Desarrollo de Antagonistas selectivos del receptor A3 de Adenosina

DESARROLLO DE ANTAGONISTAS SELECTIVOS DEL RECEPTOR A3 DE ADENOSINA DEVELOPMENT OF ADENOSINE A3 RECEPTOR SELECTIVE ANTAGONISTS DARÍO MIRANDA PASTORIZA CURSO ACADÉMICO 2019-2020 DESARROLLO DE ANTAGONISTAS SELECTIVOS DEL RECEPTOR A3 DE ADENOSINA Development of adenosine A3 receptor selective antagonists DARÍO MIRANDA PASTORIZA Trabajo de Fin de Grado Curso académico 2019-2020 Santiago de Compostela Tutor: Prof. Eddy Sotelo Pérez Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela y Centro Singular de Investigación en Química Biológica y Materiales Moleculares (CiQUS) Índice I. Resumen .................................................................................................... 1 II. Abstract ...................................................................................................... 1 III. Abreviaturas .............................................................................................. 2 1. Introducción .............................................................................................. 4 1.1 Adenosina .................................................................................................... 4 1.2 Receptores de adenosina ........................................................................... 5 1.2.1 Función de los receptores de adenosina................................................................. 6 1.2.2 Localización de los receptores de adenosina ......................................................... 7 1.3 Relevancia fisiopatológica de la adenosina .............................................. 8 1.3.1 Sistema cardiovascular ........................................................................................... 8 1.3.2 Cáncer ..................................................................................................................... 8 1.3.3 Desórdenes visuales ............................................................................................... 9 1.3.4 Sistema inmunitario ................................................................................................. 9 1.3.5 Otras patologías .................................................................................................... 10 1.4 Ligandos del receptor A3 de adenosina ................................................... 10 1.4.1 Agonistas del receptor A3 ...................................................................................... 11 1.4.2 Antagonistas del receptor A3 ................................................................................. 12 1.5 Estructura del receptor A3 ........................................................................ 14 1.6 Reacciones multicomponente como herramientas de síntesis ............. 14 1.6.1 Ejemplos de reacciones multicomponente ............................................................ 15 1.6.2 Características y ventajas de las RMC .................................................................. 16 1.6.3 Reacción de Biginelli ............................................................................................. 18 1.7 Objetivos del Trabajo Fin de Grado ......................................................... 22 1.7.1 Antecedentes ......................................................................................................... 22 1.7.2 Objetivos ................................................................................................................ 24 2. Materiales y métodos .............................................................................. 26 2.1 Esquema del proceso ............................................................................... 26 2.2 Síntesis ...................................................................................................... 26 2.2.1 Preparación de los β-cetoésteres .......................................................................... 28 2.2.2 Preparación de los derivados tricíclicos ................................................................ 29 2.3 Purificación ................................................................................................ 31 2.4 Caracterización estructural de los compuestos ..................................... 32 2.5 Evaluación farmacológica ........................................................................ 33 3. Resultados y discusión .......................................................................... 35 3.1 Diseño de ligandos .................................................................................... 35 3.2 Precursores obtenidos y caracterización estrutural ............................... 38 3.3 Obtención de compuestos finales y caracterización estructural ........... 39 3.3.1 Serie I: exploración del grupo aldehído en posición 4 ........................................... 39 3.3.2 Serie II: exploración del grupo éster en posición 3 ............................................... 41 3.3.3 Serie III: exploración combinada en R3 y R4 ......................................................... 43 3.4 Evaluación farmacológica de los compuestos frente al receptor de adenosina .............................................................................................................. 45 4. Conclusiones ........................................................................................... 46 Bibliografía ...................................................................................................... 47 Índice de Figuras ............................................................................................ 52 Agradecimientos ............................................................................................ 55 1 I. Resumen El presente Trabajo de Fin de Grado describe el diseño, síntesis y evaluación farmacológica de derivados del sistema 1,4-dihidrobenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pirimidina como antagonistas del receptor A3 de adenosina. Empleando una variante de la reacción de Biginelli se obtuvo una colección de 19 ligandos. Uno de los compuestos sintetizados mostró una elevada afinidad (Ki=2.28 nM) por el receptor A3 de adenosina. Palabras clave: adenosina, receptor A3 de adenosina, antagonistas, reacciones multicomponente, reacción de Biginelli. II. Abstract The current project describes the design, synthesis and pharmacological evaluation of 1,4-dihydrobenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyrimidine derivates as potential antagonists of the A3 adenosine receptor. By employing the Biginelli reaction, a collection of 19 ligands has been obtained. Furthermore, a compound with A3 receptor affinity (Ki=2.28 nM) has been identified. Keywords: adenosine, A3 antagonist receptor, antagonists, multicomponent reaction, Biginelli reaction. 2 III. Abreviaturas A1AR: Receptor A1 de adenosina A2AAR: Receptor A2A de adenosina A2BAR: Receptor A2B de adenosina A3AR: Receptor A3 de adenosina AC: Adenilato ciclasa ADP: Adenosín Difosfato ADO: Adenosina AMP: Adenosín Monofostato AMPc: Adenosín Monofosfato cíclico ATP: Adenosín Trifosfato AR: Receptor de adenosina CCF: Cromatografía en Capa fina CDCl3: Cloroformo deuterado DCM: Diclorometano DMSO-d6: Dimetilsulfóxido hexadeuterado GPCR: Receptor Acoplado a Proteína G MeOH: Metanol mg: miligramo mL: mililitro mmol: milimol Mw: Peso molecular μL: microlitro Pi: Fosfato inorgánico REA: Relación Estructura-Actividad RMC: Reacción Multicomponente RMN: Resonancia Magnética Nuclear 3 RMN-1H: Resonancia Magnética Nuclear de protón RMN-13C: Resonancia Magnética Nuclear de carbono THF: Tetrahidrofurano 4 1. Introducción 1.1 Adenosina La adenosina (ADO) es un nucleósido presente en diferentes tejidos de nuestro organismo. Se forma a través de la unión de la adenina con un anillo de ribosa mediante un enlace β-N9 glucosídico. Esta estructura de 6-Amino-9-β-D-ribofuranosil-9H-purina (Figura 1.1) tiene una relevancia importante en diversas funciones biológicas al ser el núcleo estructural de moléculas como el Adenosín Trifosfato (ATP), Adenosín Difosfato (ADP) o el Adenosín Monofosfato cíclico (AMPc) (1,2). Figura 1.1 Estructura química de la ADO. La ADO actúa como sustrato en todo un complejo engranaje de sistemas enzimáticos. Por este motivo, la concentración de esta dependerá de la actividad que presenten las diferentes enzimas (Figura 1.2), pero también de los transportadores de nucleósidos y nucleótidos presentes en la membrana celular (2). El ATP, nucleótido fundamental en la obtención de energía celular, se forma a partir de la trifosforilación de la molécula de ADO a través de la enzima adenosín quinasa (AQ). La conversión de ADO en ATP puede ser revertida mediante la rotura de los grupos fosfato a través de la acción de enzimas con actividad 5’-nucleotidasa (5’NT). La rotura del ATP formado provoca la liberación de energía. Esta energía es empleada en multitud de procesos celulares. Además, a partir del ATP se puede obtener el AMPc, importante segundo mensajero en muchos procesos biológicos, mediante la acción de la enzima adenilato ciclasa N NN N NH2 O HO HO OH Adenosina 6-Amino-9-b-D-ribofuranosil-9H-purina Adenina Ribosa 5 (AC). La concentración de AMPc está regulada por las enzimas con actividad fosfodiesterasa (PDE). Figura 1.2 Metabolitos formados a partir de la ADO y enzimas responsables (AQ = Adenosín quinasa; 5’NT = 5’-Nucleotidasa, PDE = Fosfodiesterasa y AC = Adenilato ciclasa). Además de su importancia como depósito energético, y en la señalización celular, la ADO ejerce sus principales funciones al unirse a los receptores de adenosina (AR). Mediante esta interacción, se regulan procesos fisiológicos (actividad locomotora, ritmo cardíaco, actividad muscular, lipólisis, etc.) y patológicos (cáncer, glaucoma, enfermedades del sistema inmunitario, inflamación de articulaciones...) (3). 1.2 Receptores de adenosina Los AR son un tipo de receptores transmembrana que pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los GPCR están formados por una única cadena polipeptídica comprendida por siete hélices transmembrana, con un OH HO HO O N N NH2 N N N NN N O OPO O OH OH NH2 HO HO O N N NH2 N N PO O HO OPO HO HO HO HO O N N NH2 N N PO O HO HO OPO O HO HO O N N NH2 N N P O OOH OH P HO O HO AMPc ADO ATP ADP AMP PDE AC 12 1.4.2 Antagonistas del receptor A3 Los antagonistas del receptor A3, a diferencia de los agonistas, pueden tener estructura variada. Esta familia de ligandos se clasifica en derivados xantínicos y no xantínicos. 1.4.2.1 Derivados xantínicos Los derivados xantínicos contienen un núcleo de xantina y la mayoría de los compuestos desarrollados no presentan la ribosa. Este tipo de compuestos generaron interés tras observar el ligero efecto antagonista que presentan las bases xánticas naturales como la cafeína o la teobromina (Figura 1.7). Para poder obtener dichos productos, se han realizado modificaciones sobre el núcleo de xantina, destacando la incorporación de cadenas alquílicas en las posiciones 1 y 3 y de grupos aromáticos en posición 8 como es el caso de los compuestos 8 y 9 (12) de la Figura 1.7. Figura 1.7 Ligandos naturales y su comparación con los compuestos sintéticos 8 y 9. 1.4.2.2 Derivados no xantínicos Son compuestos que no derivan del núcleo xantínico. Hay mucha diversidad estructural dentro de este grupo, dentro del cual destacan los derivados de pirimidina. Derivados de piridina y pirimidina El núcleo de pirimidina genera gran interés en la búsqueda de antagonistas del receptor A3 ya sea en sistemas monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos. El grupo ComBioMed ha desarrollado con anterioridad diferentes compuestos dentro de esta 13 familia, como es el caso de la molécula ISVY130 e ISVY345, con una elevada afinidad y selectividad por el receptor A3 (Figura 1.8) (5). Figura 1.8 Ejemplo de antagonista pirimidínico del receptor A3. Sistemas tricíclicos Existen diferentes estructuras tricíclicas que actúan como antagonistas del receptor A3, destacando grupos como las triazoloquinazolinas y las pirazolo[3,4-c]quinolinas, entre otros (Figura 1.19). Dentro de esta línea de investigación hay ejemplos de diferentes compuestos como MRS1220 (12), 13 y 14 (Figura 1.9) (5). Figura 1.9 Ejemplos de antagonistas tricíclicos del receptor A3. NN N N Cl HN O NN N NBr NN N N NH O 14 12. MRS1220 13 Ki hA1 = 231 nM Ki hA2A = 25 nM Ki hA2B = 3% Ki hA3 = 0.59 nM Ki hA1 = >1000 nM Ki hA2A = >1000 nM Ki hA2B = - Ki hA3 = 8.2 nM Ki hA1 = >1000 nM Ki hA2A = >1000 nM Ki hA2B = - Ki hA3 = 2.1 nM 14 1.5 Estructura del receptor A3 El escenario óptimo para desarrollar ligandos selectivos para un receptor requiere conocer con la mayor precisión posible la estructura tridimensional de este. Actualmente, la técnica más usada para ello es la cristalización. Mediante la cristalización de un receptor (solo o con un ligando unido) se puede conocer en detalle su estructura, así como los aminoácidos implicados en la interacción con el fármaco. Actualmente disponemos de cristales del receptor A1 y A2A. Debido a la alta semejanza del receptor A3 con el receptor A1 se han podido emplear modelos informáticos para así desarrollar modelos de homología. Esto se basa en modelar computacionalmente la estructura del receptor A3 partiendo de la estructura conocida del receptor A1 (20,21). Gracias a la química computacional, existen simulaciones altamente precisas, como la realizada con la molécula ISVY-345 (22) unida al receptor A3 (Figura 1.10) que permiten tener una referencia en el diseño de nuevos ligandos. Figura 1.10 Modelo computacional de ISVY-345 unido al receptor A3. 1.6 Reacciones multicomponente como herramientas de síntesis La búsqueda de metodologías sintéticas más eficientes, rápidas y respetuosas con el medioambiente ha posicionado las reacciones multicomponente (RMC) como una de las metodologías emergentes en Química Farmacéutica. 15 En la mayoría de las RMC existentes interviene un compuesto carbonílico (a) y una amina (b) que, cuando reaccionan entre sí, forman un compuesto denominado aminol (c) y este compuesto da lugar a: iminas si la amina utilizada es primaria; sales de imino, si dicha amina es secundaria (d), tras el proceso de deshidratación. Finalmente, se le acopla el tercer componente de la reacción, un nucleófilo (Nu), obteniendo el producto final de la reacción (e) (Figura 1.11) (23,24). Figura 1.11 Esquema de reacción entre un compuesto carbonílico, una amina y un nucleófilo. 1.6.1 Ejemplos de reacciones multicomponente La historia de las reacciones multicomponente se remonta al año 1850 con el descubrimiento de la reacción de Strecker (23) . Ésta consiste en la combinación de un aldehído (a), una amina (b) y un ion cianuro (c) que forman un α-aminonitrilo (d), precursor sintético de los α-aminoácidos (e) (Figura 1.12). Figura 1.12 Reacción de Strecker. A partir de esta primera reacción aparecieron nuevas RMC. Un ejemplo es la síntesis de dihidropiridinas de Hantzsch (1882) (23). Aquí, los compuestos que intervienen son un aldehído (a), una amina (b) y dos equivalentes de un compuesto 1,3dicarbonílico (c), obteniendo como producto final una 1,4-dihidropiridina (d) (Figura 1.13). 16 Figura 1.13 Reacción de Hantzsch. Dentro de estas reacciones que, como hemos visto, utilizan grupos carbonilo, amino y nucleófilos, destacan las RMC que emplean isonitrilos. Las más relevantes en ese grupo son la reacción de Passerini y la reacción de Ugi (Figura 1.13) (24) . La primera utiliza un ácido carboxílico (a), un compuesto carbonílico (b), y un isonitrilo (c) para formar una α-aciloxiamida (d). En el caso de la reacción de Ugi se utiliza, además de los precursores nombrados anteriormente, una amina (e) formando una α-acilaminoamida (f) (Figura 1.14) Figura 1.14 Reacciones de Passerini y Ugi. Las RMC, a pesar de existir desde hace más de un siglo, no despertaron suficiente interés en el campo de la síntesis química hasta hace relativamente poco tiempo, donde se empezó a explotar su potencial en la investigación química y farmacéutica. En los siguientes apartados hablaremos, entre otros aspectos, de la reacción de Biginelli, RMC muy importante en este trabajo. 1.6.2 Características y ventajas de las RMC La química clásica se caracteriza por utilizar aproximaciones sintéticas lineales en varias etapas, modelo contrario al de las reacciones multicomponente (que realiza la síntesis en una única etapa). Este hecho le aporta a las RMC ciertas ventajas frente a las reacciones de la química tradicional (24): 17 • Economía de etapas: el modelo sintético de las RMC se basa en una etapa, por lo que el número de reacciones necesarias para llegar al producto final es mucho menor que en la química lineal (Figura 1.15). Este hecho aporta un ahorro de tiempo, de métodos de purificación y de disolventes. Además, el rendimiento global de la reacción es mayor, puesto que se evita perder producto entre una etapa y otra, como ocurre en la química clásica. • Economía de átomos: la mayoría de los átomos de los precursores que participan en una RMC acaban formando parte del producto final. Esto tiene importantes ventajas medioambientales. • Economía de enlace: en cada RMC se generan como mínimo dos nuevos enlaces, haciendo más eficiente la síntesis. • Simplicidad: la gran mayoría de las RMC se realizan bajo condiciones suaves, usando productos de partida sencillos y comerciales en la mayoría de los casos. • Poco contaminantes: el uso de disolventes es mucho menor que en las reacciones lineales y la formación de agua como subproducto permite reducir considerablemente el impacto medioambiental. Figura 1.15 Comparativa entre la síntesis lineal y la síntesis multicomponente (23). 18 La simplicidad y la rapidez, entre otros aspectos, hacen de las RMC una excelente herramienta para la síntesis de nuevos compuestos, permitiendo la preparación de compuestos con pequeñas variaciones estructurales. Esto genera un gran interés en el ámbito del descubrimiento de fármacos, debido a la elevada capacidad exploratoria de las RMC. 1.6.3 Reacción de Biginelli Reacción multicomponente descubierta en el año 1893 por el químico italiano Pietro Biginelli (23). La primera versión de la reacción fue utilizando como compuestos de partida benzaldehído, urea y acetoacetato de etilo en etanol a reflujo y con catálisis ácida, obteniendo a partir de esto como producto mayoritario el 6-metil-2-oxo-4-fenil1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato de etilo (25) (Figura 1.16). Figura 1.16 Primera reacción de Biginelli (24). A partir de esa primera reacción se verificó el potencial sintético de la transformación mediante la variación de sus tres componentes (Figura 1.17). Ésta consiste en usar β-cetoésteres, aldehídos y un derivado de la urea para obtener 3,4-dihidropirimidin1(H)-onas (DHP) (24). Además, permite explorar la reactividad de otro tipo de compuestos que mantengan semejanza química y estructural con estos tres grupos funcionales de partida. Los derivados del grupo β-cetoéster pueden ser sustituidos por grupos cetona, que presentan menos reactividad, la urea puede ser sustituida por tiourea o por compuestos con núcleo de guanidina y en el caso del aldehído, se pueden presentar diferentes variantes a parte de los aromáticos, como los alifáticos y los heterocíclicos (24,26). Lo mismo ocurre con los catalizadores empleados para la reacción, que, en las últimas décadas se ha registrado un crecimiento exponencial hasta llegar a presentar más de HO NH2 H2N O +HCl EtOH reflujo HN N H O OEt O OEt O O 15 16 17 18 19 300 tipos diferentes (27). Aunque la mayoría de ellos son ácidos de Lewis, destacan otro tipo de catalizadores con técnicas innovadoras como las nanopartículas de cobre (28) o incluso a nivel enzimático en levaduras (29). La gran variabilidad estructural permitida, además de la baja dificultad de la reacción, facilita su uso como herramienta para el descubrimiento de nuevos fármacos. Figura 1.17 Esquema general de la reacción de Biginelli (cat = catalizador). 1.6.3.1 Mecanismo de reacción A lo largo de los años el mecanismo de la reacción de Biginelli ha sido tema de debate. Los tres mecanismos más relevantes propuestos para la transformación deben su nombre al tipo de compuesto intermedio de reacción supuestamente formado. Cabe destacar que los diferentes mecanismos se diferencian en la pareja de precursores (e intermedios clave) que inician la secuencia que conduce al producto final: 1. Mecanismo imino: como bien dice el nombre, el producto intermedio relevante es una imina. Se da reacción entre la urea (a) y un aldehído (b) que forman una imina (i), la cual reacciona con el β-cetoéster (c) para finalmente formar la DHP (d) tras sufrir un proceso de ciclación intramolecular (Figura 1.18) (27). 2. Mecanismo enamina: este mecanismo propone la reacción de la urea (a) con el β-cetoéster para generar una enamina,(ii) que reaccionará con el aldehído para formar la DHP (d) tras sufrir un proceso de ciclación intramolecular (Figura 1.19) (27). 3. Mecanismo Knovenagel: se produce una condensación de Knovenagel entre el aldehído (a) y el β-cetoéster formando un aducto de Knovenagel (iii) (24) que reacciona con la urea (c) para formar la DHP (d) tras sufrir un proceso de ciclación intramolecular (Figura 1.20). 20 Figura 1.18 Mecanismo imino. Figura 1.19 Mecanismo enamina. 21 Figura 1.20 Mecanismo Knoevenagel. En 1933 Folkers y Johnson propusieron los posibles intermedios de la reacción (30). Cuatro décadas después, en el año 1973, destacaron los estudios de Sweet y Fissekis que propusieron el mecanismo de Knoevenagel, ya que defendían que inicialmente se producía una condensación (31) . Sin embargo, no fue hasta el año 1997 cuando Kappe, mediante técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN), descubre la presencia mayoritaria del intermedio imina (32). Esto demostró que el mecanismo predominante de la reacción de Biginelli es el mecanismo imina. 1.6.3.2 Estereoquímica en la reacción de Biginelli. Los compuestos obtenidos en la reacción de Biginelli son asimétricos, por lo que en dicha reacción se obtienen mezclas racémicas (27). Esto presenta gran relevancia en la química farmacéutica, puesto que en muchas ocasiones uno de los dos enantiómeros es el que presenta la mayor actividad farmacológica (eutómero) e incluso uno de los dos enantiómeros puede causar efectos contrarios al terapéutico y ser dañino (33,34). Debido a esto, es importante buscar métodos para poder separar ambos enantiómeros o variantes enantioselectivas y así poder mejorar la afinidad del compuesto por el receptor (ya que uno de los dos es inactivo o prácticamente inactivo) 28 Figura 2.3 PLS con viales Kimble de 7 mL. 2.2.1 Preparación de los β-cetoésteres Una mezcla de la 2,2,6-trimetil-4H-1,3-dioxin-4-ona 35 (1 eq, 50 mmol) y el alcohol 36a-e deseado (1 eq, 50 mmol) en 5 mL de tolueno se mantuvo en agitación a 150ºC durante 12 horas en un matraz de reacción. Comprobando que la reacción ha finalizado por cromatografía en capa fina (TLC), se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo obtenido fue purificado por columna cromatográfica (nhexano/Acetato de etilo 5:1-10:1). Los compuestos 30a-e se aislaron como aceites y se caracterizaron mediante RMN-1H. Los rendimientos de la síntesis oscilan entre el 60-85%. Figura 2.4 Esquema general de síntesis de los precursores. 29 A modo de ejemplo, se muestran los datos de RMN-1H de la molécula 30a, representativa de esta serie. 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm): 6.88 – 6.70 (m, 4H), 5.95 (d, J = 0.8 Hz, 3H), 5.06 (d, J = 1.7 Hz, 3H), 3.47 (s, 2H). 2.2.2 Preparación de los derivados tricíclicos Los productos finales se sintetizaron siguiendo el esquema sintético descrito y la metodología general para las tres series. Una mezcla de 1,5 equivalentes de 2-amino5-benzoimidazol, 1 equivalente de aldehído, 1 equivalente de β-dicarbonílico y 0,5 equivalentes de ácido cloroacético en 2 mL de THF se colocó en un vial Kimble. La mezcla se calentó a 90ºC durante 12 horas en un sintetizador orgánico (PLS). Comprobando que la reacción ha finalizado por TLC, se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo obtenido fue purificado por columna cromatográfica (MeOH/DCM 0.5%-3%) y/o preparativa (MeOH/DCM 1%) (Apartado 2.3) obteniendo los compuestos con un rendimiento entre el 20-50%. Finalmente se realizó la caracterización estructural de los compuestos mediante Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN-1H) (Apartado 2.4 y 3.3). 2.2.2.1 Serie I: exploración del grupo aldehído en posición 4 Siguiendo la metodología general descrita y el esquema sintético (Figura 2.5) se han preparado los compuestos 32a-k. Figura 2.5 Esquema general de síntesis de la serie I. A modo de ejemplo, se muestran los datos de RMN-1H de tres moléculas representativas de esta serie, 32b y 32h respectivamente. 30 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 10.77 (s, 1H), 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 12.6, 8.1 Hz, 3H), 7.01 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.91 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.78 – 6.67 (m, 4H), 6.36 (s, 1H), 5.99 (d, J = 0.9 Hz, 2H), 5.00 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 3.64 (s, 3H), 2.43 (s, 3H). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm): 7.51 (d, 1H), 7.25 – 7.14 (m, 2H), 7.14 – 7.03 (m, 1H), 6.83 – 6.70 (m, 3H), 6.52 (s, 2H), 6.39 (s, 1H), 5.97 (s, 2H), 5.11 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.70 (s, 6H), 2.76 (s, 3H). Serie II: exploración del grupo éster en posición 3 Siguiendo la metodología general descrita en la página 29 y el esquema sintético de la Figura 2.6 se han preparado los compuestos 33a-d. Figura 2.6 Esquema general de síntesis de la serie II. A modo de ejemplo, se muestran los datos de RMN-1H de dos moléculas representativas de esta serie, 33a y 33d respectivamente. 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm): 7.48 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.33 – 7.15 (m, 5H), 7.16 – 7.05 (m, 1H), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.63 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 5.89 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 5.12 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.68 (s, 3H). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ(ppm): 7.51 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.23 – 7.12 (m, 2H), 7.08 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.89 – 6.71 (m, 5H), 6.69 – 6.58 (m, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.88 (d, 2H), 5.30 (s, 1H), 5.07 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.27 (s, 4H), 2.72 (s, 3H). 31 2.2.2.2 Serie III: exploración combinada de R3 y R4 Siguiendo la metodología general descrita y el esquema sintético de la Figura 2.7 se han preparado los compuestos 34a-d. Figura 2.7 Esquema general de síntesis de la serie III. A modo de ejemplo, se muestran los datos de RMN-1H de la molécula 34a, representativa de esta serie. 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm): 7.48 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.29 – 7.09 (m, 5H), 7.05 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 6.88 – 6.69 (m, 3H), 6.40 (s, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.28 (d, J = 1.3 Hz, 4H), 2.71 (s, 3H), 2.26 (s, 3H). 2.3 Purificación Una vez finalizada la reacción, la mezcla resultante se purificó por cromatografía en columna (usando como fase estacionaria gel de sílice de Acros de 40-60 μm y como fase móvil una mezcla de MeOH/DCM (0,5-3%)) y/o cromatografía preparativa empleando gel de sílice de Acros de 40-60 μm como fase estacionaria y usando como fase móvil una mezcla de MeOH/DCM (1%) (Figura 2.8). 32 Figura 2.8 Ejemplos de cromatografía en columna (izquierda) y preparativa (derecha). 2.4 Caracterización estructural de los compuestos La Resonancia Magnética Nuclear es una herramienta analítica usada, además de en la medicina clínica, para apoyar la síntesis química y poder confirmar si se ha obtenido exactamente la estructura molecular que se buscaba. Esta técnica consiste en generar un campo magnético dentro de una bobina generadora, irradiar la muestra mediante una bobina emisora y detectar la absorción magnética que efectúe esta muestra por una bobina receptora y procesando después los datos mediante un software (37) . Dentro de los espectros más utilizados en la química orgánica destacan el espectro de Resonancia Magnética Nuclear de Carbono (RMN–13C) y el de protón (RMN-1H). Los espectros de RMN-1H se realizaron en el Centro singular de Investigación en Química biológica y materiales moleculares de la Universidad de Santiago de Compostela (CiQUS). El modelo de espectrómetro que se usó es BRUKER AMX 300 (Figura 2.9). Dichos espectros se realizaron a temperatura ambiente, usando como disolvente CDCl3 o DMSO-d6. Una vez realizado el experimento, los espectros fueron procesados usando el software Mnova de Mestrelab research. Los desplazamientos químicos δ se indican en ppm. La multiplicidad de la señal generada se representa con las abreviaturas s (singulete), d (doblete), t (triplete), q (quintuplete), m (multiplete), dd (doble doblete) y dt (doble 33 triplete), seguido del número de protones para los que integra esa señal. Las constantes de acoplamiento (J) están medidas en Hertzios (Hz). Figura 2.9 Varian 300 MHz Mercury (38). 2.5 Evaluación farmacológica La evaluación farmacológica representa la etapa de comprobación de la capacidad que tiene la molécula analizada de unirse a un receptor sobreexpresado en una célula que funcionará como soporte. Para los receptores de adenosina se realizan ensayos de competición con radioligando, que consiste en medir el desplazamiento que sufre un radioligando del receptor cuando se pone en contacto con 1 μM de disolución de la molécula que se analiza (39). Las moléculas preparadas por el grupo ComBioMed son evaluadas farmacológicamente por el grupo Biofarma de la profesora María Isabel Loza en el Centro Singular de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CiMUS) y para cada subtipo de receptor de adenosina se utilizan diferentes células: • Receptor A1: las células utilizadas para los ensayos con el receptor A1 son células ováricas de hámster chino (CHO) con sobreexpresión del receptor A1 (CHO-A1) marcadas con 2 nM [3H]DPCPX. • Receptor A2A: las células utilizadas para los ensayos con el receptor A2A son células de cáncer cérvico-uterino (HeLa) con sobreexpresión del receptor A2A (HeLa-A2A) marcadas 3 nM de [3H]ZM241385. 34 • Receptor A2B: las células utilizadas para los ensayos con el receptor A2B son células renales de embrión humano (HEK-293) con sobreexpresión del receptor A2B (HEK-293A2B) marcadas con 3 nM de 25 nM de [3H]DPCPX. • Receptor A3: las células utilizadas para los ensayos con el receptor A3 son células de cáncer cérvico-uterino (HeLa) con sobreexpresión del receptor A3 (HeLa-A3) marcadas con 30 nM [3H]NECA. Los resultados obtenidos del ensayo se expresan en porcentaje de desplazamiento del radioligando a concentración 1 μM o en constante de afinidad (Ki). Esta constante representa la concentración a la cual se alcanza un porcentaje de desplazamiento del 50% del radioligando. La constante de afinidad se determina mediante curvas dosisrespuesta para los ligandos que muestran porcentajes de desplazamiento superiores al 70%. Cuanto mayor es el porcentaje de desplazamiento o menores los valores de Ki, mayor afinidad presenta la molécula por el receptor. Respecto a la selectividad, ésta se considera comparando los valores de unión de la molécula a los cuatro subtipos de receptores de adenosina. Concretamente, una molécula selectiva y específica para el receptor A3 tendrá buenos valores de afinidad para este receptor y bajos para el resto de los subtipos. 35 3. Resultados y discusión 3.1 Diseño de ligandos Como indicamos anteriormente, el objetivo de este trabajo es el desarrollo de nuevos antagonistas selectivos del receptor A3. Para ello tenemos como base un modelo refinado de la interacción del receptor A3 con series de ligandos desarrollados anteriormente en nuestro grupo (Figura 3.1). Figura 3.1 Simulación computacional comparativa del receptor A3 (bolsillo lipofílico resaltado en azul) en la unión de análogos de ISVY-345 y datos farmacológicos (5,40). El nuevo modelo sugiere que podríamos ocupar una cavidad poco explorada. Para ello propusimos transformar el anillo pirimidínico central en un triciclo (mediante la creación de un ciclo) (Figura 3.2). Figura 3.2 Heteroclación del núcleo pirimidínico para los compuestos del presente trabajo. De esta forma se diseñaron los nuevos ligandos descritos en este trabajo. Los grupos de las posiciones R3 y R4 fueron elegidos entre los sustituyentes que mejor afinidad proporcionaran en series anteriores (Figura 3.3). 36 Figura 3.3 Compuestos antagonistas del receptor A3 que tomaron como referencia para los sustituyentes en R3 y R4 de los compuestos del presente trabajo. La elección del sistema tricíclico 1,4-dihidrobenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pirimidina se debe también a su accesibilidad sintética mediante la reacción de Biginelli. Cabe destacar que nuestro grupo ha empleado esa reacción y este heterociclo para mejorar antagonistas selectivos del receptor A2B (Figura 3.4). Figura 3.4 Comparativa estructural para obtener antagonismo A2B o A3 en el mismo sistema tricíclico (39). 37 Los estudios con el receptor A2B nos han permitido verificar que los grupos óptimos para las posiciones R4 y R3 son un anillo heterocíclico pentagonal (furano o tiofeno) y un grupo etilo o isopropilo (Figura 3.4). En todos los datos hemos observado que cambios fuera de esos grupos conducen a la pérdida de la afinidad A2B. Aprovechando esas observaciones y las predicciones del modelo computacional, decidimos introducir en R4 Y R3 grupos voluminosos con residuos alcoxi (que proporcionan afinidad por el receptor A3) (Figura 3.3). A diferencia de anteriores series de ligandos A3 de nuestro grupo (que tienen los grupos alcoxifenilo en posición 1,3) los nuevos compuestos aquí descritos tienen esos residuos en posiciones contiguas (1,2). En cualquier caso, los modelos computacionales sugieren que debido a la mayor flexibilidad del grupo en R3 esa modificación sería bien tolerada (Figura 3.5). Figura 3.5 Comparativa 2D de disposición entre compuestos conocidos y obtenidos en este trabajo para su unión al receptor A3. 44 Caracterización estructural A modo de ejemplo de esta serie, se muestra el espectro de 1H-RMN (Figura 3.15) de la molécula 34b. Figura 3.15 Espectro de RMN-1H del compuesto 34b. 45 3.4 Evaluación farmacológica de los compuestos frente al receptor de adenosina Ante la inesperada pandemia de la enfermedad Covid-19; y debido al confinamiento, no se han podido realizar la evaluación farmacológica de la mayoría de los compuestos descritos. El único compuesto evaluado (32k) mostró una elevada afinidad por el receptor A3 de adenosina (Ki = 2.28 nM) y excelente selectividad frente al resto de subtipos (Figura 3.16). Figura 3.16 Resultados de la evaluación farmacológica del compuesto 32k. A la espera de obtener los datos farmacológicos del resto de la serie (que serán evaluados en septiembre), el excelente perfil de potencia y selectividad de 32k permite ser optimistas. La comparación estructural y de los datos farmacológicos de 32k y el ligando modelo 23, permiten sugerir que la estrategia de diseño empleada en este trabajo es acertada (Figura 3.17). Figura 3.17 Izquierda: Antagonista selectivo del receptor A3 de adenosina. Derecha: Compuesto obtenido en el presente trabajo con mejora en los resultados. 46 4. Conclusiones 1) Hemos sintetizado una nueva familia de potenciales antagonistas del receptor A3 de adenosina empleando la reacción de Biginelli. 2) Los resultados de la evaluación farmacológica del ligando 32k y a la espera de recibir los datos farmacológicos de los otros miembros de las series, permiten validar de forma preliminar la hipótesis de diseño que sirvió de inspiración al presente proyecto. 3) Hemos identificado un nuevo antagonista selectivo del receptor A3 derivado del sistema 1,4-dihidrobenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pirimidina (Figura 3.16). 47 Bibliografía 1. Rang H, Dale M. Farmacología. 8a Ed. Elsevier; 2008. 2. Layland J, Carrick D, Lee M, Oldroyd K, Berry C. Adenosine: Physiology, pharmacology, and clinical applications. JACC Cardiovasc Interv. 2014;7(6):581-91. 3. 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J Med Chem. septiembre de 2017;60(17):7502-11. 52 Índice de Figuras Figura 1.1 Estructura química de la ADO. ............................................................................................... 4 Figura 1.2 Metabolitos formados a partir de la ADO y enzimas responsables (AQ = Adenosín quinasa; 5’NT = 5’-Nucleotidasa, PDE = Fosfodiesterasa y AC = Adenilato ciclasa). .................................. 5 Figura 1.3 Estructura de los subtipos de AR y esquema de su funcionalidad (Elaboración propia). ..... 6 Figura 1.4 Localización de los AR (5). .................................................................................................... 7 Figura 1.5 Esquema de la fisiopatología del receptor A3 (Elaboración propia). ................................... 10 Figura 1.6 Ejemplos de agonistas del receptor A3 y su semejanza estructural con la ADO. En rojo el núcleo de adenina y en azul el núcleo de ribosa. ......................................................................... 11 Figura 1.7 Ligandos naturales y su comparación con los compuestos sintéticos 8 y 9. ...................... 12 Figura 1.8 Ejemplo de antagonista pirimidínico del receptor A3. .......................................................... 13 Figura 1.9 Ejemplos de antagonistas tricíclicos del receptor A3. .......................................................... 13 Figura 1.10 Modelo computacional de ISVY-345 unido al receptor A3. ................................................ 14 Figura 1.11 Esquema de reacción entre un compuesto carbonílico, una amina y un nucleófilo. ......... 15 Figura 1.12 Reacción de Strecker. ........................................................................................................ 15 Figura 1.13 Reacción de Hantzsch. ...................................................................................................... 16 Figura 1.14 Reacciones de Passerini y Ugi. ......................................................................................... 16 Figura 1.15 Comparativa entre la síntesis lineal y la síntesis multicomponente (23). .......................... 17 Figura 1.16 Primera reacción de Biginelli (24). ..................................................................................... 18 Figura 1.17 Esquema general de la reacción de Biginelli (cat = catalizador). ...................................... 19 Figura 1.18 Mecanismo imino. .............................................................................................................. 20 Figura 1.19 Mecanismo enamina. ......................................................................................................... 20 Figura 1.20 Mecanismo Knoevenagel. .................................................................................................. 21 Figura 1.21 Ejemplos y datos farmacológicos de antagonistas del receptor A3 obtenidos en anteriores trabajos (5). ................................................................................................................................... 22 Figura 1.22 Izquierda: ISVY-130, antagonista selectivo A3. Centro: simulación computacional de unión al receptor A3. Derecha: SY1DM-18, antagonista selectivo A3. ................................................... 23 Figura 1.23 Izquierda: SYAF-30, antagonista selectivo A2B. Derecha: ISAM-140 antagonista selectivo A2B con mejor afinidad debido al esqueleto tricíclico. ................................................................... 23 53 Figura 1.24 Estructura general de las 3 series objetivo. ....................................................................... 24 Figura 2.1 Esquema general del proyecto. ........................................................................................... 26 Figura 2.2 Esquema general de síntesis de los compuestos tricíclicos finales. ................................... 27 Figura 2.3 PLS con viales Kimble de 7 mL. .......................................................................................... 28 Figura 2.4 Esquema general de síntesis de los precursores. ............................................................... 28 Figura 2.5 Esquema general de síntesis de la serie I. .......................................................................... 29 Figura 2.6 Esquema general de síntesis de la serie II. ......................................................................... 30 Figura 2.7 Esquema general de síntesis de la serie III. ........................................................................ 31 Figura 2.8 Ejemplos de cromatografía en columna (izquierda) y preparativa (derecha). ..................... 32 Figura 2.9 Varian 300 MHz Mercury (38). ............................................................................................. 33 Figura 3.1 Simulación computacional comparativa del receptor A3 (bolsillo lipofílico resaltado en azul) en la unión de análogos de ISVY-345 y datos farmacológicos (5,40). ......................................... 35 Figura 3.2 Heteroclación del núcleo pirimidínico para los compuestos del presente trabajo. .............. 35 Figura 3.3 Compuestos antagonistas del receptor A3 que tomaron como referencia para los sustituyentes en R3 y R4 de los compuestos del presente trabajo. .............................................. 36 Figura 3.4 Comparativa estructural para obtener antagonismo A2B o A3 en el mismo sistema tricíclico (39). ............................................................................................................................................... 36 Figura 3.5 Comparativa 2D de disposición entre compuestos conocidos y obtenidos en este trabajo para su unión al receptor A3. ........................................................................................................ 37 Figura 3.6 Precursores obtenidos ......................................................................................................... 38 Figura 3.7 Espectro de RMN-1H del compuesto 30b. ........................................................................... 38 Figura 3.8 Esquema sintético y compuestos de la serie I. .................................................................... 39 Figura 3.9 Espectro de RMN-1H del compuesto 32b. ........................................................................... 40 Figura 3.10 Espectro de RMN-1H del compuesto 32h. ......................................................................... 40 Figura 3.11 Esquema sintético y compuestos de la serie II. ................................................................. 41 Figura 3.12 Espectro de RMN-1H del compuesto 33a. ......................................................................... 42 Figura 3.13 Espectro de RMN-1H del compuesto 33d. ......................................................................... 42 Figura 3.14 Esquema sintético y compuestos de la serie III. ................................................................ 43 Figura 3.15 Espectro de RMN-1H del compuesto 34b. ......................................................................... 44 Figura 3.16 Resultados de la evaluación farmacológica del compuesto 32k. ..................................... 45