Niveles de hidrocarburos alifáticos, policlorobifenilos (PCBs) y policloroterfenilos (PCTs) en aves rapaces y sus implicaciones en el ecosistema

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología NIVELES DE HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS, POLICLOROBIFENILOS (PCBs) y POLICLOROTERFENILOS (PCTs) EN AVES RAPACES Y SUS IMPLICACIONES EN EL ECOSISTEMA. TERESA DE JESÚS LÓPEZ Y LÓPEZ-LEITÓN 1999 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología NIVELES DE HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS, POLICLOROBIFENILOS (PCBs) y POLICLOROTERFENILOS (PCTs) EN AVES RAPACES Y SUS IMPLICACIONES EN EL ECOSISTEMA. Memoria presentada por Teresa de Jesús López y LópezLeitón en la Universidad de Santiago de Compostela para optar al Grado de Doctor. Santiago de Compostela, 1999 Mª Asunción Lage Yusty, Catedrática de Nutrición y Bromatología, Jesús Simal Lozano, Catedrático de Análisis Químico Aplicado, Bromatología y Toxicología y Mª Elena Álvarez Piñeiro, Doctora en Farmacia AUTORIZAN: a Teresa de Jesús López y López-Leitón a presentar el trabajo, realizado bajo su dirección en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia, titulado "Niveles de Hidrocarburos Alifáticos, Policlorobifenilos (PCBs) y Policloroterfenilos (PCTs) en Aves Rapaces y sus Implicaciones en el Ecosistema" para optar al Grado de Doctor en Farmacia. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela, a Fdo. M.A. Lage Yusty J. Simal Lozano M. E. Álvarez Piñeiro Deseo expresar mi agradecimiento: A los directores de este trabajo, Dra. Dña. Mª Asunción Lage Yusty, Dr. D. Jesús Simal Lozano y Dra. Dña. Mª Elena Álvarez Piñeiro, por la orientación y el apoyo prestados para la realización del mismo. A todos los profesores y compañeros del Laboratorio de Bromatología, especialmente a la Dra. Dña. Susana Carril González-Barros, Dña. Susana González Amigo y Dña. Elena Sandomingo López por su ayuda y cordial ambiente de trabajo que en todo momento me han proporcionado. Al Laboratorio de Parasitología del Instituto de Investigación y Análisis Alimentarios y en especial al Prof. Dr. D. Manuel Sanmartín Durán por habernos suministrado las muestras objeto de este estudio. A la Consellería de Educación y Ordenación Universitaria de la Xunta de Galicia por la financiación del proyecto "Estudio de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), policlorobifenilos (PCBs) y policloroterfenilos (PCTs) en aves rapaces y sus implicaciones en el ecosistema", que ha permitido la realización de este estudio. Y, por último a todos aquellos que, de una forma u otra, han colaborado no sólo en la realización de este trabajo, sino en mi formación científica en general. A mis padres ÍNDICE GENERAL Indice general Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón I INDICE GENERAL AGRADECIMIENTOS .................................................................................. INDICE GENERAL.......................................................................................I INDICE.........................................................................................................II INDICE DE TABLAS.....................................................................................V INDICE DE FIGURAS ..................................................................................VIII ABREVIATURAS..........................................................................................XIV INTRODUCCIÓN..........................................................................................1 ANTECEDENTES ........................................................................................50 OBJETIVO....................................................................................................74 PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................75 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.....................................................................90 CONCLUSIONES.........................................................................................145 BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................148 INDICE Indice Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón II INDICE INTRODUCCIÓN CARACTERÍSTICAS DE LAS ESPECIES DE AVES RAPACES ESTUDIADAS...........................................................................................2 RATONERO COMÚN. Buteo buteo L......................................................2 IDENTIFICACIÓN ................................................................................2 HÁBITAT..............................................................................................3 NIDIFICACIÓN.....................................................................................3 LECHUZA COMÚN. Tyto alba Scop. .......................................................4 IDENTIFICACIÓN ................................................................................4 HÁBITAT..............................................................................................5 NIDIFICACIÓN.....................................................................................5 CÁRABO COMÚN. Strix aluco L..............................................................5 IDENTIFICACIÓN ................................................................................5 HÁBITAT..............................................................................................6 NIDIFICACIÓN.....................................................................................6 HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS............................................................7 OTRAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ......................................26 ETIOLOGÍA..........................................................................................26 TOXICOLOGÍA ....................................................................................28 POLICLOROBIFENILOS..........................................................................29 OTRAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ......................................32 ETIOLOGÍA..........................................................................................33 TOXICOLOGÍA ....................................................................................35 POLICLOROTERFENILOS......................................................................38 ETIOLOGÍA..........................................................................................39 TOXICOLOGÍA ....................................................................................40 EXTRACCIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS..................................41 LEGISLACIÓN ESPAÑOLA RELATIVA A AVES RAPACES...................44 ÍNDICE DE FIGURAS Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón VIII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Ratonero común........................................................................3 Figura 2: Lechuza común.........................................................................4 Figura 3: Cárabo común...........................................................................6 Figura 4: Estructura y propiedades físico-químicas del pristano ..............7 Figura 5: Espectro de masas del pristano................................................9 Figura 6: Espectro de infrarrojo del pristano.............................................9 Figura 7: Estructura y propiedades físico-químicas del C18..................................10 Figura 8: Espectro de masas del C18.......................................................................................11 Figura 9: Espectro de infrarrojo del C18..................................................................................11 Figura 10: Estructura y propiedades físico-químicas del fitano..................12 Figura 11: Espectro de masas del fitano....................................................13 Figura 12: Estructura y propiedades físico-químicas del C19..................................13 Figura 13: Espectro de masas del C19.......................................................................................14 Figura 14: Espectro de infrarrojo del C19..................................................................................15 Figura 15: Estructura y propiedades físico-químicas del C20..................................15 Figura 16: Espectro de masas del C20.......................................................................................16 Figura 17: Espectro de infrarrojo del C20..................................................................................17 Figura 18: Estructura y propiedades físico-químicas del C22.................................17 Figura 19: Espectro de masas del C22.......................................................................................18 Figura 20: Espectro de infrarrojo del C22..................................................................................19 Figura 21: Estructura y propiedades físico-químicas del C24..................................19 Figura 22: Espectro de masas del C24.......................................................................................20 Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón IX Figura 23: Espectro de infrarrojo del C24..................................................................................21 Figura 24: Estructura y propiedades físico-químicas del C28..................................21 Figura 25: Espectro de masas del C28.......................................................................................22 Figura 26: Estructura y propiedades físico-químicas del C32..................................23 Figura 27: Espectro de masas del C32.......................................................................................24 Figura 28: Estructura y propiedades físico-químicas del C36..................................24 Figura 29: Espectro de masas del C36.......................................................................................25 Figura 30: Estructura de policlorobifenilos..................................................29 Figura 31: Estructura y propiedades físico-químicas de PCB101..........................30 Figura 32: Estructura y propiedades físico-químicas de PCB138..........................31 Figura 33: Estructura y propiedades físico-químicas de PCB180.........................31 Figura 34: Estructura y propiedades físico-químicas de PCB206..........................32 Figura 35: Estructura de los policloroterfenilos...........................................38 Figura 36: Extractor de fluidos supercríticos ..............................................41 Figura 37: Localización geográfica del área de muestreo..........................77 Figura 38: Esquema básico del extractor supercrítico HP 7680 A..............80 Figura 39: Condiciones del SFE para realizar la extracción.......................81 Figura 40: Esquema del sistema de purificación........................................82 Figura 41: Cromatógrafo de gases y ordenador.........................................83 Figura 42: Cromatograma de un patrón de hidrocarburos alifáticos con detector de ionización de llama ..........................................84 Figura 43: Cromatograma de un patrón de Aroclor1260 y Aroclor5460 con detector de captura de electrones..................85 Figura 44: Cromatograma de un patrón de PCBs individuales con detector de captura de electrones.............................................85 Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón X Figura 45: Cromatograma de un patrón de n-alcanos con detector de ionización de llama...............................................................86 Figura 46: Rectas de calibrado de hidrocarburos alifáticos........................88 Figura 47: Rectas de calibrado de PCBs individuales................................89 Figura 48: Rectas de calibrado de Aroclor1260 y Aroclor5460......................................89 Figura 49: Valores medios (%) de humedad y grasa en función de la víscera...................................................................................91 Figura 50: Valores medios (%) de humedad y grasa en función del sexo...........................................................................................92 Figura 51: Valores medios (%) de humedad y grasa en función de la especie..................................................................................93 Figura 52: Overlay de: cromatograma patrón de PCBs y PCTs y cromatograma de la alúmina con ECD......................................94 Figura 53: Overlay de: cromatograma patrón de hidrocarburos alifáticos y cromatograma de la alúmina con FID......................94 Figura 54: Columna capilar y su conexión con el inyector y detectores..................................................................................99 Figura 55: Overlay de: cromatograma patrón de hidrocarburos alifáticos y cromatograma de una muestra de hígado de pollo sobrecargada con hidrocarburos alifáticos .......................102 Figura 56: Overlay de: cromatograma patrón de PCBs y PCTs y cromatograma de una muestra de hígado de pollo sobrecargada con PCBs y PCTs...............................................102 Figura 57: Cromatograma de muestra de pulmón de lechuza Le2 en cromatografía de gases-detector de ionización de llama ..........104 Figura 58: Cromatograma de muestra de corazón de lechuza Le1 en cromatografía de gases-detector de ionización de llama..........................................................................................111 Figura 59: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según la edad....................................113 Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón XI Figura 60: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según la edad...............113 Figura 61: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según la edad.....................................113 Figura 62: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según la edad................113 Figura 63: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según la provincia..............................115 Figura 64: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según la provincia.........115 Figura 65: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según la provincia...............................116 Figura 66: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según la provincia..........116 Figura 67: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según el sexo ....................................118 Figura 68: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según el sexo................118 Figura 69: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según el sexo .....................................118 Figura 70: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según el sexo.................118 Figura 71: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de cárabo según el sexo.......................................119 Figura 72: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de cárabo según el sexo..................119 Figura 73: Análisis de varianza del C18 en función de la edad ...................120 Figura 74: Análisis de varianza del C20 en función de la edad ...................120 Figura 75: Análisis de varianza del C20 en función de la especie...............121 Figura 76: Análisis de varianza del C20 en función de la provincia.............121 Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón XII Figura 77: Análisis de varianza de C22 en función de la provincia..............122 Figura 78: Análisis de varianza de los hidrocarburos totales identificados en función de la edad...........................................122 Figura 79: Análisis de varianza de los hidrocarburos totales identificados en función de la especie.......................................123 Figura 80: Análisis de varianza de los picos no identificados en función del tipo de víscera.........................................................123 Figura 81: Análisis de la varianza del C20 en ratonero según la edad........124 Figura 82: Análisis de varianza de hidrocarburos totales identificados en lechuza según la edad.....................................124 Figura 83: Análisis de varianza de hidrocarburos totales identificados en lechuza según la provincia ..............................125 Figura 84: Análisis de varianza de picos no identificados en lechuza según el tipo de víscera.............................................................125 Figura 85: Cromatograma de la muestra de riñón de ratonero Ra1 en cromatografía de gases-detector de captura de electrones..................................................................................133 Figura 86: Cromatograma de la muestra de intestino de lechuza Le3 en cromatografía de gases-detector de captura de electrones..................................................................................134 Figura 87: Valores medios de PCBs individuales en muestras de ratonero según la edad..............................................................135 Figura 88: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de ratonero según la edad..............................................................135 Figura 89: Valores medios de PCBs individuales en muestras de lechuza según la edad...............................................................136 Figura 90: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de lechuza según la edad...............................................................136 Figura 91: Valores medios de PCBs individuales en muestras de ratonero según la provincia.......................................................137 Indice de Figuras Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón XIII Figura 92: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de ratonero según la provincia.......................................................137 Figura 93: Valores medios de PCBs individuales en muestras de lechuza según la provincia........................................................138 Figura 94: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de lechuza según la provincia........................................................138 Figura 95: Valores medios de PCBs individuales en muestras de ratonero según el sexo..............................................................140 Figura 96: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de ratonero según el sexo..............................................................140 Figura 97: Valores medios de PCBs individuales en muestras de lechuza según el sexo...............................................................140 Figura 98: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de lechuza según el sexo...............................................................140 Figura 99: Valores medios de PCBs individuales en muestras de cárabo según el sexo ................................................................141 Figura 100: Valores medios de Aroclor1260 y totales en muestras de lechuza según el sexo...............................................................141 Figura 101: Análisis de varianza en función de la provincia.........................142 ABREVIATURAS Abreviaturas Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón XIV ABREVIATURAS Am: Área del analito en la muestra Ap: Área del analito en el patrón atm: atmósferas ATSDR: Agency for Toxic sustances and Disease Registry BOE: Boletín Oficial del Estado CAS: Chemical Abstracts Service CBs: Chlorinated Biphenyls CEE. Comunidad Económica Europea CI: Cuartil Inferior CL50:Concentración Letal media Cm: Concentración del analito en la muestra col: colaboradores Cp: Concentración del analito en el patrón CS: Cuartil Superior DDE: Diclorodifenildicloroeteno DDT: Diclorodifeniltricloroetano ECD: Electron Capture Detector EEUU: Estados Unidos EPA: Environmental Protection Agency FDA: Food and Drugs Administration FID: Flame Ionization Detector FRm: Factor de Respuesta del analito en la muestra FRp: Factor de Respuesta del analito en el patrón GC: Gas Chromatography HCB: Hexaclorobenceno HCtotales: Hidrocarburos totales identificados Abreviaturas Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón XV HPLC: High Performance Liquid Chromatography HRGC: High Resolution Gas Chromatography LD: Límite de Detección LQ: Límite de Cuantificación min.: minutos MPa: megapascales ( 1MPa= 10 bar= 145 psi= 9.86 atm.) MS: Mass Spectrometry MSD: Mass Selective Detector n: número de muestras ND: No Detectable ng: nanogramos NIOSH: National Institute for Occupational Safety and Health NPLC: Normal-Phase Liquid Chromatography PAHs: Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PCBs: Polychlorinated Biphenyls PCTs: Polychlorinated Terphenyls pg: picogramos PNI: Picos no identificados ppm: partes por millón Prist.: Pristano psi: pound square inches r: coeficiente de correlación Ref: referencia RSD%: Relative Standard Desviation % SD: Standard Desviation seg: segundos SFC: Supercritical Fluid Chromatograhy Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 5 Hábitat: Tiene gran predilección por lugares habitados, criando en casas de campo, torres de iglesias, ruinas, etc. También frecuenta parques con troncos viejos, a veces acantilados. La lechuza común puede encontrarse en toda la Península Ibérica. Nidificación: Al igual que con el hábitat, nidifica en cualquier lugar (huecos de árboles, agujeros de cortados rocosos, etc.), pero sobre todo utiliza edificaciones humanas (castillos, torreones, iglesias, graneros, edificaciones moderna, etc.). No construye nido alguno, deposita los huevos directamente sobre el suelo, aunque utiliza las egagrópilas y otros restos para evitar su rotura. Suele empezar la puesta a últimos de marzo principio de junio. Pueden realizar dos puestas al año. CÁRABO COMÚN. Strix aluco L Pertenece al Orden Strigiformes y a la Familia Strigidae. Identificación: 38 cm. Moteado y listado, cabeza grande redonda, ojos negros, sin “orejas”. Las partes superiores varían de pardorrojizo a color leonado o grisáceo. Partes inferiores pardo amarillento con marcadas listas oscuras. Discos faciales pardo grisáceos (Fig. 3). Estrictamente nocturno. Se alimenta principalmente de pequeños roedores, aves, insectos, etc. Se distingue del búho chico por mayor robustez, ojos negros y carencia de “orejas”; de la lechuza campestre por aspecto más oscuro, menos amarillento y ojos negros; de la lechuza común por mayor tamaño y aspecto mucho más oscuro, especialmente cara y partes inferiores. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 6 Figura 3: Cárabo común Hábitat: Permanecen en el territorio en el que nidifican durante todo el año, siendo su hábitat más típico los bosques viejos, dehesas, aunque pueden vivir próximos al hombre en parques. Distribución discontinua en la Península por la fragmentación de bosques. Sólo accidental en las islas. Nidificación: Utilizan como nido agujeros naturales en árboles, aunque aceptan muy bien las cajas nido. No aportan ningún tipo de material al nido. La época de cría comienza a mediados de marzo. Ponen de 3 a 4 huevos, con intervalos de 48 horas, casi redondos y completamente blancos. Son incubados durante 30 días y desde el primer huevo por la hembra, mientras que el macho aporta comida. Los pollos dejarán el nido a los 30 días, siendo posible observarlos por las ramas de los árboles, pero dependen de los padres para comer hasta 3 meses después. La actual política forestal ha propiciado que los cárabos se vean obligados a utilizar los sitios tradicionales de cría de la lechuza. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 7 HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS Son alcanos de cadena lineal que contienen enlaces químicos simples entre sí, pudiendo ser de cadena recta, ramificados o de cadena cíclica. Debido a que son los compuestos que contienen el número más alto posible de átomos de hidrógeno por átomo de carbono, se denominan hidrocarburos saturados (Brawn y col. 1991). La fórmula general es CnH2n+2 donde "n" es el número de átomos de carbono En este trabajo se han investigado: - Pristano Figura 4: Estructura y propiedades físico-químicas del pristano CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Molecular formula = C 19 H40 Molecular Weight = 268.521 Composition = C(84.99%) H(15.01%) Molar Refractivity = 89.90 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 343.6 ± 3.0 cm 3 Parachor = 777.5 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.436 ± 0.02 Surface tension = 26.2 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.781 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.08 ± 0.1 Polarizability = 35.64 ± 0.5 10 -24cm3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 8 Entry Name: 2,6,10,14-Tetramethylpentadecane Synonym(s): Pristane. Norphytane. Bute hydrocarbon Chapman Hall Number: HNR64-M CAS Registry Number: 1921-70-6 Molecular Formula: C19H40 Molecular Weight: M 268.525. Hazard Toxicity: >>Skin irritant. RTECS Accession Number: >>RZ1880000. Supplier(s): Aldrich T2280-2; Fluka 87885; Sigma T7640. Variant: (6RS,10SR)-form Chapman Hall Number: HNR65-N Type of Compound Code(s): VS5370 Synonym(s): meso-form Source/Synthesis: Obt. from shark liver oil, herring oil, Bute inlet wax, wool wax, zooplankton and crude oil. Physical Description: Oil. Melting Point: Mp -100 deg. Boiling Point: Bp 296 deg. Bp 10 158 deg. Other Data: Chiral forms may also occur naturally; in most cases the opt. rotn. of isol. samples has not been measured. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 16C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 12B (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 16C (ir) Hallgren, B. et al.,Acta Chem. Scand.,1963, 17, 543 Kates, M. et al.,Biochemistry,1967, 6, 3329 (abs config, bibl) Jain, T.C. et al.,Can. J. Chem.,1969, 47, 4359 (isol) Goodman, R.A. et al.,J.A.C.S.,1973, 95, 7553 (cmr) Carman, C.J. et al.,Macromolecules,1973, 6, 719 (cmr) Lewis, R.J., Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, PMD500 [00007814-3] Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 9 Figura 5: Espectro de masas del pristano Figura 6: Espectro de infrarrojo del pristano Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 10 - C18 Figura 7: Estructura y propiedades físico-químicas del C18 Entry Name: Octadecane Chapman Hall Number: GZW06-Q CAS Registry Number: 593-45-3 Type of Compound Code(s): VA0050 H3C(CH2)16CH3 Molecular Formula: C18H38 Molecular Weight: M 254.498. Source/Synthesis: Isol. from plant oils and waxes, e.g. Piper longum, Ulex europaeus, hop and rose oil. Physical Description: Cryst. (Me2CO). Melting Point: Mp 28 deg. Boiling Point: Bp 305-307 deg (317 deg). Bp 15 180-183 deg. Hazard Toxicity: >>Fl. p. >100 deg, autoignition temp. 227 deg. Supplier(s): Aldrich O-65-2; Fluka 74710; Sigma O1876; Supelco 44-2697. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 5B (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 4C (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 5C (ir) Schrauth, W. et al.,Chem. Ber.,1931, 64, 1314 (synth) Carey, P.C. et al.,J.C.S.,1933, 346 (synth) Nyburg, S.C. et al.,Acta Cryst. B,1972, 28, 2992 (cryst struct) Trenner, N.R. et al.,J. Chromatogr.,1972, 71, 415 (glc) Pacakova, V. et al.,Chromatographia,1974, 7, 171 (glc) Erkelens, J. et al.,J. Catal.,1975, 39, 173 (ir) [00027439-3] CH3 CH3 Molecular formula = C 18 H 38 Molecular Weight = 254.494 Composition = C(84.95%) H(15.05%) Molar Refractivity = 85.44 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 325.6 ± 3.0 cm 3 Parachor = 748.2 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.437 ± 0.02 Surface tension = 27.8 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.781 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.06 ± 0.1 Polarizability = 33.87 ± 0.5 10 -24 cm 3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 11 Figura 8: Espectro de masas del C18 Figura 9: Espectro de infrarrojo del C18 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 12 - Fitano Fig. 10 : Estructura y propiedades físico-químicas del fitano Entry Name: 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane Synonym(s): Phytane Chapman Hall Number: JRB30-V CAS Registry Number: 638-36-8 Molecular Formula: C20H42 Molecular Weight: M 282.552. Supplier(s): Sigma P9087. Variant: (6R,10R,14R)-form Chapman Hall Number: JTC44-V CAS Registry Number: 18651-07-5 Type of Compound Code(s): VS5350 Source/Synthesis: Found in human liver, meteorites, oil shale and other sediments. Physical Description: Oil. Boiling Point: Bp 15 179.5 deg. References: Kates, M. et al.,Biochemistry,1967, 6, 3329 [00007641-2] CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Molecular formula = C 20 H 42 Molecular Weight = 282.547 Composition = C(85.02%) H(14.98%) Molar Refractivity = 94.54 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 360.1 ± 3.0 cm 3 Parachor = 817.3 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.437 ± 0.02 Surface tension = 26.5 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.784 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.08 ± 0.1 Polarizability = 37.47 ± 0.5 10 -24 cm 3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 13 Fig.11: Espectro de masas del fitano - C19 Figura 12: Estructura y propiedades físico-químicas del C19 CH3 CH3 Molecular formula = C 19H40 Molecular Weight = 268.521 Composition = C(84.99%) H(15.01%) Molar Refractivity = 90.07 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 342.1 ± 3.0 cm 3 Parachor = 788.0 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.439 ± 0.02 Surface tension = 28.1 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.784 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.07 ± 0.1 Polarizability = 35.70 ± 0.5 10 -24cm3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 14 Entry Name: Nonadecane Chapman Hall Number: HJL34-X CAS Registry Number: 629-92-5 Type of Compound Code(s): VA0050 H3C(CH2)17CH3 Molecular Formula: C19H40 Molecular Weight: M 268.525. Source/Synthesis: Isol. from apple wax, Manilkara bidentata and many other plant sources. Constit. of sex pheromone of female fall cankerworm Alsophila pometaria, male southern green stinkbug Nezara viridula and female tigermoth Holomelina lamae. Melting Point: Mp 32 deg. Boiling Point: Bp 330 deg. Bp 30 212 deg. Hazard Toxicity: >>Fl. p. >100 deg, autoignition temp. 230 deg. Supplier(s): Aldrich N2890-6; Fluka 74160; Sigma N4129; Supelco R42-1019. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 5C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 4D (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 5D (ir) Hildebrandt, J.H. et al.,J.A.C.S.,1929, 51, 2487 Cocker, W. et al.,J.C.S.,1963, 677 (isol) Carnduff, J. et al.,Phytochemistry,1966, 5, 1029 (isol) Roelofs, W.L. et al.,Science (Washington, D.C.),1971, 171, 684 Olf, H.G. et al.,J. Chem. Phys.,1973, 59, 534 (Raman) Balinova-Tsvetkova, A. et al.,Dokl. Skh. Akad. (Sofia),1974, 7, 45; CA,83, 32911c (glc) Wong, J.W. et al.,J. Chem. Ecol.,1984, 10, 463 [00027378-0] Figura 13: Espectro de masas del C19 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 21 Figura 23: Espectro de infrarrojo del C24 - C28 Figura 24: Estructura y propiedades físico-químicas del C28 CH3CH3 Molecular formula = C 28 H 58 Molecular Weight = 394.760 Composition = C(85.19%) H(14.81%) Molar Refractivity = 131.76 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 490.7 ± 3.0 cm 3 Parachor = 1146.1 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.449 ± 0.02 Surface tension = 29.7 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.804 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.11 ± 0.1 Polarizability = 52.23 ± 0.5 10 -24 cm 3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 22 Entry Name: Octacosane Chapman Hall Number: HJL35-Y CAS Registry Number: 630-02-4 Type of Compound Code(s): VA0050 H3C(CH2)26CH3 Molecular Formula: C28H58 Molecular Weight: M 394.766. Source/Synthesis: Isol. from plant waxes, e.g. Coriolus sanguineus, Bacopa monniera. Melting Point: Mp 61.2-61.4 deg. Fp 64-65 deg. Boiling Point: Bp 1.1 224 deg. Supplier(s): Aldrich O-50-4; Fluka 74690; Sigma O2126; Supelco 44-2696. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 7C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 6B (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 8A (ir) Hidebrand, J.H. et al.,J.A.C.S.,1929, 51, 2487 (synth) Brown, I. et al.,J.C.S.,1960, 2783 (isol) Cambie, R.C. et al.,J.C.S.(C),1966, 72 (isol) George, R.A. et al.,J. Phys. Chem.,1972, 5, 871 (uv) Boistelle, R. et al.,Acta Cryst. B,1976, 32, 1240 (cryst struct) Prakash, A. et al.,Curr. Sci.,1976, 45, 705 (isol, ir) [00027401-7] Figura 25: Espectro de masas del C28 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 23 - C32 Figura 26: Estructura y propiedades físico-químicas del C32 Entry Name: Dotriacontane, 9CI Synonym(s): Dicetyl. Lacceran. Bicetyl Chapman Hall Number: HFH36-D CAS Registry Number: 544-85-4 Type of Compound Code(s): VA0050 H3C(CH2)30CH3 Molecular Formula: C32H66 Molecular Weight: M 450.873. Source/Synthesis: Constit. of higher plants, eg. Bacopa monnieri, Mentha aquatica, Agave sisalana. Physical Description: Plates (Et2O). Melting Point: Mp 74-75 deg. Boiling Point: Bp 1.5 245 deg. RTECS Accession Number: >>JT2360000. Supplier(s): Aldrich D22310-7; Fluka 44260; Sigma D4634; Supelco R42-1064. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 8B (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 6D (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 8D (ir) Levene, P.A. et al.,J. Biol. Chem.,1915, 20, 530 (synth) Brown, I. et al.,J.C.S.,1960, 2783 (isol) Razafindrazaka, J. et al.,Bull. Soc. Chim. Fr.,1963, 1633 (isol) [00036656-9] CH3 CH3 Molecular formula = C 32 H 66 Molecular Weight = 450.866 Composition = C(85.25%) H(14.75%) Molar Refractivity = 150.30 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 556.7 ± 3.0 cm 3 Parachor = 1305.2 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.452 ± 0.02 Surface tension = 30.2 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.809 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.12 ± 0.1 Polarizability = 59.58 ± 0.5 10 -24 cm 3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 24 Figura 27: Espectro de masas del C32 - C36 Figura 28: Estructura y propiedades físico-químicas del C36 CH3 CH3 Molecular formula = C 36 H 74 Molecular Weight = 506.973 Composition = C(85.29%) H(14.71%) Molar Refractivity = 168.83 ± 0.3 cm 3 Molar Volume = 622.7 ± 3.0 cm 3 Parachor = 1464.3 ± 4.0 cm 3 Index of refraction = 1.454 ± 0.02 Surface tension = 30.5 ± 3.0 dyne/cm Density = 0.814 ± 0.06 g/cm 3 Dielectric Constant = 2.12 ± 0.1 Polarizability = 66.93 ± 0.5 10 -24 cm 3 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 25 Entry Name: Hexatriacontane Chapman Hall Number: CQF21-H CAS Registry Number: 630-06-8 H3C(CH2)34CH3 Molecular Formula: C36H74 Molecular Weight: M 506.981. Physical Description: Cryst. (petrol). Melting Point: Mp 76 deg. Supplier(s): Aldrich H1255-2; Fluka 52920; Sigma H9504; Supelco R42-1072. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 1, 8C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 7A (ir) Morgat, J.-L. et al.,C. R. Hebd. Seances Acad. Sci.,1965, 260, 5579 (synth) Boistelle, R. et al.,Acta Cryst. B,1976, 32, 1240 (cryst struct) [00028042-7] Figura 29: Espectro de masas del C36 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 26 OTRAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS Los puntos de ebullición aumentan de forma proporcional a su peso y disminuyen al aumentar la ramificación de su estructura molecular mientras que sus puntos de fusión crecen lentamente a medida que aumenta el peso molecular. Los primeros hidrocarburos de la serie son gases a temperatura ambiente y en estado puro son inodoros, los siguientes hasta el dieciséis son líquidos y poseen un olor parecido al de la gasolina y los superiores son sólidos e inodoros. Los alcanos son casi completamente insolubles en agua, disminuyendo su solubilidad al aumentar su peso molecular, siendo totalmente solubles en disolventes orgánicos. Las densidades de los alcanos líquidos son menores que la unidad, e incluso la cera de parafina flota sobre el agua. Desde el punto de vista químico, la gran estabilidad de los enlaces C-C y C-H así como su escasa polaridad, hacen de los alcanos compuestos muy poco reactivos (Bonner y Castro, 1968). ETIOLOGÍA La principal fuente de alcanos, hasta el C40 la constituye el petróleo o aceite crudo, compleja mezcla de compuestos orgánicos, principalmente hidrocarburos, con pequeñas cantidades de otros que contienen nitrógeno, oxígeno o azufre (Brown y col. 1991). El petróleo crudo, como tal, no tiene utilidad comercial por lo que es necesario someterlo a procesos de refinado siendo normalmente la primera etapa, la separación en diferentes fracciones basada en el punto de ebullición (Tabla I). Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 27 Tabla I: Principales fracciones de la destilación del petróleo y principales aplicaciones FRACCIÓN Nº DE CARBONOS INTERVALO DE EBULLICIÓN PRINCIPALES APLICACIONES Gas C1-C5<30 Combustible, producción de hidrógeno Gasolina C5-C12 30200 Combustible de motores Queroseno, gasoil C12-C18 180400 Combustible, alumbrado Aceites lubricantes C16-C20 >350 Lubricantes Parafinas >C20 Sólido bajo pto. fusión Velas, mechas Asfalto C36 Residuos gomosos Pavimentación, combustible Una importante observación que ha surgido de varios estudios es que la toxicidad de ciertos hidrocarburos está fuertemente ligada a su estructura química y a su naturaleza hidrófoba. El mecanismo biológico de la hidrofobicidad consiste en que la proporción del transporte de hidrocarburos dentro de los organismos depende de su solubilidad en las fases lipídicas de la membrana (polarizabilidad) (Fredman, 1989). Por otro lado, las propiedades hidrófobas están asociadas a la estabilidad química y esto da lugar a su persistencia, por consiguiente, el daño ambiental puede producirse mucho después de que la entrada al ambiente ha cesado. El petróleo, se ha convertido en una preocupación ambiental seria, dado que su extracción y uso como fuente de energía por los seres humanos ha conducido a su distribución amplia en la biosfera. Esto ha sido muy evidente después de grandes derrames a gran escala en el mar, a partir de pozos petrolíferos; pero los efectos acumulativos de muchos derrames pequeños que se han producido en la tierra y en el mar pueden ser también importantes. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 28 TOXICOLOGÍA Los efectos tóxicos del petróleo en los organismos vivos pueden dividirse en: aFísicos: causados por el recubrimiento de los organismos o de su ambiente inmediato con petróleo. Esto se observa muy claramente cuando las aves acuáticas quedan cubiertas de petróleo pudiendo causar la muerte por asfixia. bQuímicos: los hidrocarburos saturados de bajo punto de ebullición pueden producir anestesia y narcosis en muchos animales inferiores. Puesto que muchos componentes del petróleo son químicamente estables y no se metabolizan o son excretados una vez que han sido absorbidos, están implicados en las cadenas tróficas (Duffus, 1983). Las principales manifestaciones de la intoxicación con estos agentes son la irritación pulmonar y la depresión del sistema nervioso central. Pueden tener lugar dos tipos de intoxicación: aIntoxicación aguda (por inhalación o ingestión): náuseas, vómitos, tos e irritación pulmonar que progresa hasta el edema pulmonar y bronconeumonía con fiebre y tos. bIntoxicación crónica (por inhalación): vértigo, debilidad, pérdida de peso, anemia, nerviosismo, dolores en las extremidades y adormecimiento periférico. La contaminación medioambiental por productos químicos agrícolas y residuos industriales afecta con resultados adversos a la reproducción de las aves de presa. La diversidad de polucionantes da lugar a efectos fisiológicos de diferentes niveles, incluyendo efectos tanto directos sobre el crecimiento de adultos como efectos sobre los embriones. Los efectos sobre embriones incluyen mortalidad o incubación dañada, malogro de los pollos al crecer y Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 29 efectos teratogénicos produciendo anormalidades del esqueleto y diferenciación disminuida de los sistemas reproductor y nervioso a través de mecanismos de mimetismo hormonal de estrógenos. El rango de efectos químicos en aves adultas incluyen mortalidad aguda, estrés sub-letal, fertilidad reducida, supresión de formación de huevos, cáscaras de huevos debilitadas e incubación dañada (Fry, 1995). Los hidrocarburos alifáticos han sido identificados en diferentes matrices medioambientales y biológicas como suelo (López-Ávila y col., 1992; Chesler y col., 1997), sedimentos (Gutiérrez y col., 1996; Kiss y col., 1997), plantas (Frontera y col., 1991), pescados (Quintero y col., 1994; Fazio, 1995), mejillones (Granby y col., 1995; Álvarez y col., 1996), etc. POLICLOROBIFENILOS Los policlorobifenilos son compuestos químicos de fórmula general C12H10-nCln donde n=1-10 (monoclorobifenilo hasta decaclorobifenilo) (Fig. 30). Figura 30: Estructura de policlorobifenilos Se conocen 209 congéneres de PCBs, pero sólo 130 se encuentran en mezclas comerciales. Cuando varía el grado de cloración se habla de "homólogo" y cuando varía la posición de los átomos de cloro se usa el término "isómero". Así se conocen 10 homólogos y 46 isómeros (Erikson, 1986), de los cuales en este trabajo se han investigado: Clx Clx Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 30 PCB101: 2, 2´, 4, 5, 5´pentaclorobifenilo PCB138: 2, 2´, 3, 4, 4´, 5´hexaclorobifenilo PCB180: 2, 2´, 3, 4, 4´, 5, 5´heptaclorobifenilo PCB206: 2, 2´, 3, 3´, 4, 4´, 5, 5´, 6 nonaclorobifenilo PCB101 Cl Cl Cl Cl Cl Molecular formula = C12 H5 Cl5 Molecular Weight = 326.432 Composition = C(44.15%) H(1.54%) Cl(54.30%) Molar Refractivity = 75.31 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 214.4 ± 3.0 cm3 Parachor = 559.9 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.619 ± 0.02 Surface tension = 46.4 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.522 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = Not available Polarizability = 29.85 ± 0.5 10-24cm3 Figura 31: Estructura y propiedades físico-químicas del PCB101 Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 37 Está aceptado, generalmente, que la toxicidad aguda de los PCBs es relativamente baja. Los PCBs tienen tendencia a producir efectos tóxicos crónicos. La exposición crónica del hombre a PCBs produce daños en el hígado así como un estado de la piel conocido como cloracné, que se caracteriza por la aparición de comedones y quistes en la cara y cuello, pero en casos severos también aparecen en el tórax, espalda y genitales. Otros síntomas de exposición crónica incluyen náuseas, vómitos, ictericia y fatiga. Cambios bioquímicos incluyen disminución de vitamina A, alteración de metabolismo lipídico y cambios hormonales (Connell, 1997). Los efectos provocados por PCBs en huevos de aves incluyen mortalidad o desarrollo reducido, efectos teratogénicos produciendo anormalidades en el esqueleto y daños en la diferenciación del sistema nervioso y reproductor a través de mecanismos de mimetismo hormonal de estrógenos y fallos en el crecimiento de los pollos. El rango de efectos químicos en aves adultas abarca mortalidad aguda, estrés sub-letal, reducción de la fertilidad, supresión de formación de huevos, y daños en la incubación y crianza de pollos (Vos, 1972). Los tipos de polucionantes que muestran efectos sobre la reproducción incluyen a los pesticidas organoclorados y polucionantes industriales, pesticidas organofosforados, hidrocarburos del petróleo, metales pesados y un gran número de herbicidas y fungicidas. o,p´-DDT, policlorobifenilos (PCBs) y mezclas de organoclorados han sido identificados como estrógenos medioambientales que afectan a poblaciones de crías de gaviotas en el Sur de California, Los Grandes Lagos y Puget Sound (Fry, 1995). Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 38 Los PCBs y mezclas de organoclorados han sido identificados como estrógenos medioambientales en gaviotas de varios países. Los organoclorados estrogénicos representan una importante clase de tóxicos en aves porque la diferenciación de su sistema reproductor es estrógenodependiente. Los principales síntomas clínicos en aves consisten en: -Jadeo, provocado por edema pericárdico y pulmonar. -Es posible un estasis pasajero del intestino durante 2 ó 3 días. -En fases avanzadas aparece decaimiento, plumas erizadas, debilidad y muerte. La concentración letal media (CL50) en el caso de las aves, es del orden de 100-400 ppm dependiendo del porcentaje de cloro y de la duración del consumo (Vos, 1972). POLICLOROTERFENILOS Los policloroterfenilos están constituidos por 3 anillos aromáticos con configuraciones en meta-, orto-, o para-, de forma que cualquier átomo de hidrógeno puede ser sustituido por un cloro, siendo su fórmula empírica C18H14nCln (Fig. 35). Figura 35: Estructura de los policloroterfenilos Clx Clx Clx Clx Clx Clx Clx Clx Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 39 Los PCTs poseen una estructura y propiedades físico-químicas similares a los PCBs, por lo tanto son también lipofílicos persistentes y tienen tendencia a bioacumularse (Remberg y col., 1998). ETIOLOGÍA Los PCTs se sintetizan como mezclas complejas cuyos componentes poseían diferentes grados de cloración. Los PCTs fueron fabricados en Estados Unidos desde 1929 hasta 1972 y además fueron producidos en Francia, Italia, Japón y la República Federal alemana. Se estima que la producción de PCTs en dicho período de tiempo fue de 50 millones de toneladas, que se equivale con el 15 % de la cantidad de PCBs fabricada (Gallager y col., 1995). Los policloroterfenilos fueron comercializados por "Monsanto Corporation" bajo la marca denominada Aroclor cada uno de los cuales era designado por 4 dígitos, los 2 primeros hacen referencia al terfenilo, mientras que los 2 últimos indican el porcentaje de cloro (por ejemplo, el Aroclor 5460 contiene un 60 % de cloro) (Hale y col., 1990). Los PCTs han sido usados en fluidos hidráulicos, adhesivos, equipos eléctricos, plasticidas y pinturas por sus propiedades dieléctricas y aislantes. En cuanto a las consecuencias medioambientales, los PCTs no fueron objeto de las atenciones reguladoras que tuvieron los PCBs (Hale y col., 1990), sin embargo han sido identificados en varias matrices medioambientales tales como suelos (Remberg y col., 1998), sedimentos (Risebrought y col., 1990; Hale y col., 1990), agua de ríos (Freudenthal y Greve, 1973), aves (Falandysz y col., 1980), pescados (Hale y col., 1991; Gallagher y col., 1995) y mejillones (Simal y col., 1991; Álvarez y col., 1995) así como en alimentos y materiales de envasado en contacto con los mismos que suponen una vía de exposición directa para el hombre (Villeneuve y col., 1973). Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 40 TOXICOLOGÍA A pesar de la similitud de los PCTs y los PCBs en cuanto a su estructura y propiedades físico-químicas, no existen muchos estudios sobre la toxicidad producida por estos compuestos, pero se considera que deben tener un potencial tóxico similar a los bifenilos policlorados. Los efectos en animales mamíferos expuestos a altas cantidades de Aroclor5460 incluye pérdida de pelo, edema subcutáneo, cloracné, hiperplasia y displasia de la mucosa gástrica y transformaciones neoplásicas. El hígado es el órgano más perjudicado ya que provoca el incremento de los niveles de citocromo P450 y de las enzimas microsomiales hepáticas produciendo carcinogénesis. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 41 Aunque estos compuestos han sido analizados por métodos tradicionales, en este trabajo se ha utilizado la extracción por fluidos supercríticos más rápida y novedosa. EXTRACCIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS La utilización de la nueva técnica de extracción mediante fluidos supercríticos (Fig. 36) de contaminantes medioambientales en diferentes matrices ha ido en aumento en los últimos años. Figura 36: Extractor de fluidos supercríticos La extracción de PCBs y PCTs de muestras biológicas a través del extractor de fluidos supercríticos no sólo es más rápida que el tradicional Soxhlet si no que también genera extractos más limpios. En este trabajo se aplica la técnica de extracción con fluidos supercríticos cuyo fundamento es el siguiente: Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 42 Un fluido supercrítico es aquel que se encuentra en condiciones de presión y temperatura superiores a las de su punto crítico, en las cuales no se condensa por muy elevada que sea la presión que se aplique y no se vaporiza al incrementar la temperatura; por lo consiguiente, posee las propiedades físicas de transporte de un gas (viscosidad y difusividad) y las propiedades químicas solventes de un líquido (poder de solvatación y densidad). Las principales ventajas de un fluido supercrítico son: -Su elevado poder solvente permite que muchas sustancias sean solubles en el fluido. -Por su elevada difusividad, las sustancias químicas disueltas se propagan rápidamente a través del fluido. -El fluido puede penetrar por pequeños resquicios de un material porque no presentan tensión superficial. -Su baja viscosidad facilita la entrada del fluido en las matrices a extraer. El poder solvente se incrementa con la densidad y ésta varía según las condiciones de presión y temperatura. Hay diferentes fluidos que se pueden utilizar para la extracción en condiciones supercríticas tales como: etileno, dióxido de carbono, etano, óxido nitroso, propano y amoníaco. El más utilizado es el CO2 debido a sus propiedades no tóxicas y su presencia como fluido supercrítico a baja temperatura y presión (Van Bavel y col., 1995; Hale y col., 1995). Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 43 La extracción con fluidos supercríticos se puede llevar a cabo mediante dos tipos de métodos: a. Método "off-line".- se caracteriza por la realización separadamente de los procesos de extracción y análisis. Existen tres variantes para la realización de la extracción: -Estática: la muestra se empapa en el fluido supercrítico y al cabo de algún tiempo éste se bombea hacia la columna de retención donde los analitos son concentrados. -Dinámica: el fluido supercrítico pasa a través de la muestra una sola vez y posteriormente se dirige hacia la columna de retención. -Recirculación: el fluido pasa repetidamente a través de la muestra y después de algún tiempo va hacia la columna de retención donde se concentran los analitos. b. Método "online".- los procesos de extracción y análisis se realizan de forma combinada sustituyendo la columna de retención por un instrumento analizador. (Hewlett Packard, 1990; Sandra y col., 1995). Las ventajas del extractor de fluidos supercríticos frente a otros métodos de extracción utilizados tradicionalmente son la mayor eficacia, rapidez y facilidad de uso así como el menor volumen de solvente necesario. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 44 LEGISLACIÓN ESPAÑOLA RELATIVA A AVES RAPACES REAL DECRETO 439/1990 DE 30 DE MARZO, POR EL QUE SE REGULA EL CATÁLOGO NACIONAL DE ESPECIES AMENAZADAS La Ley 4/1989, de 27 de marzo, de conservación de los espacios naturales y de la flora y la fauna silvestres, crea en su artículo 30.1 el catálogo nacional de especies amenazadas, en el que se incluirán, según establece el artículo 29 de la misma ley, las especies, subespecies o poblaciones cuya protección efectiva exija medidas específicas por parte de las administraciones públicas. Este proceso de catalogación, cuyos efectos son los que determina el artículo 31 de la Ley, es uno de los principios fundamentales de la misma, pues implica que la protección de las especies amenazadas no consista tan solo en medidas positivas por parte de las administraciones públicas para remediar los factores de amenaza sobre las especies de flora y fauna sobre sus hábitats. Además, el Real Decreto cataloga como especies o subespecies "en peligro de extinción", aquellas que habiendo sido científicamente identificadas como tales, requieren una acción urgente e inmediata para garantizar su conservación. Se prevé la catalogación, como "de interés especial" de determinadas especies, cuya conservación exige la adopción de medidas de protección entre las que se incluyen las especies: Buteo buteo, Tyto alba y Strix aluco. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 45 LEGISLACIÓN EUROPEA RELATIVA A PCBs y PCTs 1. DIRECTIVA 75/439/CEE RELATIVA A LA GESTIÓN DE LOS ACEITES USADOS En la misma se denominan "aceites usados" a todos los aceites industriales, con base mineral o lubricantes que se hayan vuelto inadecuados para el uso que se les hubiera asignado inicialmente y, en particular, los aceites usados de los motores de combustión y de los sistemas de transmisión, así como los aceites minerales lubricantes, aceites para turbinas y sistemas hidráulicos. No incluye los residuos procedentes de refinerías del petróleo. El principal objetivo de dicha Directiva es la protección del medioambiente frente a los efectos perjudiciales cuyo origen sea la evacuación, depósito o tratamiento de este tipo de aceites que obliga a garantizar que los "aceites usados" utilizados como combustible no constituyan un residuo tóxico y peligroso y que no contengan policlorobifenilos y policloroterfenilos en concentraciones superiores a 50 ppm. Posteriormente ha sido modificada por la Directiva 87/101/CEE en la que se exige una mayor efectividad en el control de la eliminación de los aceites mediante su regeneración. 2. DIRECTIVA 75/442/CEE modificada por la DIRECTIVA 91/156/CEE, define el concepto de "residuo" como cualquier sustancia u objeto del cual se desprende o tiene la obligación de desprenderse el poseedor. Entre dichas sustancias se encuentran aquellas materias que, bien se hayan vertido por accidente o bien aquellas que han sido polucionadas (por ejemplo materia polucionada por PCB). Además esta directiva obliga a los Estados miembros a garantizar la eliminación y la valorización responsable de los mismos y a adoptar medidas encaminadas a limitar su producción. Introducción Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 46 3. DIRECTIVA 91/689/CEE RELATIVA A LOS RESIDUOS PELIGROSOS La presente Directiva tiene por objeto aproximar a los Estados miembros en materia de gestión controlada de residuos peligrosos. A efectos de la presente Directiva se entenderá por "residuo peligroso": cualquier residuo que figure en una lista que se elaborará con arreglo al procedimiento establecido en el artículo 18 de la Directiva 75/442/CEE y tomando como base los Anexos I y II de la presente Directiva, a más tardar 6 meses antes de la fecha de entrada en vigor de la presente Directiva. Tales residuos deberán tener una o más propiedades de las enumeradas en el Anexo III. Dicha lista tendrá en cuenta el origen y composición de los residuos y, cuando corresponda, los valores límite de concentración. En el Anexo I A aparecen las categorías o tipos de residuos peligrosos clasificados según su naturaleza o la actividad que los genera donde se incluyen, entre otros, sustancias que contengan PCB y/o PCT. 4. DIRECTIVA 94/67/CE RELATIVA A LA INCINERACIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS El objetivo de la presente Directiva es establecer medidas y métodos para impedir o reducir tanto como sea posible los efectos sobre el medioambiente, especialmente la contaminación atmosférica, la del suelo y la de las aguas superficiales y subterráneas, así como los riesgos para la salud humana, resultantes de la incineración de residuos peligrosos y, con este fin establecer y mantener las condiciones adecuadas de explotación y los valores límite de emisión para las instalaciones de incineración de residuos peligrosos en la comunidad. La presente Directiva se aplicará sin perjuicio de la legislación comunitaria correspondiente, especialmente la relativa a los residuos peligrosos y a la protección de la salud y la seguridad de los trabajadores en las instalaciones de incineración. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 52 CARRIL, S. y col (1996) desarrollan un procedimiento de extracción/concentración de multicomponentes para el enriquecimiento de PCBs, PCTs e hidrocarburos alifáticos (pristano, C18, C19, C20, C22, C24, C28, C32 y C36) en hígado de cerdo. Estos componentes del extracto enriquecido eran entonces purificados a través de "sep-pack" de sílica, eluidos con hexano y analizados simultáneamente por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones, detector de ionización de llama y columna capilar RSL200. Las medias de las recuperaciones están en un rango entre 81.5 % para pristano y 93 % para PCBs; RSD % (0.9-6.7). El método es preciso y reproducible. GUTIÉRREZ, E. A. y col. (1996) analizan contaminantes orgánicos en sedimentos recogidos en 39 estaciones entre octubre y noviembre de 1992. Los hidrocarburos alifáticos se extraen por Soxhlet y se analizan por cromatografía gaseosa usando detector de ionización de llama y columna DB5. Los hidrocarburos alifáticos incluyen la suma de alcanos normales de n-C10 a n-C34 más pristano y fitano y sus concentraciones oscilan entre 0.130 y 2.9 ppm. CHESLER, S. N. y col. (1997) evalúan un método analítico basado en extracción con fluidos supercríticos (CO2), con trampa de acero inoxidable y hexano como solvente seguido por cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama; lo comparan con extracción mediante Soxhlet y determinan la contaminación con gasoil de muestras estándar de suelos con un nivel de hidrocarburos totales del petróleo de 100 µg/g. Mientras que ambos métodos de extracción tienen la misma desviación estándar relativa del 3 %, el extractor de fluidos supercríticos requiere mucho menos tiempo, usa menor cantidad de disolventes orgánicos y proporciona mejores recuperaciones de los hidrocarburos más volátiles n-C10 al n-C12. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 53 KISS, G. y col. (1997) presentan los resultados de la determinación de hidrocarburos volátiles en muestras de aerosol atmosférico, precipitados y sedimentos recogidos en el Lago Balaton. Los n-alcanos son extraídos en un baño de ultrasonidos con n-hexano, purificados con cartuchos de sílica y analizados por cromatografía de gases con detector de masas con columna capilar SPB-1. Encuentran unas concentraciones que oscilan entre 1.5 y 41.6 ng/m3. LIANG, S. y TILOTTA, D. C. (1998) describen el uso de argon supercrítico para la extracción de hidrocarburos del petróleo de muestras de suelos. Realizan sobrecargas en arena, marga y barro obteniendo porcentajes de recuperación que aumentan con el incremento de presión y/o temperatura en el extractor de fluidos supercríticos, consiguiendo los mejores resultados a 500 atm. y 150 ºC. Realizan el análisis por cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama con columna DB-1 y confirman la identificación de los picos por cromatografía de gases con detector de masas. Específicamente la extracción con CO2 y argon supercríticos tienen similar porcentaje de recuperación y reproducibilidad pero el argon requiere un poco más de tiempo de extracción (7 minutos más). MORSELLI y col. (1998) analizan hidrocarburos alifáticos mediante extracción por fluidos supercríticos con CO2 modificado con acetona a 227 bar. y 80 ºC usando una trampa ODS y como solvente hexano. Analizan el extracto con un cromatógrafo de gases equipado con detector de ionización de llama y columna de metilsilicona, obteniendo un porcentaje de recuperación medio del 80 %. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 54 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS DE PCBs y PCTs HALE, R. C. y col. (1990) extraen Aroclor5432 de sedimentos y ostras con diclorometano en Soxhlet seguido de purificación mediante columnas de florisil, cuantifican por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y columna DB-5 y confirman la identificación por cromatografía de gases con detector de masas. Las concentraciones encontradas en sedimentos y ostras eran tan elevadas como 250000 µg/kg y 35000 µg/kg respectivamente, expresados en materia fresca. HALE, R. C. y col. (1991) separan PCTs del material lipídico de pescados mediante cromatografía de gel-permeación con 2 columnas empaquetadas con resinas S-X3 y S-X8. Los PCTs son analizados con un cromatógrafo de gases equipado con un sistema de detección de conductividad electrolítica y una columna DB-5. Encuentran valores de Aroclor5460 del orden de 26 mg/kg en sedimentos de río y de Aroclor5432 entre 35-250 mg/kg en pescados y sedimentos respectivamente. MULCAHEY, L. J. y col. (1991) evalúan distintas fases sólidas utilizadas como trampas para la extracción por fluidos supercríticos (off-line) con CO2. Determinan la eficacia de trampas de fase normal y reversa con hidrocarburos, fenoles y "test mezcla". Estas trampas fueron posteriormente usadas para la extracción de PCBs en sedimentos de río. Investigan también fases de fritado de polietileno y hexano "ice-cold" como solvente de elución para la extracción de PCBs en muestras de tejidos biológicos. Otro tipo de trampa usada es una superficie sólida como cuentas de acero inoxidable y cuentas de cristal o también un sorbente de fase-sólida, el cual, la mayoría de las veces es material cromatográfico empaquetado. Para los 5 PCBs individuales estudiados usan trampa de diol y las condiciones son 350 atm. de presión, temperatura termostatizada a 50 ºC y temperatura de la trampa –50 ºC. Usando CO2 como fluido supercrítico obtienen un porcentaje de recuperación entre 44.65 % para los PCBs 52 y 65 % para el PCB170 mientras que si añaden 0.8 % de tolueno como modificador obtienen unos valores que oscilan entre 29 % para los PCBs52 y 47 % para el PCB138. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 55 TANABE, S. y col. (1991) analizan PCBs en grasa de cerdo mediante extracción en Soxhlet y cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. Consiguen porcentajes de recuperación superiores al 90 % y el límite de detección es 10 µg/kg. La concentración media encontrada es 0.01 mg/kg en peso total. DAVID, F. y col. (1992) optimizan las condiciones de extracción con fluidos supercríticos de muestras sobrecargadas con PCBs para superar las interacciones soluto-matriz, que son responsables de recuperaciones más bajas en muestras reales comparadas con muestras sobrecargadas. Los porcentajes de recuperación oscilan entre el 32 % para una densidad del CO2 de 0.29 g/mL y el 102 % para una densidad del 0.7 g/mL en muestras de sedimentos sobrecargados. FURTON, K. G. y LIN, Q. (1992) muestran el efecto de las dimensiones de la celdilla de extracción sobre la eficacia del extractor de fluidos supercríticos al ser dependiente del tipo de sorbente usado. Para el sorbente octadecilsilano hay un aumento significativo en las recuperaciones de PCBs en el extractor de fluidos supercríticos cuando las dimensiones de las celdillas son más anchas, mientras que cuando se usa como sorbente el Florisil no se observa este efecto. Además la recuperación disminuye proporcionalmente con el número de átomos de cloro de los PCBs estudiados para el sorbente octadecilsilano, no observándose tal efecto para el Florisil. El mayor porcentaje de recuperación es de 42.8 % usando florisil como sorbente y CO2 a 60 ºC y 2000 psi. La identificación y cuantificación se realiza con un cromatógrafo de gases obteniendo unos niveles de recuperación entre 40.1 y 42.8 % con una desviación estándar entre 0.4 y 1.6 %. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 56 HAWTHORNE, S. B y col. (1992) comparan recuperaciones obtenidas mediante el extractor de fluidos supercríticos para polucionantes naturales, incluyendo policlorobifenilos de sedimentos con material estándar de referencia (SRM 1939) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) de lodo con restos de petróleo de suelo de las vías del ferrocarril, usando difluorclorometano (Freón-22), N2O y CO2 supercríticos. El CO2 da lugar a las recuperaciones más bajas para cada muestra, mientras que el difluorclorometano consigue las más altas, probablemente debido a su alto momento dipolar. La eficacia de extracción obtenida en 30-45 min. usando difluorclorometano supercrítico generalmente es igual o mayor que la obtenida realizando durante 18-32 horas extracción con solventes líquidos. La .modificación con metanol mejora las recuperaciones de los PCBs del sedimento (la media es 90 %) usando acetona para recoger el extracto. Los resultados de este estudio muestran la capacidad del extractor de fluidos supercríticos para interaccionar con el lugar de adsorción en las matrices de sólidos ambientales. Todos los extractos fueron analizados por cromatografía de gases con columna DB-5. JOHANSEN, H. R. y col. (1992) utilizan un extractor de fluidos supercríticos directamente acoplado a un cromatógrafo de gases para la extracción selectiva de PCBs en matrices lipídicas de diferentes especies biológicas (bacalao y cangrejo) usando alúmina básica como adsorbente selectivo. Las recuperaciones obtenidas están entre el 70 y 96 % ± 3 y 6 %. El método ha sido aplicado a muestras con grandes diferencias en contenido graso y éste no parece influir en la ejecución del análisis. La temperatura de la trampa era de - 30 ºC y la temperatura del análisis 220 ºC; la densidad del CO2 de 0.69 g/mL a una temperatura de 60 ºC y presión de 14.5 MPa. Tiempo de extracción = 45 minutos. VAN DER VELDE, E. G. y col. (1992) comparan la extracción por fluidos supercríticos con otras técnicas tradicionales para la extracción de PCBs y pesticidas organoclorados en suelo. El uso de CO2 a 50 ºC y 20 MPa, 10 min. de extracción estática seguida de 20 min. de extracción dinámica y elución con Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 57 iso-octano fueron las condiciones óptimas encontradas. Usan como material test 2 tipos de suelo con bajo y alto contenido en carbón orgánico respectivamente, conteniendo 16 PCBs y pesticidas organoclorados con un ancho rango de volatilidad y polaridad a un nivel de 5 µg/kg de materia seca. El extractor de fluidos supercríticos da buenos porcentajes de extracción para los PCBs y pesticidas organoclorados variando entre el 85 y 105 % con una reproductibilidad del 5 % para cada componente en ambos tipos de suelo. Para la separación y cuantificación usan un cromatógrafo de gases con una columna capilar de sílica Ultra-2. KANNAN, K. y col. (1993a; 1993b) investigan la presencia de PCBs en muestras de diferentes tejidos de marsopas y delfines mediante extracción en Soxhlet y cromatografía gaseosa. El nivel de concentración más elevado se encuentra en muestras de grasa con 42 mg/kg. MILLS, A. G. y JEFFERIES, T. M. (1993) investigan las condiciones de extracción por fluidos supercríticos requeridas para extraer PCBs y grasa de leche encontrando que aunque la extracción es rápida (10 min.), las condiciones requeridas son tan idénticas que no hay separación de PCBs y grasa. La combinación SFE-SFC permite la resolución de PCBs en grasa de leche en 15 minutos recogiéndolos en etilenglicol a -10 ºC. Los extractos fueron analizados por cromatografía de gases con detector de masas con una columna OY-1. NEWTON, I. y col. (1993) determinan los niveles de PCBs en hígado de 5 especies de aves rapaces mediante extracción líquido-líquido con hexano:acetona, purificación con alúmina y posterior análisis por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. Las recuperaciones de sobrecargas con aproximadamente 2 mg/kg de PCBs oscilan entre 94-106 %. El límite de detección es alrededor de 0.01 mg/kg. Obtienen valores de PCBs que oscilan entre 0.98-7.88 µg/g en materia fresca. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 58 SOMERS, J. D. (1993) determina PCBs en muestras de tejido adiposo de cormoranes mediante la extracción con diclorometano:ciclohexano (1:1) separando los residuos por cromatografía de gel permeación e identificándolos por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y columna SPB-608. El valor más elevado que encuentran es de 2.03 mg/kg peso total. TANG, P. H. (1993) separan un grupo de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), policlorobifenilos, pesticidas organoclorados y ésteres de ftalato en agua reactiva que no contiene partículas, por extracción en fase sólida y extracción con CO2 supercrítico con una trampa de acero inoxidable recogiéndolos en acetona. Finalmente el extracto es analizado por cromatografía de gases con detector de masas con una columna capilar DB5625. El tiempo total de análisis se acorta mediante el uso de extracción por fluidos supercríticos en lugar de la elución líquido-solvente. Además, el solvente residual generado es minimizado usando extracción por fluidos supercríticos. Obtienen unos porcentajes de recuperación entre 72 y 116 % con una RSD % entre 3 y 34. ÁLVAREZ , M. E. y col. (1994) determina PCBs en mejillones de Galicia, mediante extracción en Soxhlet con hexano:diclorometano (1:1) , purifican con florisil y eluyen con hexano. Realizan la identificación y cuantificación por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. El porcentaje de recuperación es del 99 % y la concentración media encontrada 113 µg/kg. COBB, G. P. y col. (1994) desarrollan un método para evaluar PCBs en huevos y tejidos de garzas. Homogeneizan las muestras con hexano y cloruro de metileno, posteriormente centrifugan y purifican el sobrenadante con florisil. Realizan la identificación por cromatografía gaseosa con una columna DB-5 y detector de captura de electrones. El límite de detección para los PCB138 y PCB180 es 0.5 pg y el límite de cuantificación 1pg en ambos casos. La concentración media de PCB138 y PCB180 es 98.1 y 79.2 ng/g respectivamente. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 59 DJORDJERIC, M. V. y col. (1994) desarrollan un método analítico preciso y altamente reproducible para el aislamiento de pesticidas organoclorados y PCBs en tejido adiposo (≥ 50 mg) mediante extracción por fluidos supercríticos con CO2 y CO2 modificado con diclorometano, purificando el extracto obtenido con una columna de alúmina y usando como solvente ciclohexano. Realizan el análisis por cromatografía gaseosa con una columna DB-5. El método puede ser utilizado para estudios epidemiológicos sobre el significado de estos polucionantes medioambientales en la etiología del cáncer de mama. Encuentran niveles de PCBs de 223 ± 145 µg/kg. DUARTE-DAVIDSON, R. y JONES, K. C. (1994) presentan detalladamente la exposición a PCBs congéneres-específicos en la población de UK. La ingesta promedio de ΣPCBs en la población contemporánea de UK era estimada sobre 0.53 µg/persona/día. El consumo de alimentos correspondía al 97 % de la exposición a PCBs con pescado (32 %), leche y derivados lácteos (24 %), vegetales (24 %), carne y grasa animal (15 %). El patrón del congénere para diferentes productos alimenticios era diferente, los vegetales presentan compuestos clorados más bajos, mientras que en alimentos grasos como el pescado, productos lácteos y carne, presentan compuestos altamente clorados. FALANDYSZ, J. (1994) determina congéneres individuales de PCBs en músculo pectoral de águilas mediante la digestión de las muestras con potasa alcohólica, purifican con una columna cromatográfica de sílica gel y los identifican por cromatografía de gases con detector de masas y con columna capilar DB-1701. Encuentran unas concentraciones de PCBs totales que oscilan entre 7 y 480 µg/kg peso fresco. FORSYTH, D. J. y col. (1994) investigan la presencia de PCBs en huevos de 5 especies de colimbos mediante cromatografía gaseosa, obteniendo un límite de detección de 0.01 mg/kg. Los niveles medios encontrados oscilan entre 0.19 y 9.96 mg/kg peso fresco. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 60 GERE, D. R. (1994) extrae PCBs con fluidos supercríticos en muestras de suelo, aguas residuales, sedimentos de referencia certificados y tejidos de pescado. El tiempo de extracción es inferior a 2 horas y los extractos son inyectados en un cromatógrafo de gases con un detector de captura de electrones o con un detector de masas. La trampa usada es Florisil 60/80 mesh, una presión de 3161 psi (218 bar) y como solvente heptano:diclorometano:heptano. Obtienen unos porcentajes de recuperación entre 87-108 % con una RDS entre 1.3-19 %. GRIMVALL, E. y ÖSTMAN, C. (1994) investigan 7 fases estacionarias de sílica considerando sus propiedades de retención para un número de polucionantes ambientales halogenados, incluyendo 26 congéneres individuales de PCBs. No se encontró una relación simple estructura-tiempo de retención para los PCBs pero un número de fases demostraron selectividad similar para los congéneres investigados. Los tiempos de retención de compuestos con carbonos alifáticos eran influenciados sustancialmente por la presencia de hidrógenos con propiedades ácidas debido a efectos inductivos de átomos de cloro y oxígeno adyacentes. El análisis se hace por cromatografía líquida de alta resolución con detector UV seguido de cromatografía de gases con una columna DB-5 y detector de captura de electrones. HATANO, Y. y HATANO, A. (1994) comparan los efectos tóxicos en pollos expuestos a 0.01 ó 0.03 ppm de PCBs con los de un "blanco". Investigan la presencia de estos compuestos en el hígado mediante extracción por Soxhlet con hexano y análisis por cromatografía gaseosa con columna SE-30 y detector de captura de electrones observando que los pollos expuestos a PCBs durante su desarrollo ven disminuido su crecimiento, al mismo tiempo que aumenta el daño histopatológico y la presencia de malformaciones. HIETANIEMI, V. y KUMPULAINEN, J. (1994) determinan PCBs en muestras de leche, queso y huevos representativos de la dieta en Finlandia mediante extracción por Soxhlet con acetona-hexano-dietileter y éter de petróleo (5.5:2.5:1:9) y posterior análisis por cromatografía gaseosa con detector Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 61 selectivo de masas. El límite de detección es 0.5 µg/kg y el porcentaje de recuperación oscila entre 83 ± 7.6 para el PCB170 y 102 ± 0.7 para el PCB28. El valor más elevado que encuentran es 9.1 para el PCB153 en queso. JOHANSEN, H. R. y col. (1994) desarrollan un método para determinar nonorto y mono-orto policlorobifenilos en muestras biológicas usando un extractor de fluidos supercríticos acoplado a un cromatografo de líquidos de alta resolución y a un cromatógrafo de gases con una columna DB-5 y con detector de captura de electrones o detector de masas. La temperatura del restrictor del extractor de fluidos supercríticos es de 280 ºC y el adsorbente es alúmina activada a 190 ºC. La media de las recuperaciones realizadas en hepatopáncreas de cangrejo oscila entre 71-101 % mientras que en suero de sangre humana y leche varía entre 35-57 % y 76-87 % respectivamente. La desviación estándar relativa de los análisis completos está comprendida entre 5-16 %. MASON, C. F. y MACDONALD, S. M. (1994) determinan PCBs en excrementos de nutrias mediante cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. El límite de cuantificación es 0.01 mg/kg y las concentraciones que encuentran oscilan entre 0.23 y 46.55 mg/kg. PEREIRA, W. E. y col. (1994) investigan la presencia de PCBs en hígado de róbalo mediante cromatografía gaseosa-espectrometría de masas con una columna DB5-MS. Las concentraciones de PCBs totales que encuentran oscilan entre 35 y 270 µg/kg peso fresco. ZASADOWSKI, A. (1994) presenta los resultados obtenidos al estudiar el contenido de PCBs en grasa de jabalíes y ciervos mediante cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones de extracto disuelto en hexano. La concentración media encontrada en jabalíes es 21.8 y en ciervos 9.7 µg/kg. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 68 La cuantificación de organoclorados se realiza con un cromatógrafo de gases equipado con un detector de captura de electrones y columna capilar DB-1. El porcentaje de recuperación de organoclorados por este método fue 100 ± 13 % para insecticidas y 102 ± 15 % para PCBs. MORA, M. A. (1996) estudia las concentraciones de compuestos organoclorados y metales traza y evalúan sus posibles efectos nocivos en huevos de pájaros que anidan en el ecosistema acuático de Laguna Madre recogidos durante 1993 y 1994. Los extractos de los huevos son analizados por cromatografía gaseosa y espectrometría de masas. Los límites de detección más bajos son de 1 ng/g (peso fresco). La mediana de los niveles de DDE y PCBs en huevos de 4 especies era alrededor de 1 ng/g (peso fresco). Las recuperaciones obtenidas eran alrededor del 80 % en todos los casos. PASTOR, D. y col. (1996) estudian la bioacumulación de organoclorados (DDTs, PCBs y HCB) en 3 especies de pescados del Delta del Ebro realizando la extracción con Soxhlet usando hexano/diclorometano y cuantificando por cromatografía gaseosa con una columna DB-5 y detector de captura de electrones. Las especies, salmonete (Mullus barbatus), mújel (Mugil cephalus) y róbalo (Dicentrarcus labrax) fueron seleccionadas por sus hábitats característicos y su comportamiento alimenticio para investigar su potencial como bioindicadores en estudios de polución. Los niveles más altos de PCBs (20.3 ± 9 ng/g peso fresco) y DDTs (16.8 ± 1 ng/g ) se encuentran generalmente en el salmonete y podría ser debido al alto contenido lipídico de estas especies. Los resultados indican que la acumulación de compuestos organoclorados en pescados costeros de la misma área depende del contenido en lípidos, hábitat, ingesta alimenticia, velocidad de desarrollo y metabolismo de cada especie. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 69 VAN DER HOFF, G. R. y col. (1996) describen un método de purificación para compuestos organoclorados en muestras grasas basado en cromatografía líquida en fase-normal y separan policlorobifenilos (PCBs) de la matriz grasa con una columna empaquetada y los analizan por cromatografía de gases con una columna SE-54 o HP-1. El método muestra unas recuperaciones medias de 80-110 % en un rango de concentración de 1-510 µg/kg, con una desviación estándar relativa más baja del 10 %. Los límites de detección están en un rango de 0.5-50 µg/kg. YANG, Y. y BAUMANN, W. (1996) analizan PCBs en muestras de polvo de suelo recogidas de carreteras, calles, estación de gasolina, un túnel peatonal y estaciones de ferrocarril en algunas ciudades de Alemania. Extraen cuantitativamente 9 PCBs mediante fluidos supercríticos con CO2 a 200 bar. y 40 ºC y los analizan por cromatografía de gases con detector de masas con una columna SE-54-CB-0.25 e inyectan "on-column". Los porcentajes de recuperación oscilan entre 97 y 102 %. Los valores más altos de PCBs de 1 a 4 µg/g se encontraron en las muestras de la autopista A60 cerca de Mainz, mientras que en casi todas las otras muestras se detectaron sólo de 0.1 a 1 µg/g. HILLERY, B. R. y col. (1997) determinan las características de retención de 209 congéneres de PCBs con una fase estacionaria de p,p-cianobifenil usando cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. Los factores de respuesta se determinan con relación al PCB209. Separan en esta fase varios congéneres que habitualmente coeluyen en otras fases usadas para el análisis de PCBs, incluyendo el 138, 163 y 164. De los 209 congéneres, 61 se separaron usando la fase p, p-cianobifenil en conjunción con cromatografía de gases-detector de captura de electrones. Cuando usan cromatografía gaseosa con detector de masas, el número de congéneres determinados aumenta a 133. Por otro lado cromatografía de gases con detector de masas se usó con la fase p,p-cianobifenil para caracterizar 3 mezclas de PCBs: Aroclor1242, Aroclor1254 y Aroclor1260. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 70 YOO, W.J. y TAYLOR, L.T. (1997) comparan la extracción con CO2 ó CHF3 supercríticos con una trampa ODS y como solvente iso-octano de 21 congéneres de PCBs en muestras de mejillón liofilizado con la extracción tradicional mediante Soxhlet. Obtienen mejores porcentajes de recuperación con un tiempo prolongado de extracción estática con CO2 en los PCBs 8, 18 y 95 que el Soxhlet, no existiendo diferencias significativas en los demás congéneres. Los extractos son analizados por cromatografía de gases con detector de captura de electrones y cromatografía de gases con detector de masas equipados con una columna DB-5. ECHARRI, I. y col. (1998) determinan 22 policlorobifenilos individuales, incluyendo los non-orto-CBs más tóxicos en 52 muestras de mamíferos marinos (focas delfines y marsopas). Aislan los non-orto-clorobifenilos y monoorto-bifenilos de los diy triortoclorobifenilos usando columna cromatografía líquida de alta resolución de pirenilsílica previa extracción en Soxhlet y posterior determinación por cromatografía gaseosa con una columna CPSil8CB y con detector de captura de electrones obteniendo valores hasta 13.297 µg/kg en materia grasa. KLEIVANE, L. y col. (1998) obtienen grasa de 72 ballenas del nordeste del Atlántico en julio y agosto de 1992 y evalúan los polucionantes organoclorados entre ellos PCBs. La concentración de PCBs está en un rango entre 0.6-20.8 µg/g expresado en materia grasa. Realizan la extracción con un homogeneizador de ultrasonidos, purifican con ácido sulfúrico y posteriormente lo inyectan en un cromatógrafo de gases con detector de captura de electrones y columna SPB-5. Obtienen una recuperación en muestras sobrecargadas entre 80-110 % y el límite de detección para diferentes congéneres de PCBs varía entre 0.005-0.017 µg/g. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 71 NEWSOME, W. H. y col. (1998) analizan 40 congéneres de PCBs en alimentos grasos mediante cromatografía gaseosa con espectrometría de masas. Extraen la grasa con acetona y hexano seguida de cromatografía de gel-permeación y analizan los PCBs por cromatografía gaseosa usando una columna DB-5. El límite de cuantificación es inferior a 13 pg/g para la mayoría de los congéneres individuales de PCBs. Las concentraciones más elevadas se encuentran en pescado fresco (14114 pg/g expresado en matera fresca) SCHANTZ, M. M. y col. (1998) comparan la extracción mediante fluidos supercríticos con la extracción tradicional de Soxhlet para la determinación de congéneres de PCBs en 3 materiales de referencia estándar: SRM 1941a (sedimentos orgánicos marinos), SRM 1944 (sedimentos de tuberías de New York /New Jersey) y SRM 2974 [tejidos de mejillón (Mytilus edulis) liofilizado]. Las muestras son analizadas por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y con columna DB-1701. Llegan a la conclusión de que el extractor de fluidos supercríticos tiene varias ventajas respecto al Soxhlet para la determinación de PCBs incluyendo el reducido tiempo de extracción (50 min. comparado con 18-24 h.) y la poca cantidad de solvente orgánico usado (7.5 mL comparado con 250 mL). SINGH, A. K. y col. (1998) analizan PCBs en muestras de suelo sobrecargado, agua o plasma usando cromatografía de gases con detector de masas con columna HP-5. Las muestras de agua y plasma se extraen por un método en fase sólida usando columnas de florisil y las muestras de suelo con agua, metanol o diclorometano. El porcentaje de recuperación del método era entre 60-105 % para las muestras de agua y sólo del 2-60 % para el plasma. En las muestras de suelo sobrecargado con los polucionantes se obtenía una recuperación entre 1-30 % extrayendo con agua y 65-100 % extrayendo con metanol o diclorometano. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 72 BACON C. E. y col. (1999) comparan la cantidad de pesticidas organoclorados, PCBs y dibenzofuranos policlorados en tejido hepático de nutrias de California, Islas Aleutianas y Alaska extrayendo con hexano:diclorometano y analizando por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y columna DB-5 y DB-17. Los niveles de PCBs totales en nutrias de Islas Aleutianas (310 µg/kg) eran 1.7 veces más altos que en las de California (190 µg/kg) y 38 veces más que en las de Alaska (8 µg/kg). BISHOP, C. y col. (1999) investigan la concentración de residuos organoclorados y sus efectos polucionantes en huevos y pollos de golondrinas. Determinan los PCBs mezclando la muestra con sulfato sódico en una columna cromatográfica y eluyen con hexano; purifican con Florisil obteniendo 3 fracciones y analizan la 1ª por cromatografía gaseosa con una columna DB-5. La máxima concentración de PCBs encontrada era 11.1 µg/g en huevos. EWINS, P. J. y col. (1999) determinan niveles de contaminantes organoclorados y el espesor del caparazón de huevos de águilas blancas (Pandion haliaetus) de 3 a 15 años de edad en Michigan durante los años 1980-89. Los compuestos organoclorados eran extraídos con diclorometano: hexano y analizados por cromatografía gaseosa con columna DB-5 obteniendo unos límites de detección para los congéneres de PCBs individuales entre 0.001-0.002 mg/g. Encuentran unos valores de PCBs totales que oscilan entre 957 y 4490 µg/kg en materia fresca. McCONNELL, L. L. y col. (1999) analizan pesticidas organoclorados y policlorobifenilos en muestras de aire en Winsconsin, mediante Soxhlet y cromatografía de gases con detector de captura de electrones. Los porcentajes de recuperación obtenidos estaban en un rango de 89 ± 13 %. La concentración media de PCBs es de 330 pg/m3 y el límite de detección 46 ng. Antecedentes bibliográficos Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 73 NAJAM, A. R. y col. (1999) presentan un método analítico para identificar y cuantificar 29 congéneres específicos de PCBs y 15 pesticidas clorados en suero humano realizando la extracción con solventes orgánicos y el análisis por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y 2 columnas capilares DB-5 y DB-1701. Obtienen un porcentaje de recuperación entre el 39 y 126 % y los límites de detección oscilan entre 0.21 y 0.51 ng/mL para los congéneres individuales de PCBs. PAIN, D. J. y col. (1999) presentan los resultados de un análisis de contaminantes y el espesor del caparazón de 13 huevos de halcones de la Isla de Oleron. Analizan residuos organoclorados extrayéndolos con hexanoacetona y los analizan por cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones. El límite de detección era de 0.001 µg para los congéneres de PCBs individuales. objetivo Objetivo Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 74 OBJETIVO En esta memoria se pretende realizar un estudio en aves rapaces procedentes de los Centros de Recuperación de Fauna Salvaje de la Xunta de Galicia orientado a la determinación de hidrocarburos alifáticos, policlorobifenilos y policloroterfenilos. Estas aves corresponden a especies protegidas y de interés especial lo que dificulta la obtención de especímenes para su estudio científico. Para ello se ha puesto a punto un método de extracción mediante fluidos supercríticos que permita separar los hidrocarburos alifáticos, policlorobifenilos y policloroterfenilos de forma simultánea identificándolos mediante cromatografía gaseosa con detectores de ionización de llama y de captura de electrones. La presencia de estos compuestos en las aves, situadas en los últimos eslabones de la cadena trófica representan una gran amenaza para el bienestar de los organismos, incluido el hombre, de ahí el gran interés de su utilización como bioindicadores del medio ambiente. Parte experimental Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 75 PARTE EXPERIMENTAL 1. MATERIAL y APARATOS: - Extractor Soxhlet - Placas Petri (Ø 9 cm) - Cartuchos de celulosa WHATMAN - Desecadores de vidrio con sílica gel - Papel de filtro WHATMAN 541 (Ø 4 µm) - Cartuchos de sílica Sep-Pak ® Plus WATERS - Plato poroso - Vidrio de reloj - Otro material de uso corriente en laboratorio - Extractor de fluidos supercríticos HP 7680A - Cromatógrafo de gases CE Instruments 8000 Top equipado con detector de captura de electrones 63Ni y detector de ionización de llama e inyector automático AS 800, conectado a un ordenador personal - Estufa eléctrica Heraus T-340 - Placas calefactoras Combimax 230 A - Balanza analítica Salter ER-120 A con una aproximación de 0.1 mg - Arcon congelador Edesa - Ordenador personal Pentium AOC Spectrum (CPU: 120 MHz; RAM: 16 MB; disco duro: 1.2 GB), con los programas: - Chrom-Card versión 1.18 para Windows 95 versión 4.00 - Microsoft Office 97 - Statgraphics 2.0 - Harvard Graphics 4.0 - ACD.Labs 3.60 (www.ACDlabs.com) - Winfirst 3.57 - MassLab 1.3 - Chapman&Hall. The Combine Chemical Dictionary 2.2 (Diciembre, 1998) Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 82 7. PURIFICACIÓN El eluato obtenido en la extracción se concentra a 1 mL mediante corriente de aire, se pasa a través de una minicolumna sep-pak de adsorción rellena de sílica y se eluye con hexano hasta un volumen final de 10 mL (Fig. 40). Se evapora la solución resultante a sequedad con aire y el residuo se redisuelve en 1 mL de n-hexano, quedando así preparado para el análisis por cromatografía de gases. Figura 40: Esquema del sistema de purificación Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 83 8. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Se analizan hidrocarburos alifáticos, PCBs y PCTs simultáneamente mediante cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama para los hidrocarburos y detector de captura de electrones para PCBs y PCTs; se utiliza una columna capilar SGL-5 de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 5 % difenilmetilsilicona como fase estacionaria, que va conectada mediante una unión "Y-Splitter" OHIO VALLEY de vidrio Ref. ML-200 a cada detector (Fig. 41). Figura 41: Cromatógrafo de gases y ordenador CONDICIONES ANALÍTICAS El gas portador es nitrógeno a una presión en cabeza de la columna de 14.7 psi y un flujo de 1mL/min. Se inyecta 1µL en modo "split-splitless", abriéndose la válvula del inyector 60 seg. después de la inyección con una relación de flujo 30:1. La temperatura del inyector se mantiene a 280 ºC mientras que la de los detectores es de 320 ºC Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 84 La temperatura de la estufa se inicia a 50 ºC durante 1 minuto, aumentándose hasta 175 ºC a razón de 20 ºC/min. y posteriormente a 3 ºC/min. hasta alcanzar 320 ºC, manteniendo finalmente esta temperatura durante 15 minutos. La duración total del análisis es de 70 minutos. IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS, PCBs Y PCTs La identificación se realiza comparando los tiempos de retención de cada pico (Fig. 42-44) obtenido en el cromatograma de la muestra con el de un patrón inyectado antes o después de cada grupo de muestras en las mismas condiciones cromatográficas. Figura 42: Cromatograma de un patrón de hidrocarburos alifáticos con detector de ionización de llama Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 85 Figura 43: Cromatograma de un patrón de Aroclor1260 y Aroclor5460 con detector de captura de electrones Figura 44: Cromatograma de un patrón de PCBs individuales con detector de captura de electrones Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 86 La cuantificación se lleva a cabo con el método del estándar externo, relacionando el factor de respuesta del patrón con área y concentración conocidos con el de la muestra. FRp= Ap/CpFRm= Am/Cm Ambos factores de respuesta coinciden cuando se parte del mismo analito: Ap/Cp= Am/Cm Cm=(Am x Cp)/Ap La cuantificación de otros hidrocarburos expresados en C18 se ha realizado a partir del cromatograma patrón de n-alcanos (Fig. 45). Figura 45: Cromatograma de un patrón de n-alcanos con detector de ionización de llama Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 87 PRECISIÓN DE LA TÉCNICA DE INYECCIÓN La precisión del inyector automático se determina inyectando 6 veces una solución patrón con 16 mg/L de hidrocarburos alifáticos, 6 mg/L de Aroclor1260, 12 mg/L de Aroclor5460 y 0.3 mg/L de los congéneres individuales PCB101, PCB206, PCB180 y PCB138. Los resultados obtenidos se recogen en las tablas IV y V. Tabla IV: Precisión de la técnica de inyección de hidrocarburos alifáticos Pristano C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 RSD % 0.95 0.99 1.00 0.83 1.22 1.48 1.46 2.54 2.72 Tabla V: Precisión de la técnica de inyección de PCBs y PCTs. Aroclor 1260 Aroclor 5460 PCB 101 PCB 206 PCB 180 PCB 138 RSD % 2.11 1.66 0.45 0.20 0.41 1.33 CALIBRACIÓN DE LOS DETECTORES Se inyectaron 3 escalas de 7 concentraciones diferentes de patrones de hidrocarburos alifáticos (entre 0.090 y 38.7 mg/L), Aroclor1260 (0.00896-12.5 mg/L), Aroclor5460 (0.26-13.2 mg/L) y PCBs individuales (0.0020-1.84 mg/L), obteniendo los coeficientes de regresión lineal recogidos en las tablas VI y VII. (Fig. 46-48) Tabla VI: Coeficientes de correlación de las rectas de calibrado de los hidrocarburos Pristano C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 r>0.9991 >0.9989 >0.9992 >0.9991 >0.9995 >0.9995 >0.9988 >0.9985 >0.9969 Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 88 Tabla VII: Coeficientes de correlación de las rectas de calibrado de PCBs y PCTs Aroclor 1260 Aroclor 5460 PCB 101 PCB 206 PCB 180 PCB 138 r>0.9950 >0.9966 >0.9978 >0.9969 >0.9953 >0.9966 Figura 46: Rectas de calibrado de hidrocarburos alifáticos ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ! ! ! ! ! ! & & & & & & & , , , , , , , ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ! ! ! ! ! ! ! & & & & & & & , , , , , , , ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ 0 10 20 30 40 Concentración (mg/L) 0 5000 10000 15000 20000 25000 -5000 Areas Fig. Pristano C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 Parte experimental Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 89 Figura 47: Rectas de calibrado de PCBs individuales Figura 48: Rectas de calibrado de Aroclor1260 y Aroclor5460 ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ 0 2 4 6 8 10 12 14 Concentración (mg/L) 0 20000 40000 60000 80000 100000 Areas A5460 A1260 ! ! ! ! ! ! & & & & & & , , , , , , ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ ∋ 00,5 11,5 22,5 Concentración (mg/L) 0 5000 10000 15000 20000 25000 Areas PCB101 PCB206 PCB180 PCB138 Resultados y discusión Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 90 RESULTADOS y DISCUSIÓN METODOLOGÍA 1. HUMEDAD y GRASA Inicialmente, se ha hecho un estudio con muestras comerciales de hígado de pollo fresco para conocer el número de horas que deben permanecer en estufa a temperatura de 70 ºC para alcanzar peso constante (la diferencia de pesada entre dos determinaciones simultáneas no debe ser superior a 0.1 g de agua por 100 g de muestra). Se han hecho determinaciones sobre la misma muestra, con tres cantidades diferentes de pesada en muestra fresca: 0.5, 2 y 5 g. La temperatura se ha fijado a 70 ºC para evitar modificaciones en la grasa, ya que las sustancias objeto de este estudio presentan un alto carácter lipofílico y a temperaturas más altas se observaba una separación de la misma. El estudio se ha empezado en 12 horas, incrementándose cada 2 horas hasta un total de 24, alcanzándose peso constante en 14 horas si la muestra es inferior a 1 g y 20 horas si es superior. Se han determinado los porcentajes de humedad y grasa en vísceras de las 3 especies de aves rapaces estudiadas: ratonero, lechuza y cárabo. En la tabla VIII se recogen los resultados estadísticos de humedad y grasa y en las siguientes (IX-XI) el porcentaje de humedad para la totalidad de las muestras (232) y la cantidad de grasa (sss) para las 87. En dichas tablas se observa que la media de la humedad es del orden del 76 % con un 4 de RSD %, mientras que el contenido en grasa un valor medio próximo al 11 % con RSD de 7%. Por vísceras, en el hígado es donde se encuentra la mayor cantidad de grasa y el menor porcentaje de humedad y el músculo es la que posee menos grasa. No se observan diferencias significativas entre sexos ni entre las diferentes especies (Fig. 49-51). Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 97 De las distintas trampas (octadecilsilano, diol, florisil...) que se pueden utilizar para la recogida de los analitos, se ha seleccionado una trampa de bolas de acero inoxidable ya utilizada por Tang y col. (1993), Alley y col. (1995), Hale y col. (1996), Chesler y col. (1997), Liang y col. (1998). Como solvente de elución se ha utilizado el n-hexano, ya empleado para la extracción de PCBs, PCTs e hidrocarburos en todo tipo de muestras por varios investigadores como Porter y col. (1992), Djordjevic y col. (1994), Bernal y col. (1995), Fernández y col. (1996), Chesler y col. (1997), Morselli y col. (1998), sin embargo otros autores utilizan acetona (Ezzel y col., 1995), isooctano (Yoo y col., 1997), tolueno (Yang y col., 1996), etc. La elución completa de los analitos retenidos en la trampa se ha conseguido con un volumen total de 7.5 mL recogido en 5 viales. Para las condiciones de trabajo finalmente seleccionadas, recogidas en la parte experimental, se han obtenido porcentajes de recuperación en alúmina superiores al 93 % para todos los analitos en los 2 niveles de concentración estudiados excepto para el pristano y C18 (26-57 %) (Tabla XIII). Estos valores son, de todas maneras, mucho mejores que los recogidos en la bibliografía (Johansen y col., 1992; LópezÁvila y col., 1992; Tang y col., 1993; Djorjevic y col., 1994). Los resultados de RSD % para los hidrocarburos de cadena más corta (pristanoC20) oscilan entre 4.6 y 12.5 % mientras que para el resto son inferiores al 4 %; para el Aroclor 5460 está por debajo del 2 % y en el Aroclor 1260 oscila entre 2-5 % dependiendo de la concentración añadida. Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 98 Tabla XIII: RSD % y % de recuperacion obtenidas al someter por sextuplicado al procedimiento experimental una muestra de alúmina sobrecargada con los analitos investigados Componente Cantidad añadida (µg) Cantidad media encontrada. (n=6) (µg) Recuperación ( %) RSD % Pristano 22.6 10.5 5.9 5.2 26 50 12.5 12.6 C18 23.2 10.8 13.2 5.2 57 49 6.7 11.1 C19 21.1 9.8 19.8 7.6 94 78 6.6 10.0 C20 23.6 11.0 22.9 10.2 97 93 4.6 6.5 C22 18.4 8.6 17.8 8.4 97 98 3.7 0.76 C24 23.1 10.8 22.4 10.5 97 98 3.0 1.76 C28 22.1 10.3 21.4 10.2 97 98 3.2 1.3 C32 21.2 10.3 20.8 10.1 98 98 3.9 0.41 C36 21.2 9.9 21.0 9.8 99 98 1.6 1.1 A1260 6.2 1.0 5.8 0.98 94 98 5.4 2.1 A5460 6.6 1.0 6.5 0.96 98 96 1.1 1.81 3. PURIFICACIÓN Se han purificado los extractos obtenidos a través de cartuchos Sep-Pak de sílica eluyendo con hexano, siguiendo las pautas recomendadas por Carril y col. (en prensa), LópezÁvila y col. (1992), Najam y col. (1999), aunque otros autores utilizan florisil (Lee y col., 1996) o ácido sulfúrico (Pastor y col., 1996). Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 99 4. ANÁLISIS GASCROMATOGRÁFICO COLUMNA y DETECTORES Se ha seleccionado, para el análisis cromatográfico, una columna capilar semipolar SGL-5 ya utilizada por nosotros para el análisis de estos analitos en muestras biológicas (Carril y col., 1996). La columna va unida mediante una "Y-splitter" a 2 detectores: detector de ionización de llama para determinar los hidrocarburos y detector de captura de electrones para los PCBs y PCTs, cuyos cromatogramas se obtienen simultáneamente con una sola inyección (Fig. 54). Figura 54: Columna capilar y su conexión con el inyector y detectores Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 100 LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN Los límites de detección y cuantificación se calculan según el método propuesto por Knoll (1985) y los resultados obtenidos se recogen en las tablas XIV y XV para hidrocarburos alifáticos y PCBs y PCTs, respectivamente, encontrando que el LD para los hidrocarburos oscila entre 8.2 y 44 µg/L para el pristano y C36 respectivamente y el LQ entre 24 y 113 µg/L para los mismos hidrocarburos. Los Aroclor presentan LD y LQ más bajos, siendo el PCB206 el mejor detectado. Tabla XIV: Límites de detección y cuantificación de los hidrocarburos alifáticos Pristano C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 LD (µµg/L) 8.2 10 14 11 14 16 21 25 44 LQ (µµg/L) 24 30 42 33 42 48 62 73 113 Tabla XV: Límites de detección y cuantificación de PCBs y PCTs Aroclor1260 Aroclor5460 PCB101 PCB206 PCB180 PCB138 LD (µµg/L) 0.622 2.75 0.59 0.47 0.66 3.60 LQ (µµg/L) 1.81 8.02 1.75 1.37 1.90 10.52 RECUPERACIÓN y PRECISIÓN DEL MÉTODO 0.5 g de hígado de pollo, previamente analizado para comprobar que no contenía los analitos investigados, se sobrecargaron con 2-3 niveles de concentración de soluciones patrón de hidrocarburos alifáticos, Aroclor1260, Aroclor5460 y los 4 PCBs individuales, por sextuplicado, para determinar la precisión del método, obteniendo porcentajes de recuperación superiores al 88 % en todos los casos excepto en el pristano y C18 (53-78 %). Los valores de RSD % son siempre inferiores a 9 salvo para el pristano, C28 y C32 que dependiendo del nivel de sobrecarga superan este valor (Tabla XVI) (Fig. 55 y 56). Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 101 Tabla XVI: RSD % y % de recuperación obtenidas al someter por sextuplicado al procedimiento experimental una muestra de hígado de pollo sobrecargada con los analitos investigados Componente Cantidad añadida (µµg) Cantidad media encontrada. (n= 6) (µµg) Recuperación ( %) RSD % Pristano 22.6 10.5 0.949 14.2 5.5 0.673 63 53 71 11.7 14.9 4.4 C18 23.2 10.8 0.975 18.5 8.4 0.916 80 78 94 7.4 7.4 2.4 C19 21.1 9.8 0.887 18.5 8.2 0.576 88 84 65 6.2 8.6 7.1 C20 23.6 11.0 0.993 22.4 10.2 0.973 95 93 98 2.8 6.9 1.8 C22 18.4 8.6 0.775 17.6 7.7 0.736 96 90 95 2.3 4.6 4.2 C24 23.1 10.8 0.972 22.4 9.7 0.563 97 90 58 2.6 4.2 3.8 C28 22.1 10.3 0.932 20.9 8.7 0.689 95 85 74 5.3 4.5 16.3 C32 21.2 10.3 0.930 20.9 8.7 0.725 98 85 78 3.4 6.3 28.16 C36 21.2 9.9 21.2 8.3 100 84 5.4 9.3 Aroclor260 6.2 1.0 0.0089 5.7 0.91 0.0084 93 91 95 2.8 4.9 5.1 Aroclor5460 6.6 1.0 5.9 0.8 90 83 4.1 8.8 PCB101 1.06 0.025 0.932 0.024 98 94 2.9 4.0 PCB206 1.00 0.025 0.98 0.023 98 92 6.8 4.3 PCB180 0.94 0.023 0.912 0.021 97 92 3.9 3.8 PCB 38 0.92 0.023 0.809 0.018 88 81 3.7 7.9 Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 102 Figura 55: Overlay de: cromatograma patrón de hidrocarburos alifáticos y cromatograma de una muestra de hígado de pollo sobrecargada con hidrocarburos alifáticos Figura 56: Overlay de: cromatograma patrón de PCBs y PCTs y cromatograma de una muestra de hígado de pollo sobrecargada con PCBs y PCTs Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 103 HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS Se han estudiado 9 hidrocarburos alifáticos que junto con sus tiempos de retención aparecen en la tabla XVII Tabla XVII: Tiempos de retención de los hidrocarburos alifáticos en cromatografía de gasesdetector de ionización de llama Pristano C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 TR (min.) 12.1 13.8 15.8 18.0 22.8 27.8 37.3 45.9 53.6 Para la cuantificación de estos compuestos, es necesario, una vez obtenido el cromatograma correspondiente, restar el blanco de la alúmina. En las tablas XVIII-XX se recogen los niveles de concentración de los hidrocarburos alifáticos presentes en las muestras analizadas expresados en el hidrocarburo correspondiente cuando se trata de la cuantificación individual o en C18 cuando se cuantifican los hidrocarburos totales, el fitano y los picos no identificados y todos ellos expresados en mg/kg de materia seca. Se ha identificado la presencia de fitano, hidrocarburo utilizado junto con el pristano para conocer la degradación microbiana, aunque en este caso lo hemos encontrado sólo en tres muestras: - Intestino de ratonero (Ra2): 0.00557 mg/kg sss - Músculo de ratonero (Ra4): 0.0373 mg/kg sss - Pulmón de lechuza (Le2): 35.1 mg/kg sss. (Fig. 57) Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 104 Figura 57: Cromatograma de muestra de pulmón de lechuza Le2 en cromatografía de gasesdetector de ionización de llama. Se ha aplicado el programa informático "Statgraphics" a los resultados obtenidos en las muestras de las 3 especies analizadas que se recogen en las tablas XXIXXIII. Con relación a los hidrocarburos individuales, los valores medios más elevados corresponden al C20 y C18 en ratonero y lechuza y al C18 en cárabo mientras que los menores al pristano, C19 y C32 en ratonero y lechuza con un valor no detectable de pristano, C19, C20 y C22 en cárabo. El cuartil inferior de las muestras no presenta ningún hidrocarburo individual y en el superior sólo hay C18. En cuanto a los totales identificados y picos no identificados, en el ratonero se encuentran los valores más altos y los más bajos en el cárabo. Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 105 Tabla XVIII: Resultados de hidrocarburos alifáticos (mg/kg sss) en muestras de ratonero (Ra) Código Víscera Prist. C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 HCtotales PNI Ra1 Hígado 0.355 0.370 ND 1.2 0.593 0.287 0.337 0.324 0.331 5.46 9.44 Ra2 Hígado 0.631 0.477 0.075 0.875 0.452 0.187 ND 0.222 ND 4.65 42.5 Ra3 Hígado 0.275 8.07 2.56 0.493 0.425 0.342 ND 0.427 3.23 16.4 625 Ra4 Hígado 0.155 0.442 ND 0.502 0.242 ND 0.217 0.496 0.412 2.82 130 Ra5 Hígado 0.431 2.29 ND 1.19 0.952 0.356 ND ND 1.69 7.18 231 Ra6 Hígado ND 0.295 ND 0.240 0.176 ND 0.410 ND ND 3.73 108 Ra7 Hígado NQ 0.556 ND 0.547 0.443 ND ND 0.345 ND 2.48 8.31 Ra8 Hígado ND 0.615 ND 1.73 0.896 ND ND ND ND 5.79 7.63 Ra9 Hígado 0.198 4.73 0.425 3.33 0.594 ND ND ND ND 7.52 133 Ra10 Hígado ND 2.23 0.229 1.96 ND ND ND ND ND 6.91 54.0 Ra1 Corazón 2.39 2.01 0.424 4.61 2.66 1.38 ND 0.680 NQ 21.5 141 Ra2 Corazón 0.610 0.461 0.148 0.937 0.478 0.191 ND 0.224 ND 4.76 122 Ra3 Corazón ND 1.11 ND 1.46 0.890 ND ND ND 1.52 6.61 186 Ra4 Corazón ND 0.443 ND 0.614 0.340 ND 0.375 0.374 0.248 3.04 4.08 Ra5 Corazón ND 0.741 ND 1.30 0.732 0.315 0.682 ND ND 5.37 145 Ra6 Corazón 0.077 0.586 ND 0.662 0.371 0.265 ND ND ND 2.97 5.94 Ra7 Corazón 0.369 1.31 ND 1.77 ND 2.41 ND ND ND 6.79 57.6 Ra8 Corazón ND 0.930 ND 2.05 1.09 ND ND ND ND 7.23 7.84 Ra9 Corazón ND 0.672 ND 0.905 ND ND 1.34 ND ND 1.23 35.4 Ra10 Corazón 0.165 0.906 ND 1.17 ND ND 3.01 ND ND 5.06 40.4 Ra1 Pulmón 4.99 2.08 ND 5.22 3.02 1.71 1.90 1.77 1.18 28.6 49.0 Ra2 Pulmón 1.18 0.764 ND 2.07 1.11 0.469 0.790 0.887 0.763 10.4 28.9 Ra3 Pulmón ND 2.65 NQ 4.52 3.35 2.34 5.24 5.71 4.54 29.8 61.6 Ra4 Pulmón ND 0.890 ND 0.965 0.666 ND 0.764 0.854 0.817 5.55 25.8 Ra5 Pulmón 0.268 1.86 ND 1.53 1.05 0.453 ND ND ND 7.53 113 Ra6 Pulmón ND 0.740 ND 1.663 1.17 ND ND NQ ND 5.66 46.6 Ra7 Pulmón ND 1.31 ND 1.62 ND ND ND ND ND 7.80 9.98 Ra8 Pulmón ND 2.84 ND 4.791 2.27 ND ND ND ND 19.0 24.9 Ra9 Pulmón ND 1.93 ND 2.63 0.807 ND ND ND ND 2.07 83.7 Ra10 Pulmón ND 1.83 0.849 2.64 1.60 ND ND ND ND 10.3 25.1 Ra2 Intestino 0.642 0.524 0.059 0.819 0.485 0.241 0.371 0.541 0.453 4.98 35.9 Ra3 Intestino ND 1.05 ND 1.34 0.732 ND ND NQ 0.793 5.67 30.2 Ra4 Intestino 0.059 0.164 NQ 0.270 0.191 ND ND ND ND 1.06 1.27 Ra5 Intestino ND 0.530 ND 0.862 0.540 ND ND ND ND 3.20 16.1 Ra7 Intestino ND 0.985 ND 1.49 ND ND 5.81 ND ND 6.55 7.78 Ra8 Intestino ND 1.28 ND 0.620 ND ND ND ND ND 2.06 13.7 Ra9 Intestino ND 0.595 ND 0.734 0.467 ND ND ND ND 2.64 7.40 Ra10 Intestino ND 0.790 ND 1.49 0.815 ND ND ND ND 4.48 11.2 Ra1 Riñón 2.80 1.56 ND 3.31 1.85 0.747 0.354 0.504 0.698 16.7 61.9 Ra2 Riñón 1.18 0.994 NQ 1.94 1.05 0.437 0.185 0.413 0.340 9.40 57.7 Ra3 Riñón ND 2.16 ND 3.20 1.84 0.948 1.34 2.41 1.26 17.3 47.7 Ra4 Riñón 0.189 1.26 ND 1.50 0.992 ND ND 0.442 1.09 7.42 54.0 Ra5 Riñón 0.268 1.49 ND 1.53 1.05 0.453 ND ND ND 5.74 61.2 Ra6 Riñón 0.307 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.51 2.97 Ra7 Riñón ND 1.41 ND 1.62 ND ND ND ND ND 5.92 6.52 Ra8 Riñón ND 1.01 ND 2.25 1.21 ND ND ND ND 7.85 8.06 Ra9 Riñón ND 2.71 ND 2.63 0.807 ND ND ND ND 8.54 51.0 Ra10 Riñón NQ 4.28 ND 5.47 3.07 3.280 27.8 ND ND 28.3 31.7 Ra2 Músculo ND 0.237 ND 0.280 0.191 0.105 0.230 0.341 0.289 5.13 1.72 Ra3 Músculo ND 0.696 NQ 1.14 0.821 0.223 ND ND 1.53 21.8 137 Ra4 Músculo 0.037 0.342 NQ 0.392 0.209 0.098 0.119 0.080 ND 1.93 2.85 Ra5 Músculo ND 0.495 NQ 0.589 0.354 0.135 ND ND ND 2.45 147 Ra6 Músculo 0.138 0.542 ND 0.917 0.531 ND ND ND ND 3.28 2.58 Ra7 Músculo ND 16.73 ND 31.65 14.01 ND ND ND ND 125.55 93.52 Ra8 Músculo ND ND ND 0.709 ND ND ND ND ND 1.14 0.67 Ra9 Músculo ND 0.557 ND 0.796 ND ND ND ND ND 3.21 24.75 Ra10 Músculo ND 0.516 ND 0.725 0.274 ND ND ND ND 2.57 5.58 Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 106 Tabla XIX: Resultados de hidrocarburos alifáticos (mg/kg sss) en muestras de lechuza (Le) Código Víscera Prist. C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 HCtotales PNI. Le1 Corazón 0.377 2.61 ND 5.00 2.85 ND ND ND ND 18.2 22.5 Le2 Corazón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 59.3 Le3 Corazón ND 0.855 ND ND ND ND ND ND ND ND 10.5 Le4 Corazón ND ND ND 0.293 ND ND ND ND 1.89 3.36 14.5 Le5 Corazón ND ND ND ND ND 0.603 ND ND ND 0.360 53.8 Le6 Corazón ND ND ND ND 3.14 4.56 5.60 6.66 6.57 10.6 2.10 Le7 Corazón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 5.54 Le8 Corazón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 3.55 Le9 Corazón ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.88 36.8 Le10 Corazón ND 1.48 ND ND ND ND ND ND ND 0.68 61.1 Le1 Hígado ND 4.13 0.458 0.656 ND ND ND ND ND 11.5 98.9 Le2 Hígado ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 20.8 Le3 Hígado ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 31.1 Le4 Hígado ND 3.38 ND 1.05 ND ND ND ND ND 6.60 136 Le5 Hígado ND 6.25 ND ND ND ND ND ND ND 8.92 348 Le6 Hígado ND 1.78 ND 0.281 ND ND ND ND ND 3.34 218 Le7 Hígado ND 1.14 ND 0.257 ND ND ND 0.334 ND 2.24 65.8 Le8 Hígado ND 0.729 ND ND ND ND ND ND ND 3.35 179 Le9 Hígado ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.600 39.1 Le10 Hígado ND 6.64 ND ND ND ND ND ND ND 21.4 344 Le1 Músculo NQ ND ND 0.660 0.727 ND 1.57 ND ND 1.55 35.5 Le3 Músculo ND ND ND ND ND ND 1.159 ND ND 0.480 46.78 Le4 Músculo ND 0.329 ND 0.384 ND ND ND ND 0.387 1.68 24.5 Le5 Músculo ND 0.512 ND 0.208 ND ND ND ND ND 1.64 32.7 Le6 Músculo ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 1.56 Le7 Músculo ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.28 Le8 Músculo ND NQ ND ND ND ND ND ND ND 0.0660 2.79 Le9 Músculo ND 0.386 ND ND ND ND ND ND ND 0.390 2.26 Le10 Músculo ND 0.855 ND ND ND ND ND ND ND 1.61 32.4 Le1 Pulmón ND 6.69 ND 16.7 9.40 ND ND ND ND 38.7 71.9 Le2 Pulmón ND 7.95 ND 3.54 ND ND ND ND ND 11.4 78.8 Le3 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND 7.16 318 Le4 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 48.2 Le5 Pulmón ND ND ND ND ND 1.43 ND ND ND 0.860 11.7 Le6 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Le7 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 14.9 Le8 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 5.92 Le9 Pulmón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 28.5 Le10 Pulmón ND 5.79 ND ND ND ND ND ND ND 34.5 280 Le1 Riñón ND 2.65 ND 5.68 4.07 ND ND ND 7.50 19.8 17.8 Le2 Riñón ND ND ND ND ND 1.37 ND ND ND 1.82 49.4 Le3 Riñón ND 2.75 ND ND ND ND ND ND ND 2.75 28.9 Le4 Riñón ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.64 90.7 Le5 Riñón ND 1.38 ND ND ND ND ND ND ND 2.86 71.8 Le6 Riñón ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.950 64.8 Le7 Riñón ND ND ND 1.44 ND 1.27 ND ND ND 3.40 57.4 Le8 Riñón ND 2.678 ND ND ND ND ND ND ND 7.41 149 Le9 Riñón ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 10.8 Le10 Riñón ND 0.781 ND ND ND ND ND ND ND 0.780 17.6 Le1 Intestino ND 3.54 ND 8.74 5.68 ND ND ND ND 29.4 25.0 Le2 Intestino ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 7.68 Le3 Intestino ND ND ND ND 8.57 16.7 24.0 ND ND 1.80 23.7 Le4 Intestino ND 4.24 ND ND ND ND ND ND ND 4.24 30.8 Le5 Intestino ND ND ND ND ND ND ND ND ND 1.51 36.1 Le7 Intestino ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 2.01 Le8 Intestino ND 0.368 ND 0.315 0.254 ND ND ND 0.510 1.02 9.81 Le9 Intestino ND 12.6 ND ND ND ND ND ND ND 12.7 24.6 Le10 Intestino ND 0.986 ND ND ND 1.27 ND ND ND 2.76 5.96 Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 113 Figura 59: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según la edad Figura 61: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según la edad Figura 60: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según la edad Figura 62: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según la edad pristano c18 c19 c20 c22 c24 c28 c32 c36 0 1 2 3 4 5 6 7 mg/Kg Adulto Inmaturo Hctotales PNI 0 20 40 60 80 mg/Kg Adulto Inmaturo pristano c18 c19 c20 c22 c24 c28 c32 c36 0 1 2 3 4 5 6 7 mg/Kg Adulto Inmaturo Hctotales PNI 0 20 40 60 80 mg/kg Adulto Inmaturo Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 114 Los valores medios de hidrocarburos alifáticos en relación con la provincia aparecen en la tabla XXIX-XXXI. Las muestras de ratonero procedentes de Lugo son las menos polucionadas, las de Ourense son las que tienen más hidrocarburos totales identificados y en Pontevedra es donde se encuentran valores más elevados de C28. Las muestras de lechuza de A Coruña son las que presentan mayores niveles de hidrocarburos salvo el C24 y C28 que son mayores en Ourense (Fig. 63-66). De cárabo sólo se dispone de muestras de la provincia de Pontevedra. Tabla XXIX: Valores medios de hidrocarburos alifáticos en ratonero según la provincia mg/kg A CORUÑA n=23 LUGO n=5 OURENSE n=18 PONTEVEDRA n=11 PRISTANO 0.685 0.139 0.059 0.033 C18 1.332 1.109 1.838 1.801 C19 0.142 ND ND 0.137 C20 1.703 1.095 3.164 1.987 C22 1.028 0.726 1.311 0.694 C24 0.441 0.252 0.149 0.298 C28 0.531 0.136 0.345 3.153 C32 0.726 ND 0.019 ND C36 0.847 0.337 ND ND HCtotales 10.371 4.788 12.021 7.341 PNI 85.578 119.93 27.559 38.171 Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 115 Figura 63: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según la provincia Figura 64: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según la provincia Tabla XXX: Valores medios de hidrocarburos alifáticos en lechuza según la provincia mg/kg A CORUÑA n=11 LUGO n=0 OURENSE n=12 PONTEVEDRA n=35 PRISTANO 0.034 SM ND ND C18 2.507 SM 0.964 1.269 C19 0.0416 SM ND ND C20 3.727 SM 0.144 0.071 C22 2.066 SM 0.714 0.102 C24 0.124 SM 1.395 0.261 C28 0.142 SM 2.079 0.159 C32 ND SM ND 0.199 C36 0.682 SM 0.189 0.202 HCtotales 12.041 SM 2.392 3.565 PNI 44.320 SM 1.811 13.197 0 100 200 300 mg/kg Hctotales PNI A Coruña Lugo Ourense Pontevedra 0 1 2 3 4 5 6 7 8 mg/kg PRISTANO C18 C19 C20 C22 C24 C28 C32 C36 A Coruña Lugo Ourense Pontevedra Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 116 Figura 65: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según la provincia Figura 66: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según la provincia Tabla XXXI: Valores medios de hidrocarburos alifáticos en cárabo según la provincia mg/kg PONTEVEDRA n=30 PRISTANO ND C18 0.264 C19 ND C20 ND C22 ND C24 0.029 C28 0.069 C32 0.171 C36 0.272 HCtotales 0.761 PNI 39.796 0 1 2 3 4 5 mg/kg Pristano c18 c19 c20 c22 c24 c28 c32 c36 A Coruña Ourense Pontevedra 0 50 100 150 200 mg/kg Hctotales PNI A Coruña Ourense Pontevedra Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 117 En la tabla XXXII se recogen los resultados correspondientes a los valores medios de hidrocarburos alifáticos en las tres especies con relación al sexo. En las muestras de ratonero se observan valores más elevados de todos los analitos, excepto el pristano, en el macho. Las hembras de lechuza tienen valores más elevados de todos los analitos excepto el C18, C32 y C36. Las hembras de cárabo están más polucionadas en aquellos hidrocarburos que son detectados (Fig. 67-72). Tabla XXXII: Valores medios de hidrocarburos alifáticos en ratonero, lechuza y cárabo según el sexo RATONERO LECHUZA CÁRABO HEMBRA n=21 MACHO n=36 HEMBRA n=36 MACHO n=22 HEMBRA n=12 MACHO n=18 PRISTANO 0.557 0.171 0.0105 ND ND ND C18 1.091 1.837 1.444 1.436 0.313 0.231 C19 0.040 0.109 0.013 ND ND ND C20 1.575 2.510 1.102 0.252 ND ND C22 0.747 1.189 0.876 0.151 ND ND C24 0.214 0.358 0.592 0.269 ND 0.049 C28 0.393 1.265 0.743 0.254 0.173 ND C32 0.263 0.320 0.009 0.302 0.428 ND C36 0.227 0.456 0.222 0.402 0.681 ND HCtotales 6.448 11.782 6.299 2.690 1.407 0.329 PNI 46.682 69.543 69.809 44.980 54.926 29.708 Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 118 Figura 67: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de ratonero según el sexo Figura 68: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de ratonero según el sexo Figura 69: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de lechuza según el sexo Figura 70: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de lechuza según el sexo pristano c19 c22 c28 c36 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 mg/Kg Hembra Macho Hctotales PNI 0 20 40 60 80 mg/Kg Hembra Macho pristano c18 c19 c20 c22 c24 c28 c32 c36 0,0 0,5 1,0 1,5 mg/Kg Hembra Macho Hctotales PNI 0 20 40 60 80 mg/Kg Hembra Macho Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 119 Figura 71: Valores medios de hidrocarburos alifáticos individuales en muestras de cárabo según el sexo Figura 72: Valores medios de hidrocarburos totales y picos no identificados en muestras de cárabo según el sexo ANÁLISIS DE LA VARIANZA Se ha aplicado el análisis de la varianza a las muestras analizadas (intervalo de confianza 95 % y nivel de significación 0.05) con el fin de averiguar si existen diferencias significativas en los niveles de polución entre los seis tipos de vísceras, las cuatro provincias gallegas, la edad, sexo y especie. En las figuras 73-84 se observa que existen diferencias significativas entre los niveles de concentración de C18 con respecto a la edad; de C20 en función de edad, especie y provincia; de C22 según la provincia; de los hidrocarburos totales identificados en función de la edad y especie y de los picos no identificados según la víscera. También se han observado diferencias significativas entre los niveles de concentración de C20 en ratonero según la edad así como para los hidrocarburos totales identificados en lechuza en función de la edad, provincia y tipo de víscera. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Hembra Macho Hctotales PNI 0 20 40 60 Hembra Macho Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 120 Figura 73: Análisis de varianza del C18 en función de la edad 20 (mg/kg) Adulto Inmaturo Figura 74: Análisis de varianza del C20 en función de la edad 18 (mg/kg) Adulto Inmaturo Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 121 Figura 75: Análisis de varianza del C20 en función de la especie Figura 76: Análisis de varianza del C20 en función de la provincia Niveles de C 20 (mg/kg) Ratonero Cárabo Lechuza A Coruña Lugo Ourense Pontevedra Resultados y discusión Tesis Doctoral: T. López y López-Leitón 122 Figura 77: Análisis de varianza de C22 en función de la provincia A Coruña Lugo Ourense Pontevedra 22 (mg/kg) Adulto Inmaturo HC totales identificados (mg/kg) Figura 78: Análisis de varianza de los hidrocarburos totales identificados en función de la edad