Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares

Tesis doctoral TESIS Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con cáncer a nivel mundial y usualmente es diagnosticado en estadios avanzados cuando ya no es posible abordarlo de manera quirúrgica. El subtipo histológico más frecuente es el carcinoma de célula no pequeña, el cual es un tumor con potenciales dianas terapéuticas moleculares y subsidiario a inmunoterapia. Esta tesis se centra en la caracterización clínica y molecular de un grupo de pacientes con este tipo de tumores, explorando además posibles asociaciones de la expresión de PD-L1 con las alteraciones moleculares conductoras. 2022 Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares Santiago de Compostela, 2022 Programa de doctorado en Medicina Molecular Silvia Margarita García Acuña Silvia Margarita García Acuña ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC TESIS DE DOCTORADO EXPRESIÓN DE PD-L1 EN CARCINOMA DE CÉLULA NO PEQUEÑA DE PULMÓN Y SU RELACIÓN CON OTRAS DIANAS TERAPÉUTICAS MOLECULARES Silvia Margarita García Acuña ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Silvia Margarita García Acuña Título de la tesis: Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares. Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 23 de mayo de 2022 Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D./Dña. Ihab Abdulkader Nallib En condición de: Director/a Título de la tesis: Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares. INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dña Silvia Margarita García Acuña, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 23 de mayo de 2022 Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D./Dña. Máximo Francisco Fraga Rodríguez En condición de: Tutor/a y director/a Título de la tesis: Expresión de PD-L1 en carcinoma de célula no pequeña de pulmón y su relación con otras dianas terapéuticas moleculares. INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dña Silvia Margarita García Acuña, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 23 de mayo de 2022 Firma electrónica 14 Durante el transcurso de este proyecto, tuve la incondicional ayuda de un amigo que ha estado a mi lado desde aquel Febrero del año 2000 en el que tuve la suerte de coincidir con él. Muchas gracias Andrés, los números siempre han sido un universo paralelo que tú dominas y sin tu paciencia desde bioestadística, pasando por epidemiología hasta el estudio de esta tesis, siempre tuve la fortuna de contar contigo a pesar de esos 7.667 kilómetros de distancia. Agradezco también a todos mis amigos en Galicia, Bogotá, Bucaramanga y en cualquier rincón del mundo en el que se encuentren ahora, porque siempre sentí su apoyo en todo momento. A mi papá, por preguntarme cada semana por la evolución de este proyecto y por enseñarme la alegría, la constancia y la responsabilidad del trabajo digno; a mi mamá, por su fortaleza espiritual, por animarme con sus palabras, por estar siempre conmigo y permitirme volar hasta aquí. A mis hermanas y sus familias por el amor desde la distancia. A Patricia por ser una segunda madre y a su maravillosa familia por permitirme ser parte de ella. Finalmente, dedico este trabajo a las dos personas más importantes de mi vida. Javier, no pude encontrar mejor compañero de vida; tu apoyo constante y sereno así como tu tranquilidad me han equilibrado y complementado siempre de tal manera que mis éxitos también son tuyos. Pablo, eres la luz de mi vida, mi mayor tesoro. Perdóname por las horas que te robé; espero que algún día leas esto, te sientas orgulloso de mi y haya logrado ser el mejor ejemplo para ti, académico, personal y profesional. Te amo. 15 RESUMEN Introducción: El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con cáncer a nivel mundial, con una estimación de 1.7 millones de muertes cada año y usualmente diagnosticado cuando los pacientes tienen la enfermedad localmente avanzada o metastásica. Este cáncer avanzado tiene una pobre supervivencia más allá de 5 años y no puede optar a manejo quirúrgico. El subtipo histológico más frecuente es el carcinoma de célula no pequeña de pulmón (CPCNP), el cual tiene potenciales dianas terapéuticas moleculares tales como las denominadas mutaciones “conductoras”. Recientemente, con el advenimiento de la inmunoterapia, también es posible valorar la expresión de PD-L1 y de esta manera, ampliar el arsenal terapéutico. Objetivos: Describir las características clínicas y moleculares de casos de CPCNP en población gallega así como evaluar la expresión inmunohistoquímica de PD-L1 en las células tumorales y explorar posibles asociaciones. Adicionalmente describir la supervivencia de este grupo de pacientes basándose en la expresión de PD-L1. Materiales y métodos: En este estudio observacional se recogieron 103 casos de pacientes de población gallega con CPCNP y se estudiaron sus características clínico-patológicas y moleculares en seis dianas terapéuticas diferentes (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, BRAF y NRAS). Se obtuvieron datos por medio de la historia clínica de manera retrospectiva y se completaron los estudios moleculares a través de RT-PCR y FISH. La expresión tumoral de PD-L1 fue valorada por medio de inmunohistoquímica. Se exploraron 16 asociaciones entre las variables clínicas y moleculares con PD-L1 y se hizo un análisis de supervivencia por el método de Kaplan-Meier en relación a la expresión de PD-L1. Resultados: El perfil clínico de los pacientes con CPNCP corresponde principalmente a hombres fumadores, con una mediana de edad de 62 años y con diagnóstico histológico de adenocarcinoma. A nivel molecular las frecuencias obtenidas de las mutaciones conductoras analizadas en orden decreciente fueron: KRAS (28.75%), EGFR (10.67%), ALK (2.9%), BRAF (2.5%), ROS1 (1%) y NRAS (0%). El estudio de expresión de PD-L1 mostró ausencia de expresión en el 60.2% de los casos, mientras que el 39.8% presentaron algún grado de positividad; de estos casos positivos, el 25.24% presentaban una expresión entre 1%-49% y el 14.56% una expresión ≥50%. No se encontraron asociaciones entre esta expresión y las características clínicas, pero a nivel molecular se observó una tendencia a que la fusión de ALK esté asociada a la expresión de PD-L1, de la misma manera que el EGFR de tipo wild-type, este último particularmente en la categoría de expresión ≥50%. También se observó en los pacientes con mutaciones en KRAS una significativa expresión de PD-L1 (43% de los casos). Finalmente, el análisis de supervivencia mostró medianas inferiores en aquellos pacientes con alta expresión de PDL1. Conclusiones: El perfil clínico y molecular de los pacientes con CPCNP en Galicia es semejante a lo descrito en la literatura. El alto porcentaje de casos con expresión de PD-L1 inferior al 1% es atribuible probablemente al predominio de biopsias endoscópicas como material de trabajo. La tendencia a que PD-L1 se exprese de mayor manera en casos de EGFR wild type, especialmente en la categoría ≥50% ó en pacientes con fusión de ALK es importante de cara al tratamiento puesto que los estudios han mostrado que en pacientes con dicha expresión y que albergan mutaciones en EGFR ó 17 fusiones de ALK hay refractariedad a la inmunoterapia. El estudio conjunto de KRAS y de PD-L1 es útil dados los datos de otros trabajos que muestran una supervivencia libre de progresión mayor al estar presentes ambas variables. Finalmente, la expresión de PD-L1≥50% se correlacionó con menor mediana de supervivencia global aunque su rol como factor predictor aún es controvertido. 19 RESUMO Introdución: O cancro de pulmón é a principal causa de morte relacionada co cancro en todo o mundo, cun estimado de 1,7 millóns de mortes cada ano, e adoita diagnosticarse cando os pacientes teñen a enfermidade localmente avanzada ou metastásica. Este cancro avanzado ten unha escasa supervivencia máis aló dos 5 anos, e non pode optar polo manexo cirúrxico. O subtipo histolóxico máis frecuente é o carcinoma de pulmón de células non pequenas (CPCNP), que posúe dianas terapéuticas moleculares potenciais como as denominadas mutacións "condutoras". Recentemente, coa chegada da inmunoterapia, tamén é posible avaliar a expresión de PD-L1 e así ampliar o arsenal terapéutico. Obxectivos: Describir as características clínicas e moleculares dos casos de CPCNP na poboación galega, así como avaliar a expresión inmunohistoquímica de PD-L1 en células tumorais e explorar posibles asociacións. Ademais, describir a supervivencia deste grupo de pacientes baseándose na expresión de PD-L1. Materiais e métodos: Neste estudo observacional recolléronse 103 casos de pacientes da poboación galega con CPCNP, estudáronse as súas características clínico-patolóxicas e moleculares en seis dianas terapéuticas diferentes (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, BRAF e NRAS). Obtivéronse datos mediante a historia clínica retrospectiva e se completaron os estudos moleculares mediante RT-PCR e FISH. A expresión tumoral de PD-L1 foi avaliada por medio da inmunohistoquímica. Exploráronse as asociacións entre variables clínicas e moleculares con PD-L1 e realizouse unha análise de 20 supervivencia mediante o método de Kaplan-Meier en relación coa expresión de PD-L1. Resultados: O perfil clínico dos pacientes con CPCNP corresponde principalmente a homes fumadores, cunha idade media de 62 anos e diagnóstico histolóxico de adenocarcinoma. A nivel molecular, as frecuencias obtidas das mutacións condutoras analizadas en orde decrecente foron: KRAS (28.75%), EGFR (10.67%), ALK (2.9%), BRAF (2.5%), ROS1 (1%) e NRAS ( 0%). O estudo da expresión de PD-L1 mostrou ausencia de expresión no 60.2% dos casos, mentres que o 39.8% presentaban algún grao de positividade; destes casos positivos, o 25.24% tiña unha expresión entre o 1%-49% e o 14.56% unha expresión ≥50%. O resto dos casos correspondentes ao 60.19% tiñan unha expresión inferior ao 1%. Non se atoparon asociacións entre esta expresión e as características clínicas, pero a nivel molecular observouse unha tendencia a que a fusión de ALK se asociase coa expresión de PD-L1, do mesmo xeito que o EGFR “wildtype”, este último especialmente na categoría de expresión ≥50%. Tamén se observou unha expresión significativa de PD-L1 (43% dos casos) en pacientes con mutacións en KRAS. Finalmente, a análise de supervivencia mostrou medianas máis baixas naqueles pacientes con alta expresión de PD-L1. Conclusións: O perfil clínico e molecular dos pacientes con CPCNP en Galicia é coherente co descrito na literatura. A alta porcentaxe de casos con expresión de PD-L1 inferior ao 1% probablemente débese ao predominio das biopsias endoscópicas como material de traballo. A tendencia de PD-L1 a expresarse máis en casos de EGFR “wild-type” especialmente na categoría de expresión ≥50% ou con fusión de ALK é importante para o tratamento, xa que algúns estudos demostraron que en pacientes con expresión de PD-L1 e que albergan mutacións de EGFR ou fusión de ALK son refractarios á inmunoterapia. O estudo conxunto de KRAS e PD-L1 é útil tendo en 21 conta os datos doutros estudos que mostran unha maior supervivencia sen progresión cando ambas variables están presentes. Finalmente, a expresión de PD-L1 ≥50% correlacionouse cunha mediana de supervivencia global máis baixa, aínda que o seu papel como factor preditivo aínda é controvertido. 23 ABSTRACT Introduction: Lung cancer is the leading cause of cancerrelated death worldwide, with 1.7 million estimated deaths per year, and it is usually diagnosed when patients have locally advanced or metastatic disease. This advanced cancer is not amenable to surgical management and has a poor 5 years survival rate. The most frequent histological subtype is non-small cell lung carcinoma (NSCLC), which has potential molecular therapeutic targets such as the so-called driver mutations. Recently, with the advent of immunotherapy, it is also possible to assess the expression of PD-L1 and thus expand the therapeutic arsenal. Objectives: To describe the clinical and molecular characteristics of NSCLC cases in the Galician population as well as to evaluate the immunohistochemical expression of PD-L1 in tumor cells and to explore possible associations. Additionally describe the survival of this group of patients based on the expression of PD-L1. Materials and methods: In this observational study, 103 cases of patients from the Galician population with NSCLC were collected and their clinical-pathological and molecular characteristics were studied in six different therapeutic targets (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, BRAF and NRAS), clinical data were obtained from the clinical history and the molecular studies were completed through RT-PCR and FISH. Tumor expression of PD-L1 was assessed by immunohistochemistry. Associations between clinical and molecular variables with PD-L1 were explored and a Kaplan-Meier survival analysis was performed in relation to PD-L1 expression. 31 LISTA DE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ADN: Ácido desoxirribonucleico AJCC: “American Joint Committee on Cancer” ALK: “Anaplastic lymphoma kinase” - quinasa del linfoma anaplásico ATP: “adenosine triphosphate” - adenosín trifosfato BAG: Biopsia con aguja gruesa BDGF: “brain-derived neurotrophic factor” - factor neurotrófico derivado del cerebro BRAF: “B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase” - B-Raf proto-oncogén serina treonina quinasa c-KIT: “KIT proto-oncogene, receptor tyrosine kinase” - receptor tirosina quinasa del proto-oncogén KIT CAP: “College of American Pathologists”- Colegio Americano de Patólogos CK2: “casein kinase 2” - caseína quinasa 2 CMH: complejo mayor de histocompatibilidad CPNCP: Carcinoma de célula no pequeña de pulmón CTLA-4: “Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4” - Receptor de antígenos de linfocitos T citotóxicos 4 CTLs: “Cytotoxic T lymphocytes” - Linfocitos T citotóxicos SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 32 DAPI: “4′,6-diamidino-2-phenylindole” - 4,6 diamino-2fenilindol ECOG: “Eastern Cooperative Oncology Group” EGRF: “Epidermal growth factor receptor” - receptor del factor de crecimiento epidérmico EML4: “echinoderm microtubule associated protein-like 4” ERRB: “erb-b receptor tyrosine kinase ” - familia de receptores de tirosina quinasa ERRB2: “erb-b2 receptor tyrosine kinase 2” - receptor de tirosina quinasa 2 erb-b2 FFPE: “formalin-fixed, paraffin embedded” – fijado en formol y embebido en parafina FGFR: “fibroblast growth factor receptor” - factor del receptor de crecimiento de fibroblastos FISH: “Fluorescence in situ hybridation” - hibridación fluorescente in situ FNT-α: factor de necrosis tumoral-α HE: Hematoxilina eosina HGF: “hepatocyte growth factor” - factor de crecimiento de los hepatocitos HGFR: “hepatocyte growth factor receptor” – receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos Abreviaturas 33 ICB: “immune checkpoint blockade” – bloqueadores de los puntos de control inmunitarios ICI: “immune checkpoint inhibitor” – inhibidor de los puntos de control inmunitarios IL: Interleuquina IFNγ: Interferón-γ IHQ: inmunohistoquímica JAK: “Janus kinases” – quinasas Jano KIF5B: kinesin family member 5B - miembro 5B de la familia de la quinesina proto-oncogén KIT KRAS: “KRAS proto-oncogene, GTPase” - KRAS proto-oncogén GTPasa LCMC: “The Lung Cancer Mutation Consortium” MAPK: “Mitogen-Activated Protein Kinases” - proteína quinasas activadas por mitógenos MET: “MET proto-oncogene, receptor tyrosine kinase” - protooncogén MET del receptor de tirosina quinasa NE: neuroendocrino NGS: “Next-generation sequencing” - Secuenciación de nueva generación NGR: “Nerve growth factor” – factor de crecimiento nervioso NK: “natural killer” SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 34 NOS: “Not otherwise specified” - no especificado NPM: “nucleophosmin” – nucleofosmina NRAS: “NRAS proto-oncogene, GTPase” - NRAS proto-oncogén GTPasa NTF-3: “neurotrophin 3” – neurotrofina 3 NTRK: “Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1” - receptor de tirosina quinasa neurotrófico OS: “Overall survival” – supervivencia global PCR: “polymerase chain reaction” - reacción en cadena de la polimerasa PD-1: “Programmed cell death protein 1” – proteina de la muerte celular programada 1 PD-L1: “Programmed Death-ligand 1” - Ligando de la vía de muerte celular programada 1 PD-L2: “Programmed Death-ligand 2” - Ligando de la vía de muerte celular programada 2 PFS: “Progression-free survival” – supervivencia libre de progresión PI3K: “phosphatidylinositol 3-kinases” - fosfatidil inositol 3 quinasa PTEN: “Phosphatase and tensin homolog “ - fosfatidilinositol3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa RET: “RET proto-oncogene” – proto-oncogén RET Abreviaturas 35 RT-PCR: “real time polymerase chain reaction” - reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. ROS1: “ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase” - receptor tirosina quinasa ROS proto-oncogén 1 SEAP: Sociedad Española de Anatomía Patológica SEOM: Sociedad Española de Oncología Médica SHP1: “Src homology region 2 domain-containing phosphatase1” SHP2: “Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2” STAT: “signal transducer and activator of transcription – transductor de señales y activador de la transcripción” TCR: “T cell receptor” - receptor del linfocito T TMB: “Tumor mutational burden” – carga mutacional tumoral TME: “tumor microenvironment” – microambiente tumoral TPS: “Tumor proportion score” TRK: “Tropomyosin receptor kinase” - receptores de tropomiosina de tirosina quinasa WT: “Wild type” I Introducción 39 INTRODUCCIÓN El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con cáncer a nivel mundial, con una estimación de 1.7 millones de muertes en el año 2020 (Globocan 2020). En España, los cánceres que produjeron más defunciones ese mismo año fueron los de pulmón (22.930 casos) seguido del cáncer colorrectal, páncreas, mama, próstata, hígado/vías biliares y estómago, todos ellos con más de 5.000 fallecimientos (SEOM 2020). El principal factor de riesgo que aumenta la probabilidad de contraer cáncer de pulmón es el tabaco. Otros factores incluyen respirar aire contaminado, la exposición a radón, asbesto, diésel o a radiaciones ionizantes así como la presencia de antecedentes familiares (Dubey 2016, Ramada 2010). Adicionalmente, hay evidencia que sugiere una correlación con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, de manera independiente al uso del tabaco, la cual es mediada probablemente por susceptibilidad genética (Reck 2017). Determinar el subtipo histológico del cáncer de pulmón empezó a tomar relevancia en los últimos años dados los notables avances en la genética de los tumores, con profundas implicaciones en el diagnóstico histopatológico y molecular así como en su tratamiento (WHO 2015, Travis 2013 y 2015). Así, una vez evaluado el tejido tumoral y teniendo en cuenta las características morfológicas e inmunohistoquímicas el cáncer puede ser diagnosticado y clasificado adecuadamente (Tabla 1 Travis 2015). El grupo histológico más frecuente es el denominado Carcinoma Pulmonar de Célula no Pequeña (CPCNP), que constituye aproximadamente el 85% de los SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 46 Figura 2. Algoritmo diagnóstico para realización de pruebas de biomarcadores en pacientes en estadios avanzados de CPCNP. Original tomado de la referencia Garrido 2019. Licencia Creative Commons. 1.1 RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGFR) El receptor del factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor receptor - EGFR) es un gen que pertenece a la familia de receptores de la tirosina quinasa (ErbB). Se encuentra localizado en el cromosoma 7p11.2, se extiende cerca de 200kb, contiene 28 exones y codifica una proteína de 464 aminoácidos (Cheng 2012). Ésta se compone de una región extracelular N-terminal que se une al ligando, un segmento lipofílico trasmembrana, y una región intracelular Cterminal con el dominio tirosina quinasa (Figura 3 Cheng 2012). Una vez el ligando se une al dominio extracelular, hay una homo/heterodimerización y posterior autofosforilación de las tirosinas c-terminales. Esto lleva a una activación intracelular de la cascada de las vías PI3K (fosfatidil inositol 3 quinasa), JAK/STAT (Jano quinasas/ transductor de señales y activador de la transcripción) y Introducción 47 MAPk (vía de las proteína quinasas activadas por mitógenos) y por tanto, a la inducción de varias respuestas celulares cruciales como proliferación, angiogénesis, metástasis y disminución de los procesos de apoptosis (Cheng 2012, Cagel 2018, Cunha Santos 2011). Por tanto, la desregulación en la señalización en estos receptores, ya sea por sobreexpresión o por la adquisición de mutaciones somáticas puede conducir a la tumorigénesis en una variedad de cánceres humanos (Shah 2020). Figura 3. Estructura molecular del receptor del factor de crecimiento epidérmico. Original tomado de la referencia Cheng 2012. Permitido por Modern Pathology. Específicamente en el CPCNP, las mutaciones activadoras en el gen de EGFR se han reportado en un 10-15% de pacientes occidentales con adenocarcinoma y hasta en un 50% en pacientes asiáticos (Shah 2020). En España, la mutación está presente en el 8%-11% de los CPCNP en estadios avanzados y específicamente en adenocarcinoma en un 16.6% (Garrido 2019, Rossell 2016). Otras características clínicas que se correlacionan con la presencia de esta mutación son el género femenino, no fumador y las variantes histológicas de adenocarcinoma de tipo lepídico y papilar (Cunha Santos 2011, WHO 2015). El clúster de mutaciones ocurre en el dominio tirosina quinasa en los exones 18, 19, 20 y 21 (Penzel 2011). Éstas pueden clasificarse en tres categorías principales: deleciones en el exón 19, inserciones en el SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 48 exón 20 y mutaciones con cambio de aminoácidos en los exones 18-21 (Cheng 2012). Una revisión de Yamamoto y colaboradores en 2009 sobre 2880 pacientes con carcinoma de pulmón, detectó 569 mutaciones en EGFR, estando 48% localizadas en el exón 19, 42% en el exón 21, 3.7% en el exón 20 y 3.2% en el exón 18 (Yamamoto 2009). Dentro de las mutaciones del exón 19 se encuentran la delE746-A750, delL747-T751insS y delL747-P753insS. En el exón 21 la mutación más característica es la L858R pero también se encuentran la L861Q y L861R. En el exón 18 están G719C, G719S y G719A. Por su parte, las mutaciones en el exón 20 se asocian a resistencia a tratamientos, siendo la más importante la T790M (Cheng 2012). La importancia terapéutica de estas alteraciones moleculares se demostró a mediados de la década pasada, cuando se encontró que los adenocarcinomas que albergaban estas mutaciones respondían a tratamientos con moléculas inhibidoras de la tirosina quinasa bloqueando la señalización de EGFR (Shah 2020). Los primeros inhibidores desarrollados fueron erlotinib y gefitinib, denominados de primera generación porque son reversibles y su único blanco es el EGFR; interrumpen su señalización al competir con el ATP en el dominio catalítico intracelular del receptor, inhibiendo la autofosforilación del dominio y atenuando la activación de la cascada intracelular (Sharma 2007). Gefitinib y erlotinib han sido aprobados para el tratamiento de CPCNP en primera línea, pero desgraciadamente, con el tiempo la mayoría de pacientes desarrollan resistencia a estos agentes (Shah 2020). La causa más frecuente, identificada hasta en un 50% de los casos, es una segunda mutación en EGFR en el exón 20, con la sustitución de una treonina por una metionina en el codón 790 (T790M) (Kobayashi 2005, Arcila 2011). Esta mutación afecta la eficacia inicial del inhibidor ya sea al generar un efecto estérico o al aumentar la afinidad del dominio tirosina quinasa por el ATP. Otros Introducción 49 mecanismos de resistencia descritos incluyen la amplificación de HER2 (ésta ha sido identificada en el 12-13% de los tumores resistentes a tratamiento con inhibidores de primera generación), amplificación del proto-oncogén MET y mutaciones en BRAF y en la vía PI3K que generan vías de señalización compensadoras (Heydt 2018, Shah 2020). A nivel histopatológico se ha descrito como mecanismo de resistencia el cambio de fenotipo a carcinoma de célula pequeña (Herbst 2018, Camidge 2014). Es por esto que se empezaron a desarrollar otra serie de medicamentos que pudieran superar los mecanismos de resistencia, al inhibir de manera simultánea e irreversible múltiples receptores de la familia ErbB. Estos fármacos incluyen a afatinib y dacomitinib y son los denominados inhibidores de segunda generación, los cuales han mostrado un aumento en la supervivencia libre de progresión en comparación a los de primera generación (Herbst 2018, Paz-Ares 2017). Afatinib inhibe de manera irreversible a EGFR, Her2 y Her4 al bloquear la transfosforilación de los residuos de tirosina a nivel cterminal, sitio donde se da el primer paso de la activación de los receptores ErbB. Tiene un perfil inhibitorio más amplio y está aceptado como tratamiento de primera línea para adenocarcinomas y como segunda línea en carcinomas epidermoides (Shah 2020). Al igual que los inhibidores de primera generación, el mecanismo de resistencia más frecuente es la mutación T790M detectada en el 50-70% de los casos (Tanaka 2017) seguida por la amplificación de MET; también se ha detectado sobreexpresión del FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y aparición de mutaciones terciarias en EGFR tal como la V843I (Van der Wekken 2016). El otro medicamento incluido en este grupo es el dacomitinib, que actúa de manera similar a afatinib y ha sido aprobado recientemente como primera línea de tratamiento para el carcinoma de célula no pequeña de pulmón EGFR positivo. Datos in vitro han indicado resistencia por medio de la mutación T790M pero hasta ahora hay pocos datos al respecto (Shah 2020). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 50 Los últimos medicamentos en desarrollarse han sido los inhibidores de tercera generación representados por osimertinib, el cual es efectivo en pacientes con la mutación T790M y en aquellos casos con progresión después del uso de inhibidores de primera generación. Este medicamento se une de manera covalente a una cisteína en el codón 797 y logra sobrepasar la afinidad mejorada del ATP secundaria a la mutación. Los mecanismos de resistencia descritos a este fármaco incluyen la amplificación de MET, mutaciones terciarias en EGFR, específicamente C797S y otras como amplificación de HER2 y mutaciones en RAS (Shah 2020, Herbst 2018, Niederst 2015) (figura 4 Cheng 2012). Figura 4. Estructura génica del EGFR, frecuencia de mutaciones y resistencias. Original tomado de la referencia Cheng 2012. Permitido por Modern Pathology. Introducción 51 El último consenso de la SEAP-SEOM así como las guías del Colegio Americano de Patólogos (CAP) sobre la determinación de biomarcadores en cáncer de pulmón recomiendan determinar la presencia de mutaciones en EGFR de manera universal, en todos los pacientes con adenocarcinoma en estadios avanzados, en pacientes con carcinomas epidermoides menores de 50 años y en aquellos casos de no fumadores o que tengan un acúmulo inferior a 15 paquetes/año (Garrido 2019). Esta determinación se puede hacer usando una variedad de métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), secuenciación de Sanger, pirosecuenciación y secuenciación de nueva generación (NGS) entre otros. La inmunohistoquímica (IHQ) no se recomienda para analizar este biomarcador (Cagle 2018, Lindeman 2018). 1.2 QUINASA DEL LINFOMA ANAPLÁSICO (ALK) El gen de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 2 y codifica un receptor de tirosina quinasa transmembrana que pertenece a la superfamilia de receptores de insulina (Golding 2018). La proteína está constituida por un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio quinasa intracelular. Su función en humanos no está del todo clara pero se ha sugerido un rol en el desarrollo del sistema nervioso fetal (Golding 2018). Hay tres tipos de mutaciones en ALK: amplificaciones, mutaciones puntuales y reordenamientos, siendo estos últimos los más frecuentes (Du 2018). El primero en ser descubierto fue el gen de fusión nucleofosmina (NPM)-ALK en el contexto del linfoma anaplásico de células grandes (Morris 1994). Posteriormente, en el año 2007, Soda y colaboradores descubrieron la fusión “echinoderm microtubule associated protein-like 4” (EML4)- ALK en un subgrupo de pacientes con CPCNP. Esta fusión se forma como resultado de una inversión dentro del brazo corto del SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 52 cromosoma 2 que une el intrón 13 de EML4 con el intrón 19 de ALK [inv(2)(p21;p23)]. Dicha fusión oncogénica codifica una proteína tirosina quinasa constitutivamente activa que genera inhibición de la apoptosis y la promoción de la proliferación celular a través de la activación de las vías PI3K/AKT, MAPk y STAT3 (Figura 5 Cheng 2012). Figura 5. Reordenamiento de ALK. Original tomado de la referencia Cheng 2012. Permitido por Modern Pathology. Dado los diferentes puntos de rotura de EML4, se han descrito hasta siete variantes de esta mutación (V1-V7), siendo la V1 la más frecuente (Soda 2007, Lawrence 2000, Cheng 2012). ). Otros reordenamientos descritos además de EML4 incluyen KIF5B (miembro 5B de la familia de la quinesina), LKC1 y TFG. (2012, Chiarle 2008, OMS 2015) (Figura 6. Wu 2017). Introducción 53 Figura 6. Variantes de la fusión EML4-ALK y otros genes de fusión descritos. Original tomado de la referencia Wu 2017. Licencia Creative Commons. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 54 A nivel clínico-epidemiológico, el reordenamiento de ALK está presente en el 2-5% de los pacientes con CPCNP en estadios avanzados (Garrido 2018) y se observa más frecuentemente en pacientes jóvenes no fumadores; histopatológicamente se ha asociado principalmente a adenocarcinomas con patrones acinares (incluyendo morfología cribiforme) y a tumores con células en anillo de sello (Del Monte 2019). En 2011, tan sólo 4 años después del descubrimiento de Soda et al, la FDA aprobó el uso de crizotinib para el tratamiento de pacientes con CPCNP ALK positivos en estadio avanzado. Crizotinib es un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de ALK, MET y ROS1 y ha demostrado ser superior a la quimioterapia respecto a la tasa de respuesta y supervivencia libre de progresión en todas las líneas de tratamiento (Solomon 2014). A pesar de estos resultados, después de cierto periodo de tiempo (media de 10.9 meses), hay progresión de la enfermedad, debido al desarrollo de hasta en un tercio de los casos de mutaciones de resistencia en el dominio tirosina quinasa de ALK, tales como L1196M (análoga a la mutación T790M de EGFR), G1269A, C1156Y, L1152R, G1202R, S1206Y, 1151Tins, F1174C y D1203N entre otras (Del Monte 2019) (Figura 7. Golding 2018). Estas alteraciones aumentan la afinidad del ATP, induciendo un cambio conformacional que interfiere con las vías de señalización. Otros mecanismos de resistencia descritos incluyen la amplificación de ALK o EGFR o mutaciones en c-KIT (receptor tirosina quinasa del protooncogén KIT) (Del Monte 2019). Introducción 55 Figura 7. Mecanismos de resistencia a crizotinib. Original tomado de la referencia Golding 2018. Licencia open access. Debido a esto, se han desarrollado inhibidores de ALK de segunda generación como ceritinib y alectinib que probaron ser efectivos contra muchas de las formas de resistencia a crizotinib, excepto a la sustitución G1202R (McCusker 2019). Afortunadamente, existe un inhibidor ALK de tercera generación (lorlatinib), el cual ha demostrado gran potencia y actividad a pesar de los mecanismos de resistencia y eficacia en pacientes previamente tratados con hasta tres líneas de inhibidores de ALK (Gainor 2016, Shaw 2017, McCusker 2019). Al igual que con EGFR, el último consenso de la SEAP-SEOM así como las guías del CAP sobre la determinación de biomarcadores en cáncer de pulmón recomiendan que la búsqueda de reordenamientos en ALK se debe realizar de manera universal en todos aquellos pacientes con estadios avanzados de adenocarcinoma u otro tipo de carcinoma en el que no se haya demostrado características de carcinoma epidermoide. Respecto a este último grupo la recomendación es realizar el test en pacientes menores de 50 años y/o casos de no fumadores o que fumen menos de 15 paquetes/año (Garrido 2019). Los métodos ideales para la detección de estos reordenamientos son la IHQ, hibridación fluorescente in situ (FISH), PCR y NGS (Garrido 2019). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 62 Figura 10. BRAF en la vía de señalización intracelular. Modificado del original Baik 2017. Permitido por The Oncologist. Dicha mutación se presenta en el 2-4% de los pacientes con CPCNP siendo la más frecuente la sustitución de un glutamato por una valina en el codón 600 (V600E) del exón 15 (Baik 2017). Otras mutaciones documentadas incluyen K601E, L597Q y G469A/V y son de manera habitual mutuamente excluyentes con otras “mutaciones conductoras”; de ahí que sea interesante su uso en pacientes con opciones terapéuticas limitadas. (Baik 2017). Basados en el éxito de los tratamientos de inhibidores de BRAF (vemurafenib, dabrafenib) en melanoma, se ha estudiado su uso en combinación con un inhibidor de MEK (trametinib) en CPCNP, observándose resistencia al fármaco al haber una reactivación de ERK a través de la vía MAPK por medio de Introducción 63 señales alternativas u otros mecanismos no conocidos (Guo 2019, Noeparast 2017). Las características clínicas de pacientes con esta mutación no están tan bien definidas como en el caso de EGFR y ALK, pero se ha relacionado con histología de adenocarcinoma y pacientes fumadores en hasta un 70% de los casos (Baik 2017). Las guías diagnósticas más recientes recomiendan incluir BRAF como parte del estudio de todos los pacientes con CPCNP sin componente escamoso, y puede ser detectado por medio de cualquier PCR así como con NGS, siempre y cuando la metodología usada incluya los exones 11 y 15 (Garrido 2019). 1.6 NRAS PROTO-ONCOGEN GTPASA NRAS es una GTPasa relacionada con KRAS, originalmente identificada en las líneas celulares del neuroblastoma como un tercer miembro de la familia RAS después de KRAS y HRAS quienes regulan el crecimiento, diferenciación y proliferación celular. A pesar de que los 3 miembros de la familia comparten algunas secuencias, sus productos proteicos generan distintos tipos de señalización y tienen roles diferentes en la tumorigénesis (Hancock 2003, Pylayeva-Gupta 2011). Las mutaciones de NRAS en cáncer de pulmón son muy raras: 0.7% en el estudio de Ohashi et al, teniendo en cuenta el sesgo de que el 80% de los casos correspondían a adenocarcinoma. En este estudio también se asociaron estas mutaciones a pacientes afroamericanos y fumadores. El 50% de ellas corresponde a transversiones A:T > T:A y son mutuamente excluyentes de las alteraciones de ALK, KRAS y EGFR (Ohashi 2013). Un caso de reciente descripción, en el cual un paciente presentaba un CPCNP con mutación de BRAF y desarrolló resistencia adquirida a los inhibidores de RAF y MEK, coincidió con SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 64 la aparición de una mutación de ganancia de función en NRAS Q61K (Abravanel 2018). Estos hallazgos están en consonancia con lo descrito por el grupo de Ninomiya, y por tanto deberían tenerse en cuenta a futuro como posible causa de resistencia a tratamientos dirigidos (Ninomiya 2018). Las recomendaciones actuales por ahora no lo incluyen en los paneles diagnósticos (Lindeman 2018). 1.7 OTRAS ALTERACIONES 1.7.1 MET proto-oncogén GTPasa El gen MET se encuentra localizado en el cromosoma 7 en la posición 31.2 y codifica un receptor de tirosina quinasa (HGFR) el cual se activa con un ligando natural específico: el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF); dicho receptor pertenece a una familia de receptores tirosina-quinasa que juega un rol fundamental en el crecimiento y proliferación celular, invasión y transición epiteliomesénquima al activar las vías de señalización PI3K, STAT y MAPK (Trusolino 2010, Sierra 2011). El exón 14 de MET codifica la región yuxtamembrana del receptor que contiene el residuo Y1003 que sirve como sitio de unión para la E3 ubiquitin ligasa CBL. Las mutaciones a este nivel conllevan a la pérdida de la degradación mediada por ubiquitina y promueve la oncogénesis (Kong-Beltrán 2006, Vuong 2018). La activación aberrante de la señalización de MET puede ocurrir como resultado de amplificaciones (4.6%), sobreexpresión proteica (23%) y mutaciones génicas (4%). La presencia de estas alteraciones son predictivas de beneficio con inhibidores de tirosina quinasa MET específicos (crizotinib, tepotinib o capmatinib) (Paik 2015, Garrido 2019). El perfil clínico patológico asociado a estas mutaciones corresponde a pacientes adultos mayores con histología sarcomatoide. Es importante recordar que uno de los mecanismos de Introducción 65 resistencia de inhibidores de tirosina quinasa específicos para EGFR es precisamente la amplificación de MET (Garrido 2019). Dada la variedad de alteraciones presentes en MET, el método de elección para detectarlas es la NGS. La secuenciación por Sanger puede detectar mutaciones en el exón 14 pero si hay baja frecuencia alélica pueden pasarse por alto. El FISH se utiliza para detectar amplificaciones y la RT-PCR de tipo cuantitativo (qRT-PCR) es sensible y específica si se busca únicamente este gen (Garrido 2019). 1.7.2 RET proto-oncogén GTPasa El proto-oncogen RET se encuentra localizado en el cromosoma 10 en la posición 11.21 y codifica un receptor tirosina quinasa compuesto por un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. La unión con su ligando causa homodimerización de RET, autofosforilación de sus residuos intracelulares de tirosina y posteriormente activación de las vías PI3K, RAS/MAPK y STAT (Mulligan 2014). Las alteraciones en RET incluyen reordenamientos con KIF5B, CCDC6 y NCO4 y de manera similar a ALK, los puntos de rotura en los exones 11 y 12 generan una homodimerización activa del receptor independiente del ligando y por ende una activación permanente de las vías de señalización (Takeuchi 2012). Las variantes estructurales que causan las fusiones de RET son bastante raras, encontrándose en 0.6-0.9% de todos los CPCNP y hasta en un 2% específicamente en los adenocarcinomas (Wang 2012). En estos últimos es posible sospechar la presencia de reordenamientos de RET cuando se encuentran calcificaciones en forma de cuerpos de psammoma (Garrido 2019). Respecto a sus posibilidades terapéuticas, se han descrito dos inhibidores selectivos, praseltinib (BLU-667) y selpercatinib (LOXO 292) aprobados por la Agencia Europea de Medicamentos para pacientes con CPCNP SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 66 avanzado con alteraciones en RET y que hayan recibido previamente inmunoterapia y/o quimioterapia basada en platinos. La técnica ideal de detección es la NGS pero una alternativa válida es el FISH (Garrido 2019) 1.7.3 ERB-B2 receptor tirosina quinasa 2 El gen del ERB-B2 (también conocido como Her2neu) se encuentra localizado en el cromosoma 17q12, consta de 32 exones y codifica a un miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento similar a EGFR, pero a diferencia de este último sin presencia de un ligando endógeno (Guo 2019). Su activación ocurre a través de su heterodimerización con otros miembros de la familia ERBB, promoviendo distintas vías de señalización incluyendo PI3K, MAPK y JAK/STAT (Guo 2019). En los casos de CPCNP, la amplificación de HER2 (a diferencia de los cánceres de mama) no es considerada una mutación conductora oncogénica sino un mecanismo secundario de resistencia a los inhibidores de EGFR (Tomizawa 2011, Takezawa 2012, Suzuki 2015); por otro lado, las mutaciones tipo inserción sí parecen tener un potencial oncogénico, especialmente la mutación YVMA 776-779 presente en el exón 20 y que se encuentra en el 3% de los adenocarcinomas; también se asocia al sexo femenino, etnia asiática y no fumadores (Gao 2019, Stephens 2004, Arcila 2012). Las terapias contra HER2 han tenido mucho éxito en el cáncer de mama, pero en el CPCNP han mostrado poca y controvertida actividad y hasta el momento no hay medicamentos aprobados para este fin; sin embargo, afatinib ha mostrado un cierto benificio clínico específicamente en carcinomas epidermoides (Goss 2018). Al igual que con otras dianas terapéuticas antes mencionadas, las pruebas moleculares para HER2 no deben incluirse dentro de la Introducción 67 rutina como prueba en solitario, sino como parte de un panel inicial o cuando las pruebas para EGFR, ALK y ROS1 sean negativas (Lindeman 2018). 1.7.4 Receptor de tirosina quinasa neurotrófico Los genes de la neurotrofina quinasa (NTRK1, NTRK2 Y NTRK3) codifican una familia de receptores de tropomiosina de tirosina quinasa (TRKA, TRKB y TRKC) los cuales se encuentran activados de manera normal durante el desarrollo neuronal (Farago 2018). Estructuralmente, están constituidos por un dominio extracelular de unión al ligando tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDGF) o neurotrofina 3 (NTF-3), así como de un segmento transmembrana y un dominio intracelular tirosina quinasa que al sufrir cambios conformacionales activan diferentes vías de señalización como la vía MAPK, ERK y PI3K (Ricciuti 2017). La alteración molecular más frecuente es el reordenamiento, con una frecuencia de presentación inferior al 1%, aunque otros estudios han mostrado prevalencias mayores especialmente con NTRK1 de hasta el 3% (Garrido 2019, Ricciuti 2017). Se han desarrollado varios inhibidores entre otros larotrectinib (inhibidor panTRK), entrectinib y selitrectinib (LOXO -195) (inhibidor selectivo de segunda generación) (Guo 2019). Es importante tener en cuenta que estas alteraciones son mutuamente excluyentes entre sí y con otras mutaciones conductoras y para su detección se puede realizar un cribado con inmunohistoquímica con posterior confirmación mediante FISH o NGS (Garrido 2019). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 68 2. EL CÁNCER Y EL SISTEMA INMUNOLÓGICO 2.1 GENERALIDADES El sistema inmune juega un rol importante en el control y erradicación del cáncer. Sin embargo, múltiples mecanismos de supresión inmune pueden impedir una efectividad adecuada del sistema ante los tumores. Por ello se están desarrollando terapias dirigidas contra varios reguladores inmunológicos negativos (Karachaliou 2015). Para entender estos nuevos tratamientos, es necesario primero hacer un análisis de la respuesta inmune ante el cáncer. Tanto la inmunidad innata como adaptativa juegan un rol crucial en la respuesta inmune antitumoral. La inmunidad innata (Figura 11 Aldarouish 2016) está compuesta de macrófagos, granulocitos, mastocitos, células dendríticas y células “natural killer” (NK), mientras que la inmunidad adaptativa (figura 12 Aldarouish 2016) está compuesta por células B, linfocitos citotóxicos CD8+ (CTLs) y linfocitos T “helpers” CD4+. Es importante mencionar que las células NK y las células T γ δ participan en los procesos de interfase entre la inmunidad innata y adaptativa (Zitvogen 2008, Liu 2012). Introducción 69 Figura 11. Inmunidad innata. Componentes y efectos. Original tomado de la referencia Aldarouish 2016.Licencia Creative Commons. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 70 Inicialmente, el infiltrado inmune es escaso, hasta que aparecen las células NK; éstas atacan directamente al tumor al inducir apoptosis y secretar perforina, granzima y factor de necrosis tumoral-α (FNT-α). De manera indirecta, atacan al expresar CD16 y destruir las células malignas a través de anticuerpos dependientes de la citotoxicidad celular (Sutlu 2009). De manera concomitante, los macrófagos de tipo M1 reconocen moléculas que expresan las células malignas en su superficie (fosfatidilserina lipídica, lipoproteínas de baja densidad oxidadas, calreticulina) y las fagocitan (Gardai 2006). Los macrófagos de tipo M2 son en parte responsables de las metástasis tumorales al promover la transferencia de las células malignas al torrente sanguíneo e inhibir a células T anti-tumorales (Kryczec 2006). Introducción 71 Figura 12. Inmunidad adaptativa. Componentes y efectos. Original tomado de la referencia Aldarouish 2016.Licencia Creative Commons. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 78 Figura 15. Punto de control inmune-CTLA-4. Original tomado de la referencia Pardoll 2012. Permitido por Nature Reviews Cancer. Introducción 79 El primer medicamento aprobado por la FDA con bloqueo de los puntos de control inmune fue el ipilimumab, una imnunoglobulina G1 humana que bloquea el CTLA-4 y que se ha usado en el tratamiento del melanoma metastásico. Posteriormente se desarrolló trelemimumab, una IgG4 también anti CTLA-4 que se encuentra en fase de estudio en combinación con anti PD-L1 para el manejo del cáncer de pulmón de célula no pequeña. (Aldarouish 2016). 2.3.2 Vía del receptor de muerte celular programada (PD1/PD-L1) La vía molecular del receptor de muerte celular programada (PD-1 ó CD279) y sus ligandos, PD-L1 (B7-H1 ó CD274) y PD-L2 (B7-DC ó CD273) juega un rol vital en el mantenimiento de la tolerancia inmune periférica (esto es, los mecanismos que mantienen la quiescencia de los linfocitos T autoreactivos, maduros, que han escapado de los medios de control centrales de tolerancia durante su desarrollo en el timo). Los tumores y patógenos que causan infecciones crónicas pueden utilizar esta vía para escapar del sistema inmune (Boussiotis 2016). Una vez se vieron los efectos del bloqueo de CTLA-4 sobre tumores malignos, se empezó a explorar la vía del PD-1/PD-L1, con resultados alentadores en múltiples ensayos clínicos para varios tipos de cáncer (Topalian 2012). 2.3.2.1 PD-1 El receptor PD-1 es una proteína constituida por 288 aminoácidos que se induce tras la activación de las células T, pero que también se encuentra presente en células T doble negativas (CD4CD8-) en el timo, en células NK, linfocitos B, monocitos y células de Langerhans inmaduras (Okazaki 2007). La molécula del PD-1 está compuesta por un dominio extracelular IgV, un dominio SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 80 transmembrana y un dominio intracelular de aproximadamente 95 aminoácidos que contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM, por sus siglas en inglés) y un motivo de cambio del inmunorreceptor basado en tirosina (ITSM, por sus siglas en inglés) (Vargas-Rojas 2008); éstos últimos son los que tienen la capacidad de unirse a la fosfatasa inhibitoria SHP-2 (Li 2016) (figura 16 Boussiotis 2016). Altos niveles de PD-1 han sido detectados en los linfocitos intratumorales (TILs) (Ahmadzadeh 2009). Figura 16. Estructura del receptor PD1. Original tomado con autorización de la referencia Boussiotis 2016. Copyright Massachusetts Medical Society. Introducción 81 2.3.2.2 PD-L1 El ligando de muerte programada 1 (PD-L1), también conocido como B7-H1 ó CD274 es el ligando principal del PD-1. Se encuentra codificado por el gen PDCDL1 localizado en el cromosoma 9 en humanos en la posición p24.1 (Kythreotou 2017). Fue descrito por Dong et al en 1999 y reconocido como el tercer miembro de la familia de proteínas B7 compartiendo su secuencia en un 37% con el PD-L2 y hasta un 20% con B7.1 y B7.2 (Dong 1999). La longitud total del PDL1 se codifica dentro de siete exones, correspondiendo entonces a una proteína de 40 kDa constituida por 290 aminoácidos y formada por dominios extracelulares similares a IgV e IgC, un dominio transmembrana hidrofóbico y una pequeña cola citoplasmática hecha de 30 aminoácidos (figura 17 Fabrizio 2018) Figura 17. Estructura del gen de PD-L1, su mRNA y la proteína. Original tomado de la referencia Fabrizio 2018. Permitido por SAGE publishing. Licencia creative commons. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 82 La expresión de PD-L1 puede ser constitutiva o inducible. A nivel constitutivo, bajos niveles pueden ser encontrados en linfocitos no activos, células presentadoras de antígenos, córnea, sincitiotrofoblasto y células de los islotes de Langerhans donde contribuye a la homeostasis tisular y a respuestas proinflamatorias (Restifo 2012). En el contexto de inflamación y/o infección, PD-L1 es inducida como una señal supresora en células endoteliales, epiteliales y especialmente en las células T para regular su función, prevenir la autoinmunidad y el daño tisular colateral (Kythreotou 2017). Una vez el PD-L1 se une a PD1, éste es fosforilado por la proteína tirosina quinasa Lck, con activación de las fosfatasas 1 y 2 (SHP-1 y SHP-2) que defosforilan a moléculas como ZAP70 inactivando de esta forma el TCR (Yokosuka 2012, Xia 2019). Esta respuesta inhibitoria es fortalecida además por la inactivación directa de la vía Ras-MEK-ERK e indirecta de la vía PI3k-AKT. Ésta última se da a través de la defosforilación de la quinasa de caseína 2 (CK-2) (otro blanco de SPH2) que genera una actividad descontrolada de la fosfatidilinositol-3,4,5trisfosfato 3-fosfatasa (PTEN), el antagonista fisiológico de PI3K-AKT (Kythreotou 2017, Patsoukis 2013). En el proceso de carcinogénesis, el PD-L1 puede estar sobreexpresado como resultado de algunos eventos oncogénicos; por ejemplo en tumores con mutaciones en PTEN (homólogo de fosfatasa y tensina) la sobreexpresión de PD-L1 se explica por la activación desenfrenada de la vía PI3K-AKT (Suzuki 2003). También se ha observado que los reordenamientos de ALK inducen la expresión de PD-L1 vía STAT-3 (Kythreotou 2017, Nielsen 1997). Esta sobreexpresión finalmente transmite señales antiapoptóticas a las células cancerígenas permitiendo su supervivencia (Boussioutis 2016) (Figura 18 Kythreotou 2017) (Figura 19 Boussiotis 2016). Sin embargo, el mecanismo más frecuente de sobreexpresión se da por reacciones en el microambiente tumoral (TME por sus siglas en inglés). En primer lugar cuando hay presencia de interferón γ y otras citoquinas liberadas Introducción 83 por células T activadas locales, se desarrolla resistencia a esas mismas células T por activación en la célula tumoral de vías de proliferación y supervivencia. En segundo lugar, la exposición por largo tiempo a antígenos tumorales en las células T infiltradas en el TME las termina agotando, y estas células T presentan mucho PD-1 pero baja función antitumoral promoviendo así la sobreexpresión de PD-L1. De ahí, que la principal función de los anticuerpos que bloquean la vía PD-1/PD-L1 es rescatar la función de las células T agotadas e incrementar la inmunidad antitumoral (Xia 2019). Figura 18. Vías de señalización implicadas en el eje PD-1/PD-L1 y su relación con las células tumorales. Original tomado de la referencia Kythreotou 2017. Permitido por BMJ Publishing Group Ltd. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 84 Figura 19. Vías de señalización implicadas en la activación de PD-1. Original tomado con autorización de la referencia Boussiotis 2016. Copyright Massachusetts Medical Society. Introducción 85 Como se ha mencionado previamente, en 1996, el grupo de Jim Allison encontró que un anti-CTLA4 podría aumentar la respuesta anti-tumoral de las células T, demostrando así por primera vez la viabilidad terapéutica en el bloqueo de los puntos de control inmune (Leach 1996). Diez años después se aprobaba ipilimumab. A partir de ahí empezaron a realizarse estudios clínicos con medicamentos que bloqueaban el eje PD-1/PD-L1 y de esta manera restauraban la inmunidad antitumoral mediada por células T (Herbst 2018, Topalian 2012). Los anticuerpos monoclonales que bloquean la interacción de PD-L1 y PD-1 aprobados hasta el momento son nivolumab y pembrolizumab, que se unen a PD-1, y atezolizumab, durvalumab y avelumab, que se unen a PD-L1; son conocidos en conjunto como bloqueadores de los puntos de control inmunitarios ó ICIs por sus siglas en inglés (Herbst 2018). La expresión de PD-L1 en células tumorales y en algunos casos en las células inmunes, es detectada por inmunohistoquímica, usándose esta técnica como biomarcador para predecir la respuesta a los ICIs. Como se ve en la tabla 3, hay variedad de anticuerpos con diferentes metodologías desarrolladas en paralelo para los diversos medicamentos aprobados. Los cuatro clones más ampliamente usados son Agilent 28-8 y 22C3 y Ventana SP142 y SP143. Éstos muestran positividad cuando las células tumorales son reactivas en la membrana de manera parcial o total con cualquier intensidad (Garrido 2019). Específicamente, con el clon SP142 las células inmunes dentro del área tumoral también deben ser evaluadas. En biopsias pequeñas es aceptable valorar entre 50-100 células para validar el resultado. También es posible hacerlo con citología aunque hasta el momento no hay estudios que comparen la correlación entre el resultado con la respuesta al tratamiento (Garrido 2019). Actualmente se están realizando estudios comparativos que permitan armonizar las SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 86 diferentes pruebas y así promover técnicas confiables y reproducibles (Hirsch 2017). Tabla 3. Medicamentos bloqueadores de los puntos de control inmunitarios. Original tomado de la referencia Kythreotou 2017. Permitido por BMJ Publishing Group Ltd. Según el estadio clínico del CPCNP la aplicación de los diferentes ICIs varía: - Enfermedad localizada: estudios recientes han mostrado resultados prometedores de los anticuerpos anti PD-L1 como tratamiento neoadyuvante, aunque en las guías actuales de manejo esto aún no se contempla (Ruiz-Bañobre 2019). - Estadío III no resecable: en pacientes sin progresión después de quimio/radioterapia, el tratamiento de consolidación con Durvalumab por 1 año ha mostrado un aumento en la progresión libre de enfermedad (PFS por sus siglas en inglés) y en la supervivencia global (OS por sus siglas en inglés) (Majen 2019). - Estadío IV sin mutaciones conductoras: o Primera línea: si la expresión es mayor o igual a 50% se recomienda el uso de pembrolizumab en ausencia de Introducción 87 contraindicaciones. Para pacientes con menos expresión, tanto en carcinomas escamosos como en no escamosos, resultados recientes de estudios en Fase III han mostrado beneficios en términos de eficacia y OS al añadir pembrolizumab o atezolizumab a la quimioterapia estándar de primera línea (Majem 2019). o Segunda línea: En pacientes con carcinomas escamosos y no escamosos metastásicos sin contraindicaciones y que no hayan recibido inmunoterapia previa, se puede administrar como agente único pembrolizumab, nivolumab o atezolizumab. Esta recomendación se basa en datos de estudios en Fase III que mostraron aumentos significativos en la supervivencia y en la tolerabilidad de estos agentes en comparación con docetaxel (Majem 2019). Dado que la inmunoterapia ha surgido como el nuevo tratamiento gold-standard para pacientes en estadio IV la mayoría de estos ensayos excluyeron a pacientes con alteraciones oncogénicas dado que dichas mutaciones conductoras pueden alterar la carga mutacional tumoral (TMB), la infiltración tumoral por linfocitos y la expresión de PD-L1 y por tanto los datos de respuesta a ICIs en estos pacientes, son limitados (Dantoing 2021, Remon 2018). Los estudios en estos casos por lo general son contradictorios, escasos y la mayoría dirigidos a pacientes con mutaciones en EGFR o reordenamientos en ALK. Adicionalmente, a pesar de toda la estrategia terapéutica antes mencionada, aún queda por definir claramente el rol de la expresión de PD-L1 y su relación con la supervivencia. Los datos sobre su significado pronóstico son conflictivos, con estudios como el de Cooper y Velcheti que lo señalan como factor pronóstico favorable, en contra de varios metaanálisis que afirman lo opuesto (Cooper 2015, SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 94 - Evaluar la expresión inmunohistoquímica de PD-L1 en las células tumorales. - Explorar asociaciones entre la expresión de PD-L1 y las características clínicas y moleculares de los casos. - Describir la supervivencia de los pacientes con base en la expresión de PD-L1 dado que los datos respecto a su rol como factor predictivo son poco consistentes e incluso contradictorios. III Materiales & Métodos 97 MATERIALES & MÉTODOS 1. MATERIALES 1.1 DISEÑO, CONTEXTO Y PACIENTES Este estudio observacional descriptivo incluye 103 casos de pacientes diagnosticados con carcinoma de célula no pequeña de pulmón (83 adenocarcinomas, 14 carcinomas epidermoides, 5 neuroendocrinos y 1 carcinoma no especificado NOS) entre los años 2010 a 2016 en los estadíos I (2), II (2), III (9) y IV (90). Se utilizaron biopsias obtenidas a través del Biobanco y del servicio de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, de las cuales 44 fueron biopsias bronquiales, 19 biopsias con aguja gruesa y 40 piezas quirúrgicas correspondientes al tumor primario o a su metástasis. Se evaluó la Hematoxilina-Eosina (HE) de cada caso para comprobar la presencia y cantidad de tejido tumoral necesario para las pruebas; se revisó y reclasificó de ser necesario el diagnóstico histopatológico de acuerdo a la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (WHO 2015). Como criterios de inclusión los casos seleccionados debían corresponder a pacientes fallecidos cuyo material de biopsia debía tener al menos 100 células tumorales viables para valoración y no contar con proceso previo de decalcificación para garantizar una extracción adecuada de ADN viable. Aquellos casos que no cumplían con cualquiera de las anteriores características fueron excluidos del trabajo. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 98 1.2 VARIABLES De manera retrospectiva se obtuvieron datos clínicos como edad al diagnóstico histopatológico (calculada de acuerdo a la fecha en que se tomó la muestra y se realizó el diagnóstico), fecha de fallecimiento y sexo (determinada por la revisión de la Historia Clínica en IANUS), historia de tabaquismo (se tomó en cuenta cualquier tipo de antecedente tabáquico y se subdividieron los exfumadores en aquellos con más o menos 15 años de abandono del hábito), estadio clínico (I a IV según clasificación de la séptima edición del libro del American Joint Committee on CancerAJCCanexo 1) y escala ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group – anexo 2). El tipo de muestra obtenida así como el diagnóstico histopatológico y el resultado del estado mutacional de EGFR, ALK y ROS1, éste último en caso de estar disponible, fueron tomados a partir de la información almacenada en el sistema EOS del servicio de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. De manera prospectiva se realizó prueba de PD-L1 a todos los casos y de ROS1, KRAS, BRAF y NRAS a aquellos en los que hubo material suficiente para completar el panel de pruebas moleculares. Las pruebas se realizaron de manera homogénea en todos los casos independientemente del valor de PD-L1 y de cualquier otro resultado de las pruebas moleculares. 1.3 PREVENCIÓN DE SESGOS Para prevenir sesgos de selección se definieron criterios de inclusión y exclusión que no estuviesen relacionados con la expresión de PD-L1. Materiales & Métodos 99 Para prevenir sesgos de medición todas las pruebas se realizaron uniformemente en todos los casos. Adicionalmente, los expertos que interpretaron los resultados de la expresión de PD-L1 desconocían el estado mutacional de los casos evaluados. Para reducir el fenómeno de confusión, se realizó análisis multivariable para el desenlace de supervivencia, ajustando por las variables edad al diagnóstico y tipo histológico. Las variables de confusión fueron elegidas por su relación teórica tanto con la expresión de PD-L1 como con la mortalidad. 1.4. TAMAÑO DE LA MUESTRA La naturaleza descriptiva de este estudio no requiere cálculo de tamaño de muestra. Se incluyeron todos los pacientes que cumplieron los criterios de selección durante el periodo de estudio. Las asociaciones calculadas en este estudio son netamente exploratorias. 1.5 CONSENTIMIENTO INFORMADO No fue necesario el uso del consentimiento informado, dado que todos los pacientes se encontraban fallecidos en el momento del estudio, el cual fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de Santiago-Lugo (código de registro: 2018/399) (Anexo 3). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 100 2. MÉTODOS 2.1 INMUNOHISTOQUÍMICA PD-L1 Se realizaron cortes de cada caso a 3-5 µm. Posteriormente el tejido se montó en cristales cargados y para preservar su antigenicidad, una vez montados, los cristales permanecieron a temperatura ambiente hasta su procesamiento. Se hizo desparafinación, rehidratación y recuperación antigénica por medio del sistema de pre-tratamiento PT Link: inmersión de los cristales con tejido en solución de recuperación a pH bajo (EnVision FLEX) e incubación por 20 minutos a 97°C; posteriormente y cuando la temperatura disminuye a 65°C se retiran y se realiza lavado con un tampón. Una vez realizado esto, los cristales con tejido pasan al Autostainer Link48 (Agilent) que se encarga del resto del procesamiento por medio del siguiente protocolo de inmunotinción: 1. Reactivo de bloqueo de peroxidasa (Agilent) (5 minutos). 2. Anticuerpo primario: anticuerpo monoclonal de ratón antiPD-L1 (clon 22C3 Agilent) (30 minutos). 3. Mouse LINKER (Agilent) para amplificación de señal (30 minutos). 4. Reactivo de visualización: dextrano conjugado con moléculas de peroxidasa y anticuerpos secundarios de cabra contra inmunoglobulinas de ratón y conejo en una solución tamponada con proteína estabilizante y un agente antimicrobiano (30 minutos). 5. Solución tamponada con peróxido de hidrógeno y un agente antimicrobiano (5 minutos). Materiales & Métodos 101 6. Solución de trabajo de tetrahidrocloruro de 3,3ʾdiaminobenzidina en solvente orgánico (5 minutos). 7. Solución de mejora con sulfato cúprico en agua (5 minutos). 8. Contratinción con hematoxilina EnVision FLEX (Agilent) (5 minutos). Entre los distintos puntos se realizaron lavados con solución tamponada y al finalizar el proceso se hicieron dos lavados adicionales con agua destilada. Finalmente se realizó montaje en un medio no acuoso. Cada vez que se realizaron pruebas con casos se incluyeron controles de calidad tanto negativos como positivos siendo estos: - Líneas celulares suministradas por la casa comercial (Agilent) - Amígdala (control positivo propio del laboratorio) (Figura 21) - Un segundo cristal de tumor de cada caso en el que se sustituyó el anticuerpo primario por tampón de dilución (control negativo propio del laboratorio). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 102 Figura 21. Tinción inmunohistoquímica para PD-L1 (20X). Control positivo en amígdala. 2.1.1 Valoración de la Inmunohistoquímica de PD-L1 Se revisaron los controles positivo y negativo para hacer la validación de la prueba y confirmar que los reactivos funcionaron de manera adecuada. Posteriormente, se examinó la HE de cada caso y se verificó la presencia de al menos 100 células tumorales viables. Respecto al control positivo, la intensidad general se evaluó con la siguiente escala (tabla 4): Tabla 4. Valoración de la intensidad de la inmunohistoquímica de PD-L1. 0 Negativo 1+ Débil 2+ Moderada 3+ Fuerte Materiales & Métodos 103 Se consideró el control positivo como satisfactorio cuando al menos 70% de las células presentaban tinción de membrana en promedio 2+ de intensidad. En el caso de observarse fondo, éste debía ser de menos de 1+ (Figura 22) Figura 22. Tinción inmunohistoquímica para PD-L1-(20x). Control positivo en línea celular. La valoración del control negativo se consideró satisfactoria cuando la mayoría de las células fueron negativas para la tinción. Se dieron como negativos también, aquellos controles con presencia de 10 células o menos con tinción de membrana. Al igual que en el control positivo, el fondo en estos casos debía ser inferior a 1+ (Figura 23). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 110 2.3 ANÁLISIS DEL ESTADO MUTACIONAL DE LOS GENES KRAS, NRAS Y BRAF 2.3.1 Extracción de ADN Se revisó el archivo de ADN congelado, extraído previamente para la realización de las pruebas de EGFR y se usó el excedente de material en caso de existir. Cuando éste era insuficiente o no había, se procedió al aislamiento del mismo, a partir de muestras FFPE con suficiente material, usando el kit Cobas® DNA sample preparation kit (Roche) siguiendo las indicaciones del fabricante. Se trata de un kit manual basado en la unión del ADN a fibras de vidrio de una columna. Para ello, partimos de cortes de 5µm de las muestras FFPE que desparafinamos usando xilol y etanol 100%. A continuación se lleva a cabo la lisis del tejido incubando la muestra con un tampón de lisis (TLB, tampón de lisis de tejido) y proteinasa, lo que permite la liberación de los ácidos nucleicos y protege el ADN de la acción de las DNAsas (enzimas degradadoras de ADN). La muestra se incuba durante 1 hora a 56°C y a continuación otra hora a 90°C. Posteriormente se añade el tampón PBB (tampón de unión a parafina) e isopropanol y se transfiere a una columna con fibras de vidrio. Seguidamente y mediante centrifugación, el ADN se une a la superficie del filtro de fibras eliminando al tiempo diferentes sustancias como sales, proteínas y otras impurezas celulares. Los ácidos nucleicos adheridos al filtro se lavan y eluyen en una solución acuosa. 2.3.2 Cuantificación de ADN Una vez extraído el ADN, se cuantificó usando un espectrofotómetro de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Nanodrop 1000 de Thermofischer). Para calibrarlo se usó tampón de Materiales & Métodos 111 elución y se realizaron dos mediciones por cada muestra. Aquellas muestras con cuantificación inferior a 9 ng/µl no se usaron para las pruebas. 2.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para detección de mutaciones en KRAS, NRAS y BRAF. Para la detección de mutaciones en KRAS se usó el kit KRAS Mutation Test v2 (LSR) (Roche) y para BRAF/NRAS el kit BRAF/NRAS Mutation Test (LSR) (Roche). La prueba se basa en la realización de una PCR en tiempo real, alelo-específica para la detección e identificación cualitativa de mutaciones en los exones 2, 3 y 4 de KRAS y NRAS y en los exones 11 y 15 de BRAF (tablas 6 y 7). Dicha prueba se basa en la amplificación y detección por PCR de ADNs diana, usando parejas de cebadores complementarias y oligonucleótidos marcados con tinciones fluorescentes. La detección de dichas mutaciones se realiza a través del sistema cobas z 480 (Roche). Se incluyeron controles positivos y negativos (incluidos en el kit) en cada serie analizada de casos para confirmar la validez de la carrera. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 112 Tabla 6. Mutaciones de KRAS detectadas por el kit KRAS Mutation Test v2 (LSR) (Roche). Materiales & Métodos 113 Tabla 7. Mutaciones de BRAF/NRAS detectadas por el kit BRAF/NRAS Mutation Test v2 (LSR) (Roche). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 114 La técnica fue realizada según recomendaciones del fabricante las cuales se resumen a continuación: 1. Realización de un mapa de la placa a analizar e introducirla en el sistema informático para posicionar adecuadamente cada muestra. 2. Cálculo del volumen de diluyente de DNA por muestra y dilución del mismo. 3. Cálculo del volumen a usar de las mezclas maestras (MMX) 1, 2 y 3 por serie y por kit. 4. Cálculo del volumen de cloruro de magnesio a usar por serie. 5. Realización de las mezclas maestras de trabajo (MMX + cloruro de magnesio) 1, 2 y 3 para cada kit según los cálculos previstos. 6. Cargar la mezcla de trabajo en cada columna correspondiente (25 µl en cada pocillo). 7. Pipetear los controles positivos en la posición A-01 a A-06 y los negativos en B-01 a B-06 (25 µl en cada pocillo). 8. Agregar el ADN diluido (25 µl en cada pocillo). Cada caso posicionado en su pocillo y fila correspondiente. 9. Cubrir la placa con film sellante. 10. Centrifugación de la placa. 11. Posicionar la placa en el equipo Cobas z 480 (Roche) con el programa KRAS v2 FFPET e iniciarlo. Materiales & Métodos 115 Una vez terminada la prueba, el software del equipo (cobas®4800 User Defined Workflow) automáticamente guarda y carga los datos al sistema los cuales se analizan por medio del portal “Oncology Research Kit data” al acceder al programa y pulsar analizar. El análisis de los resultados se interpreta de la siguiente manera (tablas 8 y 9): Tabla 8. Interpretación de resultados del kit KRAS Mutation Test v2 (LSR) (Roche). Resultado de la prueba Resultado de la mutación Interpretación Mutación detectada G12X (G12A, G12D, G12R, G12S, G12V) G12C G13X (G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V) A59X (A59E, A59G, A59S, A59T) Q61X (Q61E, Q61Hc, Q61Ht, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R) K117X (K117Nc, K117Nt) A146X (A146P, A146T, A146V) Mutación detectada en un área específica de la zona diana. No mutación detectada (NMD) N/A Mutación no detectada en las regiones diana. Inválida N/A Fallida N/A Fallo de la prueba por problemas de hardware o software. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 116 Tabla 9. Interpretación de resultados del kit BRAF/NRAS Mutation Test (LSR) (Roche). Resultado de la prueba Resultado de la mutación Interpretación Mutación detectada BRAF V600E/E2/D BRAF V600K BRAF V600R BRAF K601E BRAF Exon 11 (G466A, G466V, G469A, G469R, G 469V) NRAS G12X (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V) NRAS G13X (G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V) NRAS A18T NRAS Q61X (Q61Ht, Q61Hc, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R) NRAS otras mutaciones exón 3 y 4 (A59D, A59T, K117Nc, K117Nt, A146T, A146V) Mutación detectada en un área específica de la zona diana. No mutación detectada (NMD) N/A Mutación no detectada en las regiones diana. Inválida N/A Fallida N/A Fallo de la prueba por problemas de hardware o software. 2.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para la descripción general de los casos se usaron frecuencias simples, porcentajes para las variables dicotómicas, y promedios, desviaciones estándar y rango para las variables continuas. Los datos ausentes en una variable en particular fueron excluidos de la descripción de la misma. Se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones: Materiales & Métodos 117 • En la variable estado tabáquico, los sujetos exfumadores con menos de 15 años de abandono del hábito se clasificaron en una categoría aparte • La variable ECOG fue dicotomizada en mayor de 2 y menor o igual a 2 • La variable PD-L1 fue categorizada en tres niveles: menor a 1, mayor o igual a 1 y menor que 50, y mayor o igual a 50. • Para el análisis de supervivencia la variable tipo histológico fue categorizada en presencia o ausencia de adenocarcinoma. Se realizó un análisis para explorar la asociación entre la expresión de PD-L1 y los demás marcadores. Para ello se usó la versión categórica de la variable PD-L1 y se cruzó con los resultados de EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS y BRAF expresados como variables dicotómicas (negativo/positivo), excluyendo los casos no valorables o con lecturas inválidas. Al tratarse de una exploración, no se realizaron pruebas de hipótesis. Los valores ausentes fueron excluidos del cálculo de las asociaciones. No se realizaron análisis de sensibilidad. Finalmente, la relación entre la expresión de PD-L1 y la mortalidad por cualquier causa se exploró mediante análisis de supervivencia. Se estimó el tiempo desde el diagnóstico hasta el fallecimiento, excluyendo aquellos casos con fecha de muerte desconocida. Las funciones de supervivencia en cada categoría de expresión de PD-L1 se estimaron mediante el método de KaplanMeier y se compararon usando regresión de Cox, ajustando por edad al diagnóstico y adenocarcinoma. Los análisis se realizaron con el software Stata 14.1 (StataCorp. 2015. Stata Statistical Software: Release 14. College Station, TX: StataCorp LP.) IV Resultados SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 126 En cuanto a la clasificación histológica, 83 tumores correspondían a adenocarcinomas (80.6%) y 14 a carcinomas epidermoides (13.6%); el resto se distribuían entre carcinomas neuroendocrinos (5 – 4.9%) y un caso de carcinoma NOS (0.9%) (figuras 29 a 33). Las muestras se obtuvieron principalmente del tumor primario (60.2%) y los demás de la metástasis (39.8%). Figura 29. Distribución según tipo histológico 80% 13.6% 4.9% 1% Adenocarcinoma Ca. Epidermoide Neuroendocrino Carcinoma NOS Resultados 127 Figura 30. Adenocarcinoma: estructuras glandulares atípicas sobre estroma fibroso e inflamación (HE 20x) Figura 31. Carcinoma epidermoide: nidos sólidos de células tumorales malignas con disqueratocitos sobre un fondo fibroso con inflamación (HE 20x). SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 128 Figura 32. Carcinoma neuroendocrino: grupos tumorales de células con citoplasma amplio y nucleolo prominente con focos de necrosis (HE 20x). Figura 33. Positividad inmunohistoquímica para sinaptofisina en carcinoma neuroendocrino (20x). Resultados 129 3. EXPRESIÓN DE PD-L1 Se realizó estudio inmunohistoquímico para PD-L1 en los 103 casos. De éstos, el 39.8% presentaron algún tipo de positividad. El 25.24% (26 casos) tenía un TPS entre 1%-49% y el 14.56% (15 casos) un TPS ≥50%. Los casos con expresión menor al 1% correspondieron al 60.19% (62 casos) (figura 34 a 37). Figura 34.Categorías de expresión inmunohistoquímica de PD-L1. 60% 25% 15% <1% 1%-49% ≥50% SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 130 Figura 35. Tinción inmunohistoquímica para PD-L1 (20X). Carcinoma de pulmón de célula no pequeña con TPS <1% Figura 36. Tinción inmunohistoquímica para PD-L1 (20X). Carcinoma de pulmón de célula no pequeña con TPS 1-49% Resultados 131 Figura 37. Tinción inmunohistoquímica para PD-L1(20X). Carcinoma de pulmón de célula no pequeña con TPS ≥50% 4. Características moleculares Se realizó estudio molecular completo en 79 de los 103 casos (76.7%); en los restantes, no fue posible completar la totalidad de las pruebas debido a falta de material o problemas técnicos. De los 79 casos con análisis completo, 39 de ellos (47%), presentaron al menos una alteración molecular. Específicamente EGFR, ALK y ROS1 fueron analizados en 98 de los pacientes incluidos y se encontró alguna mutación o reordenamiento en el 15.3%. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 132 Puntualmente para EGFR se observaron mutaciones en el 10.67% de los casos (11), todos ellos casos de adenocarcinoma, siendo la frecuencia en este subgrupo de un 13.25%. La más usual correspondió a una mutación puntual en el exón 21 (L858R), presente en 5 casos, todos ellos con histología de adenocarcinoma y en estadio IV. La siguiente en frecuencia fue una mutación tipo deleción en el exón 19 en cuatro pacientes no fumadores, también con histología de adenocarcinoma y en estadio IV. Los dos casos restantes consistían en una doble mutación en el exón 20 (T790M) y el exón 21 (L858R) y de igual manera que los anteriores casos, eran pacientes con adenocarcinomas en estadio IV (figura 38, Tabla 11). Se observó una tendencia a detectarse la mutación en mujeres (7 de los 11 casos - 63%) y en pacientes no fumadores (8 de 11 casos – 72%) Figura 38. Estado mutacional de EGFR en todos los casos. 4% 5% 2% 89% Mutación exón 19 Mutación exón 21 Mut. en exón 20 y 21 No mutado Resultados 133 Tabla 11. Características clínicas y patológicas de los pacientes y su correlación con el estado de EGFR. (NE = neuroendocrino, NOS = no especificado). Variable EGFR MUTADO EN EXON 19 (n = 4) EGFR MUTADO EN EXON 21 (n = 5) EGFR MUTADO EN EXON 20 Y 21 (n = 2) EGFR NO MUTADO (n = 92) Edad - < 62 años - ≥ 62 años 1 (25%) 3 (75%) 1 (20%) 4 (80%) 1 (50%) 1 (50%) 45 (48.9%) 47 (51.1%) Sexo: - Hombre - Mujer 2 (50%) 2 (50%) 2 (40%) 3 (60%) 0 2 (100%) 80 (86.96%) 12 (13.04%) Historia de consumo de tabaco: - Fumador activo - No fumador - Ex fumador de más de 15 años - Ex fumador de menos de 15 años - Sin dato 0 4 (100%) 0 0 1 (20%) 3 (60%) 1 (20%) 0 1 (50%) 1 (50%) 0 0 70 (76.1%) 4 (4.34%) 16 (17.4%) 1 (1.08%) 1 (1.08%) Tipo histológico: - Adenocarcinoma - Carcinoma epidermoide - Carcinoma NE - Carcinoma NOS 4 (100%) 0 0 0 5 (100%) 0 0 0 2 (100%) 0 0 0 72 (78.27%) 14 (15.21%) 5 (5.43%) 1 (1.08%) Estadío tumoral: - I - II - III - IV 0 0 0 4 (100%) 0 0 0 5 (100%) 0 0 0 2 (100%) 2 (2.1%) 2 (2.1%) 9 (9.8%) 79 (85.9%) SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 134 Del total de los 103 casos, se observaron reordenamientos de ALK en 3 de ellos (2.91%) que representan el 3.6% de todos los adenocarcinomas. Estos pacientes eran todos hombres y con historia de consumo de tabaco (figura 39, Tabla 12). El estudio de ROS1 se realizó de manera adecuada en 100 casos, siendo 98 de ellos valorables y observándose el reordenamiento en solo uno de ellos, correspondiente a una paciente de sexo femenino de 55 años con carcinoma epidermoide y no fumadora (figura 40). Los cinco casos restantes no pudieron realizarse pues en cuatro de ellos no fue valorable la técnica y en el último no hubo material. (Tabla 12) Figura 39. Reordenamientos de ALK 3% 97% POSITIVO NEGATIVO Resultados 135 Tabla 12 .Características clínicas y patológicas de los pacientes en relación a ALK y ROS1. (NE = neuroendocrino, NOS = no especificado). Variable ALK POSITIVO (n = 3) ROS1 POSITIVO (n = 1) Edad - < 62 años - ≥ 62 años 1 (33.3%) 2 (66.6%) 1 (100%) 0 Sexo: - Hombre - Mujer 3 (100%) 0 0 1 (100%) Historia de consumo de tabaco: - Fumador activo - No fumador - Ex fumador de más de 15 años - Ex fumador de menos de 15 años - Sin dato 2 (66.6%) 0 1 (33.3%) 0 0 1 (100%) 0 0 0 Tipo histológico: - Adenocarcinoma - Carcinoma epidermoide - Carcinoma NE - Carcinoma NOS 3 (100%) 0 0 0 0 1 (100%) 0 0 Estadío tumoral: - I - II - III - IV 0 1 (33.3%) 0 2 (66.6%) 0 0 0 1 (100%) SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 142 Aunque a primera vista pensaríamos que la expresión de PD-L1 es más frecuente en hombres, al analizar de manera proporcional con todos los casos estudiados (incluyendo los negativos), encontramos que el porcentaje de mujeres con expresión es del 47.27% vs. un 38.1% en hombres. De la misma manera, el análisis de expresión entre historia de consumo de tabaco vs. pacientes que nunca han fumado, no muestra diferencias muy significativas, con una expresión de PD-L1 en el 39% en el primer grupo vs. 41% en el segundo. Finalmente, respecto a tipo histológico observamos una positividad para PD-L1 en un 43.4% de todos los adenocarcinomas vs. 25% en carcinomas epidermoides. En los casos de carcinomas neuroendocrinos y carcinoma NOS, no se detectó expresión. 6. CORRELACIÓN ENTRE EXPRESIÓN DE PD-L1 Y LAS MUTACIONES CONDUCTORAS ANALIZADAS De todos los casos estudiados para todas las pruebas moleculares (81 casos) se encontró expresión de PD-L1 en asociación a algún tipo de mutación en un 20.9%, correspondiente a 17 casos. De manera descriptiva, en el grupo con TPS 1%-49% se evidenciaron 4 casos con mutaciones en EGFR (3 en el exón 19 y 1 en el exón 20), 2 casos con reordenamientos de ALK y el único caso con reordenamiento de ROS1. Respecto a KRAS se observaron 7 casos mutados. En el grupo de TPS ≥50% solo se detectaron 3 mutaciones en KRAS, siendo el resto de alteraciones negativas. En ninguno de los grupos con expresión de PD-L1 hubo casos con mutaciones de BRAF ó NRAS. En las figuras 45 y 46 y en las tablas 15 y 16 se recogen los resultados del análisis. Resultados 143 Figura 45. Correlación entre expresión de PD-L1 y EGFR, ALK y ROS1. Figura 46. Correlación entre expresión de PD-L1 y KRAS y BRAF. 0 10 20 30 40 50 60 70 EGFR + EGFRALK+ ALKROS1+ ROS1PD-L1 Positivo PD-L1 Negativo 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 KRAS + KRAS - BRAF + BRAF - PD-L1 positivo PD-L1 negativo SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 144 Tabla 15. Correlación entre expresión de PD-L1 y mutaciones en EGFR, ALK y ROS1. Variable Total de pacientes (n = 103) Expresión de PD-L1 <1% (n =62) Expresión de PD-L1 1%-49% (n =26) Expresión de PD-L1 ≥50% (n=15) EGFR - Mutado en exón 19 - Mutado en exón 21 - Mutado en exón 20 y 21 - No mutado 4 (3.88%) 5 (4.85%) 2 (1.94%) 92 (89.32%) 1 (25%) 4 (80%) 2 (100%) 55 (59.7%) 3 (75%) 1 (20%) 0 22 (23.9%) 0 0 15 (16.3%) ALK - Positivo - Negativo 3 (2.91%) 100 (97.09%) 1 (33.3%) 61 (61%) 2 (66.7%) 24 (24%) 0 15 (15%) ROS1 - Positivo - Negativo - No valorable 1 (0.97%) 97 (94.17%) 5 (4.85%) 0 59 (60.8%) 3 (60%) 1 (100%) 24 (24.7%) 1 (20%) 0 14 (14.4%) 1 (20%) Tabla 16. Correlación entre expresión de PD-L1 y mutaciones en BRAF y KRAS. Variable Total de pacientes (n = 82) Expresión de PD-L1 <1% (n = 49) Expresión de PD-L1 1%-49% (n = 22) Expresión de PD-L1 ≥50% (n = 11 ) BRAF - Mutación en V600K - Mutación en V600R - No válido - No mutado 1 (1.22%) 1 (1.22%) 3 (3.65%) 77 (93.9%) 1 (100%) 1 (100%) 2 (66.6%) 45 (58.44%) 0 0 1 (33.3%) 21 (27.27%) 0 0 0 11 (14.28%) KRAS - Mutación G12X - Mutación G13X - Mutación Q61X - No válido - No mutado 19 (23.17%) 2 (2.44%) 2 (2.44%) 2 (2.44%) 57 (69.5%) 12 (63.15%) 1 (50%) 0 2 (100%) 34 (59.64%) 6 (31.57%) 0 1 (50%) 0 15 (26.31%) 1 (5.26%) 1 (50%) 1 (50%) 0 8 (14.03%) Resultados 145 7. EXPRESIÓN DE PD-L1 Y ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Se realizó un análisis de supervivencia por el método de Kaplan Meier comparando las diferentes categorías de expresión de PD-L1. Como se puede observar en la figura 47, la supervivencia en el grupo con TPS <1% es significativamente mayor, observándose una mediana de supervivencia de 207 días, frente a los 63 días el grupo con TPS ≥50%. Por otra parte, la categoría intermedia (TPS 1-49%) presenta una mediana de supervivencia de 129 días. En la regresión de Cox, el Hazard Ratio ajustado de la comparación TPS 1-49% vs TPS <1% fue de 1.2 (intervalo de confianza del 95% 0.77 a 2.03, p=0.365), y el de la comparación TPS ≥50% versus TPS <1% fue de 2.27 (IC95% 1.23 a 4.18, p=0.009). Figura 47. Curva de supervivencia según categorías de expresión de PD-L1. V Discusión 149 DISCUSIÓN Las estrategias actuales en el CPCNP se basan en ofrecer un tratamiento personalizado para todos los pacientes. El diagnóstico molecular para detectar las alteraciones genéticas conductoras se ha convertido en el estándar de atención y se ha establecido como método viable para seleccionar a los pacientes que van a beneficiarse de una terapia dirigida. Además, la inmunoterapia se ha convertido en una nueva opción terapéutica para aquellos pacientes que no tienen alteraciones dirigibles. Los resultados de este estudio mostraron las siguientes frecuencias en las mutaciones estudiadas: EGFR: 10.67%, ALK: 2.9%, KRAS: 28.75%, BRAF: 2.5% y NRAS: 0%. Adicionalmente, no se encontraron tendencias importantes entre las variables clínicopatológicas y moleculares con la expresión de PD-L1, sin embargo, se observó que PD-L1 tiende a expresarse en los casos con fusión en ALK y en los EGFR wild-type, estos últimos especialmente en la categoría de mayor expresión; el análisis de supervivencia mostró medianas inferiores en aquellos pacientes con alta expresión de PDL1. A continuación se detallan y discuten estos resultados en donde además de describir las características clínicas y moleculares de los tumores, se ha evaluado la relación entre estos biomarcadores (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, BRAF, NRAS) y la expresión de PD-L1 y se comparan con la literatura más reciente. SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA 150 1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS Las características clínico-patológicas de nuestra serie son muy similares a lo descrito por la literatura. La mayoría de los pacientes eran hombres con una media de edad de 62 años, fumadores y con adenocarcinomas. La tabla 17 resume los datos comparativos entre nuestros casos y algunos estudios representativos. La diferencia significativa en el número de pacientes en estadio IV puede explicarse por un sesgo de selección, dado que al inicio de nuestro estudio se planteó trabajar únicamente con pacientes en estadios avanzados para posteriormente ampliarlo con pacientes en otros estadios y poder llegar a un mínimo de 100 casos. Discusión 151 Tabla 17. Comparación entre diferentes estudios respecto a variables clínicas (ND: no dato) Variable Li et al (2017) n = 6458 Jiang et al (2017) n = 297 Lee et al (2019) n = 1000 Liu et al (2020) n = 1017 Esteban et al (2020) n = 53 Presente serie (2020) n = 103 Edad (años) 59.22 65 64 62 66.47 62 Sexo: - Hombre - Mujer 4291 (66.5%) 2167 (33.5%) 211 (71.1%) 86 (28.9%) 574 (57.4%) 426 (42.6%) 554 (54.47%) 463 (45.53%) 45 (84.9%) 8 (15.09%) 84 (81.55%) 19 (18.45%) Historia tabaquismo: - Si - No - Sin dato ND 169 (56.9%) 128 (43.1%) 454 (45.4%) 546 (54.6%) 462 (45.4%) 555 (54.6%) 44 (83.01%) 8 (15.09%) 1 (1.88%) 90 (87.4%) 12 (11.6%) 1 (0.97%) Tipo histológico: - Adenocarcinoma - Carcinoma epidermoide - Otros 3523 (54.4%) 1637 (25.35%) 1298 (20.25%) 156 (52.5%) 129 (43.4%) 12 (4.1%) 773 (77.3%) 188 (18.8%) 39 (3.9%) 863 (84.9%) 121 (11.9%) 29 (2.8%) 26 (49.05%) 26 (49.05%) 1 (1.88%) 83 (80.6%) 14 (13.6%) 6 (5.8%) Estadío tumoral: - I - II - III - IV 10.5% ND ND 53.3% ND 634 (63.4%) 176 (17.6%) 144 (14.4%) 30 (3%) ND 12 (22.63%) 21 (39.62%) 20 (37.73%) 0 2 (1.94%) 2 (1.94%) 9 (8.74%) 90 (87.38%)