Sondas fluorescentes en reacciones bioortogonales catalizadas por metales de transición

1 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA TRABAJO FIN DE GRADO Sondas fluorescentes en reacciones bioortogonales catalizadas por metales de transición Xulián Fernández González Tutores: José Luis Mascareñas Cid / María Tomás Gamasa Dpto. de Química Orgánica, Centro de Investigaciones en Química Biológica y Materiales Moleculares (CIQUS), Universidad de Santiago de Compostela Curso Académico: 2018/2019 2 D. JOSÉ LUIS MASCAREÑAS CID, Catedrático del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela. Dra. MARÍA TOMÁS GAMASA, Investigadora Juan de la Cierva del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela. CERTIFICAN: Que la memoria adjunta, titulada “Sondas fluorescentes en reacciones bioortogonales catalizadas por metales de transición”, que presenta Xulián Fernández González, ha sido realizada bajo su dirección, en los laboratorios del Centro Singular de Investigación en Química Biológica y Materiales Moleculares (CIQUS). Considerando que dicho trabajo constituye el trabajo fin de grado, autorizan su presentación en la Universidad de Santiago de Compostela. Para que así conste, firman el presente informe en Santiago de Compostela a día 5 de Julio de 2019. Fdo.: José Luis Mascareñas Cid Fdo.: María Tomás Gamasa 3 Índice: Abreviaturas…………………………………………………………………………………………………………….5 1. Resumen…………………………………………………………………………………………………………………………8 2. Introducción………………………………………………………………………………………………………. 11 2.1 Química Bioortogonal…………………………………………………………………………….12 2.1.1 Tipos de reacciones bioortogonales…………………………………………. 12 2.1.2 Antecedentes de la química bioortogonal………………………………..13 2.1.3 Reacciones de formación de enlaces………………………………………..15 2.1.4 Reacciones de rotura de enlaces………………………………………………15 2.1.4.1 Rotura de N-aliloxicarbonil y O-alilo…………………………..15 2.1.4.2 Rotura de O-propargilo y N-propargiloxicarbonilo……..19 2.2 Diseño de sondas fluorescentes……………………………………………………………. 19 2.2.1 Sondas fluorescentes en la Química Bioortogonal …………………… 20 2.2.1.1 Sondas AIE………………………………………………………………… 20 3. Objetivos…………………………………………………………………………………………………………….22 4. Resultados y discusión………………………………………………………………………………………..24 4.1 Procesos de desprotección de éteres alílicos mediados por complejos de rutenio………………………………………………………………………………………………………..25 4.2 Diseño y síntesis de sondas …………………………………………………………………… 25 4.2.1 Síntesis de la sonda A……………………………………………………………… 26 4.2.2 Síntesis de la sonda B……………………………………………………………… 28 4.2.3 Síntesis de la sonda C……………………………………………………………… 29 4.3 Estudios en células vivas………………………………………………………………………. 30 4.3.1 Estudio de la sonda A……………………………………………………………… 31 4 4.3.2 Estudio de la sonda B……………………………………………………………… 33 4.3.3 Estudio de la sonda C………………………………………………………………. 35 5. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………..…. 37 6. Bibliografía………………………………………………………………………………………………………….40 7. Anexos………………………………………………………………………………………………………………..43 7.1 Anexo I: Procedimiento experimental…………………………………………………… 44 7.2 Anexo II: Espectros…………………………………………………………………………………57 5 ABREVIATURAS λex: longitud de onda de excitación λem: longitud de onda de emisión δ: desplazamiento químico µM: micromolar AcOEt: acetato de etilo ADN: ácido desoxirribonucleico AIE: aggregation-induced emission alloc: aliloxicarbonilo c: cuartete CEF: Chicken Embryonic Fibroblasts cod: 1,5-ciclooctadieno Cp*: pentametilciclopentadieno CuAAC: Copper azyde-alkyne cycloaddition d: doblete dd: doble doblete dt: doblete triplete dba: dibencilidenacetona DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona DMEM: Dubelcco’s Modified Eagles’s Medium DMF: N,N-dimetilformamida DMSO: dimetilsulfóxido ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay 6 Eq.: equivalente EtOH: etanol GSH: glutationa h: horas HeLa: Henrietta Lacks HPLC: high performance liquid chromatography Hz: hertzios J: constante de acoplamiento L: ligando m: multiplete o señal sin resolver Me: metilo MeOH: metanol mg: miligramos min: minutos mM: milimolar nm: nanómetros Nu: nucleófilo Ph: fenilo poc: propargiloxicarbonilo Rf: factor de retención RMN: resonancia magnética nuclear ROS: Reactive oxygen species s: singulete 7 t: triplete t.a.: temperatura ambiente TFA: ácido trifluoroacético TLC: Thin Layer Chromatography TON: turnover numbers TsOH: ácido p-toluenosulfónico 8 1. RESUMEN 9 La química bioortogonal ha supuesto una revolución en los últimos años pues permite llevar a cabo reacciones en medios biológicos e incluso dentro del ambiente celular, sin que éste vea alterado sus procesos biológicos habituales. El desarrollo de un número creciente de reacciones organometálicas compatibles con medio acuosos ha impulsado el estudio de estas transformaciones en medio biológicos complejos e incluso medios celulares. De estos avances surge la necesidad de disponer de estrategias para la monitorización de estas reacciones en tiempo real en el interior celular, por ejemplo, mediante el uso de microscopía y de sondas fluorescentes. En este estudio se plantea el diseño y síntesis de sondas fluorescentes para estudiar reacciones de desprotección de éteres alílicos promovidas por complejos de rutenio en el interior de células HeLa. Las sondas preparadas poseen propiedades fluorescentes que se pueden modular químicamente. Esta modulación consiste en la protección de grupos hidroxilo con un grupo alilo, lo que provoca una desactivación de la fluorescencia o un cambio en la longitud de onda de emisión. La fluorescencia se ve activada de nuevo mediante la reacción de desprotección promovida por rutenio. Precisamente, esta diferencia en la señal de fluorescencia entre la sonda protegida y la sonda desprotegida nos permite controlar el avance de esta reacción bioortogonal. Resumo: A química bioortogonal supuxo unha revolución nos últimos anos pois permite levar a cabo reacción en medios biolóxicos e incluso dentro do ambiente celular, sen que este vexa alterado os seus procesos biolóxicos habituais. O desenvolvemento dun número crecente de reaccións organometálicas compatíbeis con medios acuosos impulsou o estudo de estas transformacións en medios biolóxicos complexos e ata en medios celulares. A partir destes avances xorde a necesidade de ter estratexias para a monitorización de estas reaccións en tempo real no interior celular, por exemplo, mediante o uso da microscopía e das sondas fluorescentes. Neste estudo planéase o deseño e síntese de sondas fluorescentes para estudar reaccións de desprotección de éteres alílicos promovidas por complexos de rutenio no interior de células HeLa. 16 Este tipo de transformación también se ha empleado para la eliminación catalítica de grupos aliloxicarbonilo (alloc) pertenecientes a carbamatos o carbonatos, generándose los correspondientes alcoholes y aminas (Esquema 2). Esquema 2: Desprotección de aminas y alcoholes protegidos por aliloxicarbonilo Como se ha mencionado antes, Meggers4 describió la desprotección promovida por complejos de rutenio de aminas partiendo de sus correspondientes carbamatos en agua y en presencia de tioles como nucleófilos de sacrificio. En particular, aminas protegidas por un grupo alloc reaccionan con cantidades catalíticas de [Cp*Ru(cod)Cl] en presencia de exceso de PhSH (Esquema 3a). Esta reacción puede llevarse a cabo en medio celular (células HeLa) usando alloc-rodamina 110 como sonda fluorogénica que después de la desprotección del grupo alloc, exhibe una intensa señal fluorescente (Esquema 3b). Esquema 3: Rotura de aliloxicarbonilo catalizada por Ru(II) En este contexto, nuestro grupo de investigación en 2014 describió el primer ejemplo de una reacción de desprotección de grupos alloc que protegían agentes de unión de ADN en medios acuosos complejos e incluso en células16 (Esquema 4). 17 Esquema 4: Generación del agente de unión de ADN mediante una reacción de desprotección promovida por Ru Una de las principales limitaciones de las reacciones descritas anteriormente es la necesidad de la presencia de tiofenol como nucleófilo en el medio. Para solucionar este problema Meggers y colaboradores desarrollaron un nuevo catalizador de Ru basado en el complejo de Kitamura (Esquema 5a)17 que presenta una gran eficiencia en la desprotección de grupos alloc, y que permite el uso de GSH como nucleófilo de sacrificio (Esquema 5b). Esquema 5: Rotura catalítica de alilcarbamatos El mecanismo propuesto se presenta en el Esquema 6. El intermedio I de Ru(II) experimenta un intercambio de ligando con la olefina para generar el intermedio II. Se forma el complejo π-alilo III con la consecuente liberación de la amina y CO2. Finalmente, un ataque nucleófilo al complejo π-alilo genera el intermedio de Ru(II) IV recuperándose la especie catalíticamente activa II tras un intercambio de ligando. Cabe destacar que esta reacción se lleva a cabo sin ninguna dependencia de GSH lo que nos indica que el proceso no se ve afectado por la alta concentración de tioles en el medio celular.18 En presencia de un nucleófilo fuerte (GSH) la desprotección (formación de III a partir de II) se convierte en el paso determinante. Sin embargo, en presencia de 18 nucleófilos más suaves el proceso de alilación se convierte en el determinante (formación de IV a partir de III). Esquema 6: Propuesta del mecanismo de desprotección del grupo aliloxicarbonilo Nuestro grupo de investigación ha desarrollado una nueva generación de complejos de rutenio, que están dotados de grupos directores permitiendo a los complejos dirigirse y acumularse en orgánulos específicos (mitocondrias, retículo endoplasmático, etc.). Estos complejos presentan un valor añadido, pues poseen una mejor internalización celular. Por ejemplo, el complejo Ru0 presenta un grupo fosfonio que tiene gran afinidad hacia la mitocondria (Figura 3).19 Además, para favorecer la visualización de los complejos en el interior celular se han incorporado al grupo director fosfonio grupos fluorescentes como el pireno. La actividad intracelular de estos complejos se ha estudiado en la reacción de desprotección de alloc-rodamina 110. 19 Figura 3: Complejo de Rutenio con grupo director con afinidad hacia las mitocondrias 2.1.4.2 Rotura de O-propargilo y N-propargiloxicarbonilo (poc) La desprotección de amina protegidas con el grupo propargiloxicarbonilo o alcoholes propargílicos ha sido descrita con complejos de Pd(0), Pd (II) y Pd(IV) (Esquema 7).20 Esquema 7: Rotura del grupo protector propargiloxicarbonilo El primer ejemplo de desprotección propargílica catalizada por complejos de Pd fue desarrollado por Chen y colaboradores. 20a Se trata de la desprotección de poc-rodamina 110 (Esquema 8). Esquema 8: Desprotección de grupo propargiloxicarbonilo La rotura del enlace 0-alenilo constituye otro ejemplo de reacción bioortogonal promovida por complejos de Pd.21 2.2 Diseño de sondas fluorescentes En las últimas décadas se han desarrollado métodos que permiten la detección de biomoléculas de una manera efectiva (HPLC, ELISA, etc). Sin embargo, estos métodos necesitan de un instrumental especializado y complicado que requiere conocimientos previos del operador. En los últimos años las sondas fluorescentes han aparecido como sustitutas idóneas de los métodos anteriores, debido a su gran sensibilidad y especificidad, la posibilidad de realizar una detección al momento, una respuesta rápida, baja citotoxicidad, bioortogonalidad, y la compatibilidad con células vivas, tejidos e incluso pequeños animales vivos.22 Algunos parámetros a tener en cuenta a la hora del diseño de sondas son: 20 • La reacción de la sonda tiene que presentar una alta especificidad y selectividad. Estas sondas deben de ser capaces de realizar su función incluso estando en un medio tan complicado como el biológico. • La sonda debe presentar baja citotoxicidad, un requerimiento indispensable en la química bioortogonal a desarrollar. • La sonda debe presentar una alta permeabilidad que le permita una fácil internalización intracelular. • La señal fluorescente debe ser intensa, así como fotoestable en el tiempo. • La excitación ideal de la sonda debería producirse en longitudes de ondas cercanas al rojo lejano o cercanas al infrarrojo. Longitudes menores provocarían daño celular. 2.2.1 Sondas fluorescentes en la Química Bioortogonal A pesar de que la química bioortogonal se encuentra en un proceso de expansión constante y de los esfuerzos en el desarrollo de nuevas transformaciones biocompatibles, existe un número muy limitado de sondas que nos permitan llevar a cabo una monitorización en tiempo real de los procesos en las células vivas. Para la detección de los productos generados necesitamos una técnica muy potente como es la microscopía de fluorescencia. Y por ello, las sondas fluorogénicas son más necesarias que nunca. Se trata de estructuras que presentan fluorescencia latente mediante modulación química. En este trabajo la modulación será la protección de grupos funcionales. La modulación química puede tanto activar como desactivar la fluorescencia (ON->OFF), provocar que la sonda protegida y la sonda desprotegida emitan a longitudes de onda diferentes (ON->ON), etc. Mediante un proceso adecuado de activación, se consigue activar las sondas fluorogénicas y convertirlas en las correspondientes sondas fluorescentes. 2.2.1.1 Sondas AIE Dentro de los diferentes tipos de sondas fluorescentes existe una clase que merece mención especial: las sondas AIE (“aggregation-induced emisión”).23 Antes del descubrimiento de estas sondas, se conocía que la agregación de las moléculas conducía a una disminución de la señal de fluorescencia. Precisamente, en las sondas AIE ocurre 21 el proceso contrario. Mientras que en disolución presentan una nula emisión de fluorescencia, si se encuentran en un estado agregado exhiben una emisión de fluorescencia intensa característica. Las sondas AIE presentan poca citotoxicidad, bioortogonalidad y una alta estabilidad en la emisión de fluorescencia, lo que las convierte en sondas con una alta aplicación en la monitorización de reacciones bioortogonales. Las sondas AIE fueron descritas por primera vez por Tang y colaboradores en el año 2001,24 y desde ese momento, su estudio ha experimentado un gran auge. Aunque el mecanismo no está del todo claro, se ha propuesto que la restricción de la rotación intramolecular, así como de las vibraciones intramoleculares y, por tanto, de los movimientos internos de la molécula, son los causantes de esta emisión anómala de fluorescencia.23c Ilustración 1:25 Ejemplos de la emisión de diferentes sondas AIE en disolución (S) y en estado agregado (A) 22 3. OBJETIVOS 23 Nuestro principal objetivo en este trabajo es el diseño y síntesis de sondas que nos permiten monitorizar en tiempo real reacciones bioortogonales promovidas por complejos de metales de transición en medios celulares. En concreto, en este trabajo se estudiará la reacción de desprotección de éteres alílicos, mediada por complejos de rutenio. Para ello se van a diseñar sondas fluorescentes que presentan un fenol en su estructura. La protección del alcohol con un grupo alilo provoca un cambio en las propiedades fluorescentes de las moléculas. La desprotección de este grupo promovida por complejos de rutenio genera una señal fluorescente que permite evaluar el avance de la reacción en el interior celular. Tabla 1: Cronograma de actividades Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Búsqueda bibliográfica X X Síntesis de sondas X X X X Experimentos en células X X X Seminarios CiQUS X X X X X X Seminarios grupo X X X X X X Escritura del trabajo X X 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 4.1. Procesos de desprotección de éteres alílicos mediados por complejos de rutenio Dada la amplia experiencia y conocimiento en este campo, este grupo ha desarrollado una serie de complejos de rutenio activos en la desprotección de éteres alílicos en el interior celular (Figura 4a).19 Se trata de especies biocompatibles, no citotóxicas y estables en el medio celular. Además, se ha conseguido dirigir y acumular complejos en compartimentos celulares específicos. La estructura de estos complejos (Figura 4b) se basa en el complejo desarrollado por Meggers que a su vez es una modificación del de Kitamura.17 El complejo consta de tres elementos importantes: un ligando 2quinolidincarboxilato (Ru1 y Ru2) o 8-hidroxiquinolina (Ru3) al que se le une una cadena con la adecuada hidrofobicidad para permitir la internalización celular que a su vez sirve de punto de anclaje para el tercer elemento, el grupo director hacia el compartimento celular deseado. Para facilitar su visualización en medio celular el grupo director posee un grupo fluorescente aromático que proporciona fluorescencia al complejo (pireno, Ru1 y Ru2). A continuación, se presentan los complejos usados a lo largo de este trabajo: Figura 4: a) Reacción de desprotección promovida por Ru(II); b) Complejos de Ru usados en este trabajo 4.2 Diseño y síntesis de sondas El número de sondas fluorogénicas desarrolladas es muy escaso, cuando se compara con el número creciente de transformaciones que se pueden llevar a cabo en medios celulares. Esto puede ser debido, en parte, a la complejidad el medio celular, así como 32 Figura 6: a) Reacción de desprotección que tiene lugar en medio celular; b) Micrografías de fluorescencia en células HeLa: (A) Células tratadas con sonda A; B) Células tratadas con Ru1 y sonda A (λex=385 nm, λem>520 nm); C) Células tratadas con Ru1 y sonda A (λex=385 nm, λem=450-500 nm) En la Figura 6 se recogen las imágenes de estos estudios. En el panel A aparecen células tratadas únicamente con la sonda A. Como se puede observar, no existe señal fluorescente, lo que corrobora el comportamiento adecuado de este compuesto como sonda fluorogénica. En los paneles B y C se muestra la señal intensa de fluorescencia generada intracelularmente tras la incubación con el complejo y el sustrato, siguiendo el protocolo previamente especificado. La sonda presenta fluorescencia al excitar a 385 nm con longitudes de emisión entre 520-550 y 450-500 nm (paneles B y C, respectivamente). También cabe destacar que en estos paneles se observa la formación característica de un agregado que presenta una fluorescencia muy intensa propia de los AIEs. Se confirma que la señal fluorescente emitida corresponde con el producto de reacción, al incubar directamente las células con producto (Figura 7, paneles A y B). También demostramos que la señal residual del complejo (fluorescencia del grupo pireno) no interfiere en la señal del producto (Figura 7, paneles C y D). Sonda A 4 3 33 Figura 7: (A, B): Células tratadas con el producto 3: A) (λex=385 nm, λem>520 nm); B) (λex=385 nm, λem=450-500 nm); (C, D) Células tratadas con Ru1: C) (λex=385 nm, λem>520 nm); D) (λex=385 nm, λem=450-500 nm) 4.3.2 Estudio de la sonda B1 Las células son incubadas con 50 µM del complejo Ru3 durante 30 min en DMEM (400 µL). A continuación, se realizan los 3 lavados pertinentes con DMEM (400 µL). Las células se incuban con sonda B1 (100 µM) durante 90 min (Figura 8). De nuevo, en paralelo se realizan los controles correspondientes (células incubadas únicamente con la sonda B1 durante 90 min, células incubadas únicamente con los complejos durante 30 min (50 µM), así como células incubadas únicamente con el producto durante 90 min (100 µM). a) 34 Figura 8: a) Reacción de desprotección que tiene lugar en medio celular; b) Micrografías de fluorescencia en células HeLa: A) Células tratadas con sonda B1; B) Células tratadas con Ru3 y sonda B1 (λex=385 nm, λem>520 nm) En la Figura 8 se muestran las imágenes procesadas de estos experimentos. En el panel A las células han sido tratadas únicamente con la sonda B1. Como se puede observar, no existe señal fluorescente, tal y como cabe esperar de una sonda fluorogénica. En el panel B se muestra la señal intensa de fluorescencia generada intracelularmente tras la incubación con el complejo Ru3 y el sustrato, siguiendo el protocolo previamente especificado. La sonda presenta fluorescencia al excitar a 385 nm con longitudes de emisión a partir de 520 nm. Al igual que en el caso interior, aparece en el panel B de la Figura 8 un agregado que presenta una fluorescencia muy intensa propia de los AIEs. Figura 9: Micrografías de fluorescencia en células HeLa: A) Células tratadas con el producto 16; B) Células tratadas con Ru3 En la Figura 9, panel A, se muestran células incubadas únicamente con el producto. Es llamativa la formación de un precipitado fluorescente extracelular. Esto significa que el producto precipita y forma agregados fluorescentes en el medio celular, lo que impide b) 35 su internalización. Sin embargo, cuando las células se incuban con la sonda B1 (Figura 8 panel A) no se observan estos precipitados. Esto es debido a que la protección del grupo OH impide la agregación, favoreciendo por tanto su internalización y la posterior generación del producto en el interior de las células. En el panel B, se observa la nula emisión de fluorescencia por parte del complejo Ru3. 4.3.3 Estudio de la sonda C Las células son incubadas con 50 µM de los complejos de rutenio Ru1 y Ru2 durante 30 min en DMEM (400 µL). A continuación, se realizan los 3 lavados pertinentes con DMEM (400 µL). Las células se incuban con la sonda C (100 µM) durante 4 h. De nuevo, en paralelo se realizan los controles correspondientes (células incubadas únicamente con la sonda C durante 4 h (100 µM), células incubadas únicamente con los complejos (50 µM) durante 30 min, así como de células incubadas únicamente con el producto (100 µM) durante 4 h. Figura 10: a) Reacción de desprotección que tiene lugar en medio celular; b) Micrografías de fluorescencia en células HeLa: A) Células tratadas con sonda C; B) Células tratadas con Ru1 y sonda C; C) Células tratadas con Ru2 y sonda C (λex=650 nm, λem= 675-725 nm) b) a) b) 36 Al igual que en los casos anteriores podemos observar los resultados de los experimentos en las imágenes recogidas en la Figura 10. En el panel A se muestran células tratadas únicamente con la sonda C protegida. Como se puede comprobar existe una emisión de fluorescencia residual. Los paneles B y C desvelan un aumento en la intensidad de la señal de fluorescencia al incubar con el sustrato las células previamente tratadas con los complejos de rutenio, siguiendo el protocolo previamente especificado. La sonda presenta fluorescencia al excitar a 650 nm con longitudes de emisión entre 700-750 nm. Figura 11: A) Células tratadas con el producto 13 durante 4 h (λex=650 nm, λem=675-725 nm); B) Células tratadas con Ru1; C) Células tratadas con Ru2 La Figura 11, panel A, muestra células incubadas únicamente con el producto, observándose emisión similar de fluorescencia. En el panel B y C se observa como Ru1 y Ru2 no presentan emisión de fluorescencia en las longitudes de onda utilizadas. Teniendo en cuenta toda la información adquirida a lo largo de este estudio en células vivas, se puede concluir que las sondas sintetizadas son sondas bioortogonales. Las células no ven alterada su morfología tras el tratamiento con las mismas. Asimismo, tampoco se observa un descenso en su viabilidad. Además, son sustratos fácilmente internalizables. Finalmente son desprotegidas en el interior de las células por los complejos de rutenio. Por todo ello, cumplen con el objetivo de poder monitorizar el avance de una reacción intracelular, pudiendo diferenciarse perfectamente las distintas señales de fluorescencia emitidas por los sustratos y los productos. 37 5. CONCLUSIONES 38 En este trabajo se ha planteado el diseño y síntesis de sondas fluorescentes que permiten la monitorización en tiempo real de una reacción bioortogonal en el interior de células vivas. Se han preparado 4 sondas fluorogénicas tipo AIE (4, 6, 9a y 9b) que exhiben altos niveles de fluorescencia en estado agregado. También se ha sintetizado la sonda fluorescente ON->ON 14 en la que el sustrato y el producto emiten a longitudes de onda diferentes (favoreciendo así la monitorización de los procesos). Además, presenta la ventaja añadida de emitir en el IR, convirtiéndose en una sonda ideal para futuros estudios en organismos más complejos. Estas sondas fluorescentes se han utilizado para estudiar reacciones de desprotección de éteres alílicos promovidas por complejos de rutenio en el interior de células vivas HeLa. Las sondas presentan baja citotoxicidad y alta biocompatibilidad al no observarse ningún efecto adverso. Los resultados obtenidos en este trabajo nos animan a profundizar en la investigación del uso de sondas fluorescente como sustratos en reacciones promovidas por rutenio. Asimismo, también se puede modificar su estructura para ser empleadas en reacciones mediadas por otros metales de transición. La química bioortogonal está aún en su infancia dentro de la química biológica, pero sus potenciales aplicaciones auguran un gran futuro apoyado en el desarrollo de la microscopía fluorescente. Conclusións: Neste traballo planeouse o deseño e síntese de sondas fluorescentes que permiten a monitorización en tempo real dunha reacción bioortogonal no interior de células vivas. Presentáronse 4 sondas fluoroxénicas tipo AIE (4, 6, 9a y 9b) que exhiben altos niveis de fluorescencia en estado agregadoTamén se sintetizou a sonda fluorescente ON->ON 14 na que o substrato e o produto emiten a lonxitudes de onda diferentes (favorecendo así a monitorización dos procesos). Ademais, presenta a vantaxe engadida de emitir no IR, converténdose nunha sonda ideal ara futuros estudos en organismos máis complexos. 39 Estas sondas fluorescentes utilizáronse para estudar reaccións de desprotección de éteres alílicos promovidas por complexos de rutenio no interior de células vivas HeLa. As sondas presentan baixa citotoxicidade e alta bioortogonalidade ao non observarse ningún efecto adverso. Os resultados obtidos neste traballo anímannos a afondar na investigación do uso de sondas fluorescentes como substratos en reaccións promovidas por complexos de rutenio. Asimesmo, tamén se pode modificar a súa estrutura para ser empregadas en reaccións mediadas por outros metais de transición. A química bioortogonal está aínda na súa infancia , pero as súas potenciais aplicacións auguran un gran futuro apoiado no desenvolvemento da microscopía fluorescente Conclusions: In this work, the design and synthesis of fluorescent probes that allow real-time monitoring of a bioorthogonal reaction inside living cells has been proposed. Four AIE-type fluorogenic probes (4, 6, 9a and 9b) have been prepared that exhibit high levels of fluorescence in an aggregated state. The fluorescent probe ON-> ON 14 was also synthesized in which the substrate and the product emit at different wavelengths (thus favoring the monitoring of the processes). In addition, it presents the added advantage of emitting in the IR, becoming an ideal probe for future studies in more complex organisms. These fluorescent probes have been used to study deprotection reactions of allylic ethers promoted by ruthenium complexes inside living HeLa cells. The probes show low cytotoxicity and high biocompatibility since adverse effects are not appreciated. The results obtained in this work encourage us to further explore the use of fluorescent probes as substrates in reactions promoted by ruthenium. Likewise, its structure can also be modified to be used in reactions mediated by other transition metals. Bioorthogonal chemistry is still in its infancy within biological chemistry, but its potential applications augur a great future supported by the development of fluorescent microscopy. 40 6. BIBLIOGRAFÍA 41 1 (a) T. Völker, E. Meggers, Curr. Opin. Chem. Biol. 2015, 25, 48; (b) E. M. Sletten, C. R. Bertozzi, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974. 2 L. Vigh, F. Joó, Á. Cséplö, Eur. J. Biochem. 1985, 146, 241. 3 (a) V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. 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Ed. 2012, 51, 3897. 48 mediante cromatografía flash sobre sílica gel, usando como eluyente hexano/AcOEt 3:1. Se obtiene 528 mg de producto 5 como un sólido blanquecino. Aspecto: sólido blanquecino Rf (Hexano/AcOEt 3:1): 0.36 Rendimiento: 46% Los datos espectroscópicos de 5 están de acuerdo con los descritos por S. Vedachalam, Q. Wong, B. Maji, J. Zeng, J. Ma, X. Liu, Adv. Synth. Catal., 2011, 353, 219. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 10.39 (s, 1H, CHO), 7.79 (d, 1H, CHAr), 7.50 (dd, 1H, CHAr), 7.08 (d, 1H, CHAr), 4.82 (d, 2H, CH2), 2.58 (t, J = 2.4 Hz, 1H, CCH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm) 188.1, 158.1, 135.2,128.0, 127.4, 126.3, 114.9, 77.3, 76.7, 56.7. 6-Cloro-2-[5-cloro-2-(prop-2-in-1-iloxi)fenil]quinazolin-4(3H)-ona 6 En un matraz de 100 mL se añade 5-cloro-2-(prop-2-in-1-iloxi)benzaldehido 5 (0.22 g, 1.12 mmol, 1 eq.), 2-amino-5-clorobenzamida 1 (0.190 g, 1.12 mmol, 1 eq.), TsOH.H2O ( 0.02 g, 1.12 mmol, 0.1 eq.) y EtOH ( 10 mL). La disolución de color crema se calienta a 80 °C a reflujo durante 1 h. Una vez pasada la hora, la disolución se enfría con un baño de hielo. Se añade DDQ (0.25 g, 1.12 mmol, 1 eq.) agitando la mezcla durante 1h a 0 °C, observándose la formación de un precipitado color blanquecino. Se filtra el sólido y se lava con EtOH frío (3x10 mL). Tras la eliminación de disolventes a presión reducida, se obtiene 0.22 g del producto 6 como un sólido blanquecino/grisáceo. Aspecto sólido blanquecino/grisáceo Rf (Hexano/AcOEt 3:1): 0.21 Rendimiento: 57% 49 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 10.74 (s, 1H, NH), 8.51 (s, 1H, CHAr), 8.26 (s, 1H, CHAr), 7.73 (t, 2H, CHAr), 7.48 (d, 1H, CHAr), 7.15 (d, 1H, CHAr), 4.95 (m, 2H, OCH2), 2.65 (s, 1H, CCH). 2-(Aliloxi)benzaldehido 8a En un matraz de 50mL se introduce salicilaldehido 7 (0.61 g, 5 mmol, 1 eq.) que se disuelve en 15 mL de DMF. A continuación, se añade K2CO3 (0.83 g, 6 mmol, 1.2 eq.). Finalmente se adiciona bromuro de alilo (0.72 g, 6 mmol, 1.2 eq.). La disolución se agita durante 15 h a temperatura ambiente. El avance de la reacción se controla mediante TLC. Transcurridas 15 h se observa la desaparición completa de los productos de partida. Se procede a la adición de H2O (50 mL) y CH2Cl2 (25 mL), separándose las diferentes fases. La fase acuosa se extrae con CH2Cl2 (3x25 mL). La fase orgánica se lava con una disolución acuosa saturadas de NaCl (50mL). La fase orgánica resultante se seca con MgSO4 anhidro, se filtra y se seca el disolvente con presión reducida. El DMF remanente se elimina mediante la línea de alto vacío. El crudo de la reacción se purifica mediante cromatografía flash sobre silica gel usando hexano/AcOEt 3:1 como eluyente. Se obtienen 0.65g de producto 8a como un sólido blanco. Aspecto: sólido blanco Rf (Pentano/EtOAc 95:5): 0.23 Los datos espectroscópicos están de acuerdo con los descritos por K. Hirano, A. T. Biju, I. Piel, F. Glorius, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14190. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 10.49 (s, 1H, CHO), 7.79 (dd, 1H, HAr), 7.51-7.45 (m, 1H, HAr), 7.00-6.92 (m, 2H, HAr), 6.03 (ddt, 1H, CH=CH2), 5.41 (ddd, 1H, CH=CH2), 5.29 (dd, 1H, CH=CH2), 4.61 (dt, 2H, OCH2); 13C NMR (100 MHZ, CDCl3): δ (ppm) 189.6, 160.9, 135.9, 132.4, 128.3, 125.0, 120.8, 118.0, 112.9, 69.1. 50 1,2-bis[(E)-2-(Aliloxi)benzilideno]hidrazina 9a En un matraz de 100 mL, se introduce 2-(aliloxi)benzaldehido 8a (0.41 g, 2.55 mmoles, 2.05 eq.) que se disuelven en 20 mL de EtOH. Se adiciona hidracina monohidratada (60 µL, 1.24 mmol, 1 eq.) lentamente. La disolución de coloración amarilla se agita a temperatura ambiente durante 24 h. Finalizado este tiempo, se observa la aparición de un precipitado amarillo. El precipitado se filtra y se lava con EtOH frío (3x30 mL). Tras la eliminación del disolvente a presión reducida, se obtienen 0.37g de producto 9a como un sólido amarillo. Aspecto: sólido amarillo Rendimiento: 45% 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 9.13 (s, 2H, -CH=N), 8.13 (dt, 2H, HAr), 7.40 (t, 2H, HAr), 7.02 (t, 2H, HAr), 6.93 (d, 2H, HAr), 6.08 (m, 2H,2x -CH=CH2), 5.47 (d, 2H, CH=CH2), 5.31 (d, 2H, CH=CH2), 4.62 (d, 4H, OCH2);13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ (ppm) 157.8 (2xCAr), 157.8 (2xC=N), 133.2 (2xCH=CH2), 132.5 (2xCHAr), 127.7 (2xCHAr), 123.4 (2xCAr), 121.3 (2xCHAr), 118.1 (2xCH=CH2), 112.7 (2xCHAr), 69.4 (2x-OCH2). 2-(Aliloxi)-5-clorobenzaldehido 8b En un matraz de 50 mL se introduce 5-clorosalicilaldehido 2 (0.78 g, 5 mmol, 1 eq.) que se disuelve en 15 mL de DMF. A continuación, se añade K2CO3 (0.83 g, 6 mmol, 1.2 eq.). 51 Finalmente se adiciona bromuro de alilo (0.72 g, 6 mmol, 1.2 eq.). La disolución se agita durante 15 h a temperatura ambiente. El avance de la reacción se controla mediante TLC. Transcurridas 15 h se observa la desaparición completa de los productos de partida. Se procede a la adición de H2O (50 mL) y CH2Cl2 (25 mL), separándose las diferentes fases. La fase acuosa se extrae con CH2Cl2 (3x25 mL). La fase orgánica se lava con una disolución acuosa saturada de NaCl (50mL). La fase orgánica resultante se seca con MgSO4 anhidro, se filtra y se seca el disolvente con presión reducida. El DMF remanente se elimina mediante la línea de alto vacío. El crudo de la reacción se purifica mediante cromatografía flash sobre silica gel usando hexano/AcOEt 3:1 como eluyente. Se obtienen 0.87 g de producto 8b como un sólido blanco. Aspecto: sólido blanco Rendimiento: 89% Rf= (Pentano/EtOAc 95:5): 0.30 Los datos espectroscópicos están de acuerdo con los descritos por K. Hirano, A. T. Biju, I. Piel, F. Glorius, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14190. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 10.43 (s, 1H, CHO), 7.75 (d, 1H, HAr), 7.48-7.40 (m, 1H, HAr), 6.92 (d, 1H, HAr), 6.12-5.96 (m, 1H, CH=CH2), 5.43 (dd, 1H, CH=CH2), 5.34 (dd, 1H, CH=CH2), 4.63 (dd, 2H, OCH2); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm) 188.5, 159.4, 135.4, 132.0, 128.0, 126.6, 126.0, 118.6, 114.6, 69.7. 1,2-bis[(E)-2-(Aliloxi)-5-clorobenzilideno]hidrazina 9b 52 En un matraz de 100 mL, se introduce 2-(aliloxi)-5-clorobenzaldehido 8b (0.5 g, 2.55 mmol, 2.05 eq.) que se disuelven en 20 mL de EtOH. Se adiciona hidracina monohidratada (60 µL, 1.24 mmol, 1 eq.) lentamente. La disolución de coloración amarilla se agita a temperatura ambiente durante 24 h. Finalizado este tiempo, se observa la aparición de un precipitado amarillo. El precipitado se filtra y se lava con EtOH frío (3x30 mL). Tras la eliminación del disolvente a presión reducida se obtienen 0.42 g de producto 9b como un sólido amarillo. Aspecto: sólido amarillo Rendimiento: 42% 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 9.05 (s, 2H, CH=N), 8.13 (d, 2H, HAr), 7.38 (dd, 1H, HAr), 7.35 (d, 1H, HAr), 6.89 (d, 2H, HAr), 6.01 (m, 2H, CH=CH2), 5.46 (d, 2H, CH=CH2), 5.36 (d, 2H, CH=CH2), 4.64 (d, 4H, 2xOCH2). 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ (ppm) 157.1 (2xCAr), 157.0 (2xHC=N), 132.7 (2xCH=CH2), 132.2 (2xCHAr), 127.3 (2xCHAr), 126.6 (2xCAr), 124.7 (2xCAr), 118.5 (2xCH=CH2), 114.2 (2xCHAr), 69.8 (2xOCH2). 2-(3,5,5-Trimetilciclohex-2-en-1-ilideno)malononitrilo 11 En un schlenk bajo atmosfera de N2 se introcuce la isoforona 10 (0.92 g, 6.67 mmol, 1eq.) y 10 mL de EtOH. Sobre la disolución resultante, se adiciona malononitrilo (0.53 g, 8.07 mmol, 1.2eq.) y 116 µL de piperidina. La disolución de color marrón se calienta a 80 C a reflujo, bajo atmósfera de N2 durante 12h. Finalizado este tiempo, la disolución adquiere una tonalidad más oscura. Se elimina el disolvente a presión reducida. A continuación, se añade H2O (10 mL) y CH2Cl2 (10mL) separándose las fases. La fase acuosa es extraída dos veces con CH2CL2 (2X10mL). La fase orgánica se seca con MgSO4 anhidro, se filtra y el disolvente es eliminado a presión 53 reducida. Se observa la aparición de un sólido violeta que se purifica mediante cromatografía flash sobre sílica gel usando hexano/AcOEt 2:1 como eluyente. Se obtienen 700 mg de producto 11 como un sólido amarillo/blanquecino. Aspecto: sólido amarillo/blanquecino Rf (Hexano/AcOEt 2:1): 0.37 Rendimiento: 56% Los datos espectroscópicos están de acuerdo con los descritos por H. Zhang, X. Xia, H. Zhao, G. Zhang, D. Jiang, X. Xue, J. Zhang, Dyes and Pigments 2019, 163, 183. 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 6.61 (s, 1H, CH), 2.51 (s, 2H, CH2), 2.17 (s, 2H, CH2), 2.03 (s, 3H, CH3), 1.01 (s, 6H, 2xCH3). (E)-2-(3-(4-(dietilamino)-2-hidroxistiril)-5,5-dimetilciclohex-2-en-1ilideno)malononitrilo 13 En un matraz de 50 mL se disuelven 11 (0.26 g, 1.14 mmol, 1 eq.) y (4-dietilamino)-2hidroxibenzaldehido 12 (0.22 g, 1.14 mmol, 1 eq.) en 10 mL de EtOH. Se añaden 12 gotas de piperidina. La disolución de color violeta se calienta a 80 °C durante 48 h. Finalizadas las 48 h, se realiza una monitorización de la reacción mediante TLC. Se observa la desaparición completa de 11 y 12 tras las 48 h. El disolvente es eliminado mediante presión reducida. Se añaden H20 (10 mL) y CH2Cl2 (10 mL) y se separan las fases. La fase acuosa se extrae tres veces con CH2Cl2 (3X10 mL). La fase orgánica resultante se seca con MgSO4 anhidro, se filtra y finalmente el disolvente se elimina a presión reducida. El crudo de la reacción se purifica mediante cromatografía flash sobre 54 sílica gel usando CH2Cl2/MeOH 100:1. Se obtienen 47mg del producto 13 como un sólido violeta. Aspecto: sólido violeta Rf (CH2Cl2/MeOH 100:1): 0.45 Rendimiento: 11% Los datos espectroscópicos están de acuerdo con los descritos por H. Zhang, X. Xia, H. Zhao, G. Zhang, D. Jiang, X. Xue, J. Zhang, Dyes and Pigments 2019, 163, 183. 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 7.38 (d, 1H, CH), 7.34 (d, 1H, CH), 6.89 (d, 1H, - CH=CH-), 6.72 (s, 1H, HAr), 6.31 (d, 1H, CH) , 6.06 (s, 1H, HAr),3.37 (q, 4H, 2xCH2-CH3), 2.55 (s, 2H, CH2), 2.55 (s, 2H, CH2), 1.20 (t, 6H, 2xCH3-CH2), 1.05 (s, 6H, 2xCH3). (E)-2-(3-(2-(aliloxi)-4-(dietilamino)stiril)-5,5-dimetilciclohex-2-en-1ilideno)malononitrilo 14 Se disuelve 13 (0.05 mg, 1.3 mmol, 1 eq.) con 3 mL de EtOH en un matraz de 25mL. La disolución adquiere un color azul. Se adiciona de manera sucesiva K2CO3 (0.02mg, 0.16 mmol, 1.2 eq.) y bromuro de alilo (26.82 µL, 0.31 mmol, 2.4 eq.). La disolución se calienta a 80 °C. El avance de la reacción se monitoriza mediante TLC. Se observa la completa desaparición de 13 tras 48 h. El disolvente es eliminado mediante presión reducida. Se añade H20 (10 mL) y CH2Cl2 (10 mL) y se separan las fases. La fase acuosa será extraída con CH2Cl2(3x10 mL). La fase orgánica recogida se lavará con una disolución acuosa saturada de NaCl (20 mL). La fase orgánica resultante se seca con MgSO4 anhidro, se filtra y finalmente el disolvente se elimina a presión reducida. El crudo de la reacción se 55 purifica mediante cromatografía flash sobre silica gel utilizando CH2Cl2/MeOH 100:1. Se obtienen15 mg de producto 14, como un sólido violeta. Aspecto: sólido violeta Rendimiento: 29% Rf (CH2Cl2/MeOH 100:1): 0.71 Los datos espectroscópicos están de acuerdo con los descritos por H. Zhang, X. Xia, H. Zhao, G. Zhang, D. Jiang, X. Xue, J. Zhang, Dyes and Pigments 2019, 163, 183. 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 7.44 (d, 1H, CH), 7.41 (d, 1H, CH), 6.86 (d, 1H, - CH=CH-), 6.71 (s, 1H, HAr), 6.32 (d, 1H, CH) , 6.11 (s, 1H, CH), 6.11 (m, 1H, -CH=CH2), 5.48 (d, 1H, CH=CH2), 5.36 (d, 1H, CH=CH2), 4.63 (m, 2H, OCH2), 3.39 (q, 4H, 2xCH2-CH3), 2.55 (s, 2H, CH2), 2.46 (s, 2H, CH2), 1.20 (t, 6H, 2xCH3-CH2), 1.07 (s, 6H, 2xCH3); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ (ppm) 169.5 (CAr), 159.3 (CAr), 156.8 (CAr), 150.9 (CAr), 133.7 (CH), 133.7 (CH), 129.4 (CH), 124.2 (CH), 121.0 (CH), 117.8 (CH=CH2), 114.9 (CAr) 114.1 (C), 113.1 (CN), 111.3 (CN), 105.5 (CH), 95.61 (CH), 69.4 (OCH2), 44.8 (2xCH2-CH3), 43.2 (2xCH2), 39.3 (CH), 32.1 (C), 28.2 (2xCH3), 12.8 (2xCH3-CH2). Estudios en células De manera general, se han realizado los experimentos con células HeLa usando DMEM (Dubelcco’s Modified Eagles’s Medium) como medio. Los cultivos de células en proliferación se mantuvieron en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 °C. Los experimentos se realizan con células HeLa con un período de incubación de 48 h. Reacciones promovidas por rutenio utilizando la sonda A1: Los experimentos en células vivas se llevan a cabo en placas de doce pocillos. Se incuban las células con catalizador Ru1 (50 µM) y DMEM (400 µL) durante 30 minutos. Pasado este tiempo, se realizan tres lavados con DMEM (400 µL). A continuación, se añade el sustrato (100 µM) y se incuban las células 30 minutos. Antes de su observación in vivo mediante microscopía de fluorescencia de las células, es necesario lavar con DMEM (2x400 µL) y transferir las células a portaobjetos para facilitar su visionado. Se realizan 56 capturas de imagen de las muestras gracias al equipo y diferentes filtros presentes en el instrumento. Reacciones promovidas por rutenio utilizando la sonda B1: Se incuban las células con catalizador Ru3 (50 µM) y DMEM (400 µL) durante 30 minutos. Pasado este tiempo, se realizan tres lavados con DMEM (3x400 µL). A continuación, se añade el sustrato (100 µM) y se incuban las células 90 minutos. Antes de su observación in vivo mediante microscopía de fluorescencia de las células, es necesario lavar con DMEM (2x400 µL) y transferir las células a portaobjetos para facilitar su visionado. Se realizan capturas de imagen de las muestras gracias al equipo y diferentes filtros presentes en el instrumento. Reacciones promovidas por rutenio utilizando la sonda C: Se incuban las células con catalizador Ru1 y Ru2 (50 µM) y DMEM (400 µL) durante 30 minutos. Pasado este tiempo, se realizan tres lavados con DMEM (400 µL). A continuación, se añade el sustrato (100 µM) y se incuban las células 4 h. Antes de su observación in vivo mediante microscopía de fluorescencia de las células, es necesario lavar con DMEM (2x400 µL) y transferir las células a portaobjetos para facilitar su visionado. Se realizan capturas de imagen de las muestras gracias al equipo y diferentes filtros presentes en el instrumento. 57 7.1 Anexo I: Espectros Sonda A1 4