Errores Congénitos del Metabolismo en edad pediátrica

ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO EN EDAD PEDIÁTRICA Ana María Baña Souto Departamento de Pediatría Universidad de Santiago de Compostela 2012 Departamento de Pediatría Universidad de Santiago de Compostela TESIS DOCTORAL: ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO EN EDAD PEDIÁTRICA Dña. Ana María Baña Souto DIRECTORES: Prof. Dr. Mª Luz Couce Pico Profesor Asociado de Pediatría Facultad de Medicina y Odontología. Universidad de Santiago de Compostela Prof. Dr. José Ramón Fernández Lorenzo Profesor Titular de Pediatría Facultad de Medicina y Odontología. Universidad de Santiago de Compostela Prof. Dr. José María Fraga Bermúdez Catedrático de Pediatría Facultad de Medicina y Odontología. Universidad de Santiago de Compostela 2012 MARIA LUZ COUCE PICO, JOSÉ RAMÓN FERNÁNDEZ LORENZO, Y JOSE MARÍA FRAGA BERMUDEZ, PROFESOR ASOCIADO, PROFESOR TITULAR Y CATEDRÁTICO DE PEDIATRIA RESPECTIVAMENTE DE LA FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA. CERTIFICAN: Que la presente tesis titulada: “ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO EN EDAD PEDIÁTRICA”, ha sido elaborada por Dña. ANA MARÍA BAÑA bajo la dirección de los abajo firmantes. Así mismo, dicha tesis reúne todos los requisitos pertinentes para su presentación y lectura, a fin de optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firmamos el presente en Santiago a veintiocho de noviembre de dos mil doce. Profª María Luz Couce Pico Prof. José Ramón Fdez. Lorenzo Prof. José María Fraga Bermúdez Departamento de Pediatría Universidad de Santiago de Compostela Dña. ANA MARÍA BAÑA SOUTO CON D.N.I. 44.818.113-Z, licenciada en Medicina y Cirugía por la Universidad de Santiago de Compostela. DECLARA: Ser la autora de la presente tesis titulada “ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO EN EDAD PEDIÁTRICA”, dirigida por los Dres. Dña. María Luz Couce Pico, D. José Ramón Fernández Lorenzo y D. José María Fraga Bermúdez y que es presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firmo el presente en Santiago a veintiocho de noviembre de dos mil doce. Ana María Baña Souto AGRADECIMIENTOS Con estos agradecimientos se llega al final de un camino y supongo que al principio de otros muchos. Cuando se inició este proyecto parecía no tener final pero aquí está, con los últimos retoques, hubiera sido sin embargo imposible este recorrido sin el apoyo de todos los que me acompañaron en él que son muchos, a todos, gracias por anticipado. Agradecer en primer lugar su apoyo a los directores de esta tesis, la Dra. Couce; el Dr. Lorenzo y el Dr. Fraga; por sus correcciones y su paciencia. No puedo, sin embargo, dejar de señalar de modo especial el agradecimiento a Mari Luz, sin ella, sin su ánimo y su cariño este proyecto nunca hubiera sido posible. Al equipo del Laboratorio de Metabolopatías (José A. Cocho, Cristóbal Colón, José R. Alonso, Javier A. Iglesias, M. Dolores Bóveda, Daisy Castiñeiras) por haberme facilitado el trabajo y la obtención de datos, por su amabilidad y su tiempo. A mis compañeros del servicio de pediatría en especial de la unidad de neonatología donde me siento casi como en casa y cómo no a Alejandro. Al personal de los Centros de Bioquímica y Genética, el Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares de la Universidad Autónoma de Madrid y el Instituto de Bioquímica Clínica de Barcelona; en especial a sus directores, la Prof. Magdalena Ugarte y la Prof. Antonia Ribes, por habernos ayudado a la valoración metabólica y genética de muchos de estos pacientes. A José Luis por su paciencia y su compañía en los buenos y malos momentos, a Álvaro que cambió mi vida completamente y con el que cada día aprendo cosas nuevas. A mis padres y mis hermanos por su cariño y su apoyo incondicional siempre y como no, también en este proyecto y sin los cuales me habría perdido muchas veces en éste y otros caminos. Tesis Doctoral Índice 1 INDICE 1. JUSTIFICACIÓN ......................................................................... 5 2. INTRODUCCIÓN ........................................................................ 9 2.1 ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO ..................... 11 2.2 CRIBADO NEONATAL DE LOS ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO ....................................... 16 2.2.1 Concepto de Cribado Neonatal ............................................ 16 2.2.2 Historia del Cribado endocrino-metabólico Neonatal ............ 16 2.2.3 Métodos de Cribado Neonatal ............................................. 17 2.2.4 Recomendaciones para la toma de muestras ......................... 18 2.2.5 Aplicación de la Espectrometría de masas en tándem (MS/MS) ............................................................................ 20 2.2.5.1 Ionización por electrospray .............................................. 22 2.2.5.2 Ionización química ......................................................... 23 2.2.5.3 Espectrometría de masas ................................................. 24 2.2.5.4 Modos de adquisición de datos en MS/MS ......................... 26 2.2.6 Cribado Neonatal Ampliado ................................................ 27 2.2.6.1 Análisis de los aminoácidos por MS/MS ............................ 27 2.2.6.2 Análisis de acilcarnitinas por MS/MS ............................... 29 2.2.7 Errores Congénitos del Metabolismo que deben incluirse en el cribado ......................................................... 31 2.2.8 Situación del Cribado Neonatal en España ........................... 38 3. OBJETIVOS .................................................................................. 41 4. MATERIAL Y MÉTODO ........................................................... 45 4.1 DISEÑO .................................................................................... 47 4.2 SUJETOS ................................................................................. 47 Tesis Doctoral Índice 2 4.3 MÉTODO ................................................................................. 47 4.3.1 Cribado neonatal ................................................................ 47 4.3.2 Diagnóstico y seguimiento ................................................... 49 4.3.3 Análisis estadístico ............................................................. 52 5. RESULTADOS ............................................................................. 53 5.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS PACIENTES DIAGNOSTICADOS A TRAVÉS DEL CRIBADO ................................................................................. 57 5.2 CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES SEGÚN LA ALTERACIÓN DETECTADA .................................................... 59 5.2.1 Aminoacidopatías ............................................................... 59 5.2.1.1 Hiperfenilalaninemias .................................................... 59 5.2.1.2 Tirosinemias .................................................................. 67 5.2.1.3 Trastornos del metabolismo de los aminoácidos azufrados ....................................................................... 67 5.2.1.4 Enfermedad de la orina de jarabe de arce .......................... 69 5.2.1.5 Alcaptonuria .................................................................. 72 5.2.2 Defectos del Ciclo de la urea ................................................ 73 5.2.2.1 Citrulinemia tipo I .......................................................... 73 5.2.2.2 Aciduria arginino-succínica ............................................ 74 5.2.2.3 Déficit de arginasa ......................................................... 74 5.2.3 Acidurias orgánicas ............................................................ 75 5.2.3.1 Acidemia propiónica ....................................................... 75 5.2.3.2 Acidemia metilmalónica .................................................. 76 5.2.3.3 Aciduria glutárica tipo I .................................................. 78 5.2.3.4 Metilcrotonilglicinuria .................................................... 81 5.2.3.5 Aciduria 3-OH-3-metilglutárica ....................................... 82 5.2.4 Defectos congénitos de la ß-oxidación de los ácidos grasos ................................................................................ 82 5.2.4.1 Déficit de acilCoA deshidrogenasa de cadena media ........... 84 Tesis Doctoral Índice 3 5.2.4.2 Déficit de 3-hidroxiaccilCoA deshidrogenasa de cadena larga .................................................................. 86 5.2.4.3 Déficit de acilCoA deshidrogenasa de cadena corta ............ 87 5.2.4.4 Déficit del transportador de carnitina ............................... 87 5.2.5 Defectos del metabolismo de los hidratos de carbono ............. 88 5.2.5.1 Galactosemia clásica ....................................................... 88 5.2.5.2 Galactosemia por déficit de galactokinasa ......................... 88 5.2.5.3 Galactosemia por déficit de epimerasa .............................. 89 5.2.6 Trastornos congénitos del metabolismo del glutatión ............. 89 5.2.7 Trastornos congénitos del metabolismo de la biotina ............. 90 5.2.8 Defectos de la biosíntesis del colesterol ................................ 91 5.2.9 Defectos congénitos del transporte de los aminoácidos ........... 92 5.3 FALSOS POSITIVOS, ALTERACIONES TRANSITORIAS Y FALSOS NEGATIVOS ............................... 93 6. DISCUSIÓN .................................................................................. 95 6.1 FRECUENCIA/PREVALENCIA DE LOS ECM DETECTADOS A TRAVÉS DEL CRIBADO NEONATAL ......... 97 6.2 SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DEL CRIBADO .................................................. 101 6.3 SINTOMATOLOGÍA AL DIAGNÓSTICO E IMPACTO EN LA UNIDAD NEONATAL ................................................... 105 6.4 EVOLUCIÓN DE LOS PACIENTES CON ECM. ....................... 109 7. CONCLUSIONES......................................................................... 117 8. TRABAJOS PUBLICADOS ........................................................ 121 8.1 EVALUATION AND LONG-TERM FOLLOW-UP OF INFANTS WITH INBORN ERRORS OF METABOLISM IDENTIFIED IN AN EXPANDED SCREENING PROGRAMME ......................................................................... 123 Tesis Doctoral Índice 4 8.2 INBORN ERRORS OF METABOLISM IN A NEONATOLOGY UNIT: IMPACT AND LONG-TERM RESULTS ................................................................................. 129 8.3 CLINICAL, GENETIC, AND THERAPEUTIC DIVERSITY IN 2 PATIENTS WITH SEVERE MEVALONATE KINASE DEFICIENCY ................................... 135 9. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................... 143 Tesis Doctoral Justificación 5 1. JUSTIFICACIÓN Tesis Doctoral Justificación 7 1. JUSTIFICACIÓN Los Errores Congénitos del Metabolismo son considerados enfermedades raras (<5 casos por cada 10.000 personas) desde un punto de vista individual, pero en su conjunto suponen un capítulo relevante de la patología pediátrica con una importante morbilidad y mortalidad y por lo tanto es de interés profundizar en su conocimiento. La mayoría de estas entidades presentan una evolución natural muy tórpida, estos efectos negativos pueden ser evitados o significativamente disminuidos si se instaura un diagnóstico y tratamiento precoz. El avance en el cribado metabólico neonatal, con la técnica de la espectrometría de masas en tándem (cribado neonatal ampliado), nos permite realizar un perfil metabólico de las alteraciones congénitas más importantes del metabolismo intermediario. La Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Congénitas del Metabolismo del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela fue pionera en España y de las primeras a nivel europeo en el estudio de los Errores Congénitos del Metabolismo detectados a través del cribado ampliado. El cribado endocrino-metabólico neonatal ampliado se realiza en nuestra comunidad a prácticamente el 100% de la población y tiene la particularidad asimismo de utilizar la muestra de orina en la detección analítica conjuntamente con la muestra de sangre. Parece por tanto de interés en este contexto profundizar en el estudio de las Enfermedades Congénitas del Metabolismo detectadas a través del cribado ampliado en nuestra unidad desde su inicio y a lo largo de una década (20002010); valorando la repercusión de la introducción del cribado neonatal ampliado, la prevalencia de los Enfermedades Congénitas del Metabolismo en nuestra comunidad, la utilidad de la muestra de orina en esa detección, el conocimiento de la historia natural de estas enfermedades a raíz del cribado, y la consiguiente influencia que ha tenido en la evolución de nuestros pacientes tanto en términos de morbilidad, al permitirnos en algunos casos ser también pioneros Tesis Doctoral Justificación 8 en instaurar tratamientos novedosos de eficacia comprobada, como de mortalidad. Tesis Doctoral Introducción 9 2. INTRODUCCIÓN Tesis Doctoral Introducción 16 2.2 CRIBADO NEONATAL DE LOS ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO 2.2.1 Concepto de Cribado Neonatal Una definición muy aceptada de cribado fue publicada en la revista Journal of Medical Screening en donde se recoge que el cribado es la aplicación sistemática de una prueba o examen para la identificación de individuos a riesgo de sufrir una enfermedad específica con el objetivo de beneficiarse de investigaciones adicionales o tratamientos entre las personas que no han buscado atención médica a causa de los síntomas de esa enfermedad10. El cribado metabólico neonatal (CMN) es por tanto el conjunto de actuaciones encaminadas a la detección sistemática de enfermedades congénitas del metabolismo en edad neonatal11. El objetivo de los programas de detección precoz de ECM es reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a estas enfermedades ya que la mayoría de los ECM que cursan con alteraciones clínicas presentan una evolución natural tórpida o catastrófica y estos efectos negativos pueden ser evitados o significativamente disminuidos si se hace un diagnóstico precoz y se instaura un programa terapéutico o preventivo. Por ello el cribado metabólico neonatal ha demostrado ser eficaz, eficiente y efectivo, tanto desde el punto de vista del diagnóstico como desde el de la sanidad pública y del de la rentabilidad económica. 2.2.2 Historia del Cribado endocrino-metabólico Neonatal La historia del cribado neonatal se remonta al año 1953 en que Horst Bickel8 desarrolla una terapia para la fenilcetonuria y observa que sólo en aquellos casos en los que los pacientes iniciaban el tratamiento dietético antes de la aparición de los síntomas, en especial, antes de la aparición de los síntomas neurológicos éste era efectivo12.En el año 1963 Robert Guthrie utiliza una muestra capilar impregnada en papel para la determinación de la concentración plasmática de la fenilalanina por un método de inhibición bacteriana siendo Tesis Doctoral Introducción 17 posible aplicar este test de una manera eficiente a todos los recién nacidos y sienta así las bases del cribado neonatal universal13,14. En el 1970 Dussault incorpora al cribado neonatal la detección del hipotiroidismo congénito con el desarrollo del radioinmunoensayo y en el 1975 el Comité de Cribado Neonatal para Errores del Metabolismo de la National Academy of Sciences (Washington), postula los principios que debe cumplir una enfermedad para ser incluida dentro de los programas de cribado neonatal, que se basan en las recomendaciones de Wilson y Jugner15 que se recogen en la tabla 2. Finalmente a principio de los 90, a raíz de la publicación de Millington16se incorpora la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en algunos programas de cribado convirtiéndose en la herramienta más poderosa que ha aparecido en los últimos 20 años en el campo del diagnóstico neonatal de los ECM por tratarse de un sistema de gran versatilidad, sensibilidad y alta capacidad de análisis que ha permito expandir el cribado al realizar la medida simultánea de varios metabolitos y hacer casi realidad el concepto ideal para el cribado de : 1 muestra múltiples diagnósticos17. Criterios clásicos para la inclusión dentro del cribado neonatal Que la enfermedad curse con daño mental y físico grave o riesgo vital en el período neonatal. Que no exista posibilidad de diagnóstico clínico efectivo en período neonatal. Que esté disponible un tratamiento efectivo y asequible. Que la instauración del tratamiento de forma precoz mejore el pronóstico clínico. Que la enfermedad tenga una incidencia relativamente elevada. Que exista una metodología analítica rápida, fiable y de coste reducido. Tabla 2: Criterios para inclusión dentro del cribado neonatal, National Academy of Sciences, Washington, 1975 2.2.3 Métodos de Cribado Neonatal Los ECM se detectan y/o diagnostican mediante pruebas de laboratorio basadas en el análisis del producto génico metabólico (enzimas y/o metabolitos) y en el análisis de mutaciones del ADN. Podemos abordar el cribado neonatal a distintos niveles: Tesis Doctoral Introducción 18 1. A través del análisis del fenotipo bioquímico, mediante la detección de metabolitos; se hace así en la fenilcetonuria, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, las acidurias orgánicas, los defectos de la ßoxidación de los ácidos grasos, la galactosemia… Genotipo  metabolitos  cribado convencional 2. Análisis del fenotipo enzimático mediante la determinación de proteínas/enzimas como en el caso de galactosemia, deficiencia de biotinidasa… Fenotipo enzimático  proteína/enzima  cribado convencional 3. Análisis del genotipo a nivel del ADN, como en la fibrosis quística y en la inmunodeficiencia combinada severa. Fenotipo bioquímico  ADN  cribado genético 2.2.4 Recomendaciones para la toma de muestras En la actualidad en la mayoría de los centros de nuestro país se realiza una toma de muestra de sangre del talón en papel secante al tercer día de vida; en 3 centros de nuestro país se recoge además una muestra de orina lo que permite completar la información que obtenemos de la muestra de sangre y ampliar nuevos horizontes diagnósticos18. La punción se realiza generalmente en la porción medial o lateral de la superficie plantar del talón en los recién nacidos; así mismo, debe haberse masajeado el pie previamente para aumentar el flujo sanguíneo en la zona y desinfectado con alcohol de 70º19. Tesis Doctoral Introducción 19 Para que la muestra sea óptima las manchas de sangre que se obtienen deben contener al menos 75 µL (13 mm de diámetro aproximadamente) y deben dejarse secar a temperatura ambiente y fuera de la luz solar directa. La obtención de la muestra es un proceso sencillo que puede ser realizado por personal no sanitario si se siguen unas normas sencillas20,21. En algunas ocasiones puede ser necesario repetir la toma de la muestra; el Clinical and Laboratory Standars Institute ha elaborado un documento con recomendaciones para niños de menos de 2000 g o con sospecha de patología al nacimiento en el que se recoge que debe tomarse una muestra al ingreso, otra a las 48-72 horas de vida y otra a los 28 días de vida22. Así mismo en ese documento se recogen una serie de situaciones especiales en las que debe realizarse una segunda muestra: 1. Prematuros y gemelos monocigóticos: Debe repetirse la toma de muestra de sangre para cribado neonatal a partir de los 14 días de vida y antes de los 28 días de nacimiento. 2. Recién nacidos con patología grave al nacimiento: En estos casos, se debe tomar una muestra en el momento de ingreso (antes de que puedan recibir tratamiento antibiótico, alimentación parenteral,…) y repetirla a las 48-72 horas de vida según los resultados, fundamentalmente porque pueden existir elevaciones transitorias de TSH/IRT/17-OHP en la primera muestra. Tesis Doctoral Introducción 20 3. Transfusiones previas al cribado: En este caso se debe repetir la muestra a la semana y al mes de la transfusión. 4. Alimentación parenteral: En aquellos pacientes que estén recibiendo esta nutrición debe practicarse un nuevo cribado a los tres días de haber reiniciado la alimentación enteral normal, con independencia de la edad del niño en ese momento. En el momento actual existe la posibilidad de utilizar las muestras de sangre en papel con otros fines además de para el cribado de los errores congénitos del metabolismo. Con ligeras modificaciones en las condiciones de conservación o en el tipo de papel se emplean también para la detección de anemias, de enfermedades infecciosas o estudios de ADN. 2.2.5 Aplicación de la Espectrometría de masas en tándem El desarrollo de la técnica de espectrometría de masas para el diagnóstico de enfermedades congénitas metabólicas comienza en los años 70, pero es en los años 90 cuando se empieza a aplicar esta tecnología para el cribado neonatal. La metodología básica para el cribado neonatal de enfermedades metabólicas por MS/MS fue desarrollada por Millington16, Chace23, Rashed24 y sus colaboradores. La espectrometría de masas es una técnica de separación e identificación múltiple de analitos basada en el patrón específico de fragmentación iónica que produce cada compuesto bajo determinadas condiciones de análisis, y en la separación-detección de cada especie iónica según su relación masa/carga. Es así posible separar, detectar y cuantificar en un mismo ensayo, sin necesidad de un sistema cromatográfico adicional y a partir de un único disco de sangre seca sobre papel de filtro, los aminoácidos y acilcarnitinas que se utilizan como biomarcadores, lo que hace posible la detección de enfermedades congénitas del metabolismo que afectan al ciclo de la urea, aminoácidos, ácidos orgánicos y ßoxidación de los ácidos grasos con alta sensibilidad y especificidad14,25,26,27. El Tesis Doctoral Introducción 21 análisis es muy rápido (2-3 minutos) y solo requiere una limitada preparación de la muestra.28. La aplicación de esta tecnología ha supuesto un avance muy importante en el cribado neonatal y además ha hecho posible ampliar el conocimiento biomédico sobre distintas enfermedades metabólicas, en lo que se refiere a su heterogeneidad genética y fenotípica, ya que ha permitido descubrir deficiencias metabólicas en progenitores asintomáticos al estudiar a los hijos de estos29,30. La espectrometría de masas es una técnica analítica que proporciona información de las moléculas analizadas previamente convertidas en iones. Las moléculas de interés, forman parte generalmente de una mezcla heterogénea que no requiere necesariamente una separación previa, y se someten en primer lugar a una fuente de ionización donde se ionizan adquiriendo carga negativa o positiva. Los iones atraviesan el analizador de masas hasta que alcanzan diferentes partes del detector de acuerdo con su relación masa/carga (m/z). Una vez en contacto con el detector, se generan señales que son registradas en el sistema informático y representadas en un espectro de masas que muestra la abundancia relativa de las señales en función de su relación m/z. El análisis por espectrometría de masas comprende básicamente 4 procesos: Ionización de la muestra Aceleración de los iones por un campo eléctrico Dispersión de los iones según su masa/carga Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica. La ionización de la muestra puede llevarse a cabo en diferentes condiciones, según la naturaleza de la propia muestra y lo que se pretenda detectar en el análisis. Puede efectuarse en condiciones de alto vacío, por impacto electrónico, o a presión atmosférica. En este último caso, si se trata de un análisis en fase líquida, se realizará una ionización por electrospray (ESI), Tesis Doctoral Introducción 22 mientras que si es en fase gaseosa, se efectuará una ionización química o bien una fotoionización. 2.2.5.1 Ionización por electrospray En este caso el analito es introducido en la fuente de disolución bien mediante una bomba inyectora o bien procedente del eluido de un sistema de cromatografía líquida. El analito pasa a través de un tubo capilar de acero inoxidable o de cuarzo sílice, al cual se le aplica una elevada diferencia de potencial habitualmente en el rango de 2.5 a 6 kV. Esto fuerza la nebulización de las gotas cargadas en el capilar, con una carga superficial de la misma polaridad que el propio capilar. Las gotas son repelidas del capilar hacia el cono de la fuente de muestreo del electrodo contador. Con la ayuda de una elevada temperatura en la fuente de ESI y/o de gas nitrógeno, a medida que las gotas atraviesan el espacio entre el capilar y el cono, van reduciendo continuamente su tamaño, por evaporación del solvente, lo que supone un incremento de la densidad de carga superficial conforme disminuye el radio de las gotas. Finalmente, la fuerza del campo eléctrico en las gotas cargadas alcanza un punto crítico en el cual es cinética y energéticamente posible el paso a fase gaseosa para los iones de la superficie. En ese momento, la tensión superficial no es capaz de mantener la carga (límite de Rayleigh), por lo que se produce una “explosión Coulómbica” y la gota se rompe en gotas más pequeñas. El proceso se repite hasta que sólo quedan iones (Figura 1) Tesis Doctoral Introducción 23 Figura 1: Imagen de ionización por electrospray La principal desventaja que presenta esta técnica es que produce muy poca o ninguna fragmentación por lo que para estudios en los que es precisa una valoración estructural se hace necesaria la utilización de espectrometría de masas en tándem para conseguir dicha fragmentación. 2.2.5.2 Ionización química Como características generales es un proceso que utiliza un flujo de inyección grande (0.2-2.0 mL/min) y se aplica a moléculas no polares, compuestos estables térmicamente, normalmente de peso inferior a 1300 uma. Se requiere un gas nebulizador y una descarga de corriente para producir la ionización. El proceso consta principalmente de 3 pasos (Figura 2): 1. Mediante un alto voltaje, se ioniza el gas nebulizante (aire o nitrógeno) formando los primeros iones. 2. Estos primeros iones reaccionan inmediatamente con las moléculas de disolvente formando iones reactivos. 3. Los iones reactivos reaccionan con las moléculas de analitos formando en modo positivo o negativo. Tesis Doctoral Introducción 24 Figura 2: Esquema del proceso de ionización química a presión atmosférica 2.2.5.3 Espectrómetro de masas El analizador más empleado en los laboratorios clínicos es el cuadrupolar. Un cuadrupolo es un filtro de masas que consta de 4 cilindros metálicos paralelos y equidistantes (Figura 3). Cada par de cilindros opuestos está conectado eléctricamente. Al par de cilindros colocados en diagonal se le aplica un voltaje de corriente continua (DC) de igual magnitud pero de signo contrario, superpuesto con un voltaje de corriente alterna de radiofrecuencia (RF). Como resultado se obtiene un campo eléctrico que origina el movimiento de los iones en la dirección z (que va desde la fuente al detector) pero con una trayectoria oscilatoria simultánea en el plano x-y. La amplitud de la oscilación sólo depende de la relación m/z y puede ser controlada modificando los voltajes DC y RF en una proporción prefijada. Así el movimiento de los iones dependerá de los campos eléctricos de modo que sólo los de una determinada relación m/z estarán en resonancia y por tanto pasarán a través del detector. Los valores m/z que no estén en resonancia con dicha trayectoria chocarán con los cuadrupolos y no se detectarán. El rango de masas y la resolución del instrumento quedan determinados por la longitud y el diámetro de los cilindros. Tesis Doctoral Introducción 25 Figura 3: Esquema de un analizador de masas cuadrupolar Los cuadrupolos pueden configurarse en tándem de tal modo que nos permitan realizar estudios de fragmentación, el más habitual es el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QQQ)31, fundamento de la MS/MS. El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo consta de tres cuadrupolos dispuestos en línea recta (Figura 4). En el primer cuadrupolo (Q1) se selecciona el ion analito de interés por su masa y se le pone en contacto con un gas de colisión, generalmente Argón, un segundo cuadrupolo (Q2), sometido únicamente a RF, que se usa como celda de colisión para producir la fragmentación del ión precursor. Este proceso recibe el nombre de disociación inducida por colisión (CID). Los iones “hijos” resultantes de CID están relacionados con la estructura molecular del ión precursor y se escanean en el tercer cuadrupolo (Q3) que será el que proporciona la información estructural de los iones moleculares. Tesis Doctoral Introducción 32 Debe tenerse en cuenta que los programas de cribado neonatal deben adaptarse a las características genéticas, costumbres y hábitos sociales, condiciones sanitarias y estatus económico del país pero incluso en poblaciones de características similares como las europeas existe gran discrepancia entre los distintos programas de cribado neonatal26,34 (Tabla 3). Es por ello necesario establecer unos criterios de mínimos de unificación de los programas de cribado. Tesis Doctoral Introducción 33 Tesis Doctoral Introducción 34 Con este fin el Maternal and Child Health Bureau (MCHB) de la Health Resources and Services Administration (HRSA) norteamericana, reunió un grupo de expertos que elaboraron un documento “Newborn screening: Toward a uniform screening panel and system” que se publica en marzo 2005 en el que se recogen unos principios básicos y se proponen una serie de criterios en base a los cuales se deben evaluar las alteraciones que deben ser cribadas, haciendo, además, recomendaciones prácticas al respecto35. En dicho documento se recoge que deben ser cribadas las siguientes alteraciones: Alteraciones del metabolismo de los ácidos orgánicos - Acidemia isovalérica - Aciduria glutárica tipo I - Aciduria 3-hidroxi-3-metilglutárica - Déficit múltiple de carboxilasas - Acidemia metilmalónica - Deficiencia de 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa - Acidemia propiónica - Deficiencia de la β-cetotiolasa Alteraciones del metabolismo de los ácidos grasos - Deficiencia acil-CoA deshidrogenasa de cadena media - Deficiencia acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga - Deficiencia hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga - Deficiencia proteína trifuncional - Déficit primario de carnitina Alteraciones del metabolismo de los aminoácidos - Fenilcetonuria - Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce Tesis Doctoral Introducción 35 - Homocistinuria - Citrulinemia - Acidemia argininosuccínica - Tirosinemia tipo I Hemoglobinopatías - Drepanocitosis - Síndrome β-talasemia - Hemoglobinopatía tipo SC Otras alteraciones - Hipotiroidismo Congénito - Deficiencia de biotinidasa - Hiperplasia adrenal congénita - Galactosemia - Defectos de audición - Fibrosis quística En este sentido en nuestro país en el año 2006 a través del Consejo Interterritorial de Sanidad se elabora un informe sobre la situación del cribado neonatal en las diferentes comunidades autónomas españolas a partir del cual, un grupo de expertos elabora un documento titulado “Programa de cribado neonatal en España: actualización y propuestas de futuro” en el que se proponen 24 enfermedades endocrinas y metabólicas que deben incluirse en un programa de cribado (Tabla 4); dicho documento está refrendado por la Asociación Española para el Estudio de los Errores Congénitos del Metabolismo, Sociedad Española de Errores Innatos del Metabolismo-Asociación Española de Pediatría y Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular y ha sido publicado recientemente por el Real Patronato sobre Discapacidad del Ministerio de Sanidad y Política Social36. Tesis Doctoral Introducción 36 Enfermedades Síntomas clínicos Prevalencia Aminoacidopatías Hiperfenilalaninemia Retraso mental; espasticidad; convulsiones; hiperactividad; problemas del comportamiento y psiquiátricos; eczemas, pelo ralo 1-9:10000 Fenilcetonuria Defectos en la biosíntesis del cofactor biopterina Retraso mental; trastornos del movimiento <1:100000 Defectos en la regeneración del cofactor biopterina Retraso mental; trastornos del movimiento <1:100000 Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce Rechazo de la alimentación y vómitos ; retraso mental grave; encefalopatía; convulsiones; olor especial 0.4-2: 100.000 Tirosinemia Tipo I Enfermedad hepática grave; cirrosis; hematomas; raquitismo 0.05-1:100000 Homocistinuria Retraso mental; ectopia lentis; osteoporosis; anomalías esqueléticas, tromboembolismo 0.5-1: 100000 Acidurias Orgánicas Aciduria Glutárica tipo I Macrocefalia, encefalopatía; retraso del desarrollo; distonía 0.42.5:100000 Acidemia Isovalérica Cetoacidosis metabólica, hiperamoniemia; rechazo de la alimentación y vómitos; retraso mental y del desarrollo, convulsiones, coma, muerte y olor a sudor 1:100000 Aciduria 3-hidroxi 3metilglutárica Hipoglucemia hipocetósica; acidosis metabólica; síndrome de Reye-like; retraso del desarrollo; convulsiones; coma y muerte <1:100000 Deficiencia de la βcetotiolasa Crisis cetoacidóticas y retraso del desarrollo Desconocida 60 casos Acidemias Metilmalónicas Rechazo de la alimentación, vómitos; hipotonía; retraso mental y del desarrollo; fallo renal progresivo; pancreatitis; coma y muerte. 1.5-2:100000 (Cbl A, B,C,D, Mut) Acidemia Propiónica Cetoacidosis, hiperamoniemia; rechazo de la alimentación; vómitos; retraso mental y del desarrollo; hipotonía; convulsiones; coma y muerte 3.75:100000 Tesis Doctoral Introducción 37 Enfermedades Síntomas clínicos Prevalencia Defectos de la β-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media Hipoglucemia hipocetósica; vómitos; letargia; convulsiones; colapso cardiorrespiratorio; hepatopatía grasa; muerte súbita 15:100000 Deficiencia de L-3hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga Hipoglucemia hipocetósica; cardiomiopatía hipertrófica; miopatía con fatiga muscular y rabdomiolisis 1-9:100000 Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga Hipoglucemia hipocetósica; cardiomiopatía hipertrófica; miopatía con fatiga muscular; rabdomiolisis Desconocida >1:100000 Deficiencia primaria de carnitina Hipoglucemia hipocetósica; hepatomegalia; cardiomiopatía; debilidad muscular; muerte súbita 1-2:100000 Deficiencia de carnitina palmito iltransferasa 2 Hipoglucemia hipocetósica; malformaciones estructurales; convulsiones; hepatopatía; cardiomiopatía; fallo renal Desconocida >300 casos Deficiencia de carnitina/acilcarnitina traslocasa Hipoglucemia hipocetósica; esteatosis hepática; hipertrofia cardíaca Desconocida 30 casos Otras enfermedades endocrino-metabólicas Hipotiroidismo congénito Retraso mental y del crecimiento grave; macroglosia; hernia umbilical 10-50:100000 Hemoglobinopatías Anemia; infecciones recurrentes; crisis de dolor 10-50:100000 Fibrosis quística Infecciones broncopulmonares graves; problemas digestivos y esteatorrea; retraso del crecimiento 1-5:100000 Deficiencia de biotinidasa Convulsiones; hipotonía; dermatitis seborreica y alopecia; conjuntivitis; sordera neurosensorial; retraso mental 1.6:100000 Galactosemia Rechazo de la alimentación; vómitos; depresión neurológica; fallo hepático; diátesis hemorrágica; cataratas 6.6:100000 Tabla 4: Enfermedades recomendadas para introducir en los programas de cribado. Síntomas clínicos más comunes si el paciente no recibe tratamiento y prevalencia o casos publicados según el Informe de Mayo 2011 de Orphanet (www.orpha.net) Tesis Doctoral Introducción 38 2.2.8 Situación del Cribado Neonatal en España En España el primer programa de cribado neonatal surge en el año 1968 en Granada por iniciativa del Profesor Mayor-Zaragoza. En 1978 se establece el Programa de Detección Precoz Neonatal de Fenilcetonuria e Hipotiroidismo Congénito, y a partir de 1979 se organizó el Plan Nacional de Prevención de la Subnormalidad, con el amparo del Real Patronato de Educación y Atención a Deficientes. En 1982 los programas fueron transferidos a las Comunidades Autónomas. En el momento actual en España existen 18 laboratorios para el cribado neonatal: dos en Andalucía (Sevilla y Málaga), dos en la Comunidad Valenciana (Alicante y Valencia), y el resto de Comunidades disponen de un único centro (Murcia realiza las pruebas de Melilla, Sevilla las de Ceuta y Aragón las de la Rioja). Cada Comunidad Autónoma determina que enfermedades incluye en su programa de cribado por lo que existe una gran variabilidad entre los distintos programas de cribado que existen en nuestro país; la situación actual se puede resumir en: Las hiperfenilalaninemias y el hipotiroidismo congénito están incluidas en todos los programas de cribado. En 8 Comunidades Autónomas se realiza cribado ampliado por MS/MS para la detección de aminoacidopatías, acidurias orgánicas, defectos de βoxidación de ácidos grasos. Se realiza detección precoz de fibrosis quística en los programas de Aragón, Baleares, Canarias, Castilla y León, Cataluña, Extremadura, Galicia, La Rioja, Málaga, Murcia, País Vasco y Sevilla. La hiperplasia suprarrenal congénita está incluida en los programas de Aragón, Castilla-La Mancha, Extremadura, Madrid y La Rioja. Tesis Doctoral Introducción 39 La anemia falciforme y otras hemoglobinopatías se incluyen en los programas de Extremadura, Madrid y País Vasco. Extremadura, Navarra y Valencia analizan la orina para la detección de otras aminoacidopatías y Murcia y Galicia para la detección de cistinuria. En Galicia se realiza la detección precoz de galactosemia y en Murcia y Galicia también del déficit de biotinidasa. Tesis Doctoral Objetivos 41 3. OBJETIVOS Tesis Doctoral Material y Método 48 En la muestra de sangre se realiza determinación de aminoácidos, acilcarnitinas y hexosas monofosfato mediante espectrometría de masas en tándem con un equipo de triple cuadrupolo ESI-MS/MS API 2000(Sciex Applied BioSystems) equipado con una bomba de jeringa integrada para realizar infusiones individuales y una fuente de Turboión Spray. Como gas de colisión y gas cortina se empleó nitrógeno. Las muestras fueron infundidas acoplando un equipo de HPLC compuesto de un muestreador automático para microplacas y una bomba modelo Series 200 (Perkin-Elmer). En la muestra de orina se estudiaron aminoácidos y acilcarnitinas mediante ionización positiva y acilglicinas y ácidos orgánicos mediante ionización negativa lo que permite obtener gran cantidad de información en un único análisis. Se analizaron también galactosa y cistina mediante el Test de Brand y la actividad de la biotinidasa mediante ensayo colorimétrico específico. Para el corte de las muestras de orina impregnadas en papel y su introducción en las placas de microtitulación se empleó una taladradora automática BSD 700 (BSD tech. Brisbane, Australia). Para la extracción de la orina del papel de filtro se empleó un vórtex de sobremesa para microplacas (SBS). La evaporación a sequedad de las muestras se realizó en un evaporador Micro-DS96 (Porvair Sciences) con nitrógeno. Estas determinaciones permiten realizar el cribado en todos los neonatos de aminoacidopatías, defectos de la ß-oxidación de los ácidos grasos, acidurias orgánicas, galactosemia y déficit de biotinidasa (también de hipotiroidismo y fibrosis quística pero estas patologías no se incluyeron en el grupo de estudio). Los percentiles de concentraciones de analitos medidos mediante MS / MS en la sangre de los recién nacidos sanos y enfermos se comunicaron periódicamente al proyecto colaborativo “Region-4-Genetics” que es un proyecto internacional para la mejora de la calidad de los resultados obtenidos mediante los programas de cribado por MS/MS en el que participan laboratorios de todo el mundo aportando los datos de los diagnósticos realizados y los niveles de metabolitos en la primera semana de vida, los valores de referencia obtenidos en Tesis Doctoral Material y Método 49 la población y los puntos de corte utilizados tanto para acilcarnitinas como para aminoácidos; permitiendo de este modo la validación de los puntos de corte utilizados. En la Tabla 5 se recogen los metabolitos usados como marcadores, el punto de corte de los mismos y el método diagnóstico empleado. En aquellos casos en los que el resultado del cribado era claramente patológico y sugería trastornos graves, los pacientes fueron remitidos inmediatamente a la unidad clínica; si el resultado se encontraba fuera del rango normal pero sin ser claramente indicativo de afectación severa se realizó una segunda muestra; si ésta resultaba igualmente positiva los pacientes se remitían también a la unidad clínica. En todos aquellos casos en los que el cribado estaba alterado se realizaron determinaciones analíticas para confirmar o descartar el diagnóstico de sospecha como aminoácidos en plasma, ácidos orgánicos en orina líquida, estudio enzimático y/o genética molecular. Así mismo a todos los pacientes en los que se confirmó el diagnóstico de una metabolopatía se les realizó un seguimiento evolutivo. 4.3.2 Diagnóstico y seguimiento En el estudio se recogieron variables relacionadas con el diagnóstico y el seguimiento. En relación con el diagnóstico se recogieron las siguientes variables: presencia o no de síntomas, marcadores bioquímicos alterados, diagnóstico, métodos usados para la confirmación diagnóstica y necesidad de usar diálisis u otras técnicas de depuración extrarrenal. Entre las relacionadas con el seguimiento se incluyeron: necesidad de tratamiento dietético y/o farmacológico, tiempo de seguimiento y desarrollo psicomotor. Se recogió así mismo el impacto que supone el cribado ampliado en una unidad neonatal valorando el número de pacientes que precisaron ingreso en la unidad, los cuidados que precisaron dichos pacientes y la evolución clínica de los mismos. Tesis Doctoral Material y Método 50 El índice de Desarrollo Psicomotor (PDI) o Cociente intelectual (CI) se valoró utilizando la escala de Brunet-Lézine en los niños lactantes; la escala de McCarthy en los niños preescolares y la Wechsler Intelligence Scale for Children (WISC-R) para los niños mayores de 6 años. Se consideraron como valores normales de PDI o CI aquellos que fueron iguales o superiores a 85. Aquellos casos en los que los marcadores bioquímicos se encontraban alterados en el cribado neonatal pero fueron normales en los test diagnósticos posteriores se consideraron como falsos positivos. Aquellos otros casos en los que los marcadores bioquímicos se encontraban alterados en el cribado pero se normalizaron espontáneamente en muestras sucesivas se consideraron alteraciones transitorias. En estos casos con alteraciones transitorias se realizó cuando era oportuno un estudio de las madres para comprobar si las alteraciones presentadas se relacionaban con un déficit materno. Si el cribado neonatal fue considerado normal pero se demostró con posterioridad que presentaban enfermedad metabólica se consideraron falsos negativos. Tesis Doctoral Material y Método 51 Tabla 5: Puntos de corte y métodos diagnósticos empleados para los distintos ECM. Tesis Doctoral Material y Método 52 4.3.3 Análisis estadístico Se realizó estadística descriptiva de las variables del estudio. Para las variables cualitativas se emplearon frecuencias relativas y absolutas que se representan mediante diagramas sectoriales y de barras mientras que, para las variables cuantitativas según siguieran o no una distribución normal (tras la aplicación del test de Kolmogorov-Smirnov) se resumieron mediante Md ±SD (media y desviación estándar) y rango (mínimo y máximo). El análisis estadístico se ha realizado con el paquete Statistical Package for Social Sciences (SPSS). Tesis Doctoral Resultados 53 5. RESULTADOS Tesis Doctoral Resultados 55 5. RESULTADOS El Programa de Cribado Neonatal está plenamente establecido en Galicia llevándose a cabo en el 99,9% de los recién nacidos lo que representa un 4,44% de los recién nacidos en España. Desde julio del 2000 se realiza cribado ampliado por espectrometría de masas en tándem. Durante el período de estudio (julio 2000 a julio 2010) se realizó el cribado metabólico neonatal a 210.165 recién nacidos, detectándose 137 casos con errores congénitos del metabolismo; esto supone una frecuencia de 1/1534 recién nacidos. Si no tomamos en cuenta los 35 pacientes que fueron diagnosticados de hiperfenilalaninemia benigna la frecuencia de Errores Congénitos del Metabolismo sería de 1/2060 recién nacidos tal y como se refleja en la publicación de Molecular Genetics and Metabolism adjunta. Si consideramos todo el cribado endocrino-metabólico neonatal, con la fibrosis quística (16) y el hipotiroidismo congénito (211) la frecuencia sería de 1/577 recién nacidos. La Tabla 6 recoge el número de casos de cada uno de los diagnósticos realizados a través del cribado, la frecuencia de estos diagnósticos en relación a los recién nacidos cribados y a cada millón de recién nacidos. Tesis Doctoral Resultados 56 Enfermedad Nº casos Incidencia/106 RN IC 95% 1/Nº RN cribados HPA benigna 35 166,5 111-221 1/6005 Fenilcetonuria 17 80,8 42-119 1/12363 Tirosinemia tipo I 2 9,5 0-23 1/105082 Homocistinuria 1 4,7 0-14 1/210165 Déficit de MAT I/III 8 38 12-64 1/26271 Enf. Jarabe arce 4 19 0-38 1/52541 Alcaptonuria 2 9,5 0-23 1/105082 Citrulinemia tipo I 1 4,7 0-14 1/210165 Aciduria arginino-succínica 1 4,7 0-14 1/210165 Déficit de arginasa 1 4,7 0-14 1/210165 Aciduria propiónica 2 9,5 0-23 1/105082 Aciduria metilmalónica 3 14,2 0-30 1/70055 Aciduria glutárica tipo I 6 28,5 6-51 1/35027 Metilcrotonilglicinuria 4 19 0-38 1/52541 Aciduria 3-OH-metilglutárica 1 9,5 0-14 1/210165 MCAD 11 52,3 21-83 1/19106 LCHAD 2 9,5 0-23 1/105082 SCAD 4 19 0-38 1/52541 Déficit transportador de carnitina 1 9,5 0-23 1/210165 Galactosemias 11 52,3 21-83 1/19106 Aciduria piroglutámica 1 9,5 0-14 1/210165 Déficit de biotinidasa Total:1 Parcial:6 Total:9,5 Parcial:28,5 Total: 0-14 Parcial: 6-51 Total: 1/210165 Parcial:1/35027 Aciduria mevalónica 1 9,5 0-14 1/210165 Cistinuria 11 52,3 21-83 1/19106 Tabla 6: ECM a través del cribado neonatal en el período julio del 2000 - julio 2010. (IC: Intervalo de Confianza) Tesis Doctoral Resultados 57 5.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS PACIENTES DIAGNOSTICADOS A TRAVÉS DEL CRIBADO Las alteraciones detectadas con mayor frecuencia en el cribado neonatal fueron las hiperfenilalaninemias (HPA benigna 1/6005; PKU 1/12363) seguidas de los defectos de la ß-oxidación de ácidos grasos de cadena media (MCAD) (1/19106), cistinurias (1/19106) y galactosemias (incluyendo galactosemia clásica por déficit de galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), deficiencia de galactokinasa (GALK) y deficiencia de galactosa-4 epimerasa (GALE) con una frecuencia en total de 1/19106). También se encontró una frecuencia relativamente elevada de la deficiencia de metionina adenosiltransferasa (MAT I/III) con una frecuencia de 1/26271 recién nacidos; que se detectó en todos los casos al realizar el diagnóstico diferencial de homocistinuria. Los casos de alcaptonuria y aciduria mevalónica no se suelen buscar de forma rutinaria en el cribado neonatal pero se han podido diagnosticar al realizar el diagnóstico diferencial de otras entidades con ayuda de la muestra de orina. La aciduria orgánica detectada con mayor frecuencia fue la aciduria glutárica tipo I con una frecuencia de 1/35027 recién nacidos. Excepto en las cistinurias el diagnóstico fue confirmado en todos los casos mediante estudio enzimático y/o molecular. Nueve pacientes (dos con enfermedad de jarabe de arce, uno con citrulinemia tipo I, uno con aciduria propiónica, uno con aciduria piroglutámica, uno con aciduria mevalónica, dos con tirosinemia tipo I y uno con aciduria metilmalónica) presentaban síntomas clínicos en el momento de su detección (6,6%); cuatro de ellos (dos pacientes con enfermedad de jarabe de arce, uno con aciduria propiónica y uno con aciduria metilamalónica) precisaron la aplicación de terapias de depuración extrarrenal. De estos cuatro las dos acidurias orgánicas fueron éxitus en el primer año de vida y los dos pacientes con enfermedad de jarabe de arce se encuentran ahora asintomáticos. Los otros cinco pacientes precisaron ingreso pero no depuración extrarrenal; actualmente tres se encuentran asintomáticos y otros dos presentan síntomas clínicos en relación con su Tesis Doctoral Resultados 64 Alelo 1 Act. % C. Mut. Dominio Alelo 2 Act. % T. Mut. Dominio FG Fen. p.Y277D c.754C>T ? Miss Catalítico p.L48S c.143T>C 0-39 Miss Regulador 2 PKUL PKUM p.F55Lfs c.165delT ? Del Regulador p.R261Q c.782G>A 27-47 Miss Catalítico 1 PKUC p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - p.R270K c.809G>A ? Miss Catalítico 1 PKUC p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - p.I65T c.194T>C 21-60 Miss Regulador 1 PKUC p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - p.R68S c.204A>T 18-98 Miss Regulador 1 PKUM p.P211T c.631C>A 72 Miss Catalítico p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - 1 PKUL p.R243Q c.728G>A 10-18 Miss Catalítico p.E390G c.1169A>G 70-85 Miss Catalítico 1 PKUL p.R243Q c.728G>A 10-18 Miss Catalítico p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - 1 PKUC p.R261Q c.782G>A 27-47 Miss Catalítico p.D415N c.1243G>A 72 Miss Catalítico 1 PKUL p.R261Q c.782G>A 27-47 Miss Catalítico p.IVS10-11G>A c.1066-11G>A 0 Spli - 1 PKUC p.R68S c.204A>T 18-98 Miss Regulador p.F39del c.115-117delTTC 20-83 Del Regulador 1 PKUL p.R176X c.526C>T ? Non Catalítico p.R261Q c.782G>A 27-47 Miss Catalítico 1 PKUC p.R243X c.727C>T <1 Non Catalítico p.V388M c.1162G>A 15-43 Miss Catalítico 1 PKUC p.V388M c.1162G>A 15-43 Miss Catalítico p.E280K c.838G>A 0-12 Miss Catalítico 1 PKUC Tabla 11: Genotipos, fenotipos y actividad enzimática de los pacientes con fenilcetonuria. (FG: Frecuencia de genotipos; Act: Actividad; T. Mut: Tipo Mutación; Non: Nonsense; Miss: Missense; Del: Delección; Spli: Splicing; Fen: Fenotipo) De los 39 genotipos encontrados sólo 5 de ellos se repiten en más de una ocasión. Tres de estos genotipos corresponden a familiares: p.L48S/p.Y277D son hermanas gemelas y p.R176L/p.R261Q y p.T380M/p.E280K son hermanos. Las dos hermanas gemelas que presentan el mismo genotipo fenotípicamente se comportan uno como una fenilcetonuria leve y la otra como una fenilcetonuria moderada, en los otros casos hay concordancia fenotipo/genotipo. No se han detectado mutaciones nuevas. La terapia con tetrahidrobiopterina (BH4) (Laboratorios Schirks, Suiza) desde 2004 a 2009, y desde 2009 con dihidrocloruro de sapropterina (Kuvan®; Merck Serono, Suiza) ha supuesto un avance en el tratamiento de la fenilcetonuria porque permite en los pacientes respondedores incrementar la tolerancia a las proteínas naturales manteniendo adecuados niveles de fenilalanina. Para valorar que pacientes presentan respuesta al tratamiento con Tesis Doctoral Resultados 65 este cofactor realizamos un test de sobrecarga durante 24 horas administrando una dosis de sapropterina (BH4) de 20 mg/kg y midiendo los niveles de fenilalanina en situación basal y a las 4, 8, 12 y 24 horas tras la administración del cofactor. En nuestra unidad se empezó a realizar este test a los pacientes diagnosticados a través del cribado neonatal en el año 2002. Se considera que la respuesta es positiva cuando se produce un descenso de los niveles de fenilalanina en sangre ≥ 30% a las 24 horas. El 29,4% (5/17) de los pacientes con fenilcetonuria tuvieron respuesta positiva a la prueba de sobrecarga y fueron tratados con BH4/sapropterina (en todos ellos se realizó previamente el test de sobrecarga de BH4 en el primer mes de vida) a una dosis de entre 5-20 mg/kg por día, la dosis se ajustó en función de la tolerancia en la dieta y de los niveles de fenilalanina en sangre (Tabla 12). De los pacientes que reciben tratamiento tres presentan fenilcetonuria leve y dos presentan fenilcetonuria moderada con niveles de fenilalanina en el momento de realizar el test de sobrecarga entre 403 y 1066 µmol/L observándose un descenso ≥30% a las 8 horas y mayor del 57-64 % a las 24 horas. No presentó respuesta ninguno de los pacientes con fenilcetonuria clásica. Ninguno de ellos presentó efectos secundarios en relación con el tratamiento farmacológico. A continuación se recogen las características de los pacientes que reciben tratamiento con BH4/ Kuvan desde el período neonatal y los datos sobre la evolución de los mismos (Tabla 12). Tesis Doctoral Resultados 66 Duración tto. 4a 10m 1a 2m 4a 4m 1a 11m 4a 4m Tabla 12: Características de los pacientes respondedores a BH4. (CD: cociente de desarrollo; PKUS: PKU suave; PKUM: PKU moderada) BH4 dosis mg/kg/d 8,9 10 10,4 10 10 Niveles de Phe (µmol/L) y tolerancia (mg/day)post-BH4 Tolerancia Phe 880 1100 800 565 750 Mediana 182 127 139 179 127 Media±SD 192 ± 84 135 ± 35 170 ± 111 195 ± 142 164 ± 118 CD 88 110 103 93 97 Edad actual 4a 11m 1a 3m 4a 5m 2a 4a 5m % red. Phe 24 h 64.2 64.2 60 60 57.1 Genotipo p.P211T (c.631C>A) p.IVS10-11G>A (c.1066-11G>A) No realizado p.Y277D (c.829T>G) p.L48S (c.143T>C) p.R68S (c.204A>T) p.IVS10-11G>A (c.1066-11G>A) p.Y277D (c.829T>G) p.L48S (c.143T>C) Fenotipo PKUS PKUS PKUS PKUM PKUM Paciente 1 2 3 4 5 Tesis Doctoral Resultados 67 5.2.1.2 Tirosinemias Durante el período de estudio se detectaron 2 pacientes con elevación de la tirosina en la muestra de sangre (valor medio de tirosina 662,729 µM); en los que se confirmó el diagnóstico de tirosinemia tipo I; lo que supone que esta patología presenta una frecuencia de 1/105082 recién nacidos. En el momento de la detección al persistir la tirosina elevada ambos presentaban alteraciones de la coagulación (índice de Quick del 16% el paciente nº1 y del 25% el paciente nº2) y marcada elevación de α-fetoproteína (media 215000 ng/ml). Además el paciente nº1 presentaba disfunción tubular renal con nefrocalcinosis y elevación de las transaminasas. En ambos casos la succinilacetona estaba elevada en sangre y orina y también los 4hidroxifenilderivados, los dos presentaron la misma mutación de splicing IVS12+5 G>A (c.1062+5G>A) en homocigosis. Recibieron desde el mes de vida tratamiento con nitisinona (NTBC) iniciándola a 1 mg/kg/día en dos dosis que se ajustó posteriormente de acuerdo con niveles plasmáticos de nitisinona (se consideraron niveles plasmáticos adecuados entre 30-60 µmol/L). También recibieron tratamiento con dieta restringida en fenilalanina y tirosina para mantener unos niveles de tirosina en sangre por debajo de 400µmol/L y de fenilalanina entre 35-120 µmol/L. Ambos presentan, con un tiempo medio de seguimiento de 99 meses, buena evolución clínica con buen cumplimiento del tratamiento, uno de ellos presenta déficit de atención recibiendo tratamiento con metilfenidato durante 6 meses. 5.2.1.3 Trastornos del metabolismo de los aminoácidos azufrados. Una elevación significativa de metionina (el percentil 99 en nuestra comunidad es de 48µmol/L) se detectó en el período de estudio en 9 pacientes; de estos 1 fue diagnosticado de homocistinuria clásica (déficit de cistationina βsintasa) y los otros 8 de deficiencia de metionina adenosiltransferasa (déficit de MAT I/III). Tesis Doctoral Resultados 68 El paciente diagnosticado de homocistinuria clásica presentaba en la muestra de sangre del cribado metionina elevada, con un valor de 59 µmol/L y homocistina en orina de 22 mg/g de creatinina. Se confirmó el diagnóstico mediante el estudio genético presentando en homocigosis la mutación p.T257M. Recibe tratamiento con betaína, dieta restringida en metionina y suplementos de ácido fólico y vitaminas B6 y B12. A los 5 años de edad presenta muy buena evolución clínica manteniendo los niveles de homocisteína por debajo de 40 µmol/L. Los ocho pacientes diagnosticados de déficit de MAT I/III presentaron en la primera muestra de cribado (recogida en todos los casos en los primeros cinco días de vida) valores elevados de metionina (rango 50-341 µmol/L). En el estudio posterior de aminoácidos plasmáticos presentaron valores medios de metionina de 188,5 µmol/L y la homocisteína normal, excepto en el paciente nº1 que presentaba en el momento de confirmar el diagnóstico una marcada elevación de la metionina (573 µmol/L) y homocisteína ligeramente elevada (22,8 µmol/L). Se confirmó en todos los pacientes el diagnóstico mediante estudio genético presentando todos ellos en heterocigosis la mutación de fenotipo dominante p.R264H (c.791g/a) en el gen MAT1A. Estos ocho casos suponen una frecuencia de déficit de MAT I/III en nuestra comunidad de 1/26271 recién nacidos (Tabla 13). Paciente 1 2 3 4 5 6 7 8 Edad Actual 5a 4m 5a 2m 5a 2m 5a 1m 3a11m 1a 6m 1a 3m 2a 8m Sexo Mujer Varón Mujer Varón Varón Mujer Mujer Mujer Metionina (µM) En cribado 50 100 88 141 100 115 106 292 Confirmación diagnóstica Met573 tHc22,8 Met189 tHc8,9 Met341 tHc9,7 Met331 tHc12,4 Met180 tHc9,3 Met180 tHc9,3 Met131 tHc15 Met295 tHc10 Mutación p.R264H p.R264H p.R264H p.R264H p.R264H p.R264H p.R264H p.R264H Tabla 13: Características de los pacientes con déficit de MAT I/III. (Met: metionina; tHc: homocisteína) Tesis Doctoral Resultados 69 Se determinaron los niveles plasmáticos de metionina en los padres de 7 de los 8 pacientes (uno de los padres no autorizó realizar la determinación) encontrándose como era previsible elevación de la metionina en uno de los padres, dado la herencia autosómica dominante de la mutación p.R264H. Los progenitores están asintomáticos con excepción del padre del paciente nº4 que presenta cardiopatía no relacionada con la hipermetioninemia y moderada elevación de las enzimas hepáticas que se relaciona con el tratamiento farmacológico que recibe. Además se diagnosticó un caso más de déficit de MAT I/III en una niña de 7 años hermana de uno de los pacientes diagnosticado por cribado que presentaba unos niveles de metionina de 124 µmol/L y que no había sido detectada en el período neonatal por no aplicarse todavía en aquel momento el cribado ampliado. Todos los pacientes detectados a través del cribado se mantienen con niveles de metionina inferiores a 300 µmol/L, con una dieta sin exceder los requerimientos recomendados de proteínas para su edad. Con un tiempo medio de seguimiento de 53 meses se encuentran asintomáticos con un desarrollo antropométrico y neurológico adecuado y un cociente de desarrollo en rango normal. 5.2.1.4 Enfermedad de la orina de jarabe de arce (MSUD) Se diagnosticaron durante el período de estudio 4 casos; 2 formas clásicas (con una actividad decarboxilante inferior al 2% respecto al control) y 2 formas intermedias (actividad entre el 3 y el 30%). Los 2 pacientes con la forma clásica diagnosticados entre el 5º y 7º día de vida presentaban a su detección clínica de encefalopatía aguda grave y concentraciones de leucina superiores a 2000 µmol/L (2500 y 2269 respectivamente). En los de la forma intermedia, uno de los pacientes fue detectado en el cribado metabólico con una concentración de leucina+isoleucina de 1467 µmol/L en la muestra de sangre tomada a los 7 días de vida; en el momento de la confirmación diagnóstica, a los 14 días de edad, presentaba clínica de vómitos y Tesis Doctoral Resultados 70 succión lenta con pérdida de peso, su concentración de leucina plasmática en ese momento era de 1682 µmol/L. El otro paciente estaba asintomático a su detección. Todos los pacientes eran hijos de padres no consanguíneos, de etnia caucásica, a término y con un embarazo y un parto sin incidencias destacables. En los 2 niños con presentación neonatal grave, síntomas de encefalopatíacoma y concentraciones de leucina plasmática al ingreso superior a 2000 µmol/L, se indicó inicialmente fluidoterapia iv con alto aporte de glucosa y lípidos, manteniendo el sodio entre 140-145 meq/L y suplemento de tiamina (aunque ninguno de ellos presentó respuesta a ésta). Se llevó a cabo además, depuración artificial mediante diálisis peritoneal, y en ambos casos se consiguieron en 24 horas valores en torno a 1000 µmol/L. Figura 9: Perfil de la enfermedad de la orina de jarabe de arce. En los pacientes con formas clásicas se observó una decarboxilación de leucina en fibroblastos muy deficiente (1,3 y 1,2% con respecto al control) y en Tesis Doctoral Resultados 71 los pacientes con formas intermedias del 4% y 26% con respecto al control. En los análisis de complementación genética los pacientes con formas clásicas pertenecen al grupo de complementación E1b del gen BCKDHB con los genotipos p.K116fs/p.G172W y p.I214K/p.I214K y los pacientes con formas intermedias pertenecen uno también al grupo E1b del gen BCKDHB con el genotipo p.I214K/p.A311H y el otro al grupo E1a del gen BCKDHA con el genotipo p.A285P/p.A220V. Todos ellos mantuvieron un adecuado control metabólico con concentraciones medias de leucina evolutivas <240 µM (220, 177, 252 y 121 µmol/L respectivamente) excepto durante los períodos de descompensación. Excepto el paciente 4 que se mantuvo asintomático, los otros tres presentaron descompensaciones metabólicas moderadas que precisaron ingreso hospitalario en relación con infecciones víricas y/o bacterianas (infección respiratoria y otitis fueron las más frecuentes). Durante estas descompensaciones, la concentración plasmática de leucina sólo superó esporádicamente los 1000 µmol/L en dos de los pacientes. El tratamiento fue siempre dietético, con suplementos de isoleucina, valina y también glutamina, alanina y tiamina; en dos de los casos se administró nutrición parenteral con una mezcla de aminoácidos exenta de leucina, valina e isoleucina. Evolutivamente todos ellos presentan unos parámetros antropométricos normales y un cociente de desarrollo normal (con puntuaciones de 85, 94, 117, 110) aunque es superior en los pacientes con formas intermedias (Tabla 14). El tiempo medio de seguimiento es de 77 meses y todos ellos se encuentran en el momento actual asintomáticos. Tesis Doctoral Resultados 72 Fenotipo Edad actual Gen Mutación Activ. Enzimát Nº Ing CD/CI 1 Clásica 7 años E1b/BCKDHB p.K116fs(c.348delA) p.G172W(c.514G>) 1,2% 6 85 2 Clásica 5a 4m E1b/BCKDHB p.I214K(c.641T>A) p.I214K(c.641T>A) 1,3% 2 94 3 Intermedia 8 años E1a/BCKDHA p.A285P(c.853G>C) p.A220V(c.659C>T) 4% 5 117 4 Intermedia 2a 7m E1b/BCKDHB p.I214K(c.641T>A) p.A311H (c.931G>C) 26% 0 110 Tabla 14: Características de los pacientes con Enfermedad de Jarabe de Arce 5.2.1.5 Alcaptonuria En nuestro grupo de estudio se detectó elevación de ácido homogentísico en orina en 2 pacientes (p.1: 4715 mmol/mol de creatinina y p.2: 300mmol/mol de creatinina) en la muestra del cribado. En muestras de orina líquidas obtenidas al mes y 3 semanas en el paciente nº1 y al mes de vida en el nº2 los valores obtenidos fueron mucho más elevados (p.1: 11752 mmol/mol de creatinina y p.2: 900 mmol/mol de creatinina). El genotipo del paciente nº1 presenta en el gen HGD las mutaciones p.V300G (c.1066T>G)/c.1355+1G>A y el del nº2 p.D18V(c.53A>T)/p.S45QfsX66 (c.133delT). Los dos pacientes reciben tratamiento con dieta sin exceso de proteínas animales y suplemento de vitamina C. Con un tiempo medio de seguimiento de 30 meses se encuentran asintomáticos como era de esperar. Tesis Doctoral Resultados 73 5.2.2 Defectos del ciclo de la urea Se han detectado por cribado aquellos defectos con citrulina/arginina elevadas en la muestra de sangre en papel de filtro. Citrulinemia tipo I Aciduria arginino-succínica Déficit de arginasa Nº casos 1 1 1 Prevalencia 1/210165 1/210165 1/210165 Síntomas al dx Si No No Marcadores bqcos alterados (rango medio) Citrulina(s): 1096µM Ac. orótico(o):80mmol/molcrea Phe(s):608µM[188-1418] Phe/Tyr:9,1[4,0-22,1] Tyr(s):662,729µM Diálisis o depuración extrarrenal No No No Tmedio dx (meses) 24 26 44 CI/CD (media) 85 86 98 Situación actual CS LS LS TABLA 15: Características de los pacientes con trastornos del ciclo de la urea (s: sangre; o: orina; LS: libre de síntomas; CS: con síntomas). 5.2.2.1 Citrulinemia tipo I Se detectó un paciente, el cual a las 48 horas de vida inicia clínica de vómitos y distensión abdominal e ingresa en su hospital de referencia con sospecha inicial de pseudobstrucción intestinal. Presenta un rápido empeoramiento del estado general con hipotonía, deterioro neurológico y crisis convulsivas precisando intubación y ventilación mecánica. Al quinto día de vida en las pruebas endocrino-metabólicas se objetiva elevación de citrulina en sangre (2400 µmol/L), de glutamina (2811 µmol/L) y del orótico en orina (1435 µmol/L). Estos hallazgos de cribado facilitaron su diagnóstico más rápido; fue trasladado a nuestro centro con un valor de amonio en ese momento de 680 µmol/L; se inició entonces tratamiento con benzoato sódico y fenilacetato sódico intravenoso consiguiendo la normalización de las cifras de amonio a las 12 horas Tesis Doctoral Resultados 80 Paciente 1 2 3 4 5 6 Sexo varón mujer varón Mujer mujer mujer Edad dx 11 días 19 días 15 días 20 días 11 días 18 días Síntomas al dx No Macrocefalia No Macrocefalia Macrocefalia Macrocefalia C5DC en sangre 0.48 0.58 0.53 0.27 3.86 4.23 C5DC en orina 43.1 17.5 15.9 14.5 132 68 3OH-GA en orina 238 1267 70 176.3 368 574 GA en orina 412 86 82 40 5160 3509 Estudio Molecular p.R227p/ p.S305L p.R88C/ p.Y398C p.D220N/ p.R402W p.R227P/ p.R227P p.R88H/ p.R88H p.R88H/ p.R88H Cambio nucleótido c.716G>C/ c.950C>T c.298C>T/ c.1229A>G c.694G>A c.1124C>T c.716G>C/ c.716G>C c.299G>A c.299G>A c.299G>A c.299G>A Imagen al dx (RNM/Eco) N A N A A A Tabla 17: Características clínicas y bioquímicas de los pacientes con aciduria glutárica tipo I al diagnóstico. (N: normal; A: aumento del espacio subaracnoideo fronto-temporal) Paciente 1 2 3 4 5 6 Edad actual 9 a 9m 9a 7m 3a6m 2a 2m 23m 16m Síntomas Asintomático Déficit atención Asintomático Asintomático Macrocefalia Asintomático Macrocefalia Asintomático Macrocefalia Tratamiento L-carnitina L-carnitina L-carnitina L-carnitina L-carnitina B12 L-carnitina B12 Dieta Restringida en lisina y triptófano Restringida en lisina y triptófano Restringida en lisina y triptófano Restringida en lisina y triptófano Restringida en lisina y triptófano Restringida en lisina y triptófano Lisina: media (rango) 72.8 (37-102) 85.6 (34.8-173) 40 (23.8-68.1) 81.6 (44.4-120) 89.1 (61.1-139) 58.9 (19.9-92) Triptófano: media (rango) 41.9 (35.7-49.3) 48.5 (33.1-86.8) 46.7 (23.1-70.7) 49.2 (38.9-60.8) 41.5 (31.8-48.8) 45.4 (28.1-59.8) Carnitina: media (rango) 41.4 (34.0-59.0) 50.4 (41.7-60.0) 66.1 (49.3-93.2) 60.6 (35.9-122) 65.2 (43.5-82.2) 74.8 (51.3-93.0) C5DCsangre:media (rango) 0.20 (0.14-0.29) 0.80 (0.56-0.92) 0.10 (0.03-0.28) 0.20 (0-0.44) 5.5 (3.60-8.09) 3.5 (1.84-7.18) Discapacidad Motora No No No No No No Cociente Desarrollo 105 85 95 100 110 100 Lenguaje Fluido Fluido Fluido Fluido Fluido Fluido Tabla 18: Seguimiento de los pacientes con diagnóstico de Aciduria Glutárica Tipo I. Tesis Doctoral Resultados 81 5.2.3.4 Metilcrotonilglicinuria En nuestra unidad se recibieron cuatro pacientes con sospecha de metilcrotonilglicinuria en el cribado neonatal; todos ellos estaban asintomáticos y presentaban niveles elevados de 3-hidroxiisovalerilcarnitina (C5OH) en sangre (media 1,89 µM y un rango 0.55-5.3) y de 3OH isovalérico en orina (media 970 mmol/mol crea y un rango 85-3521). Se confirmó el diagnóstico por estudio enzimático demostrándose actividad deficiente de la 3 metilcrotonilCoAcarboxilasa (MCC) y se realizó también estudio genético; identificándose en tres de ellos los genotipos p.F546fs (c.1635dupT)/p.F546fs (c.1635dupT),p.A160T (c.478G>A)/p.I441T (c.1321T>C) en el gen MCCC2 y p.P464H(c.A1528C)/p.A456A en el MCCC1. El resultado del estudio genético del otro paciente está pendiente de resultado. Con un tiempo medio de seguimiento de 56 meses presentan un buen control clínico, recibiendo dieta con moderada restricción proteica y suplementos de biotina y carnitina. Uno de los pacientes precisó ingreso en relación con una hipoglucemia cetósica y ese mismo paciente está diagnosticado de déficit de atención e hiperactividad. Paciente 1 2 3 4 C5-OH 5.3 0.93 0.55 0.79 3OH isovalérico en orina 3521 189 87 85 Estudio genético p.F546fs/p.F546fs c.1635dupT/c.1635dupT Pendiente de resultado p.A160T/p.I441T c.478G>A/c.1321T>C p.P464H/p.A456A c.A1528C/-- Gen MCCC2 MCCC2 MCCC1 Edad actual 1a 11m 5a 5m 2a 7m 6a 9m Clínica Asintomático Déficit atención Asintomático Asintomático Tabla 19: Características de los pacientes con metilcrotonilglicinuria. Dos nuevos casos fueron detectados en este período al diagnosticar dos madres metilcrotonilglicinuria por las alteraciones observadas en el cribado de sus hijos. Tesis Doctoral Resultados 82 5.2.3.5 Aciduria 3-OH-3-metilglutárica Un único paciente fue diagnosticado por cribado de este error congénito del metabolismo lo que supone una frecuencia de 1/210165 recién nacidos. Presentaba elevación en sangre de 3-OH-isovalerilcarnitina (0,93 µM) y 3metilglutarilcarnitna (0,54 µM) y en orina de los ácidos 3-OH-isovalérico, 3metilglutárico, 3-OH-3metilglutárico y 3-metilglutacónico. El estudio enzimático en cultivo de fibroblastos confirmó una actividad indetectable de la 3-OH-3metilglutaril CoA Liasa y en el estudio molecular se confirmó la presencia en homocigosis de la mutación p.E37X (c.109A>T) en el gen HMGCL. Recibe tratamiento con dieta restringida en proteínas y grasas y suplementos de carnitina con buena evolución clínica. En la actualidad tiene 7 años y 5 meses y se encuentra asintomático presentando un único episodio de descompensación a los 4 años por gastroenteritis con hipoglucemia, insuficiencia renal aguda y elevación de las transaminasas que precisó ingreso en UCI pediátrica. 5.2.4 Defectos congénitos de la ß-oxidación de los ácidos grasos Como punta de partida la Tabla 20 recoge el resumen de las características de los pacientes con este tipo de trastornos que seguimos en nuestra unidad clínica. Tesis Doctoral Resultados 83 Situación actual 10 LS 1 Éxitus LS LS LS Tabla 20: Características de los pacientes con trastornos de la ß-oxidación. (s: sangre; o: orina; LS: libre de síntomas) CI/CD (rango) 87-142 95-107 100-112 103 Tmedio dx (meses) 41 69 53 39 Diálisis o depuración extrarrenal No No No No Marcadores bqcos alterados (rango medio) C8(s):3.3µM[0.84-9.4] C8/C10(s):7.79µM[1.64-13.2] C16OH(s):0.79,0.68 µM C18OH(s):1.4, 0.7µM C18-1OH(s):0.97, 0.51µM C4(s):1.57µM[1.1-2.16] Ac.etilmalónico(o):1783mmol /molcrea [367-2539] Carnitina(s):2.3µM Síntomas al dx No No No No Prevalencia 1/19106 1/105082 1/52541 1/210165 Nº casos 11 2 4 1 MCAD LCHAD SCAD Déficit transportado carnitina Tesis Doctoral Resultados 84 5.2.4.1 Déficit de acil coenzima A deshidrogenasa de cadena media (MCADD) Se identificaron mediante cribado neonatal 11 casos de este ECM lo que supone una frecuencia de 1/19106 recién nacidos; confirmándose que se trata del trastorno de la ß-oxidación más frecuente. Se sospechó este diagnóstico en aquellos pacientes en los que se objetivó en el cribado una elevación específica de acilcarnitinas C6, C8, C10, C10:1 por encima del percentil 99 de la población de estudio. Los puntos de corte fueron C8> 0.52 µM, C6>0,43µM, C10>0.50 µM, C10:1<0.33 µM, C8/C2>0.02 µM, C8/C10>1.85. La octanoilcarnitina (C8) y los cocientes C8/C2 y C8/C10 se mostraron como los mejores marcadores para el diagnóstico de este trastorno, ya que, todos los pacientes presentaron elevación de C8 (valor medio de 3,22 µmol/L), C8/C2 (valor medio 0,32 µmol/L) y sólo uno no presentó elevación del cociente C8/C10 (valor medio de 7, 79 µmol/L) (Tabla 21). Paciente Nº1 Nº2 Nº3 Nº4 Nº5 Nº6 Nº7 Nº8 Nº9 Nº10 Nº11 Media±DS Edad dx(días) 6 4 7 6 10 23 6 4 4 4 5 7.18±5.28 C6 0.44 0.28 0.34 0.25 0.65 0.63 0.46 1.67 0.93 1.24 0.90 0.70±0.42 C8 1.72 1.31 1.23 0.84 3.06 5.82 1.9 9.4 4.57 5.19 1.26 3.22±2.55 C10:1 0.61 0.27 0.20 0.33 0.66 0.47 0.22 0.97 0.55 0.56 0.39 0.47±0.21 C8/C2 0.22 0.12 0.11 0.06 0.34 0.67 0.08 0.74 0.55 0.6 0.12 0.32±0.25 C6/C2 0.06 0.03 0.03 0.01 0.07 0.05 0.02 0.13 0.11 0.14 0.1 0.06±0.04 C8/C10 7.53 6.62 7.33 1.64 7.94 10.3 11 13.2 11.4 6.38 2.45 7.79±3.42 Tabla 21: Valores de acilcarnitinas en MS/MS en pacientes con MCADD Entre las características que presentan los pacientes cabe destacar que ocho de ellos eran caucásicos y tres de etnia gitana; todos ellos además eran recién nacidos a término con peso normal al nacimiento y se encontraban asintomáticos a su detección. La mutación más frecuentemente encontrada fue p.K329E (c.985A>G) en el gen ACADM que se encontró en homocigosis en siete pacientes y en heterocigosis en otros tres; uno de los pacientes no presentó esta mutación. Se Tesis Doctoral Resultados 85 encontraron 2 nuevas mutaciones p.D181G (c.542A>G) y p.W82S (c.245G>C). Los genotipos de nuestros pacientes se recogen en la Tabla 22. Después del diagnóstico todos los pacientes recibieron tratamiento dietético; cinco de ellos precisaron además tratamiento con suplementos de Lcarnitina por presentar niveles en plasma de carnitina por debajo de 12 µM. Evolutivamente con un tiempo medio de seguimiento de 41 meses todos mostraron un desarrollo físico y neurológico normal y se mantuvieron asintomáticos. El paciente 6 murió a los 2 años de edad en otro hospital en relación con una infección respiratoria severa. Este paciente era homocigoto para la mutación más frecuente y al diagnóstico presentaba valores muy elevados de C8 y de los cocientes C8/C2 y C8/C10. Los otros pacientes no presentaron episodios de descompensación. Todos los pacientes presentan cocientes de desarrollo normales; de hecho dos de ellos heterocigotos para la mutación más frecuente presentaron cocientes de desarrollo elevados (pacientes nº1 y 4). Tesis Doctoral Resultados 86 Paciente E. Molec. Cambio Nucleó. CD/CI Estado actual Nº1 p.K329E p.W82S c.985A>G c.245G>C 142 LS Nº2 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 104 LS Nº3 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 98 LS Nº4 p.K329E p.Y67H c.985A>G c.199T>C 128 LS Nº5 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 87 LS Nº6 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G No Éxitus Nº7 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 105 LS Nº8 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 90 LS Nº9 p.K329E p.K329E c.985A>G c.985A>G 88 LS Nº10 p.G267R p.D181G c.799G>A c.542A>G 92 LS Nº11 p.K329E p.I416T c.985A>G c.1247T>C 100 LS Tabla 22: Estudio genético y seguimiento de los pacientes con MCADD 5.2.4.2 Déficit de 3-hidroxiacil coenzima A deshidrogenasa de cadena larga (LCHADD) En nuestra unidad se realiza seguimiento de 2 pacientes con esta entidad cuya detección fue realizada a través del cribado neonatal; esto supone una frecuencia de 1/105082. En ambos casos se objetivó en el cribado elevación de C16OH (0.79; 0.68 µM); C18-1OH (0.97; 0.51 µM); C18OH (1.4; 0.7 µM). Ambos pacientes se encontraban asintomáticos en el momento del diagnóstico. Se confirmó el diagnóstico mediante estudio molecular siendo ambos homocigotos para la misma mutación: p.Q510E en el gen EOAG. Evolutivamente con un tiempo medio de seguimiento de 69 meses los dos se encuentran asintomáticos, aunque ambos precisaron hospitalizaciones por episodios de rabdomiolisis. Reciben tratamiento con restricción de triglicéridos de cadena larga al 10% de la energía total, suplementación con triglicéridos de cadena media (MCT) al 10-20 % de la energía total, aporte de ácidos grasos Tesis Doctoral Resultados 87 esenciales linoleico y linolénico del 3-4% y 0,5-1%, respectivamente, del total calórico. Suplementos con riboflavina, coenzima Q10 y ácido docosahexaenoico. 5.2.4.3 Déficit de acil coenzima A deshidrogenasa de cadena corta (SCADD) En la unidad se realiza seguimiento de cuatro pacientes diagnosticados de SCADD a través del cribado neonatal en el período de estudio. En el cribado neonatal se observó que presentaban elevación en sangre de butirilcarnitina (C4) (media 1.57 µM, rango 1.1-2.16) y en orina de ác. etilmalónico (media 1783 mmol/mol creatinina, rango de 367-2539). En todos ellos se realizó estudio molecular y todos son heterocigotos para distintas mutaciones en el gen ACADS. El paciente 1 con las mutaciones p.R171W (c.511C>T) y c.47-36X>G en el exón 1, no descrita previamente en la base de datos Human Genetic Mutation Database. El paciente 2 p.L88R (c.263T>G); p.Q311X (c.931C>T) y el polimorfismo p.625G>A; el paciente 3 p.M1T (c.2T>C) y p.R383C (c.1147 C>T) y el paciente 4 p.R22W (c.136C>T) y p.R306H (c.989G>A). Evolutivamente tras un tiempo medio de seguimiento de 53 meses con tratamiento con dieta moderadamente restringida en grasas y suplementos de riboflavina todos ellos han presentado un adecuado desarrollo psicomotor y se encuentran asintomáticos en el momento actual. 5.2.4.4 Déficit del transportador de carnitina En nuestra unidad se realizó este diagnóstico a través del cribado neonatal en un paciente lo que supone en una frecuencia de 1/210165 recién nacidos. La alteración que se objetivó en el cribado fueron unos niveles séricos anormalmente bajos de carnitina libre (C0) (2.3 µM). Recibe tratamiento con suplementos con carnitina realizándose controles periódicos de ésta y con un tiempo de seguimiento de 5 años y 10 meses se encuentra asintomático. Tesis Doctoral Resultados 88 5.2.5 Defectos del metabolismo de los hidratos de carbono Se diagnosticaron de galactosemia en nuestro centro a través del cribado neonatal en el período de estudio un total de once pacientes lo que supone una frecuencia de 1/19105 recién nacidos; de estos cinco presentaron galactosemia clásica (1/42033), cuatro presentaron galactosemia por déficit de GALK (1/52541) y los otros dos galactosemia por déficit de GALE (1/105082) 5.2.5.1 Galactosemia clásica Estos pacientes presentaron en el cribado elevación de galactosa 1P en sangre con un valor medio de 2.36 mM y rango 0.95-4 (punto de corte <0.5 mmol/L) con galactosa en orina normal. En el momento del diagnóstico cuatro de ellos se encontraban asintomáticos y el quinto presentaba una opacidad ocular incipiente que remitió tras tratamiento de base con la exclusión de la lactosa de la dieta. En todos ellos se confirmó el diagnóstico midiendo la actividad enzimática de la galactosa 1 fosfato uridiltransferasa que en cuatro pacientes fue prácticamente indetectable y en el quinto muy deficiente. En tres se realizó estudio molecular; dos de los pacientes son homocigotos para p.R148Q y el otro, que es el que presenta actividad enzimática residual, es heterocigoto para la mutación p.Q188R/alelo Duarte 2. En los otros dos está pendiente de realizar el estudio genético. Con un tiempo medio de seguimiento de 34 meses los pacientes no presentan lesiones hepáticas, renales ni opacidad del cristalino. Todos ellos presentan un desarrollo neurológico normal pero dos de ellos presentan peso en el percentil 10. 5.2.5.2 Galactosemia por déficit de galactokinasa En el cribado de estos pacientes se puso de manifiesto un aumento de galactosa en orina pero con galactosa 1P en sangre normal. En el momento de su detección tres estaban asintomáticos pero uno con distocia social y detección Tesis Doctoral Resultados 89 tardía (a los 2 meses) presentaba ya catarata bilateral, que no remitió con dieta y precisó intervención. El estudio enzimático puso de manifiesto una actividad deficiente de la galactokinasa en todos ellos. Reciben tratamiento con dieta sin lactosa y con un tiempo medio de seguimiento de 48 meses todos presentan un cociente de desarrollo normal y se encuentran asintomáticos. 5.2.5.3 Galactosemia por déficit de epimerasa Los dos pacientes con este diagnóstico presentaron en el cribado elevación moderada de la galactosa 1P en sangre (media 1.39 mM) y de galactosa en orina. Ambos se encontraban asintomáticos en el momento del diagnóstico. El estudio enzimático puso de manifiesto una actividad deficiente de la UDP-galactosa 4epimerasa. Con un tiempo medio de seguimiento de 67 meses y una dieta libre pero sin abuso de lácteos ambos se mantienen asintomáticos. 5.2.6 Trastornos congénitos del metabolismo del glutatión Controlamos un paciente diagnosticado de aciduria piroglutámica, lo que supone una frecuencia de 1 /210165 recién nacidos. A las 16 horas de vida ingresó en la Unidad Neonatal por anemia con ictericia generalizada (sin incompatibilidad Rh ni de grupo) y acidosis metabólica con elevación del anión GAP; presentaba además en la ecografía cerebral múltiples septos en los ventrículos laterales con calcificaciones lineales en el tálamo. El diagnóstico se orientó a la aciduria piroglutámica al objetivarse en el cribado neonatal niveles elevados en sangre de glutamato (1703 µM) y de ácido piroglutámico (300µM) y niveles elevados en orina de oxiprolina. El estudio de la actividad enzimática de la glutatión sintetasa presentaba en este paciente una actividad del 9% con respecto al control y presentó en homocigosis la mutación p.G374A en el exón 5 del gen de la glutatión sintetasa que se encuentra localizado en el cromosoma 20q11.2. Tesis Doctoral Discusión 97 6. DISCUSIÓN 6.1 FRECUENCIA/PREVALENCIA DE LOS ECM DETECTADOS A TRAVÉS DEL CRIBADO NEONATAL En la comunidad de Galicia la frecuencia de Errores Congénitos del Metabolismo detectados a través de nuestro programa de cribado ampliado es de 1/1534 recién nacidos y de 1/2060 recién nacidos si excluimos las hiperfenilalaninemias benignas. El programa incluye los trastornos recomendados para cribado por la American College of Medical Genetics37, además de la cistinuria. La frecuencia con respecto a los trastornos más frecuentemente detectados en los programas de cribado (aminoacidopatías excepto hiperfenilalaninemias benignas, defectos de la β-oxidación de los ácidos grasos, acidurias orgánicas y defectos del ciclo de la urea) es de 1/2960 recién nacidos, frecuencia que es similar a la reportada en Portugal38 (1/2396), Alemania39 (1/2712) y Austria40 (1/2855) y es algo mayor que la encontrada en otros lugares como Carolina del Norte18 (1/4300) o en otros países del entorno europeo26 tales como Francia, Suiza o Irlanda. Además, la frecuencia global de 1/2060 recién nacidos es más alta que en otras poblaciones; ello es probablemente debido a la realización de análisis de orina de forma rutinaria41 en el programa de cribado, que permiten detectar entidades que no se expresan en las muestras de sangre como la cistinuria, la galactosemia por déficit de galactokinasa, la aciduria mevalónica y la alcaptonuria. De éstas, la cistinuria y la galactosemia se buscan de forma rutinaria en el cribado mientras que la alcaptonuria y la aciduria mevalónica se pueden detectar en el proceso de exclusión de otras entidades. La recogida rutinaria de la muestra de orina puede también facilitar la detección de otros ECM (con mínimos costes y escaso equipamiento) como sucede en los defectos del ciclo de la urea, acidurias orgánicas, galactosemia por déficit de epimerasa y aciduria piroglutámica. Los ECM detectados en nuestra población con mayor frecuencia son las hiperfenilalaninemias, MCADD y las galactosemias. Tesis Doctoral Discusión 98 En las hiperfenilalaninemias distinguimos dos grandes grupos: las hiperfenilalaninemias benignas con una frecuencia de 1/6005 y las PKU con una frecuencia de 1/12363. La incidencia global de la PKU recogida en la literatura es de aproximadamente 1/10000 recién nacidos42 aunque puede variar de 1/4000 a 1/100000 recién nacidos dependiendo de las regiones geográficas43; así por ejemplo en zonas como Túnez presenta una elevada frecuencia con 1/7631 recién nacidos44 y en otros lugares como Zheijang (China) la frecuencia es mucho menor con 1/25001 recién nacidos45. La segunda alteración más frecuentemente detectada es la MCADD, con una frecuencia de 1/19106 recién nacidos, lo cual era esperable ya que, desde la implantación del cribado ampliado el número de casos detectados se ha elevado considerablemente en los países donde se lleva a cabo dicho cribado39,40. Si comparamos esta frecuencia con lo recogido en la literatura de la detección por cribado de esta entidad, esta tasa es mayor que la recogida por Kasper40 y cols de 1/24900 recién nacidos pero menor que la recogida por otros autores como Vilarinho38 o Harms39 que refieren una frecuencia de 1/10000 recién nacidos. Desde 1979 nuestro programa de cribado incluye de forma sistemática la determinación de alteraciones del metabolismo de carbohidratos mediante una prueba de dos etapas, en la cual las muestras de orina que han sido positivas para azúcares reductores son examinadas mediante cromatografia de capa fina41 y desde 2002 se emplea rutinariamente MS/MS para la determinación en sangre de hexosas monofosfato46. La determinación de galactosa total (galactosa libre, galactosa 1P y UDP-galactosa) en muestras de sangre impregnada en papel es cara e innecesaria para la detección de galactosemias si la muestra de orina es recogida de forma sistemática. La proporción de recién nacidos detectados con galactosemia en nuestra comunidad es de 1/19106, esta frecuencia es elevada en comparación con la estimada para esta patología a nivel mundial que es de 1/50000 recién nacidos de raza caucásica. Debe tenerse en cuenta, que esta frecuencia puede estar subestimada al realizar diagnóstico tardío porque el cribado neonatal de galactosemia no se practica de modo universal y por la gran variabilidad en la expresión clínica de esta patología47. Tesis Doctoral Discusión 99 Dentro del grupo de las aminoacidopatías, debe destacarse así mismo la relativa elevada incidencia del déficit de MAT I/III (1/26271), detectado en el diagnóstico diferencial de homocistinuria, y de enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce. Esta última patología presenta en nuestro medio una frecuencia de 1/52541 recién nacidos, que es muy superior a la frecuencia mundial recogida de 1/85000 recién nacidos, aunque existen grupos étnicos con mayor incidencia48,49. Con frecuencias mucho menores fueron detectados dos casos de tirosinemia tipo I (1/105082) y uno de homocistinuria clásica (1/210165). La frecuencia de tirosinemia es similar a la recogida en la literatura de 1/100000 recién nacidos50 y también la de homocistinuria clásica basada en el cribado neonatal, ya que está recogida una frecuencia de 1/200000-300000 recién nacidos con variaciones entre los distintos países, así es más frecuente en lugares como Irlanda y Nueva Gales del Sur (Australia) donde es de 1/65000 recién nacidos y mucho menos frecuente en otros como Japón donde se estima una frecuencia de 1/900000 recién nacidos51. La aciduria glutárica tipo I es la aciduria orgánica más frecuentemente detectada en nuestro medio, con una incidencia de 1/30023 recién nacidos (1/35027 recién nacidos a través del cribado) lo que representa una frecuencia mucho mayor de la recogida en la literatura, sean detectadas o no a través del cribado 18,38,52. El caso del paciente falso negativo con aciduria glutárica tipo I bajo excretor en el cribado en el 2003 (glutarilcarnitina en sangre en rango normal y ácido glutárico en orina < 100mmol/mol de creatinina) llevó a utilizar la glutarilcarnitina en orina como marcador desde entonces. No se confirma en nuestro medio lo recogido en la literatura de que la metilcrotonilglicinuria sea la aciduria orgánica más frecuente53, aunque si presenta una frecuencia significativa afectando a 1/52541 recién nacidos. Detectamos en esta década tres pacientes con defectos del ciclo de la urea (una citrulinemia, una aciduria arginino-succínica y una deficiencia de arginasa) lo que supone una frecuencia global de 1/70055. Este hallazgo indica que se detectaron las 3 patologías del ciclo de la urea que es posible detectar al presentar Tesis Doctoral Discusión 100 citrulina elevada a través del cribado. Sólo hallamos descritos previamente 6 casos de deficiencia de arginasa mediante cribado por MS/MS 38,54, el nuestro sería el séptimo caso. Se detectaron asimismo 7 casos de déficit de biotinidasa; uno con deficiencia total (1/210165) y seis con deficiencia parcial (1/35027), lo que representa una incidencia combinada de 1/28563 recién nacidos. Ello supone más de dos veces la frecuencia combinada reflejada a nivel mundial por Wolf55 que es de 1/60089 recién nacidos, sin embargo, si desglosamos los pacientes en aquellos que presentan una deficiencia total y los que presentan una deficiencia parcial se observan diferencias ya que en nuestro medio la deficiencia total presenta una frecuencia menor que la reflejada en este estudio de 1/112271 pero la de la deficiencia parcial es mucho mayor que la recogida de 1/129281 recién nacidos. La incidencia combinada observada en nuestro estudio es sin embargo similar a la observada en otros lugares como Hungría Occidental56 donde se detecta deficiencia de biotinidasa en 1/20000 recién nacidos. El cribado ampliado nos ha permitido por tanto conocer la prevalencia de las principales enfermedades congénitas del metabolismo intermediario en nuestra comunidad. Tesis Doctoral Discusión 101 6.2 SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DEL CRIBADO La calidad y fiabilidad de nuestro programa de cribado neonatal se confirma con los elevados valores que presenta de sensibilidad (97,16%), especificidad (99,98%) y valor predictivo (76,11%). Debemos puntualizar que este valor predictivo, es considerablemente más elevado que el recogido en otros estudios, como el de Schulze57 (58%), el de Vilarinho38 (38%), el de Juan-Fita58 (20,25%) o el de Huang59 (2,10%); esto puede ser debido a que en nuestro centro se solicitan a menudo segundas muestras a los recién nacidos antes de remitirlos a la unidad clínica, lo que reduce el número de falsos positivos. También contribuye a este elevado valor predictivo el hecho de recoger de forma rutinaria la muestra de orina que permite completar la información obtenida en aquellos pacientes que presentan anormalidades bioquímicas antes de remitirlos a la unidad clínica60 (lo que reduce la tasa de falsos negativos y aumenta la certeza de los casos de alta sospecha diagnóstica). Por otra parte, al igual que otros centros, cumplimos el protocolo de analizar de forma rutinaria una segunda muestra en aquellos niños que son prematuros o que reciben transfusiones o nutrición parenteral de forma prolongada61,62. La búsqueda de una mayor calidad del programa quedó reflejada entre otros aspectos en la disminución de resultados falsamente positivos por la elevación de citrulina, que se encontró elevada inicialmente en 13 pacientes sin que luego se confirmara dicha alteración, pero disminuyó considerablemente el envío a consulta de estos pacientes al incluir en los análisis de confirmación inicial de cribado la determinación de ácido orótico y ácido arginino-succínico63. También permitió mejorar el valor predictivo de nuestro programa de cribado la inclusión de glutarilcarnitina en orina64,65 gracias a lo cual es posible evitar que la gran mayoría de los pacientes con aciduria glutárica tipo I bajo excretores queden sin diagnóstico, como nos ocurrió en 2003 con un paciente, y Tesis Doctoral Discusión 102 la determinación de succinilacetona en orina que facilita el diagnóstico de la tirosinemia66 ya que la tirosina elevada es un marcador poco fiable en el período neonatal por la elevada incidencia de tirosinemia neonatal transitoria (0,2-10%), además pueden presentar en ocasiones valores en el límite superior de la normalidad. En dos casos con elevación transitoria del marcador bioquímico C5OH en el cribado neonatal, que llevaron al diagnóstico en sus madres de metilcrotonilglicinuria; casos similares también fueron presentados por otros autores como Vilarinho38 y Frazier18. Es por este motivo recomendable que se realice estudio de ácidos orgánicos y acilcarnitinas en las madres de estos niños. En resumen, el hecho de realizar de forma rutinaria una muestra de orina conjuntamente con la de sangre permite ampliar de forma fácil y sencilla la información obtenida a través del cribado, mejorar la fiabilidad del mismo y así aumentar su valor predictivo positivo. Nuestro programa de cribado ampliado presenta una elevada especificidad (99.98%); al igual que la observada en los programas recogidos en los estudios de Schulze57 (99,95%), Juan-Fita58 (99,9%) o Huang59 (99,72%), es decir, en este sentido no existen diferencias significativas como sucedía con el valor predictivo. En la década recogida de nuestro programa de cribado se detectaron cuatro pacientes con resultados falsos negativos (0,001% de los pacientes cribados) entre los que se incluyen una tirosinemia tipo I que se diagnóstico al mes de vida por presentar un fallo hepático agudo, una aciduria glutárica tipo I en un paciente bajo excretor que debutó con un cuadro de encefalopatía severa y en el que se comprobó posteriormente que la determinación de glutarilcarnitina en orina al cribado estaba elevada, una deficiencia múltiple de acil-CoA deshidrogenasa que debutó a los 13 días de vida con un cuadro de miocardiopatía y acidosis metabólica severa cuyo diagnóstico se confirmó por medición de la flavoproteína transportadora de electrones en fibroblastos y un último caso de una paciente con hiperfenilalaninemia benigna que presentara en el cribado un valor de fenilalanina de 1,9 mg/dl y cociente de Phe/Tyr de 1,5 cuyo diagnóstico se hizo Tesis Doctoral Discusión 103 al diagnosticarse su hermana en el cribado. Debemos considerar que con las modificaciones introducidas en el programa de cribado al añadir la determinación en la muestra de orina de succinilacetona y glutarilcarnitina los pacientes con tirosinemia tipo I y aciduria glutárica tipo I ya no hubieran pasado desapercibidos en el momento actual, con lo que los falsos negativos se reducirían a dos casos (0,0005% de los pacientes cribados). Tesis Doctoral Discusión 105 6.3 SINTOMATOLOGÍA AL DIAGNÓSTICO E IMPACTO EN LA UNIDAD NEONATAL El principal objetivo del cribado neonatal sistemático es la detección de los pacientes afectos cuando todavía se encuentran asintomáticos, permitiendo así un diagnóstico y un tratamiento precoz que sin ninguna duda va a mejorar la evolución y pronóstico a largo plazo de estos pacientes. Así, muchos de los pacientes con patologías detectadas a través del cribado neonatal se benefician de forma clara de iniciar un tratamiento dietético y/o farmacológico de forma inmediata67,68,69,70, y nuestros pacientes no fueron una excepción a este hecho. Este es el caso de fenilcetonuria, tirosinemia tipo 1, aciduria glutárica tipo 1, homocistinuria, trastornos ß-oxidación de los ácidos grasos (MCAD, LCHAD), galactosemias y déficit total de biotinidasa. En otras entidades puede parecer más controvertido la utilidad de un cribado precoz, que aunque no se busquen directamente entran en el diagnóstico diferencial de determinadas patologías, por ejemplo en la metilcrotonilglicinuria, déficit de MAT I/III, SCADD o la deficiencia parcial de biotinidasa dado que además en todas ellas la presentación clínica es muy variable habiendo incluso individuos que se encuentran asintomáticos71,72,73. En nuestro estudio, un paciente con déficit parcial de biotinidasa presentó convulsiones mioclónicas que cedieron tras la administración de biotina, desde entonces todos nuestros pacientes, al igual que recomiendan otros autores, reciben 5 mg de biotina a la semana74. Se plantean más dudas con respecto al tratamiento en el déficit de MAT I/III, el SCADD o la metilcrotonilglicinuria, que son usualmente condiciones benignas en las que como se refleja anteriormente los pacientes pueden encontrarse asintomáticos. Sin embargo, debe valorarse que niveles altos de metionina (>1000µM) pueden inhibir el transporte de otros aminoácidos neutros en el cerebro y causar efectos neurotóxicos75. Además, Ficicioglu y cols documentaron un paciente diagnosticado de metilcrotonilgicinuria por screening neonatal que sufrió descompensación metabólica aguda al abandonar su tratamiento de base76, y por otra parte también conocemos que la prevención de hipoglucemia Tesis Doctoral Discusión 112 Dentro de las alteraciones del metabolismo de los ácidos grasos los pacientes con MCADD y SCADD suelen presentar buen pronóstico e incluso algunos de ellos se mantendrían asintomáticos sin tratamiento, pero, dado que el ajuste dietético en éstos pacientes cuando se detectan por cribado y están asintomáticos es relativamente sencillo y permite en la mayoría de las ocasiones que no surjan descompensaciones con repercusión clínica100,101se recomienda que se mantengan incluidos en los programas de cribado. En nuestro estudio, como era de esperar según lo recogido anteriormente, todos los pacientes con MCADD y SCADD se encuentran asintomáticos con un tiempo medio de seguimiento elevado (41 meses) y presentan cocientes de desarrollo en rango normal con excepción del paciente que fue éxitus en relación con una infección respiratoria grave ya mencionado. Esta buena evolución clínica no se observó sin embargo en los 2 pacientes diagnosticados de LCHADD que presentaron varias descompensaciones metabólicas en los primeros años con rabdomiolisis y afectación hepática que requirieron ingreso, todas ellas en relación con procesos infecciosos y/o actividad física, pero ninguno de ellos presentó miocardiopatía ni otras alteraciones clínicas graves. En la literatura hasta el 50% de los pacientes diagnosticados de LCHADD por cribado presentan sintomatología clínica a su detección y son muy frecuentes los episodios de rabdomiolisis102. Esto refuerza la importancia de realizar un diagnóstico precoz de estos defectos a través del cribado neonatal; aunque implique detectar también formas moderadas de la enfermedad103. Nuestros pacientes con trastornos congénitos del metabolismo de los hidratos de carbono, concretamente con galactosemia clásica, detectados a través del cribado presentan en el momento actual evolución favorable encontrándose libres de alteraciones neurológicas, hepáticas y renales. No obstante, sin embargo debemos vigilar la aparición de alteraciones tardías tales como alteraciones del habla, alteraciones motoras, disfunción ovárica, osteoporosis o retraso del Tesis Doctoral Discusión 113 crecimiento y del desarrollo cognitivo que pueden verse en éstos pacientes a pesar de recibir tratamiento dietético correcto desde el período neonatal104,105. El tratamiento precoz permitió igualmente que tres de los cuatro pacientes con galactosemia por defecto de la galactokinasa no presentaran cataratas; el cuarto ya las presentaba en el momento de su detección al realizarse ésta en la quinta semana de vida por distocia social, precisando finalmente tratamiento quirúrgico. En nuestro programa de cribado se incluye también la deficiencia de biotinidasa ya que se trata de una patología fácilmente detectable y que con un tratamiento sencillo como es la administración diaria de biotina oral previene un daño neurológico irreversible106,107. Todos nuestros pacientes presentan una evolución satisfactoria con tratamiento, excepto como se mencionó anteriormente, uno de nuestros pacientes con un déficit parcial que presentó crisis mioclónicas que cedieron cuando se administró biotina por lo que al igual que otros autores recomendamos el tratamiento en todos los pacientes, tanto en el déficit total como parcial108. Todos nuestros pacientes presentan una evolución satisfactoria con este tratamiento. Buena evolución clínica presentaron también, como era de esperar, los pacientes con déficit de MAT I/III por tratarse de una entidad benigna75. En relación con esta patología cabe resaltar que todos ellos presentan la mutación de fenotipo dominante p.R264H que además es la misma que presentaron los pacientes del estudio realizado en nuestro país vecino Portugal38. La evolución no fue tan favorable en otros pacientes con formas de presentación neonatal grave como en algunas acidurias orgánicas clásicas; tres de los cuales como ya se mencionó fallecieron; uno con aciduria metilmalónica y dos con aciduria propiónica. De los pacientes con aciduria metilmalónica que sobreviven uno presenta una epilpepsia parcial y los otros se encuentran asintomáticos. También encontramos manifestaciones clínicas severas en la paciente con aciduria piroglutámica, que presenta un CI de 68, aunque los episodios de crisis hemolíticas han disminuido con la edad. En la literatura no Tesis Doctoral Discusión 114 hay ningún caso publicado al respecto al no ser habitual la recogida de orina en las muestras de cribado. Con respecto a los pacientes con aciduria glutárica tipo I es reseñable la gran diferencia evolutiva entre los pacientes diagnosticados a través del cribado (5) y los diagnosticados tardíamente tras crisis encefalopática y que acudieron a nuestra unidad clínica en ese período, cuyo nacimiento fue previo a que se instaurara el cribado (3); ya que éstos últimos han presentado una evolución tórpida presentando 2 de ellos tetraparesia espástica en el momento actual frente a los asintomáticos por cribado. Estos hallazgos refuerzan lo descrito en la literatura de que en los pacientes con aciduria glutárica tipo I diagnosticados en el período neonatal la lesión del estriado que se encuentra como correlato neuropatológico puede prevenirse con el adecuado tratamiento metabólico; y que sin embargo, iniciar el tratamiento después de la aparición de los síntomas clínicos generalmente no previene la aparición de daño permanente109,110,111. El paciente con aciduria mevalónica presenta manifestaciones clínicas relevantes tales como: fallo de medro, retraso psicomotor, episodios febriles recurrentes y catarata que precisó ser intervenida. Tras el diagnóstico inició tratamiento con corticoides y antioxidantes (vitamina C, E y coenzima Q10) y ocasionalmente transfusión de concentrado de hematíes, a pesar de lo cual, persistieron episodios febriles por lo que se decidió iniciar tratamiento anakinra112,113 (antagonista del receptor de la interleukina-I) alcanzando una dosis máxima de 8 mg/kg/día al que inicialmente presenta buena respuesta, aunque después de un año ésta disminuye y reaparecen las crisis febriles cada vez más continuadas (2-3 episodios al mes, con una duración media cada uno de cinco días). Tras posterior tratamiento con etanercept (inhibidor TNF-α) y de nuevo falta de respuesta, en el momento actual acaba de realizarse, en consenso con la familia, un transplante de progenitores hematopoyéticos, del que hay descritos muy pocos casos en la literatura con este tratamiento pero con buena respuesta, al volver a la normalidad los marcadores de inflamación postransplante y desaparecer las crisis114,115. Tesis Doctoral Discusión 115 Finalmente mencionar la evolución de los pacientes con defectos del ciclo de la urea. Se trata de tres pacientes; uno de ellos con citrulinemia tipo I presentó un cuadro encefalopático con hiperamoniemia que precisó tratamiento de depuración urgente83 y en el momento actual su situación clínica es bastante buena a pesar de precisar nutrición por sonda de gastrostomía y presentar un leve retraso del lenguaje. Los otros dos pacientes con aciduria arginino-succínica y déficit de arginasa se encontraban asintomáticos en el momento del diagnóstico y han presentado una evolución favorable con su tratamiento de base presentando ambos un cociente de desarrollo normal (86 y 98 respectivamente) y encontrándose en el momento actual asintomáticos. Tesis Doctoral Conclusiones 117 7. CONCLUSIONES Tesis Doctoral Conclusiones 119 7. CONCLUSIONES 1. El cribado neonatal ampliado incluyendo la aplicación de la técnica por MS/MS ha supuesto una auténtica revolución en el estudio de las Enfermedades Congénitas del Metabolismo permitiendo realizar el diagnóstico de múltiples enfermedades con un único análisis y demostrando ser eficaz, eficiente y efectivo. Nuestro programa de Cribado presenta con una década de seguimiento una sensibilidad del 97,16 %, una especificidad 99,98 % y un valor predictivo positivo de 76,11 %. 2. Nuestra Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Congénitas del Metabolismo ha sido pionera en España en la aplicación de esta tecnología a la práctica clínica y en la actualidad el cribado se realiza de forma sistemática en nuestra comunidad al 99,9 % de la población. 3. La aplicación del cribado neonatal ampliado permite la detección precoz de Enfermedades Congénitas del Metabolismo Intermediario, y por tanto una intervención terapéutica precoz de estas entidades. Ello ha representado en nuestros pacientes una evolución significativamente más favorable tanto en términos de morbilidad como de mortalidad, ya que con una década de seguimiento el 95,5% de estos pacientes se encuentren asintomáticos; el 98,6% presenta un CI ≥ 85% y la mortalidad fue del 2,9%. 4. La recogida sistemática de una muestra de orina conjuntamente con la de sangre permite complementar la información obtenida en el cribado y facilita la realización de pruebas de segundo nivel que disminuyen de manera significativa los resultados falsos negativos y la necesidad de segundas muestras. Esto se ha puesto de manifiesto en nuestro estudio al permitir realizar pruebas más específicas en entidades como la tirosinemia, la homocistinuria o la aciduria glutárica; además permitió la detección de aciduria mevalónica, alcaptonuria, cistinuria y galactosemia por déficit de galactokinasa, al aportar biomarcadores para estas entidades no disponibles a nivel sanguíneo. Tesis Doctoral Conclusiones 120 5. El cribado neonatal ampliado nos ha permitido conocer la prevalencia real de los ECM en nuestro medio, así como mejorar nuestro conocimiento acerca de la historia natural de estos trastornos. La frecuencia de ECM detectados a través del cribado es de 1/1534 recién nacidos en nuestra Comunidad. Los más frecuentemente detectados fueron las hiperfenilalaninemias con una frecuencia de 1/4041 recién nacidos (1/6005 en las HPA y 1/12363 para la PKU), los trastornos de la ßoxidación de los ácidos grasos de cadena media, las cistinurias y las galactosemias con una frecuencia cada uno de ellos de 1/19106 recién nacidos. 6. Los pacientes diagnosticados de Enfermedades Congénitas del Metabolismo son pacientes complejos que en las formas clásicas precisan con cierta frecuencia ingreso en las unidades neonatales y cuidados específicos como la aplicación de terapias de depuración extrarrenal y/o soporte ventilatorio; de todos modos, debe tenerse en cuenta que con la detección precoz aumenta el número de pacientes que puede ser tratados ambulatoriamente. En la década analizada en este trabajo ingresaron en nuestra unidad neonatal 38 pacientes de los detectados a través del cribado, de los cuales 22 precisaron cuidados intensivos (de éstos 5 precisaron medidas de depuración extrarrenal y 8 precisaron soporte ventilatorio). 7. La aplicación del cribado neonatal ampliado nos ha permitido también detectar ECM en las madres a través de los resultados encontrados en los hijos. Esto se ha puesto de manifiesto en nuestro estudio al diagnosticar dos madres con metilcrotonilglicinuria tras presentar sus hijos una alteración transitoria en el cribado. Tesis Doctoral Trabajos publicados 121 8. TRABAJOS PUBLICADOS Tesis Doctoral Trabajos publicados 128 Tesis Doctoral Trabajos publicados 129 Tesis Doctoral Trabajos publicados 130 Tesis Doctoral Trabajos publicados 131 Tesis Doctoral Trabajos publicados 132 Tesis Doctoral Trabajos publicados 133 Tesis Doctoral Trabajos publicados 135 Tesis Doctoral Trabajos publicados 136 Tesis Doctoral Trabajos publicados 137