Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina

Departamento de Fisiología y Departamento de Psiquiatría, Radiología y Salud Pública, Enfermería y Medicina Facultad de Medicina Programa de Doctorado en Endocrinología ESTUDIO PRECLÍNICO DE LA PARADOJA DE LA OBESIDAD EN LA ISQUEMIA CEREBRAL: EFECTO TERAPÉUTICO DEL TRATAMIENTO CON NICOTINA Tesis Doctoral Tania López González 2017 FINANCIACIÓN El presente trabajo fue financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias del Ministerio de Economia, Industria y Competitividad a través del Instituto Carlos III (PIE13/00024), por el Ministerio de Economía y Competitividad a través del Instituto de Salud Carlos III (RETICS INVICTUS+:RD16/0019) y por la Xunta de Galicia (Consellería de Educación: GRC2014/027). Durante el período de desarrollo del trabajo, la doctoranda Tania López González ha sido beneficiaria de una ayuda predoctoral del Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago de Compostela (convocatoria 2014). En dicho período, el Prof. Dr. Miguel López ha sido beneficiario de una ayuda Starting Grant, modalidad Consolidator, del European Research Council (ERC-2011-StG-281854-LS4), y el Dr. Tomás Sobrino ha sido beneficiario de un contrato Miguel Servet del Instituto de Salud Carlos III (CP12/03121). AGRADECIMIENTOS Teño que decir que este é o primeiro apartado da tese que escribo, e a razón é sinxela… a tese non tería sentido sen toda esta xente da que vou a falar! Igual me estendo máis da conta, pero a miña situación actual fai que os meus sentimentos se expresen sen control. Agradecezolle aos meus directores de tese, Miguel, Tomás e Pepe, darme a oportunidade de formar parte dos seus respectivos grupos e poder levar a cabo esta tese, foi realmente enriquecedor para min a colaboración entre estos dous grandes grupos. Miguel, moitas grazas por ese primeiro voto de confianza sen apenas coñecerme. Tomás, a ti teño que agradecerche a hospitalidade coa que me recibiches no LINC. E Pepe, grazas polo teu apoio e por facer de todos nós un verdadeiro grupo. Recordo moi ben o momento exacto no que Miguel me abreu as portas do laboratorio de Neurobesidade… alí coñecín ás persoas que me axudaron a emprender o camiño da tese. Cris, esa profesora que calquera desexa, grazas por ter sempre un sorriso e palabras de amabilidade. Noe e Patri, investigadoras natas e as mulleres máis traballadoras do mundo, fostes todo un referente para aprender. Laura e Eva, as duas en punto, grazas por esa disposición e por facer que se formase un bo grupo de traballo, e en particular pola axuda cos últimos estudos moleculares cando eu máis o necesitaba. Isma, grazas por resolverme moitas dúbidas e por transmitir esa tranquilidade que tantas veces se precisa. Ángela, eres a espontaneidade en persoa, grazas por todalas risas contigo. Agradecer tamén ao resto de persoas do grupo, coas que non tiben a oportunidade de lidiar tanto; Ánxela, Ahmed, Luis Martins, Edward… E tamén á xente dos laboratorios veciños que forman a planta 0 do CIMUS… Tres meses despois, tiben a oportunidade de coñecer á xente do LINC… Fran, grazas polos teus bos consellos e por demostrar que un IP tamén curra en poyata. A Bárbara e María, as supernenas, maestras da ciencia e da vida, grazas por recibir cos brazos abertos a Carry Bradford no “despachito” e por facela soñar que algún día sería como vos. Ramón e Juan, esos físicos que tanto me costa entender ás veces, grazas por sempre poñer unha boa cara e por toda a axuda coas resonancias, sen vos faltarían capítulos na tese. Grazas tamén as persoas de ANEVAS, que fixeron que aprendese moito sobre a parte clínica de este campo. Decirlle aos novos membros do LINC, Pablo e Marta, que, ainda que non deu tempo a coñecernos demasiado, lles desexo moita sorte. Quero facer un agradecemento especial ás persoas que me fixeron ver que “a ciencia é amor”. Esteban, amigo, a ti teño tanto que agradecerche… máis alá de todo o que me ensinaches como “tutor”, grazas por esos cafés, noites santiaguesas, conversas absurdas… e sobre, polos teus abrazos. Claris, tan diferentes e iguais ao mesmo tempo, grazas por saber entenderme con unha simple mirada e por poder contar contigo sempre, e sobre todo por todas as nosas “escondidas”… Andrés, guapo por fóra pero máis ainda por dentro, grazas por sacarme as risas máis grandes no LINC e por estar pendente sempre de cómo estou; máis de un día fixeches que o meu día malo se convertise en bo. Antonio, ese home que calquera muller quixese ter ó seu lado, grazas pola túa xenerosidade, por facer as cousas sen que chas pidan, e pola túa naturalidade en xeral. Albiña, a persoa que se me pasa pola cabeza ante unha dúbida (científica e non…), grazas por resolvermas sempre e por todas as boas conversacións que me deches (cánto me gusta verte razoar). Nacho, a definición gráfica de “boa persoa”, grazas por ter sempre palabras amables e por sacarlle o punto positivo a todo, que falta fas no laboratorio. Manolito, tan intrigante como interesante, grazas polos teus alagos e polas tuas palabras educadas e caballerosas de vez en cando. Fernando, veciño e amigo da adolescencia, grazas por poder desfrutar da túa sabiduría no LINC tamén. Uxía, a dulzura en persoa, grazas por estar sempre disposta a todo, e sobre todo polas boas noites de festa. Héctor, grazas pola túa axuda cando comecei coas ciruxías e polos teus “chistazos” que me sacaron máis de un sorriso. Paulo, grazas por demostrar que sempre estas disposto a botar unha man. Por último, pero non por iso menos importante, a Joserra, o confidente de todo o laboratorio, o home con máis paciencia do mundo, grazas por todo. Ás miñas amigas da universidade Nuria e María, grazas por seguir estando ahí na distancia. Aos de sempre, David, Natalia, Laura, Chus, Sol, Kike, Suso, Sandra, Xiana… grazas por distraerme da ciencia de vez en cando. En especial a Adri, Ana, Aitor e Silvia, grazas por apoiarme en este camiño que tomei e por brindarme a vosa amizade. Moitas grazas Ana por axudarme a tomar decisións importantes. Adri, grazas a ti por ser a persoa que sempre está pendente de todo. A toda a miña familia, grazas por facerme sentir importante cada vez que vos interesades polo que fago. Avoa María, grazas por ensinarme que loitando se consegue o que te propoñas. Avoa Antonia, a miña segunda mama e a mellor persoa que coñezo, grazas por ensinarme os valores máis importantes da vida, oxalá algún chegue a ser así. A ti, Iván, a miña outra metade, grazas por ser un perfecto compañeiro de viaxe e por aguantar o bo e o malo da ciencia ó meu lado. Grazas por entenderme, por apoiarme e por quererme. Por todo o que me das día a día, e polo tesouro que me deches este ano, grazas. Finalmente, grazas á miña irma Alba e os meus país. A ti, Albis, por ser a nena dos meus ollos e sobre todo por darme tanto cariño de forma incondicional. Ao meu pai Antonio teño que agradecerllle que me ensinase a cuestionarme o porqué das cousas, así como os seus innumerables consellos que, ainda que non sempre sigo, sei que son acertados. Grazas por brindarme coa túa axuda sempre. E a miña nai, Leonor, agradezolle que me ensinase a “andar pola vida”, foi sempre, e é, o meu referente en todo. Grazas por facerme sentir que estas e estarás sempre. ratas isquémicas, e o mecanismo molecular parece ser a través da inhibición da AMPK e consecuentemente, das rutas de ER stress, autofaxia e apoptose.  Palabras chave: ictus isquémico, obesidade, nicotina, AMPK Resumen El ictus isquémico es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo, pero su tratamiento farmacológico se reduce a la recanalización de los vasos, que solo se aplica al 5% de los pacientes. Por otro lado, la obesidad es un factor de riesgo para padecer un ictus, sin embargo, algunos estudios recientes hablan de la paradoja de la obesidad, sugiriendo que los pacientes obesos puedan tener mayores tasas de supervivencia después de un ictus en comparación a los pacientes de peso normal. De la misma forma, el tabaquismo es un factor de riesgo para padecer esta enfermedad, pero también hay estudios que describen una mejor respuesta de los fumadores al tratamiento recanalizador tras un ictus. Además, in vitro, se ha descrito el efecto neuroprotector de la nicotina e, in vivo, el pretratamiento con nicotina parece mejorar la lesión. Por otro lado, se ha descrito que la nicotina desencadena la inhibición hipotalámica de la AMPK con el consecuente balance energético negativo, tanto en ratas con dieta estándar como en un modelo de obesidad inducida por dieta. Ante esto, el objetivo de este trabajo ha sido estudiar el efecto de la obesidad en un modelo de rata inducido por dieta alta en grasa frente a un grupo de ratas con dieta estándar sometidos a la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO), al igual que el efecto del tratamiento con nicotina en este modelo de isquemia cerebral dentro de ambos tipos de dieta. Además, ante la implicación de la obesidad en la homeostasis energética y la inhibición de la AMPK por parte de la nicotina, se ha llevado a cabo el estudio molecular de este regulador homeostático y de las rutas downstream de la misma de autofagia, ER stress y apoptosis. Partiendo de volúmenes de lesión basales homogéneos, se ha visto que las ratas obesas muestras una mayor reducción del volumen de lesión a largo plazo, a partir de los 14 días, así como un incremento de la disminución del déficit motor y sensitivo a los 7 días, respecto al grupo con dieta estándar. Paralelamente, se ha visto una reducción de la apoptosis (caspasa 3) en este grupo, mientras que no se observan diferencia para las otras rutas estudiadas. En ambos grupos de dieta, el tratamiento con nicotina reduce los volúmenes de lesión desde las 24 horas y a lo largo de 28 días. Además, este tratamiento disminuye el edema y el déficit motor y sensorial de los animales. A nivel molecular se ha observado la inhibición de las rutas de AMPK, autofagia, ER stress y apoptosis bajo el tratamiento con nicotina. Con la activación de AMPK mediante AICAR se revierte el efecto neuroprotector de la nicotina y la activación de las otras rutas estudiadas, corroborando que el mecanismo molecular que subyace al efecto neuroprotector de la nicotina implica la inhibición de esta kinasa. Por tanto, la obesidad reduce el volumen de lesión y el déficit motor y sensorial, a largo plazo, tras un ictus isquémico, probablemente a través de la inhibición de la apoptosis. Por otro lado, el tratamiento con nicotina reduce el volumen de lesión, el edema y el déficit motor y sensorial en ratas isquémicas, y el mecanismo molecular parece ser a través de la inhibición de la AMPK y consecuentemente, de las rutas de ER stress, autofagia y apoptosis.  Palabras clave: ictus isquémico, obesidad, nicotina, AMPK Abstract Ischemic stroke is one of the leading causes of death and disability worldwide, but its farmacologic treatment is reduced to recanaization of vessels, only for 5% of patients. On the other hand, obesity is a risk factor for stroke, however, some recent studies show the obesity paradox, suggesting that obese patients may have higher survival rates after a stroke compared to patients of normal weight. Likewise, smoking is a risk factor for this disease, but there are also studies that describe a better response to recanalization treatment after a stroke in smokers patients. In addition, the neuroprotective effect of nicotine has been described in vitro, and in vivo, the pretreatment with nicotine improves the lesión. On the other hand, it has been reported that nicotine triggers the hypothalamic inhibition of AMPK with a consequent negative energy balance in rats with standard diet and in a diet-induced obesity model. The objective of this project has been to study the effect of obesity on a high fat diet induced rat model in contrast to a group of rats with a standard diet undergoing transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO), as well as the effect of nicotine treatment in this model of cerebral ischemia within both types of diet. In addition, due to the implication of obesity in energy homeostasis and the inhibition of AMPK by nicotine, it was carried out a molecular study of this homeostatic regulator and downstream pathways of autophagy, ER stress and apoptosis. From homogeneous basal lesion volumes, obese rats show a long-term reduction in the volume lesión, after 14 days of ischemia, as well as in the neurological deficit at 7 days, in contrast to estándar group. Moreover, it has been observed a reduction of apoptosis (caspase 3) in this group. In both diet groups, nicotine treatment reduces lesion volumes from 24 hours and during 28 days. In addition, this treatment decreases edema and neurological deficit of animals. At the molecular level, the inhibition of AMPK, autophagy, ER stress and apoptosis has been observed under nicotine treatment. Activation of AMPK through AICAR reverses the neuroprotective effect of nicotine and activation of the other pathways studied, corroborating that the molecular mechanism underlying the neuroprotective effect of nicotine involves the inhibition of this kinase. Thus, obesity reduces long-term volume lesion and motor and/or sensitive déficit after stroke, probably through the inhibition of apoptosis. On the other hand, nicotine treatment reduces volume lesion, edema and neurological deficit in ischemic rats, and the molecular mechanism seems to be through the AMPK inhibition and, consequently, the ER stress, autophagy and apoptosis inhibition.  Keywords: ischemic stroke, obesity, nicotine, AMPK Índice ÍNDICE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ....................................................................................... 29 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 37 1. Enfermedad cerebrovascular: ictus ............................................................................. 37 1.1. Definición ............................................................................................................... 37 1.2. Epidemiología ........................................................................................................ 37 1.3. Clasificación ........................................................................................................... 38 1.3.1. Ictus isquémico .............................................................................................. 39 1.3.2. Ictus hemorrágico .......................................................................................... 40 1.4. Factores de riesgo .................................................................................................. 40 1.4.3. Factores de riesgo no modificables .............................................................. 40 1.4.4. Factores de riesgo modificables .................................................................... 40 1.5. Fisiopatología ......................................................................................................... 41 1.5.1. Descenso del flujo sanguíneo ........................................................................ 41 1.5.2. Fallo energético .............................................................................................. 42 1.5.3. Desequilibrio iónico y despolarización de la membrana celular ............... 44 1.5.4. Excitoxicidad.................................................................................................. 44 1.5.5. Estrés oxidativo ............................................................................................. 46 1.5.6. Apoptosis ........................................................................................................ 47 1.5.7. Inflamación .................................................................................................... 49 1.5.8. Mecanismos de regeneración ........................................................................ 52 1.6. Enfoques terapéuticos para el tratamiento del ictus isquémico ........................ 52 1.6.1. Marcadores de progresión del ictus isquémico ........................................... 53 1.6.2. Restauración del flujo sanguíneo ................................................................. 55 1.6.3. Neuroproteción .............................................................................................. 56 1.6.4. Neurorreparación .......................................................................................... 59 1.7. Modelos animales de isquemia cerebral .............................................................. 61 2. Obesidad ......................................................................................................................... 63 2.5. Definición ............................................................................................................... 63 2.6. Importancia socieconómica .................................................................................. 64 2.7. Homeostasis energética ......................................................................................... 65 2.7.1. Concepto ......................................................................................................... 65 2.7.2. Regulación de la homeostasis energética ..................................................... 67 2.7.2.1. Señales periféricas ..................................................................................... 67 2.7.2.2. Sistema nervioso central ........................................................................... 69 3. La paradoja de la obesidad en el ictus isquémico ....................................................... 70 3.1. La obesidad como factor de riesgo para el ictus isquémico ............................... 70 3.2. La obesidad como indicador de buen pronóstico tras un ictus isquémico ....... 71 3.3. Efecto de la obesidad en los modelos animales de isquemia cerebral ............... 73 3.4. Implicación de rutas moleculares relacionadas con el control de la homeostasis energética en el ictus isquémico ....................................................................................... 79 3.4.1. La ruta de la AMPK ...................................................................................... 79 3.4.2. El estrés del retículo endoplasmático ........................................................... 87 3.5. El tratamiento dual con nicotina de la obesidad y el ictus isquémico ............... 89 3.5.1. La nicotina ..................................................................................................... 89 3.5.2. Efecto de la nicotina en la obesidad ............................................................. 90 3.5.3. Efecto de la nicotina en el ictus isquémico .................................................. 90 3.5.3.1. La paradoja del tabaquismo en pacientes con ictus isquémico ............. 90 3.5.3.2. Efecto de la nicotina en modelos animales de isquemia cerebral .......... 92 HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 97 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 101 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 105 4. Modelo preclínico ........................................................................................................ 105 4.1. Manejo de animales ............................................................................................. 105 4.2. Modelo de obesidad inducida por dieta ............................................................. 106 4.3. Modelo de isquemia focal transitoria ................................................................ 107 4.4. Criterios de inclusión .......................................................................................... 108 4.5. Aleatorización de los grupos ............................................................................... 109 4.6. Diseño experimental ............................................................................................ 109 5. Procedimientos para el seguimiento de los animales ............................................... 111 5.1. Administración de tratamientos ......................................................................... 111 5.2. Estudios por resonancia magnética ................................................................... 112 5.2.1. Equipo de resonancia .................................................................................. 112 5.2.2. Protocolo de neuroimagen por resonancia magnética ............................. 112 5.2.2.1. Angiografía por resonancia magnética .................................................. 112 5.2.2.2. Imágenes de difusión y mapas de coeficiente de difusión aparente .... 112 5.2.2.3. Secuencia T2 ............................................................................................ 113 5.2.3. Análisis de las imágenes de resonancia magnética ................................... 113 5.3. Evaluación funcional y del déficit motor y sensorial ........................................ 114 Índice 5.4. Sacrificio, disección y extracción de tejidos ...................................................... 116 6. Análisis molecular de proteínas en el hemisferio ipsilateral ................................... 116 6.1. Extracción de proteína ........................................................................................ 116 6.2. Cuantificación de proteína ................................................................................. 117 6.3. Western blot ......................................................................................................... 117 6.3.1. Preparación de las muestras ....................................................................... 117 6.3.2. Electroforesis ............................................................................................... 118 6.3.3. Transferencia ............................................................................................... 119 6.3.4. Inmunodetección de proteínas ................................................................... 120 6.3.5. Revelado y fijación de la señal.................................................................... 121 6.3.6. Cuantificación .............................................................................................. 122 7. Análisis estadístico....................................................................................................... 122 RESULTADOS ........................................................................................................................ 127 8. Animales incluidos en el estudio................................................................................. 127 9. Efecto de la obesidad en el modelo animal de isquemia cerebral ........................... 129 9.1. Evaluación del modelo de obesidad inducida por dieta ................................... 129 9.2. Influencia de la obesidad en el volumen de la lesión isquémica ...................... 131 9.3. Influencia en la formación del edema cerebral ................................................. 133 9.4. Análisis funcional y del déficit motor y sensorial ............................................. 134 9.5. Influencia de la obesidad en las rutas moleculares implicadas en la homeostasis energética ......................................................................................................................... 136 9.5.1. La ruta de la AMPK .................................................................................... 136 9.5.2. La ruta de mTOR y de la autofagia ........................................................... 137 9.5.3. El ER stress .................................................................................................. 138 9.5.4. La apoptosis ................................................................................................. 138 10. Efecto neuroprotector de la nicotina en el modelo animal de isquemia cerebra ............................................................................................................................... 139 10.1. Disminución del peso corporal, ingesta y peso de la grasa .......................... 139 10.2. Reducción del volumen de lesión isquémica ................................................. 142 10.3. Disminución del edema cerebral .................................................................... 144 10.4. Mejora funcional y del déficit motor y sensorial .......................................... 146 10.5. Influencia de la nicotina en las rutas moleculares implicadas en el control de la homeostasis energética ................................................................................................ 147 10.5.1. Inhibición de la ruta de la AMPK .............................................................. 147 10.5.2. Inhibición de la autofagia ........................................................................... 149 10.5.3. Inhibición del ER stress .............................................................................. 150 10.5.4. Inhibición de la apoptosis ........................................................................... 151 10.6. Reversión del efecto neuroprotector de la nicotina con un activador de la ruta de AMPK ................................................................................................................. 152 10.6.1. Incremento del volumen de lesión y edema isquémico............................. 152 10.6.2. Empeoramiento funcional y del déficit motor y sensorial ....................... 156 10.6.3. Reversión del efecto de la nicotina sobre las rutas moleculares implicadas en la homeostasis energética ....................................................................................... 159 10.6.3.1. Activación de la ruta de AMPK ........................................................... 159 10.6.3.2. Activación de la autofagia ..................................................................... 160 10.6.3.3. Activación del ER stress........................................................................ 161 10.6.3.4. Influencia en la apoptosis...................................................................... 162 DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 167 CONCLUSIONES ................................................................................................................... 181 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 183 INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES Introducción Tania López González Página 37 INTRODUCCIÓN 1. Enfermedad cerebrovascular: ictus 1.1. Definición La Enfermedad Cerebrovascular (ECV) es el conjunto de manifestaciones clínicas del sistema nervioso central derivadas de alteraciones de la circulación cerebral. Dentro de las enfermedades cerebrovasculares se encuentra el ictus, que la Organización Mundial de la Salud (OMS) define como: “el desarrollo clínico rápido de signos focales de alteración de la función cerebral sin otra causa aparente que no sea el origen vascular”. El ictus se origina como consecuencia de la alteración del flujo cerebral normal, lo que resulta en la alteración transitoria o permanente de la función de una o más partes del cerebro. Alternativamente se puede definir como todas las alteraciones, por mecanismos isquémicos o hemorrágicos, que afectan a alguna parte del cerebro de manera transitoria o permanente, hasta el punto de inducir alteraciones metabólicas o bioquímicas que conducirían a la muerte cerebral, y consecuentemente, a la alteración del sistema nervioso [1]. 1.2. Epidemiología El ictus es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Cada año, alrededor de 15 millones de personas sufren un ictus, y de ellos, 6.7 millones mueren y la mayoría de los supervivientes sufren algún grado de discapacidad [2]. Según la OMS, la incidencia media mundial de la enfermedad cerebrovascular es alrededor de 200 casos nuevos por 100000 habitantes [3]. En Europa existen diferencia entre las poblaciones del norte y del sur, siendo las cifras más altas en países nórdicos como Finlandia (270 por 100000 en hombres), y las menores en los del sur como Italia y Portugal (100 por 100000 en hombres) [4]. En España, el ictus es la primera causa de muerte en mujeres y la tercera en hombres (superado únicamente por las muertes debido a infarto de corazón y cáncer de pulmón) [5]. La incidencia en España es de 167 por 100000 habitantes/año (181 para hombres y 153 para mujeres), siendo mayor en Galicia en relación con el envejecimiento de la población [6]. Teniendo en cuenta que la incidencia aumenta en personas mayores de 65 años y que, en base a una mejoraría en la calidad de vida, se está produciendo un incremento notable en la esperanza de vida y un envejecimiento progresivo de la población mundial, la prevalencia de esta enfermedad aumenta, y con ella, la magnitud del problema sociosanitario que implica. Por ello, el ictus supone un problema de salud que obliga a establecer mejores pautas de prevención y tratamiento para reducir tanto su incidencia como el grado de discapacidad que origina. También hay que señalar que, a pesar de la incidencia incrementada, el número de muertes por Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina ictus se redujo significativamente en las últimas décadas, principalmente debido a la mejoría en el manejo de pacientes tras la creación de unidades de ictus especializadas, el uso de activador del plasminógeno tisular recombinante (rtPA) como una terapia trombolítica, o a los avances en la trombectomía mecánica [2]. 1.3. Clasificación Atendiendo a la naturaleza de la lesión, el ictus se puede clasificar en dos grupos principales (Figura 1): el isquémico, en el que un flujo sanguíneo inadecuado provoca un área circunscrita de infarto cerebral, y el hemorrágico, en el que una extravasación sanguínea en el parénquima cerebral produce lesión y desplazamiento de las estructuras cerebrales [7]. Sin embargo, se pueden usar clasificaciones alternativas de esta enfermedad cerebrovascular teniendo en cuenta otros parámetros como el subtipo de ictus, el perfil de progresión, características de neuroimagen, tamaño y topografía de la lesión, naturaleza, y otros mecanismos de inducción y etiología. Figura 1. Ictus isquémico e ictus hemorrágico. El ictus isquémico ocurre cuando se obstruye una arteria del cerebro y el ictus hemorrágico cuando hay una hemorragia en un área cerebral. Creative commons. Introducción Tania López González Página 39 1.3.1. Ictus isquémico El ictus isquémico es el tipo más común, representando sobre el 80% de los ictus [8]. Se habla de isquemia cerebral focal cuando sólo afecta a una parte del cerebro, y dentro de esta, podemos diferenciar entre ataque isquémico transitorio (AIT) e infarto cerebral. El AIT se define como la disfunción cerebral focal o monocular, con síntomas que duran menos de 1 hora, cuyo origen es la isquemia causada por un trombo o embolia arterial en relación con enfermedad arterial, cardiaca o hematológica [9]. Los pacientes con AIT presentan un alto riesgo de padecer, posteriormente, un ictus (infarto cerebral) u otros episodios vasculares, principalmente coronarios. El infarto cerebral se define como una lesión causada por una isquemia intensa o prolongada, la cual produce la pérdida irreversible de células. Según su etiología, el ictus isquémico puede clasificarse en base a los criterios TOAST [10] en:  Infarto aterotrombótico: (~20%) Presencia de estenosis igual o mayor al 50% del diámetro luminal u oclusión de una arteria extracraneal o intracraneal de gran calibre que suple la región clínicamente afectada, en ausencia de otra etiología.  Infarto cardioembólico: (~25%) Presencia de fuente embolígena inequívoca (trombo o tumor intracardíaco, estenosis mitral reumática, prótesis aórtica o mitral, endocarditis, fibrilación auricular, enfermedad del nodo sinusal, aneurisma ventricular izquierdo, infarto agudo de miocardio de menos de 3 meses de evolución, o presencia de hipocinesia cardíaca global o discinesia), en ausencia de otra etiología.  Infarto lacunar: (~20%) Infarto de menos de 15 mm de diámetro en el territorio de una arteria perforante cerebral, que suele ocasionar clínicamente un síndrome lacunar (síndrome motor, sensitivo, sensitivo-motor, hemiparesia ataxia, disartria mano torpe), en ausencia de otra etiología.  Infarto de origen indeterminado: (~30%) Infarto cerebral en el que, tras un exhaustivo estudio diagnóstico, han sido descartados los subtipos aterotrombótico, cardioembólico, lacunar o inhabitual, o bien coexista más de una posible etiología. En este caso se pueden subdividir en indeterminado estudio incompleto, por más de una etiología o por causa desconocida.  Otras causas: (~5%) Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 1.3.2. Ictus hemorrágico En medio de todas las enfermedades cerebrovasculares, el grupo patológico de hemorragias se corresponde con el 15% de todos los ictus. Este porcentaje excluye las derivadas de un traumatismo craneoencefálico. En definitiva, consiste en una extravasación de sangre, consecuencia de la ruptura de un vaso sanguíneo, tanto arterial como venoso, por diversos mecanismos [11]. 1.4. Factores de riesgo 1.4.3. Factores de riesgo no modificables  Edad: El envejecimiento es uno de los principales factores de riesgo para la enfermedad cerebrovascular. La incidencia del ictus aumenta exponencialmente con la edad, alcanzando sus valores máximos por encima de los 65 años.  Sexo: Se ha visto que los varones tienen mayor incidencia de ictus que las mujeres.  Raza: La ateromatosis de grandes vasos afecta con mayor frecuencia a los individuos de raza caucásica, mientras que la patología de pequeño vaso es más frecuente en africanos y asiáticos. 1.4.4. Factores de riesgo modificables  Hipertensión arterial: Es el principal factor de riesgo para cualquier tipo de ictus, tanto isquémico como hemorrágico. Todos los tipos de hipertensión, tanto sistólica como diastólica o combinada, incrementan el riesgo de ictus a partir de cifras moderadas. Cifras de tensión arterial sistólica en torno a 140-160 mm Hg o diastólica de 90-94 mm Hg incrementan el riesgo de ictus en 1.5 veces.  Cardiopatía: Las enfermedades cardíacas tienen una clara asociación con los ictus, especialmente la fibrilación auricular, las valvulopatías, el infarto de miocardio, la hipertrofia ventricular izquierda y la cardiomegalia.  Diabetes mellitus: Se ha estimado que el riesgo de ictus en pacientes diabéticos aumenta 1.8 veces en varones y en 2.2 veces en mujeres. La diabetes predispone al ictus isquémico debido a su influencia en el desarrollo de aterosclerosis.  Hiperlipemia: La hiperlipemia favorece el desarrollo de la ateromatosis y de la isquemia, tanto coronaria como carotídea.  Tabaquismo: El consumo de cigarrillos predispone a la aparición de aterosclerosis en hombres y mujeres, con un incremento del riesgo de 2-3 veces. El tabaco facilita el espasmo Introducción Tania López González Página 41 arterial y el daño endotelial. Se ha visto que este riesgo añadido del tabaco desaparece tras cinco años de abstención.  Otros factores: El sedentarismo, la obesidad, el ronquido nocturno, el síndrome de apneas del sueño, los anticonceptivos orales y el consumo excesivo de alcohol también se han relacionado con un incremento del riesgo de ictus. Para ver cuáles son los factores de riesgo que más influyen en la enfermedad cerebrovascular, es importante conocer su prevalencia y su riesgo relativo, ya que un factor con un riesgo relativo elevado puede tener poca relevancia si no es muy frecuente [12]. En la Tabla 1 se resumen la prevalencia y el riesgo relativo de los principales factores modificables. Factor de riesgo Prevalencia (%) Riesgo relativo Hipertensión arterial 25 a 40 x 3 a 5 Fibrilación auricular 1 a 2 x 5 a 18 Dislipemia 6 a 40 x 1 a 2 Tabaquismo 20 a 40 x 1,5 a 2,5 Diabetes mellitus 4 a 20 x 1,5 a 3 Alcolismo 5 a 30 x 1 a 3 Inactividad física 20 a 40 x 2,7 Tabla 1. Prevalencia y riesgo relativo de los factores de riesgo modificables para el ictus. 1.5. Fisiopatología 1.5.1. Descenso del flujo sanguíneo La isquemia cerebral se origina por la disminución del flujo sanguíneo hasta un nivel capaz de interferir con la función del sistema nervioso. Este proceso es el resultado de una alteración del equilibrio de numerosos factores hemodinámicos, que puede producir una serie de alteraciones metabólicas y bioquímicas en las neuronas y en la glía, que conducirán a la necrosis celular [13]. La obstrucción aguda de una de las grandes arterias del cerebro induce una reducción instantánea del flujo cerebral en la correspondiente área de irrigación (isquemia focal). Pero la reducción del suministro de sangre no es homogénea en el área afectada, y puede cambiar en minutos u horas, especialmente si el suministro de sangre no se recupera. [14] Así, cuando se obstruye un vaso sanguíneo cerebral se produce un gradiente de perfusión sanguínea. La disminución del flujo sanguíneo cerebral (FSC) en una determinada zona de tejido cerebral por Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina debajo de 10 ml/100 g/min produce una rápida muerte neuronal [15]. Sin embargo, entre este núcleo intensamente isquémico y el parénquima perfundido de forma normal (FSC > 50 ml/100 g/min), existe una zona hipoperfundida, cuya extensión depende del mejor o peor funcionamiento de la circulación colateral [16]. Estudios recientes de tomografía por emisión de positrones (PET) han logrado diferenciar en la zona hipoperfundida dos regiones con pronóstico claramente diferenciado: una ligeramente hipoperfundida (FSC > 22 ml/100 g/min) en la que la transformación en infarto sólo sucede en circunstancias especialmente adversas (zona oligohémica), y otra, denominada de penumbra isquémica [17], con una perfusión cerebral críticamente disminuida (FSC < 22 ml/100 g/min), pero en la que el consumo de oxígeno es todavía suficiente para preservar la supervivencia tisular. Sin embargo, la penumbra isquémica no tiene que estar necesariamente alrededor de una zona de necrosis neuronal, sino que puede constituir por sí misma un territorio cerebral con aporte sanguíneo comprometido, pero con un metabolismo energético preservado [18]. La penumbra isquémica se define entonces como el tejido cerebral en el cual el flujo sanguíneo cerebral ha disminuido hasta el punto de causar silencio electrofisiológico y pérdidas pasajeras pero recurrentes de los gradientes de membrana y metabolitos energéticos [19]. En la penumbra isquémica hay alteración de la actividad funcional de las neuronas, pero se conserva una actividad metabólica mínima que preserva la integridad estructural durante algún tiempo. En esta zona el tejido resulta dañado, se altera el mecanismo de autorregulación, se mantiene parcialmente la reactividad al CO2, la transmisión sináptica y el contenido de adenosín-5´-trifosfato (ATP) son normales y disminuye el contenido de glucosa. Esto produce la aparición de síntomas neurológicos, pero no de daños irreversibles [13]. Lo importante, y que constituye la base para el tratamiento de la isquemia cerebral, es que las neuronas de la penumbra isquémica sobreviven, y podrán recuperarse cuando se mejoren las condiciones hemodinámicas y se restaure el flujo sanguíneo cerebral que aporte de nuevo la glucosa y el oxígeno necesarios [20]. El impacto de la isquemia cerebral dependerá del nivel de oclusión arterial y de la duración de la reducción del flujo sanguíneo, por lo que el tiempo es un parámetro muy importante en la enfermedad. 1.5.2. Fallo energético Tras el descenso del flujo sanguíneo, tiene lugar una secuencia de eventos moleculares a corto y largo plazo, iniciada con el fallo energético celular, que constituyen la cascada isquémica (Figura 2) [21]. Introducción Tania López González Página 43 Figura 2. Mecanismos moleculares implicados en la cascada isquémica. El descenso del flujo sanguíneo desencadena un fallo energético que conlleva al desequilibrio Na+/K+ despolarizando la membrana, con la consecuente liberación excesiva de glutamato y activación de los receptores de NMDA y AMPA. Esto genera una entrada excesiva de Ca+2 que activa la señalización de la muerte celular neuronal. El sistema nervioso central gasta sobre el 20% del O2 y el 25% de glucosa circulantes. En condiciones fisiológicas, las neuronas y células gliales obtienen su energía del metabolismo aeróbico de la glucosa, o, bajo ayuno, del metabolismo aeróbico de los cuerpos cetónicos. Aunque en los astrocitos se almacenan pequeñas cantidades de glucógeno, el sistema nervioso central depende totalmente del combustible que proviene de la circulación sistémica para mantener la actividad cerebral normal [22]. Bajo condiciones de isquemia cerebral, con el suministro sanguíneo interrumpido, las células cambian su metabolismo y obtienen energía de forma anaeróbica a partir de la glucosa restante. En el metabolismo aeróbico, la glucosa se metaboliza a piruvato, el cual es descarboxilado por la piruvato deshidrogenasa mitocondrial produciendo Acetil-Coa, que es usado en el ciclo de Krebs para producir intermediarios reducidos (NADH Y FADH2) que pueden producir grandes cantidades de ATP por fosforilación oxidativa en la membrana interna mitocondrial. Sin embargo, bajo condiciones de pérdida de oxígeno, el piruvato no se convierte a Acetil-Coa, eliminando la consecuente fosforilación oxidativa y forzando la reducción de piruvato a lactato, una reacción que produce pequeñas Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina o por otro lado, limitar o incluso reparar el daño expresando un fenotipo antiinflamatorio. El desequilibrio entre ambos perfiles determinará el empeoramiento o mejora de la lesión. Figura 5. Evolución de la inflamación tras un ictus isquémico; activación de diferentes tipos celulares a lo largo del tiempo. Tras la isquemia cerebral, la inflamación temprana comienza con la activación de la microglía y la infiltración de macrófagos y neutrófilos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) dañada. Esto comienza minutos después de la oclusión del vaso, pero tiene un pico a los 2-3 días [51]. La activación es mediada por moléculas secretadas por estrés y neuronas que se están muriendo. Estas moléculas que son normalmente intracelulares (y por lo tanto no están expuestas para su reconocimiento) trabajan como patrones moleculares asociados al daño (DAMPs) activando receptores microgliales, como, por ejemplo, receptores toll like (TLRs). Una vez activadas, las células microgliales y los macrófagos sufren cambios morfológicos y funcionales. Mientras en condiciones de reposo las células microgliales funcionan como centinelas del SNC, tras su activación, adquieren morfología ameboidea [52]. El fenotipo funcional de la microglía y macrófagos activados puede ser M1 (pro-inflamatorio o destructivo) o M2 (antiinflamatorio y neuroprotector). En la fase aguda el microambiente dañado desequilibra enormemente el fenotipo funcional de la microglía y macrófagos promoviendo el fenotipo M1. La microglía y macrófagos M1 activados liberan moléculas de señalización proinflamatoria como el factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleuquinas 1, 6, 12 o 23 (IL-1, IL2, IL-6, IL-12, IL-23) o NO. Estas citoquinas, entre otros procesos, también inducen el reclutamiento de células de la inmunidad circulantes, que juegan un papel crítico en los Introducción Tania López González Página 51 procesos inflamatorios tardíos. Por otro lado, la microglía y macrófagos M2 expresan moléculas antiinflamatorias como la interleuquina 10, CD206 o arginasa 1. A pesar de que la transición de la microglía y macrófagos desde el fenotipo M1 al M2 podría ser una importante diana terapéutica, este proceso aún está muy poco comprendido. Estudios recientes revelan que la ratio M1:M2 es mayor en el SNC de varones de avanzada edad, pero los mecanismos precisos aún son desconocidos [53]. Otras células inflamatorias que juegan un papel central en la inflamación temprana son los neutrófilos. Estos atraviesan la BBB durante las primeras horas tras el ictus, pero su pico está entre 1-3 días, luego desaparecen [51]. La infiltración de neutrófilos está mediada por la expresión de moléculas de adhesión específicas en el endotelio de células sometidas a estrés, como son la selectina endotelial (E-selectina), la molécula de adhesión intracelular (ICAM) -1 y -2, la molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1) y la molécula de adhesión plaquetoendotelial-1 (PECAM-1). Estos antígenos son detectados por receptores específicos en la superficie de neutrófilos y monocitos [54]. Una vez infiltradas, las células liberan ROS y NOS, ya que expresan la iNOS. Además, igual que la microglía y los macrófagos, los neutrófilos liberan citoquinas pro-inflamatorias como el TNFα, IL-6, IL-8, incrementando el reclutamiento de neutrófilos y leucocitos. También son liberadas las quimioquinas con ligando tipo C-C 2 y 3 (CCL2 y CCL3), señalizando el reclutamiento de linfocitos T, monocitos y células dendríticas. Finalmente, los neutrófilos secretan grandes cantidades de proteasas que dañan la lámina vascular basal incrementando la permeabilidad de la BBB [55]. Se ha visto que algunas metaloproteasas de matriz (MMPs) intervienen en la lesión tisular tras la isquemia. Los leucocitos que se acumulan y se adhieren por la acción de las citoquinas en la isquemia cerebral utilizan la producción de MMPs para migrar a través del endotelio, desestructurar la barrera hematoencefálica y contribuir a la producción del edema [56]. Mientras que en las primeras horas y días tras el ictus predomina la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa se desarrolla a lo largo de los siguientes días hasta la primera semana tras la iquemia. Los linfocitos T o células T, juegan un papel central en este proceso desde que reciben señales pro-inflamatorias liberadas por la microglía y los macrófagos, originando una respuesta compleja e ininterrumpida. Las células T se clasifican en T helper (Th) o células T citotóxicas (Tc), que expresan CD4 o CD8 en su superficie, respectivamente. Las células Th se clasifican por el perfil de liberación de citoquinas. Los subtipos mejor conocidos son las Th1, Th2 y las células T reguladoras (Treg). Las células Th1 liberan citoquinas pro-inflamatorias como el interferón gamma (INFϒ). Por otro lado, las Th2 liberan moléculas antiinflamatorias, IL-4 e IL-10, entre otras. Las células Treg son inmunosupresoras, y juegan un papel importante limitando el daño cerebral después del ictus [gu el al de alba]. Las células Tc son responsables de retirar lo dañado o inducir apoptosis en las células diana. Estas células liberan perforina, Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina granzimas y granulisina (envueltas en la formación de poros de membrana e inducción de apoptosis). La inmunidad adaptativa tiene también consecuencias sistémicas, produciendo linfopenia (haciendo que los pacientes se vuelvan más vulnerables a infecciones), y respuesta autoinmune contra antígenos del SNC (incrementando el daño secundario al SNC) [57]. El desequilibrio entre células pro-inflamatorias y antiinflamatorias determinará nuevamente la progresión de la lesión. 1.5.8. Mecanismos de regeneración Como consecuencia del daño isquémico, el microambiente de la zona de la lesión puede afectar al estado del tejido colindante. Por eso, para impedir su expansión, algunas células rodean el tejido dañado para formar una cicatriz. Tras la isquemia, durante la fase aguda, se forma la cicatriz glial, formada por astrocitos, microglía y células gliales precursoras [58], que sirven como barrera fisiológica. Los astrocitos activados o reactivos incrementan su habilidad para eliminar neurotransmisores, ROS, o dan soporte metabólico a las neuronas dañadas con pequeñas cantidades de glicógeno almacenado en su citoplasma [22]. En etapas más tardías, la microglía tiende a desaparecer y la cicatriz se invade de fibroblastos, que proliferan y secretan grandes cantidades de moléculas de la matriz extracelular, formando la cicatriz fibrótica. Esta actúa como una barrera física limitando la entrada de nuevos axones al área dañada, lo que puede ser muy importante para entender los procesos neuroregenerativos en el SNC de mamíferos [59]. Tras un daño isquémico, los procesos de reparación del tejido cerebral se estimulan lentamente, aunque en los primeros días se ven camuflados por el ambiente pro-inflamatorio. Pero, cuando las células necróticas son eliminadas y la inflamación se estabiliza, los procesos proliferativos como son la angiogénesis, neurogénesis y neuroplasticidad, adquieren una posición central. [60, 61, 53]. 1.6. Enfoques terapéuticos para el tratamiento del ictus isquémico Uno de los mecanismos que conduce a la progresión del ictus es la transformación de la penumbra isquémica en una zona de lesión irreversible (Figura 6). En la zona de la penumbra isquémica se produce una mayor demanda de energía debido a que aumentan las necesidades metabólicas al producirse ondas de despolarización recurrentes. Estas mayores necesidades de aporte de nutrientes no pueden ser cubiertas debido a una disminución del flujo sanguíneo cerebral, por lo que el umbral de perfusión se hace cada vez más crítico, y zonas de penumbra se incorporan progresivamente al parénquima cerebral no viable [18]. Si no se reestablece el flujo sanguíneo, o si no se aplica ninguna estrategia Introducción Tania López González Página 53 protectora en las primeras horas durante la evolución de la isquemia, las células localizadas en esta área sufrirán muerte celular. Así, los enfoques terapéuticos se deberían centrar en esta área, ya que al contrario que el núcleo de la lesión, la penumbra contiene tejido potencialmente salvable. Figura 6. Progresión de la penumbra isquémica a tejido necrótico. Con una estrategia terapéutica que actúe sobre la penumbra isquémica, el núcleo de la lesión (tejido necrótico) acabará siendo menor que bajo la evolución fisiopatológica. 1.6.1. Marcadores de progresión del ictus isquémico En la práctica clínica, hay ciertas variables modificables que tienen influencia en la evolución de la lesión, y, por tanto, en el pronóstico de los pacientes. La estabilización del flujo sanguíneo cerebral es una de las variables más importantes en la progresión del ictus isquémico. Los pacientes de dicha patología suelen desarrollar hipertensión en la fase aguda, lo que incrementa el riesgo de transformación hemorrágica. Por otro lado, se ha relacionado la hipotensión con un mal pronóstico, seguramente debido a la hipoperfusión del tejido [62]. Además, independientemente de si ha habido reperfusión o no, el flujo sanguíneo cerebral debería de ser estabilizado, impidiendo la formación de nuevos trombos. Para combatir esto, en la práctica clínica se usan agentes antiagregantes y anticoagulantes. El antiagregante más usado es el ácido acetilsalicílico, un inhibidor irreversible de la ciclooxigenasa-1 (COX-1) Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina que reduce la síntesis de prostaglandina y tromboxano, indispensables para la agregación plaquetaria. Además, ante el riesgo tromboembólico, se suele tratar a los pacientes isquémicos con el anticoagulante heparina [63]. Con niveles de flujo sanguíneo cerebral inferiores a 22 ml/100 g/min se produce la liberación de grandes cantidades de glutamato y de otros aminoácidos neuroexcitadores, capaces de inducir ondas de despolarización recurrentes en la zona de penumbra isquémica [18]. El predictor más potente de progresión de infarto cerebral es el glutamato. Niveles plasmáticos de glutamato por encima de 200 μM/L en las primeras 24 horas desde el inicio de la sintomatología predicen el deterioro neurológico con una probabilidad del 92%. También se han asociado niveles elevados de glicina con el aumento de la frecuencia de deterioro neurológico precoz [64]. La disminución de la concentración del GABA en plasma también es un predictor importante de deterioro neurológico en las primeras 48 horas en los infartos lacunares, sobre todos los localizados en los núcleos de la base [65]. Pero para la progresión de la isquemia cerebral son necesarios otros mecanismos secundarios. Se ha demostrado una relación entre el aumento de los depósitos de hierro (como fuente de radicales libres) y el deterioro neurológico [66]. También se ha visto que el NO es un factor importante en la progresión de la zona de penumbra isquémica, especialmente en las zonas más periféricas, donde la presencia de oxígeno facilita la producción de peroxinitrilo [67]. Los mecanismos inflamatorios también desempeñan un papel fundamental en la progresión del infarto, y concentraciones plasmáticas elevadas de IL-6 son un potente predictor de deterioro neurológico precoz [68]. La hiperglucemia, la hipertermia, la cefalea y las crisis comiciales en las primeras horas del ictus se han relacionado con el infarto cerebral progresivo. Los niveles plasmáticos de glucosa elevados durante la fase aguda del ictus isquémico aumentan la concentración de ácido láctico. Se ha visto que el efecto de la hipertermia sobre la progresión del infarto es dependiente de la neurotoxicidad del glutamato [69], y posiblemente de la IL-6 y del TNF-α. La cefalea al inicio del ictus isquémico está mediada por el glutamato, por el NO y por la IL-6 [70]. Las crisis convulsivas al inicio del ictus aparecen en los infartos corticales, y se relacionan con un empeoramiento neurológico como resultado del aumento de concentración de glutamato extracelular liberado en esta zona [71]. También existen marcadores de neuroimagen del infarto cerebral progresivo. La presencia de hipodensidad precoz en la tomografía axial computarizada (TAC) o de hiperseñal en la resonancia magnética de difusión (RM-DWI) se relaciona con la progresión del infarto cerebral. Este hecho se debe a la presencia de edema citotóxico relacionado con el glutamato [72] o de edema vasogénico relacionado con el aumento de la permeabilidad vascular originado por el NO y por los mecanismos de inflamación [67, 68, 73, 74]. Introducción Tania López González Página 55 1.6.2. Restauración del flujo sanguíneo La terapia trombolítica consiste en la administración intravascular de agentes capaces de disolver el trombo in situ [75]. La trombolisis farmacológica o mecánica (trombectomía) son las estrategias clínicas que aportan más beneficios a los pacientes de ictus isquémico, en términos de recuperación neurológica.  Trombolisis farmacológica El agente trombolítico más común es el rt-PA, un enzima relacionado con la degradación del trombo en el vaso ocluído [76, 77]. El activador del plasminógeno tisular (tPA) es una serin proteasa que se secreta por las células endoteliales, entre otras. Es capaz de romper el zimógeno del plasminógeno en una proteasa activa, la plasmina, la cual rompe las fibras de fibrina que mantienen las plaquetas unidas al trombo sanguíneo [75]. Así, se ha generado la versión recombinante del tPA (rtPA), que aunque tiene modificaciones de la secuencia original para mejorar sus propiedades farmacológicas, mantiene propiedades indeseables como el incremento de la permeabilidad de la BBB, incrementando así el riesgo de transformación hemorrágica [75]. Su administración suele ser intravenosa, pero también se puede llevar a cabo la administración intraarterial, una forma más específica de concentrar el agente terapéutico cerca del trombo, reduciendo la cantidad del mismo para la recanalización, lo que reduce su cantidad circulante y los efectos adversos ligados [63]. Sin embargo, esta administración es más invasiva y su alta concentración en la región del trombo podría incrementar los efectos neurotóxicos. El rtPA es el único tratamiento aprobado por la FDA (agencia estadounidense que regula la administración de fármacos y alimentos) para tratar el ictus isquémico agudo [78], sin embargo, sólo el 3-7% de los pacientes son tratados con este fármaco en la mayoría de los países. Esto podría ser debido a diferentes factores, incluyendo la pequeña ventana terapéutica y el alto riesgo de transformación hemorrágica. Se requieren nuevas estrategias neuroprotectoras para trabajar en ambos aspectos, abriendo la ventana terapéutica y reduciendo los factores de riesgo asociados. [76, 77]. La ventana terapéutica para el tratamiento trombolítico intravenoso es de 4,5 h y su extensión puede ser posible seleccionando, por técnicas de neuroimagen, pacientes con una gran área de penumbra (el área del cerebro susceptible de daño está, al mismo tiempo, protegida en las primeras 24-48 h) [79].  Trombectomía mecánica La trombectomía es una técnica que permite la extracción de un trombo del lumen vascular por un mecanismo mecánico, implicando el uso de un catéter intravascular semi-invasivo (generalmente introducido desde la arteria femoral) para llegar al vaso ocluido y coger el Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina trombo. Se aplica a los pacientes que reciben rtPA y no responden, o a los pacientes que están en la ventana terapéutica del rtPA pero no son aptos para el tratamiento fibrinolítico debido a la existencia de coagulopatías o una cirugía mayor reciente. Aunque tiene altas tasas de recanalización y una ventana terapéutica mayor que el rtPA, su uso implica dificultad técnica, sedación, y riesgo de trauma vascular debido a la ruptura del vaso o al vasoespasmo. Además, puede causar la fragmentación del trombo provocando la embolización en tejido previamente no afectado. Debido a estas limitaciones, el uso de la trombectomía endovascular está generalmente restringida a centros especializados [78]. 1.6.3. Neuroproteción El término neuroprotección engloba diferentes estrategias que reducen el área muerta tras un evento isquémico sin afectar a la reperfusión del tejido. Se han propuesto algunos compuestos para bloquear la vía de señalización que lleva a la muerte celular inducida por la isquemia, en diferentes etapas de la cascada isquémica. La mayoría de los compuestos han mostrado efectos positivos en los estudios experimentales, pero desafortunadamente ninguno de ellos ha mostrado efectos beneficiosos en los ensayos clínicos [80]. Esto puede ser en parte por el rápido desarrollo de los eventos de la cascada isquémica, lo que reduce la ventana terapéutica. A pesar de esto, el gran potencial terapéutico de la neuroprotección hace que sea un campo activo en la investigación [81]. Los fármacos neuroprotectores se pueden clasificar en diferentes grupos en función de su mecanismo de acción.  Bloqueantes del calcio El Ca+2 juega un papel importante en la fisiopatología del ictus isquémico. El bloqueo de los canales de calcio paraliza la entrada de calcio, reduciendo la muerte celular. La Nimodipina es un ejemplo de esta familia de compuestos. Se han publicado más de 250 estudios con animales sobre la Nimodipina en isquemia cerebral, pero solo 10 de ellos hablan de un resultado positivo [80]. Ninguno de los miembros de esta familia de componentes ha demostrado una actividad neuroprotectora clara en estudios clínicos. Una de las explicaciones puede ser que, en estos estudios, los animales son tratados generalmente en los primeros 15 minutos tras la isquemia, algo que no es trasladable a la práctica clínica. Como alternativa a moléculas complejas que bloqueen estos canales, se ha comprobado que el Mg+2, un competidor del Ca+2, interfiere con los canales de Ca+2 reduciendo su liberación incontrolada y bloqueando los canales NMDA, entre otros procesos. Hasta ahora, el efecto del Mg+2 muestra resultados promotores, y debe ser comprobado en estudios clínicos [82]. Introducción Tania López González Página 57  Homeostasis de los neurotransmisores Está bien establecido que el glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio del SNC, es también culpable de inducir el daño excitatorio neuronal en la isquemia cerebral y otros desordenes. El glutamato y otros aminoácidos excitatorios relacionados interactúan con diferentes clases de receptores, los cuales son relevantes para la neuroprotección. Estos incluyen los receptores NMDA y AMPA. Los antagonistas de los receptores NMDA reducen el tamaño de infarto y el déficit motor y sensorial en modelos animales de isquemia cerebral focal, pero su uso clínico ha presentado muchos efectos secundarios, especialmente efectos cardiovasculares y psiquiátricos. Por ejemplo, Selfotel, un antagonista competitivo de los receptores NMDA, ha demostrado mejorar el resultado en la fase III de estudio, pero una alta incidencia de efectos psiquiátricos adversos condicionó su retirada de las fases clínicas. De la misma manera, el Dextromethorphan y sus metabolitos destrorphan y aptiganel fueron interrumpidos por una relación no favorable entre el riesgo y el beneficio y por el incremento de los efectos adversos. El Eliprodil reduce la acción del glutamato por interferir con el sitio poliamina en el receptor NMDA, pero no mostró diferencias con el placebo. El Gavestinel, antagonista de la glicina del receptor NMDA, mostró una tolerancia excelente, pero sin eficacia [83]. Por otro lado, varios antagonistas de AMPA mostraron eficacia neuroprotectora en estudios preclínicos de isquemia focal y global, pero no tuvieron éxito en los largos estudios clínicos. Otra opción para reducir el glutamato cerebral son los inhibidores de la liberación de glutamato, que trabajan bloqueando los canales presinápticos, previniendo la despolarización y liberación de glutamato. Un ejemplo de este tipo de fármacos es el Lubezol, un compuesto culpable de la desregulación de la vía de señalización de la óxido nítrico sintasa inducida por glutamato. Este compuesto ha mostrado neuroprotección en el hipocampo frente a la toxicidad del óxido nítrico. En estudios experimentales se ha visto una reducción del volumen de infarto del 50% tras la inyección del fármaco 3 horas después de la isquemia. Sin embargo, no se realizó ningún ensayo clínico con resultados positivos, y uno de ellos fue cancelado debido al incremento de mortalidad en el grupo tratado [84]. Ante la poca traslación de los resultados con antagonistas de receptores de glutamato e inhibidores de su liberación, una alternativa puede ser la reducción del glutamato cerebral usando un sistema para atraparlo. Este método está basado en la reducción del glutamato sanguíneo forzando su transporte, a través de la BBB, desde el cerebro a la sangre, en favor del gradiente de concentración, mostrando esperanzadores resultados terapéuticos en modelos preclíncios de isquemia cerebral [85]. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina En el balance del glutamato también interviene GABA, el principal inhibidor de neurotransmisores del cerebro. Tambien se estudiaron agonistas de GABA, como el Diazepam, obteniendo resultados negativos [81].  Vías de señalización de muerte celular También se ha estudiado el potencial neuroprotector de anestésicos y medicaciones anticonvulsivas como el Pentobarbital, Sevofluorano, Isofluorano o ketamina, revelando su habilidad para potenciar las vías de señalización pro-supervivencia que producen resultados positivos en animales. Sin embargo, la translación a la clínica fue fallida [86].  Antioxidantes El estrés oxidativo es otro mecanismo implicado en la muerte cerebral tras un evento isquémico. Los antioxidantes pueden jugar, por tanto, un papel importante como fármacos neuroprotectores. El antioxidante con más éxito ha sido NXY-059. Este fármaco reduce el infarto cerebral un 66% en modelos animales, cuando se inyecta incluso 5 horas después de la oclusión. El primer estudio clínico obtuvo resultados positivos, mejorando el resultado funcional de los pacientes. Sin embargo, un segundo estudio clínico mostró resultados negativos [87]. Otro antioxidante que alcanzó la fase clínica fue el ácido úrico, un antioxidante con efectos neuroprotectores en modelos animales de isquemia cerebral. Un estudio clínico reciente ha evaluado si la terapia con ácido úrico podría mejorar los resultados funcionales, a los 90 días, en pacientes con ictus isquémico agudo. Los resultados mostraron que el tratamiento con ácido úrico es seguro, pero no incrementa la proporción de pacientes que muestren resultados excelentes tras el ictus, en comparación con el placebo [88].  Antiinflamatorios Los compuestos antiinflamatorios actúan inhibiendo alguno de los mecanismos de la extensa cascada inflamatoria de la isquemia cerebral. El Enlinomab, un anticuerpo monoclonal contra ICAM-1, que inhibe la adhesión leucocitaria y la migración a través del endotelio vascular, es capaz de reducir el tamaño de infarto en modelos animales de isquemia cerebral focal transitoria; sin embargo, en fase III, el resultado ha sido negativo con un alto número de complicaciones. El UK-279.276, una proteína recombinante inhibidora del receptor CD11b/CD18, muestra una baja eficacia en estudios clínicos [80]. Introducción Tania López González Página 59  Otros La Citicolina o CDP-colina es un precursor de la síntesis de fosfato-colina, la cual se integra en la membrana de neuronas. Se ha demostrado que inhibe los niveles de norepinefrina y dopamina en el SNC, y restaura la actividad de la ATPasa mitocondrial [89]. En modelos animales, la Citicolina reduce la activación de la fofolipasa 2 tras la isquemia cerebral, reduciendo la formación del ácido araquidónico y la producción de radicales libres; por tanto, reduciendo el estrés oxidativo. Otros efectos de este fármaco son su capacidad de reducir la excitotoxicidad o de estimulación de la plasticidad cerebral [90]. En estudios preclínicos, el tratamiento con Citicolina inmediatamente después de la reperfusión, mejora el déficit funcional a los 28 días [91]. Un análisis publicado en 2002 mostró un incremento del 33% en la recuperación completa después de un ictus moderado o grave, cuando el tratamiento se empiezó entre las primeras 24 horas y se mantuvo durante 6 semanas [92]. Sin embargo, un estudio clínico reciente ha demostrado que pierde la protección en pacientes de ictus [93]. Se han desarrollado algunos estudios usando otros agentes neuroprotectores como activadores de los canales de potasio neuronales (BMS-204354), modificadores de la fluidez de membrana (Piracetam), antagonistas de opioides (Namafeno), factores de crecimiento empleados como reguladores del calcio intracelular, y muchos otros. Ninguno de ellos ha demostrado eficacia definitiva de neuroprotección farmacológica [81]. 1.6.4. Neurorreparación Las estrategias de neuroreparación implican la restauración de la función cerebral, tanto por la regeneración del tejido cerebral dañado (neuroregeneración), como por el establecimiento de vías de señalización neuronales o sinapsis alternativas (plasticidad cerebral). Además, la ventana terapéutica para estas terapias es más grande que para el enfoque trombolítico o neuroprotector. El objetivo de los tratamientos para la recuperación neurológica tras un ictus no está restringido a las neuronas; está más centrado en la unidad neurovascular, incluyendo procedimientos que potencien la sinaptogénesis y la angiogénesis. Así, los tratamientos neuroreparadores pueden usar células madre, pro-neurogénicos, pro-angiogénicos y/o prosinaptogénicos, entre otros.  Neurogénesis En el cerebro adulto hay nichos para la producción de células madre [94], localizados en la región subventricular de los ventrículos laterales (SVZ) y el giro dentado del hipocampo. Bajo condiciones fisiológicas normales, los neuroblastos producidos en el SVZ migran al bulbo olfatorio para diferenciarse en nuevas neuronas. Tras la inducción de la isquemia cerebral focal Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina reacciones fisiológicas ocurran de la forma correcta. El principal tejido implicado en este proceso es el tejido adiposo pardo (BAT; del inglés brown adipose tissue), lo que lo sitúa en un lugar privilegiado en la regulación del balance energético [126, 127]. Figura 8. Balance energético. El equilibrio se genera cuando la ingesta y el gasto energético son iguales, sin embargo, cuando la ingesta es mayor se genera un balance energético positivo y cuando es menor se genera un balance energético negativo. La masa corporal y su composición, al igual que el almacenamiento de energía como triglicéridos en el tejido adiposo blanco (WAT; del inglés white adipose tissue), están determinados por la interacción entre factores genéticos, ambientales y sociales. Estos factores actúan a largo plazo variando el balance energético; es decir, modifican el balance entre ingesta y gasto energético. Estudios fisiológicos han sugerido que la masa corporal y las reservas de energía están reguladas homeostáticamente, es decir, cualquier cambio en la masa corporal produce cambios en la ingesta y en el gasto energético que contrarestran la perturbación inicial. Así, desde un punto de vista termodinámico, la obesidad y la delgadez son el resultado de una alteración en este balance (positivo o negativo) entre la ingesta y el gasto energético (Figura 8). Asumiendo que un individuo no tiene problemas con la absorción de nutrientes, el almacenamiento de energía en forma de grasa solo se incrementará si la energía ingerida excede Introducción Tania López González Página 67 el total del gasto energético (actividad física, metabolismo basal y termogénesis adaptativa) [128, 129, 130, 131]. Como consecuencia de la forma de vida en los países industrializados, la alta disponibilidad de comida y el sedentarismo, hacen que el balance energético esté inclinado hacia el almacenamiento de grasas sin gasto energético, lo que a largo plazo conduce al sobrepeso y a la obesidad [128, 132, 133]. 2.7.2. Regulación de la homeostasis energética La regulación del balance energético es un proceso altamente complejo en el que intervienen tanto señales fisiológicas como de comportamiento, además de un gran número de tejidos. A grandes rasgos, el mantenimiento de un correcto balance entre ingesta y gasto energético depende de tres elementos reguladores de la respuesta homeostática (134-136):  Señales periféricas:  Señales de saciedad (procedentes del tracto gastrointestinal)  Señales hormonales  Sistema nervioso central Durante los últimos años, muchas de las investigaciones se han centrado en identificar los mecanismos moleculares de la homeostasis energética [122, 123, 128, 137]. Se han investigado moléculas clave en el desarrollo de la obesidad, como es el caso de la leptina o la grelina, y se han descubierto numerosos neuropéptidos y vías metabólicas que actuando en el sistema nervioso central (SNC) modulan la ingesta. También se ha avanzado notablemente en el conocimiento de las bases moleculares del gasto energético. La prevención debería ser el primer mecanismo de acción contra la obesidad, pero también es muy importante el desarrollo de estrategias para el tratamiento. Nuevas señales y factores involucrados en la modulación del balance energético y del metabolismo están siendo continuamente descubiertos, proporcionando nuevas dianas terapéuticas para fármacos potenciales contra la enfermedad metabólica. Lo que se pretende es el mejor conocimiento de cómo las señales periféricas y del SNC actúan conjuntamente y cómo la manipulación de las rutas en las que están implicadas puede conducir a una mejora de la disfunción metabólica [128, 137]. 2.7.2.1. Señales periféricas Existe una clara interacción entre el SNC y la actividad de numerosos órganos involucrados en la homeostasis energética, lo que requiere la transmisión de información al cerebro. Para llevar a cabo esto, el cerebro recibe información continuada: 1) acerca de las Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina reservas y de flujo de energía en órganos críticos; 2) acerca de los nutrientes que están siendo ingeridos y absorbidos y, 3) sobre las necesidades energéticas basales por lo tejidos. Las señales periféricas que interactúan con otros factores hipotalámicos para controlar el apetito y la masa corporal pueden ser divididas en dos categorías claramente diferenciadas, como veremos a continuación [130, 138]. Por un lado, están las señales generadas durante las comidas, que causan saciedad; es decir, señales que informan sobre la terminación de la comida o que prolongan el intervalo hasta la siguiente. La sensación de hambre puede ser definida como la motivación para buscar y consumir alimentos, que inicia el acto de comer. La saciedad es el estado en el cual el hambre y el comportamiento alimentario están inhibidos. El tracto gastrointestinal juega un papel crucial en la regulación de la ingesta de alimentos, informando al SNC sobre la cantidad de alimento ingerido y la composición nutricional del mismo [139, 140]. Esta información engloba toda una serie de estímulos mecánicos, químicos y hormonales que se denominan señales de saciedad, y son los mecanismos de control homeostático a corto plazo. El SNC recibe información sensorial procedente de estímulos mecánicos, que informan sobre el grado de distensión del tubo digestivo y aportan información sobre la cantidad de alimento ingerido, y químicos, que aportan información sobre la composición nutricional del mismo. Esta información llega al SNC, concretamente a núcleos del tronco cerebral como el núcleo del tracto solitario (NTS) y el área postrema (AP), a través de las aferencias vagales del ganglio cervical superior [130, 137, 138]. Por otro lado, el tracto gastrointestinal también informa al SNC del estado nutricional a través de la secreción de hormonas, fundamentalmente anorexigénicas (reducen la ingesta) como la colecistoquinina (CKK), el glucagon, el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), enterotastina, polipéptido pancreático… con la excepción de la grelina, que es la hormona orexigénica (incrementa la ingesta) [141]. El otro grupo de señales incluye hormonas que se secretan en proporción a la cantidad de grasa corporal, ayudando al control homeostático a largo plazo. Estas hormonas adipocitarias llegan al cerebro transportadas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) e interaccionan con sus receptores de membrana específicos, expresados preponderantemente en el hipotálamo [130, 137, 138]. Existen dos importantes hormonas anorexigénicas que envían señales al hipotálamo del estado nutricional y de adiposidad, que son la leptina, producida por el WAT y la insulina, producida por las células β del páncreas y que también responde a los niveles de glucosa en sangre [141]. Algunas otras hormonas adipocitarias sintetitazas en el WAT son la resistina, adiponectina, IL-6… Introducción Tania López González Página 69 2.7.2.2. Sistema nervioso central Toda la información periférica procedente de los mecanismos anteriores es recibida, analizada y procesada en el SNC, el cual influye en el balance energético y la masa corporal a través de tres mecanismos: 1) efecto del ambiente, incluyendo alimentación y actividad física; 2) efectos en la actividad del sistema nervioso autónomo (SNA), que regula el gasto energético y otros aspectos del metabolismo y, 3) efectos en el sistema neuroendocrino, incluyendo secreción de hormonas como hormona de crecimiento (GH), hormonas tiroideas (THs), insulina, cortisol y hormonas sexuales. El cerebro controla los tejidos que tienen mucha importancia en la homeostasis energética, como pueden ser hígado o músculo, a través, fundamentalmente, del sistema nervioso autónomo y de la secreción de hormonas activas metabólicamente (9). La coordinación de este sistema complejo ha sido sujeto de intensos estudios y ha aportado muchos avances en el estudio de la obesidad [128, 141]. El hipotálamo es un elemento de SNC fundamental para el control y la coordinación de la actividad homeostática periférica. Esta pequeña región diencefálica localizada debajo del tálamo es considerada el centro neuroendocrino del organismo y controla un amplio número de procesos homeostáticos como son la ingesta, la saciedad, la bebida, el metabolismo, la temperatura la reproducción, la lactancia, la función cardiovascular, el ciclo sueño-vigilia y la secreción hormonal [142, 143]. Esta región está organizada anatómicamente en poblaciones de células establecidas en grupos definidos llamados núcleos, con múltiples conexiones neuronales gracias a proyecciones axonales, formando de esta forma circuitos. Estos núcleos hipotalámicos modifican la expresión de neurotransmisores específicos y de neuromoduladores de naturaleza peptídica (neuropéptidos), dependiendo de la señal homeostática proveniente de los nutrientes (aminoácidos, ácidos grasos y glucosa) y de hormonas (leptina, ghrelin, glucosa, resistina e insulina, entre otras) que alcanzan el hipotálamo e informan de la condición de las reservas energéticas dentro del cuerpo [134, 144, 145, 146, 147]. Esta información es procesada en poblaciones neuronales específicas capaces de modular la expresión o síntesis de neuropéptidos orexigénicos (promueven la ingesta de energía) o neuropéptidos anorexigénicos (inhiben la ingesta). Dentro de estos centros hipotalámicos, los más relevantes modulando la homeostasis energética son: el núcleo arcuato (ARC), el núcleo paraventricular (PVH), el núcleo dorsomedial (DMH), el núcleo ventromedial (VMH) y el área hipotalámica lateral (LHA). Además del hipotálamo también existen otras zonas del SNC implicadas en la regulación de la ingesta. Por ejemplo, como se expuso anteriormente, en el tronco cerebral, el NTS y el AP integran la información sensorial y hormonal procedente del tracto gastrointestinal y del hígado (vía nervio vago y aferencias del ganglio cervical superior), así como la información sobre el sabor, procedente de la cavidad bucal (vía nervios craneales), el olor y la apariencia. Por otro lado, el sistema hedónico de la ingesta está formado principalmente por el área tegmental Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina ventral (VTA), donde se sintetiza dopamina (principal neurotransmisor de las vías de recompensa), y el núcleo accumbens (NAc), inervado por las neuronas del área VTA y que por tanto responde al estímulo de dopamina, constituyendo así el circuito dopaminérgico mesolímibico [148]. 3. La paradoja de la obesidad en el ictus isquémico 3.1. La obesidad como factor de riesgo para el ictus isquémico El sobrepeso y la obesidad (y posiblemente el bajo peso) se asocian con una mayor mortalidad por todas las causas, siendo la mortalidad más baja para un IMC entre 20 y 24,9 kg/m2 [149, 150]. Esto se debe a que la obesidad está asociada con muchas enfermedades crónicas como la diabetes mellitus, las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, hipertensión y ciertos tipos de cáncer [121, 122, 123, 124, 125]. En las enfermedades cardiovasculares, el incremento del índice de masa corporal ≥ 30 kg/m2, acompañado de altas demandas oxidativas del tejido adiposo metabólicamente activo, eleva el consumo total de oxígeno del cuerpo, que va acompañado de un aumento absoluto del gasto cardíaco llevando a la hipertrofia ventricular izquierda. Esto se asocia con insuficiencia cardíaca congestiva, un mayor riesgo de morbilidad y mortalidad por enfermedad coronaria y muerte súbita, así como ritmos cardíacos anormales (o arritmias) [151]. Sin embargo, también se cree que el riesgo está mediado sustancialmente por la dislipemia, la hipertensión, la resistencia a insulina, la diabetes mellitus, y la inflamación (asociado a la obesidad se han visto incrementados los niveles de la proteína C reactiva, IL-6, TNFα, MCP-1/CCL-2, IL-8 e ICAM1) [152]. Son muchos los estudios que han examinado la asociación entre la obesidad y la enfemedad cerebrovascular, asociándose la obesidad con un mayor riesgo de ictus [153, 154]. Prácticamente la totalidad de estos estudios miden la obesidad con el IMC, pero alguno también usa las medidas de obesidad central como la relación cintura-cadera o la circunferencia de la cintura. En la mayoría se encuentra al menos una de las medidas de adiposidad significativamente asociada con el incremento de riesgo de ictus. En estudios epidemiológicos recientes, por cada unidad que incrementa el IMC, el riesgo de ictus isquémico incrementa sobre el 5%, y el riesgo parece ser casi lineal en un IMC todavía normal de 20 kg/m2 [155]. Existen evidencias importantes que han surgido de los estudios de asociación entre obesidad y riesgo de ictus. Primera, que las medidas de obesidad central predicen mejor el riesgo de ictus que el IMC en la mayoría de los estudios [156], aunque no en todos [157]. Segunda, el riesgo relativo de ictus asociado a la obesidad parece ser mayor para individuos de mediana edad comparados con los de avanzada edad. Y tercera, se asocia tanto con el ictus isquémico como con el hemorrágico Introducción Tania López González Página 71 [158], pero se ha demostrado de forma más consistente para el primero [154]. Es preciso señalar que la asociación entre la obesidad y el aumento de riesgo de ictus se explica, en gran medida, por la hipercolesterolemia, hipertensión y diabetes mellitus [152, 154, 155]. Pero la mayoría de los investigadores consideran que estas son variables intermedias (es decir, son causadas por la obesidad e independientemente incrementan el riesgo de enfermedad cerebrovascular) y, por tanto, las omiten para los modelos que examinan la asociación entre la obesidad y el riesgo de accidente cerebrovascular. La prevalencia de la obesidad en los pacientes de ictus no se ha descrito, pero las estimaciones disponibles indican que puede oscilar del 18 al 44% según lo definido por la obesidad total (es decir, el IMC) y del 36% según las medidas centrales [159-162]. No resulta extraño que los supervivientes de un ictus que son obesos sean más propensos a tener ciertos factores de riesgo vascular, incluyendo diabetes mellitus, lipoproteínas de baja densidad (HDL), colesterol, hipertensión, y apnea obstructiva del sueño [159, 162, 163]. Esta última está asociada con peor resultado y alta mortalidad tras un ictus [164]. Por otro lado, un pequeño número de estudios sugieren que la obesidad confiere una peor respuesta al activador de plasminógeno tisular [165], menor probabilidad de obtener la alta a casa [160] y peor respuesta a la rehabilitación [166]. Sin embargo, la efectividad de la terapia hipotensiva tras el ictus no está afectada por el peso corporal [167]. La pérdida de peso en pacientes obesos se puede dar debido a cambios en el comportamiento alimenticio, por fármacos o por cirugía bariátrica. Desafortunadamente, hay muy pocos datos sobre el efecto de alguna de estas intervenciones en el riesgo de eventos vasculares [168]. 3.2. La obesidad como indicador de buen pronóstico tras un ictus isquémico En contraposición a los múltiples estudios que relacionan la obesidad como un factor de riesgo para padecer múltiples enfermedades incluyendo al ictus [151], en los últimos años se está teniendo una perspectiva diferente sobre el peso corporal en lo referente a pacientes con enfermedades cardiovasculares establecidas. De hecho, el sobrepeso y la obesidad están asociados con una mayor supervivencia en diversas enfermedades cardiovasculares, incluyendo la insuficiencia cardíaca [169], el infarto agudo de miocardio [170], la cirugía de bypass [171], la cirugía valvular [172] y la enfermedad coronaria [173]. Esta relación entre supervivencia y el peso corporal también es aplicable a los pacientes con ictus y, mientras que hay muchos estudios que hablan de que la obesidad podría ser un factor de riesgo de ictus, la relación entre el peso corporal y el pronóstico después de un ictus o Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina un AIT está peor establecida. Se han llevado a cabo investigaciones para evaluar el impacto del estado nutricional y del peso corporal sobre el pronóstico después de un ictus. Los resultados muestran, de forma contradictoria a los estudios que hablan de una peor recuperación de los pacientes obesos tras un ictus [159-166], que existe una relación inversa entre el peso corporal y la mortalidad en dichos pacientes. En el ensayo FOOD se ha investigado el impacto del estado nutricional en la mortalidad de pacientes con ictus y se ha descrito que los pacientes con mala nutrición tuvieron un riesgo de morir 2,3 veces mayor, en el plazo de 6 meses, frente a los pacientes con un estado nutricional normal; mientras que los pacientes con sobrepeso no presentaron un riesgo aumentado [174]. En un proyecto danés, en el que se incluyeron 21.884 pacientes con ictus, se observó una mayor mortalidad en los pacientes con bajo peso [175]. De igual modo, los pacientes con sobrepeso y obesidad tuvieron una supervivencia significativamente mayor que los pacientes con peso corporal normal. En un estudio griego reciente, que incluyó 2.785 pacientes con ictus, se evidenció una asociación inversa entre el peso corporal y la mortalidad [161]. Por otro lado, la obesidad no se establece como un factor de riesgo para la recurrencia de ictus.Además, los resultados de estudios recientes indican que los pacientes obesos tienen un riesgo más bajo que los pacientes delgados de sufrir un evento vascular importante tras un ictus, además de mejores resultados de supervivencia y pronóstico funcional [162, 176]. De igual forma, los pacientes obesos presentan menor mortalidad y mejor recuperación funcional tras una hemorragia intracerebral [177]. Esta relación inesperada de la obesidad con un mejor ponóstico después del ictus ha sido denominada paradoja de la obesidad, y ha llevado a cuestionar la recomendación de pérdida de peso en estos pacientes [161]. La paradoja de la obesidad es particularmente desconcertante porque la pérdida de peso se asocia con mejoras en los principales factores de riesgo cardiovascular, incluyendo la dislipemia, la diabetes mellitus, la hipertensión y las medidas de inflamación. Por eso, también se ha sugerido que la subestimación del efecto adverso de la obesidad podría explicarse por sesgo [178]. Por otro lado, otros estudios clinicos recientes se contraponen a la paradoja de la obesidad en los pacientes de ictus isquémico [179, 180, 181]. Ante esta falta de consenso, se deja abierto un campo de estudio para poder obtener resultados más concluyentes para dos patologías muy prevalentes en la actualidad, el ictus y la obesidad. Sin embargo, es preciso matizar que los estudios clínicos son observacionales, no es factible el estudio experimental en los pacientes y, a su vez, es difícil de analizar esta asociación en la fase aguda tras la isquemia. En general, los estudios clínicos investigan el efecto positivo o negativo de la obesidad sobre la morbilidad y mortalidad a largo plazo tras un ictus, pero los mecanismos a través de los cuales la obesidad tiene un efecto beneficioso o perjudicial no se han elucidado en los estudios clínicos. Además, en los ensayos clínicos está presente el sesgo de selección [182] que da lugar a relaciones no causales o asociaciones entre los diferentes efectos. Cuando son efectos medidos puede hacerse un ajuste estadístico, pero el problema está con los Introducción Tania López González Página 73 efectos no medidos que pueden distorsionar la relación entre la obesidad y el pronóstico tras la isquemia cerebral [183]. Por otro lado, los estudios clínicos existentes han utilizado principalmente el IMC como medida de la obesidad, y esto no siempre es el mejor indicador de adiposidad ya que no discrimina entre la masa corporal magra y grasa. Otras medidas de la obesidad pueden reflejar con mayor precisión la adiposidad nociva, como por ejemplo la obesidad visceral/abdominal [184,185]. 3.3. Efecto de la obesidad en los modelos animales de isquemia cerebral En contra de la perspectiva clínica, hay un claro consenso en los estudios preclínicos de que la obesidad empeora el resultado tras un ictus. Este efecto nocivo de la obesidad en el pronóstico ha sido principalmente demostrado en roedores sometidos a una isquemia cerebral experimental. En ambos modelos de obesidad, rata y ratón, los roedores sufren un incremento del daño isquémico cerebral y tienen peores resultados de comportamiento en comparación con los animales control. Este efecto desfavorable fue inicialmente observado en modelos genéticos de obesidad, como los ratones ob/ob [186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193] los ratones db/db [194, 195, 196, 197, 198] o las ratas Zucker [199, 200, 201], los cuales desarrollan obesidad debido a la deficiencia de leptina o del receptor de la misma, respectivamente. Este resultado negativo se ha confirmado también en modelos de obesidad inducidos por dieta, en los que el animal se convierte en obeso por estar alimentado con una dieta alta en grasa, tanto en rata [202, 203, 204, 205, 206, 207] como ratón [193, 208, 209, 210] y gerbil [211, 212, 213]. Se han usado gran variedad de modelos de isquemia cerebral en estos estudios, incluyendo oclusión permanente y transitoria de la arteria cerebral media, ligación de la arteria carótida común y exposición a un ambiente hipóxico. En ratón, se ha descrito recientemente que el impacto negativo de la obesidad inducida por dieta en el pronóstico tras la isquemia depende de la gravedad del daño isquémico inicial (volumen de isquemia) [60]. Sin embargo, no está claro si estos efectos nocivos de la obesidad en estos estudios preclínicos son permanentes, o reversibles, con la reducción de peso.  Efecto de la obesidad en la inflamación  Neuroinflamación La inflamación crónica de bajo grado que resulta de la obesidad puede afectar al resultado tras un ictus modulando la inflamación del SNC previa al ictus. Los pacientes obesos suelen mostrar niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias en el plasma, incluyendo CRP, IL-6, TNFα y CCL-2/MCP-1 [152]. Las citoquinas circulantes pueden acceder directamente al Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina parénquima cerebral, o trasmitir señales inflamatorias sobre la BBB indirectamente, a través de receptores en las células endoteliales de la vasculatura cerebral o por la estimulación de fibras nerviosas aferentes. Sin embargo, la elevación sistémica de mediadores de inflamación en la obesidad puede que no sea suficiente para elevar la respuesta inflamatoria en el SNC. En su lugar, puede dar origen a consecuentes estímulos inflamatorios en las células, por ejemplo leucocitos o plaquetas en la circulación [191, 214]. Los ratones que desarrollan obesidad tras ser alimentados con una dieta alta en grasa muestran un incremento de la activación de astrocitos y microglía, e incremento de mediadores de inflamación en el cerebro, principalmente debido a la acitivación de NF-kB [215, 216]. Sin embargo, esta respuesta puede ser debido a las grasas de la dieta, más que el resultado de la obesidad. El incremento en la inflamación basal puede, por tato, alterar la reactividad de las células dentro del SNC a estímulos isquémicos posteriores, cambiando la consecuente respuesta inflamatoria. Además de mostrar el daño isquémico incrementado, se ha visto reducida la reactividad microglial y la expresión de citoquinas inflamatorias en los cerebros de ratones db/db, ob/ob y con dieta alta en grasa tras la isquemia cerebral [188, 191, 210, 217, 218]. Esto puede ocasionar un fallo para generar una respuesta inflamatoria adecuada, lo que puede impedir la transición apropiada de la inflamación aguda a la reparación y recuperación. Además, los ratones db/db expresan factores de crecimiento y otros marcadores de reparación en el cerebro de forma retrasada y disminuída [217]. Por el contrario, otros estudios han visto que los niveles de expresión de citoquinas y quimioquinas están incrementados en el tejido cerebral isquémico de ratas y ratones obesos [195, 199, 202, 208]. Esta respuesta puede ser debido al incremento del daño en los roedores obesos, a pesar de que la elevada expresión de mediadores de inflamación se observe temprano sobre 2,5 horas tras la reperfusión [199].  Respuesta inflamatoria periférica tras la isquemia experimental El ictus isquémico desencadena una respuesta inmune periférica tanto por vía humoral como por vía neural, con liberación de linfocitos en órganos inmunes (médula ósea, timo y bazo), liberación de proteínas de fase aguda en el hígado, aumento de mediadores de inflamación en varios órganos y aumentos sostenidos en otros marcadores de inflamación circulantes [219, 220]. Dado que esta respuesta periférica posterior al ictus se produce a medida que el daño central está evolucionando, se cree que este proceso amplifica la reacción inflamatoria tras el ictus y el daño resultante. En la obesidad, la respuesta inmune periférica después de la isquemia parece estar aumentada, ya que la IL-6 plasmática, CCL-2/MCP-1 y CXCL-1 (KC) aumentan significativamente en ratones obesos con isquemia [191, 208]. La inhibición de CCL-2/MCP-1 utilizando un anticuerpo de bloqueo reduce el daño en los ratones ob/ob, lo que sugiere que la respuesta inflamatoria periférica pueda contribuir al daño en la obesidad [191]. De la misma forma, tanto la Rosuvastatina (una estatina) como la Dargilitazona Introducción Tania López González Página 75 (un agonista de PPARγ) parecen ser antiinflamatorios y neuroprotentores en ratones ob/ob pero no ob/- [188, 192].  Alteración de adipoquinas Los niveles plasmáticos de adiponectina en adultos sanos son elevados, pero se reducen en correlación con el aumento de adiposidad [221, 222]. La adiponectina tiene una variedad de acciones antiinflamatorias y recientemente se ha demostrado que es neuroprotectora en el ictus [223, 224]. En humanos, los niveles incrementados en plasma correlacionan con la disminución del daño isquémico, y al contrario, niveles bajos están asociados con un incremento de la mortalidad tras la isquemia cerebral. [225]. Se han hecho observaciones similares en modelos de isquemia focal transitoria en roedores, donde se ve que con la administración de adiponectina se disminuye el tamaño de infarto y déficit motor y sensorial [223, 224], y la deficiencia de la misma incrementa los daños [226]. Los efectos neuroprotectores de la adiponectina parecen estar mediados principalmente por el endotelio cerebrovascular isquémico, donde la adiponectina se localiza selectivamente después de la isquemia cerebral. Los mecanismos de esta localización no se entienden completamente ya que la adiponectina no se sintetiza localmente y no es capaz de atravesar una BBB intacta [227], pero puede implicar la adhesión al colágeno del endotelio lesionado y el paso sobre la barrera endotelial isquémicamente dañada [224, 226]. La acumulación de adiponectina resultante, puede tener una variedad de efectos beneficiosos; parece promover la integradidad de la BBB reduciendo su permeabilidad, la expresión microvascular de MMP-9 y la acumulación de leucocitos [224]. Además, la adiponectina induce la activación de la oxido nítrico sintasa endotelial y, consecuentemente, aumenta el flujo sanguíneo cerebral durante la isquemia [223]. Finalmente, se ha demostrado que la adiponectina reduce la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, supuestamente inhibiendo NF-kB posiblemente debido a la activación de los receptores de adiponectina [224, 227]. Se encontró una disminución similar en la expresión de citoquinas inflamatorias en células endoteliales de cerebro cultivadas y tratadas con adiponectina [227]. Debido a estas acciones, se ha demostrado ampliamente que protege el endotelio vascular en la periferia [228]. Por lo tanto, una pérdida de estos efectos protectores puede explicar aumentos en el daño por isquemia cerebral y complicaciones microvasculares en ratones obesos, donde los niveles de adiponectina están crónicamente disminuídos. En concordancia, datos recientes demuestran que la obesidad exacerba la isquemia cerebral mediante el aumento de la apoptosis de las neuronas que expresan adiponectina [203]. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina  Estudios in vivo  Activación e inhibición farmacológica de la AMPK Por otro lado, el efecto de la manipulación de AMPK in vivo, cuando los astrocitos y las neuronas están en estrecha proximidad y cooperan entre ellos, puede diferir. Los estudios in vivo utilizando un modelo de oclusión transitoria de la cerebral media (tMCAO) en ratones han demostrado que la activación de AMPK en ratones es perjudicial, al menos cuando el daño es agudo (días después de la isquemia). La administración con AICAR en ratones aumenta la lesión en un modelo de MCAO y la inhibición farmacológica de AMPK usando C75 (que modula los niveles de ATP neuronal) o el compuesto C reduce la lesión [264], demostrando que la inhibición de AMPK es protectora en el ictus isquémico. Estos estudios examinaron la señalización de AMPK después de una isquemia severa y prolongada y una reperfusión. Está cada vez más claro que la activación inicial de AMPK es un intento de restaurar la homeostasis en el cerebro isquémico. Sin embargo, después de comenzar la muerte celular, los intentos adicionales de producir ATP en las células metabólicamente dañadas conducen únicamente a un empeoramiento de la herida y a una disfunción metabólica adicional [265]. El tratamiento con metformina durante 3 días (agudo) antes de un ictus isquémico (modelo MCAO) condujo a un aumento de la lesión, a una mayor activación de la AMPK y a una acidosis láctica inducida por el ictus isquémico exagerada [266]. Cabe señalar que la activación farmacológica de AMPK con fármacos puede conducir a efectos secundarios fuera del objetivo [265]. El AICAR, por ejemplo, tiene baja especificidad y baja potencia [267], por lo que también se han llevado a cabo estudios más concluyentes utilizando modelos genéticos, aclarando más el papel de AMPK en el ictus isquémico. Por otro lado, algunos estudios han sugerido que la activación de AMPK, puede ser beneficiosa durante la lesión isquémica. La activación de AMPK inducida por el ictus isquémico conduce a la fosforilación de la serina 783 en la subunidad R2 del receptor GABA, potenciando la inhibición sináptica lenta mediante la rectificación de los canales de K+ hacia el interior. Se ha sugerido que esto provocaría una redución en el daño excitotóxico que condujo a una mayor supervivencia neuronal. Cabe señalar que la fosforilación inducida por lesiones de GABA se observó principalmente en la región del hipocampo, que no suele lesionarse con la oclusión de la ACM. Estos resultados dispares deben aclararse con otros estudios [268].  Modelos de delección genética de AMPK El estudio de los modelos de ratón con la subunidad α1 o α2 de AMPK delecionada ha ayudado a entender el papel de AMPK en la isquemia cerebral, aunque estos modelos también tienen limitaciones. Es preciso señalar que un knockout completo de la subunidad α es embrionariamente letal [269]. En un modelo de isquemia por MCAO, los ratones knockout de Introducción Tania López González Página 83 AMPKα2 tienen menos lesión en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje, mientras que no se observó diferencia en la lesión en ratones knockout α1 [270]. Esta protección isquémica observada en ratones knockout AMPK α2 se ha encontrado también en otros estudios [271, 272]. La administración del compuesto C disminuyó la lesión en ratones de tipo salvaje, pero no en ratones knockout α2, lo que sugiere que los efectos perjudiciales de AMPK en el accidente cerebrovascular están mediados por la subunidad α2 [270]. Sin embargo, otro grupo ha demostrado un aumento de los volúmenes de infarto en ratones knockout α2 de AMPK en comparación con el tipo salvaje, posiblemente como resultado del uso de una oclusión isquémica más prolongada (120 min de MCAO) [258]. Los estudios que utilizan el activador de AMPK metformina en ratones knockout para AMPK, han demostrado la complejidad de la señalización de AMPK. Los efectos deletéreos del tratamiento agudo con metformina se suprimieron en ratones knockout para α2 de AMPK, lo que confirma que la metformina actúa a través de las vías de AMPK. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que la activación de AMPK es perjudicial en el ictus isquémico, pero cuestionan el mecanismo que conduce a sus beneficios para la prevención del ictus isquémico en la clínica. Cuando se cambió la duración del tratamiento de un régimen agudo a crónico (3 semanas antes de la isquemia cerebral), se observó una disminución significativa en la lesión isquémica. Curiosamente, se encontró que el tratamiento crónico con metformina condujo a una disminución significativa de los niveles de pAMPK inducidos por el ictus isquémico, redujo la formación de lactato y mejoró el daño del infarto [266]. Este trabajo sugiere que la duración y la cronificación de la actividad de AMPK (aguda versus crónica) son determinantes críticos de los resultados del ictus isquémico. La hipotermia es neuroprotectora después de la isquemia experimental [273, 274], probablemente reduciendo la demanda metabólica. En un modelo de MCAO en ratones, 6 horas de hipotermia condujeron a una reducción significativa en el volumen de infarto y también a una reducción en pAMPK en el cerebro. El efecto neuroprotector de la hipotermia fue mediado por la reducción de los niveles de pAMPK inducidos por el accidente cerebrovacular, ya que tanto la inhibición farmacológica con compuesto C, como la deleción del gen AMPKα2 no proporcionaron ninguna reducción en la lesión debido a la hipotermia (más allá a la reducción por la pérdida de AMPK solamente). Si la protección inducida por hipotermia fuese mediada por un mecanismo que no incluyera a AMPK, se esperaría un efecto aditivo (protección mejorada). Sin embargo, estos resultados deben ser interpretados con cautela, porque bajo lesiones pequeñas se reduce la posibilidad de observar diferencias significativas en el volumen. Curiosamente, los ratones que recibieron el compuesto C desarrollaron hipotermia de forma espontánea, lo que sugiere que una reducción en el estímulo que señala la demanda metabólica (bajos niveles de pAMPK) conduce a la hipotermia. Esto puede tener relevancia clínica, ya que Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina tanto la hipotermia como la inhibición de AMPK disminuyen el metabolismo neuronal, prolongando potencialmente la ventana de tiempo para la terapia de reperfusión [275].  La AMPK en los diferentes tipos celulares En condiciones normales (normoxia y disponibilidad de glucosa) las neuronas utilizan la glucosa como principal sustrato energético a través del metabolismo oxidativo, en lugar de obtener energía de la glucólisis. Mientras tanto, los astrocitas utilizan la glucosa a través de la glucólisis anaeróbica para producir piruvato y lactato, el cual es absorbido por las neuronas para una posterior degradación oxidativa y produción de ATP [276]. Sin embargo, en condiciones de hipoxia e hipoglucemia, el metaboismo oxidativo cesa y se induce la actividad metabólica diferencial en astrocitos y neuronas. Bajo estas condiciones, las neuronas, debido a la degradación proteosomal constante de la fosfofructokinasa 2 (PFK2) y a la baja reserva de glucógeno, son incapaces de regular positivamente la glucólisis y no oxidan eficientemente los ácidos grasos. Los astrocitos tienen más actividad de la enzima PFK2 y almacenan grandes cantidades de glucógeno, por lo que, en condiciones de estrés, tienen una mayor tasa de glucólisis y oxidan más eficientemente ácidos grasos para producir ATP que la neurona [277]. Por eso, parece que los astrocitos (a diferencia de las neuronas) están equipados para mejorar la producción de energía a través de mecanismos de señalización por AMPK (induce glicolisis y oxidación de ácidos grasos) y se cree que la activación de esta vía realza el metabolismo y supervivencia astrocítica proporcionando así un mejor entorno de soporte para las neuronas mediante la potenciación del lactato. La deleción de la AMPKα2 astrocítica, de forma específica, es deletérea tras un ictus isquémico, conduciendo a un aumento del edema y del volumen de infarto, así como a peores resultados conductuales y de transformación hemorrágica. Esto sugiere que la AMPK astrocítica puede proteger al cerebro de la lesión isquémica, quedando pendiente el estudio de la delección específica en neuronas [278]. En las células endoteliales, la hipoxia también conduce a la activación de AMPK [279], pero, en contraste con lo que se observa en neuronas, la activación de AMPK es protectora en las células endoteliales. Esto puede ser debido un aumento de la eNOS y la vasodilatación aguda [280]. La activación de AMPK también se requiere específicamente para la migración y diferenciación de células endoteliales en condiciones de hipoxia [279]. La angiogénesis después del ictus isquémico es necesaria para la reparación y recuperación, por lo que hay que tener en cuenta que el momento de administración de los inhibidores de AMPK (neuroprotectores en modelos animales) es crítico, ya que debe mantenerse la reparación tras el ictus isquémico [281]. Introducción Tania López González Página 85  La AMPK en el preacondicionamiento El preacondicionamiento isquémico es un fenómeno por el cual la exposición a un breve estímulo de isquemia conduce a la protección del organismo de un próximo daño isquémico grave [286]. In vitro, se ha visto que el preacondicionamiento isquémico por la exposición a glutamato (lesión excitotóxica) condujo a la activación y translocación de AMPK a la membrana plasmática, con la consecuente activación y translocación del transportador de glucosa 3 (GLUT 3) [287] y la hiperpolarización del potencial de membrana mitocondrial [288]. In vivo, algunos estudios demostraron que el proacondicionamiento isquémico (inducido por una breve isquemia de 3 min 72 h antes de la isquemia cerebral) conduce a la neuroprotección, de forma paralela a la inhibición significativa de la pAMPK. La activación farmacológica de AMPK con metformina eliminó los efectos neuroprotectores del precondicionamiento y los a ratones knockout de AMPKα2 no mostraron respuesta al preacondicionamiento. Sin embargo, la coadministración de un inhibidor de AMPK al preacondicionamiento, no suposo una protección adicional [271].  La AMPK en la apoptosis Se hace evidente que breves períodos de activación de AMPK mejoran la supervivencia neuronal, mientras que la activación sostenida de AMPK induce la muerte celular. El efecto proapoptótico de la AMPK se ha demostrado en diferentes tipos celulares y a través de diferentes rutas moleculres (Figura 9). La primera demostración se ha visto en el hígado de ratas, a través de la activación de la proteína kinasa c-Jun N-terminal (JNK) y la caspasa 3 [289]. Hay otros estudios que relacionan a la activación de AMPK con la activación de p53 seguido de la activación apoptótica [290], la cual también se ha visto que puede ser desencadenada por la inhibición del complejo TORC1 causada por la AMPK [291]. También se ha visto que la inhibición del complejo TORC1 disminuye la tranlocación de proteínas antiapoptóticas [292]. La activación prolongada de AMPK activa la proteína proapoptótica Bim [293]. Curiosamente, la activación de esta proteína durante la lesión excitotóxica no sólo requiere la desfosforilación y translocación nuclear del factor de transcripción Forkhead FOXO3, sino también una segunda etapa de activación en la que FOXO3 tiene que ser directamente fosforilado por AMPK en el núcleo [294]. Se ha demostrado que FOXO3 promueve la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans [295]. Por lo tanto, la exposición a corto plazo de AMPK provoca sólo translocación nuclear de FOXO3, preacondicionamiento y supervivencia celular. Sin embargo, la actividad prolongada de pAMPK estimula la segunda etapa de activación de FOXO3, dando lugar a la expresión de Bim y a la muerte celular [294, 295]. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina Recientemente, se ha propuesto un nuevo mecanismo que explica la apoptosis inducida por AMPK, a través de la ruta del ER stress; se ha visto que el tratamiento con metformina, en la leucemia linfoblástica, lleva a la apoptosis por la activación de la endonucleasa 1α que requiere inositol (IRE1α), la proteína homóloga de C/EBP (CHOP), caspasas y JNK [296]. Figura 9. La ruta de la AMPK y su implicación en la supervivencia celular tras el ictus isquémico. Introducción Tania López González Página 87  La AMPK en la autofagia Además de la necrosis y apoptosis, en el cerebro isquémico también se induce la muerte celular llamada autofagia. Este tipo de muerte celular permite que las células produzcan energía durante períodos de inanición de nutrientes a través de la absorción de material citoplasmático y orgánulos y permite el reciclaje de aminoácidos y otros nutrientes. La AMPK induce la autofagia (Figura 9) en respuesta a las necesidades energéticas [297, 298] mediante la inactivación del complejo diana de la rapamicina 1 (TORC1) y la fosforilación directa de la kinasa iniciadora de autofagia en mamíferos, Ulk1 [298, 299, 300]. El complejo TORC1 funciona como un sensor de ATP y aminoácidos para equilibrar la disponibilidad de nutrientes y crecimiento celular, por lo que bajo disponibilidad de nutrientes responde fosforilando y activando la kinasa ribosomal S6 de 70 KDa (S6K), llevando a la síntesis proteica [301]. La AMPK fosforila a una de las proteínas que forman parte del complejo TORC1, RAPTOR, en la Ser 722/Ser 792, inhibiendo así dicho complejo [302]. Además, la AMPK activa la tuberina 2 (TSC2) por fosforilacion en la Ser 1387, la cual inhibe al complejo TORC1 [302]. Por otro lado, la activación del complejo TORC1 lleva a la inhibición de la autofagia por fosforilación de Ulk1 [298]. La AMPK también fosforila a Ulk1, pero en este caso concretamente en la Ser 555 causando su activación [300]. Se ha demostrado que el agotamiento de la energía en los mutantes de AMPK de Drosophila desencadena un aumento de la autofagia que promueve la neurodegeneración [304]. No se conoce si la autofagia estimulada por AMPK ocurre en la isquemia cerebral, por lo que se necesitan futuros estudios para investigar la contribución de la autofagia al daño del infarto después de la isquemia cerebral. 3.4.2. El estrés del retículo endoplasmático El retículo endoplasmático (ER) es responsable de las modificaciones de plegamiento y postraduccionales de las proteínas. Estos procesos son llevados a cabo por enzimas que están reguladas directa e indirectamente por Ca+2, un ion que en condiciones fisiológicas está en alta concentración en el lumen del ER. Sin embargo, cuando el fallo energético ocurre como consecuencia de la isquemia, las bombas de Ca+2 fallan y la concentración intraluminal de Ca cae comprometiendo las funciones del ER, un proceso conocido como estrés del retículo endoplasmático, más conocido como ER stress (Figura 10). Las proteínas desplegadas se acumulan en el lumen del ER, y la chaperona GRP78 (BiP), se disocia de sus receptores para resolver el problema de desplegamiento y evitar la agregación de proteínas. La disociación de GFP78 de sus receptores en la membrana del ER desencadena una cascada de señalización conocida como respuesta a proteínas desplegadas (Unfolded Protein Response, UPR), la cual Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina está interelacionada con muchas rutas de inflamación y con diferente tipo de señalización de estrés, como en el caso de la isquemia [305] o de la obesidad [306]. Estos receptores son la kinasa reticular endoplasmática del tipo ARN, la endonucleasa que requiere inositol 1 y el factor de activación transcripcional 6 (PERK, IRE1 y ATF6 respectivamente) [305, 306]. PERK está principalmente involucrado en la reducción de la síntesis de proteínas globales por medio de la inhibición del factor de iniciación de la traducción eucariótica 2α (eIF2α), y aumenta la expresión de los genes relacionados con la UPR mediante la activación del factor de transcripción 4 (ATF4). Por otro lado, IRE1 promueve la expresión de chaperonas de plegamiento y proteínas relacionadas con la proteólisis mediante la activación del factor de transcripción XBP1 y activa la proteína JNK relacionada con la activación de la apoptosis. El ATF6 se disocia de la membrana del ER, y después de ser activado por proteolisis, actúa regulando los genes relacionados con la UPR, de forma complementaria a IRE1 [307]. Por último, aunque la principal función de la UPR es promover la supervivencia celular, si el ER stress dura, la UPR puede señalar muerte celular por medio de CHOP (en cuya activación desencadena la señalización a partir de los 3 receptores), o JNK, activando finalmente a las caspasas [305]. Figura 10. ER stress en la isquemia cerebral. Cuando se mantiene la activación de los receptores de la membrana del retículo endoplasmático PERK, IRE1 y ATF6, debido a la activación de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) que ocurre bajo la isquemia cerebral, se activa la apoptosis vía CHOP. Introducción Tania López González Página 89 3.5. El tratamiento dual con nicotina de la obesidad y el ictus isquémico 3.5.1. La nicotina Está muy bien establecido que el hábito de fumar tiene consecuencias negativas en la salud. Sin embargo, el uso del tabaco está creciendo todavía globalmente [308]. La nicotina no es una causa directa de las enfermedades relacionadas con el tabaco, pero es altamente adictiva. La adicción causada por la nicotina desencadena un continuo uso del tabaco (el cual se puede fumar, masticar o esnifar) causando la exposición a diversos carcinógenos y otros compuestos bioactivos del mismo, un hecho que proboca muertes prematuras en los países desarrollados [309]. El tabaco es la única causa prevenible de la muerte por cáncer; la gran mayoría de los fumadores lo quieren dejar, pero debido a la adicción de la nicotina solo un pequeño porcentaje de los mismos son capaces de hacerlo [310]. La medicación con nicotina se usa como terapia de reemplazamiento para poder parar de fumar, aunque también se ha estudiado como terapia experimental en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad del Alzheimer y la colitis ulcerosa [311]. La nicotina constituye sobre el 0,6-3% del peso en seco de la planta del tabaco y es un potente repelente e insecticida natural. Es el principal alcaloide del tabaco, de media abarca sobre un 1,5% del peso de un cigarrillo comercial, que supone aproximadamente una media de 10-14 mg de nicotina, de los que se absorben sistémicamente una media de 1-1,5 mg de nicotina. Parte de la nicotina se absorbe a través de la boca hasta que se comienza con la absorción pulmonar llegando al torrente sanguíneo. Tras una bocanada, en 10-20 segundos llegan grandes niveles de nicotina al cerebro produciendo un refuerzo conductual rápido mediante la activación del sistema de recompensa dopaminérgico [312]. La nicotina es un compuesto altamente lipofílico, por lo que, una vez en el cerebro, se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina neuronales (nAChRs). Estos representan una familia heterogénea de canales iónicos pentaméricos, los cuales responden al neurotransmisor endógeno acetilcolina (ACh) y a la nicotina exógena, y están envueltos en un gran número de procesos fisiológicos y efectos farmacológicos [313]. La activación de los nAChR excita células diana y media una rápida transmisión sináptica en neuronas ganglionares autónomas y en varias áreas del cerebro. Estos receptores regulan la liberación tanto de neurotransmisores excitatorios como inhibitorios, y como consecuencia, la activación de los nAChRs puede tener efectos de modulación opuestos en el mismo circuito dependiendo en si se expresan en neuronas exitatorias o inhibitorias [314]. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 3.5.2. Efecto de la nicotina en la obesidad A pesar del esfuerzo para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el equilibrio energético, la búsqueda de objetivos moleculares y tratamientos farmacológicos no ha sido totalmente exitosa y la mayoría de los fármacos aprobados han mostrado efectos secundarios indeseados o baja efectividad después del tratamiento a largo plazo [316]. Además, varios factores que normalmente inducen un balance energético negativo, como la leptina, la insulina y el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), son en gran medida ineficaces en los modelos de obesidad de roedores y en los pacientes obesos [317]. Una estrategia para identificar los mecanismos moleculares involucrados en el control del peso corporal es obtener más conocimiento sobre las sustancias ya usadas comúnmente, con efectos farmacológicos establecidos y propiedades farmacocinéticas. Los fumadores de todo el mundo suelen tener un aumento del peso corporal después del abandono del hábito de fumar [318], y numerosos estudios controlados en humanos y roedores han informado que la nicotina ejerce efectos potentes sobre la homeostasis energética. De hecho, se ha demostrado que la nicotina disminuye la ingesta de alimentos mediante la modulación de los sistemas de neuropéptidos hipotalámicos. Además, la nicotina afecta al metabolismo periférico. La termogénesis del tejido adiposo marrón (BAT) en ratas se incrementa mediante la nicotina a través de la activación del sistema nervioso simpático y el aumento de la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP-1), hechos mediados por la regulación de la AMPK en el hipotálamo [319]. Además, el tratamiento crónico periférico con nicotina reduce el peso corporal al disminuir la ingesta de alimentos y aumentar la termogénesis del tejido adiposo marrón tanto en ratas con dieta baja en grasa, como con dieta alta en grasa. Este balance energético global negativo se asoció con una disminución de la activación de la AMPK hipotalámica en ambos modelos. Además, la nicotina mejora el perfil lipídico del suero, disminuye los niveles séricos de insulina, al igual que reduce la esteatosis, la inflamación y el ER estress en el hígado de ratas con dieta alta en grasa pero no en el de ratas con dieta baja en grasa. En general, esto sugiere que la nicotina disminuye el peso corporal y mejora los trastornos metabólicos vinculados a la dieta alta en grasa, por lo que, puede ofrecer una estrategia clara para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos contra la obesidad y sus complicaciones metabólicas [320]. 3.5.3. Efecto de la nicotina en el ictus isquémico 3.5.3.1. La paradoja del tabaquismo en pacientes con ictus isquémico El tabaco es un factor de riesgo bien establecido para la aterosclerosis prematura [321], infarto de miocardio [322] e ictus [323]. Al igual que lo que se ha visto en el infarto de Introducción Tania López González Página 91 miocardio agudo, se espera que el tabaquismo incremente el riesgo de muerte y eventos cardiovasculares en pacientes con ictus [324, 325]. Sin embargo, numerosos estudios muestran resultados contradictorios al respecto. Algún estudio habla de que sólo los ex fumadores presentan peores resultados [326], otros no encuentran una asociación entre el tabaquismo en el momento del ictus y los resultados a largo plazo [327] y otros hablan de que los pacientes que fuman en el momento del ictus o que han fumado antes tienen mayor riesgo de muerte o de un evento vascular recurrente en comparación con los pacientes que nunca han fumado o son ex fumadores [328]. Por otro lado, otros estudios han demostrado que los fumadores con infarto de miocardio tienen menores tasas de mortalidad después de la trombolisis que los no fumadores [329, 330]. Pero también son muchos los estudios en los que se ha cuestionado la denominda paradoja del tabaquismo, atribuyéndole el efecto a los bajos perfiles de riesgo clínico de estos pacientes [331]. Por otra parte, los estudios de imagen han demostrado una perfusión miocárdica mejorada después de la trombolisis en fumadores a pesar del ajuste por edad y otras comorbilidades, ofreciendo una explicación alternativa [330]. La mejora de la reperfusión tisular en los fumadores puede explicarse por el incremento de un mecanismo causal. El tPA es un factor fibrinolítico liberado del endotelio para prevenir la formación de trombos intravasculares; el tabaquismo impide la liberación endógena de tPA y hace que los niveles circulantes de fibrinógeno aumenten [332]. Algunos estudios han demostrado que la exposición al humo del cigarrillo altera la dinámica del coágulo y la composición del trombo, haciendo que la sangre se vuelva hipercoagulable [333]. Se ha sugerido que el riesgo aumentado de enfermedad isquémica cardíaca asociada con el tabaquismo está mediado en gran medida por el aumento de las concentraciones intraarteriales de fibrina. Aunque esto puede predisponer a los fumadores a la oclusión temprana de los vasos, el trombo rico en fibrina en los fumadores puede ser más susceptible al tratamiento fibrinolítico [334]. Así, el tPA puede actuar más específicamente en los fumadores, lo que contrarresta los efectos adversos de este factor de riesgo fisiopatológico. En el ictus isquémico agudo, los pacientes fumadores tratados con rtPA intravenoso presentan mejores resultados para dicho tratamiento trombolítico. Un estudio reciente habla de que los fumadores en el momento del ictus presentan mayores tasas de recanalización en las primeras 24 h tras el inicio de los síntomas en comparación con los no fumadores. Además se ve que el tabaquismo está asociado de forma independiente con la recanalización y la reperfusión, indicando que la terapia trombolítica actúa de forma más efectiva en fumadores [335]. Las razones para esta asociación no se entienden completamente, y las evidencias contradictorias de los estudios previos con rtPA intravenoso, dificultan la visión del efecto potencialmente beneficioso [336, 337]. En un estudio más reciente vieron que la administración intraarterial de INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES Objetivos Tania López González Página 101 OBJETIVOS El presente estudio tiene 2 objetivos principales, con sus correspondientes objetivos específicos. 1. Entender la fisiopatología y el mecanismo molecular que subyace de la paradoja de la obesidad, con la finalidad de identificar nuevas dianas moleculares que puedan ser empleadas para mejorar el pronóstico del ictus isquémico, más allá de la población obesa.  Evaluar el efecto paradójico de la obesidad en el modelo animal de isquemia cerebral por oclusión transitoria de la arteria cerebral media.  Identificar nuevas dianas moleculares, a través del estudio de rutas de señalización celular, asociadas al efecto paradójido de la obesidad en la isquemia cerebral. 2. Evaluar el efecto neuroprotector de la nicotina en el ictus isquémico a través de la ruta de la AMPK.  Evaluar el efecto neuroprotector de la nicotina en el modelo animal de isquemia cerebral por oclusión transitoria de la arteria cerebral media.  Identificar nuevas dianas terapéuticas mediante el estudio del efecto de la nicotina sobre la ruta de la AMPK en la isquemia cerebral. INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES Materiales y métodos Tania López González Página 105 MATERIALES Y MÉTODOS 4. Modelo preclínico 4.1. Manejo de animales Todos los procedimientos experimentales y protocolos de manipulación de animales llevados a cabo durante la realización de esta tesis han sido aprobados previamente por el jefe del servicio provincial de ganadería del departamento territorial de la Consellería do Medio Rural e do Mar de la provincia de A Coruña, siendo responsable el Prof. Dr. Miguel Antonio López Pérez. Los experimentos se realizaron bajo el número de procedimiento: ID 15010/14/006 (cumpliendo el actual y vigente RD 53/2013 del 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en expermientación y otros fines científicos, incluyendo la docencia), de acuerdo con la legislación vigente; Ley 30/1992 del 26 de noviembre del régimen jurídico de las administraciones públicas y del procedimiento administrativo común, moficada por la Ley 4/1999, del 14 de enero, por la que se establece que la resolución que proponga fin al procedimiento decidirá todas las cuestiones expuestas por los interesados y aquellas otras derivadas de este; el Decreto 296/2008, del 30 de diciembre, de protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia, y por el que se crea el “Rexistro de centros de cría”de suministradores y usuarios y la “Comisión Galega de Bienestar de los Animales de Experimentación”; orden del 15 de septiembre de 2006 por la que se crea el “Comité de Bioética da Consellería Rural”; Decreto 153/1998, del 2 de abril, por el que se aprueba el reglamento que desarrolla la Ley 1/1993 del 13 de abril (protección de animales domésticos y salvajes en cautividad); Ley 32/2007, del 7 de noviembre, para el cuidado de los animales en su explotación, transporte y sacrificio; siguiendo también la Directiva Europea de Experimentación Animal (2010/63/UE). Se utilizaron ratas macho comunes (Rattus Norvergicus) de la cepa Sprague-Dawley suministrados por el Animalario General de la Universidad de Santiago de Compostela, con una masa corporal de unos 50 gramos aproximadamente (unas 4 semanas, recién destetadas). Los animales fueron estabulados en condiciones estables de temperatura (21±2ºC), con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas y con un período de aclimatación a las instalaciones de unos 7 días aproximadamente, previo a cualquier procedimiento. Los animales fueron mantenidos en condiciones de acceso libre a agua y comida. La estabulación de los animales fue colectiva teniendo en cuenta el comportamiento social de estos animales. Luego, una vez realizado el procedimiento para desarrollar el modelo de isquemia cerebral, se estabularon individualmente. Se trató de valorar su correcto aspecto físico Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina y acostumbrarlos al manejo por el personal de laboratorio para reducir en todo lo posible el estrés generado durante los experimentos llevados a cabo. El procedimiento de cirugía y el seguimiento de la lesión isquémica mediante resonancia magnética se realizan bajo anestesia por sevofluorano (6% para la indución y 4% para el mantenimiento, en una mezcla de gases de 70% NO2 y 30% O2). Mientras, la temperatura corporal de los animales se controla, manteniendo la temperatura rectal a 37±0.5°C con una manta eléctrica controlada con termostato (NeoBiotec, Spain). 4.2. Modelo de obesidad inducida por dieta En este estudio existen dos grupos principales de animales en función de la dieta que se les suministra durante 12 semanas antes de generar el modelo de isquemia cerebral y durante el seguimiento de los animales tras la misma:  El grupo control, con dieta estándar (STD; 3,1% de grasas, 2,791 Kcal/g, Scientific Animal Food & Engineering, Nantes, France).Composición en Tabla 2.  El grupo de obesidad inducida por dieta, con dieta alta en grasa (HFD; 45% de grasas, 4,73 Kcal/g, Research Diets, New Brunswick, NJ). Composición en Tabla 2. Composición (%) STD HFD Grasas 3,1 45 Hidratos de carbono 59,9 35 Proteínas 16,1 20 Tabla 2. Composición de la dieta estándar (STD) y alta en grasa (HFD). Para la evaluación del modelo de obesidad inducida por dieta se realizó un seguimiento periódico del peso de la masa corporal y la ingesta de todos los animales, con el uso de una balanza de precisión. Todos los animales parten de un peso similar, en torno a los 50 gramos (tienen aproximadamente 4 semanas y están recién destetados de la madre). Durante 12 semanas, previas a la isquemia cerebral, los animales y su comida fueron pesados semanalmente, y la ingesta se promedió en función del número de individuos de cada caja. Tras la isquemia cerebral, la masa corporal e ingesta se registran diariamente, siempre más o menos a la misma hora (en el ciclo de luz, a las 9:00). Una vez sacrificados los animales, se pesa la grasa blanca y parda de los mismos. Materiales y métodos Tania López González Página 107 4.3. Modelo de isquemia focal transitoria Se induce una isquemia focal transitoria (60 minutos) por la oclusión intraluminal transitoria de la arteria cerebral media (ACM), tMCA, siguiendo el método descrito por Longa et al. (Figura 11) [110]. De forma resumida, bajo un microscopio de cirugía, se realiza una incisión en la línea media del cuello, exponiendo el sistema carotideo. La arteria carótida común (ACC) derecha y la ramificación externa de la ACC (ACE) se ligan permanentemente, mientras la ramificación interna de la ACC (ACI) se liga provisionalmente, todas ellas con suturas de seda de 6-0. Se utiliza una sutura comercial con una cabeza recubierta de caucho de silicona (Doccol, USA) de 450-490 μm de diámetro y 2,3-5,6 mm de largo para introducir a través de la ACE y la ACI mediante la eliminación temporal de la ligación de la ACI. Se tiene que situar la sutura en el origen de la ACM, bloqueando el flujo cerebral. Durante el período de oclusión, la arteria carótida común izquierda se liga provisionalmente, permitiendo que se reduzca el flujo cerebral sanguíneo global y se incremente la reproducibilidad de la lesión. Durante la cirugía, el flujo cerebral sanguíneo se monitoriza con el sistema de láser Doppler Periflux 5000 (Perimed AB, Sweeden) situando la sonda doppler (modelo 411, Perimed AB, Sweeden) en la superficie del hueso parietal cerca de la cresta sagital, bajo el músculo temporal (la zona irrigada por la ACM). Figura 11. Esquema de la tMCAO Una vez que la ACM está ocluida, hecho que se determina por la reducción de la señal del doppler, los animales se trasladan rápidamente desde el puesto de cirugía hasta el aparato de resonancia magnética (RM), con el objetivo de determinar la lesión isquémica basal por los mapas del coeficiente de difusión. También se realiza una imagen de angiografía para confirmar que la ACM sigue ocluida mientras se lleva a cabo el estudio de RM y descartar malformaciones en los vasos. Tras el análisis basal por RM, los animales vuelven al puesto de Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina Figura 16. Medición del volumen de lesión en las imágenes de resonancia magnética. En las imágenes de RM se obtienen 14 cortes de 1 mm de grosor, por lo que la suma del área de estos 14 cortes nos aporta el resultado de volumen. Se mide el volumen total, el del hemisferio ipsilateral y el de la lesión para poder calcular el edema y el % de lesión respecto al hemisferio ipsilateral. 5.3. Evaluación funcional y del déficit motor y sensorial Para la evaluación de la recuperación funcional se realizó el test funcional del Cilindro [353] y la evaluación del déficit motor y sensorial mediante la escala de Bederson antes de la tMCAO (basal), a las 24 y 72 horas y a los 7, 14 y 28 días. La examinación funcional y del déficit motor y sensorial se realiza siempre en el período de actividad de los animales (las primeras 6h del ciclo de oscuridad). El test del Cilindro está diseñado para evaluar la asimetría locomotora en modelos de roedores con trastornos del SNC. En esta prueba, mientras el animal se mueve dentro de un cilindro de plástico transparente de 20 x 30 cm, se registra la actividad de sus extremidades anteriores durante 10 minutos con una cámara de video de infrarrojos (Sony, Japón). El uso de las extremidades anteriores se define por la colocación de toda la palma en la pared del cilindro, lo que indica su uso para el soporte del cuerpo. Se apuntan 10 contactos de las extremidades anteriores para cada animal registrados durante la grabación, anotando cuántos de ellos son con la derecha o con la izquierda (Figura 17). Con esto se observa la lateralidad de los animales, es decir cuánto más usan una extremidad que otra. Tras el modelo de tMCAO hay una hemiparesia izquierda causada por la lesión isquémica en el hemisferio derecho, por lo que se usa más la extremidad derecha. El índice de lateralidad se calcula como el número de contactos con la extremidad izquierda respecto al total de contactos (está cerca de 0,5 en animales sanos y tiende a 0 en animales isquémicos ya que tienen una preferencia de uso de la extremidad derecha). Materiales y métodos Tania López González Página 115 Figura 17. Imagen representativa de la exploración de una rata en el test del cilindro. La escala de Bederson se utiliza para ver la recuperación del déficit motor y sensorial, evaluando diferentes ítems (Tabla 3) que reflejan el déficit motor y sensorial causado por la lesión isquémica en uno de los hemisferios cerebrales. Tras la realización de los diferentes ítems por parte de los animales, se obtiene una puntuación final de la escala en base a las puntuaciones de los mismos. La escala de Bederson [353] va desde 0 (asintomático) hasta 8 (déficit grave). Puntuación normal Déficit Nivel de actividad 0 muy alto; 1 alto 2 bajo; 3 muy bajo Movimiento circular espontáneo 0 1 Flexión espontánea de la extremidad parética 0 1 Giro al levantar el animal por la cola 0 1 Incapacidad de extensión de la extremidade parética al suspender el animal por la cola 0 1 Detección de bordes con la extremidad parética 0 1 TOTAL 0 8 Tabla 2. Evaluación del déficit motor y sensorial mediante la escala de Bederson. En cada ítem estudiado se otorga un punto ante la incapacidad de realizar la tarea, salvo el nivel de actividad que se puntúa como: 0; muy alto, 1; alto, 2; bajo y 3; muy bajo. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 5.4. Sacrificio, disección y extracción de tejidos Al término de cada procedimiento experimental se sacrificaron los animales por luxación cervical y decapitación posterior según las normas y leyes de experimentación animal. Se extrajeron los tejidos (cerebro, grasa blanca subcutánea y epididimal, grasa parda, hígado y músculo) y se conservaron a -80ºC hasta su procesamiento y análisis. La grasa blanca subcutánea y epididimal, así como la grasa parda, se pesan antes de su congelado. 6. Análisis molecular de proteínas en el hemisferio ipsilateral 6.1. Extracción de proteína En primer lugar se separó la porción del cerebro de interés para el estudio, y el resto de la muestra se volvió a congelar a -80ºC. Concretamente, empleando una matriz se extrajo un corte axial de 2 mm de grosor del hemisferio ipsilateral correspondiente a la zona media de la lesión isquémica (Figura 18). Figura 18. Extracción de un corte axial de la zona isquémica en el hemisferio ipsilateral para la extracción de proteína. Materiales y métodos Tania López González Página 117 Luego, durante todo el proceso de extracción, las muestras estuvieron refrigeradas a 0ºC para evitar la degradación de las proteínas. En un tubo eppendorf de 2 ml con cierre de seguridad (Safe-Lock Tubes 2.0 ml, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) se le añadió un volumen de 1 ml de tampón de lisis (Composisición del tampón de lisis: 2,5 ml Tris-HCl pH 7,5; 2,5 ml EGTA 0,2 M pH8; 2,5 ml EDTA 0,2 M pH8; 5ml Triton X-100; 5 ml Ortavanadato Sódico 0,1 M, 1 g Fluoruro Sódico; 1,1 g Pirofosfato Sódico; 46 g Sacarosa; H2O hasta 500 ml y ajustar pH a 7,5) con inhibidor de proteasas (Complete TM, Roche, Mannhein, Alemania). Las muestras se homogeneizaron por un proceso de disgregación y rotura celular mecánica mediante un homogeneizador (TissueLyser II, Qiagen, Germantown, MD, USA) durante 2-3 min con una frecuencia de unos 30 Hz. Posteriormente, se centrifugaron durante 30 minutos a 13.200 rpm y a 4ºC. Se retiró el sobrenadante en otra alícuota y se congeló a -80ºC, hasta el momento de su análisis. 6.2. Cuantificación de proteína Para determinar la concentración de proteína en las alícuotas obtenidas en la extracción, mantenidas a 4ºC en hielo, se utilizó el método colorimétrico de Bradford, utilizando el kit BioRad Protein Assay (Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Para ello, se procedió a diluir cada muestra por un factor de 1:26 en H2O destilada dentro de tubos eppendorfs. En una placa de 96 pocillos, se cargaron por duplicado 10 μl de cada muestra, y posteriormente se añadieron 250 μl de reactivo de Bradford diluido en proporción 1:4 en H2O destilada y a una temperatura de 37ºC. Además, en cada placa se realizó una recta de calibrado, mediante una dilución seriada de BSA (Albumin bovine fraction V powder, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) con 7 puntos duplicados, (0,03125; 0,0625; 0,125; 0,125; 0,25; 0,5; 0,7 y 1 mg/ml). Luego en un lector de placas (Multiskan Go Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) se incubó la placa durante 5 min a 37º y se midió la colorimetría en OD (optical density) en cada pocillo a una longitud de onda de λ=595nm. A través de la extrapolación de los valores de la recta de calibrado se determinó la concentración de proteína de cada muestra. Una vez determinada la cantidad de proteína de cada muestra se prepararon alícuotas a la concentración necesaria para cada análisis (20 μg/14 μl en cada pocillo para un gel). 6.3. Western blot 6.3.1. Preparación de las muestras Las proteínas son separadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Al Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina tratarse de una técnica que se basa en la separación de proteínas por su masa molecular, en base a su migración en un campo eléctrico, es necesario neutralizar una serie de características de las proteínas que darían lugar a patrones de migración erróneos e identificaciones incorrectas. Por un lado, es necesario eliminar la estructura cuaternaria de la proteína para poder reproducir una migración en el gel lo más proporcional posible a su tamaño. Y por otro lado, dado que las proteínas van a estar sometidas a un campo eléctrico, es necesario eliminar la carga intrínseca de los polipéptidos, (desnaturalizarlos) y otorgarles el mismo signo de carga. Para ello, se preparó una alícuota de cada muestra, con la misma concentración de proteína total (20 μg/14 μl en cada pocillo para un gel) en tampón de lisis con inhibidor de proteasas. A cada muestra además se le añadió la misma proporción de solución de carga 5x. Este tampón de carga proporciona a la alícuota la eliminación de la estructura cuaternaria de la proteína (β-mercaptoetanol, SigmaAldrich, St. Louis, USA), uniformiza su carga eléctrica de forma proporcional a su longitud (SDS, Sodium DodecylSulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) y le da una densidad mayor (Glicerol, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Todo esto facilita su carga en el gel y además tiene un colorante para identificar el frente de migración (azul de bromofenol, MERK, Darmstadt, Alemania). 6.3.2. Electroforesis La electroforesis se realizó en un gel que tiene una estructura tridimensional, en forma de red, formada por la polimerización de acrilamida y bis-acrilamida (N,N-metilenobisacrilamida). El proceso de polimerización se cataliza por amonio persulfato (APS) (Ammonium persulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) y TEMED (N,N,N,N-tetramethyletilenediamina, SigmaAldrich, St. Louis, USA). La concentración de acrilamida y bis-acrilamida (30% Acrylamide/Bis Solution 29:1, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en el gel determina el tamaño de los poros de la red tridimensional y el grado de migración de las proteínas según su tamaño. El gel consiste de dos fracciones, una fracción concentradora con 4% de acrilamida/bis-acrilamida, en la que la que se agrupan las muestras a cargar, de manera que la separación de las proteínas de las diferentes muestras ocurra de forma simultánea, y una fracción separadora con 6%, 8% y 10% en función del tamaño de la proteína de interés (Compossición gel concentrador 4%: H2O destilada 3,4 ml; Acrilamida/bisacrilamida (30%) 0,83 ml; 1,5M Tris (pH 8,8) 0,63 ml; SDS 10% 50 μl; APS 10 % 50 μl; TEMED 5 μl). También se emplearon geles SDS-PAGE comerciales con la fracción separadora del 7,5 o 10% (Criterion™ TGX™ Precast Midi Protein Gel, BioRad, USA) con 24 pocillos, para poder cargar un mayor número de grupos. Los geles se montaron en un kit de electroforesis (Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad, Hercules, CA, Materiales y métodos Tania López González Página 119 USA) y se sumergieron en tampón running 1x (Composición del tampón de running 5X: 72 g de Glicina, 15 g de Trizma base, 5 g de SDS, H2O destilada hasta 1L). Previamente a la carga de las muestras en el gel se agitaron y se calentaron a 95º C durante 10 minutos para la desnaturalización de las proteínas y se volvieron a agitar. En cada pocillo del gel se cargaron 14 μl de muestra. En uno de los carriles se cargaron 5 μl de un marcador de pesos moleculares (Precision Plus Protein Standars-Dual Color, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En cada gel se cargaron siempre muestras de todos los grupos experimentales. Una vez esto, se sometieron las muestras a un campo eléctrico (voltaje constante de 140 V120 V y amperaje de 180 mA durante 1 h en los geles sintetizados, y voltaje constante de 200 V durante 40 min en los geles comerciales), conectando el kit de electroforesis a una fuente de energía (PowerPac HC High Current Power Suppy, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), en el que se indujo la migración de las proteínas hacia el cátodo. Se detuvo la electroforesis cuando el frente de migración llegó a una distancia aproximada de unos 0,5 cm del final del gel. 6.3.3. Transferencia Una vez finalizada la electroforesis las proteínas deben ser transferidas a una membrana para poder realizar el análisis de expresión de cada proteína; para ellos son sometidas a un campo eléctrico capaz de movilizar las proteínas hasta la membrana donde quedarán adsorbidas y donde se realizarán las incubaciones con los diferentes anticuerpos. Se realizó una transferencia de tipo semi-seca, donde la membrana y el gel se situan uno debajo del otro separados por papeles absorbentes de las placas que crean el voltaje (Trans-Blot Semy-Dry Transfer Cell, Bio-Rad). Se utilizaron membranas de PVDF (Polivinylidene Fluoride Immobilion-P membrane, Millipore), cortadas con unas dimensiones de 8,5 x 6,5 cm en los geles sintetizados y 14 x 7 cm en los geles comerciales, activadas previamente durante 5 min en metanol, 5 min en H2O destilada y 5 min en tampón de transferencia. Composición del tampón de transferencia 25X: 36,5 g de Glicina, 72,5 g de Trizma base, 4,5 g de SDS, H2O destilada hasta 500 ml. Composición del tampón de transferencia 1X: 40 ml de tampón de transferencia 25X, 200 ml de Metanol, H2O destilada hasta 1L. El papel de transferencia (Extra Thick Blot Paper, Bio-Rad) se empapó en tampón de transferencia para que a través de él pudiera crearse el campo eléctrico necesario para la transferencia; el gel y la membrana se colocaron entre dos piezas de papel de transferencia de manera que así se creó un campo eléctrico necesario para la correcta transferencia; se eliminaron las posibles burbujas que podían quedar entre esta, el papel y el gel con un rodillo. Se realizó la transferencia durante 1 h y 40 min a un voltaje constante de 250 V conectando el kit de electroforesis a una fuente de energía (PowerPac HC High Current Power Suppy, BioRad, Hercules, CA, USA). Para comprobar la correcta transferencia se tiñeron las membranas Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina con colorante Rojo de Ponceau (Ponceau S Red, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Para eliminar la tinción fue suficiente con hacer un par de lavados con tampón de lavado. Componentes tampón de lavado 10X: 24,2 g de Trizma base, 80 g DE NaCl, H2O destilada hasta 1 L; ajustar pH a 7,6. Componentes tampón de lavado 1X: 100 ml de tampón de lavado 10X, 1 ml de Tween 20, H2O destilada hasta 1 L. 6.3.4. Inmunodetección de proteínas Tras la transferencia, la membrana se incubo a temperatura ambiente durante 1 h con tampón de bloqueo (Componentes del tampón de bloqueo: 3 g BSA en 100 ml de tampón de lavado). De esta manera se eliminaron las uniones inespecíficas ofrecidas por la membrana en todas aquellas áreas donde no existía proteína transferida. Posteriormente, se cortó la membrana tomando como referencia el marcador de pesos moleculares, de manera que, pudiéramos detectar en una misma membrana proteínas diferentes, de esta forma se pudieron detectar diferentes proteínas simultáneamente. Cada fragmento de membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4ºC con el anticuerpo primario diluido previamente en el tampón de bloqueo (las condiciones específicas de los diferentes anticuerpos empleados están en la Tabla 4). Transcurrido el tiempo de incubación con el anticuerpo primario, se retiró y se hicieron 3 lavados de 5 min con tampón de lavado a temperatura ambiente. Seguidamente se incubaron las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario (anti-mouse o anti-rabbit dependiendo del anticuerpo primario, para que pueda reconocer y unirse específicamente al mismo) conjugado con la Horseradish Peroxidase (Dako, Produktionsvej 42, Dinamarca), una enzima que reacciona ante el luminol (o sus derivados) emitiendo luz. Materiales y métodos Tania López González Página 121 Anticuerpo Primario Casa comercial Dilución ACCα Millipore; Billerica, MA, USA 1:1000 pACC CellSignaling; Danvers,MA,USA 1:1000 AMPKα1 Millipore; Billerica, MA, USA 1:1000 AMPKα2 Upstate; Temecula, CA, USA 1:1000 pAMPK Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:2000 FAS BD, Franklin Lakes, NJ, USA 1:1000 pmTOR Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pS6K Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pRAPTOR Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pTSC2 Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pUlk1 (Ser 555) Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 GRP78 (BiP) Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 ATF6α SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 pPERK SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 peIF2α SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 CHOP SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 pIRE1α Abcam; Cambridge, UK 1:1000 p-SAPK/JNK Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:2000 Caspasa 3 Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 Cleaved Caspasa 3 Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 β-actina SIGMA; St. Louis, MO, USA 1:5000 Tabla 4.Anticuerpos empleados en el estudio por western blot. Se representa la casa comercial a la que pertenece y la dilución realizada con el tampón de dilución. 6.3.5. Revelado y fijación de la señal Se retira el anticuerpo secundario y se vuelven a hacer tres lavados; para proceder al revelado de la membrana se utilizó 1 ml de un sustrato de revelado que detecta el Horseradish Peroxidase en proporción 1:1 (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Cultek). Se incuban las membranas durante 2 min en oscuridad con este sustrato. Una vez pasado el tiempo de incubación se colocaron las membranas en una casete de revelado (Hypercassette, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) y se impermeabilizaron con la ayuda de papel transparente. Se procedió a su revelado en una sala oscura destinada a tal fin. Se introdujo una hoja de revelado (FujiMedical X-Ray Film Super RX, Fujifilm Corporation, Tokio, Japón) sobre las Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina membranas y se cerró el casete; se dejó exponer la señal quimioluminiscentre durante unos segundos o minutos en función de la proteína. Luego se retiro la película y se sumergió en una solución reveladora (dilución 1:10) (G150, Developer/Replenisher, Agfa-Gevaert Group, Dubendorf, Suiza) hasta que se visualiza la señal buscada y en ese momento se sumerge la película en líquido fijador (dilución 1:5) (G354, Manual Fixing Bath, Agfa-Gevaert Group, Dubendorf, Suiza) durante un par de minutos con el fin de fijar la señal. Por último se lava la película con agua correinte y se deja secar. 6.3.6. Cuantificación La cuantificación de la señal se realizó mediante la medición de la densidad óptica de la señal de cada muestra, a partir de las imágenes escaneadas en resolución 400 ppp (CanonScan 9900F, Canon, Tokio, Japón) de las películas autorradiografiadas, con el software informático ImageJ (ImageJ 1.40g, Wayne Rasband, NIH, USA). Cada medición de densidad óptica se corrigió por la medición de la densidad óptica de una región adyacente a la señal de las muestras. 7. Análisis estadístico Los datos obtenidos en todos los experimentos se analizaron mediante los softwares estadísticos IBM SPSS Statistics for Windows version 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) y GraphPad Instad (GraphPad Instad Software, v5, La Jolla, CA, USA). Se ha comprobado la distribución de los datos mediante el test estadístico Kolmogorov Smirnov. Ante una distribución norma de los datos, el grado de significación estadística se determinó por el test estadístico t-Student para la comparación entre 2 grupos y el análisis estadístico ANOVA seguido del test estadístico post-hoc Bonferroni para la comparación entre más de 2 grupos. Los resultados se representaron como la media y la desviación estándar de la media (SEM) (media±SEM). Se consideraron significativos todos los resultados con una p<0,05; muy significativos con una p<0,01 y extremadamente significativos con p<0,001. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina Figura 21. Evaluación del modelo de obesidad inducida por dieta. A - Incremento del peso corporal en los grupos HFD o STD a lo largo de las 12 semanas, expresado como los gramos incrementados respecto al peso basal. B – Peso corporal en el momento de la tMCAO en ambos grupos de dieta, expresado en gramos. C – Ingesta de la dieta HFD o STD a lo largo de 12 semanas, en gramos de comida consumida. D – Kcal consumidas por semana en ambos grupos de dieta. E – Peso de la grasa blanca subcutánea en ambos grupos de dieta, expresado como % de gramos de grasa respecto a los gramos de peso corporal. F - Peso de la grasa blanca epididimal en ambos grupos de dieta, expresado como % de gramos de grasa respecto a los gramos de peso corporal. Los datos se muestran como la media ± SEM. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 respecto al grupo STD; empleando el test estadístico t-Student (N=20 para el grupo STD y N=16 para el grupo HFD en el incremento de peso, peso en la tMCAO, ingesta y Kcal/semana, N=10 y N=8, respectivamente, para las grasas blancas) Resultados Tania López González Página 131 Se ha pesado la grasa blanca (subcutánea y epididimal) y la grasa parda, una vez sacrificados los animales. De acuerdo con el mayor incremento de peso corporal en el grupo HFD, se ha visto que, tanto la grasa blanca subcutánea como la epididimal, tienen un peso significativamente mayor en el grupo HFD respecto al STD (Figura 21E, 21F); 1,96±0,151% frente a 1,487 ± 0,089% de grasa respecto el peso corporal y 0,962±0,08% frente a 0,682±0,043% de grasa respecto el peso corporal, respectivamente, mientras que no se observan diferencias estadísticamente significativas para la grasa parda. En este caso no se tienen en cuenta los animales de cada grupo que tras la tMCAO han sido tratados, ya que dicho tratamiento puede tener un efecto sobre el peso de las grasas. 9.2. Influencia de la obesidad en el volumen de la lesión isquémica El seguimiento mediante imágenes de resonancia magnética para la evaluación de los volúmenes de lesión se ha realizado de forma basal, a las 24 y 72 horas, y a los 7,14 y 28 días tras la isquemia, tanto en el grupo STD como HFD. En este caso, para comparar los resultados entre el modelo de obesidad inducida por dieta y el grupo con dieta estándar, se emplean los grupos de ambas dietas tratados con vehículo (salino). De acuerdo con nuestros criterios de inclusión, el volumen de lesión basal de cada animal, determinado mediante mapas ADC, está entre el 30-45% del hemisferio ipsilateral: 38,07±1,20% en el grupo STD vehículo y 37,33±1,20% en el grupo HFD vehículo (Figura 22). Partiendo de estos volúmenes basales homogéneos, el modelo de obesidad inducida por dieta (grupo HFD vehículo) tiene menores volúmenes de lesión tras la isquemia cerebral respecto el grupo STD vehículo, como se puede comprobar observando los valores de lesión, tanto en mm3 en la Tabla 5 como en % de lesión respecto al hemisferio ipsilateral en la Tabla 5 y Figura 22, a lo largo de los diferentes puntos de seguimiento durante 28 días. Mientras que, a corto plazo, a las 24 y 72 horas, sólo se observa una tendencia a menores volúmenes de infarto en el grupo HFD respecto al STD que se va acentuando a los 7 días tras la isquemia, es a largo plazo, a los 14 días, cuando se observa una diferencia muy próxima a la significancia estadística (p=0,068); un volumen de infarto de 22,36±1,96% del hemisferio ipsilateral en el grupo HFD frente al 27,48±1,6% del grupo STD. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina Figura 22. Evolución de la lesión isquémica mediante el seguimiento por resonancia magnética. Los mapas ADC (DWI o difusión) se adquieren antes del tratamiento para asegurar que todos los animales incluidos en el estudio tengan daños isquémicos basales homogéneos. La evaluación de la lesión isquémica se lleva a cabo mediante una secuencia de peso T2 registrada a las 24 y 72 horas, y 7, 14 y 28 días tras la isquemia. A – Imágenes por resonancia magnética de la evolución de la lesión durante 28 días en los animales STD y HFD vehículo. B – Análisis cuantitativo de los volúmenes de lesión a partir de las imágenes por RM en % del hemisferio ipsilateral. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD; empleando el test estadístico t-Student (N=18 para el grupo STD y N=17 para el grupo HFD en los seguimientos a 24 horas, 72 horas y 7 días, N=10 y N=8, respectivamente, en los seguimientos a 14 y 28 días). Resultados Tania López González Página 133 Volumen de infarto (mm3) STD HFD Basal 272,75±11,65 272,60±10,88 24 horas 370,61±26,54 351,44±26,09 72 horas 408,76±21,87 373,62±20,35 7 dias 268,05±17,93 244,64±19,74 14 dias 178,86±9,81 152,74±12,37 28 dias 164,78±9,22 144,94±12,42 Volumen de infarto (%Hemisferio ipsilateral) Basal 38,07±1,20 37,33±1,2 24 horas 39,78±1,89 37,47±2,09 72 horas 43,06±1,42 39,99±1,81 7 dias 34,59±1,98 30,68±2,11 14 dias 27,48±1,6 22,34±1,96 28 dias 26,34±1,55 22,37±1,97 Tabla 5. Volúmenes de lesión a lo largo de 28 dias tras la isquemia cerebral. Los datos se muestran como la media±SEM (N=18 para el grupo STD y N=17 para el grupo HFD en los seguimientos a 24 horas, 72 horas y 7 días, y N=10 y N=9, respectivamente, en los seguimientos a 14 y 28 días). 9.3. Influencia en la formación del edema cerebral Se evaluó la formación de edema isquémico midiendo la desviación de la línea media del cerebro, la cual se calcula como el volumen del hemisferio ipsilateral entre el volumen del hemisferio contralateral. En un cerebro sano, sin presencia de edema, la igualdad entre ambos hemisferios hace que la desviación de la línea media sea 1. Sin embargo, tras un daño isquémico, la consecuente formación de edema isquémico lleva a que la desviación de la línea media sea superior a 1, puesto que el hemisferio ipsilateral se ve incrementado respecto al contralateral. En este caso, no se han observado diferencias estadísticamente significativas en los valores de edema isquémico entre el grupo HFD vehículo y el grupo STD vehículo (Figura 23); 1,14±0,012 en el grupo STD vehículo frente al 1,13±0,014 en el grupo HFD vehículo a las 24 horas, 1,17±0,013 en el grupo STD vehículo frente al 1,17±0,011 en el grupo HFD vehículo a las 72 horas y 1,05±0,013 en el grupo STD vehículo frente al 1,03±0,015 en el grupo HFD vehículo a las 7 dias tras la isquemia. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 24 HORAS 72 HORAS 7 DÍAS 1.1 1.2 1.3 STD HFD Seguimiento Edema (Vol Hemisferio ipsilateral/Vol Hemisferio contralateral) Figura 23. Análisis cuantitativo del edema isquémico en base a los datos de imagen por resonancia magnética. El edema se mide por la desviación de la línea media del cerebro calculada como el volumen del hemisferio ipsilateral entre el volumen del hemisferio contralateral. Los datos se muestran como la media±SEM (N=18 para el grupo STD y N=17 para el grupo HFD). 9.4. Análisis funcional y del déficit motor y sensorial En la comparación entre el modelo de obesidad inducida por dieta (grupo HFD vehículo) y los animales con dieta estándar (grupo STD vehículo), también se han estudiado las diferencias en la función sensoriomotora y en el déficit motor y sensorial. La evaluación funcional mediante el test del Cilindro analiza la lateralidad de los animales, la cual, por la hemiparesia izquierda causada por la tMCA, tiende a 0 en animales isquémicos (mientas en un animal sano es aproximadamente de 0,5). Por otro lado, la escala de Bederson estudia diferentes ítems de déficit motor y sensorial, también característico tras la tMCAO, y da una puntuación que va desde 0; asintomático, hasta 8; déficit grave. No se han observado diferencias estadísticamente significativas entre el grupo HFD y STD para la recuperación funcional a lo largo de 28 días tras la isquemia cerebral (Figura 24A). En el caso del déficit motor y sensorial, a los 7 días tras la isquemia cerebral, se ha visto que el grupo HFD tiene una puntuación significativamente más baja (menor déficit motor y sensorial) en la escala de Bederson respecto al grupo STD (Figura 24B), un dato que concuerda con los menores valores de lesión isquémica de este grupo a partir de los 7 días. Resultados Tania López González Página 135 Figura 24. Evaluación de la función sensoriomotora y del déficit motor y sensorial mediante el test del Cilindro y la escala de Bederson respectivamente. El análisis funcional y del déficit motor y sensorial se realiza antes del daño isquémico (basal), a las 72 horas, y a los 7, 14 y 28 días tras la isquemia. A – Índice de lateralidad en los grupos STD y HFD (vehículos) para evaluar la función sensoriomotora, calculado como; el número de contactos con la extremidad izquierda/ número total de contactos. B – Puntuación en la escala de déficit motor y sensorial de Bederson en los grupos STD y HFD (vehículos), que va desde 0; asintomático, hasta 8; déficit grave. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD; empleando el test estadístico tStudent (N=18 para el grupo STD y N=17 para el grupo HFD en la evaluación basal y a los 7 días, N=8 y N=9, respectivamente, en la evaluación a las 72 horas, N=10 y N=8, respectivamente, en la evaluación a 14 y 28 días). Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 9.5. Influencia de la obesidad en las rutas moleculares implicadas en la homeostasis energética 9.5.1. La ruta de la AMPK Teniendo en cuenta los múltiples estudios que observan un incremento de la ruta de la AMPK tras la isquemia cerebral relacionándola con la mala prognosis en dicha enfermedad [264-266, 270-272, 275], así como algunos estudios que relacionan la inhibición de esta ruta molecular en el ámbito de la obesidad debido al exceso energético [252, 253], se ha realizado un estudio cualitativo, mediante western blot, de las diferentes proteínas que engloban la ruta de la AMPK, a los 28 días tras la isquemia cerebral y en ambos grupos de dieta. Aunque se podría esperar un descenso de la ruta de AMPK en el modelo de obesidad inducida por dieta debido al exceso energético [252, 253], no se ha visto diferencias estadísticamente significativas para los niveles de pAMPK (activa) entre los grupos STD vehículo y HFD vehículo (Figura 25). Además, se observa un incremento estadísticamente significativo en la cantidad de AMPKα2 en el grupo HFD respecto al STD. Contradictoriamente, los niveles de pACC (dowstream de pAMPK) están disminuidos de forma estadísticamente significativa en el grupo HFD frente al STD. Figura 25. La ruta de AMPK en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel derecho) e imágenes autorradiográficas representativas (panel izquierdo) de la ruta de AMPK en los grupo STD vehículo y HFD vehículo (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo STD vehículo, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD vehículo; empleando el test estadístico t-Student (N=6 para cada grupo). Resultados Tania López González Página 137 9.5.2. La ruta de mTOR y de la autofagia Se ha descrito que la pAMPK activa la autofagia, tanto de forma directa fosforilando a la kinasa iniciadora de autofagia, Ulk1, como a través de la inhibición de la ruta de mTOR, inhibidora de la autofagia [300]. Por eso, se ha estudiado cualitativamente los niveles de las proteínas que engloban a la ruta de mTOR (incluyendo pTSC2 y pRAPTOR con las fosforilaciones sobre las que actúa la AMPK y que, consecuentemente, inhiben la ruta de mTOR) [302, 303] y de Ulk1 fosforilado en la Ser 555 (fosforilación sobre la que actúa la AMPK). El estudio, de nuevo, se realiza a los 28 días tras la isquemia cerebral y en ambos grupos de dieta. Se observa que existe una tendencia al incremento de pmTOR en el modelo de obesidad inducida por dieta (grupo HFD vehículo) frente al grupo STD vehículo (Figura 26), un hecho que concuerda con el descenso muy próximo a la significancia estadística de pUlk1 en el grupo HFD respecto al STD, intuyendo una posible reducción de la autofagia en este grupo. Sin embargo, no se observan diferencias para la proteína dowstream de pmTOR (pS6K) y las proteínas que bajo la fosforilación de pAMPK inhiben dicha ruta (pTSC2 y pRAPTOR), contradictoriamente al incremento de mTOR, tienen también una tendencia al incremento en el grupo HFD respecto al STD (que si coincide con la tendencia al incremento de pAMPK). Figura 26. La ruta de mTOR y la autofagia en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel derecho) e imágenes autorradiográficas representativas (panel izquierdo) de la ruta de mTOR y de pUlk1 (Ser 555) en los grupos STD vehículo y HFD vehículo (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo STD vehículo, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD vehículo; empleando el test estadístico tStudent (N=6 para cada grupo). Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 9.5.3. El ER stress Los estudios que demuestran la importancia del estrés del retículo endoplasmático (ER stress) en la patología de la isquemia cerebral [305, 307], nos han llevado al estudio cualitativos de la cantidad de proteínas que forman parte del llamado ER stress, a los 28 días tras la isquemia cerebral y en ambos grupos de dieta. No se han observado diferencias estadísticamente significativas en la mayor parte de los componentes del ER stress, aunque se observa una leve tendencia al incremento de los mismos en el grupo HFD vehículo respecto al grupo STD vehículo (Figura 27), un hecho que concuerda con el incremento de ER stress en la obesidad descrito en la bibliografía [306]. Sin embargo, contradictoriamente, los niveles de peIF2α (dowstream de pPERK) aparecen con una reducción estadísticamente significativa en el grupo HFD frente al STD. No hay diferencias entre estos grupos para CHOP, la principal proteína que relaciona el ER stress con la apoptosis. Figura 27. La ruta de ER stress en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel dereho) e imágenes autorradiográficas representativas (panel izquierdo) de la ruta de ER stress en los grupos STD vehículo y HFD vehículo (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo STD vehículo, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD vehículo; empleando el test estadístico t-Student (N=6 para cada grupo). 9.5.4. La apoptosis Queriendo profundizar más en el estudio de la influencia de la obesidad inducida por dieta en la apoptosis, proceso clave en la prognosis tras una isquemia cerebral [43, 45-50] e inducido por la ruta de AMPK [289-296] e ER stress [305-307], se han estudiado los niveles de uno de Resultados Tania López González Página 139 los efectores finales de dicho proceso, la caspasa 3 (completa y cleaved, que está en estado activo), a los 28 días y en ambos grupos de dieta. Se ha observado una disminución estadísticamente significativa de los niveles de la caspasa 3 cleaved (activa) en el modelo de obesidad inducida por dieta (HFD vehículo) frente al grupo STD vehículo (Figura 28), mientras que no hay diferencias entre estos grupos para la caspasa 3. La disminución de la forma activa de la caspasa 3 es un hecho que concuerda con la tendencia a mejores resultados del grupo HFD en los volúmenes de lesión y déficit motor y sensorial. Figura 28. La Caspasa 3 en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteína (panel derecho) e imágenes autorradiográficas representativas (panel izquierdoo) de la Caspasa 3 en los grupos STD vehículo y HFD vehículo (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo STD vehículo, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD vehículo; empleando el test estadístico t-Student (N=6 para cada grupo). 10. Efecto neuroprotector de la nicotina en el modelo animal de isquemia cerebral 10.1. Disminución del peso corporal, ingesta y peso de la grasa Tras la isquemia cerebral generada mediante el modelo de tMCAO, los animales tienden a disminuir su ingesta con una consecuente pérdida de peso. En los animales tratados durante 28 días, tanto en el grupo de dieta STD como HFD, se observa que el tratamiento con nicotina tiene un claro efecto reductor de la ingesta, peso corporal y peso de las grasas blancas, en concordancia a lo descrito anteriormente por el grupo [320]. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina 10.4. Mejora funcional y del déficit motor y sensorial El estudio del efecto terapéutico del tratamiento con nicotina tras la isquemia cerebral, en ambos grupos de dieta, se completa con la evaluación de la función sensoriomotora y en el déficit motor y sensorial. El estudio funcional mediante el test del Cilindro analiza la lateralidad de los animales, la cual, por la hemiparesia izquierda causada por la tMCA, tiende a 0 en animales isquémicos (mientas en un animal sano es aproximadamente de 0,5). Por otro lado, la escala de Bederson estudia diferentes ítems de déficit motor y sensorial, también característico tras la tMCAO, y da una puntuación que va desde 0; asintomático, hasta 8; déficit grave. Paralelamente a los resultados obtenidos para el volumen de lesión y formación de edema isquémico, se ha observado que los grupos tratados con nicotina tienden, de forma general, a una mejoría funcional y del déficit motor y sensorial frente a los grupos vehículo (Figura 32A, 32B). Esta tendencia no llega a ser estadísticamente significativa en el test del Cilindro, pero en la escala de Bederson se observa que ya a las 72 horas el grupo HFD nicotina muestra mejores resultados, con una reducción estadísticamente significativa de la puntuación de déficit motor y sensorial respecto al grupo HFD vehículo (Figura 32D) y también al STD vehículo (P<0,05), en concordancia a los resultados para los volúmenes de lesión. A los 7 días, el grupo STD vehículo presenta un incremento estadísticamente significativo del déficit motor y sensorial frente a los otros 3 grupos de estudio (Figura 32C respecto STD nicotina, y P<0,05 respecto HFD vehículo y HFD nicotina). El déficit motor y sensorial a los 14 días sigue tendiendo a ser mejor para los grupos nicotina frente a sus respectivos vehículo, pero sólo el grupo STD nicotina tiene una disminución estadísticamente significativa frente al STD vehículo (Figura 32C). Resultados Tania López González Página 147 Figura 32. Evaluación de la función sensoriomotora y del déficit motor y sensorial bajo el tratamiento con nicotina mediante el test del Cilindro y la escala de Bederson, respectivamente. El índice de lateralidad se calcula como; el número de contactos con la extremidad izquierda/ número total de contactos. La puntuación en la escala de déficit motor y sensorial de Bederson va desde 0; asintomático, hasta 8; déficit grave. El análisis funcional y del déficit motor y sensorial se realiza antes del daño isquémico (basal), a las 72 horas, y a los 7, 14 y 28 días tras la isquemia. A – Índice de lateralidad para en el grupo STD. B – Índice de lateralidad en el grupo HFD. C – Puntuación en la escala de déficit motor y sensorial de Bederson en el grupo STD. D – Puntuación en la escala de déficit motor y sensorial de Bederson en el grupo HFD. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo de la misma dieta; empleando el test estadístico t-Student (N=18 para el grupo STD vehículo, N=19 para el grupo STD nicotina, N=17 para los grupos HFD vehículo y HFD nicotina en la evaluación basal y a los 7 días, N=8, N=9 y N=9, respectivamente, en la evaluación a las 72 horas, N=10, N=10 y N=8, respectivamente, en la evaluación a 14 y 28 días). 10.5. Influencia de la nicotina en las rutas moleculares implicadas en el control de la homeostasis energética 10.5.1. Inhibición de la ruta de la AMPK Teniendo en cuenta los múltiples estudios que observan un incremento de la ruta de la AMPK tras la isquemia cerebral relacionándola con la mala prognosis en dicha enfermedad [264-266, 270-272, 275], así como otros estudios que relacionan la nicotina con la inhibición de esta ruta molecular en el ámbito de la obesidad [319, 320], se ha realizado un estudio Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina cualitativo, mediante western blot, de la cantidad de las diferentes proteínas que engloban la ruta de la AMPK, a los 28 días tras la isquemia cerebral y en ambos grupos de dieta. Tanto en el modelo de obesidad inducida por dieta HFD, como en el grupo STD, se ha visto la inhibición de la ruta de AMPK en los grupos tratados con nicotina frente a los grupos vehículo de la misma dieta. Como se puede ver en la Figura 33 los niveles de pAMPK (activa) y consecuentemente los de pACC (activa) están significativamente disminuidos en los grupos tratados con nicotina respecto a los grupos vehículo. Figura 33. Efecto de la nicotina sobre la ruta de AMPK en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel izquierdo) e imágenes autorradiográficas representativas (panel derecho) de la ruta de AMPK en los cuatro grupos; STD vehículo, STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo vehículo de su misma dieta, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 **p<0.01 y ***p<0.001 en comparación con el grupo vehículo de la misma dieta; empleando el test estadístico t-Student (N=7 para cada grupo). Además, en concordancia, los niveles de FAS están incrementados en estos grupos, siendo el incremento significativo únicamente en el grupo HFD. Por otro lado, parece que la expresión de la subunidad α2 de la AMPK y la expresión de ACC están incrementadas bajo la administración de nicotina en ambas dietas, hecho que podría deberse a una compensación molecular contra la gran inhibición del estado activo de la AMPK causada por la nicotina. Resultados Tania López González Página 149 10.5.2. Inhibición de la autofagia Se ha descrito que la pAMPK activa la autofagia, tanto de forma directa fosforilando a Ulk, una de las kinasas que activan este proceso, como a través de la inhibición de la ruta de mTOR, inhibidora de la autofagia [300]. Por eso, se ha estudiado cualitativamente la cantidad de las proteínas que engloban a la ruta de mTOR (incluyendo pTSC2 [303] y pRAPTOR [302] con las fosforilaciones sobre las que actúa la AMPK) y de Ulk foforilado en la Ser 555 por la AMPK. El estudio, de nuevo, se realiza a los 28 días tras la isquemia cerebral. Figura 34. Efecto de la nicotina sobre la ruta de mTOR y la autofagia en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel izquierdo) e imágenes autorradiográficas representativas (panel derecho) de la ruta de mTOR y de pUlk1 (Ser 555) en los cuatro grupos; STD vehículo, STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo vehículo de su misma dieta, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 **p<0.01 y ***p<0.001 en comparación con el grupo vehículo de la misma dieta; empleando el test estadístico t-Student (N=7 para cada grupo). En ambas dietas, los grupos tratados con nicotina, de acuerdo a los resultados vistos para la ruta de AMPK, presentan la ruta de mTOR incrementada, así como la presencia de pUlk1 (Ser 555) disminuida, suponiendo una disminución de la autofagia. Se puede ver en la Figura 34 que Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina los niveles de pTSC2 fosforilada por AMPK, que actúa inhibiendo la ruta de mTOR, están significativamente reducidos en los grupos tratados con nicotina frente a los grupos tratados con vehículo. Consecuentemente, en los grupos nitotina hay un incremento significativo de pmTOR y su efector dowstream pS6K (en el STD la diferencia para la pS6K es prácticamente significativa con una p=0,06). También es estadísticamente significativa la disminución de pUlk1 (Ser 555) en los grupos tratados con nicotina frente a sus respectivos grupos vehículo. 10.5.3. Inhibición del ER stress Ante los estudios que demuestran la importancia del estrés del retículo endoplasmático (ER stress) en la patología de la isquemia cerebral [305, 307], y el hecho de que la nicotina tenga efecto en este proceso molecular [320], ha llevado al estudio cualitativos de la cantidad de proteínas que forman parte del llamado ER stress, a los 28 dias tras la isquemia cerebral. Se ha visto que los grupos tratados con nicotina; presentan una disminución de la mayor parte de las proteínas que engloban al ER stress (Figura 35). En la dieta STD, el grupo tratado con nicotina presenta una disminución estadísticamente significativa de los niveles de BiP, pIRE1α, ATF6α y peIF2α respecto al grupo vehículo, mientras que, sorprendentemente, los niveles de pPERK están incluso incrementados. En el caso del modelo de obesidad inducida por dieta HFD, en el grupo nicotina se observa una reducción estadísticamente significativa de pIRE1α, peIF2α y pPERK respecto al grupo vehículo, mientras que BiP tiene un incremento significativo (hecho que se podría explicar por la compensación) y en ATF6α no hay diferencias estadísticamente significativas. En el último efector del ER stress, que abre las puertas a la apoptosis, CHOP, no parece haber diferencias estadísticamente significativas entre los grupos nicotina y vehículo. Sin embargo, en pJNK, activado por el ER stress y activador de la apoptosis, si se observa una tendencia clara a su disminución bajo el tratamiento con nicotina, siendo esta diferencia estadísticamente significativa en la dieta HFD. Resultados Tania López González Página 151 Figura 35. Efecto de la nicotina sobre la ruta de ER stress en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel izquierdo) e imágenes autorradiográficas representativas (panel derecho) de la ruta de ER stress en los cuatro grupos; STD vehículo, STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo vehículo de su misma dieta, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 **p<0.01 y ***p<0.001 en comparación con el grupo vehículo de la misma dieta; empleando el test estadístico t-Student (N=7 para cada grupo). 10.5.4. Inhibición de la apoptosis Queriendo profundizar más en el estudio de la influencia del tratamiento con nicotina en la apoptosis, proceso clave en la prognosis tras una isquemia cerebral [41, 45, 46, 50], se han estudiado los niveles de uno de los efectores finales de dicho proceso, la caspasa 3 (completa y cleaved, en estado activo), en los grupos tratados o no con nicotina de ambos tipos de dietas, a los 28 dias tras la isquemia cerebral. Se ha observado una clara disminución de los niveles de caspasa 3 bajo el tratamiento con nicotina. Tanto en el grupo STD, como HFD se observa una disminución estadísticamente significativa de la caspasa 3 cleaved (Figura 36) en los grupos tratados con nicotina en comparación con los tratados con vehículo. En el caso de la expresión de caspasa 3, la tendencia Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina en ambas dietas es a su disminución en los grupos tratados con nicotina, pero esta diferencia sólo tiene significancia estadística en el grupo HFD. Figura 36. Efecto de la nicotina sobre los niveles de Caspasa 3 en STD y HFD a los 28 días tras la isquemia cerebral. Niveles de proteínas (panel izquierdo) e imágenes autorradiográficas representativas (panel derecho) de la Caspasa 3 en los cuatro grupos; STD vehículo, STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina (hemisferio ipsilateral). Los niveles de proteína se han calculado como % respecto al grupo vehículo de su misma dieta, y han sido previamente normalizados por los niveles de β-actina. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 **p<0.01 y ***p<0.001 en comparación con el grupo vehículo de la misma dieta; empleando el test estadístico t-Student (N=7 para cada grupo). 10.6. Reversión del efecto neuroprotector de la nicotina con un activador de la ruta de AMPK 10.6.1. Incremento del volumen de lesión y edema isquémico Teniendo en cuenta los resultados de activación de la ruta de la AMPK bajo el tratamiento con nicotina durante 28 días ligados a una mejora de los volúmenes de lesión, edema isquémico y déficit funcional, ha sido de interés el estudio del tratamiento con nicotina junto a un activador de la ruta de AMPK, AICAR [264]. Son muchos los estudios que observan un incremento de la Resultados Tania López González Página 153 ruta de la AMPK tras la isquemia cerebral relacionándola con la mala prognosis en dicha enfermedad [264-266, 270-272, 275], por lo que se podría esperar una reversión de los efectos de la nicotina bajo el tratamiento simultáneo con AICAR. El estudio de la influencia del activador de AMPK, AICAR, sobre el efecto protector de la nicotina en los volúmenes de lesión isquémica, se ha estudiado tanto en el grupo STD como HFD. El seguimiento mediante neuroimagen de resonancia magnética para la evaluación de los volúmenes de lesión isquémica se ha realizado de forma basal, a las 24 y 72 horas, y a los 7 días tras la isquemia. De acuerdo con nuestros criterios de inclusión, el volumen de lesión basal de cada animal, determinado mediante mapas ADC, está entre el 30-45% del hemisferio ipsilateral: 40,54±1,48% en el grupo STD vehículo, 40,40±1,52% en el grupo STD nicotina, 40,57±1,72% en el grupo STD AICAR, 40,42±1,51% en el grupo HFD vehículo 40,09±1,51% en el grupo HFD nicotina y 39,42±1,49% en el grupo HFD AICAR (Figura 37A, 37B). Tanto en el grupo STD como HFD se ha observado que el efecto protector de la nicotina se revierte bajo la administración de AICAR (Figura 37, ver grupos tratados con nicotina y AICAR). A las 24 y 72 horas tras la isquemia cerebral parece que se mantiene el efecto protector de la nicotina, observándose incluso una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo vehículo y el tratado con AICAR a las 24 horas en la dieta STD. Es a los 7 días cuando se observan un incremento del volumen estadísticamente significativo del grupo con AICAR respecto al grupo nicotina, tanto en dieta STD como HFD; un 37,97±2,63% en el grupo STD con AICAR frente un 29,32±1,45% en el grupo STD nicotina y un 35,91±1,95% en el grupo HFD con AICAR frente al 26,72±35,91% en el grupo HFD nicotina. Estudio preclínico de la paradoja de la obesidad en la isquemia cerebral: efecto terapéutico del tratamiento con nicotina Figura 37. Evolución de la lesión isquémica bajo el tratamiento con AICAR mediante el seguimiento por resonancia magnética. Los mapas ADC (difusión) se adquieren antes del tratamiento para asegurar que todos los animales incluidos en el estudio tengan daños isquémicos basales homogéneos. La evaluación de la lesión isquémica se lleva a cabo mediante una secuencia de peso T2 registrada a las 24 y 72 horas, y 7 tras la isquemia. A – Análisis cuantitativo de los volúmenes de lesión del grupo STD a partir de las imágenes por RM (en % del hemisferio ipsilateral) B – Análisis cuantitativo de los volúmenes de lesión del grupo HFD a partir de las imágenes por RM (en % del hemisferio ipsilateral). Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 **p<0.01en comparación con el grupo vehículo de la misma dieta y +p<0.05 en comparación con el grupo nicotina de la misma dieta; empleando el ANOVA seguido del test estadístico Bonferroni (N=8 para los grupos STD vehículo, STD nicotina + AICAR y HFD nicotina + AICAR y N=9 para los grupos STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina). Resultados Tania López González Página 155 Se evaluó la formación de edema isquémico bajo el tratamiento con nicotina y AICAR y se ha observado que este tratamiento no parece tener efecto en dicha formación, manteniéndose el efecto reductor de la nicotina sobre el edema isquémico. Se ha descrito previamente el efecto de la nicotina en la disminución del edema isquémico respecto a los grupos tratados con vehículo, tanto en STD como HFD (véase de nuevo en la Figura 38A, 38B). En el caso de los grupos AICAR (tratados con nicotina y AICAR) se observa la misma tendencia a menores valores de edema isquémico frente a los grupos vehículo, con resultados estadísticamente significativos a las 72 horas tras las isquemia (el punto de mayores valores de edema isquémico) en ambas dietas, y a las 24 horas en el grupo HFD (Figura 38A, 38B). Figura 38. Análisis cuantitativo del edema isquémico bajo el tratamiento con AICAR en base a los datos de imagen por resonancia magnética. El edema se mide por la desviación de la línea media del cerebro calculada como el volumen del hemisferio ipsilateral entre el volumen del hemisferio contralateral. A – Grupo STD. B – Grupo HFD. Los datos se muestran como la media±SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo STD vehículo; empleando el ANOVA seguido del test estadístico Bonferroni (N=8 para los grupos STD vehículo, STD nicotina + AICAR y HFD nicotina + AICAR, y N=9 para los grupos STD nicotina, HFD vehículo y HFD nicotina). Los resultados más detallados sobre la medición del edema isquémico a lo largo de 7 días se pueden ver en la Tabla 8.