Evaluación de la presencia de psicofármacos y drogas de abuso en muestras biológicas y ambientales mediante nuevas metodologías analíticas
Abstract
En esta Tesis se proponen nuevas metodologías analíticas confirmatorias para la separación y cuantificación de sustancias psicoactivas en muestras biológicas y medioambientales, basadas en técnicas miniaturizadas como la microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) y la microextracción con adsorbentes empaquetados (MEPS). La optimización de las condiciones experimentales se llevó a cabo mediante herramientas quimiométricas basadas en los diseños de experimentos. La separación y determinación de los analitos de interés se realizó mediante cromatografía líquida de ultra resolución, que consigue reducir el tiempo de análisis, acoplada a la detección con red de diodos o a la espectrometría de masas. Finalmente, todos los métodos optimizados fueron validados siguiendo las directrices marcadas por guías internacionales de validación, y se aplicaron a la determinación de benzodiacepinas en orina y aguas residuales y de drogas de abuso en plasma y fluido oral.
Full text
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''ÎD0DUÊD5HJHQMR9¾]TXH] Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para a su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. (Q6DQWLDJRGH&RPSRVWHODGHRFWXEUHGH )LUPDGR 0DUÊD5HJHQMR9¾]TXH] (YDOXDFLÐQGHODSUHVHQFLDGHSVLFRI¾UPDFRV\GURJDVGHDEXVRHQ PXHVWUDVELROÐJLFDV\DPELHQWDOHVPHGLDQWHQXHYDVPHWRGRORJÊDV DQDOÊWLFDV '(&/$5$&,°1 '(/$8725'(/$7(6,6
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DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERÉS EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE PSICOFÁRMACOS Y DROGAS DE ABUSO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES MEDIANTE NUEVAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS Dña. María Regenjo Vázquez Declara no tener ningún conflicto de interés En Santiago de Compostela, 25 de octubre de 2019 Asdo. ...........
ASPECTOS ÉTICOS EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE PSICOFÁRMACOS Y DROGAS DE ABUSO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES MEDIANTE NUEVAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS Dña. María Regenjo Vázquez Declara que: Las investigaciones de esta tesis se realizaron siguiendo la legislación vigente en cuanto al tratamiento y protección de los datos de carácter personal, de acuerdo con: Los "Principios éticos para la investigación médica implicando seres humanos”. World Medical Association. Declaration of Helsinki. Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects. JAMA – J. Am. Med. Assoc. 2013; 310: 2191-2194 La ley 14/2007 «BOE» núm. 159, de 4 de julio de 2007 Capítulo III Utilización de muestras biológicas humanas con fines de investigación biomédica pp. 26-28 El informe favorable del Comité Autonómico de Ética de la Investigación de Galicia. Código de Registro: 2015/488 (Anexos). Existe un compromiso por parte de la doctoranda y las directoras de la tesis de garantizar el cumplimiento de los principios éticos y la normativa vigente referida a la investigación. En Santiago de Compostela, 25 de octubre de 2019. Asdo. María Regenjo Vázquez
AGRADECIMIENTOS Gracias a todos os que me axudástedes neste longo proceso. En primeiro lugar as miñas directoras de tese Purificación Fernández Gómez y Antonia María Carro Díaz por darme a oportunidade de realizar este traballo, e á profesora Rosa Antonia Lorenzo Ferreira que aínda que non figura como tal é unha directora máis deste traballo. Á Xunta de Galicia pola bolsa de movilidade do Programa Iacobus POCTEP Interreg 2014-2020 e á Profesora Mª Lourdes Bastos por permitirme realizar unha estancia na Universidade de Porto e aprender un pouquiño mais, e a Vera por acompañarme neses días que estiven alí. Á Xunta de Galicia, Ministerio do Interior-DGT e fondos FEDER polos contratos obtidos (Proxecto 10TAL209005PR e SPIP2015-01838). Á profesora Maria Isabel Loza, por permitirme realizar parte deste traballo no CIMUS, e como non a Jose M. Ramos por acompañarme cando o cromatógrafo non tiña un bo día. A todos os compañeiros do laboratorio de Toxicoloxía, Pamela, Chus, Ana, Angelines e en especial a Iván por todos esos, deixeiche ahí, botalle un ollo, e toda a paciencia que ten conmigo, e a Ana por todas as comidas. A José Manuel por toda a axuda cos tramites. A Abel, Alex, Ana, Antía, Brais, Dani, David, Eva, Fabián, Fátima, Fernando, Isa, Iván, Joana, Jonathan, Laura, Lucia, Lucia T., Marcos, Marta, Mónica, Noa, Paula, Raquel, Raul, Saray, Uxía, a todos os meus nenos e os que están por vir gracias por todo o que me enseñastedes, en especial a Mónica, Eva e Saray porque con vos empecei esa aventura que se acabou convertendo en parte do sustento desta tese.
A todos os compañeiros do Concello de Lousame en especial a Ramón e Silvia por escoitar as miñas queixas e a Teresa por todos os bos consellos e esperanzas. Por ultimo e máis importante: A meus pais e meu irmán por toda a axuda nestes anos, e a miña nai por insistir e retarme para que me embarcase nesta viaxe, porque me fixo comerme as palabras “eu cando acabe a carreira non vou facer a tese”, pois aquí estou a piques de rematala. Os meus avos que xa non puideron chegar ao final pero que foron parte importante, a miñas avoas e a Dolores a miña segunda nai. A Adri por acompañarme na viaxe e non deixarme abandonar o barco nas horas baixas. O meu pequerrecho por acompañarme na escritura desta tese, fíxose máis levadeiro contigo o meu lado. A todos eses amigos Cris, Ángel, Vareluda, Anxo, Lara, María, Martín, Lore, Fachi… gracias por estar sempre ahí.
ÍNDICE ABREVIATURAS 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................ 1 1.1. BENZODIAZEPINAS. ............................................................. 3 1.1.1. Propiedades fisicoquímicas. ............................................... 3 1.1.2. Propiedades farmacológicas. .............................................. 5 1.1.3. Farmacocinética. ................................................................. 6 1.1.4. Toxicidad y abuso. .............................................................. 8 1.2. COCAINA Y METABOLITOS. ............................................. 11 1.2.1. Propiedades físicoquímicas. ............................................. 11 1.2.2. Propiedades farmacológicas. ............................................ 12 1.2.3. Farmacocinética. ............................................................... 13 1.2.4. Toxicidad y Abuso. .......................................................... 15 1.3. OPIÁCEOS . ......................................................................... 18 1.3.1. Propiedades fisicoquímicas. ............................................. 18 1.3.2. Propiedades farmacológicas. ............................................ 20 1.3.3. Farmacocinética. ............................................................... 21 1.3.4. Toxicidad y Abuso. .......................................................... 24 1.4. CATINONAS. ......................................................................... 29 1.4.1. Propiedades fisicoquímicas. ............................................. 29 1.4.2. Propiedades farmacológicas. ............................................ 31 RESUMO ÍNDICE
1.4.3. Farmacocinética. ............................................................... 32 1.4.4. Toxicidad y abuso. ............................................................ 33 1.5. ESCOPOLAMINA. ................................................................. 35 1.5.1. Propiedades fisicoquímicas. .............................................. 35 1.5.2. Propiedades farmacológicas. ............................................. 36 1.5.3. Farmacocinética. ............................................................... 36 1.5.4. Toxicidad y abuso. ............................................................ 37 1.6. MUESTRAS BIOLÓGICAS. .................................................. 38 1.6.1. Sangre. .............................................................................. 38 1.6.2. Orina.................................................................................. 39 1.6.3. Saliva. ................................................................................ 40 1.6.4. Comparación y elección de muestras. ............................... 41 1.7. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN. ............................................ 45 1.7.1. Microextracción líquido líquido dispersiva (DLLME). .... 46 1.7.2. Microextracción con sorbentes empaquetados (MEPS). .. 48 1.7.3 Revisión bibliográfica ........................................................ 51 1.8 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS. ..................................... 57 1.8.1. Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC). ............ 57 1.8.2. Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia (UPLC). ........... 61 1.8.3. Detector de array de diodos (DAD). ................................. 62 1.8.4. Detector de Espectrometría de Masas (MS/MS). .............. 63 1.8.5 Revisión bibliográfica. ....................................................... 65 1.9. DISEÑOS EXPERIMENTALES . ........................................ 86 1.9.1. Introducción. ..................................................................... 86
1.9.2. Diseños de screening o cribado. ....................................... 88 1.9.3. Diseños de optimización. .................................................. 89 1.10. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS. ......... 91 1.10.1. Linealidad y Efecto Matriz. ............................................ 91 1.10.2. Sensibilidad. ................................................................... 92 1.10.3. Selectividad. ................................................................... 92 1.10.4. Límites de Detección y Cuantificación. ......................... 92 1.10.5. Precisión. ........................................................................ 93 1.10.6. Recuperación. ................................................................. 94 1.11. BIBLIOGRAFÍA. .................................................................. 95 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ............................................... 119 2.1. JUSTIFICACIÓN. ................................................................. 121 2.2. OBJETIVOS. ......................................................................... 125 3. METODOLOGÍA ......................................................................... 127 3.1. DETERMINACIÓN DE BENZODIAZEPINAS (BZD) EN ORINA Y AGUAS RESIDUALES DE HOSPITALES .............. 129 3.1.1. Reactivos. ....................................................................... 129 3.1.2. Muestras de orina y agua. ............................................... 129 3.1.3. Procedimiento de UA-DLLME. ..................................... 130 3.1.4. Condiciones de UPLC-PDA. .......................................... 131 3.1.5. Diseño Experimental: Diseño Doehlert. ......................... 132 3.2. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN PLASMA MEDIANTE DLLME-HPLC-PDA. ............................................. 134
3.2.1. Reactivos. ........................................................................ 134 3.2.2. Muestras de plasma. ........................................................ 134 3.2.3. Procedimiento de US-DLLME. ...................................... 134 3.2.4. Condiciones de HPLC-PDA. .......................................... 135 3.2.5. Diseño experimental. ...................................................... 136 3.3. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN PLASMA MEDIANTE MEPS-UPLC-PDA ................................................. 138 3.3.1. Reactivos. ........................................................................ 138 3.3.2. Muestras de plasma. ........................................................ 138 3.3.3. Procedimiento de MEPS. ................................................ 139 3.3.4. Condiciones de UPLC-PDA. .......................................... 140 3.3.5. Diseño experimental. Diseño de screening asimétrico. .. 141 3.4. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN SALIVA MEDIANTE DLLME-UPLC-MS/MS ......................................... 143 3.4.1. Reactivos. ........................................................................ 143 3.4.2. Muestras de saliva. .......................................................... 143 3.4.3. Procedimiento de US-DLLME. ...................................... 144 3.4.4. Condiciones de UPLC-MS/MS. ...................................... 144 3.4.5. Diseño experimental. ...................................................... 148 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................. 151 4.1. DETERMINACIÓN DE BENZODIAZEPINAS EN ORINA Y AGUAS RESIDUALES DE HOSPITALES MEDIANTE USDLLME - UPLC-PDA. ................................................................. 153 4.1.1. Optimización de la US-DLLME. .................................... 155
4.1.2. Validación del método analítico. .................................... 162 4.1.3. Aplicación del método a muestras de orina y aguas residuales. ................................................................................. 167 4.1.4. Bibliografía. .................................................................... 171 4.2.1. Optimización del procedimiento US-DLLME. .............. 177 4.2.2. Validación del método analítico. .................................... 184 4.2.3. Aplicación del método a muestras de plasma. ................ 188 4.2.4. Bibliografía. .................................................................... 190 4.3. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN PLASMA MEDIANTE MEPS - UPLC-PDA. .............................................. 196 4.3.1. Optimización de MEPS. ................................................. 198 4.3.2. Validación del método analítico. .................................... 207 4.3.3. Aplicación del método a muestras de plasma. ................ 212 4.3.4. Bibliografía. .................................................................... 214 4.4. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN SALIVA MEDIANTE US-DLLME - UPLC-MS/MS. ............................... 221 4.4.1. Optimización de las condiciones de US-DLLME. ......... 223 4.4.2. Validación del método. ................................................... 231 4.4.3. Aplicación del método a muestras reales. ...................... 239 4.4.4. Bibliografía. .................................................................... 242 5. CONCLUSIONES ........................................................................ 245 ANEXOS .......................................................................................... 251 4.2. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN PLASMA MEDIANTE US-DLLME-HPLC-P . ...........................................176
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Estructura general de las benzodiazepinas Figura 2: Mecanismo de acción de las benzodiazepinas. Figura 3: Consumo de benzodiazepinas en España 2000-2012. Figura 4: Planta erythroxylon coca. Figura 5: Estructura de la cocaína, benzoilecgonina y cocaetileno. Figura 6: Mecanismo de acción de la cocaína. Figura 7: Metabolismo de la cocaína. Figura 8: Prevalencia del consumo de cocaína en adultos jóvenes (15-34). Figura 9. Formas de abuso de la cocaína: a) Hojas de coca, b) Pasta de coca, c) clorhidrato de cocaína, d) Crack. Figura 10: Amapola del opio. Figura 11: Estructura de los opiáceos. Figura 12: Metabolismo de la heroína y la morfina. Figura 13: Metabolismo de la metadona. Figura 14: “Golden triangle”. Figura 15: Estimaciones nacionales de prevalencia anual del consumo de opiáceos de alto riesgo, tendencias seleccionadas y datos más recientes. Figura 16: Estructura general de las catinonas. Figura 17: Estructuras químicas de etilcatinona efedrina y la metilefedrina. Figura 18: Metabolismo de la metilona. Figura 19: (a) Hyoscyamus Niger, (b) Datura Stramonium, (c) Brugmasia Candida. Figura 20: Estructura de la escopolamina.
ABREVIATURAS A ACN Acetonitrilo Alpra Alprazolam 6-AM Monoacetilmorfina ATD Antidepresivos B BEG Benzoilecgonina BMIm PF6 Hexafluorofosfato de Butilimidazolio Broma Bromacepam Bupre Buprenorfina BZD Benzodiazepinas C CE Electroforesis Capilar (Capillary Electrophoresis) CD Detección coulométrica (Coulometric Detection) CG Cromatografía de Gases (Gas Chromatography) Clona Clonacepam COC Cocaína COCET Cocaetileno CPE Extracción en Punto de Nube (Cloud Point Extraction) CTAB Bromuro de cetilmetil amonio CV Coeficiente de Variación D DAD Detector Array de Diodos (Diode Array Detector). DBS Manchas de sangre seca (Dried Blood Spots)
DART Análisis Directo en Tiempo Real (Direct Analysis in Real Time) DCM Diclorometano Dia Diacepam DIE Dietilpropiona DLLME Microextracción Líquido Líquido Dispersiva (Dispersive Liquid Liquid Microextraction) DNUM Microextracción Dispersiva con Nanomateriales asistida por Ultrasonidos (Dispersive Nanomaterial-Ultrasounds assisted Microextraction) D-µSPE Microextracción en fase sólida dispersiva (Dispersive µSPE) E EDAR Estación De Aguas Residuales. EDDP 2-etileno-1, 5-dimetil-3, 3-difenilpirrolidina ESI Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization) EtOH Etanol F FASS Espectrometría de Absorción Atómica de Llama (Flame Atomic Absorption Spectroscopy) FID Detector de Ionización en Llama (Flame Ionization Detector) FD Detección Fluorométrica (Fluorometric Detection) FM Fase Móvil G GABA Ácido Gamma-Amino butírico GC Cromatografía de Gases (Gas Chromatography)
H HPLC Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (High Performance Liquid Chromatography) HV Humor Vítreo I IPA Isopropanol L LC Cromatografía Líquida (Liquid Chromatography) LLE Extracción Líquido Líquido (Liquid Liquid Extraction) LOD Límite de Detección Lora Loracepam Lormet Lormetacepam LOQ Límite de Cuantificación LSD Dietilamida del Ácido Lisérgico ((6aR,9R)-N, N-dietil-7metil-4,6,6a,7,8,9-hexahidroindolo [4,3-fg]quinolina-9-carboxamid) M M1 Modo mixto (SCX-C8) MAE Extracción Asistida por Microondas (Microwave Assisted Microextraction) MDPV Metilendioxipirovalerona MEPS Microextracción con Adsorbentes Empaquetados (Microextraction by Packed Sorbents) MeOH Metanol MET Metadona MIPS Polímeros de Impronta Molecular (Molecularly Imprinted Polymers) MOR Morfina
MS Espectrometría de Masas (Mass Spectrometry) N Nalo Naloxona NPS Nuevas Substancias Psicoactivas (New Psychoactive Substances) P PCP Fenilciclohecilpiperidina PDA Fotodetector de red de Diodos (Photodetector Diode Array) Q QC Control de calidad (Quality Control) QTOF-MS Cuadrupolo de Tiempo de Vuelo-Espectrometría de Masas (Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry) QuEChERS Método rápido, sencillo, económico, eficaz, robusto y seguro (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe method) S SNC Sistema Nervioso Central SDS Dodecil Sulfato Sódico SIB Sibutramina SPE Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extraction) SPED Extracción en Fase Sólida Dispersiva (Solid Phase Dispersive Extraction) SPME Microextracción en Fase Sólida (Solid Phase Microextraction) SSLLE Extracción líquido líquido en soporte sólido (SolidSupported Liquid-Liquid Extraction) T Tetra Tetracepam
TOF Tiempo de Vuelo (Time of Flight) U UHPLC Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia (Ultra High Performance Liquid Chromatography) UPLC Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia (Ultra Performance Liquid Chromatography) UV Ultravioleta V VANS Micromuestreo de Absorción Volumétrica (Volumetric Absorptive Microsampling) VIS Visible VWD Detector de longitud de onda variable
1. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. BENZODIAZEPINAS. 1.1.1. Propiedades fisicoquímicas. Las benzodiazepinas son los fármacos más prescritos en el mundo. Formadas por un anillo poco habitual de siete lados, fusionado con un anillo aromático, con cuatro grupos sustituyentes principales que pueden modificarse sin pérdida de actividad (Figura 1, Tabla 1). [1, 2] Alprazolam: Polvo cristalino blanco. Soluble en cloroformo y diclorometano, poco soluble en alcohol y acetona y prácticamente insoluble en agua. 8-chloro-1-methyl-6-phenyl-4H-[1,2,4] triazolo [4,3-α] [1,4]. C17H13ClN4. Peso molecular: 308,8 g/mol. Nombre comercial: Trankimazin. pKa 2,4. Bromazepam: Polvo cristalino blanco o amarillo. Parcialmente soluble en alcohol y diclorometano y prácticamente insoluble en agua. 7-bromo-1,3-dihidro-5-(2-piridinilo)-2H-1,4-benzodiacepin-2-ona. C14H10BrN3O. Peso molecular: 316,2 g/mol. Nombre comercial: Lexatin. pKa 11. Clonazepam: Polvo cristalino blanco o amarillo claro. Soluble en acetona y cloroformo. 5. (2-clorofenilo)-1,3-dihidro-7-nitro-2H-1,4benzodiacepin-2-ona C15H13ClN3O3. Peso molecular: 315,7 g/mol. Nombre comercial: Rivotril. pKa 1,5/10,5. Diazepam: Polvo cristalino blanco o amarillo. Ligeramente soluble en agua, soluble en etanol y cloroformo. 7-cloro-1,3-dihidro1-metilo-5-fenilo-2H-1,4-benzodiacepin-2-ona. C16H13ClN2O. Peso molecular: 284,7 g/mol. Nombre comercial: Valium. pKa 3,3. Lorazepam: Polvo blanco. Soluble en etilacetato, alcohol y cloroformo. 7-cloro-5-(2-clorofenilo)-1,3-dihidro-3-hidroxi-2H-1,4benzodiacepin-2-ona. C15H10Cl2N2O2. Peso molecular: 312,2 g/mol. Nombre comercial: Orfidal. pKa 1,3/11,5.
María Regenjo Vázquez 10 Figura 3: Evolución de las benzodiazepinas en España 2010-2018. Con permiso de Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad. AEMPS "Informe de utilización de medicamentos" U/HAY/V1/17012014.
INTRODUCCIÓN 11 1.2. COCAINA Y METABOLITOS. 1.2.1. Propiedades físicoquímicas. La cocaína es un alcaloide tropano encontrado en la Erythroxylon coca, (Figura 4) en cantidades de hasta el 2% de su peso. Esta planta crece principalmente en los Andes, y en menor medida en India, África e Indonesia. [1, 2] Figura 4. Planta erythroxylon coca. Con permiso de Fundation Wikipedia Inc. Cocaína: Methyl-(1S, 3S, 4R, 5R)-3-benzoyloxy-8-methyl-8azabicyclo-[3,2,1] octane-4-carboxylate. Es un polvo blanco cristalino, poco volátil y soluble en agua, pK 8,6. C12H21NO4. Peso molecular: 303,4g/mol. Benzoilecgonina: 3-(Benzoyloxy)-8-methyl-8-azabicyclo [3,2,1] octane-2-carboxylic acid. La forma hidratada se presenta en cristales. Es muy soluble en agua caliente, soluble en etanol y prácticamente insoluble en éter. C16H19NO4. Peso molecular: 289,3g/mol. Cocaetileno: Ethyl (1R, 2R, 3S, 5S)-3-(benzoyloxy)-8-methyl-8azabicyclo [3, 2, 1] octane-2-carboxylate. C18H22NO4 Peso molecular: 317.4g/mol.
María Regenjo Vázquez 12 La Figura 5 muestra las estructuras de la cocaína y sus metabolitos benzoilecgonina y cocaetileno. [2] Cocaína Benzoilecgonina Cocaetileno Figura 5: Estructura de la cocaína, benzoilecgonina y cocaetileno 1.2.2. Propiedades farmacológicas. La cocaína fue usada como anestésico local y principalmente como droga de abuso por sus efectos estimulantes. Su mecanismo de acción clínica más importante radica en su habilidad para bloquear la conductancia del canal de sodio y así aumentar el umbral necesario para generar un potencial de acción. La cocaína inhibe la recaptación de neurotransmisores como dopamina, noradrenalina y serotonina (Figura 6), lo que facilita su acumulación en la hendidura presináptica, y una prolongación de los impulsos nerviosos. Los efectos son midriasis, vasoconstricción, hipertensión, taquicardia, hipertermia, euforia, aumento de la excitación sexual, y autoconfianza. Los efectos indeseables incluyen paranoia, alucinaciones y disforia. [1, 6, 10-11]
INTRODUCCIÓN 13 Figura 6: Mecanismo de acción de la cocaína. Con permiso de Isipedia.com. 1.2.3. Farmacocinética. Absorción y distribución: La cocaína se puede administrar por vía intravenosa, intranasal, oral o fumada, siendo poco frecuente la vía oral porque produce efectos reducidos debido a su liberación ineficaz al cerebro. La vía intravenosa es la única ruta que produce el 100% de la biodisponibilidad de la droga. La biodisponibilidad de las rutas intranasal e inhalada es variable, sin embargo la conveniencia de esas rutas se debe al rápido e intenso inicio de los efectos. [1] La cocaína es rápida y eficazmente absorbida por las membranas de las mucosas y de los pulmones. Sin embargo, el ritmo al que la cocaína aparece en la sangre depende de la ruta de administración. [10] La cocaína es distribuida ampliamente por todo el organismo, y puede encontrarse en el cerebro, bazo, riñón, pulmón, sangre, corazón y músculo. El volumen de distribución varía entre 1,5 y 2 L/Kg. [11] Metabolismo: La cocaína es inicialmente metabolizada a benzoilecgonina (BEG) y ecgonina metil ester (EME). Mediante
María Regenjo Vázquez 14 diferentes mecanismos, las esterasas hepáticas producen el metabolito inactivo EME, mientras que la BEG se forma espontáneamente al pH fisiológico y alcalino, así como a partir de la cocaína gracias a la carboxilesterasa hepática. La cocaína también puede ser Ndesmetilada mediante el citocromo P-450 que produce la norcocaína, un metabolito inactivo. Cuando la cocaína es administrada junto con alcohol etílico se forma el cocaetileno (COCET) por transesterificación mediada por las metilesterasas hepáticas. Este compuesto lipofílico cruza la barrera hematoencefálica y se conoce su contribución a los efectos psicológicos producidos por la cocaína. La aparición del cocaetileno en la sangre puede retrasarse entre 10 y 30 minutos. Cuando la cocaína es inhalada se forma un producto de pirolisis, la anhidro-ecgonina metil ester. [1,10] La Figura 7 muestra las distintas rutas metabólicas de la cocaína. Figura 7: Metabolismo de la cocaína
INTRODUCCIÓN 15 Eliminación: La cocaína es eliminada por la orina: entre 1 y 9% como droga sin modificar (según el pH de la orina), entre 35 y 45% como benzoilecgonina, entre 32 y 49% como ecgonina metil ester y entre 2 y 3% como ecgonina, en un período de 24 horas. [1, 10] La presencia de benzoilecgonina en orina es el marcador más utilizado para determinar el consumo de cocaína. Se puede detectar en orina hasta dos o tres días después del consumo, y su concentración dependerá de la cantidad de droga consumida y de la vía de administración. [11] 1.2.4. Toxicidad y Abuso. La cocaína es la segunda droga ilegal más consumida en Europa. Fue originalmente conocida como “la droga de los ricos” pero los bajos precios y las formas menos costosas de la droga, como el crack, han dado lugar al uso generalizado entre toda la población. Muchos consumidores de cocaína la toman en contextos recreativos, viéndose aumentado el consumo los fines de semana y vacaciones. Se estima que 17,5 millones de adultos europeos (de 15 a 64 años) han consumido cocaína en algún momento de su vida. Entre ellos hay unos 2,3 millones de jóvenes de 15 a 34 años que han consumido la droga durante el último año. En España, 2008 fue el año de mayor consumo de esta droga entre los más jóvenes, comenzando una bajada que todavía se mantiene en la actualidad; aún así, España es uno de los países europeos con mayor porcentaje de jóvenes que consume cocaína (Figura 8). [8, 12, 13]
María Regenjo Vázquez 16 Figura 8: Prevalencia del consumo de cocaína en adultos jóvenes (15-34 años). Con permiso de Observatorio Europeo sobre drogas y toxicomanía “Informe europeo sobre drogas. Tendencias y novedades” Luxemburgo: Oficina de Publicaciones de la Unión Europea, 2019 Los principales países de producción de cocaína se encuentran en Sudamérica y desde ahí se lleva al resto de países. En Europa la principal ruta de entrada es la costa Atlántica, aunque a causa de los mayores registros se han creado rutas alternativas desde África por el Mediterráneo (Figura 9). [7] Las sobredosis por cocaína son relativamente bajas considerando lo popular que es su consumo. Se estima que la dosis letal mínima es de 1,2 g pero personas más sensibles a la droga han muerto con dosis tan pequeñas como 30 mg. Sin embargo, los adictos pueden tolerar dosis de hasta 5 g. Se han observado efectos tóxicos con concentraciones en sangre que van desde 0,5 a 5 µg/mL y letales con concentraciones de más de 1 mg/L. En la Tabla 4 se pueden ver los rangos de concentraciones letales en distintos tejidos. [2, 14] Tabla 4: Concentraciones letales de cocaína en distintos tejidos (µg/mL ó µg/g). Sangre Cerebro Hígado Riñón Orina HV Bilis Rango 0,1-330 0,04-74 0,2-393 3,8-28 0,05-402 0,8-13 2-468
INTRODUCCIÓN 17 Existen diferentes formas de abuso de la cocaína que determinan las vías de administración de la droga y que condicionan la farmacocinética, la farmacología, el grado de adicción y la toxicidad. Se conocen las siguientes formas de abuso: Hojas de coca: es la forma de consumo más habitual en Sudamérica. La absorción es variable dependiendo de la cantidad de droga en las hojas (Figura 9a). Pasta de coca: Es el producto bruto, no refinado que resulta del primer proceso de extracción de la cocaína a partir de las hojas. Se obtiene de la maceración de las hojas con ácido sulfúrico u otros productos químicos y sirve de base para la posterior elaboración de clorhidrato de cocaína. Se fuma (Figura 9b). Clorhidrato de cocaína: Es la sal de la cocaína formada con ácido clorhídrico que se presenta en forma de cristales blancos. Se consume por vía intravenosa o intranasal, siendo esta última la más habitual (Figura 9c). Crack: Es la base libre de la cocaína. Se obtiene mezclando el clorhidrato de cocaína con una solución básica, se disuelve con éter, se deja que se evapore y se forma un precipitado “rock”. El crack es la segunda forma de consumo de la cocaína y produce una gran dependencia. Se fuma usando pipas de crack (Figura 9d). [6, 11] a b c d Figura 9. Formas de abuso de la cocaína. a) Hojas de coca, b) Pasta de coca, c) clorhidrato de cocaína, d) Crack. con permiso de www.teinteresa.es
María Regenjo Vázquez 18 1.3. OPIÁCEOS. 1.3.1. Propiedades fisicoquímicas. Usados durante más de 2000 años, los opiáceos son analgésicos y alcaloides naturales obtenidos de la amapola del opio (Figura 10). Figura 10. Amapola del opio. Acceso libre Los exudados obtenidos de la planta contienen numerosos compuestos activos entre los que se incluyen la morfina y la codeína. El término opiáceos se usa para nombrar los alcaloides naturales y semisintéticos obtenidos a partir del opio, así como los preparados sintéticos cuyos efectos farmacológicos y estructuras son similares a los de la morfina. La heroína fue el primer opioide semisintético, obtenido a partir de la morfina en 1874. [1] 6-acetilmorfina: Metabolito de la heroína. Cristales. Soluble en agua. C19H21NO4. Peso molecular: 363,8 g/mol. Buprenorfina: Polvo cristalino blanco. Poco soluble en agua, soluble en alcohol y metanol. C29H41NO4. Peso molecular: 467,6 g/mol. Pk 8,5-10,0. Heroína: Diacetato de (5α, 6α)-7,8-didehidro-4,5-epoxi-17metilmorfiinan-3,6-diol. Polvo blanco cristalino. Soluble en etanol. C21H23NO5. Peso molecular: 369,41g/mol. Pk 7,6. Metadona: 6-Dimetilamino-4,4-difenil-3-heptanone. Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Soluble en agua. C21H27NO. Peso molecular 309,5 g/mol. Pk 8,3. Nombres comerciales: Dolofina, Methadose.
INTRODUCCIÓN 19 EDDP: 2-Etilidene-1,5-dimetil-3,3-difenilpyrrolidine. Metabolito de la metadona. C 20 H 23 N . Peso molecular: 277,4 g/mol. Morfina: (5α, 6α)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-metilmorfinan3,6-diol. Principal alcaloide del opio. Polvo blanco cristalino. C 17 H 19 NO 3. Peso molecular: 303,4 g/mol. Pk 8,0. Naloxona: (5ª)-4, 5-Epoxy-3, 14-dihydroxy-17-(2-propenyl) morphinan-6-one. Cristales. Soluble en cloroformo, insoluble en éter. C 19 H 21 NO 4 . Peso molecular: 327,4 g/mol. Pk 7,9. [2] La Figura 11 muestra la estructura de los opiáceos. Buprenorfina Naloxona Heroína 6AM Morfina Metadona EDDP Figura 11: Estructura de los opiáceos.
María Regenjo Vázquez 26 Figura 14: “Golden triangle”. Acceso libre. En Europa, la heroína es el opiáceo más común en el mercado de la droga, que llega principalmente de Afganistán y en menor medida de Asia sudoriental. También han incautado opio y medicamentos como la morfina, metadona, buprenorfina, tramadol y fentanilo. [7, 18] El opiáceo ilegal más consumido en Europa es la heroína, usando diversas vías: Fumada (chino de heroína), se suele consumir mezclada con tabaco o cannabis. Es la forma más habitual de consumo en la actualidad. Esnifada, la heroína se calienta en un papel de aluminio y se inhalan los vapores. Vía parenteral, se disuelve el producto en agua caliente, se le agrega unas gotas de jugo de limón o vinagre y se inyecta. Hasta el descubrimiento del SIDA fue la forma más habitual de consumo. Proporciona la mayor intensidad y causa la oleada de euforia más rápida.
INTRODUCCIÓN 27 En Europa ha habido varias oleadas de adicción a la heroína, la primera a mediados de la década de los 70 y que afectó a muchos países de la parte occidental y una segunda entre mediados y finales de los 90 que afectó a países especialmente de la parte central y oriental. La prevalencia del consumo de opioides de alto riesgo entre adultos (de 15 a 64 años) se sitúa en el 0,4 % de la población de la UE, que equivale a 1,3 millones de personas en 2017. A escala nacional, las estimaciones de prevalencia de este tipo de consumo varían entre uno y ocho casos por cada 1 000 habitantes de 15 a 64 años, situándose España en torno a dos por cada 1000 habitantes, cifra que se mantiene desde el 2009. Los cinco países más poblados de la Unión Europea (Alemania, España, Francia, Italia y Reino Unido), que representan el 62% de su población, concentran aproximadamente las tres cuartas partes (77 %) de su cifra estimada de consumidores de opioides de alto riesgo (Figura 15). [13] Figura 15: Estimaciones nacionales de prevalencia anual del consumo de opiáceos de alto riesgo, tendencias seleccionadas y datos más recientes. Con permiso de Observatorio Europeo sobre drogas y toxicomanía “Informe europeo sobre drogas. Tendencias y novedades” Luxemburgo: Oficina de Publicaciones de la Unión Europea, 2019 El aumento de la mortalidad entre los consumidores de opiáceos está principalmente relacionado con la sobredosis, pero existen otras
María Regenjo Vázquez 28 causas relacionadas como las infecciones, la violencia, los accidentes o los suicidios. Los consumidores de opiáceos tienen una probabilidad entre 5 y 10 veces mayor de morir que personas no consumidoras de su mismo sexo y edad. En la mayoría de muertes por sobredosis hay presencia de opiáceos, con un 78% de varones y un 42-43% de sujetos entre 25 y 64 años. En España, se observa una bajada en el consumo desde 2008 hasta 2012, pero a partir de este año vuelve a aumentar. [6, 7, 13, 18].
INTRODUCCIÓN 29 1.4. CATINONAS. 1.4.1. Propiedades fisicoquímicas. Las catinonas, “sales de baño o bath salts”, son nuevas sustancias psicoactivas (NPS) químicamente relacionadas con la catinona, un alcaloide encontrado en el arbusto Catha edulis (Khat) que crece en el este de África y el sur de Arabia. Las variantes sintéticas de la catinona son normalmente más potentes que el compuesto natural. [1, 19] Las catinonas sintéticas son derivados de la fenilalquilamina y están estrechamente relacionadas con las anfetaminas, diferenciándose en el grupo cetona introducido en la posición β de la cadena aminoalquilo unida al anillo fenilo (Figuras 16 y 17, Tabla 8). Estas drogas se usan como alternativas legales a otras drogas, en especial a las anfetaminas. Catinona: Benzoyletanamina. C9H11NO. Peso molecular: 149,2 g/mol. Butilona: 2-Methylamino-1-(3, 4-methylenedioxyphenyl) butan1-one. (βk-MBDB). C12H15NO3. Peso molecular: 221,3 g/mol. Etilona: 2-Ethylamino-1-(3,4-methylenedioxyphenyl) propan-1one. (bk-MDEA). C12H15NO3. Peso molecular: 221,2 g/mol. Etilcatinona: 2-(ethylamino)-1-phenylpropan-1-one. C11H15NO. Peso molecular: 177,2 g/mol. Etilcatinona efedrina: Metabolito primario de la etilcatinona. C11H17NO. Peso molecular: 215,7 g/mol. Flefedrona: 4-fluoromethcathinone. 1-(4-fluorophenyl)-2-methylaminopropan-1-one. C10H12FNO. Peso molecular: 181,2 g/mol. MDPV: Metilendioxipirovalerona. (RS)-1-(Benzo[d] [1,3] dioxol5-yl)-2-(pyrrolidin-1-yl) pentan-1-one. También conocida como Ola de marfil, Cielo de vainilla, Bendición, Droga caníbal o Leyenda Viviente. C16H21NO3. Peso molecular: 275,3 g/mol. Mefedrona: (RS)-2-methylamino-1-(4-methylphenyl) propan-1one. También conocida como 4-MMC, Mf, Comida para Cactus,
María Regenjo Vázquez 30 meow meow, Miau, CatMef, o MMCAT. C11H15NO. Peso molecular: 177,2 g/mol. Metilefedrina: (1R, 2S)-2-(Dimethylamino)-1-phenylpropan-1-ol. Polvo blanco cristalino. Soluble en cloroformo y éter, fácilmente soluble en agua. C11H17NO. Peso molecular: 179,3 g/mol. pK 9,3. Metilona: 2-Methylamino-1-(3,4-methylenedioxyphenyl) propan1-one. MDMC, βk-MDMA. C11H13NO3. Peso molecular: 207,2 g/mol. Pentedrona: 2-(Methylamino)-1-phenyl-1-pentanone. C12H17NO. Peso molecular: 191,3 g/mol. Pirovalerona: 1-(4-Methylphenyl)-2-(1-pyrrolidinyl)-1-pentanone C16H23NO. Peso molecular: 245,4 g/mol. [2, 20, 21] Figura 16: Estructura general de las catinonas
INTRODUCCIÓN 31 Tabla 8. Estructura química de las catinonas estudiadas Droga R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Catinona H H H H H Metilona Metil H 3,4-Metilenedioxi H H Etilona Etil H 3,4-Metilenedioxi H H Butilona Metil H 4-Metil Metil H Mefedrona Metil H 4-Metil H H Flefedrona Metil H 4-F H H Pirovalerona {pirrolidino} 4-Metil Etil H MDPV {pirrolidino} 3,4-Metilenedioxi Etil H Pentedrona H H H Etil H Etilcatinona H Metil H H H Etilcatinona efedrina Metilefedrina Figura 17: Estructuras químicas de etilcatinona efedrina y la metilefedrina. 1.4.2. Propiedades farmacológicas. Hay muy pocos datos sobre la farmacocinética y farmacodinamia humana de las catinonas. Al igual que las anfetaminas, las catinonas sintéticas ejercen sus efectos estimulantes al aumentar la concentración sináptica de catecolaminas. Estas moléculas son capaces de inhibir los transportadores de captación de monoaminas produciendo una eliminación reducida de los neurotransmisores de la sinapsis. Además, pueden causar la liberación de aminas biogénicas
María Regenjo Vázquez 32 de los almacenes intracelulares. Se comportan como depresores del SNC, aunque con una potencia menor que la feniletilamina análoga correspondiente; esto se debe al grupo β-ceto que hace que la molécula sea más polar, dificultando que ésta cruce la barrera hematoencefálica. Las catinonas poseen propiedades analgésicas lo que reduce la reacción motora producida por un estímulo doloroso térmico o irritativo, por lo tanto, un efecto inhibitorio en la percepción de dolor. La intoxicación por sales de baño presenta síntomas que incluyen psicosis, hipertermia y taquicardia, que pueden venir acompañados de ataques violentos. El problema más importante de las catinonas quizás sea el “delirio emotivo” en el cual los pacientes sufren agitación extrema, delirio e hipertermia, junto con rabdomiolisis y la consiguiente insuficiencia renal. [12, 19, 21, 22] 1.4.3. Farmacocinética. Absorción y distribución: Después de una dosis, la catinona alcanza una concentración plasmática máxima en 1 hora aproximadamente. Las piperazinas y las catinonas tienen vidas medias cortas, en torno a 4-5 h, lo que permite concluir que los efectos serán más cortos que los de las anfetaminas. Metabolismo: El metabolismo hepático de primer paso de la catinona conduce a la formación de norefedrina. Las catinonas sintéticas son N-desmetiladas, el grupo ceto se reduce a hidroxilo y los grupos alquilo del anillo se oxidan. El metabolismo primario de la metilona (Figura 18), etilona y butilona comienza con la desmetilación del anillo metilendioxi, seguida por una O-metilación mediada por la catecol-O metiltransferasa dando lugar a 4-OH-3-metoxi o 3-OH-4metoximetcatinona. También sufre este proceso la mefedrona, que es N-desmetilada a una amina primaria. A continuación, los grupos cetona son reducidos a alcoholes y finalmente el grupo “totyl” es oxidado al correspondiente alcohol. La N-desalquilación parece ser otra vía metabólica.
INTRODUCCIÓN 33 El metabolismo de MDPV se evaluó in vitro, demostrando que los principales metabolitos son catecol y metil-catecol pirovalerona, que a su vez son sulfatados y glucuronados. Figura 18: Metabolismo de la metilona. Excreción: El 2% de la catinona se excreta sin modificar. La semivida de eliminación de la catina y la catinona es de 5,2 ± 3,4 y 1,5 ± 0,8 h respectivamente. Las catinonas sintéticas son eliminadas principalmente por la orina, como metabolitos y, en menor medida, como droga sin modificar. [23] 1.4.4. Toxicidad y abuso. Las catinonas sintéticas fueron inicialmente usadas con fines terapéuticos y finalmente introducidas en el mercado de drogas recreativas como substitutos legales de las drogas ilegales, en especial de las anfetaminas. [20]
María Regenjo Vázquez 34 Los efectos tóxicos de las catinonas incluyen incremento de la frecuencia cardíaca, agitación, dificultad para respirar e incremento de la presión arterial. Las muertes son causadas por toxicidad aguda pero a menudo se ven implicadas otras drogas. Las catinonas también se asocian con ideas suicidas lo que da como resultado casos de suicidios asociados con su uso. Las catinonas sintéticas constituyen el segundo grupo de nuevas substancias vigiladas por la EMCDDA. Se han detectado un total de 118, catorce de ellas por primera vez en el año 2016. El aumento de la demanda de estas substancias se debe a la percepción entre los jóvenes de que son alternativas legales relativamente seguras. Sin embargo, cada vez es más evidente que su consumo es problemático en algunos ámbitos y en poblaciones vulnerables. En 2015, las catinonas sintéticas representaron casi un tercio de las incautaciones de nuevas substancias psicoactivas y casi un 60% de ellas procedían de China. En 2017 el número de incautaciones fue del 25% del total ocupando el segundo lugar solo por detrás de los cannabinoides sintéticos [7, 8, 12, 13].
INTRODUCCIÓN 35 1.5. ESCOPOLAMINA. 1.5.1. Propiedades fisicoquímicas. La escopolamina, hioscina o burundanga es un alcaloide tropano que se encuentra en las plantas de la familia de las solanáceas, como la hyoscyamus niger o beleño negro, la datura stramonium o estramonio y la brugmasia candida o trompa de ángel (Figura 19). [1, 6] ab c Figura 19: (a) Hyoscyamus Niger, (b) Datura Stramonium, (c) Brugmasia Candida. Acceso libre. La escopolamina (1α,2β,4β,5α,7β)-9-metil-3-oxa-9azatriciclo [3.3.1.0 2,4 ] non-7-il-(α-S)-α-(hidroximetil) benceno acetato (Figura 20) es un líquido viscoso que forma cristales monohidratados. Soluble en agua caliente, etanol, cloroformo, acetona y eter. C 17 H 21 NO 4. Peso molecular: 303,4 g/mol. pK 7,6 [2] Figura 20: Estructura de la escopolamina.
María Regenjo Vázquez 42 posibilidad de acceder a él de forma fácil y en procesos de descomposición. Sin embargo, el proceso de preparación de la muestra es complejo, puesto que esta matriz es sólida y es necesaria la extracción de las drogas hacia un disolvente. El contenido gástrico es útil cuando el consumo es muy reciente o la muerte se produce de forma rápida tras la ingesta de la droga o drogas, puesto que se pueden encontrar trozos de las pastillas ingeridas. Los tejidos son muestras alternativas que permiten obtener buenos resultados en algunos casos y para determinadas drogas (Tabla 10, Figura 25). La elección de una muestra se hace en función del tipo de análisis (determinación cuantitativa, screening o confirmación, consumo reciente o habitual), del tipo de droga a analizar, de la disponibilidad de la muestra (individuo vivo o muerto, cadáver reciente o putrefacto) o de la recogida de la misma (presencia de medios especializados en la extracción). [1, 27-30] Tabla 10: Comparación de las muestras biológicas usadas en Toxicología. Muestra Cantidad Obtención Ventajas Desventajas Sangre 10-20 mL Antemortem y postmortem -Determinación de uso reciente (2448h) -Relación con los efectos. -No adulterable. -Datos de referencia. -Recogida invasiva. -Personal médico. -Tiempos cortos de detección. Orina 50 mL Antemortem y postmortem -Fácil recogida. -Gran volumen. -Concentraciones elevadas. -No necesita conservantes. -Determinación de uso de días a semanas. -Niveles bajos de droga consumida. -Fácil manipulación. -No siempre está disponible.
INTRODUCCIÓN 43 Humor Vítreo 2 mL/ ojo Postmortem -Determinación de uso reciente (horas, días). -Resistente a putrefacción. -Pocas interferencias. -Postmortem. -Poco volumen. -Pocos datos de referencia. Saliva 1 a 5 mL Antemortem -Determinación de uso reciente. -Fácil recogida y preparación. -Drogas sin modificar. -Relación con el plasma. -Antemortem. -Poco volumen. -Posible contaminación. -Recogida influida por el pH. Pelo Depende de la longitud. Antemortem y postmortem -Historial de abuso. -Fácil recogida. -Baja posibilidad de manipulación. -Útil en estados de descomposición avanzada. -No valido para consumo reciente. -Contaminación del medio. -Pocos datos de referencia. -Necesidad de técnicas muy sensibles. Bilis 50 mL Postmortem -Fácil detección de algunas drogas. -Útil para drogas conjugadas. -Matriz compleja. -Interferencias. -Pretratamiento necesario. Contenido gástrico Contenido en estómago Antemortem y postmortem -Detección en tiempo corto postingesta -Gran cantidad de droga (ingestión). -Fragmentos de pastillas. -No sirve si la droga fue inhalada -Matriz compleja, no homogénea. -Pretratamiento necesario.
María Regenjo Vázquez 44 Figura 25: Períodos de detección de drogas en distintas muestras biológicas.
INTRODUCCIÓN 45 1.7. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN. En el análisis de drogas en muestras biológicas es muy importante la etapa de preparación de muestra porque se trata de matrices complejas, que contienen interferencias que podrían afectar a la determinación de la droga o a los equipos de detección. Las técnicas de extracción más ampliamente usadas son la extracción líquido líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE), pero recientemente se han descrito nuevos procedimientos que minimizan el consumo de muestra, disolventes y tiempo. De esta forma, se pueden disminuir los costes del proceso y solucionar los problemas derivados de las pequeñas cantidades de las muestras biológicas recibidas en el laboratorio de Toxicología para su análisis. Estas técnicas nacen de la miniaturización de la LLE y la SPE. La LLE se basa en la transferencia de los analitos de la fase acuosa a la fase orgánica y, aunque es un método ampliamente utilizado, tiene las siguientes limitaciones: consumo de grandes volúmenes de disolventes orgánicos, caros y tóxicos, producción de desperdicios peligrosos, formación de emulsiones, procedimientos laboriosos y bajos factores de enriquecimiento. La SPE es otra técnica ampliamente usada que se basa en la extracción de los analitos con ayuda de un soporte sólido; el proceso consta de cuatro etapas: 1) acondicionamiento de la fase sólida, 2) carga de la muestra, 3) lavado y secado de la fase sólida, y 4) elución de los analitos con un disolvente adecuado. La SPE consigue mejores resultados frente a la LLE, en relación con la recuperación, selectividad, sensibilidad y limpieza de los extractos obtenidos. Con el fin de mejorar estas técnicas tradicionales, se han desarrollado técnicas de microextracción que requieren menos cantidad de disolventes, tiempo, trabajo y coste y que son más respetuosas con el medio ambiente. La Microextracción en Fase Sólida (SPME), desarrollada por Pawliszyn en 1990, revolucionó la metodología de preparación de muestra, y en este mismo año también surgió la Microextracción en Fase Líquida (LPME). En 2004, Abdel Rehim [31] introdujo la Microextracción en Sorbentes Empaquetados (MEPS), y en 2006, Rezaee y col. [32] introdujeron la
María Regenjo Vázquez 46 Microextracción Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME). Ambas técnicas minimizan el consumo de disolventes y el coste de la extracción. [33-36] 1.7.1. Microextracción líquido líquido dispersiva (DLLME). La microextracción líquido-líquido dispersiva (Dispersive LiquidLiquid Microextraction, DLLME) está basada en un sistema ternario de componentes, formado por la muestra acuosa, un disolvente extractante y un disolvente dispersante [32]. La mezcla del disolvente extractante y dispersante se inyecta rápidamente en la muestra acuosa, formándose como resultado una solución turbia, que consiste en minúsculas gotas de disolvente extractante que se dispersan a través de la fase acuosa, aumentando la superficie de contacto y mejorando la extracción, pues disminuye el tiempo y aumenta la recuperación de las sustancias en estudio. Finalmente, se centrifuga la muestra para que el disolvente extractante se sitúe en el fondo del tubo (Figura 26). Figura 26: Procedimiento de la DLLME. Con permiso de Agnieszka Zgoła-Grze kowiak, Tomasz Grze kowiak. Trends in Analytical Chemistry, 2011; 30: 1382-1399
INTRODUCCIÓN 47 En la DLLME tradicional, el disolvente extractante es más denso que la muestra acuosa y es inmiscible en ella; además debe presentar una alta capacidad para extraer los analitos de la muestra. Los extractantes más usados son el cloroformo, diclorometano, tetracloruro de carbono, dicloroetano y clorobenceno. El disolvente dispersante debe ser miscible en la muestra y en el disolvente extractante para favorecer su dispersión en la muestra acuosa y así mejorar la extracción de los analitos. Los dispersantes más usados son acetonitrilo, acetona, metanol y etanol. [33-35, 37-40] En la DLLME, la adición de sal puede favorecer la obtención de mejores resultados en la extracción; sin embargo, como disminuye la solubilidad del extractante, la fase sedimentada puede crecer y el factor de enriquecimiento decrece; por esta razón es importante optimizar la cantidad de sal añadida para maximizar el porcentaje de recuperación obtenido. El tiempo de extracción se define como el intervalo entre la inyección de la mezcla del dispersante y extractante sobre la muestra acuosa y la centrifugación. Los cortos tiempos que se necesitan suponen una de las mayores ventajas de esta técnica. La primera aplicación de la DLLME fue desarrollada por Rezaee [32] para la extracción de hidrocarburos policíclicos aromáticos en muestras de agua, demostrando la aplicabilidad del método para la determinación de los analitos en muestras acuosas. En los años siguientes, la DLLME se optimizó generalmente para matrices simples, siendo las muestras acuosas las más estudiadas. Según pasan los años, la técnica se enfoca a matrices más complejas como vino, zumos, miel, leche, aguas residuales y muestras farmacéuticas y biológicas. La DLLME ha sido ampliamente utilizada en la determinación de numerosas drogas y venenos en muestras forenses [31, 33, 36, 38, 40] Para mejorar la DLLME se pueden introducir varias modificaciones de la técnica. El uso de los ultrasonidos (US) para favorecer la dispersión del extractante en la fase acuosa da lugar a la US-DLLME. En 2009, Xu y col. [41] propusieron una modificación de la DLLME, basada en la solidificación de la gota orgánica flotante SFO-DLLME (Solid Floating Organic Drop-DLLME), la cual usa
María Regenjo Vázquez 48 disolventes con baja densidad y puntos de fusión por debajo de la temperatura ambiente, como el 1-undecanol, el 1-dodecanol o el hexadecanol. Este procedimiento incluye la inyección rápida de la mezcla dispersante/extractante en la muestra, seguida de la centrifugación; como consecuencia de la baja densidad del disolvente orgánico, la gota se situará en la parte superior del tubo por lo que la muestra se debe someter a un baño de hielo para facilitar la recogida de la gota en estado sólido. En los últimos años y como consecuencia del desarrollo de la química verde, se modificó la DLLME introduciendo como extractantes los líquidos iónicos, que presentan alta estabilidad térmica, baja presión de vapor y viscosidad/solubilidad variable con la temperatura; de esta forma aparece la DLLME con Líquidos Iónicos (IL-DLLME). [33, 35, 38, 40] 1.7.2. Microextracción con sorbentes empaquetados (MEPS). La Microextracción con sorbentes empaquetados (MEPS) es una miniaturización de la tradicional SPE. Fue introducida en 2004 por Abdel-Rehim [31], y permite trabajar con volúmenes de muestra de entre 10 y 250 µL. Los sorbentes usados en MEPS son los mismos que usa la tradicional SPE pero en cantidades inferiores (1-4 mg) e integrados en una jeringa de líquidos (100-250 µL). En MEPS, el uso de disolventes se reduce en comparación con la SPE y además el adsorbente se puede usar hasta 100 veces. La reducción del volumen de muestra necesario hace que ésta sea una técnica muy útil en Toxicología, puesto que en muchas ocasiones las muestras son escasas y los análisis requeridos son numerosos. El proceso de extracción es similar al de la tradicional SPE y se divide en cuatro etapas: acondicionamiento de la fase estacionaria, inyección de la muestra, lavado de la fase y elución de los analitos (Figura 27). Sin embargo, se introduce una nueva etapa que es el lavado final de la fase para su reutilización. [31, 38, 42-44]
INTRODUCCIÓN 49 Figura 27: Esquema de MEPS. Con permiso de L. Yang, R. Said, M. Abdel-Rehim. J. Chromatogr. B, 2017; 1043: 33–43. La puesta a punto de la MEPS debe tener en cuenta diversos factores que afectan al proceso como son: la fase elegida, la muestra, el lavado, el disolvente de elución y el lavado final de la fase. [42, 44] Se pueden encontrar numerosas fases usadas en MEPS, incluyendo adsorbentes basados en sílice, como SIL (sílice sin modificar), C2 (etil), C8 (octil), C18 (octadecil); modo mixto C8 e intercambio catiónico (SCX) o modo mixto M1 (80% C8 y 20% SCX), poliestireno-divinilbenceno (PS-DVB) y carbono grafitico poroso, además de adsorbentes no comerciales como los polímeros de impronta molecular (MIPs), etc., que permiten usar MEPS para la extracción selectiva de diferentes analitos[45]. Para la extracción de drogas en muestras biológicas son la C8 y la C18 las dos fases más usadas (Tabla 12). La carga de la muestra en la fase es un paso importante en MEPS, por lo que se debe hacer lentamente (10-20 µL/seg) y en las condiciones necesarias para que los analitos queden retenidos en la fase. El pH es un factor importante en la retención y elución de los
María Regenjo Vázquez 50 analitos que afecta a la obtención de altas recuperaciones de los mismos. Es necesario eliminar macropartículas, que puedan obturar la fase, mediante centrifugación de la muestra, e incluso diluirla si ésta es muy viscosa. Otro factor importante es el número de ciclos de carga (strokes) pues esta acción puede incrementar la recuperación de los analitos. [42, 43, 45] La etapa de lavado, que sirve para eliminar interferencias no deseadas y débilmente retenidas en la fase, es importante para mejorar la recuperación de los analitos y para eliminar futuras interferencias en los equipos de detección que puedan modificar la señal. El disolvente o mezcla de disolventes elegidos, así como el pH de la mezcla son factores importantes a la hora de elegir la disolución de lavado adecuada para cada caso. [43] La etapa de secado es una etapa recomendada pero no necesaria. [45] La elución de los analitos debe hacerse con un pequeño volumen del disolvente más adecuado para su recuperación total a partir del sorbente. Debe ser un disolvente orgánico puro o mezclado con disoluciones ácidas o básicas, que sea volátil o soluble en la fase móvil de la cromatografía líquida (LC). Finalmente, debe introducirse una etapa de lavado posterior al proceso de extracción, que permita reutilizar la fase unas 100 veces dependiendo de la matriz de la muestra. En esta etapa se recomienda hacer un primer lavado con un disolvente orgánico, modificado con un ácido o base dependiendo de la naturaleza de los analitos, y un segundo lavado con agua pura o una disolución acuosa. Se recomienda también repetir cada paso unas cuatro veces. [42]
1.7.3 Revisión bibliográfica Las tablas 11 y 12 muestran aplicaciones de estas dos técnicas de extracción (DLLME y MEPS) para el estudio cromatográfico de drogas en Toxicología clínica y forense. Tabla 11: Revisión bibliográfica de la DLLME aplicada a la extracción de drogas a partir de muestras biológicas. Droga Muestra (mL) Dispersante (mL) Extractante (µL) Separación Detección LOD/LOQ (ng/mL) Referencia 7-aminoflunitrazepam Orina (5) IPA (0,5) DCM (250) LC ESI-MS 0,025 - [46] Melwanki, 2009 Antidepresivos (ATD) Orina (5) ACN (0,5) CCl4 (20) HPLC UV 3-8 0,5-25 [47] Xiong, 2009 Fentanilo Orina (5) Plasma (1,25) MeOH (2) Cloroformo (162) HPLC UV 0,4-1,9 1,1-5,5 [48] Saraji, 2011 Opiáceos Orina (2) Acetona (1) Cloroformo (88) HPLC UV 0,2-10 - [49] Shamsipur, 2011 ATD Orina (0,3) MeOH (0,15) CCl4 (10) GC MS 0,5-2 2-5 [50] Ito, 2011 Anfetaminas Orina (5) SDS (0,0565) 1-undecanol (31) HPLC UV 2-3 - [51] Tehrani, 2012 51 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 58 Un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia (Figura 28) consta de: a) Recipientes para la fase móvil y sistema para el tratamiento de disolventes. b) Bomba. c) Inyector. d) Columna cromatográfica. e) Detector. Figura 28: Esquema de un equipo HPLC a) Recipientes para la fase móvil y sistema para tratamiento de disolventes. Los equipos modernos de HPLC normalmente están dotados con recipientes de vidrio o acero inoxidable para los disolventes y un sistema para eliminar gases disueltos, que pueden formar burbujas en la columna, provocando ensanchamientos de banda y errores en el funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacio, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o sistemas de purga que arrastran
INTRODUCCIÓN 59 los gases disueltos mediante finas burbujas de gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también presentan un dispositivo para la filtración de polvo y partículas sólidas en suspensión y así evitar daños en la bomba, el sistema de inyección y/o la columna. No es necesario que los sistemas de desgasificación y filtrado se incluyan en el cromatógrafo, pues el tratamiento de los disolventes se puede hacer previamente. En cromatografía líquida las separaciones se pueden llevar a cabo usando un solo disolvente o mezcla de disolventes (elución isocrática) o usando varios disolventes con una polaridad significativamente distinta que se mezclan en distintas proporciones a lo largo del tiempo (elución en gradiente). La elución en gradiente incrementa notablemente la eficacia de la separación. b) Bomba. Los requisitos necesarios para un sistema HPLC son rigurosos e incluyen: la generación de altas presiones, por encima de 6000 psi, un flujo constante en el tiempo y reproducible día a día, un flujo libre de pulsaciones, permitir la variación de flujo en un intervalo práctico de trabajo, un intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min, ser químicamente inerte, permitir cambios de disolvente y operaciones de mantenimiento de modo simple y rápido, operar sin excesivo ruido o vibración, y disponer de elementos de seguridad. Existen tres tipos de bombas, cada una con sus ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante. [86, 87] c) Inyector. A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El sistema de inyección debe ser capaz de trabajar a presiones elevadas y de inyectar la muestra en cantidades reproducibles, como una banda lo más estrecha posible. El problema se acentúa por el ensanchamiento de banda que se asocia con la sobrecarga de la columna. Por ello, los volúmenes usados deben ser muy pequeños, de unos pocos microlitros. Además, la muestra se debe
María Regenjo Vázquez 60 introducir sin despresurizar el sistema; de hecho la inyección de la muestra se realizaba con jeringa a través de un septum que cierra herméticamente. La ventaja de esta técnica es la sencillez, pero desafortunadamente la reproducibilidad de la inyección con jeringa no es buena. [86, 87] En cromatografía de líquidos, el dispositivo más usado para introducir la muestra utiliza una válvula rotatoria que consta de seis canales con dos posiciones de trabajo (carga e inyección). En la posición de carga, se introduce la muestra mediante una jeringa, que llena un bucle o loop. Al mismo tiempo la fase móvil circula por otro circuito independiente. En la posición de carga, la fase móvil entra en el bucle y arrastra la muestra hacia la columna. Se inyecta un volumen reproducible de muestra y existen bucles intercambiables que permiten la elección de distintos volúmenes de muestra. d) Columna cromatográfica. Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se usa vidrio o material polimérico. La mayoría de las columnas tienen una longitud entre 10 y 30 cm, con un diámetro interno de 4 a 10 mm y los tamaños de partícula de los rellenos más comunes están entre 5 y 10 µm. Una de las columnas más utilizadas es la de 25 cm, 4,6 mm de diámetro interno y rellena de partículas de 5 µm. En muchas ocasiones, para alargar la vida de las columnas se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensión, los contaminantes de los disolventes y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Además, también sirven para saturar la fase móvil con la fase estacionaria y así minimizar las pérdidas de fase en la columna, por lo que su relleno debe ser semejante al de la columna analítica, aunque el tamaño de partícula suele ser mayor para minimizar la caída de presión. [86, 87] La mayoría de los instrumentos comerciales llevan actualmente sistemas de calefacción que controlan la temperatura de la columna.
INTRODUCCIÓN 61 Además, se debe tener en cuenta la temperatura máxima que soporta el relleno de la columna cromatográfica. e) Detector. Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer las siguientes características: adecuada sensibilidad, estabilidad y reproducibilidad, respuesta lineal para los solutos, tiempo corto de respuesta, alta fiabilidad y manejo sencillo, respuesta similar para todos los solutos, no destruir la muestra y tener un volumen interno mínimo con el fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores en cromatografía líquida miden fluorescencia, índice de refracción, conductividad, dispersión de la luz, absorbancia o espectrometría de masas. Los dos últimos son los más usados en la actualidad (Tabla 13). 1.8.2. Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia (UPLC). UPLC es una técnica analítica emergente para llevar a cabo las separaciones rápidas y de alta eficiencia con mayores presiones de trabajo que las de HPLC. Aunque a veces es difícil definir el punto exacto donde termina la HPLC y comienza la UPLC, el uso de presiones más elevadas mejora el rendimiento cromatográfico hasta conseguir la separación de un número mayor de compuestos en un período corto de tiempo. Muchos de los refinamientos que se producen en el campo de la cromatografía de líquidos están relacionados con el desarrollo de pequeñas columnas rellenas con materiales que tienen mejores propiedades de transferencia de masa y la consiguiente necesidad del uso de presiones muy altas para llevar a cabo las separaciones cromatográficas. Las equipos de UPLC son similares a los de HPLC, solo que las características de los mismos deben estar adaptadas a presiones de trabajo más altas. La diferencia más importante entre los componentes de los cromatógrafos son las columnas. En UPLC se usan columnas más estrechas que en HPLC convencional; estas columnas son empaquetadas con partículas de 2,5 μm o más pequeñas que pueden ser no porosas, porosas superficialmente o totalmente porosas. Mediante su uso, una separación puede realizarse a velocidades más
María Regenjo Vázquez 62 altas, con poca perdida de resolución. Las partículas totalmente porosas se usan con mayor frecuencia para producir los tamaños más convencionales de 2,1 a 3 mm de diámetro interno, ya que proporcionan un mejor equilibrio entre una alta eficacia y una alta capacidad (gran superficie de área por unidad de volumen) [88]. 1.8.3. Detector de array de diodos (DAD). Es el más habitual en los laboratorios analíticos y su sensibilidad es buena. La mayoría de las moléculas orgánicas absorben en la región UV/Visible. Existe una gran variedad de instrumentos, desde los de longitud de onda fija hasta los sistemas de red de diodos (DAD). Los primeros son útiles para análisis de rutina, en los que las sustancias a separar son conocidas, por lo que interesa exclusivamente el dato cuantitativo. Los segundos permiten el registro a tiempo real del espectro de los compuestos eluídos y proporcionan información sobre la pureza de los compuestos, pasando por sistemas intermedios de longitud de onda programable, más versátiles y más automatizados. Los sistemas con red de diodos (Figura 29) son buenos detectores a causa de su rapidez. También proporcionan una gran reproducibilidad en las medidas porque el sistema óptico es fijo y estable. El poder disponer de los valores de absorción a distintas longitudes de onda resulta más eficaz para algunas aplicaciones, como en el sistema de multicomponentes. [87, 88] Figura 29: Detector de array de diodos (DAD).
INTRODUCCIÓN 63 1.8.4. Detector de Espectrometría de Masas (MS/MS). La espectrometría de masas es una técnica analítica que proporciona información cualitativa y cuantitativa de las moléculas analizadas, previamente convertidas en iones. Los analitos de interés son inicialmente ionizados; estos iones atraviesan el analizador de masas hasta que alcanzan las diferentes partes del detector, de acuerdo con su relación masa/carga (m/z). Para el análisis de los compuestos mediante espectrometría de masas, se llevan a cabo tres pasos: ionización de la muestra, análisis de la muestra ionizada y detección de los iones formados (Figura 30). Figura 30: Componentes de un Espectrómetro de Masas. Con permiso de ThermoFinnigan Fuente de ionización: Con muestras líquidas, se realiza la ionización por electrospray (ESI). El analito, una vez introducido en la fuente, pasa a través de un tubo capilar de acero inoxidable o cuarzo, al cual se le aplica una diferencia de potencial en presencia de un flujo de gas nitrógeno. Tiene lugar la nebulización de las gotas cargadas en el capilar, provocando la formación de iones.
María Regenjo Vázquez 64 Analizador de Masas triple cuadrupolo: Este analizador es el más empleado; consiste en dos analizadores de masas (Q1, Q3) separados por una celda de colisión (Q2). En el primer cuadrupolo se selecciona el ión analito de interés por su masa (ión precursor o “parent ion”). En el segundo cuadrupolo este ión se pone en contacto con un gas de colisión (argón) para producir la fragmentación del “parent ion”. Los iones formados o iones hijos (“daughter ion”) están relacionados con el ión precursor y son escaneados en el tercer cuadrupolo. Se pueden usar distintas maneras de análisis; el método usado en este trabajo es la Monitorización de Reacción Múltiple (MRM), en la cual los iones precursores con una m/z única pasan a la celda de colisión. Los fragmentos iónicos se generan mediante la colisión con moléculas de nitrógeno. Q3 se configura para una m/z única de fragmento iónico específico. Este método es muy sensible y se utiliza para realizar cuantificaciones. [86-90]
INTRODUCCIÓN 65 1.8.5 Revisión bibliográfica. La tabla 13 muestra una lista de aplicaciones de la cromatografía líquida en Toxicología clínica y forense. Tabla 13: Revisión bibliográfica de las técnicas cromatográficas usados para el análisis de drogas en muestras biológicas. Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia Opiáceos/ Orina Inmunoensayo High Purity C8 (150 x 3 mm) A: 4mM acetato amónico pH:6,8, 5% MeOH B: 1% propan-2-ol 0,05% ac. fórmico MeOH Gradiente 0,8 mL/min 35ºC MS/MS [91] Fox, 2009 BZD/ Suero SPE Unison UK-C18 (150 x 2 mm, 3 μm) A: 10mM formiato amónico 0,1% ác. fórmico B: 0,1% ác. fórmico MeOH Gradiente 0,25 mL/min 40ºC MS/MS [92] Nakamura, 2009 Drogas/ Saliva SPE HSS T3 C18 (100 x 2,1 mm, 1,8 μm) A: 2mM acetato amónico pH:6,2 B: MeOH Gradiente 0,4 mL/min 35ºC MS/MS [93] Badawi, 2009
María Regenjo Vázquez 66 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia Morfina/ Sangre SPE Synergy Polar (150 x 2 mm) A: formiato amónico / ac. fórmico pH 2,7 B: ACN/formiato amónico / ac. fórmico pH:3,8 (96:4) 0,6 mL/min MS/MS [94] Taylor, 2009. Opiáceos/ Sangre, orina LLE Gemini C18 (100 x 2 mm, 3 μm) A: ACN B: Ácido fórmico C: Acetato amónico Gradiente 0,15 mL/min 35ºC MS/MS [95] Gergov, 2009. Coca y metabolites/ Orina SPE XDB C8 (50 x 2,1 mm, 1,8 μm) A: formiato amónico pH:2,7 B: MeOH: ACN (50:50) Gradiente 0,27 mL/min 38ºC MS/MS [96] Langman, 2009 MOR, COD, 6MAM, BEG/ Orina SPE Zorbax XDB-C18 (4,6 x 50 mm, 1,8 μm) Zorbax XDB-C18 (4,6 x 50 mm, 3,5 μm) A: 5mM formiato amónico B: 0,1% ac. fórmico Gradiente 0,8 mL/min 50ºC A: ACN B: 0,1% ac. fórmico Gradiente 0,6 mL/min 35ºC MS/MS [97] Stout, 2009
67 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil BZD/ Plasma SPE Xbridge Shield (100mm × 2,1mm, 3,5 µm) A: 20mM acetato pH:5 B: ACN (67:33) 0,2 mL/min INTRODUCCIÓN Detector Referencia MS/MS [98] Marchi, 2009 Opi, coca, BEG/ Orina SPE BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 μm) A: Bicarbonato amónico pH:10,2 B: MeOH Gradiente 0,4 mL/min 60ºC MS/MS [99] Berg, 2009 BZD, Z-drugs/ Plasma SPE Acquity UPLC BEH C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 μm) A: 0,05% ac. fórmico / H2O B: 0,05% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,4 mL/min MS [100] Ishida, 2009 BZD/ Orina DLLME Shield RP18 (50 x 2,1 mm, 3,5 µm) A: ACN B: H2O (20:80) 0,2 mL/min ESI-MS [46] Melwanki, 2009 BZD/ Plasma SPE Supelcosil® LC-18DB (250 × 4,6mm, 5 µm) A: 5mM KH2PO4 pH:6 B: MeOH C: Dietil éter (55:40:5) 0,8 mL/min 35ºC UV [101] Bastos Borges, 2009 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 74 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia BZD/ Orina DLLME ODS2 (250 x 4,6 mm, 5 µm) A: H2O B: ACN (55:45) 1 mL/min UV [52] Vardini, 2012 Metadona/ Orina, plasma, saliva. DLLME C18 (250 x 4,6 mm, 10 µm) A: 0,1% TFA / MeOH B: H2O (60:40) UV [53] Ranjbari, 2012 BZD / Plasma CPE Nucleosil C8 (125 × 4,6mm, 5 μm) A: 2mM ac. ortofosfórico B: ACN Gradiente 1 mL/min DAD [130] Madej, 2013 Drogas/ Orina Incubación Thermo Fisher Hypersil Gold (50 x 2,1 mm, 5 µm) A: 0,1% ac. fórmico 10mM / bicarbonato pH:9 B: 0,1% ac. fórmico / ACN / 10mM acetato amónico pH:6 Gradiente de flujo MS/MS [131] Schaefer, 2013 Drogas de diseño/ Suero SPE Eclipse Plus C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) A: 2mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / ACN: H2O (90:10) Gradiente 0,5 mL/min 40ºC MS/MS [132] Swortwood, 2013
75 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Drogas/ Sangre SPE Acquity CSH C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 0,1% amoniaco (25%) / H2O B: 0,1% amoniaco (25%) / MeOH Gradiente 0,4 mL/min 50ºC INTRODUCCIÓN Detector Referencia MS/MS [133] Bjørk, 2013 Catinonas/ Orina SPE Accucore C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,4 mL/min 35ºC MS/MS [134] Concheiro, 2013 BZD/ Plasma DLLME XbridgeTM Shield RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) ACQUITY BEH Shield RP18 (100 x 2,1mm, 1,7 µm) ACQUITY BEH C18 (100 x 2,1mm, 1,7 µm) A: ACN B: 1 mM tampón fosfato pH 6 Gradiente 0,8 mL/min Tª ambiente 0,4 mL/min 40ºC, 0,3 mL/min 30ºC PDA [54] Fernández, 2013 Drogas/ Sangre QuEChERS ODS (50 x 1,5 mm, 5 µm) A: 10mM acetato amónico / MeOH (95/5) B: 10mM acetato amónico / MeOH (5/95) Gradiente 0,2 mL/min MS [135] Matsuta, 2013 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 76 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia Drogas/ Sangre, orina SPE Eclipse Plus C18 (100 x 3 mm, 1,8 µm) A: MeOH B: 5mM formiato amónico 0,6 mL/min 50ºC TOF-MS [136] Guale, 2013 Catinonas/ Saliva SPE Acquity BEH C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 0,1% ac. fórmico H2O/ACN (5/95) B: 0,1% ac. fórmico ACN Gradiente MS/MS [137] Amaratunga, 2013 Drogas/ HV SPE Xterra RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) A: ACN B: 20mM tampón fosfato pH: 6,5 Gradiente 0,8 mL/min PDA [138] Fernández, 2013 Catinonas/ Orina SPE Kinetex PFP (100 x 3 mm, 2,6 µm) A: ACN B: 50mM Trifluoroacetato amónico (33:67) 0,35 mL/min DAD [139] Mayer, 2013 Drogas/ Saliva Incubación C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 5mM ac. fórmico / H2O B: 5mM ac. fórmico / ACN Gradiente 0,6 mL/min 50ºC MS/MS [149] Di Corcia, 2013
77 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Drogas/ Orina Incubación Poroshell 120EC-C18 (100 × 2,1 mm, 2,7 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / MeOH Gradiente 0,32 mL/min 40ºC INTRODUCCIÓN Detector Referencia MS/MS [139] Lin, 2013 Opiáceos/ Plasma DLLME H5-ODSC18 (25cm × 4,6mm, 5 µm) A: 60% 10mM fosfato sódico / 0,70mM dodecilsulfato sódico B: 40% ACN UV [56] AhmadiJouibari, 2013 BZD y zolpidem/ Saliva LLE Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) A: 2mM formiato amónico / 0,2% ac. fórmico / H2O B: 2mM formiato amónico0,2% ac. fórmico / ACN Gradiente 1 mL/min 40ºC MS/MS [142] Jang, 2013 Opiáceos, coca y metabolitos/ Sangre SPE Acquity BEH Phenyl (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / MeOH Gradiente 1 mL/min 35ºC MS/MS [143] Ramírez Fernández, 2013 BZD y Z-drugs/ Sangre, suero, plasma LLE SunFire C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 µm) A: 10mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,5 mL/min 30ºC MS/MS [144] Montenarh, 2014 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 78 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia MDPV/ Plasma Incubación / Precipitación de proteínas Synergy Polar RP (100 x 2 mm, 2,5 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,4 mL/min 40ºC MS [145] Anizan, 2014 BZD/ Orina, D-µSPE ODS-H C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) A: 5mM Dihidrógeno fosfato potásico pH:6 B: MeOH (38:62) 1mL/min UV [146] Asgharinezhad, 2014 BZD/ Orina DLLME Shield RP18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 1mM tampón fosfato pH6 B: ACN Gradiente 0,4 mL/min 30ºC PDA [66] Fernández, 2014 Opiáceos/ Orina Dilución Acquity HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) A: 0,1% ac. fórmico B: MeOH Gradiente 0,2 mL/min 60ºC MS/MS [147] Anderson, 2014 Drogas, BZD/ Sangre QuEChERS Kinetex C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) Aeris PEPTIDE XB-C18 (150 x 2,1 mm, 3,6 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: ACN/MeOH (1/1) Gradiente 0,4 mL/min A: H2O B: 0,1% ac. fórmico / MeOH Gradiente 0,3 mL/min MS/MS [148] Anzillotti, 2014
79 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil MDPV, BZD/ Orina, Sangre LLE (BZD) SPE (MDPV) Atlantis T3 (150 x 2,1 mm) A: 10mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,3 mL/min INTRODUCCIÓN Detector Referencia HRMS [149] Bertol, 2014 Drogas/ Sangre SPE Luna SCX (150 x 2 mm, 5 µm) A: 100mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico B: 0,1% ac. acético / ACN Gradiente 0,5 mL/min MS/MS [150] Steuer, 2014 Catinonas/ Saliva SPE Atlantis T3 (50 x 2,1 mm, 3 µm) A: 0,1% ac. fórmico B: ACN Gradiente 0,3 mL/min 35ºC MS/MS [151] De Castro, 2014 Drogas/Orina Dilución Acquity HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) A: 0,1% ac. fórmico B: ACN Gradiente 0,6 mL/min 50ºC MS/MS [152] Hegstad, 2014 BZD/ Orina, suero SPDE Poroshell 120 EC-C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 µm) A:10mM formiato amónico pH:3 B: ACN (70:30) 0,5 mL/min 40ºC TOF-MS [153] Saito, 2014 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 80 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia BZD/ Sangre DBS cards Kinetex RP C18 (50 x 3 mm, 2,6 µm) A: 2mM formiato amónico 0,2% ac. fórmico H2O B: 2mM formiato amónico 0,2% ac. fórmico ACN Gradiente 0,4 mL/min 40ºC MS/MS [154] Lee, 2015 BZD, zolpidem/ Orina Inyección directa Zorbax SB-C18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) A: 0,2% ac. acético / 2mM trifluoro acetato amónico H2O B: 0,2% ac. acético / 2mM trifluoro acetato amónico ACN Gradiente 0,25 mL/min MS/MS [155] Jeong, 2015. Drogas/ Plasma DLLME Xbridge RP18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) A: 50mM tampón fosfato pH 6,5 B: ACN Gradiente 0,8 mL/min PDA [63] Fernández, 2015 Opiáceos, BZD/ Orina SPE Xterra MS C18 (150 x 2,1 mm, 3,5 µm) A: 0,05% ac. fórmico / H2O B: ACN C: MeOH Gradiente 0,2 mL/min 40ºC MS/MS [156] Xiong, 2015
81 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil INTRODUCCIÓN Detector Referencia NPS/ Orina SPE Accucore C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,4 mL/min 35ºC HRMS [157] Concheiro, 2015 NPS/ Sangre DLLME Kinetex C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) A: 5mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico. B: 0,1% ac. fórmico / MeOH Gradiente 0,4 mL/min 40ºC MS/MS [67] Odoardi, 2015 BZD/ Suero, sangre MAE Hypersil Gold C18 (50 x 2,1 mm, 1,9 µm) A: 0,1% ac. fórmico / ACN B: 1mM formiato amónico pH: 3,4, / 0,1% ac. fórmico Gradiente 0,4 mL/min 25ºC TOF-MS [158] Wózniakiewicz, 2015 Drogas, BZD/ Sangre DLLME Kinetex Biphenol (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / MeOH 0,4 mL/min MS/MS [64] Fisichella, 2015 Drogas/ Plasma MEPS Xselect CSH C18 (100 x 2,1 mm, 2,5 µm) A: 5mM acetato amónico B: ACN Gradiente 0,3 mL/min 40ºC MS/MS [82] De Souza, 2015 INTRODUCCIÓN
María Regenjo Vázquez 82 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia Opiáceos, coca/ Sangre QuEChERS Pinacle DB PFPP (50 x 2,1 mm, 1,9 µm) A: 5mM formiato amónico / 0,1% ac. fórmico B: ACN Gradiente 0,47 mL/min 50ºC MS/MS [159] Dulaurent, 2016 BZD/ Orina, plasma DNUM Zorbax SB-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) A: ACN B: 5mM KH2PO4 pH:6 (70:30) 1 mL/min UV [160] Pebdani, 2016 Catinonas/ Orina, sangre SPE Poroshell 120 EC-C18 (5 x 2,1 mm, 2,7 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: ACN Gradiente 0,4 mL/min 35ºC QTOF-MS [161] Glicksberg, 2016 Catinona/ Orina, plasma, saliva VAMS Zorbax C18 (50 x 2,1 mm, 3,5 µm) A: 0,1% ac. fórmico / ACN B: 0,1% ac. fórmico /H2O Gradiente 0,3 mL/min MS/MS [162] Mercolini, 2016 BZD, NPS/ Orina LLE ACE5 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) A: 0,1% ac. fórmico /5% ACN B: 0,1% ac.fórmico / 95%ACN Gradiente 0,5 mL/min MS/MS [163] Lee, 2016 BZD/ Plasma SPE Sumipax ODS D-Swifer (30 × 3 mm, 2 µm) A: 10mM acetato amónico pH: 6,76 B: ACN Gradiente 0,7 mL/min 40ºC MS/MS [164] Lee, 2016
INTRODUCCIÓN 83 Droga /Matriz Extracción Columna Fase móvil Detector Referencia ATD, BZD/ Suero, orina DLLME C18 (150 x 4,5 mm, 5 µm) A: ACN B: 60mM tampón fosfato pH: 5,5 (1:1) 1 mL/min UV-VWD [69] Farsimadan, 2016 BZD/ Suero LLE RP -18 (70 x 4,6 mm, 5 µm) A: formiato amónico pH:8,6 B: ACN Gradiente 1 mL/min 25ºC DAD [165] Vosough, 2016 Catinonas/ Saliva SPE Kinetex C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: 0,1% ac. fórmico / H2O B: 0,1% ac. fórmico / ACN Gradiente 0,4 mL/min 35ºC MS/MS [166] Miller, 2017 BZD, Z-drugs/ Sangre DLLME Kinetex® Biphenol (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) A: tampón pH 8 B: MeOH Gradiente 0,5 mL/min 45ºC MS/MS [70] De Boeck, 2017 Drogas/ Plasma MEPS BEH Shield RP18 (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) A: ACN B: 0,1% ac. fórmico / H2O Gradiente 0,4 mL/min 55ºC PDA [83] Fernández, 2017
María Regenjo Vázquez 90 El diseño central compuesto está formado por puntos de diseño factorial o factorial fraccional de dos niveles (–1 y +1), puntos axiales o de “estrella” y puntos centrales con todos los factores establecidos en 0. Los factores axiales se establecen en 0, excepto un factor con el valor ± α. En función de la ubicación de puntos , el espacio del diseño puede ser cúbico o esférico. Para construir el modelo matemático con una estimación eficiente se requiere un polinomio de segundo grado que incluye los términos cuadráticos para cada factor, según la siguiente ecuación: y = b0 + ∑bx + ∑∑ donde xi es el valor codificado de los factores estudiados e y es la función de respuesta obtenida para cada analito. Los valores b son los coeficientes del polinomio estimado: b0 es la ordenada en el origen, bi representan el efecto principal de cada variable, los coeficientes bij en los términos cuadráticos son responsables de los efectos de curvatura, y bij (i ≠ j) son los coeficientes que describen los efectos de interacción entre factores. Los valores de respuesta obtenidos se utilizaron para estimar los valores de los coeficientes del modelo, a través de una regresión lineal múltiple mediante el método de mínimos cuadrados. La validación del modelo se lleva a cabo mediante el análisis de la varianza (ANOVA). [176, 180] El diseño de Doehlert ofrece una distribución uniforme de puntos en el espacio esférico de respuesta experimental, en el centro y en la superficie. La distribución de puntos describe una figura geométrica (en el caso de dos variables se produce un hexágono) en la que se asignan cinco niveles a la primera variable y tres a la segunda variable. El número de determinaciones experimentales (N) se calcula a partir de la expresión N = k2 + k + 1, donde k es el número de factores estudiados. La principal ventaja de este diseño con respecto a otros métodos de amplia aplicación como el diseño central compuesto es la posibilidad de estudiar factores con diferentes niveles. [176] El modelo matemático es similar al descrito anteriormente para un diseño central compuesto.
INTRODUCCIÓN 91 1.10. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS. La validación de los métodos analíticos es necesaria para demostrar que el análisis cuantitativo de los analitos es fiable dentro de unos márgenes de error determinados. Para asegurar la fiabilidad de un método y así realizar su validación se deben determinar parámetros tales como: linealidad, sensibilidad, selectividad, límites de detección y cuantificación, precisión y recuperación. [181-186] 1.10.1. Linealidad y Efecto Matriz. La linealidad es la capacidad del método para obtener respuestas lineales proporcionales a la concentración del analito. El modelo de calibración debe prepararse para cada analito en la misma matriz que las muestras de estudio mediante la adición de cantidades conocidas a la matriz de muestra blanco. El número de estándares usado para la preparación de la curva de calibrado viene determinado por los valores del rango analítico y la naturaleza de la relación analito/respuesta. La curva de calibración deberá contener una muestra blanco (matriz procesada sin analitos y sin estándar interno), una muestra cero (matriz procesada con estándar interno) y entre seis y ocho muestras de adición que cubran todo el rango e incluyan el LLOQ. Cada nivel de calibración debe hacerse por triplicado. El efecto matriz (EM) se define como el efecto que tienen otros componentes de la matriz, diferentes al analito, sobre la cuantificación del analito: supresión o aumento de la señal instrumental, elevada línea de base, impacto en la retención, etc. Para la determinación del efecto matriz existen varias posibilidades [186]: % = ñ ó−ñ ñ × 100 Los valores del efecto matriz próximos al 0% indican que no hay efecto matriz, y valores superiores al 10% indican que la matriz produce un efecto sobre la señal del analito en la muestra. % = ñ ó ñ × 100
María Regenjo Vázquez 92 En este caso, los valores próximos al 100% indican que no hay efecto matriz, valores inferiores al 100% indican la supresión de la señal por los componentes de la muestra, y valores que superan el 100% indican que la matriz produce un aumento de la señal del analito. En ambos casos, la presencia de efecto matriz lleva a realizar la validación de la muestra en la matriz problema. [182-186] 1.10.2. Sensibilidad. La sensibilidad, al igual que la linealidad, se asocia con la calibración. Se define como el cambio en la respuesta del instrumento dividida entre el correspondiente cambio en el estimulo. La sensibilidad no es un parámetro esencial en la validación del método, sin embargo, es importante en la optimización del método y la monitorización rutinaria del instrumento. La medida de la sensibilidad de cada analito se obtiene de la pendiente de la recta de calibrado, los analitos con mayor pendiente presenta mayor sensibilidad. [186] 1.10.3. Selectividad. Es la habilidad del método analítico para diferenciar y cuantificar el analito en presencia de otros componentes de la muestra. Para determinar la selectividad se deben analizar individualmente al menos seis muestras de la matriz blanco apropiada, para poder determinar las interferencias. Las sustancias potencialmente interferentes en la matriz biológica incluyen componentes endógenos de la matriz, metabolitos, productos de descomposición y contaminación por otros medicamentos. [182186] 1.10.4. Límites de Detección y Cuantificación. El límite de detección (LOD) se corresponde con la menor concentración de analito que se puede detectar e identificar con el método pero que no es necesaria su cuantificación exacta; también se define como la cantidad mínima de analito que se puede diferenciar de la señal del ruido. Debe determinarse en una matriz igual a la matriz de la muestra. La relación señal/ruido (S/N) se usa para determinar el LOD cuando el método presenta ruido de base. El LOD se determina estableciendo la concentración mínima a la que S/N es superior a 3.
INTRODUCCIÓN 93 La relación S/N puede variar entre días e incluso dentro de un día, por lo tanto, se deben realizar muchas mediciones para la determinación fiable del LOD. También se puede calcular el LOD utilizando varias disoluciones con diferentes concentraciones próximas al LOD. El límite de detección es la concentración más baja que puede ser detectada sin error. El límite de cuantificación (LOQ) se corresponde con la menor concentración de analito que se puede determinar con fiabilidad y repetibilidad aceptables. El LOQ se determina estableciendo la concentración mínima a la que S/N es superior a 10. La precisión de los resultados en el LOQ debe ser al menos del 20%. En caso de que el resultado de una medición esté entre el LOD y el LOQ puede informarse que el analito ha sido detectado en la muestra, pero está por debajo del LOQ. [184-186] 1.10.5. Precisión. La precisión representa la proximidad de los datos obtenidos con respecto al valor real. La precisión se relaciona con el error aleatorio de un sistema de medición. En general, se mencionan dos tipos de precisión: la repetibilidad (evaluada como precisión intradía) y la precisión intermedia (evaluada como precisión interdía). En la actualidad, muchas guías de validación consideran el término reproducibilidad asociado a la precisión interlaboratorios [187]. La repetibilidad se obtiene analizando repetidamente en un mismo día, de forma independiente, varias submuestras preparadas a partir de una muestra homogénea en el laboratorio, por un operador, utilizando una configuración experimental y un conjunto de reactivos. Para su medida, cada nivel debe analizarse un mínimo de cinco veces y en un mínimo de tres niveles de concentración que abarquen todo el rango de concentraciones. El valor del coeficiente de variación (%CV) o desviación estándar relativa (%RSD) debe ser inferior al 15% (20% en el LOQ) para que el método pueda considerarse preciso. La precisión intermedia se obtiene analizando repetidamente en varios días, de forma independiente, submuestras preparadas a partir de una muestra homogénea en el laboratorio, por un operador, utilizando una configuración experimental y un conjunto de reactivos.
María Regenjo Vázquez 94 Para su medida, cada nivel debe analizarse un mínimo de dos días y en un mínimo de tres niveles de concentración que abarquen todo el rango de concentraciones. El valor del %CV debe ser inferior al 15% (20% en el LOQ) para que el método pueda considerarse preciso. [181, 185] 1.10.6. Recuperación. La recuperación se refiere a la eficiencia de la extracción en un método analítico, dentro de los límites de la variabilidad. Se puede calcular como el porcentaje de la señal de analito en una disolución, comparada con una disolución estándar con el mismo nivel de concentración. La recuperación debe calcularse como mínimo a tres niveles de concentración que abarquen todo el rango estudiado. Los valores de recuperación deben encontrarse próximos al 100%, considerándose valores aceptables los que se encuentran entre 70 y 120%. [182, 184-187]
INTRODUCCIÓN 95 1.11. BIBLIOGRAFÍA. [1] Levine B “Principles of forensic toxicology” 4ª ed, AA CC Press, USA, 2013. [2] Rang HP, Dale MM, Ritter JM “Farmacología” 4ª ed, Ed. Harcourt, 2000. [3] Moffat AC, Osselton MD, Widdop B, Watts J (Eds), “Clarke´s analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material” 4ª ed, Pharmaceutical Press, London, 2011. [4] Cabrera Bonet R; Mencías Rodríguez E; Cabrera Forneiro J, “Toxicología de los psicofármacos” Ed. Mosby Year Book, Madrid, 1993. [5] MacGregor Whyte I, Benzodiazepines In: Dart RG, “Medical Toxicology” 5ªed, Ed. Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia (USA), 2004. [6] Baselt RC (Ed), “disposition of toxic drugs and chemicals in man” 10ª ed, Biomedical Publications, California (USA), 2014. [7] “Informe mundial sobre las drogas” UNODC Oficina de las Naciones Unidas contra la droga y el delito, 2016. [8] Observatorio europeo sobre drogas y toxicomanías “Informe europeo sobre drogas. tendencias y novedades” Luxemburgo: Oficina de publicaciones de la Unión Europea, 2017. [9] Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, AEMPS “Informe de utilización de medicamentos U/HAY/V1/17012014” Ministerio de Sanidad, 2014. [10] Karch SB “Pharmacokinetics and pharmacodynamics of abused drugs” CRC Press, Boca Ratón, Florida (USA), 2008. [11] Lizasoain I, Moro MA, Lorenzo P, “Cocaína: aspectos farmacológicos”. Monografía cocaína: adicción, 2001; Vol 13: 23-37. [12] Davies S, Johnson A, Holt D. “Forensic toxicology drug use and misuse” The Royal Society of Chemistry, Cambridge UK, 2016.
María Regenjo Vázquez 96 [13] Observatorio Europeo sobre drogas y toxicomanía “Informe europeo sobre drogas. Tendencias y novedades” Luxemburgo: Oficina de Publicaciones de la Unión Europea, 2019. [14] Molina, DK. “Handbook of forensic toxicology for medical examiners” Taylor and Francis, USA, 2010. [15] Rook EJ, Huitema ADR, Van den Brink W, Van Ree JM, Beijnen JH, “Pharmacokinetics and pharmacokinetic variability of heroin and its metabolites: review of the literature” Current Clinical Pharmacology, 2006; 1: 109-118. [16] Sandilands EA, Baterman N, “Opioids” Medicine, 2016; 44: 187-189. [17] Steven B, Karch MD, “Drug abuse handbook” CRC Press (USA), 1998. [18] Baumann MH. A wash in a sea of 'bath salts': implications for biomedical research and public health. Addiction, 2014; 109: 1577‐1579. [19] Valente JM, Guedes de Pinos P, Bastos ML, Carvalho F, Carvalho M. “Khat and synthetic cathinones: a review” Arch. Toxicol. 2014; 88: 15-45. [20] Coppola M, Mondola R, Synthetic cathinones: Chemistry, pharmacology and toxicology of a new class of designer drugs of abuse marketed as “bath salts” or “plant food” Toxicol. Letters 2012; 211: 144– 149. [21] Espert Tortajada R, Pérez San Miguel J, Gadea Doménech M, Oltra-Cucarella J, Aliño Costa, M. Drogas emergentes: catinonas sintéticas (“sales de baño”). Revista Española de Drogodependencia 2015; 40(2): 56-71. [22] “Drogas emergentes. Informe de la comisión clínica” Ministerio de Sanidad, Política Social e Igualdad. Gobierno de España. 2011. [23] Coppola M, Mondola R. “Synthetic cathinones: Chemistry, pharmacology and toxicology of a new class of designer drugs of
INTRODUCCIÓN 97 abuse marketed as “bath salts” or “plant food” Toxicol. Letters 2012; 211: 144-149. [24] Renner UD, Oertel R, Kirch W, “Pharmacokinetics and pharmacodynamics in clinical use of scopolamine” Ther. Drug Monit., 2005; 27: 655-665. [25] Lemaire-Hurtel AS, Alvarez JC, “Drugs involved in drugfacilitated crime-pharmacological aspects” in Toxicological aspects of drug-facilitated crimes, 2014. [26] Prusakov PA, “Belladonna alkaloids” in Encyclopedia of Toxicology 3ª ed., 2014. [27] Kabir A, Holness H, Furton KG, Almirall JR, “Legal and forensic samples” In Pawliszyn J, Bayona JM (Eds) “Comprehensive sampling and sample preparation”. Elsevier, Academic Press, Oxford, UK, 2012; 441-465. [28] Repetto M. “Toxicología fundamental” 2ª ed. Ed. Científico Médica, Barcelona, 1988. [29] Martínez AP, Hernández Jerez AF. “Investigación toxicológica”, en Villanueva Cañadas E, “Medicina legal y toxicología” 6ª ed., Ed. Masson, Barcelona 2004. [30] Flanagan RA, Taylor A, Watson JD, Whelpton R. “Fundamentals of analytical toxicology” John Wiley & Sons Ltd. England, 2007. [31] Abdel-Rehim M. “New trend in sample preparation: on-line microextraction in packed syringe for liquid and gas chromatography applications I. Determination of local anesthetics in human plasma samples using gas chromatography–mass spectrometry” J. Chromatogr. B, 2004; 801: 317–321. [32] Rezaee M, Assadi Y, Reza Milani Hosseini M, Aghaee E, Ahmadi F, Berijani S. “Determination of organic compounds in water using dispersive liquid–liquid microextraction” J. Chromatogr. A, 2006; 1116: 1–9.
María Regenjo Vázquez 98 [33] Jain R, Singh R. “Applications of dispersive liquid-liquid microextraction in forensic toxicology” Trends Anal. Chem. 2016; 75: 227-237 [34] Rezaee M, Yamini Y, Faraji M. “Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction” J. Chromatogr. A 2010; 1217: 23422357 [35] Saraji M, Khalili Boroujent M. “Recent developments in dispersive liquid-liquid microextraction” Anal. Bioanal. Chem. 2014; 406: 2027-2066 [36] Samanidou V, Kovastsi L, Fragou D, Rentifis K. “Novel strategies for sample preparation in forensic toxicology. Review” Bioanal. 2011; 3: 2019-2046. [37] Cruz Vera M. “Dispersive liquid-liquid microextraction” Meyers RA. “Encyclopedia of analytical chemistry, applications, theory and instrumentation” 1ªed. Ed. Wiley, USA, 2011. [38] Ocaña-González JA, Fernández-Torres R, Bello-López M, Ramos Payán M. “New developments in microextraction techniques in bioanalysis. A review”. Anal. Chim. Acta 2016; 905: 8-23. [39] Kokosa JM. “Advances in solvent-microextraction techniques” Trends Anal. Chem. Elsevier, 2013. [40] Herrera-Herrera AV, Asensio-Ramos M, Hernández-Borgés J, Rodríguez-Delgado MA. “Dispersive liquid-liquid microextraction for determination of organic analytes” Trends Anal. Chem. 2010; 29(7): 728-751. [41] Xu H, Ding Z, Lv L, Song D, Feng YQ. “A novel dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous samples” Anal. Chim. Acta 2009; 636: 28– 33. [42] Abdel-Rehim M. “Microextraction by packed sorbent (MEPS): A tutorial” Anal. Chim. Acta 2011; 701: 119-128.
INTRODUCCIÓN 99 [43] Abdel-Rehim M. “Recent advances in microextraction by packed sorbent for bioanalysis” J. Chromatogr. A 2010; 1217: 25692580. [44] Mahdi Moein M, Abdel-Rehim A, Abdel-Rehim M. “Microextraction by packed sorbent (MEPS)” Trends Anal. Chem. 2015; 67: 34-44. [45] Yang L, Said R, Abdel-Rehim M. “Sorbent, device, matrix and application in microextraction by packed sorbent (MEPS): A Review” J. Chromatogr. B 2017; 1043: 33-43. [46] Melwanki MB, Chen W-S, Bai H-Y, Lin T-Y, Fuh M-R. “Determination of 7-aminoflunitrazepam in urine by dispersive liquid–liquid microextraction with liquid chromatography– electrospray-tandem mass spectrometry” Talanta 2009; 78: 618-622. [47] Xiong C, Ruan J, Cai Y, Tang Y. “Extraction and determination of some psychotropic drugs in urine samples using dispersive liquid–liquid microextraction followed by highperformance liquid chromatography” J. Pharm. Biomed. Anal. 2009; 49: 572-578. [48] Saraji M, Borojeni MK, Akbar A, Bidgoli H. “Comparison of dispersive liquid-liquid microextraction and hollow fiber liquidliquid microextraction for the determination of fentanyl, alfentanyl, and sufentanyl in water and biological fluids by high-performance liquid chromatography” Anal. Bioanal. Chem. 2011; 400: 2149-2158. [49] Shamsipur M, Fattahi N. “Extraction and determination of opium alkaloids in urine samples using dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography” J. Chromatogr. B 2011; 879: 2978-2983. [50] Ito R, Ushiro M, Takahashi Y, Saito K, Ookubo T, Iwasaki Y, Nakazawa H. “Improvement and validation the method using dispersive liquid-liquid microextraction with in situ derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry for determination of tricyclic antidepressants in human urine samples” J. Chromatogr. B 2011; 879: 3714-3720.
María Regenjo Vázquez 106 and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”. Forensic Sci. Int. 2009; 189: 36-43. [96] Langman LJ, Bjergum MW, Williamson CL, Crow FW. “Sensitive method for detection of cocaine and associated analytes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in urine”. J. Anal. Toxicol. 2009; 33(8): 447-55. [97] Stout PR, Bynum ND, Mitchell JM, Baylor MR, RoperoMiller JD. “A comparison of the validity of gas chromatographymass spectrometry and liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis of urine samples for morphine, codeine, 6acetylmorphine, and benzoylecgonine”. J. Anal. Toxicol. 2009; 33(8): 398-408. [98] Marchi I, Schappler J, Veuthey J-L, Rudaz S. “Development and validation of a liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization-mass spectrometry method for the quantification of alprazolam, flunitrazepam, and their metabolites in hemolysed blood”. J. Chromatogr. A 2009; 877: 2275-2283. [99] Berg T, Lundanes E, Christophersen AS, Strand DH. “Determination of opiates and cocaine in urine by high pH mobile phase reversed phase UPLC-MS/MS”. J. Chromatogr. B 2009; 877: 421-432. [100] Ishida T, Kudo K, Hayashida M, Ikeda N. “Rapid and quantitative screening method for 43 benzodiazepines and their metabolites, zolpidem and zopiclone in human plasma by liquid chromatography/mass spectrometry with a small particle column” J. Chromatogr. B 2009; 877: 2652-2657. [101] Bastos Borges K, Figueiredo Freire E, Martins I, Pereira Bastos de Siqueira ME. “Simultaneous determination of multibenzodiazepines by HPLC/UV: Investigation of liquid-liquid and solid-phase extractions in human plasma” Talanta 2009; 78: 233-241. [102] Mercolini L, Mandrioli R, Iannello C, Matrisciano F, Nicoletti F, Raggi MA. “Simultaneous analysis of diazepam and its
INTRODUCCIÓN 107 metabolites in rat plasma and brain tissue by HPLC-UV and SPE” Talanta 2009; 80: 279-285. [103] Bjørk MK, Nielsen MK, Markussen LØ, Klinke HB, Linnet K. Determination of 19 drugs of abuse and metabolites in whole blood by high-performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2010; 396(7): 2393-401. [104] Fernández P, Vázquez C, Lorenzo RA, Carro AM, Álvarez I, Cabarcos P. “Experimental design for optimization of microwaveassisted extraction of benzodiazepines in human plasma” Anal. Bioanal. Chem. 2010; 397: 677-685. [105] Concheiro M, Gray TR, Shakleya DM, Huestis MA. “Highthroughput simultaneous analysis of buprenorphine, methadone, cocaine, opiates, nicotine, and metabolites in oral fluid by liquid chromatography tandem mass spectrometry” Anal. Bioanal. Chem. 2010; 398: 915-924. [106] Fernández P, Vázquez C, Lorenzo RA, Carro AM, Bermejo AM. “Development of a liquid chromatographic method for the simultaneous determination of six benzodiazepines in human plasma after solid-phase extraction” Anal. Letters 2010; 43: 1075-1084. [107] Chiuminatto U, Gosetti F, Dossetto P, Mazzucco E, Zampieri D, Robotti E, Gennaro MC, Marengo E. “Automated online solid phase extraction ultra high performance liquid chromatography method coupled with tandem mass spectrometry for determination of forty-two therapeutic drugs and drugs abuse in human urine” Anal. Chem. 2010; 82: 5636-5645. [108] Sergi M, Compagnone D, Curini R, D’Ascenzo G, Del Carlo M, Napoletano S, Risoluti R. “Micro-solid phase extraction coupled with high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of stimulants, hallucinogens, ketamine and phencyclidine in oral fluids” Anal. Chim. Acta, 2010; 675: 132-137. [109] Simonsen KW, Hermansson S, Steentoft A, Linnet K. “A validated method for simultaneous screening and quantification of
María Regenjo Vázquez 108 twenty-three benzodiazepines and metabolites plus zopiclone and zaleplone in whole blood by liquid-liquid extraction and ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry” J. Anal. Toxicol. 2010; 34: 332-341. [110] Wang I-T, Feng Y-T, Chen C-Y. “Determination of 17 illicit in oral fluid using isotope dilution ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry with three atmospheric pressure ion;izations” J. Chromatogr. B 2010; 878: 3095-3105. [111] Remane D, Meyer MR, Wissenbach DK, Maurer HH. “Ultra high performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometric multi-analyte procedure for target screening and quantification in human blood plasma: validation and application for 31 narcoleptics, 28 benzodiazepines, and Z-drugs” Anal. Bioanal. Chem. 2011; 401: 1341-1352. [112] Fernández P, Seoane S, Vázquez C, Bermejo AM. “A rapid analytical method based on microwave-assisted extraction for the determination of drugs abuse in vitreous humor” Anal. Bioanal. Chem. 2011; 401: 2177-2186. [113] Napoletano S, Montesano C, Compagnone D, Curini R, D´Ascenzo G, Roccia C, Sergi M. “Determination of illicit drugs in urine and plasma by micro-SPE followed by HPLC-MS/MS” Cromatographia. 2012; 75: 55-63. [114] Kriikku P, Wilhelm L, Schwarz O, Rintatalo J. “New designer drugs of abuse: 3, 4-Methylendioxypyrovalerone (MDPV). Findings from apprehended drivers in Finland” Forensic Sci. Int. 2011; 210: 195-200. [115] Uddin MN, Samanidou VF, Papadoyannis IN; “Simultaneous Determination of 1, 4-benzodiazepines and tricyclic antidepressants in saliva after sequential SPE elution by the same HPLC conditions” J. Chin. Chem. Soc. 2011; 58: 142-154. [116] Ming DS, Heathcote J. “A rapid and accurate UPLC/ MS/MS method for the determination of benzodiazepines in human urine” J. Chromatogr. 2011; 879: 421-428.
INTRODUCCIÓN 109 [117] de Jager AD, Bailey NL. “Online extraction LC-MS/MS method for the simultaneous quantitative confirmation of urine drugs of abuse and metabolites: amphetamines, opiates, cocaine, cannabis, benzodiazepines and methadone” J. Chromatogr. B 2011; 879: 26422652. [118] Sørensen LK. “Determination of cathinones and related compounds ephedrines in forensic whole-blood samples by liquidchromatography-electrospray tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. B 2011; 879: 727-736. [119] Salomone A, Gerace E, Brizio P, Gennaro MC, Vicenti M. “A fast liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for determining benzodiazepines and analogues in urine. Validation and application to real cases of forensic interest” J. Pharm. Biomed. Anal. 2011; 56: 582-591. [120] Magalhães EJ, Nascentes CC, Augusti R, Lopes Ribeiro de Queiroz ME, Cardoso da Silva JC, de Cássia Franco Alonso RJ. “Fast determination of benzodiazepines in human urine via liquid-liquid extraction with low temperature partitioning and LC-HRMS” J. Anal. Chem. 2012; 3: 118-124. [121] Cone EJ. “Oral fluid results compared to self reports of recent cocaine and heroin use by methadone maintenance patients” Forensic Sci. Int. 2012; 215: 88-91. [122] Dupont Birkler RI, Telving R, Ingemann-Hansen O, Vesterby Charles A, Johannsen M, Findal Andreasen M. “Screening analysis for medicinal drugs and drugs of abuse in whole blood using ultra-performance liquid chromatography liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-TOF-MS)-Toxicological findings in cases of alleged sexual assault” Forensic Sci. Int. 2012; 222: 154-161. [123] Zancanaro I, Pereira Limberger R, Bohel PO, Kerpel dos Santos M, De Boni RB, Pechansky F, Dutra Caldas E. “Prescription and illicit psychoactive drugs in oral fluid-LC-MS/MS method development and analysis of samples from Brazilian drivers” Forensic Sci. Int. 2012; 223: 208-216.
María Regenjo Vázquez 110 [124] Hoonka S, Bose D, Esteve-Romero J, Durgbanshi A. “Micellar liquid chromatography for the determination of some less prescribed benzodiazepines” J. Chem. 2012; 9: 443-450. [125] Mirnaghi FS, Monton MRN, Pawliszyn J. “Thin-film octadecyl-silica glass coating for automated 96-blade solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for analysis of benzodiazepines” J. Chromatogr. A 2012; 1246: 2-8. [126] Verplaetse R, Cuypers E, Tytgat J. “The evaluation of the applicability of a high pH mobile phase in ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis of benzodiazepines and benzodiazepine-like hypnotics in urine and blood” J. Chromatogr. A 2012; 1249: 147-154. [127] Wang X, Wang R, Zhang Y, Liang C, Ye H, Cao F, Rao Y. “Extending the detection window of diazepam by directly analyzing its glucuronide metabolites in human urine using liquid chromatography–tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. A 2012; 1268: 29-34. [128] Sauve EN, Langødegarda M, Ekeberg D, Øiestada AML. “Determination of benzodiazepines in ante-mortem and post-mortem whole blood by solid-supported liquid–liquid extraction and UPLC– MS/MS” J. Chromatogr. B 2012; 883-884: 177-188. [129] Karampela S, Vardakou I, Papoutsis I, Dona A, Spiliopoulou C, Athanaselis S, Pistos C. “Direct urine analysis for the identification and quantification of selected benzodiazepines for toxicology screening” J. Chromatogr. B 2012; 902: 42-46. [130] Madej K, Persona K, Nizio M. “Application of micellemediated extraction in preparation of body fluids for HPLC-DAD Screening of acidic and neutral drugs” Acta Chromatogr. 2013; 25: 97-110. [131] Schaefer N, Peters B, Schmidt P, Ewald AH. “Development and validation of two LC-MS/MS methods for the detection and quantification of amphetamines, designer amphetamines,
INTRODUCCIÓN 111 benzoylecgonine, benzodiazepines, opiates, and opioids in urine using turbulent flow chromatography” Anal. Bioanal. Chem. 2013; 405: 247-258. [132] Swortwood MJ, Boland DM, DeCaprio AP. “Determination of 32 cathinones derivatives and other designer drugs in serum by comprehensive LC-QQQ-MS/MS analysis” Anal. Bioanal. Chem. 2013; 405: 1383-1397. [133] Bjørk MK, Simonsen KW, Andersen DW, Dalsgaard PW, Sigurðardóttir SR, Linnet K, Rasmussen BR. “Quantification of 31 illicit and medicinal drugs and metabolites in whole blood by fully automated solid-phase extraction and ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry” Anal. Bioanal. Chem. 2013; 405: 2607-2617. [134] Concheiro M, Anizan S, Ellefsen K, Huestis M. “Simultaneous quantification of 28 synthetic cathinones and metabolites in urine by liquid chromatography-high resolution mass spectrometry” Anal. Bioanal. Chem. 2013; 405: 9437-9448. [135] Matsuta S, Nakanishi K, Miki A, Zaitsu K, Shima N, Kamata T, Nishioka H, Katagi M, Tatsuno M, Tsuboi K, Tsuchihashi H, Suzuki K. “Development of a simple one-pot extraction method for various drugs and metabolites of forensic interest in blood by modifying the QuEChERS method” Forensic Sci. Int. 2013; 232: 4045. [136] Guale H, Shahreza S, Walterscheid JP, Chen H-H, Arndt C, Kelly AY, Mozayani A. “Validation of LC–TOF-MS screening for drugs, metabolites, and collateral compounds in forensic toxicology specimens” J. Anal. Toxicol. 2013; 37: 17-24. [137] Amaratunga P, Loemberg BL, Lemberg D. “Quantitative measurement of synthetic cathinones in oral fluid” J. Anal. Toxicol. 2013; 37: 622-628. [138] Fernández P, Seoane S, Vázquez C, Tabernero MJ, Carro AM, Lorenzo RA. “Chromatographic determination of drugs of abuse
María Regenjo Vázquez 112 in vitreous humor using solid-phase extraction” J. Appl. Toxicol. 2013; 33: 740-745. [139] Mayer M, Benko A, Huszár, Sipos K, Lajtai A, Lakatos A, Porpàczy Z. “Simultaneous determination of 4-substituted cathinones (4-MMC, 4-MEC and 4-FMC) in human urine by HPLC-DAD” J. Chromatogr. Sci. 2013; 51: 861-866. [140] Di Corcia D, Lisi S, Pirro V, Gerace E, Salomone A, Vicenti M. “Determination of pharmaceutical and illicit drugs in oral fluid by ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. B. 2013; 927: 133-141. [141] Lin H-R, Chen C-L, Huang C-L, Chen S-T, Lua A-C. “Simultaneous determination of opiates, methadone, buprenorphine and metabolites in human urine by superficially porous liquid chromatography tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. B. 2013; 925 : 10-15. [142] Jang M, Chang H, Yang W, Choi H, Kim E, Yu B-H, Oh Y, Chung H. “Development of an LC–MS/MS method for the simultaneous determination of 25 benzodiazepines and zolpidem in oral fluid and its application to authentic samples from regular drug users” J. Pharm. Biomed. Anal. 2013; 74: 213-222. [143] Ramírez Fernández MM, Wille SMR, Kummer N, Di Fazio V, Ruyssinckx E, Samyn N. “Quantitative analysis of 26 opioids, cocaine, and their metabolites in human blood by Uutra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry” Ther. Drug Monit. 2013; 35: 510-521. [144] Montenarh D, Hopf M, Maurer HH, Schmidt P, Ewald AH. “Detection and quantification of benzodiazepines and Z-drugs in human whole blood, plasma, and serum samples as part of a comprehensive multi-analyte LC-MS/MS approach” Anal. Bioanal. Chem. 2014; 406: 803-818. [145] Anizan S, Ellefsen K, Concheiro M, Suzuki M, Rice KC, Baumann MH, Huestis MA. “3,4-methylenedioxypyrovalerone (MDPV) and metabolites quantification in human and rat plasma by
INTRODUCCIÓN 113 liquid chromatography–high resolution mass spectrometry” Anal. Chim. Acta 2014; 827: 54-63. [146] Asgharinezhad AA, Ebrahimzadeh H, Mirbabaei F, Mollazadeh N, Shekari N. “Dispersive micro-solid-phase extraction of benzodiazepines from biological fluids based on polyaniline/magnetic nanoparticles composite” Anal. Chim. Acta 2014; 844: 80-89. [147] Andersson M, Stephanson N, Öhman I, Terzuoli T, Lindh JD, Beck O. “Direct and efficient liquid chromatographic tandem mass spectrometric method for opiates in urine drug testing – importance of 6-acetylmorphine and reduction of analytes” Drug Test. Analysis 2014; 6: 317-324. [148] Anzillotti L, Odoardi L, Strano-Rossi S. “Cleaning up blood samples using a modified “QuEChERS” procedure for the determination of drugs of abuse and benzodiazepines by UPLC– MSMS” Forensic Sci. Int. 2014; 243: 99-106. [149] Bertol E, Mari F, Berto RB, Mannaoni G, Vaiano F, Favretto D. “A mixed MDPV and benzodiazepine intoxication in a chronic drug abuser: Determination of MDPV metabolites by LC– HRMS and discussion of the case” Forensic Sci. Int. 2014; 243: 149155. [150] Steuer AE, Forss A-M, Dally AM, Kraemer T. “Method development and validation for simultaneous quantification of 15 drugs of abuse and prescription drugs and 7 of their metabolites in whole blood relevant in the context of driving under the influence of drugs––Usefulness of multi-analyte calibration” Forensic Sci. Int. 2014; 244: 92-101. [151] de Castro A, Lendoiro E, Fernández-Vega H, Steinmeyer S, López-Rivadulla M, Cruz A. “Liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of selected synthetic cathinones and two piperazines in oral fluid. Cross reactivity study with an on-site immunoassay device” J. Chromatogr. A 2014; 1374: 93-101.
María Regenjo Vázquez 114 [152] Hegstad S, Hermansson S, Betnér I, Spigset O, Falch BMH. “Screening and quantitative determination of drugs of abuse in diluted urine by UPLC-MS/MS” J. Chromatogr. B 2014; 947-948: 83-95. [153] Saito K, Kikuchi Y, Saito K. “Solid-phase dispersive extraction method for analysis of benzodiazepine drugs in serum and urine samples” J. Pharm. Biomed. Anal. 2014; 100: 28-32. [154] Lee H, Park Y, Jo J, In S, Park Y, Kim E, Pyo J, Choe S. “ Analysis of benzodiazepines and their metabolites using DBS cards and LC-MS/MS” Forensic Sci. Int. 2015; 255: 137-145. [155] Jeong Y-D, Kim MK, Suh SI, In MK, Kim JY, Peang K-Y. “Rapid determination of benzodiazepines, zolpidem and their metabolites in urine using direct injection liquid chromatography– tandem mass spectrometry” Forensic Sci. Int. 2015; 257: 84-92. [156] Xiong L, Wang R, Liang C, Teng X., Jiang F, Zeng L, Ye H, Ni C, Yuan X, Rao Y, Zhang Y. “Determination of coadministrated opioids and benzodiazepines in urine using columnswitching solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. A 2015; 1395: 99-108. [157] Concheiro M, Castaneto M, Kronstrand R, Huestis MA. “Simultaneous determination of 40 novel psychoactive stimulants in urine by liquid chromatography–high resolution mass spectrometry and library matching” J. Chromatogr. A 2015; 1397: 32-42. [158] Wózniakiewicz A, WietechaPosłuszny R, Wózniakiewicz M, Nowak J, Kóscielniak P. “Development of the MAE/UHPLC-MSTOF method for determination of benzodiazepines in human biofluids for toxicological analysis” J. Pharm. Biomed. Anal. 2015; 108: 97-101. [159] Dulaurent S, El Balkhi S, Poncelet L, Gaulier J-M, Marquet P, Saint-Marcoux F. “QuEChERS sample preparation prior to LCMS/MS determination of opiates, amphetamines, and cocaine metabolites in whole blood” Anal. Bioanal Chem. 2016; 408: 14671474.
INTRODUCCIÓN 115 [160] Pebdani AA, Khodadout S, Talebianpoor MS, Zargar HR, Zarezade V. “Preconcentration and determination of chlordiazepoxide and diazepam drugs using dispersive nanomaterial-ultrasound assisted microextraction method followed by high performance liquid chromatography” J. Chromatogr. B 2016; 1008: 146-155. [161] Glicksberg L, Bryand K, Kerrigan S. “Identification and quantification of synthetic cathinones in blood and urine using Liquid Chromatography-Quadrupole/Time of Flight (LC-Q/TOF) Mass Spectrometry” J. Chromatogr. B 2016; 1035: 91-103. [162] Mercolini L, Protti M, Catapano MC, Rudge J, Sbern AE. “LC–MS/MS and volumetric absorptive microsampling for quantitative bioanalysis of cathinones analogues in dried urine, plasma and oral fluid samples” J. Pharm. Biomed. Anal. 2016; 123: 186-194. [163] Lee HH, Lee JF, Lin SY, Chen BH. “Simultaneous identification of abuse drugs, benzodiazepines, and new psychoactive substances in urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry” J. Med. Sci. 2016; 32: 118-127. [164] Lee X-P, Shouji Y, Kumazawa T, Hasegawa C, Fujishiro M, Sato J, Hasegawa I, Sato K. “Rapid and highly sensitive analysis of benzodiazepines and tandospirone in human plasma by automated on-line column-switching UFLC-MS/MS” Legal Med 2016; 24: 3655. [165] Vosough M, Iravani NJ. “Matrix-free analysis of selected benzodiazepines in human serum samples using alternating trilinear decomposition modeling of fast liquid chromatography diode array detection data” Talanta 2016; 148: 454-462. [166] Miller B, Kim J, Concheiro M; “Stability of synthetic cathinones in oral fluid samples” Forensic Sci. Int. 2017; 274: 13-21. [167] Dunlop S, Hayes K, Leavy P, Cusack D, Maguire R. “An atmospheric pressure chemical ionization liquid chromatographic– tandem mass spectrometry method for the analysis of benzodiazepines in urine” J. Chromatogr. B 2017; 1070: 22-27.
María Regenjo Vázquez 218 [26] Lewis GA, Mathieu D D, Phan-Tan-Luu R. “Pharmaceutical experimental design” New York: Marcel Dekker; 1999. [27] Bylda C, Thiele R, Kobold U, Volmer KA. “Recent advances in samplepreparation techniques to overcome difficulties encountered duringquantitative analysis of small molecules from biofluids using LC-MS/MS” Analyst 2014; 139: 2265-2276. [28] de Castro A, Lendoiro E, Fernández-Vega H, Steinmeyer S, López-Rivadulla M, Cruz A. “Liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of selected synthetic cathinones and two piperazines in oral fluid. Crossreactivity study with an onsite immunoassay device” J. Chromatogr. A 2014; 1374: 93–101. [29] Ramírez Fernández MM, Fazio V, Wille SMR, Kummer N, Samyn N. “A quantitative, selective and fast ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the simultaneous analysis of 33 basic drugs in hair (amphetamines, cocaine, opiates, opioids and metabolites)” J. Chromatogr. B 2014; 965: 7-18. [30] Lerch O, Temme O, Daldrup T. “Comprehensive automation of the solid phase extraction gas chromatographic mass spectrometric analysis (SPE-GC/MS) of opioids cocaine, and metabolites from serum and other matrices” Anal. Bioanal. Chem. 2014; 406: 4443– 4451. [31] Gonçalves JL, Alves VI, Rodrigues FP, Figueira JA, Câmara JS. “A semi-automatic microextraction in packed sorbent using a digitally controlled syringe, combined with ultra-high pressure liquid chromatography as a new and ultra-fast approach for the determination of prenylflavonbids in beers” J. Chromatogr. A 2013; 42-51: 1304. `[32] Perestrelo R, Silva CL, Câmara JS. “Quantification of furanic derivatives in fortified wines by a highly sensitive and ultrafast analytical strategy based on digitally controlled microextraction by packed sorbent combined with ultra-high pressure liquid chromatography” J. Chromatogr. A 2015; 1381: 54-61.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 219 [33] Mendes B, Silva P, Mendonça I, Pereira J, Câmara JS. “A new and fast methodology to assess oxidative damage in cardiovascular diseases risk development through eVolMEPS–UHPLC analysis of four urinary biomarkers” Talanta 2013; 116: 164–172. [34] Candish E , Gooley A , Wirth HJ, Dawes PA, Shellie RA, Hilder EF. “A simplified approach to direct SPE-MS” J. Sep. Sci. 2012; 35: 2399-2406. [35] El-Beqqali A, Abdel-Rehim M. “Quantitative analysis of methadone in human urine samples by microextraction in packed syringe-gas chromatography-mass spectrometry (MEPS-GC–MS)” J. Sep. Sci. 2007; 30: 2501-2505. [36] Alves V, Gonçalves J, Conceição C, Teixeira HM, Câmara JS. “An improved analytical strategy combining microextraction by packed sorbent combined with ultra-high pressure liquid chromatography for the determination of fluoxetine, clomipramine and their active metabolites in human urine” J.Chromatogr. A 2015; 1408: 30-40. [37] Food and Drug Administration (FDA), U.S. Department of Health and Human Services. “Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation” [Online].; 2001. Available from: http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.pdf. [38] ICH International Conference on Harmonisation. “Harmonised tripartite guideline validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1)” [Online].; 2005. Available from: http://academy.gmp-compliance.org/guidemgr/files/Q2(R1).PDF. [39] Campillo N, Viñas P, Feırez-Melgarejo G, HernáındezCóırdoba M. “Liquid chromatography with diode array detection and tandem mass spectrometry for the determination of neonicotinoid insecticides in honey samples using dispersive liquid–liquid microextraction” J. Agric. Food Chem. 2013; 61: 4799-4805. [40] García-Galán MJ, Petrovic M., Rodríguez-Mozaz S, Barceló D. “Multiresidue trace analysis of pharmaceuticals: their human
María Regenjo Vázquez 220 metabolites and transformation products by fully automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry” Talanta 2016; 158: 330-341. [41] López P, Bermejo AM , Tabernero MJ, Fernández P, Álvarez I. “Determination of cocaine and heroin with their respective metabolites in human hair using gas chromatographymass spectrometry” Anal. Letters 2006; 39: 2307-2316. [42] Moffat AC, Osselton MD, Widdop B, Watts J. “Clarke´s Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material” London: Pharmaceutical Press 4ed. 2011. .
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 221 4.4. DETERMINACIÓN DE DROGAS DE ABUSO EN SALIVA MEDIANTE US-DLLME - UPLC-MS/MS. Según un informe publicado en 2016 por el Centro Europeo de Monitoreo de Drogas y Adicciones a las Drogas (EMCDDA), el mercado de drogas ha aumentado en complejidad debido a la disponibilidad de nuevas sustancias psicoactivas (NPS) a través de Internet, de sus efectos estimulantes más potentes en comparación con drogas clásicas ya consumidas, de los nuevos patrones de uso de drogas múltiples y de la falta de regulación. La escasa información sobre NPS y el uso de drogas de alto riesgo se ha convertido en una amenaza para la salud pública y la seguridad en la conducción y justifica la necesidad de desarrollar políticas y metodologías de control rápidas y confiables. [1-3] Las catinonas sintéticas son el segundo grupo más grande de NPS que vigila el EMCDDA. Desde que se detectaron por primera vez en Europa en 2004, se han identificado 103 nuevas catinonas: 31 en 2014 y 26 en 2015. [1] Generalmente se venden como sustitutos “legales” de drogas estimulantes como la anfetamina, la MDMA y la cocaína. [1-3] Recientemente, una droga no recreativa, la escopolamina, está ganando popularidad debido a sus efectos alucinógenos por el mal uso para sedar y manipular a las víctimas de robos o violaciones. [4] El test de detección de fluido oral (OF) es ideal para detectar la ingesta reciente de drogas en situaciones como infracciones de tránsito, accidentes o agresión sexual. El test OF requiere una pequeña muestra que se recoge bajo supervisión directa, lo que reduce la posible adulteración y refleja el uso reciente de drogas. Las drogas que se analizan con mayor frecuencia son THC (marihuana), opiáceos, cocaína, anfetaminas, metanfetaminas, éxtasis y PCP (fenciclidina) [5]. Además, los diferentes dispositivos de recolección de OF están destinados a detectar la presencia o no de drogas y metabolitos en la saliva con umbrales de concentración predeterminados, pero se requiere un análisis cuantitativo más exhaustivo en el laboratorio. Los métodos de screening son herramientas limitadas para identificar muestras positivas en el análisis de NPS en fluido biológico, y se
María Regenjo Vázquez 222 requieren técnicas más selectivas y sensibles, como los métodos cromatográficos, para un propósito de confirmación. [6-8] Por estos motivos se ha desarrollado un método para la determinación de 20 drogas de abuso, incluidas NSP, como 10 catinonas sintéticas, escopolamina y drugas utilizadas en programas de terapia de sustitución (metadona, naloxona y buprenorfina) en saliva. La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) es la técnica utilizada para separar y determinar las drogas de abuso como la metanfetamina, los cannabinoides en OF. Para evitar la etapa de derivación antes del análisis, algunos estimulantes de diseño se analizan en cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS), incluidas algunas catinonas y cannabinoides [8-10], anfetaminas [11], y anfetaminas y opioides sintéticos [12, 13] Se usan diversas técnicas para la extracción de estas drogas en fluidos biológicos, siendo las más habituales la SPE [8, 14] y la LLE [7, 13,15]. Sin embargo, una consideración importante en el uso de OF es la disponibilidad limitada de la muestra y la posibilidad de encontrar concentraciones de fármacos en niveles traza. Estos desafíos han motivado la necesidad de profundizar en el desarrollo de estrategias de preparación de muestras miniaturizadas. El uso creciente de NPS y los efectos adversos en la salud humana han llevado al desarrollo de métodos de microextracción para la determinación sensible de estos fármacos emergentes en matrices biológicas alternativas de interés toxicológico. En este sentido, la microextracción dispersiva líquido-líquido (DLLME) desarrollada por Assadi et al. en 2006 se basa en un sistema ternario de disolventes en el que los disolventes de extracción y dispersión se inyectan rápidamente en la muestra acuosa con una jeringa. Después de agitar suavemente la mezcla, se forma una solución turbia y los analitos se extraen en una gota obtenida por centrifugación. [16] Es un procedimiento sencillo, usado en aplicaciones de control forense, que utiliza volúmenes reducidos de muestra y disolventes [17,18]. Por tanto, es la técnica de preparación de muestra seleccionada en este trabajo. Para evaluar los factores que pueden influir en la misma, se ha
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 223 utilizado un diseño de screening asimétrico y un diseño de superficie de respuesta, con el fin de optimizar todos los parámetros influyentes y obtener finalmente las condiciones de trabajo [19]: 0,5 mL de saliva; 1,4 mL de metanol como precipitante y dispersante; pH 8; 0,1 g de NaCl; 200 µL de cloroformo como extractante y 5 min de ultrasonidos (US). Para la identificación y determinación de las drogas se utilizó la cromatografía líquida de ultra eficacia, usando una columna Acquity UPLC BEH Shield RP18 (100 mm x 2,1 mm, 1,7µm) y un detector de espectrometría de masas de triple cuadrupolo. Con ello se consiguió la separación de todas las drogas en 3,5 min. El método fue validado, siguiendo las guías de validación de FDA, ICH y Eurachem [20-24] de manera satisfactoria en términos de linealidad, límites de detección y cuantificación, precisión y recuperación. Posteriormente, el método fue aplicado a muestras de saliva procedentes de individuos en proceso de desintoxicación, observando que en algunos casos se sigue consumiendo drogas y en otros se está llevando a cabo la toma de medicación pautada en el proceso de desintoxicación. 4.4.1. Optimización de las condiciones de US-DLLME. El dispersante y el extractante se optimizaron previamente a la utilización del diseño de experimentos. La selección del disolvente dispersante se basó en la miscibilidad de éste con la fase acuosa y el disolvente extractante. Se probaron acetonitrilo, acetona, isopropanol, metanol, ácido fórmico al 0,1% en metanol e hidróxido amónico al 5% en metanol. Para estos ensayos se utilizaron las siguientes condiciones generales: fluido oral, 0.5 mL; sin adición de sal; pH 7; volumen de solvente extractante (cloroformo), 100 µL; tiempo de ultrasonido, 5.0 min; centrifugación 3500 rpm por 5.0 min Como se muestra en la Figura 52a, las respuestas cromatográficas de las drogas con cada disolvente demostraron que la capacidad de extracción, usando metanol como dispersante, es adecuada para la extracción de los 14 analitos considerados, aunque para cinco catinonas y para escopolamina, el mejor dispersante es el metanol
María Regenjo Vázquez 224 ligeramente alcalinizado, por lo que el pH debe considerarse un factor a estudiar. La selección de un disolvente extractante apropiado es esencial en US-DLLME. Considerando la bibliografía y las características necesarias para su elección, cloroformo (CHCl3), dicloroetano (C2H4Cl2), diclorometano (CH2Cl2), clorobenceno (C6H5Cl), tetracloruro de etileno (C2Cl4) y tetracloruro de carbono (CCl4) fueron probados. Como se muestra en la Figura 52b, el cloroformo mostró los mejores resultados, a excepción de algunos compuestos como naloxona, metilona, butilona y mefedrona. La extracción de estos analitos mejoró al considerar y optimizar otros factores, como el pH o el volumen del dispersante. Para realizar estas experiencias previas al diseño, las muestras de saliva se enriquecieron con una concentración de 100 ng/mL de patrón mezcla de drogas y de patrón interno, y se usaron las siguientes condiciones: 0,5 mL saliva, pH: 7, sin adición de sal, 2 mL de metanol como dispersante (en el primer caso se probaron los antes indicados), 200 µL de cloroformo como extractante (en la segunda experiencia se prueban los diferentes extractantes antes indicados), 5 min de US y centrifugación durante 5 min a 3500 rpm.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 225 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 NORMALIZED RESPONSES Chloroform CH2Cl2 C2H4Cl2 Chlorobenzene CCl4 C2Cl4 a Figura 52: Optimización (a) del disolvente extractante y (b) del disolvente dispersante.
María Regenjo Vázquez 226 Figura 52: (Continuación) Optimización (a) del disolvente extractante y (b) del disolvente dispersante. -20,0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 NORMALIZED RESPONSES ACN Acetone Isopropanol MeOH MeOH 5%NH3 MeOH 0,1% formic b
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 227 La optimización de los parámetros multivariados que afectan al proceso de US-DLLME, como los volúmenes de disolvente extractante y dispersante, el volumen de la muestra, el pH, la fuerza iónica (cantidad de NaCl añadido) y el tiempo de ultrasonidos se estudiaron mediante diseños de experimentos. [19] Este enfoque quimiométrico evalúa simultáneamente varios factores a dos o más niveles en un número reducido de experimentos. Primero, se aplicó un diseño de cribado asimétrico (213441) para encontrar los factores críticos entre los seis considerados (Tabla 31). Tabla 31. Condiciones experimentales para un diseño de cribado asimétrico: 213441//18 experimentos en US-DLLME de nuevas sustancias psicoactivas en fluido oral N°Exp Random Vol muestra (mL) Vol dispers (mL) Vol extract (µL) US (min) NaCl (g) pH 1 7 0,25 0,5 50 1 0 7 2 11 0,5 1 100 3 0,1 7 3 3 0,25 2 200 5 0,2 7 4 17 0,25 0,5 100 3 0,2 8 5 12 0,5 1 200 5 0 8 6 16 0,25 2 50 1 0,1 8 7 18 0,25 1 50 5 0,1 9 8 5 0,5 2 100 1 0,2 9 9 2 0,25 0,5 200 3 0 9 10 8 0,25 2 200 3 0,1 10 11 9 0,5 0,5 50 5 0,2 10 12 14 0,25 1 100 1 0 10 13 6 0,25 1 200 1 0,2 7 14 13 0,5 2 50 3 0 7 15 1 0,25 0,5 100 5 0,1 7 16 4 0,25 2 100 5 0 8 17 10 0,5 0,5 200 1 0,1 8 18 15 0,25 1 50 3 0,2 8 Se evaluó el análisis de la varianza (ANOVA) y los factores mostraron significación estadística (nivel de confianza del 95%, p <0,5) en US-DLLME para pentedrona, cocaína y cocaetileno. El efecto de cinco variables, volumen de dispersante (b2), volumen de
María Regenjo Vázquez 234 La linealidad fue estudiada añadiendo analitos y patrón interno a muestras blanco de saliva en los siguientes rangos: 0,5 a 500 ng/mL (7 de las drogas analizadas), 1,0 a 500 ng/mL (5 de las drogas analizadas) y 2,5 a 500 ng/mL (5 de las drogas analizadas). Se obtuvieron rangos de linealidad más cortos: 5 a 500 ng/mL para etilcatinona y metilefedrina y 50 a 1000 ng/mL para la morfina (Tabla 33). Los coeficientes de determinación (r2) se obtuvieron con un mínimo de siete niveles de concentración por triplicado, y oscilan entre 0,9901 y 0,9995. Los LOD variaron de 0,1 a 2,5 ng/mL, excepto para la morfina (25 ng/mL). Los LOQ oscilaron entre 0,25 y 5 ng/mL, excepto para la morfina (50 ng/mL). Como puede verse en la Tabla 30, nueve compuestos muestran un efecto matriz (EM) de 63,1% a 105%. Un valor menor que 100% indica la supresión de la señal, mientras que un valor mayor que 100% indica un aumento de la señal. %EM próximos al 100% indican que la determinación del compuesto estará menos afectada por el efecto matriz. Algunos fármacos mostraron un EM moderado: morfina, metilona, etilcatinona efedrina, etilcatinona, escopolamina, etilona, metilefedrina y metadona presentaron un EM entre 63% y 77%; y por lo tanto, su análisis puede considerarse afectado por las interferencias de la matriz. Todas las drogas restantes no se vieron afectadas por los efectos de la matriz, con valores superiores al 80%; sin embargo, se utilizó el método de adición estándar en la cuantificación de todas las drogas estudiadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 235 Tabla 33: Rango lineal, LOD, LOQ y %EM. Compuesto Rango lineal (ng/mL) r2LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL) %EM Morfina 50-1000 0,9907 25 50 66,7 Naloxona 1-500 0,9916 0,5 1 95,6 Metilona 2,5-500 0,9985 0,25 2,5 63,1 Etilcatinona efedrina 1-500 0,9968 0,5 1 75,6 Etilcatinona 5-500 0,9967 0,25 5 65,1 Escopolamina 1-500 0,9901 0,5 1 77,0 Etilona 0,5-500 0,9975 0,25 0,5 77,4 6AM 2,5-500 0,9972 1 2,5 85,4 Metilefedrina 5-500 0,9981 2,5 5 67,6 Butilona 1-500 0,9938 0,5 1 85,7 Mefedrona 2,5-500 0,9960 1 2,5 85,3 Pentedrona 2,5-500 0,9950 1 2,5 84,9 BEG 0,5-500 0,9907 0,25 0,5 87,0 Cocaína 0,5-500 0,9982 0,25 0,5 91,6 MDPV 0,5-500 0,9977 0,1 0,25 87,5 COCET 0,5-500 0,9995 0,25 0,5 82,4 Pirovalerona 0.5-500 0,9968 0,1 0,25 105,0 EDDP 1-500 0,9965 0.5 1 82,4 Buprenorfina 2,5-500 0,9926 1 2,5 83,4 Metadona 0,5-500 0,9976 0,1 0,25 76,1 La precisión del método y las recuperaciones se calcularon en muestras de control de calidad (QC) adicionadas a tres niveles de concentración (5, 25 y 100 ng/mL, excepto la morfina (50, 100 y 500 ng/mL). La precisión intradía (n = 6) varió entre 1,7% y 14,8% RSD y la precisión interdía (n = 16) varió entre 2,4% y 14,8% RSD (Tabla 34).
María Regenjo Vázquez 236 Tabla 34: Precisión intradía e interdía. Compuesto Precisión intradía %RSD (n=6) Precisión interdía %RSD (n=16) 5 ng/mL 25 ng/mL 100 ng/mL 5 ng/mL 25 ng/mL 100 ng/mL Morfina * 12,4 10,1 12,3 11,3 10,1 13,5 Naloxona 14,5 9,8 6,3 14,5 12,4 14,1 Metilona 9,3 6,6 9,3 9,7 13,6 13,7 Etilcatinona efedrina 14,3 8,1 7,9 11,1 13,3 10,9 Etilcatinona 13,6 9,0 8,6 13,5 14,7 13,4 Escopolamina 7,7 6,2 7,5 14,5 12,5 10,9 Etilona 9,2 9,2 5,7 12,9 13,7 5,5 6AM 10,1 4,8 10,8 12,3 14,1 12,8 Metilefedrina 8,7 14,3 2,9 14,0 14,2 11,5 Butilona 5,4 14,1 14,6 10,3 13,3 13,0 Mefedrona 7,0 8,7 9,2 13,2 12,9 10,8 Pentedrona 8,5 8,1 6,8 13,5 14,8 11,0 BEG 12,7 10,1 14,8 13,2 13,2 7,9 Cocaína 4,5 2,7 1,7 4,0 2,4 2,4 MDPV 2,4 3,2 3,0 12,9 5,5 9,4 COCET 3,7 4,9 3,4 13,4 6,3 12,6 Pirovalerona 11,8 6,1 8,3 12,5 9,8 7.5 EDDP 8,9 7,3 5,3 13,0 14,8 10,2 Buprenorfina 10,0 4,7 7,5 12,8 9,5 12,8 Metadona 2,5 4,2 3,2 10,2 8,3 7,2 *Niveles para la morfina 50, 100 y 500 ng/mL
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 237 La exactitud del método se evaluó mediante el cálculo de la concentración de droga encontrada en la muestra de saliva y la desviación estándar (S) de cinco replicados y recuperaciones absolutas (Tabla 35), y los valores obtenidos indican la buena calidad del método. La mayoría de las recuperaciones de las drogas en muestras QC de niveles bajo y medio (5–25 ng/mL o 50 ng/mL para morfina) estuvieron en el rango de 80–115%, y entre 80 y 110% en niveles altos de muestras QC (100 o 500 ng/mL para morfina), que están en el rango marcado por la FDA “Guidelines for the Validation of Chemical Methods” [22] Las recuperaciones de solo seis analitos presentaron desviaciones leves, en los niveles altos de las muestras QC, en comparación con los valores de referencia (entre 1,7% para 6AM y 19% para BEG). Se encontraron pequeñas desviaciones en las muestras QC bajo y medio (6,7% para pirovalerona, 10,3% para EDDP y 14% para naloxona), lo que demuestra que la metodología propuesta está validada adecuadamente. Tabla 35: Exactitud del método de extracción en saliva. Droga aQC Bajo bQC Medio cQC Alto Concent. hallada±S (ng/mL) Recuper. ± RSD (%) Concent. hallada±S (ng/mL) Recuper. ± RSD (%) Concent. hallada±S (ng/mL) Recuper. ± RSD (%) Morfina 51,9 ± 6,0 118,2 ±11,9 86,5 ± 12,2 86,5 ± 12,2 554,5 ± 66,8 110,9 ±13,4 Naloxona 6,5 ± 0,4 129,0 ± 7,4 21,5 ± 2,4 85,8 ± 9,7 93,7 ± 3,0 93,7 ± 3,0 Metilona 5,1 ± 0,3 101,5 ± 5,8 25,9 ± 3,2 103,8± 13,0 116,8 ± 16,0 116,8± 16,0 Etilcatinona efedrina 3,7 ± 0,5 74,6 ± 11,4 23,0 ± 3,0 91,9 ± 12,0 100,0 ± 11,4 100,0± 11,4 Etilcatinona 6,1 ± 0,7 122,7± 13,2 21,1 ± 3,6 84,5 ± 10,4 96,3 ± 12,3 96,3 ± 12,3 Escopolamina3,8 ± 0,5 77,1 ± 9,8 22,9 ± 5,8 91,7 ± 23,1 92,2 ± 5,8 92,2 ± 5,8
María Regenjo Vázquez 238 Etilona 5,5 ± 1,2 110,6 ± 23,4 20,6 ± 5,4 82,5 ± 10,6 105,2 ± 5,6 105,2 ± 5,6 6AM 5,8 ± 0,8 115,4 ± 13,9 20,2 ± 2,3 80,9 ± 9,4 111,7 ± 13,8 111,7 ± 13,8 Metilefedrina3,7 ± 0,6 73,8 ± 12,2 28,3 ± 2,3 113,1 ± 9,0 96,0 ± 9,6 96,0 ± 9,6 Butilona 4,9 ± 0,8 98,5 ± 16,2 21,7 ± 2,9 96,8 ± 11,6 113,4 ± 11,6 113,4± 11,6 Mefedrona 3,8 ±0.5 76,6 ± 11,3 21,8 ± 3,0 87,1 ± 12,2 98,3 ± 10,8 98,3 ± 10,8 Pentedrona 5,4 ± 1,1 107,2 ± 1,2 24,5 ± 4,0 98,1 ± 16,0 92,1 ± 10,4 92,1 ± 10,4 BEG 5,1 ± 1,2 102,7± 23,3 19,2 ± 2,8 76,8 ± 11,2 126,2 ± 20,6 126,2± 20,6 Cocaína 5,1 ± 0,2 102,6 ± 4,0 25,4 ± 0,7 101,0 ± 1,7 101,6 ± 2,7 101,6 ± 2,7 MDPV 5,3 ± 0,5 105,5± 10,5 22,7 ± 2,9 96,8 ± 11,6 110,2 ± 10,2 110,2± 10,2 COCET 5,0 ± 0,6 100,7± 11,8 26,6 ± 1,8 106,5 ± 7,3 118,2 ± 13,0 118,2± 13,0 Pirovalerona 6,1 ± 0,4 121,7 ± 8,5 21,4 ± 1,9 85,8 ± 7,4 113,5 ± 8,4 113,5 ± 8,4 EDDP 6,3 ± 0,5 125,3 ± 9,6 23,5 ± 3,1 93,9 ± 12,4 109,5 ± 10,9 109,5± 10,9 Bupre 4,6 ± 0,6 92,3 ± 30,7 22,0 ± 2,1 87,8 ± 8,8 108,9 ± 14,6 108,9± 14,6 Metadona 5,2 ± 0,6 103,9± 11,6 28,3 ± 2,4 113,2 ± 9,4 106,4 ± 11,8 106,4± 11,8 aQC Bajo 5 ng/mL (50 ng/mL para morfina) bQC Medio 25 ng/mL (100 ng/mL para morfina) cQC Alto 100 ng/mL (500 ng/mL para morfina)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 239 4.4.3. Aplicación del método a muestras reales. Tras la validación del método propuesto, se aplicó con éxito para el análisis por duplicado de las drogas estudiadas en 15 muestras de saliva procedentes de pacientes que participan en programas de terapia de sustitución con metadona y buprenorfina/naloxona. Fue necesario diluir algunas muestras positivas que tenían concentraciones más altas que el rango lineal estudiado, para su correcta cuantificación. Además, debido al pequeño volumen de saliva recogido en los dispositivos Salivette®, las muestras se analizaron por duplicado, excepto aquellas para las cuales se disponía de una cantidad limitada y solo fue posible realizar un único análisis. Los resultados se presentan en la Tabla 36 y los cromatogramas de UPLC-MS/MS, en modo MRM para la muestra nº 9 (positiva a metadona y EDDP) se muestran en la Figura 56. Como se esperaba, no se detectaron nuevas sustancias psicoactivas (NPS) en las muestras de saliva. Los pacientes que siguen el tratamiento con metadona también tienen concentraciones de su metabolito EDDP, excepto en un caso donde la concentración de metadona era muy baja (0,6 ng/mL). Los casos positivos en estas muestras reales oscilaron entre 875,8 y 8323,7 ng/mL para morfina, 8,0 a 16336,8 ng/mL para 6AM, 2,0 a 12529,3 ng/mL para cocaína, 0,6 a 1554,6 ng/mL para BEG, solo una muestra positiva de 23,3 ng/mL para cocaetileno, 0,6 a 841,1 ng/mL para metadona, 4,4 a 84,0 ng/mL para EDDP, 1,9 a 730,8 ng/mL para naloxona y 20,9 a 3938,3 ng/mL para buprenorfina. Los resultados muestran que el 67% de los sujetos usaron terapia con metadona y el 33% usaron la terapia con buprenorfina/naloxona. Sin embargo, el 47% de estos pacientes consumieron cocaína y presentaron concentraciones de los metabolitos BEG y cocaetileno en el 40% y el 7% de los casos, respectivamente. En algunos pacientes se detectó la presencia de morfina (13% de los casos) y 6AM (33% de los casos), que eran compatibles con un consumo de heroína. El uso de opiáceos y cocaína se demuestra en los casos 3, 4, 10 y 15, tras la detección simultánea de algunos de sus metabolitos.
María Regenjo Vázquez 240 Tabla 36: Concentraciones de las drogas en muestras de saliva de sujetos consumidores. Muestra Morfina Nalo 6AM BEG Cocaína COCET EDDP Bupre Met 1 n.d. n.d. n.d. 0,6±0,1 15,6±0,8 n.d. 13,9±0, 2 n.d. 841±255 2 n.d. n.d. n.d. n.d. 2,0±0,04 n.d. 84,0±4, 0 n.d. 84,0±4, 0 3 n.d. 730,8± 48,9 15,9±1,5 n.d. 2,4±0,01 n.d. n.d. 3938,3±124, 9 n.d. 4 875,8± 35,6 n.d. 36,8±13, 3 1554,6±168, 0 12529,3±26 0,9 23,3± 8,6 8,8± 0,07 n.d. 8,8±0,0 7 5 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 4,4± 0,2 n.d. 4,4±0,2 6 n.d. n.d. n.d. n.d. 15,5±0,5 n.d. n.d. n.d. n.d. 7 n.d. 131,8 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1044,1 n.d. 8 n.d. 21,4 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 87,2 n.d. 9 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 200,3 n.d. 1588,9 10 8323,7±574 ,3 n.d. 16336,8± 1037,7 n.d. 8323,7± 574,3 n.d. 27,0±1, 6 n.d. 310,8 11 n.d. n.d. n.d. 565,5 n.d. n.d. n.d. n.d. 9,7
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 241 12 n.d. n.d. 8,0±0,8 n.d. n.d. n.d. 16,7±0, 4 n.d. 447,0± 6,6 13 n.d. n.d. n.d. 12,3± 0,5 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,6± 0,003 14 n.d. 1,9± 0,8 n.d. 3,6±1,6 n.d. n.d. 11,4±1, 8 20,9± 1,4 33,4±0, 1 15 n.d. 69,3 4,5 134,1 23,2 n.d. n.d. 196,7 n.d. n.d. no detectado Figura 56: Cromatograma de muestra real (código 9, tabla 30).
María Regenjo Vázquez 242 4.4.4. Bibliografía. [1]. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, “European Drug Report 2016: trends and developments” Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2016 http://www.emcdda.europa.eu/system/files/publications/2637/TDAT1 6001ENN.pdf. [2]. Miller BI, Stogner JM, Miller JM, Fernandez MI. “The arrest and synthetic novel psychoactive drug relationship: observations from a young adult population” J. Drug Issues 2017; 47: 91–103. [3]. Rech MA, Donahey E, Cappiello Dziedzic JM, Oh I, Greenhalgh E. “New drugs of abuse” Pharmacotherapy 2015; 35: 189-197. [4]. Benítez G, March-Salas M, Villa-Kamel A, Cháves-Jiménez U, Hernández J, Montes-Osuna N. “The genus Datura L. (Solanaceae) in Mexico and Spain—ethnobotanical perspective at the interface of medical and illicit uses” J. Ethnopharmacol. 2018; 219: 133–151. [5] Bosker WM, Huestis MA. “Oral fluid testing for drugs of abuse” Clinical Chem. 2009; 55: 1910–31. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.108670 [6]. Aldlgan AA, Torrance HJ. “Bioanalytical methods for the determination of synthetic cannabinoids and metabolites in biological specimens” TRAC. Trends Anal. Chem. 2016; 80: 444-457. [7]. Mercolini L, Protti M. “Biosampling strategies for emerging drugs of abuse: towards the future of toxicological and forensic analysis”. J. Pharm. Biomed. Anal. 2016; 130: 202-219. [8]. Amaratunga P, Lemberg BL, Lemberg D. “Quantitative measurement of synthetic cathinones in oral fluid” J. Anal. Toxicol. 2013; 37: 622-628. [9]. Di Rago M, Chu M, Rodda LN, Jenkins E, Kotsos A, Gerostamoulos D. “Ultra-rapid targeted analysis of 40 drugs of abuse in oral fluid by LC-MS/MS using carbon-13 isotopes of methamphetamine and MDMA to reduce detector saturation” Anal. Bioanal. Chem. 2016; 40: 3737–3749.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 243 [10]. Sergi M, Montesano C, Odoardi S, Rocca LM, Fabrizi G, Compagnone Dea. “Microextraction by packed sorbent coupled to liquid chromatography tandem mass spectrometry for the rapid and sensitive determination of cannabinoids in oral fluids” J. Chromatogr. A 2013; 1301: 139-146. [11]. Newmeyer MN, Concheiro M, Huestis MA. “Rapid quantitative chiral amphetamines liquid chromatography-tandem mass spectrometry: method in plasma and oral fluid with a cost-effectivechiral derivatizing reagent” J. Chromatogr. A 2014; 1358: 68–74. [12]. Montesano C, Simeoni MC, Curini R, Sergi M, Lo Sterzo C, Compagnone D. “Determination of illicit drugs and metabolites in oral fluid by microextraction on packed sorbent coupled with LC-MS/MS” Anal. Bioanal. Chem. 2015; 407: 3647–3658 [13]. Liu HC, Lee HT, Hsu YC, Huang MH, Liu RH, Chen TJ. “Direct injection LC-MS-MSanalysis of opiates,methamphetamine, buprenorphine, methadone and their metabolites in oral fluid from substitution therapy patients” J. Anal. Toxicol. 2015; 39: 472-480. [14]. de Castro A, Lendoiro E, Fernández-Vega H, Steinmeyer S, López-Rivadulla M, Cruz A. “Liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of selected synthetic cathinones and two piperazines in oral fluid. Crossreactivity study with an onsite immunoassay device” J. Chromatogr. A 2014; 1374: 93–101. [15]. Mercolini L, Protti M, Catapano MC, Rudge J, Sberna AE. “LC-MS/MS and volumetric absorptive microsampling for quantitative bioanalysis of cathinone analogs in dried urine, plasma and oral fluid samples” J. Pharm. Biomed. Anal. 2016; 123: 186–194. [16]. Rezaee M, Assadi Y, Milani Hosseini MR, Aghaee E, Ahmadi F, Berijani S. “Determination of organic compounds in water using dispersive liquid–liquid microextraction” J. Chromatogr. A 2006; 1116: 1-9.
ANEXOS
ANEXOS 253 ANEXOS Publicaciones derivadas de la tesis. Fernández P, Regenjo M, Fernández AM, Lorenzo RA, Carro AM. “Optimization of ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction for ultra performance liquid chromatography determination of benzodiazepines in urine and hospital wastewater”. Anal. Methods 2014; 6: 8239-8246. Fernández P, Regenjo M, Bermejo AM, Fernández AM, Lorenzo RA, Carro AM. “Analysis of drugs of abuse in human plasma by dispersive liquid–liquid microextraction and high-performance liquid chromatography” J. Appl. Toxicol. 2015; 35: 418–425. Fernández P, González M, Regenjo M,. Ares AM,. Fernández AM, Lorenzo RA,. Carro AM. “Analysis of drugs of abuse in human plasma using microextraction by packed sorbents and ultra-highperformance liquid chromatography” J. Chromatogr. A 2017; 1485: 819. Fernández P, Regenjo M, Ares A, Fernández AM, Lorenzo RA, Carro AM. “Simultaneous determination of 20 drugs of abuse in oral fluid using ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction” Anal. Bioanal. Chem. 2019; 411(1): 193-203