Cryptosporidium en moluscos bivalvos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA LABORATORIO DE PARASITOLOGÍA CRYPTOSPORIDIUM EN MOLUSCOS BIVALVOS MEMORIA que para optar al Grado de Doctor en Farmacia presenta Hipólito Gómez Couso Santiago de Compostela, 2005 Mª Elvira Ares Mazás, Profesora Titular de Parasitología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMA: Que el trabajo de investigación titulado “Cryptosporidium en moluscos bivalvos”, que presenta el Licenciado en Farmacia D. Hipólito Gómez Couso para optar al Grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizado bajo mi dirección en el Laboratorio de Parasitología de este Departamento y, hallándose concluido, autorizo su presentación a fin de que pueda ser juzgado por el Tribunal correspondiente. En Santiago de Compostela, a 12 de diciembre de 2005 Fdo. Mª Elvira Ares Mazás Ana María Otero Casal, Profesora Titular de Microbiología y Secretaria del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Cryptosporidium en moluscos bivalvos”, que presenta el Licenciado en Farmacia D. Hipólito Gómez Couso para optar al Grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizado bajo la dirección de la Prof. Dra. Dña Mª Elvira Ares Mazás en el Laboratorio de Parasitología de este Departamento. Y para que así conste y a los efectos oportunos expido el presente certificado en Santiago de Compostela, a 12 de diciembre de 2005. Fdo. Ana María Otero Casal A mis padres , hermanos y aVânia AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quisiera hacer constar mi más sincero agradecimiento a la Prof. Dra. Dña. Mª Elvira Ares Mazás por la dirección, apoyo permanente y horas de trabajo dedicadas a la elaboración de esta Tesis Doctoral, así como por su gran paciencia, entusiasmo y valiosos consejos. Deseo expresar, también, mi afecto a la Dra. Dña. Rosario García Ramos por sus enseñanzas y orientación en un momento confuso de mi carrera profesional, brindándome la oportunidad de conocer a la Dra. Dña. Mª Elvira Ares Mazás. Asimismo, deseo manifestar mi gratitud a todas aquellas personas e instituciones que de forma directa o indirecta hicieron posible la realización de este Trabajo, en especial: A los Drs. D. Francisco Freire Santos, Dña. María Ortega Iñarrea, D. Fernando Méndez Hermida y D. José Antonio Castro Hermida, por su valiosa orientación y colaboración en los distintos estudios realizados. A los Drs. D. Oscar García Martín y D. Jaime Martínez Urtaza, Director e Investigador, respectivamente, del Instituto de Acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela, por facilitarnos las muestras de moluscos bivalvos y los datos correspondientes, haciendo extensivo mi agradecimiento a los demás miembros de la Unidad de Control de Moluscos del citado Instituto por la buena disposición mostrada en todo momento. Al Dr. D. Gustavo Hernández Córdova, también del mencionado Instituto, por su inestimable ayuda en el estudio histológico y por compartir sus conocimientos sobre la anatomía de los moluscos bivalvos. A la Dra. Dña. Dorotea Martínez Patiño y a Dña. Justa Ojea Martínez del Centro de Cultivos Mariños de Ribadeo (Lugo) y a Dña. Mª Isabel Seoane Ramallo y D. Valentín Rodríguez Castro del Centro de Experimentación en Acuicultura de Couso (A Coruña), por suministrarnos las semillas de ostra y almeja con las que se llevaron a cabo los estudios de contaminación experimental. Al Dr. D. Arturo Silva Abuín por sus recomendaciones para el mantenimiento de los cultivos de microalgas. También deseo agradecer a las distintas personas que amablemente me acogieron en sus laboratorios en los que tuve la oportunidad de realizar varias estancias muy xvi Índice 6.3.1. Fundamentos patogénicos y manifestaciones clínicas ..................................................53 6.3.2. Situación actual del tratamiento y control..................................................................57 MATERIAL Y MÉTODOS..........................................................................................................61 1. CRYPTOSPORIDIUM SPP......................................................................................................63 1.1. Obtención de aislados ooquísticos ............................................................................63 1.2. Determinación de la viabilidad ooquística.................................................................64 1.2.1. Técnica de inclusión/exclusión de colorantes vitales fluorogénicos ................................64 1.2.2. Bioensayos en ratón ...............................................................................................65 1.3. Detección en muestras de moluscos bivalvos............................................................65 1.3.1. Técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) ............................................................66 1.3.2. Técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).............................................66 1.4. Caracterización molecular.........................................................................................68 1.4.1. Análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (técnica de RFLP) ......68 1.4.2. Secuenciación del ADN............................................................................................68 1.5. Análisis estadístico ...................................................................................................69 2. ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN NATURAL ............................................................................70 2.1. Detección y determinación de la viabilidad ooquística de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano ........................70 2.1.1. Muestras ...............................................................................................................70 2.1.2. Detección y determinación de la viabilidad ooquística..................................................70 2.2. Determinación de los niveles de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante las técnicas de IFD y PCR ...................................................................71 2.2.1. Evaluación de la técnica de IFD ................................................................................71 2.2.2. Evaluación de la técnica de PCR ...............................................................................72 2.3. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano..........................................................73 2.3.1. Muestras ...............................................................................................................73 2.3.2. Técnicas moleculares ..............................................................................................74 2.4. Cryptosporidium y Giardia en zonas de cultivo de moluscos bivalvos .......................74 2.4.1. Muestras ambientales .............................................................................................75 Índice xvii 2.4.2. Muestras biológicas ................................................................................................ 78 2.4.3. Detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. y de quistes de Giardia spp................. 78 2.4.4. Identificación de especies/genotipos de Cryptosporidium ............................................ 78 3. ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN EXPERIMENTAL ................................................................... 78 3.1. Supervivencia de C. parvum en dos especies de moluscos bivalvos: O. edulis y T. decussatus .................................................................................................................. 79 3.2. C. parvum en T. decussatus ...................................................................................... 80 3.3. Transmisión de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos .............................. 81 3.4. ¿Es Cryptosporidium infectante después de cocinar los mejillones al vapor? ........... 82 RESULTADOS ........................................................................................................................ 87 1. RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN NATURAL ............................................ 89 1.1. Detección y determinación de la viabilidad ooquística de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano........................ 89 1.2. Determinación de los niveles de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante las técnicas de IFD y PCR................................................................... 93 1.2.1. Evaluación de la técnica de IFD................................................................................ 93 1.2.2. Evaluación de la técnica de PCR............................................................................... 94 1.3. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano ......................................................... 96 1.4. Cryptosporidium y Giardia en zonas de cultivo de moluscos bivalvos..................... 102 1.4.1. Detección de Cryptosporidium spp. y Giardia spp. en muestras ambientales y biológicas procedentes de las Rías Baixas ....................................................................................... 102 1.4.2. Identificación de especies/genotipos de Cryptosporidium .......................................... 105 2. RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN EXPERIMENTAL.................................. 106 2.1. Supervivencia de C. parvum en dos especies de moluscos bivalvos: O. edulis y T. decussatus ................................................................................................................ 106 2.2. C. parvum en T. decussatus .................................................................................... 107 2.3. Transmisión de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos ............................ 112 2.4. ¿Es Cryptosporidium infectante después de cocinar los mejillones al vapor? ......... 113 DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 115 xviii Índice CONCLUSIONES...................................................................................................................133 BIBLIOGRAFÍA .....................................................................................................................137 RESUMEN.............................................................................................................................177 APÉNDICE ............................................................................................................................183 Índice xix LISTA DE ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico BOE Boletín Oficial del Estado CF Coliformes fecales COWP Proteína de la pared del ooquiste de Cryptosporidium DAPI 4’,6-diamino-2-fenilindol DE Desviación estándar Di Dosis infectante DIC Contraste diferencial de interferencia dNTP Desoxinucleótido trifosfato DOCE Diario Oficial de la Comunidad Europa DWI Drinking Water Inspectorate EDAR Estación depuradora de aguas residuales EDTA Ácido etilendiaminotetraacético ETAP Estación de tratamiento de aguas potables FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FISH Hibridación in situ con fluorescencia FOM Orgánulo alimentador de membrana HAART Terapia antirretroviral altamente activa HBSS Solución balanceada de Hanks IFD Inmunofluorescencia directa IFN-γ Interferón gamma IMS Inmunoseparación magnética IP Ioduro de propidio JACUMAR Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos MAPA Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación NMP Número más probable pb Pares de bases PBS Tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa pi Post-inoculación RAE Real Academia Española RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida xx Índice TAE Tampón tris-acetato-EDTA TRIS Tris (hidroximetil)-aminoetano UCM Unidad de Control de Moluscos UNF Unidades nefelométricas USEPA United States Environmental Protection Agency VIH Virus de la inmunodeficiencia humana vs Versus χ2 Test de chi-cuadrado Índice xxi ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1. Localización geográfica de las rías gallegas (clasificación de Torre Enciso, 1954, 1958). (pág. 9) FIGURA 2. Anatomía interna de la almeja T. decussatus (cortesía del Dr. Hernández Córdova). (pág. 13) FIGURA 3. Cultivo de mejillón M. galloprovincialis. (pág. 21) FIGURA 4. Cultivo de ostras. (pág. 23) FIGURA 5. Producción en parques de cultivo de almejas y berberechos (obtenidas de Pérez Camacho, 1992b). (pág. 25) FIGURA 6. Representación esquemática del ciclo biológico de C. parvum (adaptado de Smith y Rose, 1998). (pág. 41) FIGURA 7. Representación gráfica de las potenciales rutas de transmisión de la cryptosporidiosis. (pág. 49) FIGURA 8. Diseño experimental aplicado para establecer el nivel de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante la técnica de IFD. (pág. 71) FIGURA 9. Diseño experimental aplicado para establecer el nivel de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante la técnica de PCR. (pág. 73) FIGURA 10. Rías Baixas: localización geográfica de los puntos de muestreo. (pág. 77) FIGURA 11. Diseño experimental aplicado en el estudio de transmisión de ooquistes de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos. (pág. 83) FIGURA 12. Contaminación experimental de semillas de moluscos bivalvos con ooquistes de C. parvum. (pp. 84-85) FIGURA 13. Evolución anual de la contaminación por Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos destinados al consumo humano. (pág. 92) FIGURA 14. Geles de agarosa mostrando la ausencia de inhibición de la técnica de PCR en el ADN extraído de mejillones (M. galloprovincialis). (pág. 94) xxii Índice FIGURA 15. Resultados obtenidos mediante la técnica de PCR aplicada a sedimentos de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados con ooquistes purificados de C. parvum. (pág. 95) FIGURA 16. Resultados de la técnica de RFLP aplicada a fragmentos del gen COWP amplificados a partir de moluscos bivalvos naturalmente contaminados. (pág. 97) FIGURA 17. Resultados de la técnica de RFLP aplicada a fragmentos del gen COWP resultantes de la clonación de las muestras M23 y M25. (pág. 98) FIGURA 18. Comparación entre las secuencias nucleotídicas obtenidas a partir de aislados de Cryptosporidium procedentes de moluscos bivalvos naturalmente contaminados y las secuencias AF266273 (C. parvum) y AF481960 (C. hominis) depositadas en el GenBank. (pág. 100) FIGURA 19. Árbol filogenético, obtenido mediante el método de Neighbour-Joining a partir de la secuencia nucleotídica diana del gen COWP, en el que se muestran las relaciones filogenéticas existentes entre los aislados de Cryptosporidium detectados en moluscos bivalvos y otras especies y genotipos pertenecientes al género. (pág. 101) FIGURA 20. Evolución comparativa entre la contaminación por Cryptosporidium y Giardia en muestras biológicas y las precipitaciones registradas durante el período de estudio. (pág. 104) FIGURA 21. Resultados de la técnica de RFLP aplicada a fragmentos del gen COWP amplificados a partir de muestras ambientales y biológicas. (pág. 105) FIGURA 22. Evolución de la viabilidad ooquística de C. parvum en semillas de ostra (O. edulis) y almeja (T. decussatus). (pág. 107) FIGURA 23. Branquias de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. (pág. 109) FIGURA 24. Estómago y hepatopáncreas de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. (pág. 110) FIGURA 25. Intestino de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. (pág. 111) FIGURA 26. Evolución de la temperatura interna de los mejillones durante el proceso de cocinado al vapor. (pág. 114) Índice xxiii ÍNDICE DE TABLAS TABLA 1. Especies de moluscos bivalvos de interés comercial que se producen en Galicia. (pág. 19) TABLA 2. Especies de moluscos bivalvos naturalmente contaminadas por Cryptosporidium spp. (pág. 32) TABLA 3. Condiciones que deben reunir los moluscos bivalvos destinados al consumo humano inmediato [BOE (núm. 86) de 10 de abril de 1999]. (pág. 34) TABLA 4. Clasificación de las zonas de producción de moluscos bivalvos de acuerdo con su calidad microbiológica. (pág. 35) TABLA 5. Especies del género Cryptosporidium actualmente reconocidas. (pág. 39) TABLA 6. Efecto de diversos factores ambientales sobre la viabilidad/infectividad de ooquistes de C. parvum. (pág. 46) TABLA 7. Moléculas implicadas en las interacciones iniciales parásito-célula hospedadora en la infección por C. parvum. (pág. 55) TABLA 8. Algunos datos sobre la geografía física de las Rías Baixas. (pág. 75) TABLA 9. Contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos destinados al consumo humano. (pág. 90) TABLA 10. Contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos procedentes de Galicia (España) y de otros países pertenecientes a la Unión Europea. (pág. 90) TABLA 11. Tiempos de depuración y contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos destinados al consumo humano. (pág. 91) TABLA 12. Contaminación por Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos clasificadas de acuerdo con los estándares de la Unión Europea. (pág. 92) TABLA 13. Resultados de la técnica de IFD aplicada sobre sedimentos de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados con ooquistes purificados de C. parvum. (pág. 93) xxiv Índice TABLA 14. Investigación de la existencia de inhibidores de la técnica de PCR en la detección de C. parvum en mejillones (M. galloprovincialis). (pág. 94) TABLA 15. Detección de Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos mediante las técnicas de IFD y PCR. (pág. 96) TABLA 16. Relación entre los resultados obtenidos mediante las técnicas de IFD y PCR en la detección de Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos. (pág. 97) TABLA 17. Caracterización molecular de aislados de Cryptosporidium spp. obtenidos en muestras de moluscos bivalvos. (pág. 99) TABLA 18. Detección mediante la técnica de IFD de Cryptosporidium spp. y Giardia spp. en muestras ambientales y biológicas procedentes de las Rías Baixas. (pág. 102) TABLA 19. Contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. de muestras ambientales y biológicas recogidas en zonas de cultivo de moluscos bivalvos (Rías Baixas). (pág. 103) TABLA 20. Contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. de muestras biológicas clasificadas de acuerdo con la calidad microbiológica de la zona de cultivo. (pág. 103) TABLA 21. Contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. de muestras biológicas clasificadas de acuerdo con su calidad microbiológica. (pág. 104) TABLA 22. Localización de ooquistes de C. parvum en distintos tejidos de almejas (T. decussatus) experimentalmente contaminadas. (pág. 108) TABLA 23. Transmisión experimental de ooquistes de C. parvum entre dos especies de moluscos bivalvos (O. edulis y T. decussatus). (pág. 113) TABLA 24. Efecto del vapor sobre la infectividad de ooquistes de C. parvum recuperados de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados. (pág. 114) INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO 8 Revisión Bibliográfica los campos de oceanografía geológica y geología marina, todavía existe una problemática con respecto al origen y evolución de las rías gallegas (Méndez y Rey, 2000). Diversos criterios (origen, desarrollo, orientación...) se utilizaron para la clasificación de las rías gallegas, siendo la propuesta por Torre Enciso (1954, 1958) (Figura 1) una de las consideradas válidas por expertos en el tema (Méndez y Rey, 2000): i) Rías del bloque septentrional o Rías Altas en sentido estricto: rías de Ribadeo, Foz, Viveiro, O Barqueiro y Ortigueira. ii) Rías enclavadas en los bordes de la penillanura que se extiende por el noroeste gallego y denominadas Rías Centrales: rías de Cedeira, el conjunto lobulado del seno coruñés (Ferrol, Ares, Betanzos y O Burgo), Corme-Laxe, Camariñas y Corcubión. iii) Rías del bloque suroccidental o Rías Baixas: rías de Muros-Noia, Arousa, Pontevedra y Vigo. Las variaciones hidrográficas que se producen en las rías están influenciadas por diversos factores como son: el vertido de los ríos; la amplitud de las mareas; la profundidad; la forma de la costa; la topografía del fondo; las condiciones climáticas; y el régimen de vientos. Además, es necesario considerar que la capa de agua oceánica no permanece invariable sino que a lo largo del año presenta oscilaciones influenciadas por el giro anticiclónico del Atlántico Norte, consecuencia del movimiento rotacional de la Tierra (Corral, 1992). En todas las rías existe un fenómeno de circulación estuárica que básicamente consiste en una entrada por la parte interior de agua dulce procedente del aporte fluvial y una penetración de agua oceánica desde la boca de la ría. El agua dulce del río, por su menor densidad, fluye superficialmente y se mezcla con el agua salada a medida que avanza hacia la boca de la ría, saliendo principalmente por la orilla norte. Esta circulación hacia el océano se compensa por la entrada de agua marina desde el fondo de la ría que se va mezclando verticalmente con el agua superficial que sale. Este modelo de circulación de agua se conoce con el nombre de circulación estuárica positiva (Corral, 1992). Por otra parte, este tipo de circulación del agua provoca oscilaciones opuestas entre los niveles de salinidad existentes en la superficie y en el fondo de las rías. La capa de agua superficial, de un espesor de 3-4 m, puede registrar valores muy bajos de salinidad dependiendo del caudal de los ríos, del viento existente y de la pluviosidad [la mayor parte de la costa gallega registra anualmente precipitaciones abundantes y superiores a 1300 mm Revisión Bibliográfica 9 (Carballeira y col., 1983)]. Por debajo de esta capa superficial, se encuentran aguas con valores de salinidad similares a los oceánicos (35-35,5‰) (Corral, 1992). La concentración de oxígeno disuelto en el agua de las rías disminuye con la profundidad. Los niveles de este gas pueden incrementarse por la acción de los vientos; las corrientes; las disminuciones de la temperatura y la salinidad; la actividad fotosintética del fitoplancton; y la proliferación de algas. Sin embargo, en ciertos fondos con exceso de materia orgánica puede existir un déficit de oxígeno, limitando el tipo de organismo que Ría de Foz Ría de Ribadeo Ría de Viveiro Ría de O Barqueiro Ría de Ortigueira Ría de Cedeira Ría de Ferrol Ría de Ares Ría de Betanzos Ría de O Burgo (A Coruña) Ría de Corme-Laxe Ría de Camariñas Ría de Corcubión Ría de Muros-Noia Ría de Arousa Ría de Pontevedra Ría de Vigo R Í AS ALTAS R Í AS CENTRALES OC É ANO ATL Á NTICO Figura 1. Localización geográfica de las rías gallegas (clasificación de Torre Enciso, 1954, 1958). R Í AS BAIXAS 10 Revisión Bibliográfica habita en estas zonas. Con respecto a la temperatura, el agua de las rías gallegas no experimenta grandes variaciones a lo largo del año. Las temperaturas mínimas invernales suelen oscilar entre los 10-12ºC y las máximas, alcanzadas a finales del verano, varían entre los 18-20ºC (Corral, 1992). Como consecuencia de las características oceanográficas de la costa gallega se produce un fenómeno conocido con el nombre de afloramiento marino, asociado con importantes áreas de pesca y consistente en el ascenso de capas de agua profundas a la superficie. En el afloramiento que se origina frente al litoral gallego, las aguas que ascienden proceden de al menos 200 m de profundidad y, cuando se aproximan a la costa, invaden las rías entrando por el fondo. Se trata de aguas frías y ricas en nutrientes, necesarios para el desarrollo del fitoplancton, primer eslabón de la cadena trófica en el mar. El afloramiento se produce por una serie de factores que actúan de forma conjunta, siendo el más importante el giro anticiclónico del Atlántico Norte centrado en las islas Azores (anticiclón de las Azores) que afecta a Galicia con vientos de componente norte que empujan las aguas cercanas a la costa hacia el océano y favorecen el ascenso de aguas profundas. En el litoral gallego, el afloramiento comienza a manifestarse en el mes de mayo para alcanzar en agosto su punto culminante y desaparecer prácticamente a finales de octubre. De esta forma y coincidiendo con los ciclos estacionales de luz, de abundancia de nutrientes disueltos y de una temperatura adecuada, se favorece la existencia de una elevada producción primaria con ciclos que se repiten anualmente. Además, los aportes procedentes de las aguas fluviales y de escorrentía junto con el reciclado natural de nutrientes, son factores importantes en el mantenimiento de esta extraordinaria producción primaria. Por tanto, las rías gallegas constituyen un modelo de ecosistema marino altamente productivo, cuyas aguas ofrecen unas excelentes condiciones para el desarrollo de organismos de interés comercial entre los que se incluyen diversas especies de moluscos bivalvos (Figueiras y col., 2002). 2. LOS MOLUSCOS BIVALVOS: ALGUNOS ASPECTOS DE SU BIOLOGÍA El phylum Mollusca consta de aproximadamente 50000 especies descritas, de las cuales alrededor de 30000 habitan en ambientes marinos. La clase Bivalvia, una de las seis que componen el phylum, incluye unas 7500 especies caracterizadas porque su cuerpo está en el interior de una concha formada por dos valvas unidas mediante un ligamento elástico. Aparte del propio interés zoológico, esta clase es importante porque algunos de sus representantes forman parte de la cadena alimentaria humana (Gosling, 2003). De esta Revisión Bibliográfica 11 forma, la producción mundial de moluscos bivalvos derivada de la pesca y de la acuicultura fue superior a los 15 millones de toneladas en el año 2003 (FAO, 2005). 2.1. Generalidades anatómicas y fisiológicas Los moluscos bivalvos son organismos comprimidos lateralmente, con simetría bilateral y carentes de esqueleto interno. Su cuerpo se encuentra protegido por una concha constituida por dos valvas, generalmente simétricas y unidas mediante un ligamento y una charnela (articulación en la que los dientes de una valva penetran en la cavidad de la otra). El carbonato cálcico es el principal componente de la concha, que se forma a partir del depósito de cristales de esta sal sobre una matriz orgánica constituida por la proteína conquiolina. En realidad, cada una de las valvas consta de tres capas: la más externa, compuesta por conquiolina, presenta frecuentemente un espesor reducido como consecuencia de abrasiones mecánicas, presencia de parásitos...; una capa intermedia prismática constituida por aragonita o calcita, formas cristalinas de carbonato cálcico, y una capa interna calcárea, de aspecto nacarado, opaco o iridiscente. En la Figura 2 se muestran las principales estructuras internas de un molusco bivalvo representado por la especie de almeja Tapes decussatus. La concha de estos moluscos actúa como esqueleto para la unión de los músculos, protege al organismo frente a predadores y, en especies bentónicas, contribuye a evitar la penetración de arena o fango en la cavidad paleal. El color, la forma y las características superficiales y ornamentales de las valvas varían notablemente entre los diferentes grupos de bivalvos, por lo que estos caracteres se utilizan para la identificación de las especies (Montero, 1971). El manto, constituido por tejido conjuntivo, forma dos lóbulos que envuelven los órganos internos, dejando un espacio o cavidad denominada cavidad del manto o cámara paleal. Los márgenes del manto se extienden formando tres pliegues: uno externo, próximo a la concha y relacionado con la secreción de la valva, uno intermedio, con función sensorial, y el interno, de naturaleza muscular, que controla el flujo de agua en la cámara paleal. Además, los bordes del manto presentan unas prolongaciones que se entrelazan al abrir las valvas, constituyendo una especie de filtro que impide la entrada de partículas de gran tamaño. El manto posee en la región ventral una abertura inhalante por donde entra el agua y un orificio exhalante por donde la expulsa, previa captación del oxígeno disuelto y de las partículas que servirán de alimento. En algunas especies bentónicas, el manto presenta modificaciones formando habitualmente dos prolongaciones tubulares retráctiles 12 Revisión Bibliográfica denominadas sifones. Éstos pueden estar separados o parcialmente soldados, presentando en su extremo numerosos tentáculos. Sobre la línea medio ventral y situado por debajo de la masa visceral, se observa un órgano de naturaleza muscular, el pie, cuya forma típica es de lengua o de hacha. El pie alcanza su máximo desarrollo en los moluscos excavadores, a los que sirve tanto para desplazarse sobre el fondo como para enterrarse en él. Numerosas especies presentan en el extremo posterior del pie la glándula bisógena encargada de segregar el biso, término que hace referencia a un conjunto de filamentos de naturaleza proteica terminados en un pequeño disco adhesivo mediante los cuales se fijan a una base o soporte. En la mayoría de los bivalvos, esta glándula sólo es funcional en las formas juveniles. Sin embargo, en ciertas especies, como las pertenecientes al género Mytilus, la capacidad de segregar biso se conserva durante toda la vida del individuo, lo que indica una preferencia por hábitats con fuertes corrientes (Puerta Henche, 1995). El sistema muscular de los moluscos bivalvos consta de dos músculos aductores que unen las valvas entre sí y son los encargados de cerrar la concha en oposición al ligamento. El músculo aductor anterior es de tamaño reducido y está situado en la porción anterior del borde ventral. El aductor posterior, mucho más grande, se localiza en la parte posterior de la región dorsal. Además, existen en el pie, músculos encargados de estirar y encoger este órgano dentro de la concha. También presentan los denominados músculos paleales, especialmente desarrollados en la parte ventral, que son los responsables de unir la concha con el borde del manto. Los moluscos bivalvos realizan la función respiratoria a través de las branquias, dos estructuras de aspecto laminar situadas en la cámara paleal. Las branquias están formadas por un conjunto de filamentos en forma de W suspendidos de un eje que a su vez se fusiona con el margen dorsal del manto. Cada filamento branquial presenta un epitelio ciliado por su cara externa, pudiendo unirse entre sí mediante haces de cilios (filibranquias) o puentes tisulares (eulamelibranquias) y dejando entre ellos numerosas aberturas o poros. Las branquias dividen la cavidad paleal en dos partes, una más externa situada entre las branquias y el manto (cámara inhalante) y otra delimitada por la cara interna de las branquias (cámara exhalante). Además del oxígeno disuelto en el agua, los moluscos bivalvos pueden captar a través de las branquias sustancias disueltas y partículas en suspensión que quedan retenidas en la superficie externa cuando el agua se filtra a través de las mismas. Revisión Bibliográfica 13 El aparato digestivo de estos moluscos se inicia en una boca, ciliada y rodeada por dos pares de palpos labiales, que conduce a un esófago estrecho y también ciliado. A continuación, se localiza el estómago que presenta dos regiones claramente diferenciadas: la región dorsal en la que desembocan el esófago y los conductos del hepatopáncreas y la región ventral, en forma de saco y de naturaleza glandular, en la que se encuentra un bastoncillo transparente o amarillento denominado estilo cristalino. Esta estructura, de tamaño considerable con respecto al del molusco, es secretada por las paredes glandulares del fondo del saco gástrico y se compone de capas concéntricas de mucoproteínas y enzimas digestivos. Las paredes del tramo superior del saco gástrico están recubiertas de numerosos cilios que, al vibrar, provocan un movimiento de rotación al estilo. De esta forma, su extremo anterior gira sobre el escudo gástrico o capa cuticular de la pared, triturando los alimentos y liberando los enzimas digestivos. El estómago presenta numerosos orificios que se prolongan hacia el exterior, ramificándose notablemente y ofreciendo un aspecto de racimos glandulares cuyos extremos distales son ciegos. Este SE SI AN GV MP MA PI GB NE PL BO ES ET GC HP EC IN CO BM MN GP ST GO B R PE AU VE Figura 2. Anatomía interna de la almeja T. decussatus (cortesía del Dr. Hernández Córdova). AN, ano; AU, aurículas; BM, borde del manto; BO, boca; BR, branquia; CO, concha; EC, estilo cristalino; ES, esófago; ET, estómago; GB, glándula del biso; GC, ganglio cerebral; GO, gónada; GP, ganglio pedal; GV, ganglio visceroparietal; HP, hepatopáncreas; IN, intestino; MA, músculo aductor anterior; MN, manto; MP, músculo aductor posterior; NE, nefridio; PE, pericardio; PI, pie; PL, palpos labiales; SE, sifón exhalante; SI, sifón inhalante; ST, estatocitos; VE, ventrículo. 14 Revisión Bibliográfica conjunto, que envuelve completamente al estómago, constituye la llamada glándula digestiva o hepatopáncreas. El intestino, ciliado y relativamente largo, forma varias asas en su región inicial, atraviesa el pericardio y el ventrículo cardíaco, se prolonga hasta el recto y desemboca en el ano, próximo al orificio exhalante. El corazón, situado en la región dorsal media del cuerpo y formado por un único ventrículo y dos aurículas, está rodeado por un tejido pericárdico que también recubre una parte del intestino. Del ventrículo parten, anterior y posteriormente, dos arterias que se ramifican para conducir la sangre o hemolinfa por todo el cuerpo. Las principales arterias irrigan el manto, las vísceras, los músculos de la concha y el pie, desembocando en una red de senos lagunares en los cuales la hemolinfa baña directamente los tejidos, constituyendo por lo tanto un sistema circulatorio abierto. A continuación, la hemolinfa es recogida mediante un sistema venoso que la transporta a los riñones y retorna al corazón. En especies del género Mytilus, parte de la hemolinfa que se dirige al riñón entra previamente en las branquias donde se oxigena. En otros bivalvos, la hemolinfa fluye directamente de las branquias al corazón. En general, a nivel del manto existe un sistema circulatorio bien desarrollado que representa un lugar adicional de oxigenación (Gosling, 2003). La hemolinfa puede contener pigmentos respiratorios, como la hemocianina en la que el cobre desempeña el papel del hierro en la hemoglobina, o bien carecer de ellos por lo que el oxígeno se disuelve directamente en el plasma. Además, la hemolinfa contiene células denominadas hemocitos que se clasifican en dos grupos, granulocitos (10-20 µm) y agranulocitos (4-6 µm). Los primeros fagocitan bacterias, algas, restos celulares y protozoos parásitos, mientras que los segundos presentan una menor actividad fagocítica. La presencia de hemocitos no se restringe a la hemolinfa sino que éstos también pueden localizarse en la luz intestinal y en la cavidad paleal, lugares en los que intervienen en el transporte, digestión y excreción de nutrientes, contribuyendo igualmente a la reparación tisular y defensa del organismo. La hemolinfa desempeña importantes papeles en la fisiología de los bivalvos como son el intercambio gaseoso, la osmorregulación, la distribución de nutrientes, la eliminación de residuos y la inmunidad. También proporciona una rigidez temporal a los palpos labiales, al pie y a los bordes del manto. En los bivalvos existen dos tipos de órganos excretores, las glándulas pericárdicas y los riñones, aunque los productos de la excreción también pueden ser eliminados a través de las branquias y de la superficie corporal (Bayne y col., 1976). Los riñones o nefridios, con aspecto de U, están situados por debajo de la cavidad pericárdica. Uno de los brazos es glandular y se abre en el pericardio; el otro consiste en una vesícula Revisión Bibliográfica 15 de pared fina que mediante el nefridioporo desemboca en la cavidad del manto. Las glándulas pericárdicas presentan unas células que acumulan los productos de desecho, que se descargan periódicamente en la cavidad pericárdica para, a continuación, ser eliminados a través del riñón. Además, tienen otras células que se encargan de filtrar la hemolinfa como paso previo a la formación de orina. Ésta presenta una elevada concentración de amonio y pequeñas cantidades de aminoácidos y creatinina. El sistema nervioso de los moluscos bivalvos presenta simetría bilateral y es notablemente sencillo. Está compuesto por tres pares de ganglios: cerebrales, situados debajo del esófago y a ambos lados de la boca; viscerales, localizados por debajo del músculo aductor posterior y los ganglios pediales emplazados en la base del pie. Los ganglios están interconectados por cordones nerviosos de los que parte una amplia red de terminaciones nerviosas. Este sistema es descentralizado ya que la respuesta a los distintos estímulos tiene lugar a nivel local o ganglionar. Dependiendo de la especie de que se trate, los bivalvos pueden presentar diferentes órganos sensoriales. Los tentáculos paliales o del manto contienen células táctiles y quimiorreceptoras que permiten detectar variaciones en la composición del agua; los estatocitos, generalmente situados en el pie en número par, son los responsables del equilibrio; los osfradios, órganos sensoriales químicos, están situados en la cámara exhalante; y finalmente, los ocelos, existentes en el borde del manto o de los sifones, pueden detectar cambios bruscos en la intensidad de la luz. El sistema reproductor de estos moluscos consta de dos gónadas formadas por túbulos ramificados que se unen entre sí para originar conductos de mayor calibre que se abren en un corto gonoducto. Los gametos se forman a partir del epitelio de los túbulos y a través del gonoducto llegan a la cámara paleal, siendo expulsados al exterior a través de la abertura exhalante. Por tanto, la fertilización es externa excepto en el caso de algunas especies de ostra que mantienen sus gametos femeninos en la cavidad del manto. La mayoría de las especies de bivalvos son dioicas y no presentan dimorfismo sexual. También se ha comprobado la existencia del fenómeno de hermafroditismo que puede manifestarse de forma simultánea o asincrónicamente (Gosling, 2003). El desarrollo de los moluscos bivalvos implica la existencia de varias fases larvarias pelágicas. Aproximadamente a las 24 horas de la fecundación, surge la larva trocófora, ciliada y con aspecto de peonza; al cabo de 24-48 horas, se convierte en larva veliger que recibe sucesivas denominaciones a medida que se originan nuevas estructuras 16 Revisión Bibliográfica (veliger en forma de D, umbonada y pediveliger). La larva pediveliger presenta un geotropismo positivo, fijándose a un sustrato de forma temporal o permanente donde evoluciona hasta alcanzar el estado juvenil, morfológicamente similar al adulto. Este desarrollo puede oscilar entre 20 y 80 días según la especie de molusco bivalvo, estando además influenciado por la disponibilidad de alimento, la temperatura y la salinidad del agua. 2.2. Alimentación y digestión Los moluscos bivalvos se alimentan por microfagia, consumiendo materia orgánica en forma de partículas inertes, detritos, fitoplancton y microzooplancton que se encuentran en suspensión en el agua que filtran. En menor medida, consumen bacterias y pueden absorber directamente sustancias disueltas en el agua como aminoácidos y azúcares (Bayne y Hawkins, 1992). El proceso de filtración tiene lugar mediante el movimiento de los cilios laterales de las branquias, el cual origina una corriente de agua que entra en la cámara inhalante, atraviesa las branquias hacia la cámara exhalante y finalmente, es expulsada a través del orificio exhalante. La velocidad de este proceso depende de varios factores: i) el tamaño del molusco (los de mayor tamaño filtran, en términos absolutos, volúmenes superiores de agua pero menor cantidad si la filtración se valora en proporción al peso del animal); ii) la temperatura del agua (su incremento favorece la velocidad de filtración); y iii) la concentración de alimento (la velocidad aumenta cuando hay poco alimento disponible y disminuye si éste es muy abundante). El volumen de agua que los moluscos bivalvos pueden filtrar es elevado. Así, la ostra americana, Crassostrea virginica, puede procesar unos 37 litros de agua por hora (Brusca y Brusca, 2002). Las partículas transportadas por el agua son retenidas por los cilios laterofrontales que las envían a los cilios frontales del filamento branquial, encargados de mezclarlas con el mucus secretado por las células glandulares y de transportarlas hacia unos canales situados en los pliegues ventrales y en los márgenes dorsales de las branquias, alcanzando finalmente los palpos labiales. El tamaño de las partículas retenidas depende de la especie de molusco y oscila entre un mínimo de 1-5 µm y un máximo de 400-500 µm de diámetro. Por encima de este valor, la penetración de las partículas en la cavidad paleal es impedida por los bordes del manto, siendo expulsadas de nuevo al exterior. Por debajo del tamaño mínimo, sólo son retenidas aquellas partículas adsorbidas sobre otras de mayor tamaño. Se demostró que tanto el mejillón como la ostra son capaces de retener partículas con Revisión Bibliográfica 17 diámetros de 2-5 µm, entre cuyos márgenes se encuentran un gran número de bacterias, componentes del plancton y restos de organismos vegetales y animales (Puerta Henche, 1995). Los palpos labiales se encargan de seleccionar, en función del tamaño, textura y composición química, las partículas que penetran en la boca y también de regular la cantidad de alimento ingerido, rechazando parte de él hacia el manto cuando la cantidad es excesiva. Las partículas aceptadas son transportadas en dirección a la boca, mientras que las rechazadas llegan al manto para su posterior expulsión mediante el pie o bien a través del orificio exhalante como pseudoheces. El alimento pasa desde la boca al esófago y penetra en el estómago, en donde se dirige hacia el estilo cristalino que, al rotar y rozar contra el escudo gástrico, facilita la trituración del alimento y su mezcla con los enzimas digestivos liberados del extremo del mismo. El alimento así digerido es absorbido a través de ciertas áreas del estómago que presentan abundantes rugosidades. Este proceso se conoce como digestión extracelular. Paralelamente y como consecuencia del movimiento de los cilios existentes sobre las crestas gástricas, las partículas de menor tamaño y el material digerido son dirigidos hacia los conductos del hepatopáncreas, mientras que las de mayor tamaño, así como otras más pequeñas pero muy densas, son transportadas hacia el intestino. En el hepatopáncreas existen células digestivas que mediante fenómenos de pinocitosis incorporan partículas de pequeño tamaño que son digeridas intracelularmente. Los nutrientes son vertidos al sistema hemolinfático para su posterior distribución por todo el cuerpo mientras que el material de desecho se almacena en el interior de vesículas. La destrucción de las células digestivas provoca la liberación de estos productos al estómago para que, tras su paso por el intestino, se eliminen a través del ano. La existencia de hemocitos libres, tanto en el estómago como en el intestino, también posibilita la digestión intracelular de eventuales partículas alimenticias. La permanencia del alimento en el tracto digestivo de los moluscos bivalvos está condicionada por factores metabólicos inherentes al propio molusco y por las características fisicoquímicas del agua. En general, se considera que el tránsito tiene lugar entre 0,5-2 días, pudiendo realizarse en tan solo 75 minutos (Puerta Henche, 1995). Del alimento ingerido, los moluscos bivalvos solamente asimilan una pequeña parte, siendo el material restante eliminado al medio acuático a través de las heces. Una parte de éstas se descompondrá por acción de las bacterias, liberando compuestos minerales que harán 24 Revisión Bibliográfica profundas de las Rías Altas gallegas, se práctican dos tipos de cultivo: directamente sobre el fondo (parque de fondo) o bien se introducen en sacos de malla colocados sobre caballetes elevados unos 30-50 cm. En Galicia se cultivan dos especies de ostra, O. edulis (fundamentalmente en batea) y la ostra japonesa C. gigas, cultivada en parque de fondo y comercializada por los productores gallegos con el nombre de ostra rizada (Guerra, 2002). Con respecto al rendimiento del cultivo, se calcula que una batea con 1000 cuerdas de 20 cestos cada una, puede contener unas 800000 ostras y producir anualmente entre 480000-560000 ejemplares de un tamaño superior a los 7 cm de longitud y unos 60 g de peso. La comercialización de la ostra (5-10 cm) tiene lugar durante todo el año, aunque la demanda se incrementa notablemente durante el mes de diciembre (Pérez Camacho y Cuña Casasbellas, 1992). 3.4. Producción de almeja y berberecho En el año 2003, la producción de almeja y berberecho a nivel mundial rebasó los 4,7 millones de toneladas, de las que un 80% procedían de la acuicultura. El principal país productor es también China, que cultiva fundamentalmente la especie R. philippinarum. Durante ese mismo año, la producción española alcanzó casi las 8000 toneladas, siendo Galicia la región con mayor número de capturas. Éstas procedieron tanto del cultivo propiamente dicho, como del sistema de semicultivo a partir de bancos naturales sumergidos o situados en la zona intermareal (FAO 2005, 2005a; JACUMAR, 2005). Estos bivalvos representan uno de los productos más importantes derivados de la milenaria actividad del marisqueo, sector precursor de la acuicultura y con una problemática social muy específica. La producción de almejas presenta unas grandes expectativas al tratarse de especies con una amplia demanda y un valor económico considerable. En Galicia, al igual que en el resto de España, se cultivan la almeja fina (T. decussatus); la almeja japonesa (R. philippinarum), y la almeja babosa (Venerupis pullastra). Para estas especies se ha desarrollado una tecnología específica de producción de semilla en criaderos (Pérez Camacho, 1992b). El cultivo de almeja se inicia a partir de la cría, cuya longitud oscila entre los 3-5 mm, producida en los criaderos industriales. Ésta se somete a una fase de preengorde en un medio protegido, el semillero, hasta que alcanza un tamaño adecuado de siembra (1215 mm). El tiempo necesario para que se alcance la talla de siembra depende de la especie Revisión Bibliográfica 25 y de la época del año, variando para R. phillipinarum entre 3-4 meses si se inicia en primavera y unos 6 meses si se comienza en otoño. Posteriormente, se procede a su engorde en los parques de cultivo (parcelas de la zona marítimo-terrestre en comunicación permanente o temporal con el mar y dedicadas al cultivo intensivo en fondo de organismos marinos) hasta que se alcanza una talla comercial entorno a los 40 mm. Para la especie citada anteriormente, este período de engorde varía entre 13-14 meses si tiene lugar en la Ría de Arousa o supera los 2 años cuando se realiza en las Rías Altas o en el litoral cantábrico (Pérez Camacho, 1992b). La duración total del ciclo de producción oscila entre 2-4 años, dependiendo de la especie cultivada y de las condiciones ambientales de la zona de cultivo, especialmente de la temperatura y de la disponibilidad de alimento. Por otra parte, la supervivencia durante la fase de engorde está condicionada por la existencia de predadores (principalmente cangrejos). Si las labores de cultivo se desarrollan correctamente, la supervivencia es del orden del 70-80% (Pérez Camacho, 1992b). 4. INFECCIONES ASOCIADAS CON EL CONSUMO DE MOLUSCOS BIVALVOS. Los moluscos bivalvos presentan, como se ha comentado anteriormente, una particular característica anatomo-fisiológica relacionada con su alimentación y respiración: mediante sus laminillas branquiales filtran importantes cantidades de agua reteniendo la Figura 5. Producción en parques de cultivo de almejas y berberechos (obtenidas de Pérez Camacho, 1992b). 26 Revisión Bibliográfica materia orgánica y el plancton presentes en la misma. Las partículas retenidas son desplazadas hasta los palpos labiales que las introducen en la boca, siendo discriminadas las de mayor tamaño que son expulsadas al medio externo en forma de pseudoheces. Este eficaz mecanismo provoca que, asociados a la retención de nutrientes, sean acumulados diversos agentes contaminantes químicos y/o biológicos presentes en el medio en el que habitan. Por otra parte, las poblaciones de moluscos bivalvos marinos crecen principalmente en zonas intermareales o próximas a la costa que, en ciertas ocasiones, están densamente pobladas. Las deficiencias en los tratamientos de las aguas residuales, la emisión de residuos ganaderos o industriales al mar y las aguas de escorrentía son, entre otros, factores que provocan una contaminación química y/o microbiológica, amplia y diversa, en toda la franja costera y consecuentemente, en los moluscos que en ella se desarrollan. Estos hechos junto con la tradicional costumbre del consumo crudo o poco cocinado de estos productos, determinan que los moluscos bivalvos sean considerados alimentos de alto riesgo sanitario al asociarse con casos de toxiinfecciones alimentarias relacionadas con metales pesados, biotoxinas y microorganismos patógenos (Harada, 1995; Potasman y col., 2002; Brett, 2003). Además, se han descrito, relacionadas con algunos moluscos bivalvos, reacciones de hipersensibilidad mediadas por inmunoglobulina E (Lehrer y col., 2003). La asociación entre el consumo de moluscos bivalvos crudos o poco cocinados y la aparición de enfermedades infecciosas ha sido sospechada durante siglos. Uno de los primeros brotes de infección humana relacionado con la ingestión de moluscos bivalvos fue el descrito por el médico francés J.P.A. Pasquier en 1816 (cit. Rippey, 1994), quien diagnosticó fiebres tifoideas en un grupo de personas que habían consumido ostras procedentes de un área contaminada con aguas residuales. Desde entonces, más de 400 brotes y 300000 casos han sido descritos a nivel mundial (Potasman y col., 2002), siendo el más importante, por el número de personas afectadas, el ocurrido en Shangai (China) en 1988, en el que alrededor de 290000 personas padecieron hepatitis A tras el consumo de almejas procedentes de una zona de cultivo contaminada con aguas residuales (Halliday y col., 1991; Tang y col., 1991). En Estados Unidos, un 8% de los aproximadamente 33 millones de casos anuales relacionados con enfermedades de transmisión alimentaria, se asocian con el consumo de ostras crudas (Altekruse y col., 1999). Sin embargo, estos datos sólo representan una pequeña proporción del número de casos a nivel mundial (Hauschild y Bryan, 1980), por lo que la incidencia de las enfermedades infecciosas transmitidas por moluscos bivalvos está infravalorada (Archer y Revisión Bibliográfica 27 Kvender, 1985). Las razones que justifican esta subestimación pueden ser varias, considerándose como principales: la ausencia de obligación, por parte de los profesionales sanitarios, de informar a las autoridades pertinentes sobre los casos de gastroenteritis de etiología no identificada; el hecho de que muchos de los casos originados sean leves y autolimitados; y la dificultad para atribuir la infección a un alimento en particular cuando el número de personas afectadas es reducido. Las infecciones alimentarias debidas al consumo de moluscos se clasifican en tres categorías de acuerdo con el origen del agente etiológico (Rippey, 1994): i) las asociadas con agentes patógenos procedentes de la contaminación fecal humana o animal; ii) las ocasionadas por organismos autóctonos de ambientes marinos y estuarios; y iii) las originadas por la contaminación del alimento durante su procesado o manipulación. Sin embargo, el riesgo que esta contaminación supone para la salud humana depende de la localización del agente patógeno (en la superficie o en el interior del molusco), de su capacidad de supervivencia a los procesos de conservación/culinarios y del estado inmunitario del consumidor (Lees, 2000). 4.1. Infecciones de etiología vírica En el medio marino, diversos agentes virales se encuentran en gran abundancia, generalmente en número de 1012 partículas virales por litro, aunque son fundamentalmente los de origen humano los que han sido asociados con casos de enfermedad tras el consumo de alimentos contaminados (Fuhrman, 1999; Lees, 2000). Los virus que presentan una ruta fecal-oral son los mejor adaptados para transmitirse a través del consumo de moluscos bivalvos. Entre ellos se incluyen los responsables de enfermedades gastrointestinales y otros como el virus de la hepatitis A y el virus de la poliomielitis que, aunque se transmiten por ruta fecal-oral y tienen una fase de replicación en el tracto intestinal, originan síntomas clínicos a nivel extraintestinal (Lees, 2000). Muchos de los virus que se transmiten por esta ruta presentan una alta prevalencia en la comunidad, pudiendo los individuos infectados eliminar millones de partículas virales en sus heces. Además, los procedimientos habituales de depuración de las aguas residuales no son totalmente eficaces en su eliminación, por lo que existe una contaminación relativamente constante en el ambiente (Sorber, 1983). En el mar, estos virus pueden sobrevivir durante semanas o meses, tanto libres en el agua como adheridos a partículas o acumulados en sedimentos (Nasser, 1994; Callahan y 28 Revisión Bibliográfica col., 1995; Gantzer y col., 1998). Se ha demostrado la existencia de una amplia variedad de virus (Calicivirus, Astrovirus, Rotavirus, Adenovirus, Enterovirus y virus de la hepatitis A) tanto en moluscos bivalvos como en sus zonas de cultivo (Lees, 2000). Entre los moluscos bivalvos, las ostras, las almejas, los berberechos y los mejillones son las especies principalmente implicadas en este tipo de infecciones, quizá debido a su tradicional consumo crudo o ligeramente cocinados y a la ingestión del animal entero, incluyendo las vísceras (Jaykus y col., 1994). Además, los procedimientos comunes de conservación por refrigeración y congelación pueden facilitar la supervivencia de los agentes virales, al ser estas técnicas ampliamente utilizadas en el laboratorio para la preservación de muestras. Sin embargo y a pesar de la gran variedad de virus transmitidos por la ruta fecal-oral y de su presencia en moluscos bivalvos y en áreas de cultivo, sólo ciertas especies han sido relacionadas epidemiológicamente con enfermedad tras el consumo de estos alimentos (Lees, 2000). La gastroenteritis de etiología vírica es reconocida como una consecuencia del consumo de moluscos bivalvos contaminados (Richards, 1985; Rippey, 1994). Después de un período de incubación de 18-48 horas, surgen las manifestaciones clínicas caracterizadas frecuentemente por diarrea y vómitos, síntomas que desaparecen a las 24-48 horas, por lo que raramente se requiere atención sanitaria. El primer brote de gastroenteritis vírica descrito y relacionado con el consumo de bivalvos tuvo lugar en el Reino Unido durante el invierno de 1976-1977. Epidemiológicamente se asoció la ingestión de berberechos cocinados con 33 brotes de infección que afectaron a una cifra próxima a 800 personas (Appleton y Pereira, 1977). De igual forma, durante el verano de 1978, se produjo en Australia un brote de gastroenteritis asociado con el consumo de ostras que afectó a unas 2000 personas, demostrándose por primera vez la asociación entre el virus Norwalk y cuadros de gastroenteritis tras la ingestión de moluscos bivalvos (Murphy y col., 1979). A partir de estas primeras referencias, se han documentado numerosos brotes de gastroenteritis causados por la ingestión de estos alimentos, identificándose en la mayor parte de lo casos partículas virales pertenecientes al género Norovirus (Familia Caliciviridae) (Lees, 2000). La hepatitis A (Hepatovirus, Picornaviridae) es la infección viral más grave asociada con el consumo de moluscos bivalvos, al desencadenar una enfermedad debilitante y ocasionalmente la muerte. El primer brote documentado de este proceso infeccioso se describió en Suecia en 1955 cuando 629 casos se asociaron con el consumo de ostras crudas (Roos, 1956). Desde entonces, numerosos brotes relacionados con el consumo de moluscos bivalvos se han descrito a nivel mundial (Richards, 1985; Jaykus y col., 1994; Revisión Bibliográfica 29 Rippey, 1994), alcanzando algunos de ellos un nivel epidémico, como el ocurrido en Shangai (China) en 1988 (Halliday y col., 1991; Tang y col., 1991). La verdadera relación entre la ingestión de moluscos bivalvos y los casos de hepatitis A diagnosticados en la población está subestimada debido al largo período de incubación (media de 4 semanas), que dificulta la asociación entre un determinado alimento y los casos esporádicos o individuales, y a los síntomas iniciales poco específicos de la enfermedad. Además, los resultados obtenidos en estudios seroepidemiológicos retrospectivos permiten establecer que el consumo de moluscos bivalvos es uno de los más importantes factores de riesgo para contraer la infección (Koff y col., 1967; Stille y col., 1972; O’Mahony y col., 1983; Kiyosawa y col., 1987; Mele y col., 1991). Incluso, estimaciones realizadas recientemente sugieren que estos moluscos pueden ser los responsables del 70% de los casos de hepatitis A diagnosticados en Italia (Salamina y D’Argenio, 1998). También se han asociado casos de hepatitis no-A y no-B con el consumo de estos alimentos (Mele y col., 1986; Torne y col., 1988; Jaykus y col., 1994). Aunque no ha sido establecido formalmente, es probable que dichos casos sean consecuencia del virus de la hepatitis E, transmitido por la ruta fecal-oral. La hepatitis E no es endémica en países industrializados, sin embargo la reciente demostración de partículas virales en muestras de aguas residuales en una zona de Barcelona, sugiere que los moluscos bivalvos podrían actuar como vehículos de la infección incluso en áreas no endémicas (Pina y col., 1998). 4.2. Infecciones de etiología bacteriana Las primeras descripciones de enfermedad bacteriana transmitida a través del consumo de moluscos bivalvos datan del siglo XIX y principios del XX. Con anterioridad a 1950, la infección más comúnmente asociada con la ingestión de estos moluscos crudos o insuficientemente cocinados era la fiebre tifoidea. Sin embargo, el establecimiento de medidas de control en la producción y comercialización de estos productos y las mejoras en el tratamiento de las aguas residuales tuvieron como consecuencia una notable disminución de las enfermedades bacterianas transmitidas por estos alimentos. Así, aunque especies de los géneros Salmonella, Shigella, Campylobacter, Plesiomonas, Aeromonas y Escherichia son encontradas frecuentemente en aguas residuales, el tratamiento con cloro consigue su eliminación (Rippey, 1994). En la actualidad, los principales agentes bacterianos implicados en brotes de infecciones transmitidas por moluscos bivalvos son diversas especies pertenecientes al 30 Revisión Bibliográfica género Vibrio (V. parahaemolyticus; V. cholerae; V. vulnificus; V. mimicus; y V. hollisae), responsables del 20% de los casos descritos. Se trata de organismos halófilos ampliamente distribuidos en medios marinos y estuarios, preferentemente en aguas cálidas (10-30ºC) y de salinidad comprendida entre un 5-30‰ (Potasman y col., 2002; Lozano-León y col., 2003; Morris, 2003, Martínez-Urtaza y col., 2004; McLauhglin y col., 2005). En estas condiciones se demostró que el 100% de las ostras pueden estar contaminadas, alcanzando concentraciones 100 veces superiores a las existentes en el agua circundante (Wright y col., 1996). En un 80% de los casos de infección por Vibrio spp., la gastroenteritis es el cuadro clínico más frecuentemente observado. Generalmente, la aparición de los síntomas oscila entre tan solo unas horas hasta un máximo de 5 días, manteniéndose durante 2-3 días. Aunque en escasas ocasiones, se han descrito infecciones de heridas y, en pacientes inmunocomprometidos o con patología hepática, septicemia primaria (Butt y col., 2004). Las infecciones causadas por especies del género Salmonella y asociadas con el consumo de moluscos bivalvos fueron muy frecuentes en el pasado, pero actualmente representan un pequeño porcentaje, a pesar de su presencia en medios marinos (MartínezUrtaza y col., 2004a). Shigella puede ser un potencial agente infeccioso debido a su baja dosis infectante y a su prolongado tiempo de supervivencia en almejas y ostras. En particular S. flexneri y S. sonnei han sido implicadas en casos de disentería relacionados con la ingestión de bivalvos. Otras bacterias asociadas en menor medida con el consumo de estos alimentos son Plesiomonas shigelloides y Listeria monocytogenes (Brett y col., 1998; Potasman y col., 2002; Terajima y col., 2004). 4.3. Potenciales infecciones de etiología parasitaria Los moluscos bivalvos, al concentrar partículas alimenticias, pueden también retener y acumular formas de resistencia de organismos parásitos, en particular protozoos, que se encuentran en el agua de mar circundante y cuya forma y tamaño son similares al de las partículas retenidas. Entre estos parásitos se encuentran Cryptosporidium spp.; Giardia spp.; Cyclospora spp.; Toxoplasma gondii; y algunas especies de Microsporidia, los cuales presentan una distribución cosmopolita y son frecuentemente diagnosticados en el hombre y animales. Los estados exógenos, ooquistes/quistes/esporas, son resistentes a la mayoría de los desinfectantes comúnmente utilizados y pueden sobrevivir en medios acuáticos durante semanas y/o meses, incluso cuando se exponen a un amplio rango de temperaturas y salinidades (Fayer y col., 2004). Algunas de estas especies fueron Revisión Bibliográfica 31 responsables de importantes brotes de infección relacionados con la contaminación de aguas destinadas al consumo humano (Benenson y col., 1982; Bowie y col., 1997; Mac Kenzie y col., 1994; Bern y col., 1999; Cotte y col., 1999; Lee y col., 2002). Aunque también han sido detectadas en moluscos bivalvos, hasta la actualidad no se ha descrito ningún brote infeccioso asociado con su consumo (Graczyk, 2003; Fayer, 2004). La presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. en aguas costeras ha sido demostrada por diversos autores (Johnson y col., 1995; Fayer y col., 1998a) y su supervivencia confirmada mediante colorantes vitales y ensayos de infectividad en ratones (Robertson y col., 1992; Freire-Santos y col., 1999). Diversos estudios experimentales comprobaron la captación y retención de formas infectantes del parásito por moluscos bivalvos (Graczyk, 2003; Graczyk y col., 2003; Izumi y col., 2004; Miller y col., 2005). También, la contaminación natural fue observada en diferentes especies destinadas al consumo humano (Tabla 2). Al igual que Cryptosporidium, quistes de Giardia spp. han sido detectados en aguas marinas (Johnson y col., 1995). Su supervivencia en agua de mar no ha sido evaluada, pero la existencia de infecciones en mamíferos marinos sugiere que, de alguna forma, ofrecen cierta resistencia al menos a salinidades bajas (Fayer y col., 2004). Experimentalmente se ha demostrado que la almeja C. fluminea, el mejillón D. polymorpha y la ostra C. virginica pueden acumular quistes de G. duodenalis (Graczyk y col., 1997, 1998b, 1999a, 2003). Estas observaciones fueron confirmadas posteriormente en moluscos bivalvos naturalmente contaminados (Graczyk y col., 1999c, 2004; Schets y col., 2003; Miller y col., 2005). Brotes de cyclosporidiosis descritos en países industrializados se han relacionado con el consumo de alimentos, como frutas y verduras, importados de regiones tropicales y subtropicales donde la infección humana es más frecuente (Mansfield y Gajadhar, 2004). Se ha demostrado que la almeja de agua dulce C. fluminea puede captar y retener ooquistes de Cyclospora cayetanensis presentes en agua contaminada experimentalmente (Graczyk y col., 1998). Recientemente, Negm (2003) detectó ooquistes de Cyclospora sp. en bivalvos naturalmente contaminados y adquiridos en un mercado local de Alejandría (Egipto). Sin embargo, los ooquistes recuperados de estos moluscos no fueron infectantes para ratones de 4-6 semanas de edad. La elevada seroprevalencia de T. gondii detectada en varias especies de mamíferos marinos evidencia la presencia y supervivencia de este parásito en el medio marino (Fayer y col., 2004). Lindsay y col. (2003) demostraron la capacidad de los ooquistes para esporular en el agua de mar y mantener su viabilidad durante al menos 6 meses. En un 32 Revisión Bibliográfica estudio realizado por Miller y col. (2002), se observó una elevada presencia de anticuerpos específicos frente a T. gondii en nutrias de zonas costeras que recibían abundantes aguas de escorrentía. Cole y col. (2000) sugirieron que los ooquistes de T. gondii podrían llegar al ecosistema marino a partir de heces de gatos domésticos y que ciertos invertebrados actuarían como hospedadores de transporte. Por lo que respecta a los moluscos bivalvos, se ha demostrado experimentalmente que tanto la ostra C. virginica como el mejillón M. galloprovincialis pueden retener ooquistes esporulados de T. gondii (Lindsay y col., 2001; Arkush y col., 2003), los cuales continúan siendo infectantes para ratones tras permanecer 85 días en su interior (Lindsay y col., 2004). Estos mismos autores concluyen que los moluscos bivalvos contaminados pueden ser una fuente de infección para los mamíferos marinos y posiblemente, también para el hombre. Tabla 2. Especies de moluscos bivalvos naturalmente contaminadas por Cryptosporidium spp. Especie Procedencia Referencia C. edule España, Portugal Freire-Santos y col., 2000a; Gómez-Bautista y col., 2000; cit. Fayer y col., 2004 C. gigas Holanda Schets y col., 2003 C. virginica Estados Unidos Fayer y col., 1998a Caelaturia pruneri* Egipto Negm, 2003 Chamelea gallina Italia Traversa y col., 2004; Giangaspero y col., 2005 Corbicula fluminea* Estados Unidos Miller y col., 2005 Donax sp. Egipto, Portugal Negm, 2003; cit. Fayer y col., 2004 Dosinia exoleta España Freire-Santos y col., 2000a Dreissena polymorpha* Canadá, Irlanda Graczyk y col., 2001, 2004 Ischadium recurvum* Estados Unidos Graczyk y col., 1999b Macoma balthica* Estados Unidos Graczyk y col., 2000b Mytilus californianus Estados Unidos Miller y col., 2005b M. edulis Irlanda, Portugal Chalmers y col., 1997; cit. Fayer y col., 2004 M. galloprovincialis España Freire-Santos y col., 2000a; Gómez-Bautista y col., 2000 O. edulis España, Inglaterra Freire-Santos y col., 2000a R. philipinarum Italia Freire-Santos y col., 2000a T. decussatus Portugal cit. Fayer y col., 2004 V. pullastra España Freire-Santos y col., 2000a Venus verrucosa España Freire-Santos y col., 2000a Scrobicularia plana Portugal cit. Fayer y col., 2004 *Especie de agua dulce Revisión Bibliográfica 33 Esporas de distintas especies de Microsporidia que infectan al hombre y animales han sido identificadas en diversos tipos de aguas (Didier y col., 2004). Estudios epidemiológicos demostraron que entre los factores de riesgo para la adquisición de la microsporidiosis humana se incluyen la exposición a aguas recreacionales y la ingestión de aguas contaminadas (Hutin y col., 1998; Cotte y col., 1999; Dascomb y col., 2000). Fayer (2004a) comprobó la diferente capacidad para sobrevivir, en aguas con distintas salinidades y temperaturas, de esporas de tres especies del género Encephalitozoon. Por otra parte, Negm (2003) detectó esporas de Microsporidia en dos especies de almeja destinadas al consumo humano. También, formas de resistencia de Encephalitozoon intestinalis y Enterocytozoon bieneusi se observaron en el mejillón cebra Dreissena polymorpha (Graczyk y col., 2004). 5. CONTROLES SANITARIOS DURANTE LA PRODUCCIÓN Y PROCESADO DE MOLUSCOS BIVALVOS VIVOS El riesgo de adquirir una enfermedad infecciosa tras el consumo de moluscos bivalvos crudos o ligeramente cocinados ha sido reconocido durante muchos años. Consecuentemente, la mayoría de los países productores han establecido controles sanitarios en la producción y comercialización de moluscos bivalvos vivos. En la Unión Europea, estos controles se recogen en la Directiva 91/492/CEE [Diario Oficial de la Comunidad Europea (DOCE) (núm. L 268) de 24 de septiembre de 1991], reflejada en la Legislación Española en el Real Decreto 571/1999 [BOE (núm. 86) de 10 de abril de 1999]. Esta reglamentación establece las normas técnico-sanitarias aplicables a la producción y comercialización de los moluscos bivalvos vivos destinados al consumo humano directo o a la transformación previa a su consumo. Además, incluye las condiciones que deben cumplir las zonas de producción y los moluscos bivalvos vivos, las normas para la recolección, transporte, envasado, conservación y almacenamiento. Estos controles se basan en la determinación de indicadores bacterianos tradicionales de contaminación fecal, como son los recuentos de coliformes fecales (CF) y/o Escherichia coli, para así evaluar la contaminación e implementar medidas de control adecuadas. Ante la ausencia de métodos habituales de detección de virus y de normas virológicas, el control sanitario se basa exclusivamente en el recuento de bacterias fecales. Cuando se demuestre científicamente la necesidad de introducir otros controles sanitarios o de modificar los parámetros indicados, con el fin de proteger la salud pública, dichas medidas serán adoptadas con arreglo al procedimiento previsto en la normativa 40 Revisión Bibliográfica conocida como orgánulo alimentador de membrana (FOM); ii) la ausencia de esporocistos, micropilo y gránulos polares; iii) la capacidad de autoinfección endógena; y iv) la resistencia observada frente a la mayoría de los fármacos anticoccidiales (Lumb y col., 1988 ; Fayer y col., 1997; Armson y col., 2003). Recientemente, datos moleculares indican que Cryptosporidium está más relacionado filogenéticamente con los gregarínidos que con los coccidios (Carreno y col., 1999; Barta, 2001; Perkins y Keller, 2001). Además, la proximidad a este grupo está también apoyada por observaciones biológicas que demuestran la existencia de estados extracelulares en el ciclo biológico de Cryptosporidium (Hijjawi y col., 2002, 2004; Rosales y col., 2005). Figura 6. Tras el desenquistamiento de los ooquistes en la luz intestinal, los esporozoítos penetran en las células del hospedador y se transforman en trofozoítos en el interior de vacuolas parasitóforas formadas en el borde de las microvellosidades del epitelio de la mucosa intestinal. Los trofozoítos sufren una división asexual (esquizogonia=merogonia) dando lugar a merozoítos. Después de ser liberados de los esquizontes Tipo I, los merozoítos invasivos penetran en células adyacentes dando lugar a nuevos esquizontes Tipo I o bien a esquizontes Tipo II. Los esquizontes Tipo II originan merozoítos de segunda generación que penetran en las células para dar lugar a las etapas sexuales, microgamontes y macrogamontes. La mayoría de los cigotos formados tras la fertilización del macrogameto por el microgameto (liberado del microgamonte), se transforman en ooquistes de pared gruesa, que sufren una esporogonia dando lugar a ooquistes esporulados conteniendo cuatro esporozoítos. Los ooquistes esporulados eliminados en las heces son las formas de resistencia del ciclo biológico y transmiten la infección de un hospedador a otro. Un porcentaje menor de cigotos no forma una pared gruesa, sino que tienen una única membrana rodeando a los cuatro esporozoítos. Estos ooquistes de pared fina representan las formas autoinfectantes del ciclo endógeno que permiten el mantenimiento de la infección en el hospedador, sin que éste se exponga a nuevas infecciones externas. Revisión Bibliográfica 41 Ingestión Esporozoítos T rofozoíto Reinfección Esquizogonia Esquizontes con 8 merozoítos Ooquiste de pared gruesa Autoinfección Ooquiste Cigoto Microgametocito Microgametos Macrogametocito HECES Figura 6. Representación esquemática del ciclo biológico de C. parvum (adaptado de Smith y Rose, 1998). 42 Revisión Bibliográfica - Importancia de la caracterización molecular de Cryptosporidium La cryptosporidiosis es un importante problema de salud pública a nivel mundial. En países en vías de desarrollo la enfermedad afecta fundamentalmente a la población infantil y a personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En países industrializados, el empleo de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) en personas afectadas por el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha reducido la prevalencia de la infección, así como la gravedad y duración de las manifestaciones clínicas (Mele y col., 2003). Sin embargo, los brotes hídricos de cryptosporidiosis descritos en estos países no sólo han provocado una alarma social sino que han tenido un fuerte impacto económico (Pretty y col., 2000; Corso y col., 2003). La capacidad de Cryptosporidium spp. para infectar al hombre y a una amplia variedad de animales y la generalizada presencia de las formas de resistencia del parásito en el ambiente, determinan que el hombre pueda adquirir la infección a través de varias rutas de transmisión. Por otra parte, el pequeño tamaño de las formas infectantes y la morfología similar que presentan los ooquistes de diferentes especies o genotipos dificultan el diagnóstico de la cryptosporidiosis y la detección de ooquistes en aguas y productos alimentarios. Por lo tanto, la identificación molecular de Cryptosporidium spp. puede ser importante con el fin de: i) identificar las especies de Cryptosporidium que infectan al hombre; ii) determinar las fuentes de infección o contaminación; iii) establecer la dinámica de transmisión en grupos de población; iv) caracterizar el espectro clínico y patológico de la cryptosporidiosis; y v) desarrollar medidas preventivas para minimizar el riesgo de infección (Xiao y col., 2004). Tradicionalmente, C. parvum fue considerada como la única especie responsable de la cryptosporidiosis humana. Sin embargo, los resultados de recientes estudios biológicos y moleculares demostraron que C. parvum es un complejo de varias especies o genotipos que difieren en características genéticas, especificidad por el hospedador y otros aspectos biológicos (Morgan y col., 1999, 2000; Xiao y col., 2000). De esta forma, numerosos estudios han demostrado que dos especies de Cryptosporidium, C. parvum y C. hominis, son las responsables de la mayoría de las infecciones humanas. C. meleagridis, C. canis, C. felis, C. suis, C. muris y los genotipos procedentes de ciervos y monos, también infectan a personas inmunocompetentes e inmunocomprometidas (Cacciò y col., 2005). En particular, C. meleagridis, un parásito inicialmente descrito en pavos por Slavin (1955), es actualmente reconocido como un patógeno humano, al ser responsable de un 1% de las infecciones descritas en el Reino Unido (McLauchlin y col., 2000) y de aproximadamente un Revisión Bibliográfica 43 10% de las diagnosticadas en Perú, donde su prevalencia es similar a la establecida para C. parvum (Cama y col., 2003). 6.2. Consideraciones epidemiológicas Ciertas características biológicas de las especies del género Cryptosporidium determinan los aspectos epidemiológicos generales de la infección. El pequeño tamaño de los ooquistes (4-8 µm); su gran resistencia a las condiciones ambientales y a los desinfectantes habituales; la baja dosis infectante; la capacidad para multiplicarse en un mismo hospedador; y la ausencia de un tratamiento totalmente eficaz son, entre otros, factores que facilitan su difusión (Casemore y col., 1997; Dillingham y col., 2002). 6.2.1. Distribución y prevalencia Desde 1976, año en el que se describieron los primeros casos humanos de cryptosporidiosis (Meisel y col., 1976; Nime y col., 1976), las infecciones por Cryptosporidium spp. han sido diagnosticadas en más de 90 países y en todos los continentes (excepto en la Antártida), lo que confirma el carácter ubicuo de este parásito (Ungar, 1990). Cryptosporidium es responsable de aproximadamente 500 millones de los casos anuales de infecciones entéricas diagnosticadas en África, Asia y América Latina (Current y Garcia, 1991). La recopilación de numerosos trabajos coprológicos, excluyendo los realizados durante brotes epidémicos y en enfermos de SIDA, reflejan una mayor prevalencia de la infección en países en vías de desarrollo. En una amplia revisión de más de cien estudios realizados en 40 países, Ungar (1990) comprobó que la prevalencia de la infección humana osciló entre: 2,6-21,3% en países africanos; 3,2-31,5% en países centro y suramericanos; y 1,3-13,1% en países asiáticos. En áreas del Pacífico y del Caribe, aunque está descrita la infección, no se dispuso de datos globales. Estas prevalencias superan las establecidas en Europa (0,1-14,1%) y Norteamérica (0,3-4,3%), atribuyéndose a las diferencias existentes en las condiciones sanitarias, a la calidad del agua de bebida y al estado nutricional de la población. Por otra parte, los datos obtenidos en estudios de seroprevalencia indican niveles de exposición al parásito mucho más elevados (O’Donoghue, 1995; Vergara Castiblanco, 1999). En la actualidad, Cryptosporidium está considerado como uno de los tres agentes enteropatógenos más frecuentemente identificados en heces diarreicas, pudiendo ocasionar infecciones esporádicas, diarreas del viajero y, en ocasiones, brotes epidémicos importantes (O’Donoghue, 1995; Rose, 1997). La infección afecta prácticamente a individuos de todas las edades. Entre las personas inmunocompetentes, los grupos con mayor susceptibilidad están constituidos por 44 Revisión Bibliográfica niños de 1-5 años y adultos de 20-40 años, este último en menor proporción y relacionado con la exposición ocupacional a animales o como consecuencia de transmisiones secundarias originadas a partir de la población infantil. El riesgo de infección no parece incrementarse con la edad, probablemente debido a la larga exposición al parásito durante la vida, aunque se han diagnosticado casos en personas de edad avanzada (Current, 1983; Casemore, 1990). Un grupo de alto riesgo para el padecimiento de la cryptosporidiosis es el constituido por personas inmunocomprometidas, en las que la infección adquiere un carácter oportunista. En este grupo se incluyen los enfermos de SIDA o con otras enfermedades del sistema inmunitario y los sometidos a terapia inmunosupresora (Hunter y Nichols, 2002). La prevalencia de la cryptosporidiosis en enfermos de SIDA es elevada, alcanzando valores que oscilan entre un 30-50% en países en vías de desarrollo (Petersen, 1992). En Europa se han descrito valores de prevalencia entorno al 6,6% en personas VIH positivas (Pedersen y col., 1996) y Sorvillo y col. (1994) sugirieron, en un estudio prospectivo, que alrededor de un 3-4% de los enfermos de SIDA padecerían la infección por Cryptosporidium durante el desarrollo de su enfermedad. Sin embargo y como consecuencia de un tratamiento más eficaz (HAART), desde hace algunos años se observa un descenso en estos valores (Manabe y col., 1998; Mele y col., 2003). Otros grupos de riesgo para el padecimiento de la infección son las personas residentes en colectividades, las que asisten a instituciones, aquéllas en contacto con enfermos y los viajeros a zonas endémicas (Casemore y col., 1997). Algunos autores detectaron variaciones estacionales en la aparición e incidencia de la cryptosporidiosis humana. Duong y col. (1995) observaron una mayor incidencia de la infección en niños menores de dos años durante la época de lluvias en Gabón; Clavel y col. (1996) comprobaron en Aragón, una mayor incidencia durante los meses de otoño-invierno, situación que los autores asocian con el inicio del curso escolar; en el Reino Unido, se encontró una mayor incidencia en la primavera y a finales de otoño-principios de invierno, relacionándola con ciertas actividades ganaderas y épocas de lluvia (Casemore, 1990; Palmer y Biffin, 1990). Sin embargo, aunque la transmisión local puede estar afectada por la pluviosidad y por actividades agropecuarias, el comportamiento humano puede ser más importante que los factores climáticos y estacionales (Casemore, 1990). 6.2.2. Dosis infectante El hombre adquiere la cryptosporidiosis mediante la ingestión de ooquistes eliminados ya esporulados, y por lo tanto con capacidad infectante, en las heces de Revisión Bibliográfica 45 hospedadores parasitados. Las rutas de transmisión más frecuentes son por contacto directo persona-persona, animal-hombre o indirectamente a través de aguas destinadas al consumo y/o superficiales, alimentos y posiblemente, por inhalación (Fayer y col., 2000). La dosis infectante (Di) de C. parvum genotipo bovino inicialmente establecida en voluntarios humanos sanos fue de un valor medio de 132 ooquistes (Dupont y col., 1995). Sin embargo, en posteriores estudios se comprobó que, dependiendo de los diferentes aislados, el rango puede oscilar entre 9 y 1042 ooquistes (Okhuysen y col., 1999). En personas inmunocomprometidas esta dosis no está determinada, no obstante se sospecha que la enfermedad puede ser causada por un único ooquiste (Rose, 1997). Además, extrapolaciones realizadas a partir del brote hídrico de Milwaukee sugieren que la Di para ciertos individuos puede variar entre 1 y 10 ooquistes (Newman y col., 1994; Eisenberg y col., 1998). Por otra parte, el período de prepatencia, es decir el tiempo que transcurre desde la ingestión de los ooquistes infectantes hasta que comienza la excreción de los mismos después de completarse el ciclo biológico, puede ser de tan solo 3-5 días o alcanzar dos semanas (Fayer, 2004). En voluntarios sanos infectados con tres aislados diferentes de C. parvum, este período varió entre 4 y 7,7 días. La duración de la excreción ooquística o período de patencia osciló entre un mínimo de 3,3 días y un máximo de 8,4 días (Okhuysen y col., 1999). 6.2.3. Resistencia de los ooquistes a las condiciones ambientales Estudios bioquímicos de las formas infectantes de C. parvum demostraron que la pared ooquística presenta numerosos puentes bisulfito, confiriéndole una elevada resistencia a las condiciones ambientales y por tanto, constituyendo una barrera protectora para los esporozoítos (Mitschler y col., 1994). En la Tabla 6 se exponen los resultados de diversos estudios de supervivencia de los ooquistes de C. parvum después de haber sido sometidos a diferentes condiciones ambientales. La temperatura es un factor que influye en la supervivencia de los ooquistes de Cryptosporidium spp. Debido a la composición proteica de la pared ooquística, la temperatura elevada puede provocar la desnaturalización de las proteínas y consecuentemente alterar la integridad de dicha pared, exponiendo los esporozoítos a condiciones que comprometen su supervivencia (Harris y Petry, 1999). Cryptosporidium puede sobrevivir durante meses en agua a temperaturas que oscilan entre 4-25ºC (Fayer, 1994; Pokorny y col., 2002). Sin embargo, valores de temperatura superiores afectan 46 Revisión Bibliográfica negativamente a la viabilidad e infectividad ooquísticas. De igual forma, temperaturas de congelación también alteran la infectividad. Así, mientras que los ooquistes sometidos a temperaturas de -20ºC; -10ºC; y -5ºC permanecen viables durante 8 horas, una semana y dos meses respectivamente, la congelación a -70ºC inactiva inmediatamente los ooquistes de C. parvum, incluso con crioprotectores (Robertson y col., 1992; Fayer y col., 1998). Tabla 6. Efecto de diversos factores ambientales sobre la viabilidad/infectividad de ooquistes de C. parvum. Factor Referencia Método Condiciones Ooquistes Temperatura Fayer y col., 1996 IR 14 días; 30ºC en agua Infectantes Harp y col., 1996 IR 5 seg; 71,7ºC en agua No infectantes Fayer, 1994 IR 1min; >72,4ºC en agua No infectantes >2min; 64,2ºC No infectantes 5min; 59,7ºC Infectantes Robertson y col., 1992 CV 152h; -22ºC <10% viables Congelación instantánea No viables Fayer y Nerad, 1996 IR 1, 8 y 24h; -70ºC No infectantes 1, 3 y 5h; -20ºC Infectantes Desecación Robertson y col., 1992 CV 4h; T ambiente <1 viables Agua Estéril Olson y col., 1999 CV/IR >12 semanas; -4ºC Viables e infectantes Jenkins y col., 2003 IR/CC 7 meses; 15ºC Infectantes Desionizada Fayer y col., 1998 IR 6 meses; 20ºC Infectantes 7 días; 35ºC Infectantes Del grifo Robertson y col., 1992 CV 176 días; T ambiente 4% viables De río Robertson y col., 1992 CV 176 días; T ambiente 6% viables Pokorny y col., 2002 CC 1 semana; -20ºC No infectantes 14 semanas; 4ºC y 10ºC Infectantes 12 semanas; 21-23ºC <1% infectantes De mar Robertson y col., 1992 CV 35 días; 4ºC 62% viables Fayer y col., 1998 IR 4 semanas; 30‰; 20ºC Infectantes Freire-Santos y col., 1999 IR 40 días, 35‰; 18ºC Infectantes Heces bovinas Robertson y col., 1992 CV 176 días; T ambiente 34% viables Heces humanas Robertson y col., 1992 CV 178 días; 4ºC 22% viables CC, cultivo celular; CV, colorantes vitales; IR, infectividad en ratones; T, temperatura. Revisión Bibliográfica 47 Los ooquistes de Cryptosporidium spp. también sobreviven en agua de mar durante largos períodos de tiempo, manteniéndose viables tras permanecer en oscuridad durante 35 días a 4ºC (Robertson y col., 1992). Estudios de infectividad en ratones demostraron que las mayores intensidades de infección se producen cuando los ooquistes se mantienen a bajas salinidades durante cortos períodos de tiempo (Fayer y col., 1998). Freire-Santos y col. (1999, 2000) valoraron de forma conjunta los efectos de la salinidad, la temperatura y el tiempo sobre la supervivencia de los ooquistes de C. parvum en el medio acuático, comprobando que la temperatura no es un factor limitante. Sin embargo, la salinidad, el tiempo y su interacción afectan significativamente a la infectividad ooquística. Los autores demostraron que ooquistes mantenidos durante 40 días en agua de mar con salinidad del 35‰ y a una temperatura de 18ºC fueron infectantes para ratones recién nacidos. Otro factor ambiental que puede afectar a la supervivencia de las formas infectantes de Cryptosporidium spp. es el grado de humedad. Robertson y col. (1992) demostraron que los ooquistes de C. parvum son susceptibles a la desecación: sólo un 3% de ellos permanecieron viables tras secarse una suspensión acuosa depositada en un portaobjetos y mantenida a temperatura ambiente durante 2 horas. Mayores períodos de tiempo ocasionaron prácticamente una inactivación total (>99% al cabo de 4 horas). El tipo de sustrato sobre el que se encuentran los ooquistes también influye en su viabilidad e infectividad. Robertson y col. (1992), mediante ensayos de permeabilidad a colorantes vitales, demostraron que entre un 0-59% de los ooquistes de Cryptosporidium sobrevivieron después de permanecer 178 días en heces humanas conservadas a 4ºC. De igual forma, comprobaron que un 39% de los ooquistes de origen bovino se mantuvieron viables en heces de ternero a 4ºC después de 176 días. Además, Jenkins y col. (1999) demostraron que la proporción de ooquistes de C. parvum potencialmente infectantes varía notablemente según el tipo de suelo y/o residuo animal en el que se mantienen. Por otra parte, Barwick y col. (2003) al analizar muestras de suelo recogidas en granjas de ganado bovino, comprobaron un menor número de ooquistes en los suelos de pH neutro o básico. Las poblaciones bacterianas existentes en el medio en el que se encuentran los ooquistes también pueden repercutir en su supervivencia. De esta forma, su viabilidad está influenciada por los niveles de bacterias heterótrofas presentes en aguas naturales (Heisz y col., 1997), comprobándose que los ooquistes sobreviven con más facilidad en aguas de río previamente filtradas (Chauret y col., 1998). También se demostró el efecto adverso en la supervivencia ooquística provocado por Serratia marcescens, una bacteria que posee gran actividad quitinolítica (Zuckerman y col., 1997). Deng y col. (2001) observaron que ciertas 48 Revisión Bibliográfica especies bacterianas presentes en residuos animales causan la inactivación de C. parvum al inducir el desenquistamiento. Por otra parte, se comprobó que varios organismos eucariotas presentes en medios hídricos, entre los que se incluyen varias especies de rotíferos, amebas, copépodos, y el nematodo Caenorhabditis elegans son capaces de ingerir ooquistes de C. parvum, pudiendo así influir tanto en su supervivencia como en la diseminación del patógeno en el ambiente (Fayer y col., 2000a; Ares-Mazás y col., 2004; Huamanchay y col., 2004; Méndez-Hermida y col., 2005). 6.2.4. Rutas de transmisión La cryptosporidiosis es una infección que afecta a una gran diversidad de animales vertebrados. Como se ha comentado anteriormente, C. parvum y C. hominis son las dos especies que habitualmente se identifican en muestras humanas. C. parvum es también capaz de infectar a más de 155 especies de mamíferos, algunas de las cuales eliminan grandes cantidades de ooquistes en sus heces (Fayer, 2004). Así, un ternero infectado puede excretar aproximadamente 1010 ooquistes/día durante el período de patencia (Blewett, 1989; Widmer y col., 1996) y un enfermo con SIDA y cryptosporidiosis puede llegar a eliminar 1,2 × 109 ooquistes en 24 horas (cit. Donnelly y Stentiford, 1997). Estos datos ponen de manifiesto la existencia de potenciales fuentes de contaminación ambiental y en consecuencia el alto riesgo que supone para la salud pública. Evidentemente, el mecanismo de transmisión es la ingestión de ooquistes bien a través del contacto con aguas, alimentos y/o superficies expuestas a heces humanas y/o de animales infectados o bien por contacto directo persona-persona (Rose, 1997) (Figura 7). La transmisión de la infección persona-persona se evidenció por la contaminación accidental de un investigador con un concentrado de ooquistes de C. parvum de origen humano (Blagburn y Current, 1983). Desde entonces, este tipo de transmisión ha sido descrita frecuentemente como brotes en guarderías, instituciones y núcleos familiares, estimándose que esta ruta es la responsable de aproximadamente un 60% de los casos diagnosticados (Cordell y Addiss, 1994; Puech y col., 2001; Redlinger y col., 2002; Miller y col., 2003; Gómez-Couso y col., 2004). Sorvillo y col. (1994) y Pedersen y col. (1996) sugirieron que la cryptosporidiosis puede ser sexualmente adquirida al comprobar una mayor prevalencia de la infección en enfermos de SIDA en los que se sospechó la vía sexual en la transmisión del VIH con respecto a otros grupos de riesgo. Recientemente, Hellard y col. (2003) concluyen que el comportamiento sexual es un factor de riesgo para el padecimiento de la cryptosporidiosis en hombres homosexuales. Revisión Bibliográfica 49 Diversas publicaciones apoyan la transmisión nosocomial de la cryptosporidiosis. Baxby y col. (1983) relacionaron la presencia de la infección en una enfermera con el contacto con un niño hospitalizado con cryptosporidiosis aguda y posteriores estudios demostraron este tipo de transmisión en hospitales (Koch y col., 1985; Dryjanski y col., 1986; el-Sibaei y col., 2003; Aygun y col., 2005). La contaminación de salas y unidades de transplante, además de posibles negligencias higiénicas del personal hospitalario, pueden contribuir a la diseminación de la infección, afectando fundamentalmente a individuos inmunocomprometidos (Martino y col., 1988; Navarrete y col., 1991). Sanidad animal Rumiantes Animales salvajes Mascotas Agua Mares Arroyos Ríos Alimentos Bivalvos? Fruta Vegetales Leche Salud pública Inmunocomprometidos Niños Ancianos Riego Fertilización Efluentes agrícolas Agua de bebida Aguas residuales Manipuladores alimentos Figura 7. Representación gráfica de las potenciales rutas de transmisión de la cryptosporidiosis. 56 Revisión Bibliográfica para controlar el curso de la parasitosis, siendo los linfocitos T cruciales en el control de la infección crónica por C. parvum (Heine y col., 1984; Flanigan y col., 1992; Waters y Harp, 1996). Aunque la inmunidad celular mediada por linfocitos T-αβ CD4+ y CD8+ es el componente inmunitario más importante para la resolución de la infección, estudios recientes, utilizando modelos murino y bovino con cryptosporidiosis, han sugerido un papel protector de los linfocitos T-γδ (Deng y col., 2004a). Por otra parte, la citoquina pro-inflamatoria interferon-γ (IFN-γ) puede ser un componente importante tanto de la respuesta inmune innata como de la mediada por células, al observarse un incremento de la misma en la mucosa intestinal humana y animal durante la infección por C. parvum. Sin embargo, los mecanismos y rutas por los cuales el IFN-γ favorece la resolución de la parasitosis todavía no están demostrados (Deng y col., 2004a). El mecanismo específico por el cual Cryptosporidium induce diarrea tampoco ha sido identificado. Ante la presencia de una diarrea secretora profusa en pacientes con cryptosporidiosis y considerando que la absorción de glucosa-ión sodio (Na+) y agua está disminuida y la secreción de ión cloruro (Cl-) está incrementada (Argenzio y col., 1990, 1993; Moore y col., 1995), se planteó la posibilidad de que el parásito produjese una enterotoxina. Sin embargo, es poco probable que la diarrea asociada a la infección sea debida únicamente a un efecto enterotoxigénico, ya que la atrofia de las vellosidades y otras alteraciones estructurales de la mucosa son también responsables de la malabsorción de fluidos y nutrientes que desencadenan procesos diarreicos (Goodgame y col., 1993, 1995). Como en todas las infecciones entéricas, los portadores asintomáticos desempeñan un importante papel en el mantenimiento y transmisión de la cryptosporidiosis en la población. Aunque escasos, diversos estudios demostraron la existencia de infecciones asintomáticas en población infantil, principalmente de países en vías de desarrollo, y en personas afectadas por el VIH (Hadad-Meléndez y col., 1993; Kamel y col., 1994; PettoelloMantovani y col., 1995; Esteban y col., 1998; Solórzano-Santos y col., 2000; Hörman y col., 2004; Palit y col., 2005). Las manifestaciones clínicas de la cryptosporidiosis humana dependen del estado inmunitario del hospedador, reconociéndose tres categorías clínicas: aguda autolimitada o enfermedad transitoria, crónica y fulminante. Revisión Bibliográfica 57 La cryptosporidiosis aguda autolimitada o enfermedad transitoria es la forma clínica más frecuente en personas inmunocompetentes. El período de prepatencia suele ser de 4-7 días, transcurridos los cuales se manifiesta un proceso diarreico que durante un máximo de 7 días puede desencadenar entre 8-20 deposiciones diarias. Sin embargo, la excreción ooquística puede alcanzar una duración superior a un mes después de la resolución de los síntomas. Además de la diarrea acuosa, también se han descrito malestar general, dolor abdominal difuso, anorexia y fiebre moderada en algunos casos (Chappell y col., 2003). La cryptosporidiosis crónica se manifiesta habitualmente en enfermos afectados por el SIDA y en personas con un cierto grado de malnutrición (Blanshard y col., 1992; Cárcamo y col., 2005). El cuadro clínico se caracteriza también por diarrea acuosa, dolor abdominal difuso, náuseas, vómitos, cefaleas, anorexia, fiebre y pérdida de peso. La Organización Mundial de la Salud establece que la cryptosporidiosis con diarrea de más de un mes de duración y en enfermos con una infección por el VIH bien demostrada y no existiendo otras causas de inmunodeficiencia que puedan explicarla, es una de las situaciones clínicas diagnósticas de SIDA (Gatell y col., 1996). La infección fulminante solamente se ha descrito en enfermos de SIDA o con inmunosupresión inducida por fármacos. En estos casos, la enfermedad se presenta como un cuadro similar al cólera, ocasionando la muerte por “shock” hipovolémico (Hunter y Nichols, 2002). 6.3.2. Situación actual del tratamiento y control Los estudios de tratamiento de la cryptosporidiosis tienen una larga e infructuosa historia. Numerosos fármacos han sido evaluados, tanto in vitro como in vivo, sin que ninguno de ellos haya mostrado una eficacia totalmente satisfactoria. Los conocimientos actuales sobre la bioquímica de Cryptosporidium y sus interacciones con la célula hospedadora deben de establecer las bases para una investigación terapéutica más racional (Armson y col., 2003). En sanidad humana, uno de los primeros fármacos empleados con relativo éxito fue el antibiótico macrólido espiramicina. Sin embargo, su eficacia en personas VIH positivas nunca ha sido demostrada en ensayos clínicos controlados (Blagburn y Soave, 1997). Otros antibióticos macrólidos evaluados también con resultados contradictorios fueron la azitromicina y la claritromicina (Smith y Corcoran, 2004). En un estudio de tratamiento con roxitromicina en 24 personas infectadas, Sprinz y col. (1998) comprobaron una remisión 58 Revisión Bibliográfica completa de los síntomas en el 50% de los enfermos y una respuesta parcial en el 29% de los restantes, después de 4 semanas de tratamiento. La paromomicina, un antibiótico aminoglucósido, se emplea en muchos países como fármaco de elección en el tratamiento de la cryptosporidiosis, aunque también con resultados diversos. Mientras que White y col. (1994) y Flanigan y col. (1996) observan una disminución significativa en la frecuencia de las deposiciones y un acortamiento en el período de excreción ooquística, Hewitt y col. (2000) no observaron diferencias entre la administración de paromomicina y un placebo respecto a la duración de la diarrea, variaciones de peso corporal y período de patencia. Recientemente, la nitazoxanida [2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamida], un antiparasitario sintético de amplio espectro, se ha revelado como uno de los fármacos más prometedores en el tratamiento de la cryptosporidiosis. Administrada por vía oral y una vez en sangre, es rápidamente hidrolizada por estearasas, obteniéndose el derivado desacetilado tizoxanida (desacetil-nitazoxanida) que constituye el metabolito activo (Stockis y col., 1996). Estudios in vitro realizados con protozoos y bacterias anaerobias mostraron que la nitazoxanida inhibe el enzima piruvato-ferredoxina oxidorreductasa, esencial para el metabolismo energético de organismos anaerobios (Sisson y col., 2002). Sin embargo, esta ruta probablemente no sea la única por la cual la nitazoxanida muestra su actividad antiprotozoaria, además de desconocerse el mecanismo de acción antihelmíntico (Fox y Saravolatz, 2005). En diciembre de 2002, el organismo encargado del control de alimentos y fármacos de Estados Unidos (“United States Food and Drug Administration”) aprobó la administración oral de nitazoxanida para el tratamiento de procesos diarreicos causados por especies de Cryptosporidium en niños de 1-11 años de edad (Fox y Saravolatz, 2005). En personas con SIDA, el tratamiento de elección es la restauración de la función inmune mediante HAART, que actúa no sólo profilácticamente sino también como tratamiento y profilaxis secundaria cuando la cryptosporidiosis está establecida en estos enfermos (cit. Smith y Corcorán, 2004). Varios estudios comprobaron que los fármacos inhibidores de la proteasa usados en la HAART (nelfinavir, indinavir, ritonavir) reducen el desarrollo in vitro de C. parvum, mostrando un efecto sinérgico cuando se combinan con la paromomicina (Hommer y col., 2003; Mele y col., 2003). Considerando que la transmisión hídrica es el mecanismo numéricamente más importante en la epidemiología de la cryptosporidiosis, en la actualidad las medidas de control se dirigen a la puesta a punto y perfeccionamiento de técnicas que permitan Revisión Bibliográfica 59 detectar e identificar las formas infectantes de este parásito en el agua (Fayer, 2004). Tan solo dos países, Estados Unidos y el Reino Unido, han adoptado medidas para optimizar el tratamiento del agua potable y minimizar el riesgo de contaminación por Cryptosporidium (USEPA, 2001; DWI, 2003) e incluso, en el Reino Unido y a través del organismo “Drinking Water Inspectorate” (DWI), las empresas de tratamiento de aguas destinadas al consumo humano están legalmente obligadas a monitorizar continuamente la efectividad del tratamiento aplicado. De acuerdo con el informe de la DWI, la presencia de tan solo un ooquiste de Cryptosporidium en un volumen de 10 litros de agua tratada e independientemente de su especie y/o viabilidad, supone un delito, a menos que la empresa implicada demuestre la aplicación de los protocolos recomendados. La Legislación Española vigente recoge en el Real Decreto 140/2003 los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano y considera agua apta para tal fin, aquélla que no contenga ningún tipo de microorganismo, parásito o sustancia en una cantidad o concentración que pueda suponer un peligro para la salud humana. En el Anexo I, parte A, se cita que cuando exista una turbidez mayor de 5 unidades nefelométricas (UNF), se determinarán, en la salida de la estación de tratamiento de aguas potables (ETAP) o depósito y si la autoridad sanitaria lo considera oportuno, Cryptosporidium u otros organismos o parásitos [BOE (núm. 45) de 21 de febrero de 2003]. Por otra parte y teniendo en cuenta que la cryptosporidiosis humana puede tener un origen zoonótico, es necesario el tratamiento y control de la infección en los rumiantes domésticos, una de las principales fuentes de contaminación ambiental. Hasta el momento, tan solo el lactato de halofuginona (comercializado para uso exclusivamente veterinario bajo el nombre de Halocurt ®), la paromomicina y el decoquinato han demostrado ser parcialmente efectivos en la prevención y tratamiento de la cryptosporidiosis en estos animales (Naciri e Yvoré, 1989; Naciri y col., 1993; Mancassola y col., 1995, 1997; Viu y col., 2000). Actualmente, se intenta obtener una vacuna frente a C. parvum con el fin de generar un calostro hiperinmune que pueda ser efectivo en la inmunoterapia pasiva frente a la infección en animales jóvenes (Jenkins, 2004). El desarrollo de programas de tratamiento de residuos ganaderos, el control de la integridad de las fosas sépticas y las mejoras en el tratamiento de aguas residuales que vierten a aguas superficiales o son reutilizadas, se dirigirán a reducir la contaminación ambiental de todos los patógenos de transmisión hídrica, incluyendo a Cryptosporidium (Fayer, 2004). Finalmente, las prácticas higiénicas en la elaboración y procesado de los alimentos, así como la educación sanitaria de la población, son medidas necesarias para controlar la 60 Revisión Bibliográfica transmisión de esta parasitosis (Slifko y col., 2000). De hecho, en el Reino Unido, la cryptosporidiosis está incluida entre la infecciones gastrointestinales que incapacitan para su trabajo a los manipuladores de alimentos y, desde 1995, existen unas normas higiénicosanitarias para estos profesionales incluyendo a los relacionados con la fabricación de hielo y embotellamiento de aguas (Donnelly y Stentiford, 1997). MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 63 1. CRYPTOSPORIDIUM SPP. 1.1. Obtención de aislados ooquísticos Se utilizaron diversos aislados ooquísticos procedentes de muestras fecales recogidas durante diversos muestreos en explotaciones ganaderas de la provincia de A Coruña. Las muestras fueron obtenidas directamente del recto de terneros de raza Frisona menores de 15 días infectados naturalmente. Mediante la realización de una tinción negativa directa con fucsina fenicada (Heine, 1982), se seleccionaron aquellas muestras que presentaron un promedio superior a 10 ooquistes de Cryptosporidium spp. por campo microscópico 100×, valor obtenido tras la observación de 20 campos microscópicos seleccionados al azar (criterio establecido en anteriores estudios como indicativo de infección grave) (Castro Hermida, 2002). Las muestras se conservaron, en cámara fría a 4ºC, en igual volumen de solución acuosa de dicromato potásico (K2Cr2O7) al 5%. Tinción de Heine (1982) Sobre portaobjetos desengrasados se colocan volúmenes similares de heces y fucsina fenicada, se homogeniza la mezcla y la extensión realizada se deja secar a temperatura ambiente. La observación microscópica (100×) se realiza en un tiempo inferior a 15 minutos. Concentración - Se homogenizan en un mortero alícuotas de heces conservadas en K2Cr2O7 al 5%. Se tamizan a través de mallas con tamaño de poro de 150 y 45 µm. El K2Cr2O7 se elimina por sucesivos lavados en PBS 0,04M pH 7,2 (Apéndice) mediante centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - Se realizan concentraciones difásicas en PBS 0,04M pH 7,2/éter etílico (2:1) hasta la total extracción de restos lipídicos por centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - Los restos de éter etílico se eliminan mediante sucesivos lavados del sedimento obtenido con PBS 0,04M pH 7,2 por centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - El sedimento obtenido se resuspende en PBS 0,04M pH 7,2 y se adiciona igual volumen de solución acuosa de K2Cr2O7 al 5%. Se conserva a 4ºC hasta su purificación. 64 Material y Métodos Purificación - Los ooquistes previamente concentrados y conservados a 4ºC en K2Cr2O7 al 2,5% se lavan dos veces con PBS 0,04M pH 7,2 mediante centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - El sedimento obtenido se purifica en gradiente discontinuo de Percoll® de densidades 1,13; 1,09; 1,05; y 1,01 g/ml (Stibbs y Ongerth, 1986) (Apéndice). En un tubo graduado de fondo cónico se colocan 2,5 ml de cada una de las soluciones de Percoll® (desde 1,13 hasta 1,01 g/ml) y se añade el sedimento resuspendido en 1 ml de PBS 0,04M pH 7,2. - A continuación se centrifuga a 650 × g, a 4ºC, durante 15 minutos. - Se separa la banda rica en ooquistes, situada entre las soluciones de Percoll® de densidades 1,05 y 1,09 g/ml. - Los restos de Percoll® se eliminan mediante varios lavados en PBS 0,04M pH 7,2 por centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. Cuantificación El recuento de ooquistes se realiza en un hemacitómetro (cámara de Neubauer, 40×) utilizando una solución acuosa de verde malaquita al 0,16% (Apéndice) como contracolorante. 1.2. Determinación de la viabilidad ooquística 1.2.1. Técnica de inclusión/exclusión de colorantes vitales fluorogénicos Se aplicó la técnica descrita por Campbell y col. (1992) que utiliza dos colorantes vitales fluorogénicos: 4’,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) e ioduro de propidio (IP). - Se resuspenden 2×106 ooquistes purificados en 100 µl de solución balanceada de Hanks (HBSS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, Estados Unidos). - Se añaden 10 µl de solución de trabajo DAPI (Apéndice) y 10 µl de solución de trabajo IP (Apéndice), incubándose a 37ºC durante 2 horas (tiempo óptimo establecido para producir la máxima adquisición de los colorantes). - Se realizan dos lavados con HBSS a 11300 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - Se elimina el sobrenadante hasta un volumen final de 500 µl. - Alícuotas de 10 µl de la suspensión ooquística se observan bajo fluorescencia con un microscopio equipado con un filtro ultravioleta de banda ancha (excitación 330-385 nm; Material y Métodos 65 barrera 420 nm) para el colorante DAPI y un filtro verde de banda ancha (excitación 510-550 nm; barrera 590 nm) para el colorante IP. Los resultados se interpretaron de acuerdo con el siguiente criterio: ooquistes viables (inclusión de DAPI pero no inclusión de IP); ooquistes inviables (inclusión de IP); ooquistes vacíos (detectados por contraste de fases); y ooquistes viables tras estimulación (no inclusión de ambos colorantes). 1.2.2. Bioensayos en ratón Se utilizaron camadas de ratones Swiss CD-1 suministradas por el Animalario Central de la Universidad de Santiago de Compostela. En todos los ensayos se emplearon animales con un peso corporal comprendido entre 2,5-3 g (3-4 días de edad). Las camadas con sus respectivas madres se mantuvieron separadas en jaulas de plástico a una temperatura aproximada de 20ºC. Diariamente recibieron un pienso comercial (Panlab S.L., Barcelona, España) y agua, manteniéndose bajo unas condiciones higiénicas adecuadas de acuerdo con la legislación vigente sobre protección de los vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos [BOE (núm. 67) de 18 de marzo de 1988; BOE (núm. 256) de 25 de octubre de 1990]. Los ratones se separaron de sus madres al menos una hora antes de ser inoculados intragástricamente utilizando una micropipeta de volumen fijo de 100 µl y colocándose de nuevo con ellas en sus jaulas hasta el momento del sacrificio. A los 7 días post-inoculación (pi), día de máxima producción ooquística establecido en estudios previos (Villacorta y col., 1988), se sacrificaron los animales y los intestinos se recogieron individualmente sobre 5 ml de PBS 0,04M pH 7,2. A continuación, se trituraron utilizando un homogenizador de barras (Ultra-Turrax® T8, IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Alemania). La producción ooquística se cuantificó en cámara de Neubauer previa dilución del homogenizado intestinal (1:10) con solución de verde malaquita al 0,16%. La intensidad de infección se expresó como el número de ooquistes/totalidad del intestino homogenizado. 1.3. Detección en muestras de moluscos bivalvos Previa aplicación de las técnicas de detección de Cryptosporidium spp., las muestras de moluscos bivalvos se sometieron a un proceso de concentración. Cada muestra estuvo constituida por 6-8 ejemplares, a los que se les extrajeron las branquias y el tejido gastrointestinal, siendo posteriormente homogenizados en PBS 0,04M pH 7,2 mediante un homogenizador de cuchillas Osterizer Pulse Matic 16 (Oster, Milwaukee, Wisconsin, Estados 72 Material y Métodos Gotas de 20 µl del sedimento contaminado se dispusieron en portaobjetos, se secaron a temperatura ambiente y se incubaron con 40 µl de anticuerpo monoclonal en cámara húmeda, a 37ºC, durante 30 minutos. Usando un microscopio de epifluorescencia equipado con filtro azul de banda ancha, se contabilizó, por triplicado, el número de ooquistes presentes en 20 µl del sedimento contaminado. Los porcentajes de detección mediante la técnica de IFD se establecieron teniendo en cuenta que el número teórico de ooquistes presentes en ese volumen es 0; 1; 5; 10; 50; y 100 ooquistes. 2.2.2. Evaluación de la técnica de PCR Previa aplicación de un diseño experimental, se investigó la presencia de inhibidores de la técnica de PCR en el ADN extraído de los moluscos bivalvos. Para ello y aplicando la metodología descrita anteriormente, volúmenes de una solución de ADN obtenida a partir de ooquistes purificados de C. parvum se mezclaron con volúmenes de otra solución de ADN extraída del sedimento obtenido a partir de 6-8 mejillones (M. galloprovincialis). Se establecieron las siguientes diluciones del ADN parasitario: 1:5; 1:10; 1:50; 1:100; 1:500; y 1:1000. Paralelamente y como control, se realizaron las mismas diluciones del ADN parasitario en agua para biología molecular. Se aplicó la técnica de PCR con muestras de todas la diluciones. - Diseño experimental Al igual que en el Apartado 2.2.1., se utilizaron muestras de mejillón M. galloprovincialis, en las que se comprobó la ausencia de contaminación por Cryptosporidium spp. mediante las técnicas de IFD y de PCR. A continuación, se aplicó el siguiente diseño experimental (Figura 9): alícuotas de 180 µl del sedimento obtenido a partir de las muestras se contaminaron con 20 µl de unas suspensiones en PBS 0,04M pH 7,2 que contenían 0; 10; 50; 100; y 1000 ooquistes purificados de C. parvum. Utilizando la metodología descrita, se procedió a la extracción del ADN cryptosporidial presente en los sedimentos contaminados y se realizó la técnica de PCR, siendo cada muestra amplificada 10 veces. Teniendo en cuenta que el volumen de la solución de ADN extraído de los sedimentos de mejillón contaminados fue de 125 µl y que en cada ensayo de la técnica de PCR se emplearon 5 µl, el número teórico de ooquistes que se detectaría en cada una de las reacciones de amplificación sería de 1; 2; 4; y 40 ooquistes para las respectivas dosis contaminantes. Material y Métodos 73 2.3. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano 2.3.1. Muestras Para este estudio, realizado en el Food Safety Microbiology Laboratory (Centre for Infections, Health Protection Agency, Reino Unido), se seleccionaron 49 de las 241 muestras de moluscos bivalvos analizadas en el Apartado 2.1. (22 de mejillón, 18 de almejas y 9 de ostra) y en las que previamente se había investigado la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. mediante la técnica de IFD. Además, se analizaron 18 muestras de mejillón M. galloprovincialis y 18 de berberecho C. edule procedentes del noroeste de Inglaterra y proporcionadas por el Laboratorio de Salud Pública de Preston (Reino Unido) y dos muestras de mejillón Perna canaliculus originarias de Nueva Zelanda. De estas muestras tan solo se dispuso de 25 ml de un homogenizado utilizado en los análisis bacteriológicos que, tras ser filtrado a través de mallas, se sometió al mismo proceso de concentración difásica aplicado al resto de las muestras. Figura 9. Diseño experimental aplicado para establecer el nivel de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante la técnica de PCR. Homogenización de branquias y tractos gastrointestinales de 6-8 mejillones Centrifugación en PBS/éter Volumen final del sedimento 1000 µl Comprobación de la ausencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. 10 × 5 µl (40 ooquistes) 180 µl sedimento + 20 µl suspensión con 1000 ooquistes Extracción de ADN Perlas de circonio + sílice (125 µl) Extracción de ADN Perlas de circonio + sílice (125 µl) Extracción de ADN Perlas de circonio + sílice (125 µl) Extracción de ADN Perlas de circonio + sílice (125 µl) 180 µl sedimento + 20 µl suspensión con 100 ooquistes 180 µl sedimento + 20 µl suspensión con 50 ooquistes 180 µl sedimento + 20 µl suspensión con 10 ooquistes 10 × 5 µl (4 ooquistes) 10 × 5 µl (2 ooquistes) 10 × 5 µl (1 ooquiste) 74 Material y Métodos 2.3.2. Técnicas moleculares Todas las muestras se sometieron al proceso de extracción de ácidos nucleicos y a la técnica de PCR descritos en el Apartado 1.3.2. Las especies y genotipos de Cryptosporidium se determinaron mediante las técnicas de RFLP y secuenciación (Apartado 1.4.). En aquellas muestras en las que se detectaron mezclas de especies/genotipos de Cryptosporidium, se utilizó una técnica de clonación para elucidar los resultados. Así, los fragmentos de ADN amplificados mediante la PCR a partir de estas muestras se purificaron usando columnas de centrifugación StrataPrep® PCR Purification Kit (Stratagene) y posteriormente se clonaron en el plásmido pCR®2.1-TOPO® usando el sistema de clonación TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial. Brevemente, una alícuota de 2 µl del producto purificado obtenido mediante la técnica de PCR se ligó al plásmido (incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente) y se implantó en células químicamente competentes de E. coli (One Shot® TOP10, Invitrogen) mediante “shock” térmico. A continuación, las células se cultivaron a 37ºC en placas de agar Luria-Bertani (Apéndice) conteniendo 50 µg/ml de ampicilina y 40 µl de una disolución en dimetilformamida de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) a una concentración de 40 mg/ml. Al cabo de aproximadamente 12 horas, diez colonias blancas o ligeramente azuladas, procedentes de cada una de las muestras, se resuspendieron en 50 µl de agua para biología molecular y se incubaron a 95ºC durante 5 minutos. Seguidamente, un volumen de 1 µl de estas suspensiones se utilizó en la segunda etapa de la técnica de PCR empleando los cebadores PCOWPIF y PCOWPIR. Los productos de la amplificación positivos para Cryptosporidium fueron posteriormente caracterizados mediante las técnicas de RFLP y secuenciación como se describe en los apartados anteriores. 2.4. Cryptosporidium y Giardia en zonas de cultivo de moluscos bivalvos Entre los meses de enero y junio de 2004, se recogieron muestras ambientales y biológicas en cuatro estuarios gallegos conocidos colectivamente como Rías Baixas, importantes zonas de producción de moluscos bivalvos y en cuyos márgenes se ubican destacados núcleos poblacionales. Algunos datos sobre la geografía física de las Rías Baixas, así como la localización de los puntos de muestreo se reflejan en la Tabla 8 y en la Figura 10, respectivamente. El Instituto Nacional de Meteorología del Ministerio de Medio Ambiente nos proporcionó los datos de precipitaciones recogidos en la estación meteorológica núm. 1484C localizada en Pontevedra (8º 36' 59'' O, 42º 26' 24'' N; altitud 107 m) y el Instituto Material y Métodos 75 Tecnolóxico para o Control do Medio Mariño de la Xunta de Galicia nos facilitó los parámetros oceanográficos de temperatura y salinidad del agua de mar durante el período de estudio. Tabla 8. Algunos datos sobre la geografía física de las Rías Baixas. Ría Muros-Noia Arousa Pontevedra Vigo Longitud (Km) 12 26 23 33 Longitud de costas (Km) 58 131 46 71 Superficie (Km2) 120 230 145 175 Volumen (millones m3) 2700 4300 3450 3100 Profundidad máxima (m) 46 65 40 42 Profundidad media (m) 22 19 24 18 2.4.1. Muestras ambientales - Aguas fluviales Se tomaron muestras de agua de siete de los principales ríos que desembocan en los estuarios objeto de estudio: ríos Tambre y Traba en la Ría de Muros-Noia; ríos Ulla y Umia en la Ría de Arousa; Río Lérez en la Ría de Pontevedra; y ríos Verdugo y Lagares en la Ría de Vigo (Figura 10). Previamente, se contactó con las distintas empresas de abastecimiento de aguas que poseen sistemas de captación localizados en el tramo final de los citados ríos. Una vez obtenido el consentimiento por parte de las mismas, se procedió, en las propias unidades de captación y con ayuda de sistemas de bombeo de la propia planta, al filtrado de un volumen comprendido entre 20-30 litros de agua utilizando el equipo Filta-Max (IDEXX, Laboratorios Inc., Westbrook, Maine, Estados Unidos). En dos ocasiones, ríos Tambre y Lagares, las muestras se tomaron directamente de la boca de los ríos y una vez en el laboratorio se filtraron empleando una bomba peristáltica (Masterflex® L/S®, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois, Estados Unidos). En todos los casos el protocolo seguido constó de las siguientes etapas: Filtración La unidad de filtrado, constituida por anillos de gomaespuma y discos, se introduce en la cápsula de filtración que se conecta a la bomba de agua. Transcurrido el tiempo necesario para la filtración del volumen de agua establecido, los orificios de entrada y salida de la cápsula se sellan con tapones de goma y los filtros se trasladan al laboratorio, procesándose en un tiempo no superior a 24 horas. 76 Material y Métodos Elución de los filtros de gomaespuma El equipo consta de dos cámaras, una superior de elución y otra inferior de concentración, en cuyo fondo existe un soporte poroso sobre el que se coloca un filtro de membrana de 3 µm de tamaño de poro y 73 mm de diámetro (IDEXX). Ambas cámaras están conectadas entre sí mediante una varilla de aspiración. El filtro se coloca en la cámara superior de elución y mediante un sistema de bombeo que expande y comprime los anillos de gomaespuma se procede a su lavado mediante un líquido de elución (Apéndice). Concentración de la muestra El líquido eluído se concentra mediante filtración a través de la membrana existente en el fondo de la cámara de concentración hasta un volumen final de 20 ml con ayuda de un agitador magnético y una bomba de vacío manual. Elución de la membrana Finalmente, la membrana colocada al inicio del proceso se introduce en una bolsa autosellable de polietileno Minigrip (IDEXX) conteniendo 5 ml de líquido de elución y se lava manualmente. La solución procedente de este lavado se añade al concentrado obtenido anteriormente. - Aguas residuales Con el consentimiento de las autoridades municipales y de las empresas responsables, se procedió a la recogida de aguas residuales procedentes de los núcleos poblacionales situados en los márgenes de los estuarios analizados. Las muestras consistieron en el efluente final de 16 estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) y en aguas residuales brutas recogidas directamente de la red de alcantarillado en 11 localidades que carecían de EDAR. En ambos casos, el volumen recogido fue aproximadamente de 2 litros. Una vez en el laboratorio y previa incorporación de Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) a una concentración del 0,01%, se procedió a realizar directamente las etapas de concentración y elución de la membrana descritos con anterioridad. Independientemente de su origen (fluvial o residual), cuando las muestras presentaron una turbidez ≥1 UNF, el concentrado obtenido se centrifugó a 1500 × g durante 15 minutos y el sedimento fue clarificado mediante separación inmunomagnética (IMS) utilizando el sistema Aureon CG Kit (Aureon Biosystems Gmbh, Viena, Austria): Material y Métodos 77 - El sedimento se resuspendió en 5 ml de agua destilada y se transfirió a un tubo leighton. - Se adicionaron 5 ml de tampón A-IMS Buffer™, 100 µl de una suspensión de partículas paramagnéticas Cryptosporidium A-Beads y 100 µl de una suspensión de Giardia A-Beads. El conjunto se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotativo MXIC1 (Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega). - A continuación, el tubo se acopló a un soporte magnético MagnetOn 4T™ y se agitó suavemente durante un minuto. El sobrenadante se eliminó por decantación. - Se añadió 1 ml de tampón de lavado IT-Wash Buffer™ y de nuevo se agitó suavemente durante 30 segundos. El sobrenadante se eliminó por aspiración. - Seguidamente, se agregaron 50 µl de HCl 50mM. El tubo se agitó vigorosamente dos veces durante 15 segundos con un intervalo de 30 segundos y se acopló de nuevo al soporte magnético. Transcurridos 10 segundos, el sobrenadante se recuperó por aspiración. Río Lérez Figura 10. Rías Baixas: localización geográfica de los puntos de muestreo. , EDAR; , sistema de alcantarillado; , zona de cultivo de moluscos bivalvos tipo A; ,zona de cultivo de moluscos bivalvos tipo B. RÍA DE MUROS-NOIA R Í A DE AROUSA R Í A DE PONTEVEDRA R Í A DE VIGO Río Tambre Río Traba Río Ulla Río Umia Río Verdugo 78 Material y Métodos 2.4.2. Muestras biológicas Durante el período de estudio establecido, la UCM nos proporcionó 184 muestras no depuradas de mejillón M. galloprovincialis con un tamaño de valva de 8,21 × 4,07 cm (±0,46 × 0,23) y los datos correspondientes a la calidad microbiológica de las mismas y de la zona de muestreo (Figura 10) clasificada como se especifica en la Tabla 4 del Apartado 5.1. de la Revisión Bibliográfica. De acuerdo con la directiva 91/492 de la Unión Europea [DOCE (núm. L 268) de 24 de septiembre de 1991], las muestras de mejillón se clasificaron como pertenecientes a: i) categoría A, menos de 230 E. coli /100 g; ii) categoría B, entre 230 y 4600 E. coli /100 g; y iii) categoría C, más de 4600 E. coli /100 g de carne y líquido intervalvar. Todas las muestras estuvieron constituidas por 6-8 mejillones y se procesaron como se describe en el Apartado 1.3. 2.4.3. Detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. y de quistes de Giardia spp. Un volumen comprendido entre 0,5-1,0 ml del concentrado obtenido tras el procesamiento de las muestras ambientales (aguas fluviales y residuales) se filtró a través de membranas de nitrocelulosa de 3 µm de tamaño de poro y 13 mm de diámetro (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, Estados Unidos). Sobre las mismas se aplicó una técnica de IFD (Merifluor® Cryptosporidium/Giardia, Meridian Bioscience Inc.) y el número de ooquistes/quistes retenidos se cuantificó mediante microscopía de epifluorescencia. De igual forma, mediante la técnica de IFD se cuantificaron los ooquistes/quistes existentes en los sedimentos obtenidos a partir de las muestras biológicas. 2.4.4. Identificación de especies/genotipos de Cryptosporidium Empleando la metodología descrita en los apartados correspondientes, se caracterizaron molecularmente los aislados de Cryptosporidium procedentes de la totalidad de las muestras de mejillón y de aquellas muestras ambientales en las que mediante la técnica de IFD se visualizaron ooquistes de Cryptosporidium spp. 3. ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN EXPERIMENTAL Los estudios de contaminación experimental se realizaron en instalaciones del Instituto de Acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela destinadas al cultivo y mantenimiento de moluscos bivalvos. Se utilizaron semillas de dos especies, O. edulis y T. decussatus, con un tamaño de valva comprendido entre 5-7 mm (aproximadamente 8 meses de edad) que fueron suministradas por el Centro de Cultivos Mariños de Ribadeo Material y Métodos 79 (Lugo) y por el Centro de Experimentación en Acuicultura de Couso (A Coruña), pertenecientes a la Red de Centros de Investigación Mariña de la Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos de la Xunta de Galicia. Las semillas se mantuvieron a lo largo de los estudios en tanques de 60 litros con agua de mar natural, a una temperatura constante de 15±3ºC y con aireación controlada. El alimento consistió en una mezcla formada en igual proporción por cinco especies de microalgas: Tetraselmis suecica; Skeletonema costatum; Phaeodactilum tricornutum; Chaetoceros calcitrans; y Monochrysis lutheri. La contaminación experimental se realizó con distintos aislados de ooquistes purificados de C. parvum (Figura 12). 3.1. Supervivencia de C. parvum en dos especies de moluscos bivalvos: O. edulis y T. decussatus En este estudio se utilizaron 120 semillas de ostra (O. edulis) y 120 semillas de almeja (T. decussatus) que se mantuvieron independientemente en dos tanques durante 31 días bajo las condiciones descritas anteriormente. Cada uno de los tanques se contaminó con 60×106 ooquistes purificados de C. parvum, alcanzándose una concentración aproximada de 1×106 ooquistes/l. Diariamente, entre los días 1 y 10 post-contaminación, se analizaron dos muestras constituidas por 10 ostras y 10 almejas respectivamente, que se procesaron como se describe a continuación: - Apertura de las valvas y extracción de la totalidad del cuerpo del molusco. - Homogenización mediante un homogenizador de barras Ultra-Turrax® T8 (IKA® Werke GmbH & Co. KG). - Concentración en PBS 0,04M pH 7,2/éter etílico (2:1) por centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos. - Lavados con PBS 0,04M pH 7,2 (1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos). El sedimento obtenido se resuspendió en 100 µl de HBSS (Sigma-Aldrich Co.) y sobre esta suspensión se aplicaron las técnicas de detección (IFD) y viabilidad ooquística (IP) descritas anteriormente para los estudios de contaminación natural. Además, los días 10 y 31 post-contaminación, se procesaron diez semillas de cada especie, cuyos sedimentos se utilizaron para determinar la infectividad ooquística mediante bioensayos en ratón (Apartado 1.2.2.). 80 Material y Métodos 3.2. C. parvum en T. decussatus Se estudió el tránsito de ooquistes de C. parvum a través de semillas de almeja T. decussatus. Para ello, 60 semillas se mantuvieron en tanques con 20 litros de agua de mar natural durante 10 días. El alimento, una mezcla de microalgas, se añadió al tanque al inicio y transcurridos cinco días con el fin de estimular la filtración e inducir la ingestión de los ooquistes. El tanque se contaminó con 20×106 ooquistes purificados de C. parvum (aproximadamente 1×106 ooquistes/l). A las 24 horas post-contaminación, se sacrificaron 10 ejemplares para confirmar la presencia de ooquistes que se detectaron mediante la técnica de IFD (Monofluo® Kit Cryptosporidium, Sanofi Diagnostics Pasteur) siguiendo el procedimiento descrito en el apartado anterior. Diariamente, se recogieron cinco semillas, cuyo cuerpo se sometió al siguiente protocolo histológico: - Fijación durante 4-5 horas en solución fijadora de Bouin (Apéndice) (Hernández Córdova, 2001). - Deshidratación mediante alcoholes etílicos de distinta graduación: Tres lavados de 1 hora en alcohol etílico 70% [saturado con carbonato de litio para la tinción tricrómica de Gomori modificada por Wheatley (1951)]. Un lavado durante 1 hora en alcohol etílico 96%. Dos lavados de 1 hora en alcohol etílico 100%. - Aclarado mediante dos lavados de 30 minutos en xilol. - Impregnación en parafina, tres baños de 1 hora (62-64ºC) (Paraplast Plus, Sherwood Medical Co., St. Louis, Missouri, Estados Unidos). - Inclusión en parafina. Los bloques obtenidos se conservaron a temperatura ambiente. A partir de estos bloques, previamente enfriados a 4ºC, se realizaron cortes de 3 µm de grosor con un microtomo manual (Rotary Microtome HM-340E, Microm Internacional Gmbh, Walldorf, Alemania). Antes de aplicar las técnicas de tinción e inmunohistoquímicas, los cortes se desparafinaron y rehidrataron: - Introducción en un horno (62-64ºC) de los cortes dispuestos en portaobjetos durante 12 horas. - Dos lavados de 5 minutos en xilol. - Rehidratación con alcoholes etílicos de distinta graduación: Material y Métodos 81 Dos lavados de 5 minutos en alcohol etílico 100%. Un lavado de 5 minutos en alcohol etílico 96%. Un lavado de 5 minutos en alcohol etílico 80%. - Un lavado de 5 minutos en agua destilada. La detección de los ooquistes de C. parvum se realizó mediante una técnica de IFD (Merifluor® Cryptosporidium/Giardia, Meridian Bioscience Inc.). Paralelamente y para facilitar la identificación de los distintos tejidos, se llevó a cabo una tinción tricrómica de Gomori modificada por Wheatley (1951): - Tinción durante 90 segundos con tricrómico de Wheatley (Apéndice). - Lavado en solución B (Apéndice) durante 10 segundos. - Enjuague con alcohol etílico 96%. - Lavado durante 5 minutos en alcohol etílico 96%. - Lavado durante 5 minutos en alcohol etílico 100%. - Dos lavados de 5 minutos en xilol. - Montaje con Depex™ (Serva, Heidelberg, Alemania). - Observación al microscopio (40×; 100×). 3.3. Transmisión de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos Se estudió la liberación de ooquistes de C. parvum a partir de semillas vivas y muertas y su posterior captación por semillas de distinta especie. Para ello, se dispuso de 100 semillas de ostra (O. edulis) y 100 semillas de almeja (T. decussatus), que se mantuvieron independientemente en tanques de 60 litros bajo las condiciones descritas anteriormente. Muestras constituidas por 20 ejemplares de cada una de las especies se colocaron en dos acuarios de un litro con agua de mar natural y se contaminaron con 20×106 ooquistes purificados de C. parvum. Transcurridas 24 horas, 10 ejemplares de cada una de las especies se sacrificaron y se procesaron como se describe en el Apartado 3.1. Sobre los sedimentos resuspendidos en HBSS (Sigma-Aldrich Co.) se aplicaron las técnicas de detección de IFD (Monofluo® Kit Cryptosporidium, Sanofi Diagnostics Pasteur) y Resultados 89 1. RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN NATURAL 1.1. Detección y determinación de la viabilidad ooquística de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano Durante el período comprendido entre los meses de octubre de 2000 y septiembre de 2001, se investigó la presencia y viabilidad ooquística de Cryptosporidium spp. en 241 muestras de moluscos bivalvos destinados al consumo humano y suministradas por la UCM que además proporcionó los datos relativos al origen de las muestras, tiempo de duración del proceso de depuración a que habían sido sometidas y los datos microbiológicos de cada una de ellas expresados en NMP de CF por 100 g de carne y líquido intervalvar. Mediante la técnica de IFD (Monofluo® Kit Cryptosporidium, Sanofi Diagnostics Pasteur) y aplicando los criterios propuestos por Graczyk y col. (1998b), se observaron ooquistes de Cryptosporidium spp. en 83 muestras de las 241 analizadas, representando un 34,4% de contaminación. De las 83 muestras positivas, 44 (53,0%) contenían ooquistes potencialmente viables detectados utilizando la técnica de Campbell y col. (1992) modificada de acuerdo con Dowd y Pillai (1997). Teniendo en cuenta la especie de molusco analizada, el mayor porcentaje de contaminación se detectó en ostra (54,8%). En mejillón, almeja y berberecho, los porcentajes de contaminación fueron respectivamente del 32,7%; 29,4%; y 20,8%, respectivamente. El mayor porcentaje de viabilidad ooquística se obtuvo en muestras de almeja y berberecho (ambas con un 60%). En muestras de mejillón y ostra, la viabilidad ooquística fue del 51,4% y 47,8%, respectivamente (Tabla 9). Considerando el origen de las muestras, se detectó contaminación por ooquistes de Cryptosporidium spp. en 69 de las 203 muestras procedentes del litoral gallego (34,0% de contaminación y 49,3% de viabilidad ooquística); de las 38 muestras procedentes de otros países de la Unión Europea, 14 (36,8%) estaban contaminadas y el 71,4% (10 muestras) presentaban ooquistes potencialmente viables (Tabla 10). 90 Resultados Tabla 9. Contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos destinados al consumo humano. Núm. de muestras Molusco bivalvo Analizadas Contaminadas (%) Con ooquistes viables (%) Mejillón 107 35 (32,7) 18 (51,4) Almeja 68 20 (29,4) 12 (60,0) Ostra 42 23 (54,8) 11 (47,8) Berberecho 24 5 (20,8) 3 (60,0) En cuanto a las muestras procedentes del litoral gallego, se detectaron moluscos bivalvos contaminados en todas las zonas de muestreo con excepción de la Ría de Ortigueira, de la que se dispuso tan solo de dos muestras de almeja. En el resto de las rías se observó que al menos una muestra de cada una de las especies analizadas estaba contaminada con la excepción de una muestra de almeja procedente de la ría de A Coruña (Tabla 10). Tabla 10. Contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos procedentes de Galicia (España) y de otros países pertenecientes a la Unión Europea. Núm. de muestras Origen Analizadas Contaminadas (%) Con ooquistes viables (%) Muestras procedentes de las costas gallegas Ría de Ortigueira 2 0 (0) 0 (0) Ría de Ferrol 7 6 (85,7) 1 (16,7) Ría de Ares-Betanzos 3 2 (66,7) 1 (50,0) Ría de A Coruña 2 1 (50,0) 0 (0) Ría de Muros-Noia 10 6 (60,0) 4 (66,7) Ría de Arousa 148 39 (26,4) 20 (51,3) Ría de Pontevedra 21 10 (47,6) 6 (60,0) Ría de Vigo 10 5 (50,0) 2 (40,0) Total 203 69 (34,0) 30 (49,3) Muestras procedentes de otros países de la Unión Europea Italia 30 10 (33,3) 8 (80,0) Irlanda 2 2 (100) 0 (0) Portugal 1 0 (0) 0 (0) Reino Unido 5 2 (40,0) 2 (100) Total 38 14 (36,8) 10 (71,4) Resultados 91 Se comprobó una ausencia de correlación (χ2, P=0,20) entre las muestras contaminadas con ooquistes de Cryptosporidium spp. no depuradas y las sometidas a distintos tiempos de depuración (entre uno y más de 14 días). Así, de las 54 muestras no depuradas, 23 estaban contaminadas (42,6%) vs 60 (32,1%) de las 187 muestras sometidas al proceso de depuración. Independientemente del tiempo de depuración, los porcentajes de viabilidad ooquística estuvieron entorno al 50% en la mayoría de las muestras contaminadas. En la Tabla 11 0.se reflejan los distintos tiempos de depuración, expresados en días, al que habían sido sometidas las muestras analizadas, así como los porcentajes de contaminación y viabilidad ooquística detectados. Tabla 11. Tiempos de depuración y contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos destinados al consumo humano. Núm. de muestras Depuración (días) Analizadas Contaminadas (%) Con ooquistes viables (%) 0 (no depuradas) 54 23 (42,6) 12 (52,2) 1 25 6 (24,0) 3 (50,0) 2 44 13 (29,5) 10 (76,9) 3 35 11 (31,4) 5 (45,5) 4 29 8 (27,6) 4 (50,0) 5 18 6 (33,3) 3 (50,0) 6 13 6 (46,2) 3 (50,0) 7 8 3 (37,5) 0 (0) 8-14 13 6 (46,2) 3 (50,0) >14 2 1 (50,0) 1 (100) Tampoco se observó correlación (χ2, P=0,85) entre los niveles de contaminación microbiológica expresados como NMP de CF por 100 g de carne y líquido intervalvar y la contaminación por Cryptosporidium spp. detectados en los moluscos bivalvos analizados. De las 206 muestras pertenecientes a la categoría A, 71 (34,5%) estaban contaminadas, observándose ooquistes potencialmente viables en 39 (54,9%). En la categoría B, el 36,4% de las muestras presentaban contaminación, conteniendo ooquistes viables el 41,7%. En ninguna de las dos muestras clasificadas como categoría C se detectó contaminación (Tabla 12). 92 Resultados Tabla 12. Contaminación por Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos clasificadas de acuerdo con los estándares de la Unión Europea. Núm. de muestras Categoría microbiológicaa Analizadas Contaminadas (%) Con ooquistes viables (%) A (<300) 206 71 (34,5) 39 (54,9) B (300-6000) 33 12 (36,4) 5 (41,7) C (>6000) 2 0 (0) 0 (0) aNMP de CF/100g de carne y líquido intervalvar Al relacionar los porcentajes de contaminación por Cryptosporidium spp. obtenidos en los moluscos bivalvos con los meses del año en los que se realizaron los muestreos, se observó que los valores más bajos de contaminación correspondieron a las muestras analizadas en los meses de mayo, junio y julio (5,0%; 12,5%; y 14,3%, respectivamente), alcanzándose los valores más elevados de contaminación en los meses de marzo, diciembre y noviembre (56,5%; 52,4%; y 50,0%, respectivamente). La viabilidad ooquística detectada tuvo un patrón de comportamiento similar, con un máximo en marzo (92,3%) y fue nula en mayo (0,0%) (Figura 13). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 Ene Feb M ar Abr M ay Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic Meses Muestras (%) M uestras positivas M uestras con ooquistes viables Figura 13. Evolución anual de la contaminación por Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos destinados al consumo humano. Resultados 93 1.2. Determinación de los niveles de detección de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos mediante las técnicas de IFD y PCR 1.2.1. Evaluación de la técnica de IFD Aplicando el diseño experimental mostrado en la Figura 8, se realizaron tres ensayos en los que se analizaron por triplicado y mediante IFD (Merifluor® Cryptosporidium/Giardia, Meridian Bioscience Inc.) alícuotas de 20 µl del sedimento obtenido de muestras de mejillón M. galloprovincialis contaminadas experimentalmente con un número teórico de 0; 1; 5; 10; 50; y 100 ooquistes purificados de C. parvum. En la Tabla 13 se muestran los promedios del número de ooquistes cuantificado por triplicado en cada uno de los tres ensayos realizados y los porcentajes de recuperación ooquística calculados con respecto al número teórico de ooquistes contaminantes. Se observa que para las dosis teóricas de 1; 5; 10; 50; y 100 ooquistes, los valores medios obtenidos fueron de 0,7; 3,6; 6,7; 37,6; y 77,2 ooquistes, respectivamente. Los porcentajes de recuperación ooquística oscilaron entre un 67,0% para la dosis teórica de 10 ooquistes y un 77,2% para la correspondiente a 100 ooquistes teóricos. Excepto para la dosis teórica de un ooquiste, que se logró detectar en 3 de los 9 ensayos, para las restantes dosis al menos un ooquiste fue observado en la totalidad del los ensayos. En ninguno de los ensayos realizados con sedimentos no contaminados se detectaron ooquistes de C. parvum. Tabla 13. Resultados de la técnica de IFD aplicada sobre sedimentos de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados con ooquistes purificados de C. parvum. Núm. teórico de ooquistes Ensayo 100 50 10 5 1 Primer ensayo 69,7* 32,7 6,3 3,0 0,3 Segundo ensayo 95,7 50,3 8,7 4,0 1,7 Tercer ensayo 66,3 29,7 5,0 3,7 0,0 Promedio 77,2 37,6 6,7 3,6 0,7 Porcentaje de recuperación 77,2 75,1 67,0 71,1 70,0 *Promedio de ooquistes determinados en los tres replicados de cada ensayo 94 Resultados 1.2.2. Evaluación de la técnica de PCR El análisis mediante PCR de diluciones del ADN procedente de una suspensión de 105 ooquistes purificados de C. parvum en soluciones de ADN extraído de los moluscos, permitió confirmar la ausencia de inhibición al comprobarse la no existencia de diferencias tanto en la presencia como en la intensidad de las bandas visualizadas mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2% (p/v) conteniendo 0,5 µg/ml de bromuro de etidio con respecto a las diluciones control realizadas con ADN del parásito en agua (Tabla 14; Figura 14). Tabla 14. Investigación de la existencia de inhibidores de la técnica de PCR en la detección de C. parvum en mejillones (M. galloprovincialis). Dilución del ADN de C. parvum Sin diluir 1:5 1:10 1:50 1:100 1:500 1:1000 Control (en agua) + + + + + - - ADN M. galloprovincialis - + + + + - - (+), amplificación positiva; (-), no amplificación Figura 14. Geles de agarosa mostrando la ausencia de inhibición de la técnica de PCR en el ADN extraído de mejillones (M. galloprovincialis). A, dilución del ADN de C. parvum en agua. B, dilución del ADN de C. parvum en el ADN extraído de sedimentos obtenidos de mejillón M. galloprovincialis. Líneas 1-6, diluciones 1:5; 1:10; 1:50; 1:100; 1:500; y 1:1000, respectivamente; línea 7, marcadores de peso molecular de 100 a 1000 pb. Resultados 95 Aplicando el diseño experimental mostrado en la Figura 9, se realizó la técnica de PCR con el ADN extraído de suspensiones obtenidas a partir de sedimentos de mejillones M. galloprovincialis contaminados con 0; 10; 50; 100; y 1000 ooquistes purificados de C. parvum. Cada muestra se amplificó 10 veces y, considerando los volúmenes utilizados, el cálculo se estableció para un número teórico de 0; 1; 2; 4; y 40 ooquistes para las respectivas dosis contaminantes. Se observó una reducción de la reproducibilidad de la técnica de PCR a medida que el número teórico de ooquistes disminuyó. Así, para 40 ooquistes teóricos, el ADN correspondiente se amplificó en el 90% de las reacciones, mientras que en el caso de un ooquiste teórico solamente se consiguió amplificar el ADN en el 10% de las reacciones (Figura 15). Figura 15. Resultados obtenidos mediante la técnica de PCR aplicada a sedimentos de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados con ooquistes purificados de C. parvum. A, 40 ooquistes teóricos. B, 4 ooquistes teóricos. C, 2 ooquistes teóricos. D, un ooquiste teórico. Línea 1, marcadores de peso molecular de 100 a 1000 pb; líneas 2-10, distintos replicados para cada una de las dosis contaminantes; línea 11, control positivo; línea 12, control negativo. 500 p b 500 p b 500 p b 500 p b 96 Resultados 1.3. Caracterización molecular de Cryptosporidium spp. en distintas especies de moluscos bivalvos destinadas al consumo humano De las 241 muestras de distintas especies de moluscos bivalvos examinadas mediante IFD y cuyos resultados se muestran en el Apartado 1.1., se seleccionaron al azar 49 (22 de mejillón, 18 de almeja y 9 de ostra). Además, se analizaron 20 muestras de mejillón (18 de M. galloprovincialis y dos de P. canaliculus) y 18 de berberecho (C. edule) disponibles en el Food Safety Microbiology Laboratory (Centre for Infections, Health Protection Agency, Reino Unido), centro donde se realizó el estudio, y que habían sido procesadas con fines bacteriológicos. Sobre todas las muestras se aplicó la técnica de PCR descrita anteriormente en el Apartado 2.3.2. de Material y Métodos. Mediante IFD, se detectaron ooquistes de Cryptosporidium spp. en 28 de las muestras naturalmente contaminadas procedentes de España (56%), amplificándose el ADN cryptosporidial en 22 de las mismas (44%). En las 38 muestras procedentes del Reino Unido, de las que no se dispuso de resultados de IFD, se amplificó el ADN cryptosporidial en 4 muestras (11%), correspondiendo 3 muestras a mejillón y una a berberecho (Tabla 15). Tabla 15. Detección de Cryptosporidium spp. en muestras de moluscos bivalvos mediante las técnicas de IFD y PCR. Especie (n) IFD positivas PCR positivas Muestras de España Mejillón (22) 12 8 Almeja (18) 10 9 Ostra (9) 6 5 Total (49) 28 (56%) 22(44%) Muestras del Reino Unido Mejillón (20) ND 3 Berberecho (18) ND 1 Total (38) ND 4 (11%) ND: No determinado La relación existente entre los resultados obtenidos mediante las técnicas de IFD y PCR en las muestras procedentes de España se refleja en la Tabla 16. Se comprobó una asociación significativa entre los resultados obtenidos por ambas técnicas (Test Exacto de Fisher, P=0,019). Resultados 97 Tabla 16. Relación entre los resultados obtenidos mediante las técnicas de IFD y PCR en la detección de Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos. Resultados de PCR Resultados de IFD Muestras positivas Muestras negativas Total Muestras positivas 17 11 28 Muestras negativas 5 16 21 Total 22 27 49 El análisis mediante RFLP permitió identificar C. parvum en 23 de las 26 muestras en las que se amplificó el fragmento del gen COWP; C. hominis en una muestra [M31 (=mejillón)] y en dos muestras [M23 (=almeja) y M25 (=ostra)] se observaron patrones electroforéticos indicativos de mezclas heterogéneas de especies/genotipos de Cryptosporidium (Figura 16). Los productos obtenidos mediante PCR de las muestras M23 y M25 se purificaron y posteriormente se clonaron como se describe en el Apartado 2.3.2. de Material y Métodos. Diez colonias blancas o ligeramente azuladas procedentes de la clonación de cada una de las muestras se incubaron a 95ºC durante 5 minutos y a continuación, se sometieron a la segunda etapa de la técnica de PCR empleando los cebadores PCOWPIF y PCOWPIR. Se comprobó la presencia del fragmento diana en 7 y 9 de las 10 colonias seleccionadas para las muestras M23 y M25, respectivamente. El análisis mediante RFLP confirmó la existencia de mezclas heterogéneas de especies/genotipos de Cryptosporidium: en 6 de las 7 colonias en las que se realizó con éxito la clonación del fragmento del gen COWP amplificado en la muestra M23, el análisis mediante PCR-RFLP de éste mostró patrones de electroforesis compatibles con C. parvum (M23A); el fragmento del gen COWP presente en la otra colonia 500 p b 100 p b Figura 16. Resultados de la técnica de RFLP aplicada a fragmentos del gen COWP amplificados a partir de moluscos bivalvos naturalmente contaminados. Líneas 1-8, marcadores de peso molecular; líneas 2, 3 y 7, C. parvum; líneas 4 y 5, mezclas heterogéneas de especies/genotipos de Cryptosporidium; línea 6, C. hominis. 104 Resultados De igual forma, se constató un comportamiento similar entre la contaminación parasitaria y la bacteriana detectada en la muestra biológica, estableciéndose una asociación estadísticamente significativa entre ambas sólo para el caso de Giardia spp. (χ2, P=0,008) (Tabla 21). Tabla 21. Contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. de muestras biológicas clasificadas de acuerdo con su calidad microbiológica. Núm. muestras contaminadas (%) Categoría microbiológica de la muestra (n) Cryptosporidium spp. Giardia spp. A (135) 27 (20,0) 53 (39,2) B (40) 11 (27,5) 17 (42,5) C (9) 4 (44,4) 7 (77,7) Se comprobó una asociación significativa (P<0,001) entre la existencia de ambos parásitos en los moluscos bivalvos analizados. En la Figura 20 se reflejan los porcentajes de contaminación detectados en las muestras biológicas para Cryptosporidium y Giardia, así como las precipitaciones recogidas en los meses del estudio. La contaminación por Giardia presenta una evolución similar a la de las precipitaciones registradas; en el caso de Cryptosporidium esta similitud no se produce en los dos primeros meses del muestreo. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 Ene Feb M ar Abr M ay Jun Mes Muestras positivas (%) 0 200 400 600 800 10 0 0 12 0 0 14 0 0 16 0 0 18 0 0 Precipitaciones (mm) Giardia Cryptosporidium Precipitaciones Figura 20. Evolución comparativa entre la contaminación por Cryptosporidium y Giardia en muestras biológicas y las precipitaciones registradas durante el período de estudio. Resultados 105 1.4.2. Identificación de especies/genotipos de Cryptosporidium Se intentó identificar la especie/genotipo de Cryptosporidium contaminante en 5 de las 7 muestras de aguas fluviales, 8 de las 16 muestras de aguas residuales depuradas y en 7 de las 11 aguas residuales brutas en las que previamente se identificaron y cuantificaron ooquistes de Cryptosporidium spp., además de en la totalidad de las muestras biológicas examinadas (184). Todas las muestras, independientemente de su origen, se sometieron al proceso de extracción del ADN descrito en el Apartado 1.3.2. de Material y Métodos, para su posterior empleo en las técnicas de caracterización molecular (Apartado 1.4. de Material y Métodos). No se logró amplificar el ADN cryptosporidial en ninguna de las muestras fluviales, a pesar de que aquéllas con una turbidez ≥1 UNF se sometieron a un tratamiento de clarificación mediante IMS (Aureon Biosystems Gmbh) previo a la extracción del ADN. De las 8 muestras de agua residual depurada, en 3 se obtuvieron resultados positivos mediante la técnica de PCR. La aplicación de las técnicas de RFLP y secuenciación del fragmento amplificado del gen COWP permitió identificar a C. muris como la especie contaminante en las 3 muestras (similitud del 100% con la secuencia de C. muris depositada en el GenBank bajo el núm. de acceso AF266264). En tan solo una de las 7 muestras de agua residual bruta se obtuvieron resultados exitosos, comprobando que el aislado previamente detectado por IFD correspondió a C. baileyi (similitud del 100% con la secuencia de C. baileyi depositada en el GenBank bajo el núm. de acceso AF266276) (Figura 21). Figura 21. Resultados de la técnica de RFLP aplicada a fragmentos del gen COWP amplificados a partir de muestras ambientales y biológicas. Líneas 1, 6 y 11, marcadores de peso molecular de 100 a 1000 pb; líneas 2, 4 y 5, C. muris procedente de aguas residuales depuradas; línea 3, C. baileyi procedente de agua residual bruta; líneas 7-10, C. parvum procedente de diversas muestras de mejillón; línea 12, control de C. hominis; línea 13, control de C. parvum. 106 Resultados Por lo que respecta a las 184 muestras biológicas, en 42 se detectó contaminación por Cryptosporidium spp. mediante la técnica de IFD. Sin embargo, tan solo se logró amplificar el ADN del parásito en 26 muestras, 14 de las cuales fueron también positivas por la técnica de IFD. C. parvum se identificó por RFLP y secuenciación en la totalidad de las muestras (Figura 21) (similitud del 100% con la secuencia de C. parvum depositada en el GenBank bajo el núm. de acceso AF266273). 2. RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN EXPERIMENTAL 2.1. Supervivencia de C. parvum en dos especies de moluscos bivalvos: O. edulis y T. decussatus Se contaminaron experimentalmente 120 semillas de ostra O. edulis y 120 semillas de almeja T. decussatus con ooquistes de un aislado de C. parvum cuya viabilidad fue del 97% determinada mediante la técnica de inclusión/exclusión de colorantes vitales fluorogénicos descrita por Campbell y col. (1992) (Apartado 1.2.1.). Las semillas se mantuvieron en tanques independientes durante los 31 días que duró el estudio. Entre los días 1 y 10 post-contaminación, se analizaron dos muestras constituidas por 10 semillas de ostra y almeja respectivamente, sobre cuyos sedimentos se aplicó una técnica de IFD para visualizar los ooquistes. La viabilidad se determinó mediante la inclusión/exclusión del colorante IP de acuerdo con Dowd y Pillai (1997). La evolución de la viabilidad de ooquistes de C. parvum en el interior de las semillas fue independiente de la especie de molusco contaminada. En ambos casos, se observó un fuerte descenso de la viabilidad ooquística durante los cuatro primeros días, alrededor del 70% (97% original vs 30% a los cuatro días post-contaminación). A partir del día cuatro y hasta el día 10 post-contaminación, la pérdida de la viabilidad ooquística fue progresiva, hasta alcanzar el último día del estudio valores del 12% y 18% para los ooquistes retenidos en semillas de almeja y ostra, respectivamente (Figura 22). La inoculación intragástrica de los sedimentos obtenidos de semillas de almeja y ostra el día 10 post-contaminación a dos camadas de ratones recién nacidos Swiss CD-1, reveló, mediante la aplicación de la técnica de IFD, que todos los animales inoculados estaban infectados a los siete días pi. De igual forma, se comprobó el mantenimiento de la infectividad ooquística a los 31 días post-contaminación. Así, 3 de los 5 animales inoculados con ooquistes recuperados de semillas de ostra y 4 de los 9 ratones inoculados con los recuperados de semillas de almeja estaban parasitados. Resultados 107 El análisis del agua de uno de los tanques donde se habían aclimatado los moluscos mostró, a las 24 horas, un descenso del 97,5% en el número de ooquistes en suspensión. De esta forma, la concentración de un litro de agua de mar por centrifugación (1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos) permitió cuantificar 0,025×106 ooquistes/l cuando la concentración inicial establecida fue de 1×106 ooquistes/l. 2.2. C. parvum en T. decussatus Mediante exámenes histológicos se estudió el tránsito de ooquistes de C. parvum a través de semillas de almeja T. decussatus. Las 60 semillas utilizadas se colocaron en un tanque con agua de mar natural contaminada con 20×106 ooquistes purificados de C. parvum y se mantuvieron bajo las condiciones descritas anteriormente durante los diez días que duró el ensayo. Transcurridas 24 horas, se sacrificaron 10 ejemplares y sobre el sedimento obtenido de la totalidad del cuerpo se aplicó la técnica de IFD (Monofluo® Kit Cryptosporidium, Sanofi Diagnostics Pasteur) para confirmar la captación y retención de las formas parasitarias. El análisis cuantitativo realizado demostró la existencia de un valor medio de 2,85×105 ooquistes/semilla, lo que supone una captación del 86% de los ooquistes añadidos (3,3×105 ooquistes/semilla). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 012345678910 Día post-contaminación Viabilidad ooquística (%) Ostra Almeja Figura 22. Evolución de la viabilidad ooquística de C. parvum en semillas de ostra (O. edulis) y almeja (T. decussatus). 108 Resultados Diariamente y hasta el final del ensayo, 5 ejemplares se procesaron histológicamente como se describe en el Apartado correspondiente. Se realizaron cortes de 3 µm de grosor a distintas alturas del cuerpo del molusco y, sobre las secciones obtenidas, se aplicaron las técnicas de tinción tricrómica de Wheatley (1951) y de IFD. La tinción tricrómica fue ineficaz en la detección de ooquistes en el tejido contaminado. Sin embargo, tuvo gran utilidad en la identificación de la región anatómica observada en los cortes histológicos y sobre cuyos equivalentes se detectaron ooquistes mediante la técnica de IFD. Se comprobó la presencia de formas parasitarias en diferentes tejidos: sifones, branquias, estómago, hepatopáncreas e intestino. El mayor número de ooquistes se detectó en el intestino: a las 24 horas post-contaminación se visualizaron más de 10 ooquistes por campo microscópico 40× y en varias ocasiones durante el experimento se observaron entre 5-10 ooquistes (días 2; 4; 6; 7; y 10 post-contaminación). Todos los días que duró el ensayo se hallaron ooquistes en esta localización anatómica (Tabla 22). Tabla 22. Localización de ooquistes de C. parvum en distintos tejidos de almejas (T. decussatus) experimentalmente contaminadas. Tiempo post-contaminación (días) Localización 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sifones - + - - + - - - - + Branquias - + + + + + + + - - Hepatopáncreas - + - - - - - + - - Estómago - - - + + + - - - - Intestino +++ ++ + ++ + ++ ++ + + ++ (−) = ningún ooquiste; (+) = <5 ooquistes; (++) = 5-10 ooquistes; (+++) = >10 ooquistes. Promedio del número de ooquistes por campo microscópico 40× determinado al observar tres cortes histológicos realizados a distintos niveles en cada uno de los cinco ejemplares procesados diariamente. En las branquias se observaron ooquistes consecutivamente desde el día 2 hasta el día 8 post-contaminación, aunque siempre en un número no superior a 5 ooquistes por campo microscópico 40×. En este tejido, los ooquistes se localizaron tanto en los espacios interfilamentares como en el mucus branquial (Tabla 22). En menor medida, los ooquistes de C. parvum contaminantes se detectaron en el estómago, en los sifones y en el hepatopáncreas. En ningún momento del estudio se observó, mediante las técnicas utilizadas, que las formas parasitarias fuesen internalizadas por células del molusco, manteniéndose los ooquistes libres o mezclados con los contenidos estomacal y/o intestinal, sin atravesar los epitelios branquial y/o gastrointestinal (Figuras 23-25). Resultados 109 Figura 23. Branquias de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. A, Tinción tricrómica modificada de Gomori (40×). B y C, técnica de IFD (40×). A B C 110 Resultados A B C D Figura 24. Estómago y hepatopáncreas de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. A, tinción tricrómica modificada de Gomori (20×). B y C, ooquistes en estómago (IFD, 40×). D, ooquiste en hepatopáncreas (IFD, 20×). Resultados 111 Figura 25. Intestino de semillas de almeja T. decussatus experimentalmente contaminadas con ooquistes de C. parvum. A, tinción tricrómica modificada de Gomori (20×). B, técnica de IFD (20×). C y D, técnica de IFD (40×). A B C D 112 Resultados 2.3. Transmisión de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos Aplicando el diseño experimental mostrado en la Figura 11, se evaluó la liberación de ooquistes de C. parvum a partir de semillas vivas y muertas y su posterior captación por semillas de distinta especie. Muestras constituidas por 20 ejemplares de cada una de las especies (O. edulis y T. decussatus) se colocaron en dos acuarios de un litro con agua de mar natural contaminada con 20×106 ooquistes purificados de C. parvum, cuya viabilidad fue del 98% detectada mediante la inclusión/exclusión de colorantes vitales fluorogénicos (Campbell y col., 1992). Transcurridas 24 horas, se analizaron los sedimentos obtenidos a partir de 10 ejemplares de cada una de las especies, detectándose la presencia de ooquistes mediante la técnica de IFD. Aplicando la técnica de inclusión/exclusión del colorante IP se comprobó un descenso de la viabilidad ooquística en ambas especies: 98% inicial vs 60%. Paralelamente y mediante centrifugación a 1250 × g, a 4ºC, durante 5 minutos, se concentró el volumen de agua de mar en el que se mantuvieron las semillas (2 litros), comprobando un descenso del 76-77% en el número de ooquistes de C. parvum en suspensión. El ensayo de transmisión de ooquistes de C. parvum entre especies coexistentes vivas demostró (Tabla 23): - Una disminución en el número de ooquistes retenidos por la especie de molusco receptora a medida que se prolonga el tiempo de contacto. - Una pérdida inicial de la viabilidad ooquística (60% en especie donante vs 18% en especie receptora a los cuatro días del inicio del estudio). - Un mantenimiento en la especie receptora de la viabilidad ooquística entorno al 20% hasta el final del ensayo (día 10 post-contaminación). Cuando se evaluó la transmisión de ooquistes de C. parvum entre semillas de ostra muertas a semillas de almeja receptoras, se observó (Tabla 23): - Una disminución en el número de ooquistes retenidos por la especie de molusco receptora hasta una ausencia de contaminación al final del ensayo (día 10 postcontaminación). - Aunque la viabilidad ooquística se mantuvo inicialmente entre un 16-17%, ninguno de los 4 ooquistes cuantificados el día 8 post-contaminación se mantenían viables. Resultados 113 Tabla 23. Transmisión experimental de ooquistes de C. parvum entre dos especies de moluscos bivalvos (O. edulis y T. decussatus). Almejas vivas -> Ostras Ostras muertas -> almejas Día post-contaminación Núm. ooquistesa Viabilidad (%) Núm. ooquistesa Viabilidad (%) 4 57 18,0 24 16,6 6 20 23,0 17 17,0 8 16 20,0 4 0,0 10 15 20,0 0 0,0 aNúmero de ooquistes cuantificados en 10 µl del sedimento obtenido a partir de 20 ejemplares de la semilla de molusco receptora. 2.4. ¿Es Cryptosporidium infectante después de cocinar los mejillones al vapor? Considerando que los mejillones al vapor representan un plato típico en algunos países, se evaluó experimentalmente si este método culinario inactiva las formas infectantes de C. parvum. Se comprobó mediante las técnicas de IFD y PCR la ausencia de contaminación natural por Cryptosporidium spp. en 8 ejemplares de mejillones vivos (M. galloprovincialis) procedentes de una bolsa debidamente envasada y etiquetada para el consumo humano. A continuación, 13 ejemplares se aclimataron en un tanque con agua de mar natural contaminada con 13×106 ooquistes purificados de C. parvum. Al cabo de 24 horas, tiempo durante el cual los mejillones son capaces de captar y retener las formas infectantes del parásito, como se demostró en los apartados anteriores de los estudios de contaminación experimental, los mejillones se colocaron en una olla metálica aplicando calor hasta la total apertura de las valvas (Figura 26). Inmediatamente después, se diseccionaron las branquias y tractos gastrointestinales y se sometieron a los procesos de homogenización y concentración difásica descritos anteriormente. Mediante la técnica de IFD se cuantificó el número de ooquistes existentes en el sedimento resuspendido en 3 ml de PBS 0,04M pH 7,2, siendo el valor obtenido de 2×104 ooquistes/ml. Alícuotas de 100 µl de esta suspensión se inocularon intragástricamente a 26 ratones Swiss CD-1 recién nacidos y la infectividad ooquística se evaluó a los 7 días pi, comprobándose que la mitad de estos animales estaban infectados con una intensidad de infección similar a la obtenida en la camada control (Tabla 24). 120 Discusión Como se ha comentado en el apartado correspondiente (Apartado 2.2. de la Revisión Bibliográfica), la digestión en los moluscos bivalvos puede ser extracelular, mediante enzimas digestivos liberados en el estómago, o bien intracelular por células digestivas existentes en el hepatopáncreas. Además, la presencia de hemocitos libres, tanto en el estómago como en el intestino, favorece la digestión intracelular de ciertas partículas alimenticias (Gosling, 2003). El notable descenso observado en la viabilidad ooquística durante los primeros días del estudio podría ser debido al efecto conjunto de ambos procesos. Estudios de microscopía electrónica revelaron que la pared ooquística de C. parvum presenta una estructura trilaminar. La capa externa es continua y de grosor uniforme, estando constituida básicamente por glucoproteínas. La capa central, aparentemente rígida, está formada por lípidos y posiblemente sea la responsable de las propiedades ácidoresistentes del ooquiste. La lámina interna está compuesta por glucoproteínas de estructura filamentosa (Bonin y col., 1991; Harris y Petry, 1999). En un estudio realizado por Harris y Petry (1999) se evaluó la acción de tres proteasas sobre la pared ooquística, comprobándose una progresiva eliminación de la capa interna filamentosa, fundamentalmente por la acción de la proteinasa K y en menor medida por la tripsina. La presencia en el estómago de los moluscos bivalvos de enzimas del tipo de las esterasas (importantes en la digestión lipídica); fosfatasas, tanto ácidas como alcalinas; y endopeptidasas, como la tripsina, podría justificar parcialmente esta pérdida de viabilidad (Gosling, 2003). Diversos estudios realizados in vitro e in vivo demostraron la fagocitosis de ooquistes de C. parvum por hemocitos de diferentes especies de moluscos bivalvos. Graczyk y col. (1997a) observaron, transcurridos 120 minutos de incubación, que un 81,6% de los ooquistes presentes en el medio fueron fagocitados por el 93,0% de los hemocitos de una almeja de agua dulce (C. fluminea). Estos autores también comprobaron la internalización de ooquistes marcados con anticuerpos monoclonales unidos a fluoresceína por parte de monocapas de hemocitos de la ostra C. virginica y observaron que se produce una pérdida de fluorescencia de la pared ooquística a medida que aumenta el tiempo de contacto, por lo que sugieren que ésta se desintegra con el paso del tiempo (Graczyk y col., 1997b). Sin embargo, Fayer y col. (1997a) y Graczyk y col. (1998a) demostraron que ooquistes retenidos en los hemocitos fueron infectantes para ratones neonatales BALB/c. En el estudio histológico planteado para dilucidar el tránsito de los ooquistes de C. parvum a través de semillas de almeja T. decussatus y realizado durante diez días Discusión 121 consecutivos, no observamos la internalización de las formas parasitarias por ningún tipo de células del molusco (la hemolinfa no se extrajo debido al pequeño tamaño de las semillas). Sin embargo, detectamos la presencia de ooquistes de C. parvum tanto en el mucus como en los espacios interfilamentares de las branquias. Esta ubicación, referida por diversos autores en diferentes especies de moluscos bivalvos (Fayer y col., 1997a; Graczyk y col., 1998a; Tamburrini y Pozio, 1999; Freire-Santos y col., 2001), podría justificar la existencia de un cierto número de ooquistes viables capaces de provocar la infección en ratones lactantes al cabo de 31 días de permanencia en el molusco. Considerando que el proceso de depuración consiste básicamente en la “limpieza” del tracto gastrointestinal de los moluscos bivalvos cuando se provoca la filtración de grandes volúmenes de agua de mar libre de microorganismos patógenos y así convertirlos en aptos para el consumo humano [BOE (núm. 86) de 10 de abril de 1999], la ineficacia de dicho proceso en la total eliminación de las formas infectantes de Cryptosporidium spp. es un resultado importante obtenido en nuestro estudio y previamente observado por FreireSantos y col. (2000a). De esta forma, comprobamos que 60 muestras de las 187 (32,1%) que habían sido sometidas a distintos tiempos de depuración presentaban ooquistes de Cryptosporidium spp. Habitualmente, las empresas depuradoras someten los moluscos bivalvos a este proceso durante al menos 48 horas, período que puede ser modificado bajo diversas circunstancias. Así, dispusimos de muestras que permanecieron en la planta desde tres días hasta más de 14 días consecutivos. Sin embargo, detectamos muestras contaminadas independientemente de los tiempos empleados en el proceso. La ineficacia del método de depuración utilizado puede ser debida a las posibles localizaciones extraintestinales del parásito descritas anteriormente en nuestro estudio experimental y por diversos autores (en el tejido branquial y en la hemolinfa). Observaciones similares fueron realizadas por Schwab y col. (1998), quienes demostraron la existencia del virus Norwalk en el músculo aductor y en la hemolinfa de diversas especies de ostras y almejas. Los autores comprobaron que tiempos de depuración de 48 horas fueron eficaces para la eliminación de bacterias (95% de reducción) pero insuficientes para disminuir los niveles del virus Norwalk (7% de reducción). De igual forma, Muniain-Mujika y col. (2002) sugieren, al evaluar la dinámica de la depuración vírica en moluscos bivalvos, que tratamientos de depuración superiores a cinco días pueden ser necesarios para garantizar la calidad sanitaria de estos moluscos. 122 Discusión Sin embargo, otros autores demostraron experimentalmente que los ooquistes de C. parvum captados por mejillones son liberados al medio en 48 horas, planteando la posibilidad de que tiempos de depuración iguales o superiores a 72 horas pueden ser suficientes para eliminar totalmente las formas parasitarias del interior de los moluscos (Gómez-Bautista y col., 2000). Recientemente y también de forma experimental, Ramos y col. (2005) comprobaron, en distintas especies de moluscos bivalvos, que el proceso de depuración durante 24 horas es eficaz. Los autores no observaron formas parasitarias en los moluscos pero sí en el agua de la depuradora. Por otra parte, el estudio histológico realizado demostró que los ooquistes de C. parvum se encuentran principalmente libres o mezclados con el contenido intestinal de las semillas de las especies experimentalmente contaminadas, pudiendo ser eliminados con las heces. En un estudio similar realizado con la almeja de agua dulce C. fluminea, Graczyk y col. (1998a) comprobaron, al aspirar las heces de los ejemplares del fondo del acuario, que el mayor número de ooquistes se eliminó los días 2 y 3 post-exposición. También, observaron que éstos se presentaban agrupados y siempre incluidos en las heces. En nuestro estudio no pudimos analizar el material fecal debido al pequeño tamaño de las semillas utilizadas (aproximadamente 7 veces inferior al de los ejemplares utilizados por los citados autores). Además de la presencia constante de ooquistes en el intestino durante el tiempo que duró el ensayo, observamos un incremento en el número de formas parasitarias los días 6 y 7 post-contaminación. Este hecho podría relacionarse con la estimulación del proceso de filtración ante un segundo aporte de nutrientes realizado el día cinco del estudio. La capacidad de filtración de una semilla de T. decussatus oscila entre 0,50-0,75 litros/hora, por lo que el agua del acuario en el que se mantuvieron (20 litros) pudo haber sido filtrada varias veces en 24 horas. Además, la capacidad de vaciado del contenido intestinal depende en gran medida de la disponibilidad de alimento, pudiendo ser de tan solo 12 minutos cuando éste es abundante (Albentosa Verdú, 1994). Estas particularidades fisiológicas justificarían las observaciones realizadas a nivel intestinal y que podrían ser consecuencia de repetidas contaminaciones. El último día del ensayo, los ooquistes, aunque emitieron una fluorescencia verde brillante, presentaron un aspecto colapsado, lo que podría ser indicativo de una pérdida de viabilidad atribuida a la repetida acción de los enzimas digestivos como sugieren Graczyk y col. (2003) para los quistes de Giardia sp. retenidos en moluscos bivalvos. Discusión 123 Estos resultados, presencia constante de ooquistes en el intestino, pueden relacionarse con los obtenidos en el estudio experimental de transmisión de ooquistes de C. parvum entre especies de moluscos bivalvos. Así, no sólo comprobamos la contaminación de especies libres del parásito al coexitir con otras experimentalmente contaminadas, sino también una evolución de la viabilidad ooquística en la especie receptora semejante a la obtenida en el estudio de supervivencia de ooquistes de C. parvum en moluscos bivalvos. Resultados similares fueron obtenidos cuando el estudio se realizó a partir de ejemplares muertos y previamente contaminados. Sin embargo, en este ensayo comprobamos una notable pérdida de la viabilidad ooquística en la especie receptora, e incluso no detectamos ooquistes el día ocho del estudio. En un trabajo previo, Freire Santos (2000) observa la existencia de un gran número de esporozoítos libres en ejemplares de almeja R. philippinarum experimentalmente contaminados y que murieron espontáneamente. El autor atribuye este hallazgo al brusco descenso del pH detectado durante la putrefacción del molusco, descenso que puede alterar la integridad de la pared ooquística, la cual actúa como barrera protectora de los esporozoítos. Los resultados de estos estudios experimentales demuestran la dispersión ambiental de las formas parasitarias por los moluscos bivalvos. La detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. en estos organismos después de haber sido sometidos a largos períodos de depuración, podría ser debido no sólo a la localización extraintestinal del parásito sino también a otras situaciones relacionadas con la propia planta depuradora. Como hemos comentado, los moluscos bivalvos que van a ser sometidos al proceso de depuración se colocan en bandejas para ser introducidos posteriormente en estanques que se llenarán con agua de mar generalmente clorada. Diversos autores comprobaron la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. en aguas costeras y la ineficacia de los tratamientos de cloración y ozonización del agua en la inactivación del parásito (Peeters y col., 1989; Korich y col., 1990; Johnson y col., 1995; Ferguson y col., 1996; Smith y Grimason, 2003). Ante estas observaciones, se plantea la posibilidad de que el agua marina utilizada para depurar puede ser responsable de la contaminación de los moluscos en la planta depuradora. Además, nuestros resultados experimentales sugieren la posibilidad de que también se produzca una contaminación de ciertos ejemplares a partir de otros ya contaminados. Así, en diferentes estudios realizados en estas instalaciones, se comprobó la importancia que tienen las dimensiones y la forma de los estanques, el tipo de suelo y la circulación del agua para evitar posteriores recontaminaciones bacterianas (Cuña Casasbellas, 1992a). También, la demostración experimental de que los moluscos muertos 124 Discusión pueden contribuir a diseminar la contaminación es un hecho a tener en cuenta, ya que durante el proceso de depuración existe un porcentaje de mortalidad variable. Un hallazgo obtenido en el presente estudio y que puede repercutir directamente en la salud pública es la ausencia de una correlación entre los niveles de contaminación microbiológica y la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. en las muestras analizadas. De acuerdo con la legislación vigente, los moluscos bivalvos pertenecientes a la categoría A (menos de 300 CF por 100 g de carne y líquido intervalvar en una prueba de NMP) pueden ser destinados directamente al consumo humano. En nuestro trabajo comprobamos que de las 206 muestras clasificadas microbiológicamente como pertenecientes a esta categoría, 71 (34,5%) estaban contaminadas, detectándose ooquistes viables en 39 (54,9%). Coincidiendo con Scott y col. (2002), quienes consideran que la eficacia de los indicadores tradicionales para predecir la contaminación fecal de origen humano y/o animal y el subsecuente riesgo para la salud pública es limitada, este resultado apoya la necesidad de incluir otros parámetros microbiológicos y/o parasitarios con el fin de garantizar la calidad sanitaria de los moluscos bivalvos. La realización del estudio epidemiológico durante tan solo un año, la diversidad en número y origen geográfico de las muestras y el hecho de que tan solo 54 de las 241 muestras analizadas procediesen directamente de la zona de cultivo (tiempo de depuración de 0 horas), son factores limitantes para valorar correctamente las posibles fluctuaciones estacionales de la contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos, por lo que los resultados deben ser juzgados prudentemente. De todas formas, comprobamos un mayor porcentaje de muestras contaminadas durante los meses de marzo, diciembre y noviembre, en los que se registraron abundantes lluvias que ocasionaron inundaciones en determinadas localidades. Diversos autores observaron una mayor incidencia de la infección humana y animal en épocas de lluvia y el comentado brote hídrico de Milwaukee se relacionó con las intensas precipitaciones que tuvieron lugar con anterioridad en la zona (Casemore, 1990; Clavel y col., 1996; Mac Kenzie y col., 1994). El número de muestras con ooquistes viables mantuvo un comportamiento similar, detectándose un máximo en marzo y un mínimo en mayo. Los elevados valores de viabilidad obtenidos en junio y julio no son significativos ante el escaso número de muestras contaminadas durante esos meses (2/16 y 3/21, respectivamente). Desde el punto de vista de la salud pública, la interpretación de los resultados obtenidos sería incompleta si no intentásemos identificar la especie/genotipo de Cryptosporidium contaminante de los moluscos bivalvos, ya que no todas las descritas Discusión 125 infectan al hombre. Las especies de Cryptosporidium parasitan a una gran variedad de animales vertebrados, principalmente a rumiantes domésticos, que durante la fase aguda de la infección eliminan al ambiente millones de formas de resistencia a través de sus heces. Además, en la mayoría de las ocasiones, los ooquistes de las distintas especies/genotipos no pueden ser diferenciados por su tamaño, forma e incluso características de tinción, siendo necesario recurrir a una metodología basada en la técnica de PCR para su identificación molecular (Xiao y col., 2004). Sin embargo, la aplicación de estas técnicas a muestras ambientales, clínicas y alimentarias puede presentar problemas ante la existencia de un gran número de sustancias potencialmente inhibidoras de la reacción (Wilson, 1997). Los moluscos bivalvos acumulan, a partir del agua que filtran, diversos agentes microbianos, compuestos orgánicos e inorgánicos, además de poseer una amplia variedad de enzimas, lípidos, polisacáridos, proteínas, etc. que han sido identificados como inhibidores de la técnica de PCR (Rossen y col., 1992; Wilson, 1997). En el presente estudio, siguiendo los protocolos de extracción del ADN y de la técnica de PCR descritos en el apartado correspondiente, comprobamos la ausencia de inhibición de la reacción con el ADN extraído de sedimentos obtenidos de moluscos y contaminados con ADN cryptosporidial. Paralelamente, al comparar mediante las técnicas de IFD y PCR los niveles de detección de ooquistes de C. parvum en sedimentos obtenidos a partir de mejillones (M. galloprovincialis) experimentalmente contaminados con diferente número de ooquistes, observamos que mediante ambas técnicas conseguimos detectar tan solo un ooquiste en el volumen analizado (20 µl y 5 µl, respectivamente). Para este número teórico, visualizamos ooquistes de C. parvum en 3 de los 9 ensayos y logramos amplificar el ADN correspondiente en una de las 10 réplicas realizadas. Los resultados obtenidos por la técnica de IFD en nuestro estudio fueron superiores a los hallados por Fayer y col. (2002), quienes detectan 1 ó 2 ooquistes en 200 µl de los lavados branquiales contaminados experimentalmente con un número teórico de 20 ooquistes de C. parvum. En un reciente estudio, Miller y col. (2005a) evaluaron diferentes métodos para detectar Cryptosporidium spp. en mejillones (M. californianus) experimentalmente contaminados, concluyendo que el más sensible es el procedimiento de IFD convencional previa concentración de las muestras mediante inmunoseparación magnética. Cuando aplicamos la técnica de PCR a las 49 muestras seleccionadas al azar de las 241 previamente analizadas mediante la técnica de IFD, comprobamos una correlación positiva entre los resultados obtenidos por ambos procedimientos. De igual forma, Fayer y 126 Discusión col. (2003) concluyen que ninguno de los dos métodos puede ser considerado superior al otro en cuanto a su capacidad para detectar la contaminación por Cryptosporidium spp. en moluscos bivalvos. Sin embargo, observamos una discrepancia de resultados en 16 muestras. El mayor número de muestras positivas hallado tras la aplicación de la técnica de IFD (11 IFD+ vs 11 PCR-) puede ser debido a la adquisición del anticuerpo monoclonal por parte de ooquistes vacíos que fueron posteriormente confirmados mediante otros tipos de técnicas microscópicas. La posible existencia de reacciones cruzadas provocada por la presencia de microalgas y de diversos organismos patógenos de los moluscos bivalvos fue evaluada por Rodgers y col. (1995) y Graczyk y col. (1998b). Ante las observaciones realizadas, estos últimos autores propusieron unos criterios para confirmar la identificación ooquística, criterios utilizados en nuestro estudio y que fueron complementados con la utilización de colorantes vitales fluorogénicos y otras técnicas microscópicas. Un factor que puede afectar a los resultados obtenidos por ambas técnicas es la antigüedad de los ooquistes contaminantes. Diversos autores comprobaron que la salinidad y el tiempo afectan significativamente a la viabilidad ooquística (Freire-Santos y col., 1999, 2000) y en nuestro estudio comprobamos un brusco descenso de dicha viabilidad en moluscos contaminados experimentalmente. Además, en condiciones naturales los ooquistes están expuestos a una serie de factores que pueden alterar la composición antigénica de su pared, impidiendo la unión de los anticuerpos y por tanto su visualización mediante la técnica de IFD. Recientemente, en un interesante estudio, Graczyk y col. (2004) detectan ooquistes de C. parvum en mejillones cebra (D. polymorpha) combinando el método de IFD convencional con técnicas fluorescentes de hibridación in situ (FISH). Así, los autores pueden distinguir los ooquistes intactos (viables) de los ooquistes no viables (paredes ooquísticas) y de otros ooquistes no viables identificados por FISH pero no mediante IFD. Por otra parte, Sturbaum y col. (2002) y Miller y col. (2005a), cuando analizaron diversas muestras ambientales mediante la técnica de PCR, comprobaron la existencia de reacciones cruzadas con el ADN de ciertos dinoflagelados e invertebrados, sugiriendo que estos resultados positivos deben ser confirmados posteriormente mediante técnicas de secuenciación. En el presente estudio, todas las muestras positivas obtenidas mediante la técnica de PCR fueron posteriormente secuenciadas, confirmando la contaminación por especies pertenecientes al género Cryptosporidium. Debido a que los moluscos bivalvos pueden estar contaminados con mezclas heterogéneas de especies/genotipos de Cryptosporidium, el análisis molecular de estas muestras presenta a menudo ciertas dificultades (Reed y col., 2002). La técnica de RFLP es Discusión 127 de gran valor para analizar muestras en las que la diversidad genética es relativamente baja (McLauchlin y col., 2000). Sin embargo, en muestras ambientales, la secuenciación del ADN es esencial para confirmar los resultados hallados mediante la técnica de RFLP ante la posibilidad de una mayor diversidad genética. Utilizando esta metodología, en dos muestras observamos patrones electroforéticos indicativos de la existencia de mezclas heterogéneas de especies/genotipos de Cryptosporidium, que necesitaron, para ser resueltas, un proceso posterior de clonación de los fragmentos de ADN amplificados. La combinación de las técnicas de RFLP, clonación y secuenciación del ADN nos permitió confirmar, en la totalidad de las muestras, la existencia de dos especies de Cryptosporidium, C. parvum y C. hominis, actualmente consideradas responsables de la mayoría de las infecciones humanas (Cacciò y col., 2005). Estos hallazgos sugieren que los moluscos bivalvos representan una potencial fuente de infección humana, especialmente cuando se consumen crudos o poco cocinados. Por otra parte, la identificación de ciertas secuencias nucleotídicas no coincidentes con las depositadas en el GenBank podría ser indicativa, entre otras posibilidades, de la existencia de hospedadores reservorios actualmente no descritos. La presencia de formas infectantes de protozoos enteropatógenos humanos en los moluscos bivalvos está estrechamente relacionada con la contaminación microbiológica de las áreas de cultivo, situadas habitualmente en zonas intermareales o próximas a la costa. En Galicia, estas zonas de cultivo se encuentran localizadas en las rías, antiguos valles fluviales que reciben el aporte de aguas dulces procedentes de ríos que en su recorrido atraviesan núcleos urbanos y zonas ganaderas. El estudio realizado en muestras ambientales y biológicas recogidas en las Rías Baixas, importantes zonas de producción de moluscos bivalvos, reveló un alto grado de contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. La utilización del método 1623 recomendado por la USEPA para la detección de ambos enteroparásitos en muestras hídricas (USEPA, 2001), permitió demostrar la contaminación por Cryptosporidium spp. y Giardia spp. en 5 (71,5%) y en 6 (85,7%) muestras respectivamente, de los 7 ríos principales que desembocan en los estuarios analizados. Observamos además, que los niveles de contaminación por Giardia spp. fueron superiores a los obtenidos para Cryptosporidium spp. (1,0-29,3 quistes/l vs 1,0-17,0 ooquistes/l). Numerosos trabajos epidemiológicos, realizados como consecuencia de los brotes hídricos ocasionados por Cryptosporidium y Giardia, demostraron una amplia distribución de ambos parásitos en aguas superficiales (LeChevallier y col., 1991; Roach y col., 1993; Ong 128 Discusión y col., 1996; Ono y col., 2001; Lemarchand y Lebaron, 2003; Hörman y col., 2004a). Sin embargo, es difícil establecer comparaciones válidas entre los porcentajes e intensidades de contaminación debido a las distintas metodologías empleadas (Clancy y col., 1994), a los factores propios de las diferentes zonas geográficas analizadas (Hansen y Ongerth, 1991) y a los diversos períodos del año durante los que se realizaron los estudios (Rose y col., 1991). Por otra parte, la importante contribución de los animales domésticos y salvajes a la contaminación ambiental por formas infectantes de ambos patógenos está ampliamente reconocida (Fayer, 2004; Fayer y col., 2004; Appellbee y col., 2005). En Galicia, destaca por su importancia el sector ganadero bovino destinado a la producción lechera y cárnica. En un interesante estudio, realizado por Castro Hermida (2002), se demostró que la cryptosporidiosis neonatal bovina es endémica en esta región y recientemente se comprobó una alta prevalencia e intensidad de parasitación por Cryptosporidium spp. y Giardia duodenalis en rumiantes domésticos (ganaderías bovina, ovina y caprina) (Castro-Hermida y col. 2005, 2005a). Los abundantes residuos generados en las granjas son frecuentemente utilizados y/o eliminados sin tratamiento previo, constituyendo la principal fuente de contaminación ambiental. La elevada pluviosidad característica de esta región asociada a ciertas prácticas ganaderas facilitan el arrastre de las formas infectantes de estos parásitos a cauces de agua. Además, al ser Cryptosporidium y Giardia parásitos ubicuos que infectan a una amplia variedad de hospedadores vertebrados, ciertos animales salvajes pueden actuar como reservorios de la infección (Zhou y col., 2004; Appelbee y col., 2005; Cacciò y col., 2005). En nuestro laboratorio, al analizar muestras fecales de nutria (Lutra lutra) recogidas en 161 puntos de la geografía gallega, comprobamos que este animal, que desarrolla sus actividades vitales en las proximidades de cursos de agua, también está parasitado por Cryptosporidium y Giardia (Méndez-Hermida y col., 2005a). La contaminación de origen parasitario detectada en los ríos es una de las razones por las que Cryptosporidium y Giardia pueden ser identificados en los moluscos bivalvos. Considerando que estas aguas son utilizadas habitualmente para abastecer de agua potable a la población y ciertas características de las formas infectantes de estos protozoos (capacidad para soportar distintas presiones ambientales, resistencia a los desinfectantes empleados y pequeño tamaño), además de las bajas dosis infectantes, los resultados obtenidos ponen de manifiesto el riesgo de potenciales brotes hídricos en la población. Como se demostró varios años después del brote hídrico de cryptosporidiosis ocurrido en Milwaukee (Peng y col., 1997), no se puede obviar la contaminación ambiental Discusión 129 de origen humano. En la actualidad y a nivel mundial, hay un notable descenso en las reservas de agua dulce debido al incremento del consumo humano y a la disminución de las precipitaciones registradas en algunas regiones (Karl y col., 1995). Consecuentemente, en los países industrializados es cada vez más frecuente el uso, con fines industriales, agrícolas e incluso domésticos, de aguas residuales depuradas como fuente alternativa de aguas no potables. Para ello, las aguas deben presentar unos niveles bajos de contaminación química y/o microbiológica, de forma que no supongan un problema de salud pública (Asano y Cotruvo, 2004). A este respecto, sólo en algunos estados de los Estados Unidos, Australia, Canadá y Reino Unido existe una reglamentación sobre la presencia de Cryptosporidium y Giardia en aguas recreacionales y de bebida. Con excepción del Reino Unido, en la Unión Europea no existe ninguna legislación que regule la existencia de ambos parásitos tanto en aguas naturales como reutilizables, a pesar de la existencia de numerosos estudios que evidencian la importancia de considerar su presencia en aguas naturales (Rose, 1997; Cacciò y col., 2003; Asano y Cotruvo, 2004). Otro motivo por el cual es posible detectar Cryptosporidium y Giardia en moluscos bivalvos es el vertido de aguas residuales brutas o depuradas a zonas de cultivo, que en nuestra área de estudio se encuentran rodeadas de importantes núcleos de población y de interés turístico. Cuando analizamos los efluentes finales de 16 plantas depuradoras de aguas residuales ubicadas en los márgenes de las rías, detectamos ooquistes de Cryptosporidium en 8 (50,0%) y quistes de Giardia en 14 (87,5%), con unas concentraciones que oscilaron entre 36,0-520,0 ooquistes/l y 7,0-2541,0 quistes/l, respectivamente. En dos recientes estudios, realizados en plantas depuradoras que utilizaban como tratamiento secundario los fangos activados y la sedimentación, se evaluó la eficacia de estos tratamientos en la retención de las formas infectantes de ambos parásitos (Cacciò y col., 2003; Montemayor y col., 2005). Los autores comprobaron la existencia de formas parasitarias en todos los efluentes secundarios a pesar de detectar unos porcentajes de retención comprendidos entre el 96,2-99,1% para ooquistes de Cryptosporidium y entre el 87,0-98,4% para quistes de Giardia. La mayoría de las EDAR analizadas en nuestro estudio utilizan los mismos sistemas de tratamiento, por lo que los porcentajes de retención serían similares. Además, en un estudio realizado en nuestro laboratorio, en el que se simularon las condiciones de una planta depuradora, se comprobó la capacidad de los fangos activados para retener entre un 80-84% de los ooquistes de Cryptosporidium contaminantes (Villacorta-Martínez de Maturana y col., 1992). Evidentemente, cuando se analizaron aguas residuales brutas procedentes de municipios carentes de EDAR o sometidas tan solo a un tratamiento primario, los niveles de