Enteromixosis del rodaballo: Esclarecimiento de mecanismos patogénicos y rutas de la respuesta inmunitaria

Ana Paula Losada García Tese de doutoramento Enteromixosis del rodaballo: Esclarecimiento de mecanismos patogénicos y rutas de la respuesta inmunitaria Departamento Ciencias Clínicas Veterinarias Facultade de Veterinaria Lugo 2013 Enteromixosis del rodaballo: Esclarecimiento de mecanismos patogénicos y rutas de la respuesta inmunitaria Tesis Doctoral Programa de doctorado: “Investigación básica y aplicada en Ciencias Veterinarias” Dpto. de Ciencias Clínicas Veterinarias Facultad de Veterinaria Campus Universitario, 27002 Lugo María Isabel Quiroga Berdeal, Profesora Titular del Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la USC, y Roberto Bermúdez Pose, Profesor Interino de Sustitución del Departamento de Anatomía y Producción Animal de la USC Informan: Que la presente Tesis Doctoral ha sido realizada por Ana P. Losada García bajo su codirección y aprueban su presentación para la obtención del Título de Doctora en Veterinaria. Lugo, 12 de septiembre de 2013 Mª Isabel Quiroga Berdeal Roberto Bermúdez Pose La doctoranda Ana P. Losada García Este trabajo ha sido realizado con fondos obtenidos a través de Proyectos de Investigación AGL2006-13158C03-02 del Ministerio de Educación y Ciencia y AGL2009-13282-C02-02 del Ministerio de Ciencia e Innovación. La estancia de la doctoranda ha sido financiada con fondos de la Acción Integrada con Italia IT2009-0036 del Ministerio de Ciencia e Innovación. Ana P. Losada ha sido beneficiaria de una beca-contrato del Programa María Barbeito 2008 de la Consellería de Innovación e Industria de la Xunta de Galicia. A mi familia A Javi Agradecimientos Más allá de todo lo que ha supuesto elaborar una Tesis Doctoral en estos días, con algunas facilidades y a veces también dificultades, quiero dar las más sinceras gracias a todas las personas que han colaborado para que esta Tesis sea una realidad. Gracias a mis estupendos directores, Maribel y Rober, que en todo este tiempo han sido unos grandes mentores. Desde el principio me abrieron todas las puertas, facilitaron mi completa integración en el grupo y demuestran a diario una paciencia extrema conmigo. Gracias a los co-autores de las publicaciones que se derivan de esta Tesis Doctoral y a las editoriales Elsevier e Inter-Research por autorizarme a reproducir los contenidos de los artículos. Gracias a toda la gente con la que he convivido este tiempo en el entorno de la Facultad de Veterinaria, con la que he compartido tanto trabajo como buenos momentos en su compañía. Por todas esas horas de laboratorio y también de ocio, gracias a Dani, Sandri, Meli, Germán, Paolo, Manuela, Rita, Andrés, Fabri, Paulo, Nuri, Sonia, Mónica y José María. Gracias a Lorena, por su amabilidad y por llenarnos la barriga de cosas deliciosas. No me puedo olvidar de Xan, que en esta última etapa me ha tenido que “aguantar” de vecina. También quiero mencionar a los compañeros de Anatomía, que siempre me han ayudado cuando lo necesitaba. De esta experiencia me llevo grandes amistades, y además, unos cuantos sobrinitos. Gracias a todos mis amigos. En primer lugar, las que siempre han estado ahí, desde muy “guajina”, Leni y Pau. De mi etapa en Lugo, muchas gracias a Marta y Koki, Rai, Manolo, Isma y otros muchos Agradecimientos compis de carrera y de batallas. Gracias a la gente de Castro, donde he pasado grandes momentos, sobre todo con las tres Legaspi, mamá Marisa y Vicky. A mi familia le tengo que agradecer su apoyo en todos los sentidos. Desde el primer día que inicié este camino tuve total respaldo de todos y esta familia es una de las mayores suertes en la vida. Papá siempre tiene una buena cara, un gesto amable ante las adversidades y buena disposición para las celebraciones. Gracias a Angels por estar ahí. Tengo que hacer una mención especial a mis hermanitas, Chefi y Olgui, que me escuchan, me apoyan y me hacen pensar. Gracias a cuñao, con el que siempre hay algún momento gracioso. Gracias a Joselín, y tengo que decir que Mar y Óscar son mis “termitas” favoritas. Finalmente, muchas gracias a Javi, el escuchador, un gran compañero para la vida, que no solo me atura sino que me anima a que la paciencia y el esfuerzo no se agoten. Además gracias a toda la familia de Javi, que han sido tan acogedores conmigo. Un recuerdo especial para los que ya no están, pero me quisieron y me apoyaron, sobre todo mami. La escritura nunca fue mi fuerte, pero quiero que en estas líneas quede patente mi agradecimiento a todos. There’s no easy way to make it better Jamiroquai Resumen xi Resumen La enteromixosis representa una seria amenaza para el cultivo del rodaballo (Psetta maxima) en Europa. La enfermedad provoca grandes pérdidas económicas asociadas a altas tasas de morbilidad y mortalidad en los lotes afectados y, en la actualidad, se desconocen medidas terapéuticas eficaces. El agente etiológico de esta enfermedad, Enteromyxum scophthalmi, es un mixosporidio parásito que infecta el epitelio de revestimiento digestivo del rodaballo y causa enteritis descamativa severa. Los mecanismos patogénicos de la enfermedad no están completamente esclarecidos, por lo que en la presente memoria, hemos progresado en el conocimiento de las lesiones asociadas a la parasitación por E. scophthalmi, aspectos de la respuesta inmunitaria y mecanismos implicados en la descamación epitelial. En primer lugar, hemos realizado una descripción histológica y ultraestructural de los cuadros lesionales durante las diferentes etapas de la infección. Los peces con infecciones leves no mostraron cambios histológicos evidentes. Se observaron estadios iniciales de desarrollo del mixosporidio en el epitelio digestivo sin una respuesta inflamatoria evidente por parte del hospedador. Las alteraciones más destacables fueron el incremento de células goblet y rodlet en el epitelio de revestimiento, y la detección de la enzima iNOS en el polo apical de enterocitos y en estructuras vasculares en bazo, reflejo de la activación de la respuesta inmunitaria innata. La aplicación de la técnica inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-E. scophthalmi permitió la Resumen xii identificación de estadios parasitarios iniciales, lo que supone una herramienta de diagnóstico temprano de la enfermedad en muestras fijadas y embebidas en parafina. En las infecciones moderadas, conforme se incrementó la carga parasitaria, aparecieron cambios histológicos en la mucosa digestiva. Se observó ondulación del epitelio de revestimiento como consecuencia de cambios morfológicos en los enterocitos, en algunos casos compatibles con apoptosis, confirmada mediante el inmunomarcaje de caspasa-3 activa. Además, en la lámina propiasubmucosa aparecieron células inflamatorias, y en la base del epitelio, mayor cantidad de linfocitos intraepiteliales. Tanto en el infiltrado inflamatorio en el tracto gastrointestinal como en el tejido linfoide de riñón y bazo, se encontraron macrófagos y, en menor medida, granulocitos con inmunotinción positiva para iNOS. En las infecciones severas, los rodaballos mostraron desprendimiento del epitelio digestivo, quedando expuesta la membrana basal subepitelial, y presencia de células descamadas junto con formas parasitarias en la luz del tubo digestivo. Además de la apoptosis descrita previamente en el revestimiento epitelial, los enterocitos descamados sufrieron anoikis, un tipo de apoptosis desencadenada por pérdida de contacto con la membrana basal y/o células adyacentes. En el lumen intestinal, algunos mixosporidios se encontraban englobados por células epiteliales en anoikis. Teniendo en cuenta la escasez de esporas de E. scophthalmi que se observan durante las infecciones tanto naturales como experimentales, esta puede ser una estrategia válida para la dispersión de los estadios de desarrollo no esporulados, Resumen xix and immune systems are interrelated and that, in case of aggression in the gastrointestinal tract, bidirectional interactions occur for the recovery of the functionality of the digestive apparatus. In previous studies, it has been shown that infection by E. scophthalmi induces changes in enteric modulators of the neuroendocrine system, which in turn interacts with the immune system, so the study of the neuroendocrine system provides valuable information on the development of the systemic response of turbot. In the present study, we observed a decrease in bombesin and glucagon, anorexigenic effectors, as a possible strategy to increase food intake and improve body condition. Moreover, the increase of enkephalins and somatostatin may counteract the effects of substance P on the motility and fluid secretion, as these modulators decrease these actions. As a result, fluid accumulation, seen in the inspection of the gastrointestinal tract at necropsy of turbot severely infected, may develop. In contrast, the enkephalins have proinflammatory effects reinforcing the possibly exceeded response. Lastly, increased somatostatin involves, on the one hand, inhibition of leukocyte proliferation, action not enough to feed back the immune response, and secondly, the scaling of the intestinal epithelial lining, due to its antiproliferative action in conjunction with the parasites and oxidative damage mechanisms previously described. Índice xxi Índice RESUMEN .................................................................................................... XI! SUMMARY .................................................................................................. XVI! ÍNDICE ....................................................................................................... XXI! ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS .................................................................... XXVII! LISTADO DE ABREVIACIONES ..................................................................... XXXI! LISTADO DE ABREVIACIONES CORRESPONDIENTES A LOS ARTÍCULOS .......... XXXIII! LISTADO DE ARTÍCULOS ........................................................................... XXXV! 1.!INTRODUCCIÓN .......................................................................... 1! 1.1.!BIOLOGÍA Y ACUICULTURA DEL RODABALLO ........................................... 1! 1.1.1. EL RODABALLO ............................................................................... 1! 1.1.2. IMPORTANCIA DE LA ACUICULTURA Y DATOS DE PRODUCCIÓN ............ 3! 1.1.3. CICLO PRODUCTIVO Y MEJORA DE LA PRODUCCIÓN ........................... 5! 1.1.4. ENFERMEDADES DE ORIGEN INFECTO-CONTAGIOSO EN RODABALLO CULTIVADO. MEDIDAS DE TRATAMIENTO Y CONTROL .................................... 7! 1.2.!MIXOZOOS ....................................................................................... 14! 1.2.1. TAXONOMÍA DE LOS MIXOZOOS ...................................................... 14! 1.2.2. CICLO VITAL Y ESTRUCTURA DE LOS MIXOZOOS ............................... 16! 1.2.3. ENFERMEDADES CAUSADAS POR MIXOZOOS ................................... 20! 1.2.4. ENTEROMIXOSIS DESCRITAS EN LA ACTUALIDAD .............................. 23! 1.3.!ENTEROMIXOSIS DEL RODABALLO ...................................................... 25! 1.3.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS Y ETIOLOGÍA ...................................... 25! 1.3.2. CICLO VITAL Y ESTADIOS DE DESARROLLO ...................................... 26! 1.3.3. EPIDEMIOLOGÍA ............................................................................ 29! 1.3.4. SIGNOS CLÍNICOS Y LESIONES ........................................................ 32! 1.3.5. FISIOPATOLOGÍA ........................................................................... 35! 1.3.6. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD ................................................. 40! 1.3.7. TRATAMIENTO, PREVENCIÓN Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD .......... 41! 1.4.!RESPUESTA DEL HOSPEDADOR A LAS PARASITOSIS INTESTINALES ........ 43! Índice xxii 1.4.1. RESPUESTA INMUNITARIA EN LOS TELEÓSTEOS ............................... 43! 1.4.2. RESPUESTA INMUNITARIA A PARÁSITOS INTESTINALES ..................... 46! 1.4.3. EFECTOS DE LOS PARÁSITOS EN EL EPITELIO: APOPTOSIS ................ 48! 1.4.4. CAMBIOS EN EL SISTEMA NEUROENDOCRINO ENTÉRICO ................... 51! 2.!OBJETIVOS ................................................................................ 55! 3.!MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................... 57! 3.1.!MATERIALES BIOLÓGICOS .................................................................. 57! 3.1.1. MUESTRAS PROVENIENTES DE INFECCIONES NATURALES Y EXPERIMENTALES .................................................................................... 57! 3.1.2. EXPERIMENTO DE TRANSMISIÓN POR EFLUENTE .............................. 58! 3.1.3. EXPERIMENTO DE INOCULACIÓN ORAL ............................................ 60! 3.2.!TÉCNICAS HISTOPATOLÓGICAS .......................................................... 63! 3.2.1. FIJACIÓN Y PROCESADO DE LAS MUESTRAS ..................................... 63! 3.2.2. MICROSCOPÍA ÓPTICA ................................................................... 63! 3.2.3. TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN ....................... 65! 3.2.4. INMUNOHISTOQUÍMICA ................................................................... 66! 3.3.!HISTOMETRÍA ................................................................................... 70! 3.3.1. RECUENTO DE CÉLULAS INMUNOMARCADAS. OBTENCIÓN DE IMÁGENES DIGITALIZADAS ........................................................................ 70! 3.3.2. ESTUDIO ESTADÍSTICO ................................................................... 72! 3.4.!MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN .................................... 75! 3.4.1. CORTES Y TINCIONES .................................................................... 76! 4.!RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................... 77! 5.!CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ............................................ 97! CONCLUSIONES .......................................................................................... 97! CONCLUSIONS .......................................................................................... 100! 6.!REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................... 103! 7.!ARTÍCULO I: LIGHT AND ELECTRON MICROSCOPY OF TURBOT ENTEROMYXOSIS .......................................................... 131! 7.1.!ABSTRACT ...................................................................................... 132! Índice xxiii 7.2.!INTRODUCTION ............................................................................... 133! 7.3.!MATERIALS AND METHODS .............................................................. 135! 7.3.1. ANIMALS ..................................................................................... 135! 7.3.2. SAMPLING PROCEDURE ............................................................... 136! 7.3.3. LIGHT MICROSCOPY (LM) ............................................................ 136! 7.3.4. TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPY (TEM) ............................ 136! 7.4.!RESULTS ........................................................................................ 137! 7.4.1. CLINICAL SIGNS AND MACROSCOPIC LESIONS ................................ 137! 7.4.2. HISTOPATHOLOGICAL CHANGES IN THE COURSE OF INFECTION ....... 137! 7.5.!DISCUSSION ................................................................................... 150! 7.6.!ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................... 156! 7.7.!REFERENCES ................................................................................. 157! 8.!ARTÍCULO II: EVALUATION OF iNOS IN TURBOT ENTEROMYXOSIS ......................................................................... 161! 8.1.!ABSTRACT ...................................................................................... 162! 8.2.!INTRODUCTION ............................................................................... 164! 8.3.!MATERIALS AND METHODS .............................................................. 166! 8.3.1. FISH ........................................................................................... 166! 8.3.2. INFECTION .................................................................................. 166! 8.3.3. SAMPLING PROCEDURE ............................................................... 166! 8.3.4. LIGHT MICROSCOPY .................................................................... 167! 8.3.5. IMMUNOHISTOCHEMISTRY ............................................................ 168! 8.3.6. QUANTITATIVE ANALYSIS OF INOS+ CELLS ................................... 168! 8.3.7. STATISTICS ................................................................................. 169! 8.4.!RESULTS ........................................................................................ 170! 8.4.1. LIGHT MICROSCOPY AND MORTALITY ............................................ 170! 8.4.2. IMMUNOHISTOCHEMISTRY ............................................................ 170! 8.4.3. QUANTITATIVE ANALYSIS OF INOS+ CELLS AND STATISTICS ........... 174! 8.5.!DISCUSSION ................................................................................... 176! 8.6.!ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................... 180! 8.7.!REFERENCES ................................................................................. 181! Índice xxiv 9.!ARTÍCULO III: STUDIES ON APOPTOSIS IN TURBOT ENTEROMYXOSIS .......................................................................... 185! 9.1.!ABSTRACT ...................................................................................... 186! 9.2.!INTRODUCTION ............................................................................... 187! 9.3.!MATERIALS AND METHODS .............................................................. 190! 9.3.1. ANIMALS ..................................................................................... 190! 9.3.2. SAMPLING PROCEDURE ............................................................... 191! 9.3.3. STUDY OF DISEASE STATUS ......................................................... 191! 9.3.4. TUNEL STAINING ........................................................................ 192! 9.3.5. IMMUNOHISTOCHEMISTRY ............................................................ 193! 9.3.6. QUANTITATIVE AND SEMI-QUANTITATIVE ANALYSIS OF ACTIVE CASPASE-3+ CELLS ............................................................................... 194! 9.4.!RESULTS ........................................................................................ 196! 9.4.1. GROSS PATHOLOGY AND MORTALITY ............................................ 196! 9.4.2. HISTOPATHOLOGY ....................................................................... 197! 9.4.3. DETECTION OF APOPTOSIS .......................................................... 200! 9.4.4. IMMUNOSTAINING OF THE PARASITES ............................................ 203! 9.4.5. SIMULTANEOUS CHARACTERIZATION OF APOPTOSIS AND E. SCOPHTHALMI .................................................................................... 203! 9.5.!DISCUSSION ................................................................................... 205! 9.6.!ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................... 211! 9.7.!REFERENCES ................................................................................. 212! 10.!ARTÍCULO IV: CHANGES IN NEUROENDOCRINE SYSTEM IN TURBOT ENTEROMYXOSIS ..................................................... 217! 10.1.!ABSTRACT .................................................................................... 218! 10.2.!INTRODUCTION ............................................................................. 220! 10.3.!MATERIALS AND METHODS ............................................................. 222! 10.3.1. FISH AND SAMPLING PROCEDURE ............................................... 222! 10.3.2. HISTOLOGY AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY ................................. 222! 10.3.3. QUANTITATIVE ANALYSIS OF POSITIVE CELLS ............................... 223! 10.3.4. STATISTICS ............................................................................... 224! 10.4.!RESULTS ...................................................................................... 225! Índice xxv 10.4.1. HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS .................................................. 225! 10.4.2. PRESENCE AND DISTRIBUTION OF ENTERO-ENDOCRINE CELLS (ECS) AND NERVOUS STRUCTURES ........................................................ 225! 10.5.!DISCUSSION ................................................................................. 231! 10.6.!ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................. 238! 10.7.!REFERENCES ............................................................................... 239 Índice de figuras y tablas xxvii Índice de figuras y tablas Figuras Figura 1.1: Distribución costera del rodaballo de vida salvaje ........................ 1! Figura 1.2: Imagen de un rodaballo ................................................................ 2! Figura 1.3: Datos de producción de rodaballo a nivel mundial ....................... 3! Figura 1.4: Principales países europeos productores de rodaballo de crianza ............................................................................................... 4! Figura 1.5: Evolución de la producción de rodaballo en Europa para el periodo 2002-2011 ..................................................................... 5! Figura 1.6: Ciclo productivo del rodaballo ....................................................... 6! Figura 1.7: Ciclo vital de los mixosporidios ................................................... 16! Figura 1.8: Esquema de una actinospora ..................................................... 18! Figura 1.9: Esquema del estadio de desarrollo de un mixosporidio ............. 19! Figura 1.10: Esquema de una mixospora ..................................................... 19! Figura 1.11: Propuesta de ciclo vital hipotético de E. scophthalmi ............... 26! Figura 1.12: Estadio 3 de E. scophthalmi ..................................................... 27! Figura 1.13: Estadios 4 y 5 de E. scophthalmi .............................................. 28! Figura 1.14: Hallazgos macroscópicos y microscópicos en rodaballos con enteromixosis ............................................................... 34! Figura 1.15: Zona de contacto de los estadios de E. scophthalmi con los enterocitos ................................................................................ 36! Figura 1.16: Principales elementos del sistema inmunitario innato y adaptativo en teleósteos ......................................................... 43! Índice de figuras y tablas xxviii Figura 1.17: Esquema de la producción de óxido nítrico por las enzimas sintasas de óxido nítrico (NOS) ........................................ 48! Figura 1.18: Esquema de las vías de la apoptosis ........................................ 50! Figura 1.19: Distribución del sistema nervioso entérico ................................ 51! Figura 1.20: Esquema de una célula enteroendocrina ................................. 54! Figura 3.1: Necropsia del rodaballo .............................................................. 59! Figura 3.2: Esquema e imagen del tubo digestivo del rodaballo .................. 61! Figura 3.3: Esquema de la técnica TUNEL ................................................... 65! Figura 3.4: Esquema de la técnica inmunohistoquímica utilizando el sistema EnVisionTM .................................................................................... 67! Figura 3.5: Esquema de la inmunotinción doble ........................................... 69! Figura 3.6: Captura del software Olympus Cell^A ........................................ 71! Figura 3.7: Captura del software Image-Pro Plus ......................................... 72! Figura 3.8: Captura de pantalla con el software PASW Statistics 18 ............ 73! Figura 3.9: Captura de pantalla del software GraphPad Prism ..................... 74! Artículos científicos xxxv Listado de artículos El desarrollo de la presente Tesis Doctoral ha conllevado la elaboración de los siguientes artículos científicos: 1) Light and electron microscopic studies on turbot Psetta maxima infected with Enteromyxum scophthalmi: histopathology of turbot enteromyxosis Bermúdez R, Losada AP, Vázquez S, Redondo MJ, Álvarez-Pellitero P, Quiroga MI (2010). Dis Aquat Organ 89: 209-221. 2) Quantitative and qualitative evaluation of iNOS expression in turbot (Psetta maxima) infected with Enteromyxum scophthalmi Losada AP, Bermúdez R, Faílde LD, Quiroga MI (2012). Fish Shellfish Immunol 32:243-248. 3) Study of distribution of active caspase-3+ cells in turbot (Psetta maxima L.) enteromyxosis Losada AP, Bermúdez R, Faílde LD, Vázquez M, Quiroga MI (2012). J Fish Dis (aceptado enero 2012). 4) Effects of Enteromyxum scophthalmi experimental infection on the neuroendocrine system of turbot, Psetta maxima (L.) Losada AP, Bermúdez R, Faílde LD, Quiroga MI, Di Giancamillo A, Domeneghini C Los contenidos de los artículos han sido adaptados para la presente Tesis Doctoral. La doctoranda tiene permiso de los autores y de los editores de Elsevier e Inter-Research para la reproducción de dichos contenidos. Introducción 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Biología y acuicultura del rodaballo 1.1.1. El rodaballo El rodaballo (Psetta maxima L.) es una especie marina bentónica, que habita fondos arenosos, pedregosos o mixtos, de profundidades entre los 20 y 75 m. Se distribuye por el mar Báltico, mar del Norte, canal de la Mancha, Atlántico nororiental hasta Marruecos, mar Mediterráneo y mar Negro (fig. 1.1). Figura 1.1: Distribución costera (naranja) del rodaballo de vida salvaje El cuerpo de los rodaballos adultos es asimétrico, redondeado, aplanado (fig. 1.2) y puede llegar a alcanzar 100 cm de talla. Poseen ojos saltones en el lado izquierdo (cara ocular), boca grande con mandíbula prominente e igual dentición a ambos lados. La cara ocular Introducción 2 está pigmentada y el color varía de marrón parduzco a grisáceo con manchas, para mimetizarse con el ambiente. La cara ciega, por el contrario, suele estar despigmentada. La piel que recubre el cuerpo del rodaballo no presenta escamas, sino una serie de tubérculos óseos distribuidos con aleatoriedad que hacen que la superficie sea rugosa (FAO 2011, APROMAR 2012). Figura 1.2: Imagen de un rodaballo Los rodaballos son carnívoros; en etapas juveniles se alimentan de moluscos y crustáceos, y los adultos principalmente de peces y cefalópodos (FAO 2011). Los huevos poseen una gota de grasa que servirá para nutrir a las larvas tras la eclosión. Inicialmente simétricas, las larvas sufrirán la metamorfosis en torno al día 45 tras la eclosión, en la que el ojo derecho migrará al lado izquierdo. Alcanzan la madurez sexual en torno al cuarto o quinto año de vida (FAO 2011). Introducción 3 1.1.2. Importancia de la acuicultura y datos de producción En los últimos años, el origen de varias especies marinas comercializadas, como la dorada (Sparus aurata), la lubina (Dicentrarchus labrax) o el rodaballo, es mayoritariamente la acuicultura (FAO 2012). Durante décadas Europa ha liderado la producción de peces planos, aunque en los últimos años, los países asiáticos encabezan gran parte del sector. De hecho, Asia es el epicentro mundial de la industria de la acuicultura, en gran medida debido a la incorporación y producción masiva de especies acuáticas exóticas, tanto de agua dulce como marina (De Silva y col. 2009). Figura 1.3: Datos de producción de rodaballo a nivel mundial (FAO 2012) Como consecuencia, la maricultura de peces planos se ha incrementado notablemente en la última década, desde las 26300 t en el año 2000 hasta cerca de 150000 t en 2010, con China y España como principales productores (FAO 2012). En particular, la obtención de rodaballo de acuicultura, originaria de Europa, ha alcanzado en 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 Producción anual de rodaballo de acuicultura (t) Resto de países productores España China Introducción 4 China datos anuales cercanos a las 60000 t en los últimos años (fig. 1.3), lo que supone seis veces la producción europea (APROMAR 2012, FAO 2010, 2012). En Europa, el cultivo del rodaballo se realiza en la vertiente atlántica, principalmente en España, seguido de Portugal y Francia, y otros países con producciones notablemente inferiores (fig. 1.4 y 1.5) (APROMAR 2012). Figura 1.4: Principales países europeos productores de rodaballo de crianza. La clasificación se basa en producciones de 2011 (datos FEAP 2012). La comercialización de rodaballo de acuicultura se ha ido incrementando paulatinamente en los últimos años y en 2010 representó el 62,5 % del total de rodaballo consumido en Europa. Estas Más de 600 t Entre 300 y 600 t Menos de 300 t España Portugal Francia Islandia Reino Unido Dinamarca Introducción 5 cifras son superiores en España, donde el 99 % del rodaballo consumido procede de la acuicultura (APROMAR 2012). Desde 2002 hasta 2009, la crianza de rodaballo en Europa se duplicó, con valores superiores a las 10000 t (FEAP 2012). En 2011, se produjo un incremento del 12 % con respecto a 2010 (fig. 1.5), con un valor de 10633 t (FEAP 2012). España es el principal país productor de rodaballo de acuicultura con 7760 t en 2011, lo que supone el 73 % de la industria europea. Dentro del territorio español, Galicia es la principal Comunidad Autónoma productora, con un 99 % de la producción nacional (APROMAR 2012, FEAP 2012). Figura 1.5: Evolución de la producción de rodaballo en Europa para el periodo 2002-2011 (datos FEAP 2012) 1.1.3. Ciclo productivo y mejora de la producción El rodaballo se cultiva de forma intensiva en granjas situadas en zonas costeras, y los juveniles se suelen engordar en tanques de cemento en tierra. En general, la duración del ciclo productivo se encuentra en 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Producción anual de rodaballo de acuicultura (t) Dinamarca Islandia Reino Unido Francia Portugal España Introducción 6 torno a los 2 años (fig. 1.6), desde la obtención de los huevos, hasta que el rodaballo alcanza su talla comercial (FAO 2011). La optimización de la producción del rodaballo de acuicultura a gran escala pasa por la selección y mejora genética de los individuos. Los principales objetivos que se persiguen con un programa de mejora incluyen el control de la endogamia, el sustento de la diversidad genética, la identificación de los genes determinantes del sexo y tasa de crecimiento, y la selección de reproductores resistentes a enfermedades (Bouza y col. 2007, Vera y col. 2013). Figura 1.6: Ciclo productivo del rodaballo. Se resumen los principales periodos, temperaturas de cultivo y dietas desde la obtención de huevos hasta la comercialización de los peces. Además del desafío que supone el control de las enfermedades, en la industria existe un especial interés por obtener poblaciones con mayor Introducción 7 cantidad de hembras (Ribas y col. 2013). El rodaballo es una de las especies cultivadas con mayor dimorfismo sexual en cuanto a la tasa de crecimiento, en favor de las hembras (Person-Le Ruyet y col. 1991), por lo que el control de la reproducción y determinación del sexo de los individuos podría incrementar la biomasa en los stocks. 1.1.4. Enfermedades de origen infecto-contagioso en rodaballo cultivado. Medidas de tratamiento y control La expansión de la acuicultura, y en esta última década de forma especial la del rodaballo en España, ha hecho que posea gran consideración en el terreno de la industria y la sanidad animal. A este crecimiento se asocian problemas relacionados con la intensificación de las producciones, como la aparición de enfermedades, que causan graves pérdidas económicas (Álvarez-Pellitero 2008, Magnadottir 2010). Para paliar estos efectos negativos, se han desarrollado múltiples investigaciones que pretenden conseguir medidas terapéuticas efectivas y sobre todo estrategias de control y prevención de las enfermedades, principalmente las de tipo infecto-contagioso (Bricknell y Dalmo 2005, Galina y col. 2009, Gatesoupe 2008, Green 2010, Kibenge y col. 2012, Sahu y col 2008). La imposición de mayores medidas de prevención también concuerda con la legislación implantada en los últimos años. Por una parte, se pretende disminuir el empleo de fármacos en las producciones animales y por otra, los consumidores demandan cada vez mayor seguridad alimentaria y bienestar animal (Cole y col. 2009, Grigorakis y Rigos 2011, Tacon y Metian 2008, van de Vis y col. 2012). Introducción 8 1.1.4.1. Principales enfermedades Las enfermedades más relevantes que afectan o pueden amenazar al cultivo del rodaballo se citan en la tabla 1.1. El impacto de estos patógenos en la producción puede ser variable, pero múltiples agentes provocan elevadas mortalidades en los stocks de rodaballo, como Enteromyxum scophthalmi (Bermúdez 2006), Tenacibaculum maritimum (Avendaño-Herrera y col. 2006), Philasterides dicentrarchi (Iglesias y col. 2001) o Listonella (Vibrio) anguillarum (González y col. 2003). Enfermedad Agente patógeno Tipo Principales lesiones Septicemia hemorrágica viral (VHS)1 Novirhabdovirus VHSV Rabdovirus Hemorragias en piel, ojos, musculatura y superficies serosas Tenacibaculosis2 Tenacibaculum maritimum Bacteria Gram - Úlceras cutáneas profundas Furunculosis3 Aeromonas salmonicida Bacteria Gram - Úlceras cutáneas profundas, dermatitis granulomatosa, septicemia hemorrágica Vibriosis4 Listonella anguillarum Bacteria Gram - Hemorragias y úlceras cutáneas Edwardsielosis5 Edwardsiella tarda Bacteria Gram - Tumefacción periocular, ascitis y abscesos en órganos internos Estreptococosis6 Streptococcus parauberis Bacteria Gram + Inflamación purulenta alrededor de ojos y aletas Micobacteriosis7 Mycobacterium spp. Bacteria Gram + Granulomas, inflamación de la piel y úlceras cutáneas Microsporidiosis8 Tetramicra brevifilum Hongo microsporidio Licuefacción y atrofia del músculo Trichodinosis9 Trichodina spp. Protozoo ciliado Lesiones branquiales Escuticociliatosis10 Philasterides dicentrarchi Protozoo ciliado Úlceras profundas y hemorragias Enfermedad amebiana de las branquias (AGD)11 Neoparamoeba spp. Protozoo amebozoo Afectación branquial: inflamación, exceso de moco, manchas de color grisáceo Enteromixosis12 Enteromyxum scophthalmi Myxozoo Caquexia, ascitis, enteritis descamativa severa Tabla 1.1: Enfermedades que afectan al rodaballo de crianza. Referencias: 1Schönherz y col. 2013, 2Faílde 2013, 3Toranzo y col. 2005, 4González y col. 2003, 5Padrós y col. 2006, 6Romalde y col. 1999, 7dos Santos y col. 2002, 8Rodriguez-Tovar y col. 2011, 9Noga 2010, 10Piazzon y col. 2011, 11Dyková y col. 2010, 12Bermúdez 2006. Introducción 15 las que se ha confirmado un ciclo vital que involucra a un pez como hospedador (Grabner y El-Matbouli 2010). Tabla 1.2: Clasificación de los mixozoos (Lom y Dyková 2006) Los mixosporidios son parásitos en ambas fases de su ciclo vital. Poseen una fase de mixospora en peces (ocasionalmente en anfibios y reptiles) y una fase de actinospora en anélidos. Aunque la mayoría de las especies no resultan dañinas para sus hospedadores, otras provocan grandes pérdidas económicas en la acuicultura de peces marinos, de agua dulce y diádromos (Feist 2008, Yokoyama y col. 2012). Dada la gran relevancia y repercusión de las parasitosis por mixozoos, las investigaciones en la actualidad se centran en la filogenia, epidemiología y patogenia de los procesos que producen. Además, se enfatiza en estudios de inmunidad del hospedador, prevención y control de importantes enfermedades, fundamentalmente aquellas Myxozoa Grassé, 1970 Clase Malacosporea Canning, Curry, Feist, Longshaw y Okamura, 2000 Orden Malacovalvulida Canning, Curry, Feist, Longshaw y Okamura, 2000 (1 Familia) Clase Myxosporea Bütschli, 1881 Orden Bivalvulida Shulman, 1959 Suborden Platysporina Kudo, 1919 (1 Familia) Suborden Sphaeromyxina Lom y Noble, 1984 (1 Familia) Suborden Variisporina Lom y Noble, 1984 (10 Familias) Orden Multivalvulida Shulman, 1959 (3 Familias) Introducción 16 mejor caracterizadas como la ceratomixosis, enfermedad del torneo o la enfermedad proliferativa del riñón (PKD) (Feist y Longshaw 2006). 1.2.2. Ciclo vital y estructura de los mixozoos El ciclo vital de los mixozoos, en particular el de los mixosporidios (fig. 1.7), incluye un invertebrado anélido (en su mayoría oligoquetos para las especies de agua dulce, y poliquetos para las especies marinas) y un hospedador vertebrado, que es por lo general un pez (Yokoyama y col. 2012). Figura 1.7: Ciclo vital de los mixosporidios La primera descripción del ciclo vital de un mixosporidio fue el de la especie Myxobolus cerebralis, responsable de la enfermedad del torneo, con el que se demostró que las mixosporas no eran infectivas para los salmónidos, sino que infectaban al oligoqueto Tubifex tubifex, del que se liberaban posteriormente actinosporas infectivas para los Hospedador pez Mixospora Actinospora Hospedador anélido Introducción 17 salmónidos (Wolf y Markiw 1984). Se han descrito ciclos similares en más de 25 especies de mixosporidios de agua dulce (Kent y col. 2001, Lom y Dyková 2006, Yokoyama y col. 2012) y, hasta el momento, se conocen los ciclos de 5 especies marinas (tabla 1.3) (Karlsbakk y Køie 2012). Además se ha demostrado la transmisión directa de estadios vegetativos de las tres especies del género Enteromyxum (Diamant 1997, Estensoro y col. 2011, Redondo y col. 2002, Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012, Yasuda y col. 2002). Mixosporidio Hospedador pez Hospedador anélido Ceratomyxa auerbachi Clupea harengus Chone infundibuliformis Ellipsomyxa gobii Pomastoshistus microps Nereis spp. Ellipsomyxa mugilis Mugílidos Nereis spp. Gadimyxa atlantica Gadus morhua Spirorbis spp. Sigmomyxa sphaerica Belone belone Nereis pelagica Tabla 1.3: Especies marinas de mixosporidios con ciclo vital indirecto conocido y sus hospedadores El ciclo presenta alternancia de hospedadores entre invertebrados y peces y en cada hospedador los mixosporidios adquieren morfologías sustancialmente distintas. Cuando un anélido ingiere una mixospora, se desarrolla la fase sexual. Se inicia la merogonia, con la producción de gametos, que se fusionan para producir zigotos, de los que se obtendrán actinosporas (fig. 1.8) (Lom y Dyková 2006). En la mayoría de las actinosporas existe un cuerpo de la espora que contiene tres cápsulas polares y tres valvas protectoras. Bajo ellas, se localiza un esporoplasma similar a un plasmodio con múltiples núcleos y células infectivas (Kent y col. 2001, Lom y Dyková 2006). Introducción 18 Una vez en el agua, la actinospora se encuentra con el pez hospedador. Al entrar en contacto, las cápsulas polares descargan los filamentos polares para fijar la espora, se abren las valvas y los esporoplasmas entran y migran al lugar en que ocurre la fase esporogónica (Lom y Dyková 2006). Figura 1.8: Esquema de una actinospora La formación de la mixospora ocurre en un plasmodio esporogónico. La característica típica de los estadios de desarrollo y formación de la mixospora es su organización denominada “célula dentro de célula” (fig. 1.9) (Lom y Dyková 2006). Esta organización se basa en la existencia de una célula primaria (P) que alberga células secundarias (S) producidas endógenamente y éstas a su vez pueden llegar a contener células terciarias (T) (Lom y Dyková 2006, Morris 2012). Introducción 19 Dependiendo de su localización, los estadios vegetativos o trofozoítos se denominan celozoicos cuando se ubican en cavidades corporales o de órganos, e histozoicos cuando se encuentran en los tejidos, bien de forma intercelular o, con mayor frecuencia, intracelular (Feist y Longshaw 2006, Lom y Dyková 2006). Figura 1.9: Esquema del estadio de desarrollo de un mixosporidio La mixospora (fig. 1.10) contiene de una a cuatro cápsulas polares, uno o dos esporoplasmas y de dos a siete valvas protectoras a modo de envoltura. Las valvas se unen entre sí a lo largo de una línea de dehiscencia denominada línea de sutura y cubren incluso el ápice de la cápsula polar (Lom y Dyková 2006). Figura 1.10: Esquema de una mixospora Introducción 20 1.2.3. Enfermedades causadas por mixozoos Las mixozoosis afectan a las principales especies que se obtienen a partir de la acuicultura: salmónidos, espáridos y lubina, principalmente. Se trata de enfermedades emergentes y re-emergentes que provocan grandes pérdidas económicas (Kent y col. 2001). Mixozoo Nombre de la enfermedad o signos típicos Pez Referencias Ceratomyxa shasta Ceratomixosis Salmónidos Bartholomew y col. 1997 Bartholomew y col. 2004 Hallett y Bartholomew 2006 Chloromyxum truttae Enteritis y vesícula biliar dilatada Salmónidos Fiala y Dyková 2004 Lom y Dyková 1993 Henneguya ictaluri Enfermedad proliferativa de las branquias (PGD) Ictalurus punctatus Griffin y col. 2008 Pote y col 2000 Myxidium giardii Infección sistémica Anguilla spp. Benajiba y col. 1993 Ventura y Paperna 1984 Myxobolus cerebralis Enfermedad del torneo Salmónidos Fetherman y col. 2011 Gilbert y Granath 2003 Hedrick y col. 1999 Myxobolus koi Mixobolosis branquial Cyprinus carpio Yokoyama y col. 1997 Myxobolus murakamii Enfermedad del sueño por mixosporidios Oncorhynchus masou Urawa y col. 2009 Myxobolus wulii Quistes en branquias y hepatopáncreas Carassius auratus Zhang y col. 2010 Parvicapsula pseudobranchicola Inflamación y necrosis de los filamentos branquiales Salmo salar Karlsbakk y col. 2002 Nylund y col. 2005 Nylund y col. 2011 Sphaerospora dykovae Inflamación de la vejiga natatoria (SBI) Ciprínidos Bartošová y col. 2013 Dyková y Lom 1988 Holzer y col. 2013 Tetracapsuloides bryosalmonae* Enfermedad proliferativa del riñón (PKD) Salmónidos Hedrick y col. 1993 Sterud y col. 2007 Thelohanellus hovorkai Telohanelosis hemorrágica Cyprinus carpio Liyanage y col. 2003 Novakov y col. 2011 Yokoyama y col. 1998 Tabla 1.4: Mixozoos con repercusión económica importante en peces de agua dulce. *El género Tetracapsuloides pertenece a la clase Malacosporea, las otras especies de la tabla son mixosporidios. Modificado de Yokoyama y col. 2012. De forma general, las infecciones por mixozoos de agua dulce (tabla 1.4) suelen afectar de forma específica a un género o familia de hospedadores. En particular, las mixozoosis que afectan a salmónidos son relativamente bien conocidas, poseen efectos devastadores en Introducción 21 granjas de salmón y trucha, y se distribuyen ampliamente en el mundo (Yokoyama y col. 2012). Mixosporidio Nombre de la enfermedad o signos típicos Pez Referencias Enteromyxum leei Enteromixosis Diplodus puntazzo Sparus aurata Paralichthys olivaceus Pagrus major Takifugu rubripes Álvarez-Pellitero y col. 2008 Cuadrado y col. 2008 Yanagida y col. 2004 Yasuda y col. 2002, 2005 Enteromyxum scophthalmi Enteromixosis Psetta maxima Bermúdez 2006 Palenzuela y col. 2002 Henneguya lateolabracis Henneguyosis cardiaca Lateolabrax spp. Yokoyama y col. 2003 Henneguya pagri Henneguyosis cardiaca Pagrus major Yokoyama y col. 2005b Kudoa amamiensis Kudoosis amami Seriola quinqueradiata Burger y col. 2008 Yokoyama y col. 2000 Kudoa iwatai Quistes en múltiples órganos Dicentrarchus labrax Lateolabrax japonicus Mugil cephalus Oplegnatus punctatus Pagrus major Sparus aurata Diamant y col. 2005 Matsukane y col. 2011 Kudoa lateolabracis Licuefacción muscular Lateolabrax spp. Paralichthys olivaceus Yokoyama y col. 2004 Kudoa lutjanus Infección sistémica Lutjanus erythropterus Wang y col. 2005 Kudoa neurophila Meningoencefalitis Latris lineata Grossel y col. 2003 Grossel 2005 Kudoa shiomitsui Quistes en el corazón Thunnus orientalis Zhang y col. 2010 Kudoa thyrsites Licuefacción muscular Coryphaena hyppurus Paralichthys olivaceus Salmo salar Scomber scombrus Levsen y col. 2008 Moran y col. 1999 Whipps y col. 2003 Kudoa yasunagai Natación anormal Lateolabrax japonicus Oplegnathus fasciatus Seriola quinqueradiata Takifugu rubripes Thunnus orientalis Plotosus lineatus Shirakashi y col. 2012 Zhang y col. 2010 Myxobolus acanthogobii Escoliosis y otras deformaciones esqueléticas Seriola quinqueradiata Scomber japonicus Yokoyama y col. 2005a Sphaerospora (Leptotheca) fugu Enfermedad caquectizante Takifugu rubripes Tun y col. 2002 Sphaerospora testicularis Lesiones graves en el aparato reproductor Dicentrarchus labrax Fioravanti y col. 2004 Tabla 1.5: Mixosporidios con repercusión económica importante en peces marinos. Modificado de Yokoyama y col. 2012. Introducción 22 Los mixosporidios que infectan peces marinos (tabla 1.5) se caracterizan por afectar a un amplio rango de hospedadores, como por ejemplo especies del género Kudoa, o Enteromyxum leei, aunque también se han descrito otros mixosporidios presentes en un sola especie de pez (Yokoyama y col. 2012). Las localizaciones de los mixosporidios en los hospedadores son múltiples, pero entre las especies marinas histozoicas destacan las infecciones en el corazón (Henneguya lateolabracis, Henneguya pagri y Kudoa shiomitsui) (Yokoyama y col. 2003, 2005b, Zhang y col. 2010), músculo esquelético (varias especies del género Kudoa), (Burger y col. 2008, Diamant y col. 2005, Levsen y col. 2008, Matsukane y col. 2011, Moran y col. 1999, Whipps y col. 2003, Yokoyama y col. 2004), sistema nervioso central (Kudoa neurophila y Myxobolus acanthogobii) (Grossel 2005, Yokoyama y col. 2005a) y tracto digestivo (especies del género Enteromyxum) (Álvarez-Pellitero y col. 2008, Cuadrado y col. 2008, Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012, Yasuda y col. 2002). Otros mixosporidios marinos son celozoicos, como especies de los géneros Ceratomyxa, Ellipsomyxa o Sphaerospora, y se suelen desarrollar en la vesícula biliar, túbulos renales o aparato reproductor (Alama-Bermejo y col. 2012, Gunter y Adlard 2010, Rangel y col. 2012, Yemmen y col. 2012). Introducción 23 1.2.4. Enteromixosis descritas en la actualidad El género Enteromyxum (Palenzuela y col. 2002) pertenece a la familia Myxidiidae que se encuentra en el suborden Variisporina (tabla 1.6). Hasta el momento se conocen tres especies: Enteromyxum fugu, E. leei y E. scophthalmi (Lom y Dyková 2006). Tabla 1.6: Clasificación del género Enteromyxum (Lom y Dyková 2006) La especie E. fugu, anteriormente Myxidium fugu (Tun y col. 2000) es un mixosporidio celozoico que se desarrolla sobre el epitelio digestivo del pez globo (Takifugu rubripes) y no provoca signos clínicos evidentes (Tun y col. 2002, Yanagida y col. 2006). Opuestamente, tanto E. leei como E. scophthalmi son mixosporidios histozoicos con un alto impacto en la producción. Provocan pérdidas directas por la mortalidad, disminución de peso y empeoramiento de los índices de conversión (Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). E. leei, antes Myxidium leei (Diamant y col. 1994), se describió como agente patógeno en dorada, pero su rango de hospedadores es amplio y puede infectar a más de 40 especies marinas y de forma experimental a peces de agua dulce (Diamant y col. 2006, Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). Es uno de los patógenos más devastadores en Clase Myxosporea è Orden Bivalvulida Suborden Variisporina (10 Familias) Familia Myxidiidae (4 Géneros) Género Enteromyxum Enteromyxum fugu Enteromyxum leei Enteromyxum scophthalmi Introducción 24 maricultura de aguas templadas, afectando a la viabilidad de los cultivos (Rigos y Katharios 2010). También infecta a peces ornamentales y se ha descrito un brote importante en peces mediterráneos en acuario, con alta virulencia en varias especies (Katharios y col. 2011, Padrós y col. 2001). El cuadro clínico de la enteromixosis causada por E. leei varía según la especie, y en los casos más graves se desarrolla como un proceso caquectizante con mortalidad muy elevada. Las especies más susceptibles son el sargo picudo (Diplodus puntazzo) y el pez globo (Álvarez-Pellitero y col. 2008, Yanagida y col. 2006). El parásito se localiza en el epitelio intestinal entre los enterocitos, lo que altera su morfología, puede causar vacuolización y necrosis del revestimiento epitelial. Los enterocitos pierden su disposición en empalizada y finalmente provoca que se desprendan del tejido subepitelial (ÁlvarezPellitero y col. 2008). En contraposición, la infección por E. leei en la dorada se desarrolla de forma lenta, y los peces sufren un proceso de adelgazamiento más crónico y leve (Sitjà-Bobadilla y col. 2008). En lubina, se ha demostrado la presencia de estadios de E. leei a través de inoculaciones experimentales, pero no desarrollan la enfermedad e incluso acaban eliminando las formas parasitarias al cabo del tiempo (Sitjà-Bobadilla y col. 2007a). Introducción 31 1.3.3.3. Susceptibilidad Los rodaballos infectados muestran gran variabilidad individual en la respuesta a la enfermedad. De forma general, las tasas de morbilidad y mortalidad observadas en diferentes estudios son muy elevadas (Bermúdez y col. 2006b, Quiroga y col. 2006, Redondo y col. 2002, 2004, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Sin embargo, otros rodaballos son resistentes, sobreviven a brotes epizoóticos de la enfermedad y adquieren anticuerpos protectores frente a nuevas infecciones (SitjàBobadilla y col. 2004, 2007b). 1.3.3.4. Curso natural En condiciones naturales, la enteromixosis se caracteriza por un periodo de prepatencia prolongado, ya que desde la exposición al mixosporidio hasta la aparición de los estadios de desarrollo en el tubo digestivo pueden transcurrir varios meses (Quiroga y col. 2006, Redondo y col. 2004). A partir del momento en que se detectan estadios parasitarios en el stock de rodaballos, y dependiendo de las condiciones de cultivo, el periodo de patencia se puede alargar de semanas a meses, y las tasas de prevalencia y mortalidad pueden ser del 100 % (Quiroga y col. 2006). 1.3.3.5. Factores de riesgo Entre los factores de riesgo asociados con el medio y el agente etiológico cabe destacar la calidad y temperatura del agua. El suministro de agua es la principal vía de entrada del parásito a las explotaciones y a mayor temperatura, más rápidos son el inicio y progresión de la infección. La presencia de rodaballos infectados en el tanque supone una fuente de contagio para otros rodaballos por Introducción 32 transmisión directa y la densidad del tanque se relaciona con la probabilidad de infección, la disponibilidad y concentración de formas parasitarias infectivas (Quiroga y col. 2006, Redondo y col. 2002). En cuanto a los rodaballos, se ha constatado la importancia de su origen, ya que muestran diferente susceptibilidad. Además, en etapas juveniles, a mayor peso existe mayor prevalencia de la enfermedad. Finalmente, los rodaballos que superaron la parasitosis con anterioridad adquieren inmunidad y muestran resistencia en retos posteriores (Quiroga y col. 2006, Sitjà-Bobadilla y col. 2004, 2007b). 1.3.4. Signos clínicos y lesiones La enteromixosis se manifiesta con el empeoramiento de los índices de conversión, alta morbilidad y elevado número de bajas en los tanques afectados. Los principales signos clínicos incluyen adelgazamiento y atrofia del tejido muscular que confieren el aspecto de “cabeza hundida”. En los casos más graves, los rodaballos pierden los depósitos grasos y la cavidad celómica se dilata por la acumulación de líquido ascítico. En la necropsia, a la apertura de la cavidad celómica, los órganos internos están pálidos, aunque los principales hallazgos se encuentran en el tubo digestivo. El tracto gastrointestinal muestra congestión y focos de hemorragia, dilatación con aspecto translúcido de las paredes intestinales y acumulación de líquido de aspecto mucoso, a veces con flóculos blanquecinos (fig. 1.14a) (Branson y col. 1999, Redondo y col. 2002, Sitjà-Bobadilla y col. 2007b). El estudio histopatológico del tubo digestivo muestra las lesiones características de la enfermedad, que consisten en gastroenteritis catarral (fig. 1.14b) con presencia de trofozoítos de mixosporidios en Introducción 33 el epitelio de revestimiento (fig. 1.14c). En las fases iniciales, los estadios de E. scophthalmi se encuentran en el epitelio de los ciegos pilóricos y del intestino anterior, y desde ahí se distribuyen colonizando los tramos intestinales medio y posterior. También se pueden encontrar en el esófago y estómago, en el que colonizan el epitelio glandular. En los casos más graves, el epitelio de revestimiento se separa del tejido subyacente, se observan hemorragias e infiltrados inflamatorios en la lámina propia-submucosa (fig. 1.14d) (Bermúdez 2006, Redondo y col. 2004). Las esporas están presentes en infecciones muy avanzadas, en rodaballos con claros signos clínicos, y su proporción con respecto al número de estadios de desarrollo es muy baja (fig. 1.14e) (Bermúdez 2006, Branson y col. 1999, Palenzuela y col. 2002, Redondo y col. 2004). Aunque el órgano diana de los estadios de desarrollo de E. scophthalmi es el tubo digestivo, también se han encontrado estadios 1 en otros órganos sin reacción inflamatoria asociada, y en frotis sanguíneos (Redondo y col. 2004, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Además de las lesiones observadas en el tubo digestivo, la enteromixosis también se asocia a una disminución del tejido linfohematopoyético en bazo y riñón. La depleción leucocitaria se intensifica según avanza la enfermedad, y los efectos de la infección son más claros en el tejido linfoide presente en el riñón (fig. 1.14f-g), donde la cantidad de células blancas disminuye de forma más evidente (Bermúdez y col. 2006b, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Introducción 34 Figura 1.14: Hallazgos macroscópicos y microscópicos en rodaballos con enteromixosis. a: Apertura de la cavidad celómica. Ascitis (flecha) y dilatación del intestino posterior con presencia de líquido en el interior (asterisco). b: Enteritis debida a la presencia de estadios de desarrollo de E. scophthalmi (flechas), con infiltrados inflamatorios en la lámina propiasubmucosa (asteriscos) y desprendimiento del epitelio de revestimiento (triángulos). Hematoxilina-eosina, barra = 200 µm. c: Varios estadios 2 y 3 de E. scophthalmi (flechas) entre los enterocitos del epitelio de revestimiento intestinal. Azul de toluidina (AT), barra = 50 μm. d: Sección de intestino anterior que presenta enteritis descamativa severa, en la que únicamente se conservan pequeños tramos de epitelio de revestimiento (flecha); en la lámina propiasubmucosa se observa presencia de infiltrados inflamatorios (asteriscos), dilatación de vasos linfáticos y acumulación de líquido (triángulos). AT, barra = 200 µm. e: Estadio 4 o diesporoblasto asincrónico en el epitelio de revestimiento intestinal. Contiene una espora en formación que presenta una cápsula polar completamente formada (flecha). AT, barra = 20 µm. f-g: Imágenes de riñón anterior, de un rodaballo sano (f) y de uno con enteromixosis (g). Se aprecia la depleción del tejido linfohematopoyético que se localiza entre los túbulos renales (T). AT, barras = 100 µm. Imágenes del grupo investigador. Introducción 35 1.3.5. Fisiopatología 1.3.5.1. Interacción parásito-hospedador y mecanismos de patogenicidad Durante la infección con E. scophthalmi ocurren una serie eventos que conducen a un síndrome caquectizante, que en la mayoría de los casos resulta letal (Sitjà-Bobadilla y col. 2007b). Los trofozoítos de E. scophthalmi se desarrollan en el epitelio digestivo intercelularmente. La penetración del parásito así como su localización entre los enterocitos es objeto de diversos estudios en la actualidad. En la capa mucínica intestinal se localizan diferentes carbohidratos y sus receptores poseen una elevada relevancia en la interacción entre el epitelio intestinal y el parásito. Los receptores pueden ser utilizados por los parásitos como lugares de fijación y adhesión, y las interacciones entre carbohidratos y lectinas se relacionan con los mecanismos de penetración parasitarios (ÁlvarezPellitero 2008). El patrón de residuos de carbohidratos presente en los rodaballos cambia debido a la infección por E. scophthalmi, de tal forma que los terminales de glucosa-manosa, fucosa y N-acetilglucosamina disminuyen en rodaballos infectados, mientras que se produce un incremento en D-galactosa y N-acetil-galactosamina (Redondo y Álvarez-Pellitero 2010a, Redondo y col. 2008). Por otra parte, las estructuras predominantes en la superficie de E. scophthalmi y en la zona de interacción parásito-hospedador son glucosa-manosa, N-acetil-glucosamina, N-acetil-galactosamina y α-D-galactosa (Redondo y col. 2008). El tratamiento de los trofozoítos de E. scophthalmi con las lectinas concanavalina A (Con A) y aglutinina Introducción 36 de soja (SBA), que se unen a carbohidratos en la superficie del parásito, inhibe la adhesión y colonización de explantes de epitelio intestinal por el mixosporidio (Redondo y Álvarez-Pellitero 2010b). Tras penetrar en el epitelio, el mixosporidio establece relaciones con los enterocitos en forma de proyecciones citoplasmáticas intrincadas, en contacto directo con las membranas celulares del hospedador, e incluso formando estructuras similares a uniones en hendidura o gap junction (fig. 1.15). Estas uniones participan en la fijación, comunicación y nutrición de los trofozoítos parasitarios (Redondo y col. 2003b). Figura 1.15: Imagen de microscopía electrónica de transmisión de la zona de contacto de los estadios de E. scophthalmi con los enterocitos (E). En la imagen se observan partes de células S (S) en el interior de la célula P (P), con proyecciones citoplasmáticas y cuyas membranas están en contacto con las del hospedador (flechas), de una forma similar a uniones en hendidura o gap junctions. Barra = 1 µm. Imagen del grupo investigador. La presencia de las formas parasitarias de E. scophthalmi en el epitelio de revestimiento altera las uniones celulares estrechas o tight junction entre los enterocitos, lo que resulta en pérdida de la barrera intestinal y paso indiscriminado de moléculas y electrolitos. El daño intestinal que disminuye la absorción de los nutrientes, acompañado por la letargia y anorexia, provoca el adelgazamiento de los rodaballos (Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). Introducción 37 La presencia de E. scophthalmi también incrementa la tasa de muerte celular en el epitelio digestivo. Este hecho afecta igualmente a la integridad de la barrera intestinal y contribuye al agravamiento del síndrome. Aunque se desconocen los mecanismos que desencadenan la muerte celular, durante la respuesta del hospedador se generan moléculas reactivas de oxígeno y nitrógeno, que causan estrés oxidativo con efectos negativos en los tejidos y podrían contribuir al daño y muerte celular (Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). En numerosos trabajos se ha sugerido que la muerte celular puede estar relacionada con una estrategia del hospedador para impedir y prevenir la proliferación y diseminación del parásito. En el caso de la enteromixosis, contrariamente, podría facilitar la dispersión de las formas parasitarias a otras áreas del tubo digestivo, e incluso favorecer la supervivencia de los mixosporidios en el medio, al rodearse de células epiteliales que se desprenden al lumen intestinal (Redondo y col. 2003a). Otro evento destacable durante la respuesta del hospedador es la liberación de determinados factores o péptidos que influyen en la ingesta de alimentos y estado corporal. En rodaballos infectados con E. scophthalmi se producen cambios en los neuropéptidos intestinales (tabla 1.7), que potencian la anorexia, la motilidad intestinal y la secreción de fluidos, a la vez que participan en la respuesta inmunitaria. Esta respuesta además podría estar exacerbada (Bermúdez y col. 2007) y tiene, por lo tanto, un alto coste metabólico. Introducción 38 Péptido Localización CEEs Cambios CEEs Efectos SNE Otras 5-HT Estómago e intestino posterior Incremento* Promotor de la motilidad Neuronas y algunas fibras nerviosas - CCK-8 Ciegos pilóricos e intestino Incremento** Anorexigénico y estimulante de secreciones - - CGRP Ciegos pilóricos, intestino anterior y escasas en intestino medio Disminución Inhibidor en digestivo y sistema inmune Fibras nerviosas en PM y alguna neurona - SP Ciegos pilóricos e intestino Incremento Estimulante en digestivo y sistema inmune Fibras nerviosas en PM y PS Leucocitos y enterocitos VIP Ciegos pilóricos e intestino anterior Disminución* Inhibidor en digestivo y sistema inmune Neuronas y fibras nerviosas en PM Vasculatura Tabla 1.7: Péptidos estudiados mediante inmunohistoquímica en rodaballos infectados por E. scophthalmi. 5-HT: serotonina, CCK-8: colecistoquinina, CGRP: péptido relacionado con el gen de la calcitonina, SP: sustancia P, VIP: péptido intestinal vasoactivo, CEEs: células enteroendocrinas, PM: plexo mientérico, PS: plexo submucoso, SNE: sistema nervioso entérico, *: resultado significativo, **: resultado altamente significativo. Resumen de los resultados de Bermúdez y col. 2007. 1.3.5.2. Respuesta inmunitaria Un hecho importante en los inicios de la infección, es la capacidad del mixosporidio para evadir la respuesta del hospedador, lo que permite su rápida proliferación. Se ha sugerido que la respuesta específica capaz de controlar la infección está retrasada, como se ha observado en la cinética de producción de anticuerpos en rodaballos supervivientes (Sitjà-Bobadilla y col. 2007b). Además, se ha propuesto la existencia de fallos en las conexiones entre los mecanismos de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa, y por otra parte, la activación de varios efectores inmunitarios estudiados parece ser incapaz de frenar la proliferación y colonización del epitelio digestivo por E. scophthalmi (Bermúdez y col. 2006b, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Introducción 39 La invasión del epitelio digestivo por parte del parásito desencadena una respuesta inmunitaria (tabla 1.8), con activación inicial de la leucopoyesis, pero seguida por depleción leucocitaria en los órganos linfohematopoyéticos. A pesar de la activación de la respuesta celular, el desarrollo e invasión del parásito no se detiene (Bermúdez 2006). La enteromixosis induce en el rodaballo la activación de varios mecanismos de la respuesta inmune inespecífica. En líneas generales, se produce un incremento del estallido respiratorio de los fagocitos circulantes, y existen variaciones en diversos factores humorales innatos, como las peroxidasas, lisozima o complemento, aunque ninguna molécula en particular parece ser clave para eliminar el parásito (Sitjà-Bobadilla y col. 2006, Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). Factor Cambios durante la enteromixosis Hematocrito Tendencia a la disminución. Leucocitos circulantes Incremento de granulocitos, progranulocitos y células plasmáticas y descenso de linfocitos. Proteínas séricas Sin cambios significativos. Estallido respiratorio Incremento. Lisozima sérica Disminución y posterior aumento. Complemento sérico Sin cambios significativos. Antiproteasas séricas Tendencia al incremento en antiproteasas, incremento significativo de α-2-macroglobulina. Anticuerpos específicos Producción retardada de anticuerpos durante la infección. Incremento significativo en rodaballos resistentes. Respuesta de células IgM+ Incremento en los órganos linfoides y posterior migración al intestino. Tabla 1.8: Principales cambios observados en la respuesta del rodaballo a la enteromixosis (Bermúdez y col. 2006b, Sitjà-Bobadilla y col. 2004, 2006, 2007b). Introducción 40 En el rodaballo se desencadena también una respuesta inmune específica frente E. scophthalmi. Las células portadoras de inmunoglobulinas se incrementan en los peces infectados, pero la velocidad de producción de anticuerpos es relativamente baja. En desafíos con el mixosporidio, se detectaron anticuerpos específicos contra el parásito a los 48 días PE en rodaballos que superaron previamente la infección, mientras que los peces expuestos por primera vez desarrollaron la enfermedad y murieron sin producir anticuerpos específicos en un periodo de 40 a 49 días (Bermúdez y col. 2006b, Redondo y col. 2002, Sitjà-Bobadilla y col. 2004, 2007b). 1.3.6. Diagnóstico de la enfermedad Los signos clínicos de la enteromixosis son inespecíficos, por lo que el diagnóstico de la enfermedad se basa en la detección de las formas parasitarias del mixosporidio. El diagnóstico de campo se realiza mediante la observación de las esporas de Enteromyxum en raspados de intestino, aunque en ocasiones resulta complicado debido a su escasez. La detección de trofozoítos en preparaciones en fresco es posible aunque su evaluación requiere experiencia (Sitjà-Bobadilla y Palenzuela 2012). El procedimiento estándar que se emplea para el diagnóstico es el estudio histopatológico del intestino del rodaballo. Mediante tinción rutinaria (hematoxilina-eosina) se distinguen los estadios de desarrollo de E. scophthalmi en el epitelio digestivo, así como el daño tisular asociado. Además, se puede facilitar la visualización de los mixosporidios con tinciones especiales (azul de toluidina, Giemsa y/o Introducción 47 forma dispersa a lo largo del tubo digestivo, aunque se distinguen principalmente dos compartimentos: la lámina propia-submucosa y los linfocitos intraepiteliales. De forma general, en la lámina propia se localizan macrófagos, granulocitos, linfocitos y células plasmáticas, mientras que los linfocitos intraepiteliales son en su mayoría células T y pocas células B (Rombout y col. 1998, Salinas y col. 2011). En teleósteos, un mecanismo de gran relevancia en la respuesta a las parasitosis es el estallido respiratorio de los fagocitos, como se ha comprobado en mixosporidiosis intestinales (Sitjà-Bobadilla 2008b). El estallido respiratorio se caracteriza por la liberación de sustancias bactericidas, entre las que se encuentran especies reactivas de oxígeno y el óxido nítrico, NO (Álvarez-Pellitero 2008, Magnadottir 2010). Este último es producido por la sintasa de óxido nítrico inducible, iNOS (fig. 1.17), principalmente localizada en macrófagos (Díez y col. 2010, Spratt y col. 2007, Zhao y col. 2010), aunque se puede encontrar en otros tipos celulares, entre ellos los enterocitos (Campos-Pérez y col. 2000, Gookin y col. 2006, Keklikoglu y col. 2008). La expresión de iNOS en macrófagos activados induce un ambiente citotóxico y promueve la vasodilatación, mediando en diferentes fases de la respuesta inmunitaria (Pacher y col. 2007, Vincendeau y col. 2003, Zhao y col. 2010). La respuesta inmunitaria frente a las enteromixosis engloba importantes eventos innatos, como el incremento del estallido respiratorio en los fagocitos circulantes y valores de NO sérico (Álvarez-Pellitero y col. 2008, Golomazou y col. 2006, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Sin embargo, no hay estudios histológicos que evalúen el Introducción 48 incremento en la expresión de iNOS o la distribución de las células productoras de NO. En cuanto a la respuesta adquirida, se ha constatado la producción de anticuerpos específicos y migración de células portadoras de inmunoglobulinas en rodaballos parasitados por E. scophthalmi (Bermúdez et al. 2006b, Sitjà-Bobadilla y col. 2006). Figura 1.17: Esquema de la producción de óxido nítrico por las enzimas sintasas de óxido nítrico (NOS). NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato, forma reducida, NADP+: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. 1.4.3. Efectos de los parásitos en el epitelio: apoptosis El epitelio intestinal sano actúa como una barrera que controla el intercambio de agua y electrolitos, absorción de nutrientes e impide el ingreso de los patógenos al organismo. Al colonizar el epitelio digestivo, los patógenos provocan cambios en los enterocitos, que alteran la función intestinal. Por ejemplo, en la enteromixosis del pez globo se ha demostrado que las lesiones intestinales causan un fallo en la regulación osmótica y absorción de los nutrientes que provocan el adelgazamiento rápido del pez (Ishimatsu y col. 2007). La modificación de la estructura interna y uniones entre las células epiteliales no solo se traduce en un mal funcionamiento del epitelio, Introducción 49 sino que puede llegar a inducir la muerte celular. Por otra parte, a consecuencia de la respuesta inflamatoria, se liberan gran cantidad de moléculas oxidativas que crean un ambiente citotóxico y pueden contribuir al daño tisular. Como se ha mencionado previamente, en las enteromixosis se liberan especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, con posibles efectos deletéreos sobre las células intestinales. Además, se ha podido demostrar en doradas con enteromixosis que los mecanismos antioxidantes, entre ellos el sistema glutatión peroxidasa-glutatión disulfuro, aparecen reducidos, lo que incrementaría el riesgo de daño oxidativo (Estensoro y col. 2011a, Sitjà-Bobadilla y col. 2008). Además de ocasionar daño celular per se, los radicales libres como el óxido nítrico pueden desencadenar la descamación de las células epiteliales (Monteiro y col. 2004). Debido a la pérdida del contacto con otras células y con la matriz subyacente, los enterocitos sufren una forma de muerte celular programada o apoptosis, denominada anoikis (Chiarugi y Giannoni 2008, Lugo-Martínez y col. 2009). La apoptosis regula la respuesta del hospedador durante infecciones causadas por una gran variedad de parásitos, que a su vez han evolucionado con diversas estrategias para inducir o inhibir apoptosis en las células que infectan, modulando la respuesta inmunitaria y beneficiando su diseminación en el hospedador (Lüder y col. 2001, Mele y col. 2004, Panaro y col. 2007, Schaumburg y col. 2006). La apoptosis se manifiesta morfológicamente por condensación de la cromatina, fragmentación del ADN, tumefacción de la membrana plasmática, retracción celular y desintegración en vesículas (cuerpos Introducción 50 apoptóticos). Existen dos vías básicas para la iniciación de la apoptosis, la vía intrínseca o mitocondrial y la vía extríseca o de los receptores de muerte (fig. 1.18). Ambas confluyen en la obtención de la forma activa de la caspasa-3 (Duan y col. 2003, Panaro y col. 2007). En mamíferos, los efectos proapoptóticos y antiapoptóticos de diversos patógenos son muy importantes en el desarrollo de las parasitosis intestinales, como las causadas por Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum o Entamoeba histolytica (Becker y col. 2010, Liu y col. 2009, Mele y col. 2004, Panaro y col. 2007, Ralston y Petri 2011). Figura 1.18: Esquema de las vías de la apoptosis. FADD: Dominio de muerte asociado a Fas. APAF-1: Factor 1 activador de la proteasa apoptótica. En peces infectados por mixosporidios intestinales también se observan cambios en la muerte celular programada. En el rodaballo está descrita la presencia de necrosis y células con caracteres morfológicos de apoptosis en el epitelio digestivo, asociada a la Introducción 51 infección por E. scophthalmi, así como muerte celular en el tejido linfohematopoyético (Bermúdez y col. 2006b). En las doradas expuestas de forma crónica a E. leei existen diferencias en la expresión de los genes relacionados con la apoptosis, con sobre-expresión de genes proapoptóticos y disminución de otros antiapoptóticos en intestino y riñón (Davey y col. 2011). 1.4.4. Cambios en el sistema neuroendocrino entérico En los teleósteos, de forma similar a los mamíferos, el sistema neuroendocrino regula los procesos fisiológicos que ocurren en el tubo digestivo (Çinar y col 2006, Vigliano y col. 2011b, Volkoff y col. 2005) y participa en la respuesta a agresiones de forma coordinada con el sistema inmune (Bermúdez y col 2007, Dezfuli y col. 2011, Selleri y col. 2008). Figura 1.19: Intestino medio de dorada inmunoteñido para tubulina alfa. Distribución del sistema nervioso entérico. Imagen del grupo investigador. Introducción 52 El sistema neuroendocrino incluye los sistemas nervioso entérico (SNE) y endocrino difuso. Las neuronas del SNE se agrupan en dos tipos de ganglios: el plexo mientérico o de Auerbach y el plexo submucoso o de Meissner. El plexo mientérico se localiza entre las capas musculares externa e interna del tubo digestivo, mientras que el plexo submucoso se encuentra bajo la lámina propia-submucosa en el caso de los teleósteos, cerca de la capa muscular interna o circular (fig. 1.19). En los peces, la mayoría de cuerpos neuronales se encuentran en el plexo mientérico. El plexo submucoso está menos desarrollado y en la mayoría de especies está compuesto únicamente por fibras nerviosas (Olsson 2009). El sistema endocrino entérico está compuesto por células secretoras individuales distribuidas en la mucosa del estómago e intestino. Las hormonas producidas regulan la secreción, absorción, motilidad y proliferación de la mucosa, además de coordinarse con el sistema inmunitario para poder iniciar una respuesta inmune. Las principales funciones de los neuropéptidos en teleósteos se resumen en la tabla 1.11. Las células enteroendocrinas responden a estímulos procedentes del lumen intestinal y señales somáticas producidas por neurotransmisores, factores de crecimiento y citoquinas (fig. 1.20). Los cambios producidos son detectados a través de neuronas, células endocrinas y células inmunitarias, que se comunican a través de péptidos intestinales de forma endocrina, paracrina y autocrina (Ahlman y Nilsson 2001, Ameri y Ferone 2012, Bilbo y Klein 2012, Snoek y col. 2010). Introducción 53 Péptido Funciones Referencias Bombesina Estimulante de la secreción de ácido gástrico. Estimulante de la motilidad gastrointestinal. Inhibidor del vaciado gástrico. Inhibidor del apetito. Jensen 2001 Lin y col. 2000 Volkoff y col. 2005 Colecistoquinina Regulador de la motilidad intestinal y el vaciado gástrico. Estimulante de la secreción pancreática. Inhibidor del apetito. Bermúdez y col. 2007 Gélineau y Boujard 2001 Volkoff y col. 2003, 2005 Encefalinas (Leuencefalina y Metencefalina) Inhibidores del vaciado gástrico. Estimulantes del tono de los esfínteres. Inhibidores de la motilidad y secreción intestinal. Holzer 2009 Lukiw 2006 Metz-Boutigue y col. 2003 Radulović y col. 1996 Sirinek y O’Dorisio 1991 Glucagón Hiperglucemiante y lipolítico. Inhibidor del apetito. Geary 1999 Moon 1998 Volkoff y col. 2005 Péptido intestinal vasoactivo Inhibidor de la motilidad intestinal. Vasodilatador. Inhibidor de la respuesta de células T. Inhibidor de la síntesis de IL-2, IL-4 e Ig. Inhibidor de la actividad de los macrófagos. Balemba y col. 2001 Bermúdez y col. 2007 Goetzl y Sreedharan 1992 Rudholm y col. 2009 Snoek y col. 2010 Péptido relacionado con el gen de la calcitonina Inhibidor de la motilidad intestinal. Vasodilatador. Inhibidor de la proliferación de linfocitos. Inhibidor de la actividad de los macrófagos. Bermúdez y col. 2007 Geary 1999 Shabhazi y col. 1998 Sirinek y O’Dorisio 1991 Neuropéptido Y Estimulante del apetito. Regulador del balance energético. Estimulante de la contracción del músculo liso. Estimulante de la respuesta inmunitaria. Inhibidor de la liberación de somatostatina. Jensen 2001 Nelson y Sheridan 2006 Volkoff y col. 2005 Serotonina Regulador del apetito. Estimulante de la motilidad intestinal. Vasoconstrictor. Bermúdez y col. 2007 Khan y Deschaux 1997 Khan y Ghia 2010 O’Hara y col. 2004 Olsson y Holmgren 2001 Somatostatina Inhibidor de la función de las células parietales. Inhibidor de la proliferación de linfocitos. Inhibidor de la síntesis de Ig. Rudholm y col. 2009 Scalera y Tarozzi 1998 Sirinek y O’Dorisio 1991 Stanisz 1994 Sustancia P Estimulante de la motilidad intestinal. Vasodilatador. Estimulante de la proliferación de linfocitos. Estimulante de la síntesis de inmunoglobulinas. Estimulante de la actividad de células NK y macrófagos, y quimiotaxis. Balemba y col. 2001 Bermúdez y col. 2007 Germonpre y col. 1999 Holzer y Holzer-Petsche 1997 Robinson y col. 2003 Stoyanova y Gulubova 2002 Tabla 1.11: Principales neuropéptidos intestinales y sus funciones Introducción 54 Las parasitosis del tubo digestivo inducen cambios en la liberación de neuromoduladores y distribución de fibras nerviosas, que originan una respuesta con repercusión en la funcionalidad intestinal (cambios en la ingesta y apetito, motilidad, secreción y absorción de fluidos…) y de forma sistémica, al interaccionar con el sistema inmunitario (Ameri y Ferone 2012, Bilbo y Klein 2012, Dezfuli y col. 2011, Di Comite y col. 2007, Snoek y col. 2010, Stanisz 1994). Figura 1.20: Esquema de una célula enteroendocrina. Varios factores luminales y somáticos activan la producción y liberación de péptidos u hormonas por las células enteroendocrinas. Los cambios en el número y distribución de las células enteroendocrinas y fibras nerviosas del SNE, junto con variaciones en péptidos inmunomoduladores se han estudiado en múltiples especies de peces parasitados con helmintos (Bosi y col. 2005b, 2005c, Dezfuli y col. 2003, 2004, 2008, 2009, 2011). Con respecto a las enteromixosis, del amplio abanico de neuropéptidos conocidos, hasta el momento solo se ha estudiado un número limitado. En doradas infectadas, se ha demostrado un recuento inferior de células positivas para neuropéptido Y y sustancia P, mientras que en rodaballos parasitados se producen incrementos de colecistoquinina y serotonina, y descenso de péptido intestinal vasoactivo tanto en células endocrinas como en el SNE (Bermúdez y col. 2007, Estensoro y col. 2009). Objetivos 55 2. OBJETIVOS Esta Tesis Doctoral se enmarca en una línea de investigación iniciada hace más de una década y particularmente en las actividades de dos proyectos financiados: AGL2006-13158-C03-02 “Enteromixosis de rodaballo y espáridos. Mecanismos patogénicos, respuesta inmunitaria y exploración de dianas terapéuticas.” del Ministerio de Educación y Ciencia. AGL2009-13282-C02-02 “Control de las enteromixosis del rodaballo y espáridos. Caracterización de la patogenia, la interacción parásitohospedador y la respuesta inmunitaria.” del Ministerio de Ciencia e Innovación. Asimismo, la doctoranda realizó una estancia de tres meses en el Dipartimento di Scienze e Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare de la Università degli Studi di Milano incluida en el Subprograma de Acciones Integradas del Programa Nacional de Internacionalización de la I+D del Ministerio de Ciencia e Innovación: IT2009-0036 “Enteromixosis de rodaballos y espáridos: estudio histopatológico y del sistema neuroendocrino. Acción Integrada con Italia.” Las propuestas de todos estos proyectos de investigación surgieron debido a que las enteromixosis son enfermedades con gran impacto en la acuicultura marina, cuyas únicas medidas de control efectivas consisten en prevenir la entrada del patógeno a los tanques de cultivo. Una vez que la infección entra en las instalaciones, las consecuencias Objetivos 56 son fatales, debido a la carencia de tratamientos eficaces. Por ello los trabajos en esta línea de investigación se centran fundamentalmente en un mejor conocimiento del parásito y de la respuesta del hospedador a la infección. En la presente Tesis Doctoral se abordan en mayor profundidad aspectos relacionados con la interacción parásito-hospedador, atendiendo especialmente a mecanismos patogénicos y muerte celular, la respuesta inflamatoria y cambios en el sistema neuroendocrino entérico. Por ello, los principales objetivos son: - Caracterización de los cambios histológicos y ultraestructurales que ocurren en el rodaballo durante la infección con Enteromyxum scophthalmi para obtener una descripción completa de la enfermedad desde el punto de vista morfopatológico. - Detección de la enzima iNOS y cuantificación de células iNOS+ en los tejidos de rodaballos con enteromixosis, para evaluar su participación en la patogenia de la enfermedad mediante el estudio de su distribución y su correlación con las lesiones. - Detección y cuantificación de las células apoptóticas en el tubo digestivo y tejidos linfohematopoyéticos de rodaballos con enteromixosis, para el esclarecimiento del papel de la muerte celular programada en la descamación epitelial y depleción leucocitaria. - Caracterización de péptidos relacionados con el sistema neuroendocrino entérico, para determinar las variaciones durante la infección de rodaballos con E. scophthalmi y su implicación en los trastornos digestivos. Materiales y métodos 63 3.2. Técnicas histopatológicas 3.2.1. Fijación y procesado de las muestras Se utilizaron dos fijadores (tabla 3.1): - formol tamponado al 10 %, fijación durante 24 h; - líquido de Bouin, con tiempos de fijación entre 6 y 18 h a 4 ºC, y posteriormente cambio de las muestras a alcohol 70 %. Tabla 3.1: Composición de los fijadores empleados Tras el periodo de fijación, las muestras se procesaron y se elaboraron bloques de tejidos en parafina. 3.2.2. Microscopía óptica Para el estudio al microscopio óptico de las muestras fijadas e incluidas en parafina se realizaron cortes de 3 µm de grosor y se secaron en estufa de 60 ºC un mínimo de 30 min. Posteriormente se desparafinaron con xileno e hidrataron en alcoholes de concentraciones decrecientes (tabla 3.2). Al finalizar la tinción, los tejidos se deshidrataron en alcoholes de concentraciones crecientes y se preservaron con un cubreobjetos y un Formol tamponado al 10 % Formol 37-40% 100 ml NaH2PO4·H2O 4 g Na2HPO4 6,5 g Agua destilada 900 ml Líquido de Bouin Solución saturada de ácido pícrico 750 ml Formol 37-40% 250 ml Ácido acético glacial 50 ml Materiales y métodos 64 medio de montaje soluble en xileno, xileno plastificante diestireno (DPX) (tabla 3.2). Tabla 3.2: Tiempos de desparafinado e hidratación de los cortes histológicos y proceso de deshidratación y aclarado para montar con DPX Las tinciones usadas fueron hematoxilina-eosina, azul de toluidina, ácido periódico de Schiff (PAS) y Giemsa (tabla 3.3). Tabla 3.3: Tinciones empleadas para microscopía óptica Proceso de desparafinado e hidratación 1. Xileno 10 min 2. Xileno 10 min 3. Etanol 100 % 5 min 4. Etanol 96 % 5 min 5. Etanol 70 % 5 min 6. Agua destilada 5 min Proceso de deshidratación y montaje 1. Etanol 96 % 30 s 2. Etanol 100 % 30 s 3. Etanol 100 % 30 s 4. Xileno 30 s 5. Xileno 30 s 6. Montaje con DPX Hematoxilina-eosina Soluciones -Hematoxilina de Harris -Eosina amarillenta 1 % Protocolo 1. Desparafinar e hidratar. 2. Hematoxilina (2 min). 3. Lavar. 4. Eosina (30 s). 5. Lavar, deshidratar, aclarar y montar con DPX. Azul de toluidina Solución de azul de toluidina -Azul de toluidina 0,5 g -Tetraborato de sodio 0,5 g -Agua destilada 100 ml Protocolo 1. Desparafinar e hidratar. 2. Solución de azul de toluidina (5-30 s). 3. Lavar, deshidratar, aclarar y montar con DPX. Tinción PAS Soluciones -Ácido periódico 1 % -Reactivo de Schiff -Hematoxilina de Harris Protocolo 1. Desparafinar e hidratar. 2. Ácido periódico 1 % (15 min). 3. Lavar en agua destilada. 4. Reactivo de Schiff (30 min). 5. Lavar en agua destilada. 6. Hematoxilina (1 min). 7. Lavar, deshidratar, aclarar y montar con DPX. Tinción Giemsa Solución de trabajo Giemsa -Azur-Eosina-Azul de metileno solución según Giemsa (lento) 20 ml -Agua destilada 80 ml Protocolo 1. Desparafinar e hidratar. 2. Solución de trabajo Giemsa (1 h). 3. Lavar en agua con 3 ó 4 gotas de ácido acético glacial. 4. Sumergir en alcohol 96 % hasta lograr el color deseado. 5. Deshidratar en etanol 100 %, aclarar y montar con DPX. Materiales y métodos 65 3.2.3. Técnicas de detección de fragmentos de ADN Para la detección in situ de la fragmentación del ADN, evento clave de la apoptosis, se puede aplicar la técnica TUNEL o de marcaje de fragmentos terminales con desoxiuridina trifosfato, dUTP, mediado por transferasa desoxinucleotidil terminal, TdT (fig. 3.3). Figura 3.3: Esquema de la técnica TUNEL La enzima TdT cataliza la adición repetitiva de desoxinucleótidos a los extremos 3’-OH libres de las cadenas de ADN. En la técnica TUNEL se añaden dUTPs con un conjugado de fluoresceína, detectable bajo el microscopio de fluorescencia o mediante el empleo de un anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa. En este último caso el marcaje se evidencia con el empleo de un sustrato cromógeno para la peroxidasa, como la 3,3’-diaminobencidina (DAB). La técnica TUNEL (tabla 3.4) se aplicó en el artículo III. Para la realización de esta técnica especial, los portaobjetos se trataron con silane, 3-(trietoxisilil)-propilamina. Materiales y métodos 66 Tabla 3.4: Protocolo utilizado para la técnica TUNEL 3.2.4. Inmunohistoquímica Esta técnica permite la detección de antígenos determinados en secciones de tejido fijadas y embebidas en parafina. Para ello, se emplean anticuerpos específicos monoo policlonales (obtenidos comúnmente de ratón y conejo, respectivamente) y una enzima, normalmente peroxidasa de rábano (HRP), que cataliza una reacción en la que se obtiene color, empleando usualmente DAB como cromógeno. Existen varios métodos de inmunotinción y los más utilizados son los indirectos. El método indirecto se basa en el uso un antisuero primario sin conjugar que reconoce el antígeno problema. Posteriormente, se Protocolo de tinción con la técnica TUNEL 1. Secar previamente a 37 ºC (1 h). 2. Desparafinar e hidratar. 3. Bloqueo de la peroxidasa endógena (Peroxidase-Blocking Solution, Dako, Denmark) (30 min). 4. Lavar con PBS* (3 x 5 min). 5. Tratamiento térmico en olla a presión con tampón citrato (citrato de sodio 10 mM, pH 6) (15 min). 6. Lavar con PBS (3 x 5 min). 7. Bloqueo de inespecificidad con seroalbúmina bovina 3 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (20 min). 8. Lavar con PBS (3 x 5 min). 9. Incubación con la mezcla TUNEL (1 h). 10. Lavar con PBS (3 x 5 min). 11. Incubación con el conjugado con peroxidasa (30 min). 12. Lavar con PBS (3 x 5 min). 13. Revelado con DAB (Dako, Denmark). 14. Lavar con agua destilada. 15. Contraste con hematoxilina (1 min). 16. Lavar, deshidratar, aclarar y montar con DPX. *PBS: Tampón fosfato salino (Na2HPO4 8 mM, NaH2PO4 3 mM, NaCl 155 mM, Tween-20 0,05 % [v/v], pH 7,4). Materiales y métodos 67 utilizan conjugados que se unen específicamente al primario o bien añadiendo más pasos intermedios. Figura 3.4: Esquema de la técnica inmunohistoquímica utilizando el sistema EnVisionTM El método empleado en los artículos II, III y IV fue el sistema EnVisionTM (fig. 3.4). En primer lugar se incubó el anticuerpo primario y después se empleó un polímero que lleva varias unidades de anticuerpo secundario (conejo, ratón o ambos) y moléculas de HRP. Las ventajas de este sistema son un protocolo que consta únicamente de dos pasos y las diluciones de los antisueros primarios pueden ser más altas. El protocolo genérico está detallado en la tabla 3.5 y el listado de los anticuerpos primarios con sus diluciones y tiempos de incubación aparecen en la tabla 3.6. Los cortes histológicos se recogieron en portaobjetos tratados con silane. Materiales y métodos 68 Tabla 3.5: Protocolo genérico de inmunohistoquímica Anticuerpo antiFuente Dilución Incubación Bombesina Peninsula Lab IHC 7113 1:1000 12 h 4 ºC Caspasa-3 activa Promega G7481 1:500 2 h TA Enteromyxum scophthalmi A. Sitjà 1:40000 2 h TA Glucagón J.M. Pollack 1:2000 48 h 4 ºC iNOS Neomarkers RB-1605 1:1000 2 h TA Leu-encefalina Genosys Biotechnol. CA-08-235 1:1000 DN 4 ºC Leu-encefalina Peninsula Lab. RAS 8601N 1:2500 DN 4 ºC Met-encefalina Gene-Tex GTX42620 1:400 DN 4 ºC Met-encefalina Bachem AG T-4294 1:1000 DN 4 ºC Somatostatina Genosys Biotechnol. CA-08325 1:800 DN 4 ºC Somatostatina Chemicon Int. AB1976 1:1000 DN 4 ºC Tabla 3.6: Anticuerpos primarios utilizados en inmunohistoquímica en los artículos II, III y IV. Todos los anticuerpos eran policlonales obtenidos en conejo. TA: temperatura ambiente, DN: durante la noche. 3.2.4.1. Protocolo de tinción inmunohistoquímica doble Existe la posibilidad de realizar múltiples inmunotinciones en un mismo corte histológico mediante el uso de una solución que inactiva o elimina los antisueros utilizados tras completar una primera reacción. Protocolo general de tinción inmunohistoquímica 1. Secar previamente a 37 °C (mínimo 1 h). 2. Desparafinar e hidratar. 3. Bloqueo de la peroxidasa endógena (Peroxidase-Blocking Solution, Dako) (30 min). 4. Lavar con PBS (3 x 5 min). 5. Recuperación antigénica (RA, opcional, dependiendo del Ac. primario). 6. Lavar con PBS (3 x 5 min). 7. Incubación con el anticuerpo primario. 8. Lavar con PBS (3 x 5 min). 9. Incubación con EnVision (30 min). 10.Lavar con PBS (3 x 5 min). 11.Revelado con DAB (Dako). 12.Lavar con agua destilada. 13.Contraste con hematoxilina (1 min). 14.Lavar, deshidratar, aclarar y montar con DPX. Materiales y métodos 69 Como resultado, el cromógeno se deposita en el tejido y se evitan reacciones cruzadas. En cada inmunohistoquímica se debe emplear un cromógeno diferente. Para la doble detección de caspasa-3 activa (c-3a) y E. scophthalmi (art. III) se completó, en primer lugar, el procedimiento para inmunomarcar c-3a. Tras el revelado con DAB, las muestras se sumergieron en tampón glicina-HCl (glicina 100 mM, pH 2,2) durante 5 min, se realizaron lavados con PBS y se procedió a realizar la inmunohistoquímica para teñir E. scophthalmi (fig. 3.5). Para revelar se utilizó un cromógeno púrpura, Vector VIP (VectorLabs, UK). Figura 3.5: Esquema de la inmunotinción doble Materiales y métodos 70 3.3. Histometría 3.3.1. Recuento de células inmunomarcadas. Obtención de imágenes digitalizadas El recuento de células inmunomarcadas se hizo de forma manual o automatizada. El recuento manual se empleó en el caso de las células positivas para c-3a en el epitelio de revestimiento y lámina propiasubmucosa del tubo digestivo (art. III). Se eligió esta metodología debido al bajo número de células positivas, la variabilidad en las áreas de epitelio capturadas en imágenes digitalizadas, y la distinción de posibles estadios primarios de E. scophthalmi sufriendo apoptosis. La totalidad del epitelio de revestimiento de los cortes histológicos de esófago, estómago, ciegos pilóricos e intestino (anterior, medio y posterior) se examinó con el objetivo de 40x para obtener el número de células positivas en cada sección. Del mismo modo, se hizo el recuento en la lámina-propia submucosa. Se asignaron valores de 1+ a 4+ según el número de células positivas para c-3a (tabla 3.7). Valor Recuento en la sección 1+ < 25 2+ 25 – 60 3+ 60 – 100 4+ > 100 Tabla 3.7: Valores del recuento de células positivas para caspasa-3 activa en las secciones de tubo digestivo Los recuentos automatizados de células inmunoteñidas con iNOS (iNOS+) en bazo, riñón y tubo digestivo (art. II) y células positivas con c-3a (c-3a+) en bazo y riñón (art. III) consistieron en la toma de Materiales y métodos 71 microfotografías y posterior procesado informático. Las imágenes se obtuvieron con un fotomicroscopio Olympus BX51 conectado a un ordenador a través de la cámara Olympus DP72. La adquisición de los campos se realizó con el software Olympus Cell^A (Olympus, Japón), que permitió la visualización del tejido en el monitor (fig. 3.6). Los parámetros de captura de imágenes se fijaron en modo manual y a los mismos niveles para lograr unos ajustes uniformes. Se tomaron aleatoriamente 5 fotos de cada órgano a estudiar utilizando el objetivo 20x. Los campos capturados de tubo digestivo se escogieron de forma que fueran similares en todos los casos. Figura 3.6: Captura del software Olympus Cell^A para obtener imágenes digitales de cortes histológicos Se contabilizaron todas las células inmunoteñidas en el área total fotografiada (0,72 mm2). Los registros fueron manuales cuando el número por imagen era inferior a 10. Materiales y métodos 72 El recuento en cada imagen se realizó con el software Image-Pro Plus 4 (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD). El programa permitió identificar los elementos con color e intensidad similares (fig. 3.7), de tal forma que se seleccionaron todas las células inmunomarcadas (color marrón). Se creó una nueva máscara con los elementos escogidos. Estos aparecían en blanco y el resto de la imagen en negro. Se introdujo un rango de tamaño de las células y se contaron las áreas blancos que cumplían esa condición. Así se obtuvo el número de células positivas por imagen. Figura 3.7: Captura del software Image-Pro Plus 4 para el recuento de células inmunoteñidas 3.3.2. Estudio estadístico Los datos del número de células iNOS+ (art. II) y c-3a+ (art. III) en cada órgano se estudiaron por separado y se agruparon según el estudio histológico de los rodaballos: sin lesiones, leve, moderado y severo. Resultados y discusión 79 esta caracterización. Esta técnica se puede aplicar en casos dudosos de muestras de tejidos en bloques de parafina, cuando no se detectan trofozoítos con la morfología típica de “célula dentro de célula”, o el rodaballo todavía no ha desarrollado los cambios histológicos asociados a la parasitación. Adicionalmente, la técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-E. scophthalmi mostró intensa positividad en fases más avanzadas de desarrollo del parásito, con marcaje más acentuado en las células P. Estos hallazgos coinciden con el inmunomarcaje recientemente descrito por Estensoro y col. (2013). En el inicio de la infección por E. scophthalmi no existieron cambios histológicos aparentes en el epitelio de revestimiento digestivo, aunque en ocasiones, se detectaron lesiones degenerativas a nivel ultraestructural en células que entraban en contacto con las formas parasitarias (art. I). Los enterocitos exhibían un citoplasma más electrolúcido, pérdida de las organelas citoplasmáticas y cambios en el patrón de distribución de la cromatina. Los plasmodios parasitarios formaban uniones especializadas con la membrana del hospedador mediante numerosas interdigitaciones citoplasmáticas, coincidiendo con la descripción realizada en estudios previos de enteromixosis en rodaballo, dorada y sargo picudo (Cuadrado y col. 2008, Redondo y col. 2003b). Estas uniones probablemente están asociadas a funciones de comunicación con las células del hospedador y nutrición de los plasmodios. Las interdigitaciones citoplasmáticas podrían ser el resultado de la deformación celular por cambios ocasionados en el citoesqueleto del enterocito. Esto representaría una estrategia del parásito para incrementar el área de contacto con las células del Resultados y discusión 80 hospedador y disponer de una mayor superficie de intercambio para la obtención de nutrientes, favoreciendo de esta manera su rápido desarrollo en el epitelio. Sin embargo, no se conocen los mecanismos que producen o desencadenan los cambios en el citoesqueleto de los enterocitos, por lo que se deberían orientar futuros estudios hacia la caracterización del citoesqueleto de las células epiteliales del rodaballo y sus alteraciones en respuesta a la parasitación. Otro hallazgo en la fase temprana de la enfermedad, fue el incremento en el número de células goblet y rodlet, lo que hacía que fueran fácilmente detectables en el estudio ultraestructural del epitelio digestivo (art. I). A veces aparecían liberando su contenido hacia la luz intestinal. Este aumento en las células goblet y rodlet, descrito de manera preliminar por nuestro grupo de investigación (Vigliano y col. 2004), indicaría la participación de estos tipos celulares en la respuesta inmunitaria frente a E. scophthalmi, como también se ha observado en otras enfermedades digestivas de peces (Dezfuli y col. 2008, 2011, Reite 2005, Reite y Evensen 2006, Ronza y col. 2011, Sitjà-Bobadilla 2008b). El incremento de las células goblet durante infecciones del epitelio gastrointestinal se ha relacionado con una estrategia para expulsar a las formas parasitarias mediante hipersecreción de moco. Este tipo de respuesta en infestaciones por helmintos (Bosi y col. 2005a, Dezfuli y col. 2009) o colonizaciones bacterianas (Ronza y col. 2011) podría ser útil para eliminar los patógenos extracelulares, aunque en el caso de E. scophthalmi, debido a su posición intercelular y su estrecha relación Resultados y discusión 81 con los enterocitos circundantes (Redondo y col. 2003b), este mecanismo no presentaría la misma eficacia. Las células rodlet son un tipo celular presente en peces que posee características estructurales y funcionales comunes a células epiteliales secretoras y a leucocitos (Manera y Dezfuli 2004, Mazon y col. 2007). Se ha sugerido que tienen un papel activo en la defensa, por su localización en branquias, riñón e intestino, y por liberar su contenido a la sangre en riñón, y a las superficies que recubren el tubo digestivo y branquias (Mazon y col. 2007). Dezfuli y col. (2000, 2007, 2009) han destacado su relevancia durante las respuestas inflamatorias y han asociado su reclutamiento a las señales químicas liberadas por leucocitos. Algunos autores incluso han sugerido que las células rodlet representan un tipo de granulocito eosinófilo (Reite 2005) o que poseen características muy similares a macrófagos y granulocitos (Mazon y col. 2007). El hallazgo del incremento de células rodlet en rodaballos infectados indica su papel en la respuesta frente al patógeno en etapas iniciales de la infección. En general este incremento no se asociaba a una respuesta inflamatoria evidente. En las infecciones leves, los infiltrados inflamatorios estaban ausentes o eran escasos, mayoritariamente de tipo mononuclear, localizándose en la lámina propia-submucosa del intestino o en la parte basal del epitelio de revestimiento digestivo (art. I). La aparición de células inflamatorias en estadios iniciales de la infección se ha descrito en sargo picudo infectado por Enteromyxum leei, especie en la que ocurre un reclutamiento de linfocitos en la mucosa intestinal (ÁlvarezPellitero y col. 2008). Resultados y discusión 82 Entre los mecanismos implicados en las primeras fases de la inflamación, se encuentra la liberación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Estas últimas son originadas en gran medida por iNOS, presente principalmente en macrófagos y granulocitos. En nuestro trabajo, hemos puesto a punto una técnica inmunohistoquímica para la detección de iNOS en los tejidos de rodaballo, con el propósito de establecer los cambios sufridos en la expresión de esta enzima en las células del sistema inmune y de la mucosa gastrointestinal durante la enteromixosis (art. II). Mediante esta técnica, se observó inmunotinción de algunas células mononucleares presentes en el infiltrado inflamatorio de la submucosa intestinal, compatibles con macrófagos, que participan en la respuesta inmune innata a este nivel. Rumbo y col. (2005) observaron la presencia de iNOS en la mucosa gastrointestinal de humano y ratón, principalmente en el polo apical de los enterocitos. Asimismo se ha comprobado que su expresión se incrementa de forma significativa en branquias de teleósteos, intestino de mamíferos y macrófagos de varias especies durante las infecciones bacterianas y protozoarias, constituyendo una herramienta importante en la lucha contra patógenos (Campos-Pérez y col. 2000, Gookin y col. 2004, Kukuruzovic y col. 2002, Leitch y He 1999, Oladiran y Belosevic 2009). En el rodaballo se observó, en el tracto gastrointestinal, inmunotinción intensa del borde en cepillo (art. II). Adicionalmente, asociada a la presencia de E. scophthalmi, se obtuvo marcaje ligero a moderado en el polo apical de los enterocitos y en leucocitos intraepiteliales. Este patrón fue apreciable sobre todo en los tramos medio y posterior del intestino. Resultados y discusión 83 En otros órganos, los cambios histológicos no fueron evidentes, aunque en el bazo, mediante inmunotinción de iNOS (art. II) se observó un marcaje punteado en los elipsoides esplénicos, leve marcaje en otras estructuras vasculares y centros de melanomacrófagos (CMMs) y un número variable de células positivas para iNOS (iNOS+), principalmente macrófagos y en menor medida granulocitos, dispersas en el parénquima. La observación de iNOS en vasos sanguíneos se ha descrito en humanos y modelos animales (Gericke y col. 2013, Shah y col. 2013), y la producción de NO está relacionada con la relajación de la musculatura lisa de los vasos (Durand y Gutterman 2013), que ocasiona vasodilatación y congestión en las fases iniciales de la inflamación. En rodaballos infectados, la presencia y distribución de iNOS en el bazo ya en etapas tempranas de la infección indicaría la activación de la respuesta inmunitaria innata y la participación de este órgano linfoide secundario en la enfermedad. Los principales hallazgos en las infecciones moderadas (art. I) consistieron en la presencia de mayor carga parasitaria de E. scophthalmi en el epitelio digestivo, con estadios de desarrollo más avanzados y mayor extensión de mucosa afectada en todos los tramos del tracto gastrointestinal. El número más elevado de parásitos se detectó en los ciegos pilóricos y el intestino anterior. Los estadios proliferativos eran principalmente estadios 2 y 3, en tanto que las fases esporogónicas y esporas fueron muy escasas, hallazgo similar a lo observado en otras infecciones tanto naturales como experimentales (Redondo y col. 2002, 2004). Resultados y discusión 84 Una característica significativa en esta fase de infección era el ondulamiento o festoneado del epitelio de revestimiento en el margen apical y la vacuolización en la zona basal (art. I). La presencia de plasmodios parasitarios modifica la morfología de los enterocitos, lo que altera la regularidad del epitelio y origina los cambios en la zona basal que pueden desencadenar la descamación. Otros autores han descrito cambios similares en otras enteromixosis (Fleurance y col. 2008, Tun y col. 2002), como por ejemplo en doradas infectadas por E. leei donde se describe la pseudoestratificación del epitelio intestinal por la presencia de formas parasitarias. Ultraestructuralmente, los enterocitos cercanos a los trofozoítos presentaban cambios más evidentes consistentes en tumefacción y pérdida de las crestas mitocondriales, pérdida de las microvellosidades, condensación de la cromatina y descenso de la electrodensidad del citosol (art. I). Todos estos cambios degenerativos están asociados a fases tempranas de muerte celular. En estas etapas, el epitelio mostraba vacuolización en la zona basal y mayor inmunotinción de iNOS (art. II), sobre todo en el polo luminal. La extensión del inmunomarcaje de iNOS en el epitelio de revestimiento en respuesta a la infección por E. scophthalmi se asemeja a lo descrito en otros procesos infecciosos-inflamatorios en tubo digestivo (Gookin y col. 2005, Keklikoglu y col. 2008, Mokrzycka y col. 2010). Los niveles tisulares de iNOS se incrementan en respuesta a los patógenos como mecanismo de defensa innato, pero puede ocurrir una sobreproducción de esta enzima con efectos perjudiciales para los tejidos del hospedador (Chokshi et al. 2008, Resultados y discusión 85 Keklikoglu y col. 2008, Pacher et al. 2007). Entre los efectos del NO se encuentra la capacidad antiadhesiva que puede desencadenar apoptosis (Monteiro y col. 2004), producida por el desprendimiento de las células de la membrana basal subyacente. Este tipo de muerte celular en epitelios de revestimiento se denomina anoikis (Chiarugi y Giannoni 2008). En el caso del rodaballo, el incremento progresivo de iNOS en los tejidos de los peces infectados podría contribuir al daño tisular, reflejado en la vacuolización de la base del epitelio, apoptosis de los enterocitos y descamación del revestimiento epitelial. De tal modo, en comparación con rodaballos controles y con infecciones leves, existía un mayor número de células epiteliales con morfología compatible con apoptosis. El inmunomarcaje de c-3a en el epitelio de revestimiento intestinal (art. III) mostró un incremento en el número de células positivas por sección de tubo digestivo en todos los tramos estudiados, más evidente en las porciones anterior y media del intestino. La presencia de patógenos en el epitelio puede inducir la apoptosis en los enterocitos, acelerando la velocidad de renovación epitelial, pero desestabilizando la función de barrera del epitelio (Cliffe y col. 2005, Panaro y col. 2007). Aunque la mayor renovación epitelial se ha descrito como un posible mecanismo para eliminar los parásitos del epitelio (Cliffe y col. 2005), la pérdida de la función de barrera epitelial contribuiría al síndrome de malabsorción y favorecería infecciones secundarias, como se ha observado en algunos rodaballos. Un aspecto similar entre las enteromixosis del rodaballo y de la dorada es el incremento de la apoptosis en el tubo digestivo. En doradas infectadas se ha detectado una mayor expresión de genes con funciones proapoptóticas, junto con un descenso en otros con Resultados y discusión 86 funciones antiapoptóticas. Otros genes proapoptóticos estaban también disminuidos, indicando los complejos ajustes de las señales apoptóticas (Davey y col. 2011). La muerte celular programada podría facilitar la infección y dispersión de los parásitos en el epitelio digestivo (Becker y col. 2010, Liu y col. 2009, Ralston y Petri 2011, Redondo y col. 2003b), como se ha observado tanto en rodaballo como dorada. En comparación con la enteromixosis producida por E. leei en dorada, existen varias diferencias que podrían ser determinantes en la progresión de la enfermedad, ya que en dorada se convierte en un proceso crónico con tasas de mortalidad muy inferiores a las observadas en rodaballos infectados con E. scophthalmi. En doradas, E. leei infecta el epitelio de revestimiento digestivo, llegando a cargas parasitarias muy elevadas, pero que no desencadenan la descamación de los enterocitos (Fleurance y col. 2008). A diferencia de la respuesta inmunitaria desarrollada en rodaballo desde las primeras fases de la infección (Sitjà-Bobadilla y col. 2006), coincidente con el incremento de iNOS en intestino y bazo, en la dorada ocurre una depleción de factores inmunes, como las peroxidasas séricas totales, lisozima u óxido nítrico, y una infraexpresión de genes relacionados con la respuesta inmunitaria (Davey y col. 2011, Estensoro y col 2011a, SitjàBobadilla y col. 2008). Esto, sumado a la sobre-expresión de genes relacionados con los mecanismos antioxidantes (Davey y col. 2011), podría evitar el daño epitelial asociado a los productos de la respuesta inmunitaria y cuyo efecto contribuiría la estabilidad del revestimiento epitelial. A pesar de este efecto beneficioso que los mecanismos antioxidantes realizan sobre el epitelio intestinal en la dorada, la Resultados y discusión 87 consecuencia de la evasión de la respuesta inmunitaría de E. leei sería la persistencia de los estadios de desarrollo entre los enterocitos y la cronificación de la enfermedad. En esta línea, sería necesario determinar los mecanismos antioxidantes que se desarrollan en rodaballos con enteromixosis, lo que podría aportar información de interés para el diseño de estrategias terapéuticas encaminadas a limitar el daño oxidativo sobre los tejidos, modulando la respuesta inmunitaria. En las infecciones moderadas, la reacción inflamatoria en la lámina propia-submucosa fue leve o moderada y se localizaba principalmente en los pliegues altamente parasitados. En estos, se observó dilatación de capilares sanguíneos, linfangiectasia e infiltrados inflamatorios mixtos, compuestos por linfocitos, granulocitos y macrófagos, que mediante inmunohistoquímica mostraron intensa inmunotinción para iNOS (art. II). El tipo de infiltrado inflamatorio presente en la lámina propia del tubo digestivo era similar al descrito en dorada, sargo picudo o pez globo parasitados por E. leei, si bien en espáridos se describe la presencia de células granulares eosinofílicas, ausentes en rodaballo (Álvarez-Pellitero y col. 2008, Fleurance y col. 2008, Tun y col. 2002). Adicionalmente, en la submucosa intestinal del rodaballo se detectaron CMMs, que no solo almacenarían detritos celulares sino que participarían en la respuesta inmunitaria a nivel local; y en la zona basal del epitelio, la presencia de linfocitos dispuestos de manera lineal, siguiendo la membrana basal. El papel de los linfocitos intraepiteliales en la enteromixosis no se ha esclarecido hasta el momento, aunque se ha podido comprobar que la mayor parte resultan positivos frente al anticuerpo anti-CD3 (CD3+, datos no publicados). Resultados y discusión 88 En el caso de la gastroenteritis de la trucha arcoiris, Ronza y col. (2011) observaron en el intestino la presencia de linfocitos intraepiteliales CD3+ cercanos a las áreas de desprendimiento epitelial, y relacionaron la descamación de los enterocitos con la inducción de muerte celular por los linfocitos. Otros autores habían descrito previamente en intestino delgado de ratón la acción de los linfocitos intraepiteliales CD3+ activados sobre la fragmentación de ADN y desprendimiento de los enterocitos (Yaguchi y col. 2004). En el rodaballo, los linfocitos localizados en el epitelio de revestimiento también podrían contribuir a la inducción de apoptosis en las células epiteliales, aunque se precisan nuevos estudios sobre mediadores citotóxicos para esclarecer este mecanismo. Finalmente, en las infecciones severas, las formas parasitarias, principalmente plasmodios de mayor tamaño, formas esporogónicas y escasas esporas, se distribuían por la mucosa de todas las secciones del tubo digestivo, en ocasiones, acompañadas por infecciones bacterianas secundarias. Los enterocitos presentaban daños evidentes consistentes en clara vacuolización e imágenes de necrosis y apoptosis. El estudio ultraestructural mostró pérdida de la adhesión de los enterocitos a la membrana basal y ruptura de las conexiones laterales entre células, provocando el desprendimiento de extensas áreas de epitelio de revestimiento digestivo. Las células descamadas mostraban características morfológicas de apoptosis e inmunomarcaje para c-3a (c-3a+) (art. III). Debido a esta descamación, los pliegues intestinales aparecían desprovistos del revestimiento epitelial, aunque en algún rodaballo se observó cierto grado de regeneración con un epitelio cúbico bajo o plano. En ocasiones, entre los detritos celulares presentes Resultados y discusión 95 parasitarias y la respuesta inflamatoria intestinal (niveles excesivos de especies reactivas de nitrógeno y citotoxicidad de linfocitos intraepiteliales), puede contribuir a la muerte celular de los enterocitos y menor renovación epitelial, lo que provocaría la disfunción y desprendimiento del epitelio de revestimiento digestivo, uno de los hechos más característicos de la enteromixosis del rodaballo. Conclusiones/ Conclusions 97 5. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS Conclusiones De acuerdo con los resultados obtenidos podemos concluir que: 1. En las fases iniciales de la enteromixosis las alteraciones histológicas en los rodaballos son escasas y la detección de las formas parasitarias de Enteromyxum scophthalmi es compleja, por lo que el empleo de la inmunohistoquímica con el anticuerpo antiE. scophthalmi en muestras fijadas e incluidas en parafina es una herramienta eficaz para el diagnóstico precoz. 2. Durante los primeros estadios de la enteromixosis se produce una respuesta inmunitaria innata, reflejada en el incremento de células goblet, células rodlet y linfocitos intraepiteliales en el epitelio de revestimiento, escasa movilización de células mononucleares a la lámina propia-submucosa e incremento de la expresión de iNOS tanto en el tubo digestivo como en el bazo. A pesar del desarrollo temprano de esta respuesta, la progresión de la enfermedad no se frena. 3. Las infecciones moderadas se caracterizan principalmente por el aspecto festoneado y la vacuolización del epitelio de revestimiento digestivo. Las uniones especializadas de los plasmodios parasitarios con la membrana del hospedador resultan en cambios en el citoesqueleto de los enterocitos, alterando la regularidad del epitelio y dañando la zona basal, lo que puede desencadenar la descamación. Conclusiones/ Conclusions 98 4. La infección por E. scophthalmi causa el incremento progresivo de la enzima iNOS en los órganos linfohematopoyéticos, enterocitos y células inflamatorias en la lámina propia-submucosa. La activación de iNOS origina óxido nítrico, con alto poder oxidativo, encaminado a eliminar los estadios parasitarios, a pesar de que en niveles elevados puede resultar perjudicial para los tejidos del hospedador. 5. En las infecciones severas de la enteromixosis se produce una descamación marcada del epitelio de revestimiento digestivo. Entre los posibles mecanismos involucrados se encuentra el incremento progresivo de la apoptosis en el epitelio de revestimiento y la acción de moléculas con efecto antiadhesivo (como el óxido nítrico) y antiproliferativo (como la somatostatina), que pueden desencadenar la separación de los enterocitos de la membrana basal y su posterior anoikis. 6. El hallazgo en el lumen intestinal de trofozoitos recubiertos de enterocitos descamados sufriendo anoikis, sugiere un modo de protección y dispersión de los plasmodios en el medio, si bien no se puede descartar que constituya una estrategia del hospedador para “secuestrar” las formas parasitarias y evitar la colonización de otras áreas. 7. La depleción leucocitaria en los órganos linfohematopoyéticos característica de las infecciones severas por E. scophthalmi, puede estar originada por la migración masiva de leucocitos a los focos inflamatorios en el tracto gastrointestinal, y el incremento progresivo de apoptosis en los órganos linfohematopoyéticos y en el infiltrado inflamatorio del tracto gastrointestinal. Conclusiones/ Conclusions 99 8. Las variaciones experimentadas por los neuropéptidos estudiados se relacionan con disminución de la motilidad intestinal y secreción de fluidos, así como un detrimento de los mecanismos anorexigénicos. Sin embargo, los peces infectados mostraron un estado caquéctico, que puede ser debido al deterioro histológico del tracto gastrointestinal, y/o a la interacción resultante entre otros neuromoduladores implicados. 9. El incremento de encefalinas en el tubo digestivo de rodaballos infectados, activaría rutas proinflamatorias, contribuyendo al desarrollo de la respuesta inmunitaria observada a este nivel. Por el contrario, el aumento de somatostatina representaría un mecanismo de control destinado a contrarrestar una posible respuesta inmunitaria exacerbada. Conclusiones/ Conclusions 100 Conclusions According to the results obtained, we can conclude that: 1. In the initial stages of enteromyxosis, histological alterations in turbot are scant and detecting parasitic forms of Enteromyxum scophthalmi is complex, so the use of immunohistochemistry with the anti-E. scophthalmi antibody in paraffin-embedded fixed samples is an effective tool for early diagnosis. 2. During the early stages of enteromyxosis, innate immune response occurs, reflected in the increase in goblet cells, rodlet cells and intraepithelial lymphocytes in the epithelial lining, scarce mobilization of mononuclear cells to the lamina propriasubmucosa and increased expression of iNOS in both the gut and spleen. Despite the early development of this response, disease progression is not halted. 3. Moderate infections are mainly characterized by the scalloped appearance and vacuolization of the digestive epithelial lining. The specialized junctions of the parasitic plasmodia with host membrane result in cytoskeletal changes in the enterocytes, disturbing the regularity of the epithelium and the basal damage, which can trigger the detachment. 4. Infection by E. scophthalmi causes progressive increase in iNOS enzyme in lymphohematopoietic organs, enterocytes, and inflammatory cells in the lamina propria-submucosa. Inducible NOS activation produces nitric oxide, with high oxidative power, Conclusiones/ Conclusions 101 aimed at eliminating the parasitic stages, although high levels of this molecule may be detrimental to the host tissues. 5. In the severe infections of enteromyxosis, epithelial desquamation of the digestive lining is produced. Among the possible mechanisms involved, we found a progressive increase in apoptosis in the epithelial lining, and the effect of anti-adhesive molecules (such as nitric oxide) and anti-proliferative mediators (such as somatostatin), which may trigger the separation of the enterocytes from the basement membrane and the subsequent anoikis. 6. The finding of scaly enterocytes undergoing anoikis coating trophozoites in the intestinal lumen, suggests a protectivedispersion mode of plasmodia in the environment, even though a host strategy to "hijack" the parasitic forms and avoid colonization of other areas may not be disregarded. 7. The characteristic leukocyte depletion in the lymphohematopoietic organs in severe infections by E. scophthalmi may be due to the massive migration of leukocytes to the inflammatory foci within the gastrointestinal tract, and the progressive increase of apoptosis in lymphohematopoietic tissues and inflammatory infiltration of the gastrointestinal tract. 8. The variations observed in the neuropeptides are related to the diminution of the intestinal motility and fluid secretion, as well as a decrease of the anorexigenic mechanisms. However, the infected fish showed cachexia, which may be due to histological impairment of the gastrointestinal tract and/or the interaction between other neuromodulators involved. Conclusiones/ Conclusions 102 9. The increased enkephalins in the digestive tract of infected turbot activate proinflammatory pathways contributing to the development of the immune response observed at this level. By contrast, increased somatostatin represent a control mechanism aimed at counteracting a possible exacerbated immune response. Referencias bibliográficas 103 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS A Actis LA, Tolmasky ME, Crosa JM (2011) Vibriosis. En: Woo PTK, Bruno DW (eds) Fish diseases and disorders, Vol 3: viral, bacterial and fungal infections, 2nd Edition. CABI, Wallingford, pp. 570-605. Agius C, Roberts RJ (2003) Melano-macrophage centres and their role in fish pathology. J Fish Dis 26:499-509. Ahlman H, Nilsson (2001) The gut as the largest endocrine organ in the body. Ann Oncol 12 Suppl 2:S63-68. Alama-Bermejo G, Bron JE, Raga JA, Holzer AS (2012) 3D morphology, ultrastructure and development of Ceratomyxa puntazzi stages: first insights into the mechanisms of motility and budding in the Myxozoa. PLoS One 7:e32679. Alejo A, Tafalla C (2011) Chemokines in teleost fish species. Dev Comp Immunol 35:12151222. 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Endogenous peroxidase activity was quenched by incubation in 3% hydrogen peroxide in PBS for 20 min, and sections were treated with normal goat serum (1:20) for 30 min to block non-specific staining. After incubation with the primary antisera (table 1), anti-rabbit EnVision+ System Labelled Polymer-HRP (Dakocytomation, Milan, Italy) was incubated for 30 min. Samples were developed using 3,3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride (0.04% w/v in Tris-HCl 0.05 M, pH 7.4), washed in distilled water, counterstained with haematoxylin, dehydrated and mounted. The specificity of reactions was tested incubating in parallel negative controls, by substituting the primary antibody for PBS or an irrelevant polyclonal antibody. Sections of mammalian (swine) alimentary canal were used as positive controls. 10.3.3. Quantitative analysis of positive cells Images were obtained using an Olympus camera (Camedia 3030, Olympus, Italy) connected to a photomicroscope Olympus BX51. Three digitised images were collected from each studied organ (stomach, pyloric caeca and anterior, medium and posterior intestine), using a 200x enlargement, and comparable regions from infected and control turbot were examined. The number of immunoreactive cells to Artículo IV 224 the used primary antiserum was counted on these images (75 images counted from each of the two groups). Anti-serum Working dilution Incubation time Code Source BOM 1:1000 12 h at 4 ºC IHC 7113 Peninsula Lab. GLUC 1:2000 48 h at 4 ºC - J.M. Pollack LEU 1:1000 ON at 4 ºC CA-08-235 Genosys Biotechnol. LEU 1:2500 ON at 4 ºC RAS 8601N Peninsula Lab. MET 1:400 ON at 4 ºC GTX42620 Gene-Tex MET 1:1000 ON at 4 ºC T-4294 Bachem AG SOM 1:800 ON at 4 ºC CA-08-325 Genosys Biotechnol. SOM 1:1000 ON at 4 ºC AB1976 Chemicon Int. Table 1: List of the primary antisera used in this study: BOM: bombesin, GLUC: glucagon, LEU: leu-enkephalin, MET: met-enkephalin, SOM: somatostatin. ON: over night. 10.3.4. Statistics A Student’s t-test was used to compare the means (average ± SEM) of the number of endocrine cells positive to the used primary antisera between uninfected and infected groups of turbot. The statistical analyses were performed using the GraphPad Prism 5.0 program (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) and the minimum significance level was set at P < 0.05. Artículo IV 225 10.4. Results 10.4.1. Histopathological findings In fish from infected group, developmental stages of E. scophthalmi were found in the epithelial layer of all examined sections, but they were prevalent in pyloric caeca and anterior intestine. The presence of the parasite in the digestive tract of infected fish was usually associated with mild catarrhal enteritis, with focal detachment of the damaged epithelial layer and moderate numbers of inflammatory cells (mainly lymphocytes) in the lamina propria-submucosa. No parasitic forms were observed in fish from control group, in which the mucosal epithelium was always intact and the tunica propria-submucosa was devoid of inflammatory signs. 10.4.2. Presence and distribution of entero-endocrine cells (ECs) and nervous structures In the present study, the presence of five neuromodulators was recognized in digestive tissue sections taken from either infected or control turbots. The expected negative or positive reactions were observed in the negative or positive controls, respectively. 10.4.2.1. Bombesin (BOM) Immunohistochemical test with anti-BOM antiserum revealed spindleshaped positive ECs in the lining epithelium of the stomach, being absent in the other portions of the digestive tract. The number of immunopositive cells was significantly higher in control than infected Artículo IV 226 animals (fig. 1 and table 2). Nerve fibres and nerve cell bodies immunoreactive to anti-BOM antiserum were noted in the nervous plexuses of the gastrointestinal tract, especially in the myenteric plexus in stomach and posterior intestine, mainly in healthy fish (fig. 2). 10.4.2.2. Glucagon (GLUC) GLUC-immunoreactive ECs occurred throughout all the portions of gastrointestinal tract of both control and infected turbot. In the stomach, few fusiform-elongated and/or rounded shape GLUCpositive ECs were respectively found at the basis of the lining epithelium and the ad luminal portion of the gastric glands. In the pyloric caeca and the intestine, a moderate amount of spindle GLUCimmunostained cells was detected at the basis of the epithelium. GLUC-ECs were more frequent in the anterior and medium intestine (fig. 1). Recipient turbot showed a significantly fewer number of ECs than control turbot (table 2). Immunoreactive nerve fibres were rarely detected in both infected and control turbot, located in the tunica propria-submucosa in the intestine (fig. 2), and in the myenteric plexus of the posterior intestine. 10.4.2.3. Leu-enkephalin (LEU) High numbers of LEU-immunoreactive, elongated ECs were demonstrated in all digestive portions of both control and infected turbot (fig. 1), except in the stomach, where they were absent. A significant increase in the mean number of ECs immunoreactive to LEU antiserum was found in turbot infected with E. scophthalmi (table 2). Neither positive nerve cell bodies nor nerve fibres were detected. In infected turbot, scattered or grouped rounded cells with Artículo IV 227 abundant cytoplasm compatible with melanomacrophage aggregates located in the tunica propria-submucosa were also immunostained with LEU antiserum (fig. 2). 10.4.2.4. Met-enkephalin (MET) Elongated ECs reactive against MET antiserum were observed in the three portions of intestine and pyloric caeca of both control and infected turbot (fig. 2). The mean number of MET-ECs was superior in infected than control turbot although no statistical differences were detected (table 2). No positive nerve cell bodies or nerve fibres were detected. 10.4.2.5. Somatostatin (SOM) SOM-immunoreactive ECs occurred in the gastric glands and in the lining epithelium of the stomach showing different appearance. Thereby, the ECs in the gastric gland were ovoid while the cells of the epithelial mucosa were spindle-shaped (fig. 2). Immunohistochemical test with antiserum raised against SOM revealed a significantly higher number of positive ECs in infected than control turbot (fig. 1 and table 2). SOM-immunoreactive nerve fibres were observed in the Meissner’s and Auerbach’s plexuses from the stomach to the posterior intestine of both control and infected animals. Although infrequent, they appeared with more intense immunostaining in the anterior intestine of infected turbot. Artículo IV 228 Artículo IV 229 Figure 1: Immunohistochemical assays using anti-bombesin and anti-somatostatin antibodies on stomach, anti-glucagon and anti-leu-enkephalin antibodies on gastrointestinal tract of turbot control and infected with E. scophthalmi (arrows). BOMBESIN: Stomach. Immunoreactive cells appeared mainly in the lining epithelium of stomach in higher number in the control. Bars = 100 µm. GLUCAGON: Medium intestine. Immunostained cells were ovoid to slightly spindle-shaped and located at the basal area of the lining epithelium. Bars = 100 µm. LEU-ENKEPHALIN: Anterior intestine of control and medium intestine of infected. Elongated immunopositive cells were located in the lining epithelium in higher quantity in infected than in control turbot. In infected turbot there were rounded immunostained cells prone to cluster in the lamina-propria submucosa, compatible with incipient melanomacrophage aggregates (triangles). Bars = 100 µm. SOMATOSTATIN: Stomach. Immunoreactive cells appeared both in the gastric glands and lining epithelium more frequently in the infected turbot. Bars = 100 µm. Insert: Immunopositive cells were elongated in the gastric lining epithelium whereas ovoid in the gastric glands. Bar = 50 µm. Anti-serum Uninfected fish Infected fish t-test P value BOM 6.2 ± 0.57 4.35 ± 0.41 2.644 0.029* GLUC 9.68 ± 0.53 7.27 ± 0.52 3.252 0.012* LEU 10.67 ± 1.04 13.93 ± 0.85 2.427 0.041* MET 15.62 ± 0.96 17.14 ± 0.92 1.145 0.285 SOM 3.08 ± 0.16 7.55 ± 0.56 7.263 0.000** Table 2: Mean number of endocrine cells immunoreactive to antisera in the digestive tract of turbot uninfected and infected with E. scophthalmi. Mean values are given ± standard error of the mean. Student’s t-test was performed using GraphPad Prism 5. BOM: bombesin, GLUC: glucagon, LEU: leu-enkephalin, MET: met-enkephalin, SOM: somatostatin. Differences between mean numbers of endocrine cells from uninfected and infected turbot are *: significant and **: highly significant. Artículo IV 230 Figure 2: Gut sections of turbot immunostained with anti-bombesin (BOM), anti-glucagon (GLUC), and anti-met-enkephalin (MET) antisera. BOM: Hindgut of control turbot. On the left, immunopositive nerve fibres were detected in the submucosal (arrowheads) and myenteric (arrows) plexuses of the hindgut. Bar = 200 µm. On the right, there is a detail of the fibres in the myenteric plexus. Bar = 50 µm. GLUC: Hindgut of infected turbot. Immunoreactive nerve fibres of the Meissner’s plexus, in the submucosa. Bar = 50 µm. MET: Anterior intestine of control turbot. Immunopositive epithelial cells were mainly elongated or spindle-shaped and located in the lining epithelium. Bar = 50 µm. Artículo IV 231 10.5. Discussion By means of light microscopy examination, different developmental stages of the myxosporean E. scophthalmi were detected in the digestive tract of turbot experimentally exposed to the parasite. The presence of the parasite was noteworthy in the pyloric caeca and anterior intestine, preferential sites of E. scophthalmi invasion, from where it extends to the rest of the digestive tract (Redondo et al. 2004). The association between the presence of the myxosporean in the epithelium of the gastrointestinal tract and epithelial desquamation and inflammatory infiltrates in the intestinal lamina propria-submucosa concurs with other descriptions of the disease (Bermúdez et al. 2010, Branson et al. 1999, Redondo et al. 2002). In general, the extension and severity of the lesions were in accordance with the parasite burden. BOM is a peptide that may play an endocrine role in the control of gastric functions such as regulation of acid secretion, inhibition of gastric emptying and stimulation of gastrointestinal motility (Holmgren 1985). Furthermore, the ability of BOM to decrease meal size and shorten the duration of eating has been demonstrated in several mammalian and fish species (Jensen 2001, Volkoff et al. 2005). In fish, BOM immunoreactivity is found in both nerves and endocrine cells, although the localization varies among species (Jensen 2001). In this study, BOM immunoreactivity was observed in ECs in the stomach, nerve cell bodies and fibres of the gastrointestinal nervous plexuses of turbot. This distribution is quite similar to the description in other fish species, in which the ECs are located in the Artículo IV 232 foregoing sections of the gastrointestinal tract (Bosi et al. 2004, Çinar et al. 2006), and the nervous system elements are distributed almost throughout the gastrointestinal tract (Bosi et al. 2004, Domeneghini et al. 2000). In the present study, a significant decrease in the number of BOM-immunoreactive ECs was found in infected turbot. Similar results were obtained in S. trutta infected with Cyathocephalus truncatus (Dezfuli et al. 2003) and Oncorhynchus mykiss infected with Eubothrium crassum (Bosi et al. 2005b). The diminution of BOM anorexigenic effects in infected turbot would be related to the favouring of the gastric emptying and a reduction of the satiety sensation. GLUC is a peptide with hyperglycaemic and lipolytic action in fish (Moon 1998). Its levels appear increased after feeding (Navarro et al. 1993), fact related to higher plasma levels of glucose and stimulation of inhibitory feeding systems, which results in an anorexigenic effect in fish (Le Bail & Roeuf 1997). The distribution of GLUCimmunoreactive cells observed in this work was similar to that described by Reinecke et al. (1997) in juvenile turbot. The presence of E. scophthalmi in the digestive tract of turbot provoked a significant descent in the number of GLUC-immunopositive ECs. These results are analogous to those observed in S. trutta infected with C. truncates (Dezfuli et al. 2003), O. mykiss infected with E. crassum (Bosi et al. 2005b) and Leuciscus cephalus infected with Pomphorhynchus laevis (Bosi et al. 2005a). Bosi et al. (2005b) suggested that the reduction of GLUC secreting cells would increase appetite. A similar effect might be supposed in E. scophthalmi infected turbot, although a hypothetical increase of food intake would not ameliorate turbot body condition, Artículo IV 239 10.7. References Agius C, Roberts RJ (2003) Melano-macrophage centres and their role in fish pathology. J Fish Dis 26:499-509. Athanassopoulou F, Karagouni E, Dotsika E, Ragias V, Tavla J, Christofilloyanis P, Vatsos I (2004) Efficacy and toxicity of orally administrated anti-coccidial drugs for innovative treatments of Myxobolus sp. infection in Puntazzo puntazzo. Dis Aquat Organ 62:217-26. Bermúdez R, Alemañ N, Vigliano F, Vázquez S, Quiroga MI, Nieto JM (2006a) Effects of symmetric triazinone (toltrazuril) on developmental stages of Enteromyxum scophthalmi parasitizing turbot (Scophthalmus maximus L.): A light and electron microscopic study. Aquaculture 254:65-71. 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