Estudio de la fosforilación de la protimosina α en células en proliferación. Descubrimiento de la bifuncionalidad enzimática de la isoenzima M2 de la piruvato quinasa

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA CIBUS. FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR TESIS DOCTORAL ESTUDIO DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α EN CÉLULAS EN PROLIFERACIÓN DESCUBRIMIENTO DE LA BIFUNCIONALIDAD ENZIMÁTICA DE LA ISOENZIMA M2 DE LA PIRUVATO QUINASA Memoria que, para optar al grado de Doctor en Bioquímica, presenta David Moreira Álvarez Santiago de Compostela, marzo de 2012 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular CIBUS. Facultad de Biología Universidad de Santiago de Compostela Manuel Freire Rama, catedrático del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, y Cristina Díaz-Jullien, profesora del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN: Que la memoria adjunta, titulada “ESTUDIO DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α EN CÉLULAS EN PROLIFERACIÓN: Descubrimiento de la bifuncionalidad enzimática de la isoforma M2 de la piruvato quinasa”, presentada por el licenciado en Biología Molecular y Biotecnología David Moreira Álvarez para optar al grado de Doctor en Bioquímica, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela y, considerándola concluida, autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Fdo. Manuel Freire Rama Fdo. Cristina Díaz-Jullien Fdo. David Moreira Álvarez Santiago de Compostela, 7 de marzo de 2012 El trabajo que ha dado lugar a la memoria aquí presentada ha sido financiado por los proyectos XUGA: PGIDT04CXIB20001PR de la Xunta de Galicia y DGU 2004-02523 del Ministerio de Educación y Ciencia, cuyo investigador principal es el profesor Manuel Freire Rama. Asimismo, el trabajo presentado en esta memoria ha sido realizado en su totalidad en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, con ayuda de una Beca de Tercer Ciclo de la Xunta de Galicia y un contrato predoctoral de formación de doctores en organismos públicos de investigación de la Comunidad Autónoma de Galicia del programa María Barbeito 2008 (Programa de Recursos Humanos del Plan Gallego de Investigación, Desarrollo e Innovación Tecnológica 2006-2010). AGRADECIMIENTOS Agradecimientos __________________________________________________________________________________________________________ AGRADECIMIENTOS A mi director, el profesor Manuel Freire Rama, por acogerme en su grupo de investigación y permitirme trabajar en su proyecto. Agradezco especialmente su infatigable capacidad de enseñanza y motivación, su comprensión y, por supuesto, su intensa pasión por la ciencia y su inagotable vitalidad. “El hombre es verdaderamente grande sólo cuando obra a impulso de las pasiones.” Benjamin Disraeli A mi directora, la profesora Cristina Díaz-Jullien, por su confianza y apoyo. Sus conocimientos, consejos y aportaciones han sido indispensables en esta etapa personal. Lo conseguido habría sido imposible sin su participación. “La inteligencia consiste no sólo en el conocimiento, sino también en la destreza de aplicar los conocimientos en la práctica” Aristóteles A Willy y Conchita, por tratarme como uno más, por soportar y resolver mis dudas, por su compañerismo y sinceridad…y por convertir un laboratorio de bioquímica en algo más que un laboratorio. “Duda siempre de ti mismo, hasta que los datos no dejen lugar a dudas” Louis Pasteur A Primitivo, mi profesor de bioquímica hace ya bastantes años, por servirme de guía en los inicios de mi actividad investigadora. Su experiencia, implicación y preocupación han sido muy importantes para mí. “La experiencia no consiste en el número de cosas que se han visto, sino en el número de cosas que se han reflexionado.” José María de Pereda Índice __________________________________________________________________________________________________________ ÍNDICE ABREVIATURAS………………………………………………………………………..i I. INTRODUCCIÓN.....................................................................5 1. LAS TIMOSINAS…………………………………………………………………………………………….5 2. LAS TIMOSINAS α Y SU PRECURSOR………………………………………………………………7 3. ESTRUCTURA DE LA PROTIMOSINA α Y SU EXPRESIÓN EN LOS DIFERENTES TEJIDOS…………………………………………………………………………9 4. GENES DE LA PROTIMOSINA α…………………………………………………………………….15 5. CONCENTRACIÓN Y DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE LA PROTIMOSINA α…………………………………………………………………………………….17 6. EVOLUCIÓN POST-BIOSÍNTESIS Y FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α………………………………………………………………………………..20 6.1. PROTIMOSINA α Y PROLIFERACIÓN CELULAR………………………………………………………………....21 6.2. PROTIMOSINA α Y ACTIVIDAD REMODELADORA DE LA CROMATINA.................................24 6.3. PROTIMOSINA α Y APOPTOSIS.............................................................................................34 6.4. PROTIMOSINA α Y ESTRÉS OXIDATIVO.................................................................................43 6.5. PROTEOLISIS DE LA PROTIMOSINA α....................................................................................44 6.6. LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α..........................................................................47 II. CONOCIMIENTO ACTUAL DE LA BIOLOGÍA DE LA PROTIMOSINA α Y OBJETIVOS....................................59 Índice __________________________________________________________________________________________________________ III. MATERIAL Y MÉTODOS......................................................69 1. MATERIAL BIOLÓGICO..................................................................................69 2. MATERIAL NO BIOLÓGICO.............................................................................73 3. MÉTODOS.....................................................................................................77 3.1. CULTIVOS CELULARES...........................................................................................................77 3.2. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CELULARES...........................................................................79 3.3. ENSAYOS DE ACTIVIDAD QUINASA PROTαK..........................................................................80 3.4. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CON ACTIVIDAD PROTαK......................................................81 3.5. ESPECTROMETRÍA DE MASAS................................................................................................83 3.6. PURIFICACIÓN DE LA ISOFORMA M2-PK CON ACTIVIDAD PROTαK Y ACTIVIDAD PK EN CÉLULAS NC37.........................................................................83 3.7. ENSAYOS DE ACTIVIDAD PK ..................................................................................................84 3.8. VECTORES DE EXPRESIÓN DE LA PROTα Y TRANSFECCIÓN EN CÉLULAS 293T Y HELA......................................................................................................85 3.9. ENSAYOS INMUNOLÓGICOS..................................................................................................90 3.10. ANÁLISIS DE FOSFOAMINOÁCIDOS.....................................................................................95 3.11. ENSAYOS DE DESFOSFORILACIÓN.......................................................................................96 3.12. FILTRACIÓN EN GEL.............................................................................................................96 3.13. ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA Y MICROSCOPÍA CONFOCAL.................................97 3.14. ENSAYOS DE ACTIVIDAD APOPTÓTICA................................................................................98 IV. RESULTADOS 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA ACTIVIDAD PROTαK EN LINFOCITOS NC37.........................................105 2. ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS ACTIVIDADES PROTαK Y PK EN LINFOCITOS HUMANOS....................................................108 Índice __________________________________________________________________________________________________________ 3. ESTUDIO DE LA BIFUNCIONALIDAD DE LA ISOFORMA M2 DE LA PK.............120 4. INVESTIGACIÓN DEL COMPORTAMIENTO CELULAR DE LA PROTα EN RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD PROTαK Y LA PROTEÍNA M2....................128 5. ESTUDIO PRELIMINAR DEL EFECTO BIOLÓGICO DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTα.....................................................................135 V. DISCUSIÓN........................................................................145 VI. CONCLUSIONES................................................................159 VII. ANEXO............................................................................163 VIII. BIBLIOGRAFÍA................................................................169 PUBLICACIONES ABREVIATURAS Abreviaturas __________________________________________________________________________________________________________ i ABREVIATURAS a.a.: Aminoácido Apaf-1: Factor 1 de activación de proteasas apoptóticas Asn: Asparagina ATP: Adenosín trifosfato Bax: Proteína X asociada a Bcl-2 Bcl: Proto-oncogen de “linfoma de células B” BSA: Seroalbúmina bovina CBP: Proteína de unión a CREB (CREB binding protein) Cdc: Ciclina (Ciclo de división celular) Cdk: Quinasa dependiente de ciclina (Cyclin dependent kinase) cDNA: DNA complementario CK-2: Caseín quinasa 2 (Casein kinase 2) ConA: Concanavalina A c.p.m.: Cuentas por minuto DAPI: 4´,6-diamino-fenilindol DMEM: Medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco DMP: Dimetilpimelimidato DMSO: Dimetil sulfóxido DNA: Ácido desoxirribonucleico DTT: Ditiotreitol EBNA3C: Antígeno nuclear 3C del virus Epstein-Barr EDTA: Ácido etilendiaminotetracético EGTA: Ácido etilenglicoltetracético FBP: Fructosa 1,6-bisfosfato FBS: Suero fetal bovino F45 SA: Fraccionado 45% sulfato amónico F75 SA: Fraccionado 75% sulfato amónico Glu: Glutamato HAT: Acetiltransferasa de histonas Abreviaturas __________________________________________________________________________________________________________ ii HEPES: Ácido N-2-hidroxietilpiperacina-N´-2´-etanesulfónico HIF-1: Factor 1 inducible por hipoxia HMT: Metiltransferasa de histonas HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución (High performance liquid chromatography) HRE: Elementos de respuesta a hipoxia HRP: Peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase) IAPs: Proteínas inhibidoras de la apoptosis IFN: Interferón Ig: Inmunoglobulina IL: Interleuquina INHAT: Complejo inhibidor de acetiltransferasas de histonas IP: Inmunoprecipitación kb: kilobase kDa: kilodalton LB: Medio de cultivo Luria-Bertani LDH: Lactato deshidrogenasa MAP: Proteínas activadas por mitógenos (Mitogen-activated proteins) MHC: Complejo principal de histocompatibilidad (Major histocompability complex) mRNA: RNA mensajero NADH: Dinucleótido de nicotinamida y adenina (forma reducida) NP-40: Nonidet P-40 NFK B: Factor nuclear K B Oct: Factor de transcripción de unión al octámero PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida PBS: Tampón fosfato salino (Phosphate buffered saline) PCNA: Antígeno nuclear de células en proliferación PEP: Fosfoenolpiruvato pI: punto isoeléctrico PK: Piruvato quinasa (Pyruvate kinase) PKA: Proteína quinasa A (Protein kinase A) PKC: Proteína quinasa C (Protein kinase C) Abreviaturas __________________________________________________________________________________________________________ iii PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo ProTα: Protimosina α ProTα T7A: Protimosina α mutada en posición 7 (treonina por alanina) ProTαK: Proteína quinasa de la ProTα (ProTα kinase) PVDF: Polifluoruro de vinilideno Raf: Factor activado por ras RNA: Ácido ribonucleico RNAi: RNA de interferencia RPMI: Medio Roswell Park Memorial Institute SA: Sulfato amónico SD: Desviación estándar (Standard deviation) SDS: Dodecilsulfato sódico Ser: serina siRNA: Moléculas pequeñas de RNA de interferencia (small interfering RNA) SMAC: Segundo activador de caspasas derivado de la mitocondria STATs: Proteínas transductoras de señal y activadoras de la transcripción (signal transducers and activators of transcription) T 3 : 3, 3´, 5-triiodo-L-tironina TAE: Tampón tris acetato EDTA Tα 1 : Timosina α 1 Tα 11 : Timosina α 11 TBS: Tampón tris salino (Tris-buffered saline) TF5: Fracción de timosina 5 Thr: Treonina (threonine) TNF: Factor de necrosis tumoral tProTα: ProTα truncada WB: Análisis Western blot Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 6 Los componentes β de la TF5 también han sido aislados y secuenciados. La timosina β 1 ha sido identificada como ubiquitina [Low et al., 1979b]; la timosina β 4 (el miembro más abundante de esta familia de péptidos) [Low et al., 1981] y sus homólogos β 8 , β 9 [Hannappel et al., 1982b] y β 10 [Hall et al., 1990], así como sus derivados, han sido también aislados y sus estructuras establecidas. Los efectos de las β-timosinas en la función inmunológica, de acuerdo con diversos ensayos biológicos [Low et al., 1985], son menos relevantes que los de las α-timosinas. La ubicua distribución de las β-timosinas en extractos de tejidos de mamíferos [Hannappel et al., 1982a], aves y anfibios [Erickson-Vitanen et al., 1982], así como su expresión génica en diversos tejidos animales [Gómez-Márquez et al., 1989a, 1996; Gómez-Márquez & Anadón, 2002], sugieren fuertemente que las β-timosinas tienen una función biológica más generalizada (incluso funciones celulares no relacionadas específicamente con el sistema inmune han sido descritas [revisado en Huff et al., 2001]). En este sentido, las β-timosinas han sido caracterizadas como proteínas de unión a actina, y la función bioquímica de la timosina β 4 como péptido regulador de los mecanismos de polimeración de la actina es bien conocida [Safer et al., 1990, 1991; Vancompernolle et al., 1992; Huff et al., 1995; Huff & Hannappel, 1997]. La timosina β 4 está implicada en la reparación de tejidos lesionados [Goldstein et al., 2005], en procesos de angiogénesis [Malinda et al., 1997] y neovascularización [Smart et al., 2007], en la movilidad celular, sinaptogénesis y otros fases relacionadas con la plasticidad sináptica [Bamburg & Bernstein, 1991], en la diferenciación neuronal [Carpintero et al., 1995] y en el desarrollo cardiovascular [Gómez-Márquez et al., 1996]. Así, en estas y otras actividades biológicas (en las que la actina tiene un papel crucial) la timosina β 4 participa controlando el remodelado del citoesqueleto celular. Las γ-timosinas no han sido caracterizadas. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 7 2. LAS TIMOSINAS α Y SU PRECURSOR La glandula tímica es un órgano linfoide en el que se produce la inmunocapacitación de los linfocitos T, responsables tanto de la inmunidad humoral como de la celular. A las timosinas α se les atribuía un papel como señalizadores moleculares de los linfocitos T en el timo, influenciando su diferenciación e inmunocapacitación dentro de este órgano. La interacción de las timosinas, y otros componentes del medio intratímico, con los linfocitos inmunológicamente incompetentes recién llegados a este órgano, procedentes de la médula ósea, propiciaría la generación de las diferentes poblaciones de linfocitos T capaces de ejercer la actividad inmunológica después de su exportación del timo a los demás tejidos del sistema inmune. Estas poblaciones de linfocitos T diferenciados: células CD4+, CD8+, y linfocitos T de memoria, son las responsables de la inmunidad celular y también de la inmunidad humoral, puesto que cooperan con la actividad de los linfocitos B [Low & Goldstein, 1985]. La importancia aparente de las α-timosinas como efectores del desarrollo y de la función de los linfocitos dependientes del timo animó, desde 1977, la investigación dirigida a caracterizar el origen celular de estos polipéptidos y su función biológica. Entre estos péptidos tímicos, la timosina α 1 era el más característico, siendo éste el primero en ser purificado [Goldstein et al., 1977]. El descubrimiento posterior de dos péptidos, la Tα 11 y la des-timosina α 1 , que poseían la misma secuencia que la Tα 1 en su extremo amino terminal [Caldarella et al., 1983], apoyaba la idea de la existencia de un precursor común. La estrategia seguida para investigar si estos péptidos podrían estar sintetizados a partir de un precursor común fue la caracterización de los productos de la traducción in vitro de los mRNAs aislados de timo de ternera, empleando anticuerpos contra la timosina α 1 . El análisis estructural de los productos inmunoprecipitados demostró la existencia de una proteína de 16 kDa (determinada mediante el protocolo de Weber & Osborn, 1969: en SDS-PAGE a pH 7) que incluye a la Tα 1 en su secuencia [Freire et al., 1978]. El aislamiento del mRNA que codifica para esta proteína [Freire et al., 1981; Rey-Campos et al., 1983] confirmó la existencia de un precursor de la Tα 1 y apoyó la Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 8 hipótesis original: la Tα 1 y quizás la Tα 11 eran generadas por proteolisis de un péptido de mayor tamaño. Posteriormente, este precursor fue aislado y secuenciado de extractos de timo de rata [Haritos et al., 1984b; Haritos et al., 1985a] usando procedimientos que minimizaban la actividad proteolítica: el análisis de los componentes de los extractos tímicos preparados en estas condiciones indicaron la ausencia de la Tα 1 y la presencia de un polipéptido de mayor longitud con la secuencia de la Tα 1 en su extremo N-terminal, y que mostraba las características del precursor descrito previamente [Haritos et al., 1984a]. A esta proteína (figura 1B), de secuencia muy conservada y que contiene en su estructura (en su extremo N-terminal) la secuencia de las timosinas α (figura 1C), se la denominó protimosina α (ProTα). Figura 1. Composición de la TF5 de timo de ternera (A) y secuencia de la protimosina α (B) y de las timosinas α purificadas (C). Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 9 3. ESTRUCTURA DE LA PROTIMOSINA α Y SU EXPRESIÓN EN LOS DIFERENTES TEJIDOS Posteriormente, la ProTα fue aislada en diferentes tejidos y secuenciada en humanos [Pan et al., 1986], ternera [Panneerselvam et al., 1988], cerdo [Economou et al., 1988], ratón [Low et al., 1990] y cabra [Frillingos et al., 1991]. Su estructura primaria se confirmó por secuenciación de su cDNA procedente de células humanas [Eschenfeldt & Berger, 1986; Goodall et al., 1986; Gómez-Márquez et al., 1989b]. Polipéptidos similares a la ProTα han sido hallados en otros vertebrados, incluyendo pollo y trucha, a concentraciones 30 veces menores que las encontradas en timo de ternera [Yialouris et al., 1988]; mientras que el mRNA de una proteína acídica que muestra una fuerte homología en su secuencia con la ProTα de mamíferos ha sido encontrado en rana, aunque los niveles celulares de esta proteína no han sido determinados [Aniello et al., 2002]. Al mismo tiempo, la ProTα procedente de rata [Frangou-Lazaridis et al., 1988], ratón [Schmidt et al., 1991], y cerdo [Wintero et al., 1996] fueron clonadas y sus cDNA secuenciados. Los resultados de estos trabajos concluyeron las siguientes características de esta proteína: - La amplia distribución tisular de la ProTα, así como la elevada concentración a la que esta proteína está presente en las células (del orden de 0.2 pg/célula) [Franco et al., 1992], muy superior a la de una hormona. De esto se deducen dos importantes consideraciones: a) la presencia generalizada de la ProTα en los diferentes tejidos es indicativa de una función básica de esta proteína en la actividad de las células de mamífero no relacionada exclusivamente con la actividad del sistema inmunitario y la inmunocapacitación intratímica de los linfocitos T; y b) la concentración preponderante de la ProTα en los diferentes tejidos, respecto a los demás polipéptidos timosínicos, parece indicar que esta proteína es la principal responsable de la actividad biológica de las timosinas α. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 10 - La ProTα es un polipéptido altamente acídico (pI 3.55, puede considerarse la proteína más acídica conocida en animales) con un peso molecular de 12.5 kDa. Posee entre 109-111 residuos aminoacídicos de los cuales los 28 primeros se corresponden con la secuencia de la timosina α 1 , mientras que la des-timosina α 1 y la timosina α 11, otros dos péptidos tímicos aislados de timo de rata [Caldarella et al., 1983], coinciden respectivamente con los primeros 24 y 35 aminoácidos. En su secuencia hay una gran proporción de residuos ácidos (Glu 37% y Asp 25%) que se localizan mayoritariamente en su región central, lo que le confiere un carácter ácido y altamente hidrofílico. No posee aminoácidos azufrados ni aromáticos (figuras 1B y 2). - La ProTα humana se presenta en dos isoformas, que difieren en la existencia o no de un resto de ácido glutámico en la posición 39 de la molécula [Eschenfeldt & Berger, 1986], confirmando los datos obtenidos mediante la secuenciación de esta proteína [Pan et al., 1986]. - La estructura primaria de la ProTα predice estructuras secundarias en hélice α y lámina β [Haritos et al., 1985a]; sin embargo, ningún tipo de estructura secundaria ha sido detectada en condiciones fisiológicas [Watts et al., 1990; Gast et al., 1995]. A pH neutro, la ProTα se mantiene como una cadena no plegada, debido probablemente a las repulsiones entre las cargas negativas [Watts et al., 1990]. Este hecho podría explicar su comportamiento anómalo en cromatografía de filtración molecular, donde se deduce un peso molecular unas 5 veces superior al que realmente posee [Haritos et al., 1989]. - En cuanto a su estructura cuaternaria, estudios de sedimentación en equilibrio en condiciones fisiológicas [Gast et al., 1995; Haritos et al., 1989] demostraron que la ProTα se encuentra en forma de monómero. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 11 - Otras características estructurales destacables de la ProTα con importantes implicaciones funcionales son la acetilación de la Ser-N-terminal [Goldstein et al., 1977; Michalewsky et al., 1983; Sburlati et al., 1993; Nogueira & Freire, 1985], la presencia de una señal de localización nuclear en su extremo Cterminal (TKKQKT) [Gómez-Márquez & Segade, 1988; Manrow et al., 1991; Rubtsov et al., 1997] y la existencia en su secuencia de lugares de fosforilación para la caseín kinasa 2 (CK-2) en sus extremos amino y carboxiterminal [Barcia et al., 1992] (figura 2B). Entre las proteínas más reseñables que presentan homología con la ProTα se encuentra la paratimosina α, un péptido inicialmente aislado a partir de extractos tímicos de rata [Haritos et al., 1985b, c], que se halla distribuido en varios tejidos de mamíferos [Clinton et al., 1989] y presenta una similitud del 43% con la ProTα [Komiyama et al., 1986], y que se ha demostrado que interviene en el metabolismo de carbohidratos [Brand & Heinickel, 1991; Brand et al., 1991]. Asimismo, la ProTα presenta un 47% de homología parcial con la proteína nuclear no histónica HMG1 [Otero., 1993]. Además, su dominio acídico central la asemeja a ciertos péptidos nucleares que interactúan con histonas, como la nucleoplasmina [Laskey et al., 1978], N1/N2 [Kleinschmidt et al., 1986], la nucleolina [Lapeyre et al., 1987] o la nucleofosmina [Chang et al., 1989]. La no detección por Haritos et al., 1984a, de la Tα 1 en extractos de timo de rata en condiciones de inhibición de la proteolisis, llevó a la hipótesis de que la ProTα era el único péptido nativo presente en las células, y que la Tα 1 y otros péptidos relacionados serían artefactos producidos por la rotura incontrolada de la ProTα durante el proceso extractivo, y no el resultado de una proteolisis específica en la célula [revisado en Szabo & Weksler, 1992]. Sin embargo, investigaciones en nuestro laboratorio demostraron la presencia simultánea de la ProTα y la Tα 1 en extractos de timo de ternera obtenidos en condiciones de inhibición drástica de la proteolisis [Freire et al., 1985; Franco et al., 1992], lo que demostraba la producción natural de las timosinas α a partir de la ProTα. La fuerte asociación de la Tα 1 con otros componentes de los Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 12 extractos obtenidos por desnaturalización térmica parece ser la causa de que no fuese detectada por Haritos et al., en los sobrenadantes de estos extractos. Figura 2. Secuencia de la ProTα αα α. Panel A: secuencia de aminoácidos de las timosinas α obtenida por traducción in vitro de mRNA de timo de ternera. En negrita se muestra la secuencia de la Tα 1 , dentro de la cual los primeros 24 aminoácidos señalados en cursiva se corresponden con la secuencia de la desTα 1 , mientras que la secuencia completa de los 35 aminoácidos se corresponde con la Tα 11 . Panel B: secuencia de aminoácidos de la ProTα de rata. En negrita se muestra la secuencia de la Tα 1 y en letra cursiva la región de residuos ácidos. Ac indica el grupo acetilo, y los asteriscos marcan la señal de migración nuclear. Las secuencias subrayadas se corresponden con las señales de fosforilación para la CK-2. Las flechas marcan los residuos fosforilados por la quinasa que fosforila a la ProTα in vivo. Panel C: comparación de la estructura primaria de la ProTα humana (2 isoformas), de rata, murina y bovina. En negrita y minúscula se señalan los aminoácidos no conservados con respecto a la ProTα humana. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 13 Los primeros estudios sobre la expresión de la ProTα en diferentes tejidos se llevaron a cabo mediante técnicas de inmunofluorescencia y de radioinmunoensayo. Utilizando la técnica de radioinmunoensayo, la ProTα se ha localizado fundamentalmente en timo, aunque también se ha encontrado en cerebro, hígado, riñón, pulmón y bazo de rata [Haritos et al., 1984b]. En humanos se ha inmunodetectado en timo [Dalakas et al., 1981], encontrándose altos niveles en leucocitos y, en muy pequeña cantidad, en plasma [Panneerselvam et al., 1987], lo cual se atribuyó a contaminaciones a partir de la fracción leucocitaria. El estudio de la distribución de la ProTα en los diferentes tejidos de ratón realizado en nuestro laboratorio [Franco et al., 1992] es coincidente con los niveles de mRNA [Bustelo et al., 1991]. Estos niveles fueron profundamente estudiados y mostraron que la ProTα se expresa principalmente en tejidos linfoides (figura 3). Además, el estudio de la expresión en otros tejidos y células demostró que la ProTα es expresada exclusivamente en tejidos de mamíferos. Figura 3. Distribución de la ProTα y expresión del gen de esta proteína en diversos tejidos de ratón. A) [Franco et al., 1992]. B) [Bustelo et al., 1991]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 14 Cabe destacar que la ProTα es sintetizada en polisomas libres y carece de secuencia de señal secretora [Eschenfeldt et al., 1989], lo que indica que posee un sitio intracelular de acción, o que su liberación al medio extracelular ocurre por un mecanismo no convencional de secreción. Por otra parte, la presencia de la ProTα en el suero [Panneerselvam et al., 1987] y en los sobrenadantes de cultivos de timocitos [Franco et al., 1989] debería, quizás, ser atribuida a la liberación de las células tímicas y otros tipos celulares a causa de la apoptosis. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 15 4. GENES DE LA PROTα Un completo estudio de la estructura del gen de la ProTα humana ha sido realizado [Eschenfeldt et al., 1989] con el objetivo de identificar los miembros de la familia génica de esta proteína. En humanos, el gen para la ProTα forma parte de una familia génica de 6 miembros en la que se incluyen 5 pseudogenes procesados, que carecen de intrones y no parece que produzcan transcritos in vivo [Manrow et al., 1992; Rubtsov & Vartapetian, 1995], con los que posee una homología que varía entre el 30-90%. Ninguno de ellos contiene secuencia codificadora para un péptido señal amino-terminal. El gen que contiene intrones (4), exones (5) y las señales regulatorias clásicas, parece ser la única fuente de mRNA de la ProTα [Eschenfeldt et al., 1989]. Tiene un tamaño de 5 kilobases. Como regiones reguladoras de la transcripción presenta una caja TATA, una región rica en GC y dos cajas CCAAT [Eschenfeldt et al., 1989]. El gen ha sido mapeado en el cromosoma 2 humano [Szabo et al., 1993]. Asimismo, se comprobó la existencia de un lugar de corte y empalme alternativo entre el segundo intrón y el tercer exón, que es el proceso responsable de la generación de las dos isoformas descritas para la ProTα a partir del producto de transcripción de un único gen (el mRNA de la ProTα en fibroblastos humanos tiene un codón interno de glutamato extra (Glu 39 ) con respecto al mRNA de bazo) [Manrow & Berger, 1993; Goodall et al., 1986; Gómez-Márquez et al., 1989b]. Las rutas de señalización intracelular que controlan la expresión del gen de la ProTα no han sido bien caracterizadas. Sin embargo, se han propuesto varios factores de transcripción que regularían su expresión, incluyendo E2F [Szabo et al., 1993] y c-myc [Eilers et al., 1991; Desbarats et al., 1996; Gaubatz et al., 1994] como reguladores positivos, y el factor inhibidor de tumores p53 como un regulador negativo [Zhao et al., 2000]. Así, E2F puede controlar directamente la expresión de la ProTα en el ciclo celular mediante la activación del promotor del gen de esta proteína. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 22 actividad proliferativa de estas células, con un incremento de la concentración del mRNA de esta proteína en células en división; sin embargo, este incremento era moderado en la mayoría de los tipos celulares estudiados [Bustelo et al., 1991]. La correspondencia observada entre los niveles del mRNA de la ProTα y los niveles de la propia ProTα confirmaron la traducción activa del mensajero de la ProTα en los diferentes tejidos. De esta manera, la expresión del gen de la ProTα en linfocitos con mayor capacidad proliferativa era superior a la que presentaban los linfocitos con menor capacidad para proliferar. Este resultado parecía establecer una dependencia entre los niveles de la concentración celular de la ProTα y la actividad proliferativa de las células. Esta consideración se vio confirmada por los experimentos en los que se analizó la variación de la expresión del gen de la ProTα en células en las que se indujo la actividad proliferativa in vitro e in vivo [Bustelo et al., 1991]. Los elevados niveles de mRNA de la ProTα permanecen casi invariables a lo largo del ciclo celular, aunque se aprecia un incremento en el tránsito de G1-S; sin embargo, la expresión del gen no parece estar ligada a la síntesis de DNA [Bustelo et al., 1991]. Este patrón ha sido corroborado por otros estudios en los cuales los niveles del mRNA o de la ProTα fueron determinados [Zalvide et al., 1992; Vareli et al., 1996; Conteas et al., 1990; Rosón et al., 1990]. No obstante, no hay evidencias de que la expresión de la ProTα regule directamente la mitosis, ya que la presencia de su mRNA no es suficiente para promover la progresión a lo largo del ciclo celular [Álvarez et al., 1993]. En este sentido, la transfección de poblaciones celulares con un oligonucleótido antisentido complementario al mRNA de la ProTα provoca la paralización de la proliferación celular, con un efecto reversible [Sburlati et al., 1991]. Trabajos posteriores mostraron que la transfección de poblaciones de células HL-60 con oligonucleótidos antisentido de la ProTα produce una inhibición de la proliferación celular a bajas concentraciones y una inducción de la apoptosis a altas concentraciones [Rodríguez et al., 1999]. También en células HL-60 y NIH3T3 se observó que la sobreexpresión de la ProTα acelera la proliferación y retarda la diferenciación celular [Rodríguez et al., 1998; Wu et al., 1997]; complementando los datos que demuestran que los niveles del mRNA de la ProTα, elevados en las células en crecimiento Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 23 logarítmico, descienden cuando las células son inducidas a su diferenciación terminal [Smith et al., 1993; Dosil et al., 1993]. Los detalles moleculares de la relación existente entre la expresión del gen de la ProTα y la proliferación celular comenzaron con el descubrimiento de la capacidad de c-myc, una proteína involucrada en división la celular, para promover la transcripción del gen de la ProTα [Eilers et al., 1991; Gaubatz et al., 1994]. Aunque este hallazgo fue cuestionado [Mol et al., 1995], posteriores resultados han confirmado el efecto de la proteína c-myc en la regulación de la expresión del gen de la ProTα [Wu et al., 1997; Mori et al., 1993; Vareli et al., 1995; Lutz et al., 1996; Kinoshita et al., 1997; Ben-Yosef et al., 1998]. El hallazgo de un incremento de la expresión del gen de la ProTα en células tumorales refuerza la relación de esta proteína con la proliferación celular [Eschenfeldt et al., 1986; Tsitsiloni et al., 1993; Gómez-Márquez et al., 1989b; Wu et al., 1997; Álvarez et al., 1993; Mori et al., 1993]. Los linfocitos de pacientes con linfomas, células con una alta actividad mitótica, poseen unos niveles de mRNA de la ProTα 4-6 veces superiores a los de las células normales [Gómez-Márquez et al., 1989b; Conteas et al., 1990; Álvarez et al., 1993]. Paralelamente, la forma en la que la ProTα podría relacionarse con los mecanismos bioquímicos de la división de las células fue investigada analizando el comportamiento de esta proteína en las diferentes fases del ciclo celular, utilizando para ello linfocitos de bazo de ratón. El estudio del comportamiento de la ProTα en la transición de las fases G 0 -G 1 de los linfocitos de bazo, correspondientes con las etapas iniciales de la señalización de la célula por factores de crecimiento, propició un importante descubrimiento en nuestro laboratorio referido a la evolución molecular de la ProTα en este período: como consecuencia de la activación proliferativa de los linfocitos, la ProTα resultaba fosforilada [Barcia et al., 1992; Barcia et al., 1993]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 24 Por otra parte, se ha descrito que la ProTα estimula la fosforilación dependiente de Ca +2 del factor de elongación EF-2 durante la mitosis [Vega et al., 1998]; sin embargo, dicho efecto ha sido cuestionado [Enkemann et al., 1999], por lo que parece improbable que la ProTα actúe como un efector metabólico que modula la actividad de enzimas dependientes de Ca +2 a lo largo del ciclo celular. De todas estas aportaciones, puede deducirse que la función de la ProTα está relacionada con la actividad proliferativa de las células, y los resultados derivados son consistentes con la teoría de que la ProTα es necesaria para la división celular. Asimismo, la demostrada capacidad de la ProTα para migrar al núcleo y los datos que muestran que la actividad proliferativa celular es concomitante con un incremento de la concentración nuclear de la ProTα [Conteas et al., 1990] parecen indicar que la función de esta proteína en la división celular es realizada en el núcleo. 6.2. PROTIMOSINA α Y ACTIVIDAD REMODELADORA DE LA CROMATINA i. Interacción de la protimosina α con las histonas La caracterización de proteínas que interaccionan con la ProTα en el núcleo de la célula ha propiciado progresos en la elucidación del mecanismo por el cual la ProTα está involucrada en el metabolismo nuclear. Así, las histonas son las proteínas nucleares cuya capacidad para interaccionar in vitro con la ProTα fue demostrada en primer lugar. Algunos ensayos han indicado que la ProTα interacciona solo con la histona H1 [Papamarcaki & Tsolas, 1994], mientras que otros experimentos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que puede interactuar con H1 y las histonas del octámero [Díaz-Jullien et al., 1996; Covelo et al., 2006]; sin embargo, la ProTα interactúa fuertemente con éstas últimas y débilmente con H1 [Freire et al., 2001; Díaz-Jullien et al., 1996]. Estas discrepancias se acentuaron con los resultados de experimentos dirigidos a la identificación de proteínas de unión a la ProTα en extractos de células NIH3T3 usando técnicas de inmunoafinidad (columnas de afinidad con anticuerpos anti-ProTα inmovilizados): las columnas retenían a la Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 25 ProTα y H1, pero la identidad de otras proteínas retenidas no fue investigada [Karetsou et al., 1998]. De este modo, los experimentos que indican la interacción de la ProTα con H1 no constituyen evidencias en contra de la interacción de esta proteína con otras histonas, ya que en estos casos no se habían realizado ensayos de inmunoprecipitación cruzada ni tampoco analizado la presencia de otras histonas en los componentes con afinidad por la ProTα. Así, la demostración de la capacidad de la ProTα para interactuar in vitro con las histonas [Díaz-Jullien et al., 1996] constituyó un paso importante en la caracterización funcional de esta proteína. En la interacción con estas proteínas, más fuerte con las histonas H3 y H4, se ve implicada tanto la región menos acídica de la ProTα, localizada en su extremo N-terminal, como la secuencia poliacídica (con glutámico y aspártico entre los residuos 41 y 85) situada en la parte central de su estructura (figura2B). En este sentido, en nuestro laboratorio hemos encontrado que la Tα 1 , el péptido correspondiente a los 28 primeros aminoácidos de la secuencia de la ProTα, también se une in vitro a las histonas del octámero con gran afinidad [Díaz-Jullien et al., 1996], sugiriendo que esta región puede estar involucrada en la interacción in vivo de la ProTα con las histonas. Esta capacidad de interacción de la ProTα con las histonas, similar a la que presentan otras proteínas acídicas de función nuclear como N1 y N2 de Xenopus [Kleinschmidt & Franke, 1982], que también muestran una afinidad preferente por las histonas H3 y H4, y otras proteínas de estructuras similares a la ProTα que han sido descritas en anfibios [Dingwall et al., 1987] y levaduras [Ishimi & Kikuchi, 1991], es muy significativa a la hora de establecer una relación funcional de esta proteína en el proceso de la organización estructural del cromosoma y, más concretamente, del ensamblaje del nucleosoma. Diversos experimentos han señalado que la ProTα es capaz de inducir el ensamblaje de los nucleosomas in vitro [Díaz-Jullien et al., 1996] (figura 5). Esta capacidad es independiente de H1 y dependiente de otras proteínas separadas en extractos de linfocitos mediante cromatografía de afinidad sobre ProTα (afines también a ATP). Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 26 Figura 5. Emsamblado de nucleosomas “in vitro” regulado por la ProTα. La posición I indica una estructura del DNA en forma lineal y la posición II indica una organización nucleosómica del DNA. En células HL-60 en las que se ha inducido la sobreexpresión de la ProTα se ha demostrado un incremento en la accesibilidad de la nucleasa micrococal a la cromatina [Gómez-Márquez & Rodríguez, 1998]; sugiriendo que el patrón observado de mononucleosomas y multímeros de mononucleosomas es atribuible a la eliminación de la histona H1 de la cromatina mediada por la ProTα, originando el desensamblaje de la cromatina detectado microscópicamente en estas células [Boán et al., 2001]. Sin embargo, otros grupos fallaron a la hora de demostrar la interacción de la ProTα con H1 en cromatina reconstituida in vitro [Karetsou et al., 1998]; en su lugar estos autores encontraron que la ProTα no era efectiva para prevenir la interacción de H1 con la cromatina. Estos estudios apoyan la implicación de la ProTα en la organización de la cromatina a través de su interacción con las histonas y de su capacidad para cooperar en el ensamblaje de los nucleosomas in vitro y en la alteración de la estructura cromosómica. Además, mediante experimentos de coinmunoprecipitación, en nuestro laboratorio se ha demostrado la interacción in vivo de la ProTα con las histonas del octámero en el nucleoplasma de linfocitos en proliferación (células NC37) [Covelo et al., 2006]. Estos resultados indican que dicha interacción ocurre con las histonas H3, H2A, H2B y H4; mientras que la histona H1 no fue detectada en los componentes separados por Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 27 afinidad a ProTα-Sepharosa. Las histonas del octámero forman parte de un complejo nuclear multiproteico, separado por cromatografía de afinidad, cuyos componentes incluyen enzimas modificadoras de histonas como las acetiltransferasas de H3 y H4 y la metiltransferasa de H3, proteínas de unión a RNA/DNA como las ribonucleoproteínas (hnRNPs) A3, A2/B1 y R y las DNA helicasas de tipo II (dependientes e independientes de ATP), y proteínas del citoesqueleto como la β-actina y la vimentina. La presencia de acetiltransferasas (HAT) y metiltransferasas (HMT) de histonas en este complejo sugiere una posible función de la ProTα en la modificación estructural de H3 y H4, las histonas más significativas en el control de la actividad de la cromatina. Los estudios que demuestran la habilidad de la ProTα para interaccionar con proteínas que se unen a HATs, como el antígeno nuclear del virus Epstein-Barr [Cotter & Robertson, 2000; Subramanian et al., 2002] y la proteína de unión a CREB [Karetsou et al., 2002] (ambas con afinidad por la acetiltransferasa p300), refuerzan esta teoría. Debido a las propiedades de las hnRNPs, especialmente aquellas derivadas de su habilidad para inducir agregaciones de proteínas y reconocer secuencias discretas del DNA y RNA [Krecic & Swanson, 1999], su presencia en el complejo nuclear puede indicar la implicación de estas proteínas en la actividad de las HATs y HMTs y/o en otros aspectos de la actividad de la ProTα en la cromatina. De hecho, experimentos en nuestro laboratorio han demostrado la interacción directa de la ProTα con las hnRNP A2/B1 y A3 (resultados no publicados). Las características estructurales y funcionales de la ProTα sugieren que esta proteína forma parte del grupo de proteínas de unión a histonas, proteínas acídicas que participan en mecanismos nucleares y citoplasmáticos, relacionados con la regulación de la cromatina y en algunos casos con la apoptosis. Otros miembros de este grupo son NAP1/NAP2 [Ishimi et al., 1987; Rodríguez et al., 2004], CAF-1 [Kaufman et al., 1995], SET [Seo et al., 2001] y pp32 [Seo et al., 2001; Chen et al., 1996]: estas proteínas han sido implicadas en la regulación de la transcripción, en la replicación del DNA y en el ensamblaje de los nucleosomas en las células de mamíferos. Además, la ProTα muestra una marcada homología estructural con proteínas de unión a histonas descritas en otros organismos [Gómez-Márquez et al., 1988], especialmente la nucleoplasmina de anfibios [Dingwall et al., 1987]. La señal cariofílica en su extremo C- Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 28 terminal, su larga región acídica central e incluso la propiedad de ser fosforilada son semejanzas que comparten la ProTα y estas proteínas de unión a histonas [Earnshaw, 1987]. Ya que se ha demostrado que la nucleoplasmina y otras proteínas acídicas similares están involucradas en la movilidad del octámero de histonas dentro de la célula y en el remodelado de la cromatina [Philpott et al., 2000], es plausible que la ProTα tenga una función similar en las células de mamíferos. En este sentido, la descondensación de la cromatina producida por la ProTα facilitaría la unión de la RNA polimerasa II al DNA y activaría la transcripción; de hecho, la ProTα colocaliza en el núcleo con esta enzima activa [Enkemann et al., 2000a; Vareli et al., 2000]. Sin embargo, durante la mitosis, la ProTα permanece excluida del volumen ocupado por el DNA, probablemente para favorecer la condensación de éste [Enkemann et al., 2000a]. No obstante, la función de la ProTα en el remodelado de la cromatina en las células de mamíferos no está completamente clara. Así, otros autores han investigado la posibilidad de que la ProTα funcione como una proteína chaperona de la histona H1 [George & Brown, 2010] definiéndola como un factor que se asocia directamente con esta histona y facilita su transferencia sin permanecer en el complejo final. Estos autores sugieren que la ProTα, componente de un complejo mayor, actuaría como una chaperona de H1 para promover su intercambio entre sitios de unión a la cromatina y facilitar su desplazamiento e incorporación in vivo durante la replicación del DNA. De este modo, la ProTα modularía la interacción de H1 con la cromatina provocando su remodelado o descondensación y potenciaría los procesos asociados de transcripción y replicación [Gómez-Márquez, 2007; Trumbore & Berger, 2000], en relación con su función en la proliferación celular. Por otro lado, la habilidad de la ProTα para interactuar con las histonas está probablemente facilitada por su alta concentración intracelular, similar a la de las proteínas del octámero (aprox. una molécula de ProTα por nucleosoma) [Palvimo & Linnala-Kankkunen, 1990; Sburlati et al., 1990, 1993]. Más argumentos a favor de la relación de la ProTα con la actividad de la cromatina vienen determinados por la caracterización de otras proteínas que interactúan con ella: el antígeno nuclear del Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 29 Epstein-Barr virus (EBNA3C), el coactivador de la transcripción CBP (proteína de unión a CREB), la acetiltransferasa de histonas p300, la oncoproteína SET, el factor de transcripción STAT3 y el represor del receptor de estrógeno (REA). ii. Interacción de la protimosina α con la proteína de unión a CREB (CBP) y potenciación de la transcripción La ProTα interacciona con el coactivador de la transcripción CBP in vivo e in vitro y estimula la transcripción génica a través de la reorganización de la estructura de la cromatina [Karetsou et al., 2002]. El sitio de interacción ha sido mapeado en el extremo N-terminal de CBP (residuos1-771) y en una región rica en glutámico de la ProTα. Esta unión podría ser debida a las características específicas de la secuencia acídica y/o a su conformación local; sin embargo, en las condiciones experimentales empleadas en los estudios de interacción este motivo no adopta ninguna estructura secundaria [Muñoz & Serrano., 1995]. Esta predicción concuerda con los trabajos experimentales que mostraban que la ProTα nativa se mantiene como una cadena no plegada [Gast et al., 1995; Uversky et al., 1999]. Por lo tanto, se concluyó que la interacción CBP-ProTα estaba mediada a través de regiones acídicas extendidas de la ProTα. Evidencias experimentales muestran que la sobreexpresión de la ProTα potencia la actividad de transcripción de promotores dependientes de CBP como TRE y NFK B; sin embargo, otro blanco de CBP, el promotor del gen de la clase II de MHC [Kretsovali et al., 1998], no se ve afectado por la ProTα (lo que indica que otros factores adicionales, el estado de la cromatina del promotor y/o la composición del complejo coactivador están implicados en el mecanismo) [Karetsou et al., 2002]. Se ha postulado que el efecto de la ProTα en la transcripción podría ser ejercido sobre el estado de la cromatina del promotor o sobre la actividad enzimática de CBP, que está directamente involucrado en la activación de la transcripción [Martínez-Balbas et al., 1998]. Al demostrarse en ensayos de actividad acetiltransferasa in vitro usando las histonas del octámero como sustrato que la actividad de CBP no era afectada por la ProTα, se ha apuntado que la cromatina es el posible blanco de la función de esta Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 30 proteína. La ProTα podría interaccionar con regiones promotoras mediadas por CBP y seguidamente promover la reorganización de H1 o el desplazamiento dirigido al desensamblaje de la fibra compacta de cromatina de 30nm [Karetsou et al., 1998]; también evitaría el reordenamiento de H1 y mantendría la conformación de la cromatina parcialmente extendida, estado necesario para el paso de la RNA polimerasa II. iii. Interacción de la protimosina α con la acetiltransferasa de histonas p300 Se ha encontrado que la acetiltransferasa de histonas p300, una proteína con gran homología a CBP, se une a la ProTα a través de su región C-terminal [Cotter & Robertson., 2000] colocalizando en dominios subnucleares discretos, y sugiriendo la implicación de ésta última en la regulación de la transcripción y la acetilación de histonas. Además, algunos trabajos han confirmado que la ProTα se concentra en dominios nucleares que se superponen o engloban a sitios de transcripción activa [Vareli et al., 2000]. La interacción de la ProTα con la acetiltransferasa p300 fue confirmada mediante ensayos de coinmunoprecipitación [Subramanian et al., 2002]. Esta interacción y la actividad de acetilación resultante está a su vez regulada por la interacción de los complejos ProTα-p300 con el antígeno nuclear 3C del Epstein-Barr virus (EBNA3C) [Cotter & Robertson., 2000]. Cuando EBNA3C es reclutado por estas proteínas, la actividad mediada por p300 y el complejo general de activación de la transcripción son modulados por el desplazamiento de componentes específicos y/o la modificación del tamaño de este complejo. Además, se ha demostrado que la ProTα y EBNA3C interaccionan con p300 específicamente en regiones idénticas a las de unión de otras proteínas reguladoras de la transcripción con esta acetiltransferasa: como E1A, E6, cjun y E2F [Shikama et al., 2000]. En base a estos datos se ha propuesto que la ProTα participaría en la decondensación de la cromatina y la acetilación de las histonas del octámero, resultando en la activación de la transcripción [Subramanian et al., 2002]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 31 iv. Interacción de la protimosina α con el represor del receptor de estrógeno La ProTα puede potenciar específicamente la activación de la transcripción mediada por el receptor de estrógeno eliminando el represor REA y favoreciendo el reclutamiento del coactivador SRC-1 [Martini et al., 2000]. Ya que el receptor de estrógeno es dependiente de CBP [Wang et al., 2001], no debe ser desechada la posibilidad de que la ProTα pueda proveer al receptor de elevadas concentraciones de CBP y SRC-1. De acuerdo con estos resultados, se ha concluido que la ProTα no interactúa directamente con este receptor, pero modula la actividad de su complejo activador. v. Asociación de la protimosina α con la oncoproteina SET e implicación en la descondensación de la cromatina La oncoproteina SET (también denominada TAF-Iβ, PHAPII, I 2PP2A ) ha sido identificada como una proteína de interacción con la ProTα [Karetsou et al., 2004]. SET pertenece a una familia conservada de chaperonas de histonas (factores de ensamblaje de nucleosomas, NAP S ) que median en el trasporte y almacenaje de histonas, en el ensamblado de nucleosomas y en la descondensación de la cromatina espermática; y posee una larga secuencia poliacídica en su extremo C-terminal. Trabajos de varios autores han indicado que SET se une a histonas, remodela la estructura de la cromatina [Nagata et al., 1995; Okuwaki et al., 1998] e inhibe la acetilación de las histonas como componente del complejo INHAT [Seo et al., 2001]. Se ha propuesto que la interacción entre SET y la ProTα podría estar promovida y/o estabilizada in vivo por CBP. Como ya se ha señalado anteriormente, CBP es una proteína multifuncional que interactúa con una gran variedad de factores de transcripción [Bannister & Kouzarides., 1996], y además se ha detectado que se une de forma directa con SET. Estos autores indican que CBP podría existir en el complejo ProTα/SET actuando como una molécula puente entre estas proteínas acídicas, las cuales regularían la estructura de la cromatina. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 38 que inhibe la formación del apoptosoma bloqueando la liberación de citocromo c desde la mitocondria [Kluck et al., 1997], se ha propuesto que la ProTα puede promover la supervivencia celular a través de la ruta antiapoptótica de Bcl-2 [Letsas et al., 2005]. Además, la asociación de la ProTα con la proteína antiapoptótica STAT3 podría indicar un programa anti-apoptótico diferente que implicaría la activación transcripcional de la proteína Bcl-xl [Battle & Frank, 2002; Yang et al., 2004]. Finalmente, se ha propuesto que la ProTα, a través de su interacción con CBP, realizaría su actividad antiapoptótica estimulando la transcripción del factor NF-κB. Este factor puede inducir la expresión de proteínas que inhiben la apoptosis como TRAF, IAPs o proteínas de la familia Bcl-2 [Bui et al., 2001; Shishodia et al., 2002]. ii. Regulación de la apoptosis mediante el complejo p8/protimosina α La ProTα y p8 son dos pequeñas proteínas sin estructura secundaria estable en solución y que muestran carga electrostática opuesta a pH neutro. Así, varios estudios han demostrado que interactúan entre ellas y parecen promover una estabilización mutua de sus estructuras en una conformación particular, resultando en un complejo envuelto en la regulación de la apoptosis [Malicet et al., 2006]. Se han encontrado otros casos de proteínas desorganizadas estructuralmente que adquieren una configuración estable después de su unión a una molécula correcta, como algunos factores de transcripción eucarióticos que presentan una región básica larga no estructurada y que pueden organizarse en una conformación helicoidal después de su asociación al DNA [Weiss et al., 1990; Encinar et al., 2001]. La interacción entre p8 y la ProTα fue confirmada mediante ensayos de coinmunoprecipitación en células 293T. Sorprendentemente, ni el extremo N-terminal ni el C-terminal de la ProTα muestran interacción con p8, indicando que la unión requiere de la mayor parte, sino toda, de la secuencia de la ProTα. Además, ensayos de fluorescencia y la espectroscopía NMR han mostrado que la unión de p8 a esta proteína está mediada por regiones de residuos de tirosina en la secuencia de p8 [Malicet et al., 2006]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 39 Además, se ha demostrado que la eliminación celular de la ProTα o p8 mediante el empleo de sus RNAs interferentes correspondientes y el tratamiento con estaurosporina resulta en un gran incremento de la actividad de las caspasas 3, 7 y 9. Sin embargo, la sobreexpresión de la ProTα o p8 provoca una moderada disminución de las actividades de las caspasas 3 y 7. Además, estas actividades fueron fuertemente inhibidas cuando p8 y la ProTα se sobreexpresaron concomitantemente, y el número de núcleos apoptóticos disminuyó [Malicet et al., 2006]. Estos resultados sugieren que cada una de estas proteínas es indispensable para el mecanismo de inhibición de la apoptosis y que se requiere la formación de un complejo heterodimérico para ejercer dicha actividad. iii. Actividad antiapoptótica de la protimosina α regulada por la proteína HuR Durante la respuesta celular al estrés genotóxico que puede conducir a la muerte celular programada, ciertas proteínas que participan en la supervivencia celular, regulan la apoptosis o controlan la reparación de macromoléculas dañadas continúan sintetizándose [Kaufman, 2002]. La proteína HuR ha sido caracterizada como una proteína de unión a RNA (RBP), perteneciente a la familia Hu/ELAV, que participa en el transporte, estabilización y potenciación de la traducción de los mRNAs transcritos durante la expresión génica (cfos, p21, c-myc, p27, p53, etc) de respuesta al estrés [Millard et al., 2000; Brennan & Steitz, 2001; Lal et al., 2004; Gorospe, 2003]. En este sentido, se ha encontrado que, bajo estímulos apoptóticos, la proteína HuR se asocia con el mRNA de la ProTα y lo protege de la degradación en el citoplasma, dirigiéndolo a los ribosomas y potenciando su traducción [Lal et al., 2004, 2005]. Así, en células HeLa tratadas con luz UV como estímulo apoptótico, la movilización del mRNA de la ProTα al citoplasma y su asociación con la proteína HuR se incrementan de forma dramática. Además, la concentración citoplasmática y la traducción de la ProTα durante la apoptosis aumenta considerablemente en células que sobreexpresan la proteína HuR [Lal et al., 2005]. Por lo tanto, estos resultados demuestran una asociación molecular y funcional entre la expresión y los efectos antiapoptóticos de la Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 40 ProTα y la proteína HuR, incidiendo en que la función inhibitoria de esta última sobre la apoptosis depende de la potenciación de la expresión y traducción de la ProTα. Este mecanismo de regulación post-transcripcional constituiría un programa de supervivencia alternativo al implementar la actividad antiapoptótica de la ProTα como bloqueante del ensamblaje del apoptosoma [Jiang et al., 2003]. iv. La protimosina α y SET como reguladores de la apoptosis La proteína SET es un componente del complejo INHAT, que regula la modificación de las histonas y la transcripción génica y tiene una función inhibitoria sobre p300/CBP y PCAF [Seo et al., 2001]. Aparte de estas propiedades de interacción con las histonas y su participación en el ensamblaje de nucleosomas, SET modula la función nuclear de HuR, una proteína de unión a RNA implicada en el transporte y estabilidad de mRNAs [Brennan et al., 2000], y en la traducción y concentración citosólica del mRNA de la ProTα en condiciones apoptóticas [Lal et al., 2005]. Además, SET y la ProTα son oncoproteínas de distribución nuclear-citoplasmática que presentan actividad antiapoptótica: se ha descrito que SET inhibe la actividad DNasa en la apoptosis inducida por Granzima A (que provoca daño independiente de caspasas en el DNA y se caracteriza por cortes de cadena simple) [Fan et al., 2003], mientras que la ProTα parece estar involucrada en la inhibición de la activación de la caspasa 3 por el apoptosoma [Jiang et al., 2003; Qi et al., 2010]. Estos estudios apuntan, por lo tanto, a una función de la ProTα y de SET relacionada con la regulación de la apoptosis. v. Fragmentación de la protimosina α en apoptosis Algunos autores han presentado evidencias de que la ProTα está sujeta a una fragmentación mediada por la caspasa 3 como consecuencia de la progresión de la apoptosis [Evstafieva et al., 2000; Enkemann et al., 2000b]. El corte en el extremo Cterminal de la proteína rompe su señal de localización nuclear y resulta en un derivado truncado (1-99) de la ProTα que carece de la capacidad de acumularse en el núcleo y aparece distribuido dentro de la célula. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 41 Sin embargo, el citoplasma celular no parece ser el punto final de la relocalización de la ProTα truncada (tProTα). Ensayos inmunológicos han mostrado una ruta en células apoptóticas que dirige la externalización de la tProTα [Evstafieva et al., 2003]. De esta manera, la ProTα (fragmento 1-99) parece ser un marcador de superficie específico de células apoptóticas. Estos autores afirman también que no deben excluirse otros procesados proteolíticos del fragmento de ProTα en su ruta hacia el exterior de la membrana celular, ya que el corte por caspasas es un proceso conocido para los precursores de secreción de la Interleuquina 1β y 18 (caspasa 1) [Kuida et al., 1995; Ghayur et al., 1997], de la interleuquina 16 (caspasa 3) [Zhang et al., 1998] y de EMAP II, una citoquina inflamatoria reclutadora de macrófagos (caspasa 7) [Knies et al., 1998; Shalak et al., 2001]. No obstante, permanece sin establecerse si el marcaje de superficie mediado por caspasa de las células apoptóticas con el derivado de la ProTα tiene función fisiológica, aunque se ha especulado que ciertas poblaciones de macrófagos podrían usar el fragmento externalizado de la ProTα, solo o asociado con otras proteínas, como una señal fagocítica [Evstafieva et al., 2003]. Además, se ha demostrado que la producción ectópica de la ProTα y sus fragmentos derivados (con distribución nuclear o nuclear-citoplasmática) protege a las células HeLa de la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral (TNF). Aunque otra función diferente se ha sugerido también para los derivados truncados de la ProTα: así, en fases tardías de la apoptosis, la tProtα cargada negativamente interactuaría con el citocromo c de carga positiva formando un complejo que anularía las propiedades antioxidantes de este citocromo y su función como transportador de electrones entre la membrana externa e interna de la mitocondria [Markova et al., 2003]. Este mecanismo parece ser dependiente de los niveles de tProTα en el citosol y ocurrir a bajas concentraciones; a elevadas concentraciones se ha especulado que la tProTα participaría en la inhibición de la apoptosis. No obstante, la fragmentación de la ProTα mediada por la caspasa 3 ha sido descrita únicamente en células HeLa, varias horas después del inicio del proceso apoptótico [Evstafieva et al., 2003], y, además, en nuestro laboratorio no se ha observado este tipo de proteolisis en linfocitos (datos no publicados). Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 42 Estos resultados, junto con la observación de que el tratamiento celular con oligonucleótidos antisentido de la ProTα es capaz de inducir apoptosis [Rodríguez et al., 1999], sugieren que la eliminación de la ProTα de forma natural (mediante fragmentación por caspasas) o artificial (por arresto de la traducción de su mRNA) puede inducir el paso de las células de la proliferación a la apoptosis. Por lo tanto, los elevados niveles de producción de la ProTα en células cancerosas podrían no solo mantener el estado proliferativo celular sino también proteger a estas células de la entrada en la ruta de muerte celular programada. En este sentido, la figura 7 representa las principales rutas de división y apoptosis celular en las que se ha descrito la participación de la ProTα. Figura 7. Modelo selectivo de las proteínas que regulan o son reguladas por la ProTα implicadas en rutas de proliferación, supervivencia y apoptosis celular [adaptado de Letsas & Lazaridis., 2006]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 43 6.4. PROTIMOSINA α Y ESTRÉS OXIDATIVO Las células animales contrarrestan el estrés oxidativo mediante la expresión coordinada de una batería de genes que codifican enzimas detoxificantes y proteínas antioxidantes [revisado en Hayes & McMahon, 2001]. La expresión de estos genes es activada por el factor de transcripción Nrf2, que reconoce sus regiones reguladoras (elementos de respuesta antioxidante, AREs) [Rushmore et al., 1991; McMahon et al., 2001; Kensler et al., 2007]. Un punto central en la regulación de Nrf2 lo constituye su interacción con el inhibidor Keap1, que previene la migración nuclear de este factor de transcripción e induce su ubiquitinación y degradación proteosómica [Kang et al., 2004; McMahon et al., 2003; Zhang & Hannink, 2003; Kobayashi et al., 2006; Kaspar et al., 2009]. La inducción del estrés oxidativo provoca la desestabilización de la unión Nrf2-Keap1, probablemente por modificaciones post-traduccionales de sus constituyentes (fosforilación por la PKC o PERK), permitiendo la liberación de Nrf2 para la activación de genes citoprotectores [Huang et al., 2002; Cullinan & Diehl, 2006; McMahon et al., 2003; Zhang & Hannink, 2003; Bloom & Jaiswal, 2003]. Se ha demostrado que la ProTα interactúa con Keap1 de forma específica (in vitro e in vivo) uniéndose a su extremo C-terminal, compitiendo con Nrf2 y provocando el desplazamiento de este factor de transcripción [Karapetian et al., 2005; Padmanabhan et al., 2008; Cino et al., 2011; Hancock et al., 2012]. Estos resultados atribuyen a la ProTα el papel de disociador intranuclear del complejo Nrf2-Keap1 [revisado en Stepkowski & Kruszewski., 2011], que se encuentra en movimiento constante entre el citoplasma y el núcleo celular. La liberación de Nrf2 producida por la unión de la ProTα a este complejo es parcial en células no estresadas, provocando un nivel basal de transcripción, y está más pronunciada en células en las que se ha inducido estrés debido a la predesestabilización del complejo por modificaciones covalentes que facilitarían la disociación. Terminado el estímulo de estrés oxidativo, el exceso de Nrf2 libre es retirado del núcleo por Keap1, porque la disociación del complejo estable (no modificado) Nrf2- Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 44 Keap1 mediada por la ProTα se vuelve ineficiente de nuevo. Así, este mecanismo finalizaría la inducción de la expresión de genes protectores frente al estrés celular. Por otra parte, se ha sugerido que la ProTα potencia la respuesta de Nrf2 mediante el incremento de la transcripción de la proteína p21 dependiente de p53 [Kobayashi et al., 2006]. La proteína p21 interviene en la regulación del ciclo celular y la apoptosis: media el arresto celular en la fase G 1 -S, permitiendo procesos de supervivencia como la reparación del DNA. En el citoplasma celular, la proteína p21 se une a Nrf2 compitiendo con Keap1, atenuando la ubiquitinación e induciendo la estabilización de este factor de transcripción [Chen et al., 2009]. 6.5. PROTEOLISIS DE LA PROTIMOSINA α Cuando la ProTα fue aislada en 1984 de extractos de timo preparados en condiciones en las cuales la actividad proteolítica había sido prevenida, la Tα 1 y la Tα 11 no eran detectadas en la separación de los extractos mediante HPLC de fase reversa. Este hecho hizo que algunos autores sugiriesen que la presencia de las timosinas α derivadas de la ProTα en la TF5 era un artefacto resultante de la proteolisis incontrolada durante su preparación. En contraste, experimentos realizados en nuestro laboratorio usando isoelectroenfoque han indicado que la Tα 1 está en realidad presente en extractos de este tipo de diversos tejidos de mamíferos [Franco et al., 1992; Freire et al., 1985] (figura 3A). La proteasa capaz de procesar de forma específica la ProTα para generar la Tα 1 fue caracterizada más tarde en nuestro laboratorio como la enzima legumaína ligada a la membrana de los lisosomas [Sarandeses et al., 2003]. Esta enzima fue descubierta en mamíferos a finales de los años noventa [Chen et al., 1997], aunque ya se conocía previamente en plantas [Hara-Nishimura et al., 1993] e invertebrados [Klinkert et al., 1989]. La legumaína de mamíferos muestra elevada especifidad por un tipo de enlaces de asparagina [Dando et al., 1999]: concretamente, in vitro, la enzima únicamente corta en la secuencia de la ProTα enlaces Asn-Glu en posición 28-29 (Tα 1 ) y 35-36 (Tα 11 ). Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 45 Este hallazgo es consistente con los resultados que indican la presencia natural de la Tα 1 en diferentes tejidos animales [Franco et al., 1992], aunque el significado biológico del procesamiento de la ProTα y la presencia celular de la Tα 1 es desconocido. A juzgar por el análisis de las timosinas α en extractos celulares preparados en condiciones de drástica inhibición de la proteolisis, esta proteasa muestra incluso una especifidad mayor in vivo, ya que solo la Tα 1 era detectada, a una concentración similar a la de ProTα, mientras que no se detectaba Tα 11 (en concordancia con estudios previos en tejidos de mamíferos) [Franco et al., 1992]. Sin embargo, no puede desecharse la posibilidad de que la aparente ausencia de Tα 11 sea debida a la rápida degradación de este péptido in vivo (la no detección del fragmento 29-109 o 36-109 de la ProTα en extractos celulares es presumiblemente indicativa también de su rápida degradación in vivo). Así, la presencia de Tα 11 a bajas concentraciones en la fracción de timo de ternera TF5 [Caldarella et al., 1983] podría deberse a las características del método usado para su preparación. Las características del procesamiento in vivo de la ProTα sugieren que es realizado también por la legumaína. A la luz de estos resultados, los fallos previos en la detección de Tα 1 en extractos preparados bajo condiciones drásticas de desnaturalización [Haritos et al., 1984a] puede ser atribuido a su anómalo comportamiento cromatográfico en esas condiciones debido a su tendencia a agregarse, como evidencian otros estudios [Franco et al., 1992; Freire et al., 1985]. La amplia distribución de la Tα 1 [Franco et al., 1992] y de la legumaína [Chen et al., 1997] en diferentes tejidos sugiere que el procesamiento de la ProTα que origina Tα 1 es un proceso general en células de mamíferos. Además, tejidos que muestran una elevada actividad de la legumaína como los linfoides [Chen et al., 1997; Manoury et al., 1998] poseen unos elevados niveles de Tα 1 . La estructura primaria altamente conservada de la ProTα [revisado Freire et al., 2002], especialmente alrededor de los enlaces de asparagina/glicina que corta la legumaína, proporciona argumentos que apoyan la visión de la proteolisis de la ProTα como un proceso generalizado. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 46 Figura 8. Procesamiento proteolítico de la ProTα a Tα 1 mediado por una endopeptidasa lisosomal: la enzima legumaína. Sin embargo, no está claro si el procesamiento de la ProTα por la legumaína es un simple paso en su catabolismo o si tiene algún significado biológico. La legumaína muestra una estricta especificidad por un grupo restringido de enlaces de asparagina, lo que ciertamente sugiere que es improbable que contribuya al catabolismo general de proteínas, pero sí su participación en procesados específicos de proteínas [Dando et al., 1999]. En este sentido, se ha identificado como una proteasa clave en el procesado del antígeno MHC de clase II [Manoury et al., 1998]. Estas consideraciones apoyan la teoría de que la proteolisis de la ProTα en linfocitos y otras células de mamíferos es un mecanismo selectivo y no una degradación inespecífica. Además, el hecho de que la Tα 1 esté presente en elevados niveles, similares a los de la ProTα, indica que puede tener una función biológica. La localización citosólica de la Tα 1 , su demostrada incapacidad para migrar al núcleo [Manrow et al., 1991], y su carencia de señal secretora [Eschenfeldt et al., 1989] argumentan una función intracelular no nuclear para esta proteína, que puede estar relacionada o no con la ProTα. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 47 Finalmente, cabe destacar que el procesamiento proteolítico de la ProTα descrito en células HeLa apoptóticas [Evstafieva et al., 2000, 2003; Enkemann et al., 2000] no ha sido confirmado en otros tipos celulares sometidos a apoptosis, y sucede en un contexto biológico enteramente diferente (muerte celular programada) a la generación de Tα 1 en células proliferantes o no proliferantes. 6.6. LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTα i. Fosforilación de la protimosina α y proliferación celular Al igual que lo que ocurre con otras proteínas acídicas nucleares que enlazan histonas y que están implicadas en la organización estructural de la cromatina, a inicios de los años 90 se demostró en experimentos realizados en nuestro laboratorio que la ProTα era fosforilada in vitro por la caseín quinasa-2 (CK-2) [Barcia et al., 1992] en residuos de Ser y Thr localizados en su región N-terminal (aminoácidos 1-14 de su secuencia). Más tarde, se encontró que la ProTα también resultaba fosforilada in vivo, en un grado dependiente de la actividad proliferativa de la célula [Barcia et al., 1993]. De hecho, la fosforilación de la ProTα era particularmente notable en linfocitos de bazo activados mitóticamente, en comparación con linfocitos y otros tipos celulares no activados para proliferar [Barcia et al., 1993; Sburlati et al., 1993]. Pero, a diferencia de lo que ocurría in vitro, en timocitos, esplenocitos y células HeLa únicamente se fosforilaba en residuos de Thr localizados en la secuencia de sus primeros 14 aminoácidos [Barcia et al., 1993]. Esta diferencia parecía indicar que la CK-2 podría no ser la responsable de la fosforilación de la ProTα en las poblaciones celulares investigadas, sugiriendo que la ProTα es fosforilada por otra quinasa. En posteriores trabajos de nuestro laboratorio se aisló esta proteína quinasa en extractos de esplenocitos de ratón activados para proliferar [Pérez-Estévez et al., 1997]. Esta proteína (ProTαK), a diferencia de la CK-2, fosforilaba a la ProTα en los mismos residuos de Thr que resultaban fosforilados in vivo [Pérez-Estévez et al., 1997], tal como se indica en la figura 9. Estos resultados confirmaron los hallazgos previos Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 54 iii. Actividad ProTαK y significado biológico de la fosforilación de la protimosina α en la célula La amplia distribución de la ProTα en las células de mamíferos, con una elevada concentración, indica una función central en la proliferación celular; por lo que es bastante razonable teorizar la existencia de una quinasa específica para esta proteína. Además, sus características sugieren que la ProTαK purificada no se incluye en las categorías principales descritas de proteínas quinasas [Pearson & Kemp, 1991]. La fosforilación de la ProTα parece tener un significado biológico, por lo menos en células en proliferación, por dos motivos principalmente: la existencia de esta proteína quinasa altamente específica y la elevada concentración de la ProTα fosforilada en estas células (cerca del 18% de las moléculas de ProTα están fosforiladas en linfocitos de bazo de ratón estimulados mitogénicamente). De igual modo, la relación directa entre la actividad de la ProTαK y la concentración de fosfo-ProTα en células en proliferación [Pérez-Estévez et al., 2000; Barcia et al., 1993] apoyan una función con significado biológico. Los efectos de esta fosforilación en el comportamiento celular de la ProTα son desconocidos. Así, se ha demostrado que la capacidad de la ProTα para interactuar con las histonas y permitir el ensamblado de los nucleosomas in vitro [Díaz-Jullien et al., 1996; Covelo et al., 2006] no parece estar afectada por su fosforilación. Además, se ha indicado que el proceso de proteolisis in vitro es independiente del estado de fosforilación de la ProTα; aunque la presencia de la Tα 1 fosforilada en células en proliferación y la incapacidad de la proteína quinasa de la ProTα para fosforilar a la Tα 1 [Pérez-Estévez et al., 2000] parecen indicar que la ProTα procesada in vivo debe ser previamente fosforilada para originar Tα 1 fosforilada. Aunque no debe desecharse la posibilidad de que la fosforilación de la ProTα afecte a su interacción in vivo con las histonas o con otras macromoléculas en la célula, parece probable que dicha fosforilación esté implicada en otros aspectos de la función de la ProTα: como su actividad de regulación de la transcripción o su efecto antiapoptótico. En este sentido, la ProTα podría estar incluida en el grupo de proteínas cuya actividad nuclear está regulada mediante fosforilación [Jans et al., 1991]. Introducción __________________________________________________________________________________________________________ 55 Claramente, la caracterización estructural y bioquímica de la ProTαK que fosforila a la ProTα en células en proliferación es muy importante para elucidar los efectos de dicha fosforilación en el comportamiento de la ProTα y para esclarecer la función de esta proteína. En este sentido, los procedimientos y ensayos experimentales llevados a cabo en el laboratorio de investigación en Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela dirigido por el profesor D. Manuel Freire Rama y presentados en esta Tesis Doctoral han resultado en la inesperada identificación de la ProTαK como la isoforma M2 de la enzima piruvato quinasa (EC.2.1.7.40) [Díaz-Jullien et al., 2011]. 56 CONOCIMIENTO ACTUAL DE LA BIOLOGÍA DE LA PROTIMOSINA α Y OBJETIVOS Conocimiento actual de la biología de la protimosina α y Objetivos __________________________________________________________________________________________________________ 59 II. CONOCIMIENTO ACTUAL DE LA BIOLOGÍA DE LA PROTIMOSINA α Y OBJETIVOS Según se deduce de lo expuesto en la Introducción y en relación a la función biológica de la ProTα, las evidencias actuales indican que se trata de una proteína multifuncional. Los datos experimentales demuestran que participa de forma esencial en la división celular, migrando al núcleo celular e influenciando la actividad de la cromatina. Específicamente, se ha demostrado que afecta al proceso de transcripción mediante interacciones con factores de trascripción [Cotter et al., 2000; Subramanian et al., 2002; Karetsou et al., 2002, 2004; Martini et al., 2000] y con las histonas [DíazJullien et al., 1996; Karetsou et al., 1998; Gómez-Márquez & Rodríguez, 1998]. Los resultados previos en nuestro laboratorio [Covelo et al., 2006] indican que la ProTα interactúa con las histonas del octámero y con un complejo nuclear que contiene actividades acetiltransferasa y metiltransferasa de las histonas H3 y H4, reforzando la teoría de una función nuclear de esta proteína en células en proliferación. Aunque estas investigaciones demuestran la habilidad de la ProTα para cooperar en el ensamblaje de los nucleosomas in vitro, para promover la descondensación de los cromosomas y para unir proteínas modificadoras de histonas y otras proteínas relacionadas con la actividad de la cromatina, el mecanismo de asociación y de actuación de la ProTα sobre la organización estructural de la cromatina permanece sin aclarar. Además de las evidencias de la función nuclear de la ProTα, recientemente se han encontrado también actividades citoplasmáticas para esta proteína. La función citosólica más importante de la ProTα consistiría en su actividad antiapoptótica, inhibiendo la activación de la caspasa 3 mediante un mecanismo desconocido [Jiang et al., 2003] que parece implicar la interacción con el apoptosoma [Qi et al., 2010] y en el que podría estar involucrada la proteína p8 [Malicet et al., 2006]. Sin embargo, la Conocimiento actual de la biología de la protimosina α y Objetivos __________________________________________________________________________________________________________ 60 especificación de las rutas de supervivencia celular e inhibición de la apoptosis en las que está implicada la ProTα se desconoce. Otra importante cuestión que continúa sin resolverse es el significado biológico del procesamiento proteolítico descrito en nuestro laboratorio para la ProTα y mediado por una proteasa lisosomal específica que genera Tα 1 [Sarandeses et al., 2003], péptido presente de forma natural en los tejidos de mamíferos a una concentración similar a la de la ProTα. Todavía debe elucidarse si la presencia estable de la Tα 1 en la célula refleja una función independiente de esta proteína o indica la simple degradación celular de la ProTα. La fosforilación citosólica de la ProTα también proporciona indicios adicionales de su función biológica. Esta fosforilación, que ocurre en residuos de treonina, es un proceso dependiente de la proliferación celular [Barcia et al., 1993], pero su trascendencia biológica no está clara. Los sitios de fosforilación está localizados en secuencias consenso para la CK-2 situadas en el extremo N-terminal (14 primeros a.a.) de la ProTα. De hecho, en nuestro laboratorio encontramos anteriormente que la CK-2 es capaz de fosforilar a la ProTα in vitro [Barcia et al., 1992]. Más tarde, aislamos de varios tipos celulares una proteína quinasa citoplasmática que designamos ProTαK y cuyas propiedades indican que es la enzima específica responsable de la fosforilación de la ProTα en las células proliferantes [Pérez-Estévez et al., 1997]. Los estudios de esta proteína quinasa [Pérez-Estévez et al., 1997, 2000], aislada de esplenocitos murinos, determinan que posee una masa molecular de 180 kDa y que su actividad parece corresponderse con un único tipo de subunidades de 60 kDa. Además, fosforila a la ProTα en residuos de treonina localizados en posición 7 y 12 o 13, siendo el patrón de fosforilación obtenido in vitro idéntico al observado in vivo. Por otro lado, una propiedad destacable de esta quinasa la constituye su incapacidad para fosforilar a la Tα 1 y a la Tα 11 , aunque ambas contienen en su secuencia los sitios de fosforilación descritos para la ProTα. De este modo, los lugares específicos de fosforilación de la ProTαK y su incapacidad para fosforilar a la caseína y para utilizar GTP como donador alternativo de grupos fosfato descartan la posibilidad de que la CK-2 sea la enzima responsable de la fosforilación de la ProTα. Conocimiento actual de la biología de la protimosina α y Objetivos __________________________________________________________________________________________________________ 61 La actividad de la ProTαK se correlaciona con la actividad proliferativa de las células: así, durante la progresión del ciclo celular, la ProTαK mantiene su localización citoplasmática y alcanza sus niveles de actividad más elevados en la fase G 1 -S [PérezEstévez et al., 2000]. Finalmente, una importante característica de la ProTαK en linfocitos de bazo activados con concanavalina (ConA) e interleuquina-2 (IL-2) es que su actividad está regulada por un proceso de fosforilación incluido en una ruta de señalización dependiente de la actividad de la PKC, aunque esta enzima no fosforila directamente a la ProTαK [PérezEstévez et al., 2000]. La existencia de una enzima quinasa específica para la ProTα y la presencia de ProTα fosforilada en células proliferantes indican un importante significado biológico para este proceso de fosforilación [Pérez-Estévez et al., 1997], aunque los efectos sobre el comportamiento celular de la ProTα todavía no han sido determinados. Así, a pesar de la extensa información disponible sobre las características estructurales de la ProTα, el significado de sus modificaciones post-traduccionales y sus mecanismos de participación en la división celular y en la apoptosis deben de ser todavía aclarados. Conocimiento actual de la biología de la protimosina α y Objetivos __________________________________________________________________________________________________________ 62 Los objetivos de nuestro estudio se incluyen en las investigaciones orientadas a la caracterización de las proteínas que interaccionan con la ProTα en la célula, al diseño de ensayos biológicos para determinar la actividad de la ProTα y a la elucidación del significado de su procesamiento proteolítico para generar Tα 1 . La caracterización de las proteínas que interaccionan con la ProTα constituye una herramienta muy importante para profundizar en los mecanismos de su función biológica y es un paso esencial para resolver su actividad bioquímica en la célula. En este sentido, el proyecto de investigación en el que se enmarca esta Tesis Doctoral se planteó con la finalidad de caracterizar e identificar la enzima quinasa aislada en nuestro laboratorio responsable de la fosforilación de la ProTα, y así esclarecer el efecto de este proceso en el comportamiento y función de dicha proteína. En concreto, los objetivos planteados son los siguientes: 1. La identificación y la caracterización estructural y bioquímica de la proteína quinasa que fosforila a la ProTα en células en proliferación. 2. El estudio del efecto de la fosforilación de la ProTα en su distribución celular y transporte nuclear. 3. La investigación de la influencia de la fosforilación de la ProTα en su actividad citosólica antiapoptótica. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 70 ANTICUERPO ORIGEN EPITOPO APLICACIÓN/ENSAYO CONCENTRACIÓN AntiNTProTα purificado (Neosystem) Conejo Extremo Nterminal de la ProTα (a.a. 1-21) Detección de la ProTα endógena y recombinante (Western blot) Inmunoprecipitación de la ProTα endógena y recombinante Citolocalización de la ProTα endógena y recombinante (microscopía de inmunofluorescencia) d: 1/800 20 µg/ml d: 1/2000 Anti -CTProTα purificado (Neosystem) Conejo Extremo Cterminal de la ProTα (a.a. 95-109) Detección de la ProTα endógena (Western blot) Inmunoprecipitación de la ProTα endógena Citolocalización de la ProTα endógena (microscopía de inmunofluorescencia) d: 1/800 20 µg/ml d: 1/2000 Suero anti-M1 (RockLand) Cabra Todas las isoformas de la PK Detección de la M1 y la M2 (Western blot) Inmunosupresion de la M1 y la M2 Inmunoprecipitación de la M1 y la M2 d= 1/5000 d ≈ 1/4 d= 1/25 AntiM2 (SheBoBiotech) (monoclonal) Ratón M2-PK Detección de la M2 (Western blot) Inmunosupresion de la M2 Inmunoprecipitación de la M2 d=1/5000 60 µg/ml 6 µg/ml Antic-myc (Sigma) Conejo (purificado por afinidad) Péptido cmyc (a.a. 410419: EQKLISEEDL) Detección de la ProTα recombinante (Western blot) Inmunoprecipitación de la ProTα recombinante Citolocalización de la ProTα recombinante (microscopía de inmunofluorescencia) d: 1/2000 10 µg/ml d: 1/1000 Anti-His (Sigma) (monoclonal) Ratón Péptido His 5 Detección de la ProTα recombinante (Western blot) d: 1/800 Anti-tubulina (Sigma) Ratón Subunidad α de la tubulina Citolocalización de la tubulina (microscopía de inmunofluorescencia) d: 1/2000 Anti-conejo-HRP (2 ario ) (GE Healthcare BioSciences) Burro IgG Western blot d: 1/5000 Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 71 ANTICUERPO ORIGEN EPITOPO APLICACIÓN/ENSAYO CONCENTRACIÓN Anti-ratón-HRP (2 ario ) (GE Healthcare BioSciences) Oveja IgG Western blot d: 1/5000 Anti-cabra-HRP (2 ario ) (Sigma) Conejo (purificado por afinidad) IgG Western blot d: 1/5000 Anti-conejo - AlexaFluor-488 (2 ario ) (Invitrogen) Cabra Cadena pesada de la IgG Microscopía de inmunofluorescencia (emisión en verde) d: 1/5000 Anti-ratónAlexaFluor-594 (2 ario ) (Invitrogen) Cabra Cadena pesada de la IgG Microscopía de inmunofluorescencia (emisión en rojo) d: 1/5000 1.4. Otros productos: Lactato deshidrogenasa ( L -LDH) (SIGMA): suministrada a 790-1020 unidades/mg. 3, 3´, 5-triiodo-L-tironina (T3) (SIGMA) Fosfatasa alcalina biotinilada (New England BioLabs): 1100 unidades/mg. Seroalbúmina bovina (BSA) (Merck) La ProTα fue purificada de timocitos de ternera siguiendo el protocolo descrito por Franco et al., 1992. El vector plasmídico pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc (Invitrogen). El plásmido pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc es un vector de 5,4 kb derivado del plásmido pcDNA 3.1 diseñado para una elevada estabilidad y para la expresión transitoria en células de mamíferos. Se le ha incorporado el origen de replicación de un fago filamentoso (fagos de DNA monocatenario, ej. f1), y de este modo tiene la capacidad de producir DNA de cadena simple (muy útil para mutagénesis dirigida). Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 72 ELEMENTO DE pcDNA 3.1(+) BENEFICIO/UTILIDAD/CAPACIDAD Promotor del citomegalovirus (CMV) humano Permite la expresión eficiente y en altos niveles de la proteína recombinante (bases 232-819) Promotor T7/ priming site Permite la transcipción in vitro del RNA del inserto (bases 863-882) Sitio de Clonaje Múltiple (MCS) Permite la inserción del gen y facilita el clonaje (bases 895-1010) Señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) Eficiencia en la terminación de la transcripción y poliadenilación del mRNA (bases 1028-1252) Origen f1 Producción de DNA monocatenario por coinfección con el fago f1 (bases 1298-1726) Origen y promotor temprano de SV40 Expresión del gen de resistencia a neomicina y replicación episomal en células que expresan el antígeno T grande de SV40 (ej. COS-1, COS-7, 293T) (oncoproteína que permite una replicación aumentada al unirse al promotor, ya que funciona como una helicasa que desnaturaliza el DNA para su replicación por la maquinaria de la célula huésped) (bases 1731-2074) Gen de resistencia a neomicina Selección de transfectantes estables en células de mamíferos (bases 2136-2930) Señal de poliadenilación de SV40 Eficiencia en la terminación de la transcripción y poliadenilación del mRNA (bases 3104-3234) Origen pUC Replicación y crecimiento en E. coli (bases 36174287) Gen de resistencia a ampicilina (β-lactamasa) Selección del vector en E. coli (bases 4432-5428) Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 73 Además, presenta una secuencia codificadora para 6 aminoácidos de histidina (His 6 ) y la secuencia correspondiente a los aminoácidos 410-419 del péptido c-myc (EQKLISEEDL), que se expresarían respectivamente en los extremos N-terminal y Cterminal de la proteína recombinante sintetizada (para facilitar posteriores análisis de citolocalización, purificación, separación, etc.). 2. MATERIAL NO BIOLÓGICO 2.1. Medios de cultivo Para el cultivo en monocapa de las líneas celulares 293T y HeLa se utilizó medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (SIGMA) pH 7.4 que contenía un 0.2% de NaHCO 3 , suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (BioWhittaker), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (BioWhittaker). Para el crecimiento en suspensión de las células NC37 se empleó medio RPMI 1640 pH 7.4 que contenía un 0.2% de NaHCO 3 , suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (BioWhittaker), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (BioWhittaker). El crecimiento de las bacterias E. coli transformadas con el plásmido pcDNA 3.1(+) His 6 - c-myc se realizó incubando los inóculos en medio Luria-Bertani (LB) pH 7 suplementado con el antibiótico ampicilina (100 µg/ml) (SIGMA). Los cultivos de colonias en medio sólido se realizaron en el mismo medio con 1.5% de bacto-agar (Scharlau) y antibiótico a la concentración indicada anteriormente. La composición de estos medios se describe de forma detallada en el manual de protocolos Sambrook et al., 1989. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 74 2.2. Disoluciones y tampones - PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 PO 4 y 1.5 mM KH 2 PO 4 . - TBST-1: 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 137 mM NaCl y 0.2% Tween-20. - TBST-2: 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 137 mM NaCl y 0.1% Tween-20. - Tampón de electroforesis SDS/PAGE 1X (Tris-glicina-SDS): 25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM glicina y 0.1% SDS. - Tampón de muestra de Laemmli: 60 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% βmercaptoetanol y 10% glicerol. - Tampón de muestra para DNA (6X): 0.25% azul de bromofenol, 0.25% xilenocianol y 30% glicerol. - Tampón de transferencia: 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 380 mM glicina, 0.1% SDS y 20% metanol. - Tampón de transferencia de la ProTα: 20 mM acetato sódico pH 4.5. - Tampón Tris-acetato-EDTA (TAE): 40 mM Tris-acetato y 1 mM EDTA. - Tampón de diálisis (tampón A): 50 mM Tris-HCl pH 7.5 conteniendo 5% glicerol (v/v), 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF y 40 mM NaF. - Tampón de diálisis (tampón B): 10 mM fosfato potásico pH 6, con 2mM MgSO 4 , 10 mM β-mercaptoetanol y 0.2 mM FBP. - Tampón de lisis de células NC37: 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet NP-40. - Tampón de lisis de células 293T: 20 Mm Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% tritón X100 y 0,5% NP-40. - Tampón de lisis de células musculares de ratón: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgSO 4 y 1 mM EDTA conteniendo 10 mM β-mercaptoetanol. - Tampón de ensayos quinasa ProTαK: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 1.6 mM EDTA, 1.6 mM EGTA, 26 mM MgCl 2 , 3.3 mM DTT, 83 mM β-glicerofosfato, 5% glicerol y 0.1 mM [ 32 P]ATP. - Tampón de ensayos de actividad PK: 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 0.1 M KCl, 5 mM MgSO 4 , 2 mM ADP, 2 mM PEP, 0.5 mM FBP, 0.18 mM β-NADH, y 8 U/ml de L - LDH. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 75 - Tampón de equilibrado de la columna Níquel-agarosa: 50 mM fosfato Na pH 8, 0.3 M NaCl. - Tampón de elución de la columna de fosfocelulosa (1): 50 mM Tris-HCl pH 7.5 conteniendo 5% glicerol (v/v), 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 40 mM NaF y 0.6 M NaCl. - Tampón de elución de la columna de fosfocelulosa (2): 70 mM fosfato potásico pH 6, 0.2 mM FBP y 0.5 mM PEP o 0.6 M KCl. - Tampón de elución de la columna de afinidad Sepharosa-ProTα: 50 mM TrisHCl pH 7.5 conteniendo 5% glicerol (v/v), 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 40 mM NaF y 1 M NaCl. - Tampón de inmunoprecipitación de la ProTαK: 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 75 mM NaCl, 0.5% Nonidet NP-40, 0.2% CHAPS, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF y 1 µg/ml de leupeptina, pepstatina y aprotinina. - Tampón NET: 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM KCl, 1 mM EDTA y 0.1% Nonidet NP-40. - Tampón de electroforesis en capa fina: 50:5:945 ácido acético/pirimidina/ agua, pH 3.5. - Tampón de ensayos de desfosforilación: 50 mM Tris-HCl pH 7.9, 100 mM NaCl, 1mM MgCl 2 y 0.1 mM ZnCl 2 . - Tampón de filtración en gel: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 5mM MgCl 2 , y 0.18% CHAPS. - Tampón de ensayos de actividad caspasa 3: 20 mM HEPES pH 7.4, 20 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl 2 , 0.05% CHAPS y 10 mM DTT. - Tampón de ensayos de actividad caspasa 9: 20 mM HEPES pH 6.5, 20 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl 2 , 0.05% CHAPS y 10 mM DTT. 2.3. Otros productos: i. GE Healthcare BioSciences: Sal de trietilamonio de adenosina 5´-[γ32 P] trifosfato ([γ32 P]ATP): suministrado a una concentración de 3000 Ci/mmol. Proteína A-Sepharosa Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 76 ii. SIGMA: Fosfoenolpiruvato (PEP) Fructosa 1,6-bisfosfato (FBP) Tripsina-EDTA, solución al 0.25% (m/v). Dinucleótido de nicotinamida y adenina, en su forma reducida (β-NADH). Adenosina 5´-difosfato (ADP) Estreptavidina-agarosa Proteína Gagarosa Estaurosporina: disuelta a una concentración patrón 1 mM en DMSO. Tripas de diálisis con un tamaño de poro de 12.000 Da. Ampicilina: solución patrón 50 mg/ml. Poli-L-lisina: diluida en agua miliQ a una concentración 0.1 mg/ml y esterilizada por filtración (0.22 µm). Divinilsulfona al 97%. Dimetilformamida DAPI, disuelto en agua miliQ (solución patrón 10 mg/ml) y filtrado (0.22 µm). iii. Invitrogen: LipofectAMINA 2000, para la transfección de ácidos nucleicos en células eucariotas. iv. MP Biomedicals: Medio DMEM libre de ortofosfato v. Serva: Ditiotreitol (DTT), disuelto en agua destilada a una concentración patrón 100 mM. Leupeptina y pepstatina: solución patrón 5 µg/µl. PMSF: solución patrón 100 mM en isopropanol. vi. Calbiochem: Mowiol 4-88 vii. Whatman: Membranas de nitrocelulosa de 0.2 µm. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 77 viii. MILLIPORE: Concentradores Amicon con un límite de exclusión de 10.000 Da. Membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) de 0.45 µm. ix. Merck: Etilendiamina Glutaraldehido, suministrado al 50%. x. BIO-RAD: Agarosa Tritón X-100 xi. Pierce Chemical Co. Ninhidrina xii. PerkinElmer [ 32 P]ortofosfato: suministrado como Na 432 PO 7 a una concentración de 1-60 Ci/mmol. 3. MÉTODOS 3.1. CULTIVOS CELULARES 3.1.1. Condiciones de manipulación La manipulación de las líneas celulares se realizó en condiciones estériles en el interior de una cabina de flujo laminar vertical TELSTAR BioStar Plus. Los cultivos se mantuvieron en el interior de un incubador Heraeus. El material desechable fue esterilizado en autoclave antes de su eliminación definitiva. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 78 3.1.2. Inicio de los cultivos celulares Los cultivos de células NC37, 293T y HeLa se iniciaron a partir de alícuotas de 1 ml almacenadas en nitrógeno líquido, que habían sido congeladas en un medio compuesto por un 90% de FBS y 10% de DMSO (SIGMA) como agente crioprotector. Las alícuotas fueron calentadas en un baño a 37 o C, centrifugadas posteriormente a 900 x g durante 5 minutos para retirar el medio de congelación, y resuspendidas a continuación en 5 ml del medio de cultivo correspondiente (10 6 células/ml). 3.1.3. Mantenimiento de los cultivos celulares Las células NC37 fueron cultivadas en botellas Pyrex con agitación a 37 o C, doblando el volumen del medio de cultivo cada 2 días, proliferando hasta alcanzar una concentración aproximada de 10 6 células/ml. Las células 293T y HeLa se mantuvieron en cultivo en frascos de 25 cm 2 a 37 o C en atmósfera humidificada y con un 5% CO 2 ; los cultivos fueron tripsinizados periódicamente y divididos en nuevos frascos al alcanzarse la semiconfluencia en la monocapa en crecimiento. 3.1.4. Tripsinización de los cultivos de células 293T y HeLa Las células 293T y HeLa fueron tripsinizadas periódicamente cuando la monocapa en crecimiento alcanzaba un 60-70% de confluencia. Para ello, se eliminó el medio de cada frasco de cultivo y se añadió sobre las monocapas 2 ml de solución 0.25% tripsina-EDTA (SIGMA) durante 5 minutos. La solución fue retirada y sustituida por el volumen de medio DMEM necesario para obtener la dilución deseada; y cantidades iguales de células resuspendidas se repartieron en los frascos correspondientes. 3.1.5. Marcaje metabólico de células NC37 y 293T con [ 32 P]ortofosfato Para el marcaje metabólico de proteínas con [ 32 P]ortofosfato, las células NC37 y 293T fueron incubadas 4 horas en medio DMEM sin ortofosfato y después 14 horas en medio DMEM sin ortofosfato conteniendo 100 µCi/ml de [ 32 P]ortofosfato. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 79 3.1.6. Análisis del número y viabilidad celular El recuento del número de células se realizó directamente a partir del cultivo empleando una cámara de Neubauer, y se determinó la viabilidad celular mediante la tinción de la muestra en proporción 1:1 con solución 0.4% azul de tripán (SIGMA). 3.2. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CELULARES 3.2.1. Fraccionamiento subcelular de células NC37 El fraccionamiento subcelular de las células NC37 fue llevado a cabo como describen Freire et al., 2001. Las células fueron recogidas de los cultivos correspondientes, lavadas 2 veces en PBS y resuspendidas (5 x 10 7 células/ml) en tampón de lisis frío (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet NP-40, 0.5 mM DTT, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 5 µg/ml pepstatina y 5 µg/ml leupeptina) durante 10 minutos a 4 o C. A continuación, se homogeneizaron en Potter y se centrifugaron a 2000 x g durante 15 minutos. La fracción citosólica fue obtenida del homogeneizado celular por ultracentrifugación del sobrenadante a 100.000 x g durante 1 h a 4 o C y dializada 24 horas frente a tampón 50 mM Tris-HCl pH 7.5 conteniendo 5% glicerol (v/v), 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, y 40 mM NaF (tampón A). 3.2.2. Lisado de células 293T Las células 293T fueron tripsinizadas cuando alcanzaron una confluencia del 60-70% y resuspendidas en 5 ml de PBS (10 6 células/ml). Se centrifugaron a 600 x g durante 5 minutos a 4 o C y fueron resuspendidas de nuevo en 5 ml de PBS. El PBS sobrenadante fue eliminado por centrifugación y, seguidamente, los pellets celulares fueron lisados en tampón frío 20 Mm Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% tritón X-100, 0.5% NP-40, 0.5 mM PMSF, 5 µg/ml leupeptina, 5 µg/ml pepstatina, 5 µg/ml aprotinina, 1 mM Na 3 VO 4 y 2 mM NaF (20 x 10 6 células/ml); permanecieron 30 minutos a 4 o C y se agitaron esporádicamente. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 86 3.8.2. Inserto: cDNA de la ProTα El inserto clonado en el vector de expresión pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc se corresponde con el cDNA de la ProTα humana [Eschenfeldt & Berger, 1986; Goodall et al., 1986] y fue introducido en el lugar de restricción único de la enzima EcoR1 en el Sitio de Clonaje Múltiple (MCS) de dicho vector (GenScript) (figura 1). Asimismo, se generó también un vector en el que se sustituyó mediante mutagénesis directa el codón ACC (Thr) en posición 7 de la secuencia de la ProTα (posición 14 del cDNA modificado) por GCA (Ala), obteniéndose de este modo 2 construcciones plasmídicas: 1) el vector recombinante que expresa la ProTα humana nativa [His 6 -cmyc ProTα (Thr)] y 2) el vector que expresa la ProTα mutada en posición 7 [(His 6 -c-myc ProTα (Ala)] (T7A). Figura 2. Secuencia de los diferentes insertos introducidos en el vector pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc. La secuencia 1 se corresponde con el cDNA de la ProTα humana; la secuencia 2 se corresponde con el cDNA de la ProTα humana a la que se le ha añadido la secuencia codificadora de 6 histidinas en el extremo N-terminal y la secuencia codificadora del péptido c-myc (EQKLISEEDL) en el C-terminal (ambas en negrita, subrayadas y en mayúsculas); finalmente, la secuencia 3 se corresponde con el cDNA de la ProTα humana con las 6 histidinas y el péptido c-myc añadidos y mutada en la posición 7 (14 en la secuencia de la construcción plasmídica completa) señalada en rojo: acc (Thr) → gca (Ala) (T7A). 1) tca gac gca gcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat ggggag cag gag gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac tag 2) CAC CAC CAC CAC CAC CAC tca gac gca gcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat ggggag cag gag gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAG GAT CTG ATT tag 3) CAC CAC CAC CAC CAC CAC tca gac gca gcc gta gac gca agc tcc gaa atc acc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat ggggag cag gag gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAG GAT CTG ATT tag Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 87 3.8.3. Crecimiento (amplificación) y extracción del plásmido pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc Para la amplificación del vector se transformaron bacterias E. coli DH5α con el plásmido pcDNA 3.1(+) His 6 -c-myc, portador del cDNA de la ProTα humana nativa o mutada, mediante el tratamiento con CaCl 2 en frío [Sambrook et al., 1989]. Las bacterias DH5α transformadas se crecieron en 3 ml de LB con ampicilina (100 μg/ml). Los cultivos se mantuvieron en agitación (200 r.p.m.) toda la noche a 37 o C y, a continuación, fueron diluidos y sembrados en placas de LB-agar-ampicilina. Se crecieron toda la noche a 37 o C y cuando las colonias individuales eran visibles y diferenciables, se picaron con palillos y se inocularon en cultivos de LB con ampicilina: se mantuvieron en agitación (200 r.p.m.) a 37 o C hasta que su densidad óptica (D.O) a 600 nm se situó entre 1-1.5 (todos los pasos anteriores se realizaron a la llama). A continuación, se procedió a la extracción del plásmido utilizando el sistema HiPure Plasmid Midiprep de Invitrogen a partir de cultivos de 100 ml de cultivo bacteriano (siguiendo las instrucciones del fabricante). Se determinó su concentración y pureza espectrofotométricamente, y se almacenaron las dos construcciones plasmídicas (vector de la ProTα recombinante mutada T7A y no mutada) y el vector vacío en alícuotas a -80 o C. La presencia de los plásmidos en los eluidos finales se confirmó mediante el corte con la enzima de restricción EcoR1 (incubación 2 horas a 37 o C) seguido de electroforesis en gel de agarosa 0.8% en TAE 1X con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) a 65 voltios; y visualización UV (según el protocolo descrito en Sambrook et al., 1989). 3.8.4. Transfección de células 293T y HeLa EN FRASCO (Falcon de 25 cm 2 ): Las células 293T o HeLa fueron transfectadas cuando la confluencia de la monocapa se encontraba en torno al 70-80%. Previamente a la transfección, las células se mantuvieron 2 horas en un volumen de 5 ml de DMEM sin FBS ni antibiótico, en atmósfera humidificada, a 37 o C y 5% CO 2 . Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 88 EN POCILLO (placa Falcon de 24 pocillos; 2 cm 2 /pocillo): Las células HeLa o 293T fueron tripsinizadas 24 horas antes de la transfección, cuando su confluencia en la monocapa se situaba en torno a un 70-80%. Se resuspendieron en 5 ml de DMEM 10% FBS 1% antibiótico y se tomó una alícuota para su contaje microscópico y la determinación de su viabilidad mediante el método del azul tripán. La concentración celular final se ajustó por dilución o por centrifugación y resuspensión en el volumen necesario de DMEM, según el caso, a 3 x 10 5 células/ml. En los pocillos de la placa se colocaron cubres circulares (Ø 13 mm) esterilizados mediante flameado en metanol y se añadió 0.5 ml de cultivo celular resuspendido (1.5 x 10 5 células). Las células se mantuvieron en atmósfera humidificada a 37 o C y 5% CO 2 .Dos horas antes de la transfección, y tras observar microscópicamente el crecimiento y confluencia celular de la monocapa y la correcta adherencia a los cubres, a las células les fue retirado el medio de cultivo y se les añadió 0.5 ml de DMEM sin FBS ni antibiótico/pocillo. Permanecieron a 37 o C y 5% CO 2 hasta el momento de la transfección. La transfección se llevó a cabo en ambos casos utilizando LipofectAMINA 2000 y siguiendo las instrucciones del fabricante para la formación de complejos estables DNA-liposomas, que fueron añadidos directamente al medio de cultivo celular. La Lipofectamina 2000 fue agitada vigorosamente antes de la realización de las mezclas de transfección. MEZCLAS DE TRANSFECCIÓN FRASCO (5 x 10 6 CÉLULAS) 6 μg plásmido + 0.5 ml DMEM 5´ 15 μl lipofectamina + 0.5 ml DMEM POCILLO (4 x 10 5 CÉLULAS) 0.7 μg plásmido + 25 µl DMEM 5´ 1.5 μl lipofectamina + 25 µl DMEM Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 89 Todas las mezclas se realizaron con DMEM sin FBS ni antibiótico. Las mezclas de transfección que portaban el plásmido diluido en DMEM se añadieron 5 minutos después de su preparación a las mezclas de LipofectAMINA 2000 diluida. En el caso de las transfecciones en frasco, las mezclas completas tuvieron un volumen aproximado de 1 ml y se añadieron gota a gota a los frascos tras 20-30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Antes de la adición, a los frascos se les retiró el DMEM (5 ml) sin FBS ni antibiótico y se les añadió 1.5 ml de DMEM fresco sin FBS ni antibiótico. El volumen final de transfección en cada frasco fue de 2.5 ml. El volumen final de las mezclas completas de transfección en pocillo fue aproximadamante de 50 μl, y se añadieron gota a gota a los pocillos tras 20-30 minutos de incubación a temperatura ambiente. A los pocillos se les había retirado previamente el DMEM (0.5 ml) sin FBS ni antibiótico y se les había añadido 200 μl de DMEM fresco sin FBS ni antibiótico. El volumen final de transfección en cada pocillo fue de 250 μl. Las células se mantuvieron de 4-6 horas en atmósfera humidificada a 37 o C y 5% CO 2 . Al cabo de ese tiempo, el medio fue retirado y sustituido por 5ml (frasco) o 0.5 ml (pocillo) de DMEM 10% FBS 1% antibiótico. Las células permanecieron 48 horas en atmósfera humidificada a 37 o C y 5% CO 2 hasta su extracción, lisis y análisis por Inmunowestern blot o hasta su fijación y análisis por microscopía confocal de fluorescencia. 3.8.5. Separación de la ProTα recombinante mediante cromatografía de Níquelagarosa La purificación de la ProTα recombinante se llevó a cabo por cromatografía de Níquelagarosa: Nickel Chelate Kit (Hispanagar). Esta matriz de afinidad (compuesta de agarosa cargada con Ni) está diseñada específicamente para la unión y captura de proteínas recombinantes que poseen colas de histidina (10-20 mg proteína/ml matrizgel). Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 90 Todas las fases del protocolo cromatográfico se realizaron a 4 o C: Se usó un volumen inicial de matriz Ni-agarosa de 75 μl y se centrifugó a 5100 x g durante 1 minuto para eliminar el etanol 30% en el que era conservada. Se lavó con 400 μl de agua destilada y seguidamente con 400 μl de tampón de equilibrado. A continuación, la matriz fue bloqueada inespecíficamente con BSA 3% en PBS durante 10 minutos. Tras un lavado, se cargaron los extractos de las células 293T transfectadas (1-1.2 x 10 7 células). La unión de la ProTα recombinante de los extractos con la matriz se realizó durante 30 minutos. Seguidamente, la matriz fue lavada con tampón de equilibrado 0.5% Tritón X-100/ 5 mM imidazol. La elución de la ProTα recombinante se realizó con tampón de equilibrado 500 mM imidazol (2 veces con un volumen de tampón de 30 μl). Finalmente, se determinó la concentración proteica de los eluidos por el método Bradford. La detección de la ProTα recombinante en las muestras obtenidas se realizó siguiendo el protocolo descrito en el apartado 3.9.2 (SDS-PAGE y Western blot). 3.9. ENSAYOS INMUNOLÓGICOS 3.9.1. Purificación de anticuerpos de conejo anti-ProTα por inmunoafinidad La purificación de los anticuerpos anti-ProTα se realizó siguiendo el protocolo descrito por Harlow & Lane, 1988: los sueros anti-NTy CTProTα (NeoSystem) fueron centrifugados a 3000 x g durante 30 minutos a 4 o C y se les añadió un volumen de solución saturada (4 M) de sulfato amónico igual al inicial (en agitación y mantenidos a temperatura ambiente) durante 2 h. Después permanecieron durante 7 h a 4 o C y fueron centrifugados a 3000 x g durante 30 minutos a 4 o C. Los pellets se secaron al aire 10 minutos y se resuspendieron en PBS en 1/2 del volumen inicial de suero. Finalmente, fueron dializados en tripas de diálisis de 12 kDa de tamaño de poro frente a PBS pH 7.4 a 4 o C durante 20 h. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 91 A continuación, fueron incubados con una matriz de afinidad ProTα-Sepharosa en tampón 10 mM Tris pH 7.5 durante 24 h a 4 o C en agitación. Se cargaron en columnas y se lavaron con tampón 10 mM Tris pH 7.5 y tampón 10 mM Tris pH 7.5, 0.5 M NaCl. Se llevó a cabo una primera elución con tampón glicina 100 mM pH 2.5. Seguidamente, se realizó un lavado con tampón 10 mM Tris pH 8.8 y una segunda elución con 100 mM trietilamina pH 11.5. Las fracciones recogidas se combinaron y concentraron en Amicon a 3000 x g durante 4 o C en ciclos de 15 minutos. Cuando se alcanzó un volumen final en torno a 400-500 µl de eluido, se realizaron 5 ciclos de diálisis con 10 volúmenes de PBS. La concentración final de anticuerpos purificados anti-NTy CTProTα en los eluidos concentrados y dializados se calculó en base a su absorbancia a 280 nm. Se dividieron en alícuotas y se congelaron a -20 o C. 3.9.2. Análisis por SDS-PAGE e inmunodetección por Western blot de la ProTα La electroforesis SDS-PAGE se llevó a cabo siguiendo el procedimiento de Laemmli, 1970. La concentración de poliacrilamida empleada para el gel concentrador fue del 4% y para el gel separador del 15%. A las alícuotas (40 μg) de los diferentes extractos se les añadió 5 μl de tampón de muestra 5X y pironina al 1%, y se completaron con H 2 O destilada hasta un volumen final de 20 μl. Fueron calentadas a 100 o C durante 5 minutos y microfugadas. Las muestras se corrieron a un amperaje constante de 35 mA hasta la salida del frente de pironina. La transferencia proteica se realizó a membranas de nitrocelulosa activadas para la ProTα [Lauritzen et al., 1990]. Brevemente, la activación se llevó a cabo mediante la incubación de la membrana en una solución de divinil sulfona (1.03 ml), dimetilformamida (2 ml) y 0.5M NaHCO 3 /Na 2 CO 3 pH 10 (17 ml) durante 1 h a temperatura ambiente y en agitación suave; seguidamente, fue incubada 30 minutos en 1% trietilamina y, finalmente, tratada con 1% glutaraldehido en 0.5M NaHCO 3 /Na 2 CO 3 pH 10 durante 15 minutos. Tras el proceso, las membranas se lavaron en agua miliQ a temperatura ambiente durante 24 h. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 92 Las proteínas se transfirieron durante 7 horas a 45 mA constantes y 13 V a 4 o C, en tampón acetato sódico 20 mM pH 4.5 [Karetsou et al., 1998]. La inmunodetección se realizó según los protocolos estándar, utilizando TBS-0.2% Tween pH 7.6 para los lavados de las membranas y leche en polvo disuelta al 5% en TBS-0.2% Tween para los bloqueos e incubaciones con los anticuerpos específicos. Se utilizaron 3 anticuerpos primarios diferentes para la detección de la ProTα: un anticuerpo anti-NT-ProTα capaz de reconocer a la ProTα endógena y a la ProTα recombinante expresada en las células, un anticuerpo anti-histidina que tiene como epitopo los 6 residuos de histidina del extremo N-terminal de la ProTα recombinante y un anticuerpo anti-c-myc que reconoce el péptido c-myc del extremo C-terminal. Los anticuerpos secundarios usados llevaban conjugada la enzima peroxidasa (HRP). ANTICUERPO PRIMARIO 2h r.t. + 2h/4 O C en agitación 2h r.t. + 2h/4 O C en agitación 2h r.t. + 2h/4 O C en agitación ANTICUERPO SECUNDARIO (1h 30´) Anti-NT-ProTα (NeoSystem) d: 1/800 Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5000 Anti-Histidina (Quiagen) d: 1/800 Anti-ratón-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5000 Antic-myc (Sigma) d: 1/2000 Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5000 El revelado de las membranas se realizó utilizando el kit ECL (Western blotting analisis system, GE healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.9.3. Análisis por SDS-PAGE e inmunodetección por Western blot de la ProTαK Alícuotas de los diversos fraccionados celulares (40 µg) o inmunoprecipitados (20 µl) fueron separadas mediante SDS-PAGE según el protocolo de Laemmli, 1970. La concentración de poliacrilamida empleada para el gel separador fue del 8% y para el gel concentrador del 4%. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 93 Las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0.22 µm durante 2 h a 50 V constantes y a 4 o C en tampón 50 mM Tris pH 8.3, 380 mM glicina, 0.1% SDS y 20% metanol, donde fueron incubadas con los anticuerpos primarios: anti-M1 o anti-M2. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon con 5% leche en polvo en TBS-0.1% Tween. La inmunodetección se realizó con los anticuerpos diluidos en la solución anterior, mediante incubaciones de 2 h a temperatura ambiente o 16 h a 4 o C. Tras los lavados con TBS-0.1% Tween, la incubación con los anticuerpos secundarios-HRP fue de 60 minutos. Las proteínas inmunoreactivas se detectaron mediante peroxidasa empleando el sistema ECL (Western blotting analisis system, GE healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.9.4. Ensayos de inmunosupresión La inmunodepleción y los inmunoensayos de actividad ProTαK se realizaron usando la ProTαK purificada de la fracción F45 SA de extractos citosólicos de células NC37. Para los ensayos de inmunodepleción [Kishimoto et al., 1991], alícuotas (50 µg) de la ProTαK fueron incubadas en tampón de ensayos quinasa (50 µl) con cantidades variables de suero no inmune, suero anti-M1 o anticuerpo anti-M2. Las mezclas se incubaron 4 horas a 4 o C con agitación suave. Posteriormente, fueron añadidos 40 µl de proteína A enlazada a Sepharosa (para el suero no inmune) o proteína G (para el suero anti-M1 y el anticuerpo anti-M2), y las mezclas se incubaron otras 2 horas a 4 o C. Los inmunocomplejos se obtuvieron por centrifugación, y la actividad quinasa en el sobrenadante fue ensayada después de añadir 100 µM [γ32 P]ATP a las mezclas de reacción. 3.9.5. Inmunoprecipitación de la ProTαK Para la inmunoprecipitación, la ProTαK purificada (300 µg) fue diluida en 500 µl de tampón de inmunoprecipitación (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 75 mM NaCl, 0.5% Nonidet P40, 0.2% CHAPS, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF y 1 µg/ml de leupeptina, pepstatina y aprotinina), preincubada con 20 µl de suero no inmune 2 horas a 4 o C, e incubada con 20 µl de suero anti-M1 o 3 µg de anti-M2 (previamente acoplados a 40 µl de proteína Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 94 G-Sepharosa) durante 4 horas a 4 o C. Los inmunocomplejos fueron recuperados por centrifugación y lavados 3 veces con tampón de inmunoprecipitación. Para los inmunoensayos quinasa [Mullapudi et al., 2000], alícuotas del material inmunoprecipitado fueron lavadas 2 veces con tampón de ensayos quinasa, suspendidas en 35 µl del mismo tampón y la actividad quinasa ensayada. 3.9.6. Ensayos de coinmunoprecipitación ProTα-M2 en células NC37 y células 293T transfectadas i) Ensayos de coinmunoprecipitación en células NC37 Los ensayos de coinmunoprecipitación en extractos citosólicos de células NC37 (3 mg) se realizaron usando anticuerpos purificados anti-NTy CTProTα (20 µg respectivamente) previamente acoplados a proteína G (20 mg) según el protocolo descrito por Harlow & Lane, 1988. Brevemente, el acoplamiento a proteína G se llevó a cabo en PBS durante 1 h a 4 o C con agitación suave. A continuación, los complejos anticuerpo-proteína G fueron lavados con tampón 0.2 M borato sódico pH 9, y se añadió dimetilpimelimidato (DMP) a una concentración final de 5 mg/ml en el mismo tampón (en agitación y durante 30 minutos). Finalmente, la reacción de acoplamiento se detuvo mediante la incubación con tampón 0.1 M Tris-HCl pH 8, seguida de 2 lavados con tampón NET y resuspensión en PBS. Los complejos fueron obtenidos por centrifugación a 3000 x g durante 5 minutos. La inmunoprecipitación se realizó durante 24 h a 4 o C. Los extractos fueron centrifugados a 400 x g durante 1 minuto y los pellets resultantes se lavaron 2 veces con tampón NET (5 min a 4 o C) y 1 vez con PBS (5 min a 4 o C). Los inmunoprecipitados se eluyeron con 40 µl de tampón de muestra 1.5X, se calentaron a 100 o C durante 5 min y se microfugaron. Los inmunocomplejos obtenidos fueron separados por SDS-PAGE y analizados mediante Western blot. Material y Métodos __________________________________________________________________________________________________________ 95 ii) Ensayos de coinmunoprecipitación en células 293T transfectadas Lisados (1.5 mg) de células 293T transfectadas (apartado 3.8.3) con el vector que expresa la ProTα recombinante o con el vector vacío fueron tratados con 20 µl de suero preinmune ligado a proteína A (4h a 4 o C) y, seguidamente, inmunoprecipitados durante 24 h a 4 o C con anticuerpo anti-c-myc (8.5 µg) acoplado a proteína A (según el protocolo descrito en el apartado anterior). Los lisados fueron centrifugados a 400 x g durante 1 minuto y los pellets lavados 2 veces con tampón NET (5 min a 4 o C) y 1 vez con PBS (5 min a 4 o C). Los inmunoprecipitados se eluyeron con 30 µl de tampón de muestra 1.5X, se calentaron a 100 o C durante 5 minutos y se microfugaron. Los inmunocomplejos obtenidos fueron separados por SDS-PAGE y analizados mediante Western blotting. 3.9.7. Cuantificación de proteínas La cuantificación de la proteínas inmunoreactivas en los diferentes fraccionados fue determinada mediante análisis densitométrico (software Quantity One de BIO-RAD) de los respectivos Western blots, refiriendo la concentración de la proteína correspondiente en estos fraccionados respecto a la proteína total estimada en los inputs. 3.10. ANÁLISIS DE FOSFOAMINOÁCIDOS 3.10.1. Purificación de la proteína M2 fosforilada in vivo El análisis de fosfoaminoácidos de la proteína M2 fosforilada in vivo se realizó según el protocolo descrito por Van der Geer et al., 1993. La isoforma M2 de la PK fue purificada de extractos de células NC37 marcadas metabólicamente (400 x 10 6 c.p.m.) mediante precipitación con sulfato amónico (F45 SA), cromatografía de afinidad a ProTα-Sepharosa e inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal anti-M2. Los inmunocomplejos fueron sometidos a electroforesis SDS-PAGE, transferidos a membranas de PVDF y detectados por autorradiografía. La identidad de la proteína M2 se confirmó mediante Western blot. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 103 IV. RESULTADOS 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA ACTIVIDAD PROTαK EN LINFOCITOS NC37………………………………………………...105 1.1. Purificación de la ProTαK en extractos citosólicos de células NC37……105 2. ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS ACTIVIDADES PROTαK Y PK EN LINFOCITOS HUMANOS……………………………………………………………………108 2.1. Estudio de la afinidad a ProTα de las actividades ProTαK y PK en extractos citosólicos de células NC37………………………..108 2.2. Estudio de la afinidad a ProTα de las actividades ProTαK y PK enfraccionados por sulfato amónico de extractos citosólicos de células NC37………………………………………………..110 2.3. Análisis estructural de la isoforma M2 con actividad ProTαK y de la isoforma M2 con actividad PK……………………………………111 2.4. Caracterización inmunológica de la actividad ProTαK purificada de extractos citosólicos de células NC37………………………..…114 2.5. Estudio comparativo del patrón de afinidad a ProTα y de las actividades ProTαK y PK de la isoforma M1 de la PK………………..…..116 2.6. Estudio comparativo de la influencia de diferentes efectores sobre las actividades M2-ProTαK y M2-PK…………………………117 3. ESTUDIO DE LA BIFUNCIONALIDAD DE LA ISOFORMA M2 DE LA PK…………..120 3.1. Efecto de la fosforilación de la proteína M2 en su funcionalidad dual ……………………………………………………………..…………120 3.2. Influencia de la estructura cuaternaria de la proteína M2 en su bifuncionalidad………………………………………………..123 Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 104 4. INVESTIGACIÓN DEL COMPORTAMIENTO CELULAR DE LA PROTα EN RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD PROTαK Y LA PROTEÍNA M2……………………………………………………………………………………128 4.1. Determinación de la interacción in vivo entre la proteína M2 y la ProTα en células en proliferación……………………………128 4.2. Estudio de la actividad M2-ProTαK in vitro e in vivo e identificación de los lugares de fosforilación de la ProTα………..…………132 5. ESTUDIO PRELIMINAR DEL EFECTO BIOLÓGICO DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTα……………………………………………………………………135 5.1. Estudio de la influencia de la fosforilación de la ProTα en su migración al núcleo de células en proliferación………………..…………..135 5.2. Estudio de la influencia de la fosforilación de la ProTα en su actividad antiapoptótica……………………………………………………………….141 Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 105 IV. RESULTADOS 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA ACTIVIDAD PROTαK EN LINFOCITOS NC37 1.1. Purificación de la ProTαK en extractos citosólicos de células NC37 Para purificar y caracterizar la proteína quinasa responsable de la fosforilación de la ProTα (ProTαK) en células en proliferación, se usaron extractos citosólicos de linfocitos B humanos transformados (células NC37) en los que previamente se habían encontrado elevados niveles de actividad ProTαK [Pérez-Estévez et al., 1997]. Se diseñó un procedimiento de purificación con la finalidad de obtener grandes cantidades de ProTαK (esquematizado en la figura 1) basado en la cromatografía de intercambio iónico en columnas de fosfocelulosa seguido por una cromatografía de afinidad a ProTα en columnas de ProTα-Sepharosa. Las fracciones de la ProTαK purificada cromatográficamente fueron, a continuación, separadas mediante SDSPAGE y se buscó la actividad enzimática de la ProTαK entre sus componentes en el gel renaturalizado. Con ese objetivo, se empleó una modificación en la técnica de renaturalización de geles [Hutchcroft et al., 1991] en la cual los ensayos de actividad ProTαK son realizados en condiciones renaturalizantes en los extractos de las porciones de 2 mm en las que los canales de los geles de poliacrilamida fueron cortados. Se había observado previamente que la actividad ProTαK copurificaba con una proteína de 60 KDa [Pérez-Estévez et al., 2000], y este procedimiento permitía también ensayar la actividad ProTαK no solo en cada banda sino también combinando bandas localizadas en diferentes posiciones en los geles. Figura 1. Esquema de la purificación de la quinasa que fosforila a la protimosina α (ProTαK) en linfocitos (células NC37). Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 106 El análisis de las actividades ProTαK en los diferentes extractos de las porciones del gel de poliacrilamida (figura 2A) indicó que la actividad ProTαK se encontraba presente exclusivamente en las porciones que contenían proteínas en el rango de 60 kDa, y no se observaron variaciones en la actividad ProTαK cuando alícuotas de extractos de estas porciones se combinaron con otras (datos no mostrados). La separación mediante SDS-PAGE de los componentes en la porción con la mayor actividad ProTαK demostró que contenía una única proteína (figura 2B). Esta proteína fue analizada por espectrometría de masas (se incluye el análisis en la figura 1 del Anexo) y en base a la secuencia de sus péptidos trípticos, mostrada en la figura 2C, se identificó como la isoenzima M2 de la piruvato quinasa humana (PK; EC 2.7.1.40) (secuencia en la figura 2C) [Tani et al., 1988]. Esta identificación resultó inesperada y especialmente relevante, ya que indicaría un nuevo comportamiento catalítico para esta enzima. Es decir, la isoforma M2 de la PK, además de su actividad en la síntesis de ATP y piruvato en la glucólisis, presentaría una actividad de proteína quinasa empleando ATP. La isoforma M2 es una de las cuatro isoenzimas (L, R, M1 Y M2) de la PK en mamíferos, las cuales son codificadas por dos genes distintos. Las isoenzimas L y R son codificadas por el gen PKL (con diferentes promotores específicos de tejido) [Noguchi et al., 1987; revisado en Mazurek, 2011], mientras que los tipos M1 y M2 son los productos resultantes de un proceso de corte y empalme alternativo de un tránscrito primario del gen PKM. La isoforma M2 difiere de la isoforma M1 en 23 de 531 aminoácidos, que se concentran en un segmento de 56 aminoácidos (a.a. 378-434) del extremo Cterminal de la proteína M2 (ver secuencia en la figura 2C), y que deriva de la inclusión alternativa del exón 9 (M1) o 10 (M2) [Noguchi et al., 1986; Takenaka et al., 1991; Clower et al., 2010; David et al., 2010]. Las características especiales de la isoforma M2, siendo expresada preferencialmente en células proliferantes y células tumorales [Reinacher & Eigenbrodt, 1981; Reinacher et al., 1979; Yamada & Noguchi, 1999a; Staal & Rijksen, 1991] hacen factible su correspondencia con la ProTαK, ya que esta proteína quinasa es esencial para la proliferación celular, y además esas son las condiciones en las que tiene lugar la fosforilación de la ProTα [revisado en Freire et al., 2002]. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 107 Figura 2. Caracterización estructural de la proteína con actividad ProTαK purificada de extractos de células NC37. A) SDS-PAGE y ensayos de actividad ProTαK en gel. La ProTαK, purificada por cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, fue separada mediante SDS-PAGE y la actividad ProTαK ensayada en los extractos de las porciones de 2 mm del gel en condiciones renaturalizantes (se representa en cada porción por las barras oscuras). B) Análisis SDS-PAGE de los componentes en la porción del gel con la actividad máxima de ProTαK. La banda principal fue obtenida, digerida con tripsina, y los péptidos trípticos analizados por espectrometría de masas (figura 1 en Anexo). C) Análisis mediante espectrometría de masas LS-ESI-IT de la proteína con actividad ProTαK. Se indican las secuencias de los péptidos trípticos identificados en la espectrometría de masas y, en el recuadro, se presenta la secuencia de la isoenzima M2 de la PK humana [Tani et al., 1988] (en la que se incluyen dichos péptidos). Los 56 aminoácidos del exón 10, que diferencia la isoenzima M2 de la isoenzima M1 [Noguchi et al., 1986], aparecen en negrita y subrayados. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 108 2. ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS ACTIVIDADES PROTαK Y PK EN LINFOCITOS HUMANOS Los resultados obtenidos nos llevaron a diseñar, a continuación, una serie de experimentos conducentes a investigar las características de la evolución de la proteína M2 por las cuales se puede originar su habilidad para fosforilar a la ProTα (añadida a la capacidad catalítica de promoción de la síntesis de ATP en su actividad piruvato quinasa). Con este propósito llevamos a cabo un estudio comparativo de las actividades ProTαK y PK en extractos de células NC37. 2.1. Estudio de la afinidad a ProTα de las actividades ProTαK y PK en extractos citosólicos de células NC37 Inicialmente, y debido a los resultados de experimentos previos en nuestro laboratorio que demostraban la afinidad de la ProTαK por la ProTα ligada a Sepharosa [PérezEstévez et al., 1997], se comparó la afinidad por la ProTα de las actividades ProTαK y PK en extractos citosólicos crudos. Los resultados mostrados en la figura 3A indican que la actividad ProTαK se recupera exclusivamente en las fracciones con afinidad por la ProTα. Por el contrario, la actividad PK es retenida en su totalidad en la fracción sin afinidad por la ProTα. Paralelamente, se analizó la presencia de la proteína M2-inmunoreactiva en los diferentes fraccionados de la cromatografía de afinidad empleando un anticuerpo monoclonal anti-M2 que reconoce exclusivamente esta isoforma y también un anticuerpo policlonal anti-M1 que es inmunoreactivo contra las isoformas M1 y M2. La proteína M2 fue detectada de manera similar en los distintos fraccionados separados mediante SDS-PAGE, y analizada por Inmunowestern blot utilizando ambos tipos de anticuerpos. En la figura 3B se muestra la inmunodetección con anti-M2. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 109 Figura 3. Análisis comparativo de la afinidad a ProTα-Sepharosa de las actividades PK y ProTαK en extractos de células NC37. A): Componentes del citosol crudo (1 mg) fueron separados en columnas de ProTα-Sepharosa y las actividades ProTαK y PK determinadas en alícuotas de las fracciones con y sin afinidad a la ProTα: la actividad ProTαK fue ensayada en mezclas de reacción (25 µl) en tampón de actividad quinasa conteniendo 5 µg de ProTα como sustrato, incubadas durante 30 minutos a 37 o C [Pérez-Estévez et al., 1997]; la actividad PK fue ensayada en mezclas de 1ml en tampón de actividad PK que contenían 8 U de enzima ι-lactato deshidrogenasa, monitorizando la reducción de su absorbancia a 340 nm [revisado en Imamura & Tanaka., 1982](Material y Métodos) B): Alícuotas (5 µg) de estas fracciones fueron separadas mediante SDS-PAGE y analizadas por Western blot usando anticuerpos antiM2 (ver Tabla de Anticuerpos en Material y Métodos). El input corresponde a un análisis similar de 10 µg de citosol crudo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes que difieren menos de un 15%. La cuantificación de la proteína M2-inmunoreactiva en los Western blots de la figura 3B, indica que la mayoría de esta proteína (sobre un 90%) no presenta afinidad por la ProTα y se corresponde con la actividad PK, mientras que solo un 10% de la proteína Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 110 M2 es retenida por la ProTα-Sepharosa junto con la actividad ProTαK (porcentajes similares fueron obtenidos a partir de los Western blots de la proteína M2inmunoreactiva cuando se emplearon anticuerpos anti-M1). 2.2. Estudio de la afinidad a ProTα de las actividades ProTαK y PK en fraccionados por sulfato amónico de extractos citosólicos de células NC37 A continuación, se realizó un análisis similar en las fracciones citosólicas de células NC37 obtenidas mediante fraccionamiento con sulfato amónico (SA), que se ha demostrado eficaz en la separación de la actividad de la M2-PK en diversos extractos [Imamura & Tanaka, 1982]. Por ello, extractos citosólicos de células NC37 fueron secuencialmente fraccionados con el 45% (F45 SA) y luego con el 75% (F75 SA) de saturación de sulfato amónico. Este fraccionamiento fue especialmente eficiente en la separación de las actividades ProTαK y PK, tal como se muestra en el análisis de las respectivas actividades enzimáticas en los diferentes fraccionados separados por afinidad a ProTα-Sepharosa, presentado en la figura 4A: la actividad ProTαK aparece exclusivamente en la F45 SA y la actividad PK en la F75 SA. Por otra parte, como se observa en los resultados de la figura 4A, las afinidades por la ProTα-Sepharosa de las actividades ProTαK y PK muestran un patrón similar al encontrado en la separación de los componentes en extractos crudos de células NC37 (figura 3A), mostrando la actividad ProTαK una clara afinidad por la ProTα-Sepharosa, mientras que la actividad PK no interactúa con ella. El análisis por Inmunowestern blot de la distribución de la proteína M2 en los diversos fraccionados, utilizando anticuerpo anti-M2, se presenta en la figura 4B. La cuantificación densitométrica de la proteína M2 indicó que aproximadamente un 20% de esta proteína aparece en la F45 SA y un 80% en la F75 SA. En los extractos F45 SA, más de la mitad de la proteína M2 muestra afinidad por la ProTα acompañando a la actividad ProTαK, lo que representa sobre un 10% de la isoforma M2 total en las células NC37. En contraste, la proteína M2 recuperada en los extractos F75 SA junto con la totalidad de la actividad PK, no posee afinidad por la ProTα-Sepharosa. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 111 Figura 4. Análisis comparativo de las actividades PK y ProTαK en extractos de células NC37 fraccionados con sulfato amónico. A): Componentes (1 mg) de las fracciones F45 SA y F75 SA fueron cromatografiados en columnas de ProTα-Sepharosa y las actividades ProTαK y PK fueron ensayadas en las diferentes fracciones como se indica en la figura 3. B): Alícuotas (5 µg) de estas fracciones fueron separadas mediante SDS-PAGE y analizadas por Western blot usando anticuerpos anti-M2. El input corresponde a un análisis similar de 7 µg de componentes en la F45 SA y en la F75 SA. Los datos son representativos de tres experimentos independientes que difieren menos de un 15%. 2.3. Análisis estructural de la isoforma M2 con actividad ProTαK y de la isoforma M2 con actividad PK Dado que la proteína M2 copurificaba con las dos actividades enzimáticas ProTαK y PK, se decidió realizar un análisis estructural de la isoforma M2 presente en los fraccionados con estas actividades. Para ello, las actividades ProTαK y PK fueron purificadas a partir de sus respectivos fraccionados citoplasmáticos precipitados con Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 118 investigó si esta hormona peptídica podría afectar a la M2-ProTαK. Específicamente, ensayamos la actividad M2-ProTαK a concentraciones de T 3 en las que esta molécula había demostrado inhibir la actividad M2-PK mediante un mecanismo dependiente de la FBP [Kato et al., 1989]. Los resultados de estos experimentos (también mostrados en la figura 8) indican que mientras la T 3 inhibe la actividad PK, no afecta a la actividad M2-ProTαK, lo que sugiere una afinidad exclusiva de la T 3 por la proteína M2 con actividad PK. Figura 8. Estudio comparativo de la influencia de distintos efectores en las actividades M2-ProTαK y M2-PK. Las actividades enzimáticas fueron ensayadas con la ProTαK y la PK, purificadas respectivamente como se indica en el apartado 3.6 de Material y Métodos, en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de los efectores. Las barras representan los niveles de actividad enzimática en condiciones estándar (sin efector) y los correspondientes en presencia de cada efector a las concentraciones indicadas. Las líneas de error indican la ± SD de cuatro experimentos independientes. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 119 También se ensayó el efecto del PEP sobre la actividad ProTαK, y se encontró que este metabolito no influye en dicha actividad (datos no mostrados). Además, el PEP es incapaz de reemplazar al ATP para la transferencia de ortofosfato a la ProTα; esto fue demostrado por la ausencia de generación de piruvato (como se describe en Materiales y Métodos apartado 3.3.3) en una mezcla de reacción que contenía M2ProTαK, ProTα y PEP en sustitución de ATP. A juzgar por los resultados del estudio comparativo de las actividades ProTαK y PK, la actividad ProTαK parece corresponderse con una pequeña parte (sobre un 10%) de la cantidad total de la proteína M2, mientras que el resto del contenido celular de la isoenzima M2 se relaciona con la actividad PK. La proteína M2 con actividad ProTαK no posee actividad PK observable y muestra importantes diferencias enzimáticas (respuesta a efectores, cosustratos, etc) respecto a la isoforma M2 con actividad PK en las células NC37. Por otra parte, de este estudio se deduce que pequeñas diferencias estructurales de la isoforma M2, especialmente aquellas responsables de su afinidad por la ProTαSepharosa, serían las causantes del comportamiento diferencial observado en la proteína M2 con actividad ProTαK, en relación a la que posee actividad PK. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 120 3. ESTUDIO DE LA BIFUNCIONALIDAD DE LA ISOFORMA M2 DE LA PK De acuerdo con los resultados expuestos, parece clara una bifuncionalidad celular de la proteína M2 en linfocitos de mamíferos. Por lo tanto, una importante cuestión a resolver era el esclarecimiento del origen de esta bifuncionalidad, mediante la cual la proteína M2 funcionaría como una proteína quinasa (actividad ProTαK) y como una enzima de la glucólisis responsable de la reacción de fosforilación a nivel de sustrato que transforma en ATP la energía del PEP (actividad PK). Por ello, el siguiente paso fue elucidar las características estructurales que podrían inducir esta funcionalidad dual observada en el contenido celular de M2 en las células NC37. Dos propiedades descritas tanto para la actividad ProTαK como para la actividad PK han servido de base para encaminar nuestra investigación en el estudio de la bifuncionalidad de la isoforma M2. Así, la característica de que la actividad ProTαK es dependiente de un proceso de fosforilación relacionado con la proliferación celular [Pérez-Estévez et al., 2000] y que modificaciones en la estructura cuaternaria de la proteína M2 influyen decisivamente en su actividad PK [revisado en Eigenbrodt et al., 1992; Mazurek et al., 2005; revisado en Mazurek, 2011] orientaron el planteamiento de nuestros experimentos para estudiar la bifuncionalidad de esta proteína. 3.1. Efecto de la fosforilación en la funcionalidad dual de la proteína M2 Para establecer la influencia que la fosforilación pudiera tener en la bifuncionalidad de la proteína M2 y su diferente afinidad por la ProTα, células NC37 fueron marcadas metabólicamente con [ 32 P]ortofosfato con el fin de establecer su posible incorporación a la proteína M2 y analizar el comportamiento de la forma fosforilada. Para ello, se prepararon los fraccionados F45 SA y F75 SA de extractos de células marcadas, y se separaron mediante cromatografía de afinidad sobre ProTα-Sepharosa. Las diferentes fracciones fueron inmunoprecipitadas con anti-M2, analizando en los inmunoprecipitados la presencia de proteína M2 y la actividad ProTαK. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 121 Los resultados mostrados en la figura 9A indican que la proteína M2 presente en la F45 SA que muestra afinidad por la ProTα (panel superior) y a su vez posee actividad ProTαK (panel inferior), se corresponde con la forma fosforilada de esta isoenzima (panel medio). Por el contrario, la proteína M2 presente en la F75 SA, sin afinidad por la ProTα y sin actividad ProTαK, no presenta incorporación de [ 32 P]ortofosfato. Para determinar qué aminoácidos están fosforilados en la proteína M2 de la F45 SA, dicha proteína fue inmunoprecipitada, separada mediante SDS-PAGE y transferida a membrana de nitrocelulosa. La banda que contenía la M2-inmunoreactiva se hidrolizó para su análisis de fosfoaminoácidos como se indica en Material y Métodos (apartado 3.10). Los resultados de este análisis (figura 9B) indican que los residuos fosforilados en la secuencia de la M2-ProTαK se corresponden con treonina y serina, siendo predominante la fosforilación en residuos de serina. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 122 Figura 9. Estudio de la fosforilación de la proteína M2. A) Influencia de la fosforilación de la proteína M2 en su afinidad a ProTα-Sepharosa y en su actividad ProTαK. Lisados de células NC37 marcadas metabólicamente con [ 32 P]ortofosfato (400 x 10 6 c.p.m.) fueron precipitados secuencialmente con sulfato amónico (45% y 75%) y cromatografiados en columnas de ProTα-Sepharosa. Componentes en los diferentes fraccionados se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-M2; y alícuotas de los diversos inmunoprecipitados fueron separadas mediante SDS-PAGE, transferidas a membranas de nitrocelulosa y analizadas con anti-M2 (panel superior) y autorradiografiadas para detectar la M2 [ 32 P]-fosforilada (panel medio) o utilizadas para ensayar la actividad ProTαK (panel inferior). B) Análisis de fosfoaminoácidos de la proteína M2 [ 32 P]-fosforilada. El análisis de fosfoaminoácidos de la [ 32 P]-M2 inmunoprecipitada de la F45 SA separada por afinidad a ProTα-Sepharosa fue realizado como se describe en Material y Métodos (apartado 3.10.2). Las flechas indican la migración de aminoácidos no marcados: fosfoserina (P-Ser), fosfotreonina (P-Thr) y fosfotirosina (P-Tyr) (detectados usando tinción de ninhidrina). Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 123 La espectrometría de masas de la proteína M2 no nos permitió identificar ningún péptido fosforilado que pudiera indicar la posición ni el número de los residuos de serina y treonina fosforilados en la secuencia de M2. Esto pudiera deberse a que no todos los péptidos trípticos generados mediante una digestión en gel de poliacrilamida pueden ser recuperados para su análisis por espectrometría de masas [Villar et al., 2006], tal como se deduce de los diversos análisis de la proteína M2 mostrados en las figuras del Anexo. De acuerdo con los resultados recogidos en la figura 9A, parece claro que la fosforilación de una parte del contenido celular de la proteína M2 es responsable de la habilidad para promover su actividad ProTαK, induciendo su afinidad por la ProTα y su capacidad para fosforilarla. Esta fosforilación parcial de la proteína M2, además de corresponderse con la isoenzima con actividad ProTαK, se sitúa en el orden de magnitud (5-10%) que se ha descrito para la fosforilación de la isoenzima M2 en las células en proliferación [Eingenbrodt et al., 1992]. 3.2. Influencia de la estructura cuaternaria de la proteína M2 en su bifuncionalidad Varios autores han descrito diversas conformaciones cuaternarias para la isoenzima M2, que se corresponden con una forma tetramérica o dimérica de esta proteína y que difieren en sus características cinéticas y función [Eigenbrodt & Glossmann, 1980; Eigenbrodt et al., 1992; revisado en Mazurek, 2007; Shimada et al., 2008; Zwerschke et al., 1999]. Así, la forma tetramérica de la proteína M2 está caracterizada por una gran afinidad por el PEP, mientras que la forma dimérica presenta una afinidad baja por este sustrato y, a la concentración fisiológica de PEP, posee unos niveles de actividad muy disminuidos [Eigenbrodt & Glossmann, 1980; Eigenbrodt et al., 1992; Mazurek et al., 2005; Mazurek, 2007]. Considerando estos datos, investigamos a continuación la posible relación entre la estructura cuaternaria de la proteína M2 y su encontrada bifuncionalidad. Para ello comparamos las estructuras cuaternarias de la ProTαK y de la PK presentes en las fracciones F45 SA y F75 SA de los extractos de células NC37 mediante su separación por filtración molecular. Este análisis de la estructura cuaternaria fue llevado a cabo en Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 124 condiciones en las que estos fraccionados no fueron sometidos a ningún tratamiento, o se trataron con reguladores que se ha demostrado poseen un efecto significativo sobre ambas actividades enzimáticas: la FBP, intermediario glucolítico indispensable para la actividad PK (afectando a la estructura cuaternaria de la isoforma M2 al inducir su reasociación tetramérica) [Ashizawa et al., 1991; Dombrauckas et al., 2005], y el tratamiento con fosfatasa alcalina, que suprime la actividad ProTαK [Pérez-Estévez et al., 2000]. En la filtración molecular fueron analizadas las actividades PK y ProTαK; y la presencia de la proteína M2 fue determinada mediante Inmunowestern blot. La elución de la ProTαK en la F45 SA, tratada y sin tratar con FBP o/y con la fosfatasa, se muestra en la figura 10A. En la fracción F45 SA no tratada, la proteína M2 y la actividad ProTαK coeluyen mayoritariamente en las fracciones correspondientes a un tamaño aproximado de 180 kDa, y en una pequeña proporción en un pico común de aproximadamente 60 KDa con baja actividad ProTαK. Este patrón de elución de la actividad ProTαK de la proteína M2 se identifica con una organización trimérica (180 kDa) y monomérica (60 kDa) respectivamente de la M2-ProTαK. Este comportamiento es similar al observado para la actividad ProTαK aislada de linfocitos murinos en proliferación [Pérez-Estévez et al., 1997]. Como también se muestra en la figura 10A, la incubación de la fracción F45 SA con FBP induce una asociación aparentemente tetramérica de la proteína M2-ProTαK (240 kDa), que resulta en una pequeña disminución de su actividad ProTαK. Cuando los componentes de la fracción F45 SA fueron tratados con fosfatasa alcalina, la actividad ProTαK de la proteína M2 fue suprimida (figura 10A), en concordancia con resultados anteriores [Pérez-Estévez et al., 2000], y ésta proteína eluyó como un monómero. Además, la incubación con FBP de esta fracción pre-tratada con fosfatasa (después de eliminar la actividad fosfatasa como se indica en Material y Métodos 3.11) no promueve la agregación de la proteína M2, ya que el patrón de elución es similar al de la ProTαK en la fracción F45 SA tratada con fosfatasa (datos no mostrados). El estudio de la elución de la actividad PK y de la proteína M2 en la fracción F75 SA se muestra en la figura 10B. En contraste con los componentes de la fracción F45 SA, la proteína M2 de la fracción F75 SA no tratada con FBP no muestra actividad PK y eluye como una forma monomérica. La incubación de la fracción F75 SA con FBP restaura y Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 125 eleva los niveles de actividad PK, que eluyen como agregados tetraméricos de la proteína M2 (240 kDa), mientras que un pico de baja actividad PK está asociado con la M2-PK en forma dimérica (120 kDa). El comportamiento de la actividad PK se corresponde con lo descrito para la M2-PK en células proliferantes [Eigenbrodt et al., 1992]. Como se indica también en la figura 10B, el patrón de elución de la M2-PK no se altera después del tratamiento con la fosfatasa alcalina en presencia de FBP: ni su estructura cuaternaria ni sus niveles de actividad se ven afectados; tampoco el patrón de elución de la proteína M2 tratada con fosfatasa en ausencia de FBP se ve modificado respecto al observado en la figura 10B (-FBP) (datos no mostrados). Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 126 Figura 10. Análisis de la influencia de la fosforilación y el tratamiento con FBP sobre la estructura cuaternaria y las actividades ProTαK y PK. Los componentes de los fraccionados F45 SA (panel A) y F75 SA (panel B), tratados con y sin fosfatasa o/y FBP, se separaron mediante filtración en gel, y la actividad ProTαK y PK en las diferentes y respectivas fracciones se ensayó como se indica en Material y Métodos (apartados 3.3.1 y 3.7.1). La presencia de la proteína M2 se determinó analizando alícuotas de las distintas fracciones mediante SDS-PAGE y Western blot con anti-M2. Resultados __________________________________________________________________________________________________________ 127 De acuerdo con estos resultados, la fosforilación de una pequeña parte (sobre un 10%) del contenido celular de la proteína M2 en residuos de serina y treonina parece ser esencial para inducir su actividad ProTαK. Esta fosforilación también permite asociaciones cuaternarias y ternarias de la M2-ProTαK que favorecen una actividad más elevada que la mostrada por las formas monoméricas de la M2-ProTαK fosforilada. Sin embargo, no puede descartarse que otros efectores celulares, de forma similar a como ocurre con la FBP, puedan también cooperar en la asociación oligomérica de la proteína M2 para incrementar la actividad de la M2-ProTαK monomérica. La desfosforilación de la isoforma M2 anula su actividad ProTαK y previene cualquier estructura cuaternaria asociada. En contraste, la proteína M2 que mantiene la actividad PK (aproximadamente un 90% del total) no es afectada por el proceso de fosforilación y, con una actividad dependiente de concentraciones fisiológicas de FBP, presenta una estructura cuaternaria con dos formas: tetramérica, la más activa y abundante, y dimérica, menos activa y abundante.