Utilización del zorro como bioindicador de la contaminación medioambiental: metales pesados

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA CAMPUS DE LUGO UTILIZACIÓN DEL ZORRO COMO BIOINDICADOR DE LA CONTAMINACIÓN MEDIOAMBIENTAL: METALES PESADOS Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Veterinaria por el licenciado Germán Quintana Diez Lugo, septiembre de 2013 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS VETERINARIAS FACULTADE DE VETERINARIA. Campus de Lugo E-27002 Lugo Tel. 982 822 641 ext. 22641 Correo electrónico: [email protected] LUIS EUSEBIO FIDALGO ÁLVAREZ Profesor Titular y ANA MARÍA LÓPEZ BECEIRO Profesora Contratada Doctora, pertenecientes al Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la Universidad de Santiago de Compostela I N F O R M A N: Que el trabajo de investigación presentado por e licenciado en Veterinaria D. Germán Quintana Diez, titulado Utilización del zorro como bioindicador de la contaminación medioambiental: metales pesados se ha realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la Universidad de Santiago de Compostela, y consideramos que cumple todos los requisitos para optar al grado de Doctor. En Lugo, a dos de septiembre de 2013. Luis Eusebio Fidalgo Álvarez Ana María López Beceiro MARCOS PÉREZ LÓPEZ, Profesor Titular de Universidad del área de Toxicología del Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura, INFORMA: Que la presente Tesis Doctoral presentada por el Licenciado en Veterinaria D. Germán Quintana Diez, titulada “UTILIZACION DEL ZORRO COMO BIOINDICADOR DE LA CONTAMINACIÓN MEDIOAMBIENTAL: METALES PESADOS” se ha realizado bajo mi codirección, cumple los requisitos exigidos a este tipo de trabajos, y se encuentra en disposición de ser defendida ante el Tribunal correspondiente. Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente informe en Cáceres, a 15 de Julio de 2013. Fdo. Marcos Pérez López Unidad de Toxicología Facultad de Veterinaria Avda de la Universidad s/n 10071 Cáceres E-mail: [email protected] AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Como es posible que se quede alguna persona en el tintero, me gustaría mostrar mi gratitud a todas aquellas que, de una u otra forma, han contribuido a que este proyecto haya llegado a buen puerto. En primer lugar, mostrar mi más sincera gratitud a mis directores, los doctores Luis E. Fidalgo, Ana Mª López y Marcos Pérez, por los consejos y paciencia que me han brindado durante todos estos años. Al profesor Luis Alberto Ramil Novo por la inestimable ayuda prestada en el diseño y por el asesoramiento para llevar a cabo el estudio estadístico de los datos. También me gustaría agradecer a todos los compañeros con los que me he iniciado en el mundo clínico en el Hospital Veterinario Universitario Rof Codina, especialmente a mis compañeros del Servicio de Medicina Interna, del Servicio Ambulatorio de Animales de Renta y Équidos, haciéndolo extensible a todos y cada uno de los miembros del Hospital sin excepción. No puedo olvidar mi agradecimiento a los profesores y compañeros con los que compartí mis años en la Facultad de Veterinaria de Lugo, ya que contribuyeron a mi formación como profesional y como persona. A la Federación Galega de Caza y a todos sus afiliados por colaborar de forma desinteresada en este proyecto. A todo el personal del Departamento de Sanidad Animal de la Universidad de Extremadura que ha colaborado en el procesamiento de las muestras. A todos mis amigos de Lugo a los que por la distancia no puedo visitar con la frecuencia con que me gustaría. A Natalia y Bruno por animarme a perseguir los sueños aunque parezcan inalcanzables. A mis amigos y compañeros de Draco Animal y de Canescola, especialmente a Katya y a Miriam, por estar ahí siempre que les he pedido ayuda. ABREVIATURAS ABREVIATURAS UTILIZADAS ATSDR: Agency For Toxic Substances And Disease Registry μl: microlitro μg: microgramo μg/g: microgramo/gramo μg/l: microgramo/litro a.C.: antes de Cristo Al: aluminio As: arsénico Ca: calcio Cd: cadmio Co: cobalto Cr: cromo Cu: cobre DL50 : dosis letal media FGC: Federación Galega de Caza Fe: hierro g: gramo g/cm3: gramo/centímetro cúbico g/ml: gramo/mililitro g/mol: gramo/mol Hg: mercurio HMDE: electrodo de gota colgante de mercurio ITIS: Integrated Taxonomic Information System IUCN: International Union For Conservation Of Nature IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry K: potasio m: metro M: molar Mg: magnesio mg/l: miligramo/litro MMA: Ministerio de Medio Ambiente MME: electrodo multimodo de mercurio Mn: manganeso Mo: molibdeno mseg: milisegundo mV: milivoltio Na: sodio ng/g: nanogramo/gramo Ni: níquel NRC: National Research Council OIE: Organización Internacional de Epizootias Pb: plomo ppm: partes por millón Pt: platino Ru: rubidio Sb: antimonio Se: selenio Sn: estaño Ti: titanio V: vanadio WHO: World Health Organization Zn: zinc 1 INTRODUCCIÓN 2 Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN El género Vulpes agrupa a un conjunto de cánidos de talla mediana denominados vulgarmente como zorros o raposos, estando representados en la actualidad por numerosas especies y subespecies que se distribuyen por prácticamente todo el planeta, siendo un animal nativo en Eurasia, América y África e introducido en otras regiones como en la Austral. Tanto en Galicia como en el resto de la Península Ibérica se cuenta con una población estable de zorro común, Vulpes vulpes, la única especie de este género presente en todo el territorio ibérico. Los hábitos tróficos del zorro poseen especial interés para la investigación (enfermedades infectocontagiosas, zoonosis, ecotoxicología, etc.), ya que no resulta infrecuente detectar su presencia cerca de asentamientos humanos y explotaciones ganaderas, siendo habituales las visitas a basureros y centros de acumulación de residuos, donde pueden encontrar alimento con relativa facilidad. Es este hecho, el característico comportamiento del zorro, lo que condiciona que una parte importante de la dieta esté integrada por restos y desperdicios urbanos. Así mismo la cercanía de muchos ejemplares a las poblaciones humanas despierta gran interés a la hora de iniciar este proyecto, en el cual se intentará valorar su utilidad como bioindicador de la contaminación ambiental, sirviendo para cuantificar el impacto del hombre, de sus poblaciones y centros de acumulación de residuos sobre la fauna y flora gallegas. Si además se tiene en cuenta el elevado número de ejemplares disponibles, la posibilidad de realizar un muestreo considerable, su amplia distribución geográfica y sus características etológicas, se puede llegar a concluir que el zorro común es una especie idónea para estudios de estas características. El término Ecotoxicología fue acuñado por Truhaut en el año 1969 en respuesta a la creciente preocupación por los problemas de contaminación medioambiental generados por la polución. Posteriormente, a mediados de los años 80 del siglo XX, se hacen evidentes otros efectos secundarios como la bioacumulación, proceso ambiental asociado a la capacidad de incrementar los problemas de toxicidad en los organismos vivos. Así pues, la Ecotoxicología es una ciencia que estudia el origen de los contaminantes, su transporte entre distintos compartimentos ambientales, las transformaciones que tienen lugar en estos y, finalmente, los efectos que originan en el ecosistema. La escasez de estudios en el noroeste peninsular, en los que se emplee el zorro como bioindicador, nos anima a continuar la presente línea de trabajo, centrada en determinar la utilidad de distintas especies animales como bioindicadores de contaminación ambiental, y en este caso concreto, la utilidad del zorro común como bioindicador de contaminación por metales pesados en Galicia. Nuestro trabajo se centrará en valorar la presencia de metales pesados en esta especie situada en la parte alta de la cadena trófica. Los bioindicadores pueden ser de utilidad para rastrear la 4 contaminación potencial debida a una gran diversidad de compuestos químicos (plaguicidas, dioxinas, hidrocarburos, etc.) y fenómenos físicos (radioactividad, etc.); más aún, estos indicadores pueden y deben constituir instrumentos de gran utilidad que permitan un control regular de la contaminación ambiental, permitiendo detectar alteraciones en el ecosistema y adoptar las medidas de gestión oportunas de forma temprana. Objetivos 5 OBJETIVOS Revisión bibliográfica 12 Tabla 2. Clasificación taxonómica del zorro (Blanco y González, 1992; GarcíaPerea y Gisbert, 1998). 3.1.2. ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LA ESPECIE Aunque aún existen lagunas que impiden aclarar el origen y evolución del género Vulpes, los estudios moleculares parecen demostrar que su origen data del Mioceno Medio (Garrido y Arribas, 2008). En el Pleistoceno Medio, aproximadamente hace 400.000-180.000 años, surgen ya las líneas evolutivas que darán lugar a las dos formas actuales del zorro en Europa: el zorro (Vulpes vulpes) que proviene del Vulpes alopecoides y el zorro polar (Alopex lagopus) que inicia su diferenciación a partir del Vulpes (Alopex) praeglacialis (Castaños, 1990). Atendiendo a la distribución, el género Vulpes aparece en Eurasia a mediados del periodo Villafranquiense, durante el Plioceno, mientras que en el continente africano los primeros registros fósiles datan del Pleistoceno Inferior. En la actualidad este género cuenta con una decena de especies, distribuidas por todo el mundo, siendo el zorro el que presenta una mayor distribución (Eurasia, Norteamérica y norte de África), siendo considerado como el carnívoro más adaptable y ampliamente distribuido (Garrido y Arribas, 2008). Las poblaciones de Vulpes alopecoides que habitaron la Península Ibérica desde finales del Plioceno Superior hasta hace 10.000 años, presentaban una distribución limitada a la cuenca del Ebro, mientras que las poblaciones de Vulpes (Alopex) praeglacialis se centraban durante el Pleistoceno Inferior en el sureste peninsular. El zorro común (Vulpes vulpes) se extendió por toda la Península desde el Pleistoceno Medio hasta la actualidad (Arribas y Palmqvist, 2010). CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA Reino Animalia Filo Chordata Clase Mammalia Orden Carnivora Suborden Caniformia Familia Canidae Genéro Especie Subespecies Zorro común europeo Zorro común ibérico Vulpes (Frisch, 1775) vulpes (Linnaeus, 1758) crucigera (Bechstein, 1789) silacea (Miller, 1907) Revisión bibliográfica 13 Estudios recientes han revelado la existencia de restos óseos de zorro ártico (Alopex lagopus) en yacimientos paleolíticos cantábricos, lo que demuestra la presencia en el norte de la Península Ibérica en el pasado de una especie denominada fría, indicadora de las condiciones climáticas existentes en ese período (Altuna, 2004). Aunque no se sabe con exactitud el momento de su extinción en nuestro país, este debiera ser próximo al cambio climático que acaece al final del Pleistoceno (Castaños, 1990). . Imagen 1. Distribución de los yacimientos españoles con fósiles de zorro (adaptado de Arribas y Palmqvist, 2010). Todavía existen dudas acerca del origen y evolución de las distintas subespecies eurasiáticas, pero se cree que la subespecie Vulpes vulpes silacea podría haberse diferenciado ya en el Neolítico (Castaños, 1990). 3.1.3. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA El raposo es el carnívoro silvestre más cosmopolita como consecuencia, entre otros aspectos, de la intervención humana sobre el medio y sobre las poblaciones vulpinas (IUCN, 2004; Palomo et al., 2007). Se distribuye por todo el hemisferio norte, desde el Círculo Polar Ártico hasta el norte de África, incluyendo las estepas asiáticas. Está presente en la práctica totalidad de Europa y Asia, con excepción de las regiones más septentrionales como Islandia y las islas del Ártico. Las subespecies europeas se introdujeron en el este de los EE.UU. y Canadá en el siglo XVII, mezclándose con las subespecies autóctonas (IUCN, 2004). En el siglo XIX se liberó en Australia y Revisión bibliográfica 14 Nueva Zelanda con fines cinegéticos y para el control de la población cunícola (Rolls, 1969). Actualmente esta especie se considera una plaga en el país austral, ya que ha contribuido al deterioro o extinción de especies nativas, particularmente herbívoros de pequeño tamaño y aves que anidan en el suelo (Morton, 1990; Catling y Burt, 1995; Lunney, 2001). El zorro común está presente en toda la Península Ibérica, desde nivel del mar hasta la alta montaña, pero ausente en las Islas Baleares y Canarias (García-Perea y Gisbert, 1997). Es más abundante en zonas urbanas, periurbanas y cerca de basureros y vertederos, por suponer una fuente accesoria de alimento (García et al., 2009). Como ya se ha comentado, la subespecie que habita la Península Ibérica es V.v. silacea, que se distingue por detalles en su pigmentación de la del resto de Europa, V.v. crucigera (cuyo límite de distribución meridional se sitúa en los Pirineos). No obstante, algunos autores no consideran que estas disparidades tengan valor taxonómico (Palomo et al., 2007). A estas dos subespecies podemos añadirle el V.v. ichnusae descrita en las islas de Córcega y Cerdeña, que se originó a partir de V.v. crucigera como consecuencia del aislamiento geográfico (Riga, 2007). Imagen 2. Mapa de distribución de Vulpes vulpes. Azul: población nativa. Rojo: población introducida (adaptado de Fidalgo et al., 2009). 3.1.4. DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA El zorro común (también denominado rojo) es un cánido de talla media, el de mayor tamaño de todas las subespecies del género Vulpes (López-Martín et al., 2007). Esta especie se caracteriza por su larga y poblada cola, que puede llegar a medir hasta un 70% de la longitud del resto de su cuerpo (Palomo et al., 2007), si bien este tamaño se reduce considerablemente (hasta el 54%) en los ejemplares vulpinos estudiados en Galicia (Fidalgo et al., 2009). Los raposos presentan un hocico fino y alargado, acabado en un belfo blanco. Las orejas son triangulares, móviles y erguidas, con su dorso negro. Sus extremidades son largas y esbeltas, con manos y pies pequeños (Fidalgo et al., 2010). Revisión bibliográfica 15 El pelaje, suave y espeso, exhibe una coloración variable abarcando desde formas casi melánicas hasta ejemplares con un cromatismo pálido-amarillento (Palomo et al., 2007). Habitualmente se encuentran tres capas predominantes: roja, plateada (negra con destellos plateados) y gris-marrón con largos pelos negros en la parte caudal del dorso y atravesando la región de la cruz (Johnson y Hersteinsson, 1993). Las extremidades poseen distalmente una pigmentación bruna. En algunos individuos la cola remata con pelos blancos (IUCN, 2004). Los cachorros nacen con un pelaje pardo oscuro uniforme, pero al mes de vida las zonas ventrales de la cabeza y tronco así como las caras mediales de las extremidades adquieren una coloración clara. Sin embargo, los extremos (orejas, hocico, pies y manos) permanecen negros y la cola suele tener una banda terminal de pelos blancos (Palomo et al., 2007). Los ojos son redondos, de color marrón avellana en adultos y azulados en cachorros, proporcionalmente pequeños respecto al tamaño de su cabeza, y con la pupila ligeramente alargada en un plano vertical en condiciones de gran iluminación y circular con poca luz (Larivière y Pasitschniak-arts, 1996). Existe una gran variabilidad individual y geográfica en el tamaño corporal y medidas morfométricas del zorro rojo (IUCN, 2004; Palomo et al., 2007). La longitud del cuerpo oscila entre 45 y 90 cm y la longitud de la cola entre 30 y 55 cm. El peso varía entre 3 y 14 kg, siendo normalmente mayor en los machos que en las hembras (Gortázar, 1997; Soulsbury et al. 2000). Las subespecies existentes en los desiertos poseen una menor envergadura que los zorros europeos. Atendiendo a la diversidad geográfica se puede indicar que los zorros de Norteamérica son comparativamente más esbeltos y presentan un importante dimorfismo sexual; sin embargo, los ejemplares británicos son más pesados y relativamente más cortos (IUCN, 2004). La fórmula dental del Vulpes vulpes es: I 3/3 C 1/1 PM 4/4 M 2/3 (x 2) = 42 (Schmidly, 2004). La dentadura de los zorros se emplea para estimar la edad del animal en base al recuento de bandas en el cemento de las piezas dentarias (el método más preciso), al estudio de la cavidad pulpar en los caninos o al desgaste general de toda la dentadura (Zapata et al., 1995). A nivel genético, el número de cromosomas presenta la siguiente fórmula: (2n) = 34 (Rausch y Rausch, 1979; Wozencraft, 1993; Palomo et al., 2007) y de 3 a 5 microsomas (Wozencraft, 1993), en contraste con la fórmula cromosómica del Canis lupus y Canis lupus familiaris, que es (2n) = 78 (Stephen et al., 2006). Por este motivo no es posible la hibridación entre el zorro y el perro o el lobo. 3.1.5. HÁBITAT El zorro presenta cierta predilección por zonas heterogéneas en las que se alternan matorral, bosque y extensiones agrarias; aprovechando también las proximidades de asentamientos humanos, áreas urbanas y periurbanas, donde se alimenta fácilmente y puede perder su comportamiento territorial (Mac Donald, 1980; Harris, 1981b; Blanco, 1998a). Revisión bibliográfica 16 A pesar de presentar predilección por entornos como los mencionados anteriormente, lo cierto es que el zorro habita todo tipo de ambientes, desde el subártico hasta el desierto, tanto en medios forestales como en espacios abiertos, e incluso en grandes núcleos urbanos como Londres, París o Estocolmo, gracias a la capacidad de adaptación a cualquier medio capaz de ofrecer refugio y alimento (Blanco, 1998a; IUCN, 2004; Fidalgo et al., 2009). La disponibilidad trófica es el factor que más condiciona la distribución de esta especie (Mac Donald, 1980; Harris, 1981b; Blanco, 1998a). En España, como en el resto del mundo, se ha descrito su presencia en regiones a nivel del mar e incluso en zonas de alta montaña, viéndose favorecida su expansión por la existencia de ambientes heterogéneos (Fidalgo et al., 2009). 3.1.6. ETOLOGÍA El zorro posee los sentidos del olfato, oído y vista muy desarrollados, lo que condiciona sus patrones de comportamiento (Larivière y Pasitschniak-Arts, 1996). Su actividad es fundamentalmente nocturna, con picos en el orto y el ocaso (Palomo et al., 2007), si bien puede mostrar un comportamiento más diurno en aquellas zonas donde no es incomodado por la presencia humana; así, la actividad diurna es mayor en áreas poco frecuentadas y cuando las noches son cortas (Rau et al., 1985; IUCN, 2004). 3.1.6.a. Organización y comportamiento social Los zorros son animales independientes y generalmente buscadores solitarios, aunque algunos ejemplares pueden vagar con cierta proximidad a otros congéneres cuando los recursos son reducidos o si la abundancia de alimento se concentra en una zona concreta (IUCN, 2004). Durante la época reproductiva la unidad social básica es la pareja, aunque se pueden observar grupos mayores de forma excepcional (Harris y Lloyd, 1991; IUCN, 2004). Existen ejemplares solitarios, conocidos como zorros nómadas (la mayor parte machos), sin un territorio definido y que suponen sólo el 15% de la población adulta (Harris y Baker, 2001). El tamaño del área frecuentada oscila notablemente, desde 0,40 km2 (en zonas urbanas) hasta superiores a 40 km2 (regiones subárticas). Estos territorios son defendidos activamente de otros posibles competidores y sólo, en algunas épocas del año, y si existen excedentes alimentarios, pueden observarse casos de superposición de territorios (Mac Donald, 1980). Revisión bibliográfica 17 3.1.6.b. Rastros Tanto el tejón como el zorro fabrican madrigueras muy similares en su estructura interna, pudiendo este último cavar las propias o agrandar las de otras especies (Serrano y Cicuéndez, 1997). Su estructura va desde un simple agujero con una cavidad espaciosa a una ramificación extensa de galerías, en algunos casos de más de 20 m. La diferencia principal es que el zorro acumula la tierra extraída alrededor de la entrada quedando un abanico claramente visible y el tejón la amontona fuera de su guarida (Ballesteros, 1998). En época de cría en la guarida del zorro, frecuentemente, habrá restos del alimento consumido (Serrano y Cicuéndez, 1997). Sus deyecciones son de tamaño muy variable (5-20 cm de longitud y 1,5-2,5 cm de grosor) y suelen estar divididas en varios cuerpos. El color varía con el tipo de alimento ingerido, así como su olor. Es habitual la presencia de huesos, pelos, escamas, plumas, restos de frutos, élitros y trozos quitinosos de insectos en sus deposiciones (Harris, 1984; Serrano y Cicuéndez, 1997; Barja et al., 2001; Hernández, 2001). Los zorros sitúan sus excrementos fundamentalmente en puntos destacados (plantas, elevaciones del terreno, piedras, cruces de caminos, carroña, excrementos de otras especies y objetos de origen humano) para amplificar de forma visual y olfativa su eficiencia señalizadora. En los cruces de caminos es muy frecuente detectar sus deyecciones, lo que aumenta la probabilidad de ser reconocidos por otros individuos de la misma especie (Barja et al., 2001). El zorro posee, tanto en las extremidades anteriores como posteriores cinco dedos, de los que en su huella sólo marca cuatro, debido a que el primer dedo está situado en ambos casos en una posición más proximal y no contacta con el suelo. En las huellas de todas las extremidades se marcan la almohadilla plantar, de mayor tamaño, y las cuatro almohadillas digitales (Fidalgo et al., 2010). Las huellas son similares a las de los perros, con un tamaño de 5 cm de largo y 3-4 cm de ancho. Generalmente se desplaza al trote y con las huellas en posición oblicua a la dirección en que camina. La separación entre dos huellas consecutivas es de unos 30 cm (Harris, 1984; Serrano y Cicuéndez, 1997; Ballesteros, 1998). Se puede diferenciar la huella del zorro de la de los perros trazando una línea recta que atraviese entre el punto más caudal de las almohadillas centrales y el más craneal de las laterales. En el zorro esta línea no corta ninguna almohadilla, mientras que en el perro sí (Murie y Elbroch, 2005; Arnosky, 2008). Revisión bibliográfica 18 Imagen 3. Comparación entre la huella de un zorro común y un perro (Murie y Elbroch, 2005; Arnosky, 2008). 3.1.7. REPRODUCCIÓN El zorro es una especie monoéstrica estacional, siendo el fotoperíodo junto con la temperatura ambiental los dos factores que más determinan el inicio y el final de la estación reproductiva (McDonald y Reynolds, 2005; Valdespino, 2007). La dinámica poblacional de esta especie parece responder a mecanismos compensatorios y así, cuando aumenta la mortalidad en la población, ésta se ve compensada por el aumento de la fertilidad, el tamaño de la camada o la supervivencia de los ejemplares juveniles (Gentle, 2005). La madurez sexual se alcanza en el primer año de vida, a los 9-10 meses de edad, pero en áreas de elevada densidad poblacional muchas de las hembras jóvenes no entran en celo, abortan o abandonan su camada (McIlroy et al., 2001; IUCN, 2004; Palomo et al., 2007). La cópula tiene lugar entre los meses de diciembre y febrero (Jeanne, 1987, IUCN, 2004; Gentle, 2005). Las hembras son receptivas durante un periodo de 1 a 6 días, que es la duración estimada del estro (Cavallini y Santini, 1996; IUCN, 2004). La mortalidad intrauterina es habitual, sobre todo en etapas previas a la implantación, observándose con más frecuencia en hembras jóvenes de menos de un año. Estas pérdidas embrionarias y fetales responden a una situación estresante relacionada con la disponibilidad de recursos tróficos y a las interacciones sociales (Cavallini y Santini, 1996; Ballesteros, 1998). El parto tiene lugar en la madriguera tras una gestación de 49-55 días, teniendo lugar los nacimientos entre marzo y mayo (Martorell y Gortázar, 1993; IUCN, 2004; Gentle, 2005; McDonald y Reynolds, 2005). Las hembras pueden preparar varias madrigueras, pudiendo cambiar los cachorros de localización varias veces durante la época de cría (Gentle, 2005). Revisión bibliográfica 19 En la Península Ibérica el tamaño de la camada puede variar entre uno y siete cachorros en función de la disponibilidad de alimento y factores sociales (Cavallini y Santini, 1996; IUCN, 2004; Palomo et al., 2007). Este tamaño es inferior al observado en otras regiones europeas, lo que parece indicar que la población vulpina ibérica está estabilizada en una densidad alta, otorgando a esta población una elevada capacidad de respuesta ante posibles bajas poblacionales (Ceballos et al., 1991; Martorell y Gortázar, 1993: Gortázar, 1999; MMA, 2006). A los tres meses de edad los cachorros abandonan completamente la madriguera y comienzan a cazar con la madre, siendo las madrigueras excavadas de vital importancia para su protección mientras son jóvenes (Ballesteros, 1998). Los zorros jóvenes se pueden emancipar del grupo entre los 6 y 12 meses de edad, ya con talla adulta, teniendo lugar esta separación entre los meses de octubre y enero, momento en el cual los animales más jóvenes comienzan la búsqueda de nuevos territorios (Larevière y Pasitschniak-Arts, 1996). 3.1.8. ALIMENTACIÓN El análisis de la dieta del raposo constituye un primer paso en el estudio de la ecología del animal ya que la alimentación refleja el empleo de los recursos disponibles, permite valorar su aprovechamiento y las interacciones competitivas intra y extraespecíficas (Rau et al., 1987; Boitani y Fuller, 2000). El régimen alimentario varía enormemente de unas regiones a otras y también de forma estacional, con una ingesta diaria que se estima entre 300 y 600 gramos. Se le puede considerar omnívoro o carnívoro oportunista dado que su dieta incluye mamíferos, invertebrados, aves, frutos, carroña, basura y otros alimentos estacionales que pueda encontrar en el medio. Como predadores, matan de forma habitual aves y mamíferos de talla equivalente a una liebre adulta (Larivière y Pasitschniak-Arts, 1996; McDonald y Reynolds, 2005). Su carácter oportunista y su gran capacidad de adaptación a las fuentes tróficas disponibles le permiten rentabilizar al máximo los recursos de su entorno. Estos rasgos afectan positivamente a la estabilidad poblacional o incluso su crecimiento (Fuller y Sievert, 2001). Los diferentes alimentos consumidos por el zorro se clasifican en distintas categorías, tal como se muestra en la tabla 3 adjunta. En ambientes humanizados, más de la mitad de la dieta del zorro la integran las basuras y las carroñas de animales domésticos, pudiendo contener estos restos elementos no digeribles (Amores, 1975; Jensen y Sequeira, 1978; Calviño et al., 1984; Fedriani et al., 2001). Revisión bibliográfica 20 Tabla 3. Alimentos ingeridos por el zorro (adaptado de Ballesteros, 1998). 3.1.9. DINÁMICA DE POBLACIONES 3.1.9.a. Estimación de la abundancia Para estimar su población se han propuesto métodos de estudio indirectos como el recuento de huellas, número de excrementos u otros signos, que se realizan con un mínimo coste aún a riesgo de presentar ciertas imprecisiones (Bookhout, 1994). Además existen muchos otros métodos, con sus ventajas e inconvenientes, pudiendo elegir entre uno u otro en función de las características del lugar, de la disponibilidad económica, del personal, de las horas de trabajo y otras variables: Estaciones de cebado (Travaini et al., 2001). Estaciones de olor (Roughton y Sweeny, 1982; MMA, 2006). Batidas de caza (Fidalgo et al., 2009). RECURSOS PRINCIPALES RECURSOS SECUNDARIOS RECURSOS PUNTUALES Pequeños mamíferos. Constituyen en algunas regiones de Europa más del 75% de la dieta, siendo un porcentaje más reducido en España, posiblemente por no ser un recurso abundante (Calviño et al., 1984; Rau et al., 1987). Basura y carroña. En zonas urbanas puede llegar a constituir el grueso de la ración (Calviño et al., 1984; Reig et al., 1985). Invertebrados. Las lombrices de tierra e insectos pueden tener una gran importancia en determinadas regiones o épocas del año, siendo particularmente de interés en animales jóvenes durante el periodo de dispersión (Rau et al., 1987; Soulsbury et al., 2000). Frutos. En épocas de abundancia de frutos y bayas constituyen una parte importante de la dieta (Fidalgo et al., 2009). Aves. A pesar de una idea preconcebida de que las aves constituyen un porcentaje importante de la dieta, en la mayoría de los estudios realizados no superan el 15% de la misma (Blanco, 1988), pudiendo aumentar este porcentaje en zonas urbanas o periurbanas y tras una repoblación cinegética (Reynolds y Tapper, 1995). Se incluyen otros recursos tróficos que son ingeridos de forma esporádica tales como peces, cereales, erizos, topos, etc. Revisión bibliográfica 21 Censo de huellas (MMA, 2006). Inventariado de madrigueras (Wandeler et al., 1974). Número de excrementos en parcelas fijas (Palomares y Ruiz-Martínez, 1994). Valoración de rastros en colaboración con radio-tracking (Rau et al., 1985). Extrapolaciones a partir del tamaño medio de las áreas de campeo (Lloyd et al., 1976). Combinaciones de estaciones de olor con conteo de rastros (Travaini et al., 1997). Modelos basados en la combinación de métodos de captura y recaptura con datos sobre la dinámica poblacional (Vos, 1995). Tablas de caza (Böger et al., 1974). Recuentos de rastros en transectos diurnos casuales (Allen y Sargeant, 1975). Censos desde avioneta (Allen y Sargean, 1975). Recorridos nocturnos con faro adicional (Stahl, 1990). Los resultados obtenidos por distintos autores muestran una gran variabilidad en la densidad de población dependiendo del área geográfica, del uso del territorio y de la presencia de poblaciones humanas. En el Reino Unido, ésta oscila entre 4 individuos/km2 en Escocia y hasta 1,17 individuos/km2 en Gales, si bien puede llegar a densidades de hasta 30 ejemplares por km2 (una de las mayores densidades conocidas) en áreas urbanas en las que existe comida abundante (Harris, 1981; Voigt, 1987; IUCN, 2004). Las densidades más bajas se han descrito en lugares de escasa disponibilidad de presas y/o donde el zorro coexiste con especies competidoras de mayor tamaño (Palomares y Ruiz-Martínez, 1994). En la Península Ibérica no existen demasiados estudios, pero tal vez uno de los lugares estudiados hasta ahora con mayor densidad es la Reserva Biológica de Doñana, con 1,2 ejemplares adultos/km2 (Rau et al., 1985), llegando a 1,7 en el año 1993 según Travaini (1994). Otros autores observan densidades aún mayores en zonas de regadío del Valle del Ebro, con 2,5 zorros adultos/km2 (Gortázar, 1999). En la provincia de Burgos los ensayos ofrecen datos invernales de 0,77 a 0,92 zorros/km2 en encinares y 0,34-0,36 zorros/km2 en robledales (Tellería y Sáez-Royuela, 1986). En Aragón se han estimado en poblaciones, antes del periodo de partos, densidades de entre 0,8 (estepa) y 2,5 (regadío) individuos por km2. En Galicia, en un estudio realizado durante un período de tres años, se estima una densidad media de la población invernal de zorros en 2,71 ejemplares por km2, más elevada en zonas periurbanas e inferior en zonas de monte (Fidalgo et al., 2009). La proliferación de esta especie en el noroeste peninsular puede deberse, en gran parte, a la disponibilidad de recursos tróficos derivados de la actividad antropomorfa (basureros, despojos de granjas, etc.); no obstante, la reciente política Revisión bibliográfica 28 Longevidad de la especie, permitiendo evidenciar fenómenos de toxicidad a largo plazo. Reproducibilidad de la recogida de individuos: los procedimientos de recogida de individuos deben ser estandarizados para que sea posible la comparación con estudios que utilizarán las mismas especies pero en diferentes áreas. Semejanza a los humanos: dado el papel que van a realizar los bioindicadores como centinelas de los riesgos para la salud humana, es necesario que compartan un cierto grado de semejanzas fisiológicas. Sin embargo, debe considerarse que son pocas las especies que cumplen los requisitos aquí indicados, por ello se hace necesario elegir a aquellas que cumplan la mayoría (Hermoso de Mendoza et al., 2008). Tabla 4. Tipos de bioindicadores (adaptada de Capó, 2002; De la Casa, 2010). 3.2.2. APTITUDES DE LOS MAMÍFEROS SALVAJES TERRESTRES COMO BIOINDICADORES Diversos estudios científicos han probado que los mamíferos salvajes resultan especialmente útiles como bioindicadores, por poseer una serie de características importantes (Tataruch y Kierford, 2003) como son:  De ellos se conocen más parámetros fisiológicos y más preferencias alimenticias que de otros seres vivos.  Las técnicas para la determinación de la edad son más fiables.  El tamaño es mayor que en otras especies, proporcionando una cantidad de muestra suficiente para los distintos procedimientos. TIPOS DE BIOINDICADORES Grado de sensibilidad Forma de respuesta Posibilidad de medida -Muy sensibles -Sensibles -Poco sensibles -Resistentes -Detectores -Exploradores -Centinelas -Acumuladores -Organismos test o bioensayo -Bioindicadores en sentido estricto -Biomonitores: por reacciones manifiestas o por acumulación -Biomonitores: pasivos (naturales) o activos (transplantes) Revisión bibliográfica 29  En la mayoría de los casos, se trata de ejemplares muertos en actividades cinegéticas, por lo que no es necesario ni su cría ni su sacrificio especifico para la toma de muestras.  Acumulan metales traza y otros contaminantes de forma activa desde el medio, parámetros que no siempre se pueden utilizar en plantas.  Debido a su longevidad, los efectos de una determinada exposición pueden ser estudiados a lo largo del tiempo.  Los humanos somos mamíferos, por lo tanto, los resultados obtenidos pueden ser extrapolados a la población humana, permitiéndonos estudiar determinados riesgos. Deben ser citados también diversos inconvenientes no menos importantes, como son (Hermoso de Mendoza et al., 2008; De la Casa, 2010): Los niveles de contaminantes en los tejidos dependen de factores endógenos tales como la edad o el sexo, pero los factores exógenos son determinantes a la hora de elegir una especie como bioindicadora. Para poder determinar estos últimos se necesita un estudio previo con gran cantidad de individuos. El muestreo, en caso de órganos internos, implica el sacrificio del animal, así que sólo es posible una única toma de muestras por individuo. A pesar de todo, tal y como ya se ha indicado, los mamíferos son uno de los grupos biológicos que presentan mejores características a la hora de actuar como bioindicadores, reflejando fielmente la contaminación presente en su hábitat, ya sea en la comida, agua, suelo, aire, etc., obteniendo una serie de datos que nos permiten actuar en consecuencia. 3.3. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CONTENIDO DE METALES PESADOS EN LOS MAMÍFEROS SILVESTRES EN GENERAL Y EN EL ZORRO EN PARTICULAR 3.3.1. HÁBITAT Y ESTACIONALIDAD El hábitat es decisivo a la hora de seleccionar una especie como bioindicador y así, los animales que viven cerca de núcleos de población humana son un reflejo de la contaminación que caracteriza esa zona. Los ejemplares que viven en zonas alejadas de estos núcleos son de gran utilidad para detectar pequeños cambios debidos a la contaminación difusa (Frank, 1986). Las variaciones en el área geográfica que habitan los animales así como las condiciones climáticas están directa o indirectamente relacionadas con el comportamiento, morfología (ecotipo), fisiología y reproducción de estas especies. Un ejemplo es el contenido en cadmio, que depende en Revisión bibliográfica 30 gran medida de las características del suelo y así, aquellos mamíferos que vivan en suelos con un pH ácido muestran un contenido más elevado de este elemento que los que habitan en suelo calizo (Tataruch y Kierdorf, 2003). También la estacionalidad condiciona la selección de un bioindicador y la interpretación de los resultados. Las mayores concentraciones de metales pesados en el pelo se detectan a finales de verano y en otoño (Flynn et al., 1977), motivado por la actividad estacional del folículo piloso y la elevada disponibilidad de metales en las hojas (White et al., 1987). 3.3.2. ALIMENTACIÓN La dieta influye de forma decisiva en la concentración de diversos contaminantes. Así, los herbívoros (consumidores primarios), al poseer una dieta con una baja densidad calórica, son más adecuados para su uso como bioindicadores. Estos consumidores primarios ingieren grandes cantidades de comida, incorporando por tanto, una mayor cantidad de sustancias potencialmente tóxicas, mientras que los carnívoros (consumidores secundarios) ingieren alimentos con una elevada densidad calórica, por lo que la cantidad de alimento ingerida es más reducida y como consecuencia, acumulan menos cantidad de sustancias tóxicas en el organismo (Funke et al., 1993). Así pues, los herbívoros estrictos están expuestos a ciertos metales pesados como el plomo o el cadmio por ingestión de plantas, frente a los carnívoros, que incorporan estos metales mediante la magnificación producida en la cadena trófica (Gamberg el at., 2005). De hecho, la contaminación por plomo en los herbívoros no sólo se debe al contenido en plomo de la materia vegetal, sino también por el hecho de que estos animales están mucho más expuestos a las partículas del suelo que otras especies. En cuanto al cadmio, los niveles de este metal en los órganos de los grandes carnívoros son generalmente muy bajos, lo que podría deberse a la reducida acumulación de este elemento en el músculo, que representa la mayor parte de la comida de los carnívoros (Tataruch y Kierdorf, 2003). 3.3.3. SEXO La acumulación y metabolismo de diversos elementos y compuestos químicos varía en función del género y también está influenciado por el estado reproductivo del animal; es por ello indispensable en estudios de Ecotoxicología examinar el estado reproductivo y la edad de los ejemplares incluidos en los mismos (Burger et al., 2007). Un ejemplo de lo expuesto anteriormente es la influencia del sexo en los niveles de cadmio y así ha sido demostrada en varias especies, que las hembras presentan concentraciones más elevadas de cadmio que los machos, probablemente como consecuencia de la ingesta de una mayor cantidad de comida por kilogramo de peso en el caso de las hembras (Tataruch y Kierdorf, 2003). Revisión bibliográfica 31 3.3.4. EDAD La edad del animal es un factor importante en la acumulación de contaminantes, especialmente cuando se trata de xenobióticos bioacumulables, ya que determina la duración de la acumulación en el organismo animal (Hermoso de Mendoza et al., 2008). El metal pesado típico cuyo contenido se incrementa con la edad es el cadmio, debido a la prolongada vida media del cadmio en los riñones. Así, para poder interpretar correctamente los resultados analíticos hay que tener en seria consideración la edad de los individuos (Tataruch y Kierdorf, 2003). Aunque la determinación de la edad en la fauna salvaje es difícil y la mayor parte de las veces imprecisa, deberían ser comparados los resultados de animales pertenecientes al mismo grupo de edad para obtener unas conclusiones válidas en el caso de los metales pesados (Tataruch y Kierdorf, 2003). 3.3.5. EL ZORRO COMO BIOINDICADOR A continuación se expone una revisión de los estudios en los que se recogen datos referentes a la concentración de metales pesados en diversos mamíferos salvajes mediante el empleo de métodos destructivos y no destructivos. Es importante destacar que ambas técnicas son válidas, si bien las no destructivas (en inglés NDT, de non destructive testing) evitan las implicaciones éticas y ecológicas del muestreo destructivo. En la mayoría de las especies protegidas el sacrificio del animal, aunque de forma controlada, puede provocar más daño que el propio compuesto tóxico a estudiar y en estos casos debe plantearse el empleo o desarrollo de técnicas no destructivas siempre que demuestren ser eficaces (Hermoso de Mendoza et al., 2008). Directamente relacionado con esto, las técnicas de muestreo invasivas o no invasivas hacen referencia al grado de daño que se infringe al animal al realizarlas. Así, en el caso concreto de fauna silvestre son especialmente interesantes las técnicas de muestreo cuanto menos invasivas mejor (detección de contaminantes por ejemplo en orina, heces o saliva) en las cuales la integridad física del animal no se vea alterada y tampoco se genera un estrés innecesario sobre el mismo. No obstante, a veces, hay que recurrir a técnicas invasivas (extracción de sangre y otras muestras biológicas) y, en casos extremos, las técnicas a emplear pueden requerir la muerte del animal (por ejemplo si se precisa la necropsia) (Heymann et al., 2004; Brousset et al., 2005). Una importante ventaja de los métodos no destructivos es que se pueden tomar muestras seriadas en la misma población e individuos, además de la mayor facilidad de muestreo, transporte y Revisión bibliográfica 32 almacenamiento de las muestras, así como un menor estrés para la población en estudio (Fossi y Leonzio, 1993). La realización de análisis mediante técnicas destructivas está regulada legalmente, indicando la normativa el número de ejemplares que se pueden emplear, el protocolo a seguir, las especies aptas para este tipo de estudios y también las medidas y controles que se deben llevar a cabo (Hermoso de Mendoza et al., 2008). En la tabla 5 adjunta se exponen los contenidos de metales pesados obtenidos en diversos trabajos científicos en diferentes mamíferos terrestres por métodos destructivos, adaptada del estudio desarrollado por Hermoso de Mendoza et al. (2008). En el estudio realizado por Dip y colaboradores (2001), se determinaron los niveles de metales pesados en zorros y se evaluó si existían diferencias significativas en zorros en función del área donde habitaban, diferenciando las áreas urbanas de las suburbanas y rurales, llegando a las siguientes conclusiones: Los individuos de zonas urbanas son los que presentaban mayores niveles de plomo en riñón e hígado. El nivel de cadmio era más elevado en zonas suburbanas que en las urbanas, aumentando de forma progresiva con la edad, al igual que ocurre en otras especies. Entre las conclusiones obtenidas en este estudio cabe destacar la idoneidad que los autores otorgan a esta especie como bioindicador para detectar la presencia de algunos compuestos tóxicos, especialmente en zonas urbanizadas. Revisión bibliográfica 33 Órgano Especie Metal Concentración Referencia Hígado Carnívoros Zorro ártico (Alopex lagopus) Cd 0,18 ± 0,03 μg/g Hoekstra et al., 2003 Cu 7,1 ± 0,49 μg/g Fe 344 ± 16 μg/g Mn 3,7 ± 0,16 μg/g Pb 0,53 ± 0,10 μg/g Se 0,88 ± 0,12 μg/g Zn 29 ± 1,8 μg/g Lobo (Canis lupus) Hg 30 μg/g Shore et al., 2001 Oso polar (Ursus maritimus) Cd 0,120 – 1,98 μg/g 1,88 μg/g (ps) Dietz et al., 2000 Woshner et al., 2001 Hg 2,13 – 22,0 μg/g 1,1 – 35,6 μg/g Dietz et al., 2000 Sonne et al., 2007 Se 1,20 – 9,80 μg/g Dietz et al., 2000 Zn 42,9 – 67,6 μg/g Zorro común (Vulpes vulpes) As 0,38 ± 0,38 mg/kg 0,047 μg/g peso húmedo Piskorova et al., 2003 Millán et al., 2008b Cd 0,52 ± 0,51 mg/kg 0,21 ± 0,12 mg/kg 0,10 ± 0,02 mg/kg 0,113 μg/g peso húmedo Dip et al., 2001 Piskorova et al., 2003 Alleva et al, 2006 Millán et al., 2008b Cu 20,2 ± 18,8 mg/kg 72,0 μg/g peso húmedo Dip et al., 2001 Millán et al., 2008b Hg 0,22 ± 0,23 mg/kg 0,03 ± 0,01 mg/kg 0,393 μg/g peso húmedo Piskorova et al., 2003 Alleva et al, 2006 Millán et al., 2008b Pb 1,20 ± 3,61 mg/kg 0,35 ± 0,12 mg/kg 0,37 ± 0,03 mg/kg 0,257 μg/g peso húmedo Dip et al., 2001 Piskorova et al., 2003 Alleva et al., 2006 Millán et al., 2008b Zn 44,9 ± 16,7 mg/kg 136,7 μg/g peso húmedo Dip et al., 2001 Millán et al., 2008b Perro (Canis lupus familiaris) As 10,4 – 12,7 μg/g López-Alonso et al., 2006 Cd 51,2 – 62,0 μg/g Hg 28,5 – 37,4 μg/g Pb 54,1 – 66,9 μg/g Co 15,0 – 17,7 μg/g Cu 38,7 – 45,9 mg/kg Fe 371 – 420 mg/kg Mn 2,23 – 2,55 mg/kg Se 0,642 – 0,730 mg/kg Zn 44,4 – 49,2 mg/kg Omnívoros Jabalí (Sus scrofa) As 0,21 ± 0,36 mg/kg Piskorova et al., 2003 Cd 0,28 ± 0,23 mg/kg Piskorova et al., 2003 Cr 0,28 ± 0,16 mg/kg 0,15 ± 0,12 mg/kg Gallego, 2006 Piskorova et al., 2003 Hg 0,24 ± 0,2 mg/kg Piskorova et al., 2003 Pb 0,24 ± 0,1 mg/kg 2,61 ± 8,35 mg/kg Piskorova et al., 2003 Gallego, 2006 Tabla 5. Contenido en metales pesados cuantificados en diferentes especies de mamíferos terrestres mediante métodos destructivos. Revisión bibliográfica 34 Órgano Especie Metal Concentración Referencia Riñón Carnívoros Oso polar (Ursus maritimus) Cd 2,16 – 28,9 μg/g 37,76 μg/g (p.s) Dietz et el., 2000 Woshner et al., 2001 Hg 2,87 – 32,0 μg/g 1 – 50 μg/g Dietz et el., 2000 Sonne et al., 2007 Se 2,34 – 13,9 μg/g Dietz et el., 2000 Zn 19,7 – 41,0 μg/g Zorro común (Vulpes vulpes) As 0,3 ± 0,28 mg/kg Piskorova et al., 2003 Cd 1,45 ± 1,43 mg/kg 0,25 ± 0,08 mg/kg Dip et al., 2001 Piskorova et al., 2003 Cr 0,29 ± 0,16 mg/kg Piskorova et al., 2003 Cu 6,3 ± 4,1 mg/kg Dip et al., 2001 Hg 0,63 ± 0,51 mg/kg Piskorova et al., 2003 Pb 0,57 ± 0,90 mg/kg 0,38 ± 0,17 mg/kg Dip et al., 2001 Piskorova et al., 2003 Zn 21,2 ± 7,8 mg/kg Dip et al., 2001 Perro (Canis lupus familiaris) As 14,3 – 17,4 μg/g López-Alonso et al., 2006 Cd 147 – 188 μg/g Hg 44,9 – 59,9 μg/g Pb 21,2 – 26,2 μg/g Co 19,7 – 22,4 μg/g Cr 40,8 – 47,3 μg/g Cu 5,63 – 6,28 mg/kg Fe 91,2 – 100,4 mg/kg Mn 0,925 – 0,988 mg/kg Mo 0,346 – 0,367 mg/kg Ni 25,2 – 28,6 μg/g Se 1,35 – 1,43 mg/kg Zn 25,1 – 26,9 mg/kg Omnívoros Jabalí (Sus scrofa) As 0,17 ± 0,22 mg/kg Piskorova et al., 2003 Cd 0,56 ± 0,69 mg/kg 2,16 ± 1,05 mg/kg Piskorova et al., 2003 Gallego, 2006 Cr 0,19 ± 0,11 mg/kg Piskorova et al., 2003 Hg 0,52 ± 0,42 mg/kg Pb 0,39 ± 0,21 mg/kg 0,33 ± 0,32 mg/kg Piskorova et al., 2003 Gallego, 2006 Tabla 5 (cont.). Contenido en metales pesados cuantificados en diferentes especies de mamíferos terrestres mediante métodos destructivos. Revisión bibliográfica 35 Por todo lo anteriormente comentado se puede considerar al zorro como una especie adecuada para su empleo como bioindicador a la hora de plantear estudios de ecotoxicidad, como el que se propone en la presente memoria de tesis doctoral ya que esta especie se caracteriza por: Población estable y abundante. Distribución homogénea en todo el territorio gallego. Tamaño corporal adecuado para tomar una cantidad suficiente de muestra. Especie silvestre bien conocida y estudiada. Se sitúa en la parte alta de la pirámide trófica. Especie cinegética legalmente regulada por lo que no son necesarias capturas ni sacrificio ex profeso para la investigación. Acceso a un número elevado de ejemplares abatidos todos los años que facilita estudios cronológicos comparativos. 3.4. METALES PESADOS: IMPLICACION MEDIOAMBIENTAL Toda materia, inorgánica y orgánica, está constituida por átomos, que corresponden a un gran número de sustancias elementales o elementos químicos, los cuales se clasifican atendiendo a diversos criterios: propiedades, lugar de descubrimiento, nombres científicos, etc (Picado y Álvarez, 2008). Es incierto el número total de elementos químicos existentes ya que seguramente algunos están por descubrir y otros citados en la bibliografía científica no han sido confirmados por la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) al ser descubiertos en condiciones de laboratorio (elementos sintéticos), siendo precisos estudios más detallados. Según los datos publicados por la IUPAC en 2007, se cita la existencia de 118 elementos químicos (algunos pendientes de confirmación) (Karol et al., 2001; Holden y Coplen, 2004; IUPAC, 2008). Uno de los intentos más destacados para clasificar los elementos químicos descubiertos hasta entonces fue el trabajo desarrollado por el químico ruso Dimitri Ivanovich Mendeleev en su tabla periódica, la cual se basa en ordenar los elementos según sus propiedades químicas y, más importante aún, el haber pronosticado y adelantado las propiedades de elementos no descubiertos hasta entonces (Picado y Álvarez, 2008). Otros estudiosos siguieron los pasos de Mendeleev, como por ejemplo Lothar Mayer que estableció una clasificación atendiendo a las propiedades físicas o Henry Moseley que plasmó la ley periódica moderna, según la cual "las propiedades de los elementos químicos y sus compuestos son funciones periódicas del número atómico de los elementos", Revisión bibliográfica 36 ordenando los 105 elementos químicos en función de su número atómico (Picado y Álvarez, 2008; Reger et al, 2009). Por definición, los elementos traza son los 80 elementos químicos que presentan una concentración en la corteza terrestre por debajo del 0,1%, para cada uno de ellos. En conjunto, todos no constituyen más del 0,6% del total, mientras que los 12 elementos mayores restantes (oxígeno, hierro e hidrógeno, entre otros), suponen un 99,4%. Dentro de este amplio grupo, algunos elementos traza son indispensables para el desarrollo de procesos biológicos esenciales, por lo cual son identificados como oligoelementos. A pesar de ello, estos minerales esenciales pueden ser también tóxicos para diversas formas de vida cuando sus concentraciones sean elevadas (o bien en función de las formas químicas en que se presenten). Es, por ejemplo, lo que ocurre con el cobre, el zinc o el cromo. Pero existe un segundo grupo de elementos traza cuya esencialidad no se ha demostrado y, por tanto, presentan un carácter potencialmente tóxico a dosis muy bajas. Dentro de éstos destacan especialmente: cadmio, mercurio y plomo (Kolf-Clauw et al., 2007). Los elementos metálicos conforman la mayoría de elementos de la tabla periódica, siendo relativamente poco frecuentes en el medio natural; en general, los más abundantes corresponden a los pertenecientes a los primeros períodos de cada grupo. Así, los metales alcalinos y alcalinotérreos más ligeros (Na, K, Mg y Ca) son profusos, sobre todo en su forma catiónica, como especies muy solubles y están presentes en concentraciones relativamente elevadas en el medio hidrosférico. En el suelo, esos cationes ocupan sitios de intercambio en las fases sólidas, en equilibrio con el medio acuoso de la disolución del suelo (Doménech y Peral, 2006). Respecto a los metales de transición, los más abundantes pertenecen a los períodos 3 y 4, los cuales forman parte de distintos minerales. Tal es el caso del Al, Mn, Fe, Cu, Zn y Ti. Se encuentran en fase sólida, particularmente como óxidos y aluminosilicatos. Aunque estos metales son relativamente frecuentes en el suelo y la litosfera, son muy poco solubles, de manera que la concentración en la hidrosfera es muy baja (Doménech y Peral, 2006). Los elementos metálicos presentes en los sistemas acuosos a muy baja concentración se denominan elementos traza. Algunos de ellos son nutrientes esenciales para plantas y animales (Mn, Mo, Cu, Co, Zn, Se y V), mientras que otros elementos (Ni, Sn y Cr) son esenciales sólamente para los animales. Es importante tener en cuenta que cuando estos elementos están presentes en sistemas ambientales a concentraciones superiores a ciertos niveles, bien como consecuencia de desequilibrios naturales o, sobre todo, debido a su introducción por mediación de la actuación humana, pueden resultar tóxicos para los seres vivos (Doménech y Peral, 2006). En los últimos 20 años, el término de metales pesados se ha usado ampliamente en el campo de las ciencias ambientales asociado a un grupo de metales y semimetales (metaloides) que causan un impacto ambiental debido a su potencial toxicidad o ecotoxicidad (Duffus, 2002; Doménech y Peral, 2006). Revisión bibliográfica 37 Es importante destacar que el término metal pesado no ha sido nunca definido por ninguna entidad con autoridad como la IUPAC. En los años 60 esta denominación empezó a emplearse en química, otorgándole numerosos significados por diferentes autores. Pero lo cierto es que no existe coherencia científica al no haber una relación entre la densidad y ninguna de las demás variables fisicoquímicas con los conceptos que se han empleado para definir los metales pesados y la toxicidad o ecotoxicidad que se les atribuye, haciendo que el término se haya quedado obsoleto (Duffus, 2002). Al mismo tiempo que se acuña el término de metales pesados surgen regulaciones legales que especifican una lista de metales pesados para su aplicación. Estas listas pueden diferir entre unas normativas y otras ya que el término en cuestión, como se ha mencionado, no especifica cuales son los elementos químicos incluidos en este grupo. Existe una tendencia, no soportada en hechos, que asume que todos los metales pesados, denominados así, y sus compuestos son altamente tóxicos o ecotóxicos, no existiendo datos químicos o toxicológicos que lo avalen. Así pues, el término metal pesado se presupone que incluye todas las especies y compuestos con las mismas propiedades fisicoquímicas, biológicas y toxicológicas, pero esta afirmación no es cierta. En un futuro debería establecerse una nueva clasificación basada en la tabla periódica que refleje conocimientos químicos y datos toxicológicos que se puedan predecir (Duffus, 2002). Aunque cada elemento químico presenta una serie de propiedades que lo caracterizan, existen otras comunes a todos los metales. Así por ejemplo, entre las propiedades físicas de los metales se citan (Picado y Álvarez, 2008): Sólidos a temperatura ambiente, a excepción del mercurio. Estructura cristalina. Muestran brillo metálico y reflejan la luz. Dúctiles y maleables. La mayoría presentan tenacidad. Conductividad de calor y electricidad. Punto de fusión y ebullición generalmente altos. Densidades variables, desde 1 g/cm3 hasta 22,95 g/cm3. En la tabla periódica se localizan a la izquierda de la línea quebrada que va del astato al boro. Así mismo, entre las propiedades químicas de los metales se pueden enumerar las siguientes (Picado y Álvarez, 2008): Sus átomos disponen de 1, 2 ó 3 electrones en su última capa, pudiendo perderlos dando lugar a la formación de iones. Sus moléculas son monoatómicas. Se combinan con los no metales formando sales. Revisión bibliográfica 44 La interferencia de los niveles de zinc en los procesos de almacenamiento y empleo de hierro y cobre, origina una supresión de la hematopoyesis y así, dietas con un nivel elevado de zinc interfieren en la acumulación de cobre hepático e impiden la absorción intestinal del calcio (Gupta, 2007). En una intoxicación por zinc también pueden observarse cuadros de pancreatitis y artritis aguda (Gupta, 2007). 3.4.2. PLOMO 3.4.2.a. Propiedades fisicoquímicas Se puede definir este elemento como un metal sólido gris-azulado, pesado, dúctil y maleable que presenta las siguientes propiedades fisicoquímicas: Tabla 7. Propiedades fisicoquímicas del plomo (Kaplan y Pesce, 1991; Gil, 2005; ATSDR, 2008) 3.4.2.b. Fuentes de plomo En la naturaleza se encuentra normalmente en forma de sulfuro, mineral que recibe el nombre de galena. Es un metal resistente a la acción de algunos ácidos fuertes, como el ácido sulfúrico; sin embargo, suele ser fácilmente atacado por ácidos orgánicos e incluso por aguas ricas en nitratos, sales de amonio o de carácter ácido (Gil, 2005). Debemos hablar no sólo del plomo sino de sus derivados, pudiendo distinguir (Gil, 2005):  Inorgánicos: son poco solubles y, por lo tanto, de escasa toxicidad. Entre ellos tenemos los óxidos (el más conocido el minio u óxido de plomo rojo, que es base de pinturas anticorrosivas), el cromato (se usa como colorante amarillo), el arseniato de plomo (presente en algunos plaguicidas), el carbonato (empleado como pigmento blanco) y el sulfuro o galena (utilizado por ceramistas y alfareros). Número atómico 82 Punto de fusión 327,40ºC Punto de ebullición 1740,00ºC Solubilidad Insoluble Presión de vapor 1,77 mmHg (1000ºC) Valencias +2 + 4 Masa atómica 207,19 g/mol Densidad 11,34 g/ml (20ºC) Revisión bibliográfica 45  Orgánicos: resultan más solubles y también más tóxicos. En este grupo se encuentran el acetato de plomo o sal de Saturno (muy soluble, se empleó como abortivo), el estearato (aditivo de plásticos), el naftaleno de plomo (empleado en aceites industriales) y el plomo tetraetilo (usado durante mucho tiempo como antidetonante en los carburantes). El plomo inorgánico, que proviene de varias fuentes industriales y mineras, se encuentra en el agua en el estado de oxidación +2. Los gases emanados por combustión de la gasolina con plomo constituyeron una importante fuente de contaminación atmosférica y terrestre de este metal. Además de las fuentes contaminantes, la caliza portadora de plomo y la galena (PbS) aportan este metal a las aguas naturales (Manahan, 2007). El plomo aparece ampliamente distribuido en el medio ambiente pero en baja concentración (Roder, 2002). Cuando se libera al aire, como consecuencia de una actividad industrial o minera, puede ser transportado a largas distancias antes de depositarse en el suelo (Kaplan y Pesce, 1991). Las fuentes naturales de liberación de este metal hacia la atmósfera están asociadas principalmente con el vulcanismo y, en una menor proporción, con la erosión eólica. Sin embargo, estos aportes son, en general, del orden de 10 veces menos importantes que los efectuados por otras contaminaciones (Kolf-Clauw et al., 2007). Por tanto, la mayor parte del plomo que se encuentra en el medio ambiente procede de actividades humanas como (Kaplan y Pesce, 1991; Roder, 2002; Gil, 2005): Extracción, tratamiento, fundición, laminado y vaciado de plomo, así como de sus aleaciones y de metales plumbíferos (fundamentalmente la galena). Fabricación y reparación de acumuladores de plomo (baterías). Fabricación y manipulación de pinturas, lacas, barnices y materias plásticas. Extracción y producción de combustibles fósiles (como antidetonante). Trabajos en alfarería y vidrios al plomo. Fabricación de municiones, artículos pirotécnicos y de pesos de plomo para pesca. Recuperación de chatarra (reciclado de plomo). Preparación y empleo de insecticidas con arseniato u otras sales de plomo. Blindajes de recintos de radiología. Soldaduras. Es importante destacar que el plomo se ha empleado durante siglos en las tuberías del agua, en barnices y en pinturas, presentando estas últimas un contenido en plomo de hasta el 40% de su peso seco (Curtis et al., 1998). Revisión bibliográfica 46 La intoxicación crónica por plomo, sobre todo en zonas urbanas, ha llevado a restricciones legislativas en el uso del plomo, especialmente en pinturas y gasolina (Curtis et al., 1998; Roder, 2002). Hasta 1999 la parte de contaminación aportada por el transporte rodado se consideraba la mayoritaria, pero la introducción de los carburantes sin plomo y la prohibición de la gasolina con plomo ha hecho que la contribución de esta fuente haya perdido toda preponderancia, siendo desde hace pocos años la industria de la manufacturación la que emite más plomo al medio ambiente (KolfClauw et al., 2007). Por el contrario, el plomo asociado a la caza, a pesar de tratarse de un fenómeno localizado en la escala global de la biosfera, manifiesta un importante impacto ecotoxicológico (KolfClauw et al., 2007). Sólo en Francia, se estima que cada año los cazadores liberan al medio alrededor de 60 toneladas de plomo. En algunos humedales de la Península Ibérica se han observado valores de 22,5 a 85,7 perdigones de plomo/m2 en los 10 cm más superficiales del sedimento (Mateo et al., 2006). Especial interés en alimentación presentan los forrajes contaminados con el plomo de operaciones de los hornos de fundición y aquellos que han crecido en suelos contaminados con plomo procedente de actividades industriales (Roder, 2002). 3.4.2.c. Funciones y efectos tóxicos del plomo La intoxicación por plomo ya aparece referenciada en textos egipcios (4.000 a.C.), y la primera descripción de Hipócrates del cólico saturnino data del año 460 a.C.. Junto con el benceno ha sido una de las intoxicaciones profesionales más importantes y frecuentes en la historia. Estas patologías aparecen recogidas en el Real Decreto 1299/2006, de 10 de noviembre, por el que se aprueba el cuadro de enfermedades profesionales en el sistema de la Seguridad Social y se establecen criterios para su notificación y registro, cuyo grupo 1 del anexo I contempla las enfermedades profesionales causadas por agentes químicos, entre ellos, los metales pesados. En medicina veterinaria, la intoxicación por plomo se describe con más frecuencia en perros, bovinos, caballos y aves acuáticas (Merck, 2000) y, en menor medida, en gatos, cabras, ovejas y pollos, debido a los hábitos alimenticios más selectivos, a una menor accesibilidad o una menor susceptibilidad (Merck, 2000; Roder, 2002 ). Por otra parte, destaca la elevada tolerancia que muestran los cerdos a la ingesta de este metal (Blood, 2002; Roder, 2002). La vía de ingreso más habitual es la digestiva, si bien la vía inhalatoria se ha descrito en algunos casos (Blood, 2002). La toxicidad del plomo depende de la forma química en que se encuentre, siendo más tóxicas las sales que el propio plomo metálico. Esta toxicidad, según Jurado (1989) decrece en el siguiente orden: nitrato, acetato, cloruro, sulfato, sulfuro y fosfato. También se debe considerar que cualquier situación de estrés exacerba los efectos de la intoxicación (Pain y Rattner, 1988). El plomo actúa prácticamente sobre todos los tejidos y órganos mediante su unión al grupo sulfhidrilo de los sistemas enzimáticos, siendo especialmente sensible el sistema nervioso central, en Revisión bibliográfica 47 especial en animales en desarrollo (Kuschinsky y Lüllmann, 1973; Mateo et al., 2006; Piedrola, 2008). A nivel encefálico, los niveles elevados de plomo originan un desequilibrio en la liberación de neurotransmisores, dando lugar a alteraciones del comportamiento, desmielinización periférica y degeneración axonal (Klaassen y Watkins, 2001). Otros órganos que se ven seriamente afectados son los riñones y el aparato reproductor (Kuschinsky y Lüllmann, 1973; Piedrola, 2008). Puede alterar la producción de hemoglobina y citocromos (Hermoso de Mendoza et al., 2008). También puede reemplazar al zinc como cofactor enzimático en algunas vías metabólicas (Roder, 2002). En rumiantes, las partículas de plomo alojadas en el retículo se disuelven lentamente y liberan cantidades significativas de plomo (Merck, 2000). Además de la hemorragia cerebelar y el edema asociado con las lesiones capilares, el plomo es irritante, inmunodepresor, gametotóxico, teratogénico, nefrotóxico y dañino para el sistema hematopoyético (Merck, 2000), a todo ello se debe añadir el demostrado efecto carcinógeno en animales (Hermoso de Mendoza et al., 2008). 3.4.3. CADMIO El cadmio fue descubierto por Friedrich Stromeyer en 1817, debiéndose su nombre al vocablo latino cadmia, procediendo este del término griego kadmeia, que significa calamina, un mineral de zinc (carbonato de zinc anhidro), al que se parece mucho el cadmio. La calamina debe su nombre a que se extraía en Kadmea, la ciudadela de Tebas, la cual, según la mitología griega, fue fundada por Cadmio, hijo de Agenor, rey de Fenicia. Plinio, por su parte, otorgó el nombre de cadmia a un polvo de tonalidad parduzca que se acumulaba en las chimeneas de los hornos de fusión que se empleaban en la fabricación de latón. A partir de este polvo pardo (carbonato de zinc), aisló Stromeyer el cadmio (Hernández, 2006). 3.4.3.a. Propiedades fisicoquímicas Se trata de un metal de color blanco-metálico con matiz azulado, brillante y dúctil (Gil, 2005). Revisión bibliográfica 48 Tabla 8. Propiedades fisicoquímicas del cadmio (Gupta, 2007; ATSDR, 2008). 3.4.3.b. Fuentes de cadmio El cadmio es un metal de transición divalente que no se encuentra en estado libre en la naturaleza, pero sí en forma mineral combinado con otros elementos formando óxido, cloruro o sulfato de cadmio (Gupta, 2007). Las fuentes naturales de cadmio son las erupciones volcánicas, la erosión y lavado de rocas graníticas y los incendios forestales. En la industria se obtiene como residuo a partir de la fundición y refinamiento de los minerales de zinc, plomo y cobre (por lo general contienen entre un 0,2 y un 0,4% de este metal), así como por el empleo de fertilizantes fosfatados (Sarabia, 2002; Gupta, 2007; Guzmán, 2007; Hermoso de Mendoza et al., 2008). El cadmio es un metal fácilmente atacable por ácidos pero de difícil oxidación, propiedad por la que fue utilizado para proteger a otros metales como el hierro y el acero contra la corrosión. Actualmente se emplea en infinidad de productos y procesos industriales, entre ellos (Méndez, 2001; Blood, 2002; Gupta, 2007): Baterías de níquel-cadmio. Preparación del cadmio por procesado del zinc, cobre o plomo. Aleaciones de cadmio con acero y cobre, aumentando así su resistencia. Producción de acero y hierro. Fabricación de lámparas fluorescentes. Galvanoplastia electrolítica (metalizado) por su resistencia a la corrosión. Fabricación de pigmentos (pinturas, tintes, textil, papel, plásticos, cerámica o pirotecnia) a Número atómico 48 Punto de fusión 321,00ºC Punto de ebullición 765,00ºC Solubilidad Insoluble Presión de vapor 1 mmHg (394ºC) Valencias 2 Masa atómica 112,41 g/mol Densidad 8,65 g/ml (25ºC) Revisión bibliográfica 49 partir de sulfuros (amarillos y naranjas) o sulfoseleniuros (rojos). Contaminante de abonos fosfatídicos. Antihelmínticos. En reactores nucleares por su capacidad de absorber neutrones. Aditivo de plásticos (estearato de cadmio). Aleaciones para soldadura, en la que el cadmio sustituye al estaño, formando electrodos de manganeso-cadmio. Desde un punto de vista industrial destaca el empleo del cadmio en distintas formas: óxidos, sulfuros, cloruros, bromuros, sulfatos o carbonatos, según las aplicaciones a las que se destine el metal (Gil, 2005). El cadmio se dispersa en el medio ambiente procedente de fuentes como la minería, la industria, por la combustión del carbón, incendios forestales, incineración de basuras domésticas y erupciones volcánicas, pudiendo viajar largas distancias a través del aire antes de depositarse en el suelo o el agua (ATSDR, 1999). El contenido de cadmio en el suelo es relativamente bajo y su absorción vegetal pobre, no siendo preocupante su entrada directa en la cadena alimentaria humana (NRC, 2001). No obstante, el empleo de fertilizantes con productos fosforados ricos en cadmio y la presencia de residuos urbanos en los suelos favorece su absorción vegetal y su posterior incorporación a la cadena alimentaria de los herbívoros (NRC, 2001; Gupta, 2007). En la aplicación de abonos de tipo superfosfato radica el origen de la contaminación del suelo, pues los abonos, sean tanto naturales como químicos, contienen impurezas, siendo el cadmio una de las principales (Kolf-Clauw et al., 2007). Entre las posibles fuentes de intoxicación no profesional cabe destacar la debida a la ingestión de moluscos bivalvos con niveles elevados de cadmio. Hoy día son menos frecuentes los casos acaecidos como consecuencia del consumo de alimentos conservados en latas galvanizadas que contenían cadmio, ya que este metal se disuelve en ácidos orgánicos incorporándose así a los alimentos. En la actualidad estos envases y utensilios están sometidos a una legislación específica restrictiva (Gil, 2005). 3.4.3.c. Funciones y efectos tóxicos del cadmio Las intoxicaciones industriales por cadmio resultan de la exposición excesiva a polvos y humos que se desprenden en la producción del metal y de sus sales (Gil, 2005), reconociéndose como enfermedad profesional en el Real Decreto 1299/2006. Revisión bibliográfica 50 No hay evidencias de que el cadmio sea un elemento esencial para los seres vivos. Por el contrario, se ha demostrado que incluso a concentraciones muy bajas, es tóxico para todas las formas de vida (Hermoso de Mendoza et al, 2008). No obstante, algunos estudios realizados con roedores, gallinas y ganado vacuno han demostrado mayores incrementos en su peso cuando se añaden cantidades bajas de cadmio en sus dietas, desconociéndose el origen de este efecto (NRC, 2005). Los bioindicadores parecen ser muy sensibles al cadmio, siendo de gran interés para evaluar su impacto en el ecosistema (Hermoso de Mendoza et al., 2008). El efecto tóxico del cadmio se debe a los iones libres, mientras que el metal unido a la metalotioneína es menos activo (NRC, 2005). La acción tóxica se debe a su acción inhibitoria sobre los grupos sulfhidrilo, perturbando el metabolismo de los aminoácidos azufrados y la acción de numerosas enzimas (anhidrasa carbónica, deshidrogenasa, carboxipeptidas, etc.), provocando disfunciones en el crecimiento y metabolismo (Hermoso de Mendoza et al., 2008). Otro aspecto importante es que este metal compite con el zinc y otros metales, a los que reemplaza como cofactor en ciertas reacciones enzimáticas. El interés de este hecho radica en el eventual papel preventivo del zinc en las intoxicaciones crónicas por cadmio (NRC, 2005). MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 53 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. TOMA DE MUESTRAS La determinación de metales pesados en este estudio se realiza en muestras procedentes de ejemplares de zorro común (Vulpes vulpes), de distintas edades y sexos, recogidas en localizaciones representativas de las cuatro provincias gallegas durante un periodo de 8 años (2003-2011). Este trabajo se ha realizado finalmente con 257 ejemplares seleccionados tras un estricto control, desechando todos aquellos animales que presentaban restos de munición (perdigones) o lesiones de origen traumático en la cavidad abdominal, por lo que el número de zorros examinados ha sido considerablemente mayor. La totalidad de los animales incluidos en este estudio proceden de batidas de caza autorizadas por la autoridad competente en la Comunidad Gallega, en fecha y localización, para el control poblacional del zorro, contando además con la colaboración del personal de la Federación Galega de Caza (FGC). La toma de datos básicos (edad, sexo, localización, etc.) y de biometría se lleva a cabo en el lugar de reunión posterior a la cacería, donde se realiza el control oficial de los animales abatidos, siendo cada animal identificado con un crotal auricular para garantizar la trazabilidad. Posteriormente todos los cadáveres se trasladan a la sala de necropsias de la Facultad de Veterinaria de Lugo, donde se realiza la toma de muestras. Habitualmente, los restos se eliminan de forma higiénica mediante incineración, salvo que se destinen a otras actividades docentes o de investigación. En cualquier caso, la toma de muestras para este estudio se realiza el mismo día en que los animales son abatidos. En el lugar de recepción de las capturas y control oficial de la batida, con la colaboración de la Federación Galega de Caza, los cazadores y jueces de la prueba, se toman los siguientes datos acerca de cada zorro: Localización exacta (ayuntamiento y lugar) de la zona de captura de cada ejemplar. Se realiza con la ayuda de mapas topográficos facilitados por la FGC en los que se incluyen los núcleos de población. Determinación de la edad de los ejemplares atendiendo a diversos factores: desarrollo corporal, aspecto externo del animal, desarrollo de los genitales y estado de las piezas dentales. Dado que éste no deja de ser un método subjetivo que depende de la pericia del observador, sólo se establecen tres grupos de edad para que resulte más sencillo ubicar a cada animal en su grupo. Aquellos ejemplares que no se puedan incluir con exactitud en alguno de los grupos de edad son excluidos del estudio. Los grupos de edad establecidos son: Material y métodos 60 El puesto de trabajo consta de una cubeta de vidrio donde se deposita la muestra y tres electrodos: Electrodo de trabajo o electrodo multimodo de mercurio (MME). Electrodo de referencia, formado por un sistema de referencia Ag/AgCl y tampón KCl 3 M. Electrodo auxiliar de platino. Se añade la disolución (50 ml) a la cubeta de medida del voltamperímetro y se miden los 3 metales pesados en un solo segmento y por duplicado, midiendo dos blancos diarios. Por su parte, las condiciones operativas de trabajo en este dispositivo para la determinación de cadmio, plomo y zinc en la disolución final se concretan en la tabla 9. La cuantificación de los niveles de metales pesados en la solución final se realizó mediante la técnica de adición de patrón estándar con las condiciones que aparecen reflejadas en la tabla 10. Tabla 9. Características del segmento de medida del Zn-Cd-Pb en el voltamperímetro Metrohm ®. Purga de nitrógeno 300 seg a 2.000 rpm Técnica HMDE (tamaño de gota 4) Modo de medición Diferencial de impulsos (DPMODE) Tiempo de electrolisis 30 seg Amplitud de impulsos 6 mV 40 mseg 15 seg Inicio de medición -1,250 mV Fin de medición - 200 mV Velocidad de barrido 20 mV/seg Electrolito de soporte Ninguno Potencial de verificación (Cd) - 585 mV ± 30 mV Potencial de verificación (Pb) - 375 mV ± 50 mV Potencial de verificación (Zn) - 960 mV ± 50 mV Tiempo de repetición de impulsos Tiempo de reposo tras electrolisis Material y métodos 61 Tabla 10. Condiciones de realización de la técnica de adición de patrón estándar Siguiendo esta técnica se elabora una curva de calibrado para cada muestra, de utilidad para cuantificar la concentración final de metales pesados. En la siguiente gráfica se pueden observar las curvas obtenidas en el análisis de las muestras procesadas, así como las curvas de calibrado. Gráfica 2. Curvas obtenidas en los análisis voltamperométricos en dos muestras de hígado elegidas al azar. Izquierda: curvas para cadmio y plomo tras el barrido. A la derecha, sus correspondientes curvas de adición estándar para la cuantificación. Volumen de muestra 10 ml Adición de solución de patrones 2 por análisis Volumen de solución de patrones / adición 100 μl Concentración de Cd en solución patrón: ●Para hígado: ●Para riñón: 0,2 mg/l 2 mg/l Concentración de Pb en solución patrón: ●Para hígado: ●Para riñón: 2 mg/l 1 mg/l Concentración de Zn en solución patrón: ●Para hígado: ●Para riñón: 25 mg/l 10 mg/l Material y métodos 62 4.3.2. VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE ANÁLISIS 4.3.2.a. Exactitud La exactitud indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor real. En este caso se compara el valor medio obtenido por el método propuesto para la determinación del metal con el valor medio obtenido por un método ya validado. Así, la validación de la técnica de determinación de metales en muestras renales y hepáticas de zorros se lleva a cabo mediante el empleo de una muestra certificada de músculo bovino liofilizado del BCR (referencia nº 184) que presenta las siguientes concentraciones certificadas: Pb 239 ng/g Cd 13 ng/g Zn 166 μg/g Tabla 11. Concentraciones de Cd, Pb y Zn en muestra certificada de músculo bovino liofilizado del BCR (referencia nº 184) De la muestra certificada se hicieron un total de 8 replicados utilizando 0,15 g de músculo liofilizado y 4 replicados de blanco que se sometieron al procesado y cuantificación detallados anteriormente. Los resultados de la exactitud del método fueron los mostrados en la tabla 12. De todos estos resultados se deduce la viabilidad del método empleado para la determinación de metales pesados en tejidos biológicos. Tabla 12. Porcentaje de recuperación de metales pesados en muestra certificada. 4.3.2.b. Linealidad y sensibilidad Para poder realizar una cuantificación de forma fiable, es preciso que se dé una relación lineal entre la concentración de los metales pesados en las muestras en estudio y las existentes en una disolución patrón. Si elaboramos una disolución patrón y la sometemos a diluciones seriadas y conocidas, conseguiremos conocer la respuesta lineal del equipo y podremos conocer la dilución más baja capaz de ser determinada por el voltamperímetro. Para el estudio de linealidad se emplean diversas disoluciones patrón de concentraciones decrecientes en agua Milli-Q que se someten al procesado de digestión descrito con anterioridad. Así, se analizaron las siguientes disoluciones patrón para los distintos metales incluidos en este estudio: Para el cadmio: 0.5, 1, 3 y 5 μg/l. Cd Pb Zn Recuperación (%) 98,92 91,35 113,40 Coef. Variación en la muestra certificada (%) 5,60 8,30 7,80 Coef. Variación en los blancos (%) 4,40 4,50 9,70 Material y métodos 63 Para el plomo: 1, 5, 10 y 15 μg/l. Para el zinc: 25, 50, 100 y 200 μg/l. En todos los casos, tal como se puede apreciar en las siguientes gráficas, se obtiene una buena linealidad entre las concentraciones estudiadas, obteniendo en todos los casos unos coeficientes de correlación (R2) superiores a 0,99. Gráfica 3. Linealidad de respuesta frente a distintas concentraciones de zinc. Gráfica 4. Linealidad de respuesta frente a distintas concentraciones de plomo. Gráfica 5. Linealidad de respuesta frente a distintas concentraciones de cadmio. Material y métodos 64 El límite de detección se calcula a partir de estas linealidades aplicando el criterio de que la altura del pico fuera como mínimo el triple del valor encontrado para una muestra blanco, diferenciándose claramente de la línea base y dando una altura que permitiera una cuantificación con garantías. En el caso de los tres metales pesados incluidos en el estudio la más baja concentración ensayada en la linealidad cumplían de sobra estos criterios por lo que fueron establecidas como límite de detección (ver tabla 13 adjunta). A todas aquellas muestras con unas concentraciones inferiores a los límites de detección señalados se les asignó un valor a efectos estadísticos de la mitad del correspondiente límite de detección. Tabla 13. Límites de detección de la metodología analítica empleada en el presente estudio. 4.3.2.c. Control de calidad Además de las pruebas de validación descritas en los puntos anteriores, a cada lote de muestras se le realiza un control de calidad del análisis que se puede resumir en los siguientes dos puntos: Estudio de blancos: con este estudio se pretende asegurar la ausencia de contaminación de los reactivos empleados en el procesado y análisis de las muestras. Muestras duplicadas: con lo que se pretende asegurar la reproductibilidad del método. Así, en cada lote de muestras, una de ellas es procesada por cuadriplicado y en una de las mismas se añade una cantidad conocida (400 μl) del patrón de adición. La recuperación y variabilidad obtenida en estas muestras duplicadas garantiza la adecuación del método. 4.4. REACTIVOS, MATERIAL E INSTRUMENTAL UTILIZADO 4.4.1. REACTIVOS Ácido nítrico 69 % para análisis de trazas (Scharlau). Ácido sulfúrico 94% para análisis de trazas (Scharlau). Ácido clorhídrico 37% para análisis de trazas (Scharlau). Cadmio Plomo Zinc Límite de detección instrumental 0,25 μg/l 1,25 μg/l 1,25 μg/l 0,005 mg/kg 0,025 mg/kg 0,025 mg/kg Límite de detección extrapolado a las muestras analizadas Material y métodos 65 Ácido perclórico 70% para análisis (Scharlau). Agua ultrapura Milli-Q. Solución patrón de cadmio (1.000 mg/l) en ácido nítrico al 2% (Scharlau). Solución patrón de plomo (1.000 mg/l) en ácido nítrico al 2% (Scharlau). Solución patrón de zinc (1.000 mg/l) en ácido nítrico al 2% (Scharlau). Mercurio metálico tridestilado (Panreac). Acetona de grado analítico ACS (Scharlau). 4.4.2. MATERIAL Cuchillo, tijeras y pinzas de plástico (disección de las muestras). Recipientes de polipropileno de 60 ml de volumen (secado de las muestras). Tubos de vidrio borosilicatado de fondo redondo de 120 x 25 mm y 1,5 mm de espesor de pared (digestión de las muestras). Tubos de polietileno de fondo cónico con faldón graduados de 40 ml (recogida y almacenamiento de la muestra resuspendida). Tubos de polietileno de fondo cónico graduados de 15 ml (colocación de la muestra en el automuestreador). Material de plástico y vidrio de uso habitual en el laboratorio. 4.4.3. INSTRUMENTAL Agitador de tubos Rex 2000 (Heidolph). Estufa de desecación modelo 2000200 (Selecta). Balanza de precisión 110 g x 0,1 mg modelo 1801 (Sartorius). Aparato de producción de agua ultrapura Milli-Q plus (Millipore). Congelador -80 ºC Ultralow Freezer (Nuaire). Bloque digestor Technicon BD-40 con controlador de temperatura Technicon BD20/40. Equipo de voltamperometría (Metrohm) compuesto por: ◦ Procesador 746-VA Trace Analyser. Material y métodos 66 ◦ Puesto de trabajo 747-VA Stand. ◦ Automuestreador 813 Compact Autosampler. ◦ Programa informático VA Database 2.1. 4.5. ANALISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS El tratamiento estadístico de los resultados se realiza mediante el programa estadístico SPSS 18.0 para Windows con licencia para la Universidad de Santiago de Compostela. En primer lugar, después de una descripción de la población muestral y de las frecuencias observadas en cada grupo y subgrupo, se realiza el análisis de los principales estadísticos descriptivos (media, desviación típica, etc.) de las concentraciones de plomo, cadmio y zinc en los riñones, hígado y pelo de todos los ejemplares incluidos en el estudio. En segundo lugar, se realizó el estudio de las correlaciones a través del coeficiente de correlación de Pearson. Se estudiaron las correlaciones existentes entre los diferentes metales y tejidos entre sí, teniendo en cuenta las variables de clasificación sexo, edad y hábitat. Posteriormente se realiza el análisis de varianza, iniciando el estudio con el test de Levene para cada variable con el fin de comprobar la existencia de homocedasticidad (varianzas iguales) o heterocedasticidad. En los casos de las variables que el resultado del Test de Levene posee un valor p ≥ 0,1 y que por tanto podemos asumir varianzas iguales en los diferentes grupos, aplicamos ANOVA con las pruebas post hoc HSD de Tukey y DMS. En los casos de las variables con heterocedasticidad, en las que no se puede asumir que las varianzas sean iguales, realizaremos transformaciones Box-Cox para lograr varianzas iguales y analizar mediante ANOVA. Después de esto, en las variables que no muestren varianzas iguales, teniendo en cuanta que el tamaño de muestras en todos los grupos es grande (más de 30 en todos los casos) realizaremos una comparación por pares mediante el test “t”, como aproximación al test utilizado en distribución normal para muestras grandes. A cada muestra por debajo del límite de detección de la instrumentación se le asignó un valor correspondiente a la mitad del límite de detección del elemento en cuestión para el estudio estadístico, para de esta manera minimizar el error nominal de tipo I (Clarke, 1998). Así mismo se aplicó un test de Spearman para determinar las correlaciones en el contenido de los distintos metales estudiados en las diferentes muestras biológicas. Para todos los ensayos, los valores de p considerados para determinar las diferencias significativas fueron p<0.001, <0.01 y <0.05. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión 69 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A lo largo del presente apartado se relacionan los resultados obtenidos en las diferentes observaciones y análisis realizados en las muestras procedentes de los 257 ejemplares que conformaron el grupo de estudio, tratados estadísticamente y ordenados en tablas de resultados y gráficas. 5.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A OBSERVACIONES GENERALES SOBRE EL GRUPO DE ESTUDIO. El grupo de ejemplares considerados en la presente tesis doctoral estuvo formado por 257 individuos, 145 machos (56,4%) y 112 hembras (43,6%) (Tabla 14). El número de machos es ligeramente más elevado que el de hembras, aunque la diferencia del número de ejemplares depende exclusivamente de la oportunidad de recoger las piezas capturadas sin que, en nuestra opinión, existan factores que condicionen este extremo, excepto tal vez, la mayor movilidad de los machos en las últimas jornadas de caza como consecuencia del inicio del celo, extremo que ha sido observado con anterioridad por nuestro grupo de investigación (Fidalgo, 2010). Tabla 14: Clasificación en grupos en función del sexo de los zorros estudiados. El número mayor de machos que de hembras, coincidentes con las observaciones de otros estudios realizados por nuestro grupo de investigación con anterioridad, parece indicar que en edad temprana mueren más hembras que machos y, en ausencia de otros datos bibliográficos al respecto, opinamos que pueda deberse a la mayor actividad desarrollada a edad temprana por las hembras, de la misma forma que ocurre en otros carnívoros, lo que las hace más vulnerables (González, 2004; Fajardo, 2008). En cualquier caso, la relación macho/hembra en la muestra (1,295 machos por cada hembra) es coherente con la encontrada en la mayoría de estudios, próxima a la unidad, pudiendo oscilar algo en función de la época del año en que se realice el muestreo (Vos, 1995; Chalon et al., 1998; Fidalgo et al., 2009). Subgrupos por sexo Frecuencia Porcentaje Hembra 112 43,60 Macho 145 56,40 Total 257 100 Resultados y discusión 76 medias para riñón e hígado estaban situadas por debajo de los valores críticos respectivos de 15 y 5 ppm en peso seco, que se consideran como indicativo de la toxicosis en los mamíferos (Ma, 1996), incluso si no se han definido niveles específicos para el zorro. Sin embargo, conviene señalar que concentraciones de plomo en el hígado situadas en el entorno de 25-35 ppm (peso seco) están asociadas con signos clínicos evidentes de envenenamiento en otras especies de mamíferos relacionadas (Ma, 1996). Hay que señalar que algún animal se ha encontrado ligeramente por encima del límite considerado tóxico para el hígado, con un valor máximo de 5,98 ppm (peso seco), lo que indica un riesgo posible y real de envenenamiento por plomo. ª, La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral) ªª, La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral) Tabla 19. Correlaciones bivariadas de los tres metales pesados estudiados en los diferentes tejidos. N=267 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pb hígado Pb riñón Pb pelo Cd hígado Cd riñón Cd pelo Zn hígado Zn riñón Zn pelo Pb hígado Cor. Pearson Sig (bilateral) -0,124 ª 0,048 -0,063 0,311 -0,183ªª 0,003 -0,103 0,099 -0,008 0,896 -0,231ªª 0,000 -0,018 0,780 0,036 0,565 Pb riñón Cor. Pearson Sig (bilateral) -0,016 0,796 0,059 0,345 0,033 0,596 0,126ª 0,043 0,056 0,375 -0,021 0,739 -0,044 0,481 Pb pelo Cor. Pearson Sig (bilateral) 0,016 0,795 0,078 0,215 0,095 0,128 0,017 0,782 -0,042 0,500 -0,017 0,791 Cd hígado Cor. Pearson Sig (bilateral) -0,082 0,189 -0,026 0,673 -0,035 0,581 -0,047 0,457 -0,009 0,886 Cd riñón Cor. Pearson Sig (bilateral) -0,032 0,608 0,086 0,171 -0,030 0,628 -0,096 0,125 Cd pelo Cor. Pearson Sig (bilateral) 0,029 0,642 0,050 0,426 -0,075 0,231 Zn hígado Cor. Pearson Sig (bilateral) 0,105 0,092 -0,021 0,734 Zn riñón Cor. Pearson Sig (bilateral) -0,004 0,955 Zn pelo Cor. Pearson Sig (bilateral) Resultados y discusión 77 Al comparar estos resultados con los obtenidos en otros estudios similares, realizados con el zorro como bioindicador, como los efectuados en la región suiza de Zurich (Dip et al., 2001) o en la región de Zemplín en Eslovaquia (Piskorova et al., 2003) se observa que la distribución de los metales en los diferentes tejidos sigue las mismas pautas que las aquí expuestas, aunque con algunas diferencias. En cuanto al plomo en el hígado, el valor promedio obtenido en este estudio supera ligeramente el detectado por Dip et al. (2001), situado en 1,20 ± 3,61 mg/kg, pero la variabilidad observada en esta referencia fue de más del doble. Las concentraciones hepáticas medias fueron significativamente más altas que las cuantificadas en nutrias y visones de Canadá, donde los valores medios del hígado se encuentran en el rango de 0,21 a 0,79 ppm en peso seco (Harding et al., 1998). Estos valores ahora presentados también fueron superiores a los detectados en el hígado de zorro ártico (Alopex lagopus), donde los valores medios eran de 0,53 µg/g (Hoekstra et al., 2003), pero claramente inferiores a los 54,1 µg/g observados en perros por López-Alonso et al. (2006). Dichas diferencias bien podrían suponer una confirmación acerca de la idoneidad del uso del zorro y otros carnívoros domésticos y/o salvajes como bioindicadores, pues los valores más bajos se localizarían en zonas supuestamente menos expuestas a contaminaciones metálicas, mientras que los animales situados en zonas antropogenizadas estarían expuestos a niveles marcadamente superiores. Conviene señalar, sin embargo, que estos estudios se han centrado en especies diferentes, con lo cual este factor tan importante de variabilidad ha de ser tenido en consideración. Respecto al plomo en riñón, en esta investigación se han cuantificado valores inferiores a los observados en la literatura de referencia. Por un lado Dip et al. (2001) situaron los valores de plomo en este órgano en 0,57 ± 0,90 mg/kg, mientras que Piskorova et al. (2003) los situaron en 0,38 ± 0,17 mg/kg tanto para jabalí como para zorro respectivamente. Por último, para comparar los valores de este metal en pelo con los resultados de otros estudios, han de tomarse en consideración otras especies como el ciervo con 1,319 ppm o el jabalí con 2,270 ppm (Gallego, 2006), de tal forma que en ambos casos se cuantifican valores muy superiores a los aquí detectados. Con respecto a estudios en otros cánidos salvajes, como es el caso del lobo, Gamberg y Braune (1999) cuantificaron 0,56-1,95 ppm (peso seco) de este metal en muestras de riñón, y 0,110,70 ppm (peso seco) en hígado. Es digno de resaltar que el valor máximo hepático cuantificado en los lobos de Canadá se encuentra por encima de 5 ppm en peso seco, que es similar al valor máximo obtenido en el presente estudio. Del mismo modo, Shore et al. (2001) identificaron las concentraciones hepáticas de plomo en lobos rusos, llegando a un nivel máximo de 24,3 ppm en peso seco (cerca de la concentración de residuos considerada umbral y asociada con signos clínicos de intoxicación por plomo). En el caso del cadmio, ha sido también el hígado el órgano en el que se han encontrado las concentraciones medias más elevadas (1,206 ± 1,339 mg/kg), siendo también el tejido donde mayor variabilidad se encontró. El valor máximo en este órgano fue de 9,900 mg/kg y el mínimo no alcanzó Resultados y discusión 78 el límite de detección. En el riñón se obtuvieron valores medios de 0,874 ± 1,020 mg/kg, con un máximo muy similar al encontrado en el hígado (9,586 mg/kg) y un mínimo de 0,002 mg/kg. En cuanto al pelo, ha sido el tejido en el que se detectaron los valores medios más bajos (0,003 ± 0,019 mg/kg) y también con una menor variabilidad. El máximo en el pelo se situó en 0,180 mg/kg y el mínimo en este caso tampoco superó el umbral de detección. El incremento de los niveles de Cd en los tejidos renales frente a lo observado previamente con el Pb, refleja fielmente la especial toxicocinética de este metal, con una gran capacidad de excreción a través del tejido renal. A pesar de ello, y curiosamente, los valores más elevados siguen correspondiendo (aunque como se ha indicado con poca diferencia) al tejido hepático. Respecto a los estudios en otros países europeos sobre zorros, citados anteriormente al considerar el plomo, en el caso del cadmio es posible encontrar matices importantes. Confrontándolos con los datos cuantificados por Piskorova et al. (2003) de 0,25 ± 0,08 mg/kg de cadmio en riñón (no considera los otros dos tejidos) los valores del presente estudio son ligeramente superiores, aunque en ambos casos se sitúan por debajo de la unidad. Sin embargo, la distribución de las concentraciones por tejidos difiere de la registrada por Dip et al. (2001), que encontraron mayores valores medios en el riñón (1,45 ± 1,43 mg/kg) que en el hígado (0,52 ± 0,51 mg/kg). Se observa, por tanto, que los valores respecto al cadmio encontrados en la bibliografía presentan disparidades entre sí y respecto a los de nuestro estudio, seguramente como reflejo de los niveles circundantes de contaminación ambiental a que estaban sometidos los animales considerados en cada estudio en concreto. El predominio de cadmio, tanto en el hígado como en el riñón del zorro, está en línea con estudios anteriores en mamíferos, en los que se ha demostrado que el riñón alcanza concentraciones críticas en comparación con otros órganos (D'Havé et al., 2006; Dodds-Smith et al., 1992; Cooke, 2011; Shore y Douben, 1994), siendo el hígado un lugar secundario de acumulación cuando se excede la capacidad del riñón. Estudios de biomonitorización similares con lobos han mostrado mayores niveles de cadmio a los obtenidos en el presente estudio para el riñón, y menores para el hígado, encontrándose por encima de 0,9 y 2,1 ppm en peso seco, respectivamente para el hígado y el riñón (Gamberg y Braune, 1999). En concreto, en el tejido renal de los lobos de Idaho fueron cuantificadas mayores concentraciones de cadmio renal (Hoffmann et al., 2010). Los resultados obtenidos con los zorros españoles sugieren que los niveles observados se encuentran significativamente por debajo de los niveles de toxicidad aguda (Puls, 1994). Siguiendo con este estudio comparativo con otras especies animales similares al zorro objeto del presente estudio, los valores del cadmio en el hígado de zorros de Galicia fueron marcadamente superiores a los reportados en una amplia gama de mamíferos carnívoros de Canadá (0,1-0,3 ppm peso seco), Finlandia e incluso el sur de España (0,05 a 0,12 ppm peso seco) (Harding et al., 1998; Hoekstra et al., 2003; Hyvarinen et al., 2003; Millán et al., 2008a). Respecto a las concentraciones de cadmio en el pelo, no han podido localizarse referencias de estudios similares al nuestro también desarrollados en zorros y en los que se estudie el cadmio en Resultados y discusión 79 el pelo, para poder así comparar los resultados. Tal vez este hecho se debe a las bajas concentraciones de ese metal en la muestra; lo que dificulta su determinación, debe recordarse que las concentraciones de cadmio en las muestras de pelo analizadas son muy bajas, en la gran mayoría de casos situados por debajo del límite de detección (el 96,9% del total) y que sólo algunos ejemplares poseían valores apreciables por lo que únicamente se pueden ofrecer los resultados para compararlos con estudios futuros (Tabla 20). Tabla 20. Tabla de frecuencias de las concentraciones de Cd en muestras de pelo. Comparado con otras especies, el zorro ha presentado concentraciones medias de cadmio en hígado superiores a las encontradas en el zorro ártico (0,18 ± 0,03 µg/g en Hoekstra et al., 2003) y muy inferiores a las detectadas en perros (51,2-62,0 µg/g en López-Alonso et al., 2006), ocurriendo lo mismo en estos últimos si se trata del riñón (147–188 µg/g). La explicación de esta diferencia podría ser la misma que la comentada previamente en el caso del plomo, asociada a la diferente carga contaminante de los ecosistemas considerados, no guardando relación con la especie animal estudiada. Finalmente, el zinc es, como ya se ha indicado, el metal estudiado en esta tesis con mayores concentraciones medias. Además, el tejido en el que se encuentran sus promedios y variabilidad más altos es el pelo (148,3±26,92 mg/kg), con un máximo de 206,300 mg/kg y un mínimo de 93,220 mg/kg. De la misma forma que ocurría con el cadmio, no se dispone de valores de referencia para el Cd en pelo (µg/g tejido fresco) Frecuencia Porcentaje Válidos 0,0000 249 96,90 96,90 96,90 0,0025 1 0,40 0,40 97,30 0,0332 1 0,40 0,40 97,70 0,0929 1 0,40 0,40 98,10 0,0972 1 0,40 0,40 98,40 0,0992 1 0,40 0,40 98,80 0,1306 1 0,40 0,40 99,20 0,1361 1 0,40 0,40 99,60 0,1791 1 0,40 0,40 100 Total 257 100 100 Porcentaje válido Porcentaje acumulado Resultados y discusión 80 zinc en pelo de zorros dentro de los estudios consultados, por lo cual para poder hacer alguna comparación de los presentes resultados han de tenerse en consideración estudios realizados en otras especies. Como se ha indicado, el segundo tipo de tejido donde se encuentran valores medios de zinc más altos es el hígado, con casi la mitad de los que se cuantificaban en pelo (76,54 ± 25,30 mg/kg), así como un máximo de 164,80 mg/kg y un mínimo de 16,06 mg/kg. En tercer lugar, las concentraciones medias más bajas de zinc se encontraron en el riñón (17,10 ± 7,00 mg/kg), con un máximo de 37,63 mg/kg y un mínimo de 0,924 mg/kg. Esta distribución de las concentraciones coincide con la recogida por Dip et al. (2001), que también encuentran mayores cantidades en el hígado (44,90 ± 16,70 mg/kg) que en el riñón (21,20 ± 7,80 mg/kg). Para ambos tejidos, los valores medios del presente estudio llevado a cabo en Galicia se encuentran dentro o muy próximos a sus rangos de variación. Este elemento es el predominante también en el cabello humano, y resultados similares se han observado en los erizos y en otras especies de micromamíferos (D’Havé et al., 2006; Miekeley et al., 1998). Las concentraciones de zinc que se consideran como indicativas de potenciales efectos tóxicos en los mamíferos son 274 y 465 ppm en peso seco, respectivamente, para los riñones y el hígado (Eisler, 1993). Incluso los valores máximos obtenidos en el presente estudio no se acercaron a las concentraciones indicativas de posibles efectos tóxicos a los zorros. Hermoso de Mendoza et al. (2011) encontraron acumulaciones superiores de zinc en el pelo del lobo ibérico (205,242 ± 60,062 mg/kg), pero no incluyeron en su estudio otro tipo de tejidos. En el campo de los herbívoros, el estudio sobre los alces en el norte de Alaska realizado por O´Hara et al. (2001) informa de la presencia de mayores concentraciones de zinc en pelo, luego en hígado y, finalmente, en riñón, como ocurre en nuestro caso. En general, los niveles de Zn obtenidos en el presente estudio en hígado y riñón son más bajos que los cuantificados en lobos árticos (Gamberg y Braune, 1999; Lamothe, 1991), pero muy similares a los obtenidos para los lobos de otras áreas de los EE.UU. (Hoffmann et al, 2010). Curiosamente, los lobos de Alaska tenían niveles significativamente más altos de Zn que los lobos del resto de los EE.UU. Debe tenerse en cuenta que los metales pesados en la cadena alimentaria pueden originarse a través de depósitos minerales naturales locales o a través del transporte atmosférico a larga distancia. Los lobos de Alaska fueron muestreados principalmente en áreas con importantes depósitos de minerales y una importante historia de minería aluvial (Hoffmann et al., 2010). Hay que señalar, por último, que la comparación de las concentraciones de elementos metálicos entre áres geográficas y especies debe tomarse con cautela, ya que las diferencias de edad y de las técnicas de análisis pueden influir en la interpretación final de los datos (López-Alonso et al., 2007). Resultados y discusión 81 5.2.1. FACTORES DE VARIACIÓN ENDÓGENOS: SEXO Y EDAD La literatura sobre el proceso de biomonitorización y los factores que influyen en los niveles de contaminación de los tejidos suele distinguir entre factores internos o endógenos (edad, sexo, alimentación...) y externos o exógenos (hábitat, estacionalidad, orografía, tipos de suelos y cultivos...) (Hermoso de Mendoza et al., 2008). En este contexto, es importante considerar la variable género en los estudios de Ecotoxicología ya que, en principio, resulta lógico esperar que la acumulación y metabolismo de metales pesados pueda variar en función de este factor, sobre todo en especies con un elevado dimorfismo sexual. Por ejemplo, los machos suelen tener mayor tamaño y, gracias a ello, consiguen presas mayores, muchas veces con mayores niveles de contaminantes (Burger et al., 2002). La acumulación de agentes químicos y la propensión según género a esta acumulación puede depender de muchos factores como los cambios en la tasa metabólica, el estado hormonal, el estado reproductivo y las variaciones de tamaño de un ejemplar (Burger et al., 2007). No se trata aquí de entrar a valorar las causas de las variaciones según sexo, pero sí de observar si se producen en nuestro estudio y tener presente de dónde pueden provenir. En relación con lo anterior, cabe señalar que, según Travaini y Delibes (2006) en un estudio realizado sobre ejemplares de zorro común en Doñana, el grado de dimorfismo sexual es pequeño y sólo se produce entre ejemplares adultos. En Galicia, en un estudio realizado por Fidalgo et al. (2009) se observó que entre los ejemplares muestreados, los machos presentaron un peso medio de 8,09 kg y las hembras de 6,56 kg, lo cual supone que por término medio una hembra posee sólo el 81,09% de la masa corporal del macho. Sin embargo, otro aspecto (bien conocido en algunas especies domésticas) que se debe considerar, es la mayor necesidad de nutrientes de las hembras durante la gestación y lactación lo cual, en nuestra opinión, condiciona un razonable mayor ingreso de alimentos -incluso más indiscriminado en las épocas más críticasen el caso de las hembras que en los machos, lo que teóricamente facilita la ingesta de contaminantes. Desconocemos si este incremento de necesidades de las hembras durante las épocas de reproducción compensarán o superarán las diferencias de los machos por su mayor masa corporal (Tataruch y Kierdof, 2003). En la tabla siguiente (Tabla 21) se reflejan los valores de Pb, Cd y Zn en hígado, riñón y pelo para los dos grupos formados en razón del género (macho y hembra). De forma similar en la Gráfica 9 se muestran los resultados, refiriendo los percentiles al 10, 25, 50 (mediana), 75 y 90%, los valores extremos y los valores atípicos. Resultados y discusión 82 Nº Mínimo Máximo Mediana Media Desv. típica Machos Hígado Pb 145 0,002 5,586 0,581 1,575 1,864 Cd N.D. 7,650 0,825 1,255 1,293 Zn 16,06 161,4 79,32 77,48 25,72 Riñón Pb N.D. 0,833 0,034 0,058 0,090 Cd 0,002 5,564 0,597 0,867 0,868 Zn 2,365 37,64 16,90 17,33 6,981 Pelo Pb N.D. 1,105 0,383 0,427 0,32 Cd N.D. 0,136 N.D. 0,003 0,02 Zn 93,50 204,6 149,2 148,6 27,28 Hembras Hígado Pb 112 N.D. 5,984 0,733 1,755 1,913 Cd N.D. 9,900 0,812 1,143 1,398 Zn 23,06 164,8 77,20 75,31 24,79 Riñón Pb N.D. 0,926 0,030 0,061 0,106 Cd 0,002 9,586 0,493 0,884 1,192 Zn 0,92 35,35 16,76 16,80 7,051 Pelo Pb N.D. 1,036 0,411 0,418 0,284 Cd N.D. 0,179 N.D. 0,003 0,021 Zn 93,22 206,3 141,7 147,9 26,56 Tabla 21. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de plomo, cadmio y zinc en muestras de hígado, riñón y pelo de zorro en función del sexo. Frente a lo que cabría esperar, no se observan, en general, concentraciones mayores de metales pesados en las hembras como consecuencia de la ingesta de una mayor cantidad de comida por kilogramo de peso, circunstancia argumentada por algunos investigadores específicamente para el Cd (Tataruch y Kierdof, 2003). Respecto al zinc, es el metal en el que se observan mayores diferencias, aunque sin diferencias estadísticamente significativas, presentando siempre valores mayores en los machos. El pelo, como es lógico, es el tejido con mayor cantidad de Zn, con cifras próximas a 148 ppm, mientras que las concentraciones en hígado son aproximadamente la mitad de esta cifra y el Zn en las muestras de riñón sólo alcanza cifras próximas a 17 ppm. Resultados y discusión 83 Gráfica 9. Representación de cajas de las concentraciones de plomo, cadmio y zinc (µg/g de tejido seco) en los subgrupos de machos y hembras. Las cajas indican los percentiles al 10, 25, 50 (mediana), 75 y 90%, los valores extremos (*) y los valores atípicos (o). Resultados y discusión 84 Con respecto al sexo, pueden ser observados en la literatura resultados contradictorios con variaciones entre especies, poblaciones, órganos o entre los distintos metales, e incluso en muchas ocasiones no se detecta ningún efecto del sexo para alguno de los metales no sólo para pequeños mamíferos (Fritsch et al., 2010; González et al., 2008; Sánchez-Chardi et al., 2007; Topolska, 2004), sino también para cánidos y otras especies relacionadas (Dip et al., 2001; Hoekstra et al., 2003). Además, no es extraño que uno de los géneros muestre niveles más altos de un metal en particular en el hígado, mientras que el otro pueda mostrar niveles más altos en el riñón (Beernaert et al., 2007; Gochfeld, 1997; Millan et al., 2008). Por otra parte, puede ser que el patrón de género para los metales se complique por el estado reproductivo y la época del año en que tenga lugar el muestreo (Burger, 2007; Robillard et al., 2002), así como las diferencias de género también podría estar asociadas a los hábitos de alimentación diferencial entre machos y hembras, como se ha indicado ya, o la dinámica de metales diferentes, cuestiones que deben ser aclaradas (Millán et al., 2008). Sin embargo, y a pesar de lo anteriormente expuesto, la influencia del sexo en los niveles de cadmio ha sido demostrada en varias especies en las que las hembras presentan concentraciones más elevadas que los machos, posiblemente debido a que las hembras consumen más comida por kilogramo de peso que los machos (Hermoso de Mendonza et al., 2011), aunque estas diferencias no suelen ser significativas desde el punto de vista estadístico (Tataruch y Kierdorf, 2003). Uno de los primeros estudios que constataba este hecho se realizó en pelo de caballo (Equus caballus) (Anke et al.,1989). Otro estudio posterior realizado también en pelo de caballo y tendente a determinar la influencia del sexo, mostraba unas concentraciones medias de cadmio de 0,15 ± 0,13 μg/g en el caso de los caballos y 0,09 ± 0,06 μg/g en las yeguas (Asano et al., 2002). Diversos autores concluyen que no existe una clara influencia del sexo en la acumulación de plomo (Tataruch y Kierdorf, 2003; Medvedev, 1999). Sin embargo, un trabajo ya referido realizado en pelo de perro cuantificaba 1,77 ± 1,05 μg/g y 2,06 ± 1,14 μg/g de plomo en machos y hembras respectivamente (Hayashi et al., 1981). Por su parte, un estudio en pelo de caballo observaba que las concentraciones de plomo eran de 0,76 ± 0,28 μg/g para los caballos y 1,24 ± 1,28 μg/g en el caso de las yeguas (Asano et al., 2002). Si bien los valores cuantificados en zorros y perros son relativamente similares entre sí, no ocurre igual con los cuantificados en caballos y yeguas. Esto último era presumible, pues tanto zorros como perros, debido a sus hábitos alimenticios, pudieran haber ingerido presas, ya sean estas aves o pequeños mamíferos, que habían sido abatidas por cazadores y así, incorporar dicho metal activamente a sus organismos (Mateo et al., 1998). Por último, con respecto al zinc , es como ya se ha indicado, uno de los elementos esenciales más abundantes en el organismo (Repetto, 1995), de ahí los elevados niveles cuantificados. Estudios similares efectuados en perros cuantificaban 205,4 ± 39,7 μg/g de zinc en pelo perteneciente a los machos y 210,2 ± 44,6 μg/g en hembras (Hayashi et al., 1981). El estudio posterior de Asano et al. (2002) coincidía con estas observaciones, encontrando unas concentraciones de zinc en yeguas (92 ± 25 μg/g) superiores a las halladas en los caballos (88,0 ± 31 μg/g). Resultados y discusión 85 En definitiva, en cuanto al sexo, en el presente trabajo se ha observado que no existe una pauta concreta respecto a la acumulación de metales pesados con relación al género. En el caso de unos metales se determinan cantidades mayores en machos y en otros casos en hembras; incluso el mismo metal adquiere valores mayores en un tejido para un sexo y en otro tejido para el sexo contrario. Dicho esto, debe tenerse presente que las diferencias entre los valores medios son pequeñas y que, además, no existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos en ningún caso (Tabla 22). Tabla 22. Diferencia de medias entre el grupo de machos y hembras para las concentraciones de Pb, Cd y Zn en hígado, riñón y pelo. La tabla expresa os resultados del test “t” de Student para muestras independientes, asumiendo en todos los casos varianzas iguales. En términos generales, ambos sexos comparten la pauta general de distribución que se recogía anteriormente para los diferentes metales estudiados: Plomo: Hígado > Pelo > Riñón Cadmio: Hígado > Riñón > Pelo Zinc: Pelo > Hígado > Riñón Prueba de Levene para la igualdad de varianzas Prueba T para la igualdad de medias F Sig. t gl Sig. (bilateral) Pb en hígado 0,202 0,653 -0,758 255 0,449 Pb en riñón 0,849 0,358 -0,264 255 0,792 Pb en pelo 2,575 0,11 0,246 255 0,806 Cd en hígado 0,733 0,393 0,665 255 0,507 Cd en riñón 0,501 0,48 -0,131 255 0,896 Cd en pelo 0,298 0,586 -0,259 255 0,796 Zn en hígado 0,105 0,746 0,683 255 0,495 Zn en riñón 0,082 0,775 0,593 255 0,554 Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales Resultados y discusión 92 altos se cuantificaban en las edades intermedias (0,44 ± 0,29 μg/g y 0,56 ± 0,26 μg/g en los individuos de 2-4 años y 5-7, respectivamente). Sin embargo, en ningún caso en este estudio obtenían grados de significación (Hayashi et al., 1981). Resultados similares a los obtenidos por nosotros se han observado otros estudios en zorro común (Dip et al., 2001) y mustélidos (Harding et al., 1998; Hyvarinen et al., 2003), no sólo en el riñón, sino también en el tejido hepático. Sin embargo, López-Alonso et al. (2007) observaron un aumento más notable de cadmio renal en perros en los primeros años de la vida. El estudio realizado en pelo de caballos jóvenes (2,3 4 y 5 años) obtenía unos valores de cadmio de 0,04 ± 0,00 μg/g (2 años), 0,11 ± 0,14 μg/g (3 años), 0,11 ± 0,14 μg/g (4 años) y 0,20 ± 0,06 μg/g (5 años) (Asano et al., 2002), lo que mostraría una ligera tendencia a concentrarse cada vez más en función de la edad. Hay que recordar, como se mencionó anteriormente, que el cadmio suele presentarse en valores muy bajos en los grandes carnívoros porque no se acumula en el músculo, tan abundante en la dieta de éstos (Tataruck y Kierdorf, 2003). Para este metal pesado, los efectos tanto de sexo como de edad sobre sus acumulaciones ponen de relieve la necesidad de comparar animales de características similares o de incluir estas dos variables en el análisis de datos para los posteriores estudios de biomonitorización. En cuanto al tercer metal analizado, el zinc, el grupo de ejemplares jóvenes se diferencia de los otros dos grupos por sus concentraciones de zinc tanto en hígado como en riñón, aunque en este último caso la diferencia es sólo entre juvenil y adulto, mostrando esa misma tendencia (sin llegar a la significación -0,075-) entre los jóvenes y los gerontes. Respecto a las concentraciones de zinc del pelo, sólo existen diferencias estadísticas entre el grupo de adultos y los otros dos grupos de edad. Además, tal como podemos comprobar en la Tabla 23, las concentraciones de zinc en hígado y riñón son mayores en los individuos más jóvenes, mientras que en el caso del pelo son los adultos los que poseen cantidades significativamente mayores de zinc que los otros dos grupos. Esta ausencia de diferencias en función de la edad para el zinc son contrarias a lo obtenido en otros estudios centrados en los osos polares (Dietz et al., 2000) y bovinos (López Alonso et al., 2000). La ausencia de un claro efecto relacionado con la edad en la acumulación de zinc se ha indicado anteriormente en un amplio espectro de especies (Dip et al., 2001; Hoffmann et al., 2010; Hyvarinen et al., 2003; Millan et al., 2008). Este hecho podría estar de acuerdo con las hipótesis que indican que, en niveles bajos a moderados de exposición, ciertos mecanismos homeostáticos son eficientes para mantener algunas concentraciones de metales esenciales dentro de un rango estrecho en el cuerpo de los vertebrados (Beernaert et al., 2007; Milton et al., 2003). Es de destacar que para los elementos considerados fisiológicos, Hunter et al. (1989) en sus investigaciones realizadas en distintos micromamíferos, como Apodemus sylvaticus, Microtus agrestis y Sorex araneus, al igual que hicieron Milton y Johnson (1999), confirmaron la no influencia del factor edad, de tal forma que el contenido de zinc en los órganos parecía ser constante e independiente de su edad. Un estudio realizado en pelo de caballos estableció unos valores de zinc de 86,0 ± 40,7 μg/g (2 años), 81,6 ± 7,2 μg/g (3 años), 77,5 ± 32,5 μg/g (4 años) y 101,7 ± 14,9 μg/g (5 años) (Asano et al., Resultados y discusión 93 2002). El trabajo de Zongping (2003) realizado en pelo de camellos adultos de China obtuvo valores de 146,9 ± 18,2 μg/g. Se trata, en todo momento, de resultados muy similares a los obtenidos en nuestra investigación, pues los valores más altos se presentan en los ejemplares adultos y jóvenes, siendo estos últimos los más elevados. Puede señalarse aquí que la bibliografía consultada en ocasiones argumenta que la mayor acumulación de metales pesados en los ejemplares jóvenes puede estar relacionada con su riesgo de mayor exposición a los mismos, como consecuencia de su etología, al permanecer generalmente en áreas más restringidas, mientras que los adultos suelen vagabundear por un área más amplia (Burger y Gochfeld, 2001). Sin embargo, con las excepciones antes indicadas, los presentes resultados, tal como se puede ver en las tablas anteriores, difieren de esa afirmación y, además, incluso se podría hipotetizar con que los ejemplares adultos -sobre todo aquellos sin territorio establecidoestán más expuestos a posibles contaminaciones como consecuencia de su comportamiento vagabundeador y el aprovechamiento de recursos marginales o poco habituales. Otros autores apuntan que las crías pueden acumular y excretar de forma diferente los metales pesados debido a las diferencias en su dieta, su fisiología y su tasa metabólica (Gallego, 2006). Por su parte, la distribución de cada metal por tejidos en los tres grupos de edad responde a las pautas que ya se apuntaron respecto a los valores generales establecidos para el grupo completo de animales estudiados, de la misma forma que ocurría cuando dividíamos en grupo inicial en los dos grupos en razón del género (machos y hembras). Respecto a los resultados obtenidos para los grupos establecidos considerando de forma conjunta los factores sexo y edad, en el presente apartado, aportaremos tan solo los valores de plomo, cadmio y zinc en los diferentes grupos y las diferencias individuales entre los grupos, considerando en un apartado especifico de la presente memoria de tesis doctoral, debido a su importancia y necesaria profundidad del examen de los datos, el análisis estadístico específico, las posibles diferencias entre ellos y su significado (apartado 5.4. Influencia del sexo, la edad y el ámbito geográfico en los niveles de plomo, cadmio y zinc en el zorro). En las tablas 26, 27 y 28 figuran los valores medios y desviación típica de las concentraciones medias para los tres metales, plomo, cadmio y zinc respectivamente en los grupos completo de ejemplares, así como en machos, y hembras según cada uno de los tres grupos etarios establecidos (joven, adulto y geronte). De forma similar, en las Gráficas 11, 12 y 13 se muestras los resultados específicos para el plomo, en las Gráficas 14, 15 y 16 para el cadmio, y en las Gráficas 17, 18 y 19 para el zinc. Resultados y discusión 94 Tabla 26. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de plomo en las muestras de zorro en función del sexo y la edad. Gráfica 11. Distribución de las concentraciones de plomo (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (edad y sexo) considerados. Juvenil Adulto Geronte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 0,746 1,137 1,967 2,062 2,075 1,85 Riñón 0,063 0,119 0,062 0,099 0,049 0,053 Pelo 0,394 0,315 0,444 0,314 0,411 0,278 Macho Hígado 0,744 1,031 1,764 2,001 2,174 2,026 Riñón 0,046 0,052 0,066 0,115 0,053 0,043 Pelo 0,374 0,34 0,473 0,327 0,381 0,284 Hembra Hígado 0,748 1,272 2,252 2,132 1,961 1,655 Riñón 0,083 0,167 0,056 0,071 0,045 0,063 Pelo 0,418 0,284 0,403 0,294 0,446 0,272 Resultados y discusión 95 Gráfica 12. Distribución de las concentraciones de plomo (μg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (edad y sexo ) considerados Gráfica 13. Distribución de las concentraciones de plomo (μg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (edad y sexo) considerados. Resultados y discusión 96 Juvenil Adulto Geronte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 1,217 1,561 1,165 1,122 1,290 1,508 Riñón 1,135 1,370 0,855 0,928 0,588 0,512 Pelo 0,004 0,022 0,002 0,012 0,005 0,027 Macho Hígado 1,350 1,542 1,119 0,837 1,479 1,807 Riñón 0,967 1,038 0,893 0,864 0,672 0,584 Pelo 0,007 0,030 0,002 0,011 N.D. N.D. Hembra Hígado 1,054 1,593 1,230 1,437 1,072 1,060 Riñón 1,339 1,684 0,803 1,016 0,492 0,405 Pelo N.D. N.D. 0,002 0,013 0,107 0,039 Tabla 27. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de cadmio en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función del sexo y de la edad. Gráfica 14. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (edad y sexo) considerados. Resultados y discusión 97 Gráfica 15. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (edad y sexo) considerados. Gráfica 16. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (edad y sexo) considerados. Resultados y discusión 98 Tabla 28. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de zinc en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función del sexo y de la edad. Gráfica 17. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (edad y sexo). Juvenil Adulto Geronte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 92,35 25,86 68,44 22,32 75,29 21,90 Riñón 19,80 7,79 15,66 6,44 17 6,28 Pelo 145 26,35 154,5 27,64 138,20 22,13 Macho Hígado 94,97 25,61 69,15 24,02 75,86 18,37 Riñón 20,48 8,05 16,07 6,63 16,42 5,002 Pelo 145,40 26,18 155,4 26,68 135,60 25,36 Hembra Hígado 89,16 26,21 67,43 19,84 74,63 25,75 Riñón 18,98 7,515 15,09 6,17 17,67 7,539 Pelo 144,60 26,98 153,10 29,12 141,20 17,69 Resultados y discusión 99 Gráfica 18. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (edad y sexo). Gráfica 19. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (edad y sexo. Resultados y discusión 100 5.2.2. FACTORES DE VARIACIÓN EXÓGENOS: EL HÁBITAT Como ya se ha comentado, el zorro habita todo tipo de ambientes pero muestra especial predilección por zonas heterogéneas, de tal forma que aprovecha la proximidad de asentamientos humanos para alimentarse. Este contacto con las poblaciones humanas y sus hábitos tróficos, entre otros factores, lo sitúan de partida como un bioindicador idóneo. Por ello, ver el comportamiento que presentan las concentraciones de los metales pesados según el hábitat en el que viven los animales muestreados cobra especial relevancia para la biomonitorización. Como mamífero debería reflejar fielmente la contaminación presente en su hábitat (en la comida, agua, suelo, aire...) (Hermoso de Mendoza et al., 2008; De la Casa, 2010). Es sabido que en Galicia el zorro presenta densidades más elevadas en las zonas periurbanas e inferior en las de monte (Tapia y Domínguez, 2003); sin embargo, dadas las características del muestreo en el presente estudio no fue posible contar con una distribución proporcional a esta realidad. No obstante, y hecha esta salvedad, el número de muestras conseguidas por cada hábitat considerado sí permite llegar a conclusiones al respecto y observar el comportamiento de los metales pesados según se trate de un entorno periurbano, agroforestal o de monte y, en definitiva, según su proximidad a asentamientos humanos. Con estas consideraciones, los resultados relativos al contenido de metales pesados en función del hábitat donde tuvo lugar el muestreo, son los que se presentan en la Tabla 29 y en la Gráfica 20. En términos generales, el entorno agroforestal ha sido aquel en el que mayores acumulaciones de metales pesados se han encontrado (mayores concentraciones de plomo en hígado, plomo en riñón, cadmio en riñón y zinc en hígado); seguido del hábitat de monte (mayor concentración de cadmio en hígado, cadmio en pelo y zinc en pelo); y, finalmente, el periurbano (mayor concentración de plomo en pelo y zinc en riñón). Por su lado, el ámbito periurbano es, en general, en el que los valores medios son más homogéneos, con menores desviaciones respeto a las concentraciones medias, y donde estos promedios de concentración de los metales son menores. Estos resultados deben ser interpretados teniendo presente que, en un análisis de la varianza, para establecer la presencia de diferencias entre grupos para algunos parámetros en primer lugar debe comprobarse que no existe igualdad de medias, que las observaciones son normales e independientes. Para esto se ha aplicado la prueba de Levene de homogeneidad de la varianza y pruebas robustas de igualdad de las medias de Welch para los diferentes parámetros estudiados; observando en la Tabla 30 que existen diferencias entre los grupos para las concentraciones de plomo en hígado y de zinc en los tres tejidos analizados. Resultados y discusión 101 Nº Mínimo Máximo Mediana Media Desv. típica Periurbano Hígado Pb 44 0,082 2,625 0,599 0,604 0,442 Cd N.D. 4,769 0,755 1,054 1,057 Zn 34,68 104,3 62,14 63,17 17,91 Riñón Pb 0,009 0,125 0,047 0,054 0,029 Cd 0,012 2,862 0,732 0,872 0,692 Zn 9,76 34,27 19,92 20,17 5,764 Pelo Pb 0,04 0,98 0,47 0,49 0,290 Cd N.D. 0,097 N.D. 0,002 0,015 Zn 107,5 187,7 134,6 138,1 20,71 Agroforestal Hígado Pb 80 0,002 5,586 0,598 1,976 2,117 Cd N.D. 5,974 0,832 1,191 1,187 Zn 16,06 161,4 81,60 80,32 24,64 Riñón Pb N.D. 0,506 0,035 0,062 0,078 Cd 0,002 9,586 0,541 0,930 1,285 Zn 0,924 32,89 15,85 16,34 6,543 Pelo Pb N.D. 1,036 0,370 0,418 0,311 Cd N.D. 0,136 N.D. 0,003 0,019 Zn 93,50 204,6 142,8 147,9 28,62 Monte Hígado Pb 133 N.D. 5,984 0,816 1,806 1,919 Cd N.D. 9,900 0,857 1,266 1,502 Zn 23,06 164,8 79,86 78,68 26,46 Riñón Pb N.D. 0,926 0,026 0,060 0,120 Cd 0,002 5,564 0,505 0,842 0,932 Zn 2,365 37,63 15,61 16,54 7,405 Pelo Pb N.D. 1,105 0,370 0,404 0,308 Cd N.D. 0,179 N.D. 0,003 0,021 Zn 93,22 206,3 154,1 151,9 26,97 Tabla 29. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de plomo, cadmio y zinc en muestras de hígado, riñón y pelo en las muestras de zorro en función del hábitat. Resultados y discusión 108 Gráfica 23. Distribución de las concentraciones de plomo (μg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (sexo y hábitat). Periurbano Agro-forestal Monte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 1,054 0,755 1,191 1,285 1,266 1,502 Riñón 0,872 0,732 0,930 0,019 0,842 0,932 Pelo 0,002 N.D: 0,003 24,640 0,003 0,021 Macho Hígado 1,161 1,155 1,325 1,382 1,239 1,290 Riñón 0,929 0,725 0,789 0,541 0,900 1,084 Pelo N.D. N.D. 0,003 0,019 0,004 0,019 Hembra Hígado 0,915 0,926 0,967 0,729 1,296 1,717 Riñón 0,797 0,658 1,164 1,979 0,776 0,732 Pelo 0,005 0,022 0,003 0,018 0,003 0,023 Tabla 33. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de cadmio en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función del sexo y del hábitat. Resultados y discusión 109 Gráfica 24. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (sexo y hábitat) considerados. Gráfica 25. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (sexo y hábitat). Resultados y discusión 110 Gráfica 26. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (sexo y hábitat). Tabla 34. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de cadmio en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función de sexo y hábitat. Periurbano Agro-forestal Monte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 1,054 0,755 1,191 1,285 1,266 1,502 Riñón 0,872 0,732 0,93 0,019 0,842 0,932 Pelo 0,002 N.D: 0,003 24,64 0,003 0,021 Macho Hígado 1,161 1,155 1,325 1,382 1,239 1,29 Riñón 0,929 0,725 0,789 0,541 0,9 1,084 Pelo N.D. N.D. 0,003 0,019 0,004 0,019 Hembra Hígado 0,915 0,926 0,967 0,729 1,296 1,717 Riñón 0,797 0,658 1,164 1,979 0,776 0,732 Pelo 0,005 0,022 0,003 0,018 0,003 0,023 Resultados y discusión 111 Gráfica 27. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (sexo y hábitat). Gráfica 28. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (sexo y hábitat). Resultados y discusión 112 Gráfica 29. Distribución de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (sexo y hábitat) considerados. De forma similar a lo antes indicado, y considerando conjuntamente el hábitat con la edad (Tablas 35, 36 y 37, así como Gráficas 30, 31 y 32 para el plomo, Gráficas 32, 34 y 35 para el cadmio, y Gráficas 36, 37 y 38 para el zinc), observamos que en general los ejemplares juveniles que viven en entornos periurbanos se distinguen por ser los que acumulan menores cantidades de plomo y mayores concentraciones de zinc. Respecto al plomo, además, los juveniles presentan mayores valores medios conforme habitan más lejos de las áreas periurbanas. El cadmio, por su parte, se comporta de modo ligeramente diferente. El grupo más homogéneo es el de ejemplares jóvenes en zonas agroforestales, que son los que presentan valores más altos de este metal mientras que los jóvenes periurbanos poseen los valores medios más bajos. Este aspecto sí concuerda con las conclusiones de Dip et al. (2001) que encontraron que los niveles de cadmio eran más elevados en zonas suburbanas que urbanas. Finalmente, respecto al zinc, también se observa que el grupo de jóvenes en zonas periurbanas es el que presenta menor variabilidad interna y las mayores concentraciones en todos los hábitats. En los gerontes se encuentra la tendencia contraria (en hígado y pelo) ya que es en las zonas periurbanas dónde presentan menores concentraciones y en las de monte donde son mayores. Resultados y discusión 113 Tabla 35. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de plomo en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función de la edad y del hábitat. Gráfica 30. Distribución de las concentraciones de plomo (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (edad y hábitat) . Periurbano Agro-forestal Monte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 0,604 0,442 1,976 2,117 1,806 1,919 Riñón 0,054 0,029 0,062 0,078 0,06 0,12 Pelo 0,49 0,29 0,418 0,311 0,404 0,308 Juvenil Hígado 0,351 0,211 0,719 1,375 0,915 1,182 Riñón 0,04 0,03 0,064 0,075 0,071 0,157 Pelo 0,332 0,271 0,408 0,353 0,409 0,313 Adulto Hígado 0,79 0,479 2,418 2,248 2,101 2,151 Riñón 0,056 0,028 0,065 0,091 0,062 0,118 Pelo 0,613 0,274 0,407 0,314 0,408 0,312 Geronte Hígado 0,499 0,412 2,432 2,03 2,217 1,787 Riñón 0,074 0,017 0,052 0,048 0,042 0,06 Pelo 0,399 0,208 0,45 0,263 0,39 0,305 Resultados y discusión 114 Gráfica 31. Distribución de las concentraciones de plomo (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (edad y hábitat). Gráfica 32. Distribución de las concentraciones de plomo (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (edad y hábitat). Resultados y discusión 115 Periurbano Agro-forestal Monte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 1,054 1,057 1,191 1,187 1,266 1,502 Riñón 0,872 0,692 0,930 1,285 0,842 0,932 Pelo 0,002 0,015 0,003 0,019 0,003 0,020 Juvenil Hígado 0,744 1,074 1,516 1,597 1,226 1,687 Riñón 0,946 0,873 1,296 2,011 1,114 1,062 Pelo N.D. N.D. 0,006 0,030 0,004 0,022 Adulto Hígado 1,092 0,887 0,982 0,707 1,299 1,365 Riñón 0,762 0,551 0,910 1,010 0,855 0,987 Pelo 0,004 0,020 N.D. N.D. 0,002 0,012 Geronte Hígado 1,553 1,453 1,271 1,429 1,240 1,609 Riñón 1,086 0,744 0,567 0,502 0,486 0,395 Pelo N.D. N.D. 0,005 0,023 0,006 0,327 Tabla 36. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de cadmio en las muestras de zorro consideradas en el presente estudio en función de la edad y del hábitat. Gráfica 33. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de hígado en función de los dos factores (edad y hábitat). Resultados y discusión 116 Gráfica 34. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de riñón en función de los dos factores (edad y hábitat). Gráfica 35. Distribución de las concentraciones de cadmio (µg/g de tejido seco) en las muestras de pelo en función de los dos factores (edad y hábitat). Resultados y discusión 117 Tabla 37. Valores de concentración (expresados en ppm referido a peso seco) de zinc en las muestras de zorro coconsiderad as en el presente estudio en función de la edad y del hábitat. Periurbano Agro-forestal Monte Media Desv. típica Media Desv. típica Media Desv. típica Todos Hígado 63,17 17,91 80,32 24,64 78,68 26,46 Riñón 20,17 5,764 16,34 6,543 16,54 7,405 Pelo 138,1 20,71 147,9 28,61 151,9 26,97 Juvenil Hígado 76,58 17,93 96,98 25,65 95,78 26,79 Riñón 24,47 6,152 18,03 7,626 19,03 7,935 Pelo 152,8 19,65 140,7 27,88 144,5 27,67 Adulto Hígado 54,2 13,02 74,33 23,95 69,8 22,01 Riñón 18,37 4,303 16,07 6,27 14,49 6,895 Pelo 133,6 18,04 159,3 27,22 158,7 27,6 Geronte Hígado 65,82 15,62 74,53 15,86 77,98 25,96 Riñón 17,52 4,951 15,06 5,733 18,11 6,744 Pelo 123,6 14,59 131,8 22,36 145,7 20,94 Resultados y discusión 124 *La correlación es significante al nivel 0,05 (bilateral). **La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral). Adultos n= 129 Celdas marcadas en fondo azul. Geronte n= 56 Celdas marcadas en fondo sepia. Tabla 40. Correlaciones bivariadas de los valores medios de Pb, Cd y Zn en las muestras de los subgrupos de edad. Los valores correspondientes a los ejemplares adultos se representan sobre fondo azul y los gerontes sobre fondo sepia. Los datos de los ejemplares jóvenes no se representan por no existir ninguna correlación bivariada en ese subgrupo de población. Pb en hígado Corr. Pearson 1,000 -0,15 -0,230** -0,232** -0,037 0,032 -0,287** 0,054 0,028 Sig.(bilateral) 0,091 0,009 0,008 0,676 0,72 0,001 0,54 0,751 Pb en riñón Corr. Pearson -0,045 1,000 -0,028 0,122 -0,002 -0,063 0,10 0,037 -0,033 Sig.(bilateral) 0,743 0,757 0,168 0,986 0,481 0,259 0,675 0,71 Pb en pelo Corr. Pearson 0,234 0,055 1,000 -0,132 0,05 0,091 0,031 0,003 -0,096 Sig. (bilateral) 0,083 0,685 0,136 0,572 0,307 0,729 0,977 0,278 Cd en hígado Corr. Pearson -0,237 0,078 0,235 1,000 -0,109 -0,034 -0,015 -0,01 0,084 Sig. (bilateral) 0,078 0,566 0,081 0,22 0,698 0,867 0,914 0,342 Cd en riñón Corr. Pearson -0,196 -0,031 -0,062 0,043 1,000 -0,027 0,03 -0,116 -0,113 Sig. (bilateral) 0,148 0,818 0,648 0,754 0,759 0,736 0,19 0,203 Cd en pelo Corr. Pearson -0,146 ,587** 0,09 -0,083 0,113 1,000 -0,095 -0,018 -0,08 Sig. (bilateral) 0,282 0,000 0,507 0,543 0,407 0,286 0,838 0,367 Zn en hígado Corr. Pearson 0,191 -0,116 0,091 -0,075 -0,174 -0,042 1,000 0,009 0,112 Sig. (bilateral) 0,159 0,395 0,504 0,583 0,20 0,756 0,922 0,207 Zn en riñón Corr. Pearson -0,074 -0,229 -0,144 -0,125 0,122 0,10 -0,134 1,000 -0,042 Sig. (bilateral) 0,586 0,09 0,29 0,357 0,372 0,465 0,323 0,637 Zn en pelo Corr. Pearson -0,018 -0,151 -0,153 -0,143 0,014 -0,027 0,013 0,013 1,000 Sig. (bilateral) 0,895 0,268 0,262 0,293 0,921 0,841 0,925 0,925 Pb en hígado Pb en riñón Pb en pelo Cd en hígado Cd en riñón Cd en pelo Zn en hígado Zn en riñón Zn en pelo Resultados y discusión 125 *La correlación es significante al nivel 0,05 (bilateral). **La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral). Monte n= 133 Celdas marcadas en fondo verde. Agroforestal n=80 Celdas marcadas en fondo gris Periurbano n= 44 Celdas marcadas en fondo amarillo. Tabla 41. Correlaciones bivariadas de los valores medios de Pb, Cd y Zn en las muestras de los subgrupos establecidos según el hábitat de procedencia. Los valores correspondientes a los ejemplares periurbanos se representan sobre fondo amarillo, los de monte sobre fondo verde y los agroforestales sobre fondo gris. En blanco y sin cifras cuando no existe ninguna correlación bivariada significativa. Pb en hígado Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0 Pb en riñón Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0,039 0,037 Pb en pelo Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0,033 0,001 0,044 Cd en hígado Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0,002 0,011 Cd en riñón Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) Cd en pelo Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) Zn en hígado Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0,002 0,033 0,047 0,027 Zn en riñón Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) 0,003 Zn en pelo Corr. Pearson 1,000 Sig. (bilateral) Pb en hígado Pb en riñón Pb en pelo Cd hígado Cd en riñón Cd en pelo Zn en hígado Zn en riñón Zn en pelo -0,456** -0,179*0,234* 0,239*-0,493** -0,305* -0,264** 0,378* -0,241*0,176*0,223* 0,334* 0,443** Resultados y discusión 126 5.4. INFLUENCIA DEL SEXO, LA EDAD Y EL ÁMBITO GEOGRÁFICO EN LOS NIVELES DE PLOMO, CADMIO Y ZINC EN EL ZORRO Se ha descrito hasta este punto el grado de acumulación de los metales pesados en los tejidos del zorro en función de variables endógenas y exógenas. Así mismo, se ha explorado la fuerza de las relaciones entre estas variables a través de coeficientes de correlación. En este apartado del estudio se considera oportuno dar un paso más y determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios de metales pesados en los tejidos en función de los factores considerados (sexo, edad y hábitat); o, equivalentemente, estudiar la variabilidad de esas concentraciones en relación con esos factores. De este modo, en el presente apartado no tratamos de comparar nuestros resultados con otros, ni considerar si son mayores o menores las concentraciones de metal pesado acumuladas en determinadas vísceras de ejemplares procedentes de un hábitat concreto, simplemente tratamos de establecer si existe o no influencia de los factores estudiados y de la combinación de estos mismos factores en los resultados. Por tanto, en este apartado del estudio se examina, mediante técnicas estadísticas, si los factores sexo, edad y ámbito (hábitat) influyen o no en los niveles de las variables plomo, cadmio y zinc que presentan los zorros, cada una de ellas determinada en hígado, riñón y pelo. El análisis se basa en un el análisis de la varianza (ANOVA) factorial y los tests asociados. Este tipo de análisis se caracteriza por contrastar una hipótesis nula por cada factor, y por cada posible combinación de factores, que afirma que las medias de las poblaciones definidas por los niveles del factor son iguales y que el efecto de la interacción entre factores también es nulo (Hair et al., 2001). Si se rechaza esta hipótesis, sabremos que existen las diferencias estadísticamente significativas que comentamos y, por tanto, que los factores influyen en la acumulación de metales pesados. A continuación, se pueden realizar pruebas post hoc (HSD de Tukey y DMS) para saber exactamente qué medias son diferentes comparando cada par de poblaciones. No obstante, para comenzar con este análisis el primer aspecto que se debe explorar es cómo se distribuyen los valores de los factores que introduciremos en el análisis, cuál es el comportamiento de la variabilidad de los metales en cada factor y si ésta nos puede indicar la presencia de una relación. 5.4.1. ANÁLISIS EXPLORATORIO DE LOS FACTORES INFLUYENTES Con una simple inspección visual de los gráficos de dispersión 3D de las Gráficas 39, 40 y 41 se observa que la mayor variabilidad del plomo se aprecia en el hígado y en el pelo, la del cadmio en el hígado y en el riñón y, en el caso del zinc, se aprecia una variabilidad considerable tanto en el hígado, como en el riñón y en el pelo, siendo en este último donde presenta una mayor variación. Resultados y discusión 127 Todos estos aspectos podemos verificarlos en la tabla 19 donde se expresan los principales estadísticos, que además, han sido tenidos en cuenta para fijar los ejes de los gráficos 3D de las Gráficas 39, 40 y 41. Si analizamos los gráficos de dispersión 3D por sexo (Gráfica 39), se observa que aparentemente el sexo de los ejemplares no influye en ninguno de los factores considerados y así, en los tres gráficos de esta figura, las hembras y machos se distribuyen de forma similar. Si se examinan a continuación los gráficos de dispersión en función de la edad (Gráfica 40), se aprecia que los juveniles muestran un nivel más bajo de plomo en el hígado que los otros dos grupos de edad (izquierda en la gráfica). Por otro lado, la edad no parece influir en el nivel de cadmio (centro en la gráfica) y tampoco se aprecia que influya en el nivel de zinc (derecha en la gráfica). En la Gráfica 41 se aprecia que los zorros de ámbito periurbano presentan niveles bajos de Pb en hígado (izquierda en la gráfica) y aunque no se percibe de forma tan clara, tienden a presentar niveles bajos de Zn en hígado (derecha en la gráfica). Si examinamos todas estas figuras en busca de relaciones entre variables podemos concluir que no se aprecia relación alguna entre las variables consideradas. Si recordamos el examen de los coeficientes de correlación de Pearson podemos verificar que no existe relación lineal entre ellas. Resultados y discusión 128 Gráfica 39. Diagramas de dispersión 3D de las muestras en función del sexo. Las concentraciones de Pb, Cd y Zn están expresadas en µg/g de tejido seco. Gráfica 40. Diagramas de dispersión 3D de las muestras en función de la edad. Las concentraciones de Pb, Cd y Zn están expresadas en µg/g de tejido seco. Gráfica 41. Diagramas de dispersión 3D de las muestras en función del ámbito geográfico. Las concentraciones de Pb, Cd y Zn están expresadas en µg/g de tejido seco. Resultados y discusión 129 5.4.2. DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS ESTADÍSTICAMENTE SIGNIFICATIVOS Para examinar con más detalle el efecto de los tres factores estudiados (sexo, edad y hábitat) en las variables consideradas (concentraciones de los metales para cada tejido) se hizo uso de la técnica de análisis de la varianza (Peña, 2002). Inicialmente se podría pensar en considerar los tres factores, pero tras verificar que el efecto del sexo no es significativo (Tabla 42), con los resultados del test Z de igualdad de medias para muestras grandes, según Lapin (1990). Por este motivo se consideró un ANOVA factorial con dos factores: la edad y el ámbito. Los cálculos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 19 (Pardo y Ruiz, 2002). Tabla 42. Resultados del test Z para muestras grandes de comparación de medias de ambos sexos para cada una de las variables. Detengámonos inicialmente, por tanto, en qué ocurre con el factor sexo. En el caso del cadmio en el pelo las cantidades son tan pequeñas (trazas) o nulas que carece de sentido la comparación de medias (se indica con la abreviatura N.D., no detectable). Mediante este test se contrasta la hipótesis nula de que las medias de las concentraciones de los metales son iguales en machos y hembras; y, por tanto, se está contrastando si el sexo de los zorros repercute en las concentraciones de metales pesados. El resultado de contrastar esta hipótesis ofrece p-valores altos (p>0,10) en todos los casos, por lo que según el test, los resultados no son estadísticamente significativos (ha de aceptarse la hipótesis nula de igualdad de medias). Por tanto, el factor sexo no se puede discriminar a partir de las concentraciones de metales pesados de los tejidos, es decir, el sexo no influye en dichas acumulaciones. De forma más visual y a modo de ejemplo, en la Gráfica 42 se recogen los gráficos de caja por sexo correspondientes al zinc, en los que se puede apreciar que las diferencias no son relevantes. p-valor 0,45 0,80 0,80 0,51 0,90 N.D. 0,49 0,55 0,84 n1 = 112 (hembras) n2 = 145 (machos) Pb en hígado Pb en riñón Pb en pelo Cd en hígado Cd en riñón Cd en pelo Zn en hígado Zn en riñón Zn en pelo Resultados y discusión 130 Gráfica 42. Representación de cajas de las concentraciones de zinc (µg/g de tejido seco) en hígado, riñón y pelo. Las cajas indican los percentiles al 10, 25, 50 (mediana), 75 y 90%, los valores extremos (*) y los valores atípicos (o). Dejando al margen la variable sexo, es preciso recordar, como se comentó en el análisis de correlaciones, que no se apreció ningún tipo de relación entre las variables estudiadas. El cumplimiento de este supuesto previo necesario, permite realizar un ANOVA factorial con cada una de ellas. Los modelos factoriales de análisis de la varianza sirven para evaluar el efecto individual, o efectos principales y conjunto, o efecto interacción, de dos o más factores (variables independientes categóricas) sobre una variable dependiente continua. En el presente caso, el modelo se definiría como: Concentración de metal = Efecto de la edad + Efecto del hábitat + Efecto conjunto edad*hábitat + Error Dado que el diseño es desequilibrado (diferentes tamaños de muestra para cada combinación de los niveles de los factores) se utilizó la descomposición de la varianza basada en una suma de cuadrados tipo III indicada para este tipo de diseño. Los resultados obtenidos se resumen, como se puede observar, en la Tabla 43. Resultados y discusión 131 Tabla 43. Resultados de los F test asociados al ANOVA factorial de dos factores (edad y hábitat). En la tabla se expresan el p-valor del test de no efecto de los efectos principales de la edad y el hábitat y del test de no interacción. La última línea incluye el p-valor del test de Levene de homogeneidad de varianzas. Una vez se conoce qué casos son válidos en el modelo es posible interpretar sus resultados. Respecto al efecto de la interacción edad x hábitat no es significativo (p>0,10) en todos estos casos en los que según el test de Levene se admite la homocedasticidad. Por tanto, no se puede hablar de que exista una influencia conjunta del hábitat y la edad en las concentraciones de metales pesados. Fijándonos en los efectos principales, sólo existe un efecto significativo de la edad (p<0,001) en el caso del zinc en el hígado y zinc en el riñón. El efecto del hábitat sólo resulta estadísticamente significativo en los mismos casos, para el zinc en hígado p=0,001 y para el zinc en riñón p=0,024. En este punto, estamos en condiciones de extraer una de las principales conclusiones de nuestro estudio, fundamentadas estadísticamente. El zinc ha resultado ser el metal pesado más eficaz a la hora de encontrar diferencias entre los grupos por edad y hábitat. No contamos con estudios estrictamente comparables a este respecto, ya sea porque no se emplea la misma especie como bioindicador, ya sea porque no se analizan los mismos metales o porque no se realizan test estadísticos (como en uno de los estudios más importantes sobre el zorro realizado por Piskorova et al. (2003)). Por otra parte, también podemos concluir que las muestras de metales obtenidas en el pelo no han permitido discriminar significativamente los grupos por edad y hábitat. En la misma línea, por ejemplo, Hermoso de Mendoza et al. (2011) tampoco encontraron que el pelo pudiese discriminar de forma significativa entre los niveles de metales pesados por sexo y edad en el lobo del norte de España. A partir de este momento, los análisis estadísticos sólo permiten seguir estudiando lo que ocurre con el zinc en hígado y riñón. El modelo ANOVA ha confirmado la existencia de diferencias significativas en estas variables según los factores edad y hábitat, ahora es conveniente investigar qué medias de los diferentes grupos son distintas a través de diversas técnicas (englobadas bajo la denominación de contrastes para comparaciones múltiples o pruebas post hoc) cuyo objeto es identificar qué grupos son estadísticamente diferentes y en cuánto oscila el valor de esas diferencias. p-valor Pb en riñón Pb en pelo Cd en riñón Cd en pelo Zn en riñón Zn en pelo Edad <0,001 0,959 0,142 0,652 0,104 N.D. <0,001 <0,001 0,002 Hábitat 0,001 0,981 0,721 0,879 0,724 N.D. 0,001 0,024 0,022 Interacción 0,46 0,827 0,132 0,443 0,578 N.D. 0,803 0,16 0,003 Levene <0,001 0,177 0,768 0,098 0,098 N.D. 0,226 0,208 0,006 Pb en hígado Cd en hígado Zn en hígado Resultados y discusión 132 En primer lugar, la comparación de medias por pares mediante el método de la mínima diferencia significativa o DMS (Peña, 2002) consiste en una prueba de hipótesis por parejas de las medias de los grupos. Esta técnica proporcionó los intervalos recogidos en la Tabla 44 para cada diferencia de medias según los grupos de edad y los mostrados en la Tabla 45 para cada diferencia de medias según los ámbitos. En el cálculo de los intervalos se consideró un nivel de confianza del 95%, por lo que la diferencia de medias es significativa al 5% de una diferencia real en aquellos casos en los que el cero no está dentro del intervalo correspondiente. Los intervalos nos proporcionan además la diferencia media mínima (límite inferior) y la diferencia media máxima (límite superior). Existen evidencias muestrales para considerar significativa (al 5%) la diferencia de medias entre juvenil y adulto, y entre juvenil y geronte, en ambos casos tanto con respecto al zinc en hígado como con respecto al zinc en riñón. Se observa además que el grupo juvenil parece diferenciarse más del grupo adulto que del geronte (diferencia mínima de 17,3592 frente a 9,1252 en el zinc en hígado, y diferencia mínima de 2,2069 frente a 0,4616 en el zinc en riñón). Por tanto, como concluíamos en el análisis de estadísticos descriptivos, el grupo juvenil es el que mejor se diferencia de los otros grupos de edad y esas diferencias son mayores respecto a los ejemplares adultos que a los gerontes. Estos resultados coinciden con los obtenidos en el estudio sobre lobos referido anteriormente (Hermoso de Mendoza et al., 2011) en el que encontraron que los valores más altos cuantificados pertenecen a los individuos que son aún cachorros, siguiéndole los adultos y por último, los de edades intermedias. En cuanto al ámbito, existen evidencias muestrales para considerar significativa (al 5%) la diferencia de medias entre el grupo periurbano y el grupo de monte, y entre el grupo periurbano y el grupo agroforestal, en ambos casos tanto con respecto al zinc en hígado como con respecto al zinc en riñón. Las diferencias mínimas del grupo periurbano respecto al grupo de monte y respecto al grupo agroforestal son similares, tanto para el zinc en hígado (6,2573 vs 7,1740) como para el zinc en riñón 0,9061 vs 0,8838). La identificación previa de los pares de grupos para los que la diferencia de medias es significativa al 5% (sobre fondo destacado en las Tablas 44 y 45), permite establecer a modo de conclusión del estudio los siguientes subgrupos homogéneos recogidos en la Tabla 46. Estos subgrupos se comprobó además que coinciden con los determinados mediante el método de Tukey, otro método de comparaciones múltiples, que permite superar las dificultades que surgen al aumentar el número de grupos a comparar y no poderse controlar los falsos rechazos de la hipótesis nula de igualdad de medias (Peña, 2002). Resultados y discusión 133 Tabla 44. Intervalos de confianza del 95% para las diferencias de medias según la edad (método de la mínima diferencia significativa). Destacados el fondo en aquellos grupos para los que la diferencias de medias es significativa al 5%. Tabla 45. Intervalos de confianza del 95% para las diferencias de medias según el ámbito (método de la mínima diferencia significativa). Destacados el fondo en aquellos grupos para los que la diferencia de medias es significativa al 5%. Tabla 46. Subgrupos homogéneos establecidos mediante el método de la mínima diferencia significativa. Zn en el hígado Zn en el riñón Límite inferior 17,3592 9,1252 -13,9485 2,2069 0,4616 -3,4326 Límite superior 30,4649 24,9975 0,2471 6,0774 5,1492 0,7595 Intervalos para un nivel de confianza del 95% Juvenil vs adulto Juvenil vs geronte Adulto vs geronte Juvenil vs adulto Juvenil vs geronte Adulto vs geronte Zn en el hígado Zn en el riñón Grupos por edad Grupos por ámbito Grupos por edad Grupos por ámbito G1 G2 G1 G2 G1 G2 G1 G2 Adulto y geronte Juvenil Periurbano Monte y agroforestal Adulto y geronte Juvenil Periurbano Monte y agroforestal Zn en el hígado Zn en el riñón Límite inferior 6,2573 7,174 -4,6338 0,9061 0,8838 -1,6616 Límite superior 24,7476 27,1289 7,9318 6,3669 6,7772 2,0495 Intervalos para un nivel de confianza del 95% Monte vs periurbano Agroforestal vs periurbano Agroforestal vs monte Periurbano vs monte Agroforestal vs periurbano Agroforestal vs monte