Validación de técnicas de electroforesis bidimensionales para el estudio del proteoma y complexoma de membrana externa de "Neisseria"

Universidad de Santiago de Compostela Departamento de Microbiología y Parasitología VALIDACIÓN DE TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS BIDIMENSIONALES PARA EL ESTUDIO DEL PROTEOMA Y COMPLEXOMA DE MEMBRANA EXTERNA DE Neisseria Memoria presentada por Ana Mª Abel Souto Para optar al Grado de Doctor en Biología Santiago de Compostela, marzo de 2008 II D a Maria Teresa Criado Álvarez, Profesora Titular de Microbiología de la Universidad de Santiago de Compostela y Dª Sandra Sánchez Poza, Dra. En Biología por la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMAN: Que la presente Tesis doctoral, titulada " Validación de técnicas de electroforesis bidimensionales para el estudio del proteoma y complexoma de membrana externa de Neisseria", que para optar al Grado de Doctor en Biología presenta D a Ana Mª Abel Souto, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Microbiología y Parasitología de esta Universidad y, hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Santiago de Compostela, marzo de 2008 M a Teresa Criado Álvarez Sandra Sánchez Poza III Quiero expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que hicieron posible la realización de esta Tesis. Agradezco a los profesores Carlos Ferreirós y Maria Teresa Criado su valiosa ayuda y siempre sabios consejos durante la elaboración de este trabajo. Quiero agradecer especialmente a Maria Teresa el haberme mantenido enfocada en mis objetivos y a Carlos el servirme de modelo e inspiración. A Sandra Sánchez, directora de Tesis y compañera, por guiarme en mis primeros pasos en el laboratorio y por ser un apoyo constante. A Juan, por todas las horas de laboratorio y los cafés compartidos. A Javier por su apoyo técnico. Al los doctores I.M. Feavers y E. Rosenqvist por facilitarnos las cepas mutantes utilizadas en este trabajo. Al Dr. Julio Vázquez y al laboratorio de referencia del meningococo (instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid) por la caracterización de las cepas estudiadas en este trabajo. Y, por supuesto, a mis padres. VI A mis padres A Blas Validación de técnicas de electroforesis bidimensionales para el estudio del proteoma y complexoma de membrana externa de Neisseria Índice 3 Página Antecedentes bibliográficos .................................................................. 13 1. Neisseria meningitidis como patógeno ............................................. 15 2. Tendencias actuales en vacunas anti-serogrupo B......................... 19 2.1 Vacunas basadas en OMVs, proteínas mayoritarias, proteínas de unión a hierro.................................................. 24 2.2 Vacunas recombinantes......................................................... 31 2.3 Antígenos derivados del genoma: vacunología reversa........ 32 2.4 Vacunas basadas en OMVs de Neisseria lactamica.............. 35 3. Proteínas de membrana externa y su papel en la patogenicidad del meningococo................................................................................ 37 3.1 Proteínas de autotransporte................................................... 38 3.2 Proteínas implicadas en la captación de metabolitos............ 40 3.3 Porinas.................................................................................... 42 3.4 Proteínas de adherencia e invasión........................................ 45 3.5 Otras proteínas....................................................................... 47 3.6 Papel en el funcionamiento celular de las interacciones entre proteínas de membrana externa.................................... 51 Objetivos e interés del trabajo ............................................................. 53 CAPÍTULO I: Análisis del proteoma de membrana externa mediante electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE ............ 59 1. Introducción........................................................................................ 61 1.1 Isoelectroenfoque......................................................................... 61 2. Material y métodos.............................................................................. 67 2.1 Cepas bacterianas, origen, características, conservación y cultivo........................................................................................... 67 Índice 4 2.1.1 Cepas bacterianas: Origen y características.................... 67 2.1.2 Conservación................................................................... 69 2.1.3 Condiciones de cultivo.................................................... 70 2.2 Extracción de vesículas de membrana externa (OMVs)............. 70 2.3 Obtención y conservación de sueros........................................... 72 2.3.1 Obtención y conservación de sueros de ratón................. 72 2.3.2 Obtención y conservación de sueros de conejo............... 73 2.3.3 Otros sueros..................................................................... 74 2.4 Técnicas electroforéticas............................................................ 74 2.4.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).. 74 2.4.2 Electroforesis bidimensional convencional (IEF/SDSPAGE)........................................................................... 75 2.5 Electrotransferencia a membranas de PVDF............................ 76 2.6 Inmunodetección. ........................................................................ 77 2.7 Análisis informático de los datos................................................ 78 2.8 Identificación por MALDI-TOF.................................................. 79 3. Resultados............................................................................................ 81 3.1 Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE. Identificación por MALDI-TOF........................................................................... 81 3.1.1 Determinación de las condiciones óptimas de tiempo de IEF, solubilización y gradiente de pI................................ 81 3.1.2 Análisis proteómico.......................................................... 85 3.1.3 Identificación por MALDI-TOF...................................... 97 3.1.4 Análisi santigénico.......................................................... 102 4. Discusión.............................................................................................. 113 Índice 5 CAPÍTULO II: Análisis de los complejos de proteínas de membrana externa mediante electroforesis bidimensional diagonal dSDS-PAGE ............................................................................. 119 1. Introducción........................................................................................ 121 1.1 Electroforesis diagonal................................................................... 121 1.2 Relevancia del estudio de complejos en el desarrollo de vacunas. Epitopos conformacionales y compartidos...................................... 123 2. Material y métodos.............................................................................. 125 2.1 Cepas bacterianas, origen, características, conservación y cultivo......................................................................................... 125 2.2 Extracción de vesículas de membrana externa (OMVs)............. 125 2.3 Obtención y conservación de sueros........................................... 126 2.4 Electroforesis bidimensional diagonal....................................... 126 2.5 Electrotransferencia a membranas de PVDF............................. 127 2.6 Inmunodetección......................................................................... 127 3. Resultados............................................................................................ 129 3.1 Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE...................... 129 3.1.1 Análisis proteómico............................................................ 129 3.1.2 Análisis antigénico.............................................................. 140 4. Discusión.............................................................................................. 145 CAPÍTULO III: Análisis en condiciones nativas de los complejos de proteínas de membrana externa mediante electroforesis bidimensional Blue-Native/SDSPAGE ............... 151 1. Introducción........................................................................................ 153 1.1 Electroforesis Blue-Native.............................................................. 153 Índice 6 1.2 Otras técnicas de estudio de complejos: Ventajas e inconvenientes............................................................................... 156 2. Material y métodos............................................................................. 165 2.1 Cepas bacterianas, origen, características, conservación y cultivo............................................................................................ 165 2.2 Extracción de vesículas de membrana externa (OMVs)................ 166 2.2.1 Extracción de vesículas de membrana externa con prensa de French.......................................................................... 166 2.2.2 Extracción de vesículas de membrana externa con deoxicolato sódico............................................................. 166 2.3 Electroforesis Blue Native (BN-PAGE)…..................................... 166 2.4 Electroforesis bidimensional BN/SDS-PAGE................................ 168 2.5 Análisis informático de los datos................................................... 168 2.6 Identificación por MALDI-TOF..................................................... 169 3. Resultados............................................................................................ 171 3.1 Análisis de la primera dimensión: BN-PAGE................................ 171 3.2 Análisis de la segunda dimensión: SDS-PAGE.............................. 172 3.3 Identificación por MALDI-TOF...................................................... 182 3.4 Comparación de las técnicas 2D BN/SDS-PAGE y 2D dSDSPAGE para el análisis de complejos de membrana externa de N. meningitidis.............................................................................. 184 4. Discusión.............................................................................................. 187 Sinopsis . ...................................................................................................... 191 Conclusiones .............................................................................................. 199 Bibliografía ................................................................................................. 203 Índice de tablas y figuras 7 ÍNDICE DE FIGURAS. Página Figura 1 : Comparación de las condiciones de solubilización de OMVs de N. meningitidis........................................................................................................ 83 Figura 2 : Comparación de las condiciones de rehidratación de las tiras IPG..................................................................................................................... 84 Figura 3 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 2851 (cepa salvaje 44/76)............................................................. 88 Figura 4 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3050 (2851 porA-)....................................................................... 89 Figura 5 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3103 (2851 PorB-)........................................................................ 89 Figura 6 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3043 (2851 FetA-)......................................................................... 90 Figura 7 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 2851 RmpM-................................................................................. 90 Figura 8 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3059 (cepa salvaje).......... ............................................................ 91 Figura 9 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3091 (3059 PorA-)........................................................................ 91 Figura 10 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3094 (3059 PorB-)........................................................................ 92 Figura 11 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis B16B6........................................................................................... 92 Figura 12 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis Nm30............................................................................................. 93 Figura 13 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis M982............................................................................................. 93 Figura 14 : Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP0................................................................................................. 95 Figura 15: Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP2................................................................................................. 96 Figura 16: Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP5................................................................................................. 96 Figura 17: Puntos comunes a todas las cepas de (A) N. meningitidis (B) N. lactamica y (C) entre ambas especies. ................................................................................. 97 Figura 18 : Proteínas identificadas por MALDI-TOF tras IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis B16B6. La identificación de los puntos más relevantes se llevó a cabo mediante análisis MALDI-TOF............................... 98 Figura 19 : Proteínas identificadas por MALDI-TOF en una electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE realizada con OMVs de la cepa N. lactamica NlP2.......... 100 Figura 20 : Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 incubada con suero antiPorA 9-1-P1.c.................................................................................................... 103 Figura 21 : Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 tras incubación secuencial con suero anti-PorA 9-1-P1.c y anti-RmpM...................................................... 103 Figura 22 : Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 tras incubación secuencial con suero anti-PorA 9-1-P1.c, anti-RmpM y anti-P47...................................... 104 Figura 23 : Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 tras incubación secuencial con suero anti-PorA 9-1-P1.c, anti-RmpM , anti-P47 y anti-B16B6............... 104 Antecedentes bibliográficos 15 Antecedentes bibliográficos. 1 Neisseria meningitidis como patógeno El Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology ubica a Neisseria meningitidis dentro del género Neisseria, situado en la clase β del phylum proteobacterias, que engloba bacterias caracterizadas por una morfología, fisiología y metabolismo muy variables. N. meningitidis es un diplococo Gram-negativo de tamaño comprendido entre 0,6 y 1µm de diámetro. Esta especie comprende bacterias no móviles carentes de flagelos que pueden presentar cápsulas y pili, pero no endosporas. Aunque son microorganismos aerobios, su crecimiento se ve favorecido por concentraciones de CO 2 del 5-10%, una humedad relativa del 50%, una temperatura de crecimiento de 35-37% y un pH entre 7,4 y 7,6. Todos los meningococos patógenos presentan una cápsula externa de naturaleza polisacarídica anclada a su membrana externa cuyas características inmunoquímicas permiten diferenciar 13 serogrupos diferentes, de los que los serogrupos A, B, C, Y, W135 son los responsables del 90% de los casos de enfermedad meningocócica a nivel global. La clasificación contempla además la existencia de 20 serotipos, definidos por las proteínas de membrana externa (OMP) de clase 2 y 3, 1 10 subtipos determinados por las OMP de clase 1, y 13 inmunotipos en base a sus antígenos lipooligosacarídicos. 2 1 Frasch CE, Zollinger WD, Poolman JT. Serotype antigens of Neisseria meningitidis and a proposed scheme for designation of serotypes. Rev Infect Dis. 1985; 7: 504–510. 2 Scholten RJ, Kuipers B, Valkenburg HA, Dankert J, Zollinger WD, et al. Lipooligosaccharide immunotyping of Neisseria meningitidis by a whole-cell ELISA with monoclonal antibodies. J Med Microbiol. 1994; 41: 236–243. Antecedentes bibliográficos 16 En la última década, el uso de métodos de subtipado molecular 3 ha permitido clasificar a la bacteria en diferentes tipos electroforéticos (ETs), que posibilitan la monitorización de la epidemiología global de la enfermedad meningocócica. Se ha descrito la capacidad del meningococo de modificar los genes que codifican para su cápsula (capsular switching), 4 lo cual podría constituir un importante mecanismo de evasión de la respuesta inmune que ya ha sido descrito en otros patógenos encapsulados. N. meningitidis coloniza de forma habitual las membranas de la mucosa orofaríngea humana, donde normalmente se comporta como comensal. En condiciones no epidémicas, entre un 5% y un 10% de la población pueden ser portadores asintomáticos. La transmisión de N.meningitidis se produce por la vía aérea superior mediante contacto directo con secreciones nasales o aerosoles procedentes de dichos portadores. La enfermedad meningocócica es un suceso relativamente raro 5 que se desarrolla cuando el meningococo penetra en el epitelio de la mucosa y de él pasa al torrente sanguíneo, donde sobrevive y se multiplica, lo que provoca una bacteriemia que puede ir acompañada de meningitis, de sépsis o de ambas. 6 La enfermedad meningocócica invasiva se caracteriza por provocar una alta tasa de mortalidad, de aproximadamente un 10%, pudiendo exceder el 35% en presencia de 3 Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 3140–3145. 4 Stwartlwey J, Marfin A, Edupuganti S, Liu L, Cieslak P et al. Capsule switching of Neisseria meningitidis in children. Infect Immun. 1999; 67: 2449–2451. 5 Aycock WL, Mueller JH. Meningococcus carrier rates and meningitis incidence. Bacteriol Rev 1950; 14: 115–160. 6 Gold R. Clinical aspects of meningococcal disease. En: Evolution of meningococcal disease. Vedros NA. (Ed). Vol 2, págs. 69–97. 1987. Crc Pr I Llc. Boca Ratón. Florida. Antecedentes bibliográficos 17 shock séptico. 7 Además, entre el 15 y el 20% de los supervivientes sufren secuelas neurológicas tales como sordera o retraso mental. 8 En Europa, las mayores tasas de enfermedad meningocócica sistémica se encuentran en niños menores de 5 años 9,10 y en adolescentes, 11 mientras que el mayor porcentaje de portadores se da entre los adultos jóvenes. Los meningococos del serogrupo A son la causa principal de enfermedad meningocócica endémica y epidémica en África, con mayor incidencia en el área subsahariana que va de Senegal a Etiopía conocida como “cinturón subsahariano de la meningitis”. Las epidemias de este serogrupo siguen ciclos irregulares de 5-12 años, con una duración de 2 a 3 años y marcada estacionalidad. En períodos epidémicos la tasa de incidencia puede llegar a 1.000/100.000, con una tasa de mortalidad es del 10 al 20%. En esta zona, la incidencia en épocas no epidémicas también es alta, 30/100.000, unas 10 veces mayor que en Europa, lo que unido a la reciente emergencia de los serogrupos W135 y X 12 como causa de enfermedad epidémica en la región, 13,14 la convierte en una de las zonas más complejas desde el punto de vista epidemiológico. 15 7 van Deuren M, Brandtzaeg P, van der Meer JW. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clin Microbiol Rev. 2000; 13: 144–166. 8 Healy C.J, Baker C.M. The future of meningococcal vaccines. The Pediatric Infectious Disease Journal. 2005; 24: 175–176. 9 Goldschneider I, Gotschlich EC, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. J Exp Med. 1969; 129: 1307–1326. 10 Moore PS, Reeves MW, Schwartz B, Gellin BG, Broome CV. Intercontinental spread of an epidemic group A Neisseria meningitidis strain. Lancet 1989; 2: 260–263. 11 Connolly M, Noah M. Is group C meningococcal disease increasing in Europe? A report of surveillance of meningococcal infection in Europe 1993–6. European Meningitidis Surveillance Group. Epidemiol Infect. 1999; 122: 41–49 12 Boisier P, Nicolas P, Djibo S, Taha MK, Jeanne I et al. Meningococcal meningitis: unprecedented incidence of serogroup X-related cases in 2006 in Niger. Clin Infect Dis. 2007; 44: 657–663 13 Wilder-Smith A, Barkham TM, Earnest A, Paton NI. Acquisition of W135 meningococcal carriage in Hajj pilgrims and transmission to household contacts: prospective study. BMJ. 2002; 325: 365–366. Antecedentes bibliográficos 18 El serogrupo B es la principal causa de meningitis endémica en los países industrializados, siendo responsable de un 80% de los casos registrados en Europa, donde la mayor parte del resto de los casos se deben a cepas del serogrupo C 16 , y de un 30%-40% de los casos en Norteamérica, donde los demás se deben a los serogrupos C e Y en la misma proporción. 17 En todos estos países, la incidencia de los serogrupos B y C es mayor en invierno en niños de menos de 1año. El serogrupo B también puede causar epidemias severas y persistentes, como las sufridas en ciertos países latinoamericanos (Cuba, Colombia, Brasil y Chile), Noruega o Nueva Zelanda. 18 La incidencia anual del serogrupo B es del orden de 20.000 a 80.000 casos por año, siendo responsable de 2.000 a 8.000 muertes. 19 En los países industrializados, debido a la práctica eliminación de las enfermedades provocadas por N. meningitidis serogrupos A y C mediante campañas de vacunación sistemáticas, la enfermedad meningocócica por serogrupo B ha pasado a ser una de las causas de muerte por infección más importantes durante la infancia. 14 Mayer LW, Reeves MW, Al-Hamdan N, Sacchi CT, Taha MK et al. Outbreak of W135 meningococcal disease in 2000: not emergence of a new W135 strain but clonal expansion within the electophoretic type-37 complex. J Infect Dis. 2002; 185: 1596–1605. 15 Teyssou R, Muros-Le Rouzic E. Meningitis epidemics in Africa: a brief overview. Vaccine. 2007; 3: A3–A7. 16 Tzanakaki G, Mastrantonio P. Aetiology of bacterial meningitis and resistance to antibiotics of causative pathogens in Europe and in the Mediterranean region. Int J Antimicrob Agents. 2007; 29: 621–629. 17 Rosenstein NE, Perkins BA, Stephens DS, Lefkowitz L, Cartter ML et al. The changing epidemiology of meningococcal disease in the United States, 1992–1996. J Infect Dis. 1999; 180: 1894–1901. 18 Dyet K, Devoy A, McDowell R, Martin D. New Zealand's epidemic of meningococcal disease described using molecular analysis: implications for vaccine delivery. Vaccine. 2005; 23: 2228–2230. 19 Girard MP, Preziosi MP, Aguado MT, Kieny MP. A review of vaccine research and development: meningococcal disease. Vaccine. 2006; 24: 4692–4700. Antecedentes bibliográficos 19 2 Tendencias actuales en vacunas anti-serogrupo B La enfermedad causada por los meningococos de los serogrupos A, C, Y y W135 se puede prevenir mediante el uso de vacunas basadas en polisacárido capsular de alto peso molecular (CPS). 20 Desafortunadamente, este tipo de vacunas no inducen respuesta inmune Tdependiente, son poco efectivas en lactantes y niños de corta edad y no generan una memoria inmune a largo plazo. La conjugación química del CPS a un transportador proteico asegura que se produzca una respuesta de este tipo, 21 de modo que ha sido ampliamente utilizada para la elaboración de vacunas contra estos serogrupos (tabla1). Esta aproximación no es válida para el serogrupo B, pues su cápsula está formada por ácido α-2,8 N-acetilneuramínico, que es estructural y antigénicamente idéntico al presente en los glicopéptidos polisiálicos de las neuronas fetales humanas, así como en ciertos tejidos nerviosos del adulto, 22 lo que evita que la cápsula sea reconocida por el sistema inmune debido a los mecanismos de autotolerancia del huésped. La perspectiva de desarrollar una vacuna universal contra este serogrupo continúa siendo remota, si bien en los últimos años se han realizado una serie de avances (tabla 2) debidos fundamentalmente a la aplicación de la tecnología de vacunología reversa. 23,24,25 Actualmente se están estudiando una serie de candidatos a vacuna contra el serogupo B 19,26,27 que se citan en la tabla 2. 20 Gotschlich EC, Goldschneider I, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus. V. The effect of immunization with meningococcal group C polysaccharide on the carrier state. J Exp Med. 1969; 129: 1385–1395. 21 Robbins JB, Schneerson R, Vann WF, Bryla DA, Fattom A. Prevention of systemic infections caused by group B streptococcus and Staphylococcus aureus by multivalent polysaccharide-protein conjugate vaccines. Ann N Y Acad Sci.1995. 31; 754: 68–82. 22 Finne J, Leinonnen M, Makela PH. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitidis: implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet. 1982; 2: 355–357 23 Rappuoli R. Reverse vaccinology, a genome-based approach to vaccine development. Vaccine. 2001; 19: 2688–2691. Antecedentes bibliográficos 20 Tabla 1: Vacunas antimeningocócicas disponibles en la actualidad. Serogrupos Vacunas Polisacarídicas Menomune® (Sanofi-Pasteur) A. C. Y y W-135 ACWY Vax (GlaxoSmithKline) A, C, Y y W-135 Mengiva A+C ® (Sanofi-Pasteur) A, C AC Vax ® (GlaxoSmithKline) A. C Vacuna Trivalente ACW A, C y W-135 (GlaxoSmithKline) Vacunas Polisacarídicas conjugadas Meningitec® (Wyeth) C conjugadada a CRM 197 Menjugate® (Novartis) C conjugadada a CRM 197 NeisVac-C ® (Baxter) C conjugadada a toxoide tetánico Nuevas vacunas conjugadas Menactra (MCV4) (Sanofi-Pasteur) A, C. Y, W-135 CRM 197 DTPvvHB/HibMenAC (GlaxoSmithKline) A, C + toxoide tetánico (MVA) en desarrollo A conjugada (Novartis) en desarrollo A, C, Y W-135 conjugada Vacunas Basadas en OMVs VA-MENGOC-BC ® OMVS de la cepa B:4:P1.19,15+C+OMPs MeNZ B® (Chiron) OMVS de la cepa B:4:P1.7 b,4 24 Rappuoli R. From Pasteur to genomics: progress and challenges in infectious diseases. Nat Med. 2004; 10: 1177–1185. 25 Kelly DF, Rappuoli R. Reverse vaccinology and vaccines for serogroup B Neisseria meningitidis. Adv Exp Med Biol. 2005; 568: 217–223. 26 Morley SL, Pollard AJ. Vaccine prevention of meningococcal disease, coming soon? Vaccine. 2001; 20: 666–687. 27 Jódar L, Feavers IM, Salisbury D, Granoff DM. Development of vaccines against meningococcal disease. Lancet. 2002; 359: 1499–1508 Antecedentes bibliográficos 21 Tabla 2: Linea temporal del proceso de desarrollo de vacunas meningocócicas (tomada de Stephens, DS. 2007. Conquering the meningococcus. FEMS microbiol rev. 31: 3-14). La incidencia de la enfermedad provocada por el serogrupo B es dependiente de la edad y se ha relacionado inversamente con la presencia de anticuerpos bactericidas, lo que indica la importancia de este tipo de anticuerpos en la lucha contra la infección por meningococos de este grupo. 28 A diferencia de lo que ocurre en los serogrupos A y C, los anticuerpos bactericidas están dirigidos principalmente contra antígenos no capsulares como proteínas de membrana externa (OMPs) y lipopolisacárido (LPS), de manera que estos componentes de la membrana externa se han estudiado como posibles candidatos para la elaboración de 28 Goldehneider I, Gotslich EC, Artenstein MS. Human immunity in the meningococcus I. The role of humoral antibodies. J Exp Med. 1969; 129: 1307–1326. 1970 1980 1990 2000 2010 Vacunas contra los serogrupos A, C, Y, W-135 1969-1971 – Vacunas polisacarídicas A y C 1978 - Vacuna polisacarídica polivalente A, C, Y, W-135  2000 – Vacunas conjugadas del serogrupo C  A partir de 2005 – Vacunas conjugadas A, C, W-135 , así como otras combinaciones de vacunas antimeningocócicas conjugadas Vacunas contra el serogrupo B 1980 al presente – Vacunas basadas en OMVs • Norwegian National Institute of Public Health (NIPH) • Walter Reed Army Institute of Research • Finlay Institute Vaccine Research - Cuba • Netherlands Vaccine Institute • Novartis Vaccines and Diagnostics  2000Vacunas multivalentes basadasa en proteínas y otras nuevas estrategias (en desarrollo)  Vacunas basadas en LPS (en desarrolllo) 1970 1980 1990 2000 2010 Antecedentes bibliográficos 22 una vacuna. El principal problema con este tipo de vacunas es la heterogeneidad antigénica de las OMPs, que implica que su éxito no pueda ir más allá de la cepa empleada en su desarrollo, existiendo así lo que se conoce como restricción de cepa. 29 Además, este tipo de vacunas son poco inmunogénicas en los niños de corta edad 30 y generan una respuesta inmune de corta duración. A pesar de todo se considera que estas vacunas monovalentes podrían ser adecuadas en el caso de enfermedad hiperendémica del serogrupo B en la que sólo esté implicado un tipo antigénico. 31 Se han empleado diferentes estrategias para incrementar el número de cepas cubiertas por las vacunas basadas en OMPs. Normalmente radican en el uso de combinaciones de múltiples tipos antigénicos, si bien el principal objetivo es encontrar un antígeno o grupo de antígenos comunes a todas las cepas del serogrupo B y capaces de inducir una respuesta inmune protectora de larga duración tanto en niños como en adultos. Otro problema en el desarrollo de una vacuna contra el serogrupo B es la falta de evidencia de una protección adecuada, ya que, así como en las vacunas frente a los grupos A y C se ha observado relación directa entre la generación de anticuerpos bactericidas y protección, esta no se ha podido evidenciar en el caso de las vacunas contra el serogrupo B. De hecho se ha sugerido que la protección contra la infección por meningococo B puede deberse también a la presencia de anticuerpos 29 Tappero JW, Lagos R, Ballesteros AM, Plikaytis B, Williams D et al. Immunogenicity of two serogroup B outer-membrane protein meningococcal vaccines: a radommized controlled trial in Chile. JAMA. 1999; 281: 1520–1527. 30 Carbonare SB, Arsianian C, Silva ML, Farhat CK, Carneiro-Sampaio MM. The antimeningococcal vaccine VAMENGOC B-C induced poor serum and salivary antibody response in young Bazillian children. Pediatr Infect Dis J. 1995; 14: 797–803. 31 Rodríguez AP, Dickinson F, Baly A, Martínez R. The epidemiological impact of antimeningococcal B vacunation in Cuba. Men Inst Oswaldo Cruz. 1999; 94: 433–40. Antecedentes bibliográficos 23 opsónicos y a respuestas inmunes innatas. 32 Es más, se ha propuesto que los ensayos de actividad opsónica y actividad bactericida de sangre completa serían marcadores de protección más apropiados que los ensayos de actividad bactericida de suero utilizados actualmente. Una vacuna capaz de dirigir la respuesta inmune contra el polisacárido capsular B podría ser la solución más sencilla para la obtención de una vacuna anti-B, puesto que este antígeno es compartido por todos los miembros del serogrupo. Desafortunadamente, la cápsula es poco inmunogénica debido a la tolerancia inmunológica ya comentada, pero la conjugación covalente del polisacárido B a una proteína transportadora parece convertirlo en un antígeno Tdependiente que es capaz de inducir respuesta de tipo IgG, incrementando tanto los títulos de anticuerpos como la actividad bactericida en estudios llevados a cabo en animales, si bien la mayor parte de los anticuerpos están dirigidos contra un epitopo sintético originado por el proceso de conjugación más que contra el polisacárido en sí. 33 En un intento por superar este problema, Jenning y colaboradores desarrollaron un polisacárido modificado químicamente que contiene grupos N-propionil en vez de N-acetil en la posición C5 de los residuos de ácido siálico. Las vacunas desarrolladas mostraron resultados muy 32 Ison CA, Anwan N, Coie MJ, Galassini R, Heyderman RS et al. Assesment of immune response of meningococcal disease : comparison of whole-blood assay and the serum bactericidal assay. Microbiol Pathol. 1999; 27: 207–214. 33 Bartolini A, Norelli F, Ceccarini C, Rappouli R, Constantino P. Immunogenicity of meningococcal B polysacharide conjugated to tetanus toxoid or CRM197 via adipic acid dihydrazide. Vaccine. 1995; 13: 463–470. Antecedentes bibliográficos 30 polisacárido capsular, lo cual lleva a pensar en la posibilidad de que los epitopos conservados lo estén precisamente porque no están sometidos a presión inmunológica al no ser accesibles por el sistema inmune, pudiendo darse el caso de que los antígenos sean inmunogénicos pero no sean útiles en estudios de protección. Otro candidato clásico para la vacuna es el lipopolisacárido (LPS). En el suero de pacientes de enfermedad meningocócica se encontraron anticuerpos contra el mismo que en algunos casos resultaron ser bactericidas. 60 Plested y colaboradores obtuvieron en ratón un anticuerpo monoclonal que reconocía un epitopo conservado en el núcleo interno del LPS en más del 70% de una colección de meningococos de los serogrupos A y B. 61 Previamente se había llevado a cabo otro estudio que utilizaba una vacuna conjugada de LPS, observándose que ésta era inmunogénica y producía suero bactericida contra meningococos heterólogos. 62 La capacidad de producir anticuerpos de protección cruzada contra un gran número de meningococos del serogrupo B observada en las vacunas de LPS ensayadas ha mantenido la vigencia del estudio de este antígeno, que sigue siendo considerado un elemento a introducir en las nuevas formulaciones vacunales. 60 Tramont EC, Sadoff JC, Artenstein MS. Cross-reactivity of Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis and the nature of antigens involved in the bacterial reaction. J Infect Dis. 1974; 130: 240–247. 61 Plested JS, Makepeace K, Jennings MP, Gidney MA, Lacelle S et al. Conservation and accessibility of an inner core lipopolysacharide epitope of N. meningitidis. Infect Immun. 1999; 67: 5417–5426. 62 Arumugham R, Fortuna-Nevin M, Mountzouros K. Development of lipopolysacharideprotein conjugate vaccines against group B N. meningitidis. En: Proceedings of the Fifth Conference of the International Endotoxin Society. Pág. 52. 1998. Santa Fe. (USA). Antecedentes bibliográficos 31 2.2 Vacunas recombinantes Debido a la variabilidad de la PorA, la protección ofrecida por una vacuna basada en OMVs procedente de una sola cepa podría estar limitada por el serosubtipo. En un intento de solventar este problema, en Holanda se desarrolló una vacuna de proteínas de membrana externa que contenía PorA de seis cepas patogénicas prevalentes 63 que ha sido capaz de inducir actividad bactericida contra cepas que presentan cada una de las seis PorA en recién nacidos, 64 niños de corta edad y escolares cuando se aplicó en un régimen de tres dosis, si bien su efectividad parece estar limitada por factores tales como la variabilidad antigénica de cada uno de los antígenos PorA, que puede impedir la generación de una buena respuesta contra todos los serotipos incluidos en la vacuna, la no generación de respuesta de reactividad cruzada contra las cepas de tipo salvaje que tengan PorA similares, pero no iguales, o el hecho de que el perfil antigénico de los aislados patógenos cambia rápidamente, de modo que una vacuna que ofrezca cobertura contra un número limitado de cepas seleccionadas es probable que en pocos años se convierta en inefectiva a menos que su composición sea modificada de acuerdo con la epidemiología local. Para conseguir una protección más amplia, se desarrolló una vacuna nonavalente (NonaMen) añadiendo un tercer tipo de OMV trivalente recombinante para así cubrir los 9 subtipos que aparecen con mayor frecuencia en los países desarrollados. 65 63 Classen I, Meylis J, van der Ley P, Peeters C, Brons H et al. Production, characterization and control of Neisseria meningitidis hexavalent class I outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 1996; 14: 1001–1008. 64 Cartwright K, Morris R, Rumke H, Fox A, Borrow R et al. Immunogenicity and reactogenicity in UK infants of a novel meningococcal vesicle vaccine containing multiple class I (PorA) outer membrane proteins. Vaccine. 1999; 17: 2612–2619. 65 Van den Dobbelsteen G, van Dijken H, Hamstra HJ, Ummels R, Van Alphen L et al. From HexaMen to NonaMen: expanding a multivalent PorA-based meningococcal outer membrane Antecedentes bibliográficos 32 Recientemente se han publicado buenos resultados de inmunogenicidad en ratones con una vacuna experimental que combina 13 serotipos de Streptococcus pneumoniae conjugados con la toxina diftérica atóxica CRM-197 de WYeth Ltd., junto con 9 PorA del meningococo B (NonaMen) del Netherlands Vaccine Institute. 66 En Nueva Zelanda también se ha utilizado la tecnología recombinante en un esfuerzo para luchar contra la cepa NZ98/254, produciéndose tanto una vacuna monovalente contra la PorA de la cepa prevalente como una vacuna hexavalente que incluye 6 porA, entre ellas la de la cepa NZ98/254. La efectividad del antígeno PorA NZ98/254 en la formulación hexavalente administrada en un régimen de tres dosis resultó ser satisfactoria en bebés y niños de corta edad. 67 2.3 Antígenos derivados del genoma: vacunología reversa. Las vacunas convencionales requieren además de que el patógeno pueda cultivarse en el laboratorio, la identificación de sus componentes y su producción de una forma pura, bien directamente a partir de la bacteria o bien mediante tecnología de DNA recombinante para que pueda ser probada su capacidad de inducir inmunidad. Todo el proceso requiere un gran consumo de tiempo y sólo permite la identificación de aquellos antígenos que pueden ser purificados en cantidades vesicle vaccine. En: Proceedings of the 14th International Pathogenic Neisseria Conference. Apicella MA and Seifert HS (Eds.) Pág. 153. 2004. Milwaukee, WI. 66 van den Dobbelsteen GP, van Dijken HH, Pillai S, van Alphen L. Immunogenicity of a combination vaccine containing pneumococcal conjugates and meningococcal PorA OMVs. Vaccine. 2007; 25: 2491–2496. 67 Longworth E, Borrow R, Goldblatt D, Balmer P, Dawson M, et al. Avidity maturation following vaccination with a meningococcal recombinant hexavalent PorA OMV vaccine in UK infants. Vaccine. 2002; 20: 2592–2596. Antecedentes bibliográficos 33 adecuadas. Como las proteínas más abundantes no son en muchos casos los candidatos más adecuados para el desarrollo de una vacuna y a que las herramientas genéticas requeridas para identificar los componentes abundantes pueden ser inadecuadas, el desarrollo de una de estas vacunas puede llevar décadas. Como resultado de la utilización de la tecnología genética a finales del siglo XX se ha producido una gran revolución en el desarrollo de vacunas. Tecnologías como la secuenciación génica, la proteómica, la espectrofotometría de masas, los microarrays de DNA o la tecnología de expresión in vivo (IVET) entre otras han revolucionado el modo de estudiar la patogénesis bacteriana y el diseño de vacunas. La posibilidad de determinar la secuencia genómica completa de una bacteria en pocos meses y con un coste reducido ha permitido la secuenciación del genoma de muchas bacterias patógenas en un corto período de tiempo, de modo que las bases de datos contienen hoy en día las secuencias completas de más de 600 bacterias, incluyendo muchos patógenos bacterianos. 68 Con estos datos, cada antígeno puede ser estudiado en cuanto a su capacidad de inducir una respuesta inmune protectora. En el caso concreto de N. meningitidis serogrupo B, el genoma completo de la cepa MC58 69 ha sido obtenido mediante la estrategia de “random shotgun”. La secuencia fue analizada con el fin de buscar y seleccionar ORF (open reading frames) que codificasen para proteínas secretadas o expuestas en la superficie. Estos posibles antígenos 68 http://www.genomesonline.org 69 Tettelin H, Saunders NJ, Heidelberg J, Jeffries AC, Nelson KE et al. Complete genome secuence of N. meningitidis serogroup B strain MC58. Science. 2000; 287: 1809–1815. Antecedentes bibliográficos 34 incluían diferentes tipos de proteínas de acuerdo con su posible localización en la superficie bacteriana: proteínas de membrana externa o secretadas, lipoproteínas, proteínas de membrana interna, proteínas periplasmáticas y proteínas que presentan homología con factores involucrados en la virulencia y patogénesis. 70 Las ORFs fueron amplificadas por PCR y clonadas en E.coli con el fin de expresar cada gen como una proteína de fusión. Las proteínas expresadas con éxito fueron purificadas y utilizadas para la inmunización de ratones, observándose que algunas estaban expuestas en la superficie celular y eran capaces de inducir anticuerpos con actividad bactericida. Mientras que la mayoría de los antígenos identificados de modo convencional mostraban variabilidad entre cepas o eran expresados únicamente por algunas de ellas, resultando en la generación de una respuesta inmune dirigida sólo contra las cepas homólogas, no contra las heterólogas, el estudio de los antígenos candidatos seleccionados mediante análisis genómico reveló que la mayor parte de ellos estaban bien conservados, siendo pocos los que presentaban regiones altamente variables. La mayoría de estos antígenos, al ser evaluados en ensayos bactericidas, generaron protección cruzada contra cepas heterólogas. Sorprendentemente, los antígenos detectados mediante métodos genéticos resultaron ser diferentes de los identificados por vacunología tradicional, pues además de las clásicas proteínas de membrana externa con bucles variables aparecían lipoproteínas y proteínas de forma globular expuestas en la superficie que carecen de dominios 70 Pizza M, Scarlato V, Masignani V, Giuliani MM, Arico B et al. Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science. 2000; 287: 1816–1820. Antecedentes bibliográficos 35 transmembrana. Algunos de estos antígenos no se encuentran de forma abundante en la superficie bacteriana. En solo unos años de vacunología reversa se han identificado más candidatos para el desarrollo de una vacuna que en los 40 años previos, de modo que quince de estos nuevos antígenos están ya en una avanzada etapa de investigación, aunque todavía es muy pronto para aventurar cuándo estará disponible una vacuna contra todos los serogrupos del meningococo. 2.4 Vacunas basadas en OMVs de Neisseria lactamica. Tradicionalmente se ha asociado la protección contra la enfermedad meningocócica invasiva con la presencia en el suero de anticuerpos bactericidas contra N. meningitidis, que son adquiridos de modo progresivo a lo largo de los primeros años de vida. 9 Sin embargo, durante este período, el estado de portador de N. meningitidis es raro, por lo que se ha postulado que la adquisición de la inmunidad natural se debe a la colonización de la nasofaringe por especies comensales del género Neisseria y otras bacterias que presentan reactividad cruzada con los meningococos. La evidencia epidemiológica sugiere que N. lactamica podría ser la más importante de las bacterias no patógenas que contribuyen a la adquisición de la inmunidad natural frente a N. meningitidis. Las bacterias de esta especie tienen una significante reactividad cruzada con N. meningitidis, 71 pero carecen de su potencial patógeno debido muy probablemente a su incapacidad para sobrevivir en el torrente 71 Troncoso G, Sánchez S, Moreda M, Criado MT, Ferreirós CM. Antigenic cross-reactivity between outer membrana proteins of N. meningitidis and commensal Neisseria species. FEMS Immunol. Med Microbiol. 2000; 27: 103–109. Antecedentes bibliográficos 36 circulatorio a causa de la ausencia de cápsula. La posibilidad de que el estado de portador de N. lactamica tenga un efecto inhibidor sobre la enfermedad meningocócica ha sido estudiada desde la caracterización organismo en 1969. Se observa que este estado tiene un pico (20%) en el intervalo de edad comprendido entre 0 y 4 años, precediendo a la incidencia reducida de la enfermedad en niños mayores. Gold y colaboradores 72 demostraron que el 66% de los portadores de N. lactamica estudiados desarrollaban anticuerpos bactericidas contra meningococos de los serogrupos A, B y C, siendo estos anticuerpos los responsables de la inmunidad contra la enfermedad meningocócica dependiente de la edad. Se ha observado que una proporción sustancial de los anticuerpos presentes en el suero de pacientes con enfermedad meningocócica pueden ser adsorbidos con proteínas de membrana externa de N. lactamica 73 y que antígenos de N. lactamica protegen a ratones contra la infección experimental. 74,75,76 Esta especie es pues un buen candidato para el desarrollo de una vacuna, pues al imitar el modelo de infección que tiene lugar durante la infancia reforzaría la inmunidad natural, además de ser independiente de serogrupo y serosubtipo. 72 Gold R, Goldschneider I, Lepow ML, Draper TF, Randolph M. Carriage of Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica in infants and children. J Infect Dis. 1978; 137: 112– 121. 73 Maelan J, Wedege E. Serum antibodies to cross-reactive Neisseria outer membrane antigens in healthy persons and patients with meningococcal disease. AMPS. 1989; 97: 774–780. 74 Oliver KJ, Reddin KM, Bracegirdle P, Hudson MJ, Borrow R, et al. Neisseria lactamica protects against experimental meningococcal infection. Infect Immun. 2002; 70: 3621–3626. 75 Bracegirdle P, Oliver K, Reddin K, Cartwright K, Feavers I et al. N. lactamica provides a cross-reactive vaccine against meningococcal disease. En: Proceedings of the 12 th International Pathogenic Neisseria Conference. Rice P. Sparling F. Shafer W. (Eds.) Pág. 46. 2000. HCC Inc. Galveston. 76 Li Y, Zhang Q, Winterbotham M, Mowe E, Gorringe A, Tang CM. Immunization with live Neisseria lactamica protects mice against meningococcal challenge and can elicit serum bactericidal antibodies. Infect Immun. 2006; 74: 6348–6355. Antecedentes bibliográficos 37 Actualmente existe una vacuna basada en OMVs de N. lactamica cuya inmunogenicidad y seguridad están siendo sometidas a un estudio en fase I en voluntarios adultos. 77 La administración de este tipo de vacunas debería plantearse teniendo en cuenta las posibles consecuencias en el desarrollo de la inmunidad natural. 3 Proteínas de membrana externa y su papel en la patogenicidad del meningococo Neisseria meningitidis pertenece al grupo de las bacterias Gram-negativas, caracterizadas por tener una membrana externa que rodea su capa de peptidoglicano y les proporciona una cubierta semipermeable que protege la célula bacteriana. La membrana externa constituye, por tanto, la interfase entre el exterior e interior de la célula y como tal, contiene numerosos tipos de proteínas críticos para la actividad biológica, como son las de transporte o las formadoras de canales. Además, la superficie del meningococo es la parte con la que éste contacta más íntimamente con el huésped, de manera que las proteínas de membrana van a ser importantes en los procesos de colonización, invasión y patogénesis. Estas proteínas también son relevantes desde el punto de vista médico, pues pueden ser reconocidas en el microorganismo intacto y servir como blancos para la respuesta inmune protectiva. Estructuralmente, las proteínas de membrana externa pueden ser de dos tipos: lipoproteínas, que están ancladas a la membrana externa por su zona lipídica N-terminal o proteínas integrales, que contienen regiones transmembrana. 77 Gorringe A, Halliwell D, Matheson M, Reddin K, Finney M, Hudson M. The development of a meningococcal disease vaccine based on Neisseria lactamica outer membrane vesicles. Vaccine. 2005; 23: 2210–2203. Antecedentes bibliográficos 38 3.1 Proteínas de autotransporte El análisis del secretoma predicho de N. meningitidis revela que los autotransportadores son la clase más importante de proteínas secretadas en esta bacteria. 78 Son proteínas modulares consistentes en una secuencia señal N-terminal, un dominio secretado pasajero y un dominio translocador C-terminal. 79,80 La secuencia señal dirige a la proteína hacia la maquinaria SEC para su transporte a través de la membrana interna 81 y el segmento translocador C-terminal media el paso del dominio pasajero formando una β-lámina a través de la membrana externa en un proceso que requiere la intervención de la proteína Omp85. 82 Al alcanzar la superficie celular, los pasajeros se liberan de forma autocatalítica y son secretados al medio, donde suelen llevar a cabo funciones relacionadas con la patogénesis. 83 Hasta el momento se han estudiado 7 autotransportadores: 84 - La IgA1 proteasa es una serina proteasa codificada por el gen iga. Esta proteína rompe específicamente la inmunoglobulina A1 humana, lo que sugiere la existencia de una vía funcional en la que 78 van Ulsen P, Adler B, Fassler P, Gilbert M, van Schilfgaarde M, et al. A novel phasevariable autotransporter serine protease, AusI, of Neisseria meningitidis. Microbes Infect. 2006; 8: 2088–2097. 79 Pohlner J, Halter R, Beyreuther K, Meyer TF. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature 1987; 325: 458–462. 80 Henderson IR, Navarro-Garcia F, Desvaux M, Fernandez RC, Ala’Aldeen D. Type V secretion pathway: the autotransporter story. Microbiol Mol Biol Rev. 2004; 68: 692–744. 81 Sijbrandi R, Urbanus ML, ten Hagen-Jongman CM, Bernstein HD, Oudega B et al. Signal recognition particle (SRP)-mediated targeting and Sec-dependent translocation of an extracellular Escherichia coli protein. J Biol Chem. 2003; 278: 4654–4659. 82 Voulhoux R, Bos MP, Geurtsen J, Mols M, Tommassen J Role of a highly conserved bacterial protein in outer membrane protein assembly. Science. 2003; 299: 262–265. 83 Henderson IR, Nataro JP. Virulence functions of autotransporter proteins. Infect Immun. 2001; 69: 1231–1243. 84 van Ulsen P, Tommassen J. Protein secretion and secreted proteins in pathogenic Neisseriaceae. FEMS Microbiol Rev. 2006; 30: 292–319. Antecedentes bibliográficos 39 las IgA1 proteasas protegen a la bacteria del sistema inmune. 85,86 Además es capaz de romper otras proteínas 87,88,89 y de provocar la producción de citoquinas como TNFα, IL-1β e IL6, lo que indica que su papel en la patogénesis y mantenimiento del estado de portador puede ser importante. - autA y autB codifican homólogos de la adhesina AIDA-1 de E. coli. - App es una proteína transportadora de tipo serina proteasa 90 altamente conservada en las cepas patógenas. Existen evidencias de su comportamiento como adhesina e implicación en la interacción inicial entre el meningococo y las células epiteliales. 91 - NhhA también es una presunta adhesina altamente conservada que forma oligómeros en la membrana externa. 92 - La proteasa NalP tiene su función en el procesamiento de la IgA proteasa y de App, las principales proteínas de secreción de Neisseria meningitidis. 85 Weiser, JN, Bae D, Fasching C, Scamurra RW, Ratner AJ et al. Antibody-enhanced pneumococcal adherence requires IgA1 protease. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 4215– 4220. 86 Kilian M, Reinholdt J, Lomholt H, Poulsen K, Frandsen EV. Biological significance of IgA1 proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evaluation of experimental evidence. APMIS. 1996; 104: 321–338. 87 Hauck CR , Meyer TF. The lysosomal/phagosomal membrane protein h-lamp -1 is a target of the IgA1 protease of Neisseria gonorrhoeae. FEBS Lett. 1997; 405: 86–90. 88 Lin L, Ayala P, Larson J, Mulks M, Fukuda M et al. The Neisseria type 2 IgA1 protease cleaves LAMP1 and promotes survival of bacteria within epithelial cells. Mol Microbiol. 1997; 24: 1083–1094. 89 Senior BW,Stewart WW,Galloway C, Kerr MA. Cleavage of the hormone human chorionic gonadotropin, bythe Type 1 IgA1 protease of Neisseria gonorrhoeae, and its implications. J Infect Dis. 2001; 184: 922–925. 90 Hadi HA, Wooldridge KG, Robinson KR, Ala'Aldeen DAA. Identification and characterization of App: an immunogenic autotransporter protein of Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 2001; 41: 611–623. 91 Serruto D, Adu-Bobie J, Scarselli M, Veggi D, Pizza M et al. Neisseria meningitidis App, a new adhesin with autocatalytic serine protease activity. Mol Microbiol. 2003; 48: 323–334. 92 Peak IRA, Srikhanta Y, Dieckelmann M, Moxon ER, Jennings MP. Identification and characterisation of a novel conserved outer membrane protein from Neisseria meningitidis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2000; 28: 329–334. Antecedentes bibliográficos 46 neutrófilos 128 y CD4+. 129 Estas proteínas constituyen una clase capaz de mostrar distinto tropismo y reacciones específicas con diferentes tipos de células del huésped 130,131 por su alta diversidad debida a variación antigénica y de fase, 132,133 recombinación entre loci dentro del propio genoma y por transformación genética horizontal. 134,135 • Las Opc presentan homología débil con las Opa. El gen opc aparece en muchas cepas de meningococos, pero no en todas ellas y está asociado a la virulencia de las mismas. Este gen sufre variación clonal por mutación que provoca cambios en el nivel de expresión. Su expresión en meningococos no encapsulados le confiere a la bacteria la capacidad de adherirse e invadir células endoteliales independientemente de Opa y pili. 136 La Opc puede 128 Belland RJ, Chen T, Swanson T, Fischer SH. Human neutrophil response to recombinant neisserial Opa proteins. Mol Microbiol. 1992; 6: 1729–1737. 129 Boulton IC, Gray-Owen SD. Neisserial binding to CEACAM1 arrests the activation and proliferation of CD4+ T lymphocytes. Nat Immunol. 2002; 3: 229–236. 130 Moore J, Bailey SE, Benmechernene Z, Tzitzilonis C, Griffiths NJ et al. Recognition of saccharides by the OpcA, OpaD, and OpaB outer membrane proteins from Neisseria meningitidis. J Biol Chem. 2005; 280: 31489–31497. 131 Muenzner P, Dehio C, Fujiwara T, Achtman M, Meyer TF et al. Carcinoembryonic antigen family receptor specificity of Neisseria meningitidis Opa variants influences adherence to and invasion of proinflammatory cytokine-activated endothelial cells. Infect Immun. 2000; 68: 3601–3607. 132 Kawula TH, Aho EL, Barritt DS, Klapper DG, Cannon JG. Reversible phase variation of expression of Neisseria meningitidis class 5 outer membrane proteins and their relationship to gonococcal proteins II. Infect Immun. 1988; 56: 380–386. 133 Stern A, Meyer TF. Common mechanism controlling phase and antigenic variation in pathogenic neisseriae. Mol Microbiol. 1987; 1: 5–12. 134 Hobbs MM, Seiler A, Achtman M, Cannon JG. Microevolution within a clonal population of pathogenic bacteria: recombination, gene duplication and horizontal genetic exchange in the opa gene family of Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 1994; 12: 171–180. 135 Hobbs MM, Malorny B, Prasad P, Morelli G, Kusecek B et al. Recombinational reassortment among opa genes from ET-37 complex Neisseria meningitidis isolates of diverse geographical origins. Microbiology. 1998; 144:157–166. 136 Virji M, Makepeace K, Ferguson DJ, Achtman M, Moxon ER. Meningococcal Opa and Opc proteins: their role in colonization and invasion of human epithelial and endothelial cells. Mol Microbiol. 1993; 10: 499–510. Antecedentes bibliográficos 47 unir indirectamente vitronectina para formar un puente molecular entre la bacteria y el receptor de la integrina en la superficie celular. 3.5 Otras proteínas • La proteína de Clase 4, también llamada proteína modificable por reducción, RmpM, 137 cuyo Pm es de 32-34 kDa. Normalmente se encuentra asociada a otras proteínas, funcionando como estabilizador de los complejos receptores de lactoferrina (LbpA), transferrina (TbpA) y sideróforos 138 (FrpB), así como de los trímeros que forman in vivo PorA y PorB, 120 en los que la unión de esta proteína es esencial para la fijación del complejo a la membrana. Estructuralmente, la RmpM es homóloga a la OmpA de E. coli, aunque carece del dominio β-barril terminal de unión a membrana. Tiene un dominio de unión a peptidoglicano en Cterminal cuya función parece ser la unión de la membrana externa a la capa de peptidoglicano, 139 que parece tener un papel fundamental en la localización y estabilización en membrana de PorA, PorB y otras proteínas de membrana externa. 137 Klugman KP, Gotschlich EC, Blake MS. Sequence of the structural gene (rmpM) for the class 4 outer membrane protein of Neisseria meningitidis, homology of the protein to gonococcal protein III and Escherichia coli OmpA, and construction of meningococcal strains that lack class 4 protein. Infect Immun. 1989; 57: 2066–2071. 138 Prinz T, Tommassen J. Association of iron-regulated outer membrane proteins of Neisseria meningitidis with RmpM (class 4) protein. FEMS Microbiol Lett. 2000; 183: 49–53. 139 Grizot S, Buchanan SK. Structure of the OmpA-like domain of RmpM from Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 2004; 51: 1027–1037. Antecedentes bibliográficos 48 La RmpM es un buen candidato para el desarrollo de vacunas, pues se ha propuesto su implicación en la patogénesis del meningococo, 140 aunque también aparece en cepas comensales 141 y aunque en principio se consideró que los anticuerpos específicos contra ella que podían bloquear la actividad bactericida de los anticuerpos dirigidos contra las proteínas de clase 1, 2 y 3 afectando negativamente a la inmunogenicidad de las vacunas basadas en proteínas de membrana externa, 142 en trabajos posteriores se demostró que no existe tal bloqueo. 143 • La Omp85 juega un papel directo en el ensamblaje de proteínas 82,144 y, posiblemente, lípidos 145,146 de membrana externa. Es una proteína de unos 88 kDa, evolutivamente conservada y presente en el genoma de todos los Gram-negativos 140 Wolff K, Stern A. Identification and characterization of specific sequences encoding pathogenicity associated proteins in the genome of commensal Neisseria species. FEMS Microbiol Lett. 1995; 125: 255–264. 141 Troncoso G, Sánchez S, Kolberg J, Rosenqvist E, Veiga M et al. Analysis of the expression of the putatively virulence-associated neisserial protein RmpM (class 4) in commensal Neisseria and Moraxella catarrhalis strains. FEMS Microbiol Lett. 2001; 199: 171–176. 142 Munkley A, Tinsley CR, Virji M, Heckels JE. Blocking of bactericidal killing of Neisseria meningitidis by antibodies directed against class 4 outer membrane protein. Microb Pathog. 1991; 11: 447–452. 143 Rosenqvist E, Musacchio A, Aase A, Høiby A, Namork E et al. Functional activities and epitope specificity of human and murine antibodies against the class 4 outer membrane protein (rmp) of Neisseria meningitidis. Infect Immun. 1999; 67: 1267–1276. 144 Wu T, Malinverni J, Ruiz N, Kim S, Silhavy TJ et al. Identification of a multicomponent complex required for outer membrane biogenesis in Escherichia coli. Cell. 2005; 121: 235– 245. 145 Genevrois S, Steeghs L, Roholl P, Letesson JJ, van der Ley P. The Omp85 protein of Neisseria meningitidis is required for lipid export to the outer membrane. EMBO J. 2003; 22: 1780–1789. 146 Doerrler WT, Raetz CR. Loss of outer membrane proteins without inhibition of lipid export in an Escherichia coli YaeT mutant. J Biol Chem. 2005; 280: 27679–27687. Antecedentes bibliográficos 49 secuenciados hasta el momento 147 y en las mitocondrias de las células eucariotas. • PilQ: Es una proteína integral de membrana externa de Pm en torno a 80 kDa perteneciente a la superfamilia GSP de secretinas 148 que interviene en el proceso de ensamblaje de los pili tipo IV permitiendo su translocación a través de la membrana externa mediante un mecanismo activo que implica la existencia de una respuesta dinámica por interacción con la sustancia secretada. 149 • Proteínas que forman parte de sistemas de transporte. o Las TpsB son proteínas integrales de membrana externa con un peso molecular aproximado de 60 kDa con estructura en βbarril 150,151 que forman complejos tetraméricos. 152 Pertenecen a la subclase de las TpsBs secretoras de hemolisina/citolisina 153 y forman parte del mecanismo de secreción TPS, específico para proteínas y péptidos de gran tamaño. 147 Bredemeier R, Schlegel T, Ertel F, Vojta A, Borissenko L et al. Functional and phylogenetic properties of the pore-forming beta-barrel transporters of the Omp85 family. J Biol Chem. 2007; 282: 1882–1890. 148 Pugsley AP. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev. 1993; 57: 50–108. 149 Collins RF, Frye SA, Balasingham S, Ford RC, Tonjum T et al. Interaction with type IV pili induces structural changes in the bacterial outer membrane secretin PilQ. J Biol Chem. 2005; 280: 18923–18930. 150 Guédin S, Willery E, Tommassen J, Fort E, Drobecq H et al. Novel topological features of FhaC, the outer membrane transporter involved in the secretion of the Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin. J Biol Chem. 2001; 275: 30202–30210. 151 Könninger UW, Hobbie S, Benz R, Braun V. The haemolysin-secreting ShlB protein of the outer membrane of Serratia marcescens: determination of surface-exposed residues and formation of ion-permeable pores by ShlB mutants in artificial lipid bilayer membranes. Mol Microbiol. 1999; 32: 1212–1225. 152 Surana NK, Grass S, Hardy GG, Li H, Thanassi DG et al. Evidence for conservation of architecture and physical properties of Omp85–like proteins throughout evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 14497–14502. 153 Jacob-Dubuisson F, Locht C, Antoine R Two-partner secretion in Gram-negative bacteria: a thrifty, specific pathway for large virulence proteins. Mol Microbiol. 2001; l: 306–313. Antecedentes bibliográficos 50 o Los sistemas de secreción de tipo I requieren una maquinaria compuesta por multímeros de tres proteínas: Una proteína integral de membrana externa, un transportador ABC y un adaptador o proteína de fusión de membrana anclada en la membrana interna y con un gran dominio periplásmico. 154,155 Esta maquinaria atraviesa toda la envoltura celular, de modo que la secreción ocurre en un único paso, directamente desde el citoplasma al medio intercelular. • Laz (lipid-modified azurin): 156 La azurina es una proteína pequeña (17 kDa) y azul que contiene cobre en su estructura y que actúa en el transporte de electrones durante la respiración en varios microorganismos. En N. meningitidis, Laz está anclada a la membrana externa por el ácido graso palmitil y posee un dominio N-terminal que coincide con el encontrado en la proteína H.8, 157,158 que es común a todas las Neisseria patógenas 159 . La función de las Laz es controvertida. Se sabe que no son esenciales para el crecimiento y que están implicadas en la respuesta contra el stress provocado por H 2 O 2 mediante un 154 Delepelaire P. Type I secretion in Gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta. 2004; 1694: 149–161. 155 Young J , Holland IB. ABC transporters: bacterial exporters – revisited five years on. Biochem Biophys Acta. 1999; 1461: 177–200. 156 Woods JP, Dempsey JF, Kawula TH, Barritt DS, Cannon JG. Characterization of the neisserial lipid-modified azurin bearing the H.8 epitope. Mol Microbiol. 1989; 3: 583–591. 157 Gotschlich EC, Seiff ME. Identification and gene structure of an azurin-like protein with a lipoprotein signal peptide in Neisseria gonorrhoeae. FEMS Microbiol Lett. 1987; 43: 253–255. 158 Kawula TH, Spinola SM, Klapper DG, Cannon JG. Localization of a conserved epitope and an azurin-like domain in the H.8 protein of pathogenic Neisseria. Mol Microbiol. 1987. 1: 179–185. 159 Cannon JG. Conserved lipoproteins of pathogenic Neisseria species bearing the H.8 epitope: lipid-modified azurin and H.8 outer membrane protein. 1989. Clin Microbiol Rev. 2: S1–S4. Antecedentes bibliográficos 51 mecanismo desconocido. 160 Estudios recientes han sugerido la posibilidad de que el epitopo H.8 pueda tener alguna función en la ruptura de la barrera hematoencefálica durante el proceso de infección. 161 3.6 Papel en el funcionamiento celular de las interacciones entre proteínas de membrana externa Las proteínas de membrana externa están en contacto estrecho con los lípidos, formando complejos con ellos. En muchos casos, estas proteínas forman además otro tipo de complejos en cuya composición intervienen distintas subunidades proteicas y cofactores y que se denominan complejos de proteínas de membrana externa. Se ha estimado que en torno a un 80% de las proteínas 162 ejercen su función por medio de interacciones estables o transitorias con otras proteínas formando complejos proteicos homoo heterooligoméricos. Esta característica puede atribuirse al llamado “abarrotamiento macromolecular” existente en el interior de las células, donde entre el 20 y el 30% del volumen intracelular está ocupado por macromoléculas que no son directamente accesibles por otras macromoléculas, lo que favorece la interacción entre macromoléculas y su segregación en distintos compartimentos. 163,164 Estas características son especialmente relevantes en 160 Wu HJ, Seib KL, Edwards JL, Apicella MA, McEwan AG et al. Azurin of pathogenic Neisseria spp. is involved in defense against hydrogen peroxide and survival within cervical epithelial cells. Infect Immun. 2005; 73: 8444–8448 161 Hong CS, Yamada T, Hashimoto W, Fialho AM, Das Gupta TK et al. Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: the role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein. Cell Cycle. 2006; 5: 1633–41. 162 Berggård T, Linse S, James P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 2007; 7: 2833–2842. 163 Zimmerman SB, Minton AP. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1993; 22: 27–65. Antecedentes bibliográficos 52 las membranas biológicas, pues son los compartimentos celulares en los que hay una mayor concentración de biomoléculas. 165,166 Los complejos supramoleculares en los que dos o más proteínas separadas que se unen de forma permanente o transitoria son elementos regulatorios importantes. En algunos casos, el complejo resultante no sólo es la suma de las proteínas que lo forman, sino que el ensamblaje es necesario para que éste lleve a cabo su función, mientras que en otros casos la unión es favorable, pero no obligatoria. La organización de las proteínas funcionalmente ligadas en complejos parece ser un principio general debido a sus importantes ventajas funcionales. Se han estudiado numerosos complejos de proteínas de membrana importantes para el metabolismo celular, tal es el caso de los implicados en la cadena de transporte electrónico mitocondrial (complejos I, II, III, IV y V), en la fotosíntesis (fotosistemas I Y II, complejo antena) o en el metabolismo del nitrógeno (complejos de la nitrogenasa, complejo transportador de nitrato, complejo fijador de nitrógeno) entre otros. Las interacciones transitorias entre proteínas también están relacionadas con procesos de regulación y de transporte de proteínas a través de la membrana. El estudio de este tipo de complejos es mucho más difícil debido a que todas las proteínas y condiciones necesarias para la formación del complejo han de ser identificadas de modo previo a la caracterización del mismo. 164 Ellis RJ. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 2001; 26: 597–604. 165 Vereb G, Szöllosi J, Matkó J, Nagy P, Farkas T et al. Dynamic, yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 8053–8058. 166 Gilkerson RW, Selker JM, Capaldi RA. The cristal membrane of mitochondria is the principal site of oxidative phosphorylation. FEBS Lett. 2003; 546: 355–358. Objetivos e interés del trabajo. Objetivos e interés 55 La enfermedad meningocócica es todavía un serio problema para la salud pública, ya que pese al éxito obtenido con la vacuna polisacarídica conjugada de serogrupo C, introducida en el Reino Unido a finales de 1999 e incluida en el calendario vacunal infantil en España en el año 2000, no existe ninguna vacuna efectiva para la prevención de la enfermedad meningocócica de serogrupo B, causante de la mayoría de los casos en Europa. El polisacárido capsular de serogrupo B es poco inmunogénico y genera autotolerancia como consecuencia de su similitud con el ácido polisiálico presente en las células neuronales humanas. Este hecho ha centrado la búsqueda de una vacuna contra dicho serogrupo en las proteínas de la membrana externa, y en especial, en las proteínas de Clase 1 o PorA. Según se ha descrito hasta el momento, se trata de porinas que se agrupan en la superficie de la membrana externa formando poros compuestos por homotrímeros, probablemente estabilizados por la presencia de la proteína de Clase 4 o RmpM. Al igual que en el caso de las PorA, las proteínas de Clase 3 o PorB también se encontrarían en la superficie bacteriana formando poros a modo de complejos homotriméricos. El estudio de la estructura de estos complejos ha sido realizado prácticamente en su totalidad empleando cepas mutantes o mediante la expresión en forma de proteínas de fusión, técnica que precisa de un proceso de desnaturalizaciónrenaturalización. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, parecen indicar que en las cepas no modificadas genéticamente, estas proteínas se encuentran en realidad formando únicamente poros heterotriméricos, es decir poros en los que junto con la RmpM están presentes los dos tipos de porinas. Este hecho no es trivial, ya que las asociaciones que se produzcan pueden determinar la formación de epitopos no lineales que serían muy importantes, puesto que se ha comprobado que los conformacionales o los compartidos son de gran relevancia en el desarrollo de la respuesta inmunitaria. Un mayor conocimiento de la Capítulo I 62 para el análisis proteómico. 169 Tras la separación, la identificación de las proteínas puede realizarse utilizando diversos métodos, como el uso de anticuerpos específicos, la comparación de las posiciones, análisis de la composición aminoacídica o la espectrometría de masas. La existencia de programas informáticos que permiten la comparación de imágenes de 2D-PAGE facilita la identificación y cuantificación de manchas de proteínas en diferentes muestras a la vez que permite el procesamiento de grandes cantidades de geles. La aplicación principal de la 2D-PAGE es la proteómica de expresión. En esta aproximación, la expresión de proteínas de dos muestras se puede comparar de forma cualitativa y cuantitativa. La aparición o desaparición de manchas proporciona información sobre la expresión diferencial de proteínas mientras que la intensidad de las mismas permite conocer sus niveles de expresión. Para realizar estos estudios se pueden utilizar tanto organismos completos como líneas celulares o fluidos biológicos. Este método de trabajo permite la comparación de tejidos normales con tejidos enfermos o la de células tratadas con drogas o sometidas a diferentes estímulos. Otra aplicación importante es la proteómica del mapa celular, donde la 2D-PAGE se utiliza para hacer mapas de proteínas de microorganismos, orgánulos celulares y complejos de proteínas. El mayor problema de este método a la hora de llevar a cabo análisis de proteínas de membrana radica en que presenta un sesgo 169 Righetti PG. The Alpher, Bethe and Gamow of IEF, the alpha-Centaury of electrokinetic methodologies. Part II: immobilized pH gradients. Electrophoresis. 2007; 28: 545–555. Capítulo I 63 importante respecto a las proteínas hidrofóbicas, de modo que la eficiencia de la separación disminuye al aumentar la hidrofobicidad. 170 Este efecto se debe a que los de detergentes iónicos fuertes, capaces de solubilizar este tipo de proteínas, son incompatibles con la técnica porque la presencia de altas concentraciones de iones interfiere en la migración de las proteínas en los geles IPG. Para evitar este problema, el tampón de solubilización utilizado para el IEF lleva urea y tiourea como agentes caotrópicos y detergentes no cargados o zwiteriónicos, 171,172 que no son los más adecuados para su utilización con proteínas de membrana pues tanto su capacidad para extraerlas del entorno lipídico como para mantener su solubilidad es menor que la de los detergentes iónicos. Otro factor a tener en cuenta es que la solubilidad de las proteínas disminuye cuando nos acercamos a su punto isoeléctrico, provocando la agregación y precipitación de las proteínas durante el isoelectroenfoque y obstaculizando la transferencia desde la matriz IPG al gel de la segunda dimensión, lo que ocasiona la pérdida de proteínas y dificulta su correcta visualización, cuantificación e identificación. 173 Se han realizado múltiples estudios en los que se intenta disminuir estos efectos mediante la utilización de distintas aproximaciones, 170 Santoni V, Molloy M, Rabilloud T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 2000; 21: 1054–1070. 171 Görg A, Obermaier C, Boguth G, Harder A, Scheibe B et al. The current state of twodimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 2000; 21: 1037– 1053 172 Görg A, Weiss W, Dunn MJ. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 2004; 4: 3665–3685. 173 Klein C, Garcia-Rizo C, Bisle B, Scheffer B, Zischka H et al. The membrane proteome of Halobacterium salinarum. Proteomics. 2005; 5: 180–197. Capítulo I 64 comprobándose que el uso de detergentes como el Triton X-100, Ndodecyl-ß-D-maltosido o ASB14, la deslipidación, 174 el enriquecimiento a partir de muestras complejas mediante distintos métodos, 175 su prefraccionamiento en membranas isoeléctricas 176 o el uso de tiras IPG con un tamaño de poro grande 177 permiten aumentar la resolución. También se ha probado la utilización técnicas de IEF alternativas que no utilizan matrices hidrofóbicas de poliacrilamida, tal es el caso de la FF-IEF (free-flow IEF) 178 o la electroforesis capilar. 179 Aunque ninguna de estas aproximaciones resuelve totalmente el problema, y éste es especialmente patente en las proteínas muy hidrofóbicas con tres o más regiones transmembrana, 175,172 con estas modificaciones el método resulta adecuado para la separación de las proteínas asociadas a la membrana o de las proteínas menos hidrofóbicas, por lo que ha sido utilizado con frecuencia para el análisis del proteoma de membrana externa de bacterias, 180 donde la proporción de proteínas tipo porina, con estructura en β-barril y menor hidrofobicidad, es alta. 174 Zhang L, Xie J, Wang X, Liu X, Tang X et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 2005; 5: 4510–4524. 175 Mattow J, Siejak F, Hagens K, Schmidt F, Koehler C et al. An improved strategy for selective and efficient enrichment of integral plasma membrane proteins of mycobacteria. Proteomics. 2007; 7: 1687–1701. 176 Pedersen SK, Harry JL, Sebastian L, Baker J, Traini MD et al. Unseen proteome: mining below the tip of the iceberg to find low abundance and membrane proteins. J Proteome Res. 2003; 2: 303–311. 177 Bruschi M, Musante L, Candiano G, Ghiggeri GM, Herbert B et al. Soft immobilized pH gradient gels in proteome analysis: a follow-up. Proteomics. 2003; 3: 821–825. 178 Obermaier C, Jankowski V, Schmutzler C, Bauer J, Wildgruber R et al. Free-flow isoelectric focusing of proteins remaining in cell fragments following sonication of thyroid carcinoma cells. Electrophoresis. 2005; 26: 2109–2116. 179 Busnel JM, Varenne A, Descroix S, Peltre G, Gohon Y et al. Evaluation of capillary isoelectric focusing in glycerol-water media with a view to hydrophobic protein applications. Electrophoresis. 2005; 26: 3369–3379. 180 Braun RJ, Kinkl N, Beer M, Ueffing M. Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins. Anal Bioanal Chem. 2007; 389: 1033–1045. Capítulo I 65 En el caso concreto de N. meningitidis serogrupo B, la aproximación por 2D-PAGE ha sido utilizada tanto para la elaboración de un mapa de referencia extensivo 181 como en diversos intentos para dilucidar el repertorio de proteínas de membrana destinados a la identificación de candidatos vacunales. 182,183 Este método también se utiliza para el análisis de la composición de vacunas basadas en OMVs. 184 En este estudio pretendemos utilizar la separación por 2D IEF/SDS-PAGE para elaborar mapas proteómicos e inmunoproteómicos y para la consiguiente identificación de las proteínas de membrana externa en las cepas indicadas en la tabla 3. 181 Schauder S, Penna L, Ritton A, Manin C, Parker F et al. Proteomics analysis by twodimensional differential gel electrophoresis reveals the lack of a broad response of Neisseria meningitidis to in vitro-produced AI-2. J Bacteriol. 2005; 187: 392–395. 182 Vaughan TE, Skipp PJ, O'Connor CD, Hudson MJ, Vipond R et al. Proteomic analysis of Neisseria lactamica and Neisseria meningitidis outer membrane vesicle vaccine antigens. Vaccine. 2006; 24: 5277–5293. 183 Post DM, Zhang D, Eastvold JS, Teghanemt A, Gibson BW et al. Biochemical and functional characterization of membrane blebs purified from Neisseria meningitidis serogroup B. J Biol Chem. 2005; 280: 38383–38394 184 Uli L, Castellanos-Serra L, Betancourt L, Domínguez F, Barberá R et al. Outer membrane vesicles of the VA-MENGOC-BC vaccine against serogroup B of Neisseria meningitidis: Analysis of protein components by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics. 2006; 6: 3389–3399. Capítulo I 67 2. Material y métodos 2.1 Cepas bacterianas, origen, características, conservación y cultivo. 2.1.1 Cepas bacterianas: Origen y características. Las cepas bacterianas del género Neisseria utilizadas en el presente estudio (tabla 3) proceden de la colección del Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia (Universidad de Santiago de Compostela). La cepa N. meningitidis Nm30 fue aislada del líquido cefalorraquídeo de un paciente del antiguo Hospital Xeral de Santiago; las cepas N. meningitidis B16B6 y M982 son cepas tipo ampliamente utilizadas en la investigación del meningococo; N. meningitidis 2851 (H44/76) es una cepa aislada a partir de un paciente con enfermedad meningocócica invasiva. 185 El Instituto Nacional Noruego de Salud Pública (NIPH) ha desarrollado una vacuna monovalente contra el serogrupo B basada en OMVs de esta cepa (MenBvac). 43 En este estudio se utilizaron varios mutantes “knock-out” de esta cepa que no expresan la proteína PorA (3050), la PorB (3103), la RmpM (2851 RmpM-) o la FetA (3043). La cepa salvaje y los mutantes PorA-, PorBy FetAfueron amablemente cedidos por el Dr. IM Feavers (Division of Bacteriology, National Institute for Biological Standards and Control, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, United Kingdom.), y el mutante para RmpM fue cedido por el Dr. E. Rosenqvist (Division of Infectious Disease Control, Norwegian Institute of Public Health (NIPH), P.O. Box 4404, Nydalen, N0403 Oslo, Norway). La cepa N. meningitidis 3059 y sus mutantes (3091 y 3094) también fueron cedidas por el Dr. IM Feavers. 185 Holten E. Serotypes of Neisseria meningitidis isolated from patients in Norway during the first six months of 1978. J Clin Microbiol. 1979; 9: 186–188. Capítulo I 68 Las cepas de N. lactamica NlP0, NlP2 y NlP5 proceden de la orofaringe de individuos sanos de nuestra Comunidad Autónoma. Todas las cepas fueron identificadas en su momento por los métodos habituales: morfología de las colonias, prueba de la oxidasa, tinción de Gram y pruebas de fermentación de azúcares en medio agar base de tripticasa-cistina (Difco Laboratories, Detroit, MI, Estados Unidos) con glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa y fructosa. La caracterización de las cepas de N. meningitidis (serogrupado, serotipado, serosubtipado y MLST) se realizó en el Laboratorio de Referencia de Meningococos del Centro Nacional de Microbiología, Virología e Inmunología Sanitarias Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda (Madrid). La caracterización de las cepas de N. lactamica se realizó empleando los sistemas de identificación API. Capítulo I 69 Tabla 3: Características de las cepas estudiadas Especie Cepa Origen Serogrupo Serotipo/ subtipo ST/ Complejo clonal N. meningitidis B16B6 Cepa de referencia B 2a:P1.2 ST-11, ET-37 N. meningitidis M982 Cepa de referencia B 9:P1.9 ST-5 N. meningitidis Nm30 LCR C 2b:P1.2 ST-8, A4 N. meningitidis 2851 H44/76 B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 N. meningitidis 3050 Mutante Knock-out (2851 PorA-) B 15: (-) ST-32,ET-5 N. meningitidis 3103 Mutante Knock-out (2851 PorB-) B (-):P1.7,16 ST-32,ET-5 N. meningitidis 3043 Mutante Knock-out (2851 FetA-) B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 N. meningitidis 2851 RmpM - Mutante Knock-out (2851 RmpM-) B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 N. meningitidis 3059 B NT:P1.22, 9 ST-275, Burst 1 N. meningitidis 3091 Mutante Knock-out (3059 PorA-) B NT: (-) ST-275, Burst 1 N. meningitidis 3094 Mutante Knock-out (3059 Por B-) B (-):P1.22,9 ST-275, Burst 1 N. lactamica NlP0 Orofaringe N.A N.A N. lactamica NlP2 Orofaringe N.A N.A N. lactamica NlP5 Orofaringe N.A N.A 2.1.2 Conservación. Las cepas se conservaron en leche descremada estéril al 10% (p/v) a -80º C, para lo cual se hizo un césped en una placa de ChocIso a partir de una colonia aislada y se cultivó a 37º C con un 5% CO 2 durante 8 horas, tras las cuales el cultivo fue resuspendido en leche descremada y distribuido en alícuotas de 300 µl. Capítulo I 70 2.1.3 Condiciones de cultivo. Tras la descongelación a temperatura ambiente del vial correspondiente a cada cepa se procedió a su aislamiento en placas de medio Choc-Iso (medio GC agar base, hemoglobina al 1% (p/v) y Biovitex al 1% [Biolife, Milán, Italia] (McGee et al, 1979) 186 que fueron incubadas durante 24 horas a 37º C en presencia de CO 2 al 5%. A partir de una colonia aislada se sembró un césped en una placa de este mismo medio y se mantuvo 8 horas en idénticas condiciones. El césped se utilizó posteriormente para preparar una suspensión bacteriana densa (con valores de absorbancia a 540 nm comprendidos entre 1.6 y 1. 8) en medio Mueller-Hinton líquido (Oxoid, Unipath Ltd, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido). La suspensión se utilizó para inocular medio Mueller-Hinton en el que previamente se habían inducido condiciones de restricción de hierro mediante la adición de desferal (deferoxamina mesilato, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos) a una concentración final de l µM. Los matraces Erlenmeyer de 1L de capacidad conteniendo 400 ml de cultivo se incubaron durante 1214 h a 37º C con agitación de 100 rpm. 2.2 Extracción de vesículas de membrana externa (OMVs). Durante la fase logarítmica de su crecimiento, el meningococo sintetiza una mayor cantidad de membrana originando unas estructuras a modo de vesículas que son liberadas de la superficie externa de la bacteria hacia el medio circundante. La forma y tamaño varían dependiendo de la cepa, pudiendo aparecer desde pequeñas vesículas 186 McGee ZA, Street CH, Chappell CL, Cousar ES, Morris F et al. Pili of Neisseria meningitidis: effect of media on maintenance of piliation, characteristics of Pili, and colonial morphology. Infect Immun. 1979; 24: 194–201. Capítulo I 71 redondas de aproximadamente 25 nm de diámetro hasta grandes estructuras tubulares. Al estar formadas por membrana externa, las OMVs se utilizan como fuente para la obtención de las proteínas de la misma. Las vesículas de membrana externa se obtuvieron por extracción con cloruro de litio, según el protocolo descrito por Gómez et al. 187 o bien una utilizando una variación del mismo en que se omite la incubación en cloruro de litio. Los matraces conteniendo las bacterias procedentes del cultivo en medio Mueller-Hinton se incubaron 1 hora a 56º C. Las células se recogieron por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos a 4º C y se resuspendieron en tampón acetato 0.1 M, pH 5.8, conteniendo cloruro de litio 0.2 M, a razón de 5 ml de tampón por gramo de células. Las suspensiones bacterianas resultantes se incubaron a 45º C con una agitación de 100rpm durante 2 horas. En los casos en los que no se utilizó cloruro de litio, el botón celular se resuspendió en agua destilada (4ml por gramo de peso húmedo). A continuación se pasaron 3 veces por la prensa de French a una presión de 16000 lb/in 2 para favorecer la extracción de las vesículas de membrana externa. Los restos celulares se retiraron por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos a 4º C y el sobrenadante se sometió a 20000 x g durante 10 minutos a la misma temperatura. Las OMVs así obtenidas se resuspendieron en agua destilada con dos pulsos de ultrasonidos de 5 segundos cada uno, obteniéndose una solución cuyo contenido en proteína se determinó por 187 Gómez JA, Criado MT, Ferreirós CM. Bactericidal activity of antibodies elicited against the Neisseria meningitidis 37–kDa ferric binding protein (FbPA) with different adjuvants. FEMS Immunol Med Microb. 1997; 20: 79–86. Capítulo I 78 con agua desionizada. En algunos casos se realizaron detecciones secuenciales utilizando distintos sueros. Tabla 4: Dilución de los sueros utilizados. Suero Origen Concentración α-RmpM α-PorA α-Nm30 α-M982 α-P47 ratón ratón ratón ratón conejo 1:500 1:500 1:1000 1:1000 1:500 El suero anti-PorA empleado (9-1-P1.c) reconoce un epitopo conformacional, por lo que es necesario renaturalizar las proteínas una vez transferidas a la membrana, para lo que se utilizó Empigen BB al 0.25% 2.7 Análisis informático de los datos. Los geles y membranas se escanearon utilizando el Bio-Rad GS 800 Calibrated Densiometer (Bio-Rad laboratories, Richmond, CA, Estados Unidos). Para el análisis de las imágenes se utilizó el programa PDQuest versión 7.4.0 de Bio-Rad, con cuyas herramientas se identificaron y enumeraron los puntos correspondientes a las proteínas. Las calidad de las imágenes se mejoró mediante el uso de un filtro que aplica un algoritmo de reducción de ruido de media ponderada (matriz de 3x3 píxeles). Se detectaron los puntos correspondientes a las proteínas y se crearon curvas gausianas para cada uno de ellos. Los mapas proteómicos e inmunoproteómicos de referencia para cada cepa se obtuvieron utilizando al menos tres mapas de OMVs obtenidas en días diferentes. El análisis comparativo de los datos se llevó a cabo utilizando el método más restrictivo de los proporcionados por el programa. El pI y el Pm de Capítulo I 79 las proteínas se aproximaron utilizando los estándares para SDS-PAGE de Bio-Rad, así como una serie de proteínas antigénicas de Pm y pI conocidos. 2.8 Identificación de proteínas por MALDI-TOF. Algunas de las proteínas fueron identificadas mediante análisis por MALDI-TOF de los puntos más relevantes (aquellos claramente visibles y comunes a todas las cepas analizadas), que se cortaron manualmente de los geles bidimensionales teñidos con Coomassie Brilliant Blue y fueron sometidos a digestión tríptica para obtener su huella peptídica mediante espectrometría de masas tipo MALDI-TOF utilizando un espectrómetro de masas con fuente de ionización MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) y analizador tipo tiempo de vuelo (TOF), modelo Voyager DE-STR Biospectrometry Workstation con un Voyager 2 GHz Acquisition System (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) o bien un Bruker Reflex IV (Bruker-Franzen Analytic GmbH, Bremen, Alemania) equipado con analizador reflectron, extracción retardada de iones y software AutoXecute para la adquisición automatizada de espectros. Las secuencias resultantes se compararon con las contenidas en las bases de datos utilizando el programa informático Mascot. 191 Para la interpretación final de los resultados obtenidos en las búsquedas en las bases de datos, el programa utilizó el algoritmo MOWSE, en base a la cantidad y abundancia relativa de los péptidos identificados, obteniéndose la probabilidad asociada a cada una de las proteínas identificadas (MOWSE Score). 191 Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 1999; 20: 3551– 3567. Capítulo I 81 3. Resultados. 3.1 Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE. Identificación por MALDI-TOF. Con el fin de obtener mapas de referencia de proteínas de membrana externa de N. meningitidis y N. lactamica, OMVs de ambas especies fueron tratadas utilizando un protocolo que incluye condiciones de solubilización restrictivas y análisis bidimensional convencional (IEF/SDS-PAGE) 3.1.1 Determinación de las condiciones óptimas de tiempo de IEF, solubilización y gradiente de pI. Debido a los conocidos problemas que existen para la solubilización de proteínas de membrana, se probaron varios tampones conteniendo distintas concentraciones de urea y tiourea, con o sin Tris y con los detergentes SB 3-10, CHAPS o ASB-14 (tabla 5). Al evaluar la solubilización de las proteínas obtenida por los distintos métodos (figura 1) se observa que los mejores resultados se obtienen utilizando como agentes caotrópicos urea y tiourea (5M y 2M), una mezcla de CHAPS al 2% y SB 3-10 al 2% como detergentes y Tris a una concentración 40mM (figura 1 A). También se compararon distintos tipos de rehidratación, activa (50V, 16h a 20ºC) y pasiva (16h a temperatura ambiente), observándose que al utilizar el segundo de los métodos disminuye tanto la cantidad de puntos detectados como su concentración, razón por la cual se utilizó la rehidratación activa (figura 2). En lo que respecta a las condiciones del IEF, la duración del segundo paso de la misma (aumento de voltaje linear de 500 a 4000 V) se varió para comprobar su influencia en el enfoque final. Se utilizaron tiempos de 3, 4 y 5h, observándose que con el más largo Capítulo I 82 se producían fallos de conductividad que llevaban a un mal enfoque de la muestra. Los resultados obtenidos con 3 y 4 h son muy similares, obteniéndose una buena resolución con ambos. Se eligió un tiempo de enfoque de 4h para ser utilizado en experimentos subsiguientes. Utilizando IPG 3-10 se obtiene mejor resolución y focalización de proteínas que con IPG 4-7, además de permitir el análisis de la mayor parte de las proteínas presentes en la muestra en un solo gel. Capítulo I 83 Figura 1: Comparación de las condiciones de solubilización de OMVs de N. meningitidis. Los geles resultantes de la electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE utilizando cuatro tampones de rehidratación diferentes se tiñeron con coomassie. En el gel 1 (A), la muestra se rehidrató con el tampón número 1 * ; en el gel 2 (B), con el tampón 2; en el gel 3 (C) con el tampón número 3 y en el gel 4 (D) con el tampón número 4. La formulación concreta de cada uno de los tampones se presenta en la tabla 5. La primera dimensión se llevó a cabo utilizando tiras IPG pH 4-7 en el gel 2 y pH 3-10 en las demás. La segunda dimensión se realizó en geles de poliacrilamida en gradiente del 7.5 al 15%. * Tampones indicados en la tabla 5. A B C D Capítulo I 84 Tabla 5: Composición detallada de los tampones de solubilización utilizados. Figura 2: Comparación de las condiciones de rehidratación de las tiras IPG. Los geles obtenidos tras la electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE se tiñeron con coomassie. En el gel 1 (A), la rehidratación se llevó a cabo de forma activa (50V ,16h a 20ºC); en el gel 2 (B) se utilizó rehidratación pasiva (16h a temperatura ambiente). El IEF se realizó en tiras IPG pH 3-10 y la segunda en geles de poliacrilamida en gradiente del 9 al 18%. Tampón Urea/ tiourea Detergente Agente reductor Anfolito Sal 1 5M /2M 2% SB 3-10 2% CHAPS 2mM TBP 0.2% 40mM Tris 2 8M 4% CHAPS 2mM TBP 0.2% -- 3 5M /2M 2% SB 3-10 2% CHAPS 2mM TBP 0.2% -- 4 7M / 2M ASB14 2mM TBP 0.5% 40mM Tris B A Capítulo I 85 3.1.2 Análisis proteómico. Una vez determinadas las condiciones óptimas de IEF, el análisis mostró ser altamente reproducible con todas las cepas estudiadas. El programa informático de reconocimiento (PDQuest v. 7.4) detectó una cantidad de puntos que varía entre los 42 de la cepa N. lactamica NlP5 y los 202 de la cepa de N. meningitidis 3043. En los mapas obtenidos (Figuras 3 a 16) puede observarse que las cepas de N. lactamica analizadas presentan como media una cantidad de puntos menor que las de N. meningitidis (Tabla 6). Tabla 6: Número de puntos detectados en mapas bidimensionales de distintas cepas de N. meningitidis y N. lactamica Cepa Nº Puntos B16B6 73 Nm30 98 M982 103 2851 187 3050 (2851 PorA - ) 155 3103 (2851 PorB - ) 179 2851 RmpM166 3043 (2851 FetA - ) 202 3059 125 3091 (3059 PorA - ) 83 N. meningitidis 3094 (3059 PorB - ) 141 NlP0 66 NlP2 87 N. lactamica NlP5 42 Capítulo I 86 Para la comparación de los mapas obtenidos se utilizó como criterio el porcentaje de puntos coincidentes entre las distintas cepas. Los porcentajes de coincidencia varían en función de la imagen utilizada como modelo de referencia de los puntos establecidos como comunes y el tipo de ajuste utilizado, siendo preferible la utilización del gel con mayor cantidad de puntos como patrón de referencia (master). En nuestro caso, hemos utilizado para este propósito el gel correspondiente a la cepa 2851, pues es la cepa no mutante en la que se detectan más puntos. Una vez determinado el master y los puntos comunes, el programa de identificación de puntos realiza un emparejamiento automático en dos pasos. En las figuras 3 a 13 se presentan los mapas de referencia obtenidos tras el análisis de las distintas cepas de N. meningitidis. Las figuras 3 a 7 corresponden a la cepa de referencia 2851 y a sus mutantes “knock-out” y las figuras 8 a 10 a la cepa 3059 y sus mutantes. Las tres figuras restantes (figuras 11 a 13) corresponden a otras tres cepas de referencia (B16B6, Nm30 y M982). Se observa que la cantidad de puntos detectados en los diferentes mutantes de una misma cepa es similar y el grado de similitud entre ellas oscila entre el 35 y el 62% en los mutantes de la cepa 2851 y entre el 27 y el 52% en los de la cepa 3059 (tabla 7). Cabe destacar que en ambos casos el mutante con menor número de puntos comunes es el que carece de la proteína PorA. Capítulo I 87 Tabla 7: Porcentaje de puntos coincidentes entre las cepas mutantes de N. meningitidis y la cepa salvaje correspondiente. En el análisis de los geles correspondientes a las distintas cepas salvajes de N. meningitidis se observa que el porcentaje de puntos comunes se sitúa entre el 56% (B16B6 y 2851) y el 26% (B16B6 y 3059), siendo destacable la existencia de 11 puntos comunes a todas las cepas analizadas. Entre ellos se encuentran un punto de gran concentración situado en torno a 60 kDa y de pI 7 () y otros dos de 53.2 y 46.6 kDa con un pI ligeramente superior (). El punto de Pm 49.2 kDa y pI 5 ( ) también aparece en todas las muestras analizadas. Son característicos los puntos de Pm en torno a 30 kDa que se disponen formando un arco (recuadrado en las imágenes). Como era de esperar algunos puntos únicamente están ausentes en las cepas mutantes carentes de una determinada proteína. Así, no se detecta la línea de puntos distribuidos a lo largo de todo el rango de pI correspondiente a una masa molecular de 42 kDa en las cepas mutantes 3050 y 3091 (figuras 4 y 9). Del mismo modo, tampoco es detectada la serie de puntos de 39 kDa en las cepas mutantes 3103 y 3094 (figuras 5 y 10). La línea tenue situada a la altura correspondiente a 36 kDa que es detectada en el mapa proteómico de Cepas Salvaje Mutante Puntos detectados Coincidentes con salvaje Porcentaje de coincidencia 2851 – 187 – 100% 3050 ( PorA-) 155 66 35% 3103 (PorB-) 179 86 45% 2851 RmpM166 108 57% 3043 (FetA-) 202 117 62% 3059 – 125 – 100% 3091 (PorA-) 83 34 27% 3094 (PorB-) 141 64 52% Capítulo I 94 0 20 40 60 80 100 120 NlP0 NlP2 NlP5 Cepa de referencia % de puntos coincidentes NlP0 NlP2 NlP5 Las figuras 14, 15 y 16 muestran los mapas proteómicos bidimensionales obtenidos con las OMVs de tres cepas de N. lactamica, NlP2, NlP0 y NlP5. Se procedió al análisis de los datos por triplicado, utilizando sucesivamente como gel de referencia (master) el mapa de cada una de las cepas analizadas. La similitud entre las distintas cepas de N. lactamica está recogida en la gráfica 1. Gráfica 1: Porcentaje de puntos coincidentes en las cepas de N. lactamica, NlP0, NlP2 y NlP5. En el eje de abscisas se indica la cepa utilizada como master en cada caso. En las cepas de N. lactamica se detectaron únicamente 17 puntos comunes a las tres cepas, que suponen el 40% de los presentes en NlP0, un 19% del total en NlP2 y un 25% en NlP5. La mayoría de estos puntos tienen un Pm similar, situándose entre 31 y 34 kDa, un pI comprendido entre 5 y 10 y se disponen formando una línea en los geles (—). Al igual que ocurría en el caso de N. meningitidis, hay un punto de 60 kDa y pI 7.5 que está presente en Capítulo I 95 las tres cepas analizadas (), además de otros dos puntos de Pm 17 y 20 kDa y pI 7 y 8 respectivamente que también aparecen en todas ellas ( ). Figura 14: Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP0. La línea señalada se corresponde con la proteína PorB. Capítulo I 96 Figura 15: Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP2. La línea señalada se corresponde con la proteína PorB. Figura 16: Electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. lactamica NlP5. La línea señalada se corresponde con la proteína PorB. Capítulo I 97 Partiendo de los datos recogidos para cada una de las cepas analizadas se elaboraron mapas de referencia para cada una de las especies (figura 17), que se compararon utilizando el “software” ya descrito, hallándose sólo una pequeña cantidad de puntos comunes en ambas especies (figura 17 C). Figura 17: Puntos comunes a todas las cepas de (A) N. meningitidis (B) N. lactamica y (C) entre ambas especies. 3.1.3 Identificación por MALDI-TOF. Algunas de las proteínas fueron identificadas mediante análisis por MALDI-TOF de los puntos más relevantes (aquellos claramente visibles y comunes a las distintas cepas). Para el análisis se utilizaron tres réplicas de los geles bidimensionales correspondientes a las cepas de N. meningitidis B16B6 (figura 18) y N. lactamica NlP2 (figura 19), obteniéndose los resultados que se presentan en las tablas 8 y 9. Se observa que la coincidencia entre ambas especies se limita a 5 proteínas, chaperonina de 60 kDa, proteína principal de unión a hierro, A B C Capítulo I 98 RmpM, proteína periplasmática de unión a histidina y proteína de intercambio tiol:disulfuro DsbA, que se corresponden con 10 puntos en los mapas de N. meningitidis y 8 en los de N. lactamica. Figura 18: Proteínas identificadas por MALDI-TOF tras IEF/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis B16B6. La identificación de los puntos más relevantes se llevó a cabo mediante análisis MALDI-TOF. Capítulo I 99 Tabla 8: Resultados obtenidos para la búsqueda en MASCOT tras el análisis de los puntos relevantes de la cepa N. meningitidis B16B6 Pm pI Punto Nº acceso GeneBank Proteína Observado Predicho Observado Predicho 1 CAA61894 OMP P64k o PM-6 61.0 62.2 6.6 5.4 2 P42385 Chaperonina de 60 kDa 66.4 57.5 6 5.0 3 CAB83479 Presunta proteína periplasmica 47.7 45.6 7.5 7.8 4 CAA40469 OMP de clase 1 (porA) 42.8 37.5 6.2 4.8 5 AAD52970 OMP de clase 1 (porA) 43.7 37.4 7.7 5.3 6 CAA40469 OMP de clase 1 (porA) 41.2 37.5 7.4 5.6 7 CAA46064 Proteína principal de union a hierro 35.7 35.8 5.9 9.6 8 1904330A Proteína de union a hierro 31.6 33.5 5.7 9.5 9 A37004 OMP de clase 4 (RmpM) 31.2 26.2 7.7 6.5 10 A37004 OMP de clase 4 (RmpM) 33.7 26.2 7 6.5 11 CAB85320 OMP de clase 4 (RmpM) 33.5 26.3 5.9 7.0 12 CAB85353 proteina hipotética 27.5 27.3 6.7 5.6 13 CAB85420 Presunta proteína de intercambio tiol/disulfuro 27.3 25.4 5.9 5.8 14 CAB85036 Proteína periplásmica de unión a histidina 27.6 29.1 5.5 5.3 15 CAB85036 Proteína periplásmica de unión a histidina 29.0 29.1 5.4 5.3 16 AAF40732 Proteína de intercambio tiol/disulfuro DsbA 24.9 25.4 5.9 5.8 17 D81800 Posible peptidil-propil isomerasa NMA1756 22.8 28.9 5.5 5.7 18 AAF41888 Presunta peptidil-propil isomerasa 19.7 28.9 7 5.7 19 A81072 Precursor de la azurina 19.8 18.7 5.6 4.8 20 A81072 Precursor de la azurina 19.8 18.7 5.5 4.8 21 D81234 Factor de translación - elongacion Tu 16.9 43.1 6.7 5.1 Capítulo I 100 Figura 19: Proteínas identificadas por MALDI-TOF en una electroforesis bidimensional en IEF/SDS-PAGE realizada con OMVs de la cepa N. lactamica NlP2. Capítulo I 101 Tabla 9: Resultados obtenidos para la búsqueda en MASCOT tras el análisis de los puntos relevantes de la cepa N. lactamica NlP2 Pm pI Punto Nº acceso GeneBank Proteína Observado Predicho Observado Predicho 1 CAA61902 Proteina regulada por Hierro B (N.meningitidis) 72.7 79.6 4.7 9.4 2 CAB83768 Subunidad de la chaperonina de 60kD 63.0 57.5 4.9 5.0 3 C81021 Subunidad de la chaperonina de 60kD NMB1972 66.1 57.5 4 5.0 4 CAA70491 Porina 36.2 31.6 7.2 7.2 5 CAA70491 Porina 35.6 31.6 7.7 7.2 6 CAA70491 Porina 36.2 31.6 7.1 7.2 7 CAA70491 Porina 37.7 31.6 3.4 7.2 8 CAA46071 Proteína periplásmica de unión a Hierro 29.9 34.2 4.1 9.5 9 A37004 Precursor de la OMP de clase 4 28.8 26.2 7.4 7.0 10 A37004 Precursor de la OMP de clase 4 28.8 26.2 7.2 7.0 11 A37004 Precursor de la OMP de clase 4 28.7 26.2 6.8 6.5 12 AAC44892 Proteína de utilización de Hemoglobina-haptoglobina A, hpuA (N.meningitidis). 29.7 36.6 5.8 8.7 13 CAB85036 Proteína periplásmica de union a histidina (N.meningitidis) 30.1 29.0 4.2 6.0 14 AAK08056 Exl3L 29.7 47.0 7.1 4.5 15 AAW90622 Presunto transportador ABC, Proteína periplásmica de union a aminoácidos (N.gonorrhoeae) 26.6 30.2 7.2 6.15 16 YP_209148 Antígeno derivado del genoma de Neisseria 1946 (N. gonorrhoeae) 25.7 31.4 5.4 5.3 17 AAK08056 Exl3L. 23.7 47.0 4.5 4.5 18 AAF40732 Proteína de intercambio tiol/disulfuro DsbA 24.1 25.4 6.2 5.8 19 CAA29561 Producto proteico sin nombre (N.gonorrhoeae) 20.3 18.7 6 4.7 20 AAF41888 OMP H.8 (N.meningitidis) 20.3 18.7 5.8 4.7 Capítulo I 102 3.1.4 Análisis antigénico. La disponibilidad de sueros anti-OMVs y sueros específicos antiPorA, anti-RmpM y anti-P47 nos permitió realizar análisis antigénicos mediante Western-blotting en dos cepas de N. meningitidis (B16B6 y Nm30) y dos cepas de N. lactamica (NlP2 y NlP5). La identificación de estas proteínas antigénicas presentes en la membrana externa se realizó mediante una incubación secuencial utilizando los cuatro sueros en el siguiente orden: 1 - Suero monoclonal anti-PorA 9-1-P1.c 2 - Suero específico para la proteína de membrana RmpM mAb 185, H-8 3 - Suero específico contra la proteína de membrana P47 de Nm30 4 -Suero homólogo contra OMVs de cada una de las cepas estudiadas. En el caso de la cepa B16B6, se obtuvieron los resultados que se muestran en las Figuras 20 a 23 . Capítulo I 103 Figura 20: Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 incubada con suero anti-PorA 9-1-P1.c Figura 21: Western-blot de la cepa N. meningitidis B16B6 tras incubación secuencial con suero anti-PorA 9-1-P1.c y anti-RmpM. La línea discontínua y las flechas indican los puntos correspondientes a la proteína RmpM.   Capítulo I 110 Figura 30: Western-blot de la cepa N. lactamica NlP5 incubada con suero anti-RmpM Figura 31: Western-blot de la cepa N. lactamica NlP5 incubada secuencialmente con suero antiRmpM y anti-NlP5 Capítulo I 111 En lo que respecta a la cepa NlP5, las reacciones son muy similares a las de la NlP2. Así, tampoco es posible detectar la proteína P47 (figura no mostrada) y los puntos correspondientes a la RmpM se encuentran en el mismo rango de pI y Pm (Figura 30). Cabe destacar la presencia de una serie de antígenos cuyo Pm es menor de 25 kDa que se revelan tras la incubación con suero anti-NlP5 (Figura 31). En la figura 32 se presentan los mapas inmunoproteómicos construidos a partir de los datos obtenidos tras el análisis de cada una de las cuatro cepas mediante IEF/SDS-PAGE y posterior Western-blotting secuencial con los distintos anticuerpos monoclonales y sueros policlonales anti-OMVs y anti-P47. El anticuerpo monoclonal anti-PorA reacciona en las cepas de N. meningitidis con varios puntos de Pm comprendido entre 31 y 41 kDa y pI variable (32A y 32B). Por su parte, el suero monoclonal anti-RmpM identifica puntos tanto en N. meningitidis como en N. lactamica con los Pm esperados en cada una de las especies (32-34 kDa en N. lactamica; 37 kDa en N. meningitidis). En N. meningitidis se detectan además puntos con un Pm que está por encima y por debajo de lo esperado, lo que sugiere la presencia de formas de RmpM comunes a ambas especies y de otras exclusivas de N.meningitidis, que tienen un Pm diferente del observado en base a 1D-SDS-PAGE: Tres de estas formas se localizan en torno a los 53 kDa y otras tres en torno a los 19kDa (17A, 17B). El suero anti-P47 detecta tres puntos presentes en todas las cepas de N. meningitidis analizadas, con un pI de 7.2 y Pm 27, 43 y 56 kDa, pero no reacciona en N. lactamica en las condiciones utilizadas para el ensayo. Capítulo I 112 Al comparar informáticamente los mapas inmunoproteómicos de las distintas cepas de ambas especies se encuentran 9 puntos comunes a todas ellas, 7 de los cuales corresponden a la proteína RmpM. Figura 32: Mapas inmunoproteómicos de los antígenos de membrana externa de las cepas de N. meningitidis B16B6 (A) y Nm30 (B) y de las cepas de N. lactamica NlP2 (C) y NlP5 (D). Los puntos marcados en la figura fueron identificados mediante análisis secuencial con anticuerpos monoclonales contra las proteínas PorA, PorB y RmpM y con dos sueros policlonales contra la proteína P47 y contra OMVs completas. Capítulo I 113 4. Discusión. En el presente capítulo se describe el estudio del proteoma de membrana externa de cepas patógenas de N. meningitidis y de la especie comensal N. lactamica mediante el uso de electroforesis bidimensional IEF/SDS-PAGE y la identificación de las proteínas separadas por MALDI-TOF. A partir de los datos obtenidos se han construido mapas proteómicos e inmunoproteómicos de proteínas de membrana externa con el fin de identificar antígenos comunes a ambas especies o exclusivos de cada una de ellas. Del mismo modo, se ha estudiado el proteoma de membrana externa de una serie de mutantes “knockout” de N. meningitidis con el fin de determinar la influencia de la ausencia de determinadas proteínas en los patrones obtenidos. Los datos obtenidos muestran que la construcción de mapas de referencia sólo es posible tras una separación adecuada de las proteínas presentes en las muestras. La gran cantidad de trabajos realizados con anterioridad al comienzo de este estudio 184,192,193 mostraban que la electroforesis bidimensional basada en IEF y posterior SDS-PAGE proporcionaba una buena resolución en la separación de proteínas, siendo una técnica adecuada para la elaboración de mapas proteicos de referencia. Además, al utilizarla en combinación con Western-blotting con sueros específicos, posibilitaría la elaboración de mapas inmunoproteómicos, siendo en esas fechas la única técnica que permitía la detección y comparación de antígenos independientes. Teniendo en cuenta que algunas proteínas antigénicas de membrana no pueden ser analizadas de este modo debido a su pI extremo o a problemas de solubilización durante la 192 Ferrari G, Garaguso I, Adu-Bobie J, Doro F, Taddei AR et al. Outer membrane vesicles from group B Neisseria meningitidis ∆-gna33 mutant: Proteomic and immunological comparison with detergent-derived outer membrane vesicles. Proteomics. 2006; 6:1856–1866. 193 Vipond C, Suker J, Jones CH, Tang C, Feavers IM et al. Proteomic analysis of a meningococcal outer membrane vesicle vaccine prepared from the group B strain NZ98/254. Proteomics. 2006; 6: 3400–3413. Capítulo I 114 separación por IEF en la primera dimensión, la determinación de las condiciones idóneas para el proceso (tipo y concentración de detergentes, gradiente de pH, presencia de agentes caotrópicos...) es crucial si se quiere lograr una separación adecuada. En el presente estudio, las mejores condiciones de resolución y reproducibilidad se obtuvieron utilizando urea 5M y tiourea 2M durante la solubilización de las muestras. Otros factores importantes fueron la determinación de tiempos de incubación adecuados y el uso de detergentes zwiteriónicos para impedir el aumento de la carga iónica de la solución, lo que permite la aplicación de altos voltajes sin que haya un incremento importante en la intensidad de la corriente. La dificultad para detectar proteínas minoritarias es otra de las limitaciones de este método, de tal modo que si se quiere trabajar con proteínas presentes en bajas concentraciones es necesario aumentar la carga, lo que puede provocar un enmascaramiento de los puntos adyacentes a las proteínas mayoritarias. Cuando el objetivo es detectar proteínas antigénicas, este problema se solventa mediante la utilización de anticuerpos específicos, que se unen con gran afinidad a determinadas proteínas provocando una amplificación aparente de su cantidad. Se observa que algunos de los puntos detectados tras el “inmunoblotting” no se corresponden con ninguno de los puntos visualizados con la tinción de Coomassie, por lo que muy probablemente se trate de proteínas minoritarias imperceptibles tras el uso de esta tinción. El análisis mediante 2D IEF/SDS-PAGE e “inmunoblotting” confirma la presencia de la PorA en todas las cepas de N. meningitidis (a excepción de la mutante PorA-) y su ausencia en todas las de N. lactamica, hecho que ya había Capítulo I 115 sido establecido con anterioridad por Kim y col. 194 y Vaugham y col. 182 La observación en los mapas de N. meningitidis de la variabilidad tanto en Pm como en pI de la PorA concuerda con los estudios publicados por Uli y col. 184 y por Vipond y col. 193 sobre la composición de vacunas basadas en OMVs. Este tipo de distribución, como describen estos autores, puede deberse a modificaciones y/o procesamiento postranslacional o bien a la asociación de la PorA con diversos complejos de membrana de pI variable descritos anteriormente en nuestro laboratorio 195 que no son resueltos durante la etapa de IEF. La presencia de puntos de distinto Pm detectados con el anticuerpo monoclonal anti-RmpM podría deberse al tratamiento al que son sometidas las muestras, aunque también cabe considerar que en el caso de las formas con un Pm de 19 kDa podrían estar implicadas en el proceso de dimerización de la RmpM, descrito recientemente por Grizot y col. 196 De hecho el Pm de este punto coincide con el del fragmento C-terminal de la proteína, llamado RmpM-Cter, consistente en un dominio tipo OmpA de 18 kDa capaz de interaccionar con otras proteínas de membrana externa. Los puntos de mayor Pm identificados por el anticuerpo utilizado en el presente estudio probablemente correspondan a diferentes conformaciones de la RmpM o a asociaciones de la misma con otros componentes de membrana (PorA y/o PorB), que afectarían a su movilidad electroforética. 194 Kim JJ, Mandrell RE, Griffiss JM. Neisseria lactamica and Neisseria meningitidis share lipooligosaccharide epitopes but lack common capsular and class 1, 2, and 3 protein epitopes. Infect Immun. 1989; 57: 602–608. 195 Sánchez S, Arenas J, Abel A, Criado MT, Ferreirós CM. Analysis of outer membrane protein complexes and heat-modifiable proteins in Neisseria strains using two-dimensional diagonal electrophoresis. J Proteome Res. 2005; 4: 91–95 196 Grizot S, Buchanan SK. Structure of the OmpA-like domain of RmpM from Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 2004; 51: 1027–1037. Capítulo I 116 El anticuerpo monoclonal anti-RmpM no detecta ninguno de estos puntos de mayor o menor Pm en ninguna de las cepas de N. lactamica, lo que sugiere que son formas específicas de N. meningitidis. En N. lactamica, la RmpM aparece como una serie de puntos de Pm comprendido entre 32 y 34 kDa, en concordancia con estudios previos realizados en nuestro laboratorio 141 . La ausencia de puntos antigénicos de mayor o menor Pm a en las cepas de la especie comensal analizadas podría explicar las diferencias en la movilidad electroforética de la proteína entre ambas especies. En base al análisis informático de los resultados obtenidos de N. meningitidis y N. lactamica, nuestros resultados indican que cepas diferentes pueden tener proteomas diferentes a pesar de tener la misma composición proteica. Es más, una cepa de N. meningitidis y una de N. lactamica pueden tener un porcentaje de similaridad (basado en puntos coincidentes) comparable al que existe entre dos cepas de N. meningitidis. Además, se demuestra que no hay una correspondencia exacta entre inmunomas y proteomas, lo que dificulta la identificación de los antígenos específicos de una especie y de los compartidos por ambas especies. Cuando los puntos son analizados por MALDI-TOF queda claro que las movilidades observadas no son fiables y resultan inadecuadas para llevar a cabo comparaciones incluso entre cepas de la misma especie. La evaluación y comparación de los mapas inmunoproteómicos mediante el uso de programas de análisis de imagen sólo permite identificar una proteína antigénica común a ambas especies, la RmpM. Sin embargo, el análisis visual de los resultados obtenidos tras la incubación con sueros policlonales revela la presencia de otras muchas proteínas comunes, si bien la carencia de anticuerpos monoclonales contra dichas proteínas no nos ha permitido establecer relaciones precisas entre puntos antigénicos. Es importante resaltar Capítulo I 117 que las proteínas comunes a las dos especies pueden mostrar diferencias en su Pm, como ocurre en el caso de la RmpM (32 a 35 kDa). Además, las proteínas con alto Pm, proteínas formadoras de complejos y aquellas altamente hidrofóbicas podrían no entrar en los geles o enfocarse mal durante la primera dimensión. De un modo similar, las proteínas con valores de pI extremos podrían quedar excluidas de los geles de IEF, lo que provocaría la aparición de patrones proteicos o antigénicos muy diferentes de los obtenidos tras 1D SDSPAGE. Muchos antígenos parecen, por tanto, desaparecer o mostrar patrones anómalos. De modo similar hay que tener en cuenta que las condiciones de solubilización utilizadas en IEF son muy diferentes de las utilizadas en 1D SDS-PAGE, por lo que consideramos que el análisis adecuado de los inmunoproteomas de membrana bacteriana todavía requiere investigación en las técnicas de separación. En lo que respecta a los resultados obtenidos al analizar cepas mutantes “knock-out”, la ausencia de los puntos correspondientes a las proteínas en las que cada una de ellas es defectiva permite su identificación por comparación con las cepas salvajes correspondientes. La identificación de las proteínas comunes detectadas mediante digestión tríptica, obtención de la huella peptídica y búsqueda en las bases de datos disponibles para N. meningitidis nos ha permitido la identificación de una serie de puntos relevantes, de los cuales sólo 5 coinciden en ambas especies, chaperonina de 60 kDa, proteína principal de unión a hierro, RmpM, proteína periplasmática de unión a histidina y proteína de intercambio tiol:disulfuro DsbA, lo que está en concordancia con la idea ya mencionada de que cepas diferentes pueden tener proteomas diferentes a pesar de presentar la misma composición proteica Capítulo I 118 La 2D IEF/SDS-PAGE constituye una mejora con respecto a la electroforesis 1D-SDS/PAGE al permitir la separación de proteínas de igual peso molecular, pero es una técnica muy desnaturalizante, por lo que no es adecuada para el estudio de las asociaciones que se dan in vivo y precisamente ese tipo de asociaciones son de importancia vital tanto para el metabolismo de la bacteria como para el desarrollo de la respuesta inmune, lo que hace necesaria la utilización de otras técnicas menos agresivas (no desnaturalizantes) que posibiliten el estudio de los complejos proteicos tal y como se expresan in vivo. CAPÍTULO II: Análisis de los complejos de proteínas de membrana externa mediante electroforesis bidimensional diagonal dSDS-PAGE. Capítulo II 126 2.3 Obtención y conservación de sueros. El protocolo utilizado para la obtención del suero anti-OMVs de la cepa N. meningitidis M982 fue el indicado en el capítulo anterior (ver capítulo I, Material y métodos). El anticuerpo monoclonal contra epitopos conservados de la proteína PorA (mab 91-P1.C) fue amablemente cedido por los Drs. W. Zollinger y E. Moran (Walter Reed Army Institute, U.S.A.), el anti-PorB (mab F1.9H10/1B3) por el Dr. A. Silva (Instituto Adolfo Lutz, Brasil), el anti-RmpM (mab 185-H8) por los Drs. E. Rosenqvist y J. Kolberg (Instituto Nacional de Salud Pública, Noruega) y el anti-Opa (mab4B12/C11) por el Dr. G. Morelli (Max Planck Institut für Infektionsbiologie, Alemania). 2.4 Electroforesis bidimensional diagonal (dSDS-PAGE). El análisis de la asociación de proteínas de membrana externa se llevó a cabo mediante electroforesis diagonal. • En ambas dimensiones se utilizó SDS-PAGE en geles en gradiente del 7.515% y condiciones estándar (200V, 1h). • Las muestras conteniendo 40 µg de OMVs se disolvieron 1:1 en tampón de muestra 2x (glicerol al 10% (v/v), SDS al 2% (p/v), 2-β-mercaptoetanol 0.7M y azul de bromofenol al 1,25x10 -3 (v/v)). • Tras correr la primera dimensión, los carriles fueron cortados, introducidos en recipientes con tampón de muestra e incubados a 95º C 10 min. Las tiras se colocaron en la parte superior de los geles de la segunda dimensión, se cubrieron con agarosa al 0.5% (Bio-Rad ReadyPrep TM Overlay Agarose 0.5% en TBS con azul de bromofenol (Bio-Rad Lab., Richmond, CA, USA)) y se llevó a cabo la segunda electroforesis. • Los geles obtenidos bien se tiñeron con Coomasie Brilliant Blue. Capítulo II 127 2.5 Electrotransferencia a membranas de PVDF. Según el protocolo indicado en el capítulo anterior. 2.6 Inmunodetección. En este estudio se utilizaron los sueros monoclonales α-PorA, α-PorB, α-RmpM y α-Opa y el suero específico contra la cepa de N. meningitidis M982. Todos ellos fueron obtenidos en ratón y se utilizaron a una dilución de 1:1000. Capítulo II 129 3. Resultados. 3.1 Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE. 3.1.1 Análisis proteómico. Para analizar la composición de los complejos de proteínas de membrana externa presentes en N. meningitidis y N. lactamica, se optó por la utilización de la electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE (dSDS-PAGE). En todos los casos, la primera dimensión se realizó a temperatura ambiente, mientras que de forma previa a la segunda, las muestras se incubaron a 95ºC durante 10 min. (ver Material y métodos) para permitir la desnaturalización de los complejos sensibles al calor. En el caso de la cepa N. meningitidis M982 se realizó también una dSDS-PAGE en la que la incubación previa a la segunda dimensión se llevó a cabo a 37ºC, para confirmar que la disociación de los complejos se debiese únicamente al efecto de la temperatura. Al comparar los resultados obtenidos al analizar las OMVs de N. meningitidis M982 en cada una de las condiciones anteriormente indicadas (figura 33), se observa que cuando la incubación previa a la segunda dimensión se realiza a 37ºC (figura 33 A), todas las proteínas detectables se localizan en la diagonal, con la excepción de tres puntos con Pm 190, 95 y 72 kDa situados a la izquierda del gel. Cuando la incubación para la segunda dimensión se realiza a 95ºC (figura 33 B), los 3 puntos señalados anteriormente se disocian parcialmente dando origen a tres nuevos puntos con Pm 43, 38 y 36 kDa (recuadrados en la figura). Del mismo modo, el gran punto que se observa a la altura Capítulo II 130 de 95kDa cuando la incubación se realiza a temperatura ambiente se disocia parcialmente dando lugar a tres nuevos puntos con masas idénticas a los anteriores (43, 38 y 36 kDa). También se observan una serie de puntos situados por debajo de la diagonal (de Pm 70, 60, 55 y 20 kDa), mientras que sobre ella se sitúan otros puntos de Pm 95, 50, 43 y 30 kDa, que corresponden a proteínas con movilidad dependiente de la temperatura. Capítulo II 131 Figura 33: Análisis en dSDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis M982 tras el tratamiento previo a la segunda dimensión a 37ºC (A) o a 95º 10 min. (B) El gel correspondiente a la primera dimensión se presenta a la derecha de la imagen. En la fig. 33A, los posibles complejos se muestran recuadrados; los puntos derivados de la disociación de los complejos (B) están rodeados por círculos y los puntos con movilidad dependiente de la temperatura (B) se señalan con rectángulos. A la derecha se indican los Pm de algunas de los puntos detectados. Capítulo II 132 Este patrón de disociación es muy similar en el resto de las cepas salvajes de N. meningitidis analizadas (figuras 34-37), destacando la ausencia de de las proteína de 36 kDa en la cepa Nm30, donde además sólo aparecen sobre la diagonal la proteína de 30 kDa junto con otra de peso molecular similar (figura 37). Figura 34: Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 2851 tras el tratamiento de los geles procedentes de la primera dimensión a 95ºC durante 10 min. Los posibles complejos se muestran recuadrados; los puntos derivados de la disociación de los complejos, rodeados por círculos y los puntos con movilidad dependiente de la temperatura se señalan con rectángulos. Capítulo II 133 Figura 35: Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis 3059 tras el tratamiento de los geles procedentes de la primera dimensión a 95ºC durante 10 min. Los posibles complejos se muestran recuadrados; los puntos derivados de la disociación de los complejos, rodeados por círculos y los puntos con movilidad dependiente de la temperatura se señalan con rectángulos. Capítulo II 134 Figura 36: Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis B16B6 tras el tratamiento de los geles procedentes de la primera dimensión a 95ºC durante 10 min. Los posibles complejos se muestran recuadrados; los puntos derivados de la disociación de los complejos, rodeados por círculos y los puntos con movilidad dependiente de la temperatura se señalan con rectángulos. Capítulo II 135 Figura 37: Electroforesis bidimensional diagonal/SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningitidis Nm30 tras el tratamiento de los geles procedentes de la primera dimensión a 95ºC durante 10 min. Los posibles complejos se muestran recuadrados; los puntos derivados de la disociación de los complejos, rodeados por círculos y los puntos con movilidad dependiente de la temperatura se señalan con rectángulos. En las cepas mutantes se observa como era de esperar la ausencia de las proteínas en la que cada una de ellas es defectiva. Así, en la cepa 3050 (figura 38 A), que corresponde al mutante PorAde la cepa 2851, no aparece ninguno de los puntos de 43 kDa, correspondientes a la PorA. En este mutante además aparece una proteína de 30 kDa que no está presente en el resto de las cepas (  ). La cepa 3103, mutante para la proteína PorB, carece de todos los puntos de 38kDa (figura 38 B). En la cepa 2851 RmpM-