Desarrollo y caracterización de una línea mutante de pez cebra para auts2a, gen candidato a trastornos del espectro autista

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC ALBA PENSADO LÓPEZ Tesis doctoral Desarrollo y caracterización de una línea mutante de pez cebra para auts2a , gen candidato a trastornos del espectro autista Lugo, 2022 Programa de doctorado en Medicina Molecular TESIS DE DOCTORADO DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA MUTANTE DE PEZ CEBRA PARA AUTS2A , GEN CANDIDATO A TRASTORNOS DEL ESPECTRO AUTISTA Alba Pensado López ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR LUGO 2022 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. ALBA PENSADO LÓPEZ Título da tese: Desarrollo y caracterización de una línea mutante de pez cebra para auts2a, gen candidato a trastornos del espectro autista Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Lugo, 24 de mayo de 2022. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Desarrollo y caracterización de una línea mutante de pez cebra para auts2a, gen candidato a trastornos del espectro autista Dª. LAURA ELENA SÁNCHEZ PIÑÓN Dª. CATARINA ALLEGUE TOSCANO INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. ALBA PENSADO LÓPEZ, bajo nuestra dirección/tutorización, y a utorizamos su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directoras de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación de la doctoranda fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En LUGO 25 de Mayo de 2022 DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERÉS Yo, Alba Pensado López, con DNI 44849551-B, declaro que la presente tesis doctoral no presenta conflicto de interés alguno. AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Como siempre dice mi padre, ahora jubilado, todos los días son Viernes…No se refiere con ello a que llegue ese ansiado día en que vamos juntitos al bar a tomar las cañitas, sino que se refiere a que yo, con suerte y a diferencia de otros muchos, vuelvo a casa no por Navidad, sino los Viernes. Es bonito, por supuesto, pero a la vez refleja lo rápido que pasa el tiempo, lo rápido que pasa la vida…ya llegó de nuevo el Viernes!!! Pues con la tesis es más o menos lo mismo; te levantas, vas al laboratorio, te rompes la cabeza a base de pensar, peleas con los protocolos y en mi caso, con mis peixes, regresas a casa, duermes (o no), y vuelta a empezar, y sin darte cuenta pasan casi 5 años. Parece, además, que pasa el tiempo y no avanzas, que todo es cuesta arriba y realmente, parece que uno cada día sabe menos, pero justamente, un par de personas muy queridas me dijeron recientemente que es ese momento, en que te da la sensación de que involucionas, cuando realmente eres bueno en lo tuyo, porque adquiriste la capacidad de autocrítica, de verlo todo en perspectiva, de analizar, y es por supuesto, cuando surgen en ti las ganas de mejorar. Una de esas personas fue precisamente Cata, a la que agradezco haber demostrado confianza absoluta en mí al nunca presionarme y mostrarse siempre radiante al contarle cualquiera de mis muy pequeños avances, y desde luego, por haberme acogido para comenzar esta experiencia. Por supuesto, a Laura, mi querida Laura, no puedo más que darle el mayor de los agradecimientos por apostar por mí desde el primer momento. ¿Sabéis esas personas con las que uno habla cuando parece que no ve la luz al final del túnel, pero luego parece que le quitaron 10 toneladas de encima? Para mí, esa persona es Laura. Siempre ve el lado bueno de las cosas, te lo transmite, te da ánimos y sobretodo, esperanza. Gracias. Quiero mencionar con especial cariño a Ana y Álvaro, mis compañeros, pero sobretodo mis amigos, ya que sin ellos nada de lo que recoge esta tesis hubiera sido posible. Ana me recibió, me enseñó todo y sin dudarlo, me acogió como una más, siempre dispuesta a echarme una mano para todo. Eres la mejor y la más buena, Ana. Mi personita preferida, Álvaro, siempre juntos, lo sabes. Y por supuesto, no me olvido de mi tarado favorito, Coppel, que siempre consigue provocarme esos ataques de risa (aunque también de ira), que uno siempre necesita. También a mi queridísimo Pablo, que siempre está ahí para apaciguarme y darme el abrazo que normalmente no quiero, pero necesito. A mi otro también muy apreciado Adri Millán, que aunque a veces nos retroalimentemos con nuestra negatividad, siempre está para darme buenos consejos y recordarme que tengo que apreciarme a mí misma. A Lucía, Peque, Susana y Porte, agradeceros con todo mi corazón haberme enseñado a hacer muchas cosas bien, pero sobretodo, a reñirme cuando hacía algo mal, ya que eso siempre me enseñó a mejorar. Quiero mencionar a Cris también, que aunque llegó un poquitín más tarde, siempre está dispuesta a ayudarme. A Mónica y Sonia, que son las mejores de mundo mundial y me ayudaron siempre. Recuerdo con mucho cariño, además, lo que pensó de mí Mónica la primera vez que me vio, pero eso queda entre nosotras, ella sabe de lo que hablo. Casi me dejo en el tintero a muchos compañeros y amigos, Chiclana, Óscar, Iago, Andrés, Martín, y a Vanesita, nuestra amiga/médico/consejera/investigadora/vale-para-todo y mi especial fuente de autoestima, que siempre espera lo mejor de mí y me lo hace saber. A mis pupilas preferidas Sara y Maider, con especial mención a Sara, con la que empecé esta aventura, sin apenas saber nada, pero con la cual aprendí infinidad de cosas y me ayudó tremendamente. Me siento orgullosa de ti Sara, de haber visto cómo evolucionas día a día, cómo sacas adelante tu trabajo (sola) y de lo buena investigadora que eres. No podría estar más agradecida a mis padres y mi hermana, que únicamente con sus frases `ti vales eso e moito mais´ o, `pero qué orgullosa estoy de ti, piojo´, hacen claros los días más oscuros. Elisa, mi madre, la mejor persona y mamá del mundo, mi símbolo de coraje, entereza y fuerza, Braulio, mi padre, mi gran apoyo, inspirador de constancia, templanza y seriedad y, Andrea, mi hermana, mi persona favorita, mi referente y mi guía. A Fernando, mi corazón. Siempre estuviste, estás y estarás, para todo. Como le dije a alguien un día….él se merecía el mundo, pero me escogió a mí. A mis más mejores amigas del mundo, Adriana, Belén, Jenni, Laura y María por confiar siempre en mí y por darme siempre momentos inolvidables. A mis chilenitas Nati y Jeza, y a Jose y Nico, aunque a veces os preocupéis más de mis peixes que de mí, y a mis muy queridísimos Iván y Carmen. Vosotros sois mi otra familia y todos los fines de semana me dais el empujón que necesito para afrontar un nuevo lunes. Gracias. Finalmente, y no por ello menos importante, agradecer a mi muy también querido Pauli, por muchas cosas, pero sobre todo por algo que me dijo, que nunca olvidaré y que me hizo sentir muy apreciada: `Alba, tú eres como una mujer orquesta, vales para todo´. ÍNDICE 21 ÍNDICE ABREVIATURAS .................................................................................................................. 35 RESUMEN .............................................................................................................................. 41 RESUMO ................................................................................................................................. 47 SUMMARY ............................................................................................................................. 53 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 59 1. TRASTORNOS DEL ESPECTRO AUTISTA: DEFINICIÓN Y EPIDEMIOLOGÍA ........................................................................................................ 61 1.1. Diagnóstico y tratamiento de TEA ....................................................................... 62 1.2. Etiología y patología de los TEA ........................................................................... 64 1.2.1. Componente ambiental ................................................................................. 65 1.2.2. Componente genético ................................................................................... 65 1.3. Herramientas de edición genómica para el estudio de factores potencialmente causales de TEA .......................................................................... 67 1.3.1. Funcionamiento general de las ZFNs y TALENs ........................................ 68 1.4. Sistemas CRISPR/CAS .......................................................................................... 69 1.4.1. Contexto histórico ........................................................................................ 69 1.4.2. Funcionamiento general de los sistemas CRISPR/Cas en procariotas ......... 70 1.4.3. Modificación de los sistemas CRISPR/Cas9 para su aplicación en investigación ................................................................................................ 71 1.4.4. Aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el estudio de TEA .................... 72 2. EL PEZ CEBRA .............................................................................................................. 73 2.1. Taxonomía y distribución ...................................................................................... 73 2.2. Descripción del pez cebra ...................................................................................... 74 2.3. El pez cebra en investigación biomédica .............................................................. 76 2.4. Aplicación del pez cebra para el estudio de trastornos del neurodesarrollo ...................................................................................................... 77 2.4.1. Modelos genéticos de pez cebra para el estudio de TEA ............................. 78 22 2.4.1.1. Morfolinos ......................................................................................... 79 2.4.1.2. TILLING, TALENs, ZFNs y CRISPR ............................................. 81 2.4.2. Caracterización de los modelos genéticos de pez cebra ............................... 83 3. AUTS2, GEN CANDIDATO DE SUSCEPTIBILIDAD A AUTISMO 2 .................... 84 3.1. Descripción y función en el neurodesarrollo ........................................................ 85 3.1.1. Función citoplasmática ................................................................................. 85 3.1.2. Función nuclear ............................................................................................ 85 3.2. auts2a, gen ortógolo en pez cebra .......................................................................... 86 3.3. Modelos in vivo e in vitro para el estudio de la implicación de AUTS2 en el neurodesarrollo ....................................................................................................... 86 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ....................................................................................... 89 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................... 93 1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ...................................................................... 95 1.1. Mantenimiento del pez cebra .................................................................................... 95 1.2. Obtención de huevos de pez cebra ........................................................................... 95 2. GENERACIÓN DE UNA LÍNEA MUTANTE PARA EL GEN AUTS2A MEDIANTE CRISPR/CAS9 ........................................................................................... 96 2.1. Selección de AUTS2, validación de su ortólogo en pez cebra ............................. 96 2.2. Diseño y síntesis de los ARNsg .............................................................................. 96 2.2.1. PCR ............................................................................................................... 97 2.2.2. Electroforesis en gel de agarosa ................................................................... 98 2.2.3. Purificación de la reacción de PCR .............................................................. 98 2.2.4. Transcripción in vitro y purificación ............................................................ 98 2.3. Inyección de los ARNsg en el estadío de una célula del embrión de pez cebra ......................................................................................................................... 98 2.4. Genotipado de los embriones de la generación F0 .............................................. 99 2.4.1. Extracción de ADN....................................................................................... 99 2.4.2. PCR, electroforesis en gel de agarosa, purificación y cuantificación ........... 99 2.4.3. Clonación bacteriana .................................................................................... 99 2.4.3.1. Reacción de ligación ...................................................................... 100 2.4.3.2. Transformación bacteriana .............................................................. 100 2.4.3.3. PCR de colonias y electroforesis en gel de agarosa ....................... 100 2.4.4. Secuenciación Sanger o dideoxi ................................................................. 101 23 2.4.4.1. Purificación de los productos de PCR ............................................ 101 2.4.4.2. Reacción de secuenciación ............................................................. 101 2.4.4.3. Purificación de la reacción de secuenciación .................................. 101 2.4.4.3. Secuenciación ................................................................................ 101 2.5. Obtención y genotipado de embriones de la generación F1 ............................. 102 2.6. Genotipado de los adultos de la generación F1 ................................................. 103 2.6.1. Análisis de heterodúplex mediante electroforesis en gel de poliacrilamida ............................................................................................. 103 2.6.1.1. Extracción de ADN, PCR y gel de agarosa .................................... 103 2.6.1.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida ........................................... 104 2.6.2. Clonación bacteriana y secuenciación ....................................................... 104 2.7. Obtención y análisis de embriones de la generación F2 ................................... 104 2.7.1. Toma de imágenes de los embriones de la generación F2 a las 48 hpf...... 104 2.7.2. Extracción de ADN y PCR ........................................................................ 105 2.7.3. Comprobación de la amplificación en gel de agarosa ................................ 105 2.7.4. Análisis de fragmentos ............................................................................... 105 2.7.5. Mezcla de ADN de homocigotos problema con ADN de homocigotos WT .............................................................................................................. 106 2.8. Genotipado de los adultos de la generación F2 y obtención de la F3 .............. 106 3. VALIDACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL KNOCK-OUT DE AUTS2A ................. 108 3.1. Cuantificación de la expresión de auts2a por qPCR ......................................... 108 3.1.1. Extracción de ARN .................................................................................... 108 3.1.2. Tratamiento con DNasa y purificación del ARN ....................................... 108 3.1.3. Retrotranscripción del ARN a ADN complementario ............................... 109 3.1.4. Diseño y validación de cebadores de qPCR ............................................... 109 3.1.4.1. Reacción de qPCR .......................................................................... 109 3.1.4.2. Rectas de calibrado ......................................................................... 110 3.2. Hibridación in situ para el gen auts2a ................................................................ 110 3.2.1. Síntesis y purificación de la ribosonda antisentido de ARN ........................ 110 3.2.2. Transcripción in vitro y purificación de la ribosonda antisentido ................ 111 3.2.3. HIS ................................................................................................................ 111 3.3. Western Blot ......................................................................................................... 112 3.3.1. Extracción y cuantificación de proteínas ...................................................... 112 30 Figura 19. Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de mutantes de la F1. En mayúscula se muestra la secuencia exónica y en minúscula la intrónica. Se marcan en gris los cebadores, en verde la región complementaria al ARNsg, en azul las inserciones y en rojo tachado las deleciones. a) Secuencia con deleción de 3 pb; b) Secuencia con deleción de 5 pb; c) Secuencia con deleción de 6 pb; d) Secuencia con deleción de 7 pb; e) Secuencia con inserción de 33 pb y un cambio de base; f) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a las mutaciones reflejadas en los apartados b y d. En amarillo la secuencia correspondiente al exón 9; g) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a la mutación reflejada en el apartado e. ........................................................................................................ 128 Figura 20. Ejemplo de análisis de heterodúplex mediante gel de poliacrilamida para 9 de los adultos de la F1. El asterisco (*) marca individuos con presencia de heterodúplex. Marcador de peso molecular de 100 pb. ............................................ 130 Figura 21. Gel de agarosa para el cribado de individuos heterocigotos de la generación F2. Los asteriscos muestran los individuos en los que el genotipo no se puede distinguir. C+, control positivo; C-, control negativo. Marcador de peso molecular de 100 pb. ................................................................................................. 131 Figura 22. Electroferogramas generados por el software del análisis de fragmentos para el genotipado: a) Individuo con dos alelos WT; b) Individuo con un alelo WT y un alelo mutante (heterocigoto); c) Individuo con dos alelos mutantes (homocigoto mutante). .............................................................................................. 132 Figura 23. Geles de agarosa para la distinción de individuos homocigotos mutantes o WT. a) Ejemplo de la validez de la metodología; b) Genotipado de 4 individuos problema. C+/+, control WT; C+/-, control heterocigoto; C-/-, control homocigoto. Marcador de peso molecular de 100 pb ............................................... 133 Figura 24. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) Análisis para auts2a; b) Análisis para actb2 y eef1α1. C-, control negativo. Marcador de peso molecular de 100 pb. ................................................................... 134 Figura 25. Validación del knock-out mediante la evaluación de la expresión de auts2a en individuos heterocigotos y homocigotos con respecto a individuos WT, 31 utilizando como normalizadores los genes actb2 y eef1α1. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ............................................................................ 134 Figura 26. Rectas de calibrado de los cebadores. a) y b), rectas para actb2 y auts2a, respectivamente, obtenidas enfrentando los valores de las Cts con el logaritmo de la cantidad de ARN en las muestras; c), ecuación de regresión lineal, valo R2, eficiencia y % de eficiencia para los cebadores. ...................................................... 135 Figura 27. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) Análisis para los cebadores de auts2a sin y con secuencia de reconocimiento de T7; b) Análisis del producto de transcripción o sonda; c) Análisis de la sonda tras la purificación. Marcador de peso molecular de 100 pb. ......................................... 135 Figura 28. Validación del knock-out mediante HIS para el gen auts2a. a y a´) Embrión WT de 24 hpf; b y b´) Embrión homocigoto mutante de 24 hpf; c y c´) Embrión WT de 48 hpf; d y d´) Embrión homocigoto mutante de 48 hpf. Las flechas indican las regiones anatómicas en que se expresa auts2a. Ca, cerebro anterior; Cm, cerebro medio; Cp, cerebro posterior; Tr, tronco; Rt, retina. ........................... 136 Figura 29. Validación del knock-out mediante Western Blot. Expresión de la proteína normalizadora Actb2 y Auts2a en individuos WT y homocigotos mutantes. Se observa banda para Actb2 en todos los individuos, mientras que solo se observa en los individuos WT para Auts2a. .......................................................................... 137 Figura 30. Análisis morfológico de los embriones y fotografías de un individuo WT y un homocigoto mutante. a, diámetro de la cabeza; b, diámetro del ojo; c, longitud total del cuerpo; d, longitud de la aleta caudal. Escala a 500 µm. .......................... 138 Figura 31. Análisis fenotípico de embriones WT y homocigotos para el diámetro de la cabeza y diámetro del ojo, longitud del cuerpo con y sin aleta, y longitud de la aleta. Se muestran las gráficas y los valores de la media, desviación típica y valor de p para todas las medidas. DC, diámetro de la cabeza; DO, diámetro del ojo; LC, longitud del cuerpo; LS/A, longitud del cuerpo sin aleta. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................. 138 Figura 32. Análisis fenotípico de embriones WT y homocigotos para la ratio cabeza/ cuerpo y ojo/ cabeza. Se muestran las gráficas y los valores de la media, 32 desviación típica y valor de p para todas las medidas. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ............................................................................ 140 Figura 33. Análisis de las estructuras cartilaginosas y dimensión de la cabeza de embriones de 5 dpf mediante azul alcián. ch, ángulo ceratohial; pc, palatocuadrado; L, longitud de la cabeza; d, diámetro de la cabeza. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ............................................................ 140 Figura 34. Evaluación de la apoptosis en embriones WT y homocigotos mutantes de 24 hpf mediante tinción con naranja de acridina. a) Individuo WT, campo claro; b) Individuo WT, fluorescencia; c) Individuo WT, imágenes superpuestas; d) Individuo homocigoto, campo claro; b) Individuo homocigoto, fluorescencia; c) Individuo homocigoto, imágenes superpuestas. ....................................................... 141 Figura 35. Análisis de p53. a) Gel de agarosa para p53. Marcador de peso molecular de 100 pb; b) recta de calibrado para p53; c) Comparación de la expresión de p53 en individuos WT y homocigotos mutantes. C-, control negativo. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................. 142 Figura 36. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a-c) Análisis para los cebadores de pax2a, emx1 y aldoca, respectivamente, sin y con secuencia de reconocimiento de T7; d-f) Análisis de las sondas de pax2a, emx1 y aldoca tras la purificación. Marcador de peso molecular de 100 pb. ....................... 142 Figura 37. HIS para el gen aldoca. a y a´) Embrión WT de 120 hpf; b y b´) Embrión homocigoto mutante de 120 hpf. Las flechas indican las regiones anatómicas en que se expresa aldoca. Cp, cerebro posterior; Cb, cerebelo; Rt, retina. ................... 143 Figura 38. Comparación entre la longitud y el peso de los individuos adultos WT y homocigotos mutantes. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). .. 143 Figura 39. Análisis de la locomoción de larvas mutantes de 7 dpf. a) Distancia recorrida expresada en pixeles/minuto para cada uno de los 6 períodos intermitentes de luz-oscuridad en individuos WT y homocigotos. b) Computo total de la distancia recorrida expresada en pixeles/minuto en luz y oscuridad en individuos WT y homocigotos. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05)................... 144 Figura 40. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) vglut2.2, isl1, nes, rac1b, elavl3, fosab, neurod1, rybpa; b) fat2, ptf1a, gad1a, 33 grid2; c) sema5a, mecp2, gfap, dcaf7, emx1, upf1, zmat3, sox2, satb2, ck2b, olig2; d) smg1, pcgf5b, c-myc, rereb, tbr1b, gtf2ird1. ............................................. 145 Figura 41. Expresión relativa de los genes tbr1b, satb2 y rac1b en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................................... 147 Figura 42. Expresión relativa de los genes gtf2ird1, mecp2, sema5a y zmat3 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................. 148 Figura 43. Expresión relativa de los genes ck2b, dcaf7, pcgf5b y rybpa en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................................... 148 Figura 44. Expresión relativa de los genes upf1 y smg1 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ....... 149 Figura 45. Expresión relativa de los genes ptf1a, fat2 y rereb en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ....... 149 Figura 46. Expresión relativa de los genes gad1a, grid2 y vglut2.2 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................................... 150 Figura 47. Expresión relativa de los genes emx1, gfap, nes y olig2 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................................... 151 Figura 48. Expresión relativa de los genes sox2, c-myc, elavl3, isl1 y neurod1 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ................................................................................................. 151 Figura 49. Expresión relativa del gen fosab en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ........................... 152 * Todas las figuras que se incluyen en la presente tesis doctoral fueron elaboradas por Alba Pensado López. ABREVIATURAS 37 ABREVIATURAS °C Grados Centígrados µg Microgramos µl Microlitros µm Micras µS Microsiemens 6-FAM 6Carboxifluoresceína ADN Ácido Desoxirribonucleico ADNc ADN complementario aldoca aldolase C, fructose-bisphosphate, a ARN Ácido Ribonucleico ARNcr ARN de CRISPR ARNm ARN mensajero ARNsg Guía Simple de ARN ARNtracr ARN de CRISPR Transactivador ASD Autism Spectrum Disorders BSA Albúmina de Suero Bovino ck2b Casein kinase 2, beta polypeptide cm Centrímetros c-Myc MYC proto-oncogene, bHLH transcription factor CNVs Copy Number Variations CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats dcaf7 Ddb1 and cul4 associated factor 7 DEPC Dietilpirocarbonato dNTPs Desoxirribonucleótidos Tri-Fosfato dpf Días Post-Fertilización DSBs Double Strand Breaks DSM-5 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders elavl3 ELAV like neuron-specific RNA binding protein 3 emx1. Empty spiracles homeobox 1 ENU N-ethyl-N-nitrosourea EtOH Etanol fat2 FAT atypical cadherin 2 fosab V-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog Ab g Gramos GABA Ácido Gamma-Aminobutírico 38 gad1a Glutamate decarboxylase 1a gfap Glial fibrillary acidic protein grid2 Glutamate receptor, ionotropic, delta 2 gtf2ird1 General Transcription Factor II-I Repeat Domain-Containing Protein 1 GWAS Genome-Wide Association Studies H2O2 Peróxido de hidrógeno HCL Cloruro de hidrógeno HDR Homology-Directed Repair hiPSCs Human Induced Pluripotent Stem Cells HIS Hibridación In Situ hpf Horas Post-Fertilización IF Inmunofluorescencia IHQ Inmunohistoquímica INDELs Inserciones y/o Deleciones isl1 ISL LIM homeobox 1 KD Knock-Down KI Knock-In KO Knock-Out KOH Hidróxido de potasio kPA kilo Pascales lncRNA Long Non-Coding RNAs mecp2 Methyl CpG Binding Protein 2) MeOH Metanol mg Miligramos MgCl2 Cloruro de Magnesio MHB Midbrain-Hindbrain Boundary ml Mililitros NaCl Cloruro de sodio NCBI National Center for Biotechnology Information nes Nestin neurod1 Neuronal differentiation 1 NHEJ Non-Homologous End Joining nl Nanolitros nm Nanómetros NSMD Nonsense-mediated mRNA decay olig2 Oligodendrocyte lineage transcription factor 2 ON Overnigh PAM Protospacer Adjacent Motif pax2a Paired box 2a pb Pares de bases pcgf5b Polycomb Group Ring Finger 5b 39 PCGFs Polycomb Group RING Fingers PCR Polimerase Chain Reaction PFA Para-formaldehido PRC1 Polycomb repressive complex type 1 PSCs Premature Stop Codons ptf1a Pancreas associated transcription factor 1a PTU Feniltiourea qPCR quantitativePolimerase Chain Reaction rac1b Rac family small GTPase 1b rereb Arginine-glutamic acid dipeptide (RE) repeats b RNasas Nucleasas de ARN rpm Revoluciones por minuto rybpa RING1 and YY1 binding protein a SAP Shrimp Alkaline Phosphatase satb2 (Special AT-Rich Sequence-Binding Protein 2, SATB Homeobox 2 sema5a Semaphorin 5A SFARI Simons Foundation Autism Research Initiative smg1 SMG1 nonsense mediated mRNA decay associated PI3K related kinase SNPs Single Nucleotide Polymorphisms sox2 SRY-box transcription factor 2 TAE Tris-Acetato-EDTA TALENs Transcription Activator–Like Effector Nucleases TBE Tris-Borato-EDTA tbr1b T-box brain transcription factor 1b TEA Trastornos del Espectro Autista TEMED Tetrametiletilendiamina TNFα Tumor Necrosis Factor alpha upf1 UPF1 RNA helicase and ATPase V Voltios vglut2.2 Solute carrier family 17 member 6a ZFNs Zinc-Finger Nucleases ALBA PENSADO LÓPEZ 64 Antipsicótico Atípico Ziprasidona Disminución de la irritabilidad Alteraciones cardíacas 22 Antipsicótico Atípico Paliperidona Disminución de la irritabilidad Síntomas extrapiramidales leves y aumento de peso 23 Antipsicótico Típico Haloperidol Disminución de la hiperactividad y comportamientos estereotipados Somnolencia, reacciones distónicas agudas e irritabilidad 24 Antidepresivo Venlafaxina Mejora de los comportamientos repetitivos, comunicación Poliuria, náuseas, irritabilidad 25 Antidepresivo Clomipramina Disminución de la irritabilidad y mejora de los comportamientos estereotipados Somnolencia, enuresis, estreñimiento 26 Antiepiléptico Sodium Divalproex Disminución de la agresividad e irritabilidad Somnolencia 27 Estimulante/ Agonista alfa-2 Metilfenidato Disminución de la hiperactividad Insomnio e irritabilidad 28 Estimulante/ Agonista alfa-2 Atomoxetina Disminución de la hiperactividad, impulsividad y mejora de la atención Leve disminución del apetito y fatiga 29 Agonista alfa-2 Clonidina Disminución de la hiperactividad, impulsividad, mejora en la calidad del sueño Disminución en la actividad general e hipertensión 30 Agonista alfa-2 Guanfacina Disminución de la hiperactividad, impulsividad y distracción Somnolencia, enuresis, dolor de cabeza y estreñimiento 31 Compuesto Natural Sulforafano Reducción de comportamientos estereotipados y mejora en habilidades sociales No descritos 32 Compuesto Natural Melatonina Mejora en la calidad y duración del sueño No descritos 33 1.2. ETIOLOGÍA Y PATOLOGÍA DE LOS TEA Las manifestaciones observadas en afectados de TEA tienen su origen en anormalidades en la anatomía y conectividad de diversas partes del cerebro como el lóbulo frontal, córtex temporal superior, parietal y órbito-frontal, amígdala, área de broca o núcleo caudado34, así como en anormalidades en la migración neuronal35. Estas anomalías se deben, a su vez, a la disfunción de una amplia gama de genes, así como a la influencia de factores ambientales, pues aunque la base genética de estos trastornos es clara, la considerable variabilidad Introducción 65 fenotípica y genotípica que se observa en los afectados por TEA, apoya la idea de una etiología multifactorial. De esta forma, los TEA se clasifican de manera general en dos categorías atendiendo al conocimiento o no del origen del trastorno: los TEA sindrómicos incluyen casos con una etiología bien caracterizada, mientras que en los casos de TEA no sindrómico ésta es menos definida, interviniendo múltiples factores en el desarrollo del trastorno. En términos generales, se conoce que estos trastornos pueden estar relacionados con factores de riesgo prenatales, perinatales y posnatales, tanto genéticos como ambientales36. 1.2.1. Componente ambiental En relación a la contribución ambiental, que se estima en un 17%37, se han determinado como factores de riesgo, entre otros, la avanzada edad de los padres, complicaciones durante el parto, el sangrado, infección o administración de fármacos durante el embarazo (p.ej., valproato o antidepresivos), diabetes, hipertensión, exposición a químicos (p.ej., organofosfatos)38,39 o déficits nutritivos de la embarazada40. Asimismo, se ha encontrado que ciertas disfunciones del sistema inmunitario pueden alterar los patrones normales de desarrollo cerebral, incrementando el riesgo a padecer autismo41 . 1.2.2. Componente genético La relevancia de los factores genéticos en el riesgo de padecer TEA se conoce desde hace más de 50 años debido principalmente, a los estudios llevados a cabo en gemelos y en familias, y se estima que la heredabilidad global media un 83%37. Los primeros estudios de gemelos arrojaron una concordancia de alrededor del 90% en gemelos monocigóticos, en comparación con una concordancia del 30% en gemelos dicigóticos42,43. A pesar de la clara heredabilidad de este tipo de trastornos, éstos son genéticamente muy heterogéneos, ya que dichos genes pueden estar afectados por variantes genéticas comunes o variantes genéticas raras, ya sean reordenaciones cromosómicas, polimorfismos de un único nucleótido (SNPs, del inglés Single Nucleotide Polymorphisms), inserciones y deleciones intrónicas o exónicas, así como variaciones del número de copias (CNVs, del inglés Copy Number Variations), tanto heredadas como de novo44-47. Además, aunque los genes de susceptibilidad conocidos son, en su mayoría, codificadores de proteínas, debido a la elevada expresión en cerebro de ARNs largos no codificantes (lncRNAs, del inglés Long Non-Coding RNAs) se ha comenzado a estudiar la implicación de los mismos en la aparición de TEA48. No obstante, se han identificado múltiples genes de susceptibilidad mediante análisis genéticos como los estudios de asociación de genoma completo (GWAS, del inglés Genome-Wide Association Studies), que han permitido asociar múltiples variantes genéticas comunes, principalmente SNPs, con la enfermedad49, o la secuenciación completa de exomas y genomas, con las que se han indentificado múltiples CNVs tanto heredadas como de novo50 así como también inserciones y deleciones intrónicas o exónicas. La base de datos SFARI (Simons Foundation Autism Research Initiative)51 recoge uno de los listados más completos de genes de susceptibilidad a TEA, con aproximadamente 1000 genes identificados, clasificados en sindrómicos y no sindrómicos, según si están implicados ALBA PENSADO LÓPEZ 66 en síndromes en los que una subpoblación significativa desarrolla síntomas de autismo o no, respectivamente. A su vez, éstos se clasifican por puntuaciones del 1 al 3 dependiendo de la cantidad de la información que respalda la implicación del gen en el desarrollo de TEA (Figura 1): - Puntuación 1: genes claramente implicados en TEA, generalmente por la presencia de al menos tres mutaciones de novo descritas en la literatura - Puntuación 2: candidatos firmes de susceptibilidad a TEA, generalmente por la presencia de al menos dos mutaciones de novo descritas - Puntuación 3: genes con asociación significativa con TEA, con presencia de una única mutación de novo descrita Figura 1. Número de genes según su clasificación como sindrómicos o no sindrómicos y su correspondiente puntuación según la base de datos de SFARI (SP=Sin puntuación). Datos de Febrero del 2022. Tal y como se muestra en la Figura 2, éstos genes no se distribuyen de manera uniforme en el genoma y de hecho, la proporción hombre-mujer de 4:1 anteriormente mencionada podría explicarse por la alta abundancia de genes con puntuación de 1 en el cromosoma X51,52. Figura 2. Número de genes de cada cromosoma humano, clasificados según la puntuación en la base de datos SFARI (SP=Sin puntuación). Datos de Febrero del 2022. 0 100 200 300 400 500 123SP Número de genes Puntuación No Sindrómico Sindrómico 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Número de genes Cromosoma SP Puntuación 3 Puntuación 2 Puntuación 1 Introducción 67 1.3. HERRAMIENTAS DE EDICIÓN GENÓMICA PARA EL ESTUDIO DE FACTORES POTENCIALMENTE CAUSALES DE TEA Debido a la etiología multifactorial y la heterogeneidad en las alteraciones genéticas de los TEA, descifrar el impacto individual de cada factor de riesgo ha sido una tarea ardua para los investigadores y aún hoy en día continúa siendo un desafío. No obstante, en los últimos años los estudios de asociación, la mejora en los métodos de secuenciación y a nivel experimental, los avances en los sistemas de edición genómica, han permitido delimitar un número importante de genes candidatos y establecer relaciones fenotipo-genotipo. En la actualidad se usan principalmente tres sistemas de edición genómica: nucleasas de dedos de zinc (ZFNs, del inglés Zinc-Finger Nucleases); nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALENs, del inglés Transcription Activator–Like Effector Nucleases); y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas, del inglés, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)53. Estos sistemas se basan fundamentalmente en el uso de nucleasas con la consecuente generación de roturas de doble hebra (DSBs, del inglés Double Strand Breaks) en el ADN que, a su vez, desencadenan los mecanismos celulares de reparación del ADN, que en las células eucariotas son principalmente dos: reparación por unión de extremos (NHEJ, del inglés Non-Homologous End Joining) (Figura 3a) y la reparación dirigida por homología (HDR, del inglés HomologyDirected Repair)54 (Figura 3b). Figura 3. Esquema del funcionamiento de los mecanismos celulares de reparación del ADN tras producirse cortes de doble hebra. (a) NHEJ; (b) HDR. ALBA PENSADO LÓPEZ 68 El primero de los mecanismos conlleva una reparación más rápida aunque más propensa a errores, ya que únicamente se produce la unión de los extremos de las cadenas. Así, habitualmente se generan inserciones y/o deleciones (INDELs) que alteran el marco de lectura del gen y generan proteínas disfuncionales. La vía de HDR es mucho más precisa, ya que repara la rotura mediante la introducción de un ADN donante homólogo. 1.3.1. Funcionamiento general de las ZFNs y TALENs El funcionamiento de las ZFNs se basa en la utilización de dos nucleasas, cada una de ellas compuesta por dos dominios: el dominio de unión al ADN (dedos de zinc) y el dominio de escisión del ADN55. El dominio de unión al ADN está compuesto por módulos de proteínas, cada uno de los cuales es capaz de reconocer un triplete de nucleótidos específico. El dominio de escisión de ADN, que no presenta homología con la secuencia de ADN, se deriva de la endonucleasa FokI. Así, el sistema se une a la región deseada del genoma, guiado por el dominio de dedos de zinc, y el dominio de escisión genera DSBs (Figura 4a). Las TALENs surgieron en 2010 como alternativa a las ZFNs56, ya que aunque éstas se han mostrado eficientes en múltiples estudios con modelos celulares y animales57,58, su diseño y utilización resulta dificultosa. El funcionamiento de las TALENs, no difiere significativamente con respecto a las ZFNs. En ese caso, existe igualmente un dominio de escisión del ADN derivado de la endonucleasa FokI y un dominio de unión al ADN, formado por subunidades TALEs, que a diferencia de los dedos de zinc, presentan complementariedad con pares de bases individuales. De forma semejante a las ZFNs, el dominio de unión al ADN guía al sistema al lugar específico del genoma, y el dominio de escisión genera DSBs (Figura 4b). Al igual que las ZFNs, las TALENs han sido ampliamente aplicadas para la generación de modelos celulares y animales59,60. Sin embargo, aunque el diseño y síntesis de estos sistemas se simplifica por el modo de reconocimiento del dominio de unión al ADN, su desarrollo continúa siendo relativamente dificultoso. Así, el sistema de edición genómica mayoritariamente utilizado en la actualidad, se basa en la tecnología CRISPR/Cas. Figura 4. Esquema del funcionamiento básico de los sistemas de edición genómica: (a) ZFNs; (b) TALENs. Introducción 69 1.4. SISTEMAS CRISPR/CAS 1.4.1. Contexto histórico Los sistemas CRISPR fueron observados por primera vez en la arquea Haloferax mediterranei por Francis Mojica en 1993 mientras estudiaba los mecanismos de regulación de dichos microorganismos para adaptarse a ambientes extremadamente salinos61, y descubiertos en múltiples bacterias y otras arqueas en años sucesivos. En un principio, Mojica trataba de obtener la secuencia genómica de las arqueas, cuando encontró en el genoma un patrón característico de secuencias que se repetían a lo largo del genoma, de entre 20-50 pares de bases (secuencias palindrómicas), separadas entre sí por fragmentos (espaciadores), cuya secuencia no se correspondía con el genoma bacteriano o de arqueas. Finalmente, Mojica y Christine Pourcel, en trabajos independientes62-64 determinaron que dichos espaciadores se correspondían con genomas de bacteriófagos, profagos y plásmidos. Se encontró además que las secuencias repetitivas y los espaciadores (array repetición-espaciador) siempre iban precedidos por una secuencia de varios cientos de pares de bases (secuencia leader). Esta observación indujo a pensar que estas secuencias foráneas podrían tener una función biológica de relevancia, confiriendo a bacterias y arqueas inmunidad específica frente al genoma exógeno. En paralelo, se habían descubierto varios genes implicados en la reparación del ADN y que dichos genes se encontraban en regiones adyacentes a los sistemas CRISPR actuando en conjunto, de forma que los denominaron genes asociados a CRISPR (CRISPRassociated genes) y por ende, proteínas endonucleasas Cas65. Un esquema simplificado de los componentes del sistema se muestra en la Figura 5. Figura 5. Esquema de los principales componentes del sistema CRISPR; proteínas Cas, secuencia leader y array CRISPR (repetición-espaciador). Mediante estudios de genómica comparativa, Makarova et al., propusieron que la función de defensa de los sistemas CRISPR/Cas en procariotas es análoga a la función de los ARN de interferencia en eucariotas66. La confirmación de que los sistemas CRISPR/Cas intervienen como mecanismos de inmunidad adquirida en procariotas se confirmó experimentalmente en 2007 en la bacteria Streptococcus thermophilus67. Asimismo se identificaron pequeñas secuencias de entre 2 y 5 nucleótidos adyacentes a los espaciadores del genoma exógeno denominados motivos adyacentes al protoespaciador (PAM, del inglés Protospacer Adjacent Motif), que son precisamente los que determinan qué porción del genoma vírico y en qué posición será introducido en el genoma de los huéspedes68. ALBA PENSADO LÓPEZ 70 En la actualidad los sistemas CRISPR/Cas se clasifican en dos clases (I y II) en base a los complejos de proteínas Cas que intervienen, siendo complejos multiproteicos en la clase I y una única proteína efectora en la clase II. Estas clases a su vez, se dividen en tipo I, III y IV (clase I) y tipo II, V y VI (clase II) atendiendo a qué nucleasas principales intervienen, siendo la Cas3 en el tipo I, la Cas10 en el tipo III, no caracterizada en el tipo IV, la Cas9 en el tipo II, la Cas12 en el tipo V y la Cas13 en el tipo VI69,70. 1.4.2. Funcionamiento general de los sistemas CRISPR/Cas en procariotas El funcionamiento básico no difiere significativamente entre los distintos sistemas CRISPR, de forma que se explicará, de forma general, el mecanismo de defensa que desarrollan las bacterias a través del sistema CRISPR/Cas9 (clase II, tipo II), ya que éste es el mejor caracterizado y el más extendido en sus aplicaciones (Figura 6). Figura 6. Esquema del funcionamiento básico del sistema CRISPR/Cas9. (a) Fase de adquisición o adaptación; (b) Fase de biogénesis de ARNcr; (c) Fase de interferencia. Cuando una bacteria es infectada por un bacteriófago ésta reconoce la presencia de un genoma exógeno y mediante las proteínas Cas1 y Cas2, que reconocen una secuencia PAM específica del protoespaciador, éste es procesado e integrado entre repeticiones del locus CRISPR como un nuevo espaciador, lo que se conoce como fase de adquisición o adaptación Introducción 71 (Figura 6a). El funcionamiento conjunto de proteínas Cas1 y Cas2 es esencial en la fase de adaptación y ambas son ubicuas en todos los sistemas CRISPR/Cas y no tienen capacidad de actuar de forma individual66. Ante una nueva reinfección, mediante el promotor de la secuencia leader, la bacteria es capaz de transcribir el array repetición-espaciador, dando lugar a los pre-ARN de CRISPR (pre-ARNcr), que son complementarios al array repeticiónespaciador y por tanto complementarios a las secuencias espaciadoras del ADN exógeno. Asimismo, se transcriben otros ARNs pequeños no codificantes denominados ARN de CRISPR transactivador (ARNtracr), que se encuentran aguas arriba del locus CRISPR y que son complementarios a las regiones repetitivas. Así, se forma un dúplex preARNcr:ARNtranscr, que será procesado por una endoribonucleasa (RNAsa III), dando finalmente lugar al dúplex ARNcr:ARNtrancr, cada uno de ellos únicamente correspondiente y complementario a un espaciador del array. Esta fase se denomina fase de biogénesis de ARNcr (Figura 6b). A continuación, durante la fase de interferencia los dúplex son reconocidos por la Cas9, por lo que se une a los mismos formando un complejo ribonucleoproteína y éste se activa. La Cas9 contiene dos dominios, el RuvC y el HNH, que guiarán al complejo a la región complementaria en el virus, a donde se unirán y generarán un corte de doble cadena, fragmentando el genoma vírico (Figura 6c)71. 1.4.3. Modificación de los sistemas CRISPR/Cas9 para su aplicación en investigación La aplicación de los sistemas CRISPR/Cas9 en investigación supone un avance importante frente a las ZFNs y a las TALENs, ya que se trata de un sistema coste-efectivo de edición, con un diseño más sencillo que únicamente requiere el uso de dos componentes principales: a) la nucleasa Cas9; b) la guía simple de ARN (ARNsg) que se sintetiza de forma que contenga el ARNtracr, que presenta una región que permite la unión a la Cas9, y el ARNcr, que contiene la secuencia complementaria a la región específica del genoma a editar72,73. De esta forma, el complejo ARNg-Cas9, se dirige específicamente a la región de interés, y se generan DSBs (Figura 7). Figura 7. Estructura básica de los componentes del sistema CRISPR/Cas9. ALBA PENSADO LÓPEZ 72 Tras la generación de los DSBs por parte de la endonucleasa, se desencadenarán los mecanismos celulares de reparación de forma que si el interés del investigador es provocar la disrupción del gen (KO, del inglés knock-out), no será necesario introducir elementos adicionales en el sistema, y se generarán INDELs (Figura 3a). Por el contrario, si la intención es corregir una secuencia determinada del gen o insertar secuencias de interés (KI, del inglés knock-in), será necesario aportar una secuencia ADN donante determinado para que ésta sea introducida en la posición deseada (Figura 3b). Así, la edición del genoma mediante la aplicación del sistema CRISPR/Cas se ha realizado satisfactoriamente en multitud de organismos modelo, como nematodos (Caenorhabditis elegans)74, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster)75, el pez cebra (Danio rerio)76 o ratón (Mus musculus) y rata (Rattus norvegicus)77. Asimismo, se han desarrollado estudios en multitud de líneas celulares, tanto somáticas como embrionarias78. 1.4.4. Aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el estudio de TEA Los modelos celulares son una herramienta fundamental para estudiar multitud de enfermedades con base genética. No obstante, las alteraciones que se producen en los TEA como consecuencia de mutaciones genéticas afectan fundamentalmente a células del sistema nervioso central asociadas a funciones cognitivas superiores, y estos tipos celulares presentan una tasa de proliferación muy baja, por lo que su cultivo y mantenimiento a largo plazo no es posible. Sin embargo, la identificación de los mecanismos que permiten reprogramar células somáticas adultas por parte de Takahashi y Yamanaka supuso una revolución en la investigación79. Este descubrimiento ha permitido desarrollar protocolos para transformar líneas celulares diferenciadas en células madre pluripotenciales inducidas humanas (hiPSCs, del inglés human induced pluripotent stem cells) mediante la expresión de los llamados factores de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc). Así, las hiPSC pueden reprogramarse y diferenciarse en tipos celulares específicos del sistema nervioso y así generar modelos in vitro derivados directamente de cada paciente y estudiar la causa particular del trastorno80. Los modelos celulares obtenidos de pacientes para estudiar la fisiopatología de los TEA presentan grandes ventajas con respecto a otros modelos celulares, ya que preservan el bagaje genético individual. Además, la obtención de estos tipos celulares y la aplicación de los sistemas CRISPR/Cas permite estudiar las alteraciones en la morfología neuronal, transmisión sináptica, migración celular o capacidad de diferenciación81. De esta forma, puede establecerse una relación genotipo-fenotipo, así como desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Siguiendo esta metodología se han descubierto alteraciones en la actividad sináptica, longitud y complejidad de las dendritas, formación de neuritas, migración neuronal, en la adhesión y diferenciación neuronal, en la ruta de señalización del calcio e incluso hiperactivación de la ruta de mTOR y la alteración en la expresión de genes asociados a la morfogénesis neuronal, a través del uso de iPSCs derivadas de neuronas corticales y disrupción del gen SHANK282, de neuronas dopaminérgicas y disrupción del gen RELN83, de neuronas glutamatérgicas y disrupción de los genes AFF2, ASTN2, ATRX, KCNQ2 y SCN2A84 o de organoides neuronales y disrupción del gen CHD885, entre otras. Introducción 73 A pesar de la valiosa información que se desprende de los estudios con modelos in vitro, es innegable que los cultivos celulares no pueden recapitular por completo la complejidad que se representa en la patología los TEA. Por ello, los modelos animales son una herramienta fundamental para una mayor comprensión de estos trastornos. La ventaja principal del uso de modelos animales para la investigación de TEA es la posibilidad de modular la actividad de determinados genes candidatos mediante los sistemas de edición genómica, y así comprobar in vivo la implicación de los mismos en la enfermedad. En el ámbito de la investigación en neurociencias, los modelos animales más comúnmente utilizados son los roedores, principalmente el ratón. Esto se basa fundamentalmente en el profundo conocimiento del genoma del mismo así como su homología con el ser humano pues aproximadamente un 99% de los genes de ratón tienen un homólogo en el genoma humano86. Además, pueden desarrollar patrones comportamentales, sociales, comunicativos o de aprendizaje análogos a los humanos87. En la actualidad existen unos 200 modelos de ratón recogidos en la base de datos de SFARI51 generados mediante distintos sistemas de edición genómica. Algunos de estos estudios llevados a cabo utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 para comprobar la implicación de diversos genes en la patología de los TEA, han mostrado un incremento en la mortalidad y disminución de la fertilidad, desarrollo anormal del cerebro y el corazón, formación anormal de la corteza cerebral, disminución en la proliferación de precursores neuronales, disminución en la mielinización, así como disminución cognitiva y alteraciones en los patrones de aprendizaje y en la interacciones sociales, y aparición de comportamientos repetitivos88-92. Asimismo, con esta misma metodología se han generado modelos de rata para el estudio de TEA, revelando alteraciones neuronales en general y de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas en particular, cambios en la materia blanca, así como dificultades motoras y en los procesos de aprendizaje y memoria93-95. A pesar de la evidente idoneidad de los roedores como modelos de TEA y la valiosa información que ofrecen, existen algunos inconvenientes notables que han llevado a los investigadores a optar por modelos más manejables, como el pez cebra, cuya descripción general y ventajas sobre otros modelos, así como su utilidad para el estudio de los factores genéticos causales de TEA se discuten en el siguiente apartado. 2. EL PEZ CEBRA 2.1. TAXONOMÍA Y DISTRIBUCIÓN El pez cebra pertenece al reino Animalia, filo Chordata, clase Actinopterygii, interclase Teleostei, orden Cypriniformes, familia Cyprinidae, género Danio y especie Danio rerio. La primera descripción del pez cebra la hizo Hamilton en 1822, bajo el nombre de Cyprinus rerio, dentro de la división Cyprinus y género Danio96, en el río Kosi, un afluente del Ganges. Con posterioridad, Weber y Beaufort propusieron subdividir esta clasificación en el género Brachydanio y el género Danio, atendiendo a ciertas características corporales 97, de ahí las diversas referencias de pez cebra como Brachydanio rerio. Tras observar las múltiples características superpuestas los géneros Brachydanio y Danio se unificaron98,99. En la ALBA PENSADO LÓPEZ 80 casos se ven fenotipos anormales inesperados debido a uniones inespecíficas del MO y en muchos casos, por apoptosis mediada por la activación de la ruta de p53. Por ello se recomienda la utilización de MOs control, para verificar que los fenotipos observados no son producto de la manipulación de los embriones; la co-inyección de MOs específicos para p53, para verificar que los fenotipos no se deben a apoptosis; y el rescate del fenotipo mediante la inyección de ARNm, para verificar que se revierten los fenotipos y que por ende el MO es específico145,146. Asimismo, es recomendable verificar los fenotipos en modelos mutantes, en los que los efectos inespecíficos se ven reducidos y es posible establecer modelos a largo plazo. Tabla 5. Estudios con MOs en pez cebra para la caracterización fenotípica de genes candidatos de TEA Gen de pez cebra Características fenotípicas observadas Referencia arid1b Longitud corporal reducida Expresión anormal de genes condrogénicos y osteogénicos 147 arxa Desarrollo cerebral anormal Alteraciones neuronales 148 auts2a Microcefalia Desarrollo anormal de la mandibular Alteraciones neuronales y motoras 149 cacna1c Alteraciones cardiovasculares Desarrollo craneofacial anormal 150 cep41 Alteraciones axonales y en la migración de la cresta neural Alteraciones en el comportamiento social 151 chd2 Alteraciones en el desarrollo Microcefalia y curvatura anormal del cuerpo Ausencia de vejiga natatoria Dificultades motoras 152 chd8 Desarrollo craneofacial alterado con macrocefalia Reducción de neuronas entéricas post-mitóticas Movilidad gastrointestinal reducida 153,154 ctnnd2b Longitud corporal reducida Alteraciones de la notocorda 155 kcnj10 Alteraciones motoras Desarrollo general anormal Incremento de la estereotipia 156 kdm6a y kmt2d Longitud corporal reducida Desarrollo anormal de la mandíbula Alteraciones de la notocorda Alteraciones neuronales 157,158 Introducción 81 mecp2 Disminución de la longitud axonal y dendrítica Disminución en las respuestas sensoriales 159 met Alta mortalidad Alteraciones neuronales 160 mytl1a and mytl1b Niveles disminuidos de oxitocina 161 rlim y rpl10 Microcefalia 162,163 syngap1a/syngap1b y shank3a/shankb Retraso en el desarrollo y dificultades mototas Incremento en la apoptosis cerebral Desregulación de señales excitatorias e inhibitorias 164 trappc6b Microcefalia Hiperexcitabilidad 165 2.4.1.2. TILLING, TALENs, ZFNs y CRISPR Debido a las relativas limitaciones que presenta el uso de MOs, y con objeto de generar líneas mutantes estables, otra estrategia ampliamente utilizada en el pez cebra para el estudio de genes relacionados con TEA es la metodología TILLING. Ésta se basa en la exposición del animal a N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), un potente agente mutagénico, y posterior secuenciación para identificar mutaciones que provoquen una pérdida de función del gen. El ENU es un agente alquilante que, mediante la transferencia de sus grupos etilo a los átomos de oxígeno o nitrógeno de las bases del ADN, genera errores en la replicación dando lugar a mutaciones puntuales al azar en el genoma166. Aunque su uso comenzó principalmente en Arabidopsis167, pronto se aplicó a otras especies, incluida D.rerio168, y se han desarrollado varios modelos de TEA generados mediante la mutagénesis mediada por ENU (Tabla 6). Sin embargo, los costes asociados son bastante elevados y el tiempo que requiere analizar todas las secuencias es considerable, lo que a su vez dificulta la generación de líneas mutantes estables para el gen específico de interés166. Para superar estas dificultades se introdujeron con posterioridad las metodologías basadas en ZFNs y TALENs, previamente descritas, también aplicadas al estudio de TEA (Tabla 6). En la actualidad, con las mejoras introducidas en los protocolos de CRISPR/Cas se ha incrementado significativamente la eficiencia de generación de líneas mutantes, por lo que esta técnica ha pasado a ser la opción de preferencia para muchos investigadores169. Para ejemplificar la utilidad de los sistemas CRISPR en el estudio del trasfondo genético de los trastornos, en este caso, psiquiátricos, cabe mencionar el estudio a gran escala desarrollado por Thyme y colaboradores. En base a variantes asociadas a esquizofrenia detectadas en estudios de casos y controles, aplicaron la técnica de CRISPR/Cas9 a 132 genes en pez cebra, pudiendo hacer una descripción fenotípica general asociada a esquizofrenia, priorizar más de 30 genes candidatos y establecer asociaciones entre genes específicos y mecanismos biológicos determinados170. Asimismo, Guissart y colaboradores mientras trabajaban con familias con grados variables de alteraciones en las funciones cognitivas, motoras y ALBA PENSADO LÓPEZ 82 conductuales, así como discapacidad intelectual, identificaron varias mutaciones en el receptor nuclear RORα, esencial para el desarrollo del cerebelo. Tras generar una línea mutante mediante CRISPR/Cas9 en pez cebra, encontraron reducción de las células granulares y de Purkinje, recapitulado así las alteraciones neuroanatómicas de los pacientes171. Este y otros ejemplos de CRISPR/Cas9 para estudiar genes relacionados con TEA se recogen en la Tabla 6. Tabla 6. Estudios en pez cebra para la caracterización fenotípica de genes candidatos de TEA mediante ZFNs, TALENs, ENU y CRISPR/Cas9 Gen de pez cebra Técnica utilizada Características fenotípicas observadas Referencia chd8 CRISPR/Cas9 Desarrollo craneofacial alterado con macrocefalia 153 cntnap2a y cntap2b ZFNs Desarrollo anormal Microcefalia Disminución de interneuronas Alteraciones motoras 172 dyrk1a TALENs Microcefalia Alteración en la morfología del cerebelo Respuesta alterada a estímulos sociales 173 fmr1 ENU y CRISPR/Cas9 Desarrollo cerebral anormal Hiperactividad Incremento de la ansiedad Comportamiento social anormal Dificultades de aprendizaje 174-176 mecp2 ENU Respuesta inmune alterada Alteraciones neuronales Alteraciones motoras 177,178 nbea ENU y TALENs Disminución de la complejidad dendrítica Respuesta sensorial alterada Actividad locomotora disminuida 179 nr3c2 CRISPR/Cas9 Comportamiento social anormal Rutinas de sueño alteradas 50 oxtr TALENs Alteración de la señalización de oxitocina Alteraciones de la memoria para el reconocimiento social y no social 180 reln TALENs Comportamiento social anormal Alteración de la señalización de serotonina 181 rerea and rereb ENU Disminución en la respuesta a estímulos Dificultades visuales y auditivas 182 Introducción 83 roraa CRISPR/Cas9 Alteraciones en la morfología del cerebelo y tectum óptico 171 shank3a y shankb CRISPR/Cas9 Desarrollo general anormal Alteraciones neuronales Alteraciones en la función sináptica Peristaltismo intestinal reducido Socialización reducida con hipoactividad 183,184 2.4.2. Caracterización de los modelos genéticos de pez cebra Una vez se han generado los modelos de KD, KO o KI para el gen deseado, se dispone de multitud de estrategias aplicables para una caracterización de los mismos, basadas principalmente en el análisis fenotípico, molecular y de comportamiento en combinación o no, con el uso de líneas transgénicas (Tabla 4). En relación al análisis morfológico, se trata fundamentalmente de evaluar la presencia de anormalidades en el cuerpo y la cola, cabeza, ojos, otolitos, vitelo, así como la posible presencia de edema cardíaco. Esto se puede realizar a través del uso de microscopía y la realización de medidas que permitan comparar datos entre individuos, por ejemplo, midiendo la longitud del cuerpo, el diámetro o área de la cabeza, ojos, otolitos y vitelo o la distancia entre estos diferentes elementos, e incluso también analizando regiones cerebrales concretas185,186. Para la caracterización molecular de los modelos en relación a los patrones de expresión génica, una técnica ampliamente utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o qPCR (del inglés, quantitativePolimerase Chain Reaction), que permite cuantificar el nivel de expresión de genes determinados y evaluar diferencias entre los individuos salvajes y los modelos. También se suele recurrir a los ensayos de hibridación in situ o HIS con sondas de ARN, que permiten además, localizar en qué tejidos se expresan los genes de interés en los distintos períodos de desarrollo. Algunos de los marcadores moleculares que se han evaluado y han arrojado resultados interesantes en modelos de neurodesarrollo son, por ejemplo, sox2 (marcador de pluripotencia de células madre neurales), vglut2.2 (marcador glutamatérgico), th1 (marcador dopaminérgico), neurog1 (marcador de determinación neuronal) , c-fos (marcador de activadoción neuronal), crh (neuronas del núcleo paraventricular), c-myc (zona de proliferación tectal y retina), emx1 (telencéfalo) u otx2a y pax2a (diencéfalo y límite mesencéfalo-rombencéfalo)185,187,188. Asimismo, en los últimos años se ha desarrollado la técnica de secuenciación del ARN o RNA-seq (del inglés RNA sequencing), que permite la caracterización completa del transcriptoma y así determinar a nivel global los cambios en la expresión génica que se producen en los modelos, o incluso la implicación a nivel transcriptómico de la exposición a ciertos factores ambientales 189,190. A nivel de proteínas, su ubicación física así como las diferencias en los niveles de las mismas entre individuos puede determinarse a través de técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia (IHQ e IF, respectivamente), basadas en la aplicación de anticuerpos. Así, se ha utilizado, por ejemplo, anti-5-HT (neuronas serotoninérgicas)191, anti-GFAP (células de glía radial)185, anti-α-tubulina acetilada (tractos axonales cerebrales), anti-sox10 ALBA PENSADO LÓPEZ 84 (migración de células de la cresta neural)151, anti-homer1 (proteína postsináptica), antisinaptofisina (terminales presinápticos)183, znp-1 (neuronas motoras)187 , anti-fosfohistona H3 (fase M, proliferación celular)172, anti-PCNA (proliferación celular)188, anti-caspasa3 (células apoptóticas)173 o anti-PSD95 (marcador sináptico)184. En cuanto a los estudios comportamentales, el desarrollo precoz de determinadas conductas en pez cebra permite la aplicación de multitud de test, no solo para caracterizar los comportamientos típicos observados en pacientes de TEA, sino también para otros síntomas comórbidos como ansiedad, agresividad, epilepsia o alteraciones del sueño192. Así, se pueden evaluar entre otros parámetros la interacción social, respuestas emocionales, capacidad sensorial, toma de decisiones o habilidades de aprendizaje193. Finalmente, la generación relativamente sencilla de modelos genéticos de pez cebra, la gran cantidad de técnicas aplicables para la validación de genes candidatos y el establecimiento de correlaciones genotipo-fenotipo, así como la disponibilidad de un número elevado de individuos, permiten testar la acción de múltiples compuestos o drogas que, en último término, pueden llevar al descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y fármacos194. 3. AUTS2, GEN CANDIDATO DE SUSCEPTIBILIDAD A AUTISMO 2 El gen AUTS2, comúnmente denominado como gen de susceptibilidad a autismo 2 (del inglés, autism susceptibility candidate 2) o también conocido como activador de la transcripción y regulador del desarrollo (del inglés, activator of transcription and developmental regulator) por el HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC:14262), se identificó y se caracterizó como gen candidato a autismo en el año 2002195. Sultana y colaboradores, basándose en estudios de ligamiento que previamente habían relacionado el cromosoma 7q con autismo196, encontraron una traslocación recíproca entre la región 7q11.2 y 20p11.2 que afectaba al gen AUTS2 en una pareja de gemelos monocigóticos con autismo. Desde entonces se han identificado múltiples variaciones estructurales de este gen, tanto heredadas como de novo, desde deleciones, traslocaciones, duplicaciones o SNPs, en pacientes de autismo e incluso en otras enfermedades psiquiátricas o del neurodesarrollo, como esquizofrenia, depresión, epilepsia, discapacidad intelectual o trastorno de déficit de atención e hiperactividad149,197-199. Sin embargo, los individuos que presentan alteraciones en torno a la región 3’ del gen muestran un fenotipo más severo, lo que parece indicar que el extremo amino terminal de la proteína es esencial para su correcto funcionamiento200. Los estudios llevados a cabo para establecer relaciones fenotipo-genotipo en pacientes con mutaciones en el gen AUTS2 han revelado que las principales características clínicas son las siguientes: retraso global del desarrollo (98%), microcefalia (65%), dificultades para la alimentación (62%), TDAH (54%), rasgos autistas (52%)201, aunque se han descrito hasta 32 rasgos relacionados con el gen, cuya frecuencia es oscila entre del 10 - 50%200 . Todo ello ha llevado a concluir que AUTS2 es un gen con efectiva implicación en el desarrollo de enfermedades del neurodesarrollo, más concretamente, TEA. Introducción 85 3.1. DESCRIPCIÓN Y FUNCIÓN EN EL NEURODESARROLLO El gen AUTS2 se localiza en el brazo largo del cromosoma 7, concretamente en la posición 7q11.22 (Figura 11), abarca una región de 1,2 megabases (69,598,296-70,793,506) y presenta 16 tránscritos codificadores de proteínas (aunque tiene un total de 33 variantes)202. La isoforma principal (NM_015570.4, ENST00000342771.10) con 7469 pb, tiene 19 exones y codifica para una proteína de 1259 aminoácidos (Figura 11). AUTS2 se expresa principalmente en el cerebro, aunque también en riñón, colon, vesícula biliar o músculo esquelético y en menor medida en la placenta y pulmón203. A nivel celular, la proteína AUTS2 tiene funciones tanto en el citoplasma como en el núcleo. Figura 11. Representación esquemática de la localización cromosómica y composición exónica de AUTS2. 3.1.1. Función citoplasmática En el citoplasma AUTS2 está involucrada en la motilidad y morfogénesis celular mediante la reorganización del citosqueleto y la interacción con miembros de la familia Rho, tales como Rac1 y CDC42204. De esta forma, AUTS2 activa a Rac1 a través de factores intercambiadores de guanina, como P-Rex1 o el complejo Elmo2/Dock180 lo que da lugar a la formación de lamelipodios, e inhibe la formación de filopodios al suprimir la función de CDC42, promoviendo así la correcta migración neuronal y la proyección axonal205,206. 3.1.2. Función nuclear La principal función del gen AUTS2 es la regulación de la transcripción génica de múltiples genes implicados en el desarrollo, estando muchos de ellos relacionados con la aparición de trastornos del neurodesarrollo y desarrolla sus funciones como parte del denominado PRC1 (del inglés, Polycomb repressive complex type 1)207. El PRC1 se subdivide en 6 clases dependiendo de la proteína del tipo RING finger que contenga (PCGFs, del inglés Polycomb Group RING Fingers), aunque todos ellos contienen la proteína RING1A/B y su función canónica es la represión transcripcional a través la monoubiquitinación de la lisina 19 de la histona H2A (H2AK119ub1) compactando la cromatina y así, reprimiendo la ALBA PENSADO LÓPEZ 86 transcripción208. No obstante, AUTS2 forma parte del complejo PRC1 que contiene las proteínas PCGF3 o PCGF5, RING1A/B, RYBP, CK2B y P300 cuya función, no canónica, revierte la represión transcripcional y convierte al complejo en activador de la transcripción. En este sentido, CK2 fosforila a la subunidad RING1A/B, lo que inhibe la ubiquitinación de la H2AK119ub1 y, a su vez, AUTS2 interactúa con las proteínas PCGFs del complejo, reclutando a P300, cuya actividad acetiltransferasa activa la transcripción209,210. A su vez, el reclutamiento al complejo de la proteína DCAF7, también denominada WDR68, induce la transcripción al promover la actividad del complejo. 3.2. auts2a, GEN ORTÓGOLO EN PEZ CEBRA Como se menciona con anterioridad, la secuenciación del genoma del pez cebra ha permitido demostrar la conservación genómica y funcional de múltiples genes implicados en enfermedades humanas109. Uno de estos genes, altamente conservados tanto a nivel de secuencia como de función es AUTS2. El ortólogo en pez cebra se denomina auts2a, cuya función se relaciona igualmente con procesos de desarrollo y cuya homología global de secuencia con el gen humano es de aproximadamente un 63%202. Este gen se localiza en el cromosoma 10 (27,182,704-27,741,793) y tiene 9 isoformas, constando al principal de 19 exones, con 4714 pb, que dan lugar a una proteína de 1278 aminoácidos (ENSDART00000129369.3). Su expresión en pez cebra se extiende al cerebro anterior, medio y posterior, así como al ojo y al tronco hasta las 24 hpf, limitándose únicamente al cerebro y ojo en etapas posteriores del desarrollo149. 3.3. MODELOS IN VIVO E IN VITRO PARA EL ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE AUTS2 EN EL NEURODESARROLLO La implicación de AUTS2 en la neurogénesis, migración neuronal, regulación sináptica, desarrollo cerebral y cerebelar, así como en la aparición de comportamientos anormales ha sido investigada a través de varios estudios, tanto en modelos animales como celulares. En relación a los modelos celulares, mediante el uso de células madre embrionarias de ratón o cultivos primarios de neuronas se demostró la función de AUTS2 en la diferenciación neuronal a través de su participación en el PRC1209,211, que su sobre-expresión promueve el crecimiento de las neuritas204 y que su disrupción provoca un incremento de la muerte celular en el proceso de diferenciación neuronal212. En el pez cebra, con el bloqueo de auts2a mediante MOs se observaron anormalidades en el desarrollo, incluyendo microcefalia y reducción del tamaño mandibular, así como disminución generalizada de neuronas en el cerebelo, retina y tectum óptico, como consecuencia de un incremento de la apoptosis149,200. Dichos fenotipos se pudieron revertir con la inyección del ARNm humano, mostrando la especificidad del MO y la responsabilidad de auts2a en la aparición de las características anormales observadas. Mediante TALENs, Jha y colaboradores pudieron establecer la relación entre la ralentización de las respuestas de escape y la excitabilidad reducida de las neuronas de Mauthner213. En ratones, la pérdida de Auts2 se ha relacionado con la disminución del tamaño y peso corporal, pérdida de la capacidad del reflejo de Introducción 87 enderezamiento corporal y una menor capacidad de vocalización ultrasónica214. Hori y colaboradores demostraron que la pérdida de Auts2 da lugar a anormalidades en la formación, extensión y ramificación de las neuritas, así como en la migración y elongación de las neuronas corticales204. Con posterioridad encontraron un balance anormal de señales excitatorias e inhibitorias, presencia de comportamientos autistas y déficits en la interacción social y la comunicación vocal215. El papel crucial de AUTS2 en las funciones motoras y la comunicación social a través de la regulación del desarrollo del cerebelo, la maduración de las células de Purkinje y el desarrollo correcto de sinapsis fue evidenciado en un modelo mutante de ratón por Yamashiro y colaboradores216. En vista de lo anteriormente expuesto, se hace necesaria la generación de un modelo KO para auts2a en pez cebra que permita su validación funcional, así como la identificación de alteraciones transcriptómicas y moleculares, y el desarrollo de estudios de comportamiento. Así, además de aportar datos muy valiosos acerca de la fisiopatología asociada a mutaciones en dicho gen, con el modelo se pretende establecer a auts2a como potencial diana terapéutica para la búsqueda y desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Todo ello permitiría una mejora en el consejo genético, tratamiento, y en último término, en la calidad de vida de los pacientes y sus familiares. Parte de los contenidos de la presente Introducción se han derivado o modificado de la publicación de Pensado-López et al. (2020), cuyos detalles se recogen en el Anexo I (página 171).* * Pensado-López, A., Veiga-Rúa, S., Carracedo, Á., Allegue, C. & Sánchez, L. Experimental Models to Study Autism Spectrum Disorders: hiPSCs, Rodents and Zebrafish. Genes (Basel) 11(2020). DOI: 10.3390/genes11111376 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ALBA PENSADO LÓPEZ 44 permitido recapitular muchos de los signos y síntomas observados en pacientes y así desentrañar las bases biológicas, celulares y moleculares de la patología. Siguiendo esta estrategia, el objetivo principal de esta tesis de investigación ha sido desarrollar una línea mutante de pez cebra para el gen auts2a, ortólogo del gen humano AUTS2. Este gen se identificó y se caracterizó como gen candidato a autismo en el año 2002 y desde entonces, se han descrito múltiples variaciones estructurales del mismo en pacientes de TEA, e incluso en otras enfermedades psiquiátricas o del neurodesarrollo, como esquizofrenia, depresión, epilepsia, discapacidad intelectual o trastorno de déficit de atención e hiperactividad. En el cerebro, y a nivel citoplasmático, la proteína AUTS2 está involucrada en la motilidad y morfogénesis celular mediante la reorganización del citoesqueleto, promoviendo la correcta migración neuronal y la proyección axonal. A nivel nuclear, la principal función del gen AUTS2 es la regulación de la transcripción génica de numerosos genes implicados en el neurodesarrollo, formando parte del complejo denominado PRC1 (del inglés, Polycomb repressive complex type 1), que resulta fundamental para la correcta diferenciación neuronal. Se han desarrollado otros modelos para este gen, tanto celulares como animales, que han revelado, entre otras características, anormalidades en formación, extensión y ramificación de las neuritas o en la migración y elongación de las neuronas corticales, desregulación en el balance de señales inhibidoras/ excitadoras, disminución generalizada de neuronas en el cerebelo y también disminución del tamaño y peso corporal, microcefalia y anormalidades mandibulares. No obstante, se hace necesaria la generación de un modelo estable y a largo plazo para auts2a en pez cebra que permita su validación funcional, así como la identificación de alteraciones celulares y moleculares y muy especialmente, trasncriptómicas, que aporten datos acerca de la fisiopatología asociada a mutaciones en dicho gen. Un aspecto crucial en el desarrollo de líneas mutantes mediante CRISPR/Cas9 es la optimización de tiempos y costes, a lo que en esta tesis se ha dado especial relevancia, principalmente a través del desarrollo y validación de distintas estrategias para el genotipado de las distintas generaciones de individuos mutantes, incluyendo la clásica secuenciación Sanger, pero también análisis de fragmentos o análisis de heterodúplex en gel de poliacrilamida. De igual importancia es la validación de la eficiencia del knock-out del gen, por lo que en la presente tesis se ha hecho hincapié en dicha comprobación y se ha establecido como segundo objetivo general, en primer lugar, mediante la comprobación in silico de la potencial producción de codones de parada prematuros (PSC, del inglés, Premature Stop Codons). Asimismo, se ha realizado la comprobación tanto a nivel transcriptómico, mediante PCR cuantitativa e hibridación in situ, pues se esperaba la participación del nonsense-mediated mRNA decay (NSMD) y la eliminación del ARN mensajero, como proteómico mediante Western Blot con el fin de comprobar los efectos de la mutación en la traducción de la proteína. Como tercer objetivo principal se ha propuesto la caracterización a nivel fenotípico de los mutantes, principalmente mediante técnicas de imagen, evaluando características morfológicas tales como el tamaño de la cabeza, de los ojos, del cuerpo e incluso de estructuras cartilaginosas de la región mandibular. Asimismo, se han evaluado procesos de Resumen 45 apoptosis, con especial atención en la región cefálica y anormalidades en la locomoción en general, lo que podría explicarse o por disfunciones motoras o bien por una desregulación del balance excitatorio/ inhibitorio. El cuarto objetivo principal ha sido la caracterización a nivel transcriptómico de los individuos mutantes, por lo que se seleccionaron una serie de genes cuya expresión podría estar afectada en los individuos mutantes. Dicha desregulación se puede relacionar con alteraciones en los procesos biológicos en los que dichos genes están implicados, y a su vez con parte de los signos y/o síntomas observados en pacientes. Los genes fueron seleccionados por ser reguladores o regulados por AUTS2, por estar implicados en enfermedades del neurodesarrollo, en el PRC1 o en NSMD, por ser marcadores específicos cerebelares, de sinapsis glutamatérgicas o gabaérgicas, de neuroglia, de pluripotencia, de diferenciación neuronal o de activación neuronal. Además de una delicada selección de los genes en base a la homología entre el gen humano y el de pez cebra, se ha prestado gran atención al funcionamiento correcto de los cebadores diseñados para maximizar la fiabilidad de los resultados obtenidos. Conocidas las alteraciones y el significado biológico que la disrupción del gen provoca, se pretende, en último término, establecer a auts2a como potencial diana terapéutica para la búsqueda y desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, sirviendo el pez cebra como plataforma de estudio a gran escala. Todo ello permitiría una mejora en el consejo genético y en las terapias y tratamientos, lo que redunda, finalmente, en una mejora de la calidad de vida de los pacientes y sus familiares. RESUMO Resumo 49 RESUMO Os Trastornos do Espectro Autista (TEA ou ASD polas súas siglas en inglés, Autism Spectrum Disorders) fan referencia a un conxunto de enfermidades complexas do neurodesenvolvemento caracterizadas polo deterioro persistente das habilidades comunicativas, as habilidades ocupacionais e a reciprocidade socioemocional. Tamén son características a presenza de comportamentos e intereses restritivos e repetitivos e a insistencia na monotonía. Os primeiros síntomas ocorren nos primeiros períodos de desenvolvemento, aínda que o trastorno pode non manifestarse plenamente ata que as demandas sociais ou intelectuais superan as capacidades limitadas, e a sintomatoloxía se presenta con distintos graos de intensidade e gravidade. Os individuos tamén poden ter manifestacións físicas como epilepsia, problemas cardiovasculares e intestinais, hipotonía, disfunción inmunolóxica ou insomnio. As características mencionadas constitúen a base fundamental do diagnóstico, aínda que este tamén pode incluír probas neurolóxicas, probas médicas físicas e tamén probas xenéticas. Actualmente, o tratamento está dirixido principalmente a reducir os síntomas presentes nos individuos mediante terapias psicosociais, farmacolóxicas e de medicina natural. As manifestacións observadas teñen a súa orixe en anomalías na anatomía e conectividade de varias partes do cerebro así como na migración neuronal, que á súa vez se deben a unha ampla gama de factores de risco prenatais, perinatais e posnatais, tanto xenéticos como ambientais. En relación á contribución xenética, descifrar o impacto individual de cada factor de risco foi unha tarefa ardua para os investigadores, aínda que os estudos de asociación, as melloras na secuenciación e, a nivel experimental, os avances nos sistemas de edición do xenoma, permitiron delimitar un número importante de xenes candidatos. En concreto, a tecnoloxía CRISPR/Cas9 aplicouse con éxito para xerar modelos mutantes para estes xenes candidatos, permitindo así establecer relacións fenotipo-xenotipo e explicar a fisiopatoloxía da enfermidade. Neste sentido, o peixe cebra (Danio rerio) consolidouse nos últimos anos como un modelo idóneo para o estudo de trastornos do neurodesenvolvemento, como o TEA, polas súas características únicas, entre as que destacan: fácil mantemento, ciclo vital e reprodución curta, fecundación externa e transparencia dos embrións e larvas e moi especialmente, a alta homoloxía a nivel xenómico co ser humano, xa que o 70% dos xenes humanos teñen ortólogo no peixe cebra, sendo o 80% deles, xenes relacionados con enfermidades humanas. Así mesmo, os procesos básicos implicados no neurodesenvolvemento están moi conservados entre humanos e peixe cebra, e hai unha alta homoloxía estrutural en varias partes do cerebro. Deste xeito, no peixe cebra xeráronse múltiples modelos xenéticos para o estudo de xenes ALBA PENSADO LÓPEZ 50 candidatos, que permitiron recapitular moitos dos signos e síntomas observados nos pacientes e desentrañar así as bases biolóxicas, celulares e moleculares da patoloxía. Seguindo esta estratexia, o obxectivo principal desta tese de investigación foi desenvolver unha liña mutante de peixe cebra para o xene auts2a, ortólogo ao xene humano AUTS2. Este xene foi identificado e caracterizado como xene candidato para o autismo no ano 2002 e dende entón, describíronse múltiples variacións estruturais do mesmo en pacientes con TEA, e mesmo noutras enfermidades psiquiátricas ou do neurodesenvolvemento, como esquizofrenia, depresión, epilepsia, discapacidade intelectual ou Trastorno de déficit de atención e hiperactividade. No cerebro, e a nivel citoplasmático, a proteína AUTS2 está implicada na motilidade celular e na morfoxénese mediante a reorganización do citoesqueleto, promovendo a correcta migración neuronal e a proxección axonal. A nivel nuclear, a función principal do xene AUTS2 é a regulación da transcrición xénica de numerosos xenes implicados no neurodesenvolvemento, formando parte do complexo denominado PRC1 (Polycomb repressive complex type 1), que é esencial para unha correcta diferenciación neuronal. Para este xene desenvolvéronse outros modelos, tanto celulares como animais, que revelaron, entre outras características, anomalías na formación, extensión e ramificación de neuritas ou na migración e elongación das neuronas corticais, desregulación no equilibrio dos sinais inhibitorios/ excitatorio, diminución xeneralizada das neuronas no cerebelo e tamén diminución do tamaño e peso corporal, microcefalia e anomalías da mandíbula. Non obstante, é necesario xerar un modelo estable e a longo prazo para auts2a en peixe cebra que permita a súa validación funcional, así como a identificación de alteracións celulares e moleculares, e especialmente, transcriptómicas, que proporcionen datos sobre a fisiopatoloxía asociada ás mutacións no devandito xene. Un aspecto crucial no desenvolvemento de liñas mutantes mediante CRISPR/Cas9 é a optimización de tempo e custos, ao que se lle deu especial relevancia nesta tese, fundamentalmente a través do desenvolvemento e validación de diferentes estratexias para o xenotipado das distintas xeracións. individuos mutantes, incluíndo a secuenciación clásica de Sanger, pero tamén a análise de fragmentos ou a análise heterodúplex en xel de poliacrilamida. De igual importancia é a validación da eficiencia do knock-out do xene, polo que nesta tese se fixo fincapé en dita verificación e se estableceu como segundo obxectivo principal, en primeiro lugar, a través da comprobación in silico da produción potencial de codóns de parada prematura (PSC, do inglés Premature Stop Codons). Así mesmo, realizouse a verificación tanto a nivel transcriptómico mediante PCR cuantitativa como hibridación in situ, xa que se esperaba a participación do nonsense-mediated mRNA decay (NSMD)e a eliminación do ARN mensaxeiro, como proteómica mediante Western Blot para verificar os efectos da mutación na tradución da proteína. Como terceiro obxectivo principal, propúxose a caracterización a nivel fenotípico dos mutantes, principalmente mediante técnicas de imaxe, avaliando características morfolóxicas como o tamaño da cabeza, ollos, corpo e mesmo estruturas cartilaxinosas da rexión mandibular. Así mesmo, avaliáronse os procesos de apoptose, con especial atención á rexión Resumo 51 cefálica e as anomalías da locomoción en xeral, que se poden explicar ben por disfuncións motoras ou por unha desregulación do equilibrio excitador/inhibitorio. O cuarto obxectivo principal foi a caracterización a nivel transcriptómico dos individuos mutantes, para o que se seleccionaron unha serie de xenes cuxa expresión podería verse afectada nos individuos mutantes. Dita desregulación pode estar relacionada con alteracións dos procesos biolóxicos nos que están implicados os devanditos xenes, e á súa vez con parte dos signos e/ou síntomas observados nos pacientes. Os xenes foron seleccionados por ser reguladores ou regulados por AUTS2, por estar implicados en enfermidades do neurodesenvolvemento, PRC1 ou NSMD, por ser marcadores específicos de sinapses cerebelosas, glutamatérxicas ou gabaérxicas, neuroglía, pluripotencia, diferenciación neuronal ou activación neural. Ademais dunha coidada selección de xenes baseada na homoloxía entre o xene humano e do peixe cebra, prestouse gran atención ao correcto funcionamento dos cebadores deseñados para maximizar a fiabilidade dos resultados obtidos. Coñecendo as alteracións e o significado biolóxico que provoca a interrupción do xene, preténdese, en definitiva, establecer a auts2a como unha diana terapéutica potencial para a busca e desenvolvemento de novas estratexias terapéuticas, servindo ao peixe cebra como plataforma de estudo a gran escala. Todo iso permitiría unha mellora no asesoramento xenético e nas terapias e tratamentos, que redunda en definitiva nunha mellora da calidade de vida dos pacientes e dos seus familiares. SUMMARY Material y métodos 95 MATERIAL Y MÉTODOS 1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN El cuidado, mantenimiento y uso, así como los procedimientos descritos en pez cebra se realizaron de acuerdo con la normativa actual (Real Decreto 53/2013) y con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Santiago conforme a los protocolos estándar (Directiva 2010-63-UE). Todos ellos se llevaron a cabo en el animalario del Departamento de Zoología, Genética y Antropología Física, en la Facultad de Veterinaria, Lugo (EA-LU-003), con código REGA de autorización ES270280346401. Todos los procedimientos fueron llevados a cabo por Alba Pensado López, capacitada para las funciones A, B y C de experimentación animal con peces, anfibios y roedores. 1.1. MANTENIMIENTO DEL PEZ CEBRA Siguiendo las directrices establecidas, los peces de la línea salvaje tipo AB, de aquí en adelante denominados como WT (del inglés wild type), así como las líneas mutantes, se mantienen en el animalario en peceras de 3, 10 o 50 litros, en condiciones estables, con una temperatura de 28,5ºC, pH 7 y conductividad de 600 µS aproximadamente. Para el correcto acondicionamiento y mantenimiento de los animales, el agua del sistema adaptado al pez cebra recircula a través de un circuito de ósmosis inversa cerrado para su renovación constante. Así, el agua se incorpora a un primer filtro mecánico (guata), pasa con posterioridad a un filtro químico (carbón activo), luego a otro filtro mecánico (malla) y por último a un filtro biológico, compuesto de bolas biológicas en donde habitan bacterias nitrificantes. Finalmente, y antes de reincorporarse de nuevo al sistema de canalización, pasa por un filtro de luz ultravioleta. Se establece un ciclo de luz y oscuridad de 14 y 10 horas respectivamente. Los animales se alimentan preferentemente con pienso de distinto tamaño de grano, dependiendo de la edad de los mismos, así como de Artemia salina, un crustáceo de pequeño tamaño altamente nutritivo. 1.2. OBTENCIÓN DE HUEVOS DE PEZ CEBRA Para la obtención de huevos de pez cebra para su posterior uso, los peces deben ser estimulados emulando las condiciones de la naturaleza. Para ello y de forma general, la noche anterior los peces se disponen en peceras especiales para la puesta, denominadas parideras, cuyo fondo formado por un entramado rugoso semeja los cantos rodados típicos de su hábitat natural. De esta forma, y como se describe en el apartado 2.2 de la introducción, con el estímulo lumínico de la mañana, comienza el proceso de apareamiento. En los casos en que se requirió la obtención de huevos sincrónicos, es decir, conocer exactamente el momento de ALBA PENSADO LÓPEZ 96 puesta y fecundación, los machos y las hembras se separaron mediante un separador físico, dentro de la misma pecera, que se retiró a primera hora de la mañana, coincidiendo con el estímulo lumínico, entrando machos y hembras en contacto e iniciando la fecundación. Una vez comenzada la puesta y pasados aproximadamente 10 minutos, para asegurar la fecundación, los huevos se recogen. Para ello se filtra en agua de la pecera a través de un colador de tamaño de poro apropiado, de forma que los huevos queden retenidos. Tras ello, se coloca el colador en orientación inversa sobre una placa de Petri y se vierte sobre el mismo agua de ósmosis inversa, lo que hace que los huevos pasen a la placa junto con el agua. 2. GENERACIÓN DE UNA LÍNEA MUTANTE PARA EL GEN AUTS2A MEDIANTE CRISPR/CAS9 La generación de la línea mutante mediante el sistema CRISPR/Cas9 en pez cebra se realizó en colaboración con la Dra. Ana Fernández Miñán, responsable del servicio de Genómica Funcional del Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC – Universidad Pablo Olavide. 2.1. SELECCIÓN DE AUTS2, VALIDACIÓN DE SU ORTÓLOGO EN PEZ CEBRA El gen AUTS2 fue seleccionado para investigar su implicación en TEA por el grupo del Dr. Ángel Carracedo Álvarez de la Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica, tras encontrar de forma recurrente mediante análisis genómicos y exómicos, mutaciones de diversa naturaleza en individuos con perfiles sintomáticos concordantes con TEA (Comunicación personal). Para el desarrollo de la línea mutante en pez cebra se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos; que existiese un ortólogo en humanos, con homología de al menos un 40% y que los parálogos de pez cebra tuviesen menos de un 60% de homología entre ellos. Para la determinación de la existencia de un ortólogo de AUTS2 en pez cebra así como la existencia de parálogos se consultaron las bases de datos ENSEMBL202 y ZFIN217, mientras que para determinar la homología nucleotídica y aminoacídica de las principales isoformas se utilizaron las herramientas Nucleotide BLAST y Protein BLAST218, respectivamente. 2.2. DISEÑO Y SÍNTESIS DE LOS ARNsg Para el diseño de los ARNsg se utilizó la herramienta CRISPRscan219. Para su selección se priorizó la puntuación que el programa les asigna basándose en la especificidad de los mismos a la región diana del genoma (que debe contener una región PAM) y en la posibilidad de uniones inespecíficas. Asimismo, se priorizaron aquellos ARNsg dirigidos a exones cuya secuencia aminoacídica presente el mayor índice de homología con los humanos, siendo en este caso el exón 9 de la principal isoforma (ENSDART00000129369.3) (Figura 12), pero teniendo en cuenta que deben presentar complementariedad con todas las isoformas. Material y métodos 97 Figura 12. Análisis del exón 9 de pez zebra. a) Secuencia nucleotídica del exón 9 de la isoforma principal de pez cebra (ENSDARE00001012383; 27,195,284-27,195,046; b) Comparación de la secuencia aminoacídica resultante de la transcripción entre humano y pez cebra. Una vez se seleccionó el ARNsg óptimo de 20 pb añadió a al extremo 5´ del mismo la secuencia de reconocimiento para la enzima de transcripción correspondiente, en este caso, polimerasa T7, de 17 pb y al extremo 3´se añadió una secuencia de 15 pb complementaria al llamado cebador o primer universal169, que permite amplificar el ARNsg y conferir al mismo un extremo 3´ constante. La secuencia del mismo, en dirección 5´ 3´ es la siguiente: AAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC TATttctagctctaaaac. Asimismo, una vez se estableció la región a la que se dirigiría el ARNsg, se diseñaron los cebadores directo e reverso (forward y reverse) para la secuenciación, mediante la herramienta Primer BLAST218, siendo las secuencias CGGCAGGAATTAAACACTCG y GCACACATGGAAATCAAATGC, respectivamente, delimitando un amplicón de 557 pb. Todos los cebadores utilizados en la presente tesis se pidieron a la casa comercial Sigma. 2.2.1. PCR El primer paso en la síntesis de los ARNsg fue la amplificación del fragmento mediante PCR con el kit iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad). Para cada reacción se usaron 5 µl de tampón HF 5X, 1,25 µl de dNTPs 2 mM, 1 µl de ARNsg 10 µM, 1 µl de cebador universal 10 µM, 0,25 µl de Taq poli PROOF 2 U/µl y 16,5 µl de agua Milli-Q. Para la reacción de termociclado, se estableció una fase de desnaturalización inicial a 98ºC durante 3 minutos, 30 ciclos de desnaturalización de 30 segundos a 98ºC, hibridación de 30 segundos a 45ºC y elongación de 20 segundos a 72ºC, y una fase de elongación final de 5 minutos a 72ºC. Todos los procesos de termociclado descritos en la presente tesis se realizaron, indistintamente, en los termocicladores Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) o Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems), a no ser que se indique lo contrario. a) Secuencia nucleotídica del exón 9 de auts2a en pez cebra AACAAGACATTCTCCGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCC CCTCCATACTTGCGGACTGAGTTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACAC CAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCACGCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAAT b)Secuencia animoacídica del exón 9 de pez cebra frente a la secuencia de humano Humano 1 QDILRQELNTRFLASQSADRGASLGPPPYLRTEFHQHQHQ ---- HQHTHQHTHQHTFTPF 56 Pez cebra 1 QDILRQELNTRFLASQSADRGASLGPPPYLRTEFHQHQHQHQHTHQHTHQHTHQHTFTPF 60 Humano 57 PHAIPPTAIMPTPAPPM ------- 73 Pez cebra 61 PH----- AIMPTPAPPMVRTPARN 79 ALBA PENSADO LÓPEZ 98 2.2.2. Electroforesis en gel de agarosa La comprobación de la correcta amplificación de los ARNsg se realizó mediante análisis en gel de agarosa (iNtRON Biotechnology) al 1% en tampón Tris-Acetato-EDTA 0,5% (TAE, Invitrogen) y con tinción de SYBR® Safe DNA Gel Stain 10000X (Invitrogen). Para la preparación de las muestras se añadió azul de bromofenol 10% al producto de amplificación y para preparar el marcador de peso molecular se añadió azul de bromofenol y agua Milli-Q al estándar de tamaño GeneRuler-100bp 1 µg/µl (ThermoFisher). Los geles se corrieron en cubetas horizontales con TAE 0,5X a 100-120 voltios (V). Los resultados se visualizaron mediante en un transiluminador y fotografiaron con una cámara conectada al programa informático Kodak Digital Science 1D. 2.2.3. Purificación de la reacción de PCR Tras comprobar que la reacción de amplificación se realizó con éxito, dicha reacción se purificó con el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), siguiendo las indicaciones del proveedor. Para asegurar que en la purificación no se produjo pérdida de material, el producto se comprobó de nuevo en gel de agarosa siguiendo los pasos descritos en el anterior apartado. 2.2.4. Transcripción in vitro y purificación Para la transcripción del producto de PCR a ARN se utilizó el kit MAXIscript T7 Transcription (Invitrogen), añadiendo 3 µl de agua Milli-Q, 3 µl de producto de PCR, 1 µl de tampón de transcripción 10X, 1 µl de mezcla de enzimas 15 U/µl y 0,5 µl de cada uno de los ribonucleótidos 10 mM (rATP, rGTP, rCTP y rUTP). Las muestras se incubaron a 37ºC durante toda la noche (ON, del inglés overnight). Tras dicha incubación se añadieron 1,5 µl de DNasa Turbo 2 U/µl para eliminar restos de ADN, y se incubó a 37ºC durante 30 minutos más. Al finalizar la incubación con la DNasa el producto de transcripción se purificó añadiendo 2 μl de EDTA 0,5 M para parar la reacción, 5 μl de cloruro de litio (LiCl) 5 M para eliminar ribonucleótidos libres y 150 μl etanol (EtOH, Sigma) 100% frío y se precipitó a -80ºC durante 3 horas y 45 minutos. Tras ello, las muestras se centrifugaron 30 minutos a 13.000 revoluciones por minuto (rpm), se lavaron dos veces con 200 μl de EtOH 70% durante 20 minutos, y finalmente se resuspendieron en 15 μl de agua libre de nucleasas. Como se describe anteriormente, la verificación de que la purificación no dio lugar a la pérdida de material se realizó mediante comprobación en gel de agarosa y la cuantificación de la concentración de las muestras se realizó en el espectofotómetro NanoDrop-1000 (ThermoFisher). 2.3. INYECCIÓN DE LOS ARNsg EN EL ESTADÍO DE UNA CÉLULA DEL EMBRIÓN DE PEZ CEBRA La inyección de los ARNsg se realizó en huevos de pez cebra recién fertilizados, para cuya obtención los machos y hembras se separaron la noche anterior tal y como se describe en Material y métodos 99 el apartado 1.2. La mezcla de inyección se preparó con 1 µl del ARNsg a 160 ng/µl, 1µl de Cas9 1,2 μg/μl y 0,4 µl de rojo fenol, un colorante inocuo para los embriones, para así poder visualizar la correcta introducción en el huevo. La mezcla se cargó en agujas de microinyección de diámetro externo de 1 mm y microfilamento interno de 0.58 mm (A-M Systems), que a su vez se colocaron en un micromanipulador conectado al microinyector Narishige IM-31, al que se le proporciono presión mediante una bomba de nitrógeno. En cuando a los parámetros de inyección, la presión de balance se mantuvo en torno a 2,5-3 kilo Pascales (kPa), la presión de inyección a aproximadamente 30 kPa y el volumen inyectado fue de 1-3 nanolitros (nl) por cada huevo. Tras las inyecciones, los individuos (generación F0) se pasaron a placas de Petri de 90x15 mm con agua de ósmosis inversa y se mantuvieron a 28,5ºC hasta su análisis a las 48 hpf. Se incubaron asimismo, individuos sin inyectar que sirvieron de control. 2.4. GENOTIPADO DE LOS EMBRIONES DE LA GENERACIÓN F0 2.4.1. Extracción de ADN A las 48 hpf se realizó la extracción de ADN de los embriones, estableciéndose conjuntos de 10 individuos por cada 100 individuos inyectados, así como de los individuos control, mientras que el resto de individuos se mantuvieron para su cría. Para ello, tras aplicarles una sobredosis de anestésico tricaína 0,03% (Sigma), se incluyeron en 125 µl de la resina quelante Chelex®-100 (Bio-Rad) al 10% y se incubaron 15 minutos a 100ºC, tras lo que se añadieron 3,8 µl de Proteinasa K a 20 mg/ml (Roche) y se introdujeron sometieron a una incubación de 1 hora a 56ºC y 15 minutos a 100ºC. Las muestras se conservaron a -20ºC hasta su uso. 2.4.2. PCR, electroforesis en gel de agarosa, purificación y cuantificación La mezcla de reacción se preparó con 8,6 µl de agua Milli-Q, 1,5 µl de tampón 10X, 1,05 µl de cloruro de magnesio (MgCl2) 25 mM, 0,75 µl de desoxirribonucleótidos tri-fosfato (dNTPs) 2 mM, 1 µl de cada cebador, 0,1 µl de Taq polimerasa 5 U/µl y 1 µl de ADN. Las muestras se introdujeron en el termociclador, en el que se estableció una fase de desnaturalización de 10 minutos a 95ºC y una fase de amplificación de 35 ciclos, basada en un paso de desnaturalización de 45 segundos a 94ºC, un paso de hibridación de cebadores de 50 segundos a 60ºC y un paso de elongación de 1 minuto a 72ºC. Finalmente se añadió una fase de elongación final de 10 minutos a 72ºC y enfriamiento a 4ºC. Las muestras se conservaron a -20ºC hasta su uso. La comprobación de la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa, así como la purificación y cuantificación del producto de PCR se realizaron como se describe en el los apartados 2.2.2 y 2.2.3. 2.4.3. Clonación bacteriana Debido a la imposibilidad de aplicar la secuenciación Sanger directamente a las muestras para conocer las potenciales mutaciones producidas debido al solapamiento de electroferogramas de alelos mutantes y salvajes, así como por la presencia de mosaicismo en ALBA PENSADO LÓPEZ 100 los embriones, se procedió a la clonación bacteriana. En este caso, el uso de la polimerasa Taq durante la reacción de PCR produjo extremos protuberantes de adenina en el extremo 3´ del amplicón, lo que es compatible con una clonación de tipo TA. 2.4.3.1. Reacción de ligación El primer paso consistió en ligar el producto de PCR con 50 ng del vector lineal con extremos protuberantes de timina (pCR®2.1, 3900 pb) para lo que previamente se calculó la cantidad de producto de PCR necesario para mantener una relación apropiada entre el inserto y vector (Ecuación 1), resultando en una cantidad de 21,42 ng. Para las reacciones de ligación se mezclaron 2 µl de vector pCR®2.1 a 25 ng/µl, 1 µl de tampón de reacción de T4 ADN ligasa 10X (NEB), 0,83 µl de T4 ADN ligasa 400.000 U/ml (NEB), 5,17 µl de agua libre de nucleasas y 1 µl de inserto a 21,42 ng/µl. Se incluyó un control negativo de la reacción, en el que se añadió agua en lugar del inserto y un control positivo, en el que se utilizó como inserto un ADN control proporcionado por el kit The Original TA Cloning (Invitrogen). Las reacciones se incubaron a 10 minutos a temperatura ambiente (RT, del inglés Room Temperature) y tras ello, 10 minutos a 65ºC para inactivar la ligasa. Las muestras se conservaron a -20ºC hasta su uso. Ecuación 1. Fórmula empleada para el cálculo de la cantidad de inserto necesario ⌊( ) ( ) ⌋ 2.4.3.2. Transformación bacteriana Para la inserción del vector con el inserto se utilizaron bacterias competentes comerciales (Escherichia coli NEB®5-α competentes de alta eficiencia). Se mezclaron 25 µl de células competentes con 2 µl de producto de ligación y se incubaron en hielo durante 30 minutos, tras lo que se aplicó un choque térmico de 30 segundos a 42ºC. Las muestras se pasaron a hielo durante 5 minutos y a continuación se añadieron 250 µl de medio líquido de crecimiento SOC (NEB) y se mantuvieron 1 hora 37ºC con agitación constante para estimular la multiplicación bacteriana. Las muestras se centrifugaron 3 minutos a 3.000 rpm y se retiró el sobrenadante, excepto 75 µl, en los que se resuspendió el sedimento de bacterias. Las bacterias se sembraron en placas de medio LB agar con ampicilina 100 µg/ml, X-Gal 80 µg/ml e IPTG 0,3 mM y se incubaron a 37ºC ON. Las bacterias transformadas son resistentes a ampicilina, pues el vector contiene un gen de resistencia, y asimismo, presentaran coloración blanca por la disrupción del gen lacZ. 2.4.3.3. PCR de colonias y electroforesis en gel de agarosa Una vez se seleccionaron las colonias de coloración blanca, cada una de ellas se recogió de la placa con ayuda de una punta blanca de micropipeta y se diluyó en 10 µl de Material y métodos 101 agua Milli-Q. De estas diluciones se utilizó 1 µl para la reacción de PCR, que se estableció y posteriormente se analizó tal y como se describe en el apartado 2.4.2. 2.4.4. Secuenciación Sanger o dideoxi 2.4.4.1. Purificación de los productos de PCR Los productos de PCR fueron sometidos a una purificación enzimática basada en la exonucleasa I y la fosfatasa alcalina de gamba (SAP, del inglés Shrimp Alkaline Phosphatase). Para ello, 10 µl de los productos de amplificación se trataron con 0,03 µl de la exonucleasa I 20 U/µl (ThermoFisher), 0,3 µl de SAP 1 U/µl (Sigma) y 1,67 µl de agua MilliQ, y se incubaron a 60ºC durante 1 hora y a 85ºC durante 15 minutos. 2.4.4.2. Reacción de secuenciación Para la secuenciación de los productos purificados se utilizó el kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y placas de 96 pocillos (4titude). Por cada reacción se utilizaron 2 µl de tampón 5X, 0,5 µl de mezcla de reacción BDT, 1 µl de cada cebador, 2 µl de producto de PCR y 4,5 µl de agua Milli-Q. Las muestras se incubaron 1 minuto a 96ºC, tras lo que se sometieron a 25 ciclos de desnaturalización de 10 segundos a 96ºC, hibridación de 5 segundos a 50ºC y elongación de 4 minutos a 60ºC. 2.4.4.3. Purificación de la reacción de secuenciación Las reacciones se secuenciación se purificaron mediante lavados con 10 µl de agua Milli-Q, 5 µl de EDTA 125 mM y 60 µl de EtOH 100% e incubaron 15 minutos a RT en oscuridad. Tras ello se centrifugaron 30 segundos a 4.000 rpm, el sobrenadante se descartó y se centrifugó de nuevo 1 minuto a 1.300 rpm. Se añadieron 60 µl de EtOH 70%, se centrifugó 15 minutos a 1.300 rpm, se descartó de nuevo el sobrenadante y se centrifugó una última vez 1 minuto a 1.300 rpm. 2.4.4.4. Secuenciación Para el proceso de secuenciación se añadieron 10 µl de formamida (Applied Biosystems) a cada una de las muestras y se introdujeron en el secuenciador de 96 capilares ABI Prism 3730 GeneticAnalyzer (Applied Biosystems). Los datos de las secuencias obtenidas se analizaron mediante el software CodonCode Aligner. Para determinar in silico las consecuencias a nivel proteico de las mutaciones encontradas se utilizó el recurso ExPASyTranslate Tool220,221, que entre otras cosas, permite identificar la introducción de codones prematuros de parada de la traducción (PSC, del inglés, Premature Stop Codons). Confirmada la presencia de mutaciones en los embriones de la F0 analizados, los individuos restantes fueron criados hasta la edad adulta. A pesar de que para la caracterización genotípica de la generación F0 de auts2a se desarrolló la metodología descrita, en nuestro laboratorio, y por sugerencia del Dr. Miguel González Blanco (Grupo de Reparación del ADN e Integridad Genómica, CiMUS, Santiago ALBA PENSADO LÓPEZ 102 de Compostela), se comprobó que la presencia de mutaciones en los embriones puede determinarse a través de la detección de heterodúplex mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Es una estrategia rápida, sencilla y de muy bajo coste en comparación con la clonación, que aunque no permite determinar el tipo de mutación a nivel de secuencia, sí confirma que se han producido cortes en el ADN. Así, es perfectamente válida para continuar con la cría de los embriones en caso de detectar heterodúplex, ya que independientemente de que se conozca o no el tipo de mutación producida a nivel de secuencia, éstas pueden no afectar a la línea germinal y por tanto no transmitirse a la descendencia y, en caso de transmitirse, no necesariamente son del mismo tipo en la generación F1. El procedimiento para los geles de poliacrilamida y detección de heterodúplex se detalla posteriormente en el apartado 2.6.1. Un ejemplo del análisis de la F0 de CRISPR/Cas9 para otro gen desarrollado en nuestro laboratorio en donde se observa una única banda para los controles y diversos heterodúplex para los embriones inyectados se muestra en la Figura 13. Figura 13. Ejemplo de análisis de heterodúplex mediante gel de poliacrilamida para embriones de la F0.Una única banda para los controles (carriles 2-5); heterodúplex para los individuos inyectados (carriles 6-9). Marcador de peso molecular de 100 pb. 2.5. OBTENCIÓN Y GENOTIPADO DE EMBRIONES DE LA GENERACIÓN F1 Tras haber confirmado la presencia de mutaciones en los embriones de la F0, los embriones restantes se criaron hasta la edad adulta, momento en el que se cruzó cada individuo de la F0 con un individuo WT para la obtención de la generación F1. Para el genotipado de los embriones de la F1 se hicieron conjuntos de embriones de cada una de las parejas y se siguieron los mismos pasos de extracción de ADN, PCR, comprobación en gel de agarosa, purificación, cuantificación, clonación bacteriana y secuenciación Sanger, descritos en el apartado 2.4. De forma semejante a lo descrito anteriormente, aunque para la línea mutante CRISPR/Cas9 de auts2a no se realizó, en nuestro laboratorio también se determinó que un primer cribado de los adultos de la F0 se puede llevar a cabo mediante detección de Material y métodos 103 heterodúplex en gel de poliacrilamida. De esta forma pueden descartarse adultos en que la ausencia de heterodúplex indica que no portan mutación alguna en el gen, por lo que ya no se establecen cruces con WT y no se analizan los embriones de la F1, lo que supone un incremento de eficiencia a nivel de tiempo y costes. Un ejemplo del análisis de los adultos de la F0 para otro gen, en donde se observa una banda para individuos que no portan mutación y varias bandas de heterodúplex para aquellos que sí portan mutación, se muestra en la Figura 14. Figura 14. Ejemplo de análisis de heterodúplex mediante gel de poliacrilamida para adultos de la F0. El asterisco (*) marca individuos con presencia de heterodúplex. Marcador de peso molecular de 100 pb. 2.6. GENOTIPADO DE LOS ADULTOS DE LA GENERACIÓN F1 Confirmadas las mutaciones en los embriones de la generación F1, éstos se criaron hasta la edad adulta, momento en el que se genotiparon para determinar de forma individual si portaban o no mutación en heterocigosis en el gen auts2a, y en su caso, caracterizar el tipo de mutación. 2.6.1. Análisis de heterodúplex mediante electroforesis en gel de poliacrilamida Como se menciona con anterioridad, para reducir costes e incrementar la eficiencia en términos de tiempo de trabajo, un primer cribado para el genotipado de los adultos de la F1 se llevó a cabo mediante la detección de heterodúplex en gel de poliacrilamida. 2.6.1.1. Extracción de ADN, PCR y gel de agarosa La obtención de ADN de los adultos de la F1 se realizó mediante el procedimiento de corte de aleta. Para ello, los individuos fueron anestesiados con tricaína 0,003%, tras lo que, con ayuda de unas pinzas y un bisturí, se seccionó una pequeña porción de la aleta caudal, que fue introducida en 125 µl de Chelex®-100 10% y se siguieron los pasos descritos en el apartado 2.4.1. Tras ello, se realizó la reacción de PCR y su comprobación en gel de agarosa como se describe en el apartado 2.4.2, aunque en este punto se comenzó a emplear ALBA PENSADO LÓPEZ 110 ordenador conectado al equipo de qPCR. El análisis de los datos obtenidos para cuantificar la expresión relativa de auts2a en los tres grupos de individuos con respecto a los dos genes normalizadores se realizó mediante el método de doble-delta Ct (ΔΔCt) en el programa Microsoft Excel y el análisis estadístico para determinar la significación, establecida en p< 0,05 se llevó a cabo mediante la prueba T de Student en del programa SPSS Statistics (IBM). En este punto, se continuó el análisis únicamente con individuos homocigotos y se estableció el gen actb2 como normalizador. 3.1.4.2. Rectas de calibrado Para incrementar la fiabilidad de los resultados se procedió a realizar rectas de calibrado para los cebadores de auts2a y actb2. Para ello, se establecieron las reacciones de qPCR tal y como se describe en el apartado anterior pero usando ADNc de WT a 5 concentraciones decrecientes (diluciones 1/10), más un control con agua Milli-Q, por triplicado. Los resultados se analizaron en el programa Microsoft Excel, de forma que se calculó la eficiencia de los mismos así como el coeficiente de regresión lineal (R2) a partir de la ecuación de regresión lineal. Las fórmulas utilizadas para dichos cálculos se muestran en la Ecuación 2. Ecuación 2. Fórmulas empleadas para el cálculo de la eficiencia de las parejas de cebadores. a) Fórmula de regresión lineal, siendo m la pendiente de la línea, x la variable independiente y b la ordenada al origen ; b) fórmula de cálculo de la eficiencia; c) fórmula de cálculo del porcentaje de eficiencia. a) b) c) 3.2. HIBRIDACIÓN IN SITU PARA EL GEN AUTS2A Con el fin de determinar la localización corporal en que se expresa el gen auts2a así como para evaluar la disminución en los niveles de ARNm en individuos homocigotos se desarrolló la metodología de HIS. 3.2.1. Síntesis y purificación de la ribosonda antisentido de ARN Para sintetizar la sonda antisentido de ARN para el gen auts2a el primer paso consistió en el diseño de cebadores mediante el programa Primer BLAST218, tras lo que se añadió una secuencia promotora de la enzima polimerasa T7 de 30 pb al extremo 5´ del cebador reverse para su posterior transcripción. La secuencia de los cebadores, que delimitan un amplicón de 426 pb (396 + 30) en dirección 5´ 3´ es la que sigue: Forward: CAGAGTGTTGGGTCCGTGA Reverse: taagctttaatacgactcactatagggagaGGGCCATCCATTTCACCAGA A continuación, se realizó una reacción de PCR con la pareja de cebadores con y sin la secuencia de reconocimiento de la T7 como se describe en el apartado 3.1.4, pero con una Material y métodos 111 concentración de ADNc de 50 ng/µl y volumen final de 50 µl. La correcta amplificación y ausencia de bandas inespecíficas se comprobaron en gel de agarosa. Los productos de amplificación fueron purificados mediante el protocolo de fenol-cloroformo y EtOH, según lo descrito en el apartado 3.1.2 y su concentración se midió con el espectrofotómetro. 3.2.2. Transcripción in vitro y purificación de la ribosonda antisentido Para la transcripción de los productos de PCR y su conversión en ARN se hicieron reacciones con 10 µl de tampón de transcripción 5X (Promega), 5 µl de DTT 50 mM (Promega), 5 µl de DIG RNA Labelling Mix (Sigma), 1 µl de RNase Out (Invitrogen), 2,5 µl de T7 polimerasa (Promega), 1 µg de producto de PCR y agua Milli-Q hasta alcanzar un volumen de 50 µl. Las muestras se incubaron 2 horas a 37ºC, se añadió 1 µl de DNasa I y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos más. Las sondas transcritas se purificaron con el kit Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification (Roche), según las indicaciones del proveedor y se cuantificaron en el espectrofotómetro. 3.2.3. HIS Los peces WT y homocigotos se criaron en agua de ósmosis reversa hasta que concluyó la gastrulación, momento en el que se pasaron a una solución de agua de ósmosis reversa con feniltiourea 75 µM (PTU, Sigma) para evitar la formación de pigmentos, hasta las 24 y 48 hpf, momento en el que se sacrificaron e incluyeron en para-formaldehido 4% (PFA, Sigma) y se mantuvieron a 4ºC, ON. Se sometieron a 2 lavados de 5 minutos en PBT, consistente en PBS 1X (Sigma) y Tween-20 0,1% (Sigma) y se deshidrataron en series de 3 minutos de 25% metanol (MeOH, Sigma) / 75% PBT, 50% MeOH / 50% PBT y 75%MeOH / 25%PBT. Se conservaron en MeOH 100% ON a -20ºC, tras lo que se hidrataron con una serie inversa a la descrita y se trataron con proteinasa K 10 µg/ml en PBT entre 4 y 20 minutos. Se realizaron dos lavados de 2 minutos en PBT, una fijación de PFA 4% de 20 minutos y otros cuatro lavados de 5 minutos en PBT con agitación. Para la pre-hibridación se sustituyó el PBT por tampón de hibridación HYB+, compuesto por formamida 50%, SSC 5X (Promega), heparina 50 µg/ml (Sigma), yeast tRNA 0,5 mg/ml (Sigma), Tween-20 0,1% y ácido cítrico 9,2 mM pH 6.0 y las muestras se incubaron durante 3 horas a 70ºC. Pasado este tiempo se añadió la sonda a 1,5 nl/µl disuelta en tapón HYB+ y se incubó ON a 70ºC. Al día siguiente, la sonda de hibridación se retiró y se realizaron lavados de 10 minutos a 70ºC de 25% SSC 2X / 75% HYB- (formamida 65%, SSC 5X y Tween-20 0,1%), 50% SSC 2X / 75% HYB-, 75% SSC 2X / 25% HYBy SSC 2X, seguidos de dos lavados de 30 minutos en SSC 0,05X, un lavado de 5 minutos a RT y con agitación de 50% SSC 0,05X / 50% PBT, y finalmente dos lavados en PBT. Tras ello, las muestras se incubaron 1 hora a RT con agitación en tampón de bloqueo, compuesto por PBT, suero de oveja 2% (Sigma) y albúmina de suero bovino 2 mg/ml (BSA, Sigma). A continuación, se incubaron 2 horas a RT en el anticuerpo antidigoxigenina de oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) disuelto a 1:2000 en tampón de bloqueo, y se realizaron seis lavados de 10 minutos a RT y con agitación en PBT, para luego conservar las muestras a 4ºC, ON. Se realizaron con posterioridad 3 lavados de 10 ALBA PENSADO LÓPEZ 112 minutos con el tampón NTMT, compuesto por Tris-HCl 100 mM pH 9.5, MgCl2 50 mM, NaCl 50 mM y Tween-20 0,1% y el revelado se realizó en oscuridad con la solución BMPurple (Sigma). Una vez alcanzada la señal colorimétrica deseada, las muestras se lavaron 4 veces durante 5 minutos en PBT y se conservaron finalmente en PFA 4% a RT hasta la toma de imágenes. 3.3. WESTERN BLOT 3.3.1. Extracción y cuantificación de proteínas Para la extracción de proteínas de los embriones WT y mutantes homocigotos de 48 hpf, éstos se sacrificaron con sobredosis de tricaína e introdujeron en 3 grupos de 10 individuos en tubos de 1,5 ml. Sobre ellos se añadieron 200 µl de solución de disociación celular, compuesta por media tableta del cóctel de inhibidores de proteasas cOmplete™ Mini (Roche) disuelta en 2,5 ml de PBS 1X, y se disgregó el tejido suavemente. A continuación, las muestras se centrifugaron a 2.000 rpm durante 2 minutos, se retiró el sobrenadante, se añadieron 200 µl más de solución de disociación y se repitió el paso de centrifugado y retirado del sobrenadante. Al sedimento se añadieron 20 µl de SDS 2XDTT 1 mM y se resuspendió. Para cuantificar las proteínas extraídas se utilizó el kit DC Protein Assay Reagents Package (Bio-Rad), una adaptación del método de Bradford, siguiendo las indicaciones del proveedor. Las absorbancias se midieron en el aparato EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer), y las concentraciones se calcularon en base a una recta patrón de BSA, según la fórmula Y = 0.1263x + 0.057, siendo Y la absorbancia y x la concentración en µg/µl. 3.3.2. Electroforesis Para realizar la electroforesis, se prepararon muestras a 30 µg, a las que se añadieron 6,7 µl del tampón de carga 4X Bolt™ LDS Sample Buffer (Invitrogen) y agua Milli-Q hasta completar un volumen de 20 µl, y se incubaron 5 minutos a 95ºC. Se utilizaron los geles comerciales de poliacrilamida desnaturalizante Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gels (Invitrogen) y como marcador de peso molecular se usó el Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-Rad). La electroforesis se llevó a cabo con tampón MES 1X (Invitrogen) en cubetas verticales a 167 V durante 25-30 minutos. 3.3.3. Transferencia, lavado y bloqueo de la membrana Las proteínas separadas en la electroforesis se transfirieron a la membrana ImmunoBlot PVDF Membranes for protein blotting (Bio-Rad), previamente activada al sumergirla 1 minuto en MeOH y empapada en tampón de transferencia, compuesto por Tris 25 nM, glicina 192 nM y MeOH 20%. La transferencia se efectuó en el equipo Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-rad) a 15 V durante 90 minutos. Una vez transcurrido ese tiempo la membrana se lavó dos veces en agitación durante 5 minutos en TBS 1X (Sigma)- Tween-20 0,1% (TTBS 1X) y se bloqueó en BSA 5% en TTBS 1X durante 90 minutos en agitación. Material y métodos 113 3.3.4. Incubación con anticuerpos y revelado Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-Auts2a (GeneTex) y anti-Actb2 (Invitrogen) como normalizador, ambos de conejo y en concentraciones de 1:1000 y 1:1500 respectivamente. Para ello, la membrana se cortó en dos pedazos, cada uno de los cuales contenía la proteína esperada y estas dos porciones se incubaron ON a 4ºC en agitación con el anticuerpo primario correspondiente, tras lo que se incubaron con el anticuerpo secundario anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell Signaling Technology) con dilución 1:2500, durante 1 hora a RT con agitación. Tras 4 lavados con TTBS 1X de 5 minutos cada uno, se añadió el sustrato comercial ECL Prime WB detection reagent (GE Healthcare) para la inmunodetección basada en quimioluminiscencia por exposición y revelado de la película autorradiográfica Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare). 4. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LOS MUTANTES DE AUTS2A 4.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LOS EMBRIONES 4.1.1. Análisis morfológico Para la caracterización fenotípica de los embriones se utilizaron las fotografías tomadas a las 48 hpf de los embriones homocigotos de la generación F2, así como de individuos homocigotos de la F3. Como control se utilizaron embriones WT de 48 hpf de puestas independientes. Las medidas de los individuos se tomaron directamente en el programa NIS-Elements (versión 4.13.04) y fueron las siguientes: - Diámetro de la cabeza, trazando una línea por la parte media de la región de los arcos branquiales y pasando por la parte del otolito más cercana al ojo y trazando su paralela en el extremo anterior de la cabeza. - Diámetro del ojo, trazando una perpendicular a la línea que delimita el diámetro de la cabeza y determinando su paralela. - Longitud total del cuerpo, mediante el trazado de una línea recta entre la región anterior de la cabeza, coincidiendo con la unión entre el cerebro anterior y medio hasta el extremo posterior del cuerpo, coincidiendo con el final de la aleta caudal. - Longitud de la aleta caudal, por trazado de una línea recta. - Longitud del cuerpo sin aleta caudal, resultante de la resta de la longitud de la aleta caudal a la longitud total del cuerpo. Una vez realizadas las medidas, se calcularon las ratios cabeza/ cuerpo y ojo/cabeza y los datos fueron analizados en el SPSS Statistics, en donde se realizó el estadístico de Levene, para evaluar la homogeneidad de varianzas, el estadístico de Kolmogorov – Smirnov, para determinar la distribución de los caracteres, y finalmente la prueba U de Mann-Whitney para determinar la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre individuos WT y homocigotos para las diferentes medidas tomadas. La significación se estableció en p< 0,05. ALBA PENSADO LÓPEZ 114 4.1.2. Tinción de cartílago El estudio de la morfología del cartílago de la región mandibular de los individuos se realizó mediante el protocolo de tinción con azul alcián. Para ello, los individuos WT y los homocigotos se criaron hasta la edad de 5 dpf, momento en que las estructuras cartilaginosas son fácilmente identificables. Llegado este punto, los embriones se sacrificaron y se fijaron ON en PFA 4%, tras lo que se lavaron tres veces durante 2 minutos en PBS 1X. A continuación, se incubaron ON en un preparado de Alcian Blue 0,1 mg/ml (Sigma) en EtOH y ácido acético glacial (Panreac) en proporción 8:2, previamente filtrado a través de un filtro para jeringuillas de 0,22 µm (Sigma). Para eliminar la pigmentación de los individuos, se trataron con hidróxido de potasio 1% (KOH, Panreac) en peróxido de hidrógeno 0,6% (H2O2, Sigma) durante 2 horas, tras lo que se lavaron dos veces durante 5 minutos en PBS 1X y se incluyeron en glicerol 99% (Sigma) a través de una serie ascendente de KOH 0,5% / glicerol 99% (9:1,7:3, 5:5, 3:7, 1:9). En este punto se fotografiaron y se tomaron medidas de la longitud del palatocuadrado, así como del ángulo ceratohial. Asimismo, se tomaron medidas de la longitud y el diámetro de la cabeza. Tras evaluar la homogeneidad de varianzas mediante el estadístico de Levene y la distribución de caracteres mediante el estadístico de Kolmogorov – Smirnov, los datos fueron analizados en el SPSS Statistics mediante la prueba T de Student para determinar la existencia de diferencias significativas entre los individuos WT y los homocigotos. La significación se estableció en p< 0,05. 4.1.3. Determinación de apoptosis 4.1.3.1. Naranja de acridina La evaluación de las diferencias en los niveles de apoptosis entre los individuos WT y los homocigotos mutantes se realizó mediante tinción con naranja de acridina. Para ello, los individuos de 24 hpf fueron incubados en oscuridad en una solución de naranja de acridina 3 µg/ml (Sigma) durante 20 minutos. Tras ello se realizaron dos lavados de 1 minuto con PBS 1X, los embriones se anestesiaron con tricaína y se fotografiaron. 4.1.3.2. Análisis de la expresión de p53 Se evaluó mediante qPCR la de expresión de p53, un importante inductor de la apoptosis, en la región cefálica de los embriones WT y homocigotos mutantes a las 48 hpf. Para ello, los individuos se sacrificaron y se cortaron con ayuda de bisturí, conservándose las cabezas en RNAlater hasta su uso. La extracción de ARN, purificación, retrotranscripción, diseño y validación de cebadores, así como la reacción de la qPCR y su análisis se llevó a cabo tal y como se describe en los apartados 3.1.1 - 3.1.4. Las secuencias de los cebadores forward y reverse son, en dirección 5´ 3´, CCCCGGATGGAGATAACTTGG y GCACAGTTGTCCATTCAGCA, respectivamente, delimitando un amplicon de 153 pb. Material y métodos 115 4.1.4. Hibridación in situ de pax2a, emx1 y aldoca Se seleccionaron los siguientes genes para su detección y análisis mediante HIS:  pax2a, Paired box 2a, (ENSDARG00000028148, ENSDART00000160921.2). Marcador de la unión entre el cerebro medio y el cerebro posterior (MHB, del inglés, midbrain-hindbrain boundary).  emx1, Empty spiracles homeobox 1, (ENSDARG00000039569, ENSDART00000057810.6). Marcador de telencéfalo.  aldoca, Aldolase C, fructose-bisphosphate a, (ENSDARG00000057661, ENSDART00000080377.7) Marcador de cerebro, principalmente de la región cerebelar. La síntesis de las sondas de ARN para estos genes se realizó de igual forma que se describe en los apartados 3.2.1 y 3.2.2. En este caso, las secuencias de los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 8. Tabla 8. Secuencias en dirección 5´ 3´de los cebadores utilizados y tamaño de amplicón Gen Forward Reverse Tamaño de amplicón (pb) pax2a ACGACTGGCTCAGTACCAAA taagctttaatacgactcactatagggaga GGGGGAGATGGATTGTTTTCCT 393 (363 + 30) emx1 TTCTTTGGCACGCAACATCG taagctttaatacgactcactatagggaga CTCCAGCTTCTGCCGCTTAT 351 (321 + 30) aldoca CCGTCTGAGTCCTTCAGTCTTG taagctttaatacgactcactatagggaga GGACGCCATCATCCGAGTTC 347 (317 + 30) El protocolo de HIS se realizó siguiendo los pasos descritos en el apartado 3.2.3, aunque únicamente para la sonda de aldoca debido a la falta de un número suficiente de individuos homocigotos mutantes. 4.2. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LOS ADULTOS 4.2.1. Longitud y peso de los adultos Los adultos de pez cebra WT y homocigotos mutantes de un año de edad se anestesiaron con tricaína 0,003% y la longitud total del cuerpo se midió con ayuda de una regla graduada. Asimismo, el peso de los individuos se midió en la báscula de precisión Explorer (Ohaus). Tras evaluar la homogeneidad de varianzas y la distribución normal, los datos fueron analizados en el SPSS Statistics mediante la prueba T de Student para determinar la existencia de diferencias significativas entre los individuos WT y los homocigotos. La significación se estableció en p< 0,05. ALBA PENSADO LÓPEZ 116 5. ANÁLISIS DE LOCOMOCIÓN DE LOS EMBRIONES MUTANTES DE AUTS2A Para estudiar posibles diferencias en la locomoción general de los individuos, se seleccionaron 48 individuos homocigotos mutantes y 48 individuos WT de 7 dpf. Esta etapa del desarrollo fue seleccionada debido a que a edades anteriores las larvas tienden a presentar movimientos de tipo explosivo, mientras que a partir de los 6-7 dpf ya presentan un nado y deslizamiento normalizado. En etapas posteriores, coincidiendo con la reabsorción completa del corión, es necesario alimentar a los animales, por lo que su movimiento normal puede verse alterado por la búsqueda de alimento. Las larvas se analizaron en el dispositivo Zebrabox con el software Zebralab de Viewpoint Life Sciences, y para el rastreo automatizado de cada uno de los movimientos de cada uno de los peces se estableció un programa de análisis de 60 minutos con tres ciclos intermitentes de luz y oscuridad, cada uno de ellos con una duración de 10 minutos. Los datos obtenidos se convirtieron a formato Microsoft Excel y se realizó el estadístico de Levene, para evaluar la homogeneidad de varianzas, el estadístico de Kolmogorov – Smirnov, para determinar la distribución de los caracteres, y finalmente la prueba U de Mann-Whitney en el programa SPSS Statistics. La significación se estableció en p< 0,05. 6. ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICO DE LOS MUTANTES DE AUTS2A Con objeto de determinar posibles diferencias transcripcionales en diversos genes entre los individuos WT y los homocigotos mutantes, y así poder dar una explicación a nivel transcripcional de la fisiopatología de los TEA, se realizaron análisis por qPCR. 6.1. SELECCIÓN DE GENES DE INTERÉS Se seleccionaron un total de 29 genes en base a su potencial relación con AUTS2/ auts2a y también genes marcadores de diversas estructuras cerebrales o de determinados procesos biológicos. Se comprobó en la base de datos de ENSEMBL202 que todos los genes en humanos contaran con un ortólogo de elevada homología en pez cebra, y que todos ellos se expresaran en el momento de desarrollo a evaluar en la base de datos ZFIN217 , siendo en este caso, 48 hpf. 6.1.1. Genes reguladores y regulados por AUTS2 - TBR1/ tbr1b, T-box brain transcription factor 1b, (ENSDARG00000004712, ENSDART00000006612.7). Regula transcripcionalmente al promotor de AUTS2 durante el desarrollo. Interviene en la diferenciación neuronal, por lo que expresa ampliamente en neuronas postmitóticas, y participa en la formación de sinapsis glutamatérgicas excitatorias y en la migración neuronal222. La homología es del 80,92%. - SATB2/ satb2, Special AT-Rich Sequence-Binding Protein 2, SATB Homeobox 2, (ENSDARG00000061885, ENSDART00000088876.4). Regula directamente la Material y métodos 117 expresión de TBR1 e indirectamente a AUTS2. Se ha establecido como marcador de neuronas excitatorias223. La homología es del 65,83%. - RAC1/rac1b, Rac family small GTPase 1b, (ENSDARG00000087954, ENSDART00000130877.3). Es regulado positivamente por AUTS2, y en conjunto participan en la remodelación del citoesqueleto de actina para una adecuada migración neuronal y proyección axonal205. La homología es del 98,44%. 6.1.2. Genes implicados en enfermedades del neurodesarrollo - GTF2IRD1/ gtf2ird1, General Transcription Factor II-I Repeat Domain-Containing Protein 1, (ENSDARG00000022203, ENSDART00000148727.3). Factor de transcripción implicado en el síndrome de Williams, un trastorno del neurodesarrollo con manifestaciones clínicas semejantes a las de TEA224. Se ha relacionado con la señalización serotoninérgica. La homología es del 53,05%. - MECP2/ mecp2, Methyl CpG Binding Protein 2, (ENSDARG00000014218, ENSDART00000123882.4). Factor de transcripción implicado en el síndrome de Rett, un trastorno del neurodesarrollo con manifestaciones clínicas semejantes a las de TEA. Se conoce que reprime transcripcionalmente la expresión de AUTS2 y que interviene en el crecimiento normal de dendritas y axones225. La homología es del 53,41% - SEMA5A/ sema5a, Semaphorin 5a, (ENSDARG00000058821, ENSDART00000164319.2). Gen candidato a TEA, interviene en la formación de un número apropiado de proyecciones axonales durante el desarrollo226. La homología es del 76,53% - ZMAT3/ zmat3, Zinc Finger Matrin-Type 3, (ENSDARG00000080021, ENSDART00000109833.4). Implicado en enfermedades neurodegenerativas, y cuya desregulación provoca disminución en los niveles cerebrales de AUTS2 en modelos de ratón para la enfermedad de Huntington203. La homología es del 62,63%. 6.1.3. Genes implicados en el PRC1 - CK2B/ ck2b, Casein kinase 2, beta polypeptide. (ENSDARG00000077776, ENSDART00000109258.4). Como componente del PRC1 interactúa físicamente con AUTS2. Interviene en la señalización dopaminérgica y tiene un papel fundamental en la oligodendrogénesis a través de la regulación del gen OLIG2227. La homología es del 99,07%. - DCAF7/ dcaf7, ddb1 and cul4 associated factor 7, (ENSDARG00000054355, ENSDART00000058221.7). Interviene en la activación del complejo PRC1 y desarrolla un papel importante en la diferenciación neuronal211. La homología es del 97,95%. - PCGF5/ pcgf5b, Polycomb Group Ring Finger 5b, (ENSDARG00000052388, ENSDART00000086211.7). Como componente del PRC1 interactúa físicamente con ALBA PENSADO LÓPEZ 118 AUTS2. Asimismo, es fundamental para la diferenciación neuronal. La homología es del 78,02%. - RYBP/ rybpa, RING1 and YY1 binding protein a, (ENSDARG00000037773, ENSDART00000055038.4). Como componente del PRC1 interactúa físicamente con AUTS2. Es fundamental para la morfogénesis normal del sistema nervioso y la formación de astrocitos y oligodendrocitos228. La homología es del 69,72%. 6.1.4. Genes implicados en el NSMD - SMG1/ smg1, SMG1 nonsense mediated mRNA decay associated PI3K related kinase, (ENSDARG00000054570, ENSDART00000076796.7)229. La homología es del 73,87% - UPF1/ upf, UPF1 RNA helicase and ATPase, (ENSDARG00000016302, ENSDART00000021011.10)229. La homología es del 95,18%. 6.1.5. Genes marcadores de tipos celulares cerebelares - PTF1A/ ptf1a, Pancreas associated transcription factor 1a, (ENSDARG00000014479, ENSDART00000021987.6). Factor de transcripción necesario para la generación específica de células de Purkinje en el cerebelo, y por tanto de neuronas gabaérgicas. En su ausencia, las neuronas adoptan un fenotipo glutamatérgico230. La homología es del 69,81%. - FAT2/ fat2, FAT atypical cadherin 2, (ENSDARG00000018923, ENSDART00000014149.11). Se expresa casi exclusivamente en el cerebelo, principalmente en las células granulares231. La homología es del 46,41%. - RERE/ rereb, Arginine-glutamic acid dipeptide (RE) repeats b, (ENSDARG00000075670, ENSDART00000111639.4). Interviene en la maduración y migración de las células y Purkinje y en la proliferación de las células granulares232. La homología es de 59,38%. 6.1.6. Genes marcadores específicos de sinapsis glutamatérgicas y gabaérgicas - GAD1/ gad1a, Glutamate decarboxylase 1a, (ENSDARG00000093411, ENSDART00000025332.9). Codifica para la glutamato descarboxilasa, que cataliza la conversión de glutamato en ácido gamma-aminobutírico (GABA), principal responsable de sinapsis gabaérgicas (inhibidoras), comúnmente alteradas en pacientes con TEA233. La homología es del 79,50%. - GRID2/ grid2, Glutamate receptor, ionotropic, delta 2, (ENSDARG00000055302, ENSDART00000141634.3). Se trata de un receptor ionotrópico de glutamato, por lo que interviene en sinapsis glutamatérgicas (excitadoras), comúnmente alteradas en pacientes con TEA. Se encuentra significativamente sobreexpresado en pacientes con síndrome de Down234. La homología es del 81,86%. - VGLUT2/ vglut2.2, Solute carrier family 17 member 6a, (ENSDARG00000001127, ENSDART00000003494.7). Codifica para un transportador vesicular glutamatérgico Material y métodos 119 por lo que interviene de forma directa en las sinapsis glutamatérgicas (excitadoras), comúnmente alteradas en pacientes con TEA235. La homología es del 85,18%. 6.1.7. Genes marcadores de neuroglía: astrocitos, microglía y oligodendrocitos - EMX1/ emx1, Empty spiracles homeobox 1. (ENSDARG00000039569, ENSDART00000057810.6). El linaje de células que expresan este factor de transcripción en el cerebro anterior o telencéfalo, dan lugar a glía y también neuronas excitatorias diversas236. La homología es del 76,19%. - GFAP/ gfap, Glial fibrillary acidic protein, (ENSDARG00000025301, ENSDART00000028270.7). Da lugar a los filamentos intermedios del citoesqueleto de astrocitos y glía, por lo que es un marcador específico de estos tipos celulares. Su expresión se encuentra elevada en pacientes237. La homología es del 65,54%. - NES/ nes, Nestin, (ENSDARG00000088805, ENSDART00000122681.3). Codifica para una proteína de los filamentos intermedios y da lugar a líneas celulares neuronales y de glía, siendo un marcador de diferenciación neuronal238. Se ha propuesto también como marcador de angiogénesis en los pericitos, encontrándose elevado en pacientes con TEA239. La homología es del 77,19%. - OLIG2/ olig2, Oligodendrocyte lineage transcription factor 2, (ENSDARG00000040946, ENSDART00000060006.5). Factor de transcripción expresado en células progenitoras de oligodendrocitos y por tanto responsable de la diferenciación de los mismos, fundamentales para la correcta integridad de las vainas de mielina y la materia blanca240,241. La homología es del 72,16%. 6.1.8. Genes marcadores de pluripotencia - SOX2/sox2, SRY-box transcription factor 2 (ENSDARG00000070913, ENSDART00000104493.5) y c-MYC/ c-myc, MYC proto-oncogene, bHLH transcription factor, (ENSDARG00000045695, ENSDART00000111014.4). Factores de transcripción responsables de mantener la auto-renovación y pluripotencia de células madre neurales, siendo fundamental para un desarrollo neuronal normal242,243. La homología es del 87,30% y 60,64% respectivamente. 6.1.9. Genes implicados en la diferenciación neuronal - ELAVL3/ elavl3, ELAV like neuron-specific RNA binding protein 3, (ENSDARG00000014420, ENSDART00000013717.9). Promueve la diferenciación y maduración neuronal por lo que se considera un marcador de neuronas postmitóticas. Interviene asimismo en el mantenimiento de una estructura axonal correcta244. La homología es del 89,69%. - ISL1/ isl1, ISL LIM homeobox 1, (ENSDARG00000004023 , ENSDART00000010896.6). Factor de transcripción requerido para la diferenciación y supervivencia de distintos tipos neuronales postmitóticos. Su sobreexpresión se ha ALBA PENSADO LÓPEZ 126 ARNsg, la Cas9 y el rojo fenol se inyectó en aproximadamente 200 embriones, mientras que un número equivalente de embriones WT sirvió como control. La mortalidad en ambos grupos fue aproximadamente la misma, lo que indicó que tanto el volumen inyectado, como el proceso de inyección en sí fueron óptimos para la correcta viabilidad de los huevos. Figura 17. Gel de agarosa para ARNsg amplificado y purificado. Marcador de peso molecular de 100 pb. 1.3. GENOTIPADO DE LOS EMBRIONES DE LA GENERACIÓN F0 El análisis de las secuencias resultantes del proceso de extracción de ADN de parte de los embriones inyectados, PCR, clonación bacteriana y finalmente secuenciación, reveló la existencia de: - Alelos portadores de una deleción de 311 pb y una inserción de 9 pb, aunque a nivel exónico se trata de una deleción de 53 pb. - Alelos con una deleción de 307 pb, que suponen la pérdida de 53 pb en el exón. - Alelos con una deleción de 293 pb y una inserción de 2 pb, con pérdida de 50 pb a nivel exónico. - Alelos portadores de una deleción de 1 pb y una inserción de 1 pb. El análisis in silico para predecir el efecto de las mutaciones a nivel proteico indicó que para los tres primeros tipos de mutaciones se introduce un PSC en el exón 9, lo que da lugar a la pérdida de la proteína a partir de este punto. En relación al último tipo de mutación, únicamente se produce el cambio de un aminoácido, lo que no supone consecuencia negativa alguna para la proteína. La secuencia nucleotídica WT delimitada por los cebadores utilizados y las secuencias de los alelos mutantes, así como la secuencia aminoacídica completa WT y de los mutantes se muestran en la Figura 18. a) Secuencia nucleotídica WT del exón 9 CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAGT TCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCACGC CATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactatatat atatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactgcaaa atgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttttgtct gtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagttgttta aaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc Resultados 127 b) Secuencia con deleción de 311 pb e inserción de 9 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccga tttccaccc ctttcatgttgagaaataaggtggatat gcctgagtagttgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc c) Secuencia con deleción de 307 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagt tgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc d) Secuencia con deleción de 293 pb e inserción de 2 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaatt tc aatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagt agttgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc e) Secuencia con deleción de 1 pb e inserción de 1 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GC T CATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactat atatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaact gcaaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagtt ttgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtag ttgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc f) Secuencia aminoacídica completa de individuo WT MDGPRCSGIRKKRKSRSVRNRERISNGIRNNHVRGSVLRFSSDSEKEDGSTNPSSSSRPRPPRRKRKESSSAEEDIIDGFSIAGFMT LEALEKDMTLKPHERRQNQAGPLRKKKPGRVANGLSLDLHKDRLNHSNHQHSDQENNPRLARTHSKKKKKKHLQKKHRPLKPGQNNC KDSDSESVSGESKPSIRSSSRDRLTDCDSESDQEDKGSDASSEKLFSTAAVKVPDFSVDTLSTNASQELRGLGIPKVSGLERSQEKS QETSREISSATPPLVPTSHSKPPLPAPLHLQPPPSSRGLPLPSRPAQIQNPCPERTLRPLSPPIALPQSQGQELSQAPPHPSQHPPE SPSHPKPPRTPSIYHHPPSPALPAQQNPTQPVQHRPPSRCHQRPISAYSGSLTLNGLSSSRSSTPGKPPGPSPAPHLHHHQPAPTGA SASFPLPLSANPTASHTFPPSLPSSTLPHHTNMFASPAALPPPPPLTSNTLPVPGHPAGSAYSEQDILRQELNTRFLASQSADRGAS LGPPPYLRTEFHQHQHQHQHQHQHTHQHTHQHTFTPFPHAIMPTPAPPMVRTPARNFEKYPTKVDPFYRHSLFHSYPPAVSGIPPVI PPTGPFGSLQGAFQPKTSNPLDVAARPGAVPHTLLQKDPRLTDPFRPVLRKPGKWCAMHVHIAWQIYHHQQKVKQQMQVDPHKLDFG LKPEFLSRPPGPTLFGAIHHPHDLARPASLFSAAGSTHPAAAPFGHPPHHPSNFLTPAPHLEPFSRPPSFGGLASLSTAAFGGLGNP ALASNSVFGHKDSPSAQQHFSGPHEPWNRLHRTPPSFPTPPPWLKPGESERSASVSSHERERERDRERERDLDKRDSSVNKDDKERE PVEKRHQNHQSPLPVNPLTLLGHTRPSEPSRNHISSSEPRDKDKDKPKDRERDREHSDWKDSNTDEHKLKENHHSDKDTPVIHDGRV SEDKPANRITASPYMRPGGMDRVNGGLTRDILEKKAEITYEKKNSEVKVKEERKEEQDGPTERSPEQRSTPQAPPPPPPAALHPPSS MPVPMGMASMHPINSISSLERTRMVAPFMGISPIPGAERFPYPAFHWDPMRDPYRGLDIHRRDPLARELLLRNDPLHRLAAPRLYEA ERSYRDREPHDFNRDHPHGLTLEQRREQERAHLEERERLHLLREDYEQGRLHPMHHPVLDGHLPHPGLMAPGLPSMHYPRVSPSSAV AAAAQNGILNKTPPTASLSAPPPLIPTLGARSSSPRRTTPLGPDIRDRPPSHTHKDIEAR g) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a las mutaciones reflejadas en los apartados b, c y d MDGPRCSGIRKKRKSRSVRNRERISNGIRNNHVRGSVLRFSSDSEKEDGSTNPSSSSRPRPPRRKRKESSSAEEDIIDGFSIAGFM TLEALEKDMTLKPHERRQNQAGPLRKKKPGRVANGLSLDLHKDRLNHSNHQHSDQENNPRLARTHSKKKKKKHLQKKHRPLKPGQN NCKDSDSESVSGESKPSIRSSSRDRLTDCDSESDQEDKGSDASSEKLFSTAAVKVPDFSVDTLSTNASQELRGLGIPKVSGLERSQ EKSQETSREISSATPPLVPTSHSKPPLPAPLHLQPPPSSRGLPLPSRPAQIQNPCPERTLRPLSPPIALPQSQGQELSQAPPHPSQ HPPESPSHPKPPRTPSIYHHPPSPALPAQQNPTQPVQHRPPSRCHQRPISAYSGSLTLNGLSSSRSSTPGKPPGPSPAPHLHHHQP ALBA PENSADO LÓPEZ 128 APTGASASFPLPLSANPTASHTFPPSLPSSTLPHHTNMFASPAALPPPPPLTSNTLPVPGHPAGSAYSEQDILRQELNTRFLASQS ADRGASLGPPPYLRTEFHQHQHQHQHQHQHTHQHTHQHTFTPFPHAIMPTPAPPMVRTPARNFEKYPTKVDPFYRHSLFHSYPPAV SGIPPVIPPTGPFGSLQGAFQPKTSNPLDVAARPGAVPHTLLQKDPRLTDPFRPVLRKPGKWCAMHVHIAWQIYHHQQKVKQQMQV DPHKLDFGLKPEFLSRPPGPTLFGAIHHPHDLARPASLFSAAGSTHPAAAPFGHPPHHPSNFLTPAPHLEPFSRPPSFGGLASLST AAFGGLGNPALASNSVFGHKDSPSAQQHFSGPHEPWNRLHRTPPSFPTPPPWLKPGESERSASVSSHERERERDRERERDLDKRDS SVNKDDKEREPVEKRHQNHQSPLPVNPLTLLGHTRPSEPSRNHISSSEPRDKDKDKPKDRERDREHSDWKDSNTDEHKLKENHHSD KDTPVIHDGRVSEDKPANRITASPYMRPGGMDRVNGGLTRDILEKKAEITYEKKNSEVKVKEERKEEQDGPTERSPEQRSTPQAPP PPPPAALHPPSSMPVPMGMASMHPINSISSLERTRMVAPFMGISPIPGAERFPYPAFHWDPMRDPYRGLDIHRRDPLARELLLRND PLHRLAAPRLYEAERSYRDREPHDFNRDHPHGLTLEQRREQERAHLEERERLHLLREDYEQGRLHPMHHPVLDGHLPHPGLMAPGL PSMHYPRVSPSSAVAAAAQNGILNKTPPTASLSAPPPLIPTLGARSSSPRRTTPLGPDIRDRPPSHTHKDIEAR Figura 18. Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas embriones WT y mutantes de la F0. En mayúscula se muestra la secuencia exónica y en minúscula la intrónica. Se marcan en gris los cebadores, en verde la región complementaria al ARNsg, en azul las inserciones y en rojo tachado las deleciones. a) Secuencia nucleotídica WT del exón 9; b) Secuencia con deleción de 311 pb e inserción de 9 pb; c) Secuencia con deleción de 307 pb; d) Secuencia con deleción de 293 pb e inserción de 2 pb; e) Secuencia con deleción de 1 pb e inserción de 1 pb; f) Secuencia aminoacídica completa de individuo WT. En amarillo la secuencia correspondiente al exón 9; g) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a las mutaciones reflejadas en los apartados b,c y d. 1.4. GENOTIPADO DE LOS EMBRIONES DE LA GENERACIÓN F1 Los embriones inyectados de la F0 se crecieron hasta la edad adulta, momento en el que se cruzaron con individuos WT con el fin de obtener la generación F1, en que los embriones se genotiparon para determinar si las mutaciones habían afectado a la línea germinal y de ser así, conocer la naturaleza de las mismas. El análisis de las secuencias resultantes del proceso de genotipado reveló alelos portadores de una deleción de 3 pb, deleción de 5 pb, deleción de 6 pb, deleción de 7 pb y alelos con una inserción de 33 pb y un cambio de base, todas ellas afectando a la región exónica. Debido a la codificación por tripletes de los aminoácidos, las deleciones de 3 y 6 pares de bases únicamente dieron lugar a la eliminación de uno y dos aminoácidos respectivamente, sin afectar a la pauta de lectura. En cuanto a las mutaciones de 5 y 7 pares de bases, ambas dieron lugar a un PSC en el exón 9, provocando la pérdida de la proteína a partir de ese punto. En relación a la mutación consistente en 33 pb de inserción y un cambio de base, ésta provocó la introducción de 11 nuevos aminoácidos, sin afectar al resto de la proteína. La secuencia de los alelos mutantes delimitada por los cebadores utilizados, así como el resultado de los análisis in sílico de los efectos a nivel de proteína se muestran en la Figura 19. Se observó asimismo y como era de esperar, que no todos los peces adultos portaban mutación, o de portarla, ésta no afectaba a la línea germinal, pues en algunos grupos de embriones de la F1 procedentes de la misma pareja no se encontró mutación alguna. a) Secuencia con deleción de 3 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAGT TCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCACGC CATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactatatat atatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactgcaaa atgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttttgtct gtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagttgttta aaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc Resultados 129 b) Secuencia con deleción de 5 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagt tgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc c) Secuencia con deleción de 6 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagt tgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc d) Secuencia con deleción de 7 pb CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC GCCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAGCCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactata tatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatccactttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactg caaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactcatttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttt tgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaattaccgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagt tgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc e) Secuencia con inserción de 33 bp y 1 cambio de base CGGCAGGAATTAAACACTCGTTTCCTGGCATCTCAGAGTGCTGATCGTGGGGCATCACTGGGTCCCCCTCCATACTTGCGGACTGAG TTCCACCAGCATCAGCACCAGCATCAGCATCAGCACCAGCACACACACCAACACACACACCAGCACACCTTCACCCCTTTCCCCCAC G AGTGTTTAATTCCTGCCGGAGAATGTCTTGTTC(A) CCATCATGCCCACGCCTGCACCGCCCATGGTGCGTACCCCAG CCAGAAATgtgaggataagtggaagacaactctaaaaaactatatatatatataaaatgataaacattgtgatgatggatgctatcc actttatttttgacacaaagtcagtcaaaactgaatggtaactgcaaaatgatatttattaacatatttcattatcataaacactca tttgttgcaagaagttttacagttttttgttctttttctagttttgtctgtaggtactaaagtagtcttgtacaattaatgttaatt accgactttcatgttgagaaataaggtggatatgcctgagtagttgtttaaaaatgatgcacacatggaaatcaaatgc f) S ecuencia aminoacídica interrumpida debido a las mutaciones reflejadas en los apartados b y d MDGPRCSGIRKKRKSRSVRNRERISNGIRNNHVRGSVLRFSSDSEKEDGSTNPSSSSRPRPPRRKRKESSSAEEDIIDGFSIAGFMT LEALEKDMTLKPHERRQNQAGPLRKKKPGRVANGLSLDLHKDRLNHSNHQHSDQENNPRLARTHSKKKKKKHLQKKHRPLKPGQNNC KDSDSESVSGESKPSIRSSSRDRLTDCDSESDQEDKGSDASSEKLFSTAAVKVPDFSVDTLSTNASQELRGLGIPKVSGLERSQEKS QETSREISSATPPLVPTSHSKPPLPAPLHLQPPPSSRGLPLPSRPAQIQNPCPERTLRPLSPPIALPQSQGQELSQAPPHPSQHPPE SPSHPKPPRTPSIYHHPPSPALPAQQNPTQPVQHRPPSRCHQRPISAYSGSLTLNGLSSSRSSTPGKPPGPSPAPHLHHHQPAPTGA SASFPLPLSANPTASHTFPPSLPSSTLPHHTNMFASPAALPPPPPLTSNTLPVPGHPAGSAYSEQDILRQELNTRFLASQSADRGAS LGPPPYLRTEFHQHQHQHQHQHQHTHQHTHQHTFTPFPHAIMPTPAPPMVRTPARNFEKYPTKVDPFYRHSLFHSYPPAVSGIPPVI PPTGPFGSLQGAFQPKTSNPLDVAARPGAVPHTLLQKDPRLTDPFRPVLRKPGKWCAMHVHIAWQIYHHQQKVKQQMQVDPHKLDFG LKPEFLSRPPGPTLFGAIHHPHDLARPASLFSAAGSTHPAAAPFGHPPHHPSNFLTPAPHLEPFSRPPSFGGLASLSTAAFGGLGNP ALASNSVFGHKDSPSAQQHFSGPHEPWNRLHRTPPSFPTPPPWLKPGESERSASVSSHERERERDRERERDLDKRDSSVNKDDKERE PVEKRHQNHQSPLPVNPLTLLGHTRPSEPSRNHISSSEPRDKDKDKPKDRERDREHSDWKDSNTDEHKLKENHHSDKDTPVIHDGRV SEDKPANRITASPYMRPGGMDRVNGGLTRDILEKKAEITYEKKNSEVKVKEERKEEQDGPTERSPEQRSTPQAPPPPPPAALHPPSS MPVPMGMASMHPINSISSLERTRMVAPFMGISPIPGAERFPYPAFHWDPMRDPYRGLDIHRRDPLARELLLRNDPLHRLAAPRLYEA ERSYRDREPHDFNRDHPHGLTLEQRREQERAHLEERERLHLLREDYEQGRLHPMHHPVLDGHLPHPGLMAPGLPSMHYPRVSPSSAV AAAAQNGILNKTPPTASLSAPPPLIPTLGARSSSPRRTTPLGPDIRDRPPSHTHKDIEAR g) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a la mutación reflejada en el apartado e MDGPRCSGIRKKRKSRSVRNRERISNGIRNNHVRGSVLRFSSDSEKEDGSTNPSSSSRPRPPRRKRKESSSAEEDIIDGFSIAGFMT LEALEKDMTLKPHERRQNQAGPLRKKKPGRVANGLSLDLHKDRLNHSNHQHSDQENNPRLARTHSKKKKKKHLQKKHRPLKPGQNNC KDSDSESVSGESKPSIRSSSRDRLTDCDSESDQEDKGSDASSEKLFSTAAVKVPDFSVDTLSTNASQELRGLGIPKVSGLERSQEKS QETSREISSATPPLVPTSHSKPPLPAPLHLQPPPSSRGLPLPSRPAQIQNPCPERTLRPLSPPIALPQSQGQELSQAPPHPSQHPPE SPSHPKPPRTPSIYHHPPSPALPAQQNPTQPVQHRPPSRCHQRPISAYSGSLTLNGLSSSRSSTPGKPPGPSPAPHLHHHQPAPTGA SASFPLPLSANPTASHTFPPSLPSSTLPHHTNMFASPAALPPPPPLTSNTLPVPGHPAGSAYSEQDILRQELNTRFLASQSADRGAS ALBA PENSADO LÓPEZ 130 LGPPPYLRTEFHQHQHQHQHQHQHTHQHTHQHTFTPFPHA CLIPAGECLVL IMPTPAPPMVRTPARNFEKYPTKVDPFYRHSLFHS YPPAVSGIPPVIPPTGPFGSLQGAFQPKTSNPLDVAARPGAVPHTLLQKDPRLTDPFRPVLRKPGKWCAMHVHIAWQIYHHQQKVKQ QMQVDPHKLDFGLKPEFLSRPPGPTLFGAIHHPHDLARPASLFSAAGSTHPAAAPFGHPPHHPSNFLTPAPHLEPFSRPPSFGGLAS LSTAAFGGLGNPALASNSVFGHKDSPSAQQHFSGPHEPWNRLHRTPPSFPTPPPWLKPGESERSASVSSHERERERDRERERDLDKR DSSVNKDDKEREPVEKRHQNHQSPLPVNPLTLLGHTRPSEPSRNHISSSEPRDKDKDKPKDRERDREHSDWKDSNTDEHKLKENHHS DKDTPVIHDGRVSEDKPANRITASPYMRPGGMDRVNGGLTRDILEKKAEITYEKKNSEVKVKEERKEEQDGPTERSPEQRSTPQAPP PPPPAALHPPSSMPVPMGMASMHPINSISSLERTRMVAPFMGISPIPGAERFPYPAFHWDPMRDPYRGLDIHRRDPLARELLLRNDP LHRLAAPRLYEAERSYRDREPHDFNRDHPHGLTLEQRREQERAHLEERERLHLLREDYEQGRLHPMHHPVLDGHLPHPGLMAPGLPS MHYPRVSPSSAVAAAAQNGILNKTPPTASLSAPPPLIPTLGARSSSPRRTTPLGPDIRDRPPSHTHKDIEAR Figura 19. Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de mutantes de la F1. En mayúscula se muestra la secuencia exónica y en minúscula la intrónica. Se marcan en gris los cebadores, en verde la región complementaria al ARNsg, en azul las inserciones y en rojo tachado las deleciones. a) Secuencia con deleción de 3 pb; b) Secuencia con deleción de 5 pb; c) Secuencia con deleción de 6 pb; d) Secuencia con deleción de 7 pb; e) Secuencia con inserción de 33 pb y un cambio de base; f) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a las mutaciones reflejadas en los apartados b y d. En amarillo la secuencia correspondiente al exón 9; g) Secuencia aminoacídica interrumpida debido a la mutación reflejada en el apartado e. 1.5. GENOTIPADO DE LOS ADULTOS DE LA F1 1.5.1. Análisis de heterodúplex en gel de poliacrilamida Los embriones de la F1 se crecieron y en la edad adulta, tras la extracción de ADN de aleta, PCR y electroforesis en gel de agarosa, se realizó el análisis de heterodúplex (Figura 20), lo que permitió reducir el número de muestras para analizar posteriormente. Así, de un total de 35 individuos de la generación F1, en 21 de ellos se encontraron heterodúplex. Los restantes 14 fueron descartados. Figura 20. Ejemplo de análisis de heterodúplex mediante gel de poliacrilamida para 9 de los adultos de la F1. El asterisco (*) marca individuos con presencia de heterodúplex. Marcador de peso molecular de 100 pb. 1.5.2. Clonación bacteriana Se realizó la clonación bacteriana para los 21 individuos adultos y así determinar el tipo exacto de mutación y así establecer cruces dirigidos. Los genotipos que se encontraron fueron los siguientes: - 3 individuos heterocigotos para la deleción de 3 pb - 7 individuos heterocigotos para la deleción de 5 pb Resultados 131 - 2 individuos heterocigotos para la deleción de 6 pb - 3 individuos heterocigotos para la deleción de 7 pb - 6 individuos heterocigotos para la inserción de 33 pb y un cambio de base 1.6. OBTENCIÓN Y GENOTIPADO DE LA F2 1.6.1. Establecimiento de cruces En vista de los genotipos de los adultos y de las consecuencias previstas para cada una de las mutaciones se decidió descartar a los individuos portadores de las mutaciones por deleción de 3 y 6 pb. Asimismo, los 3 individuos portadores de la mutación por deleción de 7 pares de bases resultaron ser hembras, por lo que el establecimiento de cruces entre individuos resultó imposible. Los 6 individuos portadores de la mutación por inserción de 33 pb y un cambio de base se mantuvieron en el sistema con vistas a realizar exámenes de expresión proteica en un futuro, ya que la inserción no garantizaba la expresión de un ARNm o proteína aberrantes. Por ello, se establecieron cruces entre hembras y machos F1 portadores de la mutación por deleción de 5 pb. 1.6.2. Genotipado de los embriones de la F2 1.6.2.1. Cribado de los individuos heterocigotos en gel de agarosa La diferencia de 5 pb entre el alelo WT y el alelo mutante resultó ser suficiente como distinguir ambos alelos en un gel de agarosa concentrado, corrido a bajo voltaje. Así, de las puestas obtenidas, aproximadamente el 50% de los individuos pudieron ser genotipados mediante esta metodología. Un ejemplo de gel de agarosa para 14 embriones de la F2 se muestra en la Figura 21. Figura 21. Gel de agarosa para el cribado de individuos heterocigotos de la generación F2. Los asteriscos muestran los individuos en los que el genotipo no se puede distinguir. C+, control positivo; C-, control negativo. Marcador de peso molecular de 100 pb. 1.6.2.2. Análisis de fragmentos En las ocasiones en que el número de individuos a analizar alcanzó un número cercano a 96, el genotipado se pudo realizar mediante análisis de fragmentos. Se comprobó la ALBA PENSADO LÓPEZ 132 exactitud con la que el programa calcula el tamaño de los fragmentos tanto WT como mutantes. De esta forma, los individuos WT presentaron un único pico a 216 pb en el electroferograma, indicando que ambos alelos eran de igual tamaño; los individuos heterocigotos presentaron un pico a 211 pb y otro a 216, lo que se corresponde con la diferencia de 5 pb entre el alelo WT y el mutante; y los mutantes homocigotos presentaron únicamente un pico a 211 pb, indicando un tamaño equivalente en ambos alelos y correspondiéndose con la deleción de 5 pb. Así, esta metodología no solo permitió un genotipado rápido de individuos con mutaciones previamente caracterizadas, sino también desarrollar una nueva estrategia para el genotipado de parte de embriones o adultos de la F1 sin necesidad de clonación bacteriana. Esto es, en individuos en que el análisis por fragmentos reveló un alelo mutante con una diferencia lo suficientemente grande con respecto al alelo WT como para físicamente dichos alelos mediante gel de agarosa, éstos se pudieron recortar, purificar y enviar directamente a secuenciar. Un ejemplo de los resultados en forma de electroferograma que ofrece el software para el análisis de fragmentos se muestra en la Figura 22. a) b) c) Figura 22. Electroferogramas generados por el software del análisis de fragmentos para el genotipado: a) Individuo con dos alelos WT; b) Individuo con un alelo WT y un alelo mutante (heterocigoto); c) Individuo con dos alelos mutantes (homocigoto mutante). Resultados 133 1.6.2.3. Mezcla de ADN de homocigotos problema con ADN de homocigotos WT Para aquellos individuos homocigotos WT o mutantes en que la detección del genotipo no fue posible mediante gel de agarosa y el número no era suficiente para realizar análisis de fragmentos se desarrolló esta estrategia, sencilla y rápida. En la Figura 23a se muestra la validez de la metodología, de forma que para los individuos homocigotos para la mutación se observan dos bandas en el gel, cuando inicialmente se observa una única banda, mientras que para los individuos WT se continúa observando únicamente una banda y para los individuos heterocigotos se conservan ambas bandas. En la Figura 23b, se muestra el resultado de la mezcla de ADN WT con el ADN problema de los 4 individuos pendientes de genotipado descritos en el apartado 1.6.2.1. Figura 23. Geles de agarosa para la distinción de individuos homocigotos mutantes o WT. a) Ejemplo de la validez de la metodología; b) Genotipado de 4 individuos problema. C+/+, control WT; C+/-, control heterocigoto; C-/-, control homocigoto. Marcador de peso molecular de 100 pb 2. VALIDACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL KNOCK-OUT DE AUTS2A 2.1. CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE AUTS2A POR QPCR Como se muestra en la Figura 24, la comprobación en gel de agarosa de los cebadores de auts2a, actb2 y eef1α1 muestra una correcta amplificación, pues se observa una única banda a la altura esperada y ausencia de banda en los controles negativos. Los análisis de qPCR para auts2a en los individuos homocigotos revelaron una disminución significativa en los niveles de expresión de dicho gen cuando se relativizan a la expresión de ambos genes normalizadores, aproximadamente en la misma medida, como se muestra en la Figura 25. En relación a los heterocigotos, se encontró un aumento significativo de la expresión de auts2a, lo que probablemente se debe a un mecanismo de adaptación transcripcional del alelo WT mediada por la degradación el ARNm derivado del alelo mutante. Por este motivo, el estudio de los mutantes para auts2a se continuó únicamente con los individuos homocigotos. Estos resultados apuntan a la potencial degradación del ARNm mutante por el NSMD y por ende, a la reducción en los niveles de proteína Auts2a. ALBA PENSADO LÓPEZ 134 En relación con el gen normalizador, se decidió continuar los análisis con actb2 debido principalmente a que es el más comúnmente utilizado en estudios con pez cebra. Figura 24. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) Análisis para auts2a; b) Análisis para actb2 y eef1α1. C-, control negativo. Marcador de peso molecular de 100 pb. Figura 25. Validación del knock-out mediante la evaluación de la expresión de auts2a en individuos heterocigotos y homocigotos con respecto a individuos WT, utilizando como normalizadores los genes actb2 y eef1α1. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). Para incrementar la fiabilidad de los cebadores de actb2 y auts2a a la hora de validar el knock-out se desarrollaron las rectas de calibrado. El rango de valores aceptados en relación coeficiente de regresión lineal (R2) se estableció entre 0,98 y 1 y el porcentaje de eficiencia entre el 90% (m= -3,58) y 110% (m= -3,1), siendo ideal un valor del 100% (m= -3,2), ya que valores por debajo del 90% suelen indicar principalmente un mal diseño de los cebadores y valores por encima de 110% apuntan a inhibición de la polimerasa o errores de pipeteo. En la Figura 26 se pueden observar las rectas de calibrado generadas al contrastar los valores de las Cts obtenidas y el logaritmo en base 10 de la cantidad de ARN de las muestras. Asimismo, se refleja la ecuación de regresión lineal para ambos cebadores, así como el R2, siendo 0,9907 para actb2 y 0,9957 para auts2a, por lo que ambos valores entran dentro del rango establecido. Resultados 135 Figura 26. Rectas de calibrado de los cebadores. a) y b), rectas para actb2 y auts2a, respectivamente, obtenidas enfrentando los valores de las Cts con el logaritmo de la cantidad de ARN en las muestras; c), ecuación de regresión lineal, valo R2, eficiencia y % de eficiencia para los cebadores. 2.2. HIBRIDACIÓN IN SITU PARA EL GEN AUTS2A La amplificación con los cebadores para la HIS de auts2a sin y con la secuencia de reconocimiento de la enzima T7 comprobada mediante gel de agarosa mostró una única banda a las alturas esperadas (Figura 27a). Asimismo, la banda esperada se obtuvo tras transcribir el producto de amplificación o sonda (Figura 27b) y tras su purificación (Figura 27c). Figura 27. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) Análisis para los cebadores de auts2a sin y con secuencia de reconocimiento de T7; b) Análisis del producto de transcripción o sonda; c) Análisis de la sonda tras la purificación. Marcador de peso molecular de 100 pb. ALBA PENSADO LÓPEZ 142 homocigotos mutantes (Figura 35c), lo que se corresponde con lo observado con la tinción de naranja de acridina. Figura 35. Análisis de p53. a) Gel de agarosa para p53. Marcador de peso molecular de 100 pb; b) recta de calibrado para p53; c) Comparación de la expresión de p53 en individuos WT y homocigotos mutantes. C-, control negativo. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 3.1.4. Hibridación in situ de pax2a, emx1 y aldoca La amplificación con los cebadores para la HIS de pax2a, emx1 y aldoca sin y con la secuencia de reconocimiento de la enzima T7 comprobada mediante gel de agarosa mostró una única banda a las alturas esperadas (Figura 36ac). Asimismo, la banda esperada se obtuvo tras la trasncripción y purificación de las sondas (Figura 36df). Figura 36. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a-c) Análisis para los cebadores de pax2a, emx1 y aldoca, respectivamente, sin y con secuencia de reconocimiento de T7; d-f) Análisis de las sondas de pax2a, emx1 y aldoca tras la purificación. Marcador de peso molecular de 100 pb. La falta de individuos homocigotos mutantes impidió llevar a cabo los análisis de HIS para todas las sondas transcritas, así que se priorizó la sonda para el gen aldoca. Así, y tal y como se muestra en la Figura 37a y a´, se encontró que a las 120 hpf el gen se expresa en los individuos WT principalmente en la retina y en el cerebro posterior, en la región que se corresponde al cerebelo, aunque la expresión se extiende, aunque más ligeramente, hacia el cerebro medio y anterior. Por el contrario, en los individuos homocigotos mutantes la expresión se pierde prácticamente en la regiones cerebrales, y disminuye significativamente en la retina (Figura 37b y b´). Siendo aldoca un gen que se expresa de forma preferente en las Resultados 143 neuronas del cerebelo, estos resultados indican una reducción en el número de células neuronales del cerebelo en los individuos homocigotos. Figura 37. HIS para el gen aldoca. a y a´) Embrión WT de 120 hpf; b y b´) Embrión homocigoto mutante de 120 hpf. Las flechas indican las regiones anatómicas en que se expresa aldoca. Cp, cerebro posterior; Cb, cerebelo; Rt, retina. 3.2. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LOS INDIVIDUOS ADULTOS 3.2.1. Longitud y peso de los adultos El análisis estadístico realizado en base a los datos obtenidos tras las medidas de la longitud del cuerpo y el peso de los adultos WT y homocigotos mutantes reveló que existen diferencias estadísticamente significativas en relación a ambos parámetros, siendo menor el valor para los homocigotos (Figura 38). Estos resultados pueden asociarse a la observación de una menor ingesta de comida por parte de los adultos homicigotos mutantes, en comparación con los WT, lo que a su vez puede relacionarse con los trastornos gastrointestinales –malestar o dismotilidad intestinal– típicamente comórbidos de los individuos afectados por TEA. Figura 38. Comparación entre la longitud y el peso de los individuos adultos WT y homocigotos mutantes. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ALBA PENSADO LÓPEZ 144 4. ANÁLISIS DE LOCOMOCIÓN DE LOS EMBRIONES MUTANTES DE AUTS2A El rastreo automatizado de los movimientos de los peces permitió determinar la distancia recorrida de cada pez medida en pixeles por minuto. Los análisis revelaron que tanto en condiciones de luz como de oscuridad, la distancia recorrida de los individuos homocigotos es significativamente menor que en los individuos WT (Figura 39a). Asimismo, se observó que en ambos casos, la locomoción es mayor en condiciones de oscuridad (Figura 39b), lo que probablemente se debe a un incremento en la ansiedad por el cambio de estímulo. Estos resultados muestran que, en términos generales, los homocigotos mutantes presentan una locomoción disminuida. Figura 39. Análisis de la locomoción de larvas mutantes de 7 dpf. a) Distancia recorrida expresada en pixeles/minuto para cada uno de los 6 períodos intermitentes de luz-oscuridad en individuos WT y homocigotos. b) Computo total de la distancia recorrida expresada en pixeles/minuto en luz y oscuridad en individuos WT y homocigotos. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). Resultados 145 5. ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICO DE LOS MUTANTES DE AUTS2A 5.1. VALIDACIÓN DE LOS CEBADORES DE QPCR La comprobación de la amplificación mediante gel de agarosa para los cebadores de qPCR reveló una especificidad correcta de todos ellos al presentarse, como se muestra en la Figura 40, una única banda a la altura esperada. Figura 40. Comprobación de la amplificación de los cebadores en gel de agarosa. a) vglut2.2, isl1, nes, rac1b, elavl3, fosab, neurod1, rybpa; b) fat2, ptf1a, gad1a, grid2; c) sema5a, mecp2, gfap, dcaf7, emx1, upf1, zmat3, sox2, satb2, ck2b, olig2; d) smg1, pcgf5b, c-myc, rereb, tbr1b, gtf2ird1. En relación con las rectas de calibrado, en la Tabla 10 se muestran los datos relativos a las mismas– ecuación de regresión lineal, R2, eficiencia y % de eficiencia– para cada una de las parejas de cebadores a analizar. Tabla 10. Datos relativos a las rectas de calibrado de los cebadores de qPCR Ecuación de regresión lineal Coeficiente de regresión (R2) Eficiencia % de eficiencia tbr1b y = -3,2876x + 29,866 0,9987 2,014527764 101,4527764 satb2 y = -3,2339x + 29,51 0,9990 2,038093747 103,8093747 rac1b y = -3,2837x + 28,816 0,9991 2,016204218 101,6204218 gtf2ird1 y = -3,2976x + 29,387 0,9998 2,010253603 101,0253603 mecp2 y = -3,3203x + 30,885 0,9717 2,000679879 100,0679879 sema5a y = -3,2704x + 29,854 0,9996 2,021962022 102,1962022 ALBA PENSADO LÓPEZ 146 zmat3 y = -3,2931x + 34,211 0,9999 2,01217264 101,217264 ck2b y = -3,3452x + 27,824 0,9932 1,990379035 99,03790353 dcaf7 y = -3,2605x + 28,46 0,9990 2,026289184 102,6289184 pcgf5b y = -3,2505x + 30,616 0,9911 2,030696301 103,0696301 rybpa y = -3,2621x + 28,894 0,9958 2,025587437 102,5587437 smg1 y = -3,297x + 29,79 0,9985 2,010509066 101,0509066 upf1 y = -3,4316x + 30,069 0,9772 1,956181985 95,61819855 ptf1a y = -3,3153x + 32,699 0,9945 2,002773462 100,2773462 fat2 y = -3,3136x + 29,988 0,9967 1,999719679 99,97196795 rereb y = -3,2671x + 29,552 0,9958 2,023400469 102,3400469 gad1a y = -3,2306x + 27,333 0,9954 2,039576613 103,9576613 grid2 y = -3,2704x + 33,657 0,9968 2,021962022 102,1962022 vglut2.2 y = -3,2522x + 31,325 0,9961 2,029944502 102,9944502 emx1 y = -3,2854x + 31,144 0,9998 2,015472795 101,5472795 gfap y = -3,2688x + 28,911 0,9997 2,02265896 102,2658960 nes y = -3,3103x + 30,051 0,9970 2,004875571 100,4875571 olig2 y = -3,3269x + 31,665 0,9993 1,998054024 99,80540238 sox2 y = -3,2937x + 28,887 0,9996 2,011916359 101,1916359 c-myc y = -3,3635x + 27,202 0,9986 1,982938981 98,29389814 elavl3 y = -3,2306x + 26,24 0,9976 2,039576613 103,9576613 isl1 y = -3,3319x + 29,133 0,9978 1,995855318 99,58553177 neurod1 y = -3,2954x + 26,306 0,9996 2,011148273 101,1148273 fosab y = -3,3518x + 33,829 0,9707 1,987683153 98,76831528 5.2. EXPRESIÓN DIFERENCIAL ENTRE INDIVIDUOS WT Y MUTANTES 5.2.1. Genes reguladores y regulados por AUTS2 El análisis de la expresión de tbr1b reveló un incremento significativo de la misma en los individuos homocigotos mutantes, en comparación con los individuos WT (Figura 41), lo que concuerda con su función de activador transcripcional de auts2a y, sorprendentemente, sugiere que en los mutantes puede haber una aceleración en el proceso de diferenciación durante el desarrollo embrionario, así como una formación de sinapsis glutamatérgicas inapropiadas, comúnmente alteradas en pacientes de TEA. En relación a satb2 no se encuentran diferencias estadísticamente significativas al comparar ambos grupos de Resultados 147 individuos (Figura 41). Al tratarse de un regulador positivo de tbr1b, y estando éste último tan sobreexpresado en los mutantes, los resultados parecen coherentes. En cuanto a rac1b, su expresión se encuentra significativamente reducida en los individuos mutantes (Figura 41), observación en consonancia con lo esperado, pues Auts2a actúa como regulador positivo de dicho gen. Este resultado, además de reafirmar la eficacia del knock-out, sugiere que en los mutantes no se está produciendo una remodelación correcta del citoesqueleto y por ende, una migración neuronal y proyección axonal normal. Figura 41. Expresión relativa de los genes tbr1b, satb2 y rac1b en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.2. Genes implicados en enfermedades del neurodesarrollo El análisis de la expresión de diversos genes relacionados con enfermedades del neurodesarrollo reveló, en primer lugar, que la expresión del mecp2 se encuentra significativamente reducida en los individuos mutantes (Figura 42). Este resultado es coherente con su papel de represor transcripcional de auts2a y con la observación recurrente de niveles disminuidos de MECP2 en individuos con TEA que se relaciona, a su vez, con anormalidades en el desarrollo de dentritas, axones y aumento de células gliales, pudiendo dicho aumento dar lugar a procesos de excitotoxicidad, posteriormente descritos. En cuanto a sema5a, la expresión se encuentra significativamente aumentada en los homocigotos (Figura 42) y se conoce que su desregulación provoca anormalidades en la cantidad de las proyecciones axonales. Que la expresión de zmat3 se encuentre elevada en los individuos mutantes (Figura 42) reafirma la hipótesis de que dicho gen interviene en la regulación de la expresión de auts2a. Finalmente, con respecto a gtf2ird1 los resultados obtenidos deberán ser estudiados en profundidad. En los análisis se encuentra un aumento significativo en la expresión del mismo (Figura 42), aunque en un principio se esperaría lo contrario, ya que mutaciones en dicho gen provocan un aumento significativo de los niveles de serotonina y sus metabolitos en sangre, característico en pacientes de TEA, que a su vez dan lugar a signos y síntomas típicos relacionados con la agresividad, ansiedad, miedo y sociabilidad249. ALBA PENSADO LÓPEZ 148 Figura 42. Expresión relativa de los genes gtf2ird1, mecp2, sema5a y zmat3 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.3. Genes implicados en el PRC1 En términos generales, se encontró que todos los componentes del PRC1 analizados presentan desregulación de su expresión en homicigotos mutantes (Figura 43). En conjunto, se sabe que el complejo PRC1-AUTS2 tiene una función crítica en la diferenciación neuronal correcta, por lo que no es de extrañar que la alteración en la expresión de sus componentes de lugar a una diferenciación anormal, pudiendo explicar parte de la fisiopatología de los TEA. En primer lugar, se encuentra una elevación significativa del gen dcaf7 (Figura 43), lo que sugiere una diferenciación neuronal anormal, probablemente prematura, de forma semejante a lo que indican otros genes analizados en otros apartados. La expresión de ck2b y rybpa, que tienen un rol fundamental en la diferenciación de oligodendrocitos, se encuentra elevada en los mutantes de auts2a (Figura 43), resultado que se corresponde con el incremento de dichas células en pacientes de TEA. Finalmente, la expresión de pcgf5b se encuentra significativamente disminuida en los individuos homocigotos mutantes (Figura 43), lo que deberá ser investigado, pues su patrón de expresión es opuesto a lo esperado y a lo observado para el resto de componentes del PRC1. Figura 43. Expresión relativa de los genes ck2b, dcaf7, pcgf5b y rybpa en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). Resultados 149 5.2.4. Genes implicados en el NSMD Los resultados del análisis para upf1 y smg1, dos componentes fundamentales del complejo NSMD, muestran un aumento significativo de su expresión en los individuos mutantes (Figura 44), confirmando así la intervención del NSMD y reafirmando la validez de los resultados observados por qPCR, en que la expresión de auts2a se encontraba muy significativamente reducida en los individuos homocigotos. Figura 44. Expresión relativa de los genes upf1 y smg1 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.5. Genes marcadores de tipos celulares cerebelares Como se muestra en la Figura 45, el estudio de ptf1a, fat2 y rereb, marcadores de células de Purkinje, células granulares y de diferenciación y maduración de las mismas, respectivamente, reveló una reducción significativa en los niveles de expresión de dichos genes. Estos resultados concuerdan, por un lado, con lo observado en la HIS para el gen aldoca, y por otro lado, con las observaciones en individuos con TEA, en los que es característica la disminución significativa en el tamaño y número de las células del cerebelo, principalmente células de Purkinje y células granulares119. Figura 45. Expresión relativa de los genes ptf1a, fat2 y rereb en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). ALBA PENSADO LÓPEZ 150 5.2.6. Genes marcadores específicos de sinapsis glutamatérgicas y gabaérgicas La expresión de gad1a, principal responsable de la síntesis de GABA, se encuentra significativamente disminuida en los individuos mutantes, mientras que grid2 y vglut2.2, un receptor y un transportador de glutamato, respectivamente, presentan niveles anormalmente elevados en los homocigotos (Figura 46). Estos resultados, que muestran de forma general anormalidades en la expresión de genes marcadores de señales glutamatérgicas y gabaérgicas concuerdan con la elevada frecuencia en que se encuentra una desregulación en la señalización excitatoria/ inhibitoria en pacientes de TEA. Muestran, asimismo, una correspondencia con lo observado en el córtex prefrontal y cerebelo de pacientes, en que se encuentran significativamente reducidos los marcadores de neuronas gabaérgicas233,237. Figura 46. Expresión relativa de los genes gad1a, grid2 y vglut2.2 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.7. Genes marcadores de neuroglia: astrocitos, microglía y oligodendrocitos En los embriones mutantes para auts2a se encontró una elevación significativa de gfap, nes y olig2 (Figura 47), marcadores de astrocitos, glía y oligondendrocitos, respectivamente, siendo estos resultados coherentes con los niveles típicamente elevados en individuos afectados por trastornos del neurodesarrollo, entre ellos TEA. Asimismo, el incremento de nes, considerado un marcador de angiogénesis en pericitos, podría indicar una angiogénesis sostenida a lo largo del tiempo y consecuentes reorganizaciones constantes de la vasculatura, impidiendo la formación de conexiones más largas y complejas, necesarias para el lenguaje y la comunicación social. Finalmente, aunque emx1 se encuentra ligeramente elevado en mutantes con respecto a los individuos WT, no se alcanza la significación. Resultados 151 Figura 47. Expresión relativa de los genes emx1, gfap, nes y olig2 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.8. Genes marcadores de pluripotencia y de diferenciación neuronal El análisis en conjunto de ambos grupos de genes sugiere un punto de vista interesante en cuando a la neurogénesis y diferenciación de las neuronas en los individuos mutantes, ya que la expresión de los genes responsables de mantener la pluripotencia de las células madre neuronales se encuentra significativamente reducida, mientras que la de los marcadores de diferenciación neuronal se encuentra significativamente elevada (Figura 48). Esto parece indicar que la neurogénesis en los embriones se produce, probablemente normal, pero desmesuradamente rápido, de forma que en un breve período de tiempo las neuronas se originan y diferencian, para luego mantenerse en el tiempo, debido a la disminución de la actividad y probable falta de auto-renovación de las células madre pluripotentes y progenitores neurales. Esta observación concuerda con lo expuesto para el gen tbr1 y también para los genes implicados en el PRC1, que en ambos casos, son indicativos de un incremento de neuronas postmitóticas y por tanto de diferenciación neuronal acelerada. Figura 48. Expresión relativa de los genes sox2, c-myc, elavl3, isl1 y neurod1 en individuos homocigotos mutantes de auts2a. El asterisco (*) indica significación estadística (p<0,05). 5.2.9. Gen marcador de activación neuronal fosab o c-fos es un marcador de activación neuronal por lo que sus niveles pueden indicar de forma general la actividad neuronal reciente de los individuos analizados y es,