Desarrollo de análogos carboránicos y adamantánicos de la vitamina D para la terapia del cáncer

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE QUÍMICA Departamento de Química Orgánica Desarrollo de análogos carboránicos y adamantánicos de la vitamina D para la terapia del cáncer Rocío Otero García Santiago de Compostela, Abril 2016 Desarrollo de análogos carboránicos y adamantánicos de la vitamina D para la terapia del cáncer Memoria que presenta Rocío Otero García para optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Abril 2016 D. Antonio Mouriño Mosquera, Catedrático de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela y D. Miguel A. Maestro Saavedra, Profesor Titular del Departamento de Química Fundamental de la Universidad de A Coruña. Certifican: Que el trabajo titulado “Desarrollo de análogos carboránicos y adamantánicos de la vitamina D para la terapia del cáncer.” fue realizado por Dña. Rocío Otero García bajo su dirección en el Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Abril 2016 Fdo. Antonio Mouriño Mosquera Fdo. Miguel A. Maestro Saavedra Agradecimientos Y empiezo con la parte más importante ya que sin esta parte esta tesis no sería posible. Creo que hay demasiada gente a la que quiero profundamente agradecer. Empezaré cronológicamente para no dejarme a nadie. Al Prof. Antonio Mouriño Mosquera, director de este trabajo, por darme la oportunidad de formar parte de su grupo. Por sus enseñanzas y sugerencias durante todos estos años. Al Prof. Miguel A. Maestro Saavedra, codirector de este trabajo, por sus enseñanzas y sugerencias durante estos años y por su ayuda en el análisis de muestras. A Carlos Gregorio por la ayuda brindada. A mis compañeros de laboratorio de Japón, especialmente Érika, al profesor Tokiwa y como no a la profesora Yamada por su grata amabilidad. A los que estaban: A mi familia por esos ánimos constantes, porque siempre me demostraron que estaban ahí, día tras día. A mi madre, por esa fuerza interna que siempre me transmitió, por su confianza, por su apoyo incondicional, por su amistad, por sus consejos…. A mi hermana, que siempre confió en mi, que siempre estuvo fuese la hora que fuese, por ser mi confidente. A mi prima Ángela por tu confianza. Se que algún día tu también escribirás una tesis. A Aarón por empezar esta historia conmigo de la mano, muchas experiencias vividas que nunca olvidaré. A mis compañeros que me recibieron en laboratorio el primer día: Tamara, Borja y Diego. Mi maestro del laboratorio, Don Diego Carballa, Abu para mi. Por nuestros momentos de pelar la fruta en la papelera, momento de confesiones, por nuestras canciones “ sopa de caracol” y porque tu ayuda hasta el ultimo de los días de mi tesis. Borja, el primero en recibirme en el laboratorio, junto con Diego otro guía espiritual, siempre ahí dándome el mejor consejo. A mi Patricia Berdullas, por esa alegría, por ese apoyo continuo, por ese cariño, por esa alegría y el buen rollo que siempre generas. Lo nuestro es para siempre. A Xiao, por esos Km de desconexión detrás de tu rueda, o tu de la mía. Por esa confianza y por siempre hacerme sentir bien. A mis pupilos Alex y Sema que siempre nos quedará bailar bachata. Con vosotros es imposible perder la sonrisa. Al resto de mis compañeros del laboratorio laboratorio: Silvia, Borges, Rafa, Rita, Natalia, Sunil, Fabián, Iris, Leti, Mauro, Sabela, Araceli. Eternamente agradecida a mi club de Ultimate frisbee Polbo A Coruña por esos largos viajes, esos largos torneos donde era imposible no llenarse de energía. A Pedro, por su apoyo constante, por su serenidad, por su confianza depositada en mi siempre, por estar siempre ahí y nunca fallarme. A mi club de triatlón Arcade Inforhouse, porque lo mejor del día era vuestra compañía. A Rubén, Paloma, Óscar, Pablo, Pablo Coach, Alberto, Miriam y Alba. A mis compañeras de piso Rach, Amanda y Stefanie por su amabilidad, su cariño y por aguantar siempre mis tonterías. Gracias por mis super fiestas de cumpleaños. A mis amigas, las más guapas del mundo entero, Isa, Lore, Bea, Ro, Iria, Neki, Patri porque no estarán para todo lo bueno, pero siempre para lo malo. Al Ministerio de Educación y Ciencia (FPI) por la financiación concedida. Al CESGA por la utilización de los superordenadores. A Ramón Gesto y a Mencha por toda la ayuda con los espectros de RMN. Al personal del CACTUS y los Servicios centrales de investigación de A Coruña por el análisis de muestras. Al Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación por la financiación concedida (proyectos SAF2010-15291). ÍNDICE 2-{(1'R,3a'S,7a'R,E)-7a'-Metil-1'-[(R)-6''-metil-6''-[(trietilsilil)oxi]heptan-2''-il]octahidro4H-inden-4'-ilidenil}etan-1-ol. ...................................................................................... 160 (R)-6-{[(1'R,3a'S,7a'R,E)-4'-(2''-o-Carboranil)-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'-il]-2metilheptan-2-il}-1-ol. ................................................................................................. 161 (S)-2-{(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-[(terc-Butildimetilsilil)oxi]-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1il}propanal. ................................................................................................................. 162 (R,E)-4-{(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-[(terc-Butildimetilsilil)oxi]-7a'-metiloctahidro-1H-inden1-il}pent-2-enoato de etilo. ........................................................................................... 163 (R,E)-4-[(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-Hidroxi-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1-il]pent-2-enoato de etilo. ....................................................................................................................... 164 (R,E)-4-[(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-Oxo-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1-il]pent-2-enoato de etilo. ........................................................................................................................... 164 (R,E)-4-[(1'R,3a'S,7a'R,E)-4'-(2''-Etoxi-2''-oxoetilidenil)-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1il]pent-2-enoato de etilo. .............................................................................................. 165 (R,E)-4-[(1'R,3a'S,7a'R,E)-4'-(2''-Hidroxietilidenil)-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'- il]pent-2-en-1-ol. ......................................................................................................... 166 (R,E)-4-[(1'R,3a'S,7a'R,E)-4'-(2''-o-carboraniletilidenil)-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'- il]pent-2-enil-1-o-carborano. ........................................................................................ 166 CONCLUSIONES ......................................................................................... 169 RESUMEN .................................................................................................. 173 1 Diseño de análogos con una unidad adamantánica. ..................................... 175 1.1 Síntesis de los compuestos (25S)-1 y (25R)-2. Análisis retrosintéticos. Análisis retrosintético. ...................................................................................... 176 1.1.1 Preparación del alcohol propargílico 11. .................................................................. 177 1.1.2 Síntesis del boronato 9. ............................................................................................ 178 1.1.3 Síntesis de los compuestos (25S)-1 y (25R)-2. ......................................................... 179 1.1.4 Ensayos biológicos de los análogos (25S)-1 y (25R)-2. ........................................... 181 1.1.5 Actividad transcripcional. ......................................................................................... 181 2 Análogos carboránicos de la Vitamina D. ..................................................... 181 2.1 Síntesis del análogo 3 con una unidad carboránica en el entorno de la posición C-25. .................................................................................................. 182 2.1.1 Síntesis del alcohol 31, construcción de la cadena lateral. ...................................... 183 2.1.2 Síntesis del bromuro vinílico 40. .............................................................................. 184 2.1.3 Síntesis del boronato 30. .......................................................................................... 184 2.1.4 Síntesis del análogo 3. ............................................................................................. 185 2.1.5 Ensayos biológicos del análogo 3. ............................................................................ 186 2.2 Síntesis de análogos carboránicos de la vitamina D funcionalizados en la posición orto. .................................................................................................... 187 2.2.1 Preparación del análogo con hidroxilo en posición orto, vía siloxialquino 42. .......... 188 2.2.2 Preparación del análogo 4 a través de la formación del benzoato. .......................... 188 2.2.3 Ensayos sobre el biciclo CD. ..................................................................................... 190 2.3 Síntesis de análogos de la vitamina D con una unidad carboránica sustituyendo el anillo A. Análisis retrosintético. ................................................. 193 2.3.1 Síntesis del alcohol 55. ............................................................................................ 193 2.3.2 Síntesis del análogo 5. ............................................................................................. 194 2.4 Síntesis de análogos con unidades carboránicas en la cadena lateral y en el anillo A. ............................................................................................................ 196 2.4.1 Síntesis del éster 66. ................................................................................................ 196 2.4.2 Síntesis del diol 61. .................................................................................................. 197 2.4.3 Síntesis del análogo 6. ............................................................................................. 198 APÉNDICE ................................................................................................. 201 ESPECTROS DE RMN ................................................................................ 203 DIFRACCIÓN DE RX .................................................................................. 247 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 251 ÍNDICE DE ESTRUCTURAS ........................................................................ 265 ABREVIATURAS Abreviaturas 1α,25-(OH)2D3 1α,25-Dihidroxivitamina D3 ó calcitriol 1,25D 1α,25-Dihidroxivitamina D3 ó calcitriol 1α-OH-asa 25-Hidroxivitamina D3 1α-hidroxilasa 24-OH-asa 25-Hidroxivitamina D3 24-hidroxilasa 25-OH-asa Vitamina D3 25-hidroxilasa 25-OH-D3 25-Hidroxivitamina D3 Asp Asparagina BNCT Terapia de captura neutrónica de boro 13C-RMN Resonancia magnética nuclear de carbono-13 c Cuadruplete d Doblete DBD Dominio de unión al DNA (DNA binding domain) DBP Proteína transportadora de vitamina D dd Doble doblete ddd Doble doblete de dobletes DIBAL-H Hidruro de diisobutilaluminio DMAP 4-Dimetilaminopiridina DMF N,N-Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DPMB Desintegración por minuto de ligando unido dppf (Difenilfosfino)ferroceno dt Doblete de tripletes EI Impacto electrónico ESI Ionización por electrospray Et Etilo 1H-RMN Resonancia magnética nuclear de protón H12 Hélice 12 His Histidina HMDS Hexametildisilazano HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia HMRS Espectroscopía de masas de alta resolución hVDR Receptor nuclear de la vitamina D humano Im Imidazol J Constante de acoplamiento kD Constante de afinidad LBD Dominio de unión al ligando LBP Centro de unión del ligando LDA Diisopropilamiduro de litio Leucina Leu M Multiplete M+ Ion molecular MS Espectrometría de masas NBS N-Bromosuccinimida PDC Dicromato de piridinio Phe Fenilalanina pin Pinacolato pin2B2 Bis(pinacolato)diborano iPr Isopropilo PTH Hormona paratiroidea py Piridina Q Quintuplete RAR Receptor del ácido retinoico Rf Factor de retención rVDR Receptor nuclear de la vitamina D de rata RXR Receptor nuclear X del ácido 9-cis-retinoico S Singulete SAR Relación estructura-actividad Ser Serina t Triplete ta Temperatura ambiente TBAF Fluoruro de tetrabutilamonio TBME terc-Butilmetil éter TBS terc-Butildimetilsililo TES Trietilsililo td Triplete de dobletes TIPS Triisopropilsililo TMS Trimetilsililo tr Tiempo de retención tt Triplete de tripletes Val Valina VDREs Elementos de respuesta a la vitamina D VDRmem Receptor de membrana de la vitamina D zVDR Receptor nuclear de la vitamina D del pez cebra ))) Ultrasonidos INTRODUCCIÓN Introducción 7 1 INTRODUCCIÓN DE LA VITAMINA D. La importancia de la vitamina D se ha reconocido desde su descubrimiento por Mellanby, que en 1920 relacionó el raquitismo con un factor nutricional, la vitamina A.1 Sin embargo, tres años más tarde, McCollum y col, demostraron que realmente este factor era la vitamina D.2 Pero no fue hasta 1932 cuando se determinó su estructura química y se clasificó como un esteroide. La vitamina D3 se considera un secoesteroide ya que presenta un sistema triénico, derivado de la ruptura fotoquímica del enlace C9 y C10 del anillo B del 7-deshidrocolesterol. Esquema 1. Estructura de la vitamina D3 y de la 1α,25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol). La vitamina D3 juega un papel importante en procesos fisiológicos, incluyendo la homeostasis del calcio y del fósforo, el metabolismo óseo y el sistema inmune.3,4 Su implicación en numerosas enfermedades ha destacado la importancia del desarrollo de numerosos análogos como agentes terapéuticos en enfermedades como la osteoporosis, (1) (a) Mellanby E, Cantag MD. Experimental investigation on rickets. Lancet 1919, 196, 407-412. (b) Mellanby E. Experimental rickets. Med Res. (G.B.), Special Report Series 1921, SRS-61, 1-78. (2) McCollum EV, Simmonds N, Becker IE, Shipley PG. Studies on experimental rickets: XXI. An experimental demonstration of the existence of a vitamin which promotes calcium deposition. J. Biol. Chem. 1922, 53, 293-312. (3) (a) Spiess YH, Price PA, Deftos JL, Manolagas SC. Phenotype-asociated changes in the effects of 1,25dihydroxyvitamin D3 on alkaline phosphatase and bone GLA-protein of rat osteoblastic cells. Endocrinology, 1986, 16, 1340-1346. (b) Norman AW. Vitamin D: The Calcium Homeostatic Steroid Hormone. Academic Press: New York, 1979. (c) Chen TC, Castillo L, Korycka-Dahl M, DeLuca HF. Role of vitamin D metabolites in phosphate transport of rat intestine. J. Nutr. 1974, 104, 1056-1060. (4) (a) Holick MF. Vitamin D: Physiology, molecular biology and clinical applications. Humana Press: Totowa, NJ, USA, 1999. (b) Jones G, Strugnell SA, DeLuca HF. Current understanding of the molecular actions of vitamin D. Physiol. Rev. 1998, 78, 1193-1231. (c) DeLuca HF, Zierold C. Mechanisms and functions of vitamin D. Nutr. Rev. 1998, 56, 54-75. (d) Bouillon R, Okamura WH, Norman AW. Structure-function relationships in the vitamin D endocrine system. Endocr. Rev. 1995, 16, 200-257. H HO Vitamina D 3 H HO 1α,25-Dihidroxivitamina D 3 OH HO 25 1 HO H A H B CD 1 25 7-Deshidrocolesterol A CD 25 13 cadena lateral Sistema triénico HH H 9 8 8 3 3 14 Introducción enfermedades autoinmunes. El VDR es un factor de transcripción, el cual es activado por el calcitriol (1α,25-dihidroxivitamina D3) y otros metabolitos de la vitamina D. El VDR humano se divide en dos dominios: El dominio de unión al DNA (DBD, DNA Binding Domain) cuya principal función es anclar el VDR a ciertas regiones específicas del DNA, llamadas elementos de respuesta de la vitamina D (VDREs), es el responsable de la dimerización del receptor. Aunque el VDR puede dimerizar consigo mismo o con el receptor X del ácido 9-cis-retinoico (RXR), solamente su heterodímero con el RXR es biológicamente activo. En el 2004, se determinó la estructura cristalográfica del heterodímero formado por el fragmento correspondiente al DBD del VDR y el DBD del RXR unido a un elemento de respuesta de la vitamina D (Figura 3).16 Figura 3. Estructura cristalina del heterodímero formada por DBD-RXR y el DBD-VDR unido a un fragmento de DNA (código PDB: 1YNW). El dominio de unión al ligando (LBD, Ligand Binding Domain) situado en el extremo carboxi-terminal del VDR, es el responsable de la elevada especificidad y afinidad con la que la proteína se une a la hormona 1,25D. (16) Shaffer PL, Gewirth DT. Structural analysis of RXR-VDR interactions on DR3 DNA. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2004, 89-90, 215-219. Zn Zn Zn Zn DBD-RXR H-2 H-3 H-1 DBD-VDR Introducción 15 La estructura cristalina del VDR(LBD) mutado es similar a la estructura del LBD de otros receptores nucleares; posee trece hélices α que se intercalan en tres capas, y tres hebras, que forman una lámina β. La nomenclatura se basa en la utilizada para la estructura del RXR(LBD) humano. Las hélices α se enumeran de H1 a H12 comenzando por el extremo N-terminal. La hélice H12 contiene una región conocida como función de activación dependiente de ligando que permite la interacción del VDR con otras proteínas nucleares, con coactivadores y/o con correpresores de la transcripción al unirse el LBD con el ligando. En el 2000, Moras y col. publicaron la estructura cristalina de un LBD mutado del VDR complejado con la hormona 1,25D (Figura 4).17 La mutación en el LBD consistió en la eliminación de los residuos 165-215 del dominio de inserción del VDR natural. El VDRLBD mutado demostró ser plenamente funcional, exhibiendo las mismas propiedades biológicas (unión, transactivación, heterodimerización) que el VDR natural. Figura 4. Estructura cristalina del VDR(LBD) unido al calcitriol (código PDB: 1DB1). (17) Rochel N, Wurtz JM, Mitschler BK, Moras D. The crystal structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand. Mol. Cell 2000, 5, 173-179. H3 H12 H11 H5 H4 H9 H1 H7 H10 H8 H2 H6 16 Introducción 5.1.3 Estudio de las interacciones entre la 1,25D y su receptor. La 1α,25-dihidroxivitamina D3 exhibe sus efectos biológicos a través de la unión al VDR ejerciendo un cambio conformacional en la hélice 12 (H12) que activa la región AF-2 (función de activación dependiente del ligando), provocando una reducción por la afinidad hacia los correpresores y aumentando la afinidad por el reclutamiento de coactivadores. Este reordenamiento estructural dispone a la AF-2 de tal manera que permite la interacción del VDR con otras proteínas nucleares, con coactivadores y/o correpresores de la transcripción. Estudios de las interacciones entre la 1,25D en el centro activo de su receptor y análisis de las estructuras cristalinas de complejos ligando-VDR (Figura 5) permiten determinar pequeñas modificaciones en las interacciones ligando-receptor que pueden modular la interacción entre la H12 y los coactivadores y, como consecuencia, su respuesta biológica. Figura 5. Interacciones más relevantes del calcitriol en el centro activo del receptor. H-5 Ser275 2.9 2.8 2.8 2.9 H-3 Ser237 Arg274 Try143 (A) H-5 Trp286 Ser275 Leu233 Val234 H-3 (B) Leu227 H-3 Leu230 Val300 Leu309 His305 H-7 Val418 His397 H-11 2.8 2.8 3.8 4.3 (C) Introducción 17 Al analizar la estructura cristalina del complejo 1α,25D-VDR se observan que las interacciones polares e hidrofóbicas son las que estabilizan la 1α,25-(OH)2D3 en el bolsillo de unión.18 Dentro de las interacciones polares se pueden destacar los enlaces de hidrógeno formados entre el hidroxilo de la posición C-3β, que establece dos enlaces de hidrógeno con la Ser278 (H5) y la Tyr143, mientras que el hidroxilo de la posición C-1α forma enlaces de hidrógeno con la Ser237 (H3) y la Arg274 (H5). La Arg274 contribuye a la estabilización del complejo por formación de enlaces de hidrógeno con una serie de moléculas de agua que se encuentran en las proximidades de la posición C-2 (Figura 5 A). El sistema triénico de la 1α,25-dihidroxivitamina D3 se encuentra ubicado en un canal hidrofóbico, rodeado por los aminoácidos Ser275 (bucle H5-β5) y Trp286 (β1) por una de las caras y con la Leu233 (H3) por la otra. La cara α del anillo C también interacciona con el Trp286, mientras que el metilo C-18 lo hace con la Val234 (H3) (Figura 5 B). Los residuos hidrofóbicos Leu227, Leu230, Val300 y Leu309, no sólo interaccionan con la cadena lateral del ligando sino que también lo hacen con otros aminoácidos de forma que ayudan a mantener la conformación activa del receptor nuclear. 19 El hidroxilo de la posición C-25 se une mediante enlaces de hidrógeno a los aminoácidos His305 (bucle H6H7) e His397 (H11) (Figura 5 C). Las interacciones de van der Waals adquieren gran importancia ya que permiten a la hélice H12, en su posición activa, establecer dos interacciones directas con el metilo Me-27 de la cadena lateral a través de los residuos Val418 y Phe422. (18) (a) Yamada S, Shimizu MN, Yamamoto K. Structure-function relationships of vitamin D including ligand recognition by the vitamin D receptor. Med. Res. Rev. 2003, 23, 89-115. (b) Rochel N, Moras D. Ligand binding domain of vitamin D receptor. Curr. Top. Med. Chem. 2006, 6, 1229-1241. (19) Yamamoto K, Abe D, Yoshimoto N, Choi M, Yamagishi K, Tokiwa H, Shimizu M, Makishima M, Yamada M. Vitamin D receptor: Ligand recognition and allosteric network. J. Med. Chem. 2006, 49, 1313-1324. 18 Introducción 6 ANÁLOGOS DE LA VITAMINA D CON UNA UNIDAD ADAMANTÁNICA EN LA CADENA LATERAL. Análogos sintéticos de vitamina D han sido utilizados con éxito en el tratamiento de trastornos como la psoriasis, la osteoporosis, y el hiperparatiroidismo secundario y tienen un inmenso potencial como agentes terapéuticos para el tratamientno de enfermedades autoinmunes, cánceres, y enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, sus efectos adversos, como la hipercalcemia, la reabsorción ósea y la calcificación de tejidos blandos, limitan la aplicación clínica de los agonistas del VDR en el tratamiento de tumores malignos y trastornos del sistema inmune. La necesidad de ligandos del VDR con potente actividad anti-proliferativa que no ejerzan efectos adversos sobre el metabolismo del calcio ha implementado esfuerzos sintéticos en el área. A fecha de hoy, sigue siendo necesario el desarrollo de ligandos de VDR sin acción hipercalcémica para el desarrollo de nuevas terapias. Se han propuesto nuevos análogos con un grupo adamantilo en la posición terminal de la cadena lateral con el fin de modificar la interaccion con la H12 y los residuos Val414 y Phe418, que son importantes para la transcripción. Tomando como base el superagonista 2MD,20 Yamada y col.21 diseñaron nuevos análogos de la vitamina D que carecen del grupo metilénico C-19 y poseen un fragmento adamantánico en la cadena lateral (Figura 6). (20) (a) Shevde NK, Plum LA, Clagett-Dame M, Yamamoto H, Pike JW, DeLuca HF. A potent analog of 1α,25dihydroxyvitamin D3 selectively induces bone formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 13487−13491. (b) Plum LA, Fitzpatrick LA, Ma X, Binkley NC, Zella JB, Clagett-Dame M, DeLuca HF. 2MD, a new anabolic agent for osteoporosis treatment. Osteoporosis Int. 2006, 17, 704−715 (21) Kudo T, Ishizawa M, Maekawa K, Nakabayashi M, Watarai Y, Uchida H, Tokiwa H, Ikura T, Ito N, Makishima M, Yamada S. Combination of triple bond and adamantane ring on the vitamin D side chain produced partial agonists for vitamin D receptor. J. Med. Chem. 2014, 57, 4073-4087. Introducción 19 Figura 6. Súper agonista 2MD y análogos de la vitamina D con una unidad adamantánica en la cadena lateral. Como se puede observar en la Figura 7 las diferencias estructurales de las cadenas laterales y la posición que adopta el fragmento adamantánico de los ligandos ADTK1, ADTK3, ADTK4 provoca interacciones de distinta intensidad con los residuos Val414 y Phe418 que explican sus propiedades selectivas. Figura 7. Interacciones del anillo adamantánico con los resíduos en el complejo ligando: rVDR(LBD). Estos análogos adamantánicos mostraron afinidades significativas por el VDR, actividades agonísticas parciales, y selectividades en la expresión de genes en diversos tipos de células. H HO OH HO H 2MD H H OHHO HO x y ADNY: y=0, x=0, 20R,24R ADTT: y=1, x=0, 20S,25R ADMI1: y=1, x=1, 20R,25S ADMI2: y=1, x=1, 20R,25R ADMI3: y=1, x=1, 20S,25S ADMI4: y=1, x=1, 20S,25R H H OHHO x HO ADTK2: x=0, 25R ADTK1: x=0, 25S ADTK3: x=1, 25R ADTK4: x=1, 25S Ser274 Arg270 2.7 Ser233 2.7 2.9 His301 His393 2.7 2.8 Try143 2.9 Phe418 Val414 3.9 4.4 3.8 Ser274 Arg270 Ser233 2.7 His301 His393 3.0 Try143 3.0 Phe418 Val414 4.6 4.2 2.9 3.1 ADTK1 Ser274 Arg270 Ser233 2.7 His301 His393 2.8 Try143 2.8 Phe4 18 Val414 4.4 4.0 2.9 ADTK1 ADTK1 ADTK1 20 Introducción Se ha observado que el grupo adamantilo se ubica hacia la H12 modificando el centro activo, permitiendo interacciones con los residuos Phe418 y Val414 situadas en esta hélice. La introducción de un grupo tan voluminoso provoca pequeñas modificaciones en las interacciones ligando-receptor que pueden modular la interacción entre la H12 y los coactivadores y en consecuencia, la actividad biológica. 7 MIMÉTICOS NO ESTEROIDALES DE LA VITAMINA D. Recientemente se han desarrollado miméticos prometedores de la vitamina D no secoesteroidales,22 , 23 , 24 que presentan propiedades ventajosas en comparación con los análogos secoesteroidales, como la modulación diferencial del VDR, alteraciones del perfil farmacodinámico y/o farmacocinético. Se han desarrollado ligandos no secoesteroidales, no calcémicos, y de actividad selectiva, de potencial valor terapeutico. 7.1 Miméticos no secoesteroidales de la vitamina D3. Se conocen varios análogos secoesteroidales que encuentran aplicación clínica sobre todo en el tratamiento de raquitismo, hiperparatiroidismo, psoriasis y osteoporosis, pero todavía no se ha desarrollado ninguno para el tratamiento del cáncer debido a que las dosis farmacológicas requeridas inducen hipercalcemia. 25 Esta limitación ha despertado el interés de los químicos por el desarrollo de ligandos no secoesteroidales del VDR que mimeticen el comportamiento de la hormona 1,25D sin generar los efectos calcémicos secundarios. Estos compuestos imitan varias actividades in vitro de la 1,25D, como la interacción con el VDR, la activación transcripcional, la inhibición a la proliferación celular y a la diferenciación celular. Estos miméticos son de interés potencial como fármacos porque pueden presentar propiedades selectivas ventajosas, como consecuencia de una (22) Boehm MF, Fitzgerald P, Zou A, Elgort, MG.; Bischoff, ED.; Mere L, Mais DE, Bissonnette RP, Heyman RA, Nadzan AM, Reichman M, Allegretto EA. Novel nonsecosteroidal vitamin D mimics exert VDR-modulating activities with less calcium mobilization than 1, 25-dihydroxyvitamin D3.Chem. Biol. 1999, 6, 265-275. (23) Swann SL, Bergh J, Farach-Carson MC, Ocasio CA, Koh JT. Structure-based design of selective agonists for a rickets-associated mutant of the vitamin D receptor. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 13795-13805. (24) Hosoda S, Tanatani A, Wakabayashi K, Makishima M, Imai K, Miyachi H, Nagasawa K, Hashimoto Y. Ligands with a 3, 3-diphenylpentane skeleton for nuclear vitamin D and androgen receptors: Dual activities and metabolic activation. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 5489. (25) (a) Ettinger RA, Deluca HF. The vitamin D endocrine system and its therapeutical potential. Adv. Drug Res. 1996, 28, 269-312. (b) Stein MS, Wark DL. An update on the therapeutic potential of the vitamin D analogues. Expert. Opin. Invest. Drugs 2003, 12, 825-840. (c) Debb KK, Trump DL, Johnson CS. Vitamin D signalling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics. Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 684-700. Introducción 21 diferente modulación del VDR o diferentes comportamientos farmacodinámicos y farmacocinéticos. Varios miméticos exhiben actividades biológicas similares a la 1,25D en células Hela,22,26 estabilizando el VDR(LBD) en su conformación agonista (Figura 8). Las bases moleculares para la actividad transcripcional de estos miméticos incluyen la conservación de los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas de van der Waals del ligando natural en el centro activo del receptor del VDR. Estas propiedades combinadas con sus bajos efectos calcémicos hacen que sean miméticos con potenciales aplicaciones clínicas. Figura 8. Algunos míméticos no secoesteroidales de la 1,25D. 7.2 Miméticos carboránicos no secoesteroidales de la vitamina D3. La necesidad de la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos ha llevado al desarrollo de nuevos análogos no secoesteroidales con una unidad p-carboránica en su estructura. (26) Ciesielski F, Sato Y, Chebaro Y, Moras D, Dejaegere A, Rochel N. Structural basis for the accommodation of bisand tris-aromatic derivatives in vitamin D nuclear receptor. J. Med. Chem. 2012, 55, 8440−8449. O Cl Cl O O O LG190090 O O O O LG190119 OH HO O OH HO OH O OH HO R 1 R 2 OH CD4528 CD3938 CD4720; R 1 = Me; R 2 = nPr CD4802; R 1 = Et; R 2 = Pr CD4742; R 1 = R 2 = Et CF 3 CF 3 OH 22 Introducción Una característica importante de los carboranos es su superficie hidrofóbica compuesta por elementos B-H, ya que las interacciones hidrofóbicas juegan un papel importante entre las proteínas y los compuestos bioactivos. Fujii y col.27 han sido pioneros en la obtención de mímicos no secoesteroidales de la vitamina D con unidades de 1,2-closo-carborano que sustituye al biciclo CD de la hormona natural 1,25D (Figura 9). Figura 9. Estructura de carboranos como miméticos de la vitamina D. Estudios de cristalización de estos ligandos en el VDR demostraron que estos miméticos presentan un comportamiento similar al de la vitamina D puesto que el hidroxilo primario y el secundario se corresponden con el 1α-OH y 3α-OH de la 1α,25-dihidroxivitamina D3 mientras el hidroxilo terciario se corresponde con el de la posición 25. Estos resultados sugirieron que las modificaciones estructurales utilizadas en este tipo de miméticos de vitamina D podrían ser útiles para el desarrollo de nuevos ligandos del VDR (27) Fujii S, Kano A, Songkram C. Synthesis and structure-activity relationship of p-carborane-based nonsecosteroidal vitamin D analogs. Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 1227-1235. O OH OOH OOH O OH O O R 1 R 1 O HO OH OH R 2 O OH OH OH OOH OH OOH O OH OH OOH OH OOH OH OOH OH R 2 = = BH CH Introducción 23 no secoesteroidales.28 Kagechika y col diseñaron y sintetizaron miméticos p-carboránicos con unidades estructurales más refinadas para profundizar en el análisis estructuraactividad.29 La actividad de los derivados carboránicos sintetizados ha sido evaluada en términos de inducción de diferenciación celular en líneas celulares HL-60 y comparados con la 1α,25-(OH)2D3 como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Potencial de diferenciación celular de los análogos no secoesteroidales. Compuesto R1 R 2 EC50 (nM) 1α,25-(OH)2D3 - - 4.4 A -H -H 47 B =CH2 6.1 C -Me -H 27 D -H -Me 53 E -Et 78 F -OH -H 63 G -H -OH 200 H -OMe -H 8.4 I -H -OMe 34 J -H -H 74 (28) (a) Fujii S, Goto T, Ohta K, Hashimoto Y, Suzuki T, Ohta S, Endo Y. Potent androgen antagonists based on carborane as a hydrophobic core structure. J. Med. Chem. 2005, 48, 4654-4662; (b) Fujii S, Yamada A, Tomita K, Nagano M, Goto T, Ohta K, Harayama T, Endo Y, Kagechika H. p-Carborane-based androgen antagonists active in LNCaP cells with a mutated androgen receptor. Med. Chem. Commun. 2011, 2, 877880 (c) Endo Y, Iijima T, Yamakoshi Y, Yamaguchi M, Fukasawa H, Shudo K. Potent estrogenic agonists bearing dicarba-closo-dodecaborane as a hydrophobic pharmacophore. J. Med. Chem. 1999, 42, 15011504; (d) Endo Y, Iijima T, Yamakoshi Y, Fukasawa H, Miyaura C, Inada M, Kubo A, Itai A. Potent estrogen agonists based on carborane as a hydrophobic skeletal structure: A new medicinal application of boron clusters. Chem. Biol. 2001, 8, 341-355; (e) Iijima T, Endo Y, Tsuji M, Kawachi E, Kagechika H, Shudo K. Dicarba-closo-dodecaboranes as a pharmacophore. Retinoidal antagonists and potential agonists. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 398-404; (f) Ohta K, Iijima T, Kawachi E, Kagechika H, Endo Y. Novel retinoid X receptor (RXR) antagonists having a dicarba-closo-dodecaborane as a hydrophobic moiety. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 5913-5918. (29) Fujii S, Sekine R, Kano A, Masuno H, Songkram C, Kawachi E, Tomoya H, Tanatani A. Kagechika H. Structural development of p-carborane-based potent non-secosteroidal vitamin D analogs. Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 5891-5901. OH O OH HO R 1 R 2 30 Introducción enlaces de hidrógenos clásicos (Figura 15) y en consecuencia le aporta al clúster un carácter lipófilo o hidrófobo.43,44 Figura 15. Justificación de la hidrofobia. La hidrofobia del closo-carborano puede reducirse por la presencia de un momento dipolar, el cual es fuertemente dependiente de la posición de los átomos de C en el clúster. La hidrofobia de los isómeros del closo-carborano incrementa desde orto < meta < para (Figura 16). Figura 16. Efecto de la polaridad sobre la hidrofobia de los closo-carboranos. (43) Lesnikowski ZJ. Boron units as pharmacophores - new applications and opportunities of boron cluster chemistry. Collect. Czech. Chem. Commun. 2007, 72, 1646-1658. (44) a) Hermansson K, Wojcik M, Sjöberg S. o-, m-, and p-Carboranes and their anions: ab initio calculations of structures, electron affinities, and acidities. Inorg. Chem. 1999, 38, 6039-6048. b) Fauchere JL, Quang Do K, Jow PYC, Hansch C. Inusually strong lipophilicity of 'fat' or 'super' amino-acids, including a new reference value for glycine Experientia 1980, 36, 1203-1204. OH H O H H δ+ δ+ δ+ δ+ δ-δYH R O H H δ+ δ+ δ+ δ-δB H O H H δ+ δ+ δδ+δ- = = BH CH orto meta para hidrofobia polaridad Introducción 31 7.2.3.4 Acidez. La acidez de los C-H en el clúster va a depender de los isómeros. Esta acidez disminuye en orden de orto, meta y para,44 siendo la afinidad por la unión al receptor inversamente proporcional a la acidez. Los protones unidos a los C del clúster son relativamente ácidos con unos valores de pKa (orto)= 22.0, pKa (meta)= 25.6, pKa (para)= 26.8 ( Figura 17). Dichos protones son fácilemente desprotonados para generar nucleófilos. Mientras que los hidrógenos unidos al boro poseen un carácter hidruro reaccionando así con electrófilos (Figura 18). Figura 17. Valores de pKa. Figura 18. Reactividad del orto-carborano. 7.2.3.5 Interacciones intermoleculares. El requisito para ser un farmacóforo es tener la capacidad de interaccionar con dianas biológicas. Los carboranos son una clase especial de compuestos con propiedades inesperadas originadas por las características atómicas del boro. Los closo-carboranos poseen dos grupos diferentes de átomos de hidrógeno, el grupo ácido C-H y el grupo hidruro, B-H. La parte ácida C-H de los carboranos forma enlaces de hidrógeno clásicos del tipo C-H---X (X= O, N, S, F). Por otro lado la electronegatividad de los átomos de H pertenecientes al grupo B-H permiten la formación de enlaces de pKa(orto)=22 pKa(meta)=25.6 pKa(para)=26.8 Acidez = = BH CH 1 2 34 56 7 8 9 10 11 12 closo-or t o-carborano E+ NuNu- 32 Introducción hidrógeno no convencionales, es decir, enlaces de dihidrógeno ( Figura 19).45 Este tipo de enlaces se producen entre un átomo de H cargado positivamente unido a un dador de protones AH (A= N, O, S, C, Cl, Br) y un enlace de un aceptor de protones MH (M= átomo electropositivo, B), dando lugar a enlaces tipo NH…HB, CH…HB y SH…HB.46,47,48 La hidrofobicidad, el momento dipolar y la capacidad de formación de enlaces de dihidrógeno juegan un papel importante en las interacciones de los clústers de boro con las biomoléculas. Figura 19. Interacciones intermoleculares. 7.3 Carboranos como farmacóforo único en compuestos biológicamente activos. El uso de carboranos como farmacóforos se popularizó a partir del trabajo de Endo y col.49,50 El término farmacóforo fue utilizado por primera vez por Lemont B. Kier.51 Este término fue definido por la IUPAC como las características estéricas y electrónicas necesarias para garantizar las interacciones supramoleculares óptimas con estructuras diana biológicamente específicas y desencadenar una respuesta biológica. 52 Los (45) Fanfrlík J, Lepšík M, Horinek D, Havlas Z, Hobza P. Interaction of carboranes with biomolecules: Formation of dihydrogen bonds. ChemPhysChem. 2006, 7, 1100-1105. (46) Custelcean R, Jackson JE. Dihydrogen bonding: Structures, energetics, and dynamics. Chem. Rev. 2001, 101, 1963-1980. (47) Alkorta I, Rozas I, Elguero J. Non-conventional hydrogen bonds. Chem. Soc. Rev. 1998, 27, 163-170. (48) Dou J, Su F, Nie Y, Li D, Wang D. Self-assembled 2D supramolecular networks of copper (I) carborane complexes through C–H···H–B dihydrogen bonding interactions. Dalton Trans. 2008, 4152-4156. (49) Endo Y, Yoshimi T, Iijima T, Yamakoshi Y. Estrogenic antagonists bearing dicarba-closo-dodecaborane as a hydrophobic pharmacophore. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 3387-3392. (50) Endo Y, Iijima T, Yamakoshi Y, Yamaguchi M, Fukasawa H, Shudo K. Potent estrogenic agonists bearing dicarba-closo-dodecaborane as a hydrophobic pharmacophore. J. Med. Chem. 1999, 42, 1501-1504. (51) Kier LB. Molecular orbital calculation of preferred conformations of acetylcholine, muscarine, and muscarone. Mol. Pharmacol. 1967, 3, 487-494. (52) Wermuth CG, Ganellin CR, Lindberg P, Mitscher LA. Glossary of terms used in medicinal chemistry. Pure Appl. Chem. 1998, 70, 1129-1143. CC B B B B H HH H H X X H H X H X H X orto-carborano BH= enlace de hidrógeno enlace de dihidrógeno H X: elemento electronegativo Introducción 33 farmacóforos se utilizan en química computacional para definir las características esenciales de las moléculas que son necesarias para el reconocimiento molecular. El closo-carborano representa un único tipo de farmacóforo que puede unirse al centro activo de la proteína mediante interacciones hidrofóbicas aprovechando el bajo carácter polar de los enlaces B-H. Las características de las estructuras policíclicas, junto con las características del boro proporcionan un closo-carborano como farmacóforo único y versátil en el campo del descubrimiento de fármacos, el cual se puede utilizar como entidad para potenciar las interacciones hidrofóbicas entre el fármaco y el receptor. Estas interacciones se pueden mejorar sustituyendo la mayoría o todos los átomos de hidrógeno en los vértices de boro, aumentando el tamaño del farmacóforo y ajustándose a posibles sitios de interacción. La jaula carboránica se ha utilizado como un núcleo hidrófobo en ligandos sintéticos de varios receptores nucleares, tales como el receptor de andrógenos, los receptores de estrógenos, el receptor del ácido retinoico y el receptor X retinoide. Muchas de las estructuras obtenidas de la difracción de rayos X de los complejos formados entre los receptores y sus agonistas y antagonistas en el dominio de unión al ligando, han sido resueltas proporcionando resultados clave para el diseño de nuevos farmacóforos. 7.3.1 Receptor de Estrógeno. Endo y col. investigaron por primera vez el uso de closo-carboranos como fracciones hidrófobas en ligandos de receptores de estrógeno. 53 El diseño, síntesis y evaluación biológica de nuevos agonistas y antagonistas estrogénicos conteniendo carborano ha dado lugar a la producción de los agonistas y antagonistas del receptor de estrógeno, siendo más potentes que la hormona natural 17β-estradiol (Esquema 5). El esqueleto hidrofóbico closo-carborano puede imitar a los anillos C y D del estradiol. Cabe destacar la importancia de funcionalizar los carbonos puesto que la presencia de C-H incrementan la acidez y reducen la hidrofobia.54 La presencia de un grupo hidroxilo en el anillo A en posición orto o meta disminuye la actividad estrogénica en un valor de 103 con (53) Las imágenes de estructuras cristalinas presentes en esta memoria se representaron usando la aplicación: PyMol, versión 0.99 (http://www.pymol.org), a partir de los archivos obtenidos del Protein Data Bank. [Tanenbaum DM, Wang Y, Sigler PB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95, 5998-6003]. (54) Ogawa T, Ohta K, Yoshimi T, Yamazaki H, Suzuki T, Ohta S, Endo Y. m-Carborane bisphenol structure as a pharmacophore for selective estrogen receptor modulators. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 39433946. 34 Introducción respecto a la posición para y la afinidad de unión disminuye a medida que aumenta el tamaño de la cadena. El carbamato diseñado como potencial antagonista imita clínicamente al tamoxifeno pero, sin embargo, exhibe una potente actividad agonista y una menor afinidad por el receptor. La afinidad de unión por el receptor está correlacionada con la acidez del protón NH, lo que sugiere una interacción entre el grupo NH y un residuo de aminoácido, Asp351 (que se sabe que juega un papel relevante en la actividad antagonista).55 Esquema 5. Carboranos como agonistas y antagonistas del receptor del estrógeno. 7.3.2 Receptor del ácido retinoico y receptor del X-retinoide. Ambos receptores forman parte de la superfamilia de los receptores nucleares. La activación de estos receptores está relacionado con la modulación de la actividad biológica relacionada con la diferenciación y proliferación celular. El receptor nuclear del ácido retinoico (RARs) es activado por el ácido trans-retinoico y el receptor del X-retinoide (RXRs) es activado por el ácido 9-cis retinoico.56 RAR forma un (55) Ohta K, Ogawa T, Suzuki T, Ohta S, Endo Y. Novel estrogen receptor (ER) modulators: carbamate and thiocarbamate derivatives with m-carborane bisphenol structure. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 7958-7963. (56) Renaud JP, Rochel N, Ruff M, Vivat V, Chambon P, Gronemeyer H, Moras D. Crystal structure of the ligand-binding domain of the human nuclear receptor RXR-a. Nature. 1995, 378, 681-689. HO H OH H A D H 17β-estradiol OH potente agonista agonista agonista HO H OH H A D H antagonista N 9 O 3 antagonista H N 10 O 3 A HO HO OH OHHO HO Introducción 35 heterodímero con RXR, al que se une el agonista de RAR resultando una asociación de dímeros con coactivadores que promueven la transcripción genética. Las diferencias en la selectividad y actividad para el RAR y RXR no sólo dependen de la orientación espacial del grupo carboxilato sino también del volumen óptimo del grupo hidrófobo y de la distancia óptima entre el grupo hidrófobo y el ácido carboxílico. El diseño de derivados de retinoides que contienen carborano se basa en la estructura del esqueleto de los retinoides sintéticos pertenecientes a polienos, benzanilidas, y ésteres de fenilo (Esquema 6). Los grupos necesarios para la actividad retinoide incluyen cadenas de alquilo, la unión a anillos arilo, a ácidos carboxílicos y a grupos bencilo sustituidos en meta, orto o para. Esquema 6. Carboranos como agonistas y antagonistas del receptor del ácido retinoico. COOH Ácido trans retinoico agonista RAR N H O N H O antagonista H H N O N H O N H O H N C 3 H 7 COOH antagonista antagonista agonista agonista parcial agonista COOH H 3 CO H 3 CO COOH H 3 CO COOH COOH COOH 36 Introducción La hidrofobia del grupo R es importante para una actividad retinoide potente así como el grupo de unión (por ejemplo, amida, éster o amina) tiene un papel importante en la determinación de la planaridad y la orientación de la molécula. Se llevaron a cabo estudios de estructura-actividad de agonistas y antagonistas retinoides conteniendo carborano unido a grupos fenilaminas y benzamidas. La distancia óptima entre el grupo hidrófobo y el grupo ácido carboxílico en los ligandos RXR es relativamente corta y es comparable con los ligandos comparables para RAR. La introducción de grupos alquilo en los anillos aromáticos provocan una torsión en la conformación, un volumen estérico y la hidrofobia del grupo closo-carborano proporciona antagonistas RXR, los cuales distorsionan la hélice 12 desactivando el heterodímero RARRXR del coactivador.57 Los requisitos estructurales para un agonista RAR son una longitud molecular óptima, un volumen hidrofóbico óptimo y una forma molecular plana. En el caso de fenilaminas, la fracción voluminosa del carboranilo en el anillo arilo se enlaza muy bien en la cavidad de RAR.58 A medida que aumentan los grupos hidrofóbicos aumenta la potencia agonística. Dentro de la serie de las benzamidas, en los closo-carborano la sustitución en la posición para del anillo de fenilo proporciona actividad antagonista RAR. 7.4 Síntesis y reactividad de los carboranos. La primera síntesis del carborano (C2B10H12) se llevó a cabo en 1963 en un proceso de conversión de los hidruros de boro B2H6, B5H9 y B10H14 en derivados orgánicos como combustible para cohetes; hasta entonces se pensaba que los derivados del decaborano serían térmicamente inestables y reactivos frente el agua y el aire.59,60 Los alquinos terminales como el acetileno, son los reactivos comúnmente usados para este tipo de inserción. El decaborano reacciona con alquinos, en presencia de bases de Lewis, para dar los correspondientes orto-carboranos. La isomerización térmica llevada a cabo en (57) Bourguet W, Vivat V, Wurtz JM, Chambon P, Gronemeyer H, Moras D. Crystal structure of a heterodimeric complex of RAR and RXR ligand-binding domains. Mol. Cell. 2000, 5, 289-298. (58) Endo Y, Iijima T, Yaguchi K, Kawachi E, Inoue N, Kagechika H, Kubo A, Itai A. Structure–activity study of retinoid agonists bearing substituted dicarba-closo-dodecaborane. Relation between retinoidal activity and conformation of two aromatic nuclei. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1307-1311. (59) Heying TL, Ager JW, Clark SL, Mangold DJ, Goldstein HL, Hillman M, Polak RJ, Szymanski JW. A New Series of Organoboranes. I. Carboranes from the reaction of decaborane with acetylenic compounds. Inorg. Chem. 1963, 2, 1089-1092. (60) Fein MM, Bobinski J, Mayes N, Schwartz N, Cohen MS, Carboranes. I. The Preparation and chemistry of 1isopropenylcarborane and its derivatives (a new family of stable clovoboranes). Inorg. Chem. 1963, 2, 11111115. Introducción 37 condiciones inertes sobre el isómero orto proporciona primero irreversiblemente el isómero meta (465-500 ºC) y finalmente el isómero para (615-700 ºC) (Esquema 7).61,62 Esquema 7. Síntesis de isómeros de closo-carboranos. 7.4.1 Síntesis de carboranos sustituidos a través del átomo de carbono. El carborano (C2B10H12) se utiliza como sustancia de partida en la química de los carboranos como alternativa al uso de decaborano, debido a bajos rendimientos, toxicidad y reactividad del decaborano. La sustitución nucleofílica es el método favorito para la obtención de clústeres de carboranos sustituidos y se puede aplicar a todos los isómeros. 7.4.1.1 Alquilación con haluros de alquilo, tosilatos y triflatos. Un método común para la introducción de grupos alquilo o cadenas largas sobre los carbonos del carborano es la reacción del carborano litiado con haluros de alquilo, como bromuros o yoduros más habituales que los tosilatos o triflatos (Figura 20).63,64,65 (61) Esvenson GM, Gaines DF. Thermal isomerization of regiospecifically 10B-labeled icosahedral carboranes Inorg. Chem. 1990, 29, 1210-1216. (62) Grafstein D, Dvorak J. Neocarboranes, a New family of stable organoboranes isomeric with the carboranes. Inorg. Chem. 1963, 2, 1128-1133. (63) Thomas J, Hawthorne MF. Dodeca (carboranyl)-substituted closomers: toward unimolecular nanoparticles as delivery vehicles for BNCT. Chem. Commun. 2001,18, 1884-1885. (64) Jiang W, Chizhevsky IT, Mortimer MD, Chen W, Knobler CB, Johnson SE, Gomez FA, Hawthorne MF. Carboracycles: Macrocyclic compounds composed of carborane icosahedra linked by organic bridging groups. Inorg. Chem. 1996, 35, 5417-5426. (65) Kaszynski P, Pakhomov S, Tesh KF, Young VG. Carborane-containing liquid crystals: Synthesis and structural, conformational, thermal, and spectroscopic characterization of diheptyl and diheptynyl derivatives of p-carboranes. Inorg. Chem. 2001, 40, 6622-6631. HH B 10 H 14 Base Lewis 2H 2 orto 465-500 ºC meta 615 ºC para 38 Introducción Figura 20. Alquilación con haluros de alquilo, tosilato y triflatos. 7.4.1.2 Reacción de cicloadicción [4+2] y [2+2]. Este tipo de reacciones está limitado a los closo-o-carboranos ya que es el único que posee el fragmento C-C necesario para la cicloadicción. Para preparar el carborano para reaccionar con sistemas π, los átomos de hidrógeno del carborano deben ser eliminados por dilitiación con nBuLi generando 1,2-dehidro-orto-carborano y posterior adicción de yodo, provocando así la eliminación de la sal. La reacción entre el carborino y el sistema diénico genera un producto cíclico unido a un carbono con hibridación sp3. La reacción de ciclación [2+2] genera mediante una reacción no estereoespecífica un ciclobutano. Mientras la reacción de ciclación [4+2] ocurre con retención de estereoquímica generando un anillo de seis miembros (Figura 21). Figura 21. Reacción de cicloadicción [4+2]. 7.4.1.3 Reacción de cicloadicción [2+2+2]. En la reacción participan tres componentes como el carboranillitio y dos grupos insaturados. Dicha reacción está catalizada por Niquel.66,67 (66) Deng L, Chan HS, Xie Z. Nickel-Mediated Regioselective [2+2+2] Cycloaddition of carboryne with alkynes. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 7728-7729. (67) Qiu ZE, Xie Z. Nickel-mediated three-component cycloaddition reaction of carboryne, alkenes, and alkynes. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2084-2085. o m p Li o m p R R= alquil, aril X= Cl, Br, I, OTs, OTf RCH 2 -X o m p Li I2, Δ o m p C6H6 o m p Introducción 39 La reacción de carboranilo con un derivado de etileno proporciona al átomo de carbono una hibridación sp3 (Figura 22) en posición α al clúster mientras que la reacción con derivados acetilénicos proporciona hibridación sp2 (Figura 23). Figura 22. Reacción de carboranilo con un derivado de etileno y un acetileno. Figura 23. Reacción de carboranilo con un derivado de acetileno. 7.4.1.4 Reacción de obtención de sustituyentes alquinílicos. La introducción de un sustituyente alquinílico se consigue mediante el uso de cobre con el correspondiente halogenuro de alquino (Figura 24).68,69 Figura 24. Reacción de obtención de alquinilcarboranos. (68) Batsanov AS, Fox MA, Howard JAK, MacBride JAH, Wade K. Synthesis and structure of 1,12-diethynylpara-carborane. J. Organomet. Chem. 2000, 610, 20-24. (69) Fox MA, Cameron AM, Low PJ, Paterson MAJ, Batsanov AS, Goeta AE, Rankin DWH, Robertson HE, Schirlin JT. Synthetic and structural studies on C-ethynyland C-bromo-carboranes. Dalton Trans. 2006, 3544-3560. o m p Li [NiCl2(PPh3)2] o m p Ni PPh3 PPh3R3 R2 R1 o m p R3 R2 R1 R1 = 2-Py, CO2Me R 3 R 2 o m p R 3 R 2 R 3 R 2 o m p Ni PPh 3 PPh 3 1. CuCl 2. RI o m p Li o m p R 46 Introducción 8.2 Aplicaciones clínicas. La terapia de captura neutrónica de boro (BNCT) está siendo utilizada fundamentalmente en Japón, Europa y Estados Unidos para tumores cerebrales malignos del tipo de los glioblastomas multiformes (GBM). 89 Aunque aún no se ha demostrado ventajas significativas de la BNCT comparada con las terapias actuales, se espera que las estrategias en desarrollo logren una mejora sustancial en la supervivencia de los pacientes. La aplicación de BNCT para melanomas 90 en diferentes localizaciones ha mostrado resultados promisorios en Japón, Estados Unidos y Argentina. Los tumores de cabeza y cuello91,92 también han tenido respuestas importantes en los tratamientos realizados en Japón y Finlandia. Cabe resaltar la contribución innovativa realizada en Italia para BNCT aplicado a las metástasis hepáticas de cáncer de colon.93 8.3 Compuestos borados para su uso clínico. Una amplia variedad de agentes borados han sido sintetizados (Hiramatsu y col. 2011, Miyata y col. 2011, Wu y col. 2007, Yang y col. 2006), pero sólo dos han sido usados clínicamente. El BSH, el borocaptato de sodio y el BPA,86 la borofenilalanina (Barth y col. 2005).94 , 95 Este último ha sido utilizado en ensayos clínicos en Japón, Europa y los Estados Unidos, principalmente para el tratamiento de gliomas de alto grado, y más recientemente para tumores de cabeza y la región del cuello (Ariyoshi y col. 2007, Haginomori y col. 2009, Kimura y col. 2009). (89) Kawabata S, Matsushita Y, Furuse M, Miyatake S, Kuroiwa T, Ono K. Clinical study on modified boron neutron capture therapy for newly diagnosed glioblastoma. Kyoto University Research Reactor Institute. (90) González SJ, Bonomi MR, Santa Cruz GA, Blaumann HR, Calzetta Larrieu OA, Menéndez P, Jiménez Rebagliati R, Longhino J, Feld DB, Dagrosa MA, Argerich C, Castiglia SG, Batistoni DA, Liberman SJ, Roth BM. First BNCT treatment of a skin melanoma in Argentina: dosimetric analysis and clinical outcome. Australas. Phys. Eng. Sci. Med. 2003, 26, 97-103. (91) Aihara T, Morita N, Kamitani N, Kumada H, Ono K, Hiratsuka J, Harada T. BNCT for advanced or recurrent head and neck cancer. Applied Radiation and Isotopes. 2014, 88, 12–15. (92) Wang LW, Chen YW, Ho CY, Liu YWH, Chou FI, Liud YH, Liu HM, Peir JJ, Jiang SH, Chang CW, Liu CS, Wang SJ, Chu PY, Yen SH. Fractionated BNCT for locally recurrent head and neck cancer: Experience from a phase I/II clinical trial at tsing hua open-pool reactor.Applied Radiation and Isotopes. 2014, 88, 23–27. (93) Pozzi ECC, Cardoso JE, Colombo LL, Thorp S, Hughes AM, Molinari AJ, Garabalino MA, Heber EM, Miller M. Boron neutron capture therapy (BNCT) for liver metastasis: therapeutic efficacy in an experimental model. Radiation and Environmental Biophysics. 2012, 51, 331-339. (94) Yokoyama K, Miyatake SI, Kajimoto Y, Kawabata S, Doi A, Yoshida T, Asano T, Kirihata M, Ono K, Kuroiwa T. Pharmacokinetic study of BSH and BPA in simultaneous use for BNCT. Journal of Neuro-Oncology. 2006, 78, 227-232. (95) Katoa I, Onob K, Sakuraic Y, Ohmaed M, Maruhashic A, Imahorie Y, Kirihataf M, Nakazawaa M, Yuraa Y. Effectiveness of BNCT for recurrent head and neck malignancies. Applied Radiation and Isotopes. 2004, 61, 1069–1073. Introducción 47 8.3.1 Borofenilalanina (BPA). Es un derivado del aminoácido fenilalanina (Figura 31), sintetizado en finales de 1950 por Snyder y col. 1958.96 Es el compuesto borado más estudiado, dada su capacidad de llevar cantidades absolutas significativas de 10B al tumor con una buena relación tumor/tejido normal y tumor/sangre. Figura 31. Borofenilalanina (BPA). Este compuesto fue propuesto inicialmente para el tratamiento de melanomas dado que es un análogo de la tirosina, sustrato para la síntesis de melanina en las células normales, la cual se ve incorporada considerablemente en células tumorales. El BPA se utilizó posteriormente como portador de boro para el tratamiento del glioblastoma multiforme, el cáncer de cabeza de cuello y las metástasis colorrectales en hígado. Se siguen realizando diversos experimentos in vivo e in vitro para estudiar y aumentar la entrada del BPA en las células tumorales y analizar su potencial de utilización en otros tipos de tumores no ensayados a nivel clínico. Actualmente se encuentra en estudio distintos procedimientos que potencian la incorporación de BPA en las células malignas. (96) Snyder HR, Reedy AJ, Lenarz WJ. Synthesis of aromatic boronic acids. Aldehydo boronic acids and a boronic acid analog of tyrosine. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 835-838. BCOOH NH 2 HO HO 48 Introducción 8.3.2 GB-10 (decahidrodecaborato de sodio). El GB-10 (decahidrodecaborato de sodio, Na210B10H10) es un compuesto borado difusivo, que en disolución acuosa forma el anión (B10H10)2- (Figura 32). Figura 32. GB-10 (Decahidrodecaborato de sodio). El GB-10 fue propuesto para el tratamiento de tumores de cerebro ya que no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) intacta. La incorporación preferencial al tumor se debería a que los tumores de cerebro están rodeados de una BHE defectuosa que permite la incorporación de GB-10. Se demostró que no era tóxico en estudios con 15 pacientes voluntarios con gliobastoma multiforme y cáncer de células no pequeñas de pulmón. 8.3.3 BSH (mercaptoundecahidro-closo-dodecaborato de sodio). El BSH (mercaptoundecahidro-closo-dodecaborato de sodio, Na210B12H11SH) (Figura 33). Se asoció al tratamiento del glioblastoma multiforme demostrando su baja toxicidad en pacientes con glioblastoma multiforme y su efectividad cuando se emplea como portador de boro en BNCT. Figura 33. BSH (mercaptoundecahidro-closo-dodecaborato de sodio). Se intenta ampliar su uso en tumores de cabeza y cuello, combinado con la administración de BPA. A su vez, se realizan diversos experimentos in vivo e in vitro para estudiar su potencial utilización en otros tipos de tumores como melanoma, para mejorar su selectividad para el tratamiento con BNCT del carcinoma hepatocelular y tumores múltiples en hígado y células de glioma. 2Na + SH = 10 B 2Na + = 10 B OBJETIVOS Objetivos 51 Los objetivos concretos de este trabajo son: 1. Diseño, síntesis y actividad biológica de análogos adamantánicos con potenciales aplicaciones terapéuticas. 2. Desarrollo de análogos carboránicos de la vitamina D para terapia del cáncer. Síntesis, afinidad por el VDR, actividad biológica y estudios estructurales. En este trabajo se combina la metodología de síntesis puesta a punto en nuestro grupo de investigación con la incorporación de unidades o-carboránicas en la estructura de la vitamina D, tanto en la cadena lateral como en el anillo A, con el objetivo a largo a plazo de la obtención de nuevos agentes para la posible aplicación en BNCT. H H OHHO 3 H H OHHO 4 H H HO H H 56 HO ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN CAPÍTULO I: ANÁLOGOS DE LA 1,25D CON UNA UNIDAD ADAMANTÁNICA EN LA CADENA LATERAL 62 Antecedentes y Justificación El nuevo análogo adamantánico ADYW2 muestra una sustancial selectividad hacia diferentes células, actuando como un agonista parcial por unión al VDR, por un lado favoreciendo la conformación activa y por el otro la conformación inactiva dependiente de las condiciones celulares. Se cree que estos novedosos análogos podrían ser candidatos a nuevos fármacos de la vitamina D. 1.3.1 Síntesis estereoselectiva. Compuestos como ADT47, ADTT, ADMIs, ADNYs previamente sintetizados por el grupo de investigación de Yamada se aislaron enantioméricamente puros utilizando la técnica de HPLC equipado con una columna con fase estacionaria quiral. Para la obtención del compuesto ADYW2 se llevó a cabo una síntesis estereoselectiva vía reducción enantioselectiva de la cetona precursora, mediante la reducción de CoreyBakshi-Shibata (CBS) (Esquema 9), obteniéndose un 85% de ee.108 Esquema 9. Mecanismo de reducción Corey-Bakshi-Shibata (CBS). (108) (a) Itsuno S, Ito K, Hirao A, Nakahama S. Asymmetric reduction of aromatic ketones with the reagent prepared from (S)-(−)-2-amino-3-methyl-1,1-diphenylbutan-1-ol and borane. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1983, 8, 469. (b) Corey EJ, Bakshi RK, Shibata S. Highly enantioselective borane reduction of ketones catalyzed by chiral oxazaborolidines. Mechanism and synthetic implications. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5551−5553. (c) Corey EJ, Helal CJ. Reduction of carbonyl compounds with chiral oxazaborolidine catalysts: A new paradigm for enantioselective catalysis and a powerful new synthetic method. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 1986−2012. NB O HPhPh BH 3 Ligando NB O HPhPh H 3 B R 1 R 2 O R 1 >R 2 O B N Ph Ph R R 1 R 2 O H 2 BH O B N Ph Ph R O B H 2 R 1 R 2 H NB O HPhPh H 2 B O HB H 2 R 1 R 2 H R BH 3 R 1 R 2 HH 2 BO I II R 1 R 2 HHO R R R 1 >R 2 Antecedentes y justificación 63 1.3.2 Diseño, síntesis, caracterización funcional y estructural de una nueva serie de análogos adamantánicos de la vitamina D con una unidad adamantánica. Después de los estudios realizados por Yamada y col. recientemente se llevó a cabo en nuestros laboratorios, en colaboración con dicho grupo, el diseño, síntesis y determinación de la configuración de una serie de nuevos análogos adamantánicos. Después de la síntesis se llevó a cabo el análisis cristalográfico de rayos X del complejo en el rVDR. Esta nueva serie de análogos pierden el grupo metileno en la posición 2 manteniendo el sistema triénico de la vitamina D y la unidad voluminosa adamantánica en la cadena lateral (Figura 38). El objetivo de este trabajo es la síntesis y el estudio del comportamiento estructural y biológico de estos análogos, los cuales pueden provocar modificaciones sobre la H12 y los coactivadores, y como consecuencia, modificar la actividad biológica. Figura 38. Análogos sintetizados con una unidad adamantánica. CAPÍTULO II: ANÁLOGOS DE LA 1,25D CON UNA UNIDAD CARBORÁNICA Antecedentes y justificación 67 1.4 Análogos con una unidad carboránica en la cadena lateral. La necesidad de desarrollar nuevos ligandos del VDR sin efectos adversos, como la actividad calcémica, generó un interés sintético hacia el desarrollo de novedosos ligandos del VDR no secoesteroidales. Hasta hace poco, sólo una serie de derivados de bisfenol, tales como LG190178, habían sido desarrollados como potentes ligandos no secoesteroidales del VDR.109 Después de que Endo y col. demostraran que la unidad carboránica podía ser usada como una entidad modificadora de las interacciones hidrofóbicas entre el fármaco y su receptor Fujii y col. fueron los pioneros en desarrollar nuevos miméticos de la vitamina D (Figura 39) basados en una unidad carboránica con la intención de aumentar las interacciones hidrofóbicas entre el ligando y el receptor.110111,112 Figura 39. Miméticos de la vitamina D. (109) Yamada S, Makishima M. Structure-activity relationship of nonsecosteroidal vitamin D receptor modulators. Trends in Pharmacol. Sci. 2014, 7, 324-336. (110) Fujii S, Masuno H, Taoda, Y, Kano A, Wongmayura A, Nakabayashi M, Ito N, Shimizu M, Kawachi E, Hirano T, Endo Y, Tanatani A, Kagechika H. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20933-209411. (111) Endo Y, Iijima T, Kagechika H, Ohta K, Kawachi E, Shudo K. Dicarba-closo-dodecaboranes as a Pharmacophore. Novel potent retinoidal agonists. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 585-587. (112) Iijima T, Endo Y, Tsuji M, Kawachi E, Kagechika H, Shudo K. Dicarba-closo-dodecaboranes as a pharmacophore. Retinoidal antagonists and potential agonists. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 398-404. OH HO OH O HO O X H HO X=CH 2 :1α,25-Dihidroxivitamina D 3 X=O: Maxacalcitol OH HO 25 1 H O HO OH O OH LG190178 OH O HO OH PQ 68 Antecedentes y Justificación Estudios de relación estructura-actividad de ligandos secoesteroidales del VDR como los de la Figura 40, revelaron que la introducción de un pequeño sustituyente hidrófobo, tal como puede ser un grupo metilo o un grupo metileno, en la posición 2 aumenta la potencia ligando, debido a las interacciones de van der Waals entre el ligando y el centro receptor de la vitamina D.29 Cuatro elementos estructurales del ligando son esenciales para una efectiva unión al VDR: un núcleo hidrofóbico con un apropiado volumen, como presenta la unidad carboránica, y las tres apropiadas posiciones de los grupos hidroxilos, ya que son críticos para la actividad de los análogos. En base a estos estudios, Fujii y col. diseñaron un nuevo potente análogo no secoesteroidal de la vitamina D que incorpora una unidad central carboránica (compuesto R, Figura 40).29 Figura 40. Estructuras de potentes ligandos del VDR. 1.4.1 Diseño, síntesis, caracterización funcional y estructural de nuevos análogos con una unidad carboránica. En base a los estudios realizados hasta el momento se propuso la síntesis de nuevos análogos carboránicos de la vitamina D (Figura 41). Con el fin de estudiar tanto su comportamiento biológico como estructural se llevó a cabo un estudio estructura-actividad de ligandos carboránicos con distintas modificaciones, tanto de la posición de la unidad carboránica, como en la introducción de un grupo hidroxilo en la unidad carboránica, como la eliminación del sistema triénico con el objetivo de una mejora de la estabilidad química. Todas estas modificaciones han sido objeto de estudio en este trabajo. OH O HO OH R H HO OH HO H 2MD H HO OH HO H 2αΜe-1α,25(OH) 2 D 3 Antecedentes y justificación 69 Figura 41. Análogos sintetizados en este trabajo con una unidad carboránica H H OHHO 3 H H OHHO 4 H H HO H H 56 HO RESULTADOS Y DISCUSIÓN 78 Resultados y discusión La oxidación del adamantilmetanol comercial con dicromato de piridinio en CH2Cl2 proporcionó el aldehído 19 en un rendimiento del 73%. Se trata de un compuesto volátil, que se utiliza directamente en la siguiente reacción. Esquema 13. Síntesis del aldehído 19. 1.1.3 Síntesis del boronato 9. Para la síntesis del boronato 9 en primer lugar se preparó el bromuro vinílico 26 (esquema 14). La síntesis del bromuro 26 se llevó a cabo en cinco etapas con un rendimiento global del 54%, a partir de la mezcla de alcoholes 11 anteriormente preparada. Esquema 14. Síntesis del bromuro vinílico 26. El alcohol 11 se trató con nBuLi dando lugar al correspondiente alcóxido que, por reacción con cloruro de benzoilo, generó el benzoato 23. A continuación, la desprotección del éter de H H TBSO HO 11 1. n BuLi, THF, -78 ºC 2. BzCl 98% H H TBSO BzO 23 HF CH 3 CN/CH 2 Cl 2 90% H H HO BzO 24 PDC CH 2 Cl 2 96% H H BzO O 25 KO t Bu, Tol, -17 ºC → 0 ºC (Ph 3 PCH 2 Br)Br ) ) ) ) PPh 3 Br 79% H H BzO Br 26 PDC, CH 2 Cl 2 73% 18 OH 19 H O Resultados y discusión 79 silicio con HF proporcionó el alcohol 24 que se oxidó con PDC en CH2Cl2 para dar la correspondiente cetona 25. La reacción de Wittig entre el iluro de fósforo Ph3P=CHBr, generado in situ, y la cetona 25 dio lugar al bromuro vinílico 26 en un 79%. En la Figura 43 se muestran las principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro 26. Figura 43. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro 26 Una vez obtenido el bromuro 26 se procedió a la preparación del boronato 9 mediante una borilación de Miyaura con pinacoldiborano (Esquema 15).113 Esquema 15. Síntesis del boronato 27. Un primer intento sobre el bromuro vinílico 26 sometido a la reacción de Miyaura con bis(pinacolato)diborano en presencia del complejo [1,1’-bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloropaladio(II), como catalizador y triciclohexilfosfina, como ligando, proporcionó el H H BzO Br 26 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H BzO Br 26 5.21 2.03 1.79-1.67 1.79-1.67 80.3 144.8 37.3 73.0 5.63 97.4 8.08-7.45 165.6 H H BzO Br 26 PdCl 2(dppf).CH2Cl2 PCy3, B2Pin2 KOAc, DMSO, 80 °C H H BzO pinB 27 H H HO Br + (46%) 80 Resultados y discusión boronato 27 en un rendimiento del 46%, obteniéndose, como producto secundario, el alcohol desprotegido de la sustancia de partida. En vista de estos resultados, se decidió llevar a cabo la borilacion de Miyaura sobre el bromuro desprotegido. Para ello, en primer lugar se llevó a cabo la desprotección del grupo benzoato con DIBAL-H que generó el bromuro vinílico 22. El bromuro desprotegido 22 se sometió a las condiciones utilizadas anteriormente proporcionando un excelente rendimiento (97%). Esquema 16. Síntesis del boronato 9. En la Figura 44 se muestran las principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro 22. Figura 44. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro 22. H H HO Br 22 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H HO Br 22 3.85 2.03 1.79-1.66 1.79-1.66 80.3 144.7 37.3 71.7 84.7 5.63 97.4 H H BzO Br 26 H H HO pinB 9 H H HO Br 22 PdCl 2 (dppf).CH 2 Cl 2 PCy 3, B 2 Pin 2 KOAc, DMSO, 80 °C 97% 93% DIBAL-H, CH 2 Cl 2 -78 °C, 2h Resultados y discusión 81 Figura 45. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del boronato 9. 1.1.4 Síntesis de los compuestos (25S)-1 y (25R)-2. La construcción del sistema triénico mediante la reacción de ciclación-acoplamiento de Suzuki-Miyaura entre el enol triflato 10 y el boronato 9 proporcionó el compuesto deseado 28, como mezcla de epímeros en la posición C-25. La separación de los diastereoisómeros se logró mediante la metodología de Pirkle,115,116 la derivatización con isocianato de (S)-(+)- 1-(1-naftil)etilo proporciona una mezcla de carbamatos diastereoméricos. Posterior separación y desprotección de los hidroxilos condujo a los análogos finales (25S)-1 y (25R)-2 en un rendimiento global del 6% y 9%. (115) Pirkle WH, Adams PE. Broad-spectrum synthesis of enantiomerically pure lactones. Synthesis of sex pheromones of the carpenter bee, rove beetle, japanese beetle, black-tailed deer, and oriental hornet. J. Org. Chem., 1979, 44, 2169-2175. (116) Gibbs RA, Okamura WH. A Short Enantioselective Synthesis of (+)-Sterpurene: Complete intramolecular transfer of central to axial to central chiral elements. J. Am. Chem. SOC. 1988, 110, 4062-4063. H H HO 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) 3.84 2.04-1.96 1.71-1.57 1.71-1.57 4.90 1.25 B O O H H HO 165.7 82.4 B O O 84.9 80.1 71.7 37.3 9 9 82 Resultados y discusión Esquema 17. Preparación del compuesto (25S)-1 y (25R)-2. El objetivo en esta etapa fue la separación de la mezcla de diastereoisómeros mediante la metodología de Pirkle.115,116 La utilización de un reactivo quiral, el isocianato de (S)-(+)-1-(1-naftil)etilo permitió obtener los dos carbamatos (25S)-7 y (25R)-8, que presentan factores de retención cuya diferencia permitió una fácil separación mediante cromatografía rápida en columna. Una vez separados los carbamatos (25S)-7 y (25R)-8, la hidrólisis en condiciones básicas seguida de la desprotección de los éteres silícicos de las posiciones C-1 y C-3 con TBAF condujo a los análogos deseados (25S)-1 y (25R)-2 respectivamente. OTBS OTf TBSO Pd(PPh 3 ) 2 Cl 2, K 3 PO 4 (2M) THF, ta 40% H H HO 9 B O O NCO 1. , Py 2. DMAP, 0 °C → ta 24 h 1. NaOH, THF 50 °C, 48 h 2. TBAF, THF, ta H H HO OTBSTBSO 28 (25S)-7 (43%) (25 R)-8 (32%) H H O NH O Naf TBSO OTBS (25S)-1 (47%) (25 R)-2 (56%) H H HO OHHO Separación 25 25 Resultados y discusión 83 En la Figura 46 se muestran las principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del carbamato (25S)-7. Figura 46. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del carbamato (25S)-7. En la Figura 47 se muestran las principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del carbamato (25R)-8. Figura 47. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del carbamato (25R)-8. En la Figura 48 se muestra el espectro de 1H-RMN del análogo (25S)-1. H H O NH O Naf TBSO OTBS (25S)-7 8.12-7.43 6.24 6.02 5.67 5.18 y 4.87 5.03 4.37 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H O NH O Naf TBSO OTBS (25S)-7 155.2 148.3 140.8 135.1 H H O NH O Naf TBSO OTBS 8.12-7.39 6.24 6.02 5.67 5.18 y 4.87 5.05 4.37 4.19 1H-RMN (δ) 13C-RMN (δ) H H O NH O Naf TBSO OTBS 155.6 148.7 141.8 135.5 (25 R)-8(25 R)-8 84 Resultados y discusión Figura 48. Espectro de 1H-RMN del análogo (25S)-1 con las señales más relevantes del análogo. En la Figura 49 se muestra el espectro de 1H-RMN del análogo (25R)-2. Figura 49. Espectro de 1H-RMN del análogo (25R)-2 con las señales más relevantes del análogo. 012345678 ppm H-6 H-7 H-19 H-19 H-1 H-3 H-21 H-18 H-25 H H HO OHHO (25S)-1 25 24 21 18 8 7 6 19 10 31 012345678 ppm H-6 H-7 H-19 H-19 H-1 H-3 H-21 H-18 H-25 H H OHHO (25 R)-2 25 24 21 18 8 7 6 19 10 31 HO Resultados y discusión 85 1.2 Ensayos biológicos de los análogos (25S)-1 y (25R)-2. Las propiedades biológicas in vitro de los análogos (25S)-1 y (25R)-2 fueron evaluaron durante una estancia en las universidades Tokyo Medical and Dental University y Nihon University School en Japón en colaboración con el grupo de la Profesora Sachiko Yamada. 1.2.1 Estudios de afinidad por el VDR. En la Figura 50 se ilustran los resultados obtenidos en los estudios de afinidad por el VDR. Figura 50. Afinidad por el VDR de los análogos (25S)-1 y (25R)-2. La afinidad por el VDR se determinó mediante un ensayo competitivo, donde se utilizó un ligando marcado isotópicamente (3H-1,25D). Se midió la desintegración por minuto de ligando unido (DPM) al añadir diferentes concentraciones (10-12 M a 10-6 M) de la 1,25D y los análogos (25S)-1 y (25R)-2. El análogo (25S)-1 posee una afinidad por el VDR ligeramente menor que la hormona natural, mientras que el análogo (25R)-2 posee una afinidad dos órdenes de magnitud menos que la hormona natural. 1.2.2 Actividad transcripcional de los análogos. En la Figura 51 se ilustran los resultados obtenidos en los estudios de actividad transcripcional. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 DPM concentración(nM) 1,25(OH)2D3 (25S)-1 (25R)-2 86 Resultados y discusión Figura 51. Actividad transcripcional. La actividad transcripcional se comprobó en células HEK293 transfectadas con un gen reportador, TK-Spp × 3-LUC, el cual es activado por la 1,25D o los análogos (25S)-1 y (25R)-2 expresando luciferasa. Tras tratar las células con diferentes concentraciones de 1,25D y de (25S)-1 y (25R)-2, se determinó la actividad de la luciferasa para cada compuesto mediante la medida de su concentración mediante un fotómetro. El análogo (25S)-1 posee una actividad ligeramente menor que la hormonal natural, mientras que el análogo (25R)-2 resulto ser menos activo que la hormona natural. 1.2.3 Estudios de cristalización. Se llevaron a cabo estudios de cristalización en colaboración con el grupo del Prof. Ito Nobutoshi [Department of Structural Biology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University (TMDU)]. Se realizó la cristalización de los complejos formados entre los análogos (25S)-1 y (25R)-2 en el zVDRLBD mutado (Δ165-211). Se llevó a cabo la cristalización de los complejos ligando receptor mediante una técnica de difusión de vapor (el método de la gota invertida). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1,25D3 (25S)-1 (25R)-2 SPP×3-tk-LUC in HEK293 0nM 0.00001nM 0.0001nM 0.001nM 0.01nM 0.1nM 1nM 10nM Resultados y discusión 87 Los datos de Rayos X fueron procesados utilizando los programas REFMAC5117, COOT118 y PHENIX.119 La Figura 52 muestra la disposición tridimensional de los ligandos en el bolsillo de unión al VDR. Figura 52. Representación de las estructuras cristalina de ambos complejos. (117) Garib N. Murshudov GN, Skubák P, Lebedev AA, Pannu NS, Steiner RA, Nicholls RA, Winn MD, Long F, Vagin AA. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures, Acta. Cryst. 2011,67, 355367 . (118) Emsley P, Lohkamp B, Scott WG. Features and Development of Coot, Acta. Cryst. 2010, 66, 486-501.501. (119) Adams PD, Afonine PV, Bunkóczi G, Chen VB, Davis IW, Echols N, Headd JJ, Hung L-W, Kapral GJ, Grosse-Kunstleve RW, McCoy AJ, Moriarty NW, Oeffner R, Read RJ, Richardson DC, Richardson JS, Terwilliger TC, Zwart PH. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution, Acta Cryst. 2010, 66, 213-221. (25S)-1 (25 R)-2 94 Resultados y discusión 1.2 Síntesis del análogo 3 con una unidad carboránica en el entorno de la posición C-25. El esquema 18 muestra el análisis retrosintético planteado para el compuesto 3. Esquema 18. Análisis retrosintético del análogo 3. Como se puede observar en el análisis retrosintético la incorporación de la unidad carboránica en la cadena lateral del precursor del análogo 3, tiene lugar en la última etapa de la síntesis, con el fín de evitar problemas sintéticos existentes en la química del carborano. La construcción del sistema triénico se lleva a cabo mediante una reacción de ciclación intramolecular catalizada por Pd(0) del enol triflato 10,113 seguida de un acoplamiento de Suzuki-Miyaura entre el intermedio Pd(II) resultante y el boronato 30. La cadena lateral insaturada se introduce en el segundo paso de la ruta sintética en el tosilato 32, procedente del diol Inhoffen-Lythgoe. H H B O O30 OTBS OTf TBSO 10 + HO H H 31 H H HO TsO 32 H H HO HO 33 H H OTBSTBSO 29 TMS TMSH H OHHO 3 Resultados y discusión 95 1.2.1 Síntesis de la cadena lateral. Esquema 19. Síntesis del precursor de la cadena lateral. El tratamiento del alquinol 34 con nBuLi y posterior atrapado con TMSCl generó el correspondiente compuesto diprotegido, que en medio ácido dio lugar al alcohol 35 por desprotección selectiva del éter silícico. A continuación, la tosilación del hidroxilo seguida de tratamiento con LiBr generó el bromuro 37. Este es un precursor clave para la construcción de la cadena lateral. Debido a la alta volatilidad del bromuro, éste fue purificado por destilación.122,123 1.2.2 Síntesis del alcohol 31, construcción de la cadena lateral. Esquema 20. Síntesis del alcohol 31. (122) Dieter RK, Ningyi C, Asymmetric synthesis of enantioenriched (+)-elaeokanine A, Chen. J. Org. Chem. 2006, 71, 5674-5678. (123) Pumar MC, Mouriño A, Castedo L, Estudios en la síntesis de metabolitos de la vitamina D y análogos. Síntesis de triacetato de 1,3,5-trihidroxi-21-nor-colesta-1,7-dieno, Anal. Quím. 1988, 84C, 105-111. HO 1. n BuLi, THF, -78 °C 2. TMSCl, 0 °C, 1 h 3. HCl 10% HO TMS 99% TsCl, Py 4 °C, 24 h 84% TsO TMS LiBr, DMF, ta 70% Br TMS 34 35 36 37 TMS Br Py, TsCl 0 °C, 24 h H H HO HO H H HO TsO 33 32 80% 1. 1,2-dibromoetano THF/Et 2 O, 70 °C Mg 2. Li 2 CuCl 4 , THF/Et 2 O -78 °C → ta 96% TMS MgBr 38 HO H H 31 TMS 37 96 Resultados y discusión El tosilato 32 se generó a partir del diol Inhoffen-Lythgoe 33 en un rendimiento del 80%. El magnesiano 38 preparado in situ procedente del tratamiento del bromuro 37 con pequeñas porciones de cinta de Mg en éter dietílico a reflujo,124 se hizo reaccionar con el tosilato 32, en presencia de Li2CuCl4 permitiendo el desplazamiento nucleófilo del tosilato y la formación de la cadena lateral en un rendimiento del 96%. En la Figura 53 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del alcohol 31. Figura 53. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del alcohol 31. 1.2.3 Síntesis del bromuro vinílico 40. Esquema 21. Síntesis del bromuro vinílico 40. La oxidación del alcohol 31 se realizó con dicromato de piridinio en CH2Cl2 obteniéndose la cetona 39 en un rendimiento del 98%. La reacción de Wittig entre el iluro de fósforo (124) Lawson KV, Rose TE, Harran PG. Synthesis of a designed sesquiterpenoid that forms useful composites with peptides and related oligomers Tetrahedron Letters, 2011, 52, 653–654. HO H H 31 TMS HO H H 31 TMS 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) 2.17 0.90 4.07 0.92 107.5 84.0 18.4 13.3 68.9 PDC, CH 2 Cl 2 98% H Br O H H 39 H 40 KO t Bu, PhMe, -17 °C → 0 °C (Ph 3 PCH 2 Br)Br ) ) ) ) PPh 3 Br 79% HO H H 31 TMS TMS TMS Resultados y discusión 97 Ph3P=CHBr, generado in situ por tratamiento de bromuro de dibromometiltrifenilfosfonio con terc-butóxido potásico, y la cetona 39 proporcionó el bromuro vinílico 40 en un 79%. En la Figura 54 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro vinílico 40. Figura 54. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del bromuro vinílico 40. 1.2.4 Síntesis del boronato 30. En primer lugar, se intentó preparar el boronato 30 a partir del bromuro 40 mediante una borilación de Miyaura utilizando las condiciones desarrolladas en este grupo de investigación, con bis(pinacolato)diborano en presencia del complejo [1,1’ bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II)-diclorometano, como catalizador y triciclohexilfosfina como ligando. Desafortunadamente, bajo estas condiciones no se obtuvo el boronato deseado sino que se produjo la descomposición de la sustancia de partida. En vista de estos resultados se decidió preparar el boronato 30 utilizando un procedimiento alternativo (Esquema 22). La metalación bromuro con tBuLi a -78 °C, seguida del atrapado del anión con triisopropóxido de boro y posterior transesterificación con pinacol, proporcionó el boronato 30 deseado, en un rendimiento del 88%. Esquema 22. Síntesis del boronato 30. H Br H 40 TMS H Br H 40 TMS 13 C-RMN (δ) 144.9 97.4 18.7 107.5 84.3 11.8 1 H-RMN (δ) 2.20-2.17 0.56 0.93 5.64 2.86 1. t BuLi, THF-PhMe, -78 °C 2. B(O i Pr) 3 , -78 °C 3. Pinacol, -78 °C → ta 88% H Br H 40 TMS H H pinB 30 TMS pinB = O B O 98 Resultados y discusión En la Figura 55 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del boronato 30. Figura 55. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del boronato 30. 1.2.5 Síntesis del análogo 3. Finalmente, la síntesis del análogo 3 se completó en 3 etapas (Esquema 23). Esquema 23. Síntesis del análogo 3. 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H pinB 30 TMS H H pinB 30 TMS 2.17 0.91 0.54 4.60 3.16 107.8 84.3 18.8 12.1 166.2 OTBS OTf TBSO 98% (Ph 3 P) 2 PdCl 2 , K 3 PO 4 THF, H 2 O, ta, 1 h 10 K 2 CO 3 THF/MeOH 92% 43% 1. B 10 H 44 , PhNMe 2 PhMe, Δ, 1 h 2. HF (48%), CH 2 Cl 2 /CH 3 CN H H OHHO 3 H H OTBSTBSO 29 H H pinB 30 TMS H H OTBSTBSO 41 TMS + Resultados y discusión 99 El sistema triénico del análogo 3 se construyó en excelente rendimiento mediante la reacción de ciclación-acoplamiento de Suzuki-Miyaura entre el enol triflato 10 (precursor del anillo A) y el boronato 30.113,125 A continuación, el tratamiento del compuesto 41 con carbonato potásico en metanol dio lugar a la desprotección selectiva del grupo sililo del alquino de la cadena lateral en un rendimiento del 92%. Por último, la introducción de la unidad carboránica por inserción de decaborano en el alquino, siguiendo el método de Wang. 126 y posterior desprotección con HF proporcionó el análogo 3 deseado, en rendimiento moderado. La síntesis del análogo 3 se llevó a cabo en 9 etapas con un rendimiento global del 20%. En la Figura 56 se muestra el espectro de 1H-RMN del análogo 3. Figura 56. Espectro de 1H-RMN del análogo 3 con las señales más relevantes. (125) Mouriño A, Torneiro M, Vitale C, Fernández S, PérezSestelo J, Anné S, Gregorio C. Effident and versatile synthesis of A-ring precursors of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 and analogues. Application to the synthesis of lythgoe-roche phosphine oxide. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4713-4716. (126) Li G, Zhang J, Wu B, Wang .Carborane as a tunable tag for Ru catalysts: generating an anion-appended recyclable and robust catalyst suitable for the noncovalent binding concept. J. Org.Lett. 2007, 9, 42634266. 012345678 ppm H-6 H-7 H-19 H-19 H-1 H-3 H-26 H-21 H-18 H H OHHO 3 26 25 24 21 18 8 7 6 19 10 31 100 Resultados y discusión 1.2.6 Ensayos biológicos del análogo 3. El análogo 3 se envió a los laboratorios del Profesor Román Pérez-Fernández (Departamento de Fisiología-Facultad de Medicina, CIMUS, Universidad de Santiago de Compostela) donde se realizaron distintos ensayos para evaluar las propiedades biológicas. 1.2.6.1 Ensayos de proliferación celular. La proliferación celular se evaluó en las células de cáncer de mama humanas MCF-7 utilizando el ensayo MTT. El análogo 3 redujo significativamente la proliferación celular a concentraciones de 10-8 y 10-7 M, de manera similar a la 1,25D, con respecto a las células (control) tratadas con vehículo (Figura 57). Figura 57. Proliferación en células MCF-7. 1.2.6.2 Estudios de afinidad por el VDR. Se estudió la capacidad biológica del análogo 3 para unirse a VDR mediante un ensayo de unión competitiva, en comparación con la hormona natural 1,25D. La afinidad del análogo 3 por el VDR es aproximadamente el doble que la de la 1,25D (CI50: 2.9 x10-9 M y 5.7 x 10-9 M), respectivamente) (Figura 58). 0 20 40 60 80 100 120 Cell proliferation (%) Proliferation MCF-7 cells 10 -7 [M] 10 -8 10 -7 10 -8 Vehicle 1,25(OH)2D3 Carborano A Resultados y discusión 101 Figura 58. Afinidad de unión al VDR. 1.2.6.3 Actividad transcripcional. Para estudiar la capacidad del compuesto 3 para inducir la actividad transcripcional en un gen diana de la vitamina D, las células MCF-7 fueron transfectadas con el vector de pCYP24A1-Luc, y 48 horas más tarde fueron tratadas con el compuesto 3 y con la 1,25D, como control. Tanto el compuesto 3 como la 1,25 D, indujeron una activación dependiente de la dosis del gen CYP24A1, tal como se observa por el incremento de la actividad de la luciferasa, pero el análogo es aproximadamente unas 43 veces menos potente que la 1,25D (CI50: 1,1 x 10-8 M y 4,7 x 10-9 M, respectivamente) (Figura 59). Figura 59. Actividad transcripcional. Carborano = 2,9x10 -9 M 1,25 (OH) 2 D 3 = 5,7x10 -9 M EC 50 : Polarization (mP) -12 -10 -8 -6 -4 100 200 300 400 1,25(OH)2D3 Carborano Log[compound] (M) Inestable = 1.9x10 -8 M 1,25 (OH) 2 D 3 = 4.7x10 -9 M EC 50 : 1,25(OH)2D3 Inestable -11 -10 -9 -8 -7 -6 0 100 200 300 Log[compound] (M) Relative Photon Counts 102 Resultados y discusión 1.2.6.4 Estudios de cristalización. El análogo sintetizado 3 se envió al IGBMC (Instituto de Genética y de Biología Molecular y Celular - Illkrich, Francia) y se trató con el receptor mutado de Moras, zVDRLBD mutado (Δ165-453) para inducir la cristalización del respectivo complejo ligando-zVDR. Los datos de Rayos X fueron procesados utilizando los programas BUSTER 127 y COOT. 118 La difracción de rayos X de este complejo permitió deducir su estructura cristalina y su disposición tridimensional de los ligandos en el bolsillo de unión al VDR (Figura 60). Figura 60. Representación de la estructura cristalina del análogo 3 en el zVDRLDB. (127) Bricogne G, Blanc E, Brandl M, Flensburg C, Keller P, Paciorek W, Roversi P, Sharff A, Smart OS, Vonrhein C, Womack WO. BUSTER version 2.11.2. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd 2011. Resultados y discusión 103 1.3 Síntesis de análogos carboránicos de la vitamina D funcionalizados en la posición orto. Los estudios de docking indicaron que la introducción de un grupo hidroxilo en la posición C-26 (orto) permitiría establecer una nueva interacción, a través de un enlace de hidrógeno, con la His305. Para la síntesis del análogo 4 se propuso el siguiente plan sintético (Esquema 24). Esquema 24. Análisis retrosintético del análogo 4. Tras la síntesis del análogo 3 descrito anteriormente, se decidió continuar la serie de análogos carboránicos de la vitamina D, utilizando el compuesto 29 como precursor de futuros análogos modificados en la posición orto. 1.3.1 Preparación del análogo con hidroxilo en posición orto, vía siloxialquino 42. El primer paso para obtener el análogo 4 fue la preparación del compuesto 42 para ello se siguieron procedimientos descritos en la literatura. Esquema 25. Intento de síntesis del sililoxialquino 42. 1. LiHMDS, THF, -78 °C 2. t BuOOLi, THF, -78 °C 3. TIPSOTf, THF, -78 °C H H OTBSTBSO 29 H H OTBSTBSO 42 TIPSO H H OTBSTBSO 42 H H OHHO 4 HO TIPSO H H OTBSTBSO 29 110 Resultados y discusión se trató con LiAlH4 proporcionando el hemiacetal 49 en un rendimiento del 60%. La reacción siguió el mismo camino que en la reacción sobre el sistema triénico generándose el hemiacetal y no el hidroxilo esperado. El hemiacetal se revirtió al benzoato 48 por oxidación con PDC en un rendimiento del 67%, comprobandose así la procedencia y estabilidad de este hemiacetal. En las Figuras 63 y 64 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del benzoato 48 y del hemiacetal 49. Figura 63. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del benzoato 48. Figura 64. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del hemiacetal 49. 7.76 7.57 7.45 3.97 186.6 69.2 83.5 79.6 48 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H TBSO 48 OPh O H H TBSO OPh O 0.88 0.80 18.3 13.5 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) 7.38 5.06 4.00 129.3 139.5 83.5 80.8 H H TBSO 49 O Ph HO H H TBSO 49 O Ph HO 0.80 18.6 13.6 0.93 Resultados y discusión 111 1.3.4.1.2 Intento de reducción del benzoato 48 al alcohol 50. Se llevó a cabo un estudio metodológico de la transferencia del benzoato al alcohol deseado 50. Esquema 30. Intento de síntesis del alcohol 50. Se intentó la síntesis del compuesto 50 con el hidroxilo en la posición orto del carborano a través de la reducción con LiAlH4 o por metanólisis con MeONa del benzoato 48. Ya se había observado el comportamiento de la reacción de reducción generando, como único producto, un hemiacetal estable en lugar del alcohol 50. En este caso el aumento de temperatura en la reducción o el uso de MeONa no permitió aislar el hemiacetal sino que favoreció la completa reducción del éster para dar el compuesto 47, hidrogenado en la posición orto tal y como demuestra la aparición de un singulete a 3.55 procedente del H en posición orto. 1.3.4.1.3 Intento de la síntesis del alcohol 50 a partir del siloxicarboranilo 52. En este punto se decidió cambiar de nuevo la estrategia y volver a la ruta inicial partiendo del siloxialquino 51. Se llevó a cabo un estudio metodológico de la introducción del oxigeno en el alquino en el biciclo CD para posteriormente poder aplicar los resultados sobre el sistema triénico. LiAlH4 THF, Δ NaOMe MeOH, ta H H TBSO 48 BzO H H TBSO 50 HO H H TBSO 47 H 112 Resultados y discusión Esquema 31. Síntesis del sililoxicarboranilo 52. El sililoxicarborano 52 se preparó a partir del alquino 46. Mediante la desprotonación con hexametildisilazanuro de litio (preparado previamente mediante el tratamiento de hexametildisilazano con nBuLia -78 °C). El anión resultante se trató con terc-butil peróxido de litio generado in situ mediante el tratamiento hidroperóxido de terc-butilo con hexametil disilazanuro de litio. El alquinóxido generado se hizo reaccionar con TIPSOTf obteniéndose el sililoxialquino deseado en un rendimiento del 65%. La introducción de la unidad carboránica, se llevó a cabo siguiendo el mismo método de Wang como se describió anteriormente obteniéndose el compuesto 52 en un rendimiento del 43%, compuesto clave para el estudio metodológico de las diferentes transformaciones.126 En la Figura 65 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 52. Figura 65. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del siloxicarboranilo 52. B 10 H 44 , PhNMe 2 Tolueno, Δ, 12 h 43% H H TBSO 46 1. LiHMDS, THF, -78 °C 2. t BuOOLi, THF, -78 °C 3. TIPSOTf, THF, -78 °C H H TBSO 51 TIPSO 65% H H TBSO 52 TIPSO 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) 3.99 1.14-1.04 69.2 18.4 H H TBSO 52 TIPSO H H TBSO 52 TIPSO 0.90 0.85 13.5 12.5 Resultados y discusión 113 1.3.4.1.4 Ensayos para la obtención del alcohol 50. Una vez obtenido el compuesto 52 se ha decidido ensayar diferentes condiciones para obtener el hidroxilo en la posición orto. Se han llevado a cabo varios ensayos con diferentes condiciones y reactivos. Esquema 32. Intento de obtención del hidroxilo en posición orto del carborano. Tabla 7. Condiciones de reacción para el alcohol 50. Entrada Reactivo Disolvente Producto 1 HF CH2Cl2/CH3CN 47b 2 AG-50W-X4 MeOH 50 3 TBAF THF 50 Como se puede observar en la Tabla 7, mediante el tratamiento con el HF se obtiene el compuesto no deseado 47b. Mediante RMN se observó la señal característica de 3.55 ppm procedente de H en posición orto (entrada 1),mientras que el tratamiento con una resina de intercambio catiónico (AG-50W-X4) o una disolución tetrahidrofuránica de TBAF (entradas 2 y 3) proporcionaron el compuesto deseado 50, según se deduce por RMN, donde se observa la desaparición de la señal a 3.55 ppm. En la Figura 66 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 50. H H TBSO 52 TIPSO H H RO HO H H RO H 50, R= OTBS 50b, R= H 47, R= OTBS 47b, R= H 114 Resultados y discusión Figura 66. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del alcohol 50. 1.4 Síntesis de análogos de la vitamina D con una unidad carboránica sustituyendo el anillo A. Al mismo tiempo que se desarrollaba la síntesis del carborano hidroxilado, se decidió continuar la serie de análogos diseñada con la preparación de otros análogos carboránicos incorporando la unidad carboránica en diferentes posiciones de la estructura de la vitamina D. En el esquema 33 se muestra el análisis retrosintético planteado para la síntesis del compuesto 5. Esquema 33. Análisis retrosintético del análogo 5. 3.99 69.1 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) 106.3 81.8 H H TBSO 50 HO H H TBSO 50 HO 0.88 0.88 13.6 18.5 H H HO H H TESO Cl + 5 53 54 H H TESO HO 55 H H TESO EtO 2 C56 H H HO HO 57 Li Resultados y discusión 115 La incorporación de la unidad carboránica en lugar del anillo A se lleva a cabo en la última etapa de la síntesis igual que en análogos anteriores para evitar posibles problemas con la química del carborano mediante una reacción entre el carboranil de litio y el cloruro alílico 53 procedente de una sustitución nucleófila del alcohol alílico 55, este último resultante de una reducción del éster 56. El éster 56 se obtuvo mediante reacción de HornerWadsworth-Emmons sobre la cetona 58 procedente de la oxidación del alcohol conocido 57. 1.4.1 Síntesis del alcohol 55. Para la preparación del alcohol 55 se planteó la retrosíntesis que se muestra en el esquema 34. Esquema 34. Síntesis del alcohol 55. La preparación del alcohol 55 se llevó a cabo a partir del alcohol 25-hidroxi alcohol de Grundmann 57 en 4 etapas con un rendimiento global del 57%. Se llevó a cabo a partir del alcohol 57 que, por oxidación con PDC seguida de la protección del OH de C-25, proporcionó la cetona 59, que posteriormente mediante una reacción de HornerH H HO H H O HO HO PDC, CH 2 Cl 2 97% 57 58 TESCl, Im DMAP, DMF 97% H H O TESO 59 (EtO) 2 P(O)CHNaCO 2 Et THF, 80 °C 77% H H TESO EtO 2 C56 LiAlH 4 Et 2 O, 0 ºC H H TESO 55 HO 79% 116 Resultados y discusión Wadsworth-Emmons permitió obtener el éster 56. Tras la reducción del éster con LiAlH4 se obtuvo finalmente el alcohol 55. 1.4.2 Síntesis del éster 56. Tabla 8. Condiciones ensayadas para la obtención del éster 56. Entrada Condiciones Disolvente Producto Relación E/Z Rendimiento(%) 1 (EtO)2P(O)CH2CO2Et NaOEt, 0 °C →Δ EtOH Cetona epimerizada 2 (EtO)2P(O)CH2CO2Et LiCl, DBU, 23 °C CH3CN Cetona epimerizada 3 (EtO)2P(O)CH2CO2Et NaH, 0 °C THF Compuesto 56 3:1 79 La cetona 59 se sometió a diferentes condiciones para la elongación de la cadena hasta obtener el compuesto de interés 56. El tratamiento con el anión del fosfonoacetato de trietilo generado por tratamiento con NaOEt (entrada 1) proporcionó la cetona de partida epimerizada en C-14. Se recurrió a la utilización de LiCl en presencia de una base voluminosa como DBU (entrada 2) pero en este caso se obtuvo también la sustancia de partida epimerizada en C-14. La reacción de Horner-Wadsworth-Emmons (entrada 3) permitió obtener el éster 56 en un rendimiento del 77% con una relación E/Z de 3:1. La mezcla de epímeros se separó por HPLC obteniendo el compuesto 56 puro con el cuál se continuó la síntesis para obtener el alcohol 55. En la Figura 67 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del éster 56. Resultados y discusión 117 Figura 67. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del éster 56. En la Figura 68 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del alcohol alílico 55. Figura 68. Principales señales de 1H-RMN y 13C-RMN del alcohol 55. 1.4.3 Síntesis del cloruro 53. La preparación del cloruro 53 a partir del alcohol 55 se ensayó con el procedimiento de Corey-Kim (entrada 1)131 pero se produjo la descomposición del material de partida. El tratamiento del alcohol alílico con PBu3 en CCl4 (entrada 2)132 proporcionó el cloruro alílico 55, que debido a su inestabilidad se utilizó directamente en el siguiente paso. (131) Corey EJ, Kim CU, Takeda M. Tetrahedron Lett. 1972,4339-4342. (132) Sikervar V, Fleet JC, Fuchs LP. Fluoride-mediated elimination of allyl sulfones: Application to the synthesis of a 2,4-dimethyl-A-ring vitamin D3 analogue. J. Org. Chem. 2012, 77, 5132−5138. H H TESO EtO 2 C56 1 H-RMN (δ) 13 C-RMN (δ) H H TESO EtO 2 C56 5.45 4.14 166.8 163.4 111.7 0.93 0.60 11.9 18.6 H H TESO HO 55 H H TESO HO 55 5.21 4.20 58.5 118.9 143.6 1H-RMN (δ) 13C-RMN (δ) 0.93 0.55 11.7 18.6 118 Resultados y discusión Esquema 35. Síntesis del cloruro 53. Tabla 9. Condiciones de formación del cloruro. Entrada Condiciones Disolvente Producto 1 NCS, DMS, 0 → -20 °C DMF-CH2Cl2 Descomposición 2 Bu3P, Py, 0 °C CCl4 53 1.4.4 Síntesis del análogo 5. La formación del compuesto 5 a partir del alcohol alílico 55 se lleva a cabo en 3 etapas con un rendimiento global del 74%. Esquema 36. Síntesis del análogo 5. Dada la inestabilidad del cloruro alílico 53 se integró su preparación en la secuencia final de la preparación del análogo 5: transformación del alcohol alílico 55 en el cloruro alílico 53, sustitución del cloruro por el closo-orto-carborano mediante el desplazamiento nucleófilo con una disolución de orto-carboranil litio seguido de la desprotección con HF del hidroxilo proporcionó el análogo 5. La reacción de introducción del núcleo carboránico H H TESO HO H H TESO Cl 55 53 H H TESO HO ,THF, -78 ºC 2. 3. HF, CH 2 Cl 2 -CH 3 CN PBu 3 , Py, 0 ºC, CCl 4 1. 74% 55 Li H H HO 5 Resultados y discusión 119 requirió el empleo de un exceso de una disolución de orto-carboranil litio (2 equiv) para que la reacción de sustitución resultara con éxito. En la Figura 63 se muestran las señales más significativas de 1H-RMN y 13C-RMN del análogo 5. Figura 69. Espectro de 1H-RMN del análogo 5 con las señales más relevantes. 1.4.5 Ensayos biológicos del análogo. El análogo 5 se envió a los laboratorios del Prof. Román Pérez (Departamento de FisiologíaFacultad de Medicina, CIMUS, Universidad de Santiago de Compostela), donde se realizarán los estudios de afinidad por el VDR e inducción de la transcripción. Al mismo tiempo se están realizando ensayos de modelo in vitro para su empleo en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en colaboración con el Profesor J. Castillo (coordinador del laboratorio de investigación de neurociencias clínicas, área neurovascular de Santiago de Compostela). 1.4.5.1 Estudios de cristalización. El análogo 5 se ha enviado al IGBMC (Instituto de Genética y de Biología Molecular y Celular, Illkrich, Francia) para el estudio cristalográfico. 012345678 ppm H-1 '' Ho -carborano H-2 '' H-7 H-8 ' H H HO 5 2'' 1'' 8' 7 Resultados y discusión 127 127 Procedimientos generales Las reacciones con compuestos o mezclas sensibles al oxígeno o a la humedad se llevaron a cabo bajo atmósfera de argón desoxigenado y seco (Argón Alphagaz-1). Los matraces utilizados para las reacciones se secaron en una estufa a 150 ºC, al menos durante 12 h y luego se flamearon o calentaron con un decapador y enfriaron bajo corriente de argón. Los disolventes utilizados se purificaron según las indicaciones de Brown133 y se destilaron bajo atmósfera de argón, utilizando un agente desecante adecuado. Et2O y THF se destilaron de Na-benzofenona, tolueno de Na, piridina, iPr2NH, Et3N, Et2NH y CH3CN de CaH2, CH2Cl2 de P2O5, MeOH de Mg/I2, DMSO se destiló de CaH2 a presión reducida y luego se almacenó sobre tamices moleculares de 4 Å y la DMF de calidad de síntesis se secó sobre tamices moleculares de 4 Å. Las disoluciones comerciales de nBuLi (disolución en hexanos, Aldrich) tBuLi (disolución en pentano, Aldrich), nHexLi (disolución en hexanos, Acros) se valoraron con N-benzilbenzamida (Aldrich) antes de su uso. El dicromato de piridinio (PDC) se preparó según las indicaciones de Corey.134 El bromuro de bromometiltrifenilfosfonio (Ph3PCH2Br)Br la N-(5-cloro-2-piridil)triflimida y el peryodinano de Dess-Martin (DMP) se prepararon siguiendo la bibliografía. 135,136,137 Para las reacciones a baja temperatura se utilizaron baños de hielo seco con acetona o baños de metanol enfriados con una sonda de refrigeración Inmersión Cooler EK-90 de Thermo Fisher Scientific, provista de un controlador de temperatura. Para las reacciones a alta temperatura se utilizaron baños de silicona provistos de termómetro de contacto en el baño. Las temperaturas indicadas se refieren a la temperatura del baño externo. Las jeringas utilizadas fueron de plástico (Discardit) y de vidrio (Hamilton), con agujas con acoplamiento Luer. La adición de disoluciones o disolventes se realizó con jeringa o cánula. Salvo que se indique lo contrario se utilizó agitación magnética. Las fases orgánicas procedentes de la elaboración de las diversas reacciones se secaron con Na2SO4 anhidro. La concentración de disolventes a presión reducida se realizó en un rotavapor Büchi modelo R-114. (133) Brown HC. Organic synthesis via boranes. John Wiley & Sons. New York, 1975. (134) Corey EJ, Schmidt G. Useful procedures for the oxidation of alcohols involving pyridinium dichromate in approtic media. Tetrahedron Lett. 1979, 20, 399-402. (135) Vassilikogiannakis G, Hatzimarinaki M, Orfanopoulos M. Mechanism of the [2 + 2] photocycloaddition of fullerene C60 with styrenes. J. Org. Chem. 2000, 65, 8180-8187. (136) Comins DL, Dehghani A, Foti, CJ, Joseph, SP. Pyridine-derived triflating reagents: N -(2-pyridyl)triflimide and N -(5-chloro-2-pyridyl)triflimide. Organic Syntheses 1997, 74 , 77-83. (137) Stephen A, Hashmi K, Bats JW, Choi JH, Schwarz L. Isomerizations on silica gel: Synthesis of allenyl ketones and the first Nazarov cyclizations of vinyl allenyl ketones. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 74917494. 128 Resultados y discusión El progreso de las reacciones se siguió mediante cromatografía en capa fina. Se utilizaron placas de aluminio con una capa de gel de sílice GF-254 Merck. Después de observar la fluorescencia a la luz ultravioleta de 254 nm, las placas se revelaron tratándolas con distintas disoluciones reveladoras: (a) disolución de p-anisaldehído en etanol y (b) disolución de molibdato cérico amónico en etanol y posterior calentamiento con un decapador. Para la cromatografía rápida en columna se utilizaron las condiciones de Still.138 Se utilizó gel de sílice (230-400 mesh, Merck). Los disolventes (hexanos, EtOAc y CH2Cl2) utilizados para la cromatografía rápida se destilaron antes de su uso. El Et2O y el terc-butilmetiléter (MTBE) se utilizaron sin destilar. Las separaciones por HPLC se realizaron en un equipo SHIDMADZU modelo LC-8A equipado con un detector de UV THERMO SP modelo Spectra 100 utilizando una columna Phenomenex-LUNA 5μ Silica(2), 10x250 mm. Los disolventes utilizados fueron de grado HPLC (hexanos, EtOAc e iPrOH) y se desoxigenaron a vacío antes de su uso. Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker AMX-500 (11.74 T, 500 MHz para 1H y 126 MHz para 13C), Varian Inova-400 (9.39 T, 400 MHz para 1H y 101 MHz para 13C) y Bruker DPX-250 (5.87 T, 250 MHz para 1H y 63 MHz para 13C) pertenecientes al servicio de RMN de la Universidad de Santiago de Compostela. Los espectros se realizaron utilizando CDCl3 como disolvente. Los desplazamientos químicos se expresan en unidades δ (ppm) en la escala del TMS (δ = 0.0 ppm) y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizó como referencia interna la señal residual del disolvente; CDCl3: 7.26 ppm (1H) y 77.0 ppm (13C, triplete). Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro de masas de sector magnético Thermo MAT95XP (EI+) y en un espectrómetro de masas en tándem (MS/MS) LC-Q-q-TOF Applied Biosystems QSTAR Elite (ESI) de los Servicios de Apoyo a la Investigación de la Universidad de A Coruña. Los espectros IR se registraron en un espectrofotómetro de infrarrojo, BRUKER VECTOR 22 de de los Servicios de Apoyo a la Investigación de la Universidad de A Coruña. Las reacciones con ultrasonidos se realizaron en un baño JP Selecta Ultrasons. Los compuestos con biciclo CD se nombraron utilizando la nomenclatura esteroidal y los análogos de la vitamina D3 se han nombrado utilizando las normas asignadas para derivados de la vitamina D.139,140 Para nombrar los demás compuestos se ha utilizado la nomenclatura de la IUPAC. (138) Still WC, Khan MY, Mitra A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolutions. J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925. (139) (a) Definitive rules for nomenclature of steroids. Pure Appl. Chem. 1972, 31, 283-322. (b) Nomenclature of vitamin D. Pure Appl. Chem. 1982, 54, 1511-1516. (140) Coffey S. Rodd’s chemistry of carbon compounds. Vol II. Part D: Steroids. Elsevier. London 1970. Resultados y discusión 129 129 A continuación se recogen las referencias y la casa comercial correspondiente para cada uno de los reactivos utilizados en este trabajo. AG50W-X4, Aldrich, Ref. 428825 nBuLi, Acros, Ref. 81278000 tBuLi, Aldrich, Ref. 186198 B(OiPr)3, ABCR, 5419 B10H14, Alfa Aesar, Ref. 17702 tBUOOH, Aldrich, Ref. 19997 o-Carborano, Katchem, Ref.16372 CBr4, Acros organics, Ref. 325151000 Cy3P, Aldrich, Ref. 261971 DAIB, Alfa Aesar, Ref. B24531 DIBAL-H, Aldrich, Ref. 214973 DMAP, Fluka, Ref. 29224 Fosfonoacetato de trietilo, Fluka, Ref.79525 1-Hidroximetil-adamantano, Acros,180050025 HCl, Quimipur HF, Merck, Ref. 1003340500 H5IO6, Aldrich, Ref. 375810 HMDS, Acros, Ref. 1205855000 I2, Fluka, Ref. 57660 Imidazol, Fluka, Ref. 56750 KCN, Merck, Ref. 104965 KOAc, Merck, Ref. 104820 KOtBu disolución, Aldrich, Ref. 328650 K3PO4·3H2O, Aldrich, Ref. P5629 K2CO3, Quimipur, Ref. 584087 LiCl, Alfa Aesar, Ref. 77447 Na, Prolabo, Ref. 27637230 (S)-(+)-(1-Naftil) etilisocianato, Aldrich, Ref. 295957. NaH, Aldrich, Ref. 45291 NaOH, Sharlan, S004251000 Ortoacetato de trietilo, Aldrich, Ref. T60402 PBu3, Fluka, Ref. 1030149 PdCl2(dppf)·CH2Cl, Aldrich, Ref. 379670 PhNMe2, Aldrich, Ref. 51512 (PhCOO)2, Merck, Ref. 4744475 (Ph3P)2PdCl2, Fluka, Ref. 15253 Ph3P, Aldrich, Ref. T84409 pin2B2, Aldrich, Ref. 473294 Piridina, Merck, Ref. 1097282500 TEMPO, Aldrich, Ref. 216143 TBAF, Aldrich, Ref. 216143 TBSCl, ABCR, Ref. AB110655 TBSOTf, ABCR, Ref. SIB1967 TESCl, Aldrich, Ref. 235067 TIPSOTf, ACROS, Ref. 250700100 TsCl, Fluka, Ref. 89730 Zn, Acros organics, Ref. 130 Resultados y discusión (R)-3-{(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-[(terc-Butildimetilsilil)oxi]-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1il}butanal. Una disolución de 12 (2.38 g, 7.09 mmol, 1 equiv) en CH2Cl2 (30 ml) se añadió vía cánula sobre una disolución de DIBAL-H (14.18 mmol, 1M, 2 equiv) enfriada a -10 ºC. La mezcla obtenida se agitó a esa temperatura. Al cabo de una hora la reacción se vertió sobre una mezcla HCl/Et2O (1:1, 10%, 100 mL) previamente enfriada a 0 ºC y se agitó durante 2 h. Las fases se decantaron y la fase acuosa se extrajo con MTBE (3×15 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo obtenido como un aceite amarillo se utilizó directamente en la siguiente reacción. terc-Butil{[(1R,3aR,4S,7aR)-1-((R)-5',5'-dibromopent-4'-en-2'-il)-7a-metiloctahidro-1Hinden-4-il]oxi}dimetilsilano. CBr4 (7.05 g, 21.26 mmol, 3 equiv) se añadió sobre una suspensión agitada y enfriada a 0 ºC de Ph3P (5.58 g, 21.26 mmol, 3 equiv) y Zn (1.39 g, 21.26 mmol, 3 equiv) en CH2Cl2 (70 mL). Al cabo de 5 min de reacción, se retiró el baño y la mezcla se agitó durante 2 h a ta. A continuación se añadió, vía cánula, una disolución de 20 (2.4 g, 7.09 mmol, 1 equiv) en CH2Cl2 (30 mL). Después de 1.5 h, la mezcla se filtró sobre un lecho de gel de sílice, lavando con hexanos. El filtrado se concentró a sequedad. El residuo obtenido se utilizó directamente en la siguiente reacción. H H TBSO NC 1. DIBAL-H CH 2 Cl 2 , -10 °C, 1 h 2. 10% HCl/Et 2 O 0 °C, 2 h OHC H H TBSO 12 20 OHC H H TBSO Ph 3 P, Zn CBr 4 , CH 2 Cl 2 H H TBSO Br Br 20 21 Resultados y discusión 131 131 (3R,5R,7R)-Adamantanil-1-carbaldehido. PDC (6.79 g, 18.04 mmol, 3 equiv) se añadió sobre una disolución de 18 (1.00 g, 6.01 mmol, 1 equiv) en CH2Cl2. La mezcla de reacción se agitó en ausencia de luz a ta durante 9 h. La mezcla se filtró a través de una capa de sílica gel. Los sólidos se lavaron con CH2Cl2 (50 mL). El filtrado se concentró a vacío. El residuo obtenido se usó directamente en la siguiente etapa. (5R)-1-{(3R,5R,7R)-Adamantan-1-il)-5-[(1R',3a'R,4'S,7a'R)-4'-(terc-butildimetilsilil)oxi]- 7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'-il}hex-2-in-1-ol. Sobre una disolución de 21 en THF (30 mL) enfriada a -78 ºC se añadió una disolución de nBuLi en hexanos (13.29 mL, 1.31M, 3 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78 ºC. A continuación se añadió vía cánula el compuesto 19 disuelto en THF (8+2 ml). La mezcla de reacción se dejó alcanzar ta y se agitó durante 9 h. La reacción se detuvo por adición de H20 (10 mL). La fase acuosa se extrajo con MTBE (3x15 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida (SiO2, Ø 3x7 cm, 2% EtOAc/hexanos) para dar 11 [2.17 g, 62% (3 pasos), Rf = 0.35 (5% EtOAc/hexanos), [α]  = 52.5 (c = 2, CHCl3), sólido espumoso blanco]. 1H-RMN (250 MHz): δ 4.00 (1H, s, H-4'), 3.84 (1H, s, H-1), 2.31-2.07 (2H, m), 2.03-1.99 (3H, m), 1.85-1.73 (3H, m), 1.74-1.57 (15H, m), 1.57-1.48 (2H, m), 1.42-1.30 (3H, m), 1.30-1.18 (3H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.5, CH3-6), 0.92 (3H, s, CH3-8'), 0.88 (9H, s, Me3CSi), 0.04 (6H, s, 2xMeSi). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 85.4 (C, C-2), 80.3 (C, C-3), 72.0 (CH, C1), 69.5 (CH, C-4'), 55.7 (CH), 53.2 (CH), 42.2 (C, C-7a'), 40.7 (CH2), 37.9 (3xCH2, C-Adm), 37.6 (C, CPDC, CH 2 Cl 2 18 OH 19 H O H H TBSO Br Br 21 1. n BuLi, THF, -78 °C 2. 19, THF, -78 °C → ta H H TBSO HO 11 26 8' 4' 1 3a' 1' 62%( 3 pasos) 132 Resultados y discusión Adm), 35.3 (3xCH2, C-Adm), 35.1 (CH), 34.5 (CH2), 28.4 (3xCH, C-Adm), 27.3 (CH2), 26.0 (CH2), 25.9 (3xCH3, Me3C-Si), 23.2 (CH2), 19.3 (CH3, C-6), 18.2 (C, C-Si), 17.8 (CH2), 14.0 (CH3, C-8'), - 4.7 (CH3, MeSi), -5.0 (CH3, MeSi). IR (film, cm-1): 3441 (νO-H), 2928 (νC-H), 2902 (νC-H), 2848 (νC-H). MS ([EI]+, m/z, %): 498 ([M]+, 0.1), 441 ([M-tBu]+, 2), 349 (15), 135 ([M-Adm]+, 100). HRMS: [EI]+, calculado para [C32H54O2Si]+, [M]+: 498.3888; encontrado: 498.3887. Benzoato de (5R)-1-[(3R,5R,7R)-adamantan-1-il]-5-{(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-[(tercbutildimetilsilil)oxi]-7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'-il}hex-2-in-1-ilo. Una disolución de nBuLi en hexanos (0.795 mL, 1.5 M, 1.2 equiv) se añadió vía jeringa gota a gota sobre una disolución enfriada a -78 ºC de 11 (0.496 g, 0.994 mmol, 1 equiv) en THF (10 mL). La disolución se agitó durante 1 h. A continuación se añadió BzCl (0.139 mL, 1.19 mmol, 1.2 equiv) vía jeringa gota a gota. La reacción se paró al cabo de 3 h por adición de una disolución saturada de NH4Cl (15 mL). La fase acuosa se extrajo con MTBE (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (SiO2, Ø 2.5x7 cm, 2% EtOAc/hexanos) para dar 23 [0.526 g, 98%, Rf = 0.75 (hexanos) , [α]  = 22.33 (c = 2.4, CHCl3)]. 1H-RMN (250 MHz): δ 8.08 (2H, m, H-Ph), 7.55, (1H, m, H-Ph), 7.45 (2H, m, H-Ph), 5.21 (1H, s, H-1), 4.00 (1H, s, H-4'), 2.23-2.11 (2H, m), 2.07-1.99 (3H, m), 1.96-1.87 (2H, m), 1.84-1.65 (15H, m), 1.41-1.14 (8H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.3, CH3-6), 0.92 (3H, s, CH3-8'), 0.88 (9H, s, Me3CSi), 0.01 (6H, s, 2xMeSi). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 165.8 (C, C=O), 133.0 (CH, C-Ph), 130.6 (C, C-Ph), 129.8 (2×CH, C-Ph), 128.4 (2×CH, C-Ph), 86.0 (C, C-2), 76.7 (C, C-3), 73.3 (CH, C-1), 69.5 (CH, C-4'), 55.6 (CH), 53.1 (CH), 42.1 (C, C-7a'), 40.6 (CH2), 38.3 (3xCH2, C-Adm), 37.2 (C, C-Adm), 37.1 (3xCH2, C-Adm), 35.0 (CH), 34.5 (CH2), 28.3 (3xCH, C-Adm), 27.2 (CH2), 26.1 (CH2), 25.9 (3xCH3, Me3CSi), 23.1 (CH2), 19.3 (CH3, C-6), 18.1 (C, CSi), 17.7 (CH2), 14.0 (CH3 C-8'), -4.7 (CH3, MeSi), -5.1 (CH3, MeSi). IR (film, cm-1): 2927 (νC-H), 2904 (νC-H), 2850 (νC-H), 1722(νC=O). MS ([EI]+, m/z, %): 602 ([M]+, 0.1), 545 ([M-tBu]+, 0.4), 481 ([M-OBz]+, 0.3), 349 (50), 135 ([M-Adm]+, 100). HRMS: [EI]+, calculado para [C39H58O3Si]+, [M]+: 602.4150; encontrado: 602.4141. H H TBSO HO 1. n BuLi, THF, -78 ºC 2. BzCl 98% H H TBSO BzO 11 23 26 8' 4' 1 3a' 1' Resultados y discusión 133 133 Benzoato de (5R)-1-[(3R,5R,7R)-adamantan-1-il]-5-[(1'R,3a'R,4'S,7a'R)-4'-hidroxi-7a'- metiloctahidro-1H-inden-1'-il]hex-2-in-1-ilo. HF (30 gotas, 48%) se añadió sobre una disolución de 23 (0.526 g, 0872 mmol, 1 equiv) en CH2Cl2 (2.5 mL) y CH3CN (13.5 mL). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 48 h. La reacción se detuvo vertiendo la mezcla lentamente sobre una disolución saturada de NaHCO3 (50 mL). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3x20 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (SiO2, Ø 2.5x8 cm, 20% EtOAc/hexanos) para dar 24 [0.401 g, 90%, Rf = 0.50 (20% EtOAc/hexanos), [α]  = 13.2 (c = 1.0, CHCl3)]. 1H-RMN (250 MHz): δ 8.07 (2H, m, H-Ph), 7.55 (1H, m, H-Ph), 7.45 (2H, m, H-Ph), 5.20 (1H, s, H-1), 4.00 (1H, s, H-4'), 2.26-2.07 (2H, m), 2.06-2.00 (3H, m), 1.86-1.64 (15H, m), 1.63-1.47 (3H, m), 1.47-1.33 (4H, m), 1.32-1.15 (4H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.6, CH3-6), 0.92 (3H, s, CH3-8'). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 165.6 (C, C=O), 132.8 (CH, C-Ph), 130.3 (C, C-Ph), 129.6 (2×CH, C-Ph), 128.2 (2×CH, C-Ph), 85.5 (C, C-2), 76.6 (C, C-3), 73.0 (CH, C-1), 69.1 (CH, C-4'), 55.1 (CH), 52.4 (CH), 41.6 (C, C-7a'), 40.0 (CH2), 38.0 (3xCH2, C-Adm), 36.9 (C, C-Adm), 36.84 (3xCH2, C-Adm), 34.6 (CH), 33.4 (CH2), 28.0 (3xCH, C-Adm), 26.8 (CH2), 25.8 (CH2), 22.3 (CH2), 19.0 (CH3, C-6), 17.2 (CH2), 13.5 (CH3, C-8'). IR (film, cm-1): 3542 (νO-H) 2904 (νC-H), 2848 (νC-H). MS ([EI]+, m/z, %): 488 ([M]+, 0.3), 470 ([M-H2O]+, 0.2), 366 ([M-OBz]+, 9), 348 (10), 135 ([M-Adm]+, 100). HRMS: [EI]+, calculado para [C33H44O3]+, [M]+: 488.3285; encontrado: 488.3282. H H TBSO BzO HF, CH 3 CN/CH 2 Cl 2 90% H H HO BzO 23 24 26 8' 4' 1 3a' 1' 134 Resultados y discusión Benzoato de (5R)-1-[(3R,5R,7R)-adamantan-1-il]-5-[(1'R,3a'R,7a'R)-7a'-metil-4'- oxooctahidro-1H-inden-1'-il]hex-2-in-1-ilo. PDC (0.926 g, 2.46 mmol, 3 equiv) se añadió sobre una disolución de 24 (0.401 g, 0.820 mmol, 1 equiv) en CH2Cl2 (20 mL). La mezcla de reacción se agitó en ausencia de luz a ta durante 2 h. La mezcla se filtró a través de una capa de sílica gel. Los sólidos se lavaron con CH2Cl2 (35 mL). El filtrado combinado se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (SiO2, Ø 2.5x7 cm, 5% EtOAc/hexanos) para dar 25 [0.384 g, 96%, Rf = 0.60 (20% EtOAc/hexanos), [α]  = -4.0 (c = 4.0, CHCl3)]. 1H-RMN (250 MHz): δ 8.08 (2H, m, H-Ph), 7.55 (1H, m, H-Ph), 7.45 (2H, m, H-Ph), 5.18 (1H, s, H-1), 2.39-2.10 (5H, m), 2.0.9-1.99 (4H, m), 1.99-1.81 (3H, m), 1.81-1.68 (15H, m), 1.63-1.21 (6H, m), 1.10 (3H, d, J = 6, CH3-6), 0.60 (3H, s, CH3-8'). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 211.7 (C, C-4'), 165.6 (C, C=O), 132.8 (CH, C-Ph), 130.3 (C, C-Ph), 129.6 (2×CH, C-Ph), 128.2 (2×CH, C-Ph), 85.0 (C, C-2), 73.0 (CH, C-1), 61.7 (CH), 49.5 (C, C-7a'), 40.7 (CH2), 38.6 (CH2), 38.0 (3xCH2, C-Adm), 36.8 (3xCH2, C-Adm), 34.8 (CH), 28.0 (3xCH, C-Adm), 27.1 (CH2), 25.8 (CH2), 23.8 (CH2), 19.1 (CH3, C-6), 18.9 (CH2), 12.4 (CH3, C-8'). IR (film, cm-1): 2904 (νC-H), 2849 (νC-H), 1713 (νC=O). MS ([EI]+, m/z, %): 486 ([M]+, 0.8), 364 ([M-BzO]+, 18), 135 ([M-Adm]+, 100). HRMS: [EI]+, calculado para [C33H42O3]+, [M]+: 486.3128; encontrado: 486.3132. Benzoato de (5R)-1-[(3R,5R,7R)-adamantan-1-il]-5-[(1'R,3a'R,7a'R,E)-4'-(bromometilen)- 7a'-metiloctahidro-1H-inden-1'-il]hex-2-in-1-ilo. H H HO BzO H H BzO O PDC, CH 2 Cl 2 96% 24 25 26 8' 4' 1 3a' 1' H H BzO O H H BzO Br KO t Bu, Tol, -17 ºC → 0 ºC (Ph 3 PCH 2 Br)Br PPh 3 Br 72% 25 26 ) ) ) ) 26 8' 4' 1 3a' 1' Resultados y discusión 135 135 Una disolución de KOtBu en THF (6.24 mL, 1 M, 7.9 equiv) se añadió gota a gota sobre una suspensión de (Ph3PCH2Br)Br (2.75 g, 6.32 mmol, 8 equiv) en tolueno (30 mL) enfriada a -17 ºC, sometida previamente a la acción de ultrasonidos durante 30 min. La mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 1.5 h y a 0 ºC durante 30 min. Se volvió a enfriar a -17 ºC y se añadió vía cánula una disolución de 25 (0.384 g, 0.789 mmol, 1 equiv) en tolueno (10 mL) enfriada a 0 ºC. La mezcla de reacción se agitó a -17 ºC durante 1.5 h y a ta durante 2 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución saturada de NH4Cl (1 mL). La mezcla de reacción se filtró a través de una capa de sílica gel, que se lavó a continuación con EtOAc (3x10 mL). El filtrado se concentró y el residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (SiO2, Ø 3x7 cm, hexanos) para dar 26 [0.320 g, 72%, Rf = 0.67 (20% EtOAc/hexanos), [α]  = 52.6 (c = 0.5, CHCl3)]. 1H-RMN (250 MHz): δ 8.08 (2H, m, H-Ph), 7.55 (1H, m, H-Ph), 7.45 (2H, m, H-Ph), 5.63 (1H, s, H-CBr), 5.21 (1H, s, H-1), 2.85 (1H, m), 2,25-2.09 (2H, m), 2.07-2.00 (3H, m), 1.981.86 (3H, m), 1.79-1.67 (12H, m), 1.66-1.35 (8H, m), 1.31-1.15 (2H, m) 1.08 (3H, d, J = 6.2, CH3-6), 0.54 (3H, s, CH3-8'). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 165.6 (C, C=O), 144.8 (C, C-4'), 132.8 (CH, C-Ph), 130.2 (C, C-Ph), 129.6 (2×CH, C-Ph), 128.2 (2×CH, C-Ph), 97.4 (C-CHBr), 85.3 (C, C-2), 73.0 (CH, C-1), 63.9 (C, C-3), 55.6 (CH), 54.3 (CH) 45.2 (C, C-7a'), 39.5 (CH2), 38.0 (3xCH2, C-Adm), 36.9 (C, C-Adm), 36.8 (3xCH2, C-Adm), 35.3 (CH), 30.8 (CH2), 28.0 (3xCH, C-Adm), 27.2 (CH2), 25.9 (CH2), 22.4 (CH2), 21.8 (CH2), 19.2 (CH3, C-6), 11.8 (CH3, C-8'). IR (film, cm-1): 2923 (νC-H), 2853 (νC-H). MS ([EI]+, m/z, %): 440 ([M-BzO]+, 2), 425 ([M-BzO-CH3]+, 0.8), 361 (32), 135 ([M-Adm]+, 100). HRMS: [EI]+, calculado para [C27H37Br]+, [M-BzO]+: 440.2073; encontrado: 440.2068. (5R)-1-[(3R,5R,7R)-Adamantan-1-il]-5-[(1'R,3a'R,7a'R,E)-4'-(bromometilen)-7a'metilocta hidro-1H-inden-1'-il]hex-2-in-1-ol. H H BzO Br 93% DIBAL-H, CH 2 Cl 2 -78 °C, 2 h H H HO Br 26 22 26 8' 4' 1 3a' 1' 238 Espectros de RMN 11B RMNac (160.46 MHz, CDCl3): δ -2.96, -3.91, -6.46, -7.25, -9.66, -10.59, -11.27, - 12.26,-13.51. 11B RMNdec (160.46 MHz, CDCl3): δ -3.38 -6.87, -10.15, -11.88, -14.19. Espectros de RMN 239 239 1HRMN (250 MHz): δ 9.56 (1H, d, J = 3.3, H-1), 4.01 (1H, s, H-4'), 2.34 (2H, m), 1.08 (3H, d, J = 6.9, CH3-3), 0.95 (3H, s, CH3-8'), 0.87 (9H, s, Me3C-Si), -0.01 (6H, 2xMe-Si). 13C-RMN (CDCl3, 63 MHz): δ 205.7 (C, CHO), 69.5 (CH, C-4'), 52.7 (CH), 52.1 (CH), 49.6 (CH), 43.0 (C, C-7a'), 40.8 (CH2), 34.7 (CH2), 26.6 (CH2), 26.2 (3xCH3, Me3CSi), 23.7 (CH2), 18.4 (C, Me3CSi), 17.9 (CH2), 14.5 (CH3, C-5), 13.7 (CH3, C-8'), -4.4 (CH3, MeSi), -4.7 (CH3, MeSi. 01234567890 ppm H H H 64 TBSO O 240 Espectros de RMN 1H RMN (250 MHz, CDCl3): δ 6.76 (1H, dd, J = 15.6, J = 8.8, H-3) 5.66 (1H, d, J = 15.5, H-2), 4.06 (2H, c, J = 7.1, OCH2CH3), 3.94 (1H, s, H-4'), 1.25 (3H, t, J = 7.2, OCH2CH3), 0.99 (3H, d, J = 6.5, H-5), 0.89 (3H, s, CH3-8'), 0.82 (9H, s, Me3CSi), -0.06 (6H, d, J = 4.1, Me2Si). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 166.7 (C, C=O), 154.5 (C, C-3), 118.7 (CH, C-2), 69.1 (CH, C-4'), 59.7 (CH2, OCH2CH3), 55.4 (CH), 52.7 (CH), 42.2 (C, C-7a'), 40.3 (CH2), 39.2 (CH), 34.2 (CH2), 27.2 (CH2), 25.6 (3xCH3, Me3CSi), 22.8 (CH2), 18.9 (CH3, OCH2CH3), 17.8 (C, Me3CSi), 17.4 (CH2), 14.1 (CH3, C-5), 13.7 (CH3, C-8'), -5.0 (CH3, MeSi), -5.4 (CH3, MeSi). -10102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm 012345678 ppm H H 67 TBSO EtO 2 C 4' 7a' 3a' 1' 4 23 Espectros de RMN 241 241 1H RMN (250 MHz, CDCl3): δ 6.78 (1H, dd, J = 15.6, J = 9.0, H-3), 5.70 (1H, d, J = 15.4, H-2), 4.13 (2H, c, J = 7.1, OCH2CH3), 4.04 (1H, s, H-4'), 1.24 (3H, t, J = 7.2, OCH2CH3), 1.03 (3H, d, J = 6.6, H-5), 0.93 (3H, s, CH3-8'). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 166.9 (C, C=O), 154.5 (C, C-3), 118.8 (CH, C-2), 68.9 (CH, C-4'), 59.9 (CH2), 52.2 (CH), 52.3 (CH), 41.9 (C, C-7a'), 40.1 (CH2), 39.2 (CH), 33.4 (CH2), 27.1 (CH2), 22.3 (CH2), 18.9 (CH3), 17.8 (C, Me3CSi), 17.3 (CH2), 14.1 (CH3, C-5), 13.6 (CH3, C-8'). -10102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm 012345678 ppm H H 66 HO EtO 2 C 4' 7a' 3a' 1' 4 23 242 Espectros de RMN 1H RMN (250 MHz, CDCl3): δ 6.79 (1H, dd, J = 15.6, J = 9.0, H-3), 5.72 (1H, d, J = 15.6, H-2), 4.14 (2H, c, J = 7.1, OCH2CH3), 1.25 (3H, t, J = 7.2, OCH2CH3), 1.09 (3H, d, J = 6.6, H-5), 0.64 (3H, s, CH3-8'). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 211.2 (C, C=O), 166.8 (C, C=O), 153.3 (CH, C-3), 119.4 (CH, C-2), 61.5 (C, CH), 60.0 (CH2), 55.3 (CH), 49.7 (C, C-7a'), 40.7 (CH2), 39.2 (CH), 38.6 (CH2), 27.1 (CH2), 23.8 (CH2), 19.2 (CH3), 18.9 (CH2), 14.1 (CH3, C-5), 12.6 (CH3, C-8'). 012345678 ppm -10102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm H H 63 O EtO 2 C 4' 7a' 3a' 1' 4 23 Espectros de RMN 243 243 1H RMN (250 MHz, CDCl3): δ 6.74 (1H, dd, J = 15.6, J = 9.0, H-3), 5.72 (1H, d, J = 15.5, H-2), 5.42 (1H, d, J = 1.9, H-1''), 4.14 (4H, c, J = 8.5, 2x(OCH2CH3), 3.83 (1H, m), 2.42 (1H, m), 2.08 (1H, t, J = 9.4), 1.25 (6H, t, J = 8.5, 2x(OCH2CH3), 1.07 (3H, dd, J = 6.5, J = 1.8, H-5), 0.57 (3H, s, CH3-8'). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 166.7 (C, C=O), 166.6 (C, C=O), 162.4 (C, C-4'), 153.8 (C, C-3), 119.2 (CH, C-2), 112.1 (CH, C-1''), 59.9 (CH2), 59.3 (CH2), 56.4 (CH), 52.3 (CH), 46.9 (C, C-7a'), 39.7 (CH2), 39.6 (CH), 29.3 (CH2), 27.1 (CH2), 23.5 (CH2), 21.9 (CH2), 19.2 (CH3), 18.9 (CH2), 14.1 (CH3, C-5), 12.2 (CH3, C-8'). 012345678 ppm -10102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm H H 62 EtO 2 C EtO 2 C 4' 7a' 3a' 1' 4 23 1'' 2'' 8' 244 Espectros de RMN 1H RMN (250 MHz, CDCl3): δ 5.49 (2H, m, H-2, H-3), 5.15 (1H, t, J = 6.9, H-1''), 4.14 (2H, d, J = 6.9), 4.00 (2H, d, J = 3.0), 2.57 (1H, m,), 1.00 (3H, d, J = 6.6, CH3-5), 0.53 (3H, s, CH3-8'). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 142.8 (C, C-4'), 138.8 (CH, C-3), 126.5 (CH, C-2), 119.3 (CH, C-1''), 63.5 (CH2), 58.3 (CH2), 55.8 (CH), 55.4 (CH), 45.1 (C, C-7a'), 40.1 (CH2), 39.7 (CH), 28.5 (CH2), 27.5 (CH2), 23.2 (CH2), 21.9 (CH2), 20.2 (CH3, C-5), 18.9 (CH3, C-8'). - 2 -100102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm 012345678 ppm H H 61 HO HO 4' 7a' 3a' 1' 4 23 1'' 2'' 8' Espectros de RMN 245 245 1H RMN (500 MHz, CDCl3): δ 5.39 (1H, dd, J = 15.1, J = 8.6), 5.24 (1H, dt, J = 15.0, J = 7.3), 4.86 (1H, t, J = 8.1), 3.54 (2H, s, HCcarborano), 2.99 (3H, qd, J = 15.0, J = 8.1), 2.86 (2H, d, J = 7.3), 2.45 (2H, d, J = 11.3), 1.03 (3H, s, CH3-5), 0.55 (3H, s, CH3-8'). 13C RMN (63 MHz, CDCl3): δ 145.1 (C, C-4'), 143.2 (CH), 120.5 (CH), 113.2 (CH), 79.9 (C), 74.4 (C), 59.3 (CH), 55.5 (CH), 55.4 (CH), 45.3 (C, C-7a'), 40.6 (CH2), 40.1 (CH), 39.8 (CH2), 34.7 (CH2), 28.4 (CH2), 27.6 (CH2), 23.2 (CH2), 22.1 (CH2), 20.3 (CH3, C-5), 12.0 (CH3, C-8'). -10102030405060708090100110120130140150160170180190200210 2 0ppm 012345678 ppm H H 6 4' 7a' 3a' 1' 4 2 3 1'' 2'' 8' 246 Espectros de RMN 11 B RMNac (160.46 MHz, CDCl 3 ): δ -2.96, -3.88, -6.32, -7.27, -9.71,-10.63,-11-51,-12.54, -13.69,-14.21. 11 B RMNdec (160.46 MHz, CDCl 3 ): δ -3.42, -6.81, -10.17, -12.01, -14.08. 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