La familia Splanchnotrophidae (Crustacea, Copepoda, Poecilostomatoida) en la Ría de Ferrol y en la de Ares (NW Península Ibérica): estudio morfológico y molecular

DEPARTAMENTO DE ZOOLOXÍA, XENÉTICA E ANTROPOLOXÍA FÍSICA FACULTADE DE BIOLOXÍA Y ESTACIÓN DE BIOLOXÍA MARIÑA DA GRAÑA La familia Splanchnotrophidae (Crustacea, Copepoda, Poecilostomatoida) en la Ría de Ferrol y en la de Ares (NW Península Ibérica): estudio morfológico y molecular. Memoria que presenta para optar al Grado de Doctor en Biología MARCOS ABAD COSTOYA Santiago de Compostela, 2016. D. VICTORIANO URGORRI CARRASCO, Catedrático de Universidade no Departamento de Zooloxía, Xenética e Antropoloxía Física da Facultade de Bioloxía e Director da Estación de Bioloxía Mariña da Graña da Universidade de Santiago de Compostela; e D. GUILLERMO J. DÍAZ AGRAS, Doutor en Bioloxía e Xefe da Estación de Bioloxía Mariña da Graña, CERTIFICAN: Que a presente memoria titulada “La familia Splanchnotrophidae (Crustacea, Copepoda, Poecilostomatoida) en la Ría de Ferrol y en la de Ares (NW Península Ibérica): estudio morfológico y molecular”, foi realizada por Marcos Abad Costoya baixo a nosa dirección na Estación de Bioloxía Mariña da Graña da Universidade de Santiago de Compostela. E considerando que representa traballo de Tese de Doutoramento, autorizamos a súa presentación ante o Consello do Departamento e a Comisión de Doutoramento da Universidade de Santiago de Compostela. E para que así conste e surta os efectos oportunos, asinamos o presente certificado. Santiago de Compostela, 5 de Setembro de 2016. Vº e Pr. Titor e Director Vº e Pr. Director Prof. Dr. Victoriano Urgorri Dr. Guillermo J. Díaz Agras Agradecimientos La primera persona a la que tengo que mencionar es a mi director de tesis y padre científico, Victoriano Urgorri. Confió en mí, me dedicó su tiempo y me ha enseñado todo lo que sabe; nunca podré estar lo suficientemente agradecido. Parecen 7 minutos pero han pasado ya 7 años desde que, mientras navegábamos por delante del castillo de San Felipe a bordo del Polybius, me propuso realizar la tesis doctoral en la Estación de Bioloxía Mariña da Graña. Me abrió de par en par las puertas de esta casa y puso a mi disposición un capital humano y material que aún a día de hoy creo que no merezco. Sin su paciencia, cariño y saber hacer este trabajo no podría haberse realizado. Gracias profesor. A mi otro director, Guillermo Díaz, “Willy”, tengo que agradecerle muchísimas cosas. En primer lugar gracias por haber estado ahí siempre que lo necesité, atendiéndome con una sonrisa y con una paciencia infinita. Gracias también por enseñarme a trabajar con meticulosidad y rigor; si Vituco es mi padre científico, tú eres mi hermano mayor científico. Gracias por haber creído en mí incluso cuando ni yo mismo lo hacía. Y por supuesto gracias por acompañarme en todos los muestreos, sé que no ha sido fácil. Tenerte a mi lado debajo del agua en tantas ocasiones ha sido un privilegio y un ejemplo. Después de todo lo que hemos pasado juntos, bueno y malo, has ganado un amigo. Gracias al Dr. Javier Quinteiro, a Lois Pérez y al profesor Manuel Rey, del departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la USC, la parte del estudio molecular es una realidad. No dudaron en perder el tiempo, sin esperar nada a cambio, para que un completo ignorante en la materia pudiese aprender de ellos. Me han enseñado técnicas de amplificación, a analizar las secuencias, a interpretar los resultados, han hecho correcciones… para ellos es lo más básico, pero para mí vale una tesis. Michael Schrödl y Roland Anton, del Zoologische Staatssammlung de Múnich, son los investigadores que más han contribuido a ampliar el conocimiento sobre la familia Splanchnotrophidae en los últimos tiempos. Soy afortunado por mantener una buena relación con ellos, lo que no resulta complicado teniendo en cuenta su cercanía y calidad humana. Me han ayudado aportando bibliografía antigua, cediéndome amablemente secuencias y haciendo comentarios clarificadores. Quiero mencionar también a Enrico Schwabe, de la misma institución, que a pesar de trabajar con otros grupos animales, siempre ha estado dispuesto a ayudar en todo lo que fue posible. El Dr. Juan Moreira me dio consejos muy valiosos y me mostró que un buen científico debe ser minucioso, exacto y efectivo en su trabajo. Más importante si cabe son los trucos que me enseñó para jugar al Panzer General, que me permitieron aplastar a la Werhmacht y tomar Berlín al mando del Ejército Rojo. Para poder plasmar lo agradecido que le estoy a mis compañeros de la EBMG necesitaría redactar otra tesis. Como considero que con una ya es más que suficiente, intentaré resumirlo lo mejor que pueda: Más allá de sus conocimientos de la meiofauna, la Subdirectora Celia Besteiro se comporta como una madre con todos nosotros, siempre atenta a becas, congresos, BOEs y DOGAs que nos puedan ser de utilidad. Su capacidad organizativa y de comprensión de enrevesados textos legales nos mantiene a salvo de la temida burocracia. Gracias a Ramiro, mi ordenador aún no ha explotado en mil pedazos. También me ha enseñado a digitalizar los dibujos y ha participado en infinidad de muestreos. He de decir que a su lado he pasado de todo: hambruna en el B/O Hespérides, recolecciones extremas de mejillón, encontronazos con inspectores de la Xunta (“Costoya es con y griega”), ordenadores de buceo que deciden morir simultáneamente, máscaras AGA rebeldes, inmersiones recreativas, “paradas de descompresión” en Catabois que se alargan... Compañero, eso une. Junto con su ayuda en los muestreos, María ha sido fundamental para que llegase a comprender los entresijos de la morfología de los copépodos. Siempre que me surgió alguna duda acerca de una espina, seda minúscula, o grosor de trazo de los dibujos sabía que podía recurrir a su opinión y consejo; además, su aporte en la preparación de las muestras para microscopía fue decisivo. Xela, incansable contadora de poliquetos, empezó su andadura en la EBMG un par de años después de que yo lo hiciese y he sido testigo de su crecimiento científico y profesional. Fue mi compañera de fatigas en el máster que nos vimos obligados a cursar (¡gracias Bolonia!), y por ello ambos podemos decir “yo estuve allí y sobreviví para contarlo”. Xandro participó muy activamente en los muestreos, buceando o como patrón. Compartimos mucho tiempo juntos en el laboratorio, y también innumerables discusiones científicas, laborales y políticas. Algunas veces incluso conseguimos ponernos de acuerdo. Gracias compañeiro, espero que te vaya bien en el nuevo rumbo que has tomado. Además de su manera de trabajar y de su carácter amable, Alberto posee la envidiable capacidad de, a partir de unas ideas generales, materializar lo que necesitas; prueba de ello es el diseño de los recipientes para nudibranquios. Gracias a su esfuerzo las embarcaciones y todo el equipamiento se encuentran siempre a punto para ser utilizados, lo cual no es fácil. Finuca mantiene la Estación perfectamente limpia para que podamos hacer nuestro trabajo, a pesar del empeño que ponemos en ensuciar todo con botas llenas de fango y bichos moribundos. Por el tipo de trabajo que se desarrolla en esta tesis hubo que realizar, literalmente, docenas y docenas de muestreos para conseguir material. Se dice rápido, pero eso supone salidas al mar e inmersiones en condiciones nada agradables: frio, lluvia, viento, corriente, mala visibilidad, calor en verano, aparejos abandonados... y puedo decir que jamás escuché a ninguno de mis compañeros quejarse o poner mala cara mientras me regalaban el escaso tiempo del que disponían para sus propias tesis. Sólo se me ocurre una palabra que describe a las personas capaces de hacer ese sacrificio: amigos. Esta tesis también es vuestra y es realidad gracias a vosotros, espero haber estado a la altura. Por supuesto no me olvido de mis compañeros de Santiago y Lugo: Marcos, Tere, Mario, Lucía Barrio y Lucía Pedrouzo. Su capacidad de trabajo y su buena disposición para participar en los muestreos son un ejemplo, y sus visitas mensuales rompían la monotonía del día a día. Mención especial para Marcos por su ayuda con la colección de Opistobranquios de Galicia de Vituco, y para Lucía Barrio por compartir conmigo una palmera de chocolate que nos haría amigos. Los componentes de la “sección sénior” de Vituco, los Doctores Óscar García, Julio Parapar, Jesús Troncoso y Luís Míguez son de esa clase de personas que, sin querer, enseñan. No tengo más que buenas palabras hacia ellos: por su impresionante nivel científico -que es un formidable referente y un estímulo para mejorar día a día-, por haberme ayudado y aconsejado, y por tratarme como a uno más con una cercanía fuera de lo común. Una de las mayores fortunas que he tenido en mi vida ha sido conocer a Ana. Gracias por soportarme cuando la presión fue demasiada, por sacarme una sonrisa, por animarme cuando me hizo falta. Gracias por estar siempre a mi lado. Finalizo con mi familia. Mi hermana y mis primos (que también son hermanos) me han apoyado pacientemente durante la realización de este trabajo. Gracias a mis padres nunca me ha faltado de nada, y han sabido respetar todas mis decisiones, tanto las buenas como las malas. Me han aconsejado y han aguantado estoicamente mis días malos, y también los peores. Pero por lo que tengo que estarles más agradecido es por ser un ejemplo de cómo superar las dificultades con fuerza de voluntad y tenacidad. Eso vale oro, y por eso esta tesis es para vosotros. ÍNDICE Capítulo 1. Introducción ................................................................. 1 1.1. Características generales de la familia Splanchnotrophidae. ................................ 3 1.2. Ordenación sistemática de las especies de la familia Splanchnotrophidae. .......... 6 1.3. Anatomía externa. ................................................................................................. 8 1.4. Anatomía interna. ................................................................................................ 10 1.5. Antecedentes históricos. ..................................................................................... 11 1.6. Historia natural. .................................................................................................. 24 1.6.1.Distribución geográfica. .............................................................................. 24 1.6.2. Hábitat. ....................................................................................................... 28 1.6.3. Reproducción. ............................................................................................. 31 1.6.4. Ciclo vital. .................................................................................................. 33 1.6.5. Alimentación. ............................................................................................. 34 1.6.6. Circulación. ................................................................................................ 34 1.6.7. Respiración. ................................................................................................ 34 1.7. Parasitismo: definición y conceptos generales. .................................................. 34 1.8. La subclase Copepoda y el parasitismo. ............................................................. 35 1.9. Infraclase Opisthobranchia: hospedadores de la familia Splanchnotrophidae. ... 39 1.9.1. Sistemática y generalidades de Opisthobranchia. ....................................... 39 1.9.2. Preferencias y especificidad de los esplancnotrófidos. .............................. 43 1.10. Problemática de la famlia Splanchnotrophidae. ................................................ 44 1.11. Antecedentes. .................................................................................................... 45 1.12. Objetivos. .......................................................................................................... 51 Capítulo 2. Área de estudio .......................................................... 53 2.1. Localización. ....................................................................................................... 55 2.1.1. Ría de Ferrol. .............................................................................................. 56 2.1.2. Ría de Ares. ................................................................................................ 57 Capítulo 1 4 D C B A al urs al al urs urs so al urs prc prc Figura 1. Anatomía externa de la hembras de la familia Splanchnotrophidae. A. Hembra de Splanchnotrophus gracilis (adaptado de H ANCOCK & NORMAN, 1863). B. Hembra de Splanchnotrophus angulatus (adaptado de HECHT, 1895). C. Hembra de I. aliena (adaptado de HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003). D. Hembra de Ceratosomicola mammilata (adaptado de SALMEN et al., 2008a) (al: apéndices laterales; prc: procesos posteriores so: sacos ovígeros; urs: urosoma). Figura 1. Anatomía externa de las hembras de la familia Splanchnotrophidae. A. Hembra de Splanchnotrophus gracilis (adaptado de H ANCOCK & NORMAN, 1863). B. Hembra de Splanchnotrophus angulatus (adaptado de HECHT, 1895). C. Hembra de Ismaila aliena (adaptado de HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003). D. Hembra de Ceratosomicola mammilata (adaptado de SALMEN et al., 2008a) (al: apéndices laterales; prc: procesos posteriores so: sacos ovígeros; urs: urosoma). Introducción 5 Figura 2. Anatomía externa de los machos de los géneros Splanchnotrophus y Ceratosomicola (tomado de UYENO & NAGASAWA, 2012). A. Macho de Splanchnotrophus helianthus. B. Macho de Ceratosomicola japonica. (trp: toracópodos). Capítulo 1 6 1.2. Ordenación sistemática de las especies de la familia Splanchnotrophidae. Actualmente se conocen 31 especies de la familia Splanchnotrophidae repartidas en seis géneros: Splanchnotrophus Hancock & Norman, 1863; Lomanoticola Scott & Scott, 1895; Ismaila Bergh, 1867; Arthurius Huys, 2001; Ceratosomicola Huys, 2001 y Majimun Uyeno & Nagasawa, 2012. Clase Maxillopoda Dahl, 1956 Subclase Copepoda H. M. Edwards, 1840 Infraclase Neocopepoda Huys & Boxshall, 1991 Superorden Podoplea Giesbrecht, 1882 Orden Poecilostomatoida Thorell, 1859 Familia Splanchnotrophidae Norman & Scott, 1906 Género Splanchnotrophus Hancock & Norman, 1863 Splanchnotrophus gracilis Hancock & Norman, 1863 Splanchnotrophus willemi Canu, 1891 Splanchnotrophus angulatus Hecht, 1893 Splanchnotrophus dellachiajei Delamare Deboutteville, 1950 Splanchnotrophus helianthus Uyeno & Nagasawa, 2012 Splanchnotrophus imagawai Uyeno & Nagasawa, 2012 Género Lomanoticola Scott & Scott, 1895 Lomanoticola brevipes (Hancock & Norman, 1863) Lomanoticola insolens Scott & Scott, 1895 Género Ismaila Bergh, 1867 Ismaila monstrosa Bergh, 1867 Ismaila occulta Ho, 1981 Ismaila belciki Ho, 1987 Ismaila aliena Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila androphila Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila damnosa Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila jenseniana Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila magellanica Haumayr & Schrödl, 2003 Introducción 7 Ismaila obtusa Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila robusta Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila socialis Haumayr & Schrödl, 2003 Ismaila chailhuiensis Anton, Schories, Jörger, Kaligis & Schrödl, 2015 Ismaila genalis Anton, Schories, Jörger, Kaligis & Schrödl, 2015 Ismaila volatilis Anton, Schories, Jörger, Kaligis & Schrödl, 2015 Género Ceratosomicola Huys, 2001 Ceratosomicola sacculata (O’Donoghue, 1924) Ceratosomicola coia Salmen, Wilson & Schrödl, 2008 Ceratosomicola delicata Salmen, Wilson & Schrödl, 2008 Ceratosomicola mammilata Salmen, Wilson & Schrödl, 2008 Ceratosomicola japonica Uyeno & Nagasawa, 2012 Género Arthurius Huys, 2001 Arthurius elysae (Jensen, 1990) Arthurius bunakenensis Salmen, Kaligis, Mamangkey & Schrödl, 2008 Arthurius gibbosa Anton, Schories, Jörger, Kaligis & Schrödl, 2015 Género Majimun Uyeno & Nagasawa, 2012 Majimun shirakawai Uyeno & Nagasawa, 2012 Capítulo 1 8 1.3. Anatomía externa. Cuerpo de la hembra adulta muy modificado (Fig. 1, Fig. 3). Prosoma de gran tamaño, sin segmentación externa visible, formado por el cefalosoma y los somitos torácicos 2º5º. Parte anterior del tórax (somitos torácicos 2º y 3º) ancha y con 3-6 pares de apéndices laterales, parte posterior mucho más estrecha, generalmente cilíndrica y formada por la fusión de los somitos torácicos 4º y 5º. Urosoma formado por el 7º somito torácico o somito genital (puede ser simple o doble, al fusionarse con el 1er somito abdominal) y, según el género, por el 6º somito torácico o por entre 0 y 2 somitos postgenitales (abdominales) (Fig. 3). Abertura anal, si existe, entre las dos ramas caudales (HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b). Genitoabdomen Urosoma Cefalosoma Prosoma Figura 3. Esquema de la anatomía externa de la hembra de Splanchnotrophus gracilis, en el que se señalan las estructuras más importantes y las regiones corporales (adaptado de HANCOCK & NORMAN, 1863). Introducción 9 Macho adulto ciclopiforme, mucho más pequeño que la hembra y sin apéndices laterales (Fig. 2, Fig. 4). Parte anterior delimitada por la articulación presente en el 3er somito torácico, formada por un cefalotórax de 5 somitos cefálicos y 2-3 torácicos. Parte posterior cilíndrica, comprende los somitos torácicos 4º-6º, somito genital (7º torácico) y somito anal (HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b). Prosoma Urosoma Cefalosoma Cefalotórax Toracópodo 2 Toracópodo 3 Ramas caudales Somito genital Figura 4. Esquema de la anatomía externa del macho de Splanchnotrophus gracilis, en el que se señalan las estructuras más importantes y las regiones corporales (adaptado de HANCOCK & NORMAN, 1863). Capítulo 1 10 Anténulas con 1-4 artejos, de segmentación más o menos marcada según el género. Antenas de 2-3 artejos (coxobase y 1-2 artejos endopodales). Labium y labrum de anatomía muy variable, pudiendo incluso estar ausentes. Mandíbulas, no presentes en Arthurius, compuestas por una gnatobase con una hoja de forma diversa entre los diferentes géneros. Maxílulas reducidas o inexistentes. Maxilas de 2 artejos (syncoxa y alobase). Maxilípedos (1er par de toracópodos) ausentes en la fase adulta (HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b). 2º y 3 er par de toracópodos birrámeos, endopodito pequeño y exopodito alargado; dimorfismo sexual y ornamentación variables. 4º par de toracópodos, si está presente, muy reducido y con forma de seda. Sin 5º par de toracópodos, 6º par ausente o muy reducido (HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b). 1.4. Anatomía interna. La pared corporal está formada por la epidermis, cubierta por una cutícula de quitina pobremente calcificada. Esta capa presenta, en el caso de las hembras, su mayor engrosamiento en la parte del urosoma que se encuentra fuera del hospedador (ANTON & SCHRÖDL, 2013b). La musculatura de la hembra se compone de tres pares de músculos longitudinales, dos ventrales y uno dorsal, que recorren toda la longitud del animal. Las antenas, mandíbulas y maxilas tienen haces musculares propios; toracópodos y apéndices laterales sin musculatura. En el macho existen dos pares de músculos longitudinales, uno lateral y otro ventral, ambos conectados por un haz muscular transversal. Las antenas y el segundo par de toracópodos poseen una fuerte musculatura (BELCIK, 1981; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). El sistema nervioso de la hembra presenta un ganglio supraesofágico y uno infraesofágico que se alarga formando un nervio ventral, ambos unidos por dos conectivos periesofágicos. El del macho consiste en un anillo nervioso periesofágico y en un ganglio supraesofágico (BELCIK, 1981; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). El sistema excretor está representado por un par de glándulas antenales. Los sistemas respiratorio y circulatorio sin estructuras detectables (BELCIK, 1981; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). El aparato digestivo de ambos sexos es muy similar, comprendido por boca, esófago e intestino medio. Las paredes y lúmen de este último presentan células glandulares. La abertura anal sólo fue expresamente mencionada en los géneros Splanchnotrophus y Introducción 11 Ceratosomicola, no se observó en el género Ismaila, y en los géneros Lomanoticola, Arthurius y Majimun su presencia o ausencia no han sido suficientemente aclaradas (BELCIK, 1981; HUYS, 2001; SALMEN, 2005; SALMEN et al., 2008a; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). El aparato reproductivo femenino está formado por los ovarios, dos oviductos y una glándula cemental. Los ovarios se extienden por todo el cuerpo, incluyendo el interior de los toracópodos y de los apéndices laterales (HUYS, 2001; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). El macho posee un par de testis ocupando la mayor parte del cefalosoma y un par de espermatóforos en distinta posición según el género (BELCIK, 1981; HUYS, 2001; ANTON & SCHRÖDL, 2013b). 1.5. Antecedentes históricos. Los primeros trabajos en los que se menciona a los esplancnotrófidos se deben a Delle Chiaje (1841) y a Alder & Hancock (1845-1855) (DELLE CHIAJE, 1841; ALDER & HANCOCK, 1845-1855; HUYS, 2001). DELLE CHIAJE (1841) ilustra un ejemplar del aeolidáceo Spurilla neapolitana (Delle Chiaje, 1841) recogido en el Mediterráneo, en el que se observan varias hembras del copépodo sin ninguna descripción ni dibujo detallado (Fig. 5). ALDER & HANCOCK (1845-1855) ilustran y describen brevemente, sin asignar ningún nombre, ambos sexos de un copépodo encontrado parasitando a Acanthodoris pilosa (Abildgaard in Müller, 1789) en la localidad inglesa de Devonshire. Comentan además que han observado una especie diferente de la anterior parasitando a Flabellina verrucosa (Sars, 1829) y a Doto coronata (Gmelin, 1791), pero sin realizar ningún tipo de descripción. Capítulo 1 12 Figura 5. Descripción de Spurilla neapolitana en la que se observan varias hembras de Splanchnotrophus dellachiajei (tomado de DELLE CHIAJE, 1841; Par: hembra del parásito). Introducción 13 Figura 6. A. Descripción original de Splanchnotrophus gracilis. B. Descripción original de Lomanoticola brevipes (A y B tomadas de HANCOCK & NORMAN, 1863). Años más tarde HANCOCK & NORMAN (1863) se centran en las especies de parásitos que aparecen en el trabajo de ALDER & HANCOCK (1845-1855). Encuentran de nuevo a una de ellas infectando a un ejemplar de Acanthodoris pilosa en Devonshire, describen ambos sexos y la denominan Splanchnotrophus gracilis (Fig. 6A). También detectan al otro parásito mencionado por ALDER & HANCOCK (1845-1855) dentro de Doto coronata y describen a la hembra de esta especie, a la que le asignan el nombre de Splanchnotrophus brevipes (Fig. 6B). Para albergar a estas dos nuevas especies proponen el género Splanchnotrophus (HANCOCK & NORMAN, 1863). Capítulo 1 20 LAUBIER (1964) estudia en detalle las piezas bucales de Splanchnotrophus dellachiajei y Splanchnotrophus gracilis. Afirma que la ausencia de maxilípedos y la forma de la mandíbula y la maxila son caracteres diagnósticos inequívocos de la familia Splanchnotrophidae y la distinguen de cualquier otra. HO (1981) describe la nueva especie Ismaila occulta, de aguas del Pacífico nororiental (Fig. 12). Ese mismo año BELCIK (1981) realiza un estudio pormenorizado del macho de Ismaila monstrosa en el que aporta datos sobre la tagmosis, apéndices cefálicos, toracópodos y anatomía interna. Figura 12. Descripción original de Ismaila occulta (tomada de HO, 1981). Introducción 21 HO (1987) publica los únicos datos conocidos hasta el presente sobre el desarrollo de los miembros de la familia Splanchnotrophidae en su detallado estudio sobre la ontogenia de Ismaila occulta (Fig. 23). En él confirma la existencia de una larva nauplius pelágica y propone que el estadío infectivo sería el de copepodito I, mientras que los copepoditos II, III y IV serían endoparasíticos. También afirma que el mayor progreso en el desarrollo larvario tiene lugar durante el estadío de copepodito IV, ya que es durante esta etapa en la que se observa la aparición del dimorfismo sexual (hecho en consonancia con lo observado en otros poecilostomatoideos). Observa además que la ausencia de maxilípedos en los adultos (una de las apomorfías que definen a los esplancnotrófidos) se debe a una detención del desarrollo del primodio del maxilípedo que aparece en el copepodito II, más que a la propia inexistencia de su desarrollo. JENSEN (1987) añade el orden Sacoglossa (von Ihering, 1876) a la lista de hospedadores de la familia Splanchnotrophidae. Encuentra a Ismaila monstrosa parasitando a Ercolania viridis (Costa, 1866) en la misma localidad en la que Bergh recolectó el primer ejemplar utilizado para describir la especie del copépodo (BERGH, 1867; JENSEN, 1987). En 1990 describe la nueva especie de esplancnotrófido Splanchnotrophus elysiae Jensen, 1990 (Fig. 13) parasitando al también sacogloso Elysia australis (Quoy & Gaimard, 1832), y lo incluye en el entonces subgénero Lomanoticola en base a la anatomía de los apéndices laterales (JENSEN, 1990). Figura 13. Descripción original de Arthurius elysae (tomada de JENSEN, 1990). Capítulo 1 22 SCHRÖDL (1997) estudia los efectos que Ismaila sp. produce en la supervivencia y capacidad reproductiva de su hospedador Flabellina sp.1. Observa que los nudibranquios infectados dejan de reproducirse y que disminuye su tiempo de supervivencia en laboratorio respecto a los no infectados. HUYS (2001) marca un punto de inflexión en el conocimiento de la familia Splanchnotrophidae, gracias a las detalladas descripciones anatómicas basadas en los dibujos obtenidos mediante microscopía óptica de las series tipo de la mayoría de las especies y a su estudio exhaustivo y crítico de la bibliografía existente. Agrupa a todos los géneros de endoparásitos de opistobranquios marinos, excepto Briarella Bergh, 1876, dentro de la familia Splanchnotrophidae (SALMEN et al., 2010). Resuelve la dudosa posición taxonómica de Lomanoticola concediéndole finalmente el estatus de género, e incluye a Splanchnotrophus brevipes en este taxón bajo la denominación Lomanoticola brevipes (Hancock & Norman, 1863) como nueva combinación. Además, crea dos nuevos géneros para acomodar a Splanchnotrophus elysiae y Splanchnotrophus sacculatus, que poseen caracteres suficientemente diferenciados del género Splanchnotrophus como para ser excluidas de él: - Arthurius Huys, 2001 para Arthturius elysae. Las principales características de este género son la presencia de un 4º par de apéndices laterales en las hembras en una posición más ventral que los otros 3, los apéndices cefálicos están muy reducidos (anténulas de un único artejo, antenas de 2, ausencia de mandíbulas y maxílulas) y con dimorfismo sexual, y los toracópodos 2º y 3º son vestigiales en las hembras pero muy desarrollados y completamente funcionales en los machos. - Ceratosomicola Huys, 2001 para Ceratosomicola sacculata (HUYS, 2001). Las apomorfías que caracterizan a este género son la anténula con 4 artejos claramente diferenciados, reducción de la maxila, presencia de dos somitos postgenitales en las hembras y reducción de los toracópodos a meros elementos vestigiales, incluidos en gran parte en el interior de la pared corporal. De esta manera, la familia Splanchnotrophidae queda conformada por los géneros Splanchnotrophus, Lomanoticola, Ismaila, Arthurius y Ceratosomicola. SCHRÖDL (2002) analiza las frecuencias y prevalencias de infección del género Ismaila en los opistobranquios de Chile y Argentina, así como su variación geográfica. Propone una hipótesis sobre la evolución de la famila Splanchnotrophidae en la que ancestros comunes los géneros Splanchnotrophus e Ismaila, con baja especificidad hospedador- Introducción 23 parásito, se habrían visto aislados geográficamente. Tras este evento ambos géneros se diferenciarían por radiación paralela y se habrían especializado en determinadas especies de hospedador. HAUMAYR & SCHRÖDL (2003) revisan el género Ismaila y describen 8 nuevas especies del Pacífico suroriental, empleando por primera vez en el estudio de la familia Splanchnotrophidae la microscopía electrónica de barrido (SEM), la cual resulta ser una herramienta eficaz para observar estructuras finas con gran detalle. MARSHALL & HAYWARD (2006) realizan un análisis histológico de varios individuos del nudibranquio Ancula gibbosa (Risso, 1818) infectados por Splanchnotrophus willemi, y concluyen que, a pesar de no existir efectos negativos evidentes en la mayoría de ellos, sí producen malformaciones en las gónadas que podrían afectar a la reproducción. SALMEN et al. (2008a, b) usan el SEM para describir nuevas especies pertenecientes a los géneros Ceratosomicola y Arthurius. ABAD et al. (2011) realizan un estudio anatómico mediante el SEM de Splanchnotrophus gracilis en la Ría de Ferrol, y aportan datos sobre la biología del parásito (tasas de infección, efectos en el hospedador, etc.) gracias a la gran cantidad de especímenes encontrados infectando al nudibranquio Trapania tartanella (von Ihering, 1886). UYENO & NAGASAWA (2012) estudian la familia Splanchnotrophidae en aguas japonesas. Fruto de este trabajo es la propuesta del género Majimun Uyeno & Nagasawa, 2012 para la nueva especie Majimun shirakawai en base a la particular segmentación del urosoma y apéndices cefálicos, y a la ornamentación diferenciada de estas estructuras. También describen una nueva especie del género Ceratosomicola y dos del género Splanchnotrophus, ampliando notablemente la distribución geográfica conocida de este último. ANTON & SCHRÖDL (2013a) se basan en caracteres anatómicos para realizar la primera filogenia de los esplanchnotrófidos. En el árbol resultante se demuestra la monofilia de la familia Splanchnotrophidae, así como el hecho de que comparte un antepasado común con el género Briarella. Encuentran que existe una dicotomía basal dentro de la familia Splanchnotrophidae, que agrupa en un clado a los géneros Arthurius y Ceratosomicola y en otro a los géneros Ismaila y Splanchnotrophus s.l. (incluyendo Lomanoticola). Así mismo, proponen la hipótesis de que el área inicial dónde se emplearon los Capítulo 1 24 opistobranquios como hospedadores fue la zona del Indo-Pacífico, donde hoy día se encuentran los géneros más basales Ceratosomicola y Arthurius. La expansión del ancestro común de los géneros Ismaila y Splanchnotrophus s.l. tendría lugar desde ahí hacia el oeste antes del cierre del Mar de Tethys, llegando al Mediterráneo y al Atlántico. En el siguiente paso, el ancestro del género Ismaila cruzaría en una primera etapa el Atlántico y en una segunda el todavía abierto Istmo de Panamá, colonizando de esta manera las costas occidentales de América del Norte y del Sur. Ese mismo año ANTON & SCHRÖDL (2013b) realizan una reconstrucción tridimensional de la hembra y del macho de la especie Ismaila aliena, con la que describen su anatomía interna y proponen hipótesis sobre su biología en base a los resultado obtenidos. WOLF & YOUNG (2014) estudian con datos estadísticos obtenidos en laboratorio la reproducción, crecimiento y tasas de supervivencia del armináceo Janolus fuscus O’Donoghue, 1924 infectado por Ismaila belciki. Determinan que esos parámetros se ven reducidos de manera más o menos significativa respecto a los de otros individuos no infectados. Además, encuentran que el parásito desvía alrededor de un tercio de la energía destinada para la reproducción del nudibranquio hacia su propio esfuerzo reproductivo. Ello implica que al menos Ismaila belciki sigue una estrategia similar en ciertos aspectos a los parásitos castradores, aunque difiere de ella en que la infección no implica el cese completo de la reproducción del hospedador. ANTON et al. (2015) emplean de nuevo el SEM para describir tres especies del género Ismaila y una del género Arthurius. 1.6. Historia natural. 1.6.1. Distribución geográfica. La mayoría de las especies se encuentran en aguas templadas, ya que de las 31 conocidas en la actualidad, 22 se han encontrado en ellas y únicamente 9 en la zona intertropical (HANCOCK & NORMAN, 1863; BERGH, 1867, 1868; CANU, 1891; HECHT, 1893, 1895; SCOTT & SCOTT, 1895; O’DONOGHUE, 1924; DELAMARE DEBOUTTEVILLE, 1950, 1951; BELCIK, 1981; HO, 1981; JENSEN, 1987, 1990; SCHRÖDL, 1997, 2002; HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b; ABAD et al., 2011; UYENO & NAGASAWA, 2012; ANTON & SCHRÖDL, 2013a; ANTON et al., 2015). Introducción 25 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 14. Mapa de la distribución del género Splanchnotrophus. 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 15. Mapa de la distribución del género Lomanoticola. - El género Splanchnotrophus presenta la distribución más amplia de la familia, puesto que se observa en dos zonas bien diferenciadas y separadas geográficamente: una europea boreo-mediterránea y otra formada por las dos especies descritas en Japón. - La distribución del género Lomanoticola se solapa con la del género Splanchnotrophus en el Mediterráneo y Atlántico nororiental (europea boreomediterránea). Capítulo 1 26 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 16. Mapa de la distribución del género Ismaila. 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 17. Mapa de la distribución del género Arthurius. - El género Ismaila se menciona en el Caribe y en aguas templadas del Pacífico nororiental y suroriental. - En el género Arthurius la distribución es indo-pacífica, observándose en Australia occidental, Nueva Caledonia y Sulawesi. Introducción 27 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 18. Mapa de la distribución del género Ceratosomicola. 0º 0º 23 26'º 23 26'º Figura 19. Mapa de la distribución del género Majimun. - La presencia del género Ceratosomicola se ha citado en las islas Houtman, Abrolhos, Sulawesi y Japón (distribución indo-pacífica). - El género Majimun presenta la distribución más limitada de la familia, ya que hasta el momento solamente se ha encontrado en Japón. Capítulo 1 28 1.6.2. Hábitat. La familia Splanchnotrophidae parasita opistobranquios de aguas costeras, desde la zona intermareal hasta los 30 m de profundidad. Dado que la familia Splanchnotrophidae se encuentra en el interior de opistobranquios, el cuerpo del hospedador se debe entender también como su hábitat (RHODE, 1993). Las hembras ovígeras se sujetan a sus vísceras con los apéndices laterales y penetran el intertegumento con el urosoma (Figs. 20A, B), mientras que los machos se mueven libremente por el interior del hospedador (Fig. 20B). Al urosoma se anclan un par de sacos ovígeros que se sitúan entre los ceratas o entre las branquias del hospedador (Fig. 21) (BELCIK, 1981; HO, 1981; SCHRÖDL, 1997; HUYS, 2001; SCHRÖDL, 2002; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b; ABAD et al., 2011; ANTON & SCHRÖDL, 2013a, b), lo que les confiere un buen camuflaje y el aprovechamiento de las defensas químicas del opistobranquio (JENSEN, 1987; SCHRÖDL, 1997; HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; ANTON & SCHRÖDL, 2013a). Introducción 29 Figura 20. Posicionamiento de Splanchnotrophus gracilis en el interior del nudibranquio Trapania tartanella. A. Posición de la hembra. B. Posición de varios machos respecto a una hembra (al: apéndices laterales; HemPar: hembra del parásito; MaPar: macho del parásito; so: sacos ovígeros). Fotografías realizadas con microscopio estereoscópico. Capítulo 1 36 - Fusión de los somitos corporales y pérdida de evidencias externas de segmentación. - Reducción de los órganos sensoriales. - Reducción del número de estadíos de vida libre. KABATA (1979) formula dos hipótesis para explicar el proceso por el cual los copépodos adoptaron el parasitismo. La primera afirma que individuos de vida libre que se alimentaban atacando larvas de peces mucho mayores que ellos lo hacían aferrándose a pliegues de su epidermis durante breves períodos de tiempo, limitados a lo estrictamente necesario para la alimentación. De ahí pasaron a encuentros más prolongados que irían evolucionando hacia incipientes sistemas parásito-hospedador. La segunda hipótesis propone que copépodos de vida libre que buscaban su alimento en los fondos marinos adquirieron aparatos bucales adecuados para este propósito, así como apéndices que les facilitaban la sujeción al sustrato donde se alimentaban. Estos copépodos, debido al gran número de encuentros esporádicos con otras especies que habitaban en el fondo o que se encontraban cerca de él, acabarían por asociarse con ellas de una forma más o menos permanente hasta culminar en el parasitismo. Ambas propuestas estarían respaldadas por los requisitos que según POULIN (2007) tienen que existir para que se produzca la transición de un modo de vida libre a otro parasítico. Uno de ellos es que surja la oportunidad de explotar un organismo de mayor tamaño por parte de uno más pequeño, derivada de encuentros esporádicos en los que ninguno sufre daños. Otro de los requisitos es que la especie de menor tamaño posea ciertas preadaptaciones encaminadas a su supervivencia, alimentación y reproducción en el hospedador. Sin éstas el parásito no podría sacar partido de su potencial hospedador, y su utilización no se vería favorecida por la selección natural. La adopción del parasitismo supuso para los copépodos el cambio de una serie de problemas biológicos por otros. Para un animal de vida libre estos problemas se refieren a su supervivencia como individuo, es decir, buscar alimento y al mismo tiempo evitar ser depredado, de manera que desarrolla estrategias para escapar de sus predadores. En el caso de los copépodos parásitos esta faceta se deja en manos del hospedador, por lo que la búsqueda de alimento y la necesidad de huir de los predadores no representan un problema para ellos (KABATA, 1979; POULIN, 2007). A pesar de ello, esta estrategia presenta el inconveniente de que la movilidad se ve muy reducida, lo que puede comprometer el éxito reproductivo. Para resolver este problema los parásitos invierten Introducción 37 la energía ahorrada en la locomoción y búsqueda de alimento en incrementar los esfuerzos destinados a su reproducción (OLSEN, 1974; ROBERTS & JANOVY, 2000). Desde un punto de vista evolutivo es muy interesante comparar la anatomía de las formas larvarias y adultas de los copépodos de vida libre y de los copépodos parásitos. Por una parte hay evidentes diferencias entre los estadíos juveniles de los copépodos parásitos y sus correspondientes adultos, sobre todo en el caso de las hembras (KABATA, 1979). Pero el hecho más destacable es el parecido entre formas larvarias y juveniles parásitas y los adultos de especies de vida libre, semejanza que se hace aún mayor a la hora de comparar los primeros estadíos del desarrollo ontogénico de formas de vida libre y parásitas (KABATA, 1979). Dentro de la subclase Copepoda el orden Poecilostomatoida ilustra la progresión desde pequeños parásitos especializados (familia Ergasilidae) a formas con una anatomía altamente modificada (familias Philichthyidae y Sarcotacidae), teniendo éxito como simbiontes s.s. y como parásitos (ROBERTS & JANOVY, 2000). HUYS & BOXSHALL (1991) se basan en este hecho al afirmar que el orden Poecilostomatoida es probablemente el más diverso, en términos de anatomía externa, dentro de los copépodos: se observan tanto representantes primitivos con la típica anatomía ciclopiforme que viven en asociaciones “débiles” con otros organismos (como por ejemplo el género Hemicyclops Boeck, 1872, que habita en las guaridas de los decápodos), como un elevado número de familias parasíticas altamente derivadas que muestran todo un abanico de anatomías externas poco comunes (como la familia Corallovexiidae, parásita de coelenterados; las familias Chondracanthidae y Philichthyidae, que parasitan peces; la familia Mytilicolidae, que infecta moluscos bivalvos; o la familia Nereicolidae, que se encuentra parasitando poliquetos) (Fig. 24). Según HO (1991) se conocen unas 1570 especies pertenecientes al orden Poecilostomatoida que se encuentran agrupadas en 47 familias y todas ellas, a excepción de 5 planctónicas (Corycaeidae, Oncaeidae, Paralubbockiidae, Sapphirinidae y Urocopiidae), viven manteniendo relaciones interespecíficas más o menos estrechas con invertebrados marinos y peces. Capítulo 1 38 Figura 24. Variabilidad del habitus en el orden Poecilostomatoida (tomado de HUYS & BOXSHALL, 1991). Introducción 39 1.9. Infraclase Opisthobranchia: hospedadores de la familia Splanchnotrophidae. 1.9.1. Sistemática y generalidades de Opisthobranchia. Según BOUCHET et al. (2005) la infraclase Opisthobranchia (Mollusca, Gastropoda) se divide en diez ordenes: Acochlidiacea Odhner, 1937; Anaspidea Fischer, 1883; Cephalaspidea Fischer, 1883; Gymnosomata Blainville, 1824; Nudibranchia Cuvier, 1817; Pleurobranchomorpha Pelseneer, 1906; Runcinacea Burn, 1963; Sacoglossa Von Ihering, 1876; Thecosomata Blainville, 1824 y Umbraculida Odhner, 1939. La característica común que define a los opistobranquios es el proceso de la detorsión, en el cual se invierte parcial o totalmente la torsión de la masa visceral, cavidad paleal y ctenidio que se da en las primeras etapas del desarrollo embrionario de todos los gasterópodos. Esta inversión secundaria de la torsión ocurre tras el estadio de larva velíger y tiene importantes implicaciones anatómicas, ya que la cavidad paleal y los órganos asociados a ella rotan hacia la derecha e incluso pueden volver a la parte posterior del animal; como consecuencia, los conectivos viscerales se disponen de nuevo paralelamente (eutineuria). La reducción en diferentes grados o completa desaparición de la concha, ctenidios y cavidad del manto son también caracteres que comparten casi todos los opistobranquios. Además, poseen un par de tentáculos cefálicos, dos rinóforos exclusivos de estos moluscos, son hermafroditas y mayoritariamente marinos y bentónicos (THOMPSON & BROWN, 1984; BRUSCA & BRUSCA, 2005). El orden Nudibranchia conforma el grupo monofilético más numeroso y diverso dentro de los opistobranquios. Con unas 3000 especies, comprende aproximadamente la mitad de toda la subclase (THOMPSON & BROWN, 1984; WÄGELE & KLUSSMANN-KOLB, 2005). Se encuentra dividido en los subórdenes Dexiarchia Schrödl, Wägele & Willan, 2001 y Euctenidiacea Tardy, 1970. El suborden Dexiarchia engloba al infraorden Cladobranchia Sars, 1878; y el suborden Euctenidiacea engloba al infraorden Doridacea Thiele, 1931. A su vez, dentro del infraorden Cladobranchia se clasifican los parvórdenes Aeolidida Odhner, 1934; Dendronotida Odhner, 1934 y Euarminida Odhner, 1939 (BOUCHET et al., 2005). Cada uno de estos grupos presenta las siguientes características: Capítulo 1 40 - Infraorden Doridacea. Grupo más abundante dentro de los nudibranquios. Cuerpo protegido por un manto dorsal espiculoso que puede estar fuertemente recubierto de espículas o disponer de glándulas notales de secreción ácida o repugnatoria. Los rinóforos presentan capacidad de retracción o contracción, pero nunca existe vaina rinofórica. El ano se encuentra en posición posterodorsal, rodeado por una corona de branquias secundarias. - Parvorden Aeolidida. Se caracteriza por presentar ceratas fusiformes en filas dorsolaterales que portan ramas de la glándula digestiva y, en sus ápices, cnidosacos. Rinóforos contráctiles, pero sin vaina. - Parvorden Dendronotida. Cuerpo con dos líneas dorsolaterales de ceratas, que raramente albergan cnidosacos. La característica más definitoria de este grupo es la presencia alrededor de la base de los rinóforos de una vaina rinofórica, cuya función es la de protegerlos cuando el animal es molestado, retrayendo los rinóforos en su interior. - Parvorden Euarminida. La característica más destacable de este grupo son los pliegues respiratorios que se encuentran en complejas filas por debajo del borde del manto. La concha y el opérculo están ausentes en los nudibranquios, salvo en fase larvaria, lo cual representa el grado más desarrollado en la tendencia polifilética de los opistobranquios a la reducción de la concha. También desparecen por completo la cavidad paleal y la branquia de tipo ctenidio, lo que hizo necesaria la aparición de branquias secundarias contráctiles o retractiles en forma de anillo en el noto posterior del animal (infraorden Doridacea) u otras estructuras respiratorias secundarias: pliegues a lo largo del borde inferior del manto (parvorden Euarminida), y ceratas (parvórdenes Dendronotida y Aeolidida). Dentro del parvorden Dendronotida existen dos tipos de estructuras respiratorias: ceratas dendríticos de adquisición neomórfica en el género Tritonia Cuvier, 1798 y las pseudobranquias del género Doto Oken, 1815 en la base interior de los ceratas (THOMPSON & BROWN, 1984). Debido a la pérdida de la concha, los nudibranquios pudieron alcanzar a lo largo de su historia evolutiva una amplia diversidad anatómica y biológica al desembarazarse del rígido modelo corporal impuesto por esta pesada y limitante defensa pasiva (WÄGELE & KLUSSMANN-KOLB, 2005; WÄGELE et al., 2006). Dicha pérdida fue posible gracias a la aparición de nuevos y variados mecanismos de defensa (THOMPSON & BROWN, 1984): Introducción 41 - Defensas físicas. Muchos doridáceos presentan numerosas espículas en el tegumento (Fig. 25A). - Cleptonidia. Se observa en los aeolidáceos y consiste en la utilización de los nematocistos sin disparar de los cnidarios que depredan para usarlos en su propia defensa. Son incorporados, vía glándula digestiva, en unas estructuras llamadas cnidosacos, las cuales se encuentran en el ápice de los ceratas (Fig. 25B). - Defensas químicas. Corresponden a estructuras glandulares repugnatorias, como son las glándulas ácidas y las formaciones dermales del manto (MDFs, de sus siglas en inglés), que incorporan metabolitos secundarios tóxicos procedentes de sus presas o de síntesis propia. Estas estructuras se pueden encontrar dispersas por toda la superficie dorsal del manto (Fig. 25C) o en su borde. La enorme diversidad en cuanto a la anatomía y utilización de estas defensas químicas es otra de las facetas más típicas de los nudibranquios. WÄGELE et al. (2006) presuponen que las defensas glandulares tienen alguna implicación en la protección de los nudibranquios frente a las infecciones por parte de los esplancnotrófidos y en la especificidad hospedador-parásito, pero esta afirmación no ha podido ser comprobada. - Coloraciones crípticas y aposemáticas. En muchos casos, los nudibranquios son capaces de imitar de manera excepcional los colores y forma de los sustratos sobre los que se encuentran con el fin de pasar desapercibidos a los potenciales predadores (Fig. 25D). Por el contrario, los que poseen sistemas de defensa muy efectivos presentan coloraciones aposemáticas, muy llamativas, para advertir a los potenciales depredadores de la existencia de defensas químicas o de otra naturaleza. Capítulo 1 42 Figura 25. Diferentes estrategias defensivas de los nudibranquios. A. Entramado espicular del manto de Doris sp. B. Cerata con cnidosaco de Cuthona nana (Alder & Hancock, 1842). C. Glándulas repugnatorias (puntos marrones) de Discodoris stellifera Vayssiére, 1903. D. Cuthona nana (flecha blanca) camuflada entre el hidroideo colonial Hydractinia echinata (Fleming, 1828) (A: fotografía realizada al SEM; B-D: fotografías realizadas con microscopio estereoscópico). Introducción 43 1.9.2. Preferencias y especificidad de los esplancnotrófidos. Los componentes de la familia Splanchnotrophidae se encuentran parasitando varios ordenes de opistobranquios marinos, con diferentes preferencias según el género al que pertenezcan (HANCOCK & NORMAN, 1863; BERGH, 1868; CANU, 1891; HECHT, 1893, 1895; SCOTT & SCOTT, 1895; O’DONOGHUE, 1924; DELAMARE DEBOUTTEVILLE, 1950, 1951; BELCIK, 1981; HO, 1981; JENSEN, 1987, 1990; SCHRÖDL, 1997, 2002; HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b; ABAD et al., 2011; UYENO & NAGASAWA, 2012): - El género Splanchnotrophus parasita hospedadores del orden Nudibranchia, específicamente del infraorden Doridacea y del parvorden Aeolidida. - El género Lomanoticola infecta a especies de los parvórdenes Aeolidida y Dendronotida. - El género Ismaila presenta patrones de infección más amplios, utilizando como hospedadores, además de a representantes de todos los grupos de nudibranquios, también a algunas especies del orden Sacoglossa. - El género Ceratosomicola sólo se ha encontrado parasitando a miembros de la familia Chromodorididae Bergh, 1871. - El género Arthurius tiene como hospedadores únicamente a miembros del orden Sacoglossa. - El género Majimun parasita a especies de doridáceos del género Roboastra Bergh, 1877. También existen diferencias entre los esplancnotrófidos en cuanto a la especificidad hospedador-parásito, entendida como el número de especies de opistobranquios que una única especie de parásito puede infectar (HANCOCK & NORMAN, 1863; BERGH, 1868; CANU, 1891; HECHT, 1893, 1895; SCOTT & SCOTT, 1895; O’DONOGHUE, 1924; DELAMARE DEBOUTTEVILLE, 1950, 1951; BELCIK, 1981; HO, 1981; JENSEN, 1987, 1990; SCHRÖDL, 1997, 2002; HUYS, 2001; HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al., 2008a, b; ABAD et al., 2011; UYENO & NAGASAWA, 2012): - Géneros Ismaila, Arthurius y Ceratosomicola: la especificidad es muy elevada ya que en todos ellos una especie de parásito utiliza una única especie de hospedador (monoespecificidad), excepto Ismaila monstrosa que utiliza 4 especies de opistobranquios como hospedadores. - Género Splanchnotrophus: sus integrantes utilizan como hospedadores un mínimo de 2 especies de nudibranquios y un máximo de 4. Capítulo 1 44 - Género Lomanoticola: las 2 especies conocidas de este género presentan distintas especificidades en la elección de sus hospedadores, ya que Lomanoticola brevipes parasita a 7 especies pertenecientes a los infraordenes Aeolidida y Dendronotida, pero Lomanoticola insolens infecta a una única especie de dendronotáceos. - La única especie conocida del género Majimun tiene 2 hospedadores. Las diferencias de especificidad a la hora de elegir hospedador plantean dos modelos explicativos acerca de este fenómeno: - Existen dos estrategias opuestas dentro de la familia Splanchnotrophidae en lo que se refiere a la selección del hospedador: una es la que siguieron las especies monoespecíficas (monófagas) y otra es la que adoptaron las especies que poseen la capacidad de parasitar a múltiples hospedadores (polífagas). - Las especies polífagas son en realidad un complejo de varias especies crípticas con monoespecifidad. Se entiende por especies crípticas aquellas que han sido clasificadas bajo un mismo nombre debido a que se diferencian por caracteres anatómicos muy sutiles (BICKFORD et al., 2006), o aquellas en las que se produce estasis morfológica tras la especiación, lo que provoca que la divergencia genética continúe sin diferenciación anatómica (ROCHAOLIVARES et al., 2001). A causa de la escasa información disponible acerca de varios géneros de la familia Splanchnotrophidae y a que algunas de sus especies fueron descritas únicamente en base a la especificidad hospedador-parásito (HECHT, 1895; DELAMARE DEBOUTTEVILLE, 1950), este taxón es susceptible de albergar especies crípticas. En ese sentido, existen precedentes en otros taxones en los que el estudio de la divergencia genética de una especie supuestamente polífaga revela un complejo de varias especies crípticas monófagas (SMITH et al., 2006; DIPPENAAR et al., 2010). 1.10. Problemática de la famlia Splanchnotrophidae. A pesar de los avances en el conocimiento en los últimos años, la familia Splanchnotrophidae sigue siendo uno de los grupos de copépodos menos conocidos. Sólo existen datos anatómicos de ciertos taxones, lo que hace necesario ampliar esa información. Esto es más evidente en los dos géneros que se encuentran en Europa, Splanchnotrophus y Lomanoticola: aunque aparecen en las mismas áreas, la relación filogenética entre estos géneros es incierta, ya que la información anatómica disponible Introducción 45 sobre el género Lomanoticola es muy limitada. En la península Ibérica la presencia de ambos taxones únicamente ha sido constatada gracias a citas esporádicas - con la excepción de ABAD et al. (2011)- a pesar de que se encuentra situada entre las dos áreas de distribución europeas de los géneros Lomanoticola y Splanchnotrophidae (Noroeste de Europa y Mediterráneo occidental). Generalmente, los trabajos sobre la morfología de las especies de la familia Splanchnotrophidae se limitan a unos pocos ejemplares por la dificultad y aleatoriedad de su recolección. En el caso de la presente memoria, por primera vez se puede afrontar el estudio amplio de algunas especies de los géneros Lomanoticola y Splanchnotrophus gracias a la recolección de individuos mediante buceo con escafandra autónoma a lo largo de 5 años y a la disponibilidad de un gran número de opistobranquios pertenecientes a la colección “Opistobranquios de Galicia” del profesor Victoriano Urgorri. 1.11. Antecedentes. Antes comenzar la recolección de ejemplares se realizó un estudio preliminar para determinar cuáles podrían ser las especies de la familia Splanchnotrophidae presentes en el área de estudio, y qué especies de opistobranquio podrían ser sus hospedadoras. Mediante una revisión bibliográfica se identificaron los géneros de la familia Splanchnotrophidae con una distribución compatible con el área de estudio y las especies de opistobranquios descritas como hospedadoras con presencia en las rías de Ferrol y Ares (ORTEA & URGORRI, 1978; ORTEA & URGORRI, 1981; URGORRI & BESTEIRO, 1984; HUYS, 2001; ABAD et al., 2011; URGORRI et al., 2011). Con el fin de ampliar el rango de opistobranquios potencialmente parasitados por los copépodos, se tuvieron en cuenta aquellas especies distribuidas en el área de estudio que muestran proximidad taxonómica, en las categorías de género y familia, con las especies de opistobranquio citadas como hospedadoras de la familia Splanchnotrophidae. Se comprobó que los géneros Doto y Lomanotus Vérany, 1844 del parvorden Dendronotida y las familias Aeolidiidae Gray, 1827, Eubranchidae Odhner, 1934, Flabellinidae Bergh, 1889 y Glaucidae Gray, 1827 del parvorden Aeolidida son los taxones con mayor potencial para albergar tanto especies del género Lomanoticola como del género Splanchnotrophus. En el mismo sentido, se encontró que especies de las familias Goniodorididae H. Adams & A. Adams, 1854 y Onchidorididae Gray, 1827 Capítulo 2. Área de estudio Área de estudio 55 Figura 26. Mapa del Golfo Ártabro. 2.1. Localización. Las rías de Ferrol y de Ares se encuentran situadas en el NW de la Península Ibérica y forman parte, junto con la Ría de Coruña, del Golfo Ártabro (Fig. 26). Capítulo 2 56 2.1.1. Ría de Ferrol. La Ría de Ferrol se encuadra entre los paralelos 43º27’ y 43º30’ de latitud norte y entre los meridianos 008º09’ y 008º21’ de longitud oeste. Su orientación sigue el eje NEEWSW, con una longitud de unos 15 km y una superficie de 21 km2. Con marea baja el volumen de agua que alberga es de 208 hm3 y con marea alta de 290 hm3 (DE CASTRO et al., 2004). La Ría de Ferrol se puede dividir en 5 zonas (DE CASTRO et al., 2004). - La primera de ellas, la más externa, se encuentra entre el Cabo Prioriño y la Punta Coitelada, que forman la boca de la ría. Se orienta hacia el SW y tiene una anchura de 2,2 km. La profundidad máxima fluctúa entre 31 m durante la marea baja y 35 m en la alta. Los fondos son sedimentarios, de arenas finasmedias. - La segunda corresponde al característico canal de entrada, que se extiende desde la Punta de Rabo da Porca hasta la Punta do Vispón. Posee una longitud de 2 km, una anchura de 0,5 km y una profundidad media de 20 m. Los fondos están dominados por arenas medias-gruesas y cascajos de origen biológico, con afloramientos de bolos de granito. Por su singular morfología, en la zona del canal se producen durante el flujo y reflujo de la marea unas fuertes corrientes de 0,5 m/s de velocidad. Gracias a la presencia de estas corrientes y a la renovación de agua que conllevan, se ve favorecido el asentamiento en los afloramientos rocosos de organismos sésiles, sobre todo de los filos poríferos y cnidarios, de comunidades epibiontes que habitan sobre la roca y de agrupamientos de Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 (VARELA et al., 2009). - La tercera zona es la intermedia, que discurre desde la Punta do Vispón hasta el puente de As Pías. La anchura es de 2,3 km, la profundidad media de 15 m y la corriente disminuye a velocidades de 0,1 m/s. Los fondos son sedimentarios, formados en su mayoría por sustratos fangosos ricos en materia orgánica. En esta zona se encuentra la ensenada de A Malata, que se interna aproximadamente 2 km en dirección NNE desde el brazo principal de la ría. - La cuarta zona, la interna, es la que va desde el puente de As Pías hasta el puente de la Faísca, con fondos sedimentarios fangosos. - La última de las zonas es la parte estuarina de la ría y se caracteriza por el aporte de agua dulce procedente del Río Xubia y del Río Belelle. Área de estudio 57 2.1.2. Ría de Ares. La Ría de Ares está situada entre las rías de Ferrol y Coruña siguiendo un eje SE-NW y enmarcada entre los paralelos 43º19’ y 43º24’ de latitud norte y entre los meridianos 008º12’ y 008º18’ de longitud oeste. Presenta una longitud de 13,5 km, desde la desembocadura del Río Mandeo hasta la boca de la ría, ocupa un área de unos 272,6 km2 y las profundidades varían entre 2 y 43 m. La velocidad de las corrientes mareales alcanza en algunos puntos los 0,89 m/s (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). Se puede dividir en tres zonas: - La zona este es la más interna y se corresponde con la desembocadura del Río Mandeo, el cual representa el principal aporte de agua dulce de este área, al que hay que sumar el que realizan, en menor medida, los ríos Mendo y Lambre. Presenta 7 km de longitud, 5 km de ancho y las profundidades varían de los 2 a los 12m. Los sedimentos que predominan son las arenas fangosas de origen continental. Río arriba se encuentra una de las marismas más importantes de Galicia, que se extiende desde la ciudad de Betanzos hasta el puente de O Pedrido (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). Al NE del brazo principal de la ría está la desembocadura del Río Eume, que realiza también importantes aportes de agua dulce. La longitud es de 5 km, el ancho de 2 km y la profundidad oscila entre los 2 y los 6 m. Los fondos se componen mayoritariamente de arenas fangosas (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). - La zona de confluencia de ambas desembocaduras se corresponde con la zona central de la Ría de Ares. La profundidad es de 10-12 m y los fondos son suaves y aplanados. Los sedimentos son arenas finas-medias de procedencia continental y oceánica (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). - La boca de la ría, expuesta a la influencia oceánica, tiene una longitud de unos 5 km, 4,5 km de ancho y profundidades que oscilan entre los 20 y los 35m. Los fondos de las orillas norte y sur son rugosos debido a la existencia de importantes afloramientos rocosos de esquistos y cuarzos, que presentan una pronunciada pendiente en dirección al canal central de la bocana; los sedimentos predominantes son gravas y arenas gruesas y medias de origen oceánico. En el canal central de la bocana los fondos son aplanados y están Capítulo 2 58 compuestos en su mayoría por limos y arcillas (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). Las aguas oceánicas penetran en la ría por su margen sur para luego dividirse en dos corrientes: una que continúa paralela al margen sur hasta mezclarse con las aguas que aporta el Río Mandeo; y otra que gira al norte a la altura de la ensenada de Ares y que discurre paralela al margen norte de la ría en dirección a su bocana. Cuando se encuentran con los afloramientos rocosos de los márgenes norte y sur, estas corrientes de origen oceánico, al igual que ocurre con las de origen mareal, experimentan importantes aceleraciones en su velocidad (ASENSIO & GRAJAL, 1981; SÁNCHEZ-MATA et al., 1999). 2.2. Estaciones de muestreo. La recolección de ejemplares se desarrolló entre los años 2009-2014, realizándose un total de 159 inmersiones en 21 estaciones diferentes, 18 en la Ría de Ferrol y 3 en la de Ares (Fig. 27, Tabla 2) durante todos los meses del año. En la Tabla 2 se indican únicamente las fechas de los muestreos realizados en las estaciones en las que aparecieron esplancnotrófidos, incluyendo los hechos por el profesor V. Urgorri para la colección “Opistobranquios de Galicia”. Área de estudio 59 Figura 27. Estaciones de muestreo, señaladas por un círculo rojo. Capítulo 2 60 Estación Fecha muestreo E7 20/08/1986 26/08/1986 22/07/2013 23/07/2013 E8 22/08/1996 E10 23/08/1992 09/08/2012 26/04/2013 17/01/2014 10/03/2014 09/05/2014 27/08/2014 03/09/2014 02/10/2014 17/11/2014 E11 22/08/2013 28/05/2014 03/09/2014 E12 14/05/2014 21/05/2014 26/05/2014 E13 11/06/2014 E14 02/08/1992 21/08/1992 23/08/1992 01/08/1996 05/08/1996 05/08/2009 24/05/2010 20/09/2010 30/07/2013 31/07/2014 E15 11/07/2012 E17 30/07/2012 E18 17/07/2014 E20 12/07/2012 19/06/2013 03/07/2013 10/07/2013 18/06/2014 19/06/2014 15/07/2014 23/07/2014 08/08/2014 Tabla 2. Fechas de muestreos en las estaciones en las que se encontraron es p lancnotrófidos. Área de estudio 61 008º 16´ 43º 28´ 1 K m Ría de Ares Ría de Ferrol E7 Figura 28. Localización de la estación E7 en la Ría de Ferrol. A continuación se describen solamente aquellas estaciones en las que se recolectaron nudibranquios parasitados por especies de la familia Splanchnotrophidae. Estación E7 Situación: Punta da Redonda (Ría de Ferrol). Coordenadas: 43°27,827'N; 008°16,237'W. Descripción: Profundidad entre 12-15 m. Fondo de arena gruesa con afloramientos de pequeños bolos de granito sobre los que se asientan diversas especies de hidrozoos. También abundan las especies de los géneros Laminaria J.V. Lamouroux, 1813 y Saccorhiza Eimer & Fickert, 1899. Las corrientes mareales son intensas. Capítulo 2 68 008º 16´ 43º 28´ 1 K m Ría de Ares Ría de Ferrol E15 Figura 35. Localización de la estación E15 en la Ría de Ferrol. Estación E15 Situación: Punta Segaño (Ría de Ferrol). Coordenadas: 43°27,111'N; 008°18,783'W. Descripción: Profundidad entre 10-12 m. Fondo rocoso con paredes verticales sobre las que abundan Laminaria spp., poríferos y cnidarios. Área de estudio 69 008º 16´ 43º 28´ 1 K m Ría de Ares Ría de Ferrol E17 Figura 36. Localización de la estación E17 en la Ría de Ferrol. Estación E17 Situación: Dique de abrigo del Puerto exterior de Ferrol (Ría de Ferrol). Coordenadas: 43°27,383'N; 008°20,039'W. Descripción: Profundidad entre 20-22 m. Bloques de hormigón sobre los que crecen diferentes especies de poríferos y cnidarios. Capítulo 2 70 008º 16´ 43º 28´ 1 K m Ría de Ares Ría de Ferrol E18 Figura 37. Localización de la estación E18 en la Ría de Ferrol. Estación E18 Situación: Pieiro Pequeno (Ría de Ferrol). Coordenadas: 43°27,475'N; 008°20,380'W. Descripción: Profundidad entre 18-20 m. Abundantes afloramientos de bolos de granito de tamaño medio y grande, estos últimos con paredes verticales sobre las que se asientan Laminaria spp. en los primeros metros, poríferos y cnidarios. Área de estudio 71 008º 16´ 43º 28´ 1 K m Ría de Ares Ría de Ferrol E20 Figura 38. Localización de la estación E20 en la Ría de Ares. Estación E20 Situación: Punta do Areoso (Ría de Ares). Coordenadas: 43°26,109'N; 008°18,222'W. Descripción: Profundidad entre 23-25m. Fondo rocoso de esquisto que forma paredes verticales. Sobre ellas aparecen Laminaria spp. en los primeros metros, poríferos y cnidarios (especialmente hidrozoos). Capítulo 3. Material y Métodos Material y Métodos 75 3.1. Muestreo, fijación y disección de ejemplares. 3.1.1. Muestreo. El muestreo de los opistobranquios se realizó mediante buceo con escafandra autónoma (Fig. 39). Aquellos individuos que se encontraron sobre poríferos o ascidias se introdujeron directamente en botes de plástico individuales, mientras que en el caso de las especies que se alimentan de hidrozoos fueron éstos los que se guardaron en los botes. A mayores de las especies señaladas como hospedadoras potenciales mediante el estudio preliminar y la revisión de la colección “Opistobranquios de Galicia”, en cada inmersión se recolectaron todos los opistobranquios que se encontraron en las localidades de muestreo. Una vez en el laboratorio se separaron del sustrato recolectado los opistobranquios con la ayuda de un microscopio estereoscópico Olympus SZ 40, y se procedió a su Figura 39. Inmersión subacuática para la toma de fotografías y recolección de ejemplares. Capítulo 3 76 Figura 40. Recipientes para la conservación de nudibranquios en acuarios. A. Malla de 250 µm. B. Malla de 40 µm para la recolección de larvas nauplius. identificación. A continuación se clasificaron en función de la presencia o ausencia de sacos ovígeros del copépodo u otro signo evidente de infección. Los opistobranquios que no presentaban sacos ovígeros se introdujeron vivos en acuarios con agua de mar circulante, dentro de recipientes de PVC cuyas tapas estaban cerradas con malla de 250 µm de luz (Fig. 40A). Durante una semana los hospedadores se observaron diariamente con la finalidad de detectar nuevas infecciones mediante la presencia de sacos ovígeros. Material y Métodos 77 Los nudibranquios infectados fueron fotografiados con una cámara Olympus CAMEDIA C-5050 acoplada a un microscopio estereoscópico Olympus SZX12. Los hospedadores con sacos ovígeros de tamaño considerable fueron seleccionados para obtener las larvas nauplius de los copépodos. Esto se logró manteniendo vivos a los nudibranquios en acuarios con agua de mar circulante, separados individualmente en tubos de PVC transparente con tapas hechas de malla de 40 µm de luz (Fig. 40B). De esta manera los huevos del parásito se desarrollaron con normalidad hasta su eclosión, tras la cual las larvas nauplius quedaron atrapadas en el interior de los tubos. Los recipientes fueron lavados diariamente para recolectar las larvas, con la ayuda de una pipeta Pasteur. 3.1.2. Fijación. Para la fijación de los nudibranquios parasitados se utilizaron 3 métodos diferentes según el tipo de estudio que se iba a realizar de cada ejemplar de parásito: - Etanol 96º para estudios moleculares. - Etanol 70º para estudios anatómicos. - Líquido de Bouin y formol al 4% para estudios anatómicos e histológicos. En el caso de los nudibranquios destinados a estudios anatómicos e histológicos se realizó una relajación previa con MgCl2 al 7% durante al menos 2 horas. La finalidad de este proceso fue evitar contracciones corporales debidas al contacto con el medio de fijación, de manera que tanto los nudibranquios como los copépodos que albergaban se encontrasen en condiciones ideales para la posterior extracción y estudio del parásito. 3.1.3. Disección. Para obtener los copépodos se realizó la disección de los nudibranquios infectados bajo el microscopio estereoscópico Olympus SZ 40. Se practicó una incisión transversal a lo largo del pie del hospedador y se extrajeron los ejemplares del parásito, que posteriormente fueron fotografiados con una cámara Olympus CAMEDIA C-5050 acoplada a un microscopio estereoscópico Olympus SZX12 y conservados en el mismo medio de fijación que el nudibranquio del que fueron extraídos. En cada caso se anotó la posición en el hospedador, número, sexo y estadío vital del parásito, así como el estado en que se encontraban las vísceras del nudibranquio en búsqueda de efectos negativos detectables. Capítulo 3 84 Especie Código Hospedador Estación Material Ismaila robusta IROB7 Phidiana lottini Valdivia (Chile) Secuencia cedida por R. Anton Ismaila robusta IROB8 Phidiana lottini Valdivia (Chile) Secuencia cedida por R. Anton Lomanoticola sp. LOM27 Cuthona caerulea Banyuls (Francia) Secuencia cedida por R. Anton Ceratosomicola mammilata CERMA1 Goniobranchus geometricus (Ribsec, 1928) Sulawesi (Indonesia) Secuencia cedida por R. Anton Clausocalanus minor Sewell, 1929 AF462313 ― Pacífico Norte Adulto 3.2.3. Análisis de secuencias. Las secuencias COX1 disponibles de los copépodos analizados en cada una de las especies de nudibranquios hospedadores se sometieron a diferentes análisis filogenéticos utilizando el programa informático MEGA v6 (TAMURA et al., 2013) (Fig. 43B). Inicialmente se obtuvo una matriz de distancias genéticas entre pares de secuencias, en la que se muestra el porcentaje de diferencias en bases de las secuencias del gen COX1 entre los individuos estudiados. Estas distancias genéticas básicas intraespecíficas e interespecíficas fueron estimadas en MEGA v6 como distancias-p (NEI & KUMAR, 2000). La inferencia de las relaciones filogenéticas entre los individuos analizados se obtuvo mediante la selección del modelo evolutivo más ajustado a los datos y la elaboración de un árbol filogenético basado en Neighbor-Joining (NJ), con una evaluación de los nodos por bootstrapping con 2000 réplicas en MEGA v6 (TAMURA et al., 2013). También se incluyeron secuencias de especies del género Ismaila y de la especie Splanchnotrophus angulatus, (ANTON et al., en prensa), usándose como grupo externo la especie Clausocalanus minor (Calanoida: Clausocalanidae) (código de acceso en GenBank AF462313, BUCKLIN et al., 2003). Material y Métodos 85 Figura 43. Programas informáticos utilizados en el análisis de las secuencias. A. Tratamiento de electroferograma con el programa BioEdit. B. Análisis de distancias con el programa Mega v6. Capítulo 3 86 3.3. Microscopía. 3.3.1. Scanning Electron Microscope (SEM). En un primer paso se eliminaron los tejidos del hospedador de los especímenes de copépodo con un limpiador ultrasónico Branson 3510, sumergidos durante 3 minutos en agua con un detergente orgánico. Una vez despojados de cualquier resto orgánico, los ejemplares de copépodo seleccionados para la observación mediante SEM se prepararon con 2 métodos diferentes: - Debido al excesivo replegamiento de la superficie corporal observado al seguir el método de deshidratación con acetona descrito por los primeros investigadores en usar el SEM (HAUMAYR & SCHRÖDL, 2003; SALMEN et al. 2008a, b), se desarrolló una nueva metodología basada en la liofilización: tras una inmersión en N2 líquido durante al menos 10 minutos, los especímenes fueron liofilizados durante un mínimo de 12 minutos en un liofilizador Telestar Cryodos-50. - Al observarse que, debido a su pequeño tamaño, con la metodología anterior se producía la pérdida de algunos machos del copépodo se empleó el protocolo descrito por BRAET et al. (1997) para la deshidratación con hexametildisilazano: tras una inmersión de los copépodos durante 2 horas en dicho compuesto, se dejó que secasen durante 14 horas. Una vez transcurrido ese tiempo se montaron los ejemplares en un portaobjetos de SEM. Los especímenes se recubrieron con oro, y a continuación fueron observados en un microscopio SEM Zeiss EVO LS15 y se tomaron fotos de las estructuras con valor taxonómico. 3.3.2. Microscopía óptica. Las estructuras pequeñas con valor taxonómico de los ejemplares de copépodo que se encontraban en mejor estado se observaron con un microscopio óptico Olympus CX41. El SEM presenta el inconveniente de que algunas estructuras pueden estar cubriendo a otras, haciéndolas indetectables mediante esta técnica. Para resolverlo se realizaron dibujos con una cámara clara acoplada a un microscopio óptico Olympus BX51 (Fig. 44A). Previamente los ejemplares fueron diseccionados bajo un microscopio estereoscópico Olympus SZX12 con una punta de tungsteno y las diferentes partes se montaron en un portaobjetos utilizando como medio de preparación glicerina. Material y Métodos 87 Figura 44. A. Proceso de dibujado de los especímenes con cámara clara. B. Equipo utilizado p ara la di g italización de los dibu j os. Los dibujos se escanearon en un escáner Konica Minolta C353 Series PCL y se digitalizaron con el programa Adobe Ilustrator versión CS5 con la ayuda de una pen Tablet Wacom Intuos Pro M (Fig. 44B). En algunos casos se tomaron microfotografías de estructuras con valor taxonómico, mediante una cámara Olympus DP12 acoplada a un microscopio óptico Olympus BX51. Capítulo 3 88 3.4. Material estudiado. En total se recolectaron un total de 127 hembras y 64 machos de la especie Lomanoticola sp. nov., que fueron estudiados mediante técnicas de microscopía de la siguiente manera: - SEM: 6 hembras (2 encontradas en Doto lemchei, 2 en Doto koenneckeri, 1 en Doto pinnatifida y 1 en Eubranchus sp.) y 4 machos (1 en Doto lemchei, 1 en Doto koenneckeri, 1 en Doto pinnatifida y 1 en Eubranchus sp.). - Dibujos en cámara clara: 9 hembras (4 en Doto lemchei, 2 en Doto koenneckeri, 2 en Doto pinnatifida, y 1 en Eubranchus sp.) y 4 machos (1 en Doto lemchei, 1 en Doto koenneckeri, 1 en Doto pinnatifida y 1 en Eubranchus sp.). Además, 22 hembras de la especie Lomanoticola sp. nov. fueron empleadas para el estudio molecular En el caso de la especie Splanchnotrophus gracilis, se recolectaron un total de 139 hembras y 118 machos, de los cuales 8 hembras y 6 machos fueron examinados al SEM. Por otra parte, 4 hembras de esa especie se destinaron al estudio molecular. 3.5. Terminología. La terminología seguida fue tomada de HUYS & BOXSHALL (1991), HUYS (2001) y HAUMAYR & SCHRÖDL (2003). Los especialistas en el estudio de los copépodos emplean una serie de términos que describen la segmentación del cuerpo y de los apéndices que, dada la particular anatomía externa de las hembras adultas de la familia Splanchnotrophidae, fueron de gran ayuda a la hora de determinar la segmentación corporal. A continuación se citan los más importantes (HUYS & BOXSHALL, 1991; HUYS, 2001): - Alobase: Segmento compuesto derivado de la fusión del basipodito y del primer segmento endopodal. - Apéndices cefálicos: Cada uno de los apéndices que se encuentran en los somitos cefálicos. Son, del 1º al 5º: anténula, antena, mandíbula, maxílula y maxila. - Artejo: Segmento de un apéndice cefálico. - Basipodito: Segmento distal del protopodito. - Cefalosoma: Segmento compuesto formado por los 5 somitos cefálicos (cada uno con un par de apéndices cefálicos) y el 1er somito torácico. Material y Métodos 89 - Cefalotórax: Unión de los 5 somitos cefálicos y de al menos el 1er y 2º somitos torácicos. Se encuentran cubiertos por el escudo cefálico. - Coxopodito: 2º segmento del protopodito. - Coxobase: Segmento compuesto formado por la fusión del coxopodito y del basipodito. - Endopodito: Rama interna de un apéndice birrámeo. - Epipodito: Lóbulo del borde externo del coxopodito. - Espina: Elemento de ornamentación rígido, insertado en el tegumento a través de un agujero. - Exopodito: Rama externa de un apéndice birrámeo. - Genitoabdomen: Tagma formado por la fusión del somito genital y de los somitos abdominales. - Gnatobase: Epipodito coxal de la mandíbula, con un borde distal en forma de cuchilla. - Maxilípedo: 1 er apéndice torácico (toracópodo), se encuentra en el último segmento del cefalosoma. Por regla general aparece modificado como apéndice alimenticio, pero la familia Splanchnotrophidae carece de él (HO, 1987). - Precoxa: 1er segmento del protopodito. - Prosoma: Región corporal anterior a la articulación mayor. - Protopodito: Parte basal de un apéndice, que generalmente comprende la precoxa, coxopodito y basipodito. - Ramas caudales: Par de apéndices que se encuentran en la superficie posterior de somito anal. Las sedas que aparecen en esta estructura se numeran mediante números romanos. - Seda: Elemento de ornamentación flexible, insertado en el tegumento a través de un agujero. - Sincoxa: Artejo doble formado por la fusión de la precoxa y del coxopodito. - Somito: Un segmento corporal. - Somito genital: 7º somito torácico, con las aperturas genitales. - Somito pedígero: Somito torácico portador de un par de patas natatorias. Su nomenclatura se abrevia como P1-P5. - Toracópodo: Apéndice torácico. En copépodos comprende del 1er al 5º apéndices natatorios (abreviados como L1-L5), que son el 2º, 3er, 4º, 5º y 6º apéndices torácicos. - Urosoma: Región corporal posterior a la articulación mayor. Capítulo 4. Resultados Resultados 93 4.1. Introducción. El capítulo de los resultados se estructura en tres apartados: estudio anatómico, análisis molecular y biología de los parásitos. En el ESTUDIO ANATÓMICO se presenta la diagnosis de cada género con las referencias bibliográficas correspondientes. De cada una de las especies se describen detalladamente los adultos de ambos sexos. En primer lugar se describe la segmentación corporal y cada uno de los apéndices cefálicos, toracópodos y ramas caudales, acompañados de fotografías al SEM y, en su caso, por dibujos realizados con cámara clara. A continuación se describen los caracteres del dimorfismo sexual y de la variabilidad intraespecífica. Tras la descripción de los adultos, se describen las larvas nauplius con la ayuda de dibujos realizados con cámara clara. Finalmente se realiza una discusión de los resultados obtenidos con la bibliografía científica pertinente. En el apartado del ANÁLISIS MOLECULAR se estudian las secuencias del gen COX1 de un total de 10 especies pertenecientes a los géneros Lomanoticola, Splanchnotrophus, Ismaila y Ceratosomicola de la familia Splanchnotrophidae; y de la especie Clausocalanus minor, que fue seleccionada como grupo externo. En primer lugar se analizan las distancias genéticas intraespecíficas e interespecíficas de los diferentes taxones, las cuales se reflejan en sendas tablas. A continuación, se realiza una reconstrucción filogenética basada en distancias mediante el método de NeighborJoining, obteniendo un árbol filogenético en el que se agrupan las diferentes secuencias en clados concretos según su afinidad. Finalmente, en el apartado de la BIOLOGÍA de los parásitos, se exponen los datos obtenidos sobre los siguientes parámetros: distribución geográfica de las especies estudiadas, opistobranquios infectados por las diferentes especies, tasas de infección, carga parasitaria, tamaño de los hospedadores, posición en el interior de los nudibranquios, efectos negativos detectados y presencia estacional de la infección. Parte de los resultados referidos a la anatomía y biología de Splanchnotrophus gracilis ya han sido publicados en ABAD et al. (2011). Capítulo 4 100 Figura 47. Hembra de Lomanoticola sp. nov. A. Vista ventral del cuerpo. B. Urosoma. C. 2º toracópodo. D. 3 er toracópodo (al: apéndices laterales; en: endopodito; ex: exopodito; ga: genitoabdomen; se: sedas; trc: toracópodos). Fotografías realizadas al SEM. Figura 46. Esquema de la segmentación de la hembra de Lomanoticola sp. nov. El tamaño de las proporciones corporales no se corresponde con el real (A-: somito abdominal; C-: somito cefálico; T-: somito torácico). T4+T5 T6 T7+A1 Cefalosoma Genitoabdomen Prosoma Urosoma T2 T3 C2 C3 C4 C5 T1 C1 Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 101 Figura 48. Hembra de Lomanoticola sp. nov. A. Cefalosoma. B. Anténula. C. Antena. D. Detalle del ápice mandibular dentado (flecha negra) (aa: antena; an: anténula; cb: coxobase; 1en: 1er artejo endopodal; 2en: 2º artejo endopodal; la: labium; lr: labrum; ma: maxila; md: mandíbula). Fotografías realizadas al SEM. Capítulo 4 102 Apéndices cefálicos (Fig. 48A): Anténula con 4 artejos de segmentación poco marcada entre los artejos 2º, 3º y 4º; únicamente detectable por constricciones que indican la segmentación ancestral. 1er artejo con 2 espinas robustas recurvadas hacia el ápice, 2º artejo con 2 espinas (una robusta en la base y recurvada hacia el ápice, y otra más delgada y alargada en la parte distal) y una 1 larga en el borde externo de artejo. 3er artejo con 2 sedas pequeñas en la parte dorsal y 1 seda más larga en el borde externo. 4º artejo con 2 sedas cortas y 1 notoriamente más larga y ancha en la parte interna de la porción medial, finalizado por 8-12 sedas largas y delgadas situadas en posición apical (Fig. 48B, Fig. 49). Antena falciforme con 3 artejos, que se corresponden con la coxobase y con el endopodito, de 2 artejos. Coxobase con 1 espina robusta y pinnada; artejo proximal del endopodito también con 1 espina robusta pero de menor porte que la de la coxobase; artejo distal del endopodito (3er artejo de la antena) recurvado, lo que le confiere al apéndice su aspecto falciforme. Este artejo presenta 4 elementos de ornamentación: 1 espina en el borde externo, 2 sedas alargadas en la superficie dorsal (una a la altura de la espina del borde externo y la otra más distal), y 1 seda más fina y larga en el borde externo orientada tangencialmente a la curvatura de la antena. Presenta 2 orificios en el borde interno de la porción distal del 3er artejo (uno de ellos en la base de una de las sedas) (Fig. 48C, Fig. 50). Labrum con dos abultamientos dirigidos lateralmente, sin ornamentación (Fig. 48A, Fig. 51). Labium circular, con dos áreas circulares recubiertas de sédulas de pequeño porte. Un par de paragnatos en la parte superior, también con sédulas (Fig. 48A, Fig. 51). Mandíbula recorrida en la zona media por una línea algo más elevada que la superficie del apéndice; gnatobase pequeña, recurvada apicalmente y con 4 ó 5 procesos dentiformes (Fig. 48D, Fig. 51). Maxílula no observada. Maxila con 2 artejos: sincoxa (fusión de la precoxa y del coxopodito) ancha y sin ornamentación; alobase (fusión del basipodito y del primer segmento endopodal) pequeña, con 1 espina y 1 seda que se va estrechando hacia el ápice (Fig. 48A, Fig. 51). Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 103 Figura 49. Anténula izquierda de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (A-: artejo de la anténula). 10µm A1 A4 A3 A2 Capítulo 4 104 Figura 50. Antena derecha de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (cb: coxobase; en: artejo endopodal es: espina; se: seda). 10µm cb 1en 2en es se Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 105 Figura 51. Piezas bucales de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (alb: alobase; es: espina; la: labium; lr: labrum; ma: maxila; md: mandíbula; pa: paragnato; scx: sincoxa; se: seda). 10µm lr la md ma pa es se scx alb Capítulo 4 106 Toracópodos: 1er par de toracópodos ausente. 2º par de toracópodos birrámeo. Endopodito mucho menor que el exopodito, con apariencia espinosa y finalizado con 1 pequeña espina apical. Exopodito con dos constricciones: una en la parte medial y otra en la distal; la parte distal se va estrechando y recurvando apicalmente en forma de gancho. La ornamentación consta de 1 seda muy desarrollada en el borde externo del protopodito y 3 sedas pequeñas en el borde externo del exopodito, 1 en la zona medial y 2 en la zona distal (Fig. 47C, Fig. 52). 3er par de toracópodos birrámeo. Endopodito mucho más pequeño que el exopodito, pero de mayor tamaño que el endopodito del 2º par de toracópodos. Exopodito con ornamentación formada por 1 seda en el protopodito (más pequeña que la del 2º toracópodo), 3 pequeñas sedas de apariencia espinosa en el borde externo del exopodito y 1 seda más pequeña que las anteriores en el borde interno, a la altura de la 2ª espina del borde externo (Fig. 47D, Fig. 53). 4º par de toracópodos representado por un proceso cónico con 1 seda apical (Fig. 47B, Fig. 54). Ramas caudales (Fig. 55): Ramas caudales pequeñas y robustas, entre las que se encuentra la abertura anal. Seda V mucho más larga que las demás y espatulada, con el ápice pinnado. Seda VII también bien desarrollada, con ¼ de la longitud de la V, se dirige hacia el margen interior. El resto de sedas, situadas en la parte dorsal, son pequeñas y en algún caso de apariencia espinosa. Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 107 Figura 52. 2º toracópodo derecho de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (en: endopodito; ex: exopodito; se: seda). 10µm en ex se Capítulo 4 108 Figura 53. 3 e r toracópodo derecho de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (en: endopodito; ex: exopodito; se: seda). 14µm en ex se Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 109 Figura 54. 4º toracópodo derecho de la hembra de Lomanoticola sp. nov. (T4: 4º somito torácico). 10µm T4 Capítulo 4 116 Figura 60. Antena izquierda del macho de Lomanoticola sp. nov. (cb: coxobase; en: artejo endopodal; es: espina; se: seda). 10µm cb 1en 2en es se Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 117 Figura 61. Piezas bucales del macho de Lomanoticola sp. nov. (alb: alobase; es: espina; la: labium; lr: labrum; ma: maxila; md: mandíbula; pa: paragnato; scx: sincoxa; se: seda). 10µm lr la md ma pa esse scx alb Capítulo 4 118 Toracópodos: 1er par de toracópodos ausente. 2º par de toracópodos birrámeo, muy similar al de la hembra. Endopodito mucho menor que el exopodito, con apariencia espinosa y finalizado con 1 pequeña espina apical. Exopodito con 2 constricciones: una en la parte media, menos marcada que la de la hembra, y otra en la distal; la parte distal se va estrechando y recurvando apicalmente en forma de gancho. La ornamentación consta de 1 seda muy desarrollada en el borde externo del protopodito y 3 sedas pequeñas en el borde externo del exopodito, 1 en la zona medial y 2 en la zona distal(Fig. 57B, Fig. 62). 3er par de toracópodos birrámeo. Endopodito mucho más pequeño que el exopodito, pero de mayor tamaño que el endopodito del 2º par de toracópodos. Exopodito con ornamentación formada por 1 seda en el protopodito (más pequeña que la del 2º toracópodo), 3 pequeñas sedas de apariencia espinosa en el borde externo del exopodito y 1 seda más pequeña que las anteriores en el borde interno, a la altura de la 2ª espina del borde externo. Como se puede observar, la estructura de este apéndice es igual a la de la hembra, diferenciándose únicamente en el protopodito, más largo en el macho (Fig. 57C, Fig. 63). 4º par de toracópodos más simple que en caso de la hembra, representado por un pequeño proceso sedoso en el borde externo del 4º somito torácico (Fig. 64). Ramas caudales (Fig. 58D, Fig. 65): Iguales a las de la hembra, con la apertura anal entre ellas. Son pequeñas y robustas, la seda V es mucho más larga que las demás y espatulada, con el ápice pinnado. Seda VII también bien desarrollada, con ¼ de la longitud de la V, se dirige hacia el margen interior. El resto de sedas, situadas en la parte dorsal, son pequeñas y en algún caso de apariencia espinosa. La única diferencia entre ambos sexos se encuentra en la seda V, que en el caso del macho está más desarrollada y más profusamente espinulada en el ápice. Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 119 Figura 62. 2º toracópodo izquierdo del macho de Lomanoticola sp. nov. (en: endopodito; ex: exopodito; se: seda). 10µm en ex se Capítulo 4 120 Figura 63. 3 e r toracópodo derecho del macho de L omanoticola sp. nov. (en: endopodito; ex: exopodito; se: seda). 10µm en ex se se Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 121 Figura 64. 4º toracópodo izquierdo del macho de L omanoticola s p . nov. ( T4: 4º somito torácico ) . 10µm T4 Capítulo 4 122 Figura 65. Vista ventral del somito genital, somito anal y ramas caudales del macho de Lomanoticola sp. nov. (I-VII: sedas de las ramas caudales; og: opérculo genital; sa: somito anal; sel: sédulas; sg: somito genital). 10µm sel I V VI IV III II VII og sa sg Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 123 Dimorfismo sexual: Muy marcado tanto en la anatomía externa como en la segmentación corporal. 4º toracópodo del macho más reducido que el de la hembra. Seda V de las ramas caudales de la hembra más reducida que la del macho. Apéndices cefálicos iguales, excepto por el surco que existe en el labium del macho. Respecto a la maxílula, presente en el macho de Lomanoticola sp. nov., cabe señalar que su observación se plantea difícil por encontrarse genralmente cubierta por la maxila. De hecho no se ha podido confirmar su existencia en la hembra ni mediante la microscopía óptica ni mediante el SEM, pero dado que en la familia Splanchnotrophidae generalmente no existen diferencias en las piezas bucales, se supone que la hembra también la tiene. Variabilidad intraespecífica: Hembras: poseen cierta variabilidad en la forma y proporciones corporales, probablemente debidas al desarrollo peramórfico. Además, los procesos posteriores presentan variabilidad asociada a la especie hospedadora. Por regla general los especímenes que se encontraron parasitando a Doto koenneckeri, Doto Lemche y Doto pinnatifida tienen 2 pares de procesos (Fig. 66A, B, C), siendo el externo el de mayor tamaño; por su parte, los individuos que parasitan a Eubranchus sp. solamente poseen 1 par de procesos, mucho más desarrollados que en los copépodos extraídos de las otras especies de nudibranquios (Fig. 66D). Esta variabilidad hospedador-dependiente plantea la posibilidad de la existencia de dos especies de parásito distintas, pero como se verá en la sección dedicada al estudio del gen COX1, las diferentes anatomías de los procesos posteriores se deben únicamente a la variabilidad intraespecífica. Machos: no se observó variabilidad. Capítulo 4 124 Figura 66. Vista dorsal de hembras de Lomanoticola sp. nov. extraídas de diferentes hospedadores, en la que se muestran los procesos posteriores (triángulos blancos). A. En Doto koenneckeri. B. En Doto lemchei. C. En Doto pinnatifida. D. En Eubranchus sp. Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 125 Figura 67. Habitus ventral de la larva nauplius I de Lomanoticola sp. nov. (aa: antena; an: anténula; lr: labrum; md: mandíbula; rc: ramas caudales). 25µm an aa md rc lr LARVA NAUPLIUS I Piriforme, con el labrum redondeado y 1 par de ramas caudales en la parte posterior (Fig. 67). Capítulo 4 132 - Lomanoticola brevipes carece de procesos posteriores. Los artejos 2º y 3º de la anténula no poseen sedas, el 4º artejo no presenta sedas en la porción medial y el número de sedas apicales es menor que el de las anténulas de Lomanoticola sp. nov. Las ramas caudales tienen solamente 3 sedas (HANCOCK & NORMAN, 1863). - Lomanoticola insolens posee surcos profundos en el 2º y 3er segmentos torácicos (Fig. 4). La anténula carece de sedas en los artejos 2º y 3º, y el 4º artejo tiene 2 sedas largas en la porción proximal. La antena únicamente presenta 2 sedas en el segmento distal del endopodito. La seda protopodial del 2º toracópodo tiene una longitud de aproximadamente ¼ de la que posee Lomanoticola. sp. nov. y el endopodito tiene forma de espina y se encuentra muy reducido. Las ramas caudales únicamente tienen 3 sedas. (DELAMARE DEBOUTTEVILLE, 1950). En la filogenia de la familia Splanchnotrophidae realizada por ANTON & SCHRÖDL (2013a) (Fig. 88) se incluye una tercera especie de Lomanoticola denominada Lomanoticola sp., la cual fue descrita y erróneamente identificada como Lomanoticola brevipes por SALMEN (2005) en su tesis doctoral (datos no publicados). Estos autores la diferencian de Lomanoticola brevipes y Lomanoticola insolens en base a la estructura y número de toracópodos de la hembra. Las hembras de Lomanoticola sp. y Lomanoticola sp. nov. poseen grandes similitudes en el habitus, segmentación corporal, segmentación y ornamentación de apéndices cefálicos, en el número y estructura de los toracópodos y en la estructura y ornamentación de las ramas caudales. La única diferencia se encuentra en la forma globular del 4º toracópodo de Lomanoticola sp., la cual podría deberse al desprendimiento de la porción sedosa distal del toracópodo durante la manipulación del animal, artefacto también observado durante la presente memoria (Fig. 47B). Poe ello, se considera que Lomanoticola sp. y Lomanoticola sp. nov. son la misma especie. Esta concclusión podrá ser testada en el estudio molecular gracias a que la secuencia COX1 con código LOM27 (Tabla 3), cedida por Roland Anton, pertenece a los sacos ovígeros de una hembra de Lomanoticola sp. Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 133 4.2.2. Género Splanchnotrophus. Clase Copepoda H.M. Edwards, 1840 Orden Poecilostomatoida Thorell, 1859 Familia Splanchnotrophidae Norman & Scott, 1906 Género Splanchnotrophus Hancock & Norman, 1863 DIAGNOSIS HANCOCK. & NORMAN, 1863: 50-54, plancha XV figs. 1-11, Plancha XVI figs. 7-10. HUYS, 2001: 110, figs. 1, 2, 3, 4, 5 y 6D-E. ABAD et al., 2011: 55-56, figs. 3 y 4. Cuerpo de la hembra dividido en un prosoma de gran tamaño y un pequeño urosoma de 2 somitos. La parte anterior del prosoma está formada por el cefalosoma y los somitos torácicos 2º y 3º, de los que surgen 3 pares de apéndices laterales largos y delgados; parte posterior más pequeña y cilíndrica, formada por la fusión de los somitos torácicos 4º y 5º. Urosoma compuesto por el 6º somito torácico y el genitoabdomen. Ramas caudales con una seda apical bien desarrolla y 6 sedas accesorias más pequeñas. Cuerpo del macho ciclopiforme. El prosoma comprende el cefalotórax (cefalosoma y 2º y 3er somitos torácicos) y el 4º y 5º somitos torácicos. Urosoma formado por el 6º y 7º somitos torácicos y por el somito genital. Ramas caudales con 1 seda apical larga y espinulada en el ápice y 6 sedas más pequeñas. Anténula de 4 artejos, el 1º con 2 espinas robustas. Antena de 3 artejos: coxobase y endopodito de 2 artejos; parte distal del endopodito con 5 elementos accesorios. Mandíbula con gnatobase corta, rematada en una hoja dentada. Maxílula representada por un pequeño esclerito fusionado a la base mandibular, con 1 pequeña seda en el ápice. Maxila de 2 artejos, con 1 espina y 1 seda en la alobase. 2º y 3er par de toracópodos birrámeos. Protopodito con 1 seda en su borde externo; endopodito representado por un pequeño lóbulo; exopodito de mayor tamaño y más alargado, con varios elementos de ornamentación. 4º par de toracópodos reducido, con apariencia de seda. Sacos ovígeros bilobulados, unidos al genitoabdomen por la parte medial. Especie tipo: Splanchnotrophus gracilis Hancock & Norman, 1863. Capítulo 4 134 T4+T5 T6 T7+A1 Cefalosoma Genitoabdomen Prosoma Urosoma T2 T3 C2 C3 C4 C5 T1 C1 Figura 72. Esquema de la segmentación de la hembra de Splanchnotrophus gracilis. El tamaño de las proporciones corporales no se corresponde con el real (A-: somito abdominal; C-: somito cefálico; T-: somito torácico). Splanchnotrophus gracilis Hancock & Norman, 1863. DIAGNOSIS HANCOCK. & NORMAN, 1863: 50-54, plancha XV figs. 1-11, plancha XVI figs. 7-10. HUYS, 2001: 116-119, figs. 5 y 6 D-E. BOXSHALL & HALSEY, 2004: 665-667. DESCRIPCIÓN HEMBRA Segmentación (Fig. 72): Cuerpo de 0,9-2,8 mm de longitud, dividido en prosoma y urosoma, siendo el prosoma más grande y sin segmentación aparente. La parte anterior del prosoma está formada por el cefalosoma y por el 2º y el 3er somitos torácicos. 2º y 3er somitos torácicos con 3 pares de apéndices laterales largos y delicados, orientados lateralmente (1 par en el 2º somito torácico y 2 pares en el 3º) (Fig. 73A). En la zona dorso lateral del tercer somito torácico aparece 1 par de procesos posteriores con forma ovalada y bien desarrollados. Parte posterior del prosoma estrecha y cilíndrica, compuesta por la fusión de los somitos torácicos 4º y 5º. Urosoma de dos somitos: 6º somito torácico y genitoabdomen (Fig. 73B). Aperturas genitales localizadas en la zona ventrolateral del genitoabdomen. Ramas caudales con una seda apical (V) robusta y 6 pequeñas sedas accesorias. Abertura anal situada entre las dos ramas caudales (Fig. 74F). Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 135 Figura 73. Hembra de Splanchnotrophus gracilis. A. Vista ventral del cuerpo. B. Detalle del urosoma (al: apéndices laterales; rcf: región cefálica; so: sacos ovígeros; urs: urosoma). Foto g rafías realizadas con el microsco p io estereoscó p ico. Capítulo 4 136 Apéndices cefálicos (Fig. 74A): Anténula con 4 artejos de segmentación poco marcada. 1er artejo con 2 espinas robustas; 2º artejo con 2 espinas robustas y 1 seda larga; 3er artejo con 2 sedas pequeñas en la superficie dorsal; 4º artejo con 2 sedas en la zona subapical y 7-9 sedas en la apical (Fig. 74A, D). Antena falciforme con 3 artejos: coxobase, 1er artejo endopodal y 2º artejo endopodal. Coxobase con 1 espina pinnada en la unión con el 1er artejo endopodal; artejo proximal del endopodito con 1 espina robusta y más pequeña que la de la coxobase; artejo distal del endopodito (3er artejo de la antena) recurvado hacia el ápice, con 2 espinas en el borde externo, 1 seda en la superficie dorsal, 1 seda más pequeña en el borde interno, y 1 seda más fina y larga en el borde externo que sigue la curvatura del artejo (Fig. 74A, E). Labrum con dos abultamientos dirigidos hacia el labium (Fig. 74A, E). Labium con dos áreas circulares ligeramente cubiertas de sédulas de pequeño porte. Un par de paragnatos en la parte superior, también con sédulas (Fig. 74A, E). Mandíbula con gnatobase pequeña, recurvada en el ápice y con cuatro o cinco procesos dentiformes (Fig. 74A, E). Maxílula formada por un pequeño esclerito fusionado a la gnatobase de la mandíbula, rematado por una pequeña seda. Se suele encontrar cubierta por la mandíbula, lo que la hace difícil de observar (Fig 74E). Maxila con dos artejos: sincoxa que no presenta ornamentación y alobase pequeña con 1 espina y 1 seda serrada (Fig. 74A, E). Toracópodos: 1er toracópodo ausente. 2º par de toracópodos birrámeo, con 1 pequeña seda en el protopodito. Endopodito pequeño y delgado, con 1 pequeña espina en la porción distal. El exopodito es más largo y grueso que el endopodito, presenta 3 sedas en el margen externo y 3 en el interno; ápice finalizado en una ampolla de la que parte un proceso largo y curvado (Fig. 74B). 3er par de toracópodos birrámeo, sin sedas en el protopodito. Endopodito más corto que el exopodito, pero más largo y grueso que el endopodito del 2º toracópodo y sin espina distal. Exopodito más largo y grueso que el endopodito, muy similar al exopodito Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 137 del 2º toracópodo, pero la seda de la porción distal del exopodito está mucho más desarrollada (Fig. 74C). 4º par de toracópodos muy corto y delgado, con apariencia de seda y con una pequeña constricción en la porción medial. Ramas caudales: Cilíndricas, con las 7 sedas típicas. Seda V de mayor tamaño y espinulada en el ápice. Las demás sedas en posición lateral y dorsal (Fig. 74F). Capítulo 4 138 Figura 74. Hembra de Splanchnotrophus gracilis. A. Apéndices cefálicos, vista general. B. 2º toracópodo. C. 3er toracópodo. D. Anténula derecha. E. Anténula y piezas bucales. F. Urosoma y genitoabdomen (aa: antena; aan abertura anal; ag: aperturas genitales; an: anténula; cb: coxobase; en: endopodito; 1en: 1er artejo endopodal; 2en: 2º artejo endopodal; ex: exopodito; la: labium; lr: labrum; ma: maxila; md: mandíbula; rc: ramas caudales). Fotografías realizadas en el SEM. Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 139 Cefalosoma Prosoma Urosoma C2 C3 C4 C5 T1 C1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 A1 Cefalotórax Figura 75. Esquema de la segmentación del macho de Splanchnotrophus gracilis. El tamaño de las proporciones corporales no se corresponde con el real (A-: somito abdominal; C-: somito cefálico; T-: somito torácico). MACHO Segmentación (Fig. 75): Cuerpo ciclopiforme, de 0,5-0,8 mm de longitud (Fig. 76A). Prosoma compuesto por un cefalotórax bien definido (cefalosoma, 2º y 3er somito torácico) y por el 4º y 5º somitos torácicos, estos últimos de forma cilíndrica. El urosoma está constituído por el 6º somito torácico, el somito genital (7º torácico) y el somito anal (1 er segmento abdominal). El somito genital, con forma cóncava, porta los opérculos genitales que están ornamentados con 2 sedas y 1 espina. Capítulo 4 140 Apéndices cefálicos (Fig. 76B, C): Anténula igual a la de la hembra: posee 4 artejos de segmentación poco marcada. 1er artejo con 2 espinas robustas; 2º artejo con 2 espinas robustas y 1 seda larga; 3er artejo con 2 sedas pequeñas en la superficie dorsal; 4º artejo con 2 sedas en la zona subapical y 7-9 sedas en la apical (Fig. 76B). Antena igual a la de la hembra: falciforme con 3 artejos: coxobase, 1er artejo endopodal y 2º artejo endopodal. Coxobase con 1 espina pinnada en la unión con el 1er artejo endopodal; artejo proximal del endopodito con 1 espina robusta y más pequeña que la de la coxobase; artejo distal del endopodito (3er artejo de la antena) recurvado hacia el ápice, con 2 espinas en el borde externo, 1 seda en la superficie dorsal, 1 seda más pequeña en el borde interno, y 1 seda más fina y larga en el borde externo que sigue la curvatura del artejo (Fig. 76B) Labrum con dos abultamientos dirigidos hacia el labium, al igual que el de la hembra (Fig. 76B, C). Labium muy similar al de la hembra, con dos áreas circulares ligeramente cubiertas de sédulas de pequeño porte. Un par de paragnatos en la parte superior, también con sédulas. La única diferencia es la existencia en el macho de un surco central vertical (Fig. 76B, C). Mandíbula igual a la de la hembra: gnatobase pequeña, recurvada en el ápice y con cuatro o cinco procesos dentiformes (Fig. 76B, C). Maxílula, como en el caso de la hembra, formada por un pequeño esclerito fusionado a la gnatobase de la mandíbula, rematado por una pequeña seda (Fig. 76B, C). Maxila igual a la de la hembra, formada por dos artejos: sincoxa que no presenta ornamentación y alobase pequeña con 1 espina y 1 seda serrada (Fig. 76B, C). Toracópodos: 1er toracópodo ausente. 2º par de toracópodos igual al de la hembra: birrámeo, con 1pequeña seda en el protopodito. Endopodito pequeño y delgado, con 1 pequeña espina en la porción distal. El exopodito es más largo y grueso que el endopodito, presenta 3 sedas en el margen externo y 3 en el interno; ápice finalizado en una ampolla de la que parte un proceso largo y curvado (Fig. 76D). Resultados: ESTUDIO ANATÓMICO 141 3er par de toracópodos, como en el caso de la hembra, birrámeo, sin sedas en el protopodito. Endopodito más corto que el exopodito, pero más largo y grueso que el endopodito del 2º toracópodo y sin espina distal. Exopodito más largo y grueso que el endopodito, muy similar al exopodito del 2º toracópodo, pero la seda de la porción distal del exopodito está mucho más desarrollada (Fig. 76E). 4º par de toracópodos mucho más reducido que el 2º y 3er par, con forma de seda alargada. Ramas caudales muy similares a las de la hembra: cilíndricas, con las 7 sedas típicas. Seda V de mayor tamaño y espinulada en el ápice. Las demás sedas en posición lateral y dorsal (Fig. 76F).