Efecto da radiación UV‐B e da combinación da temperatura e o CO2 sobre a ecofisioloxía dos organismos colonizadores do patrimonio cultural granítico

Universidade de Santiago de Compostela Escola Técnica Superior de Enxeñaría Máster Universitario en Enxeñaría Ambiental Efecto da radiación UV‐B e da combinación da temperatura e o CO2 sobre a ecofisioloxía dos organismos colonizadores do patrimonio cultural granítico. Diana Pérez Velón Santiago de Compostela, 2021 Índice Resumo ................................................................................................................................................... 1 1. Introdución ........................................................................................................................................ 2 1.1. Escenario futuro de cambio climático: variacións da temperatura, concentración atmosférica de CO2 e dos patróns de luz ultravioleta. ................................................................... 2 1.2. Cambio climático e conservación do Patrimonio Cultural..................................................... 4 1.3. Resposta dos biofilms subaéreos ás variacións ambientais. ................................................... 7 2. Obxectivo ......................................................................................................................................... 10 3. Material e métodos .......................................................................................................................... 11 3.1. Experimento temperatura-CO2 .............................................................................................. 11 3.1.1. Biofilm: cultivos iniciais e preparación do inóculo ............................................................ 11 3.1.1.1. Cepas utilizadas e condicións de cultivo ......................................................................... 11 3.1.1.2. Purificación de cultivos existentes ................................................................................... 12 3.1.1.3. Cuantificación da biomasa e da densidade óptica........................................................... 12 3.1.1.4. Preparación do cultivo mixto 1:1 .................................................................................... 14 3.1.2. Material lítico e preparación do experimento .................................................................... 14 3.1.2.1. Material lítico .................................................................................................................. 14 3.1.2.2 Montaxe do experimento ................................................................................................... 15 3.1.3. Monitorización do efecto das condicións ensaiadas nos cultivos ...................................... 16 3.1.3.1 Cuantificación do número de células de Synechocystis sp PCC 6803 e Bracteacoccus minor ............................................................................................................................................. 16 3.1.3.2. Fluorescencia clorofílica ................................................................................................. 16 3.1.3.3. Cuantificación da cor....................................................................................................... 17 3.1.3.4. Cuantificación do contido en pigmentos .......................................................................... 18 3.1.3.5. Cuantificación do contido de carbono inorgánico (CI) TOC-IC ..................................... 19 3.1.3.6. Cuantificación do osíxeno disolto .................................................................................... 20 3.1.3.7. Cuantifiación de elementos disoltos por espectroscopía de absorción atómica en chama ...................................................................................................................................................... 20 3.1.3.8. Cuantificación do pH ....................................................................................................... 21 3.1.4. Análise estadística ................................................................................................................. 21 3.2 Experimento UV-B .................................................................................................................... 22 3.2.1. Biofilm: cultivos iniciais e preparación do inóculo ............................................................ 22 3.2.1.1. Cepas utilizadas e condicións de cultivo ......................................................................... 22 3.2.1.2. Cuantificación do número de células de Bracteacoccus minor e Synechocystis sp PCC 6803 e preparación do cultivo mixto 1:1 ...................................................................................... 22 3.2.2. Preparación do experimento ................................................................................................ 22 3.2.3. Monitorización do efecto das condicións ensaiadas nos cultivos ...................................... 25 3.2.4. Análise estadística ................................................................................................................. 26 4. Resultados ........................................................................................................................................ 27 4.1. Experimento temperatura-CO2 .............................................................................................. 27 4.1.1. Cuantificación do número de células e variación da proporción de células de Synechocystis sp PCC 6803 e Bracteacoccus minor ...................................................................... 27 4.1.2. Fluorescencia clorofílica ....................................................................................................... 28 4.1.2 Cuantificación do cambio de cor .......................................................................................... 31 4.1.3. Cuantificación do contido en pigmentos ............................................................................. 34 4.1.4. Cuantificación do contido de carbono inorgánico (CI) TOC-IC ...................................... 37 4.1.5. Osíxeno disolto ...................................................................................................................... 37 4.1.6. Espectroscopía de absorción atómica en chama ................................................................ 38 4.1.7. Cuantificación do pH ............................................................................................................ 40 4.2 Experimento UV-B .................................................................................................................... 41 4.2.1. Variación da proporción de células de Synechocystis sp PCC 6803 e Bracteacoccus minor ................................................................................................................................................ 41 4.2.2. Fluorescencia clorofílica ....................................................................................................... 42 4.2.3. Cuantificación da variación da cor ...................................................................................... 45 4.2.4. Cuantificación do contido en pigmentos ............................................................................. 48 4.2.5. Microscopía confocal (CLSM) ............................................................................................. 51 5. Discusión .......................................................................................................................................... 53 5.1. Experimento CO2-Temperatura ............................................................................................. 53 5.2. Experimento UV-B ................................................................................................................... 58 6. Conclusións ...................................................................................................................................... 61 7. Bibliografía ...................................................................................................................................... 62 1 Resumo Un dos problemas máis importantes no campo da conservación do Patrimonio Cultural é a colonización dos sustratos por parte de biofilms. Estes biofilms, compostos en moitos casos por compendios de algas e cianobacterias, están en gran medida influenciados por cambios ambientais. Nun contexto de cambio climático como o actual é esencial entender cales son estes procesos e en que medida van a afectar aos organismos e, polo tanto, que consecuencias terá esto sobre o biodeterioro do patrimonio. Neste traballo fin de máster (TFM) estudouse o efecto do cambio climático, en termos de aumento de temperatura, CO2 e radiación UV-B, na ecofisioloxía dun biofilm composto por unha especie de cianobacteria, Synechocystis sp PCC 6803 e outra de alga verde, Bracteacoccus minor. Observouse que, de forma xeral, o aumento de calquera destes parámetros provocou un aumento no dominio das cianobacterias, que provocan un maior biodeterioro do substrato sobre o que viven, en comparación coas algas verdes. Concretamente, descubriuse que para os organismos estudados, un aumento da temperatura reduce o seu crecemento e eficiencia fotosintética, mentres que a nivel de substrato aumenta a disolución de elementos. Ante un aumento da temperatura, poderíase esperar un aumento da meteorización dos minerais, pero unha menor actividade deteriorante dos organismos. O efecto do CO2 observouse dependendo da temperatura e, a pesar do esperado, só produciu un lixeiro aumento da eficiencia fotosintética. Finalmente, o aumento da radiación UV-B tamén produciu un aumento na proporción de cianobacterias, así como un cambio de tamaño nas células de algas que sobreviviron. Isto, xunto cunha menor produción de EPS por parte das cianobacterias, parece indicar unha menor necesidade de protección contra o estrés luminoso e, polo tanto, menor dano pola radiación UV-B. Pódese concluír que as variacións destes parámetros con respecto aos niveis actuais afectarían tanto á fisioloxía das biopelículas como á súa capacidade para deteriorar o substrato. Isto implica un cambio na dirección do biodeterioro e, polo tanto, en como se deben afrontar as tarefas de conservación para evitar a desaparición do noso Patrimonio Cultural. 2 1. Introdución 1.1. Escenario futuro de cambio climático: variacións da temperatura, concentración atmosférica de CO2 e dos patróns de luz ultravioleta. As emisións antropoxénicas de gases de efecto invernadoiro (GEI) e, consecuentemente, as súas concentracións atmosféricas aumentaron drásticamente dende a Revolución Industrial, sendo o principal factor responsable do cambio climático na actualidade. Segundo o quinto informe do Panel Intergubernamental do Cambio Climático (IPCC), as concentracións atmosféricas de CO2, CH4 e N2O, os principais GEI, se atopan hoxe en día nas máximas históricas rexistradas, non habendo precedentes nos últimos 800.000 anos. Entre os anos 2000 e 2010, as emisións de GEI aumentaron máis que nas tres décadas anteriores (Fig.1) e en febreiro de 2015 as concentracións atmosféricas de CO2 alcanzaron 400,26 ppm. Os últimos datos rexistrados confirman as peores previsións, que a tendencia de aumento das emisións de GEI continúe a longo plazo (Leissner et al., 2015). Así, dependendo do desenvolvemento socioeconómico, demográfico e das políticas climáticas se espera unha ampla variabilidade de escenarios futuros de emisións antropoxénicas (IPCC, 2014). Fig. 1. Promedio global de concentracións de gases de efecto invernadoiro (GEI). Fonte: (IPCC, 2014) Unha das consecuencias máis evidentes da crecente concentración atmosférica de GEI é o aumento de temperatura, tendo aumentado xa 0,8ºC no último século. Múltiples evidencias 3 apuntan a unha relación liñal entre as emisións de CO2 acumuladas e os niveis de quecemento global. Na Fig. 2 móstrase a previsión de emisións de CO2 das diferentes traxectorias de concentración representativas (RCP) propostas polo quinto informe do IPCC, onde se representan diferentes escenarios de mitigación do cambio climático. As RCP situadas entre 6,0 e 8,5 corresponden a escenarios sen esforzos adicionais para limitar as emisións, mentres que as RCP 4,5 e 2,6 representan escenarios de mitigación con altas probabilidades de manter o quecemento global por baixo dos 2ºC. Fig. 2. Emisións de dióxido de carbono anuais (GtCO2/ano) nas traxectorias de concentración representativas (RCP) (liñas). Fonte: IPCC, 2014. Os modelos climáticos prevén aumentos de entre 0,6 e 4ºC na temperatura media global, aumento de temperatura e acidificación dos océanos así como aumento do nivel do mar, maior frecuencia e duración nos eventos climáticos extremos, variación nas concentracións de ozono estratosférico e cambios nos patróns de precipitación, nubosidade e polo tanto nos patróns de luz e radiadión ultravioleta (UV). Estudos previos consideran o papel do cambio climático no aumento e diminución das concentracións de ozono estratosférico e a súa relación cos niveis de radiación ultravioleta-B (UV-B 280-315 nm) na superficie terrestre (Bais et al., 2019). Non 4 obstante, outros estudos afirman que o cambio climático está contribuindo cada vez máis a cambios na duración da exposición á radiación UV-B en diferentes zonas do planeta, independentemente dos cambios no ozono estratosférico e relacionados con, por exemplo, alteracións na cobertura de nubes ou no crecemento vexetal debidas, a súa vez, ao cambio climático (Bornman et al., 2019; Cleland et al., 2007; Robinson et al., 2015). 1.2. Cambio climático e conservación do Patrimonio Cultural. As consecuencias do cambio climático (desertificación, chuvias torrenciais, aludes, inundacións) xa se están a experimentar e afectan tanto a organismos vivos como a obxectos expostos ao medio ambiente entre os que se atopan, e son causa de preocupación, os bens mobles e inmobles do Patrimonio Cultural (UNESCO, 2007). Dada a importancia que ten o noso Patrimonio Cultural como arquivo de saber e memoria, temos o deber de conservalo e transmitilo ás futuras xeracións e para iso é preciso ter en conta os anteriormente comentados cambios nas condicións ambientais e desenvolver medidas de adaptación e mitigación sostibles de protección do Patrimonio Cultural. Entre os ben do Patrimonio Cultural expostos aos factores climáticos e atmosféricos, a protección dos monumentos fronte o cambio climático, pola súa característica de bens inmobles que non poden ser protexidos da intemperie, supón un verdadeiro reto. Entre os axentes causantes de alteración dos materiais de construción dos monumentos, maioritariamente pedra natural, a colonización biolóxica debida a unha ampla variedade de organismos dende microorganismos ata mamíferos (Francis, 2011; Scheerer et al., 2009), pode verse modificada polas condicións cambiantes e o seu efecto pode verse exacerbado. A colonización biolóxica do Patrimonio Cultural ten xerado e sigue xerando controversia, por un lado é considerada unha molestia porque pode provocar biodeterioro nos materiais de construcción e ocultar elementos arquitectónicos e polo outro, de forma positiva, pode contribuir as súas calidades estéticas e tamén pode ter un papel bioprotector, por exemplo modificando o microclima das paredes 5 colonizadas (Viles et al., 2012). Existen relacións complexas entre os monumentos históricos e as comunidades bióticas que os colonizan que están fortemente influenciadas polas condicións ambientais predominantes. Por conseguinte, non só se deben considerar as variacións dos parámetros climáticos senón tamén os seus efectos sobre o metabolismo, crecemento e desenvolvemento dos organismos, ademais de posibles cambios na distribución e composición das comunidades bióticas e as repercusións destes cambios na conservación do substrato colonizado (Bornman et al., 2019; Fuentes & Prieto, 2021; Prieto et al. , 2020) Entre a ampla variedade de organismos colonizadores do Patrimonio Cultural, este traballo centrarase no desenvolvemento de biofilms e biofilms subaéreos (SAB) en material granítico. Defínese biofilm como un agregado organizado de microorganismos que viven dentro dunha matriz de produción de substancias poliméricas extracelulares (EPS) que se une a unha superficie biótica ou abiótica. A matriz de EPS é unha mestura polar altamente hidratada composta principalmente por polisacáridos, proteínas, lípidos e ácidos nucleicos (ARN e ADN extracelular (eDNA)) que contribúe á armazón da estrutura tridimensional dos biofilms, ademais ten un papel protector do propio biofilm fronte alteracións das condicións ambientais coma cambios de temperatura, presión atmosférica, pH e humidade relativa (Costerton, 2007; Flemming et al., 2010). O termo "biofilm subaéreo" (SAB) foi descrito para comunidades microbianas unidas por unha matriz de EPS que se desenvolven sobre superficies minerais sólidas expostas á atmosfera. Os SAB caracterízanse por un crecemento irregular que está dominado por asociacións de fungos, algas, cianobacterias e bacterias heterótrofas, estes biofilms son omnipresentes, autosuficientes, e cunha ampla distribución, xa que se atopan en edificios, en rochas nos desertos, en montañas e en todas as latitudes (Yin et al., 2019). A formación dun biofilm subaéreo pódese resumir en 5 pasos (Fig. 3): 1) Fixación: os microorganismos libres (células planctónicas) son adsorbidos reversiblemente a unha superficie mediante interaccións débiles 6 (como as forzas de van der Waals). 2) Colonización: os microorganismos únense á superficie mediante unha fixación química permanente, comeza a produción de EPS e división celular facilitando un temperán desenvolvemento vertical. 3) Desenvolvemento: proliferación e acumulación de células en multicapa que segregan e producen unha matriz de EPS. 4) Maduración: formación estable dunha comunidade tridimensional con canais de distribución de nutrientes e moléculas de sinalización, caracterizado por unha arquitectura específica, heteroxénea e con interacións sinérxicas. 5) Dispersión activa: debido a remodelación da matriz de EPS e a interaccións con factores intrínsecos e extrínsecos, algúns microorganismos deslíganse en cúmulos ou son separados, e posteriormente poden colonizar outras localizacións (Bos et al., 1999; Limoli et al., 2015; Sharahi et al., 2019). Fig. 3. Modelo de formación de biofilm microbiano en 5 etapas. Fonte: Yin et al., 2019. A actividade metabólica dos SAB céntrase na retención de auga, protexendo as células das condicións ambientais flutuantes e da radiación solar, así como prolongando a súa vida vexetativa. Os aerosois atmosféricos, gases e partículas propagadoras serven como fontes de nutrientes e inóculo para estas comunidades abertas. Son varios os traballos de investigación nos que se caracterizan os SAB colonizadores do patrimonio xa que este tipo de colonización se atopa en monumentos de todo o mundo (Joh & 13 someteu durante o experimento, sen necesidade de ter que cuantificar o peso seco de cada mostra cada vez que se precise medir biomasa. Extraéronse 10 alícuotas de cada cultivo e se diluiron secuencialmente con medio de cultivo BG11 de forma que non superaran o valor de 1 de DO750, para poder garantir unha medida lineal. Cada dilución, previamente centrifugada a 5000 rpm durante 1 minuto, mediuse por triplicado usando un espectrofotómetro UV-visible (Varian Cary 100), obtendo para cada mostra un valor de DO a 750 nm. Despois, filtráronse ao vacío 2 mL de cada dilución a través de filtros de nitrocelulosa de 0.45 µm previamente marcados, pesados e secados en estufa a 65ºC. Os filtros resultantes deste proceso volvéronse secar en estufa a 65ºC e pésaronse, obtendo así un valor de biomasa en peso seco (DW) resultado de restar o peso dos filtros con e sen biofilm filtrado. Obtívose así unha relación biomasa (peso seco)-densidade óptica a 750nm para cada cultivo (Fig. 5-6): Bracteacoccus minor: Biomasa DW (g L-1) = 0,9111 · DO750 + 0,2347 R2= 0.9191 Fig 5. Relación DO a 750 nm e biomasa en peso seco do cultivoda alga verde Bracteacoccus minor. 14 Synechocystis sp PCC 6803: Biomasa DW (g L-1) = 0,808· DO750 +0,294 R2= 0,9424 Fig 6. Relación a DO a 750 nm e biomasa en peso seco do cultivo da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803. 3.1.1.4. Preparación do cultivo mixto 1:1 Partindo da curva de calibración biomasa vs. DO750 calculada anteriormente, procedeuse a establecer a cantidade a tomar de cada cultivo purificado co obxectivo de acadar un cultivo mixto cunha relación 1:1 en biomasa. 3.1.2. Material lítico e preparación do experimento 3.1.2.1. Material lítico Para este experimento selecionouse un granito de dúas micas, adamelítico, con textura equigranular panalotriomórfica de gran medio. Está principalmente composto por cuarzo, feldespato K, plaxioclasas, biotita, moscovita e clorita, e coñécese comercialmente co nome de Silvestre. O material granítico fragmentouse ata obter grans de tamaño entre 0 e 5 mm, co obxectivo de aumentar a exposición da rocha ao medio e aos microorganismos, acelerando os posibles procesos de degradación e facilitando o acceso aos minerais. O granito fragmentado tamizouse y = 0,808x + 0,294 R² = 0,9424 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Biomasa (g L-1) DO (750 nm) Synechocystis sp PCC 6803 15 para asegurar unha distribución homoxénea dos tamaños de gran en todas as mostras separando o material en tres fraccións: de 2 a 5 mm, de 0,5 a 2 mm e <0,5 mm de diámetro. 3.1.2.2 Montaxe do experimento Dispuxéronse 24 tubos de ensaio de vidro, con 18 g de fragmentos graníticos de tamaño 5-2 mm, 2-0,5 mm e <0,5 mm en relación 1:1:1. Tras esterilizar os tubos co material lítico no seu interior en autoclave a 121ºC durante 15 min, engadiuse á metade dos tubos un volume de 5 mL de medio de cultivo BG11 e 50 mL de auga destilada e á outra metade engadiuse un volume de 5 mL de cultivo mixto (que inclúe o medio BG11) e 50 mL de auga destilada. Cada tubo conta ademais, cun tapón dúas veces perforado e un sistema de aireación mediante o que se suministra aire natural do exterior a través dunha bomba de aireación. O sistema funciona de modo que o aire entra por unha das perforacións dos tapóns dos tubos conectada ao sistema de aireación producindo burbuxeo e sae pola outra perforación. Os 24 tubos mantivéronse en cámara climática cunha iluminación de 1900 lux e un fotoperíodo luz/escuridade de 12:12 h. Do total de 24 tubos, usáronse 3 réplicas para cada conxunto de condicións aplicadas (con inóculo/sen inóculo, 20ºC/26ºC e altos niveis de CO2/niveis ambientais de CO2). A metade dos tubos, (6 inoculados + 6 sen inocular) mergulláronse nun recipiente transparente con auga e un quentador acuático que eleva a temperatura a 26ºC ±1. Os tubos restantes (6 inoculados + 6 sen inocular) quedaron expostos á temperatura de 20ºC ± 1 (fixada na cámara climática), polo que se estableceron dúas condicións de temperatura. Ademais, para cada temperatura a metade deles, (3 inoculados, 20ºC; 3 sen inocular, 20ºC; 3 inoculados, 26ºC; 3 sen inocular, 26ºC) foron sometidos a elevadas concentracións de CO2 mediante a conexión do seu sistema de aireación a unha bombona de CO2 e suministrouse un pulso diario do gas (9,6 L/semana). A aireación da outra metade dos tubos (3 inoculados, 20ºC; 3 sen inocular, 20ºC; 3inoculados, 26ºC; 3 sen inocular, 26ºC) consistiui únicamente no aire natural do exterior; desta forma 16 estábleceronse dúas condicións de concentración de CO2 (altos niveis de CO2 e niveis atmosféricos de CO2). Pódese ver un esquema da montaxe do experimento na Fig 7. Fig. 7. Esquema da montaxe do experimento. Móstrase a distribución e colocación das réplicas dos tubos de vidro na cámara climática (inoculados e non inoculados), así coma a temperatura á que están expostos (20ºC e 26ºC) e o tipo de exposición de CO2 (elevada e ambiental). 3.1.3. Monitorización do efecto das condicións ensaiadas nos cultivos 3.1.3.1 Cuantificación do número de células de Synechocystis sp PCC 6803 e Bracteacoccus minor Unha vez preparado o cultivo mixto, este foi observado ao microscopio óptico ca finalidade de de cuantificar o número de células de alga verde e de cianobacteria no inicio, na metade (día 45) e no final (día 90) do experimento seguindo o protocolo de Vega & Lobina, (2007) e empregando unha cámara de reconto ou hematocitómetro de 0.1 mm de profundidade con escala graduada de Neubauer. 3.1.3.2. Fluorescencia clorofílica As moléculas de pigmentos situadas nas antenas fotosintéticas dos organismos fotoautótrofos absorben a enerxía luminosa que se pode consumir por tres vías: utilizarse na fotosíntese, disiparse en forma de calor ou reemitirse en forma de fluorescencia clorofílica (Lichtenthaler, 17 1987). A partires da fluorescencia emitida pola clorofila tras un pulso de luz saturante pódese valorar o rendemento cuántico máximo do fotosistema II (PSII). O rendemento cuántico máximo obtense ca ratio Fv/Fm = (Fm-F0)/Fm, onde F0 e Fm defínense como a mínima e máxima fluorescencia, respectivamente, en mostras adaptadas á escuridade. A condición de adaptación a escuridade é necesaria para que o electroaceptor se oxide ao máximo e os centros de reacción do PSII se atopen abertos, esto proporciona o nivel de fluorescencia mínimo, F0. Trala aplicación dun pulso de luz saturante, o aceptor de electróns redúcese ao máximo, obtendo o nivel de fluorescencia máximo, Fm. A ratio Fv/Fm estima a fracción da enerxía luminosa absorbida que é utilizada na fotoquímica do PSII, estando correlacionada ca cantidade de carbono fixado por unidade de luz absorbida (Maxwell & Johnson, 2000; Roháček, 2002). A fluorescencia clorofílica mediuse por primeira vez o día 0 do experimento e consecutivamente cada 15 días con Phyto-PAM (Heinz Walz GmbH) equipado cunha unidade emisor-detector de fibra óptica Phyto-EDF, que permite a medición en superficies a través dunha varilla de plexiglás de 50 mm de largo e 4 mm de diámetro. Extraéronse 1,5 mL de cada tubo de vidro e pasáronse a tubos eppendorf de 2 mL debidamente etiquetados. As mostras permaneceron en escuridade durante 30 minutos previos ás medicións. Leváronse a cabo tres medicións por mostra, mergullando a sonda no tubo eppendorf, axitando a mostra entre cada medición. Phyto-PAM rexistra medidas a 665 nm que corresponde co pico de absorción da clorofila-a. 3.1.3.3. Cuantificación da cor Está demostrado que a cuantificación da cor é un método non destructivo confiable para monitorizar o desenvolvemento de biofilms en superficies rochosas (Prieto et al., 2002, 2004; Sanmartín, 2012). 18 De cada tubo de cultivo, tomáronse 1,5 mL que foron filtrados ao vacío a través de filtros de nitrocelulosa de 0.45 µm de maneira que os organismos quedaron depositados sobre o filtro. Sobre cada filtro realizáronse 5 medidas da cor empregándose un espectrofotómetro portátil (Konica Minolta CM-700D) con software CM-S100w (Spectra Magic TM NX) e baixo as seguintes condicións: iluminante D65, observador 2º e área obxectivo tipo SAV con 3 mm de diámetro. Os datos obtidos representáronse no espazo CIELAB ou CIE 1976 L* a* b*, onde cada color está definida por tres coordenadas cartesianas ou lineais L* a* b*, sendo L * a medida de luminosidade, que varía de 100 blanco absoluto a 0 negro absoluto, a* a medida que representa variacións cromáticas no eixo vermello-verde (vermello positivo, verde negativo) e b* unha medida que representa variacións cromáticas no eixo amarelo-azul (amarelo positivo, azul negativo). 3.1.3.4. Cuantificación do contido en pigmentos Determinouse o contido de clorofila a, clorofila b, scitonemina e carotenoides totais de todas as mostras sometidas ás diferentes condicións de temperatura e concentración de CO2. Ademais, tamén se determinou o índice de feofitinización (Phaeophytinization Quotient, PQ), calculado pola relación de absorbancias dos extractos en 435 e 415nm, que reflicte a degradación de clorofila a feopigmentos (Sanmartín et al., 2011). Os fitopigmentos foron extraídos, cada 15 días dende o día 0 do experimento incluído, con dimetilsulfóxido (DMSO), xa que presenta vantaxes fronte a outros disolventes como son a súa fácil manipulación, maior poder de extracción e estabilidade dos pigmentos ao manter as mostras no frigorífico (Prieto et al., 2004). Tomáronse alícuotas de 1,5 mL de cada tubo e filtráronse ao vacío con filtros de nitrocelulosa de 0.45 µm, a continuación resuspendéronse os filtros en 1,5 mL de DMSO durante 1 hora a 19 65ºC de temperatura con axitación (Bell & Sommerfeld, 1987). Ao rematar a dixestión con DMSO, as mostras centrifugáronse durante 10 minutos a 7000 g (Centric 150 Tehtnica), o sobrenadante foi medido a diferentes lonxitudes de onda usando un espectrofotómetro UVvisible (Varian Cary 100). O contido de clorofila a, clorofila b, scitonemina e carotenoides foi calculado mediante as seguintes ecuacións (Mushir & Fatma, 2012; Wellburn, 1994): Clorofila-a (Chla) = 12.47 · (Abs664-Abs750) - 3.62 · (Abs647-Abs750) Clorofila-b (Chlb) = 25.06 · (Abs647-Abs750) – 6.5 · (Abs664-Abs750) Scitonemina = 1.04 · Abs384 – 0.79 · Abs665.1 – 0.27 · Abs490 Carotenoides totais = (1000 · Abs480 – 1.29 · Chla – 53.78 · Chlb) / 220 3.1.3.5. Cuantificación do contido de carbono inorgánico (CI) TOC-IC O contido de carbono inorgánico (CI) foi cuantificado en todas as mostras. Os métodos de análise de TOC-IC (Carbono orgánico totalCarbono inorgánico) utilizan calor, O2, irradiación ultravioleta e oxidantes químicos. As mostras inxectáronse na cámara de reacción que contén H3PO4 ao 25% tras o que son sometidas a un proceso de quecemento onde se produce a combustión e se desprende CO2 e H2O. Polo tubo circula unha corrente de osíxeno que arrastra os gases emitidos na combustión ata dúas celdas de infravermello (IR) onde se analiza selectivamente o CO2. Cada 15 días dende o comezo do experimento, tomáronse alícuotas de 1,5 mL de cada tubo e filtráronse ao vacío con filtros de nitrocelulosa de 0.45 µm. O volume filtrado foi medido no analizador de carbono orgánico e inorgánico (SHIMADZU TOC5000A). 20 3.1.3.6. Cuantificación do osíxeno disolto O osíxeno disolto é un indicador importante e un factor limitante na eficiencia fotosintética e polo tanto, na fixación de CO2 (Björkman, 1966). Co obxectivo de determinar a concentración de osíxeno disolto nas mostras expostas ás diferentes condicións de temperaturas e CO2, tomáronse alícuotas de 1,5 mL de cada tubo de mostra e leváronse a cabo medicións con oxímetro (O2 microsensor 10 µm, Unisense) cada 15 días dende o comezo do experimento. 3.1.3.7. Cuantifiación de elementos disoltos por espectroscopía de absorción atómica en chama Co obxectivo de coñecer o o efectos das condicións ensaiadas na capacidade dos organismos para solubilizar e/ou tomar elementos dende o sustrato, neste caso granito, cuantificouse, ao final do experimento, o contido de Na+, K+, Ca2+ e Mg2+ disoltos en cada tubo mediante espectroscopía de absorción-emisión atómica. Para a análise tomáronse 20 mL de cada tubo de ensaio, filtrados previamente ao vacío con filtros de nitrocelulosa de 0.45 µm. e utilizouse un espectrómetro de absorción atómica de chama SpectrAA 220 FS (Mulgrave, Victoria, Australia) Modelo Varian con módulo secuencial rápido (FS-FAAS), equipado cun sistema convencional de nebulizador pneumático e cámara de nebulización. As lámpadas de cátodo oco de sodio, potasio, calcio e maganesio funcionaron baixo unha corrente de 5mA (Na+ e K+) e 10 mA (Ca2+ e Mg2+). As lonxitudes de onda utilizadas foron: para sodio (589,0 nm), potasio (766,5 nm), calcio (422,7 nm) e magnesio (285,2 nm). A composición da chama era acetileno (2,0 L min-1) e aire (13,5 L min-1) e a altura do queimador axustouse ao sodio e potasio, os elementos con menor sinal de absorbancia. O fluxo de aspiración do nebulizador mantívose entre 5,5 e 6,0 ml min-1. 21 3.1.3.8. Cuantificación do pH Co obxectivo de determinar o posible cambio no pH das mostras provocado polos efectos das condicións estudadas, leváronse a cabo medicións co medidor de pH de sobremesa Thermo Scientific™Orion™ Dual Star™ con doble canle o día do comezo do experimento e o día final. 3.1.4. Análise estadística Os datos foron sometidos a un ANOVA de dúas vías e unha proba post hoc de Tukey HSD, considerando os parámetros medidos como variables dependentes e a temperatura e concentración de CO2 como factores fixos. As análises estatísticas levarónse a cabo usando o software SPSS Statistics v23.0 (IBM) e as diferenzas consideráronse estatisticamente significativas a p ≤ 0,05. 22 3.2 Experimento UV-B 3.2.1. Biofilm: cultivos iniciais e preparación do inóculo 3.2.1.1. Cepas utilizadas e condicións de cultivo Para este experimento usáronse as mesmas dúas especies descritas no experimento anterior: a cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 (ATCC 27184) obtida a través do Pasteur Culture Collection (PCC) de París, e a alga Bracteacoccus minor (Schmidle ex Chodat) Petrová obtida por Vázquez-Nion et al., (2016) a partires dunha mostra representativa de biofilms subaéreos recollidos nas paredes de edificios monumentais no centro histórico da cidade de Santiago de Compostela, España, no ano 2012. Ambos microorganismos mantivéronse en medio de cultivo líquido BG11 (Rippka et al., 1979) con aireación, a temperatura constante de 23ºC e fotoperíodo de 12:12 h de luz/oscuridade (~20 μmol photon m-2 s-1). 3.2.1.2. Cuantificación do número de células de Bracteacoccus minor e Synechocystis sp PCC 6803 e preparación do cultivo mixto 1:1 Co obxectivo de acadar un cultivo mixto con relación 1:1 en número de células, procedeuse ao reconto celular de 1,5mL de cada monocultivo con microscopio óptico empregando a mesma metodoloxía que a descrita na sección 3.1.3.1 3.2.2. Preparación do experimento O cultivo mixto 1:1 da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e da alga Bracteacoccus minor foi inoculado en cabina de fluxo laminar sobre membranas de policarbonato (0,22 μm de poro, 25 mm de diámetro, Millipore) previamente esterilizadas baixo UV-C (Philips TUV F17T8) durante unha hora por cada cara. Inoculáronse 0.2 ml de cultivo mixto en fase exponencial por cada membrana. Estas foron colocadas en placas Petri (n: 16) con 25 ml de BG11 agarizado, esterilizado previamente en autoclave a 110°C durante 20 minutos. 29 A relación F0 470nm / F0 645nm é un indicador do dominio das algas verdes (valores altos) ou das cianobacterias (valores baixos) (Vázquez Nion, 2016) e se presenta na figura 12. As mostras mantidas a 20ºC presentan valores significativamente máis altos ata a metade do experimento que as mostras mantidas a 26ºC. A partires do día 45 os valores das mostras baixo calquera das condicións de temperatura e CO2 tenden a confluír, acadando valores semellantes aos do inicio do experimento. O rendemento cúantico máximo (Fv/Fm) indica a eficiencia da actividade fotosintética (Fig.13). Neste experimento, atopáronse diferencias neste parámetro entre as temperaturas e as diferentes exposicións a CO2 estudadas . Ata o día 45, os valores de eficiencia das mostras mantidas a 20ºC de temperatura son significativamente maiores que os das mostras mantidas a 26ºC. En ambas condicións de temperatura, os valores das mostras expostas a altos niveis de CO2 son máis altos que os das mostras sometidas a condicións ambientais de CO2. Fig.11. Valores de F0 do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de concentración de CO2 e temperatura a 665 nm. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de ukey HSD (valor p ≤ 0,05). 0 100 200 300 00 500 00 00 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 0 5 nm Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a ab bc c a a a a 30 Fig 12. Relación F0470nm / F0645nm do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de concentración de CO2 e temperatura. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). Fig.13. Rendemento cuántico máximo a 665 nm (Fv/Fm) do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de concentración de CO2 e temperatura. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de ukey HSD (valor p ≤ 0,05). 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0, 0 0, 5 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 0 0nm / 0 5nm Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a ab ab b a a a a 0,30 0,35 0, 0 0, 5 0,50 0,55 0, 0 0, 5 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 v/ m 5nm Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a ab b b a b bc c 31 4.1.2 Cuantificación do cambio de cor A cor dos cultivos é un indicador do seu nivel de desenvolvemento, senescencia e de estado fisiolóxico (Prieto & Silva, 2005; Prieto et al, 2004; Patricia Sanmartín, 2012). Variacións do parámetro L* indican variacións de luminosidade de maneira queas mostras con máis claridade teñen valores cercanos a 100 e as mostras máis escuras teñen valores cercanos ao 0. Os parámetros a* e b* mostran as variacións cromáticas nos eixos verde (negativos) - vermello (positivos), e azul (negativo) - amarelo (positivo), respectivamente. En xeral, ao longo do experimento os cultivos evolucionaron cara a seren máis luminosos, máis vermellos e máis amarelos con respecto ao día 0 do experimento (Fig.14). Fig. 14. Cor, segundo as coordenadas CIELAB, do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de concentración de CO2 e temperatura a día 0, 45 e 90 dende o comezo do experimento. 32 En canto ó parámetro L* (Figura 15), ata o día 45 varía significativamente en sentido contrario nas mostras sometidas a distintas temperaturas, cun aumento deste parámetro no caso de mostras mantidas a 26°C (fanse mais luminosas) e unha disminución no caso das mantidas a 20°C (oscurécense). O día 45 supón un punto de inflexión xa que a partires de aquí as mostas de ambas condicións de temperatura cambian de tendencia para amosar valores moi cercanos entre eles o día 90. No que ao parámetro a* se refire (Fig.16), obsérvase que as mostras de todos os tratamentos amosan unha variación cara o vermello. Ao final do experimento, as mostras mantidas a 20°C son significativamente mais vermellas que as mantidas a 26ºC. As variación do parámetro cromático b* móstrase na figura 17. Ao final do experimento todas as mostras variaron cara o amarelo. Obsérvase sen embargo que, de novo o día 45 parece marcar un cambio de tendencia de maneira que o incremento de b* vese revertido a partir dese día habendo ademais diferencias significativas nos valores obtidos cas distintas temperaturas. Co paso do tempo pódese observar unha lixeira diferenciación de tendencias entre os tratamentos de temperatura, mostrando unha cor máis amarela as mostras tratadas a 20ºC. A partires do día 60 de experimento os valores de todas as condicións tenden a diminuir. Estatísticamente existe variación de color asociada ao efecto do CO2 no día 45 nas mostras mantidas a 26°C e no día final do experimento nas mantidas a 20°C. 33 Fig 15. Valores do parámetro de color L* do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de temperatura e concentración de CO2. As letras sobre a gráfica (a,b,c,d) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). Fig 16. Valores do parámetro de color a* do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de temperatura e concentración de CO2. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). 50 55 0 5 0 5 0 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a b c d a b 25 20 15 10 5 0 5 10 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 a Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a ab b c a b 34 Fig 17. Valores do parámetro de color b* do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de temperatura e concentración de CO2. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). 4.1.3. Cuantificación do contido en pigmentos O contido en pigmentos dos organismos fotosintéticos é un indicador do estado fisiolóxico e do seu desenvolvemento. Baixo calquera das condición estudadas, o contido de Chl a reduciuse co paso do tempo con respecto ao inicio do experimento, sufrindo flutuacións ata o final do experimento, onde tódalas mostras acadaron valores semellantes (Fig.18a). O contido de clorofila b (Chl b) con respecto a clorofila a (Fig.18b) aumentou co paso do tempo para tódalas mostras e amosou diferencias significativas debidas a interacción dos factores temperatura e CO2. Obsérvase un aumento nos valores das mostras mantidas a 26ºC con e sen exposición a CO2 e das mostras mantidas a 20ºC sen exposición a CO2 ata o día 45; as mostras mantidas a 20ºC expostas a CO2 mostran unha diminución dos valores ata o día 30, a partires do cal aumentan ata o día 45. Dende o día 45, os valores das mostras de tódalas condicións de 20 25 30 35 0 5 50 55 D0 D15 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 b Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a b c c a ab b c 35 temperatura e de exposición a CO2 seguen a mesma tendencia chegando ata valores moi similares entre eles o día 90. O contido en carotenoides con respecto a clorofila a aumentou co paso do tempo para tódalas mostras. O día 30 e o día 60 os valores das mostras amosaron diferencias significativas en función da exposición a CO2, sen embargo, cara o final do experimento, os valores de todas as mostras tenderon cara o mesmo punto sen amosar diferencias entre condicións de temperatura ou CO2 (Fig.18c). O contido en scitonemina con respecto a clorofila a ao longo do experimento variou de forma similar para os valores das mostras sometidas a tódalas condicións de temperatura e exposición a CO2 (Fig.18d). A partires do día 75, tódolos valores experimentan un aumento notable diferenciándose por un lado as mostras mantidas a 20ºC expostas a CO2 e as mostras mantidas a 26ºC sen exposición de CO2, que alcanzaron valores similares, e polo outro as mostras mantidas a 20ºC sen exposición a CO2 e as mantidas a 26ºC expostas a CO2. Por último, o índice de feofitinización (PQ) (Fig.18e), que da información sobre a degradación da clorofila a de maneira que valores altos do índice indican niveis baixos de degradación da clorofila a, diminuiu en tódalas mostras co paso do tempo, o que sinala cara a un aumento na degradación de clorofila a. Durante todo o experimento as mostras mantidas a 20ºC mantiveron valores de PQ superiores con respecto as mostras mantidas a 26ºC o que indica unha maior degradación dos cultivos mantidos a 26°C. 36 Fig 18. Cantidade de clorofila a (a), clorofila b en relación á chlorofila a (b), carotenoides en relación á chlorofila a (c), scitonemina en relación á chlorofila a (d) e índice de feofitinización PQ (435nm/415nm) (e) do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de exposición a CO2 e temperatura. As letras sobre a gráfica (a,b) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de ukey HSD (valor p ≤ 0,05). 0,0 0,2 0, 0, 0, 1,0 1,2 1, 1, 1, 2,0 D0 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 Clorofila a (mg 1) Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC 0, 0,2 0,0 0,2 0, 0, 0, 1,0 1,2 1, D0 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 Chl b/Chla Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC 0,0 0,1 0,2 0,3 0, 0,5 0, 0, 0, 0, D0 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 Carotenoides/Chl a Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC 0,0 0,2 0, 0, 0, 1,0 1,2 D0 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 Scitonemina/ Chl a Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a a a b a a a a a a a a a 0, 0, 0, 0, 1,0 1,1 1,2 D0 D30 D 5 D 0 D 5 D 0 P ( 35nm/ 15nm) Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a b a 37 4.1.4. Cuantificación do contido de carbono inorgánico (CI) TOC-IC Na figura 19 móstranse os valores de CI disolto nos tubos de ensaio. As mostras non inoculadas non presentaron variacións no contido en CI disolto durante o experimento (valores non mostrados). Os valores de CI disolto das mostras inoculadas variou de forma similar en todos as mostras independientemente das condición de temperatura e concentración de CO2, mostrando un aumento ata o día 30 e diminuíndo ata o día 45, a partires do cal volven a aumentar para manterse constantes ata o final do experimento. Fig 19. Cantidade de carbono inorgánico disolto (ppm) no cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de exposición a CO2 e temperatura. 4.1.5. Osíxeno disolto A concentración de osíxeno disolto é indicador da actividade fotosintética. Na figura 20 mostrase a variación da concentración de osíxeno disolto (Δ O2 disolto) con respecto ao inicio do experimento. A concentración de osíxeno disolto diminuiu co paso do tempo en tódalas mostras independentemente da temperatura e a concentración de osíxeno ata o día 75, aumentando lixeiramente de cara o final do experimento. Non obstante, as mostras mantidas a 20ºC presentaron un incremento na cantidade de e osíxeno disolto os primeiros días do experimento pero igualarónse ao longo do tempo. 0 5 10 15 20 25 CO2 + 26ºC + IN CO2 2 ºC N CO2 + 20ºC+ IN CO2 20ºC N CI (ppm) Días dende a inoculación DIA0 DIA 15 DIA 30 DIA 45 DIA 60 DIA 75 DIA 90 38 Fig.20. Variación da concentración de osíxeno disolto (Δ O2 disolto) no cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor con respecto ao inicio do experimento baixo diferentes condicións de exposición a CO2 e temperatura. A letra sobre a gráfica (a) indica as diferencias estatísticamente significativas tralas probas nova e post hoc de ukey HSD (valor p ≤ 0,05). 4.1.6. Espectroscopía de absorción atómica en chama O contido de Ca+2, Mg+2, Na+ e K+ disolto é indicativo da meteorización do granito e ao mesmo tempo, por comparación, da incorporación deses elementos nos organismos vivos. Os valores dos ratios do contido en Ca+2, Mg+2, Na+ e K+ das mostras inoculadas fronte as non inoculadas represéntanse na figura 21. Valores por enriba de 1 implican unha maior proporción do elemento nas mostras inoculadas que nas non inoculadas, mentres que valores menores a 1 representan maior proporción do elemento nas mostras non inoculadas con respecto ás que sí están inoculadas. No presente experimento, en todolos casos a cantidade de elementos disoltos nas mostras inoculadas foi maior que nas mostras sin inocular polo que os orgnismos induciron alteración do sustrato. 300 250 200 150 100 50 0 50 100 150 015 30 5 0 5 0 ( O2disolto) Días dende a inoculación CO2 2 ºC CO2 2 ºC CO2 20ºC CO2 20ºC a a 45 cas mostras control, non expostas a luz UV-B, e os máis baixos as mostras expostas a radiación UV-B durante máis tempo. Fig.27. Rendemento cuántico efectivo (Fv’/ m’) a 665nm do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo 0,1,2 e h de exposición diarias a luz UV-B. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). 4.2.3. Cuantificación da variación da cor Na figura 28 móstrase a evolución dos parámetros da cor nas mostras sometidas ás distintas condicións de radiciación UV-B. En xeral, as mostras de todas as condicións de exposición a luz UV-B escureceron co tempo. Os valores de L* (Fig.28a) experimentaron unha tendencia similar nas mostras expostas a UV-B e nas mostras control diminuíndo ata o día 30, a partires do cal volven a aumentar pero sendo o valor de L* ao final do experimento menor que ao principio. As mostras expostas ás condicións de Irlanda (1hora/día) e de Galicia (2 horas/día) presentan valores menores, e moi parecidos entre eles, que os valores das mostras expostas ás condicións de Portugal (3 horas/día) e o control. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0, 0, 5 0,5 015 30 5 v / m 5 nm Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U bc c a b a a ab b 46 O parámetro a* (Fig.28b), aumentou en tódolos casos, volvéndose os organismos máis vermellos co paso do tempo. Hai variacións nos primeiros 15 día de experimento e a día 30 as mostras expostas ás condicións de luz UV-B de Irlanda, Galicia e Portugal tenden a valores máis negativos, o que significa que son máis verdes que no comezo do experimento, sen embargo a partires do día 30 os valores das mostras de tódalas condicións de luz UV-B aumentan de forma acusada para chegar ao día final do experimento a valores moi similares entre eles, e claramente menos verdes (máis vermellos) que no principio do experimento. En xeral os valores de b* (Fig.28c) das mostras de tódalas condicións de exposición a luz UVB tenderon a diminuír co paso do tempo. Durante os primeiros 15 días obsérvase un leve aumento, é dicir, un amarelecemento das mostras expostas as condicións de Portugal e control, e poucas variacións no resto dos casos con respecto ao día 0. A partires dese día, e ata o final do experimento, tódalas mostras tornaron cara unha cor menos amarela. As mostras sometidas ás condición de Galicia e Irlanda e as mostras control, sofreron un decaemento de b* moi acusado nos seguintes 15 días, mentres que as mostras sometidas as condicións de Portugal diminúiron os seus valores de forma menos abrupta. Ao final do experimento, tódolos supostos acadan valores moi semellantes, moi por debaixo dos de partida. 47 15 20 25 30 35 0 5 50 015 30 5 Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U a a ab b a a b b 5 ,5 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 015 30 5 a Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U d a a ab b a b c 48 Fig.28. Medida dos parámetros de color L*(a), a*(b) e b*(c) do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo 0,1,2 e h de exposición diarias a luz UV-B. As letras sobre a gráfica (a,b,c,d) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de Tukey HSD (valor p ≤ 0,05). 4.2.4. Cuantificación do contido en pigmentos Na figura 29 represéntanse as variacións no contido en pigmentos na mostra control e nas mostras sometidas ás distintas condición de radiación UV-B. O contido en pigmentos dos microorganismos que compoñen os biofilms é un indicador de desenvolvemento e senescencia. De modo xeral, o contido en cada un dos pigmentos estudados variou de igual maneira nas mostras sometidas a 1, 2 e 3 horas/día que no control, non obstante, as mostras sometidas a 3 horas/día tiveron O contido en clorofila a (Fig.29a) tendeu a aumentar co paso do tempo nas mostras de tódalas exposicións a luz UV-B. Os valores máis altos ao final do experimento corresponderon ás mostras expostas as condicións de Irlanda e Galicia, sendo moi similares entre elas, seguidos polas mostras expostas as condición de Portugal, e finalmente as mostras control. A variación 0 5 10 15 20 25 015 30 5 b Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U c c a a ab b b ab a 49 ao longo do tempo foi similar á que ocorreu na mostra control, desviándose desa tendencia unicamente a mostra exposta durante mais tempo a UV-B. Con respecto á relación da clorofila b ca clorofila a (Fig.29b), atopamos diferenzas entre as mostras según as horas de exposición a luz UV-B. Os valores das mostras expostas durante mais tempo (3h/día) tenderon a diminuir co paso do tempo mentres que os valores do resto das mostras tenderon a aumentar co paso do tempo, aumentando os valores das mostras do control de forma máis rápida e acusada. O contido de carotenoides totais con respecto á clorofila a (Fig.29c) diminui en tódalas mostras co paso do tempo, sen embargo esta diminución foi diferente en función das horas de luz UVB ás que foron expostas as diferentes mostras. A ratio de carotenoides frente a chla das mostras control diminuiu de forma moi acusada a partires do día 15, excepto no caso das mostras expostas por mais tempo (3 horas/día) a luz UV-B, sendo estas as que mostraron un maior contido en carotenoides ao final do experimento. Os valores do contido en scitonemina con respecto á clorofila a (Fig.29d) experimentan unha diminución acusada dende o comezo do experimento ata o día 15 nas mostras de tódalas condicións de luz UV-B. As mostras control e as expostas a 1 e 2 horas/día perderon totalmente a scitonemina, non obstante, os valores das mostras expostas por máis tempo presentaron un aumento ata o día 30 aínda que e volveu a diminuír cara o día final do experimento. O índice de feofitinización (PQ) (Fig.29e) aumentou para todas as mostras ata o día 15, a partires do cal produciuse unha baixada brusca dos valores das mostras control e as expostas a 1 e 2 horas/día, mentres que as mostras expostas a UV-B durante máis horas diarias presentaron unha diminución máis paulatina dos valores do índice. 50 Fig.29. Cantidade dos pigmentos clorofila a (a), clorofila b (b), carotenoides (c) e scitonemina (d) e PQ (435nm/415nm) (e) do cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo 0,1,2 e h de exposición diarias a luz UV-B. As letras sobre a gráfica (a,b,c) indican as diferencias estatísticamente significativas tralas probas Anova e post hoc de ukey HSD (valor p ≤ 0,05). 0, 0, 1 1,1 1,2 1,3 1, 1,5 1, 015 30 5 P ( 35nm/ 15nm) Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U a b c b b aa 0 0,02 0,0 0,0 0,0 0,1 0,12 0,1 0 15 30 5 Scitonemina/Chl a Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 15 30 5 Chl b/Chl a Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U 0 5 10 15 20 25 30 35 0 15 30 5 Chl a (mg 1) Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0, 0, 5 0 15 30 5 Carotenoides/ Chl a Días dende a inoculación CON RO R ND C POR U a ba b c a b a bb a c d d c b a a b c d bb b aa a ad c b a 51 4.2.5. Microscopía confocal (CLSM) Na figura 30 móstranse imaxes obtidas mediante CLSM dos biofilms expostos a 0 h (control), 1h (Irlanda), 2h (Galicia) e 3h (Portugal) de luz UV-B. A matriz proteica móstrase de cor verde, os carbohidratos en vermello, as células de algas verdes en azul e as de cianobacterias en rosa. As variacións nos biofilms entre 0 e 3 horas de exposición ao UV-B son evidentes, especialmente en relación ao número de células observadas, sendo maior na mostra control. Ademais, na mostra control obsérvase a presencia tanto de células de algas verdes coma de células de cianobacteria distribuídas de forma homoxénea pola superficie estudiada. A medida que as horas de exposición a UV-B aumentan, obsérvase unha diminución do número de algas fronte a unha dominancia das cianobacterias. Ademais, atopamos que a acumulación de horas de UV-B provoca un aumento do tamaño das células de algas verdes, que pese a ser menor en número, son máis grandes en tamaño (círculo vermello). Na mostra control obsérvase unha distribución filamentosa tanto dos carbohidratos coma das proteínas. A medida que aumentan as horas de exposición a UV-B, apréciase unha tendencia á diminución das proteínas fronte a un aumento relativo da presencia de carbohidratos. Obsérvase tamén que o desenvolvemento dos carbohidratos, e especialmente das proteínas, está máis asociado ás algas verdes que ás cianobacterias. Neste sentido, parece que a diminución das proteínas nas mostras expostas por mais tempo, vai ligada a un decremento do número de células de algas verdes. 52 Fig.30. Imaxe por microscopía de barrido láser confocal (CLSM) da biopelícula desenvolvida na superficie das membranas inoculadas con un cultivo mixto da cianobacteria Synechocystis sp PCC 6803 e a alga Bracteacoccus minor baixo diferentes condicións de exposición a luz UV-B. A: a cor verde indica as proteínas tinguidos con FTIC e a vermella os hidratos de carbono tinguidos con ConA-TMR. B: a cor azul é a autofluorescencia da clorofila das algas verdes e o rosa a autoflorescencia da clorofila das cianobacterias. 53 5. Discusión Os modelos climáticos, baseados en principios físicos que poden reproducir as características observadas dos cambios no clima pasado e actual, proporcionan estimacións cuantitativas plausibles do cambio climático futuro a diferentes escalas. Actualmente, as proxeccións mostran un aumento das temperaturas ao longo do século XXI en todos os escenarios de emisión avaliados e cambios a longo prazo en todos os compoñentes do sistema climático, aumentando a probabilidade de impactos graves, xeneralizados e irreversibles sobre as persoas e sobre o patrimonio natural e histórico (IPCC, 2014). Os factores ambientais chave, susceptibles de afectar aos organismos vivos colonizadores e deteriorantes do patrimonio cultural son o clima e a química atmosférica, polo que os cambios nestes factores poden causar potenciais cambios na relación entre biota e patrimonio construído (Viles & Cutler, 2012). Este traballo profundiza no coñecemento dos efectos que poden provocar os cambios esperados dos factores ambientais (temperatura, concentración de CO2 atmosférico e radiación UV-B) nun escenario futuro de cambio climático sobre os organismos colonizadores do patrimonio cultural granítico. 5.1. Experimento CO2-Temperatura A análise da evolución dos cultivos sometidos a diferentes condicións de temperatura (20, 26ºC) e de CO2 (ambiental, elevado) mostran que ambos parámetros, individualmente ou en combinación, afectan significativamente ao desenvolvemento dos organismos. O día 45, a metade do experimento, supón un punto de inflexión nas respostas aos factores ambientais. Ata o día 45 hai unha evolución no crecemento, desenvolvemento e eficiencia da actividade fotosintética de todas as mostras marcada maiormente polas diferenzas entre condicións de temperatura, aínda que tamén se mostran diferenzas significativas en función das condicións de CO2 e da interacción das condicións de temperatura e CO2 nalgúns parámetros. A partires 54 do día 45 prodúcese un cambio no que todos os parámetros medidos nos cultivos, independentemente das condicións ás que estean sometidos, conducen ata o mesmo punto e desaparecen as diferenzas que se manifestaron ata a metade do experimento. No que se refire ao desenvolvemento dos cultivos, se ben o número total de células mantense ata o día 45 (Fig.10), varía a proporción dos distintos organismos, xa que aumenta a porcentaxe de algas verdes en relación ás cianobacterias, especialmente nos cultivos mantidos a 20ºC. O final do experimento, o número total de células é menor que no comezo do experimento, pero a porcentaxe de algas verdes é maior, especialmente nos cultivos mantidos a 20ºC e sen adición de CO2. O aumento na porcentaxe de algas o longo do experimento está tamén reflexado no parámetro F0470nm / F0645nm (Fig. 12). O sinal de F0 a 470 nm está relacionado coa clorofila b e o sinal a 645 nm coa aloficocianina, sendo a relación F0470nm / F0645nm un indicador do dominio das algas verdes (valores altos) ou das cianobacterias (valores baixos) (Vázquez Nion, 2016). Tendo en conta o anterior, o aumento no parámetro F0 ao longo do experimento está determinado polo incremento na porcentaxe de algas verdes fronte as cianobacterias, favorecido por condicións de temperatura de 20ºC fronte a 26ºC e aporte de CO2, pero só na primeira etapa do experimento, ata o día 45. Os datos da cor tamén mostran esa inflexión no día 45, especialmente no parámetro b*. Tendo en conta que o parámetro da cor b* varía a súa dirección segundo as células do cultivo se estean a desenvolver ou estean morrendo (Prieto et al., 2002) e a contaxe do número de células, está claro que ata o día 45 os organismos foron desenvolvéndose variando o equilibrio inicial alga/cianobacteria, aínda que respondendo de diferente maneira ás condicións de temperatura e CO2, pero a partires do día 45 as cianobacterias, que eran as maioritarias, comezaron a morrer, moi probablemente debido o esgotamento do medio de cultivo. Hai que ter en conta que o 61 6. Conclusións A partir dos resultados obtidos pódese concluír que variacións nas condicións de temperatura, concentración de CO2 e radiación UV-B con respecto as actuais afectarán tanto aos biofilms colonizadores do Patrimonio cultural pétreo como a súa capacidade de deteriorar o substrato. En condicións dun hipotético escenario futuro de cambio climático no que aumente a temperatura, a concentración de CO2 e a radiación UV-B, o efecto máis acusado será unha variación no consorcio formador do biofilm xa que esas condicións, segundo o presente traballo, estimulan o desenvolvemento de cianobacterias fronte a algas verdes. Demostrouse ademais que o incremento de temperatura aumenta a cantidade de elementos disoltos dende os minerais, sen embargo a súa eliminación do sistema, ben sexa por consumo ou por precipitación é maior a baixas temperaturas, é dicir, cando o crecemento dos organismos foi favorecido. As anteriores conclusións teñen gran repercusión en canto á conservación do Patrimonio Cultural pétreo nun contexto de cambio climático xa que implican un cambio de dirección no biodeterioro estético, ao cambiar o tipo de colonizador dominante, e no biodeterioro físico e químico, ao cambiar a relación biofilms-sustrato debida principalemente ao incremento das temperaturas. 62 7. Bibliografía Ariño, X., Llop, E., Gómez-Bolea, A., & Saiz-Jimenez, C. (2010). Effects of climatic change on microorganisms colonizing cultural heritage stone materials. Climate Change and Cultural Heritage, 193–198. Bais, A. F., Bernhard, G., McKenzie, R. L., Aucamp, P. J., Young, P. J., Ilyas, Deushi, M. (2019). Ozone-climate interactions and effects on solar ultraviolet radiation. Photochemical and Photobiological Sciences, 18(3), 602–640. https://doi.org/10.1039/C8PP90059K Balaguer, L., Manrique, E., De Los Rios, A., Ascaso, C., Palmqvist, K., Fordham, M., & Barnes, J. D. (1999). Long-term responses of the green-algal lichen Parmelia caperata to natural CO2 enrichment. Oecologia, 119(2), 166–174. https://doi.org/10.1007/s004420050773 Beardall, J., & Raven, J. A. (2004). The potential effects of global climate change on microalgal photosynthesis, growth and ecology. Phycologia, 43(1), 2640.https://doi.org/10.2216/i0031-8884-43-1-26.1 Bell, R. A., & Sommerfeld, M. R. (1987). Algal biomass and primary production within a temperate zone sandstone. American Journal of Botany, 74(2), 294–297. https://doi.org/10.1002/j.1537-2197.1987.tb08608.x Björkman, O. (1966). The effect of oxygen concentration on photosynthesis in higher plants. Physiologia Plantarum, 19(3), 618-633. https://doi.org/10.1111/j.13993054.1966.tb07046.x Bornman, J. F., Barnes, P. W., Robson, T. M., Robinson, S. A., Jansen, M. A. K., Ballare, C. L., & Flint, S. D. (2019). Linkages between stratospheric ozone, UV radiation and 63 climate change and their implications for terrestrial ecosystems. Photochemical and Photobiological Sciences, 18(3), 681–716. https://doi.org/10.1039/c8pp90061b Bos, R., van der Mei, H. C., & Busscher, H. J. (1999). Physico-chemistry of initial microbial adhesive interactions – its mechanisms and methods for study. FEMS Microbiology Reviews, 23(2), 179–230. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.1999.tb00396.x Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., & West, G. B. (2004). Toward a metabolic theory of ecology. Ecology, 85, 1771–1789. https://doi.org/10.1890/03-9000 Castenholz, R. W., & Garcia-Pichel, F. (2013). Cyanobacterial responses to UV radiation. In Ecology of Cyanobacteria II: Their Diversity in Space and Time (pp. 481–499). Springer Netherlands. https://doi.org/10.1007/978-94-007-3855-3_19 Cleland, E. E., Chuine, I., Menzel, A., Mooney, H. A., & Schwartz, M. D. (2007, July). Shifting plant phenology in response to global change. Trends in Ecology and Evolution, 22(7), 357-365. https://doi.org/10.1016/j.tree.2007.04.003 Cogdell, R. J., Cogdell, & J., R. (1978). Carotenoids in photosynthesis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences, 284(1002), 569– 579. https://doi.org/10.1098/rstb.1978.0090 Colette, A. (2013). Case studies on climate change and World Heritage. UNESCO Publishing. Costerton, J. W. (2007). The Biofilm Primer. (Vol. 1). Springer Science & Business Media.. https://doi.org/10.1007/b136878 Crispim, C. A., Gaylarde, P. M., & Gaylarde, C. C. (2003). Algal and cyanobacterial biofilms on calcareous historic buildings. Current Microbiology, 46(2), 79–82. https://doi.org/10.1007/s00284-002-3815-5 de Carvalho, C. C. (2017). Biofilms: Microbial strategies for surviving UV exposure. 64 Ultraviolet Light in Human Health, Diseases and Environment, 233-239. https://doi.org/10.1007/978-3-319-56017-5_19 De ucia, E. H., Hamilton, J. ., Naidu, S. ., homas, R. B., ndrews, J. ., inzi, ., … & Schlesinger, W. H. (1999). Net primary production of a forest ecosystem with experimental CO2 enrichment. Science, 284(5417), 1177–1179. https://doi.org/10.1126/science.284.5417.1177 DeNicola, D. M. (1996). Periphyton responses to temperature at different ecological levels. Algal ecology: freshwater benthic ecosystems, 149-181. https://doi.org/10.1016/b978-012668450-6/50035-7 Dineshbabu, G., Uma, V. S., Mathimani, T., Prabaharan, D., & Uma, L. (2020). Elevated CO2 impact on growth and lipid of marine cyanobacterium Phormidium valderianum BDU 20041– towards microalgal carbon sequestration. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 25, 101-606. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2020.101606 Flemming, H. C., & Wingender, J. (2010,). The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology, 8(9), 623-633.. https://doi.org/10.1038/nrmicro2415 Francis, R. A. (2011). Wall ecology: A frontier for urban biodiversity and ecological engineering. Progress in Physical Geography, 35(1), 43–63. https://doi.org/10.1177/0309133310385166 Fuentes, E., & Prieto, B. (2021). Recovery Capacity of Subaerial Biofilms Grown on Granite Buildings Subjected to Simulated Drought in a Climate Change Context. Microbial Ecology, 1–9. https://doi.org/10.1007/s00248-021-01692-0 Gao, K., Li, P., Watanabe, T., & Walter Helbling, E. (2008). Combined effects of ultraviolet radiation and temperature on morphology, photosynthesis, and DNA of Arthrospira 65 (Spirulina) Platensis (Cyanophyta). Journal of Phycology, 44(3), 777–786. https://doi.org/10.1111/j.1529-8817.2008.00512.x Geraldes, V., & Pinto, E. (2014). Mycosporine-like amino acids (Maas): Biology, chemistry and identification features. Pharmaceuticals, 14(1), 63. https://doi.org/10.3390/ph14010063 Gorbushina, A. A. (2007). Life on the rocks. Environmental Microbiology, 9(7), 1613–1631. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2007.01301.x Häder, D. P. (2000). Effects of solar UV-radiation on aquatic ecosystems. Advances in Space Research, 26(12), 2029–2040. https://doi.org/10.1016/S0273-1177(00)00170-8 Hamilton, J. G., DeLucia, E. H., George, K., Naidu, S. L., Finzi, A. C., & Schlesinger, W. H. (2002). Forest carbon balance under elevated CO2. Oecologia, 131(2), 250–260. https://doi.org/10.1007/s00442-002-0884-x Hodkinson, T. R., Jones, M. B., Waldren, S., & Parnell, J. A. N. (2011). Climate change, ecology and systematics (Vol. 78). Cambridge University Press. https://doi.org/10.1017/CBO9780511974540 Hu, S., Chapin, F. S., Firestone, M. K., Field, C. B., & Chiariello, N. R. (2001). Nitrogen limitation of microbial decomposition in a grassland under elevated CO2. Nature, 409(6817), 188–191. https://doi.org/10.1038/35051576 Huertas, E., Montero, O., & Lubián, L. M. (2000). Effects of dissolved inorganic carbon availability on growth, nutrient uptake and chlorophyll fluorescence of two species of marine microalgae. Aquacultural Engineering, 22(3), 181–197. https://doi.org/10.1016/S0144-8609(99)00038-2 IPCC, 2014: Climate Change 2014: Synthesis Report. Contribution of Working Groups I, II 66 and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change [Core Writing Team, R.K. Pachauri and L.A. Meyer (eds.)]. IPCC, Geneva, Switzerland, 151 pp. Ji, X., Verspagen, J. M. H., Stomp, M., & Huisman, J. (2017). Competition between cyanobacteria and green algae at low versus elevated CO2: Who will win, and why? Journal of Experimental Botany, 68(14), 3815–3828. https://doi.org/10.1093/jxb/erx027 Joh, G., & Lee, J. (2012). Cyanobacterial biofilms on sedimentation basins in a water treatment plant in South Korea. Journal of Applied Phycology, 24(2), 285–293. https://doi.org/10.1007/s10811-011-9678-z Koerdt, A., Gödeke, J., Berger, J., Thormann, K. M., & Albers, S. V. (2010). Crenarchaeal Biofilm Formation under Extreme Conditions. PLoS ONE, 5(11), 14104. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014104 Körner, C. (2000). Biosphere response to CO2 enrichment. Ecological Applications, 10(6), 1590–1619. Lear, G., Anderson, M. J., Smith, J. P., Boxen, K., & Lewis, G. D. (2008). Spatial and temporal heterogeneity of the bacterial communities in stream epilithic biofilms. FEMS Microbiology Ecology, 65(3), 463–473. https://doi.org/10.1111/j.15746941.2008.00548.x Leissner, J., Kilian, R., Kotova, L., Jacob, D., Mikolajewicz, U., Broström, T., Vyhlídal, T. (2015). Climate for culture: Assessing the impact of climate change on the future indoor climate in historic buildings using simulations. Heritage Science, 3(1), 1-15. https://doi.org/10.1186/s40494-015-0067-9 Lesser, M. P. (2008). Effects of ultraviolet radiation on productivity and nitrogen fixation in 67 the Cyanobacterium, nabaena sp. (Newton’s strain). Hydrobiologia, 598(1), 1–9. https://doi.org/10.1007/s10750-007-9126-x Li, W., Xu, X., Fujibayashi, M., Niu, Q., Tanaka, N., & Nishimura, O. (2016). Response of microalgae to elevated CO2 and temperature: impact of climate change on freshwater ecosystems. Environmental Science and Pollution Research, 23(19), 19847–19860. https://doi.org/10.1007/s11356-016-7180-5 Lichtenthaler, H. K. (1987). Chlorophylls and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes. Methods in Enzymology, 148(C), 350–382. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)48036-1 Limoli, D. H., Jones, C. J., & Wozniak, D. J. (2015). Bacterial Extracellular Polysaccharides in Biofilm Formation and Function. Microbiology Spectrum, 3(3) MB-0011-2014. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.mb-0011-2014 Maxwell, K., & Johnson, G. N. (2000). Chlorophyll fluorescence—a practical guide. Journal of Experimental Botany, 51(345), 659–668. https://doi.org/10.1093/jexbot/51.345.659 Morales, E., Rodríguez, M., García, D., Loreto, C., & Marco, E. (2002). Crecimiento, producción de pigmentos y exopolisacáridos de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 en función del pH y CO2. Interciencia, 27(7), 373-378. Mushir, S., & Fatma, T. (2012). Monitoring stress responses in cyanobacterial scytonemin - screening and characterization. Environmental Technology, 33(2), 153–157. https://doi.org/10.1080/09593330.2011.553842 Necchi, O. (2004). Photosynthetic responses to temperature in tropical lotic macroalgae. Phycological Research, 52(2), 140–148. https://doi.org/10.1111/j.1440183.2004.00334.x 68 Norf, H., Arndt, H., & Weitere, M. (2007). Impact of local temperature increase on the early development of biofilm-associated ciliate communities. Oecologia, 151(2), 341–350. https://doi.org/10.1007/s00442-006-0545-6 Ortega-Morales, B. O., Narváez-Zapata, J. A., Schmalenberger, A., Sosa-López, A., & Tebbe, C. C. (2004). Biofilms fouling ancient limestone Mayan monuments in Uxmal, Mexico: a cultivation-independent analysis. Biofilms, 1(2), 79–90. https://doi.org/10.1017/s1479050504001188 Palmqvist, K. (2000). Tansley review no. 117: carbon economy in lichens. New Phytologist, 148(1), 11-36. https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.2000.00732.x Parker, B. C., Bold, H. C., & Deason, T. R. (1961). Facultative heterotrophy in some chlorococcacean algae. Science, 133(3455), 761–763. https://doi.org/10.1126/science.133.3455.761 Prieto, B., Seaward, M. R. D., Edwards, H. G. M., Rivas, T., & Silva, B. (1999). Biodeterioration of granite monuments by Ochrolechia parella (L.) mass: An FT Raman spectroscopic study. Biospectroscopy, 5(1), 53–59. https://doi.org/10.1002/(sici)15206343(1999)5:1<53::aid-bspy7>3.0.co;2-%23 Prieto, B., & Silva, B. (2005). Estimation of the potential bioreceptivity of granitic rocks from their intrinsic properties. International Biodeterioration and Biodegradation, 56(4), 206–215. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2005.08.001 Prieto, B., Silva, B., & Lantes, O. (2004). Biofilm quantification on stone surfaces: Comparison of various methods. Science of the Total Environment, 333(1–3), 1–7. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2004.05.003 Prieto, B., Vázquez-Nion, D., Fuentes, E., & Durán-Román, A. G. (2020). Response of 69 subaerial biofilms growing on stone-built cultural heritage to changing water regime and CO2 conditions. International Biodeterioration and Biodegradation, 148, 104882. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2019.104882 Prieto, B., Edwards, H. G. M., & Seaward, M. R. D. (2000). A fourier transform-raman spectroscopic study of lichen strategies on granite monuments. Geomicrobiology Journal, 17(1), 55–60. https://doi.org/10.1080/014904500270495 Prieto, Beatriz, Rivas, T., & Silva, B. de M. (2002). Rapid Quantification of Phototrophic Microorganisms and their Physiological State through their Colour. Biofouling, 18(3), 237–245. Querijero-Palacpac, N. M., Martinez, M. R., & Boussiba, S. (1990). Mass cultivation of the nitrogen-fixing cyanobacterium Gloeotrichia natans, indigenous to rice-fields. Journal of Applied Phycology, 2(4), 319–325. https://doi.org/10.1007/BF02180921 Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., & Ball, A. (1982). Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 149(1), 1–5. https://doi.org/10.1128/jb.149.1.1-5.1982 Rifón-Lastra, A., & Noguerol-Seoane, Á. (2001). Green algae associated with the granite walls of monuments in Galicia (NW Spain). Cryptogamie, Algologie, 22(3), 305–326. https://doi.org/10.1016/S0181-1568(01)01069-8 Rinaudi, L. V., & Giordano, W. (2010). An integrated view of biofilm formation in rhizobia. FEMS microbiology letters, 304(1), 1-11. https://doi.org/10.1111/j.15746968.2009.01840.x Rippka, R., Deruelles, J., & Waterbury, J. B. (1979). Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Journal of General Microbiology, 70 111(1), 1-61. https://doi.org/10.1099/00221287-111-1-1 Robinson, S. A., & Erickson, D. J. (2015). Not just about sunburn - the ozone hole’s profound effect on climate has significant implications for Southern Hemisphere ecosystems. Global Change Biology, 21(2), 515-527. https://doi.org/10.1111/gcb.12739 Roháček, . (2002). Chlorophyll fluorescence parameters: he definitions, photosynthetic meaning, and mutual relationships. Photosynthetica, 40(1), 1329.https://doi.org/10.1023/A:1020125719386 Sand-Jensen, K., Pedersen, N. L., & Søndergaard, M. (2007). Bacterial metabolism in small temperate streams under contemporary and future climates. Freshwater Biology, 52(12), 2340–2353. https://doi.org/10.1111/j.1365-2427.2007.01852.x Sanmartin, P., Aira, N., Devesa-Rey, R., Silva, B., & Prieto, B. (2010). Relationship between color and pigment production in two stone biofilm-forming cyanobacteria (nostoc sp. pcc 9104 and nostoc sp. pcc 9025). Biofouling, 26(5), 499–509. https://doi.org/10.1080/08927011003774221 Sanmartín, P., Villa, F., Silva, B., Cappitelli, F., & Prieto, B. (2011). Color measurements as a reliable method for estimating chlorophyll degradation to phaeopigments. Biodegradation, 22(4), 763–771. https://doi.org/10.1007/s10532-010-9402-8 Sanmartín, Patricia. (2012). Cuantificación del color en el estudio de la formación de biofilms en rocas graníticas del Patrimonio histórico artístico (Tesis Doctoral), Universidade de Santiago de Compostela. Scheerer, S., Ortega-Morales, O., & Gaylarde, C. (2009). Microbial deterioration of stone monuments—an updated overview. Advances in applied microbiology, 66, 97-139. https://doi.org/10.1016/S0065-2164(08)00805-8