este tratamiento puede ser muy positivo por el hecho de destruir factores antinutritivos de naturaleza proteica como, por ejemplo, las antitripsinas de las leguminosas (Candela y Astiasarán, 2000). Vidal y col. (1994) estudiaron el efecto del procesamiento sobre algunas sustancias antinutritivas de las legumbres (actividad inhibidora de la tripsina, contenido en ácido fítico, taninos y catequinas) y concluyeron que el cocinado producía una eliminación de la actividad inhibidora de la tripsina, una reducción de la cantidad de ácido fítico y un aumento en contenido de taninos y catequinas. 1.2.4. Enfriado y escurrido Concluido el escaldado o cocido, la materia prima exhibe una alta temperatura. La zona térmica entre 50 ºC y 10 ºC constituye una fase crítica para la calidad del producto (gran fragilidad ante recontaminaciones con microorganismos, acusadas modificaciones Introducción ________________________________________________________________________ 27 de color, grandes pérdidas de nutrientes, pero especialmente mermas en el contenido vitamínico y empeoramiento del aroma). Por estas razones, se impone el principio de refrigerar, con máxima rapidez, a temperaturas inferiores a 10 ºC las materias primas escaldadas o cocidas, inmediatamente después de recibir éstas el tratamiento térmico (Gruda y Postolski, 1986; Lyon y Churchill, 1992). Esto se efectúa habitualmente por inmersión en una corriente de agua y, más raramente, por aire forzado o por aspersión de agua refrigerada (Instituto Internacional del Frío, 1990). Para realizar el enfriamiento con agua, se utilizan equipos económicos y fáciles de instalar; además se asegura el transporte del producto del escaldador a la etapa siguiente. Sin embargo, requiere grandes volúmenes de agua y elimina una cantidad importante de compuestos solubles del producto (Instituto Internacional del Frío, 1990). Los sistemas de enfriamiento por aire o por pulverización de agua, reducen las pérdidas por lavado de sustancias solubles y la polución de las aguas, pero causan una elevada pérdida de peso del producto que los hace no competitivos en comparación con los sistemas normales de enfriamiento convencional mediante corriente de agua (Canet y Álvarez, 2000). Durante las etapas de escaldado, cocción y enfriamiento se produce una importante incorporación de agua al producto, que debe ser eliminada con el escurrido, que se lleva a acabo mediante: Centrifugación. La separación del agua se lleva a cabo por la acción de fuerzas centrífugas que se generan durante la rotación de material. Para desarrollar esta operación se utiliza una centrífuga que consiste, en esencia, en una cámara o recipiente cilíndrico que gira alrededor de su eje. Existen distintos tipos, la elección de una u otra depende, en gran medida, de la aplicación a la que se destina (Ordóñez y col., 1998); si lo que se pretende es eliminar exceso de agua las más utilizadas son las centrífugas deslodadoras (Aleixandre, 1997). Introducción ________________________________________________________________________ 28 Prensado. Consiste en la separación de líquidos que están contenidos en productos sólidos mediante fuerzas de compresión (Ordóñez y col., 1998). Esta operación se realiza mediante prensas. 1.2.5. El envasado a vacío Es la forma de envasado en atmósfera protectora desarrollada comercialmente en primer lugar. El proceso implica el envasado del producto en plásticos de baja permeabilidad al oxígeno, y el sellado después de realizar la evacuación del aire. Con unas buenas condiciones de realización del vacío, la concentración de oxígeno se reduce por debajo del 1 %. Un inconveniente adicional en los envases al vacío durante el largo almacenamiento, es la acumulación de exudado (Sánchez, 2004b). Como en todos los productos alimentarios, el envase debe proteger su contenido de las agresiones exteriores (resistencia a los choques, protección frente a las contaminaciones exteriores) pero debe limitar los intercambios durante el almacenamiento y, más concretamente, en los expositores de venta (Bettison, 1992; Biton, 2002a). El envase influirá también sobre la estabilidad del producto almacenado. Los envases permeables a la humedad provocarán la deshidratación de los productos. El acceso de oxígeno deberá ser mínimo para que el envase suponga un medio de control de la degradación oxidativa. Los espacios vacíos serán mínimos en el interior del envase, ya que suponen unas condiciones ideales para el movimiento interno de la humedad (Reid, 1992). Tipos de películas utilizadas Entre las películas más utilizadas para el almacenamiento en atmósfera protectora se incluyen: polietileno (PE), poliamida (PA), polipropileno (PP), poliestireno (PS), policloruro de vinilo (PVC), policloruro de vinilideno (PVCD), copolímero etilenoacetato de vinilo (EVA), entre otras (Kirwan y Strawbridge, 2004). Introducción ________________________________________________________________________ 29 También existen combinaciones entre estas películas con el fin de aprovechar cada una de sus propiedades individuales. Un ejemplo de ello son las películas laminadas, las cuales están conformadas por láminas de diferentes materiales unidas mediante un adhesivo, en forma de sándwich. Las películas laminadas ofrecen una mejor calidad de grabado ya que la superficie impresa es incorporada entre las numerosas láminas que las constituyen y esto evita el desgaste durante la manipulación (Sánchez, 2004b). La exposición a la luz puede acelerar la destrucción de la clorofila en las hortalizas y el empleo de películas con pigmentos blancos u otros medios para crear opacidad mejora la vida útil de tales productos vegetales (Bettison, 1992). 1.2.6. La congelación Dentro de las distintas técnicas empleadas en la conservación de alimentos, una de las más utilizadas es la congelación, la cual consiste en reducir la temperatura de los productos hasta valores iguales o inferiores a -18 ºC, lo más rápidamente posible, y almacenarlos, a continuación, por debajo de esa temperatura. La conservación se asegura bloqueando, de este modo, la actividad microbiana y ralentizando mucho las actividades enzimáticas (Biton, 2002a; Sánchez, 2004c). En los productos con elevado contenido en agua es muy importante la velocidad de congelación. Así, si la congelación es lenta los primeros cristales formados serán gruesos. Estos cristales provocan una importante compresión de las células, lo que produce una salida de agua al exterior. En una congelación rápida, tanto en el interior como en el exterior, se forman cristales muy pequeños que dañan mucho menos los productos. En la congelación de las hortalizas, la velocidad de congelación deberá ser lo más elevada posible (Biton, 2002a). Existen distintos equipos de congelación, que se clasifican habitualmente atendiendo al medio utilizado para la transmisión de calor, distinguiéndose los siguientes grupos: congeladores de contacto directo, congeladores de aire forzado, congeladores por Introducción ________________________________________________________________________ 30 inmersión y congeladores criogénicos (Instituto Internacional del Frío, 1990; Fellows, 1994; http://www.ainia.es/esp/Servicios/ippc/pdf/mtd/Elaboradosveg.PDF, 13/04/2005). Para obtener el efecto conservador deseado, es indispensable determinar con exactitud los tratamientos anteriores a la congelación, la velocidad óptima de congelación, el tipo de embalaje, la temperatura de almacenamiento y la velocidad de descongelación (Sánchez, 2004c). La congelación es la forma más simple y natural de conservar los vegetales (Cano, 1996), y se aplica mucho a hortalizas de hoja como las espinacas, las acelgas, las judías verdes, las coles de Bruselas, y a otras como las zanahorias, los guisantes y las coliflores (Cid, 2000). 1.2.7. El almacenamiento Generalmente la vida útil de un producto congelado es mayor cuanto más baja es su temperatura de almacenamiento, la cual normalmente es igual o inferior a -18 ºC (Instituto Internacional del Frío, 1990). Sin embargo, los productos congelados no permanecen estables durante este período de almacenamiento, que generalmente se prolonga durante meses, pudiendo producirse un deterioro de su calidad (Canet y Álvarez, 2000). Estas pérdidas de calidad pueden llegar a ser superiores a las que se producen como consecuencia de la propia congelación, las operaciones previas o la descongelación. Dada la imposibilidad de proliferación microbiana a estas temperaturas las alteraciones que tienen lugar en los productos congelados son debidas a cambios físicos y químicos (Canet y Álvarez 2000). Cambios físicos Los cambios físicos que afectan a la calidad de los vegetales congelados durante su almacenamiento son la sublimación y la recristalización de los cristales de hielo y están Introducción ________________________________________________________________________ 31 relacionados con la estabilidad de los mismos en el interior y en la superficie del producto. Estos fenómenos están asociados a fluctuaciones de temperatura que se producen durante el almacenamiento y se traducen en pérdidas de peso del producto congelado (Reid, 1992, Canet y Álvarez 2000). Cambios químicos Las pérdidas de calidad de los alimentos congelados debidas a cambios químicos y en algunos casos, a la actividad enzimática, son lentas, pero se aceleran por efecto del aumento de la concentración de solutos alrededor de los cristales de hielo, por la reducción de la actividad de agua y por cambios en el pH y el potencial de óxidoreducción (Fellows, 1994). Los principales cambios que tienen lugar son: Cambios sobre el valor nutritivo Las hortalizas están constituidas por células microscópicas muy unidas entre sí, con pequeños espacios intercelulares. La congelación destruye la integridad celular. En la descongelación las membranas de las células muertas se vuelven muy permeables. En esta última etapa el exudado comienza a difundir (sales, azúcares, pigmentos, etc.), reduciendo así su valor alimenticio (Sánchez, 2004c). Sin embargo, Canet (1996) señala que los azúcares, las proteínas, los elementos minerales y las vitaminas liposolubles permanecen estables en las hortalizas congeladas a lo largo de la conservación, independientemente de la temperatura a la que se efectúe la misma; no obstante, eso no ocurre con ciertas vitaminas hidrosolubles susceptibles de oxidarse y degradarse rápidamente cuando la temperatura de conservación no es suficientemente baja. Así, por ejemplo, la vitamina C puede desaparecer por completo si el producto se almacena durante largos períodos de tiempo a temperaturas por encima de –18 ºC o si la descongelación se efectúa a temperaturas inadecuadas. Introducción ________________________________________________________________________ 32 Cambios en el pH Durante la congelación, las sales inorgánicas y orgánicas se concentran en la fase acuosa. Al disminuir las temperaturas, las sales precipitan y como consecuencia cambia el pH de la fase acuosa no congelable (Canet y Álvarez, 2000). Cambio de color Durante el almacenamiento en estado congelado no se producen pérdidas importantes de pigmentos. Sin embargo, si se pueden formar pigmentos pardos, debido a reacciones de oxidación enzimática de precursores fenólicos incoloros. Por tanto, es necesario realizar la inactivación de las enzimas antes de comenzar el proceso de congelación (Cid, 2000; Sánchez, 2004c). Modificación del aroma Las alteraciones del aroma son consecuencia tanto de la modificación del aroma fresco característico del producto como del desarrollo simultáneo de aromas anormales. En ocasiones, el desarrollo de estos aromas se produce de forma simultánea a la pérdida del color. Ambos fenómenos pueden evitarse inactivando enzimas oxidativas como la peroxidasa y la lipoxigenasa (Cid, 2000; Sánchez, 2004c). Asimismo, el uso de envases que excluyan el oxígeno puede combatir este problema (Barbosa y col., 2005). Modificación de la textura Los cambios más notables en las verduras adecuadamente congeladas, almacenadas y descongeladas, son los que afectan a su textura. Estos cambios se deben principalmente al daño físico provocado por la formación de hielo, que conduce a la pérdida de turgencia de la célula, al desplazamiento del agua endógena y a la separación de las células (Rutledge, 1992; Cid, 2000). Introducción ________________________________________________________________________ 33 1.3. VITAMINAS Las vitaminas, a pesar de su composición química diversa, pueden definirse como compuestos orgánicos que deben ser obtenidos de fuentes exógenas y que son esenciales para las funciones fisiológicas y metabólicas normales del organismo (Russell, 2000). Se clasifican en vitaminas liposolubles: A, D, E y K, y vitaminas hidrosolubles: B1, B2, B6, B12, C, niacina, biotina, ácido fólico y ácido pantoténico (http://www.nutrinfo.com.ar/pagi na/info/vita_min.html, 02/02/2006). Las vitaminas no son fuente de energía, sin embargo varias de ellas juegan un papel importante dentro del metabolismo para producirla (http://www.aerobicos.com.mx/alimenta147.htm, 02/02/2006). Las vitaminas hidrosolubles, o solubles en agua, conforman un grupo diverso de compuestos con propiedades físico-químicas diferentes. Una sola vitamina presenta varias formas coenzimáticas, cada una de las cuales muestra la misma actividad biológica in vivo (Russell, 2000). La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es, sin duda, la técnica más popular para la cuantificación de vitaminas hidrosolubles, ya que al ser compuestos de naturaleza hidrofílica, no volátiles, son candidatos especialmente adecuados para los análisis de HPLC en fase reversa. La principal ventaja al usar este tipo de análisis, es la capacidad que tiene para separar las vitaminas de los compuestos que interfieren en sistemas biológicos tan complejos como son los alimentos. Este tipo de análisis presenta como ventajas la rapidez, la precisión y la especificidad, exactitud razonable, y la posibilidad de cuantificar simultáneamente múltiples vitaminas y/o metabolitos (Russell, 2000). Introducción ________________________________________________________________________ 34 1.3.1. Tiamina (vitamina B1) Figura 4. Estructura de vitamina B1 La tiamina o vitamina B1(Figura 4) está constituida por un anillo pirimidínico y un anillo tiazólico, unidos por un metileno, y con diversos grupos funcionales substituyentes (Mataix y Sánchez, 2002). El clorhidrato de tiamina puro es un polvo blanco amarillento cristalino con sabor salado y aroma a nuez (Mahan y Arlin, 1995). Se presenta como cristales solubles en agua, parcialmente solubles en alcoholes y acetona, e insoluble en solventes lipídicos, como el éter, benceno, hexano y cloroformo. Es una molécula termolábil y sensible a la oxidación y a los sulfitos, que destruyen su actividad biológica (Mataix y Sánchez, 2002). Métodos de análisis La tiamina es determinada normalmente como sus tiocromo derivados. La hidrólisis ácida, por ebullición o esterilización por autoclave en ácido clorhídrico (0.1-0.3 M) ó ácido sulfúrico (0.05-0.1 M) de 10 a 60 min, es empleada para liberar la vitamina de la matriz del alimento. Para la determinación de tiamina total, los ésteres de fosfato son convertidos a tiamina usando hidrólisis enzimática con una enzima que contenga fosfatasa, tal como la claradiastasa o la takadiastasa, sola o en combinación con una fosfatasa. Generalmente, el extracto obtenido debe ser incubado entre 1 y 18 h de 37 a 50 ºC. La hidrólisis enzimática se usa también para eliminar el exceso de almidón, con βamilasa o amiloglucosidasa, y proteína, con papaína, en la matriz del alimento (Russell, 2000). Introducción ________________________________________________________________________ 35 La tiamina muestra un rango de absorbancia entre 230 y 270 nm, dependiente del pH, sin embargo su detección puede causar interferencia con otros compuestos del alimento que absorben a esas longitudes de onda, tales como los ácidos nucleicos. Por lo anterior, la tiamina es oxidada con ferrocianuro de potasio, bajo condiciones alcalinas, para ser convertida a sus tiocromo derivados y éstos analizados fluorométricamente a longitudes de onda de excitación entre 365 y 375 nm y longitudes de onda de emisión entre 425 y 435 nm, a pH alrededor de 8.0. Los tiocromo derivados son relativamente estables en solución alcalina a pH mayor de 9.0 y temperatura ambiente (Russell, 2000). Cabe señalar que el uso de la fluorescencia reduce el rango de los factores que interfieren, incrementando de esta forma, la reproducibilidad y sensibilidad del método (Valls y col., 1999a). Fuentes En los alimentos, la tiamina endógena se encuentra en forma de cuatro especies químicas: la forma no fosforilada, tiamina, y sus ésteres fosforilados, tiamina monofosfato (TMP), tiamina pirofosfato (TPP) y tiamina trifosfato (TTP). La tiamina predomina en plantas, aunque sus ésteres, especialmente TPP, son las formas principales en los productos de origen animal (Russell, 2000). Entre las fuentes dietéticas de tiamina (Figura 5) se encuentran los cereales no refinados, levadura de cerveza, órganos animales (hígado, corazón, riñón), porciones magras del cerdo, legumbres y semillas (National Research Council, 1991). La leche y los productos lácteos, la fruta y otros vegetales no son ricos en tiamina, pero cuando se consumen en cantidades suficientes contribuyen de manera importante a la ingesta total (Mahan y Arlin, 1995). Sin embargo, en algunos vegetales (coles, hojas de té, etc.) se encuentran compuestos polihidroxifenólicos, que inactivan la tiamina por oxidación, y algunos pescados contienen tiaminasas que son enzimas que destruyen a la vitamina (Mataix y Sánchez, 2002). Esta vitamina está ausente de grasas, aceites y azúcares refinados (Russell, 2000). En la Tabla 6 se representa el aporte de vitamina B1 de las raciones de distintos tipos de alimentos que la contienen en cantidad significativa. Introducción ________________________________________________________________________ 42 Métodos de análisis Los procedimientos para la extracción de vitamina C tienen en cuenta la necesidad de prevenir la degradación y pérdida de las especies químicas. Los reactivos más populares para la extracción son los ácidos. La mayoría de los extractantes contienen ácido metafosfórico, tricloroacético y oxálico, solos o en combinación con otros ácidos o alcoholes de cadena corta, tales como el metanol y el etanol (Russell, 2000). La detección de las especies químicas individuales es complicada por sus propiedades tan diferentes. Aunque AA y DHAA absorben en el rango de ultravioleta, el máximo de absorbancia de DHAA está entre 210 y 230 nm y su detección lo hace especialmente susceptible de sufrir interferencias con un gran número de constituyentes alimenticios que absorben en el mismo rango. En contraste, AA exhibe una absorbancia máxima a 245-265 nm, dependiente del pH, lo cual hace que la detección por ultravioleta sea la más adecuada. Ninguna de las dos especies químicas fluorescen naturalmente (Russell, 2000). Fuentes En los alimentos, la vitamina C existe como dos especies químicas: ácido L-ascórbico (AA) y su producto de oxidación, ácido dehidro-L-ascórbico (DHAA), siendo la suma de ambos, el contenido total de vitamina C (Russell, 2000). Las frutas, verduras y hortalizas constituyen la mayor fuente de vitamina C (Figura 10) en la dieta, siendo escasa en cereales, legumbres y frutos secos (Tabla 8). Como ejemplo de importantes fuentes de esta vitamina se encuentra la naranja, la manzana, el limón, la mandarina, el ajo, el mango, el melón, la fresa, la frambuesa, el kiwi, la guayaba, las grosellas, la cereza, la ciruela, el tomate, el pimiento verde, el aguacate, la calabaza, la cebolla y las verduras verdes (brócoli, repollo, coliflor, col de Bruselas, endibia, espinaca, lechuga). La mejor manera de aprovechar la vitamina C es consumiendo estos alimentos crudos o con un mínimo de cocción (http://www.nutrinfo.com.ar/pagina/info/vita_min.html 02/02/2006). Introducción ________________________________________________________________________ 43 Figura 10. Fuentes de vitamina C Tabla 8. Contenido en vitamina C de distintos alimentos (Mataix y Sánchez, 2002) Alimento Cantidada Mandarina 35 Melón 32.1 Naranja 50.6 Fresa y fresón 60 Kiwi 94 Tomate 26.6 Coliflor, col, repollo 67 Pimientos 131 Espinaca 35 Nueces 2.6 Lentejas 3.4 Garbanzos 4.1 amg/100 g. Pérdidas debidas a la tecnología industrial y doméstica A continuación se indican los aspectos más sobresalientes de la inestabilidad de la vitamina C: a) Acción enzimática. En la mayor parte de tejidos vegetales existe la ácido ascórbico oxidasa, que está separada del ácido ascórbico en la célula intacta, además de Introducción ________________________________________________________________________ 44 que la vitamina se encuentra protegida por la presencia de ácidos orgánicos y antioxidantes. Pero, cuando la situación estructural cambia al manipular la fruta a nivel culinario (cortes, aplastamientos, etc.) la enzima puede inactivar la vitamina. b) Luz. La luz es otro agente capaz de inactivar la vitamina C. Así la luz solar incidiendo sobre una botella de cristal incoloro provoca la pérdida de la totalidad de vitamina C en aproximadamente 20 min. c) Calor. El calor afecta también a la vitamina C, siendo más acusado el efecto cuando aumenta el tiempo de actuación. El efecto negativo se evita cuando el alimento (con vitamina C) se introduce en agua hervida previamente, que además ha eliminado gran parte de oxígeno. En estos casos además la utilización de tapaderas evita también la acción del oxígeno atmosférico. Las ollas a presión que elevan la temperatura por encima del punto de ebullición, pero en que el tiempo de exposición es menor y además reducen mucho la presencia de oxígeno y utilizan menos cantidad de agua de cocinado, son claramente aconsejables. d) Metales. Deben evitarse utensilios que contengan sobre todo cobre. El hierro y cinc producen efectos menores. e) Almacenamiento. El almacenamiento reduce los niveles de vitamina C, como consecuencia de efectos diversos de entre todos los antes mencionados. Un ejemplo evidente se encuentra en las patatas, que pueden disminuir sus niveles en más de un 40 %, en seis meses de almacenamiento. La vitamina C es una de las vitaminas que más fácilmente pueden ser destruidas durante el almacenamiento y conservación de los alimentos, siendo además sus pérdidas bastante grandes e incluso totales durante la manipulación culinaria, lo que es debido tanto a su inestabilidad química como a su alta solubilidad en agua (300 g/L de agua). Por lo tanto, es importante considerar el tiempo de almacenamiento, cocción y otros tipos de procesamiento, en el momento de evaluar el contenido real de ácido ascórbico en los Introducción ________________________________________________________________________ 45 alimentos. Debido a todo lo ya explicado, la vitamina C es usada frecuentemente como un indicador de la estabilidad de todas las vitaminas en los alimentos (Mataix y Ochoa, 2002). 1.4. PIGMENTOS Los alimentos presentan una coloración porque los pigmentos que contienen absorben la luz de unas determinadas longitudes de onda y reflejan o transmiten la luz de otras. El color se ve afectado no solamente por la concentración de pigmentos sino también por la estructura física del alimento y por la forma en que se dispersa la luz desde su superficie. La definición del color puede ser ambigua. Las determinaciones objetivas de los atributos del color incluyen curvas espectrofotométricas, mediciones triestímulo CIE, determinaciones de diferencias de color y mediciones practicadas sobre pigmentos extraídos del producto (Lyon y Churchill, 1992). 1.4.1. Carotenoides Los carotenoides son un grupo de pigmentos naturales responsables del color amarillo, naranja o rojo de muchos alimentos (Niizu y Rodríguez-Amaya, 2005). Desde el punto de vista químico, son terpenoides, sustancias derivadas naturalmente del intermediario metabólico ácido mevalónico que proporciona la unidad estructural básica, el isopreno (Coultate, 1996). En la naturaleza, los carotenoides son sintetizados exclusivamente por las plantas superiores y microorganismos fotosintéticos, en los cuales, juegan un papel fundamental en el metabolismo (Ball, 2000). La molécula de carotenoide está constituida por dos mitades, y la naturaleza del grupo terminal de cada mitad está especificada. Cada carotenoide está considerado como un derivado de un caroteno cercano, indicado por dos letras griegas que describen los grupos terminales. La nomenclatura reconoce seis grupos terminales: β, ε, κ, φ, χ y ψ. Los tres más comunes son β, ε, y ψ. (Ball, 2000). Introducción ________________________________________________________________________ 46 Desde el punto de vista nutricional, los carotenoides se clasifican como provitaminas y carotenoides inactivos. Para tener actividad de vitamina A, la molécula de carotenoide debe incorporar una molécula de retinol, por ejemplo, un anillo no sustituido de β-ionona con una cadena polieno de 11 carbonos. β-caroteno (C40H56, PM= 536.88), el carotenoide provitamina A más conocido, está compuesto por dos moléculas de retinol; de este modo el compuesto posee una actividad de vitamina A del 100 %. Las estructuras de los otros carotenoides incorporan una molécula de retinol y, así teóricamente, contribuyen con un 50 % de la actividad biológica del β-caroteno. Entre los casi 600 carotenoides que existen en la naturaleza, solo alrededor de 50 poseen actividad de vitamina A (Ball, 2000). Algunos estudios epidemiológicos han correlacionado la ingesta de frutas y vegetales, ricos en carotenoides, con la protección de algunas formas de cáncer. Esta acción posiblemente se deba a las propiedades antioxidantes de los carotenoides más que a su actividad de vitamina A (Ziegler, 1989; Ziegler, 1991). Los carotenoides se dividen en dos grupos principales: los carotenos (Figura 11), que son hidrocarburos, y las xantofilas que contienen oxígeno. El caroteno más simple es el licopeno. Figura 11. Estructura del β-caroteno Las xantofilas pueden inicialmente considerarse como productos de la hidroxilación de los carotenos y la mayor parte de los tejidos vegetales contienen cantidades traza de criptoxantinas, los precursores monohidroxilados de las xantófilas dihidroxiladas, como la zeaxantina y la luteína (Figura 12). Introducción ________________________________________________________________________ 47 Figura 12. Estructura de luteína La mayoría de los carotenoides de los tejidos vegetales contienen átomos de 40 carbonos, pero también se encuentran moléculas más cortas conocidas como apocarotenoides (Ball, 2000). Métodos de análisis Con la excepción de los dos apocarotenoides ácidos, que forman sales hidrosolubles en disoluciones alcalinas, los carotenoides son solubles sólo en disolventes orgánicos apolares. Sus espectros de absorción son bastante similares, viéndose notablemente influidos en su λ máx y su coeficiente de extinción por el disolvente. Los espectros de absorción intentan mostrar que las xantofilas son los pigmentos dominantes en los tejidos de color amarillo, mientras que los carotenos tienden a proporcionar una tonalidad naranja (Coultate, 1996). Fuentes La distribución de los carotenoides entre los distintos tipos de vegetales o tipos de alimentos es muy variada (Figura 13). En las hortalizas foliáceas verdes, se hallan presentes los mismos carotenoides que en los cloroplastos de todos los vegetales superiores, y en las mismas proporciones, siendo dominantes el β-caroteno y las xantofilas luteína, violaxantina y neoxantina. También se encuentran en ellas pequeñas cantidades de zeaxantina, α-caroteno, criptoxantina, y anteraxantina. La cantidad de β- Introducción ________________________________________________________________________ 48 caroteno presente en los tejidos de las hojas suele hallarse entre 200 y 700 µg g-1 (peso seco) (Coultate, 1996). En la mayoría de los vegetales y, de muchas frutas, el β-caroteno constituye más del 85 % de la actividad total de provitamina A y, cabe mencionar, que la luteína es el carotenoide más abundante en los vegetales de hoja verde (Khachik y col., 1986). Figura 13. Fuentes de carotenoides Pérdidas debidas a la tecnología industrial y doméstica Los carotenoides son, en general, bastante estables en su ambiente natural pero, al calentar los alimentos, o cuando se extraen en disoluciones oleosas o en disolventes orgánicos, se tornan mucho más lábiles. Al calentarlos en ausencia de aire, algunos de los dobles enlaces de los carotenos sufren una isomerización trans cis. No se conocen suficientemente las estructuras de los “neocarotenos” resultantes, pero a medida que crece el número de dobles enlaces cis, el color va perdiendo intensidad. La degradación del βcaroteno deja un resto de β-ionona, un compuesto volátil al que se debe el olor característico del heno secado al sol (y parcialmente decolorado) (Coultate, 1996). Introducción ________________________________________________________________________ 49 1.4.2. Clorofilas Las clorofilas son los pigmentos verdes de las hortalizas foliáceas y son los pigmentos funcionales de la fotosíntesis, en todas las plantas verdes (Boekel, 1999). Se hallan, junto con numerosos carotenoides, en las membranas de los cloroplastos, los orgánulos que llevan a cabo el proceso fotosintético en las células vegetales. Los pigmentos de los cloroplastos se encuentran íntimamente asociados a otros componentes lipófilos de las membranas, como los fosfolípidos, y a algunas proteínas. Las algas y las bacterias fotosintéticas contienen diferentes tipos de clorofilas, pero en los vegetales superiores sólo se encuentran las clorofilas a y b, en la proporción aproximada de 3/1 (Coultate, 1996). Figura 14. Estructuras de clorofila a y clorofila b Se trata esencialmente de porfirinas similares a las de los pigmentos hemo, como la mioglobina, pero con diferentes sustituyentes en los anillos y con un átomo de magnesio sustituyendo el hierro; poseen además un quinto anillo formado por un enlace establecido entre la posición 6 y el puente γ–metino (Figura 14). Por analogía con otros pigmentos, como la mioglobina, se deduce que el anillo de porfirina se asociará fácilmente con las regiones hidrófobas de las proteínas constitutivas de las membranas de los cloroplastos. La larga cadena lateral del fitol facilitará la íntima asociación con los carotenoides y los lípidos de las membranas (Coultate, 1996). Introducción ________________________________________________________________________ 50 Las clorofilas son compuestos que tienen ciertas funciones biológicas, que son efectivas siempre y cuando estos compuestos conserven en su estructura el anillo de porfirina. Estudios recientes señalan que las clorofilas y sus derivados, tienen funciones relacionadas con la promoción de la salud, tales como actividades de tipo antimutagénico y anticarcinogénico (Yoshikawa y col., 1996; Chernomorsky y col., 1999; Higashi-Okai y col., 1999; Ma y Dolphin, 1999; Morita y col., 2001). En un estudio realizado por Negishi y col. (1997) encontraron que el extracto de clorofila crudo y purificado de la espinaca, inhibía la mutagenicidad de varios agentes mutagénicos. Por lo anterior, la presencia de clorofilas contribuye a dar un valor añadido a los productos vegetales (MinguezMosquera y col., 2002). Métodos de análisis No son fáciles de definir las longitudes de onda exactas de los máximos de absorción, ni los coeficientes de extinción, dado que varían con la naturaleza del disolvente orgánico utilizado y con la presencia de trazas de agua. Estas variaciones son suficientes para dificultar la determinación precisa, espectrofotométricamente, de las tasas de clorofila en los tejidos foliáceos. Una dificultad adicional es la constituida por el hecho de que, en disolución, especialmente en disolventes en los que participe el metanol, tiene considerable tendencia a la oxidación o a la isomerización, con sustitución del hidrógeno en posición 10 por OH o OCH3. La estabilidad o inestabilidad de la clorofila en los tejidos vegetales tiene un gran interés en la industria alimentaria. La clorofila desaparece de las hojas al final de la vida activa de las mismas. La degradación de la clorofila acompaña a la de las membranas de los cloroplastos; en cambio, los carotenoides son más estables. (Coultate, 1996). Fuentes Las clorofilas son los pigmentos principales en las plantas (Boekel, 1999) (Figura 15) y en las algas verdes (Schoefs, 2002). Introducción ________________________________________________________________________ 51 Figura 15. Fuentes de clorofilas Pérdidas debidas a la tecnología industrial y doméstica Las clorofilas son muy susceptibles a cambios químicos y físicos durante el procesamiento de los vegetales (Teng y Chen, 1999). Los vegetales verdes expuestos a procesamiento térmico, muestran una pobre calidad en su color, comparado al de los vegetales frescos. El grado de verdor, debido principalmente a la presencia de las clorofilas, es de gran importancia para determinar la calidad de este tipo de vegetales (Nisha y col., 2004), ya que es el color, uno de los principales parámetros para medir la calidad de los productos frescos (Teng y Chen, 1999; Tan y col., 2000; Tijskens y col., 2001). Los cambios de color en los vegetales verdes, a causa de los tratamientos térmicos (tratamientos culinarios ordinarios, durante el escaldado previo a la congelación o durante el tratamiento térmico para la elaboración de conservas) son el resultado de la conversión de clorofilas a feofitinas a través de la sustitución del Mg por el hidrógeno, proceso que tiene lugar más fácilmente en medio ácido (Canjura y col., 1991; Lau y col., 2000; Ahmed y col., 2002). Las feofitinas presentan un color pardo mate; son los pigmentos dominantes en las hortalizas «verdes», como la col o el repollo, que han sido sobrecocinadas. La acidez del contenido vacuolar de las células vegetales dificulta la lucha contra la formación de feofitina, especialmente durante el intenso tratamiento térmico necesario en la Material y métodos ________________________________________________________________________ 61 Refrigerador También llamado refrigerador posterior. Se refrigera por aire (refrigerador posterior aire-aire). Está dotado de un separador de condensados y de un sistema de purga automáticos (Arbones y col., 2001). Separador de condensados Situado a la salida del compresor para eliminar la humedad del aire. Depósito o acumulador Consiste de un recipiente a presión que incluye válvula de seguridad, manómetro, boca de limpieza y sistema de purga automático (Arbones y col., 2001). Sus funciones son: Acumular gran cantidad de aire a presión capaz de mantener en marcha, durante un cierto tiempo, los equipos neumáticos en caso de que falle el fluido eléctrico que alimenta el compresor, así como evitar arranques frecuentes del mismo. Absorber fluctuaciones de presión originadas por los generadores. Hacer de refrigeradores de aire y también de condensadores de la humedad del aire (Serrano, 1997). Secador frigorífico Los secadores son elementos que separan automáticamente la humedad del aire comprimido en un grado suficiente para evitar que se produzcan posteriores condensaciones en el circuito. Los secadores frigoríficos operan con un punto de rocío a la presión de trabajo de 2 ºC, garantizando un alto grado de secado del aire comprimido (Guillén, 1988). Material y métodos ________________________________________________________________________ 62 Filtros Se encargan de retener las impurezas que posee el aire en su seno (Serrano, 1997). Se distinguen por su grado de filtración y por la capacidad para la retención de aceite, un contaminante del aire generado durante la compresión. Existen diversos tipos, por ejemplo, microfiltro, filtro desoleador y filtro de carbón activo; a partir de éstos se pueden obtener distintos tipos de aire (alimentario, estéril, etc.) (Arbones y col., 2001). 3.1.1.2. Red de distribución Esta red tiene la misión de transportar el aire desde la sala de compresores hasta los equipos que lo consumen (Serrano, 1997). En la instalación de la nave, las tuberías principales son de acero estirado negro de ¾ de pulgada y las tuberías de servicio son de polímeros semirígidos como nylon. 3.1.2. Instalación eléctrica Aunque la nave de procesamiento contaba con una instalación eléctrica, ésta no era la adecuada para garantizar el funcionamiento normal de la maquinaria y la seguridad de los equipos y los operarios. Asimismo, la disposición existente en la colocación y número de tomas de corriente, tanto trifásica como monofásica, era deficiente. Por este motivo, la instalación eléctrica fue modificada con el fin de mejorar la seguridad de la misma y adaptarla a las nuevas necesidades (Viña, 2004). Se trata de una instalación trifásica de 230/400 V de 50 Hz de frecuencia. En la llegada de la corriente a la nave de procesamiento existen dos cuadros eléctricos, uno que distribuye la instalación de fuerza y otro que distribuye la instalación de alumbrado. Del cuadro general, una corriente va al cuadro secundario de la sala de fabricación, del que parte la instalación por medio de una canalización eléctrica en superficie bajo tubo de PVC de 32 mm de diámetro. En el interior de los cuadros existen diversas protecciones unidas por un conductor de 2.5 mm2. Material y métodos ________________________________________________________________________ 63 3.1.3. Instalación de fontanería Una única línea de cobre de 20 mm, con llave general de corte y filtro para la eliminación de impurezas. 3.1.4. Instalación de frío Compuesta de tres recintos frigoríficos, uno de conservación de productos congelados (2660 fr/h y -30 ºC) que también puede trabajar a temperaturas de refrigeración, y dos de refrigeración (0 ºC a 8 ºC y 2545 fr/h). Las cámaras frigoríficas (Figura 17) están situadas en la zona de fabricación y tienen unas dimensiones interiores de 2.0 m × 2.4 m × 2.5 m. Los cierres están constituidos por paneles prefabricados tipo sándwich formados por una capa de 12 cm de poliuretano inyectado de 40 kg/m3 situado entre dos chapas de acero galvanizado y lacado en ambas caras. Figura 17. Cámaras frigoríficas 3.1.5. Instalación de vapor Constituida por una caldera de 300 kg/h (Figura 18) y presión de diseño de 8 bar, un depósito de alimentación de la caldera, un equipo de tratamiento de agua de alimentación, un depósito de gasóleo y una red de abastecimiento de vapor y retorno de condensados Material y métodos ________________________________________________________________________ 64 realizado en acero negro estirado DIN 2440 con diámetros comprendidos entre ¾ pulgada y 1 ¼ pulgada y aislamiento con coquillas de lana mineral. Figura 18. Caldera 3.1.6. Instalación para la cocción Esta instalación está compuesta por cuatro quemadores–paelleros (Figura 19) que se conectan a dos bombonas de gas butano, cuya presión de funcionamiento es de 28-30 mbar, su potencia nominal es de 5 kW y su consumo de gas butano es de 0.363 kg/h. Figura 19. Quemadores-paelleros Material y métodos ________________________________________________________________________ 65 3.2. DESCRIPCIÓN DE LOS EQUIPOS 3.2.1. Equipo de lavado Este equipo se construyó para lavar las muestras utilizadas en los experimentos (García, 2005). 3.2.1.1. Descripción El equipo está construido en acero inoxidable AISI 304 (Figura 20) La limpieza se realiza con agua a la cual se le hace burbujear aire comprimido. Figura 20. Equipo de lavado Consta de los siguientes elementos: Estructura El conjunto de la estructura está fabricado con chapa curvada de acero inoxidable de 1.5 mm de espesor, en la cual se utilizó soldadura TIG para formar un cilindro de 65 cm de diámetro y 67 cm de altura. Material y métodos ________________________________________________________________________ 66 Doble fondo El doble fondo ha sido construido en chapa de acero perforada de 0.5 mm de diámetro de poro, su función es la de facilitar la separación de los grelos y la tierra y otras impurezas que deseamos eliminar en esta etapa. Válvula de vaciado Se trata de una válvula de esfera de 1 pulgada situada en el fondo de la estructura. Permite efectuar la eliminación del agua de lavado. Sistema de aireación La aireación se realiza con aire comprimido de calidad alimentaria que se aplica a una presión de 6 bar a 7 bar a través de cuatro manguitos de ¼ pulgada distribuidos uniformemente a 17 cm del fondo de la estructura. Soporte Fabricado con perfil angular soldado de 50 mm × 50 mm × 5 mm de acero inoxidable. 3.2.1.2. Funcionamiento Inicialmente, se procede al llenado del cilindro, con agua, hasta completar aproximadamente 2/3 de su capacidad. Después se introducen las muestras y, posteriormente, se activa el sistema de aireación permitiendo la entrada del aire. Una vez completada la limpieza, se abre la válvula de vaciado para efectuar la eliminación del agua y así poder retirar las muestras que pasarán a la siguiente fase del proceso de industrialización. Material y métodos ________________________________________________________________________ 67 3.2.2. Equipo de escaldado Este equipo se construyó para esta etapa del procesamiento. 3.2.2.1. Descripción El equipo está construido en acero inoxidable AISI 316 (Figura 21) El escaldado se realiza a vapor, alimentado por la caldera descrita en el apartado 3.1.5. Figura 21. Equipo de escaldado Consta de los siguientes elementos: Estructura El conjunto de la estructura está fabricado con chapa curvada de acero inoxidable de 1.5 mm de espesor, en la cual se utilizó soldadura TIG para formar un cilindro de 70 cm de diámetro y 80 cm de altura. Válvula de vaciado Se trata de una válvula de esfera de 1 pulgada situada en el fondo de la estructura. Permite efectuar la eliminación del condensado. Material y métodos ________________________________________________________________________ 68 Cestón Se trata de un cilindro fabricado en chapa de acero inoxidable, con perforaciones de 10 mm de diámetro y dimensiones 2000 mm × 1000 mm × 1 mm. Esta chapa está curvada formando un cilindro de 65 cm de diámetro interno. Se mueve por medio de un elevador que es accionado por un cilindro neumático. 3.2.2.2. Funcionamiento Inicialmente, se colocan las muestras en el tambor y, por medio del elevador neumático, se introduce éste a la cuba de escaldado. Posteriormente, se abren las válvulas, cuya regulación es de forma manual, y se deja pasar el vapor, a presión atmosférica, al interior de la cuba. Este vapor inicialmente se encontraba a una presión de 3 bar. Es muy importante tener abierta la válvula de vaciado para ir eliminando el condensado que se vaya formando. Una vez concluido el proceso de escaldado, se retiran rápidamente las muestras del equipo. 3.2.3. Equipo de prensado Este equipo se construyó para esta etapa del procesamiento (Viña, 2004). 3.2.3.1. Descripción Se trata de una prensa neumática (Figura 22) sobre una base de acero al carbono, en la que, las partes que van a entrar en contacto con las muestras son de acero inoxidable. Material y métodos ________________________________________________________________________ 69 Figura 22. Equipo de prensado Básicamente se distinguen los siguientes elementos: Estructura La estructura de este aparato está constituida por piezas de perfil cuadrado de acero al carbono de 80 mm × 80 mm × 2 mm, también posee piezas de perfil cuadrado colocadas estratégicamente para estabilizar la estructura. Se distinguen además seis piezas angulares de acero galvanizado, de 800 mm de largo, cuya función es la de sujetar la base de prensado a distintas alturas. Toda la estructura está pintada con pintura plástica de color rojo, con el fin de evitar la oxidación del acero al carbono. Cilindro neumático Se trata de un cilindro de doble efecto de 6 cm de diámetro, con una longitud de barra de 350 mm. Este elemento aplicará la fuerza sobre el producto. Material y métodos ________________________________________________________________________ 70 Cuadro de mandos Está formado por: Válvula reductora de presión: su función es la de regular la presión de trabajo del cilindro y, por tanto, controlar la fuerza proporcionada por el mismo, ya que ésta es proporcional a la presión (Arbones y col., 2001). Manómetro: mide la presión exacta realizada por el cilindro neumático. Es un manómetro que mide de 1 a 6 bar, cuya sensibilidad es de 0.2 bar. Válvula de vías: abre, cierra y modifica la dirección de paso del aire, lo que permite controlar el cilindro. Todos los aparatos van colocados sobre una placa de acero inoxidable unida a la estructura. Cabezal de prensado En este cabezal se distinguen dos partes: Parte superior: esta hecha con angular de acero inoxidable de 50 mm × 50 mm × 5 mm. En esta parte es donde se une el cilindro neumático a la cabeza de prensa. Parte inferior: Constituida por seis tacos rectangulares de polietileno apto para uso alimentario; de dimensiones 55 mm × 45 mm × 150 mm, a cada uno de ellos se une una chapa perforada de acero inoxidable. Base de prensado Se trata de una estructura cuadrada de 820 mm de lado con perfiles angulares de acero inoxidable de 50 mm × 50 mm × 5 mm. Material y métodos ________________________________________________________________________ 77  Vortex, Velp Scientifica. Reactivos:  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua, Millipore Milli-Q plus.  Guayacol extrapuro, Merck Cód. 1.04212.  Peróxido de hidrógeno al 30 % p/v, Panreac Cód. 141076.1211.  Sodio di-hidrógeno fosfato anhidro (NaH2PO4), Panreac Cód. 122018.1210.  di-Sodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4), Panreac Cód. 131679.1210.  Solución de guayacol al 0.5 %, se diluye en una solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.5.  Solución de peróxido de hidrógeno al 0.5 %, se diluye en una solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.5.  Solución de di-sodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4) 0.2 M.  Solución de sodio di-hidrógeno fosfato anhidro (NaH2PO4) 0.2 M.  Solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.5. Procedimiento 1) Preparación del extracto enzimático crudo. La determinación de la actividad de peroxidasa se realizó siguiendo el protocolo indicado por Gökmen y col. (2005). Para la preparación del extracto enzimático se pesa una cantidad de grelo liofilizado equivalente a 10 g de materia fresca y se le adicionan 50 mL de agua Milli-Q mantenida a 4 ºC. Se mezcla en el Vortex durante 2 min y se filtra a través de dos capas de gasa. El filtrado se centrifuga a 17700 rpm durante 20 min a 4 ºC. El sobrenadante se recupera y se conserva en refrigeración hasta su utilización. 2) Ensayo de peroxidasa. La solución sustrato se prepara mezclando 2 mL de una solución de guayacol al 0.5 % y 2 mL de una solución de peróxido de hidrógeno al 0.5 %. Se deja en reposo unos min. Se transfieren 2.9 mL de la solución sustrato a la cubeta de cuarzo y la reacción se Material y métodos ________________________________________________________________________ 78 inicia al añadirle 0.1 mL del extracto enzimático. La reacción se analiza espectrofotométricamente a 420 nm durante 20 min. La solución blanco se prepara al mezclar 2.9 mL de la solución sustrato con 0.1 mL de agua Milli-Q. 3) Cálculos: 1 Unidad de Actividad de POD = incremento en la absorbancia de 0.001 a 420 nm por min por mg de proteína, bajo las condiciones de ensayo. 3.3.1.2. Determinación de la actividad de la lipoxigenasa Referencia: Gökmen y col. (2005). Principio La actividad de la lipoxigenasa (LOX), se basa en la absorción a 234 nm de los dienos conjugados que se forman cuando el ácido linoleico, el cual se usa como sustrato, es oxidado por la enzima. Material y aparatos  Bala de aire sintético, Carburos metálicos.  Balanza analítica, Adam Equipment modelo ADP 3100/L.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Baño de agua termostatizado, Selecta modelo Tectron 200.  Cronómetro, Scharlau.  Cubetas de cuarzo de 3.5 mL, Hëllma tipo 100.600-QG 10 mm.  Gasa.  Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz, Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager for Windows 95/NT, Jasco.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Tubos de policarbonato, Kontron modelo 909190236. Material y métodos ________________________________________________________________________ 79  Ultracentrífuga, Centrikon modelo T-2070 con rotor TFT 70.38-906590027.  Vortex, Velp Scientifica. Reactivos:  Ácido linoleico mínimo 99 %, Sigma Cód. L-1376.  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua, Millipore Milli-Q plus.  Hidróxido de sodio, Panreac Cód. 141687.1214.  Sodio di-hidrógeno fosfato anhidro (NaH2PO4), Panreac Cód. 122018.1210.  di-Sodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4), Panreac Cód. 131679.1210.  Tween-20, Sigma Cód. P1379.  Solución de hidróxido de sodio 0.1 N.  Solución de hidróxido de sodio 1 N.  Solución de di-sodio hidrógeno fosfato anhidro (Na2HPO4) 1/15 M.  Solución de sodio di-hidrógeno fosfato anhidro (NaH2PO4) 1/15 M.  Solución tampón de fosfato de sodio 1/15 M pH 6.0. Procedimiento 1) Preparación del extracto enzimático crudo. La determinación de la actividad de la lipoxigenasa se realizó siguiendo el protocolo indicado por Gökmen y col. (2005). La preparación del extracto enzimático se efectúa de la misma forma que para la determinación de peroxidasa. 2) Ensayo de lipoxigenasa. La solución sustrato se prepara mezclando 157.2 µL de ácido linoleico puro, 157 µL de Tween-20 y 10 mL de agua Milli-Q. Ésta se clarifica al añadir 1 mL de una solución de NaOH 1 N y se diluye con una solución de tampón de fosfato de sodio 1/15 M pH 6.0 hasta un volumen final de 200 mL. Posteriormente, se miden 29 mL de la solución sustrato y se transfieren a un matraz volumétrico que se coloca en un baño de agua termostatizado a 30 ºC. La solución sustrato se airea con una suave corriente de aire Material y métodos ________________________________________________________________________ 80 sintético durante 2 min y la reacción se inicia al adicionar 1 mL de extracto enzimático crudo a la misma. A intervalos de tiempo de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 y 5.0 min se retiran alícuotas de 1 mL del medio de reacción y se transfieren a tubos de vidrio que contienen 4 mL de una solución de NaOH 0.1 N. El uso de esta solución detiene la reacción enzimática y asegura la claridad óptica, al formarse una sal de sodio del ácido linoleico sin reaccionar, antes de realizar la respectiva lectura de absorbancia. La formación de hidroperóxidos se analiza espectrofotométricamente a 234 nm debido a la formación de una cadena hidroperoxidieno conjugada. La solución blanco se prepara al mezclar 1 mL de la solución sustrato con 4 mL de la solución de NaOH 0.1 N. 3) Cálculos: 1 Unidad de Actividad de LOX = incremento en la absorbancia de 0.001 a 234 nm por min por mg de proteína, bajo las condiciones de ensayo. 3.3.2. Determinaciones físico-químicas 3.3.2.1. Determinación de actividad de agua Referencia: AOAC: 978.18 (2002). Principio La actividad de agua (aw) se define como la relación existente entre la presión de vapor del agua en un producto y la presión de vapor del agua pura, a la misma temperatura. La aw es numéricamente equivalente a 1/100 de humedad relativa (HR) generada por un producto en un sistema cerrado. La HR puede ser calculada a partir de la medición directa de la presión de vapor parcial o punto de rocío, o medido indirectamente por sensores, cuyas características físicas o eléctricas son alteradas por la HR a la cual son expuestos. Material y métodos ________________________________________________________________________ 81 Material y aparatos  Cubetas de plástico de 4 cm de diámetro.  Picadora, Moulinex modelo D56.  Sistema medidor de aw, Aqua Lab modelo CX-2. Procedimiento Con el fin de estabilizar el equipo, éste se enciende 15-30 min antes de su uso. Posteriormente, se introduce la muestra homogenizada en la cubeta de plástico con ayuda de una espátula hasta lograr una capa uniforme que cubra el fondo, sin sobrepasar la mitad de su altura. La cubeta con la muestra se introduce en la cámara de medida y se espera a que el equipo proporcione los valores de aw y temperatura. 3.3.2.2. Determinación de humedad Referencias: Board (1989) y AOAC: 930.15 (2002). Principio La humedad se determina mediante la liofilización, que consiste en la eliminación del agua tras su congelación y posterior sublimación del hielo formado Material y aparatos  Balanza analítica, Adam Equipment modelo ADP 3100/L.  Equipo de liofilización freeze dry/sell freeze system, Labconco modelo 77535-01 con bomba de vacío RV5, Bo Edwards.  Recipientes de plástico. Procedimiento Una vez homogenizada la muestra, se coloca en recipientes de plástico previamente tarados (P1) y se pesan (P2), realizando a continuación el proceso de liofilización. Una vez finalizado el mismo, se pesan de nuevo los recipientes conteniendo la muestra liofilizada Material y métodos ________________________________________________________________________ 82 (P3). Por diferencia de peso, antes y después de la liofilización, se determina el porcentaje de pérdida de agua. Cálculos 100% 12 32    PP PP HUMEDAD Siendo: P1= Peso en g del recipiente vacío. P2 = Peso en g del recipiente con la muestra fresca. P3 = Peso en g del recipiente con la muestra liofilizada. Las muestras liofilizadas son conservadas en un arcón a -20 ºC, para ser utilizadas en las determinaciones correspondientes. 3.3.2.3. Determinación de pH Referencia: AOAC: 981.12 (2002). Principio El pH se define como la medida de la actividad de los iones hidrógeno. Este puede ser medido determinando el potencial eléctrico entre un electrodo de vidrio y su referencia, usando un aparato comercial estandarizado calibrado con patrones primarios de pH. Aparatos  Agitador termomagnético, Velp Scientifica.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Electrodo de pH, Crison modelo 52-02.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Medidor automático de pH, Crison modelo GLP 21. Material y métodos ________________________________________________________________________ 83 Reactivos  Disolución tampón pH 7.00 a 25 ºC, Crison Cód. 23-111-02.  Disolución tampón pH 4.01 a 25 ºC, Crison Cód.23-112.02. Procedimiento Previamente, se calibra el medidor automático de pH con dos soluciones tampón de pH 7.00 y pH 4.01. A continuación, se pesa aproximadamente una cantidad de muestra liofilizada equivalente a 10 g de muestra fresca, y se mezcla durante 5 min con 100 mL de agua desionizada, hasta obtener una disolución uniforme. Posteriormente, se sumergen los electrodos del medidor de pH en la misma y se realiza directamente la lectura. 3.3.2.4. Determinación de acidez titulable Referencias: Board (1989) y AOAC: 942.15 (2002). Principio La concentración de ácidos orgánicos, como los ácidos acético, cítrico, láctico y málico, se estima mediante la titulación de una muestra de alimento con hidróxido de sodio a un punto final de pH 8.1. Material y aparatos  Agitador termomagnético, Velp Scientifica.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Bureta de 10 mL, Pyrex.  Electrodo de pH, Crison modelo 52-02.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Medidor automático de pH, Crison modelo GLP 21. Material y métodos ________________________________________________________________________ 84 Reactivos  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua Millipore Milli-Q plus.  Hidróxido de sodio, Panreac Cód. 141687.1214.  Solución de hidróxido de sodio 0.1 N, de factor conocido. Procedimiento Se pesa una cantidad de muestra liofilizada equivalente a 10 g de muestra fresca, y se mezcla durante 5 min con 100 mL de agua desionizada, hasta obtener una disolución uniforme. Se determina el pH de esta solución y posteriormente se titula con hidróxido de sodio 0.1 N hasta llegar a pH 8.1. Se selecciona el ácido málico para expresar el resultado, ya que es el que se encuentra en mayor cantidad en el grelo. Cálculos ACIDEZ TOTAL (% ácido málico) = 100    P FVfN Siendo: N = normalidad del NaOH. f = factor del NaOH. V = volumen de NaOH consumidos en la valoración. F = factor de conversión del ácido málico: 0.067 P = peso en g de la muestra. 3.3.2.5. Determinación de vitamina B1(tiamina) y vitamina B2 (riboflavina) Referencias: Sims y Shoemaker (1993); Sánchez-Machado y col. (2004). Principio Se basa en determinar la concentración de la vitamina B1 y vitamina B2 mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa con detector de fluorescencia. Material y métodos ________________________________________________________________________ 85 Material y aparatos  Balanza analítica, Adam Equipment modelo ADP 3100/L.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Baño de agua termostatizado, Selecta modelo Tectron 200.  Columna Kromasil 100 C18, de Teknokroma, con dimensiones de 250 mm × 4.6 mm, empacada con partículas de 5 µm.  Precolumna Tracer ODS, Teknokroma, con dimensiones de 10 mm × 4.6 mm, empacada con partículas de 5 µm. (Cód. TR-C-160-1).  Cromatógrafo líquido de alta resolución, que consta de: * Bomba para HPLC, Jasco modelo PU-2080 Plus. * Detector ultravioleta-visible, Jasco modelo UV-2075 Plus. * Detector de fluorescencia, Jasco modelo FP-2020 Plus. * Horno de columna, Gecko modelo 2000. * Inyector manual, Rheodyne con bucle de inyección de 20 µL. * Software HSS-2000 control Server, Jasco version 3.5.2. * Sofware Borwin Chromatography, Jasco versión 1.50. * Unidad de gradiente ternaria (mezclador), Jasco modelo LG-2080-02. * Unidad LC-Net II/ADC, Jasco.  Desgasificador de helio, Carburos metálicos.  Estufa de laboratorio termostatizada, Indelab.  Filtros de jeringa de nylon de 0.2 µm, Waters.  Fluorímetro, Perkin Elmer modelo LS 50.  Jeringa de 50 µL, SGE.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Papel filtro, Albet 135. Reactivos  Acetato de amonio, Merck Cód. 1.01116.0500.  Acetato de sodio anhidro, Panreac Cód. 131633.  Ácido acético glacial, Panreac Cód. 131008. Material y métodos ________________________________________________________________________ 86  Ácido clorhídrico fumante al 37 %, Merck Cód. 1.00317.1000.  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua, Millipore Milli-Q plus.  Claradiastasa de Aspergillus oryzae, Fluka Cód. 86959.  Etanol absoluto, Panreac Cód. 141086.1212.  Hexacianoferrato de potasio (III), Aldrich Cód. 24, 402-3.  Hidrocloruro de tiamina (vitamina B1), Sigma Cód. T-4625.  Hidróxido de sodio, Panreac Cód. 141687.1214.  Metanol grado HPLC, Merck Cód. 1.06018.2500.  Riboflavina (vitamina B2), Sigma Cód. R-4500.  Solución de acetato de amonio 0.005 M.  Solución de acetato de sodio 2.5 M.  Solución de ácido acético 0.02 N.  Solución de ácido clorhídrico 0.1 N.  Solución de ácido clorhídrico 3.75 N.  Solución de claradiastasa al 1 %, se diluye en agua Milli-Q.  Solución de etanol al 20 %.  Solución de hexacianoferrato de potasio (III) al 1 %, se diluye en hidróxido de sodio al 15 %.  Solución de hidróxido de sodio al 15 %.  Solución patrón de hidrocloruro de tiamina, se diluye en etanol al 20 %.  Solución patrón de riboflavina, se diluye en ácido acético 0.02 N. Condiciones de trabajo  Fase móvil: mezcla de acetato de amonio 0.005 M, (tamponada a pH 6.0) y metanol, con relación 72:28 (v/v).  Flujo de trabajo: 0.8 mL/min.  Modo: isocrático. Longitud de onda de detección (excitación/ emisión): vitamina B1 (370/435) y vitamina B2 (370/520). Material y métodos ________________________________________________________________________ 93 Figura 25. Representación del espacio de color CIE L*a*b* 3.3.2.8. Determinación de pigmentos Referencias: Khachik y col. (1986); López-Hernández y col. (1993); Wright y col. (1997); Cartaxana y Brotas (2003). Principio Se basa en determinar la concentración de luteína, β-caroteno, clorofila a, clorofila b, feofitina a y feofitina b mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa y con detector diodo array. Material y aparatos  Balanza analítica, Adam Equipment modelo ADP 3100/L.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Columna Sun Fire C18, Waters, con dimensiones de 250 mm × 4.6 mm, empacada con partículas de 5 µm.  Precolumna Sun Fire C18, Waters, con dimensiones de 20 mm × 4.6 mm, empacada con partículas de 5 µm.  Cromatógrafo líquido de alta resolución, que consta de: * Bomba para HPLC, Jasco modelo PU-1580. * Detector de multilongitud de onda UV/VIS (Diodo array), Jasco modelo MD- Material y métodos ________________________________________________________________________ 94 1515. * Horno de columna, Jetstream Plus serie 90305-2. * Inyector manual, Rheodyne con bucle de inyección de 20 µL. * Sofware Borwin Chromatography, Jasco versión 1.50. * Sofware Borwin PDA, Jasco versión 1.50. * Software HSS-2000 control Server, Jasco version 3.5.2. * Unidad de gradiente ternario de baja presión (mezclador), Jasco modelo LG1580-02. * Unidad LC-Net II/ADC, Jasco.  Cubetas de cuarzo de 3.5 mL, Hëllma tipo 100.600-QG 10 mm.  Desgasificador, Gastorr modelo 154.  Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz, Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager for Windows 95/NT, Jasco.  Filtros de fibra de vidrio, Albet.  Filtros de jeringa de nylon de 0.2 µm, Waters.  Jeringa de 50 µL, SGE.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Rotavapor, Büchi modelo RE 111.  Vortex, Velp Scientifica. Reactivos  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua Millipore Milli-Q plus.  Acetona, grado analítico, Scharlau Cód. AC0311.  Acetonitrilo supragradient, grado HPLC, Scharlau Cód. AC0331.  Ácido clorhídrico fumante al 37 %, Merck Cód. 1.00317.1000.  Carbonato de calcio, Panreac Cód. 121212.  β-caroteno, Sigma Cód. C-9750.  Clorofila a, Sigma Cód. C-5753.  Clorofila b, Sigma Cód. C-5878.  Cloruro de sodio, Scharlau Cód. SO0227. Material y métodos ________________________________________________________________________ 95  2, 6-Di-ter-butil-4-metilfenol (BHT), Panreac Cód. 162825.1209.  Diclorometano estabilizado con aproximadamente 50 ppm de amileno multisolvent, grado HPLC, Scharlau Cód. CL0347.  Éter de petróleo 40-60 ºC, Panreac Cód. 141315.1612.  n-Hexano, grado HPLC, Merck Cód. 1.04391.2500.  Metanol, grado analítico, Scharlau Cód. ME0316.  Metanol grado HPLC, Merck Cód. 1.06018.2500.  Sulfato de sodio anhidro, Panreac Cód. 131716.  Xantofila (luteína; α-caroteno-3-3´-diol), Sigma Cód. X-6250.  Solución de ácido clorhídrico, 0.1 N.  Solución de cloruro de sodio al 10 %.  Solución de éter de petróleo 40-60 ºC, con 0.1 % de BHT.  Solución de metanol, grado analítico, con 1 % de BHT.  Solución patrón de β-caroteno, se diluye en acetona.  Solución patrón de clorofila a, se diluye en acetona.  Solución patrón de clorofila b, se diluye en acetona.  Solución patrón de feofitina a. Se prepara a partir de una solución patrón de clorofila a, a la cual se añaden 3 gotas de HCl 0.1 N, y se mantiene en la oscuridad durante 15 min.  Solución patrón de feofitina b. Se prepara a partir de una solución patrón de clorofila b, a la cual se añaden 3 gotas de HCl 0.1 N, y se mantiene en la oscuridad durante 15 min.  Solución patrón de luteína, se diluye en acetona. Condiciones de trabajo  Fase móvil: mezcla inicial isocrática de acetonitrilo (75 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (1:1) (10 %)  Flujo de trabajo: 0.8 y 1.5 mL/min.  Modo: gradientea. Material y métodos ________________________________________________________________________ 96 Longitud de onda de detección: * Luteína: 450 nm * B-caroteno: 450 nm * Clorofila a: 430 nm * Clorofila b: 460nm * Feofitina a: 405 nm * Feofitina b: 432 nm  Temperatura del horno: 25 ºC. aLa fase móvil se compone de una mezcla isocrática de acetonitrilo (75 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (1:1) (10 %) que se mantiene durante 9 min, seguida por un gradiente que termina a los 16 min con una composición final de acetonitrilo (40 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (45 %), manteniéndose dicha proporción hasta los 24 min. Se usa un flujo constante de 0.8 mL/min. Al finalizar la separación, la columna es reequilibrada con la mezcla inicial isocrática, se aumenta el flujo a 1.5 mL/min en un gradiente que dura 1 min y se mantiene en esas condiciones hasta los 35 min, posteriormente el flujo cambia a 0.8 mL/min en un gradiente que termina a los 38 min y se mantiene con este flujo durante otros 2 min. La separación de los compuestos se logra en un tiempo de 22 min. La absorción visible de los mismos se mide a las longitudes de onda óptimas, seleccionadas en función de los máximos de absorbancia de los espectros registrados de cada componente. Preparación de patrones Se prepara una solución madre de pigmentos en 10 mL de acetona (López-Hernández y col. (1993). De aquí se toman las porciones necesarias para establecer una escala, de tal forma que las concentraciones de los pigmentos en la muestra queden en el rango de la escala establecida. La acetona se evapora bajo corriente de nitrógeno y se redisuelven las porciones en hexano, para luego ser inyectadas en el cromatógrafo. Material y métodos ________________________________________________________________________ 97 Procedimiento Los pigmentos se extrajeron tomando en cuenta las indicaciones dadas por Wright y col. (1997) y Cartaxana y Brotas (2003), pero con algunas modificaciones derivadas de la puesta a punto de este método. Todo el procedimiento se realiza con luz tenue. Para la extracción de los pigmentos, se pesan 0.25 g de muestra liofilizada y finamente molida, se le agrega la misma cantidad de carbonato de calcio y se homogeniza completamente en un mortero. Dicha mezcla se transfiere a una probeta, se le añaden 10 mL de metanol (mantenido a 4 ºC y recien adicionado con 1 % de BHT) y se lleva a un baño de ultrasonidos con agua fría, durante 10 min. Posteriormente se filtra al vacío con filtro de fibra de vidrio. La extracción se repite una vez más. El filtrado se lleva a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con el metanol, antes mencionado. Se toman 10 mL de la solución anterior y se llevan a un embudo de decantación, se le añaden 10 mL de éter de petróleo con 0.1 % de BHT, se agita cuidadosamente y enseguida, resbalando por las paredes del embudo, se agregan 10 mL de cloruro de sodio al 10 % (Khachik y col., 1986). Nuevamente se agita y se deja en reposo para que los pigmentos de la fase metanólica se transfieran a la fase etérea. Se desecha la capa inferior (metanólica) y se recupera la capa superior (etérea). A ésta se le agrega un 2 % de sulfato de sodio anhidro. La fase etérea, libre de agua, se evapora a temperatura ambiente en un rotavapor giratorio con corriente de nitrógeno. El extracto se disuelve en 2 mL de hexano y posteriormente se pasa a través de un filtro de nylon de 0.2 µm (Waters) y se inyecta en el HPLC. 3.3.2.9. Determinación de cenizas Referencia: AOAC: 942.05 (2002). Principio Se determina mediante calcinación de la muestra en una mufla a 600 ºC. Material y métodos ________________________________________________________________________ 98 Material y aparatos  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Cápsulas de porcelana.  Desecador, Simax.  Horno eléctrico de Mufla, Hobersal modelo HD-230.  Picadora, Moulinex modelo D56. Procedimiento Previamente se calcinan las cápsulas en la mufla a 600 ºC durante 12 h, se introducen en el desecador hasta que alcanzan la temperatura ambiente y se pesan (P1). A continuación, se trituran los grelos hasta obtener una muestra homogénea, se introducen en las cápsulas aproximadamente 2 g de muestra y se pesan de nuevo (P2). Se introducen en la mufla a 600 ºC durante 12 h. Transcurrido dicho tiempo se llevan las cápsulas a un desecador hasta que alcancen la temperatura ambiente y se pesan (P3). Cálculos 100% 12 13    PP PP CENIZAS Siendo: P1= Peso en g de la cápsula vacía. P2 = Peso en g de la cápsula con la muestra fresca. P3 = Peso en g de la cápsula con la muestra calcinada. 3.3.2.10. Determinación de proteína Referencia: AOAC: 955.04 (2002). Principio El contenido de proteína se determina por el método de Kjeldahl, el cual se basa en el supuesto de que la proporción de nitrógeno no proteínico en un producto alimenticio es demasiado pequeña para ser significativa, y que una determinación del nitrógeno total Material y métodos ________________________________________________________________________ 99 (con exclusión del presente en los nitratos y nitritos, que no los determina) refleja con suficiente precisión la riqueza en proteína. Material y aparatos  Balanza analítica, Mettler modelo AE 2005 Nº 82929.  Destilador, Buchi.  Digestor con capacidad para 6 tubos, Buchi modelo B-426RD.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Perlas de vidrio.  Tubos Kjeldhal de 350 mL. Reactivos  Ácido bórico, Probus Cód. 011320.  Ácido clorhídrico 0.1 N, Panreac Cód. 181023.1211.  Ácido sulfúrico al 96 %, Panreac Cod. 131058.  Agua destilada.  Azul de metileno, Panreac Cód. 251170.1606.  Catalizador Kjeldahl (Se) tabletas, Panreac Cód. 173348.  Hidróxido de sodio, Panreac Cód. 141687.1214.  Indicador mixto, preparado por disolución de 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de metileno en 1000 mL de agua destilada.  Rojo de metilo, Analema Cód. 13020.  Solución de ácido bórico al 40 %.  Solución de hidróxido de sodio al 33 %. Procedimiento Se introducen sucesivamente en el tubo Kjeldahl 2 tabletas de catalizador y la cantidad de muestra pesada. Se añaden 25 mL de ácido sulfúrico al 96 %, se mezcla suavemente y se somete a la digestión. Cuando el líquido está transparente, se retira el matraz del equipo y se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se añaden con precaución Material y métodos ________________________________________________________________________ 100 100 mL de agua destilada y se disuelve agitando el sulfato potásico que pueda haber cristalizado. En un matraz erlenmeyer de 250 mL se introducen 25 mL de ácido bórico al 4 % y unas gotas de indicador mixto a fin de que adquiera una coloración violeta. EL matraz se sitúa en el destilador para recoger el destilado. Se coloca el tubo Kjeldahl en el destilador de forma que quede perfectamente ajustado. Se agregan al tubo 100 mL de hidróxido sódico al 33 %. Se destila hasta alcanzar 150 mL de destilado en el matraz erlenmeyer, produciéndose el viraje a color verde. Se retira el matraz y el destilado se valora con ácido clorhídrico 0.1 N hasta la coloración violeta original. Se efectúa una prueba en blanco en cada ensayo sustituyendo la muestra por 5 mL de agua destilada, siguiendo el mismo procedimiento. Cálculos % NITRÓGENO TOTAL = [(Vm-Vb) × N × 1.4]/M Siendo: Vm= volumen en mL de HCl gastado por la muestra. Vb = volumen en mL de HCl consumido por el blanco. N=normalidad del HCl. M = peso en g de la muestra. El contenido en proteína (%) se calcula a partir del contenido en nitrógeno total: % PROTEÍNA = Nt × 6.25 Siendo: Nt= Contenido en nitrógeno total. Material y métodos ________________________________________________________________________ 101 3.3.2.11. Determinación de fenoles totales Referencias: Singleton y Rossi (1965); Slinkard y Singleton (1977); Singleton y col. (1999); Oboh (2005). Principio Los fenoles son los responsables de la capacidad de oxigenación en la mayoría de los alimentos derivados de plantas. El análisis de fenoles totales debe incluir la cuantificación de monofenoles y polifenoles oxidados. La determinación se basa en la utilización del reactivo propuesto por Otto Folin y Vintila Ciocalteu, el cual tiene la capacidad de reaccionar, de forma completa y rápida, con sustancias oxidables, desarrollando una coloración azul, cuya intensidad es proporcional a la concentración de dichas sustancias en la muestra. Esta reacción se debe realizar a pH alcalino. Material y aparatos  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.  Cronómetro, Scharlau.  Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz, Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager for Windows 95/NT, Jasco.  Estufa de laboratorio termostatizada, Indelab.  Material de vidrio de uso en laboratorio.  Microcubetas de poliestireno de 2.5 mL, dispolab Kartell.  Papel filtro, Albet 135.  Vortex, Velp Scientifica. Reactivos:  Acetona, grado analítico, Scharlau Cód. AC0311.  Ácido tánico purísimo, Riedel-deHaën Cód. 16201.  Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua, Millipore Milli-Q plus.  Carbonato de sodio anhidro, Panreac Cód. 131648.1210. Material y métodos ________________________________________________________________________ 102  Reactivo Folin-Ciocalteu´s phenol 2 N, Sigma Cód. F9252.  Solución de acetona al 70 %.  Solución de carbonato de sodio 75 g/L.  Solución del Reactivo Folin-Ciocalteu´s phenol 2 N 1/10, se diluye en agua MilliQ.  Solución patrón de ácido tánico, se diluye en agua Milli-Q. Preparación de patrones Se prepara una solución madre de ácido tánico (se usa como un patrón fenólico) de concentración conocida. A partir de la misma, se toman los volúmenes necesarios para establecer una escala, de tal forma que las concentraciones equivalentes de ácido tánico en las muestras se encuentren en el rango de la escala establecida. Se toman 2 mL de cada concentración, se tratan como una muestra y, posteriormente, se analizan espectrofotométricamente. Las lecturas de absorbancia obtenidas se representan frente a las concentraciones respectivas, para obtener una recta de calibración. Procedimiento La determinación de fenoles totales se realizó siguiendo el protocolo indicado por Singleton y Rossi (1965) y Slinkard y Singleton (1977). Para la extracción de los fenoles totales se pesan aproximadamente 0.03 g de muestra liofilizada, finamente molida, y se le agregan 20 mL de acetona al 70 % conservada a 4 ºC (Oboh, 2005). Se mezcla en Vortex y se deja en reposo a 4 ºC durante toda la noche. La solución obtenida se filtra a través de papel Albet 135. Del filtrado anterior, se toman 2 mL y se le adicionan 10 mL de una solución 1/10 de Reactivo Folin-Ciocalteu´s phenol 2 N. Se mezcla cuidadosamente en Vortex con el fin de homogenizar los dos componentes. Se deja en reposo durante 3 min y, a continuación, se agregan 8 mL de una solución de carbonato de sodio (75 g/L). Nuevamente se mezcla en Vortex y se lleva a incubar a 25 ºC durante 90 min. Finalizado ese tiempo las muestras exhibirán un color azul, cuya absorbancia se mide a 760 nm. Cada lectura se realiza por triplicado. Material y métodos ________________________________________________________________________ 109 en posición invertida a 35-37 ºC durante 24 h. En caso de no aparecer colonias o éstas ser pequeñas se continúa la incubación durante 24 h más. Se consideran positivas aquellas colonias de color negro con una depresión en el centro de la misma. El número de ufc/g correspondiente se obtiene tras multiplicar el número obtenido por el factor de dilución. Paralelamente, se hace una prueba de detección, tras enriquecimiento. En bolsas de homogenizador estériles, previamente pesadas y taradas, se introducen 25 g de muestra y se añaden 225 mL de caldo selectivo propuesto por la FDA. Se homogenizan durante 30 s y se incuban durante 24 h a 30 ºC. Se repite la metodología descrita en el párrafo anterior. Nota: En caso de aparición de colonias presuntamente positivas se realiza una caracterización bioquímica de las mismas mediante las pruebas siguientes: tinción de Gram, prueba de catalasa, por inmersión en peróxido de hidrógeno al 3 %, detección de movilidad en agar BHI, detección de carácter hemolítico mediante prueba de sobrecapa utilizando sangre de cordero desfibrinada lavada con azida de sodio e inoculación de galerías API listeria, las cuales se leen con ayuda del software APILAB PLUS. 3.3.3.6. Salmonella spp Referencia: Norma ISO 6579:2003. Medios de cultivo y reactivos  Agar SM-ID®, BioMérieux, Cód. 43621.  Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD), Oxoid, Cód. PO5238E.  Agua de peptona tamponada, Merck, Cód. 1.07228.0500.  API 20E®, BioMérieux, Cód. 20100.  Caldo Rappaport-Vassiliadis, Merck Cód. 1.07700.0500.  Kit Oxoid Biochemical Identification System (OBIS Salmonella), Oxoid Cód. X5865. Material y métodos ________________________________________________________________________ 110 Procedimiento Se realiza directamente una prueba de detección tras enriquecimiento, para la cual se incuba la dilución madre original durante 24 h a 41.5 ºC. Transcurrido ese plazo, se inocula 0.1 mL de la dilución en 9.9 mL de Caldo Rappaport-Vassiliadis. Posteriormente, se procede a su incubación durante 24 h a 44.5 ºC. Una vez realizado este enriquecimiento, se procede a su siembra en estría con asa de Kölle en agar XLD y agar SM-ID y se incuban en posición invertida durante 24 h a 37 ºC. En caso de aparición de colonias presuntamente positivas (negras en el agar XLD y rojas en el agar SM-ID), se realiza una caracterización bioquímica de las mismas usando los sistemas de identificación OBIS Salmonella y API 20E. 3.3.3.7. Clostridium perfringens Referencia: Norma UNE-EN 13401:2000. Medios de cultivo y reactivos  Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS), según Angelotti, Cultimed Cód. 414125.1210.  Agua de peptona tamponada, Merck Cód. 1.07228.0500.  D-Cicloserina, BioMérieux Cód. 42619.  Kit RapID® ANA II System, Remel Cód. 8311002. Procedimiento Se realizan diluciones seriadas en tubo apropiadas a la muestra procesada. De éstas, se extrae 1 mL y se inocula en una placa petri sobre la cual se añaden 15 mL de agar SPS, suplementado con D-cicloserina estéril, atemperado a 45 ºC. Tras una agitación suave, las placas se dejan solidificar a temperatura ambiente y se le añade una fina sobrecapa de medio. Posteriormente, se incuban en posición invertida a 35-37 ºC durante 24 h en atmósfera anaerobia generada mediante el sistema Anaerogen® (Oxoid) en una jarra hermética, tras lo cual se cuentan las colonias desarrolladas. Las colonias negras son Material y métodos ________________________________________________________________________ 111 sometidas a identificación bioquímica mediante el kit RapID® ANA II System. El número de ufc/g correspondiente se obtiene tras multiplicar el número obtenido por el factor de dilución. 3.4. Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos se realiza mediante el programa SPSS versión 14.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Se realizan los siguientes tratamientos: -ANOVA de dos factores con interacción. -ANOVA de un factor, realizando la comparación de medias con el test de Tukey. -Test t-Student para muestras independientes. -Análisis de la correlación de Pearson para muestras bivariadas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 115 4.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS ETAPAS DEL PROCESO DE CONGELACIÓN EN EL GRELO La optimización del proceso de congelación en el grelo, consta de tres etapas: escaldado, cocción y escurrido. 4.1.1. Escaldado El escaldado se optimizó a dos niveles: laboratorio y planta piloto. La etapa, a nivel de laboratorio, ha sido objeto de una publicación reciente: Mondragón-Portocarrero, A., Pena-Martínez, B., Fernández-Fernández, E., Romero-Rodríguez, A. y Vázquez-Odériz, L. (2006). Effects of different pre-freezing blanching procedures on the physicochemical properties of Brassica rapa leaves (Turnip Greens, Grelos). International Journal of Food Science and Technology. 41: 1-6. 4.1.1.1. Optimización del proceso a nivel de laboratorio a) Primera serie de experimentos Los grelos fueron suministrados por un productor local de la provincia de Lugo, Galicia. Se clasificaron para quitar las hojas dañadas, se cortaron y se lavaron con agua. Inicialmente, se realizaron varios tipos de escaldado con agua a ebullición y a vapor, en ambos casos con adición de ácido cítrico al 1 y al 5 % y, sin adición del mismo. Los tratamientos fueron realizados manteniendo constante la relación peso de producto/agua. En el caso de inmersión en agua esta relación fue de aproximadamente 800 g de producto en 2 L de agua y en el caso del escaldado a vapor fue de alrededor de 800 g de producto por cada litro de agua. Cuando el agua hervía se introducían los grelos para efectuar su escaldado ensayándose los tiempos de 1 min, 1.5 min, y 2 min, contados desde el momento en el que el agua volvía a hervir. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 1 16 Después de cada tratamiento térmico los grelos se sumergían rápidamente en un baño de agua con hielo, se mantenían así durante 5 min y, posteriormente, se secaban con papel de filtro durante otros 5 min. Una vez finalizado ese tiempo, se realizó la prueba cualitativa de actividad de la peroxidasa a una porción de cada producto tratado. Se comprobó que dicha enzima se inactivaba al cabo de 2 min en los grelos escaldados en agua, sin embargo con la adición del ácido cítrico, solo era necesario 1 min de escaldado. Asimismo, con respecto al escaldado con vapor, fueron necesarios 2 min para inactivar la peroxidasa, sin embargo se observó que la adición del ácido cítrico no disminuía el tiempo de escaldado, por lo que se suprimió la adición de este ácido. b) Segunda serie de experimentos En función de los resultados obtenidos en la primera serie de experimentos, y con la finalidad de no aplicar un tratamiento térmico de larga duración, se optó por realizar una segunda serie de experimentos, los cuales se detallan a continuación. Escaldado a vapor, durante 2 min. Escaldado con agua, durante 2 min. Escaldado con agua y adición de 1 % de ácido cítrico, durante 1 min. Escaldado con agua y adición de 5 % de ácido cítrico, durante 1 min. Después de cada escaldado, enfriado y secado, siguiendo el procedimiento anteriormente descrito, los grelos se dividieron en porciones de 25 g, los cuales fueron introducidos en recipientes plásticos con tapa de uso alimentario y congelados a –18 ºC en un arcón congelador (Lynx, modelo LG-682). Durante un período de 120 días, en intervalos aproximados de 15 días, porciones de los grelos congelados, fueron retirados del arcón y descongelados a 4 ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se realizaron los análisis fisicoquímicos (cenizas, contenido de vitamina C, pH, acidez titulable, humedad y parámetros de color, L*, C* y Hº), cuyos resultados se analizan a continuación. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 117 Es conveniente mencionar que en las tablas de datos y en sus respectivas figuras, para la variable “Número de muestreo” se usa la nomenclatura establecida en la Tabla 9, la cual será de uso común para todos los resultados de este trabajo. Tabla 9. Nomenclatura para definir la variable “Nº de muestreo”. Nº de muestreo significado 0grelo fresco (sin tratamiento). 1grelo escaldado, enfriado y secado. 2grelo congelado durante 15 días. 3grelo congelado durante 30 días. 4grelo congelado durante 45 días. 5grelo congelado durante 60 días. 6grelo congelado durante 75 días. 7grelo congelado durante 90 días. 8grelo congelado durante 105 días. Cenizas La determinación de cenizas solo se realizó en el producto fresco y en el producto tras el escaldado. Tabla 10. Cenizas en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. cenizasa Nº muestreo vapor (2 min) agua (2 min) agua + 1 % ác. cítrico (1 min) agua + 5 % ác. cítrico (1 min) 01.19 ± 0.12 1.19 ± 0.12 1.19 ± 0.12 1.19 ± 0.12 11.16 ± 0.02 0.56 ± 0.01 0.81 ± 0.06 0.75 ± 0.07 Promedio ± desviación estándar (n=2); a g/100 g. El contenido en cenizas del producto fresco (promedio ± DS) fue de 1.19 ± 0.12 g/ 100 g (Tabla 10). Este valor disminuyó considerablemente en el escaldado con agua (a 0.56 ± 0.01 g/100 g en agua, durante 2 min; a 0.81 ± 0.06 g/100 g con agua y 1 % de ácido cítrico, durante 1 min; y 0.75 ± 0.07 g/100 g con agua y 5 % de ácido cítrico, Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 118 durante 1 min). En contraste, el escaldado con vapor no tuvo efecto sobre esta variable ya que el resultado fue de 1.16 ± 0.02 g/100 g. A partir de los resultados de los restantes parámetros fisicoquímicos se realizó el tratamiento estadístico ANOVA de dos factores, siendo éstos el tiempo de almacenamiento (t) y el método de escaldado (E) con la interacción de ambos factores (t × E). Los resultados obtenidos de dicho tratamiento se recogen en la Tabla 11. Tabla 11. ANOVA de dos factores (tiempo de almacenamiento y método de escaldado, con interacción). variables t E t × E vitamina C 0.000* 0.000* 0.000* pH 0.002* 0.000* 0.000* acidez titulable 0.005* 0.000* 0.007* humedad 0.000* 0.000* 0.151 L* 0.798 0.003* 0.184 C* 0.611 0.000* 0.220 Hº 0.575 0.000* 0.629 *: p<0.05; t: tiempo de almacenamiento; E: método de escaldado. Se observa que existen diferencias estadísticamente significativas respecto al factor tiempo de almacenamiento (t) para las variables vitamina C, pH, acidez titulable y humedad; mientras que para el factor método de escaldado (E) existen diferencias significativas en todos los parámetros estudiados. La interacción t × E es estadísticamente significativa para las variables vitamina C, pH y acidez titulable. En los casos en que la interacción es significativa, se procede al análisis de los datos independientemente seleccionando, en este caso, como factor el método de escaldado. Los resultados de este análisis se recogen en la Tabla 12. Cuando se observan diferencias estadísticamente significativas, se aplica el test de Tukey para comprobar en donde se localizan esas diferencias. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 119 Tabla 12. ANOVA de un factor (método de escaldado). Nº de muestreo vitamina C pH acidez titulable 10.000* 0.182 0.021* 20.000* 0.002* 0.042* 30.000* 0.032* 0.643 40.000* 0.000* 0.000* 50.000* 0.000* 0.516 60.000* 0.001* 0.003* 70.000* 0.000* 0.001* 80.000* 0.000* 0.000* *: p<0.05. Contenido de vitamina C En lo que respecta al contenido de vitamina C, se aprecian diferencias estadísticamente significativas, tanto a lo largo del almacenamiento, como entre los diferentes métodos de escaldado (Tabla 12). El contenido promedio en vitamina C en el grelo fresco fue de 68.06 mg/100 g (Tabla 13). Autores como Mataix y col. (2003) indican que este contenido es de 40 mg/100 g, diferencias que pueden ser debidas a distintos factores: genéticos, ambientales, climáticos, condiciones de cultivo, localización, etc. (Simonetti y col., 1991). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 120 Tabla 13. Vitamina C en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. vitamina Ca Nº muestreo vapor (2 min) agua (2 min) agua + 1 % ác. cítrico (1 min) agua + 5 % ác. cítrico (1 min) 068.06 ± 1.82 68.06 ± 1.82 68.06 ± 1.82 68.06 ± 1.82 157.33 ± 0.33 26.75 ± 0.52 37.07 ± 0.24 39.12 ± 0. 84 254.44 ± 0.88 30.70 ± 0.36 19.62 ± 0.06 26.75 ± 1.39 360.20 ± 0.63 20.71 ± 0.21 23.29 ± 0.24 26.43 ± 0.47 465.28 ± 0.01 20.26 ± 0.93 26.95 ± 0.08 23.72 ± 0.09 576.63 ± 2.17 38.69 ± 0.31 31.73 ± 0.18 45.32 ± 0.82 679.94 ± 0.25 27.76 ± 0.28 32.56 ± 0.32 40.17 ± 0.08 782.83 ± 0.16 34.85 ± 0.18 36.48 ± 0.08 24.15 ± 0.16 870.12 ± 0.02 39.56 ± 0.58 29.69 ± 0.05 20.55 ± 0.12 Promedio ± desviación estándar (n=2); a mg/100 g de materia fresca. En la Figura 26 se observa que, tras el escaldado, se produce una disminución en el contenido de vitamina C para los distintos métodos aplicados. En el presente estudio, la reducción fue más severa tras el escaldado con agua (aproximadamente 61 % del contenido inicial) y menor con agua adicionada de 1 % de ácido cítrico (aproximadamente 45 % y 42% del contenido inicial respectivamente). La reducción menor se produjo con el escaldado a vapor, únicamente un 16%. Es ya conocido que, tras el escaldado con vapor, el contenido en vitamina C se reduce menos que tras el escaldado con agua, debido a que las pérdidas por lixiviación son menores (Canet y col., 1991; Canet, 1996). Así, Rutledge (1992) indica que las hortalizas escaldadas con agua contienen menos de la mitad de vitamina C que las escaldadas con vapor. Ponne y col. (1994) encontraron que las pérdidas de vitamina C en espinacas congeladas (con respecto al producto fresco), fueron del 29 % para espinacas escaldadas con vapor, mientras que las escaldadas en agua fueron del 69 %. Howard y col. (1999) encontraron que las pérdidas de vitamina C en brócoli, tras el escaldado a vapor, fueron aproximadamente de 30 %. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 127 84 88 92 96 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo % de humedad vapor, 2 min. agua, 2 min. agua con 1 % de ácido cítrico, 1 min. agua con 5 % de ácido cítrico, 1 min. Figura 29. Evolución del contenido de humedad en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. Los parámetros de color CIEL*a*b* (L*, C* y Hº), presentaron diferencias estadísticamente significativas para el factor método de escaldado (E), no así para el factor tiempo de almacenamiento (t) (Tabla 11). Luminosidad (L*) En la Tabla 17 se observa que se produce una disminución en la luminosidad (L*), desde un valor de 48.32 ± 1.81 para el producto fresco, hasta valores entre 39.29 y 45.23 tras el escaldado (45.23 ± 1.79 con vapor; 39.29 ± 2.35 con agua; 41.95 ± 1.96 con agua con 1 % de ácido cítrico y 39.88 ± 1.81 con agua con 5 % de ácido cítrico). Durante el almacenamiento en congelación, se aprecian ligeras variaciones en la luminosidad en las muestras sometidas a los diferentes tipos de escaldado (Figura 30). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 128 Tabla 17. Luminosidad (L*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. luminosidad (L*) Nº muestreo vapor (2 min) agua (2 min) agua + 1 % ác. cítrico (1 min) agua + 5 % ác. cítrico (1 min) 048.32 ± 1.81 48.32 ± 1.81 48.32 ± 1.81 48.32 ± 1.81 145.23 ± 1.79 39.29 ± 2.35 41.95 ± 1.96 39.88 ± 1.81 242.76 ± 1.38 43.96 ± 4.54 44.06 ± 1.12 38.28 ± 4.90 341.77 ± 3.17 41.87 ± 0.79 42.41 ± 2.44 38.21 ± 1.16 442.10 ± 2.13 45.01 ± 7.21 39.48 ± 1.51 37.96 ± 1.37 542.30 ± 1.35 45.20 ± 8.58 38.29 ± 3.15 43.39 ± 3.17 640.41 ± 0.90 45.48 ± 1.64 43.19 ± 4.13 42.80 ± 5.68 742.17 ± 2.39 44.08 ± 1.04 40.60 ± 2.56 38.16 ± 3.23 841.71 ± 1.39 41.33 ± 1.10 43.36 ± 2.31 39.44 ± 2.21 Promedio ± desviación estándar (n=2). 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo L* vapor, 2 min. agua, 2 min. agua con 1 % de ácido cítrico, 1 min. agua con 5 % de ácido cítrico, 1 min. Figura 30. Evolución de la luminosidad (L*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 129 Cromaticidad (C*) En la Tabla 18 se observa que se produce un aumento de la cromaticidad (C*), desde un valor de 26.73 ± 2.82 para el producto fresco, hasta valores entre 29.51 y 34.38 tras el escaldado (34.38 ± 2.16 con vapor; 29.51 ± 3.50 con agua; 34.34 ± 2.76 con agua con 1 % de ácido cítrico y 31.18 ± 4.46 con agua con 5 % de ácido cítrico). Durante el almacenamiento en congelación, se aprecian ligeras variaciones en la cromaticidad (C*) para los 4 tipos de muestras (Figura 31). Tabla 18. Cromaticidad (C*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. cromaticidad (C*) Nº muestreo vapor (2 min) agua (2 min) agua + 1 % ác. cítrico (1 min) agua + 5 % ác. cítrico (1 min) 026.73 ± 2.82 26.73 ± 2.82 26.73 ± 2.82 26.73 ± 2.82 134.38 ± 2.16 29.51 ± 3.50 34.34 ± 2.76 31.18 ± 4.46 234.09 ± 4.74 41.72 ± 5.80 38.75 ± 5.39 28.95 ± 5.42 334.98 ± 1.63 38.11 ± 3.41 37.25 ± 8.88 31.31 ± 2.38 435.74 ± 2.24 42.03 ± 10.06 32.98 ± 2.88 34.17 ± 4.27 533.37 ± 3.03 40.83 ± 12.70 30.15 ± 7.37 41.17 ± 5.70 631.72± 5.25 42.33 ± 1.97 36.41 ± 7.79 36.45 ± 8.22 733.47 ± 2.91 42.75 ± 2.33 35.32 ± 3.80 31.57 ± 6.35 834.66 ± 3.00 39.94 ± 2.47 37.20 ± 0.58 30.25 ± 4.97 Promedio ± desviación estándar (n=2). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 130 0 10 20 30 40 50 60 012345678 Nº de muestreo C* vapor, 2 min. agua, 2 min. agua con 1 % de ácido cítrico, 1 min. agua con 5 % de ácido cítrico, 1 min. Figura 31. Evolución de la cromaticidad (C*) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. Tono (Hº) El valor promedio para el tono (Hº) del grelo fresco, fue de 108.80 ± 1.01º. Este valor se incrementó a 110.50 ± 0.71º tras el escaldado con agua durante 2 min y a 112.41 ± 2.42º tras el escaldado con vapor. En contraste, este parámetro disminuyó a 97.38 ± 3.77º tras el escaldado en agua con 1 % de ácido cítrico y a 91.54 ± 7.88º tras el escaldado en agua con 5 % de ácido cítrico (Tabla 19). Uno de los inconvenientes de los tratamientos térmicos en los productos vegetales verdes, es que se produzca la transformación de clorofilas a feofitinas. Los factores que influyen principalmente en dicha transformación, son el tipo de tratamiento térmico, la temperatura y duración del mismo, así como el pH del medio (Schwartz y Lorenzo, 1991). Así, los tratamientos térmicos a temperaturas elevadas durante tiempos cortos, mantienen mejor el color verde, que los tratamientos a temperaturas más bajas durante tiempos largos (Canjura y col., 1991; López y col., 1994). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 131 En este estudio, no se han encontrado diferencias entre el tono de las muestras escaldadas a vapor y con agua, ya que no se observaron prácticamente cambios en el color, respecto al producto fresco. Teng y Chen (1999) encontraron que el escaldado con agua aplicado a la espinaca causó una mayor degradación de la clorofila que el escaldado con vapor. La adición de ácido cítrico al agua de escaldado, aumenta la sensibilidad al calor de los sistemas enzimáticos permitiendo disminuir la duración del escaldado, lo cual, a la vez, disminuye el pH (Figura 27) pero presenta un efecto desfavorable sobre el color al favorecer la transformación de clorofila en feofitina (Belitz y Grosch, 1997; Canjura y col., 1991; Lin y Schyvens, 1995; López-Ayerra y col., 1998; Canet y Alvarez, 2000; Lau y col., 2000; Ahmed y col., 2002). En este trabajo se observa como la acidificación del agua de escaldado provoca una variación del tono verde brillante a marrón oliva (Figura 32). Tabla 19. Tono (Hº) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. tono (Hº) Nº muestreo vapor (2 min) agua (2 min) agua + 1 % ác. cítrico (1 min) agua + 5 % ác. cítrico (1 min) 0108.80 ± 1.01 108.80 ± 1.01 108.80 ± 1.01 108.80 ± 1.01 1112.41 ± 2.42 110.50 ± 0.71 97.38 ± 3.77 91.54 ± 7.88 2111.03 ± 2.09 107.88 ± 3.23 94.77 ± 0.77 89.35 ± 4.84 3110.55 ± 1.11 110.24 ± 0.84 95.01 ± 8.76 84.43 ± 5.66 4111.58 ± 2.65 110.07 ± 4.06 107.75 ± 1.42 91.88 ± 9.80 5113.54 ± 0.70 107.80 ± 3.74 96.83 ± 13.15 93.12 ± 13.39 6111.45 ± 0.72 109.34 ± 2.14 97.44 ± 9.78 94.00 ± 12.42 7112.18 ± 2.94 111.13 ± 0.93 107.64 ± 2.95 85.58 ± 7.49 8115.06 ± 0.56 111.32 ± 1.93 102.95 ± 12.67 84.46 ± 12.13 Promedio ± desviación estándar (n=2). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 132 Durante el almacenamiento en congelación, solo se observaron ligeras variaciones en el tono (Hº) para los grelos escaldados con vapor y con agua. Sin embargo, estas variaciones fueron más notables para los grelos escaldados con agua y adicionados con 1 y 5 % de ácido cítrico (Figura 32). López y col. (1994) estudiaron la degradación de la clorofila durante el almacenamiento de guisantes y espinacas y concluyeron que la congelación a -30 ºC era el método más idóneo para preservar el color verde, ya que en el transcurso de 50 días de almacenamiento en congelación, la concentración de clorofilas sólo se redujo en un 13 %, para el caso de las espinacas y en un 6 %, para el caso de los guisantes. De forma similar, López-Ayerra y col. (1998) encontraron que el contenido de clorofilas disminuyó alrededor de un 16 % en espinaca almacenada en congelación. 0 20 40 60 80 100 120 140 012345678 Nº de muestreo Hº vapor, 2 min. agua, 2 min. agua con 1 % de ácido cítrico, 1 min. agua con 5 % de ácido cítrico, 1 min. Figura 32. Evolución del tono (Hº) en grelo fresco y expuesto a 4 métodos de escaldado. En conclusión, se determinó que el vapor durante 2 min, es el mejor método para escaldar los grelos antes de su congelación, ya que se reducen las pérdidas de vitamina C, y se mantiene el color y el contenido de humedad similar al producto en fresco. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 133 Asimismo, se observó que el almacenamiento en congelación solo produce ligeras variaciones en los parámetros fisicoquímicos, hasta el momento, analizados. 4.1.1.2. Optimización del proceso a nivel planta piloto El equipo utilizado para el escaldado, a nivel planta piloto, se describe con mayor detalle en el apartado 3.2.2. de la sección de “material y métodos”. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el laboratorio, respecto a que el vapor era el mejor método para escaldar el grelo, se decidió utilizar este método, a nivel planta piloto. Se pesaron lotes de grelo de 2 kg y se les aplicaron tiempos de escaldado de 1.0, 1.5 y 2.0 min. Tras el enfriamiento con agua, durante 5 min, se realizó a cada lote la prueba cualitativa de la actividad de la peroxidasa, cuyos resultados se recogen en la Tabla 20. Tabla 20. Resultados de la prueba de actividad de la peroxidasa. Tiempo Prueba de actividad de la peroxidasa 1.0 min 1.5 min 2.0 min Positiva Positiva Negativa Estos resultados confirman lo comprobado a nivel de laboratorio, ya que los tiempos de escaldado de 1 min y 1.5 min, no son suficientes para inactivar la peroxidasa, por lo tanto, el tiempo de escaldado de 2 min, bajo las condiciones descritas anteriormente, es el que se elige para realizar este proceso en los grelos, ya que es el menor tiempo requerido para que se inactive la enzima (García, 2005). 4.1.2. Cocción La demanda de alimentos procesados se ha incrementado enormemente con el crecimiento de la población en núcleos urbanos. Esto no se ha debido a la escasez de productos frescos, sino más bien, a un cambio completo del estilo de vida (Holdsworth, Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 134 1987; Conning, 1992). Asimismo, ha aumentado la utilización de platos preparados, por su comodidad y porque en la sociedad actual cada vez se dispone de menos tiempo para complejas preparaciones culinarias (Holdsworth, 1987; Lyon y Churchill, 1992). Por estas tendencias actuales que se dan en el comportamiento de los consumidores, se ha llevado a cabo la congelación de grelos, ya cocinados, que solo necesitan una mínima preparación en el hogar. Esta etapa del proceso se realizó en el equipo que se describe, con mayor detalle, en el apartado 3.1.6. de la sección de “material y métodos”.El proceso de cocción se ha llevado a cabo manteniendo constante la relación peso de producto/agua a 1 kg de producto/2 L de agua. Se han ensayado 5 tiempos de cocción: 45, 50, 60, 75 y 90 min, contados a partir del momento en que el agua con el producto comienza a hervir. La elección del tiempo de cocción adecuado, se realizó en base a tres índices de calidad: color, grado de cocción o dureza y sensación de humedad en la boca. De este modo, atendiendo al parámetro de color, se rechazaron los grelos sometidos a los tratamientos térmicos de 75 y 90 min de duración, ya que presentaban una coloración parda muy poco atractiva, que reflejaba un tratamiento térmico demasiado intenso. En lo que respecta a las muestras cocidas durante 45, 50 y 60 min no se apreciaron diferencias importantes en cuanto a su color. Prestando atención al parámetro de grado de cocción o dureza, se consideraron no aptas las muestras tratadas durante 60, 75 y 90 min por apreciar que presentaban un grado de cocción excesivo. Entre los tiempos de 45 y 50 min, se opta por el primero, ya que se considera que es tiempo suficiente para la cocción, teniendo en cuenta que la preparación posterior en el hogar puede prolongarse en el caso de que resulte insuficiente para el consumidor. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 135 En cuanto a la sensación de humedad en la boca, no se han encontrado importantes diferencias entre las muestras. Teniendo en cuenta, los 3 índices de calidad evaluados, se considera que el tiempo de cocción óptimo es el de 45 min, bajo las condiciones descritas anteriormente. 4.1.3. Escurrido Para esta etapa del proceso, fue necesario diseñar dos equipos, uno fue el equipo de prensado y, otro, el equipo de centrifugado, los cuales se detallan en los apartados 3.2.3. y 3.2.4., respectivamente, de la sección de “material y métodos” (Viña, 2004). 4.1.3.1. Prensado Se han ensayado presiones de 1, 2 y 3 bar. Para conocer la presión y la fuerza ejercida en las cubetas de prensado se tiene en cuenta: ccpcpbb cpb nAPAP FF   Siendo: Fb: fuerza aplicada por el cilindro neumático. Fcp: fuerza realizada por las cubetas de prensado. Pb: presión ejercida por el cilindro neumático. Ab:área total del cilindro: Pcp: presión ejercida por las cubetas de prensado. Acp: área de una cubeta de prensado: nc: número de cubetas. En todos los ensayos nc = 2.   2 2 27.28 4 6cm cm Ab      2 117913 cmcmcmAcp  Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 136 De este modo, los resultados obtenidos se observan en la Tabla 21. Tabla 21. Valores de presión (P) y fuerza (F) ejercidos en las cubetas en función de la presión de trabajo PbaPcpa(Fcubetas = Pcp ×Acp)b 1 2 3 0.12 0.24 0.36 14.04 28.08 42.12 bar a; kg b La elección de la presión más adecuada, para llevar a cabo los ensayos, se ha realizado en base a 3 índices de calidad: volumen ocupado, comodidad de embalaje y aspecto final. Como no existen diferencias en el aspecto final del producto, en función de la presión aplicada, se considera que la óptima, en las condiciones de utilización del equipo, es 3 bar. A esta presión, el volumen de la muestra es menor, lo cual a su vez implica una mayor comodidad en el embalaje (García, 2005). 4.1.3.2. Centrifugado Se han ensayado valores de frecuencia de 10, 20 y 30 Hz. Para conocer la velocidad de giro del tambor se tiene en cuenta: Siendo: np: velocidad de giro de la polea. f: frecuencia a la que se alimenta el motor.   ttpp p nn s p f n     1 60 Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 239 escaldadas y cocidas. Y ello se atribuye a la mayor extractibilidad de los pigmentos tras la exposición al calor. Se cree que el calentamiento dispara la ruptura de la pared celular facilitando la liberación de los pigmentos (Schoefs, 2002). Además, los carotenoides son compuestos estables frente a tratamientos térmicos, tal y como indican Lin y Chen (2005), siendo un posible factor de la estabilidad térmica de estos compuestos el hecho de estar disueltos en compuestos lipídicos que los protegen de la acción del calor (Camacho y col., 2004). En cuanto a los carotenoides provitamina A, en este estudio solo se determinó el contenido de -caroteno debido a que fue el que se encontraba en mayor concentración en el grelo (Mataix y col., 2003). Se ha tomado como base el factor de conversión adoptado por el Instituto de Medicina (IOM, 2001), el cual asume que una sexta parte del contenido de carotenoides totales es absorbido dentro de la mucosa y que la mitad del -caroteno absorbido es convertido a retinol. En base a este criterio se determinó la actividad de la vitamina A en las muestras y se obtuvo un valor de 1433 µg eq. de retinol/100 g en el grelo fresco. Tras el escaldado se incrementó a 1628 µg eq. de retinol/100 g y tras la cocción el incremento fue superior (2376 µg eq. de retinol/100 g). Los valores obtenidos en el grelo fresco son comparables a los indicados en diferentes referencias bibliográficas, (Mataix y col., 2003; http://www.sehlelha.org/busalimento.aspx, 30/10/2005; http://perso. wanadoo.es/conservaslou/p44.html, 06/01/2006), pudiéndose clasificar al grelo como uno de los vegetales ricos en contenido de vitamina A (Mataix y Aranceta, 2002; Mataix y col., 2003). Durante el almacenamiento en congelación, existen diferencias estadísticamente significativas a lo largo del tiempo (Tablas 37 y 38). En el grelo escaldado se observa un comportamiento estable hasta el 4º muestreo, a partir del cual se inicia una tendencia ascendente, resultado similar al indicado por Lisiewska y col. (2004). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 240 Figura 93. Evolución del -caroteno en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación. Clorofila a y clorofila b El contenido en clorofila a en el grelo fresco fue de 60.19 ± 1.74 mg/100 g, en el grelo tras el escaldado de 46.58 ± 0.03 mg/100 g y en el grelo tras la cocción de 6.49 ± 0.40 mg/100 g (Tabla 48). Existen diferencias estadísticamente significativas para ambas muestras tras los tratamientos térmicos (Tablas 39 y 40). Con respecto a la clorofila b, se obtuvieron valores en el grelo fresco de 20.54 ± 0.10 mg/100 g, en el grelo tras el escaldado de 18.50 ± 0.08 mg/100 g y en el grelo tras la cocción de 9.65 ± 0.27 mg/100 g (Tabla 48). Al aplicar el test t-Student se comprueba que existen diferencias significativas entre el valor inicial y los obtenidos tras aplicar ambos tratamientos térmicos, para ambas muestras. Kidmose y col. (2005) señalan que el escaldado a vapor afecta significativamente el contenido de clorofila a puesto que hay una disminución proporcional al tiempo de escaldado. 0 4 8 12 16 20 24 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo mg/100 g grelo escaldado grelo cocido Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 241 Los valores de clorofila a y clorofila b encontrados en el grelo fresco, coinciden con los señalados por Krumbein y col. (2005), determinados en varios cultivares de brassicas (B. juncea, B. rapa subsp. nipposinica var. chinoleifera, B. rapa subsp. chinensis y B. rapa subsp. rapa). El “grado de verdor” de los vegetales verdes atribuido a las clorofilas, es importante para determinar la calidad final de este tipo de vegetales (Nisha y col., 2004) ya que el color es uno de los principales indicadores de calidad en los productos vegetales (Teng y Chen, 1999; Tan y col., 2000; Tijkskens y col., 2001). Las clorofilas son fácilmente degradadas durante el procesado de los vegetales (Boekel, 1999), ya que son susceptibles de sufrir cambios químicos y físicos durante dicho procesado (Teng y Chen, 1999; Rehman y col., 2003; Zhang y Hamauzu, 2004). Así, los vegetales verdes procesados térmicamente muestran variaciones en el color respecto a los vegetales frescos. Los cambios de color en estos productos se deben a la conversión de clorofilas en feofitinas a través de la sustitución del magnesio de la clorofila por el hidrógeno (Canjura y col., 1991; Heaton y Marangoni, 1996; Lau y col., 2000; Ahmed y col., 2002). Los compuestos de clorofila desempeñan ciertas funciones biológicas que son efectivas mientras la clorofila conserve la estructura del anillo de porfirina básica, de esta forma la presencia de las clorofilas y sus productos de transformación contribuyen a dar un valor añadido a los productos vegetales (Minguez-Mosqueda y col., 2002). Recientemente, se ha demostrado que la clorofila y sus derivados presentan una relación importante con la salud promoviendo funciones tales como actividades antimutagénicas y anticarcinogénicas (Yoshikawa y col., 1996; Negishi y col., 1997; Chernomorsky y col., 1999; Higashi-Okai y col., 1999; Ma y Dolphin, 1999; Morita y col., 2001). En este estudio, se observó que existe mayor cantidad de clorofila a, que de clorofila b en el grelo fresco, ya que la relación que se mantiene entre ellas es de 3:1, aproximadamente; resultados coincidentes con lo indicado por diferentes autores en vegetales verdes (Khachik y col., 1986; Belitz y Grosch, 1997; Lisiewska y col., 2004). Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 242 Las pérdidas por escaldado fueron del 23.7 % para la clorofila a y del 9.9 % para la clorofila b, en cambio, con la cocción, las pérdidas fueron del 89.2 % para la clorofila a y del 53.0 % para la clorofila b. Es evidente que la cocción es el tratamiento que más pérdidas produjo a nivel de clorofilas y que es la clorofila a la más sensible, debido a su mayor labilidad, lo cual aumenta su susceptibilidad a transformarse en su respectiva feofitina, durante el calentamiento, como ya ha sido señalado anteriormente (LópezAyerra y col., 1998; Teng y Chen (1999); Tan y col., 2000; Tenorio y col., 2004; Turkmen y col., 2006). Tabla 48. Clorofila a y clorofila b en grelo escaldado y grelo cocido. clorofila aaclorofila ba Nº muestreo grelo escaldado grelo cocido grelo escaldado grelo cocido 060.19 ± 1.74 60.19 ± 1.74 20.54 ± 0.10 20.54 ± 0.10 146.58 ± 0.03 6.49 ± 0.40 18.50 ± 0.08 9.65 ± 0.27 253.37 ± 0.72 6.00 ± 0.73 22.97 ± 0.83 8.40 ± 0.28 348.20 ± 1.39 5.24 ± 0.31 19.84 ± 0.40 7.84 ± 0.08 446.61 ± 1.51 5.98 ± 0.28 20.12 ± 0.25 9.93 ± 0.27 553.12 ± 1.93 5.48 ± 0.11 21.28 ± 0.56 6.86 ±0.44 655.00 ± 0.19 5.66 ± 0.33 25.33 ± 0.75 8.45 ± 0.10 739.36 ± 1.62 4.43 ± 0.16 17.98 ± 0.66 5.82 ± 0.28 850.23 ± 1.54 3.57 ± 0.01 27.46 ± 0.40 4.13 ± 0.01 Promedio ± desviación estándar (n=4); a mg/100 g de materia fresca Para ambos tipos de muestras (grelo cocido y grelo escaldado), durante el almacenamiento en congelación, existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido en clorofila a y en clorofila b (Tablas 37 y 38). En el caso del grelo cocido, las clorofilas a y b van disminuyendo de forma progresiva, aunque ligera, y en el caso del grelo escaldado existen fluctuaciones de ambas clorofilas con respecto al valor inicial. Lisiewska y col. (2004) indican que el almacenamiento a temperatura de congelación en Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 243 vegetales escaldados, presenta un efecto beneficioso ya que se mantiene el contenido de ambas clorofilas (Figuras 94 y 95). Figura 94. Evolución de la clorofila a en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo mg/100 g grelo escaldado grelo cocido Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 244 Figura 95. Evolución de la clorofila b en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación. Feofitina a y feofitina b El grelo en estado fresco contiene 1.81 ± 0.73 mg de feofitina a /100 g. Este valor se incrementa tras el escaldado hasta 4.26 ± 0.34 mg/100 g, aunque el incremento mas notable se da tras la cocción, hasta 33.40 ± 0.99 mg/ 100 g (Tabla 49). De hecho, al aplicar el test t-Student, sólo existen diferencias estadísticamente significativas entre el grelo cocido respecto al fresco (Tablas 39 y 40). En cuanto a la feofitina b, el grelo en estado fresco contiene 0.39 ± 0.03 mg/100 g, este valor se incrementa tras el escaldado hasta 1.00 ± 0.21 mg/100 g, aunque el incremento mas notable, al igual que con la feofitina a, se da tras la cocción, hasta 7.84 ± 0.61 mg/ 100 g. (Tabla 49). Este comportamiento es semejante desde el punto de vista estadístico al de la feofitina a, ya que solo hay diferencias significativas entre el grelo cocido y el fresco (Tablas 39 y 40). 0 10 20 30 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo mg/100 g grelo escaldado grelo cocido Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 245 Tabla 49. Feofitina a y feofitina b en grelo escaldado y grelo cocido. feofitina aafeofitina ba Nº muestreo grelo escaldado grelo cocido grelo escaldado grelo cocido 01.81 ± 0.73 1.81 ± 0.73 0.39 ± 0.03 0.39 ± 0.03 14.26 ± 0.34 33.40 ± 0.99 1.00 ± 0.21 7.84 ± 0.61 24.64 ± 0.08 31.23 ± 1.45 1.49 ± 0.05 7.05 ± 0.47 33.58 ± 0.06 29.18 ± 0.38 1.15 ± 0.05 8.06 ± 0.12 44.85 ± 0.31 36.01 ± 0.62 1.29 ± 0.06 9.72 ± 0.34 55.92 ± 0.18 34.64 ±0.26 2.01 ± 0.10 7.19 ±0.06 65.64 ± 0.20 34.44 ± 0.19 1.97 ± 0.26 7.52 ± 0.13 74.20 ± 0.47 25.38 ± 0.02 1.10 ± 0.06 4.84 ± 0.01 85.91 ± 0.20 19.10 ± 0.03 1.70 ± 0.04 3.13 ± 0.00 Promedio ± desviación estándar (n=4); a mg/100 g de materia fresca. El incremento en el contenido de feofitinas a y b, tras la aplicación de los tratamientos térmicos en grelo, son lógicos debido a la formación de estos compuestos por efecto de la degradación de las clorofilas en presencia de calor, siendo más notable en el grelo cocido, a causa de la duración del tratamiento. La reducción en los contenidos iniciales de clorofila a y clorofila b, analizados anteriormente, se deben a la degradación de ambas clorofilas en sus feofitinas respectivas, feofitina a y feofitina b (Schwartz y Elbe, 1983; Mangos y Berger, 1997; Boekel, 1999). En el grelo sometido a cocción, las cantidades de feofitina a fueron más elevadas que las de la feofitina b, con respecto al grelo sometido a escaldado, y esto tiene relación con el grado de tratamiento térmico aplicado, lo que se corresponde con los cambios producidos en el color desde un verde brillante inicial a un verde oliva opaco. Kidmose y Hansen (1999) señalaron que existe una buena correlación entre el color y el contenido de clorofilas en brócoli cocinado y almacenado, lo cual está en concordancia con los resultados obtenidos en el presente trabajo. Teng y Chen (1999) y De La Cruz-García y col. (1997) han encontrado la máxima concentración de feofitina en espinacas y judías verdes tras la cocción. Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 246 El contenido de feofitina a fue mayor que el de feofitina b, tanto en las muestras escaldadas, como en las cocidas, lo cual está de acuerdo con resultados previamente citados (Schwartz y Elbe, 1983; Khachick y col., 1986; Schwartz y Lorenzo, 1991; López-Ayerra y col., 1998). Aún cuando a lo largo del almacenamiento en congelación, existen diferencias estadísticamente significativas para ambos tipos de muestras, existen menos fluctuaciones en el contenido en feofitina a y b en el grelo escaldado (Figura 96 y 97). Figura 96. Evolución de la feofitina a en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación. 0 10 20 30 40 50 60 012345678 Nº de muestreo mg/100 g grelo escaldado grelo cocido Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 247 Figura 97. Evolución de la feofitina b en grelo escaldado y grelo cocido durante el almacenamiento a temperatura de congelación. Las concentraciones de -caroteno y luteína se analizaron mediante la correlación de Pearson, obteniendo un r=0.883 (p=0.002). Asimismo, las concentraciones de clorofila a y clorofila b, se correlacionaron altamente entre sí (r=0.961, p=0.000), lo cual sugiere que sus niveles pueden aumentarse simultáneamente, datos coincidentes con Mou (2005). Las altas correlaciones obtenidas entre los parámetros de color (Hº y a*/b*) y las concentraciones de clorofila a (r=0.967, p=0.000; r=-0.966, p=0.000); clorofila b (r=0.950, p=0.000; r=-0.949, p=0.000); feofitina a (r=-0.945, p=0.000; r=0.944, p=0.000) y feofitina b (r=-0.883, p=0.000; r=0.882, p=0.000) confirman que el contenido de clorofilas puede ser determinado indirectamente a través de la medición del color (Kidmose y Hansen, 1999). 0 4 8 12 16 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nº de muestreo mg/100 g grelo escaldado grelo cocido Resultados y discusión ________________________________________________________________________ 248 4.4.2.9. Cenizas El contenido en cenizas del grelo fresco fue de 1.26 ± 0.02 %. Este valor disminuyó considerablemente tras el proceso de escaldado, 0.79 ± 0.01 y tras la cocción, 0.59 ± 0.01 (Tabla 50), encontrando estos descensos estadísticamente significativos tras la aplicación del test t-Student (Tablas 39 y 40). La disminución ocurrida tras el tratamiento térmico de cocción es debida al método empleado (ebullición en agua). Por otro lado, la disminución ocurrida en el caso del grelo escaldado probablemente se debe, no al propio sistema de escaldado, sino al método de enfriado con agua (apartado 4.2) (Odland y Eheart, 1975). Se observan diferencias con lo ocurrido en los primeros ensayos (MondragónPortocarrero y col., 2006) debido a que el sistema de enfriamiento utilizado en el laboratorio era mediante hielo, lo cual no provocó pérdidas significativas. Durante el almacenamiento en congelación, existen ligeras fluctuaciones estadísticamente significativas a lo largo del tiempo en ambos tipos de muestra. Autores como Canet-Parreño (2000) indican que no existen diferencias en los productos vegetales congelados a lo largo del almacenamiento. Tabla 50. Cenizas y proteína en grelo escaldado y grelo cocido. cenizasaproteínaa Nº muestreo grelo escaldado grelo cocido grelo escaldado grelo cocido 01.26 ± 0.02 1.26 ± 0.02 2.79 ± 0.00 2.79 ± 0.00 10.79 ± 0.01 0.59 ± 0.01 2.41 ± 0.00 2.85 ± 0.00 20.71 ± 0.01 0.35 ± 0.03 2.50 ± 0.00 2.81 ± 0.00 30.67 ± 0.06 0.29 ± 0.03 2.34 ± 0.00 2.84 ± 0.00 40.72 ± 0.03 0.44 ± 0.04 2.36 ± 0.00 2.69 ± 0.00 50.92 ± 0.00 0.51 ± 0.02 2.52 ± 0.00 2.89 ± 0.00 60.92 ± 0.01 0.49 ± 0.01 2.75 ± 0.00 2.75 ± 0.00 70.76 ± 0.00 0.38 ± 0.00 2.82 ± 0.00 2.56 ± 0.00 80.93 ± 0.01 0.50 ± 0.00 2.78 ± 0.00 2.84 ± 0.00 Promedio ± desviación estándar (n=2); a %. CONCLUSIONES Conclusiones _______________________________________________________________________________ 257 CONCLUSIONES 1. Los tratamientos óptimos para el escaldado y cocción de los grelos (Brassica rapa, L.), son el de vapor durante 2 min, y la cocción en agua durante 45 min, respectivamente, bajo las condiciones ensayadas en este estudio. 2. El prensado resulta el sistema de escurrido más efectivo. Ya que las muestras prensadas presentan un porcentaje de humedad menor que sometidas a centrifugación. 3. Las técnicas analíticas propuestas para la extracción y cuantificación de vitaminas (ácido ascórbico, ácido dehidroascórbico, tiamina y riboflavina) y pigmentos (carotenoides, clorofilas y feofitinas), mediante HPLC, son válidas para obtener resultados satisfactorios, ya que cumplen con los parámetros de linealidad, precisión, exactitud y límites de detección establecidos. Asimismo, los métodos cromatográficos son adecuados puesto que desarrollan una separación definida, eficiente y libre de interferencias. 4. La peroxidasa es el indicador enzimático más adecuado para determinar la idoneidad del tratamiento de escaldado aplicado al grelo. 5. Se ha encontrado una influencia clara del tratamiento térmico aplicado (escaldado o cocido) sobre las características físico-químicas estudiadas en el grelo. La cocción provoca mayores pérdidas de acidez, cenizas, color, tiamina, riboflavina, ácido ascórbico, clorofilas, fenoles totales y actividad reductora que el escaldado. Sin embargo, los valores de luteína, β-caroteno y feofitinas, se incrementan tras la cocción. 6. El almacenamiento en congelación produce ligeras variaciones en los parámetros fisicoquímicos analizados. Conclusiones _______________________________________________________________________________ 258 7. La ausencia de Listeria monocytogenes y el bajo número de otras poblaciones bacterianas, como los aerobios mesófilos, demuestra que el procedimiento de industrialización implantado, así como la congelación, almacenamiento y posterior descongelación de las muestras de grelo, es adecuado desde el punto de vista microbiológico, por lo que el grelo escaldado y/o cocido, bajo las condiciones aplicadas en este estudio, puede considerarse apto para consumo humano. 8. Los grelos son un producto apto para la congelación, tanto escaldados como cocidos. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía ________________________________________________________________________ 261 BIBLIOGRAFÍA Adams, J.B., Harvey, A. y Dempsey, C.E. (1996). Regenerated and denaturated peroxidase as potential lipid oxidation catalysis. Food Chemistry. 57(4): 505-514. Adragna-Bourgeois, O. y Bourgeois, C.M. (2002). Valor nutricional de las hortalizas. En Tecnología de las hortalizas. Tirilly, Y. y Bourgeois, C.M. (Eds.). Ed. Acribia, S.A. Zaragoza, España. Agte, V.V., Tarwadi, K.V., Mengale, S. y Chiplonkar, S.A. (2000). Potencial of traditionally cooked green leafy vegetables as natural sources for supplementation of eight micronutrients in vegetarian diets. Journal of Food Composition and Analysis. 13: 885-891. Agte, V., Tarwadi, K., Mengale, S., Hinge, A. Y Chiplonkar, S. (2002). Vitamin profile of cooked foods: how healthy is the practice of ready-to-eat foods? 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