Efecto de las hormonas tiroideas sobre la homeostasis energética y metabólica

  UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina Departamento de Fisiología       EFECTO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS SOBRE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA LUIS VARELA FERNÁNDEZ 2010 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina Departamento de Fisiología Dr. Miguel A. López Pérez, Investigador del Programa Ramón y Cajal de la Universidad de Santiago de Compostela Dr. Carlos Diéguez González, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela Certifican que: la presente Tesis Doctoral titulada “Efecto de las Hormonas Tiroideas sobre la Homeostasis Energética y Metabólica”, elaborada por Luis Varela Fernández, ha sido realizada bajo su dirección en los Laboratorios de Neurociencia “Ramón Domínguez” del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firmamos la presente autorización, Fdo.: Dr. Miguel A. López Pérez Fdo.: Dr. Carlos Diéguez González Fdo.: Luis Varela Fernández Santiago de Compostela, 2010 A mis padres y a mi hermano Índice INTRODUCCIÓN ______________________________________ 1 INTRODUCCIÓN _______________________________________________ 3 SEÑALES PERIFÉRICAS_________________________________________ 6 SEÑALES DE SACIEDAD. Señales procedentes del tracto gastrointestinal ________ 7 SEÑALES DE ADIPOSIDAD. Tejido adiposo______________________________ 10 SISTEMA NERVIOSO CENTRAL_________________________________ 12 HIPOTÁLAMO. Regulación hipotalámica de la ingesta_______________________ 13 Núcleo Arcuato_______________________________________________________ 14 Núcleo Ventromedial __________________________________________________ 17 Núcleo Paraventricular_________________________________________________ 19 Núcleo Dorsomedial___________________________________________________ 20 Hipotálamo lateral ____________________________________________________ 21 Núcleo Supraquiasmático_______________________________________________ 21 OTRAS ZONAS DEL SNC_____________________________________________ 22 Tronco Cerebral ______________________________________________________ 22 Cerebelo ____________________________________________________________ 22 Hipocampo _________________________________________________________ 22 Área tegmenal ventral (VTA)____________________________________________ 23 GASTO ENERGÉTICO __________________________________________ 23 TERMOGÉNESIS ADAPTATIVA. Tejido adiposo marrón____________________ 24 Regulación transcripcional de UCP-1 _____________________________________ 33 METABOLISMO DE LÍPIDOS____________________________________ 35 mTOR (Mammalian Target of Rapamycin _________________________________ 46 HORMONAS TIROIDEAS _______________________________________ 48 Hormonas tiroideas y la regulación de la ingesta y de la masa corporal ___________ 51 Hormonas tiroideas y termogénesis adaptativa ______________________________ 54 Hormonas tiroideas y metabolismo lipídico_________________________________ 56 OBJETIVOS__________________________________________ 59     INTRODUCCIÓN Introducción 3 INTRODUCCIÓN Uno de los mayores problemas de salud detectado en los últimos años ha sido la obesidad, tanto en las sociedades desarrolladas como en las que están en vías de desarrollo. Se entiende por obesidad un aumento de la masa corporal, sobre todo del tejido adiposo, que lleva asociadas consecuencias negativas en el estado de salud (1). Diferentes estudios sobre la prevalencia de la obesidad en las sociedades europeas han arrojado datos poco prometedores sobre la evolución de este problema: se estima que en Europa la obesidad afecta al 10-20% de los hombres y al 10-25% de las mujeres; además, en una década la prevalencia de la obesidad ha aumentado entre un 10-40 % en casi todos los países europeos, mientras que en el Reino Unido este dato se eleva hasta ver que desde 1980 su prevalencia se ha duplicado (2;3). Otros estudios han atribuido a la obesidad el 9,1% del total del gasto sanitario de un país como Estados Unidos. La evolución de este problema ha llevado a calcular que alrededor de 2030 el 90% de todos sus habitantes adultos padecerán sobrepeso y que el 51,1% de ellos serán obesos, con lo que se podría llegar a decir que la obesidad alcanzará proporciones pandémicas (3). Se ha estimado que en esa década el gasto debido a la obesidad y a los problemas que provoca, como hipertensión, dislipemia, diabetes mellitus tipo II, problemas cardiovasculares o cáncer (conocidos en conjunto como Síndrome Metabólico), supondrán alrededor del 15,8-17,6% del gasto total en Sanidad en Estados Unidos; es decir, 1 de cada 6 dólares gastados (3). Con la evolución que lleva este problema, se piensa que en la próxima década la obesidad causará más muertos que la desnutrición. La masa corporal y su composición, así como el almacenamiento de energía como triglicéridos en el tejido adiposo, están determinados por la interacción entre factores genéticos, medioambientales y psicosociales. Estos factores actúan a largo plazo variando el balance energético; es decir, modifican el balance entre ingesta y gasto energético. Estudios fisiológicos han sugerido que la masa corporal y las reservas de energía están reguladas homeostáticamente, cualquier cambio en la masa corporal produce cambios en la ingesta y en el gasto que se oponen a la perturbación inicial. Así, desde un punto de vista termodinámico, la obesidad y la delgadez son el resultado de una alteración en este balance (positivo o negativo) entre la ingesta y el gasto energético. La obesidad se produce cuando existe un balance energético positivo como resultado de un desequilibrio entre ingesta calórica y el gasto energético; es decir, aparece cuando el número de calorías ingeridas sobrepasa, de manera crónica, al Introducción 4 número de calorías consumidas (figura 1). Este desequilibrio es una de las consecuencias de la evolución del ser humano hacia sociedades industrializadas, en donde la disponibilidad y la composición de la comida, además del reducido (o nulo) ejercicio físico voluntario requerido para la vida cotidiana y la consecución de alimento, son factores críticos para la aparición y expansión de la obesidad. El cuerpo humano está diseñado evolutivamente para el almacenamiento de grasas en tiempos de disponibilidad nutricional, que son consumidas en los periodos en los que el acceso a comida está restringido. En la actualidad la disponibilidad de la comida es muy abundante, lo que hace que el consumo de esas reservas grasas no se lleve a cabo. Figura 1. Representación esquemática del balance entre ingesta y gasto energético. Modificado de (4). Además del aumento de la cantidad de comida ingerida, el otro factor que desregula en balance energético es el gasto energético. Se entiende por gasto energético la suma de la actividad física, el metabolismo basal y la termogénesis adaptativa. Cuando se habla de ejercicio se está refiriendo al movimiento voluntario, mientras que por metabolismo basal se entiende todos aquellos procesos bioquímicos necesarios para mantener las funciones vitales. La termogénesis adaptativa se refiere a la energía disipada en forma de calor en respuesta a cambios ambientales, como pueden ser la exposición al frío o a alteraciones en la dieta, aunque realmente no está del todo bien Introducción 5 definido el límite entre esta y el metabolismo basal, debido a que se puede llegar a considerar que la respuesta al frío puede ser parte de este metabolismo. Todo este gasto energético está orientado a quemar todas esas grasas acumuladas en el tejido adiposo. Como consecuencia de la forma de vida en los países occidentales, sobre todo en las grandes ciudades, el gasto energético se ve disminuido al mínimo, lo que lleva a que el balance energético que debería tender hacia el equilibrio, esté inclinado de una forma muy importante hacia el almacenamiento de grasas sin gasto energético, lo que a largo plazo conduce al sobrepeso y a la obesidad (1;5;6). Además de estos factores ambientales y sociales, existe otro factor determinante en la regulación de la masa corporal de un individuo: su propia dotación genética (6). La existencia de factores genéticos es a día de hoy uno de los mayores objetos de estudio en las sociedades avanzadas. Desde hace ya más de una década se han investigado moléculas clave en el desarrollo de la obesidad, como es el caso de leptina o ghrelin, y se han descubierto numerosos neuropéptidos y vías metabólicas que actuando en el sistema nervioso central (SNC) modulan la ingesta. Finalmente, también se ha avanzado notablemente en el conocimiento de las bases moleculares del gasto energético. Todos estos factores se integran formando un sistema regulador de la homeostasis energética, que busca el equilibrio entre todas las señales para mantener la masa corporal entre umbrales específicos. A grandes rasgos, el mantenimiento de un correcto balance entre ingesta y gasto energético depende de tres elementos reguladores de la respuesta homeostática (7-9): - Señales periféricas: • Procedentes del tracto gastrointestinal (señales de saciedad) • Hormonales - Sistema nervioso central Introducción 6 SEÑALES PERIFÉRICAS En los últimos años, se ha visto con gran claridad la existencia de una interacción entre el SNC y la actividad de numerosos órganos involucrados en la homeostasis energética. Esto requiere la transmisión de información al cerebro, y el control de la ingesta es un componente del balance de energía en donde la señalización endocrina de la periferia al SNC tiene un papel fundamental (figura 2). La homeostasis energética consiste en procesos interrelacionados integrados por el cerebro para mantener las reservas de energía a niveles apropiados para unas condiciones ambientales determinadas. La homeostasis incluye la regulación de los niveles de nutrientes en órganos de almacenamiento, como puede ser la grasa en el tejido adiposo, y en la sangre, como la glucosa sanguínea. Para llevar a cabo esto, el cerebro recibe información continuada: 1) acerca de las reservas y de flujo de energía en órganos críticos; 2) acerca de los nutrientes que están siendo ingeridos y absorbidos y, 3) sobre las necesidades energéticas basales por lo tejidos. El cerebro controla tejidos que tienen mucha importancia en la homeostasis energética, como pueden ser hígado o músculo, a través, fundamentalmente, del sistema nervioso autónomo (SNA) y de la secreción de hormonas activas metabólicamente (9). Las señales periféricas que informan acerca de la ingesta y del gasto energético pueden ser divididas en dos categorías claramente diferenciadas (10;11). Una comprende las señales generadas durante las comidas que causan saciedad; es decir, señales que informan sobre la terminación de la comida o que prolongan el intervalo hasta la siguiente. El otro grupo de señales incluye hormonas que se secretan en proporción a la cantidad de grasa corporal. Estas hormonas adipocitarias llegan al cerebro transportadas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) e interaccionan con sus receptores de membrana específicos, expresados preponderantemente en el hipotálamo. Todas estas señales interactúan con otros factores hipotalámicos para controlar el apetito y la masa corporal (9-11). Introducción 7 Figura 2. Diferentes señales periféricas que informan al SNC acerca del estado energético. Tomado de (12). SEÑALES DE SACIEDAD. Señales procedentes del tracto gastrointestinal Estas señales están íntimamente ligadas a las tres fases en la que se suele diferencias la ingesta de alimentos: 1) fase prepandial (previa al acto de comer), 2) prandial (durante el propio acto de comer) y 3) postprandial (posterior al acto de comer). La sensación de hambre puede ser definida como la motivación para buscar y consumir alimentos, que inicia el acto de comer. La saciedad es el estado en el cual el hambre y el comportamiento alimentario están inhibidos. El objetivo de estas fases está encaminado a la búsqueda de un estado de saciedad. El tracto gastrointestinal juega un papel crucial en la regulación de la ingesta de alimentos, informando al SNC sobre la cantidad de alimento ingerido y la composición nutricional de mismo (13;14). Esta información engloba toda una serie de estímulos mecánicos, químicos y hormonales que se denominan señales de saciedad, y son los mecanismos de control homeostático a corto plazo. El SNC recibe información sensorial procedente de estímulos mecánicos, que informan sobre el grado de distensión del tubo digestivo y aportan información sobre la cantidad de alimento ingerido, y químicos, que aportan información sobre la composición nutricional del mismo. Esta información llega al SNC, concretamente a Introducción 8 núcleos del tronco cerebral como el núcleo del tracto solitario (NTS) y el área postrema (AP), a través de las aferencias vagales del ganglio cervical superior. Sin embargo, la señalización procedente del tracto gastrointestinal no está basada únicamente en estímulos nerviosos. A través de la secreción de hormonas, fundamentalmente anorécticas con la excepción de ghrelin, el tracto gastrointestinal también informa al SNC del estado nutricional. Una de las primeras de estas hormonas descubiertas fue la colecistoquinina (CCK), que es secretada en respuesta a los lípidos y las proteínas de la comida (15). La liberación de esta hormona activa los receptores de los axones vagales en el duodeno; la señal generada es transmitida al troncoencéfalo a través del nervio vago, y de éste a otras zonas cerebrales, incluyendo el hipotálamo, y contribuye a la aparición de la sensación de saciedad. Se ha visto que la CCK no previene el inicio de las comidas sino que su acción es la de adelantar el fin de la comida que se está llevando a cabo (16;17). En diversos estudios se ha observado que en modelos animales la administración de exógena de CCK reduce la ingesta calórica, que se compensa con una mayor frecuencia en las comidas (18). Además de la CCK existe un gran número de señales gastrointestinales (tabla 1). Estas se caracterizan por promover la sensación de saciedad; por ejemplo: el glucagón-like peptide-1 (GLP-1), la oxintomodulina o el polipéptido pancreático (PP). Las características más importantes de estas hormonas se describen en la tabla 1. Como ya se ha dicho anteriormente, existe una única excepción, el ghrelin, que hasta el momento es la única hormona gastrointestinal conocida que tiene un efecto orexigénico. Esta hormona, descubierta a finales de la década de los 90 (19), es sintetizada en el estómago y necesita de una modificación post-transcripcional única para ser biológicamente activa. Ghrelin es acilado en el tercer residuo aminoacídico por un enzima denominada gastric O.acyl transferase (GOAT) (20). Ghrelin se ha llegado a denominar como la “hormona del hambre”, debido a su efecto estimulatorio sobre el apetito y en la ingesta al ser administrado tanto de modo ICV como IP en ratas (21-23). Los niveles de ghrelin circulante aumentan en situaciones de ayuno, incrementándose de forma muy pronunciada antes de las comidas y cayendo a niveles mínimos una hora después de la comida (24). Estos hallazgos han llevado a proponer que ghrelin actúa como un iniciador de la ingesta. La caída en los niveles postprandiales de ghrelin es proporcional a las calorías ingeridas, causando la grasa una menor supresión en sus niveles que los carbohidratos o las proteínas (25;26). Otras características de ghrelin se pueden ver en la tabla 1. Introducción 9 Tabla 1. Relación de los principales péptidos gastrointestinales y sus efectos en la ingesta y la homeostasis energética. Hormona Lugar de Secreción Factores que modulan su secreción Receptores Sitios de acción Acciones sobre regulación de ingesta Ref. Colecistoquinina (CCK) Células I de la mucosa del intestino delgado Dietas ricas en grasa y proteínas CCK1 Nervio vago Tronco cerebral Hipotálamo Saciedad Posible papel patogénico en obesidad (16;2729) Oxintomodulina (OXM) Células L del intestino Macronutrientes GLP-1R Hipotálamo Saciedad Gasto energético (30-33) Glucagon like-peptide (GLP-1) Células L del intestino Macronutrientes Somatostatina Restricción calórica GLP-1R Nervio vago Tronco cerebral Hipotálamo Saciedad Potencia la liberación de insulina Posible papel patogénico en obesidad (34) (35-37) Péptido YY Células L del intestino Macronutrientes Ejercicio Y2 Nervio vago Tronco cerebral Hipotálamo Circuitos de Recompensa Saciedad Gasto energético Regulación a largo plazo de la masa corporal. Posible papel patogénico en obesidad (38-40) Polipéptido Pancreático (PP) Células PP en los islotes de Langerhans del páncreas Macronutrientes Ejercicio Distensión gástrica CCK Somatostatina Y4,Y1, Y5 Nervio vago Tronco cerebral Saciedad Gasto energético Posible papel patogénico en obesidad (41-44) Ghrelin Células X/A de la mucosa gástrica Pérdida de sueño Restricción calórica Macronutrientes Ritmos circadianos GHS-1Ra Nervio vago Tronco cerebral Hipotálamo Circuitos de Recompensa Iniciador de comidas Regulación a largo plazo de la masa corporal. Posible papel patogénico en obesidad (19;2123;45) Introducción 16 ventrolateral del ARC, se caracteriza por suprimir agudamente la ingesta después de ser administrada de modo intracerebroventricular (ICV) en ratas y ratones (100;101). Un gran número de observaciones sugieren un papel fisiológico para esta respuesta anoréctica de α-MSH. Por ejemplo, las condiciones asociadas a una reducción de la ingesta de alimentos, como el ayuno o la deficiencia de leptina, van acompañadas de una reducida expresión de este péptido, mientras que en estados de sobrealimentación su expresión disminuye (102;103). El efecto de este péptido se debe a que es un potente agonista de MC3-R y MC4-R, que como ya se ha dicho anteriormente, al activarse causan un efecto anorexigénico muy fuerte (92;93). Por otra parte, otro de los neuropéptidos que se expresan en el hipotálamo, AgRP, es un antagonista selectivo de los receptores 3 y 4 de las melanocortinas. AgRP es un neuropéptido que al igual que NPY, con la que se co-expresa en un 90% en el ARC, está regulado negativamente por la leptina, siendo su expresión más alta en casos de ayuno (104) o mutación del gen de la leptina (ratones ob/ob y db/db), y menor en casos de sobrealimentación o administración ICV de leptina. Su acción orexigénica, como se ha dicho anteriormente, se produce cuando antagoniza los receptores de melanocortinas, aunque se ha demostrado que el efecto sobre la ingesta de la administración ICV de AgRP se mantiene durante más tiempo que el de la administración de NPY. Este hecho ha llevado a postular dos teorías muy diferentes: 1) que puede ser debido a que está actuando a través de otro mecanismo además del sistema de melanocortinas (105;106) ó 2) que es debido a un problema de cinética del receptor, presentando el antagonista de AgRP mucha mayor afinidad por su receptor que el antagonista de NPY (107). Otro de los neuropéptidos que se expresa en el ARC y que actúa regulando ingesta es CART. Este péptido se co-expresa con POMC y también tiene efecto marcadamente anorexigénico (78;79). Las neuronas que secretan CART también están asociadas con recompensa y refuerzo, procesamiento sensorial o estrés (108). La administración ICV de CART, especialmente en el 4º ventrículo, provoca activación neuronal en el PVH, causando así la reducción de la ingesta normal y la inducida por ayuno (109). CART colocaliza con receptores de leptina en las neuronas del hipotálamo. Tanto en ratas fa/fa (deficientes en la señalización de leptina) como en ratones ob/ob, reduce los niveles de expresión de CART en el ARC, mientras que la administración de leptina a ratones ob/ob incrementa el mRNA de CART (110). Los niveles de expresión de CART caen Introducción 17 durante el ayuno o diabetes, indicando que la expresión de este tránscrito está regulada por la cantidad de reserva energética y el estado hormonal periférico (111). Figura 5. Proyecciones de las neuronas del ARC hacia neuronas de segundo orden. Todas estas poblaciones neuronales del ARC emiten proyecciones hacia otras zonas hipotalámicas (figura 5). Estas neuronas, denominadas neuronas de primer orden (10;112), actúan, por ejemplo en el caso de NPY, enviando señales hacia PVH (en donde existe expresión de sus receptores), DMH y LH. Tanto AgRP como POMC tienen proyecciones hacia, entre otras zonas, el PVH en donde antagonizan o agonizan, respectivamente, a los receptores de melanocortinas presentes. Estas neuronas que reciben proyecciones desde el ARC son denominadas neuronas de segundo orden y se ha demostrado que están implicadas fisiológicamente en la homeostasis energética (10;107;113-116). Núcleo Ventromedial Este núcleo es de gran importancia en la regulación de la ingesta (figura 6). Desde los primeros estudios en los que se observó que lesiones en esta región producían un fenotipo hiperfágico y obeso, hasta otros en los que se utilizaban lesiones químicas y tratamientos farmacéuticos, se apunta la posibilidad que este núcleo actúe inhibiendo ingesta y aumentando metabolismo (23;117;118). Se ha llegado a denominar como un “centro de saciedad”. Introducción 18 Figura 6. Factores implicados en la regulación de la ingesta a nivel del VMH. Tomado de (74). El VMH recibe proyecciones de las neuronas inmuno-reactivas de NPY, AgRP y POMC del ARC, y a su vez proyecta sobre otras zonas hipotalámicas (DMH y ARC) y otras regiones del cerebro (NTS) (119). Aunque las proyecciones provenientes de ARC son menores que en otros núcleos, se ha propuesto que la actividad del VMH puede estar modulada por las neuronas de NPY y POMC, debido a que en él se expresan los receptores de NPY Y1 e Y5, y también MC4-R (120-124). La administración de NPY en el VMH aumenta la ingesta. El ayuno está asociado con unos niveles de proteína elevados de este neuropéptido en esta región (107;120), mientras que la respuesta electrofisiológica de las neuronas en el VMH a α-MSH está disminuida en animales en ayuno y/o tratados con AgRP (124). Existe un número elevado de factores que ejercen sus acciones directamente en el VMH debido a que es en las neuronas de este núcleo en donde se expresan un gran número de receptores para las señales metabólicas, como pueden ser ghrelin, leptina, estrógenos u hormonas tiroideas. Además, este núcleo tiene un papel fundamental en la vía síntesis/oxidación de ácidos grasos a nivel hipotalámico, como se verá más adelante (epígrafe de Metabolismo de Lípidos). Los estudios sobre el papel de la leptina en el control metabólico se han centrado fundamentalmente en las acciones sobre el ARC. Sin embargo, estudios recientes identifican las neuronas que expresan el factor esteroidogénico tipo 1 (SF-1) en el VMH como neuronas de primer orden mediadoras de los efectos de la leptina en la regulación de la masa corporal (125). SF-1 es esencial para el correcto desarrollo y funcionamiento del VMH (126;127). Se ha demostrado que la co-expresión del receptor de leptina y SF1 en las neuronas de este núcleo es fundamental para el control de la homeostasis mediada por leptina (125). Además, la deleción específica del receptor de leptina en las neuronas de SF-1 conlleva la aparición de patologías propias del síndrome metabólico, tales como la esteatosis hepática, hiperleptinemia o dislipemia (125;128). Introducción 19 También se ha visto que en el VMH se expresa el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), implicado en la regulación del desarrollo neuronal y su plasticidad, y cuya expresión se reduce en situaciones de ayuno (129). Se ha comprobado en humanos que la alteración de BDNF o su receptor TRKB causan hiperfagia y obesidad, además de retraso en el desarrollo mental, disminución de la memoria a corto plazo e hiperactividad (129-131). Este factor, que interviene en las funciones metabólicas reguladas por el VMH, está regulado a su vez por distintos factores nutricionales. Este efecto no es mediado por el sistema de melanocortinas, a diferencia de lo que se pensaba inicialmente, ya que BDNF reduce la ingesta y la masa corporal en ratones deficientes de MC4-R (129). Núcleo Paraventricular Está situado en la parte anterior del hipotálamo, próximo a la parte superior del tercer ventrículo (3V) y se ha descrito que su destrucción implica la aparición de hiperfagia. Al igual que el VMH, es un núcleo que integra señales (tales como NPY, AgRP o POMC) procedentes del ARC y de otra regiones del SNC. Además es un núcleo muy sensible a la administración de péptidos implicados en la ingesta, como CCK, NPY, ghrelin o leptina. Como ocurre con el VMH, estos péptidos pueden actuar mediante la modulación de la kinasa activada por AMP (AMPK) ya que la administración de péptidos anorexigénicos inhibe la subunidad AMPKα2, mientras que los péptidos orexigénicos la activan (132). Figura 7. Regulación de la ingesta a nivel del PVH. Tomado de (74). Una de las características más relevantes de PVH es que es el principal productor de hormona liberadora de corticotropina (CRH) y de hormona liberadora de Introducción 20 tirotropina (TRH), ambos factores anoréxicos. Es en este núcleo, más concretamente en su división parvocelular, en donde se encuentra la neurona hipofisiotrópica de TRH (133;134). Los axones de esta neurona hipofisiotrópica proyectan a la zona externa de la eminencia media en donde la TRH es liberada cerca de los capilares del sistema portal hipofisario, y puede entonces llegar hasta la hipófisis anterior en donde ejerce su función como regulador de la secreción de la hormona estimuladora del tiroides (TSH) (134). La función más importante de TRH es la de mantener la homeostasis de las hormonas tiroideas a través de la regulación de la TSH de la células tirotropas de la hipófisis. La unión de TRH con sus receptores estimula la expresión génica de las subunidades de TSH a través de la ruta de fosfatidilinositol (135). Además, TRH regula la actividad biológica a través de la modulación de la glicosilación de TSH (136). La deleción o mutación de TRH provocan un hipotiroidismo muy severo con niveles muy bajos de TSH y de hormonas tiroideas circulantes (137). Se ha descrito una relación inversa entre los niveles de hormonas tiroideas (TH) y la expresión de TRH en el PVH durante la inducción de hipoe hipertiroidismo. Además, la TRH es de gran importancia en la homeostasis energética debido a que ejerce efectos sobre ingesta, termogénesis, activación del aparto locomotor o la regulación de SNA (138). Otro factor que se expresa en el PVH es CRH, que es modulado por las proyecciones de NPY del ARC para tener influencia sobre la homeostasis energética. Además, CRH modula la producción hipofisaria de POMC, que es el precursor de la adrenocorticotropina (ACTH), la cual modula la producción de glucocorticoides adrenales (139). Núcleo Dorsomedial El DMH se ha implicado en la regulación del balance energético; sin embargo, su función era desconocida hasta hace no mucho tiempo. El DMH está implicado en una gran variedad de mecanismos reguladores que incluyen la modulación de la secreción de glucocorticoides, temperatura corporal, sueño y ritmos circadianos de la actividad locomotora (140;141). Este núcleo recibe proyecciones de las células del ARC y de otras zonas cerebrales implicadas en la regulación de la ingesta. Se ha visto que lesiones provocadas en este núcleo inducen hiperfagia, aunque los animales mantienen la misma composición corporal (142). Además, en este núcleo existe una pequeña población de neuronas que expresan NPY, que podrían estar mediando en la hiperfagia observada en ratas preñadas y en Introducción 21 lactantes (143;144), así como en modelos de obesidad genética como el ratón agouti y el MCR4 KO (145-147). También se ha localizado una abundante expresión de CART. Aunque no está del todo claro su función, se piensa que puede estar involucrado en la respuesta a situaciones de ayuno (148). Hipotálamo lateral Durante mucho tiempo fue considerado el “centro del hambre”. Se ha visto que animales con lesiones provocadas en este área desarrollaron un fenotipo hipofágico y delgado. En él existen dos poblaciones principales de neuronas: las que expresan orexinas (OX-A y OX-B, también llamadas hipocretinas) y las que expresan la hormona concentradora de melanina (MCH), ambos neuropéptidos orexigénicos. Estas neuronas están inervadas por axones de POMC y NPY, sugiriendo que su función estimulando ingesta podría estar mediada por el sistema de melanocortinas del ARC (70). Tanto orexinas como MCH proyectan a una gran variedad de núcleos y zonas extrahipotalámicas, lo que hace que participen en procesos tales como el sueño (orexinas), función neuroendocrina, aprendizaje, memoria o motivación (149-155). Figura 8. Factores implicados en la regulación de la ingesta a nivel del LHA. Tomado de (74). Núcleo Supraquiasmático La función del núcleo supraquiasmático (SCN) en el balance energético ha sido eclipsada por la función que este tiene como mediador de los ritmos circadianos de las funciones biológicas (156). El SCN controla la secreción circadiana de las hormonas metabólicas y se piensa que regula el contenido de tejido adiposo estacional y mantiene las pautas de los niveles de glucosa (157;158). La destrucción de SCN provoca ingesta continua debido a la pérdida del patrón circadiano, y mutaciones en el gen clock (un factor de transcripción expresado en el SCN que es crítico para la generación de los ritmos circadianos) provocan la aparición de fenotipo obeso. Introducción 22 El SCN proyecta a muchos núcleos hipotalámicos, sobre todo a PVH y DMH (156). Existen estudios que sugieren que el ARC proyecta al SCN, lo que podría indicar que el sistema de melanocortinas puede influenciar su actividad (159). OTRAS ZONAS DEL SNC Tronco Cerebral Se ha descrito la existencia de conexiones entre el hipotálamo y el tronco cerebral, particularmente en el núcleo del tracto solitario (NTS), y se han encontrado neuronas que están implicadas en el control autónomo de la ingesta, digestión y absorción de comida. Al igual que el ARC, el NTS se encuentra cerca de la zona en donde la BBB es más laxa, para poder responder a las señales periféricas circulantes, además de recibir aferencias vagales del trato gastrointestinal (70). Se ha encontrado una gran cantidad de sitios de unión para NPY, incluyendo los receptores Y1 e Y5 (160-162). Además, también se ha descrito que existe expresión de MC4-R y la síntesis de péptidos derivados de POMC, lo que evidenciaría la existencia de un sistema de melanocortinas diferenciado del ARC (163). Cerebelo Se han encontrado conexiones bidireccionales entre neuronas hipotalámicas y el cerebelo mediante estudios electrofisiológicos (164). Está relacionado con la motivación de comer, y se ha comprobado que la saciedad disminuye la actividad del cerebelo mientras que la administración oral de glucosa la aumenta. Desde el cerebelo salen proyecciones hacia otras zonas implicadas en la regulación de la ingesta tales como NTS (164). Hipocampo Está relacionado con la memoria espacial, así como de eventos y hechos. Además, está implicado en la regulación de la ingesta ya que presenta receptores de señales metabólicas tales como insulina y leptina, necesitando para ello que presente integridad estructural (165). La exposición a dieta alta en grasa está asociada a aumento de ingesta, ganancia de peso y disminución de la memoria (166). Introducción 23 Área tegmenal ventral (VTA) La relevancia de esta zona es debida a la presencia de neuronas dopaminérgicas. La presencia de estas neuronas en el VTA y que proyectan sobre el núcleo accumbens (NAc) se ha implicado en sistemas de recompensa asociados a la comida (167). Aunque inicialmente se creía que las señales metabólicas modificaban el sistema de la dopamina a través del ARC, ahora se cree que las propias neuronas dopaminérgicas del VTA son sensibles a distintos péptidos hipotalámicos tales como NPY, AgRP y orexinas, y también a ghrelin, insulina o leptina (70). GASTO ENERGÉTICO Hasta el momento solo se ha descrito uno de los dos componentes de la ecuación del balance energético: la regulación de la ingesta. Es de gran importancia, debido al auge actual en las investigaciones, tener en cuenta el otro factor que modula este balance, que como ya se ha dicho anteriormente, es el gasto energético. Al igual que ocurre con la regulación de la ingesta, cualquier variación o modificación en el balance del gasto energético lleva asociada alteraciones en la masa corporal de un individuo. Para poder entender el gasto energético desde un punto de vista fisiológico es necesario explicar los diferentes conceptos que lleva asociados. Se ha descrito que el gasto energético se podría dividir en tres tipos más o menos bien diferenciados de uso de la energía: 1) metabolismo basal, 2) actividad física (ejercicio) y 3) termogénesis adaptativa (figura 9). El primero de ellos, usa la energía almacenada para llevar a cabo todos esos procesos biológicos necesarios requeridos para el mantenimiento de las células y de los órganos; es decir, representa un gasto de energía obligatorio para el correcto funcionamiento del organismo (1;168). Introducción 24 Calorías Ingeridas (Ingesta) Metabolismo Almacenamiento de energía (grasa) Gasto energético total = calor producido + trabajo inducido por condiciones ambientales Termogénesis adaptativa Metabolismo basal obligatorio Variable, regulada por el cerebro Tiene lugar en las mitocondrias del BAT, músculo esquelético y otros Responde a cambios de temperatura y a la dieta Actividad Física Variable Requerido para mantenimiento de funciones celulares y corporales Figura 9. Factores implicados en el gasto energético. Modificado de (169). Uno de los factores que ayudan más activamente al aumento de la prevalencia del sobrepeso y de la obesidad en la sociedad actual es la actividad física. Como ya se ha dicho, uno de los problemas más perjudiciales de las sociedades industrializadas es el sedentarismo que conduce a poco ejercicio físico necesario para poder desempeñar las actividades cotidianas; es decir, el poco gasto de energía acumulada necesario para el día a día. Esta disminución en la liberación de la energía lleva como consecuencia su almacenamiento como grasa y, como consecuencia directa, un aumento en la adiposidad y la masa corporal al no poder ser gastadas las calorías ingeridas (1;5;6). El último de los factores implicados en el gasto energético es la termogénesis adaptativa: la energía gastada en forma de calor en respuesta a cambios ambientales, como pueden ser el frío o la dieta. Se podría decir que su función primordial es proteger al organismo de esos cambios ambientales (169;170). Las bases moleculares de este mecanismo son bastante complejas y se tratarán en profundidad en el próximo apartado. TERMOGÉNESIS ADAPTATIVA. Tejido adiposo marrón. Tanto la aclimatación al frío como los cambios en la dieta consumida son capaces de producir variaciones muy importantes en el gasto energético total de un individuo. Se sabe que ante la exposición al frío el cuerpo se protege con una serie de estímulos agudos como son, por ejemplo, los escalofríos (temblores en respuesta a las Introducción 25 bajas temperaturas). Para la aclimatación al frío o a la variación a la dieta, el organismo necesita una producción de energía mucho mayor que cuando se encuentra en condiciones normales. Este intento de producir energía en respuesta al ambiente se denomina termogénesis adaptativa (168;171). En la producción de calor juega un papel crucial el tejido adiposo pardo (brown adipose tissue; BAT) (5;169;170). A pesar de estar compuesto por células grasas, la constitución del BAT es totalmente diferente a la del tejido adiposo blanco (white adipose tissue WAT). El BAT está ampliamente inervado por el sistema nervioso simpático (SNS), que hace que tenga una respuesta mucho más rápida a su estimulación, un hecho clave en su función termogénica (5;169;170;172;173). Además, existe una característica bastante llamativa, que es la presencia de gran cantidad de mitocondrias en los adipocitos del BAT (el lugar en donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa y la que da lugar a la producción de calor ) (174). Los primeros estudios llevados a cabo sobre la fisiología y la actividad termogénica del BAT fueron desarrollados en animales que se someten a periodos de hibernación en los que el organismo se debe proteger contra el frío sin la ayuda de ningún otro factor que ayude a mantener la temperatura corporal (5;175). Se ha visto que en ratas este tejido presenta mayor actividad termogénica en hembras que en machos, y que en ellas el tamaño de las mitocondrias es mayor (176). En humanos se creía en un principio que únicamente se podía encontrar BAT en recién nacidos (177), pero se ha descrito que en respuesta al frío se puede transactivar de los depósitos de WAT para dar lugar a termogénesis (178;179). En los últimos años se ha estudiado más en profundidad y por medio de técnicas más novedosas la evolución de los depósitos de BAT con la edad en humanos. Se ha descrito que muchos de los depósitos encontrados durante la niñez disminuyen o incluso desaparecen (180). En diversos ensayos publicados durante el año 2009 se ha visto, usando la tecnología PET (positron emission tomography; PET)(181-183), el aumento de los depósitos de BAT tras la exposición al frío, y que este tejido presenta mayores niveles de UCP-1, D2 ó receptores adrenérgicos (181). Además, también se ha visto que existe una relación entre los depósitos de BAT y la masa corporal, siendo menores los depósitos encontrados en individuos que presentan obesidad (182). Asimismo, se ha descrito que la mujeres presentan mayor cantidad de BAT que los hombres (183). La gran cantidad de mitocondrias existentes en las células del BAT, es fundamental para que se produzcan la fosforilación oxidativa y la termogénesis (175). Introducción 32 Tras UCP-1 se descubrieron dos homólogos de esta proteína: UCP-2 y UCP-3 (uncoupling protein 3; UCP-3). Se cree que están involucrados de alguna manera en la termogénesis adaptativa. Ambas proteínas presentan un 58% de homología con UCP-1, y la gran diferencia entre todas ellas es el lugar de expresión (209). Mientras que UCP-1 se expresa únicamente en los adipocitos del BAT, UCP-2 está expresado, además de en BAT, en otros tejidos como corazón, pulmón o WAT. UCP-3 se caracteriza por tener una elevada expresión en el músculo esquelético (en donde su papel es muy importante), aunque también se ha encontrado en BAT (210). A pesar de estar expresadas en BAT, tanto los niveles de UCP-2 como UCP-3 son mucho más bajos que los de UCP-1 (del rango de 200:1). Además, se ha observado que aunque exista expresión de mRNA no siempre hay expresión de estas proteínas en BAT (211). Tras el estudio de los ratones deficientes en estas proteínas se ha confirmado que no juegan ningún papel alguno en la función termogénica, por lo menos en lo vinculado a la exposición al frío. Tampoco se ha visto que estén reguladas en animales normales tras adaptación al frío o por el cambio de dieta (168;212-215). Se ha postulado que pueden funcionar como mecanismo de compensación al menos en BAT, en estados en los que la actividad de UCP-1 está reducida. En otros tejidos desempeñan otras funciones como es el caso de UCP-2, que está involucrada en la limitación de especies reactivas al oxígeno (ROS), regula de modo negativo la secreción de insulina o controla el metabolismo de ácidos grasos (211). En el caso de UCP-3 cabe destacar la función que lleva a cabo en músculo como desacoplador de la fosforilación oxidativa; el músculo es un tejido en el que se ha postulado que puede tener lugar la termogénesis. En diferentes estudios se ha visto que UCP-3 no tiene un efecto directo sobre la función termogénica, que puede ser debido a su baja expresión con respecto a la de UCP-1 en el BAT. La expresión específica de músculo tanto de mRNA como de proteína hace de UCP-3 un candidato mejor para llevar a cabo la termogénesis en este tejido (216;217), pero se ha demostrado que su expresión solo se ve alterada durante el primer día de exposición a frío, volviendo a niveles basales tras la aclimatación a bajas temperaturas (218;219). Existen indicios de que esta proteína puede estar involucrada en la termogénesis, pero realmente aun no está del todo clara su relevancia (219). Otro modelo interesante que aporta mucha información sobre la importancia de toda la ruta descrita previamente en la termogénesis adaptativa es el ratón con los receptores adrenérgicos β delecionados. Estos animales presentan una mayor masa corporal, que es atribuida a que estos ratones presentan mayor cantidad de grasa, aun sin Introducción 33 que presenten una mayor ingesta (220). Otro hecho que va en concordancia con la importancia de esta vía es que tras la exposición a dieta rica en grasas estos animales ganan peso muy rápidamente, indicando que los receptores adrenérgicos están mediando la activación de la termogénesis inducida por dieta. En el caso de la exposición al frío de estos animales se ha descrito que pierden la capacidad de responder al estímulo creado por la temperatura y no son capaces de mantener su temperatura corporal entre umbrales óptimos; este hecho va acompañado de una menor expresión de los genes implicados en la termogénesis, como UCP-1 o D2 (220). Por otra parte, otra evidencia del papel relevante del SNS es que estos ratones muestran un menor gasto metabólico; es decir, la consumición de oxígeno es menor a la de los ratones control (220). Estos trabajos clarifican la importancia del mantenimiento del sistema β-adrenérgico intacto para que se lleve a cabo el proceso termogénico, y por tanto, se mantenga el balance energético en un estado óptimo. El fenotipo del ratón β3AR-null no presenta fenotipo normal; únicamente tiene un leve aumento en la masa grasa y en la masa total de las hembras (192). Esto puede deberse a un mecanismo compensatorio con los otros receptores adrenérgicos. Además de los β-AR, sobre todo β3-AR, se ha descrito que los receptores adrenérgicos α pueden tener influencia en el gasto energético. En el caso del α2-AR se ha visto que también responde a la estimulación de la NE, pero su activación causa efectos opuestos a los de la activación β-adrenérgica, disminuye actividad de la vía de la adenilato ciclasa e inhibe la termogénesis (170). En el caso de α1-AR, se ha comprobado que responde a estímulos de NE, pero una de sus funciones principales es la de liberar iones Ca+2 intracelular que inducen el grado de termogénesis a un nivel de cAMP dado (221). Regulación transcripcional de UCP-1 Como se ha visto hasta el momento, la proteína mas involucrada en la termogénesis adaptativa es UCP-1. Además de su activación, es crítica la regulación de la expresión de su gen, que está mediada por un amplio número de factores de transcripción. La regulación de UCP está mediada por cAMP que, como se ha visto anteriormente, aumenta los niveles de PKA, y a su vez es capaz de fosforilar CREB (222). En el promotor del gen ucp-1 existe una región enhancer de 200 pares de bases que promueve la transcripción en respuesta a la estimulación β-adrenérgica (y por lo tanto dependiente de cAMP) y que es selectiva de la grasa parda (223;224). Además, en Introducción 34 el promotor del gen se encuentra otra región similar a la anterior que presenta sitios de unión para diferentes receptores nucleares, como son el receptor activado del proliferador del perixosoma (perixosome proliferator-activated receptor; PPAR), el receptor de hormonas tiroideas β (TRβ) o el receptor X de ácido retinoico (RXR). Al ser activados por sus correspondientes ligandos incrementan la transcripción de ucp1(169;222) (figura 14). Estos receptores se encuentran formando heterodímeros (PPAR/RXR y TRβ/RXR) que necesitan un cofactor para involucrarse en la transcripción de ucp-1. Dicho cofactor, el co-activador de PPARγ 1α (peroxisome proliferator-activated receptor-coactivator, PGC-1α), actúa como regulador transcripcional y se ha visto que su co-expresión activa de modo muy fuerte ambos heterodímeros (225;226). Este co-activador responde a estímulos adrenérgicos y por lo tanto está regulado por cAMP. Existe otro miembro de la familia de PGC-1, el PGC-1β; se ha descrito que esta isoforma está preferentemente implicada en procesos de biogénesis mitocondrial, aunque se ha visto que en el ratón PGC-1β KO el BAT pierde la capacidad de mediar la termogénesis termoregulatoria tras la exposición al frío (227). Figura 14. Mecanismo de la regulación transcripcional de UCP-1. Tomado de (169). La acción del heterodímero formado por TRβ/RXR, además de necesitar de la activación por PGC-1α, está mediada por la actividad de la deiodinasa 2 (D2). Esta es dependiente de cAMP y aumenta la síntesis de triiodotironina (T3), que estimula la Introducción 35 actividad de TRβ en la región enhancer del gen ucp-1(169;222). Esto lleva a pensar en un posible papel de las hormonas tiroideas en la termogénesis, pero este punto será discutido más adelante (epígrafe de Hormonas tiroideas y ermogénesis adaptativa). Además de a estos estímulos, la expresión de UCP-1 y los genes involucrados en la termogénesis son sensibles a otras señales; por ejemplo, como ya se ha escrito, los depósitos de BAT son más pequeños en individuos obesos, y esto va acompañado con la represión de la expresión de UCP-1. Existen diversos estudios que demuestran la implicación de la leptina y otras señales periféricas en el proceso termogénico; se ha descrito que ratones ob/ob o db/db presentan un menor gasto energético (168;228), indicativo de que la termogénesis adaptativa no responde del mismo modo que en animales normales, y que la administración de leptina a ratones normales induce la termogénesis aumentando la expresión de UCP-1 y PGC-1 (170). METABOLISMO DE LÍPIDOS Hace más de cincuenta años se identificó la molécula de malonil-Coenzima A (malonil-CoA), un derivado del ácido malónico, como un intermediario en la síntesis de ácidos grasos (229). Se demostró que esta molécula, producto de la acción de la acetilCoenzima A carboxilasa (ACC) sobre la acetil-Coenzima A (acetil-CoA), jugaba una papel fundamental en la regulación tanto de la síntesis como de la oxidación de ácidos grasos en tejidos periféricos (230). Para poder visualizar la importancia de los niveles de malonil-CoA sobre distintas funciones del organismo es necesario entender de un modo general la ruta de síntesis de ácidos grasos (figura 15). Introducción 36 Palmitoyl-CoA Acetyl-CoA Malonyl-CoA Palmitate pACC FAS AMPK ACC Outer membrane Matrix Cristae Mitochondria CPT1 CPT2 pAMPK Inner membrane MCD ACS Figura 15. Síntesis de ácidos grasos. De toda esta vía, los enzimas que actúan directamente, y por tanto que regulan la cantidad de malonil-CoA presente en el citosol, son ACC, malonil-Coenzima A descarboxilasa (MCD), sintasa de ácidos grasos (fatty acid synthse; FAS) y la carnitín palmitoil transferasa-1 (CPT-1) (55;231). El paso crítico de producción de malonil-CoA es el sistema formado por ACC y MCD. La regulación de estos enzimas se considera fundamental para la posterior utilización del malonil-CoA. ACC es el enzima encargado de carboxilar acetil-CoA para formar malonil-CoA, mientras que MCD tiene la función contraria; es decir, cataliza la conversión de malonil-CoA en acetil-CoA. ACC puede presentarse como dos isoformas diferenciadas: ACCα (ACC1) y ACCβ (ACC2), y aunque ambas tienen la misma función se encuentran en diferentes tejidos. ACCα es una proteína citosólica que se encuentra en tejidos lipogénicos, aquellos en los que es fundamental la síntesis de ácidos grasos, como pueden ser el hígado y el WAT (232;233). La mayor parte del malonil-CoA formado por esta isoforma sirve como sustrato para la formación de ácidos grasos de cadena larga (long chain fatty acids; LCFAs). Se ha demostrado que ACCβ está anclada a la membrana mitocondrial externa, y está mayoritariamente expresada en tejidos que carecen de síntesis lipídica. En estos tejidos (músculo esquelético o músculo cardiaco, por ejemplo) es fundamental la utilización de los ácidos grasos para la obtención de energía, en ellos se lleva a cabo la β-oxidación(232-234). El punto crítico de acción de ACC es la regulación de su actividad enzimática. Se ha descrito que existen tres modos diferentes de modificar la actividad de este enzima: la actividad de ACC es inhibida por dos metabolitos de la ruta de síntesis lipídica, alostéricamente por los niveles de LCFA-CoAs, y también por su sustrato, malonil-CoA, de modo competitivo. ACC experimenta también una fuerte activación alostérica por citrato, que previene la unión de los LCFA-CoAs y por tanto de su función inhibitoria. Además de las interacciones alostéricas que causan la Introducción 37 modificación su actividad, ACC está regulado por la fosforilación en sus residuos de serina, siendo fosforilada por PKA (Ser1200) y por AMPK (Ser79) (232;235-239). La fosforilación causa la inactivación de ACC in vivo al impedirse el correcto ensamblaje de los monómeros de ACC, aunque mientras que PKA causa una reducción de menos del 15% en su actividad, AMPK disminuye hasta un 90% la actividad de ACC (240). Tanto su activación como el control de su expresión marcan la cantidad de malonil-CoA producido y por tanto los ácidos grasos serán oxidados en la mitocondria para la obtención de energía o se almacenarán para periodos de escasez energética. La regulación de la actividad mediante fosforilación por AMPK depende de factores nutricionales y hormonales: AMPK es una kinasa que se fosforila (activa) dependiendo de los niveles de ATP y AMP y es activada cuando el ratio AMP:ATP está aumentado; es decir, actúa como un sensor del estatus energético del organismo, activándose en situaciones de balance energético negativo (mayores niveles de AMP) (55;241-246). En los últimos años se ha postulado otro modo de regulación de AMPK que no es directamente a través de AMP:ATP: el aumento de AMP inactiva la defosforilación de AMPK por PP2Cα (protein phosphatase-2Cα; PP2Cα). La inhibición de PP2Cα y la activad constitutiva de LKB1 (kinasa “upstream” de AMPK) tiene entonces como consecuencia el aumento en la fosforilación y por lo tanto en la actividad de AMPK (242;243;247-249). Además de estar regulada por AMP, se ha encontrado que la fosforilación de AMPK es dependiente tanto de CaMKKα (Ca+2/Calmodulin kinase kinase α) como de CaMKKβ (Ca+2/Calmodulin kinase kinase β), que activan AMPK al aumentar los niveles intracelulares de Ca+2 (250;251). Recientemente se ha identificado una nueva kinasa capaz de fosforilar in vitro AMPK, TAK1 (transforming growth factor-β-activated kinase) (252), y una kinasa supresora de Ras (KSR2) que interactúa con la subunidad α1 de AMPK para regular su actividad (253). Se ha encontrado también un mecanismo diferente de la fosforilación e independiente de los niveles de AMP que modula de actividad de AMPK. En este proceso, CIDEA (celldeath-inducing like-effector A; CIDEA) forma un complejo con la subunidad β de AMPK que da lugar a la degradación mediada por ubiquitinación de AMPK reduciendo su actividad kinasa (254) (figura 16). Introducción 38 AMP:ATP β γ α AMPK β γ α Thr 172 pAMPK PP2Cα CIDEA LKB1 CaMKK2 TAK1CaMKK1 P Ca +2 AMP AMP AMP KSR2 Figura 16. Estructura y regulación de AMPK. Existe otro factor encargado de regular los niveles de malonil-CoA: MCD, que al contrario que ACC, cataliza su desaparición para producir nuevamente acetil-CoA. Se ha descrito que MCD presenta en roedores niveles más elevados tanto de RNA como de proteína en hígado y corazón, aunque también existe en niveles altos en otros tejidos como músculo esquelético, riñón o páncreas, mientras que en humano, la mayor expresión es en músculo esquelético y corazón (255-257). La actividad enzimática en hígado y corazón es elevada y en músculo varía según la capacidad oxidativa de las diferentes fibras. Es en el músculo cardiaco donde presenta la actividad más elevada, y las fibras IIb, donde su actividad es menor debido a que estas tienen menor capacidad oxidativa (257;258). Se ha hipotetizado sobre la forma en la que MCD es regulada. Unos estudios especularon con la posibilidad de que aquellas kinasas que inactivan ACC, activan MCD, mientras que otros defienden la idea de que no es necesaria la fosforilación y que no está claro a qué nivel se produce su regulación (si a nivel de RNA o de proteína) (240). Existen otros estudios que muestran que se activa en músculo tras la realización de ejercicio físico (259). Otro estudio demuestra que la activación de MCD en músculo Introducción 39 es dependiente de la fosforilación de AMPK (260), aunque a día de hoy su activación en otros tejidos, por ejemplo en hipotálamo, no está de todo clarificado (261). Tras la formación de malonil-CoA, este metabolito juega un papel fundamental en siguientes pasos de la vía. Esta molécula, además de servir como sustrato en la biosíntesis de ácidos grasos es capaz de regular la β-oxidación inhibiendo la actividad de CPT-1. Como intermedio de la ruta de síntesis de ácidos grasos, malonil-CoA es sustrato de un paso que lleva hacia la producción de palmitato. El complejo enzimático que cataliza dicha conversión es FAS, que por medio de una serie de reacciones encadenadas da lugar a la producción de palmitato. Más tarde, tras la acción de AcilCoenzima A Sintetasa (ACS), se convierte en palmitoil-CoA (la forma activa) a partir de moléculas de malonil-CoA, acetil-CoA y NADPH procedente de la ruta de pentosas fosfato en la que se transforma oxaloacetato citosólico en piruvato (4). Al igual que ACCα, FAS se expresa de forma muy abundante en tejidos lipogénicos como hígado o WAT, que se caracterizan por ser lugares de almacenamiento de grasas. El hecho de que la actividad de FAS sea mínima en tejidos no lipogénicos, como el músculo esquelético o cardíaco, es debida a que los LCFA-CoAs resultantes sirven únicamente como sustratos para la β-oxidación, no siendo necesario sintetizar LCFA-CoAs para almacenar (262;263). A diferencia de otros enzimas de la ruta que se regulan de modo posttraduccional, alostéricamente o mediante fosforilación, FAS se regula únicamente a nivel de RNA. Su expresión en tejidos periféricos varía en función de la dieta, la glucosa, de hormonas tiroideas y de SREBP-1c (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c). Este último es un factor de transcripción que actúa como mediador de los efectos de la insulina sobre enzimas lipogénicos, como ACCα, FAS o SCD-1. Se ha descrito que en situaciones de deficiencia energética, como el ayuno, la actividad de FAS disminuye drásticamente en tejidos lipogénicos, como resultado de la regulación transcripcional dependiente de SREBP-1c y AMPK, que actúa como kinasa upstream de este factor de transcripción (263). Como se ha dicho previamente, malonil-CoA juega un papel fundamental en la regulación de la entrada de los LCFA-CoAs en la mitocondria para que se lleve a cabo la β-oxidacion. Los enzimas encargados de esta translocación de los LCFA-CoA al Introducción 40 interior de la mitocondria son las carnitin palmitoil tranferasas (CPTs) (264). Existen dos tipos distintos de CPTs: la CPT-1 y la CPT-2. La CPT-1 está presente en la membrana externa de la mitocondria y se caracteriza por llevar a cabo la transferencia del grupo acilo desde la CoA hacia la carnitina, dando lugar a la producción de acilcarnitina en el espacio intermembrana. Una vez traspasada la membrana externa, es CPT-2 proteína anclada a la membrana interna de la mitocondria, la que lleva a cabo el siguiente paso. Este enzima transfiere el grupo acilo desde la carnitina hacia el grupo CoA, para volver a formar LCFA-CoA dentro de la mitocondria y llevar a cabo la βoxidación y la consiguiente producción de energía en forma de ATP (figura 17). De este sistema de CPT, la única proteína que está sometida a regulación por medio de malonilCoA es CPT-1. La regulación es inversamente proporcional a los niveles de malonilCoA existente: a menor nivel de este metabolito, mayor es la activación que ejerce sobre la actividad enzimática de CPT-1 debido a que la caída en los niveles de CPT-1 es traducida como una situación de deficiencia energética, y es necesaria la producción de energía por medio de la β-oxidación. Es importante distinguir tres subtipos de la CPT-1, que según el tejido en el que sea expresada, se puede dividir en CPT-1L, que es la isoforma presente en hígado, CPT-1M, en músculo y CPT-1C que se expresa en cerebro (265-269;269-271). Figura 17. Mecanismo de acción de CPTs. Introducción 41 Hasta este momento solo se han descrito los componentes más importantes de la síntesis de novo de ácidos grasos por separado, comentado los aspectos más importantes de su regulación y expresión en diferentes tejidos. Para comprender mejor su importancia fisiológica, es fundamental poder visualizar esta ruta desde un punto de vista global; cómo varía toda la cascada atendiendo a las necesidades del organismo en general y de cada tejido en particular. Tratando a todo el conjunto de enzimas y metabolitos como un sistema en el que en cada uno de ellos se reflejan las fluctuaciones de los componentes ”upstream” de la vía, es clave visualizar al primer enzima de la cascada, AMPK, como el desencadenante de los consiguientes cambios en biosíntesis de ácidos grasos. Puesto que, como ya se ha explicado anteriormente, AMPK está regulado directa o indirectamente por los niveles de ATP, se puede proponer esta proteína como un sensor del balance energético, que varía en función de las necesidades del organismo. La fosforilación de AMPK inhibe el anabolismo (como la síntesis de ácidos grasos, triglicéridos) y estimula los procesos catabólicos (como la oxidación de ácidos grasos, glicolisis, captación de glucosa) en un intento de restaurar los niveles de ATP (55;241;242;245). Un aumento en el ratio AMP:ATP, que indica una situación de deficiencia de energía, lleva asociado un incremento en la fosforilación de AMPK (directa o indirectamente): el aumento de esta provoca la fosforilación e inactivación de ACC, lo que tiene como consecuencia una menor síntesis de malonil-CoA. La disminución de los niveles de malonil-CoA, indicativos de un balance energético negativo, tiene un efecto activador sobre CPT-1 favoreciendo la entrada de LCFA-CoAs en la mitocondria para su posterior oxidación y por tanto producción de energía en forma de ATP. La regulación de toda esta vía es de gran importancia en todo el organismo, pero es fundamental en tejidos lipogénicos, en donde marca la activación de la oxidación de los ácidos grasos frente a su síntesis, un proceso clave en este tipo de tejidos para poder almacenar ácidos grasos para su utilización en periodos de restricción energética (272-274). En tejidos no lipogénicos como el músculo, la escasa expresión de enzimas como ACCα o FAS indica que aun en condiciones anabólicas las síntesis de ácidos grasos no se lleva a cabo; simplemente aumenta la capacidad de CPT-1 de internalizar los LCFA-CoAs en la mitocondria para su utilización como sustratos en la β-oxidación, ya que estos tejidos no son lugares de almacenamiento de lípidos. La síntesis de malonil-CoA en estos tejidos es llevada a cabo por ACCβ, lo que lleva a pensar que el malonil-CoA producido por esta isoforma de ACC induce la inhibición de CPT-1(240;263). Introducción 48 HORMONAS TIROIDEAS Desde el descubrimiento de la leptina se han investigado en profundidad los mecanismos centrales que modulan la ingesta y el gasto de energía, y se han identificado un gran número de hormonas y neuropéptidos involucrados en el balance energético. Sin embargo, mucho antes de estos descubrimientos, las hormonas tiroideas (TH) eran conocidas por alterar el metabolismo. De hecho, desde la década de los 40 se usaron de distintas formas para reducir peso (318-320). A pesar de ser unas de las primeras hormonas en descubrirse que afectan a la masa corporal, poco se sabe acerca de sus mecanismos de acción a nivel central sobre la regulación de la ingesta y del balance energético (321). Las primeras evidencias sobre la implicación de las hormonas tiroideas en la regulación de la masa corporal se notaron al ver que individuos con disfunciones tiroideas que presentaban hipertiroidismo o hipotiroidismo, tenían alterado su peso. Individuos con hipotiroidismo tenían su masa corporal incrementada un 30% en relación a un individuo eutiroideo, mientras que el hipertiroidismo hacía que la masa corporal disminuyese en torno al 15% (320;322;323). Tanto en persona como en animales sanos, la concentración en plasma de hormonas tiroideas se contiene relativamente estable. Esto se debe a la existencia de un fino sistema regulatorio de retro-alimentación negativo, el eje hipotálamo-hipófisotiroideo (HHT), que se encarga de controlar de secreción de hormonas tiroideas (TH) (figura 20). A grandes rasgos este sistema regulador se encarga de sintetizar TRH en las neuronas del PVH. La liberación de esta estimula la síntesis y liberación de TSH en la hipófisis, y en último lugar es la TSH la encargada de estimular la producción y secreción de THs en la glándula tiroides. Un incremento en la concentración en plasma de TH inhibe la producción tanto de TRH como de TSH, llevando a una disminución de la función tirocitaria con la intención de restablecer los niveles de TH. La posterior disminución de los niveles plasmáticos de TH hace que desaparezca la señal de retroalimentación negativa, y que el sistema se restablezca de nuevo (134;324;325). Introducción 49 Figura 20. Eje hipotálamo-hipófiso-tiroideo y su mecanismo de retro-alimentación negativa. Tomado de (321). En la tiroides se produce 3,5,3´,5´-tetraiodotironina (también conocida como Ltiroxina o T4), la hormona tiroidea dominante en la circulación. Esta es trasformada en la forma bioactiva 3,5,3´-triiodo-L-tironina (T3) en los diferentes tejidos por medio de la acción de las deiodinasas (326). Estas catalizan la cascada de monodeiodinización secuencial que lleva a la producción, además de T3, de 3,3´,5´-triiodo-L-tironina (T3reversa, rT3), a partir de T4, y de 3,5-L-diiodotironina (T2) y 3,3´-diiodotironina (T2reversa, rT2) a partir de T3 (figura 21). Se han identificado tres tipos diferentes de deiodinasa: deiodinasas tipo1, tipo 2 y tipo 3 (D1, D2 y D3, respectivamente) (327). En rata, D1 se expresa preferiblemente en tejidos periféricos como hígado y riñón, aunque también se encuentra en la hipófisis, tiroides o el CNS; es el enzima encargado de llevar a cabo la deiodinización tanto del anillo externo como del interno de la T4 para dar lugar a T3 o rT3 (327-329). Por su parte, D2 se expresa en hipófisis, en diferentes regiones cerebrales, como las células gliales hipotalámicas, BAT, hígado y músculo, en donde cataliza la conversión de T4 a T3 (327;329;330). D3, que está presente en CNS, placenta o piel, lleva a cabo la deiodinizacion del anillo interno dando lugar a la Introducción 50 producción de rT3 y rT2 (328;331). En condiciones de hipotiroidismo, tanto D1 como D2 están sobre-reguladas para permitir una mayor conversión de T4 en T3 (326). Figura 21. Cascada de monodeiodinización secuencial que lleva a la producción de diferentes THs. Tomado de (332). Uno de los puntos clave de la regulación del sistema que rige la síntesis y secreción de hormonas tiroideas se encuentra a nivel hipotalámico. Como se ha dicho anteriormente (en el epígrafe sobre el PVH) el área hipotalámica encargada de la síntesis de TRH es el PVH. La T3 que llega este núcleo es producida por la D2 presente en los tanicitos, que son las únicas células gliales que se encuentran alrededor del tercer ventrículo (3V). Estas captan la T4 presente en el fluido cerebro-espinal (CSF) (333). Una vez producida la T3 a partir de T4 periférica, esta difunde por todo el cerebro alcanzando el PVH y las neuronas hipofisiotrópicas por medio del transportador de membrana MCT8 (monocarboxilate transporter 8) (321;334). Una vez en las neuronas de TRH, la T3 se une a los receptores de TH (TR) para regular la síntesis de TRH. La T3 unida a TR forma un heterodímero con RXR, que reprime la síntesis de TRH debido a que la formación del heterodímero imposibilita la unión del TR al elemento de respuesta a TH (TRE), que en este caso regula negativamente, existente en el promotor del gen trh (335). Es por ello que en casos de hipertiroidismo, en donde los niveles de T4 circulante son muy elevados, la producción de T3 en los tanicitos y su posterior transporte y unión a TR en el PVH inhibe la síntesis de TRH. Esto disminuye la Introducción 51 liberación de TSH y por tanto también de TH, en un intento de restaurar los niveles plasmáticos basales de T4 (134;324;325). Los mecanismos de acción de TH en los diferentes tejidos también se producen a través de la unión de estas a los TRs, que pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares. Hasta el momento se han identificado diferentes isoformas de estos receptores: TR está codificado por dos genes diferentes, TRα y TRβ, localizados en distintos cromosomas. El splicing alternativo de cada uno de estos dos genes genera múltiples isoformas de TR, incluyendo TRα1, TRα2 y TRα3 a partir del gen TRα, y TRβ1 y TRβ2 desde TRβ, aunque únicamente TRα1, TRβ1 y TRβ2 son capaces de unirse a las THs. Estos receptores tienen una afinidad mucho mayor por T3 que por T4 (del orden de 15 veces más afinidad). Es este hecho el que le confiere a la T3 la denominación de forma bioactiva de todas las THs (336-340). Se han realizado estudios mostrando la localización de las diferentes isoformas de los TRs en el cerebro de rata, y se ha visto que existe una expresión intensa de TRs en el PVH, en el ARC y en la eminencia media (341-343). Además, se ha observado que la expresión de TRβ2 es elevada en el PVH (341). Este receptor se expresa de modo más restringido en el cerebro, frente a TRα1, TRβ1, que tiene una expresión más ubicua (344;345). Esto evidencia que puede ser TRβ2 la que media los efectos de la T3 sobre la regulación de la neurona hipofisiotrópica de TRH. Se han llevado a cabo diferentes estudios para comprobar esta hipótesis, y se ha encontrado que tras el silenciamiento de TRβ2 se bloquea la represión de la transcripción causada por T3 (346). El estudio del ratón trβ2-/- demostró que la expresión basal de prepro-TRH estaba incrementada a niveles de animales hipotiroideos pero que su expresión no variaba significativamente en respuesta a la administración de T3 (347). Además, la supresión de mRNA de prepro-TRH causada por el ayuno se conserva en el modelo KO (347). Hormonas tiroideas y la regulación de la ingesta y de la masa corporal La relación entre el estado nutricional y las hormonas tiroideas se ha estudiado ampliamente desde que se observó que variaciones en el estatus energético llevaban asociados cambios en el eje HHT a través de las THs y viceversa Existen diferentes estudios que demuestran la variación de los niveles plasmáticos de las THs en función del balance energético del animal. Por ejemplo, Introducción 52 durante el ayuno, una situación de balance energético negativo, se ha visto que los niveles de TH en plasma están reducidos, y que además también disminuyen los niveles plasmáticos de TSH y TRH en el PVH (348;349). Esto es en contraste con la situación de hipotiroidismo, en donde reducidos niveles de TH llevan asociados el incremento tanto de TRH como de TSH (350;351). Este hecho sugiere que la caída de TH en plasma sirve para provocar una reducción en el gasto energético; es decir, permite que durante este estado TSH permanezca bajo a pesar de los niveles de T3. Se ha descrito que la diferencia de síntesis y liberación de TRH durante el ayuno y el hipotiroidismo puede ser debida a la distinta expresión de D2 en ambos casos (352); durante el ayuno se produce un incremento en el mecanismo de retro-alimentación negativa debido a la producción de T3 que hace que se suprima la síntesis de TRH. Los mecanismos de la regulación diferencial de D2 no se comprenden de todo, pero en los últimos años se han publicado diversos trabajos que proponen que los cambios vistos en el eje HHT pueden ser debidos a señales no tiroideas. Se ha demostrado que el restablecimiento de los niveles de leptina durante el ayuno revierte el aumento en la expresión de D2 y por tanto, la supresión del eje tiroideo en este estado (353-355). Parece poco probable que el mecanismo de acción de la leptina sobre D2 sea directo sobre los tanicitos del 3V debido a que estos no expresan receptores de leptina. Se ha postulado que el mecanismo de este proceso se lleva a cabo de modo indirecto a través de las neuronas que expresan AgRP, NPY y POMC en el ARC, y que además proyectan a las neuronas de TRH del PVH (356). Se ha mostrado que lesiones en el ARC bloquean el efecto de la leptina en la expresión de TRH (357), y existen estudios que relacionan la acción de la leptina sobre el eje tiroideo con el sistema de melanocortinas (358), puesto que se ha visto que MC3/4-R están presentes en el PVH (138). Algunos estudios relacionan la hiperfagia característica del hipertiroidismo con los niveles de expresión de diferentes neuropéptidos del ARC. Así, se ha descrito que la inducción del estado hipertiroideo en ratas causa un incremento en la expresión de un neuropéptido orexigénico como NPY, mientras que disminuye los niveles de los anorexigénicos como POMC y CART (359). Este último también tiene disminuida su expresión en el PVH al igual que en el ARC(360). se ha Descrito que la alteración del estado tiroideo no varía la expresión de las OXs y de MCH en el LHA (360)}. Además del ARC, se ha visto que el VMH asimismo tiene un papel clave en la regulación de la ingesta por hormonas tiroideas. Se ha publicado que la administración Introducción 53 de dosis altas de T3 en este núcleo estimula ingesta. El mecanismo mediante el cual se produce este incremento de la ingesta aun no se conoce con certeza, pues no se han detectado cambios en los niveles de expresión de los diferentes neuropéptidos tras la administración de T3 (361). Se piensa que esta respuesta a THs en el VMH puede estar mediada por otras moléculas involucradas en la regulación de la ingesta en este núcleo como pueden ser la dopamina, la serotonina o el BDNF (361). Además del control que ejerce la leptina sobre eje HHT, las THs también juegan un papel fundamental en la regulación de diversas adipokinas, como leptina, resistina o adiponectina, influenciando la homeostasis del peso corporal. Existen diferentes estudios en roedores que demuestran cómo variaciones en el estado tiroideo afectan a los niveles de circulantes de estas adipokinas, aunque en humanos los resultados publicados son discordantes. Por ejemplo, en el caso de la leptina, se ha visto que en ratas la inducción del hipertiroidismo causa la disminución de sus niveles plasmáticos, mientras que en ratas hipotiroideas, los niveles de leptina son mayores que los de las ratas con estado tiroideo normal (362-364). A pesar de estos resultados obtenidos en modelos animales que demuestran que las THs regulan los niveles de leptina, en humanos los estudios publicados hasta el momento muestran datos contradictorios. Así, se ha descrito en diferentes estudios que tanto el hipertiroidismo como el hipotiroidismo no modifican los niveles plasmáticos de leptina, aunque existen diferentes trabajos que indican que estos niveles están incrementados y otros que muestran que disminuyen (365-391). Estos datos discordantes son visibles también en trabajos con otras adipokinas (384-386;389;392-396). Como ya ha sido comentado, las THs han sido utilizadas desde hace varias décadas como tratamientos contra la obesidad (318-320). A pesar de ello, actualmente no se puede asegurar que los tratamientos con T3 o T4 produzcan reducción en la masa corporal de un individuo (397;398). Tampoco existen evidencias clínicas que confirmen la eficacia de los tratamientos con análogos de las THs como son la D-tiroxina o el TRIAC (ácido 3,5,3'-triiodotiroacético) (398). En la actualidad, y debido al mayor conocimiento existente de los mecanismos de acción de las THs, se está tratando de obtener nuevos tratamientos terapéuticos mediante el uso de agonistas selectivos de sus receptores. Los trabajos que se han llevado a cabo hasta el momento se han centrado casi exclusivamente en diferentes Introducción 54 agonistas de los TRβ, debido a sus efectos sobre el metabolismo hepático (399). Los efectos más importantes que presentan estos agonistas se resumen en la tabla 3. Tabla 3. Efectos y características de diferentes agonistas de TRs. Efectos sobre gasto, masa y composición corporal Efectos sobre lipidos Efectos sobre niveles de THs circulantes Afinidad por TR Ref. GC-1 Gasto energético Masa y grasa corporal = Ingesta FAO Esteatosis hepática Triglicéridos y colesterol LDL Recetores de HDL Transporte inverso de colesterol TSH, T3 y T4 10 veces más selectivo para TRβ que para TRα (400403) KB141 Gasto energético Masa y grasa corporal Glucosa en ratas Zucker y ratones ob/ob Colesterol Recetores de LDL 15 veces más selectivo para TRβ que para TRα (404) GC-24 Gasto energético Previene incremento de masa grasa Expresión génica en BAT Sensibilidad a la insulina Colesterol y triglicéridos TSH, T3 y T4 40 veces más selectivo para TRβ que para TRα (405;406) KB2115 = Gasto energético = Masa corporal Colesterol total y LDL Síntesis de ácidos biliares TSH = T3 y T4 (407) DIPTA Masa corporal Triglicéridos y Colesterol total y LDL TSH, T3 y T4 Baja afinidad por TR (408;409) Hormonas tiroideas y termogénesis adaptativa La importancia de las TH en el gasto energético y en la termogénesis adaptativa se puede observar fácilmente en el hecho de que las ratas hipotiroideas no sobreviven a la exposición prolongada al frío y no incrementan la activación ni expresión de UCP-1 tras la administración exógena de norepinefrina (NE) (410;411). Desde hace algunos años se sabe que el contenido de T3 en el BAT está profundamente influenciado por la expresión de D2, que convierte T4 en T3, y que además, este enzima es activado a través del SNS e inhibido fuertemente por su sustrato Introducción 55 T4 (326;412) (figura 22). Estas evidencias llevan a pensar que tanto T3 como SNS interactúan en el proceso termogénico. Se produce un efecto sinérgico que lleva a producir una respuesta máxima a la exposición al frío en forma de un gran incremento tanto en actividad como en expresión de UCP-1. Este supuesto efecto común que le otorga a T3 y al SNS se puede verificar claramente en el hecho de que en ausencia de TH, por ejemplo durante condición de hipotiroidismo, la estimulación de UCP-1 por NE es mínima, y que además, en animales con el BAT denervado apenas se produce el estímulo de la administración de T3 sobre la expresión de UCP-1 (410;411;413;414). Figura 22. Papel de las THs en la regulación de la termogénesis. Tomado de (415). Las bases moleculares de este denominado efecto sinérgico residen en que en el promotor de gen ucp-1 existen dos elementos de respuesta a hormonas tiroideas (TRE) y un elemento de respuesta a cAMP (CRE) localizados en regiones adyacentes (224;416-418), y en la capacidad de T3 de regular el sistema adrenérgico por sí solo (412). Como se ha dicho previamente, la T3 producido por D2 se une a un TR, y en este caso, como los TRE se regulan positivamente, estimulan la transcripción de ucp-1. Cuando la T3 se une al receptor, en este caso TRα1, forma heterodímeros con RXR o PPARγ a los que se une el co-activador PGC1-1γ para actuar sobre la región promotora de ucp-1 que contiene TRE y comenzar la transcripción. Se ha visto que el ratón con el Introducción 56 gen trα1 delecionado presenta una temperatura corporal más baja, algo que no se ha observado en el ratón trβ-/-, lo que apoya la hipótesis de que es TRα1 el receptor que media la respuesta termogénica de T3 en BAT (326;412). Además del efecto sobre UCP-1, también se ha visto que las THs actúan sobre UCP-2 y UCP-3. Se han publicado estudios que demuestran que tras la administración de T3 en ratas se incrementa la expresión UCP-2 y UCP-3 en corazón y en músculo esquelético (419-421). Se ha observado que en músculo la expresión de UCP-3, la proteína termogénica fundamental en este tejido, está aumentada en condiciones de hipertiroidismo, y disminuida en hipotiroidismo cuando se compara con su expresión en animales eutiroideos (421). Además, se ha visto que durante el hipotiroidismo, la administración de T3 incrementa los niveles de proteína de UCP-3, e incrementa el gasto metabólico basal (411;422). En contraste con estas observaciones, el estudio del ratón ucp-3-/- crea discrepancias sobre el papel de UCP-3 y la termogénesis inducida por THs, al ver que la administración crónica de T3 en este modelo no incrementa el gasto metabólico (212), aunque se ha hipotetizado que podía ser debido a las altas dosis de T3 usadas en este estudio (estas podrían haber sobre-estimulado otros mecanismos termogénicos o a rápida conversión del T3 administrado a T2 u otras tironinas)(411;423). Hormonas tiroideas y metabolismo lipídico Desde hace algunos años se ha investigado acerca de la relación entre las THs y el metabolismo lipídico. Los primeros estudios hechos en modelos in vivo se centraron en el estudio de la variación de la ruta de las síntesis de novo de los ácidos grasos en tejidos periféricos (424-427); desde el comienzo de las investigaciones se han publicado diferentes estudios que muestran resultados discrepantes en cuanto a las acciones de las THs estimulando o inhibiendo lipogénesis en el mismo tejido. Un caso evidente de estos resultados contradictorios se ve en lo que ocurre con WAT; existen estudios que muestran que la administración de T3 disminuye la síntesis de ácidos grasos en este tejido, mientras que otros grupos han publicado que el tratamiento con T3 no afecta en modo algunos a enzimas lipogénicas como FAS. En contraste con estos resultados, se ha descrito que el hipertiroidismo induce el incremento en la expresión de FAS y ACC y por lo tanto, la estimulación de la lipogénesis (425). Introducción 57 Además de los estudios llevados a cabo en WAT, existen diferentes trabajos en los que se intenta caracterizar la modulación del metabolismo lipídico en otros tejidos. Distintas observaciones mostraron que, en músculo, la alteración del estado tiroideo conlleva cambios en AMPK y en toda la cascada de proteínas envueltas en la síntesis de novo. En condiciones de hipertiroidismo se observa un incremento de la activación de los enzimas implicados en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos y una disminución en la concentración de malonil-CoA; es decir, las THs estimulan la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético (427). En animales que presentan hipotiroidismo toda la vía está regulada al contrario: los enzimas lipogénicos están inhibidos y la concentración de malonil-CoA aumenta (426). En un estudio posterior se muestra que los efectos de T3 sobre la activación de AMPK son visibles a corto plazo (427). En hígado, la inducción del estado tiroideo tiene los mismos efectos sobre lipogénesis, con la única variación de que en este tejido las diferencias son mayores que las vistas en músculo: el hipertiroidismo inhibe lipogénesis y el hipotiroidismo la estimula (427). Recientemente se ha descrito la relación entre las THs y vía de síntesis de ácidos grasos a nivel hipotalámico (428). En este trabajo, en el que se usa una dosis de T3 considerablemente alta, se observa que tras la administración de T3 ICV se estimula ingesta. Esta alteración en la ingesta está acompañada por los incremento vistos de AMPK y ACC (en sus formas activas), y que además, tras la inhibición de AMPK mediante la administración de compuesto C se pierde el efecto orexigénico que T3 presenta a nivel central (428).    MaterialesyMétodos 65 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN En este trabajo se utilizan ratas Sprague-Dawley (Animalario General, Universidad de Santiago de Compostela). En todos los diseños experimentales se tratan ratas macho adultas (peso aproximado de 250-300g). Los animales permanecen en el animalario durante 5 ó 6 días antes de ser usados, para que se adapten a las condiciones de temperatura y luz. Estas condiciones, que se mantienen constantes, son de 21-23º C e iluminación controlada con ciclos alternos de 12h (luz/oscuridad). Las ratas son alimentadas con pienso comercial y agua ad libitum. En aquellos casos en los que es necesaria la cirugía, se utiliza como anestésico una mezcla de Ketamina-Xilazina en unas proporciones determinadas. La dosis administrada es de 200 μl/100 g de masa corporal, considerándose esta una dosis adecuada para conseguir una anestesia de grado II-III durante períodos de una o dos horas, siendo la mortalidad muy baja. La anestesia se administra vía intraperitoneal. SOLUCIÓN ANESTÉSICA: i. KETAMINA: 42.5% Ketolar, Parke-Davis, Morris Plañís N.J., (USA). 50 mg/ml. ii. XILAZINA: 20% Rompun, Bayer Leverkusen, Alemania. 2mg/ml iii. SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA 37.5%. Todos los experimentos se realizan de acuerdo con el Comité Ético Animal de la Universidad de Santiago de Compostela, cumpliendo las Normas de Cuidado de Animales de Laboratorio y la Ley Internacional de Experimentación Animal. TÉCNICAS EXPERIEMENTALES in vivo -CANULACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR (ICV) Esta operación debe llevarse a cabo aproximadamente unos 4 días antes del experimento. El objeto de la implantación de estas cánulas es acceder al ventrículo lateral. Se utilizan cánulas de polietileno (PE-20, Clay-Adams, Becton-Dickinson, New Jersey, USA), de calibre fino (1.09 mm de diámetro externo y 0.38 mm de diámetro MaterialesyMétodos 66 interno). En uno de los extremos de la cánula se pone un tope, y se corta en bisel a unos 3/4 mm de distancia, siendo esta parte la que se introduce en el cerebro y que permite el acceso al ventrículo lateral. El extremo opuesto de la cánula se sella hasta el día del experimento. Una vez anestesiados los animales se realiza un corte transversal en la piel de la cabeza a la altura de la frente y hasta la parte posterior de los ojos, dejando al descubierto el tejido subcutáneo, el cual debe ser retirado con ayuda de un bisturí hasta dejar a la vista el cráneo. Se localiza a simple vista el bregma, que separa frontales de occipitales, y que se utiliza como punto de referencia para realizar un orificio (1.2 mm lateral y 1 mm posterior) a través del cual se introduce la cánula. Posteriormente, se añade cianoacrilato para que la cánula quede perfectamente fijada y se selle toda la zona abierta. Para comprobar que la cánula se ha colocado en la posición correcta, se inyecta Protamina 2%, disuelta en agua con acetato sódico, que claramente tiñe el ventrículo lateral de azul, demostrando así la buena implantación de la cánula. -IMPLANTACIÓN DE MINIBOMBAS OSMÓTICAS Para la realización de un tratamiento crónico (8 días) a nivel periférico se usan minibombas osmóticas (modelo 2001; Alza Corp., Palo Alto, CA). Estas bombas, que tienen un volumen de expulsión constante de 1 μl/hora, se rellenan con el compuesto a utilizar o su vehículo hasta un volumen total de 200 μl, y se ponen sobre salino en un baño a 37 ºC durante, al menos, 4 horas previas a la operación para asegurar que ya están liberando el tratamiento cuando se colocan sobre el animal. Para colocar estas bombas se procede a realizar un corte en la zona lumbar de la rata, haciendo un poco de hueco para crear el espacio suficiente para implantar la minibomba. Una vez en el interior, se sutura el corte para evitar que la minibomba se desplace. -ADMINISTRACIÓN DE VECTORES ADENOVIRALES EN EL VMH Una vez anestesiados los animales y comprobado el plano quirúrgico, se les practica un corte de aproximadamente un centímetro en la piel de la cabeza, perpendicular a la sutura sagital del cráneo y se retira el tejido subcutáneo dejando el cráneo al descubierto. A continuación, los animales son inmovilizados en un marco estereotáxico (David Kopf Instruments). Las inyecciones se realizan por duplicado en cada núcleo con una microjeringa Hamilton (Hamilton, Serie 700, Modelo 7001, Vol. MaterialesyMétodos 67 1uL calibre 25) dirigida a las coordenadas estereotáxicas: 2.4, 3.2 mm posterior al bregma, 0.6mm lateral a la sutura sagital y 10.2 mm por debajo de la superficie del cráneo, que se determinan siguiendo las indicaciones del atlas estereotáxico Paxinos G. & Watson C de cerebro de rata (figura 23). El sistema inyector se mantiene en las coordenadas durante 5 minutos adicionales posteriores a la administración intranúcleo. Una vez finalizada la inyección y retirada la microjeringa, la piel de la cabeza se fija al cráneo con cianicrilato (SuperGlue-3, Loctite). ab Figura 23: Imagen parcial de una sección coronal del cerebro de rata en la que se muestra una trayectoria unilateral (rectángulo izquierdo) y el punto de administración (VMH) de los vectores adenovirales empleados. a) Imagen obtenida mediante microscopía. b) representación estereotáxica parcial de una sección coronal del cerebro de rata (Paxinos G. & Watson C.) representativa de la sección mostrada. -CONDICIONATED TASTE AVERSION Este experimento se realiza para averiguar si el tratamiento con una determinada sustancia está causando algún tipo de reacción aversiva a la rata. Para ello, se intenta asociar el tratamiento con sabor dulce (bebida preferida al agua por las ratas). Así, durante los cinco primeros días de experimento se restringe a 2 horas diarias el acceso a la bebida (agua normal), mientras que el día del tratamiento, en el mismo momento de la administración de la sustancia, se le da de beber durante media hora la bebida dulce (agua con sacarina) (231;429;430). Además de la sustancia en estudio y del vehículo, se hace un grupo con LiCl (que se sabe que les produce aversión y gran molestar abdominal). Al día siguiente, a la misma hora que se les permitió el acceso a la bebida los días anteriores, se le ofrecen a cada rata dos botellas, una con agua y otra con sacarina (figura 24). Si el tratamiento administrado les causa algún tipo de malestar, las ratas asociaran el sabor dulce con ese malestar, y elegirán preferentemente el agua corriente como bebida. Mientras que si el tratamiento no tiene ningún tipo de efecto sobre la rata, optaran por beber la bebida dulce. El protocolo del experimento es del siguiente modo: MaterialesyMétodos 68 Día 1-5 Día 6 Día 7 Restricción de bebida (agua) Administración de tratamientos 30 min solución de sacarina 1h 30min agua •Solucion de sacarina •Agua Medirvolúmenes deambasbotellas (2horas) Figura 24. Protocolo seguido para realizar el experimento de Taste Aversion. -PERFUSIÓN INTRACARDIACA El cerebro de la rata se fija mediante perfusión intracardíaca como paso previo al estudio inmunohistoquímico (figura 25). Tras la anestesia intraperitoneal del animal con el anestésico habitual y comprobar el plano quirúrgico (referenciado anteriormente) se procede a la apertura de la cavidad abdominal. Tras la localización del apéndice xifoides, este se levanta ligeramente con unas pinzas procediendo a la rotura del diafragma y al corte de las parrillas costales. Tras la apertura de la caja torácica y del pericardio, a continuación se administra mediante una inyección intracardíaca 200 µl de heparina (Heparina sódica Mayne 5%; Mayne Pharma) en el ventrículo izquierdo, con el fin de evitar problemas de coagulación en los vasos durante la perfusión. A continuación, se realiza una pequeña incisión en la punta del ventrículo izquierdo por la cual se introduce una cánula hasta llegar a la raíz de la aorta. Tras el clampaje de la vía se secciona la orejuela de la aurícula derecha. A través de dicha vía se bombea una solución de suero salino 0.9% NaCl, con el fin de eliminar la sangre del sistema circulatorio. La decoloración del hígado, así como la de la propia solución salina que sale por la orejuela seccionada marca el inicio del proceso de fijado. A través de la misma vía se introducen 500 ml de una solución de formalina (100mM) en tampón fosfato (PB, pH=7.4) durante aproximadamente 10 minutos. La eficacia de la perfusión puede constatarse por la rigidez plena del animal. Los tejidos son diseccionados y mantenidos en la solución de fijado durante 12 horas a 4ºC. A continuación se realizan un par de lavados en tampón fosfato. MaterialesyMétodos 69 Figura 25. Imágenes de diferentes pasos de la perfusión intracardiaca. -REGISTRO DE LA ACTIVIDAD DEL SISTEMA NERVIOSO SIMPÁTICO Una vez anestesiados los animales del modo previamente descrito, se les mantiene bajo anestesia mediante el uso de α-cloralosa (dosis inicial: 25mg/kg, dosis repetidas:50 mg/kg/h) administrada vía catéter en la vena femoral. Una vez anestesiadas, se canula la tráquea para permitir la respiración. La temperatura rectal se mantiene a 37.5ºC usando una mesa quirúrgica de temperatura controlada y una lámpara. Se identifica una fibra nerviosa inervando el BAT interescapular usando un microscopio de disección, y se coloca sobre un electrodo bipolar de platino-iridio al que se le une una sonda de alta impedancia (HIP-511, Grass Instruments; West Warwick, RI USA). La señal se amplifica 105 veces con la ayuda de un pre-amplificador Grass P5 AC. Tras la amplificación, la señal del nervioso se filtra a 100 y 1000 Hz. A continuación, la señal del nervio se acopla a un osciloscopio (modelo 54501A, Hewlett-Packard, Iowa, USA) para monitorizar la calidad del registro del nervio. Las medidas de actividad del SNS en el BAT se realizan cada 15 minutos durante 6 horas tras las microinyecciones ICV o en el VMH. Para asegurarse que el ruido eléctrico es excluido durante el estudio, cada registro se corrige por la actividad que presenta postmortem. (Protocolo experimental realizado por el Dr. Kamal Rahmouni. Departments of MaterialesyMétodos 70 Internal Medicine, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa City, Iowa, 52242, USA) -MEDIDA DE LA COMPOSICIÓN CORPORAL Para la realizar las medidas de composición corporal se ha usado la técnica de resonancia magnética nuclear (Whole Body Composition Analyzer; EchoMRI). Las medidas se realizan el último día de tratamiento, previo al sacrificio de los animales. DISEÑOS EXPERIMENTALES -ALTERACIÓN DEL ESTADO TIROIDEO Gran parte de los diseños experimentales se realizan con ratas con el estado tiroideo alterado. Para la generación de estos modelos se somete a los animales a tratamientos de 19 días en los que se les induce tanto el hipotiroidismo como el hipertiroidismo: -El hipotiroidismo se induce por administración de 0.1% de aminotriazol (Sigma; ref. A8056), 3% de albúmina de suero bovina (BSA, Sigma) y 0.0003% de HCl (Merck) en el agua de bebida durante un período de 19 días. -El hipertiroidismo se induce por administración subcutánea de L-tiroxina (Sigma; ref. T2501) (100 μg/rata/día, disuelta en suero salino, en un volumen de 200 μl) durante 19 días. A los animales control (eutiroideos) y a los hipotiroideos se les suministra la misma cantidad, subcutánea, de vehículo (431;432). Como control negativo de este último experimento, se lleva a cabo un tratamiento subcutáneo de 3,5-diiodotironina (T2) (Sigma; ref. D0629) durante 19 días al igual que se hace con T3. La dosis administrada de T2 es de 100 μg/rata/día en un volumen de 200 µl. Como vehículo se administra 200 µl de suero salino. -TRATAMIENTOS INTRACEREBROVENTRICULARES En todos los casos el tratamiento ICV se hace crónicamente; es decir, se administra la molécula deseada durante cuatro días, justo antes del inicio de la fase oscura, y se sacrifican por la mañana del quinto día. Como ya se ha dicho previamente, MaterialesyMétodos 71 la implantación de las cánulas se debe llevar a cabo cuatro días antes del inicio del tratamiento. Gran parte de los experimentos con este tipo de tratamientos se realiza con ratas hipertiroideas, lo que añade otro factor a la hora de diseñar el experimento. En el caso de estas ratas, se comienzan a tratar con dosis diarias de L-tiroxina (descrito previamente) y a día 11 se les implanta la cánula. A partir de ese día se sigue tratando exactamente igual con la hormona tiroidea y después de cuatro días se comienza con el tratamiento ICV, quedando el diseño experimental del siguiente modo (figura 26): SacrificioComienzode tratamientocon L‐tiroxina Día1Día11 Día15 Día19 Implantaciónde cánulas Iniciodel tratamientoICV Tramiento subcutaneo conL‐tiroxina Figura 26. Protocolo seguido para la realizacion de tratamientos ICV en ratas hipertiroideas. • CERULENIN Para este experimento son necesarios cuatro grupos, dos de los cuales están formados por ratas hipertiroideas. La configuración de los grupos experimentales es la siguiente: - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con CERULENIN - Ratas hipertiroideas tratadas con vehículo - Ratas hipertiroideas tratadas con CERULENIN En todos los casos los grupos experimentales constan de n = 8. La dosis administrada de CERULENIN (Sigma; ref. c-2389) es de 10 µg/5 µl. Como vehículo, DMSO (5µl). • TOFA Como en el caso anterior, el diseño consta de cuatro grupos experimentales: - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con TOFA - Ratas hipertiroideas tratadas con vehículo MaterialesyMétodos 72 - Ratas hipertiroideas tratadas con TOFA En todos los casos los grupos están formados por 8 animales. La dosis administrada de TOFA (Sigma; ref. T6575) es de 10 µg/5 µl. Como vehículo se inocula DMSO (5 µl). • AICAR Como en los experimentos descritos anteriormente, este diseño consta de cuatro grupos experimentales: - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con AICAR - Ratas hipertiroideas tratadas con vehículo - Ratas hipertiroideas tratadas con AICAR Todos los grupos constan de un n = 8. La dosis administrada de AICAR (Sigma; ref. A9978) es de 3 µg/5 µl. Como vehículo de administra salino (5 µl). • T3 ¾ Crónico Para la realización de este experimento son necesarios cuatro grupos. Al contrario que en los experimentos descritos hasta el momento, en este dos de los grupos están formado por ratas hipotiroideas. El experimento está formado por los siguientes grupos: - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con T3 - Ratas hipotiroideas tratadas con vehículo - Ratas hipotiroideas tratadas con T3 ¾ Agudo Son necesarios dos grupos. Las animales se sacrifican tres horas después de la administración de T3. - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con T3 Todos los grupos están formados por 8 ratas cada uno. La dosis administrada de T3 (Sigma; ref. T2877) es de 4 ng/10 µl. Como vehículo de administra DMSO (10 µl). MaterialesyMétodos 73 • T3 + TRAMAMIENTO SUBCUTANEO CON SR59230A Únicamente se realiza con ratas eutiroideas. Es necesario un pretratamiento de dos días con SR59230A (antagonista del receptor adrenérgico β3) previo a la administración crónica de T3 ICV. Los grupos creados para este experimento son: - Vehículo ICVVehículo SC - Vehículo ICVSR59230A SC - T3 ICVVehículo SC - T3 ICVSR59230A SC Los grupos formados constan de 8 ratas cada uno. La dosis y el vehículo de T3 son los mismos citados anteriormente. El tratamiento con SR59230A (Tocris Bioscience; ref.1511) se realiza de modo subcutáneo. Se comienza con el tratamiento dos días de la primera administración de T3. La dosis utilizada de SR59230A es de 3 mg/kg/día dividida en dos inyecciones diarias (una a primera hora de la mañana y otra justo antes del inicio de la fase oscura). La dosis de antagonista se elige teniendo en cuenta un experimento de puesta a punto descrito en un apartado posterior. El vehículo del antagonista es DMSO (200 µg). • RAPAMICINA Este experimento está formado por los siguientes cuatro grupos: - Ratas eutiroideas tratadas con vehículo - Ratas eutiroideas tratadas con RAPAMICINA - Ratas hipertiroideas tratadas con vehículo - Ratas hipertiroideas tratadas con RAPAMICINA Todos los grupos están formados con un n = 8. La dosis administrada de RAPAMICINA (Calbiochem; ref. 553210) es de 50 µg/5 µl. Como vehículo se administra DMSO (5 µl). -TRATAMIENTOS INTRAPERITONEALES (IP) • T3 Este tratamiento se lleva a cabo tratando las ratas durante 4 días. Los animales se sacrifican a día 5. Los grupos necesarios para este diseño son: - Vehículo MaterialesyMétodos 80 - Vehículo SCVehículo IP - Vehículo SCLiCl 0.15M IP - Rapamicina SC-Vehículo IP Los grupos son de 8 animales. La cantidad de Rapamicina administrada es la misma (50 µg) pero en un volumen mayor (200 µl). TÉCNICAS EXPERIMENTALES -HIBRIDACIÓN IN SITU La mayor parte de los neuropéptidos estudiados se expresan en más de un núcleo hipotalámico. La hibridación in situ permite hacer un estudio anatómico, determinando los núcleos en los cuales se expresa el gen y un estudio semicuantitativo del mismo determinando el grado de expresión del mismo. Para todas las hibridaciones in situ analizadas en este trabajo se utilizaron como sondas desoxioligonucleótidos monocatenarios antisentido. • Parámetros de diseño de los desoxioligonucleótidos. El diseño de las sondas de hibridación in situ se realiza a través del programa informático Primer Express (Applied biosystems). Para ello, basándose en la secuencia de cDNA del gen, se diseñan una pareja de sondas para la amplificación del mismo, manteniendo para todos ellos los mismos parámetros (tabla 4). Se selecciona siempre la sonda antisentido. Tabla 4. Parámetros de diseño de los desoxioligonucleótidos. Tª media (ºC) % GC Tamaño (bp) Mínimo 75 45 30-34 Máximo 100 65 45 Óptima 90 40 . • Obtención de los cortes Tras el sacrificio del animal los cerebros son rápidamente congelados en CO2 sólido, manteniendo su anatomía, y almacenados en un congelador a -80°C hasta el momento de su uso. Los cortes del cerebro se realizan en un criostato (HM505E ® , Microm) en secciones de 16 μm de grosor. Los cortes resultantes se montan en portaobjetos de MaterialesyMétodos 81 polilisina (Microscope Slides Polysine, VWR) para facilitar la adhesión de los cortes. Las secciones se eligen en función del área de expresión del gen de estudio basándose en los criterios estereotáxicos del atlas “The rat brain” de Paxinos & Watson (433). • Marcaje de la sonda Los oligonucleótidos se marcan en el extremo 3’ con [α35S] dATP (Amersham). La reacción de transcripción se lleva a cabo en un volumen total de 20 μl, con las siguientes proporciones: - 100 ng del oligonucleótido en cuestión (tabla 5) - 2 μl de tampón de reacción (“10X one-phor all buffer: 100mM tris-acetato, 100 mM acetato de magnesio, 500 mM acetato de potasio, Amersham) - 2 μl de [α32S] dATP (Amersham), con una concentración de 12.5 μCi/μl y una actividad específica de 1250 Ci/mmol (46.2 TBq/mmol) - 34 unidades de Tdt (terminal deoxynucleotidil tranferase, Amersham) La mezcla de reacción se incuba durante un intervalo de 120-150 minutos a 37°C. Transcurrido ese tiempo se procede a la purificación de la sonda a través de columnas de Sephadex (Nick ™ column, Amersham) previamente lavadas con tampón de elución estéril (20 mM Tris-HCl pH 7.5, Merck; 2 mM EDTA pH 8, Merck). Se eluyen tres fracciones en 400 μl del tampón, y se cuentan 4 μl de cada una en el contador β (WinSpectral 1414 ® , Wallac). La segunda fracción corresponde al oligonucleótido marcado. • Preparación del tejido (Pre-hibridación) Las secciones, una vez seleccionadas, se someten a un proceso de secado rápido para eliminar la capa superficial de hielo y con ello evitar cualquier interferencia en el proceso de fijación. La fijación se realiza por inmersión de los cortes en una solución de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato (PB) 0.2 M (38 mM NaH2PO4, Sigma; 0.15 M Na2HPO4, Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se realizan dos lavados rápidos con tampón fosfato sódico (PBS) (72mM NaCl, Sigma; 9.5 mM NaH2PO4, Sigma; 39 mM Na2HPO4, Sigma) y se deshidratan los mismos mediante inmersiones sucesivas en concentraciones crecientes de etanol (Merck) (70, 80, 90, 95 y 100%, 5 minutos cada uno a excepción de la inmersión final en etanol absoluto que se realiza durante 10 minutos). Finalmente las secciones se dejan secar al aire. MaterialesyMétodos 82 Sobre cada porta se aplican las cuentas (cpm) necesarias (tabla 5) en función del oligonucleótido de estudio, en 200 ul de una solución de hibridación que contiene: SSC 4X (SSC 20X: 3M NaCl, Sigma; 280 mM C6H5Na3O7.2H2O, Sigma), 50% formamida desionizada (Sigma), disolución Denhart´s 1X (albúmina de suero bovino (BSA) 1%, ficoll 1%, polivinilpirrolidona 1%, Sigma), 440 μg/ml de DNA de esperma de salmón (Sigma) y 10 % dextrán sulfato (p/v) (Sigma). Las secciones se incuban con la sonda durante toda una noche en un horno de hibridación en unas condiciones de humedad y temperatura (37ºC) constantes. • Lavados Una vez hibridadas las secciones se someten a los siguientes lavados para eliminar los posibles restos de sonda: - Se elimina el grueso de la solución mediante decantación. - 5 lavados a temperatura ambiente en SSC 1X - 4 lavados de 30 minutos a temperatura controlada, a 42 Ó 55°C en SSC 1X en función del oligonucleótido (tabla 6) - un lavado de 1 hora a temperatura ambiente en SSC 1X - lavado rápido en agua milliQ autoclavada - lavado rápido en etanol 70% con 0.3 M de NH4Ac (Sigma Aldrich), lavado rápido en etanol absoluto. - Una vez secos, los portaobjetos se exponen en un cassete (HypersassetteTM Amersham Biosciences) a una película de autoradiografía (Hyperfilm β -Max, Amersham). Los tiempos de exposición varían en función del oligonucleótido (tabla 6). • Cuantificación Las películas autoradiográficas se escanean (CanonScan 9900F) a una resolución de 800X y digitalizadas para su procesamiento con el programa de imagen (ImageJ 1.33, NIH; Maryland, USA). El estudio cuantitativo se realiza corrigiendo de la densidad óptica de las señales de hibridación en núcleos concretos por la señal de fondo del área adyacente. Las áreas de medición (señal positiva y fondos) son idénticas en todos los casos. Todos los grupos experimentales de un mismo ensayo se exponen en la misma película autorradiográfica. MaterialesyMétodos 83 Tabla 5. Oligonucleótidos antisentido para hibridación in situ. Sonda Código GenBank Secuencia AgRP AF206017 5´-CGACGCGGAGAACGAGACTCGCGGTTCTGTGGATCTAGCACCTCTGCC-3´ CART M29712 5’-CCGAAGGAGGCTGTCACCCCTTCACA-3’ FAS NM_017332 5´-GGGTCCATTGTGTGTGCCTGCTTGGGGTG-3´ NPY M20373 5´-AGATGAGATGTGGGGGGAAACTAGGAAAAGTCAGGAGAGCAAGTTTCATT-3´ POMC AF510391 5’-CTTGATGATGGCGTTCTTGAAGAGCGTCACCAGGGGCGTCTGGCTCTT -3’ TRH NM_013046 5’-ATACCAGTTAGGGTGAAGATCAAAGCCAGAGCCAGCAGCAACCAA-3’  Tabla 6. Condiciones de hibridación, lavados y exposición. Sonda cpm (X106) T de lavado (ºC) t de exposición (días) AgRP 1 55 4-5 CART 1 42 5-6 FAS 0,5 55 15 NPY 1 42 4-5 POMC 0,5 55 2-3 TRH 0,5 55 6-7 -WESTERN BLOT El análisis mediante Western Blot (WB) de las distintas proteínas implicadas en el metabolismo de lípidos se realiza en base a protocolos estandarizados por nuestro grupo de investigación. • Extracción de proteínas totales: Se realiza todo el proceso en hielo para evitar que las proteínas se degraden. - Las muestras de tejido se homogeneízan mecánicamente hasta que están completamente disgregadas. - Se añade tampón de lisis en proporción al tejido (1:5 (p:v) si es hipotálamo, 1:10 si es hígado o 1:2 si es WAT). ** Tampón de lisis: 50 mM TRIS-HCl pH=7.5, 1% Triton X-100 v/v, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, MaterialesyMétodos 84 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 5mM Na4P7O2 y 42.75g Sacarosa. Esta solución se conserva a 4º C y en el momento de su uso se le añaden los inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics): 1 pastilla de cóctel de inhibidores/25ml tampón de lisis. Después de los inhibidores de proteasas se añade 0.2% β-mercaptoetanol. - Se centrifuga a 13500 rpm a 4ºC durante 30 minutos. En el sobrenadante se determina la concentración de proteína (método colorimétrico de Bradford) mediante el reactivo Bio-Rad Protein Assay Kit, (Bio-Rad Laboratorios, Inc., Richmond, CA). - Se guarda la muestra a -80ºC, hasta su utilización. - En el momento en que se utilicen las muestras se añade el tampón de carga y tampón de lisis, y se calientan a 95ºC durante 10 minutos. • Electroforesis y Transferencia - La separación por peso de las proteínas se realiza por electroforesis en geles SDS-PAGE, compuesto por dos fases: fase superior o stacking (permite homogeneizar la entrada de las proteínas en el gel separador), y la fase inferior o running (permite la separación de las proteínas exclusivamente en función del tamaño). El porcentaje de acrilamida de esta última fase varía en función del tamaño de las proteínas a estudiar. ** Gel 6%:7 ml H20d 13.5 ml Tampón A (90.1 g Tris-HCl, 2g SDS, 1 l H2Od; pH=8.8), 5.4 ml Acrilamida, 75 μl TEMED y 150 μl APS. ** Gel 8%:5.2 ml H20 d, 13,5 ml Tampón A, 7.2 ml Acrilamida, 75 μl TEMED y 150 μl APS La cantidad total de proteína cargada: 40 μg de hipotálamo, 20 μg de hígado o 15 μg en el caso del tejido adiposo. La cantidad de proteína a cargar se lleva a un volumen final de 16 µl con tampón de lisis y tampón de carga 5X. ** Tampón de carga 5X (25 ml): 12,5 ml glicerol, 1,25 ml βmercaptoetanol, 2,5 g SDS, 0.125 ml azul de bromofenol y 6,25 ml TrisHCl pH 6.8. Para determinar el peso de las proteínas y confirmar la transferencia de las muestras se utiliza un marcador comercial (Precision plus protein Standard, Bio-RAD) MaterialesyMétodos 85 - La electroforesis se lleva a cabo durante 60 minutos aproximadamente bajo las siguientes las condiciones de un voltaje constante de 130 V y un amperaje limitado de 180 mA. ** Tampón de electroforesis 5X (1 l): 72 g Glicina, 15 g Tris base y 5 SDS. Para pasar a 1X: 100 ml de tampón de electroforesis 5X en un volumen final de 500 ml. • Transferencia La transferencia (Semiseca) se realiza sobre membrana de PVDF (Millipore), que debe ser activada previamente (5 minutos en metanol, 2 minutos en H20d y 2 minutos en Tampón de Transferencia). ** Tampón de transferencia 25X (500 ml): 72.5 g Tris base, 36.5 g Glicina y 4.5 g de SDS. Para pasar a 1X: 40 ml del tampón de transferencia 25X, 200 ml de metanol en un volumen final de 1 L de H2Od. Duración trasferencia: 90 minutos a 25 V y 180 mA. - Finalizada la Transferencia se bloquea la membrana con exceso de proteína (BSA 3%) durante 60 minutos de agitación a temperatura ambiente. • Inmunodetección - Se lava la membrana con solución de lavado TBS-TWEEN 0.1 % (24,2 g Tris-Base, 80 g NaCl y 1 ml Tween 20© en un volumen final de 1L, a un pH=7.6) durante unos 30 minutos. - Se incuba con el Anticuerpo primario toda la noche a 4ºC ó 2 horas a Tª ambiente en solución de bloqueo (TBS-TWEEN al 0.1% + 3% BSA) en agitación. La concentración de anticuerpo varía en función de la proteína a estudiar (tabla 7). - Se realizan 3 lavados de 10 minutos cada uno con la solución de lavado. - Se incuba 1 hora a Tª ambiente con el anticuerpo secundario en solución de bloqueo. - Se realizan 3 lavados de 10 minutos cada uno con la solución de lavado. - Se incuba la membrana durante 1-2 minutos con el sustrato y potenciador de quimioluminiscencia a volúmenes iguales (1ml de cada), en oscuridad y sin agitación MaterialesyMétodos 86 Tabla 7. Relación de anticuerpos primarios y secundarios usados y sus correspondientes diluciones. ANTICUERPO PRIMARIO DILUCIÓN Casa Comercial ANTICUERPO SECUNDARIO DILUCIÓN Casa Comercial ACC 1:500 Upstate anti-conejo 1:5000 DaKO cytomation pACC 1:2000 Upstate anti-conejo 1:5000 Dako cytomation AMPKα1 1:1000 Upstate anti-conejo 1:5000 Dako cytomation AMPKα2 1:1000 Upstate anti-conejo 1:5000 Dako cytomation pAMPK 1:2000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation FAS 1:1000 Santa Cruz anti-conejo 1:5000 Dako cytomation CPT1-M 1:500 Santa Cruz anti-conejo 1:7000 Dako cytomation pSTAT-3 1:500 Abcam anti-conejo 1:5000 Dako cytomation p-FOXO1 1.500 Santa Cruz anti-conejo 1:5000 Dako cytomation mTOR 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation pmTOR 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation S6K1 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation pS6K1 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation S6 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation pS6 1:1000 Cell signaling anti-conejo 1:5000 Dako cytomation β-Actina 1:5000 Sigma Aldrich anti-ratón 1:5000 Dako cytomation ** Para detectar la proteína se usa anticuerpo secundario conjugado con HRP y quimioluminiscencia. ** Sustrato de Quimioluminiscencia: Pierce® ECL Wb substrate (Thermo scientific) Cuando el anticuerpo secundario se incuba con el sustrato y el potenciador, se emite una reacción luminosa que permite la visualización, mediante autoradiografía, de la interacción de los anticuerpos con la proteína de la muestra. MaterialesyMétodos 87 - Se coloca la membrana en un cassette de autoradiografía con películas fotográficas (Amersham, Hiperfilm M RPN 6K) y se revelan las películas a distintos tiempos en función de la señal obtenida. 1. Para re-incubar la membrana con otros anticuerpos es necesario incubarla en solución de “stripping” durante 30 minutos a 50ºC. Así se consigue despegar el anticuerpo de la membrana. 2. ** Solución de “stripping”: 6.25 ml Tris-HCl pH 6.8, 20 ml SDS, 710 μl β-mercaptoetanol. Completar con H20d hasta un volumen final de 100 ml. A continuación se lava con solución de lavado (3 lavados de 5 minutos) y se procede a bloquear de nuevo la membrana. Para conservar la membrana para futuros experimentos se lava en PBS, se seca al aire sobre un papel de filtro y se guarda. • Cuantificación Las películas autorradiográficas son escaneadas (CanonScan 9900F) a una resolución de 400X y digitalizadas para su procesamiento con el programa de imagen (ImageJ 1.33, NIH; Maryland, USA). El estudio cuantitativo se realiza corrigiendo la densidad óptica de las señales de inmunodetección por la señal de fondo de cada placa. Las áreas de medición (señal positiva y fondo) son idénticas en todos los casos. Todos los grupos experimentales de un mismo ensayo fueron expuestos en la misma película fotográfica. MaterialesyMétodos 88 -RT-PCR I. EXTRACCION DE RNA TOTAL • Extracción de RNA de los tejidos Las muestras congeladas son homogeneizadas mecánicamente (Polytron) después de añadirles 500 ml de Trizol (TRIZOL® Reagent; Invitrogen) Después de la homogeneización las muestra se dejan reposar a Tª ambiente durante unos 5 minutos. • Aislamiento de RNA A continuación se añade 1 ml de CHCl3, se agita fuertemente durante varios segundos y se deja reposar durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se centrifuga 15 minutos a 12000 rpm a 4ºC, observando ya claramente las 2 fases: una fase acuosa (donde se halla el RNA) y una fase orgánica (que contiene las proteínas y los lípidos). Entre ambas se encuentra la interfase (donde está el DNA). Se retira la fase acuosa con cuidado pasándola a otro tubo de polipropileno autoclavado y se desprecia la fase orgánica. De esa manera se separa el RNA del resto de los componentes celulares. • Precipitación de RNA Una vez separado el RNA, se le añade 1 ml de isopropanol, se agita y se mete a -20ºC durante unos 10 minutos, consiguiendo así que el RNA precipite. Transcurrido este tiempo se centrifuga 10 minutos a 12000 rpm a 4ºC para concentrar el RNA al fondo. • Lavado Una vez eliminado el sobrenadante se añade 1 ml de etanol al 70% en H2ODEPC, y tras una agitación corta se centrifuga durante unos 5 minutos a 12000 rpm y 4ºC. Para eliminar la mayor cantidad de etanol posible, se vuelve a centrifugar 1 minuto a 13500 rpm y 4ºC, y posteriormente se retira el sobrenadante con una pipeta. MaterialesyMétodos 89 Finalmente se resuspende en H2O DEPC calentándolo a 60 ºC durante 15 minutos. • Cuantificación La concentración de ARN de la muestra se determina en un espectofotómetro ajustado a 2 longitudes de onda: 260 y 280 nm. La absorbancia a 260 nm proporciona la cantidad de ácidos nucleicos y a 280 nm la cantidad de proteína. El grado de pureza de la muestra se determina estudiando el cociente 260/280, considerándose aceptable la oscilación entre 1.4 y 1.8 ** H2O DEPC: agua bidestilada con dietilpirocarbonato al 0.1%. Tras una noche a Tª ambiente se autoclava. II. RETROTRANSCRIPCIÓN (RT) La reacción de retrotranscripción se lleva a cabo en un volumen total de 30 μl, con las siguientes proporciones: - Volumen de muestra necesario para obtener: 500 ng (grasa) ó 100 ng (hígado) de RNA total - 6 μl de tampón de reversotranscripción (5X first strand buffer; Invitrogen)(250 nM Tris-HCl, pH 8.3, 375nM KCl, 15mM MgCl, 50nM DDT) - 1.5 μl Mg2Cl 50 mM (Invitrogen) - 6 μl de mezcla de dNTPs (dTTp, dCTp, dGTp, dATp, con una concentración de 10 mM de cada uno) - 0.17 μl de Random primers (Invitrogen) - 0.25 μl inhibidor de RNasa (RNaseOUT®, 40 U/μl Invitrogen) - 2 μl de m-MLV reversotranscriptasa (200 U/μl, Invitrogen) - Volumen correspondiente de H20 MQ para obtener el volumen final de 30 μl También se realiza una RT- (30 μl de mezcla de reacción excepto M-MLV, cuyo volumen era sustituido por H20 MQ) MaterialesyMétodos 96 concentración que el anticuerpo primario; 3) pre-absorción del anticuerpo primario con el péptido control (Cell Signalling) a una concentración 1-10 nmoles/mL. La reacción fue obsevada y fotografiada bajo un microscopio de fluorescencia Provis AX70 (Olympus Corp., Tokyo, Japan) • Detección inmunohistoquímica de la expresión de c-FOS a) Incubación en anticuerpo primario c-FOS (Santa Cruz) en dilución 1:1000 durante toda la noche a 4ºC b) H2O2 3% en agua destilada (para inhibir la peroxidasa endógena) 10 min c) Como sistema de detección se utilizó EnVision policlonal (polímero de dextrano conjugado con anticuerpos anti-conejo y con peroxidasa; Dako) 30 min. d) DAB (Dako) 10 min, preparada siguiendo el protocolo del fabricante (1 gota de DAB en 1 mL del disolvente suministrado). Entre cada uno de los pasos se realizan 2 lavados de 10 min cada uno. Al finalizar la reacción las secciones se extienden en portas xilanizados (Histobond) dejándolos secar y posteriormente se deshidratan (etanol), se aclaran (xilol) y se montan con un medio de montaje permanente. La reacción fue observada y fotografiada bajo un microscopio de fluorescencia Provis AX70 (Olympus Corp.; Tokyo, Japan). Además, se cuantifica la inmuno-reactividad de c-FOS en DMN. El número de células teñidas en cada sección se usa como numero representativo de células con inmunoreactividad positiva de c-FOS. -ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos han sido expresados como media ± error estándar de la media (SEM). Los test estadísticos empleados han sido t-student o ANOVA y post-hoc Bonferroni siendo considerado como significativo P<0.05. El programa informático empleado para el análisis estadístico fue el Instat 3.   RESULTADOS   Resultados 99 CARACTERIZACIÓN DEL ESTADO TIROIDEO Efecto del hipotiroidismo y del hipertiroidismo sobre la composición corporal y los niveles plasmáticos de distintas hormonas Con el fin de comprobar que la administración de T4 y AMT durante 21 días inducían hipertiroidismo y hipotiroidismo respectivamente, se llevaron a cabo medidas de diferentes hormonas y de otros parámetros que se modifican con el estado tiroideo (tabla 9). Tabla 9. Parámetros corporales y plasmáticos, y niveles hipotalámicos de TRH en ratas tratadas con vehículo, T4 y AMT. *P<0.01,**:P<0.01y***: P<0.001 vs. vehículo. Vehículo T4 AMT Tamaño corporal (cm, sin cola) 44.44±0.18 44.25±0.25 42.63±0.46** Tamaño corporal (cm, con cola) 24.78±0.22 24.50±0.29 23.75±0.25** Masa grasa (g) 34.99±2.06 17.25±1.90 *** - Masa no-grasa (g) 314.61 ±5.84 295.83±5.29** - Agua libre (g) 1.32±0.09 1.19±0.08 - Temperatura (ºC) 34.60±0.09 35.43±0.13*** - TSH (ng/ml) 3.47 ± 0.20 0.42 ± 0.08*** 27.17±1.71*** T4 (nmol/l) 80.20 ± 7.16 321.64 ± 33.42*** 25.0±7.67*** T3 (nmol/l) 3.17 ± 0.23 5.10 ± 0.64*** 1.28±0.19*** Glucosa(mmol/l) 7.36 ± 0.15 7.38 ± 0.35 6.12±0.23* Insulina (ng/ml) 2.11 ± 0.34 2.48 ± 0.41 1.50±0.55 Leptina(ng/ml) 3.89 ± 0.46 1.65 ± 0.42*** 3.40±1.05 TRH PVH (% vehículo ) 100.00 ± 9.29 48.15 ± 4.51*** 189.68±14.45*** Resultados 100 Los niveles plasmáticos de TSH, T4 y T3 en los distintos modelos demostraron que los tratamientos de inducción del estado tiroideo habían ejercido el efecto esperado; en ratas hipertiroideas las concentraciones T4 y T3 en plasma eran mayores que en un animal eutiroideo, mientras que los niveles de TSH disminuyeron como consecuencia del mecanismo de retro-alimentación negativo que rige la síntesis y liberación de THs; durante el hipotiroidismo se produjeron efectos contrarios en estos parámetros (134;324;325). Efecto del hipertiroidismo sobre la regulación de la ingesta y la masa corporal Como se puede observar, durante la administración crónica de T4 la ganancia de masa corporal disminuyó respecto a la de las ratas vehículo; esta disminución iba acompañada, además, de un elevado incremento en la ingesta diaria, presentando así las ratas tratadas con T4 un fenotipo delgado e hiperfágico (figura 34). Los datos de la evolución de la masa corporal se apoyaron en medidas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) en las que se demostró que tanto la masa grasa como la magra eran menores durante el hipertiroidismo (tabla 9). Estudiando los distintos depósitos se comprobó que el hipertiroidismo inducía la disminución de la cantidad de grasa en los depósitos de WAT, mientras que el depósito de BAT era significativamente mayor que en ratas eutiroideas (figura 35). Tiempo (días) 13579111315171921 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Vehículo T4 Vehículo T4 c c bc a b bb cc b b b bb b b b cc b Tiempo (días) 1 3 5 7 9 111315171921 20 25 30 35 40 c c c c c c c c c c c c a c c Vehículo T4 Vehículo T4 a GananciadeMasaCorporal(g) Ingesta(g) Figura 34. Evolución de la a) masa corporal y b) la ingesta durante el tratamiento de 21 días con T4. a: P<0.05, b: P<0.01, c: P<0.001 vs. vehículo.  Resultados 101 Epididimal Interescapular 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 MasaGrasa(g) OmentalVisceralRetroperitoneal WAT BAT * * * ** * Eutiroideas Hipertiroideas Figura 35. Masas de los distintos depósitos de grasa de ratas eutiroideas e hipertiroideas. *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. eutiroideas. Efecto del hipertiroidismo sobre la expresión de neuropéptidos orexigénicos y anorexigénicos a nivel hipotalámico Con el fin de determinar a qué se debía la marcada hiperfagia que muestran las ratas hipertiroideas, se llevó a cabo el análisis de los neuropéptidos orexigénicos y anorexigénicos más importantes en diferentes núcleos hipotalámicos (figura 36). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Total Posterior DMH CART (Total ARC) Neuropeptide niveles mRNA (%Eutiroideas) Anterior * Posterior ** Anterior * POMC (Total ARC) ** Total ** AgRP(ARC) NPY ARC TRH (PVH) *** FIGURA 36. Niveles de mRNA de neuropéptidos orexigénicos y anorexigénicos en distintos núcleos hipotalámicos de ratas eutiroideas y hipertiroideas. *: P<0.05, **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas. La expresión de los neuropéptidos demostró que la hiperfagia del modelo hipertiroideo está asociada a cambios en su expresión. Así, se pudo observar claramente como NPY, neuropéptido orexigénico, tiene incrementada su expresión de mRNA en el ARC, tanto en la zona anterior como en la posterior, variación que no se observó en el DMH. Otro neuropéptido orexigénico como es AgRP también mostró un incremento en la expresión en el ARC, pero en este caso únicamente se observó esta variación en la Resultados 102 parte anterior del ARC. En cambio, la expresión del prepro-neuropéptido anorexigénico, POMC estaba disminuida en el ARC de ratas hipertiroideas. Efectos del hipertiroidismo sobre la termogénesis adaptativa en diferentes tejidos El hecho de que las ratas hipertiroideas aun siendo hiperfágicas muestren fenotipo delgado, lleva a pensar que presentan un gasto metabólico elevado que hace que disipen mayor cantidad de energía en forma de calor. Para comprobar esta hipótesis se realizó el estudio de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en los tejidos más importantes para esta función (figura 37). BAT 0 50 100 150 200 250 *** ** * *** *** *** *** Adrβ3 D2 HSL LPL FABP3 PGC1αPGC1βUCP‐1UCP‐3 Niveles demRNA/HPRT (%Eutiroideas) a Eutiroideas Hipertiroideas c Músculo 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Adrβ3Adrα2 *** Niveles demRNA/HPRT (%Eutiroideas) D2 *** FABP3 * LPL ** NFR‐1 ** PGC1α * UCP‐3 ** HSL P=0.09 PGC1β P=0.09 Eutiroideas Hipertiroideas Hígado 0 Adrα2D2FABP3 HSL LPL NFR‐1PGC1αPGC1β 0 100 200 2x10 5 1.5x10 5 *** 100 200 300 400 *** *** ** ** * Niveles demRNA/HPRT (%Eutiroideas) b Eutiroideas Hipertiroideas  FIGURA 37. Niveles de mRNA de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en diferentes tejidos. a) BAT, b) hígado y c) músculo. *: P<0.05, **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas. Resultados 103 De un modo general, se puede ver que en estos tejidos el programa termogénico estaba fuertemente incrementado. La mayoría de los genes implicados de modo más directo en la función termogénica; es decir, UCPs y PGC-1s, tenían una expresión de mRNA elevada en tejidos periféricos. Individualmente, el BAT, el tejido fundamental en la termogénesis mostraba incrementos significativos en UCP-1, UCP-3, PGC-1α y PGC-1β, que indicaba que se estaba disipando una gran cantidad de energía. En músculo se observó el incremento de la isoforma específica de UCP, la UCP-3. En el hígado también se observó de modo claro como la termogénesis estaba incrementada. Estos datos podrían explicar el porqué aun siendo hiperfágicas las ratas hipertiroideas son delgadas. Esto se debe a que su gasto es muy superior al de las ratas eutiroideas y todos los lípidos ingeridos por la dieta y sintetizados se usan como sustrato en la termogénesis adaptativa. Estudio de la vía de señalización de AMPK durante el hipertiroidismo a nivel central y periférico Mediante el uso de la técnica de Western Blot se procedió al estudio de la vía de señalización de AMPK en el hipotálamo (figura 38). Como se puede comprobar, la activación de AMPK disminuyó, lo que indica que durante el hipertiroidismo en el hipotálamo está incrementada la síntesis de ácidos grasos. La disminución en los niveles de pAMPKα se correlacionó con los menores niveles de proteína de tAMPKα, que a su vez parecía ser debido únicamente a la disminución de la expresión de la isoforma AMPKα1. La inactivación de AMPK correlacionaba con unos menores niveles de pACC y una mayor expresión de FAS. Resultados 104 0 20 40 60 80 100 120 140 160 FASFAS tAMPK α AMPK α1 pAMPK α *** *** AMPK α2 pACC α ACC α ACCβ *** *** *** Niveles de proteína /β-Actina (% Eutiroideas) ba Eutiroideas Hipertiroideas AMPKα2 pAMPKα β-Actina tAMPKα pACCα tACC FAS AMPKα1 Eutiroideas Hipertiroideas Figura38. Efectos del tratamiento crónico con T4 durante 21 días en los niveles de proteína de la vía de AMPK. a) imágenes autorradiográficas de western blot. b) cuantificación de los niveles de proteína. ***: P<0.001 vs. eutiroideas. Como ya se ha explicado anteriormente, FAS es un enzima que está regulado a nivel transcripcional (263). Tras ver el dato del aumento de los niveles proteicos de FAS, se realizaron mediante hibridación in situ estudios de la expresión de mRNA en distintos núcleos hipotalámicos; como se puede observar en la figura 39 la expresión de FAS estaba incrementada en todos los núcleos estudiados. HipertiroideasEutiroideas VMH ARC 3V 3V HipertiroideasEutiroideas PVH 3V 3V *** *** *** VMH ARC PVH 0 20 40 60 80 100 120 140 160 FASmRNA(%Eutiroideas) b a Eutiroideas Hipertiroideas  Figura 39. Efecto del tratamiento crónico con T4 durante 21 días en los niveles de mRNA de FAS en distintos núcleos hipotalámicos. a) imágenes autorradiográficas de hibridación in situ. b) cuantificación de los niveles de mRNA. ***: P<0.001 vs. eutiroideas. Hasta el momento todas las evidencias, tanto por medidas de proteína como mRNA indicaban que la vía lipogénica estaba aumentada tras el tratamiento crónico de T4, es decir, en el hipotálamo de las ratas hipertiroideas predomina la síntesis de lípidos frente a su oxidación. Además de estos datos, se han llevado a cabo diferentes medidas Resultados 105 de actividades enzimáticas y concentración de malonil-CoA (figura 40) que confirman con los ya obtenidos de proteína y mRNA. *** CPT1actividad (pmol palmitato/min/µgprot) Eutiroideas Hipertiroideas 0 20 40 60 80 d *** 0.00 0.05 0.10 0.15 Malonil‐CoA(nmol/g) Eutiroideas Hipertiroideas c actividad (mU/mgproteína) 5 10 15 20 25 30 35 40 * 0 AMPKα1AMPKα2 b 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 AMP(µmol/g) ** Eutiroideas Hipertiroideas a Eutiroideas Hipertiroideas Figura40. a) Concentración de AMP, b) actividad de AMPKα1 y AMPKα2, c) concentración de malonilCoA y d) actividad de CPT-1 en hipotálamos de ratas eutiroideas e hipertiroideas. *: p<0.05, **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas. Como cabía de esperar tras ver los niveles de proteína de pAMPKα, la concentración de AMP detectada en los hipotálamos de las ratas hipertiroideas era mucho menor que en los de las eutiroideas. Como se ha descrito previamente, la variación de AMPK se debe, entre otras causas, a alteraciones en el ratio AMP:ATP (55;241-246): la disminución de la concentración de AMP lleva a una caída en este ratio y por tanto a la disminución de pAMPK. Por otra parte, la medida de las actividades kinasa de AMPKα1 y AMPKα2 confirmó el dato obtenido mediante Western Blot, la isoforma regulada en hipertiroidismo era la AMPKα1. Finalmente, para acabar el análisis de la vía de síntesis de lípidos en el hipotálamo de ratas hipertiroideas, se llevaron a cabo medidas de concentración de malonil-CoA y de actividad enzimática de CPT-1. El aumento detectado en la concentración de malonil-CoA en el hipertiroidismo concordaba con los datos de proteína (figura 38); es decir, todas las evidencias Resultados 112 parte, es de destacar la disminución observada en FAS, que indica que se está limitando la conversión del parte del malonil-CoA a LCFA-CoAs. Estudiando los efectos del estado hipotiroideo en tejidos periféricos se pudo ver que, a grandes rasgos, en el hígado produjo las mismas variaciones vistas en hipertiroidismo, excepto para los niveles de proteína de FAS, que en este caso, a pesar de que la ruta está incrementada (disminución en pAMPK y pACC), muestra una menor expresión que en ratas eutiroideas (figura 48). Tanto en músculo como en WAT se comprobó que el hipotiroidismo afectaba de manera opuesta al metabolismo lipídico que el hipertiroidismo y que los enzimas implicados en la síntesis de lípidos se encontraban reducidos. a Hígado 0 20 40 60 80 100 120 pAMPK AMPKα1AMPKα2pACCαACCαFAS Nivelesdeproteína/β‐Actina (%Eutiroideas) ** ** *** *** *** Músculo b 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPK AMPKα1AMPKα2pACCβACCβ Nivelesdeproteína/β‐Actina (%Eutiroideas) P=0.08 ** ** ** * WAT 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 pAMPK AMPKα1AMPKα2pACCαACCαFAS Nivelesdeproteína/β‐Actina (%Eutiroideas) c *** *** *** P=0.08 Eutiroideas Hipotiroideas Eutiroideas Hipotiroideas Eutiroideas Hipotiroideas Figura 48. Efectos del tratamiento crónico con AMT durante 21 días en los niveles de proteína de la vía de AMPK. a) hígado, b) músculo y c) WAT. *: p<0.05, **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas.  Resultados 113 Estudio de la variación de las especies lipídicas complejas durante el hipertiroidismo Vistos los resultados de metabolismo lipídico en el hipotálamo de ratas hipertiroideas, el siguiente punto del trabajo fue investigar, mediante lipidómica, cómo variaban los lípidos complejos en el estado hipertiroideo (figura 49). Tras el análisis de los datos obtenidos por lipidómica, se pudo observar que en hipertiroidismo todas las especies lipídicas analizadas en hipotálamo estaban incrementadas. La única excepción a esto la constituyen las glicerofosfoetanolaminas, que no varían su concentración. Por otra parte, cabe destacar que al igual que lo que ocurre sobre los enzimas de metabolismo lipídico, los cambios vistos en hipotálamo no se presentaban en otras áreas cerebrales, como el córtex. Resultados 114 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Hipotálamo Córtex Monoacilgliceroles (pmol/Kg) * b HipotálamoCórtex 10 8 6 4 2 0 * Diacilgliceroles (pmol/Kg) c Triacilgliceroles (pmol/Kg) 0 5 10 15 20 25 30 HipotálamoCórtex ** d e 0 20 300 400 500 600 10 Glicerofosfocolinas (pmol/Kg) HipotálamoCórtex * i Lisoglicerofosfocolinas (pmol/Kg) 0 10 20 30 40 50 Córtex * Hipotálamo * f Glicerofosfoetanolaminas (pmol/Kg) 0 100 200 300 400 500 Hipotálamo Córtex j Lisoglicerofosfoetanolaminas (pmol/Kg) Hipotálamo Córtex 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * 0.00 0.02 0.04 1.5 1.75 2.0 Hipotálamo Córtex Glicerofosfoinositoles (pmol/Kg) * g k Esfingomielinas (pmol/Kg) Hipotálamo Córtex 0 10 15 20 25 30 5* h 0.0 0.5 40 60 Glicerofosfoserinas (pmol/Kg) Hipotálamo Córtex 0.25 * a ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 20 ‐8 ‐6 ‐4 ‐2 0 2 4 6 8 LV2 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 20 ‐8 ‐6 ‐4 ‐2 0 2 4 6 8 LV1 Eutiroideas Hipertiroideas Eutiroideas Hipertiroideas  FIGURA 49. a) Análisis multivariado modelo PLS/DA (2 LVs, Q2=61%) en hipotálamo. Niveles en hipotálamo y en córtex de: b) monoacilgliceroles, c) diacilgliceroles, d) triacilgliceroles, e) glicerofosfocolinas, f) glicerofosfoetanolaminas, g) glicerofosfoinositoles, h) glicerofosfoserinas, i) lisoglicerofosfocolinas, j) lisoglicerofosfoetanolaminas y k) esfingomielinas. *: p<0.05 y **: P<0.01 vs. eutiroideas. Además de los lípidos complejos, también se estudió la expresión de los enzimas que llevaban a cabo las síntesis de dichos complejos (figura 50). Resultados 115 DAG PCPSPE PI Lisoglicerofosfolípidos LIPIN1 CDIPT PISD PTDSS1 PLA2g4a PLA2g4a PLA2g4a Fosfocolina PCYT1a SMPD2 SGMS1 SPTlc1 Esfinganina Ceramida Esfingomielina TAG DGAT1PNPLA2 Palmitoyl -CoA Malonyl -CoA Acetyl-CoA FAS ACC MCD DAG PCPSPE PI LIPIN1 CDIPT PISD PTDSS1 PLA2g4a PLA2g4a PLA2g4a PCYT1a SMPD2 SGMS1 SPTlc1 TAG DGAT1PNPLA2 Palmitoil -CoA Malonil -CoA Acetil -CoA FAS ACC MCD Figura 50. Vía de síntesis de Lípidos Complejos. a ** 0 50 100 150 200 CDIPT DGAT1 LIPIN1 PCYT1a PISD1 PLA2g4a PNPLA2 PTDSS1 SGMS1 SMPD2 SPTlc1 NivelesdemRNA/HPRT(Eutiroideas) * ** **** ** * *** ** * Hipotálamo Eutiroideas Hipertiroideas b Córtex 0 50 100 150 200 CDIPT DGAT1 LIPIN1 PCYT1a PISD1 PLA2g4a PNPLA2 PTDSS1 SGMS1 SMPD2 SPTlc1 NivelesdemRNA/HPRT(%Eutiroideas) * * P=0.06 Eutiroideas Hipertiroideas  FIGURA 51. Efectos del hipertiroidismo sobre los niveles de mRNA de los genes de la vía de síntesis de lípidos complejos. a) hipotálamo y b) córtex. *: p<0.05, **: P<0.01 y ***P<0.001 vs. eutiroideas. Resultados 116 De los enzimas analizados todos presentaban incremento en hipotálamo de ratas hipertiroideas, mientras que únicamente dos de ellos (LIPIN1 y PTDSS1) lo hacían en el córtex (figura 51). Todos estos datos junto con los obtenidos anteriormente, demuestran también que el hipertiroidismo activa las vías lipogénicas de modo selectivo en hipotálamo. ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIÓN CENTRAL DE HORMONAS TIROIDEAS Efectos sobre masa corporal e ingesta de la administración central de T3 Dado que el estado hipertiroideo induce, además del incremento en THs, importantes cambios metabólicos que podrían influir en la vía lipogénica, el siguiente paso fue averiguar qué efectos directos tienen las THs administradas crónicamente de modo ICV. Tiempo (días) ‐30 ‐20 ‐10 0 10 20 30 Ganancia deMasa Corporal(g) 12345 Eutiroideasvehículo EutiroideasT3ICV **** *** a 0 10 20 30 40 50 60 Ingesta (g) Tiempo (días) 12345 Eutiroideasvehículo EutiroideasT3ICV b Figura 52. Evolución de la a) masa corporal y b) la ingesta durante el tratamiento con T3 ICV. *: p<0.05 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas vehículo. Los datos obtenidos mostraron que la administración ICV de T3 causaba, al igual que el hipertiroidismo, una gran pérdida de masa sin afectar en cambio a la ingesta (figura 52). Además, para comprobar que los efectos observados no se debían a un incremento en la concentración circulante de hormonas tiroideas o a la difusión de T3 Resultados 117 desde el CSF a la circulación periférica, se analizaron los niveles de T3 y T4 en plasma (figura 53). b vehículo T3ICV 0 20 40 60 80 100 120 140 T4(nmol/l) *** a 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 vehículo T3(nmol/l) T3ICV *  Figura 53. Niveles plasmáticos de a) T3 y b) T4 en ratas tratadas crónicamente con T3 ICV. *: p<0.05 y ***: P<0.001 vs. vehículo. Los resultados obtenidos mostraron que la administración de T3 ICV causaba una reducción en los niveles plasmáticos de T3 y T4. Debido a la alta concentración de T3 a nivel central, el eje HHT actúa a través de TRH reduciendo la síntesis y liberación de THs. Estos resultados demostraban que los efectos de la T3 sobre la pérdida de masa se debían a su acción central y no a una acción periférica tras su difusión al plasma. Efecto de la administración central de T3 sobre el metabolismo lipídico Visto que los cambios en metabolismo lipídico a nivel central en hipertiroidismo eran exclusivos de hipotálamo, se llevó a cabo el análisis de los niveles de proteína de los enzimas implicados en la síntesis de lípidos tras la administración crónica de T3 ICV en hipotálamo (figura 54). Resultados 118 0 20 40 60 80 100 120 pAMPK AMPKα1AMPKα2pACC ACCα Nivelesdeproteína/β‐Actina (%vehículo) *** ** *** b Vehículo T3ICV a T3Vehículo β‐Actina AMPKα2 pAMPKα AMPKα1 pACCα ACCα  Figura 54. Efectos del tratamiento con T3 ICV durante 4 días en los niveles de proteína de la vía de AMPK. a) imágenes autoradiográficas de western blot. b) cuantificación de los niveles de proteína. **: P<0.01 y ***P<0.001 vs. vehículo. Los datos obtenidos indican que la lipogénesis de novo estaba incrementada tras el tratamiento con T3 ICV, del mismo modo que ocurría en hipertiroidismo. La fosforilación de AMPK y ACC estaba disminuida, al igual que el nivel AMPKα1, mientras que AMPKα2 y ACCα no mostraba ninguna variación tras el tratamiento con T3. Efecto de la administración central de T3 sobre la termogénesis adaptativa Viendo que el tratamiento con T3 ICV provocaba los mismos efectos sobre metabolismo lipídico que el hipertiroidismo, y que además llevaba asociado pérdida de masa, se estudiaron los genes involucrados en termogénesis (figura 55), en un intento por explicar esta disminución de la masa corporal. Resultados 119 0 50 100 150 200 250 UCP‐1UCP‐3PGC1αPGC1βFABP3 HSL LPL D2 NivelesdemRNA/HPRT(%vehículo) * ** * *** ** ** * Vehículo T3ICV  Figura 55. Niveles de mRNA de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en BAT tras el tratamiento crónico con T3 ICV. *: P<0.05, **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. eutiroideas. Los datos en BAT mostraron que todo el programa termogénico estaba significativamente incrementado tras el tratamiento con T3 ICV; de hecho, siete de los ocho genes estudiados estaban elevados en BAT. Además, UCP-1, la proteína fundamental que lleva a cabo la termogénesis, mostraba un elevado incremento. Por otra parte, analizando los resultados de termogénesis en otros tejidos, hígado y músculo, se observó que no se reproducían los cambios vistos en BAT (figura 56), indicando que en ellos no se incrementaba la termogénesis. Resultados 120 Vehículo T3ICV a Hígado 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Adrα2 NivelesdemRNA/HPRT(%Vehículo) D2 FABP3 HSL LPL NFR‐1PGC1αPGC1β b 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Adrα2Adrβ3 NivelesdemRNA/HPRT(%Vehículo) Músculo ** D2 FABP3 HSL LPL NFR‐1PGC1αPGC1βUCP‐3 Vehículo T3ICV Figura 56. Niveles de mRNA de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en a) hígado y b) músculo tras el tratamiento crónico con T3 ICV. **: P<0.01 vs. vehículo. Es importante destacar que los efectos del tratamiento con T3 ICV fueron independientes del estado tiroideo del animal, pues en ratas hipotiroideas, la administración de T3 ICV causó los mismos resultados tanto en masa e ingesta (figura 57) como en termogénesis en BAT, hígado y músculo (figura 58). Resultados 121 Tiempo (días) 0 10 20 30 40 50 60 Ingesta (g) 12345 b Hipotiroideas vehículo Hipotiroideas T3ICV ‐40 ‐30 ‐20 ‐10 0 10 20 Ganacia deMasa Corporal(g) Tiempo (días) 12345 ** ** *** *** a Hipotiroideas vehículo Hipotiroideas T3ICV c 0.0 0.25 0.5 1.0 1.25 1.5 Vehículo T3(nmol/l) T3ICV d Vehículo T3ICV 0 5 10 15 20 25 30 35 T4(nmol/l)  Figura 57. Evolución de la a) masa corporal y b) la ingesta durante el tratamiento con T3 ICV en ratas hipotiroideas. Niveles plasmáticos de a) T3 y b) T4 en ratas hipotiroideas tratadas crónicamente con T3 ICV. **: P<0.01 y ***: P<0.001 vs. hipotiroideas vehículo. Resultados 128 0 20 40 60 80 DMV IO RPa C‐FOS‐IRcélulas *** *** *** Vehículo T3ICV b Vehículo T3ICV DMV HN CC CC RPa IO a  FIGURA 66. Efecto de la T3 ICV sobre c-Fos en el DMV. a) imágenes de la inmunohistoquímica de cFos en el DMV. b) cuantificación de las células inmuno-reactivas de c-Fos en el DMV. ***P<0.001 vs. vehículo. Finalmente, se estudió la actividad del SNS y se encontró que la administración de T3 ICV causaba grandes incrementos en la actividad neuronal del SNS en el BAT (figura 67), lo que estaba indicando que la T3 modulaba las funciones en el BAT a través de sus acciones a nivel hipotalámico. 0 50 100 150 200 ΔBATSNA(últimahora)(%) Vehículo T3ICV 4ng *** T3ICV 2ng ** # b ‐50 0 50 100 150 200 0 45 90 135 180 225 270 315 360 Tiempo(min) ΔBATSNA(%) ** # *** a Vehículo T3ICV2ng T3ICV4ng  Figura 67. Actividad del SNS tras la administración de distintas dosis T3 ICV. a) evolución de la actividad en las 6 primeras horas tras el tratamiento. b) actividad del SNS en la última hora. **: P<0.01 y ***P<0.001 vs. Vehículo. #: P<0.05 vs. T3 ICV 2ng. Resultados 129 Hasta el momento, todos los tratamientos centrales con T3 fueron administrados de modo ICV. Visto que uno de los núcleos en los que co-localizan pAMPK y TR es el VMH, y que además se ha descrito que este núcleo tiene gran importancia en metabolismo de lípidos y en la modulación del BAT (23), junto a la evidencia vista por la IR de c-Fos, se estudiaron los efectos de la administración de T3 directamente, mediante esterotaxia, en el VMH. 13 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Ingesta(g) Vehículo T3ICV Tiempo(horas) Figura 68. Ingesta a 1 y 3 horas tras la administración de T3 en el VMH. b 0 20 40 60 80 100 120 AMPKα1AMPKα2pACCαACCα pAMPKα ** P=0.1 * a T3VMHVehículo pACCα ACCα β‐Actina AMPKα1 AMPKα2 pAMPKα Vehículo T3VMH Nivelesdeproteína/β‐Actina (%Vehículo)  FIGURA 69. Efectos de la administración de T3 en el VMH sobre los niveles de proteína de la vía de AMPK. a) imágenes autorradiográficas de western blot. b) cuantificación de los niveles de proteína. *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. Vehículo. Los resultados obtenidos, además de no presentar variaciones en ingesta (figura 68) mostraron que los cambios sobre metabolismo lipídico tras la administración de T3 Resultados 130 en el VMH eran iguales que los vistos tras los tratamientos con T3 ICV, indicando que las variaciones vistas en proteína total del hipotálamo se debían en gran medida a los cambios ocurridos en el VMH. Al igual que lo visto en el caso de la administración ICV de T3, se encontró que su administración estereotáxica en el VMH también producía los mismos cambios sobre la actividad neuronal del SNS (figura 70), lo que llevaba a pensar que no solo la T3 modulaba las funciones del BAT a través de sus acciones en el hipotálamo, sino que más concretamente se debían a las acciones directas sobre el VMH. ΔBATSNA(%) ‐50 0 50 100 150 200 250 300 0 45 90 135 180 225 270 315 360 Tiempo(min) *** Vehículo T3VMH  Figura 70. Evolución de la Actividad del SNS durante las 6 primeras horas tras la administración de T3 en el VMH. ***P<0.001 vs. Vehículo. Todas las evidencias halladas hasta el momento tras los tratamientos con T3 indicaban que los efectos sobre el BAT eran debidos a sus acciones en el hipotálamo y no como consecuencia de los niveles de THs circulantes. Se realizó un último experimento con el objetivo de demostrar de modo más robusto las evidencias obtenidas tras el análisis de los resultados anteriores. Con el fin de analizar si durante la inducción de hipertiroidismo de modo periférico, los cambios vistos en el programa termogénico en el BAT se debían a las THs circulantes o estaban mediados por sus efectos en el VMH, se ha llevado a cabo un experimento en el que se han bloqueado genéticamente los TR estereotáxicamente en el VMH. Resultados 131 d Ingesta(g) 0 10 20 30 40 50 60 123456 Tiempo(días) AdministracióndeAdenovirus HipertiroideasGFP HipertiroideasTR‐DN HipertiroideasGFP HipertiroideasTR‐DN GananciadeMasaCorporal(g) 123456 ‐40 ‐30 ‐20 ‐10 0 10 * ** ** ** ** AdministracióndeAdenovirus Tiempo(días) c GananciadeMasaCorporal(g) 123456 ‐40 ‐30 ‐20 ‐10 0 10 Administración deAdenovirus a Tiempo(días) EutiroideasGFP EutiroideasTR‐DN b Ingesta (g) 0 10 20 30 40 50 60 123456 Tiempo(días) AdministracióndeAdenovirus EutiroideasGFP EutiroideasTR‐DN Figura 71. Evolución de la ganancia de masa corporal e ingesta diaria tras la inoculación de adenovirus TR-DN en ratas eutiroideas (a y b) y hipertiroideas (c y d). *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. GFP. Se puede comprobar que únicamente en ratas hipertiroideas, la administración de los adenovirus que codificaban una isoforma dominante negativa del receptor de hormonas tiroideas (TR-DN) llevó asociado un incremento significativo en la masa corporal, sin causar alteración alguna sobre la ingesta en ninguno de los grupos (figura 71). b 0 50 100 150 200 250 Eutiroideas Hipertiroideas T4(nmol/l) TR‐DN GFP *** *** 5.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Eutiroideas Hipertiroideas T3(nmol/l) TR‐DN GFP *** *** a  FIGURA 71. Niveles plasmáticos de a) T3 y b) T4 tras la inoculación de los adenovirus TR-DN. ***: P<0.001 vs. eutiroideas GFP. Resultados 132 Al igual que lo ocurrido tras la administración de T3, la administración de los adenovirus TR-DN no provocó ninguna variación en los niveles plasmáticos de THs (figura 71). Curiosamente, los datos mostraron que tras la administración de adenovirus, las ratas hipertiroideas presentaban menores valores en la expresión de los genes implicados en el proceso termogénico en BAT (figura 72a), sobre todo UCPs y PGCs, indicando que incluso durante el hipertiroidismo inducido periféricamente las acciones sobre termogénesis en BAT están mediadas mayoritariamente a nivel hipotalámico, y más concretamente a través del VMH. En ratas eutiroideas no se observó ninguna variación en termogénesis tras la administración de TR-DN, la expresión de las UCPs se mantuvo al mismo nivel que en las ratas control (figura 72). b 0 20 40 60 80 100 120 UCP‐1UCP‐3 PGC1αPGC1β FABP3 HSL LPL D2 * *** *** ** * * * NivelesdemRNA/HPRT (%HipertiroideasGFP) HipertiroideasGFP HipertiroideasTR‐DN a 0 20 40 60 80 100 120 140 NivelesdemRNA/HPRT (%Eutiroideas GFP) D2 FABP3 HSL LPL PGC1αPGC1βUCP‐1UCP‐3 EutiroideasGFP EutiroideasTR‐DN Figura 72. Niveles de mRNA de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en BAT tras la inoculación de los adenovirus TR-DN en ratas a) eutiroideas y b) hipertirodieas. *: P<0.05 y ***: P<0.001 vs. GFP. Hasta el momento se había observado que las acciones que las THs ejercían a nivel central únicamente afectaban al proceso termogénico específicamente en el BAT; siguiendo con estas observaciones se estudiaron diferentes tejidos tras el tratamiento con los adenovirus TR-DN en el VMH (figura 73), en donde se pudo comprobar cómo, al igual que lo anteriormente descrito, en hígado y músculo ninguno de los genes Resultados 133 implicados en el proceso termogénico tenía revertida su expresión como se vio en el caso de BAT, indicando que las alteraciones en termogénesis vistas en estos tejidos durante el hipertiroidismo eran debidas a efectos de las THs plasmáticas. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Adrα2 NivelesdemRNA/HPRT (%HipertiroideasGFP) D2 FABP3 HSL LPL NFR‐1PGC1αPGC1β HipertiroideasGFP HipertiroideasTR‐DN Hígado 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Adrα2Adrβ3D2 FABP3 HSL LPL NFR‐1PGC1αPGC1βUCP‐3 NivelesdemRNA/HPRT (%Hipertiroideas GFP) HipertiroideasGFP HipertiroideasTR‐DN Músculo  Figura 73. Niveles de mRNA de los genes implicados en la termogénesis adaptativa en a) hígado y b) músculo tras la inoculación de los adenovirus TR-DN. Resultados 134 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE METABOLISMO LIPÍDICO EN HIPOTÁLAMO Y TERMOGÉNESIS DURANTE EL HIPERTIROIDISMO Los datos obtenidos hasta el momento mostraban que el hipertiroidismo causaba la activación de la lipogénesis de novo en el hipotálamo y que sus efectos en termogénesis eran mediados a nivel central. El siguiente punto a estudiar fue la interconexión que tenían ambos factores; es decir, si la activación del metabolismo lipídico en el hipotálamo era la causa del incremento de la termogénesis en BAT y otros tejidos, además de intentar explicar el fenotipo hiperfágico y delgado a pesar de los altos niveles de malonil-CoA hipotalámico. Para llevar a cabo este enfoque experimental, se emplearon diversos activadores e inhibidores farmacológicos de los distintos enzimas de la ruta de síntesis de ácidos grasos. El primer paso fue estudiar los efectos de la administración de un inhibidor específico de FAS, denominado cerulenin, en ratas hipertiroideas. *** *** *** GananciadeMasaCorporal(g) 0 5 10 15 20 Eut Hipert a 0 5 10 15 20 25 30 35 Ingesta(g) Eut Hipert *** ****** b vehículo Cerulenin vehículo Cerulenin  Figura 74. a) Ganancia de masa corporal y b) ingesta diaria durante el tratamiento central con cerulenin. ***: P<0.001 vs. eutiroideas vehículo. La administración de cerulenin no tuvo ninguna repercusión ni en la masa corporal ni en la ingesta de las ratas hipertiroideas (figura 74) a pesar de que, como era de esperar, presentaban una mayor concentración de malonil-CoA hipotalámico (figura 75). En cambio, las ratas eutiroideas, presentaban una disminución conjunta de la masa Resultados 135 corporal y la ingesta, que correlacionaba con el incremento en la concentración hipotalámica de malonil-CoA similar al observado en las hipertiroideas 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Eut Hipert Malonil‐CoA(nmol/g) *** *** *** # ### vehículo Cerulenin  Figura 75. Niveles hipotalámicos de malonil-CoA tras el tratamiento central con cerulenin. ***: P<0.001 vs. eutiroideas vehículo. #: P<0.05 vs. hipertiroideas cerulenin. ###: P<0.001 vs. hipertiroideas vehículo. Estos datos indicaban que las ratas hipertiroideas no respondían a los efectos anorécticos de los inhibidores de FAS y del incremento de los niveles hipotalámicos de malonil-CoA. Es decir, en conjunto los resultados indicaban que las ratas hipertiroideas eran resistentes a la acumulación de este metabolito. Con el fin de explorar en profundidad el mecanismo mediante el cual ocurría este fenómeno se analizó la expresión de distintos neuropéptidos implicados en el control de la ingesta (figuras 76 y 77). Eutiroideas Hipertiroideas 0 20 40 60 80 100 120 140 AgRPmRNA (ARCanterior) (%Eutiroideasvehículo) ** * a Eutiroideas Hipertiroideas 0 20 40 60 80 100 120 140 ** ** NPYmRNA(ARCtotal) (%Eutiroideasvehículo) vehículo Cerulenin b vehículo Cerulenin  Figura 76. Niveles de expresión de mRNA de AgRP y NPY tras el tratamiento central con cerulenin. *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. eutiroideas vehículo. Resultados 136 El análisis mediante hibridación in situ demostró que la expresión de mRNA de AgRP y NPY en el ARC no se veía afectada tras el tratamiento con el inhibidor ni en ratas eutiroideas ni en hipertiroideas (figura 76). 0 20 40 60 80 100 120 140 POMCmRNA (ARCtotal) (%Eutiroideasvehículo) ** ** * Eut Hipert b vehículo Cerulenin Eutiroideas vehículo Cerulenin vehículo Cerulenin Hipertiroideas 3V 3V ARC 3V 3V ARC a  Figura 77. Efecto del tratamiento central con cerulenin en los niveles de mRNA de POMC en el ARC. a) imágenes autorradiográficas de hibridación in situ. b) cuantificación de los niveles de mRNA. *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. eutiroideas vehículo. Analizando la expresión de mRNA de POMC en este experimento, se pudo comprobar que el cerulenin indujo un incremento significativo en la expresión de este prepro-neuropéptido en ratas eutiroideas en el ARC (figura 77), lo que correlacionaba con el efecto anoréxico de la droga. Contrariamente, en los animales hipertiroideos, en los que el cerulenin no indujo la ingesta, la expresión de POMC no se vio afectada. Para estudiar los mecanismos moleculares de esta falta de respuesta, se analizaron los niveles hipotalámicos de pFoxO1 y pSTAT3 (figura 78), dos factores de transcripción claves en la regulación de POMC. Resultados 137 Eutiroideas Hipertiroideas Vehículo Vehículo CeruleninCerulenin β‐Actina pSTAT3 pFoxO1 b 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Niveles deProteína/β‐Actina (%EutiroideasVehículo) ** ** * EutiroideasVehículo EutiroideasCerulenin HipertiroideasVehículo HipertiroideasCerulenin pFoxO1 pSTAT3 *P=0.1 a  Figura 78. Efectos de la administración central de cerulenin sobre los niveles de proteína de pFoxO1 y pSTAT3. a) imágenes autorradiográficas de western blot. b) cuantificación de los niveles de proteína. *: P<0.05 y **: P<0.01 vs. eutiroideas vehículo. Los resultados obtenidos mostraron que el incremento en mRNA de POMC en los animales eutiroideos iba acompañado de un aumento en los niveles de proteína, tanto de pFoxO1 como de pSTAT3 (figura 78). Inversamente, en las ratas hipertiroideas este efecto no se observaba, indicando que la falta de respuesta en la expresión de POMC correlacionaba con alteraciones en su maquinaria de transcripción. Siguiendo con el estudio de la interacción entre la lipogénesis de novo en el hipotálamo y la termogénesis, se utilizaron otros dos inhibidores farmacológicos de la vía lipogénica: un activador de AMPK, denominado AICAR, y un inhibidor de ACC, denominado TOFA. La administración central de AICAR no producía ningún efecto sobre la masa corporal de las ratas eutiroideas, mientras que en ratas hipertiroideas restablecía la masa corporal a valores de las eutiroideas. Además, no se vieron efectos en ingesta diaria ni en la ingesta acumulada en ninguno de los grupos tras el tratamiento (figura 79).