Análisis de diversidad y estructuración genética para la conservación de poblaciones de trucha común (Salmo trutta) en ríos Pirenaicos de Cataluña

Facultad de Veterinaria Beatriz Viso Salas Análisis de diversidad y estructuración genética para la conservación de poblaciones de trucha común (Salmo trutta) en ríos Pirenaicos de Cataluña Trabajo de Fin de Grado Grado en Veterinaria Año 2020-2021 Modalidad de Trabajo: Experimental RESUMEN La trucha común (Salmo trutta) es una especie piscícola de agua continental que habita en los ríos de la Península Ibérica. Esta especie tiene un alto valor como recurso genético, siendo importante su conservación. La Península Ibérica es un reservorio natural de esta especie. Debido a la repoblación con truchas domesticadas de origen centroeuropeo, en muchos ríos de la Península Ibérica existe un cierto grado de introgresión con las poblaciones autóctonas, ésta se mide, principalmente, mediante el uso de un marcador genético específico, el locus LDH-C*, que presenta alelos diagnóstico entre repobladores y poblaciones nativas ibéricas. Desde 1997, algunos ríos pirenaicos fueron designados como refugios genéticos para proteger la diversidad genética de esta especie. En estos ríos fue prohibida la repoblación con truchas de origen centroeuropeo, aunque se mantienen las actividades relacionadas con la pesca. Algunas localidades son analizadas cada dos o tres años para monitorizar el impacto de la introgresión, debida, en su mayor parte, a la repoblación en ríos cercanos no pertenecientes a refugios genéticos. Además, también se monitorea la diversidad y estructura genética de las diferentes poblaciones mediante marcadores moleculares, con el fin de detectar diferencias genéticas entre las poblaciones nativas. En total, 229 individuos pertenecientes a siete localizaciones muestrales (6 localidades en ríos pirenaicos y el Centro Piscícola Bagà, perteneciente a la Generalitat de Cataluña) fueron genotipados para 6 marcadores microsatélites y para el locus LDH-C*, analizando así la diversidad genética, la estructura poblacional y la introgresión causada por la repoblación. Los valores de diversidad genética fueron similares a los obtenidos en estudios anteriores realizados en esta zona y en otros ríos mediterráneos. Se encontraron diferencias significativas entre distintas cuencas, mientras que, entre localidades dentro de un mismo río las diferencias fueron mínimas, exceptuando el río Ter, en el cual se encuentra una población bastante introgresada, aumentando su diferenciación con respecto a las poblaciones nativas. En cuanto a la frecuencia del alelo LDH-C*90 resultó ser nula en el río Noguera Pallaresa y alcanzó sus valores máximos en una de las poblaciones analizadas en el río Ter, siendo esta la más introgresada. A partir de los resultados obtenidos, finalmente, se expone la situación actual de las truchas pirenaicas y métodos para mantener la diversidad genética en los refugios genéticos. Palabras clave: trucha común, conservación, impacto de la repoblación, refugios genéticos, loci microsatélites, locus LDH-C, diversidad genética, estructura poblacional, introgresión, frecuencia del alelo LDH-C*90. RESUMO A troita común (Salmo trutta) é una especie de auga continental que habita nos ríos da Penísula Ibérica. Esta especie ten un alto valor como recurso xenético, sendo importante a súa conservación. A Península Ibérica é un reservorio natural desta especie. Por mor da repoboación con troitas de orixe centroeuropea, en moitos ríos da Península Ibérica existe un certo grao de introgresión, ésta mídese, principalmente, mediante o uso dun marcador específico, o locus LDH-C*, o cal presenta alelos diagnóstico entre repoboadores e poboacións nativas ibéricas. Dende 1997, algúns ríos pirenaicos foron designados como refuxios xenéticos, para protexer a diversidade xenética desta especie. Nestos ríos, foi prohibida a repoboación con troitas de orixe centroeuropea, aínda que se manteñen as actividades relacionadas coa pesca. Algunhas destas localidades son analizadas cada dous ou tres anos para monitorizar o impacto da introgresión, debida, na súa maior parte, á repoboación en ríos cercanos non pertencentes a refuxios xenéticos. Ademáis, tamén se monitorea a diversidade xenética e estructura das diferentes poboacións, á fin de detectar diferenzas xenéticas entre as poboacións nativas. En total, 229 individuos pertencentes a sete localizacións (6 localidades en ríos pirenaicos e mailo Centro Piscícola Bagà, pertencente á Generalitat de Cataluña) foron xenotipados para 6 marcadores microsatélites e para o locus LDH-C*, analizando así a diversidade xenética, a estrutura poboacional e a introgresión causada pola repoboación. Os valores de diversidade xenética foron similares aos obtidos en estudios anteriores realizados nesta zona e noutros ríos mediterráneos. Atopáronse diferenzas significativas entre distintas concas, mentres que, entre localidades dentro do mesmo río as diferenzas foron mínimas, exceptuando o río Ter, no cal atópase una poboación bastante introgresada, aumentando a súa diferenzación con respecto ás poboación nativas. En canto a frecuencia do alelo LDH-C90* resultou ser nula no río Noguera Pallaresa e alcanzou os seus valores máximos nunha das poboacións analizadas no río Ter, sendo ésta a máis introgresada. Finalmente, exponse a situación actual das troitas pirenaicas e métodos para manter a diversidade xenética nos refuxios xenéticos. Palabras clave: troita común, conservación, impacto da repoboación, refuxios xenéticos, loci microsatélites, locus LDH-C, diversidade xenética, estrutura poboacional, introgresión, frecuencia do alelo LDH-C90*. ABSTRACT The brown trout (Salmo trutta) is a freshwater species, that lives in the rivers of de Iberian Península. This species has an important value as a genetic resource, being its conservation important. The Iberian Peninsula is a natural reservoir for this species. Due to the restocking with Central European origin trout, in many rivers of the Iberian Peninsula there is a certain degree of introgression, which is measured mainly through the use of a specific marker, the LDH-C locus, which presents diagnostic alleles between stocks and native populations. Since 1997, some Pyrenean rivers have been designed as genetic refuges to protect the genetic diversity of this species. Restocking with Central European origin trout was prohibited in these rivers, although activities related to fishing continue. Some localities from these refuges are analysed every two or three years to monitor the introgression impact, mainly, due to restocking in nearby rivers that do not belong to genetic refugees. Moreover, the genetic diversity and population structure is also monitored, in order to detect genetic differences between the native populations. In total, 229 individuals belonging to seven sites (six locations from Pyrenean rivers and the Bagà hatchery, from Generalitat de Cataluña) were genotyped for six microsatellite markers and for the LDH-C* locus, thus analyzing genetic diversity, population structure and introgression caused by restocking. The genetic diversity values were similar to those obtained on previous studies found at this region and other Mediterranean rivers. Significative genetic differences between rivers were found, while, the differences between localities within rivers were lower, except within Ter river, where a high introgressed population was found, increasing its differentiation from native populations. The frequency of the LDH-C90* allele (which suggests stocking activities) was null in Noguera Pallaresa river and its maximum value was reached in a population from Ter river. Finally, the current status of Pyrenean brown trout is exposed and some methods to keep the genetic diversity at the genetic refuges are defined. Key words: Brown trout, conservation, stocking impact, genetic refugees, microsatellite markers, LDH-C locus, genetic diversity, population structure, introgression, allele LDH-C90* frecuency. ÍNDICE 1. Introducción 1.1. Trucha común (Salmo trutta) 1.1.1. Factores que afectan a las poblaciones de trucha 1.2. Marcadores moleculares 1.2.1. Loci microsatélites 2. Objetivos del Trabajo de Fin de Grado (TFG) 3. Material y métodos 3.1. Material biológico 3.2. Extracción de ADN 3.3. Análisis de loci microsatélites 3.4. Amplificación de loci microsatélites mediante PCR multiplex 3.5. Genotipado en secuenciador automático 3.6. Análisis del locus LDH-C* 3.6.1. Genotipado del locus LDH-C* en gel de agarosa 3.7. Estimadores de diversidad genética 3.7.1. Riqueza alélica (RA) 3.7.2. Heterocigosis observaba (Ho) y heterocigosis esperada (He) 3.7.3. Coeficiente de consanguinidad 3.8. Equilibrio Hardy – Weinberg (H – W) 3.9. Análisis de estructura poblacional y diferenciación entre poblaciones 4. Resultados y discusión 4.1. Diversidad genética 4.2. Estructura genética 4.3. Estrategias de gestión y conservación 5. Conclusiones 6. Bibliografía Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 1 - 1. Introducción 1.1. Trucha común (Salmo trutta) La trucha común (Salmo trutta) es un pez de la familia Salmonidae, perteneciente al orden Salmoniformes. Es un pez de talla media que no suele superar los 100 cm de longitud y los 20 kg de peso. Posee dos aletas dorsales, la primera cuenta con un número de 9 a 11 radios ramificados y la otra es una aleta adiposa, próxima al extremo caudal. Las escamas que recubren su cuerpo son de muy pequeño tamaño y poseen entre 110 y 125 en la línea lateral. La coloración de estas es muy variable, pero normalmente poseen manchas negras o rojas oceladas por toda la superficie (Figura 1), a excepción de la aleta caudal (Kottelat y Freyhof, 2007). Figura 1. Imagen de un ejemplar de trucha común (Salmo trutta). Su alimentación consta de moluscos, invertebrados bentónicos, anfibios y otros peces de menor tamaño. A medida que aumentan su tamaño y pasan a adultos se convierten en ictiófagos (Hyatt, 1979; Hunter et al., 1991). En cuanto a su distribución natural, esta especie se extiende por Europa, el oeste de Asia, Atlántico noreste, Mar Báltico, Mar del Norte, Mar Mediterráneo, Mar Negro y Mar Caspio. A partir de 1863, por su interés para la pesca deportiva, fue introducida en numerosos sitios del mundo (Eschmeyer, 2010; Alonso et al., 2010). La trucha común es una especie ovípara, cuya reproducción es sexual y externa. El periodo de puesta se sitúa entre noviembre y enero. La puesta se deposita en la grava y el número de huevos oscila entre 1000 a 2000 por kg de peso. La incubación tiene una duración de 40 días. Esta especie alcanza la madurez sexual entre los 2 y 3 años de vida (Klemetsen et al., 2003). Existen dos formas de vida en relación con el comportamiento reproductivo de esta especie: la residente, que realiza todo su ciclo vital en el medio fluvial, y la anádroma o migratoria (trucha de mar o reo), que alcanza su madurez sexual en el medio marino para luego volver al río, Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 2 - preferentemente a la zona en la que nacieron (proceso conocido como homing), en la época de reproducción (Berg y Berg, 1987; Elliot, 1989). La forma anádroma se distribuye en los ríos de vertiente Atlántica, por encima del paralelo 42º N (Bouza et al., 1999), frente a la forma de vida residente en el área suratlántica ibérica y mediterránea. Además, las hembras son más frecuentemente anádromas, mientras que los machos siguen, con mayor frecuencia que las hembras, una estrategia de vida residente. Individuos anádromos y residentes pueden convivir y reproducirse entre ellos como parte de la misma población (Jonsson, 1989; Hindar et al., 1991; Gibson, 1993; Hansen et al., 2000). No hay una separación clara entre las historias de vida migratorias, así ejemplares de S. trutta previamente anádromos pueden adoptar posteriormente una historia de vida de agua dulce (Klemetsen et al., 2003). La península Ibérica representa un reservorio genético de trucha común (Suarez et al., 2001). La mayoría de las poblaciones en este territorio son fruto de complejas historias evolutivas y el contacto entre linajes antiguos y adaptaciones locales (Antunes et al., 2002, Sanz et al., 2002; Snoj et al., 2008; Vera et al., 2010a). Se han descrito hasta siete linajes matriarcales de trucha común mediante la utilización de ADN mitocondrial (ADNmt), distribuidos de manera geográfica a lo largo del rango de distribución natural de la especie. Estos siete linajes son el Adriático (AD), Atlántico (AT), Danubio (DA), Marmoratus (MA), Mediterráneo (ME), Tigris (TI) y Duero (DU) (Bernatchez, 2001; Susnik et al., 2005; Vera et al., 2010a; Cortey et al., 2010). Cuatro de estos linajes (ME, AD, AT y DU) están presentes en las poblaciones nativas de trucha común de la Península Ibérica (Suarez et al., 2001; Cortey et al., 2004, 2009; Vera et al., 2010a). Los linajes AT y DU se encuentran principalmente en los ríos atlánticos; mientras que ME y AD en los que desembocan al Mediterráneo. Hay evidencias que sugieren que el linaje DU podría ser un vestigio de una colonización ancestral, anterior al linaje AT, ahora más numeroso, y al ME y AD. Este linaje es endémico de la Península Ibérica, por lo que tiene un gran interés conservacionista (Vera et al., 2010a; Vera et al., 2015). Estos cuatro linajes colonizaron de forma natural la Península Ibérica y se distribuyeron siguiendo un complejo patrón resultante del aislamiento fruto de procesos de sequía que aíslan las diferentes cuencas hidrográficas, contactos secundarios con otros linajes y la reciente introducción de stocks foráneos (Sanz et al., 2006). Respecto a los ríos atlánticos, generalmente en los mediterráneos se observan mayores diferencias genéticas debidas al aislamiento de las poblaciones locales y a la distribución en mosaico de los linajes mayoritarios en esta zona (Cortey et al., 2004), aunque, rondando el límite de reo, la diferenciación en ríos atlánticos también es importante, ya que este representa un conector entre cuencas (Bouza et al., 1999). En los Pirineos se preservan las poblaciones mediterráneas más estables de trucha en la Península Ibérica (Almodovar et al., 2012). En este área, los bajos niveles Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 3 - de caudal durante el verano reducen el flujo genético entre las poblaciones, creciendo así las diferencias genéticas entre poblaciones vecinas (Cortey et al., 2004, Araguas et al., 2004, Vera et al., 2010b, Fernández-Cebrián et al., 2014). 1.1.1. Factores que afectan a las poblaciones de trucha Las amenazas a los ecosistemas fluviales, como el cambio climático, modificaciones en las cuencas, pérdida de hábitats y la transferencia de stocks de truchas de piscifactoría, las cuales se usaron para repoblaciones en ríos, están modificando los patrones estructurales de las poblaciones truchícolas de la Península Ibérica. Los ríos mediterráneos están más afectados por la variabilidad de las precipitaciones y, por tanto, del caudal debido a las grandes diferencias entre años húmedos y años de sequía (Trigo et al., 2004). El cambio climático podría llegar a impedir la conexión entre poblaciones, aumentando el aislamiento, lo que aumentaría el riesgo de extinción de poblaciones locales durante este siglo (Almodovar et al., 2012). Además, las truchas peninsulares han sufrido introgresión debida a la hibridación con stocks de origen centroeuropeo (García-Marín et al., 1999b; Aparicio et al., 2005; Almodovar et al., 2006; Vera et al., 2018), utilizados para aumentar las poblaciones en ríos para la pesca, debido a su valor socioeconómico. Algunos marcadores genéticos han servido para monitorizar el impacto genético de la liberación de estos stocks foráneos. Estos marcadores demostraron que las truchas foráneas se han reproducido exitosamente con las poblaciones nativas, existiendo niveles variables de hibridación, sobre todo, cuando los individuos no fueron estresados por la pesca tras su liberación (García-Marín et al., 1998). Entre ellos, el más utilizado ha sido el locus de la Lactato Deshidrogenasa C (LDH-C*), ya que el alelo LDH-C100* está fijado en las poblaciones nativas ibéricas, mientras que el alelo LDH-C90* está fijado en el caso de las poblaciones centroeuropeas, de las que proceden los stocks de los centros piscícolas ibéricos (Martinez et al., 1993) La introgresión tiende a ser mayor en localidades con aguas fértiles y descarga estable (Almodovar et al., 2006). Al contrario que en los ríos Atlánticos, en los mediterráneos se ha observado una introgresión significativa (García‐Marín et al., 1998; Sanz et al., 2000, 2002, 2006; Araguas et al., 2004). Se han descrito muchas consecuencias negativas, incluyendo la reducción de las poblaciones nativas y la pérdida de diversidad, lo que lleva, en algunos casos, al reemplazamiento total de las poblaciones nativas (Araguas et al., 2004, 2017; Sanz et al., 2006). En el este de los Pirineos, la zona de la cuál proceden las muestras del presente trabajo, se ha observado en algunos estudios una introgresión del 1% por año (Araguas et al., 2004). El porcentaje de introgresión genética a nivel general se ha estimado entre un 5% y un 10%, alcanzándose en España valores de hasta el 20% en algunas poblaciones, aunque el valor medio se sitúa en torno al 13,4%, observándose menor incidencia en ríos que en lagunas o embalses Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 4 - (Martínez et al., 1993; Almodóvar et al., 2006; Vilas et al., 2010; Preston et al., 2013; Vera et al., 2018). Desde 1997, para aumentar las poblaciones nativas, el Gobierno de Cataluña creó refugios genéticos en algunos ríos del Pirineo catalán en los cuales no se encontró evidencia de introgresión o era muy reducida. En estos refugios la liberación de truchas está prohibida, pero se permite la pesca. Algunos estudios indican que el establecimiento de estos refugios no ha reducido la abundancia de alelos de repoblación, pero sí ha decrecido la velocidad de introgresión. En algunas zonas ha aumentado el número de alelos procedentes de poblaciones de piscifactoría (Araguas et al., 2008, 2017), lo que puede deberse a migraciones de estas truchas liberadas en otras zonas no protegidas (García-Marín et al., 1998). En España, se ha prohibido recientemente la repoblación de poblaciones naturales con truchas de stock centroeuropeo (Artículo 52.2, Ley 42/2007 del Patrimonio Natural y la Biodiversidad). Algunas administraciones están reemplazando selectivamente estos individuos foráneos con individuos nativos y promoviendo traslocaciones de individuos salvajes (Fernández-Cebrián et al., 2014), siguiendo las recomendaciones para una administración sostenible (Marco-Ruis et al., 2013). 1.2. Marcadores moleculares Los marcadores moleculares de ADN son segmentos genómicos que tienen una ubicación física identificable en los cromosomas y cuya herencia es rastreable. Un marcador molecular puede ser un gen o, simplemente, una región del ADN sin función conocida, como, por ejemplo, los loci microsatélites utilizados en este trabajo. 1.2.1. Loci microsatélites Los loci microsatélites, STRs (Short Tándem Repeats) o SSR (Simple Sequence Repeats) son repeticiones en tándem de un número variable o VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) de secuencias de 2 a 6 pares de bases, pueden consistir en dinucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos e incluso penta y hexanucleótidos, el número de veces que se repite un segmento dentro de un locus se denomina n. Se trata de secuencias altamente variables entre y dentro de un mismo individuo, estas variaciones se manifiestan como diferencias en la longitud entre los distintos alelos de un mismo locus y surgen de la existencia de un número diferente de repeticiones de estas secuencias. Un microsatélite está formado por este fragmento repetitivo y dos regiones flanqueantes. Para que un microsatélite sea útil, las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas, de forma que se puedan diseñar los cebadores o primers, los cuales tendrán la misma secuencia que éstas. Algunas de las principales características de los microsatélites son: Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 11 - 3.5. Genotipado en secuenciador automático Para el genotipado de los fragmentos de ADN amplificados mediante la PCR multiplex se utilizó un secuenciador automático ABI PRISM® 3730 XL GENETIC ANALYSER (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se utilizaron los siguientes fluorocromos para cada uno de los loci microsatélite: ➢ Para el locus Str591, se usó VIC (color verde) ➢ Para SshaeIII14.20, VIC (verde) ➢ Para Str73, NED (amarillo) ➢ Para Ssa85, 6-FAM (azul) ➢ Para SsaSL-438, NED (amarillo) Se usó el mismo marcador para dos loci (Str591INRA y SsHaeIII14.20), con rangos alélicos diferenciados en estudios previos en trucha común (Sanz et al., 2009; Araguas et al., 2017). Antes de introducir la placa en el secuenciador, se deben desnaturalizar las muestras durante 2-3 minutos a 95ºC en un termociclador y luego enfriarse a 12ºC. Además, en el secuenciador, ningún pocillo debe entrar vacío ya que se quemaría el capilar, por ello, los pocillos que carezcan de muestra deberán rellenarse con agua MQ. 3.6. Análisis del locus LDH-C* El locus LDH-C*, es un marcador muy utilizado para la identificación de repoblaciones en poblaciones naturales de trucha en la Península Ibérica (Martínez et al., 1991; Vera et al., 2013; Araguas et al., 2017; Vera et al., 2018). Para este locus hay dos posibles alelos: el alelo LDHC100*, que está fijado en las poblaciones nativas ibéricas de trucha común, y el alelo LDH-C90*, fijado en las poblaciones de origen centroeuropeo. Por lo tanto, este marcador permite cuantificar el impacto de las repoblaciones realizadas con individuos del stock centroeuropeo del centro piscícola, estimando la frecuencia del alelo LDH-C90* en las poblaciones naturales muestreadas. Para análisis de este locus, se utiliza una PCR simple, con un volumen total de muestra de 24,4 µL, de los cuales 0,4 µL pertenecen al ADN molde obtenido mediante el método Chelex® y el resto a la mezcla de reacción. Esta mezcla está compuesta de: 14,87 µL de agua MQ, 5 µL de Buffer 5 X (1,02 X), 0,75 µL de MgCl2 a 25 mM (0,77 µM), 2,5µL de dNTPs a 2 mM (0,20 µM), 0,34 µL del primer Ldh-5 Forward a 50 µM (0, 70 µM), 0,34 µL del primer Ldh-5 Reverso a 50 µM (0,70 µM) y 0,2 µL de TAQ a 5 u/ µL (0,04 u/µL). Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 12 - En este caso, la reacción de PCR simple se produjo en un termociclador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) y constó de las siguientes fases: 1) Desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, 2) 35 ciclos de PCR (95ºC/1 min, 58ºC/1 min, 72ºC/ 1 min), y 3) extensión final a 72ºC durante 10 min. 3.6.1. Genotipado del locus LDH-C* en gel de agarosa Para evaluar la amplificación, el método más usado es la visualización del fragmento amplificado mediante electroforesis en un gel de agarosa. En estos se produce la separación de los fragmentos de ADN en disolución al someterlos a un campo eléctrico. Para realizar este método se coloca el gel de agarosa en una cubeta de electroforesis de forma que quede sumergido en el medio TBE (Tris-Borato-EDTA, 0,5x). El TBE es una sustancia tampón con un pH de 8, aproximadamente. Las moléculas de ADN, cuando se encuentran en un ambiente con pH superior a 5, se dotan de carga negativa, por lo que este medio permite que éstas se desplacen hacia el polo positivo. Antes de testar todos los individuos, en un gel de agarosa pequeño, se testan unos 9 individuos, para comprobar la amplificación (bandas difusas/ ausentes). Para la preparación del gel de agarosa pequeño se utilizaron 35 mL de Buffer TBE (Tris-BoratoEDTA, 0,5x), 1 g de agarosa y 1,75 µL de SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, 10000x). Este último reactivo es un agente intercalante de ADN que emite fluorescencia al ser excitado, lo que permite la visualización del ADN al ser iluminado en una lámpara de luz UV o azul. En uno de los pocillos debe usarse un marcador de tamaño conocido, de forma que se pueda estimar la migración y el peso molecular, en este estudio se compararon las muestras con el marcador Base Pair Ladder (Invitrogen), que tiene distintas moléculas que difieren en tamaño en 100 pares de bases. Para ello, se añade 1 µL de este marcador, 1 µL de azul de bromofenol (10x) y 6 µL de agua MQ. En el resto de los pocillos se administran 7 µL de la PCR preparada anteriormente y 1 µL de azul de bromofenol (10x). De esta forma en todos los pocillos habrá el mismo volumen. El Azul de Bromofenol o Azul de Carga es una tinción que permite saber si se está administrando bien la PCR dentro del pocillo del gel de agarosa, además, también hace que la muestra se vaya al fondo del pocillo debido a su mayor densidad con respecto al tampón. Este reactivo viene comercialmente en polvo, al llegar al laboratorio se prepara con Xylene Cyanol (0,25 g) y Glicerol en agua al 30% (30 mL). Se añaden 0,25 g de Azul de Bromofenol. Una vez que se han testado estos individuos y se ha comprobado que los productos de amplificación se ven claramente (y por tanto que la reacción PCR ha funcionado correctamente), se procede a la digestión de los fragmentos amplificados por PCR del locus en cada ejemplar para obtener un marcador de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP de sus Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 13 - siglas en inglés Restriction Fragment Leght Polymorfism; McMeel et al., 2001; Vera et al., 2018). Para ello, se hacen digestiones con la enzima de restricción Bse LI, que se encarga de cortar (o no) los fragmentos de ADN amplificados. Por cada pocillo, se administra la siguiente cantidad: 2,7µL de agua MQ, 1µL de tampón Tango 10 X (1 X), 0,3µL de enzima Bse LI de 10 unidades/ µL (Thermo Scientific) (0,3 unidades/µL). De esta mezcla se añade a cada pocillo 4 µL, que contienen 6 µL de la PCR preparada anteriormente con el marcador LDH-C*. Para realizar la digestión, se utiliza el termociclador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) y se programa a 55ºC durante 2 horas y 30 min. Para la preparación de un gel grande de agarosa en el análisis de todas las muestras, se utilizaron: 200 mL de Buffer TBE 0,5x, 2 g de agarosa y 10 µL de SYBR. Para testar a los individuos en el gel de agarosa, en uno de los pocillos del gel (preferentemente el central), se carga el marcador, en el resto se cargan las diferentes muestras (utilizando diferentes puntas de pipeta, ya que se trata de diferentes individuos). Después, se tapa la cubeta y se conectan los cables negro y rojo (correspondientes al polo negativo y positivo, respectivamente). Las muestras correrán siempre hacia el polo positivo, por lo tanto, habrá que ponerlas lo más cerca posible del cable negro (polo negativo). Se realiza la electroforesis a voltaje constante de 110 V. Para comprobar que está funcionando, observar que salgan burbujas de ambos lados de la cubeta. Este proceso tendrá una duración de al menos 20 minutos. Una vez finalizado se comprobará el número y posición de las bandas para cada individuo y se genotipará conforme a si son homocigotos 100/100, 90/90 o heterocigotos 90/100. El alelo LDHC100* no presenta la diana de restricción de Bse LI, por lo tanto, el fragmento no se corta (fragmento de longitud 460 pb), mientras que el alelo LDH-C90* sí la presenta, cortándose el fragmento amplificado en dos, uno de 360 y otro de 100 pb. Así, se puede asociar fácilmente los diferentes patrones observados a cada uno de los tres genotipos esperados, correspondiéndose el de una banda en 460 pb al homocigoto para el alelo LDH-C100*, el de dos bandas (360 y 100 pb) al homocigoto para el alelo LDH-C90* y el de tres bandas (460, 360 y 100 pb) al heterocigoto (ver Figura 3). Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 14 - Figura 3. Imagen de un gel de agarosa para el marcador LDH-C*. Aparecen individuos homocigotos para el alelo LDH-C100* (banda superior; 460pb), homocigotos para el alelo LDH-C90* (dos bandas inferiores; 360 pb y 100 pb) y heterocigotos (tres bandas). El marcador de peso molecular (carril central) se corresponde con un marcador con bandas que difieren 100 pb, siendo la menor de 100 pb. 3.7. Estimadores de diversidad genética Los estimadores de diversidad genética (heterocigosis observada, heterocigosis esperada y coeficiente de consanguinidad) fueron calculados, por locus y población, mediante el programa GENEPOP v. 4.7.5 (Rousset, 2008). Después, se realizó un promedio sobre el total de loci para obtener valores medios por población. También se estimó el número de alelos (A) y la riqueza alélica (RA) por locus y población utilizando el programa FSTAT v 2.9.3 (Goudet, 2001). 3.7.1. Riqueza alélica (RA) La riqueza alélica (RA) estima el número de alelos por locus, ya que este se encuentra afectado por el tamaño muestral. Este valor está corregido para comparar entre distintos tamaños muestrales entre poblaciones. En este caso, se utiliza para comparar las poblaciones nativas con respecto a Bagá (N=49), ya que el resto de las poblaciones tienen un tamaño muestral de 30 individuos. 3.7.2. Heterocigosis observada (Ho) y heterocigosis esperada (He) Se considera que un locus es polimórfico al 99% cuando el alelo más común se observa en una frecuencia inferior a 0,99. La heterocigosis observada (Ho) es la proporción de individuos heterocigotos en una muestra de una población determinada. Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 15 - La heterocigosis esperada (He) es la proporción de heterocigotos que se esperaría en condiciones de Equilibrio Hardy-Weinberg y se calcula de la siguiente manera: He = 1 - ∑𝑥 𝑛 𝑖=1 i2 (Nei, 1973; Nei et al., 1987), donde xi es la frecuencia del alelo i y n el número de alelos. 3.7.3. Coeficiente de consanguinidad (FIS) El parámetro FIS permite cuantificar el exceso o déficit de heterocigotos por locus en una población determinada respecto a las condiciones de equilibrio Hardy-Weinberg. Este coeficiente se calcula de la siguiente manera: FIS = (He – Ho) / He Si el valor de FIS es negativo, habrá un exceso de heterocigotos, mientras que, si es positivo, existirá un defecto de heterocigotos en la población estudiada. 3.8. Equilibrio Hardy-Weinberg (H-W) La Ley de Hardy-Weinberg, formulada por Godfrey H. Hardy y Wilhelm Weinberg en 1908, estudia el efecto de la reproducción en las frecuencias alélicas y genotípicas de una determinada población. Según ésta, en una población grande bajo apareamiento aleatorio (panmixia), sin selección, mutación o migración, las frecuencias alélicas y genotípicas permanecerán constantes entre generaciones. Para un mismo locus con dos alelos (A y B), cuyas frecuencias alélicas son p y q, respectivamente, las frecuencias de los genotipos de la progenie serían AA (p2), BB (q2) y AB (2pq). Pueden producirse desviaciones del Equilibrio Hardy-Weinberg por varios factores: ➢ Los apareamientos no se producen al azar ➢ Existen subdivisiones de las poblaciones (Principio de Wahlund) ➢ Antepasados comunes ➢ Selección natural (por ej., posible ventaja de los heterocigotos sobre los homocigotos) ➢ Migración ➢ Diferencias entre sexos ➢ Técnica de muestreo incorrecta ➢ Presencia de alelos nulos y errores de genotipado (stuttering y drop-out) Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 16 - Si un locus se desvía significativamente de H-W en varias poblaciones puede que se haya producido una selección que afecte a este locus o, más probablemente, que existan alelos nulos. Si una población se desvía de H-W para un número variable de loci puede deberse a subdivisiones dentro de la población (efecto Wahlund), migración o a que los apareamientos no se producen al azar. Para este trabajo se utilizó un test exacto de probabilidad mediante el uso del programa GENEPOP v. 4.7.5, testando las frecuencias genotípicas observadas y esperadas en condiciones de equilibrio H-W bajo un nivel de significación de 0,05 y aplicando la corrección de Bonferroni para tests múltiples (nivel de significación corregido = 0,05 / Nº de loci estudiados). 3.9. Análisis de estructura poblacional y diferenciación entre poblaciones Para el análisis de la estructura poblacional se utilizaron los estadísticos F o índices de fijación (Wright, 1969). Estos estadísticos descomponen la diversidad genética total observada (HT) en: ➢ Diversidad intrapoblacional (HS/HT), en donde HT es la heterocigosis esperada en la población total y HS la heterocigosis esperada en cada subpoblación. ➢ Diversidad interpoblacional (FST; Nei, 1973). El FST es el coeficiente relativo de diferenciación poblacional y analiza la diferenciación entre las diferentes subpoblaciones estudiadas con respecto al total. Se calcula de la siguiente manera: (HS – HT) / HT. El valor oscila entre un mínimo de 0, que indicaría que las subpoblaciones son idénticas, es decir, que no existe diferenciación genética entre subpoblaciones, y un máximo de 1, cuando hay fijación de alelos alternativos en las diferentes subpoblaciones. Este valor puede desglosarse en FSC, que indica la diferenciación entre poblaciones dentro de grupos poblacionales y FCT, que identifica la diferenciación entre grupos. Los valores de FST por locus, por pares de poblaciones y global en el total de poblaciones se estimaron con el programa FSTAT v 2.9.3, calculándose su significación con 10.000 permutaciones. Para obtener los valores de los diferentes estadísticos F de Wright se utilizó el análisis de varianza molecular (AMOVA), implementado en el programa ARLEQUIN v 3.5.2 (Excoffier et al., 2005). Este es un método estadístico que permite realizar un análisis jerárquico de la diversidad genética, permitiendo analizar las diferencias genéticas totales entre las poblaciones (FST) entre poblaciones dentro de grupo (FSC) o entre grupos poblacionales (FCT), creados a priori. Así, el método de agrupación se aplicó a las poblaciones silvestres (OD, FR, RI, SO, CA y TO) por cuenca. Un primer grupo estuvo formado por las poblaciones OD y FR, pertenecientes al río Ter; el segundo grupo por RI y SO, que pertenecen al río Noguera Pallaresa, y el tercer grupo formado por CA y TO, del río Noguera Ribagorzana. Para este estudio se excluyeron las muestras del Centro Piscícola Bagà (BA). El valor de significación de todos los Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 17 - estadísticos se testó utilizando 10.000 permutaciones. Además, se realizaron los cálculos teniendo en cuenta todos los marcadores y excluyendo el locus LDH-C*. Finalmente, se utilizó el método Bayesiano implementado en el programa STRUCTURE v 2.3.4. (Falush et al., 2007) para estimar el número de unidades poblacionales (K) presentes en la zona de estudio. Este método minimiza el desequilibrio de ligamiento y de HW dentro de los grupos creados. Los valores de K testados fueron de 1 hasta 7 (número de poblaciones + 1), realizándose cinco réplicas para cada valor de K testado. Para cada réplica, se utilizó un período de calentamiento (burn-in) de 50.000 pasos seguido por 200.000 réplicas de Monte Carlo. El valor más probable de K se estimó siguiendo el método de Evanno et al. (2005) utilizando el programa STRUCTURE HARVESTER v 0.6.94 (Earl y vonHoldt, 2012). Las representaciones gráficas de los resultados de STRUCTURE se obtuvieron mediante la aplicación web CLUMPAK (Kopelman et al., 2015), para agrupar los resultados de las diferentes réplicas de cada valor de K en una única gráfica. Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 18 - 4. Resultados y discusión 4.1. Diversidad genética A partir de los genotipos de los marcadores microsatélites y el locus LDH-C* (Anexo I), se estimaron las frecuencias génicas en las distintas poblaciones analizadas (Tabla 3). Para el locus SsHaeIII14.20 se han encontrado 15 alelos comprendidos en un rango de 294 a 338 pares de bases (pb). Las frecuencias de los diferentes alelos por población se encuentran entre 0,000 y 0,900 (alelo 298, población OD). Se han encontrado, en total, 5 alelos privados, que son los siguientes (entre paréntesis sus frecuencias): 294 en la población RI (0,017), 320 en la población TO (0,017), 334 en BA (0,031), 336 en FR (0,033) y 338 en BA (0,010). Estos alelos privados se encuentran solamente en esa población, teniendo una frecuencia de 0 en el resto. Para el locus Ssa85 se han encontrado 10 alelos diferentes, con tamaño entre 100 y 118 pb. Las frecuencias observadas por población se encuentran en un rango de 0,000 a un máximo de 0,531 (alelo 112 en la población BA). En total, se encontraron 2 alelos privados, que son: alelo 100 en la población OD y alelo 118 en TO, ambos con una frecuencia de 0,017. En cuanto al locus SsoSL438, fueron identificados 7 alelos, con un rango entre 89 y 105 pb. Las frecuencias alélicas poblacionales se encontraron en un rango entre 0,000 y 0,483 (alelo 97 en la población TO). Se encontró un solo alelo privado, el alelo 89 en la población FR, con una frecuencia de 0,100 en esta población. Para el locus STR591INRA, se cuantificaron, en total, 18 alelos, comprendidos en un rango entre 148 y 196 pb. Sus frecuencias se encontraron entre 0,000 y 0,918 (alelo 148 en BA). En total, se observaron 6 alelos privados: alelo 164 en la población SO (frecuencia = 0,050); alelo 168 en BA (0,020); 184 en RI (0,017) y alelos 186, 188 y 192 en la población FR (0,100, 0,233 y 0,033, respectivamente). En cuanto al locus STR73INRA, fueron observados 5 alelos comprendidos entre los 138 y 146 pb. La máxima frecuencia encontrada fue de 0,917, para el alelo 142 en la población OD. No fue encontrado ningún alelo privado en las poblaciones estudiadas. En el caso del locus LDH-C*, se detectaron dos alelos, que, como ya se ha comentado anteriormente, se encuentran fijados, en el caso del alelo LDH-C90*, en las poblaciones de Centro Europa y stocks de piscifactoría, y, en el caso del alelo LDH-C100*, en las nativas. Como era de esperar, en la población BA, procedente de la piscifactoría de Bagà, se encontró una frecuencia de 1,000 para el alelo LDH-C90* (i.e. población fijada para este alelo), concordante con su origen alóctono respecto a poblaciones ibéricas. Las poblaciones RI y SO, pertenecientes al río Noguera Pallaresa, tienen una frecuencia de 1,000 para el alelo LDH-C100*, lo que sugeriría que presentan componente nativo ibérico. En el resto de las poblaciones (OD, FR, CA y TO), existe un cierto Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 19 - grado de hibridación entre acervos genéticos nativos y de repoblación, siendo la población FR la más introgresada, con una frecuencia de 0,300 para el alelo LDH-C90*, y OD, la menos introgresada de estas cuatro, con una frecuencia de 0,017 para este mismo alelo. Tabla 3. Frecuencias génicas por locus microsatélite y población. Se indica el número de individuos que fueron genotipados (N). Para cada locus se indican los alelos detectados (primera columna) y sus frecuencias en las distintas poblaciones analizadas. En negrita se resaltan las frecuencias de los alelos privados (encontrados en una única población). SsHaeIII14.20 OD FR RI SO CA TO BA N 30 30 30 30 30 30 49 294 0,000 0,000 0,017 0,000 0,000 0,000 0,000 298 0,900 0,433 0,367 0,450 0,500 0,433 0,031 300 0,017 0,400 0,400 0,383 0,167 0,317 0,000 302 0,000 0,000 0,183 0,150 0,033 0,033 0,000 308 0,050 0,000 0,017 0,017 0,150 0,150 0,000 312 0,017 0,033 0,017 0,000 0,033 0,017 0,276 320 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,000 322 0,000 0,067 0,000 0,000 0,017 0,000 0,286 324 0,017 0,033 0,000 0,000 0,067 0,017 0,224 326 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,000 0,010 328 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,122 330 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,000 0,010 334 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,031 336 0,000 0,033 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 338 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,010 Ssa85 N 30 30 30 30 30 30 49 100 0,017 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 102 0,117 0,067 0,067 0,033 0,000 0,000 0,000 104 0,050 0,017 0,017 0,150 0,183 0,133 0,071 106 0,300 0,083 0,100 0,067 0,000 0,000 0,020 108 0,383 0,417 0,250 0,217 0,067 0,150 0,020 110 0,067 0,283 0,317 0,317 0,450 0,367 0,184 112 0,067 0,133 0,250 0,217 0,150 0,200 0,531 114 0,000 0,000 0,000 0,000 0,133 0,133 0,122 116 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,000 0,051 118 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,017 0,000 SsoSL438 N 30 30 30 30 30 30 49 89 0,000 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 95 0,033 0,117 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 97 0,267 0,133 0,133 0,133 0,433 0,483 0,143 99 0,250 0,600 0,433 0,450 0,050 0,050 0,408 101 0,200 0,033 0,250 0,317 0,383 0,300 0,082 103 0,250 0,017 0,183 0,100 0,083 0,067 0,122 105 0,000 0,000 0,000 0,000 0,050 0,100 0,245 Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 20 - Str591INRA N 30 30 30 30 30 30 49 148 0,000 0,167 0,017 0,000 0,067 0,100 0,918 150 0,017 0,050 0,000 0,000 0,133 0,017 0,051 162 0,200 0,000 0,217 0,133 0,083 0,000 0,000 164 0,000 0,000 0,000 0,050 0,000 0,000 0,000 166 0,450 0,000 0,167 0,217 0,267 0,200 0,000 168 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,020 170 0,000 0,000 0,233 0,200 0,000 0,000 0,000 172 0,000 0,000 0,083 0,067 0,067 0,100 0,010 174 0,000 0,000 0,017 0,033 0,017 0,067 0,000 176 0,050 0,000 0,050 0,083 0,350 0,467 0,000 178 0,000 0,000 0,017 0,033 0,017 0,000 0,000 180 0,050 0,000 0,183 0,150 0,000 0,017 0,000 182 0,233 0,417 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 184 0,000 0,000 0,017 0,000 0,000 0,000 0,000 186 0,000 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 188 0,000 0,233 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 192 0,000 0,033 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 196 0,000 0,000 0,000 0,033 0,000 0,033 0,000 Str73INRA N 30 30 30 30 30 30 49 138 0,000 0,000 0,000 0,000 0,133 0,400 0,000 140 0,033 0,483 0,667 0,717 0,633 0,517 0,102 142 0,917 0,350 0,333 0,283 0,117 0,067 0,173 144 0,033 0,050 0,000 0,000 0,050 0,000 0,306 146 0,017 0,117 0,000 0,000 0,067 0,017 0,418 LDH-C* N 30 30 30 30 30 30 49 90 0,017 0,300 0,000 0,000 0,117 0,133 1,000 100 0,983 0,700 1,000 1,000 0,883 0,867 0,000 En la Tabla 4 se presentan los resultados de diversidad alélica para los 5 microsatélites estudiados y el locus LDH-C*. Todos los microsatélites son polimórficos, es decir, se ha encontrado más de un alelo en todos ellos. El número de alelos por locus (A) en las poblaciones se encuentra entre un mínimo de 2, en el caso del locus Str73INRA en las poblaciones RI y SO, y un máximo de 10 alelos, para el locus Str591INRA en esas mismas poblaciones. El número de alelos medio por población se encuentra en un rango entre 5,2, en la población SO, y 6,6, en la población CA. En el caso del locus LDH-C*, el número de alelos varía entre 1, en las poblaciones donde se encuentra fijada una de las variantes (RI, SO y BA) y 2, en las poblaciones con heterocigosis (OD, FR, CA y TO). Los valores de riqueza alélica (RA) por locus se encuentran comprendidos entre 2 (Str73INRA en RI y SO) y 10 (Str591INRA en RI y SO) y el valor promedio poblacional de la riqueza alélica Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 27 - estudios realizados en Galicia, el porcentaje de variación entre grupos y entre poblaciones dentro de grupos es menor en este trabajo, esto parece explicarse por el mayor aislamiento de las poblaciones en la zona sur-mediterránea de Galicia, debido, principalmente, a factores humanos (Vera et al., 2018). Tabla 8. Resultados de AMOVA (no incluyen población BA). Se observan los estadísticos F (FSC, FCT y FST), el componente de variación entre grupos, entre poblaciones dentro de grupos y entre poblaciones y el porcentaje de variación en estas mismas. Los resultados entre paréntesis no incluyen el locus LDH-C*. Estadístico F Componente Varianza % Variación Entre poblaciones (FST) 0,14824*** (0,14855***) 1,97832 (1,24607) 14,83 (14,86) Entre cuencas (FCT) 0,07769*** (0,08109***) 0,15677 (0,15652) 7,77 (8,11) Entre poblaciónes dentro de cuenca (FSC) 0,07650*** (0,07341***) 0,14237 (0,13020) 7,06 (6,75) Dentro de poblaciones 1,71890 (1,64336) 85,18 (85,14) Los análisis de agrupación mediante métodos Bayesianos del programa STRUCTURE, confirmaron los resultados de estructura previamente descritos: la existencia de dos unidades poblacionales diferenciadas en el río Ter, mientras que, en los ríos Noguera Pallaresa y Noguera Ribagorzana, las localidades estudiadas fueron genéticamente muy similares. El valor de K más probable, según el método de Evanno, resultó ser K = 4. Con este valor, se observa que las localidades del río Noguera Pallaresa (RI y SO) podrían considerarse una única unidad poblacional. Lo mismo sucede con las localidades de la cuenca del río Noguera Ribagorzana (CA y TO). Sin embargo, las localidades OD y FR, pertenecientes al río Ter, aparecieron como dos unidades poblacionales diferenciadas (Figura 4). Esta situación puede deberse a que exista aislamiento entre estas dos localidades debido, por ejemplo, a barreras físicas, además de, como se ha comentado anteriormente, la localidad FR se encuentra altamente introgresada, lo cual dispara la diferenciación entre estas dos localidades pertenecientes a la misma cuenca fluvial. Desde el valor K = 2 se observan dos unidades poblacionales diferenciadas. Una de ellas se relaciona con un componente nativo (color azul) y la otra comprende el componente de piscifactoría (color naranja, ver Figura 4). Se puede observar que las poblaciones FR y CA se encuentran introgresadas, tal y como había sugerido también el locus LDH-C*, ya que se encontró componente genético perteneciente a la población de piscifactoría. Hasta K = 4, este componente nativo es mayoritario en el río Noguera Pallaresa y en la población OD, perteneciente al río Ter. Sin embargo, en FR este componente desaparece a partir del valor de K = 4, lo que sugiere que la población OD se asemeja más genéticamente a otras poblaciones nativas, pertenecientes a otras cuencas fluviales, que a la población FR. Esta situación es compatible con la premisa de que esta última población se encuentra altamente introgresada, por lo tanto, genéticamente difiere del resto Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 28 - de las poblaciones nativas. Cuando el valor de K es de 7 o superior, se observa que las poblaciones de los ríos Noguera Pallaresa y Noguera Ribagorzana comparten componente genético (rojo, azul y azul oscuro). Por otra parte, las poblaciones OD y FR siguen estando completamente diferenciadas pese a pertenecer a la misma cuenca. Los valores de diferenciación genética obtenidos en este estudio resultaron ser muy similares a los obtenidos en otros estudios en ríos que desembocan al Mediterráneo (Vera et al., 2013; Araguas et al., 2017). En estudios realizados previamente en la zona de los Pirineos, se constató que en algunas cuencas se podían distinguir hasta tres poblaciones genéticamente diferenciadas en el mismo río (Araguas et al., 2017), lo cual contrasta con el presente trabajo, en el cual, se puede afirmar que, salvo el caso del río Ter, en las otras dos cuencas estudiadas los individuos analizados podrían tratarse como una única población. Otra diferencia importante entre el estudio realizado por Araguas et al. (2017) y el presente trabajo es que, en el anterior estudio se observa que la proporción de genoma proveniente de truchas de repoblación era nulo en el río Ter, sin embargo, en el trabajo actual, se observa componente genético de piscifactoría (color naranja) en la población FR, perteneciente a esta cuenca. Como era de esperar, estos valores fueron menores a los obtenidos en ríos atlánticos (Vera et al., 2018). Una de las diferencias entre las truchas pertenecientes a poblaciones mediterráneas y las pertenecientes a poblaciones atlánticas es que, en las primeras, es muy infrecuente o prácticamente inexistente el comportamiento anádromo (Bouza et al., 1999), lo cual, por lo general, lleva a un mayor aislamiento de las poblaciones y a una mayor diferenciación. Sin embargo, en Galicia, algunos estudios demuestran que cada localidad de recogida se corresponde con una población diferente, debido a la deriva genética producida por el aislamiento y el “homing” (Vilas et al., 2010; Vera et al., 2018). Ciertos estudios muestran, además, en esta zona, la existencia de una población endémica (Vilas et al., 2010; Vera et al., 2015, Vera et al., 2018). Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 29 - Figura 4. Estructura poblacional representada gráficamente mediante el programa CLUMPAK. Cada espacio entre bandas corresponde a una localización, representadas mediante sus códigos en la parte superior. En el lateral se exponen los diferentes valores de K analizados. Cada barra vertical representa un individuo y su proporción de color indica su probabilidad posterior de asignación a los diferentes grupos (K) inferidos por el programa. 4.3. Estrategias de gestión y conservación Aunque, en el status de conservación global, la trucha común está catalogada como de preocupación menor o ‘Least Concern’ (IUCN, 2016), en España, está considerada como una especie Vulnerable (Doadrio, 2002), por lo que se deben implementar una serie de medidas para proteger la diversidad genética de esta especie y disminuir la introgresión causada por la repoblación reiterada con truchas de piscifactoría, de origen centroeuropeo. En los Pirineos, la legislación para la conservación de la biodiversidad (Artículo 52.2, Ley 42/2007 del Patrimonio Natural y la Biodiversidad) prohíbe la repoblación con truchas de piscifactoría. Esta legislación previene la introducción de genes foráneos, pero no disminuye la introgresión ya existente, la cual podría suponer una amenaza para las poblaciones adyacentes, por ejemplo, en el caso de la población FR, la cual se encuentra altamente introgresada, pudiendo diseminar sus genes a otras poblaciones en el río Ter. Además, se sospecha la existencia de Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 30 - translocaciones ilegales en algunas localidades pirenaicas (Araguas et al., 2009). Por ello son necesarias otras medidas complementarias para recuperar el componente genético nativo en estas áreas protegidas (Araguas et al., 2008,2009; Caudron et al., 2012). Algunas de estas medidas son la pesca selectiva y la suplementación con individuos pertenecientes a poblaciones nativas. La pesca selectiva de individuos híbridos o de piscifactoría podría ayudar a recuperar el acervo genético en poblaciones como FR, disminuyendo la introgresión. Esta pesca selectiva puede realizarse a nivel de campo, ya que existen diferencias fenotípicas entre las truchas nativas y las híbridas o completamente foráneas (Lascaux, 1996; Mezzera et al., 1997; Aparicio et al., 2005). Se ha propuesto una clasificación en árbol, teniendo en cuenta variables como la coloración y el patrón de punteado, que permiten distinguir entre poblaciones mediterráneas, atlánticas e híbridas o introgresadas (Aparicio et al., 2005). Además, existe una mayor vulnerabilidad de las truchas de stock a la pesca, en comparación con las truchas nativas (García-Marín et al., 1999b; Mezzera & Largiader., 2001). La suplementación puede realizarse mediante el cultivo y reproducción de poblaciones nativas o mediante translocaciones de individuos pertenecientes a otras poblaciones salvajes. La translocación es útil en casos en que la población se considere una población de stock naturalizada, reemplazando estos individuos de piscifactoría por individuos procedentes de poblaciones cercanas. Sin embargo, en poblaciones con cierto grado de introgresión no se recomienda este método ya que podría llevar a la total extinción del componente nativo de esa población (Vera et al., 2013). Algunos autores sugieren que se realice la repoblación con individuos estériles, como, por ejemplo, triploides (Piferrer et al., 2009). Esto ayudaría a alcanzar un equilibrio entre las actividades de pesca y la conservación genética, pero tiene algunas limitaciones, por ejemplo, que no todos los individuos triploides resultan ser estériles (Normand et al., 2008). Finalmente, sería necesario realizar estudios más extensos, en los cuales se monitorice un mayor número de localidades, ya que existen muchas limitaciones a la hora de monitorizar sólo unas pocas localidades para predecir la situación global en los ríos, dado que estos estudios no informan de cambios a nivel local (FernandezCebrián et al., 2014). Por ejemplo, en estudios anteriores no se había demostrado la presencia de introgresión en el río Ter (Araguas et al., 2017). Sin embargo, en este trabajo se ha encontrado una población altamente introgresada. Situaciones como esta pueden darse muy a menudo, ya que los ríos en esta zona son muy extensos y es muy difícil abarcar toda su longitud. Estos estudios son importantes a la hora de definir estrategias para evitar situaciones como la del río Ter, en el cual, una población altamente introgresada (FR) podría poner en peligro la integridad genética de poblaciones adyacentes (GarcíaMarín et al., 1998; Hitt et al., 2003; Araguas et al., 2009). Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 31 - 5. Conclusiones Las conclusiones del presente Trabajo Final de Grado son las siguientes: 1. La diversidad genética encontrada en el presente trabajo se asemeja a la encontrada en trabajos previos en la misma zona y en otros ríos mediterráneos, sin embargo, todos ellos son menores a la diversidad genética encontrada en poblaciones estables de ríos atlánticos, exceptuando poblaciones aisladas con muy baja diversidad. 2. La introgresión por repoblación con stocks centroeuropeos domesticados, estimada mediante la frecuencia del alelo LDH-C90* y loci microsatélites, en este estudio resultó similar a la encontrada en otros ríos pirenaicos y mediterráneos, pero mayor a la obtenida en estudios realizados en ríos atlánticos. Destaca la situación en el río Ter, en el cual, estudios anteriores no habían demostrado la presencia de este alelo, sin embargo, en el presente trabajo se encuentra una frecuencia del 30%. 3. El mayor porcentaje de diferenciación se encontró entre cuencas, por lo tanto, la gestión para la conservación de la diversidad genética de las poblaciones de trucha en los Pirineos debe hacerse por cuencas, preservando así los recursos genéticos de las diferentes poblaciones. 4. Se definen tres estrategias para la gestión y conservación de las truchas en los refugios genéticos de los pirineos, los cuales son: la pesca selectiva de ejemplares de origen centroeuropeo, la suplementación con individuos de poblaciones nativas y la necesidad que realizar estudios más extensos, que abarquen un mayor número de localidades por cuenca. Análisis de diversidad y estructura genética en Salmo trutta Viso Salas, Beatriz - 32 - 6. Bibliografía lmodóvar, ., icola, . ., lvira, . & García‐Marín, J. . (2006). Introgression variability among Iberian brown trout Evolutionary Significant Units, the influence of local management and environmental features. Freshwater Biology, 51, 1175–1187. Almodóvar, A., Nicola, G. G., Ayllón, D. & Elvira, B. (2012). Global warming threatens the persistence of Mediterranean brown trout. Global Change Biology, 18(5), 1549–1560. Alonso, C., Gortazar, J., & Garcia de Jalon, D. (2010). Trucha común – Salmo trutta, Linnaeus, 1758. Pág, 2, 13. 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ANEXO I BA_03 7 298 312 110 112 99 105 148 148 142 144 90 90 BA_04 7 322 324 110 112 99 105 148 148 140 146 90 90 BA_05 7 322 328 110 112 97 105 148 148 142 144 90 90 BA_06 7 312 324 110 112 99 99 148 148 142 146 90 90 BA_07 7 322 322 112 112 97 99 148 148 144 144 90 90 BA_08 7 312 312 110 112 99 105 148 148 146 146 90 90 BA_09 7 322 324 110 114 97 99 148 148 144 146 90 90 BA_10 7 322 328 110 114 99 105 148 148 144 146 90 90 BA_11 7 312 324 106 112 99 99 148 148 142 146 90 90 BA_12 7 322 328 110 112 97 105 148 148 140 142 90 90 BA_13 7 324 326 104 116 97 97 148 148 142 146 90 90 BA_14 7 312 312 110 112 99 105 148 148 146 146 90 90 BA_15 7 322 328 112 114 99 103 148 150 140 144 90 90 BA_16 7 322 322 112 112 99 99 148 148 140 144 90 90 BA_17 7 312 328 104 104 101 105 148 148 144 146 90 90 BA_18 7 312 324 104 112 99 105 148 148 144 146 90 90 BA_19 7 322 328 112 114 101 103 148 150 146 146 90 90 BA_20 7 312 328 112 112 99 105 148 148 144 144 90 90 BA_21 7 312 322 110 112 99 105 148 172 144 146 90 90 BA_22 7 312 324 112 112 101 103 148 148 144 146 90 90 BA_23 7 312 324 112 116 97 103 148 148 144 146 90 90 BA_24 7 312 328 110 112 99 105 148 148 144 144 90 90 BA_25 7 312 324 112 112 101 103 148 148 144 146 90 90 BA_26 7 322 322 112 114 97 99 148 168 144 144 90 90 BA_27 7 324 334 112 114 97 105 148 148 142 146 90 90 BA_28 7 312 324 112 116 97 101 148 148 142 146 90 90 BA_29 7 324 338 104 104 99 105 148 148 146 146 90 90 BA_30 7 322 330 112 112 99 105 148 148 144 146 90 90 BA_31 7 312 328 104 112 99 105 148 148 142 146 90 90 BA_32 7 322 324 112 114 99 103 148 148 140 146 90 90 BA_33 7 322 322 112 112 99 99 148 148 140 142 90 90 BA_34 7 312 324 110 112 97 101 148 148 144 146 90 90 BA_35 7 312 324 108 114 99 101 148 148 142 146 90 90 BA_36 7 312 328 112 114 97 105 148 148 146 146 90 90 BA_37 7 322 324 110 112 99 103 148 148 142 146 90 90 BA_38 7 298 312 112 112 99 99 148 148 140 142 90 90 BA_39 7 322 328 112 112 105 105 148 148 142 146 90 90 BA_40 7 322 334 110 114 97 105 148 150 146 146 90 90 BA_41 7 324 334 110 112 99 101 148 148 144 146 90 90 BA_42 7 298 312 112 112 99 99 148 148 144 144 90 90 BA_43 7 312 324 110 112 99 99 148 150 140 146 90 90 BA_44 7 312 324 112 116 103 103 148 148 142 146 90 90 BA_45 7 322 328 110 112 97 105 148 148 142 144 90 90 BA_46 7 312 324 106 108 99 99 148 148 142 146 90 90 BA_48 7 322 324 112 114 99 103 148 150 140 146 90 90 BA_49 7 322 322 112 114 99 105 148 168 144 146 90 90 BA_50 7 322 322 112 112 99 105 148 148 140 144 90 90