Diagnóstico genético en los trastornos del espectro autista (TEA): análisis de exoma

1 FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA TRABALLO FIN DE GRAO DE MEDICINA Diagnóstico genético en los trastornos del espectro autista (TEA): Análisis de exoma AUTORA: Ben Rivas, Alba TITOR: Carracedo Álvarez, Ángel María COTITORA 1: Rodríguez Fontenla, María Cristina COTITORA 2: Alonso González, Aitana Departamento: Medicina Xenómica, Pediatría. Curso académico: 2019-2020 Convocatoria: Xullo ALBA BEN RIVAS ÍNDICE 2 ÍNDICE Resumen................................................................................................................................................. 3 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 6 1.1. Trastornos del espectro autista (TEA) .................................................................................... 6 1.1.1. Definición ....................................................................................................................... 6 1.1.2. Evolución ....................................................................................................................... 6 1.1.3. Criterios diagnósticos de los TEA (en el DSM-5) .......................................................... 7 1.1.4. Niveles de gravedad de los TEA ..................................................................................... 8 1.1.5. Epidemiología ................................................................................................................ 9 1.1.6. Signos precoces de TEA ............................................................................................... 10 1.1.7. Marcadores neurobiológicos tempranos ....................................................................... 11 1.1.8. Detección precoz y diagnóstico. ................................................................................... 11 1.1.9. Tratamiento .................................................................................................................. 15 1.2. Etiología de los TEA ............................................................................................................ 16 1.2.1. Factores ambientales..................................................................................................... 16 1.2.2. Genética de los TEA ..................................................................................................... 16 2. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 23 2.1. Historia clínica de los pacientes. Aspectos fenotípicos destacados. ...................................... 23 2.2. Test genéticos previos .......................................................................................................... 25 3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 26 4. MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................................... 27 4.1. Filtrado inicial de variantes .................................................................................................. 27 4.1.1. Posición genómica con respecto al gen y cambios en la secuencia de aminoácidos: .... 27 4.1.2. Frecuencia poblacional ................................................................................................. 27 4.1.3. Criterios de calidad asociados a cada variante .............................................................. 28 4.1.4. Bases de datos específicas de enfermedad .................................................................... 28 4.2. Priorización de variantes ...................................................................................................... 29 4.2.1. Herencia. Comparación con el exoma del padre y la madre ......................................... 30 4.3. Clasificación de variantes ..................................................................................................... 31 5. RESULTADOS ............................................................................................................................ 33 6. DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 38 7. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 41 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................. 43 ALBA BEN RIVAS 3 Resumen Antecedentes: Los trastornos del espectro autista, TEA (en inglés ASD, “Autism Spectrum Disorders”) son trastornos del neurodesarrollo (TND) caracterizados por déficits en la comunicación social, intereses restringidos y comportamientos repetitivos. Los TEA son TND complejos, en los que el ambiente y la genética son claves en su patogénesis. El componente genético de los TEA se estima en torno a un 80%. Aunque la variación común es la que juega un papel más relevante, la variación rara (MAF<1%) confiere un mayor riesgo individual. Objetivo: El objetivo principal de este trabajo es realizar un análisis de exoma completo en 3 tríos de TEA (padre y madre no afectos, hijo afecto) para su diagnóstico genético. En este caso, los probandos afectos muestran un fenotipo grave, que parece indicar una causa genética subyacente, pero cuyo diagnóstico genético no se pudo esclarecer en una primera fase, en la que solo se buscaron mutaciones en genes de riesgo conocidos para TEA. Una vez priorizadas las variantes genéticas, se realizará una caracterización bibliográfica de los genes descubiertos en relación a la historia clínica de los individuos con TEA. Métodos: Seguimos una serie de criterios de filtrado de variantes, atendiendo a la posición genómica y los cambios en los aminoácidos, la frecuencia poblacional y criterios de calidad. Se consultó una serie de bases de datos (DECIPHER, Varsome, Polyphen2, HPO, gnomAD) para llevar a cabo la priorización de variantes. Finalmente, se clasificaron las variantes siguiendo los criterios propuestos por el ACMG. Resultados: No identificamos variantes patogénicas en los probandos afectos 1 y 2, aunque sí que encontramos algunas de significado incierto, que podrían ser diagnósticas si existiese otra variante no detectada hasta el momento. Sí que conseguimos un diagnóstico genético en el probando afecto 3, al hallar una variante de novo que justifica su fenotipo. ALBA BEN RIVAS Resumo 4 Resumo Antecedentes: Os trastornos do espectro autista, TEA (en inglés ASD, “Autism Spectrum Disorders”) son trastornos do neurodesenvolvemento (TND) caracterizados por déficits na comunicación social, intereses restrinxidos e comportamentos repetitivos. Os TEA son TND complexos, nos que o ambiente e a xenética son claves na súa patoxénese. O componente xenético dos TEA estímase en torno a un 80%. Aínda que a variación común é a que xoga un papel máis relevante, a variación rara (MAF<1%) confire un maior risco individual. Obxectivo: O obxectivo principal deste traballo é realizar unha análise de exoma completo en 3 tríos de TEA (pai e nai non afectos, fillo afecto) para o seu diagnóstico xenético. Neste caso, os probandos afectos mostran un fenotipo grave, que parece indicar unha causa xenética subxacente, pero cuxo diagnóstico xenético non se puido esclarecer nunha primeira fase, na que só se buscaron mutacións en xenes de risco coñecidos para TEA. Unha vez priorizadas as variantes xenéticas, realizarase unha caracterización bibliográfica dos xenes descubertos en relación á historia clínica dos individuos con TEA. Métodos: Seguimos unha serie de criterios de filtrado de variantes, atendendo á posición xenómica e aos cambios nos aminoácidos, á frecuencia poblacional e a criterios de calidade. Consultouse unha serie de bases de datos (DECIPHER, Varsome, Polyphen2, HPO, gnomAD) para levar a cabo a priorización das variantes. Finalmente, clasificáronse as variantes seguindo os criterios propostos polo ACMG. Resultados: Non identificamos variantes patoxénicas nos probandos afectos 1 e 2, aínda que sí que encontramos algunas de significado incerto, que poderían ser diagnósticas se existise outra variante non detectada ata o momento. Si que conseguimos chegar a un diagnóstico xenético no probando afecto 3, ao achar unha variante de novo que xustifica o seu fenotipo. ALBA BEN RIVAS Abstract 5 Abstract Background: Autism Spectrum Disorders (ASD) are Neurodevelopmental Disorders (NDDs) characterized by deficits in social communication, restricted interests, and repetitive behaviors. ASDs are complex NDDs, in which environment and genetics are key to their pathogenesis. The genetic component of ASDs is estimated about 80%. Although the common variation plays the most relevant role, the rare variation (MAF <1%) confers a higher individual risk. Objective: The main objective is to analyse a complete exome in 3 trios of ASD (unaffected father and mother, affected son) for genetic diagnosis. In this case, the affected probands show a severe phenotype, that seems to indicate an underlying genetic cause, but whose genetic diagnosis could not be clarified in the first phase, in which only mutations in known ASD risk genes were sought. Once the genetic variants have been prioritized, we will make a bibliographic characterization of the genes discovered in relation to the clinical history of individuals with ASD. Methods: We follow different variant filtering criteria, attending to genomic position and aminoacid changes, population frequency, and quality criteria. Several databases (DECIPHER, Varsome, Polyphen2, HPO, gnomAD) were consulted to carry out variant prioritization. Finally, variants were classified according to the ACMG recommendations. Results: We did not identify pathogenic variants in probands 1 and 2. However, we find some variants of uncertain significance, which could be diagnostic if it existed another variant not detected at this moment. We could diagnose proband 3, by finding a de novo variant that justifies its phenotype. ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 6 1. INTRODUCCIÓN 1.1. TRASTORNOS DEL ESPECTRO AUTISTA (TEA) 1.1.1. DEFINICIÓN Los trastornos del espectro autista, TEA (en inglés ASD, Autism Spectrum Disorders) son trastornos del neurodesarrollo (TND) caracterizados por déficits en la comunicación social, intereses restringidos y comportamientos repetitivos (1). La definición de los TEA se ha ido modificando y ajustando en las últimas décadas, teniendo en cuenta los resultados de diversas investigaciones. Con la publicación en 2013 del DSM-5, el “Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales” (del inglés “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”, Fifth edition) (2), se constituye la denominación genérica y única de TEA, eliminando las subcategorías del DSM-IV-TR, que incluían al autismo, síndrome de Asperger y trastorno generalizado del desarrollo no especificado, entre otros. Este cambio ayuda a expresar el concepto dimensional de los TEA. Resulta difícil establecer límites precisos entre los subgrupos. Se trata de trastornos complejos y altamente heterogéneos, tanto en lo referente a la etiología como en la manifestación y evolución de los síntomas en las diferentes etapas del desarrollo, en su expresión y presentación según el sexo, edad o comorbilidades coexistentes (3). En el DSM-5, los TEA se engloban en una nueva categoría denominada “trastornos del neurodesarrollo” (TND). Esta categoría también incluye, además de a los TEA, los trastornos del desarrollo intelectual, de la comunicación, del aprendizaje, trastornos motores y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) (2). 1.1.2. EVOLUCIÓN Los TEA presentan una evolución crónica, se inician en la infancia y están presentes toda la vida, pasando por diferentes grados de afectación, adaptación funcional y desarrollo del área del lenguaje e intelectual. Estudios recientes de TEA han visto que existe una tendencia a la mejora de los síntomas y mejor adaptación funcional con la edad, aun tratándose de un trastorno crónico. También encontraron que el retraso en el inicio del lenguaje no implica una diferencia significativa en la adaptación funcional evolutiva en la edad adulta (3). ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 7 1.1.3. CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE LOS TEA (EN EL DSM-5) Con la clasificación nueva del DSM-5 (2), los criterios de inclusión para el diagnóstico de los TEA se volvieron más específicos y estrictos. Por ejemplo, se incluyeron las alteraciones sensoriales (hiporreactividad o hiperreactividad sensorial) dentro de los “patrones restringidos y repetitivos de comportamiento, actividades e intereses”. Así, se reduce la probabilidad de falsos positivos; sin embargo, también se reduce la sensibilidad para la detección de cuadros clínicos menos graves. Es decir, el grupo de pacientes que sólo presenta alteraciones socioemocionales y de la comunicación, pero que no tienen conductas repetitivas, no serán incluidos actualmente en el diagnóstico de TEA, cuando anteriormente, en el DSM-IV-TR, sí lo hacían. CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE LOS TEA (DSM-5) A. Déficits persistentes clínicamente significativos en la comunicación y en la interacción social, que se presentan en diversos contextos, sea actualmente o en sus antecedentes: 1. Dificultades en la reciprocidad socio-emocional: desde aproximaciones sociales anormales y fracaso de las conversaciones bidireccionales, pasando por la disminución de intereses, emociones o afectos compartidos, hasta la falta total de iniciación de interacciones sociales. 2. Déficits en la comunicación no verbal, que se presentan en las interacciones sociales: desde una comunicación verbal o no verbal con baja integración, que se manifiesta con el contacto visual y del lenguaje corporal, pasando por déficits de la comprensión y el uso de gestos, hasta una falta total de expresión facial y de comunicación no verbal. 3. Dificultades para desarrollar, mantener y comprender las relaciones sociales: desde problemas para ajustar el comportamiento en diversos contextos sociales, pasando por dificultades para compartir juegos imaginativos o para hacer amigos y amigas, hasta una falta aparente de interés por otras personas. B. Patrones repetitivos y restringidos de comportamiento, actividades e intereses, que se manifiestan en al menos dos de los siguientes puntos (actualmente o en sus antecedentes): 1. Comportamientos motores, verbales o utilización de objetos de forma estereotipada o repetitiva (estereotipias motoras simples, uso de objetos de forma repetitiva, alineación de los juguetes, frases idiosincrásicas, ecolalia…). 2. Adherencia excesiva a rutinas, patrones de comportamiento verbal y no verbal ritualizado o excesiva resistencia a los cambios (insistencia en una misma rutina o comida, angustia extrema frente a cambios pequeños o transiciones, patrones de pensamiento rígidos…) 3. Intereses muy restringidos y fijos, que son anormales en cuanto a su intensidad o foco de interés (fuerte preocupación o apego por objetos inusuales, intereses excesivamente perseverantes) 4. Hiperreactividad o hiporreactividad sensorial o interés sensorial inusual por determinados aspectos del entorno (indiferencia aparente al dolor, al calor, al frío; respuesta negativa a sonidos o texturas específicas, oler o tocar objetos en exceso, fascinación por las luces o por los objetos que giran). ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 8 C. Los síntomas deben estar presentes en la infancia temprana, aunque puede que no se manifiesten plenamente hasta que las demandas sociales del entorno excedan sus capacidades. D. Sus síntomas limitan y causan un deterioro clínicamente significativo en lo social, laboral u otras áreas importantes del funcionamiento diario. E. Las alteraciones del paciente no se explican mejor por la discapacidad intelectual o por el retraso global del desarrollo. La discapacidad intelectual y el trastorno del espectro autista frecuentemente coinciden. Para hacer diagnósticos de comorbilidades de un TEA y discapacidad intelectual, la comunicación social estará por debajo de lo previsto para su nivel de desarrollo. Para hacer el diagnóstico deben cumplirse los criterios A, B, C, D y E. Tabla 1: Criterios diagnósticos de los trastornos del espectro autista (DSM-5) (2) Además de cumplirse estos cinco criterios para hacer el diagnóstico de TEA, también se debe especificar:  Si existe discapacidad intelectual acompañante o no.  Si hay alteraciones o retraso en el desarrollo del lenguaje.  Si está asociado a una afección médica o genética, o a un factor ambiental conocidos.  Si está asociado a otro trastorno del neurodesarrollo, mental o del comportamiento.  Si está asociado con catatonía. 1.1.4. NIVELES DE GRAVEDAD DE LOS TEA Respecto a la severidad de los TEA, se describen tres niveles (grado 1, 2 y 3) para cada una de las dos dimensiones que forman los criterios diagnósticos (“Comunicación social” y “Comportamientos restringidos y repetitivos”) (3). Estos niveles se refieren al grado de ayuda necesaria para cada uno de los dominios ("necesita ayuda muy notable", "necesita ayuda notable" o "necesita ayuda"). NIVELES DE GRAVEDAD DE LOS TEA Categoría dimensional de los TEA en el DSM-5 Comunicación social Comportamientos restringidos y repetitivos Grado 3: Necesita ayuda muy notable Mínima comunicación social Interferencia marcada en la vida diaria, por inflexibilidad y dificultades de cambio de foco de atención. ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 9 Grado 2: Necesita ayuda notable Marcado déficit con limitada iniciación o respuestas reducidas o atípicas Interferencia frecuente, relacionada con la inflexibilidad y dificultades del cambio de foco. Grado 1: Necesita ayuda Sin apoyo in situ, aunque presenta alteraciones significativas en el área de la comunicación social Interferencia significativa en, al menos, un contexto. Síntomas subclínicos Algunos síntomas en esta o ambas dimensiones, pero sin alteraciones significativas Presenta un inusual o excesivo interés, pero no interfiere. Dentro de la normalidad Puede ser peculiar o aislado, pero sin interferencia No interferencia. Tabla 2: Niveles de gravedad en los TEA (DSM-5) (2) 1.1.5. EPIDEMIOLOGÍA Hace años, las primeras estimaciones acerca de la prevalencia de los TEA los consideraban como trastornos raros, que afectaba a 4-5/10.000. En 2012, los datos se sitúan en 1 de cada 68 niños de 8 años, según el CDC (Centers for Disease Control and Prevention) en Estados Unidos. En 2014, nuevos resultados del CDC en Estados Unidos, encuentran que los TEA tienen una prevalencia del 2,24% (1 de cada 45 niños) (4). Los últimos datos muestran una prevalencia de los TEA en la población general del 1% aproximadamente (18). En los últimos estudios de incidencia y prevalencia se refleja un incremento paulatino del número de casos. Esto está posiblemente relacionado con cambios en los criterios diagnósticos, con un cambio metodológico, cuestionarios más sensibles para la detección de casos. En definitiva, el aumento de diagnósticos de TEA se debe a una mejor detección y evaluación de los pacientes, tanto por el sistema educacional como el sistema de salud (5,6). Análisis sobre el estudio de prevalencia de los TEA del CDC estiman una proporción significativamente mayor entre los niños de 8 años (23,6 diagnosticados de TEA por cada 1.000) en comparación con las niñas de la misma edad (5,3 diagnosticadas por cada 1.000) (3). Los últimos estudios muestran que los niños tienen tres veces más probabilidades de estar afectados que las niñas (18). Además, en cuanto a la raza o la etnia, la estimación de prevalencia de los TEA era significativamente mayor entre los blancos no-hispanos en comparación con los niños negros no-hispanos y los hispanos. También se observaban diferencias de estimación según la zona. El porcentaje de edad en el que recibían una evaluación completa era de 36 meses, sin diferencias en cuanto al sexo, pero si era superior en la población de niños no hispánicos blancos (45%), comparado con la población negra no–hispana (40%) e hispanos (39%). Las diferencias ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 16 Así, se diseñan programas integrales, intensivos y estructurados basados en intervenciones sobre el comportamiento, que se comparten con los padres, la escuela y el terapeuta responsable del niño, para que sean ellos mismos los encargados de llevarlos a cabo con el paciente. Se deben realizar, dentro de lo posible, en los entornos naturales del niño. Además, se debe de hacer un seguimiento periódico de su evolución clínica por un equipo multidisciplinar, pudiendo pedir la colaboración a otras especialidades médicas si se considerase necesario (19). La mayoría de los niños con TEA no se benefician de un tratamiento farmacológico. En caso de decidir administrarlo, se debe comenzar por un único fármaco, e ir incrementando su dosis muy despacio, para así controlar de cerca posibles efectos secundarios. Se deberá informar a los padres de aquellos más frecuentes para que también estén alerta. Además, evitaremos comenzar el tratamiento durante periodos de cambios en la vida del paciente. En la actualidad, no existen fármacos de eficacia probada para todos los síntomas específicos de TEA (9). Los únicos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) son la Risperidona y el Aripiprazol. Estos se utilizan para las comorbilidades asociadas a TEA. La medicación más ampliamente estudiada y más prometedora para los síntomas específicos de autismo es la Oxitocina. Su uso por vía intranasal parece estar asociado a una mejora en la cognición social, en el contacto ocular y el reconocimiento de expresiones faciales. Su mayor limitación es que tiene una vida media muy corta, lo que la convierte en una opción terapéutica no recomendable (3). 1.2. ETIOLOGÍA DE LOS TEA Los TEA son trastornos del neurodesarrollo complejos y multifactoriales (21). El ambiente y la genética son claves en su patogénesis. 1.2.1. FACTORES AMBIENTALES Entre los factores ambientales que influyen en la etiología de TEA se encuentran las alteraciones perinatales (prematuridad extrema, muy bajo peso al nacer), la exposición a tóxicos o a medicamentos durante el embarazo (por ejemplo, ácido valproico para el tratamiento de la epilepsia), enfermedades maternas durante la gestación que produzcan una gran reacción inmunológica, así como dificultades durante el parto, que lleguen a producir hipoxia fetal. También influye la edad paterna en el momento de la concepción, que luego comentaremos. Cabe destacar que estos factores por sí solos no son causa de TEA, sino que pueden actuar sobre el componente genético influyendo sobre su etiología (22). 1.2.2. GENÉTICA DE LOS TEA Los TEA presentan un fuerte componente genético (20). Este se estima en torno a un 80%. La epigenética está también implicada de manera relevante en los TEA (21). ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 17 Estudios en diversas familias y gemelos han demostrado la contribución de la genética a la etiología de los TEA (23). El porcentaje de herencia se situaba en el 90% de casos (24), pero un análisis posterior más preciso estimó una herencia del 83% (25). Una parte importante de la herencia se puede explicar por los SNPs. Estas variantes comunes contribuyen en la etiología del TEA alrededor de un 50% cuando se consideran en conjunto (26). Un metaanálisis de GWAS sobre TEA desarrolló un control de calidad bien definido y, por primera vez, llevó a la identificación de 93 marcadores genéticos significativos para TEA, de los cuales 53 fueron replicados en cohortes independientes (27). A pesar de la evidencia del papel fundamental que tienen las variantes comunes en el riesgo de TEA, las variantes raras (MAF<1%) confieren al niño un riesgo individual más alto. Estas variantes raras se pueden encontrar en inserciones y delecciones pequeñas (indels), CNV (copy number variants) o SNVs (single nucleotide variant). Además, pueden ser heredadas del padre o de la madre, o, por el contrario, aparecer de novo en el paciente afecto (28). Estas mutaciones de novo (DNMs) son variantes identificadas en el paciente, pero que no se encontraron en los padres biológicos. Las DNMs tienen más probabilidades de causar un efecto fuerte sobre el individuo. El descubrimiento de DNMs nos permite identificar genes de riesgo para TEA (29). Por ejemplo, presentar un SNV de novo y una mutación específica “sin sentido” confiere sobre 5 veces más riesgo individual que presentar una CNV heredada (30). Además, los niños con síntomas de TEA graves son susceptibles de portar DNMs más patogénicas (31). Por lo tanto, existe un interés considerable en identificar nuevas DNMs asociadas a los TEA. 1.2.2.1. IDENTIFICACIÓN DE DNMS (DE NOVO MUTATIONS) Los estudios en tríos genéticos (el padre y la madre no afectos y el hijo afecto) se han usado desde 2007 para estudiar DNMs y buscar mutaciones en el paciente que no estuviesen presentes en ninguno de los padres. Analizando las características de las DNMs identificadas, es posible caracterizar genes previamente desconocidos para TEA (23). En los primeros estudios para detectar CNVs usando micro-arrays de gran resolución, los CNVs de novo eran más frecuentes en los casos que en los controles (32), así como más frecuentes en familias simples que en familias múltiples (32, 33). Sin embargo, el gran número de CNVs existentes supone un problema cuando tenemos como objetivo detectar genes candidatos para TEA. Las CNVs pueden contribuir a un riesgo moderado de TEA, mientras que los SNVs tienen más probabilidad de indicar directamente genes asociados a una alta susceptibilidad para TEA (34). Para revelar la arquitectura genética del TEA se han utilizado grandes secuenciaciones paralelas y específicamente, la secuenciación de exoma completo o WES (Whole Exome ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 18 Sequencing) (35, 36, 37). Esta tecnología se ha utilizado en la gran mayoría de estudios de DNMs, recogiendo datos de muchas familias (normalmente en tríos, como se explicó anteriormente) (28, 38, 39). Comparando la secuencia de ADN obtenida del niño afecto con la de sus padres, podemos identificar DNMs, después de haber filtrado los artefactos de la secuenciación (40). Este proceso requiere un pipeline bioinformático que incluya diferentes filtros de frecuencia poblacional y parámetros de calidad más o menos restrictivos (41). De todas formas, cada DNM será finalmente resecuenciado por separado, mediante otros métodos, normalmente secuenciación de Sanger, para comprobar así la precisión de los hallazgos (23). Todos las DNMs localizadas en la secuenciación de exoma se deben clasificar también según su anotación funcional, es decir, según el impacto que tenga la sustitución aminoacídica en la estructura de la proteína formada y en su función (23). Podemos encontrarnos mutaciones de cambio de sentido (missense DNMs) y mutaciones sin sentido (non-sense DNMs), que truncarían la proteína al formarse un codón de parada (stop codon). Las mutaciones que implican una pérdida de función (LoF mutation, loss of funcion mutation) pueden clasificarse en frameshift (mutación por desplazamiento del marco de lectura), splice site (mutaciones de splicing, en el lugar de empalme) y stop-gain (mutaciones que truncan la proteína). La importancia de las DNMs missense en la patogénesis de los TEA se ha comenzado a estudiar recientemente. Así, los genes que presentan dos o más mutaciones de este tipo tienen más probabilidades de ser patogénicas en los TEA (42). Además, algunos estudios refieren un aumento de las mutaciones LoF en pacientes con TEA comparados con familiares suyos sanos. En concreto, mutaciones LoF heterocigotas están presentes en el 20% de los pacientes, pero solo en el 10% de los hermanos no afectos (38, 43, 44, 45). Las mutaciones de cambio de sentido (missense mutations) son también más comunes en pacientes con TEA que en sus hermanos cuando se consideran cohortes grandes. Se calculó que las mutaciones missense contribuyen al menos a un 10% de los diagnósticos de TEA (40). 1.2.2.2. RECURRENCIA DE LOS TEA EN HERMANOS DEL PACIENTE El riesgo de padecer TEA aumenta para un niño cuando tiene un hermano mayor afecto. El riesgo total de recurrencia en hermanos se estima alrededor del 6,9-18% dependiendo del diseño del estudio (46). Este porcentaje es significativamente superior al riesgo en la población general, que es del 1%. Si el niño tiene 2 o más hermanos con TEA, el riesgo de presentarlo se incrementa al 30% (3). Los padres que han tenido un hijo diagnosticado de TEA deben de recibir consejo genético por un especialista a la hora de tomar la decisión de si tener o no más hijos. Esta decisión va a depender, en parte, de si hemos podido identificar o no una causa genética específica para TEA en su primer hijo o hija. Si hemos detectado una mutación de novo responsable, los hijos posteriores tendrán el mismo riesgo de TEA que la población general. ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 19 1.2.2.3. INFLUENCIA DE LA EDAD PATERNA Se ha establecido una relación entre la edad paterna avanzada y el aumento del riesgo de los TEA (47,48). Esta relación se puede explicar por múltiples mecanismos biológicos, no solo las DNMs, sino también los cambios epigenéticos asociados con la edad (49). Las DNMs están presentes típicamente en el espermatozoide o en el óvulo de uno de los padres, transmitiéndose después al embrión. En los estudios realizados se vio que la mayoría de los DNMs se originaban en el padre (50), lo cual parece lógico conociendo el número mucho mayor de espermatozoides que se producen a lo largo de la vida, comparado con el número de óvulos en la madre. Las células germinales masculinas presentan un gran número de divisiones celulares, lo cual puede explicar estos hallazgos mutacionales. Además, se calculó que por cada año adicional en la edad paterna en el momento de la concepción, aparecían 2 DNMs extra en el hijo. Sin embargo, el número de mutaciones transmitidas por la madre se mantenía constante año tras año (51). Estos resultados nos muestran que la edad paterna más alta conlleva un aumento del riesgo de padecer TEA debido a la acumulación de un mayor número de mutaciones. Sin embargo, esta hipótesis biológica solo revelaría un riesgo genético moderadamente mayor (sobre un 10-20%), por lo que se deben considerar otros mecanismos adicionales. Una hipótesis alternativa sugiere que la paternidad atrasada se correlaciona con una tendencia a las enfermedades neuropsiquiátricas, ya que los factores de riesgo genéticos para problemas psiquiátricos altamente hereditarios los compartirán padres mayores y su descendencia (52). Como vemos, este riesgo relacionado con la edad paterna está sujeto a una gran red de factores genéticos y epidemiológicos interrelacionados. 1.2.2.4. ESTUDIOS DE EXOMA EN LOS TEA. PRINCIPALES GENES DE RIESGO Las variantes raras y de novo constituyen la mayor contribución al riesgo individual para TEA (28, 34, 40). Cuando una variante rara interrumpe un gen más frecuentemente de lo esperado por azar, implica que este es de riesgo (60). Los genes de riesgo proporcionan información sobre los fundamentos de los TEA tanto individualmente (61, 62) como en conjunto (28, 34, 63, 64). En la última década se han realizado varios estudios de este tipo (Rubeis et al, 2014, Sanders et al, 2015), que han contribuido a aumentar paulatinamente la lista de genes de riesgo en los TEA. El ASC (Autism Sequencing Consortium) incrementa las cohortes de tríos en cada estudio, contribuyendo con este aumento del tamaño muestral a un mayor poder estadístico, que ha permitido encontrar nuevas variantes y genes de riesgo de los TEA. ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 20 ESTUDIO DE SATTERSTROM (65): En el último estudio de WES del ASC (Satterstrom et al, 2020), se llevó a cabo la mayor secuenciación de exoma en los TEA hasta la fecha. Se reunió una cohorte de 35.584 muestras, incluyendo 11.986 con TEA. Se introdujo un marco analítico mejorado, consiguiendo identificarse 102 genes asociados a TEA (FDR, false discovery rate ≤ 0.1). Para llegar a estos resultados, se consideraron tanto variantes de novo como heredadas (DNMs y CNVs), utilizando una herramienta de análisis denominada TADA (Transmission and De Novo Association Analysis). Se identificaron subgrupos dentro de los 102 genes asociados a TEA. Así, 49 genes mostraron frecuencias más elevadas de variantes disruptivas de novo en individuos con TND graves, mientras que 53 genes mostraron frecuencias más elevadas en individuos con TEA. Además, 13 de los genes asociados colocalizan con loci afectados de forma recurrente por las variantes del número de copias (CNVs) (65). Mediante la comparación de diferentes casos de TEA con mutaciones en estos grupos de genes, se reveló que también mostraban diferencias fenotípicas. Hay que considerar que a partir de los resultados de los estudios de exoma (genes asociados), se puede llegar a estudiar otras jerarquías biológicas que implican, por ejemplo, las rutas biológicas subyacentes a la patogénesis de los TEA. Para ello, se utilizan diferentes herramientas bioinformáticas que integran datos de expresión a nivel celular. En el estudio de Satterstrom, la mayoría de los genes mostraron una expresión temprana en el neurodesarrollo del cerebro y tienen un papel en la regulación de la expresión génica o en la comunicación neuronal, pudiendo aparecer un desequilibrio excitador-inhibidor subyacente en los TEA. En conjunto, estos conocimientos constituyen un importante paso para dilucidar la neurobiología de los TEA (65). Figura 1: Manhattan plot que muestra los 102 genes autosómicos asociados con TEA en el último estudio de exoma (65). ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 21 SFARI GENE: La base de datos de SFARI Gene constituye una plataforma desarrollada para permitir la evaluación sistemática de la evidencia genética de la comunidad para genes individuales relacionados con los TEA (66). Contiene una clasificación de genes con diferente score de riesgo para TEA (dependiendo de si los estudios tienen una evidencia constatada muy fuerte o no). Dentro de SFARI, el módulo Human Gene es una colección activa de genes candidatos identificados a través de estudios de asociación genética, genes vinculados a los TEA sindrómicos y genes en los que se han encontrado mutaciones raras que están vinculadas a TEA (66). En la última actualización, se agregaron un total de 30 genes nuevos al módulo de Human Gene, lo que lleva a un número total de 1.171. También se completó la anotación en profundidad de 641 variantes raras y 1331 variantes comunes, y se agregaron 74 nuevas referencias. Los genes y referencias añadidas incluyen:  De los 102 genes asociados a TEA que se identificaron en el estudio de Satterstrom et al., 24 fueron recientemente añadidos a SFARI Gene: AP2S1, MAP1A, MKX, SRPRA, GFAP, GNAI1, KIAA0232, LDB1, PHF12, SATB1, SKI, TM9SF4, VEZF1, ZMYND8, CORO1A, GABRB2, LRRC4C, NCOA1, NUP155, PPP1R9B, PPP5C, TEK, TRIM23, y UBR1.  Formas sindrómicas nuevas de TEA se asociaron a los genes ZMIZ1, TET3, SUPT16H, YWHAG, SRPRA.  Se agregó un total de 8 referencias recientemente seleccionadas y 292 registros de casos individuales al módulo Copy Number Variant (CNV) de SFARI Gene, que es un recurso paralelo que cataloga las deleciones y duplicaciones recurrentes de un solo gen y de múltiples genes en el genoma y describe su posible vínculo con el autismo (66). Así, se hace un total de 619 referencias seleccionadas.  El módulo de ratón (mouse model) se actualizó con datos de un total de 10 referencias. Los modelos de ratones derivados de genes de riesgo incluyeron los genes: CNTNAP2, PTEN, FMR1, CUL3, POGZ, SCN1A, MECP2, Y SHANK3. El módulo de Modelos animales de SFARI Gene examina datos de modelos animales utilizados en investigaciones de laboratorio para dilucidar los mecanismos de acción de los genes de riesgo de TEA. Ofrece una cobertura integrada de los últimos descubrimientos a nivel molecular, celular y conductual en TEA. Las anotaciones más destacadas incluyen:  CUL3: En el estudio de Dong et al. (67) se generaron ratones con deficiencia de CUL3, que manifestaron déficits sociales, mayor ansiedad, mayor transmisión glutamatérgica y excitabilidad neuronal. La inhibición farmacológica de EIF4G1, un objetivo de Cul3, y la inhibición quimiogenética de la actividad neuronal de las neuronas piramidales del ALBA BEN RIVAS INTRODUCCIÓN 22 hipocampo ventral, rescataron los déficits celulares y conductuales asociados a TEA en ratones con genes inactivados con Cul3.  EIF4G1: Los ratones con deficiencia de microexón EIF4G1 muestran déficits en el enfoque social y la memoria social, interacción social disminuida, memoria episódica deteriorada, y la plasticidad sináptica hipocampal alterada. También muestran una mayor expresión de proteínas sinápticas críticas incluyendo GluN1 (68).  POGZ: Ratones con knockdown del gen POGZ muestran alteraciones del desarrollo neuronal cortical, de la migración y de la diferenciación neuronal, aumento de la excitabilidad neuronal y alteración de la función de la red cortical madura. La inhibición compensatoria del aumento de la excitabilidad neuronal en mutantes de POGZ que usa el agente antiepiléptico Perampanel restaura la sociabilidad en ratones que portan mutaciones heterocigotas en Q1038R (69). 1.2.2.5. FUTURO EN GENÉTICA DE TEA A pesar de los importantes avances que se han realizado en los últimos años en el estudio de genética de los TEA, todavía existen limitaciones en la detección de DNMs, que tendrán que resolverse en futuros estudios (23). Ha quedado patente la necesidad de una fuente de información unificada y optimizada. Esta será una de las áreas más beneficiadas en futuras investigaciones. Así, se conseguirá descubrir nuevos factores genéticos implicados en la patogénesis de los TEA, estudiando el mayor número posible de familias y empleando diferentes métodos de detección de variantes, de novo indels, variaciones estructurales post-zigóticas, mosaicismos heredados de padres asintomáticos, mutaciones de novo en regiones no codificantes, etc. (28, 53). Todas estas fuentes de variabilidad genética se estudiarán también en detalle gracias a la secuenciación de genoma completo (WGS, Whole Genome Sequencing), que está permitiendo obtener información de las mismas en el restante 98% del genoma que no codifica para proteínas y que tiene principalmente una función reguladora. También se esperan nuevos abordajes bioinformáticos para permitir la implementación de estructuras de análisis integradas y adaptadas a la biología de TEA, y así definir mapas de rutas neurobiológicas implicadas más detalladas y válidas. ALBA BEN RIVAS ANTECEDENTES 23 2. ANTECEDENTES En este trabajo, partimos de tres tríos genéticos, es decir, tres pacientes con un diagnóstico clínico de TEA (probandos afectos) y sus respectivos padre y madre (progenitores sanos). El exoma de cada uno de los integrantes del trío fue secuenciado en el contexto de un proyecto de investigación. Así pues, de cada probando afecto, tenemos el conjunto de las variantes genéticas exónicas, anotadas funcionalmente con la herramienta ANNOVAR (ANNOtate VARiation) y organizadas en un archivo en formato Excel con extensión .xlsx. 2.1. HISTORIA CLÍNICA DE LOS PACIENTES. ASPECTOS FENOTÍPICOS DESTACADOS. A continuación, procedo a la caracterización fenotípica de los tres pacientes con TEA, que se nombrará como “Probando afecto 1”, “Probando afecto 2” y “Probando afecto 3”. 2.1.1. PROBANDO AFECTO 1  Se trata de un varón de 11 años.  Antecedentes personales y familiares: Fue un CIR (crecimiento intrauterino retardado).  Antecedentes familiares: Una tía materna presenta discapacidad intelectual.  Exploración física y clínica: TEA sindrómico. Dificultades motoras y dificultades para la comunicación verbal y no verbal (ausencia de lenguaje). Presenta epilepsia parcial compleja del lóbulo frontal. Cataratas congénitas bilaterales. Microcefalia y dismorfias.  Pruebas complementarias: Cariotipo normal, descartados X frágil y Síndrome de Angelman; RMN cerebral normal, con leve agenesia del cuerpo calloso. 2.1.2. PROBANDO AFECTO 2  Se trata de un varón de 21 años.  Antecedentes personales: Amenaza de parto pretérmino a los 5 meses de gestación. Finalmente, parto pretérmino a los 8 meses, mediante cesárea. Cribado de metabolopatías normal. Se le detectó poca fuerza muscular en los primeros meses de vida. ALBA BEN RIVAS ANTECEDENTES 24  Antecedentes familiares: Sin interés.  Exploración física y clínica: A los 2 años, se describió como un niño macrosómico, con clinodactilia (en el 5º dedo), pabellones auriculares ligeramente deformes. Se observó pliegue transverso único incompleto; facies plana; nariz respingona, ligera micrognatia. Prácticamente, ausencia de lenguaje. Padece DM1 (diabetes mellitus tipo 1), episodios de agitación y agresividad. Sufre también epilepsia.  Pruebas complementarias: Cariotipo normal; RMN y TAC cerebrales sin hallazgos patológicos; Arrays (estudio del genoma) y Potenciales evocados normales; analítica de orina anodina. 2.1.3. PROBANDO AFECTO 3  Se trata de una mujer de 24 años.  Antecedentes personales: Durante el segundo trimestre de embarazo, su madre sufrió varicela. Periodo neonatal sin incidencias.  Antecedentes familiares: Su madre presenta microcefalia. Su hermana sufre habitualmente migrañas.  Exploración física y clínica: La paciente se sigue desde los 8 meses en las consultas de Neuropediatría, diagnosticándose de un trastorno generalizado del desarrollo no especificado. Desde los 4 meses, presenta epilepsia, con las siguientes características: Mirada alta, reflejo de chupeteo, hiperextensión cervical y movilidad de extremidades. A los 5 años, sufre un status convulsivo, con infarto isquémico temporo-parietal derecho. A los 2 años (casi 3 años), se hace el diagnóstico de “Trastorno de la conducta adaptativo, social y del lenguaje”. Emplea gestos, ausencia de lenguaje. No aparecen conductas disruptivas.  Pruebas complementarias: o En el año 2010, la RMN cerebral informa de “ligera atrofia de surcos corticales a nivel parietal derecho”. o En el 2011, se sospecha deficiencia de MCAD (acil-CoA deshidrogenasa de cadena media). Se realiza estudio de acilcarnitinas, que muestra una muy ligera elevación de C5OH. El gen MCAD resultó negativo para mutaciones. o Cariotipo sin alteraciones; EEG y perfil metabólico normales. Estudio del genoma sin alteraciones significativas. o Se descartó síndrome de Williams, síndrome de Rett y síndrome de MELAS (encefalomiopatía mitocondrial).  Tratamiento: Carbamacepina (400-0-400) y Topiramato (150-0-125). ALBA BEN RIVAS ANTECEDENTES 25 2.2. TEST GENÉTICOS PREVIOS Anteriormente al desarrollo de este trabajo, se habían realizado ya una serie de pruebas genéticas para cada uno de los 3 probandos afectos. Se les había hecho un array previo, en el que no se identificó ninguna CNV clínicamente significativa. También habían pasado un cribado para X frágil, que resultó negativo. Y además, se había realizado un análisis de exoma, filtrando por genes previamente seleccionados por su asociación firmemente demostrada con algún trastorno del neurodesarrollo (n = 261), sin hallar tampoco ninguna variante clínicamente significativa en ninguno de los genes seleccionados. Por lo tanto, el siguiente paso, en el que se centra este trabajo, es analizar el exoma completo. ALBA BEN RIVAS MATERIAL Y MÉTODOS 32 requiere evaluar si el fenotipo del paciente es altamente específico para aquello observado en el gen donde se halla la variante. En ese caso, se sospechará de patogenicidad. Esto suele hacerse comparando el fenotipo clínico con aquellos ejemplos reportados en OMIM para casos con mutaciones patogénicas en el mismo gen. Alternativamente, se debe evaluar la posibilidad de una causa alternativa desencadenante del fenotipo observado, lo que se traduce en la presencia de otra variante con un mayor nivel de evidencia para explicar el cuadro clínico observado.  Por otro lado, se debe evaluar la existencia de reportes previos donde se haya clasificado la variante como patogénica o benigna. Si bien parece simple, esta categoría es una de las más discutidas y donde se observan mayores diferencias de interpretación. En este contexto, la recomendación del ACMG, es utilizar una fuente independiente donde se haya analizado la misma variante en un contexto clínico y se tenga una asignación de “patogénica” o “benigna.  El último grupo analiza la evidencia asociada a la segregación de la variante dentro del grupo familiar, valorando si concuerda o no con el modelo de herencia propuesto para la patología, o si se ha verificado que la variante es de novo. Una vez asignados los códigos correspondientes a la variante de interés, estos se combinan para dar como resultado la clasificación de la misma en “patogénica”, “probablemente patogénica”, “variante de significado incierto”, “probablemente benigna” o “benigna” (70). Se debe de tener en cuenta que el ACMG sólo ha hecho unas recomendaciones, que son específicas para trastornos de herencia mendeliana. Los TEA son trastornos complejos, en los que son comunes los fenómenos de penetrancia incompleta y expresividad variable. Por lo tanto, las guías de la ACMG deben ser interpretadas con cautela en el diagnóstico de individuos con TEA. ALBA BEN RIVAS RESULTADOS 33 5. RESULTADOS Tras la priorización y la clasificación de las variantes genéticas, estudiándolas una a una, obtuvimos los siguientes resultados: 5.1. PROBANDO AFECTO 1 No se identificaron variantes patogénicas. La gran mayoría de las variantes genéticas presentaron criterios de evidencia para su clasificación como “benignas” o “probablemente benignas”. No obstante, podemos destacar las siguientes variantes, que fueron clasificadas como “de significado incierto” por los motivos que se comentarán posteriormente: Tabla 4: Variantes genéticas susceptibles de patogenicidad en el Probando afecto 1  Encontramos una variante en el gen SRD5A3: Esta inserción de cuatro pares de bases, en heterocigosis, y heredada de la madre, en el gen SRD5A3, provoca un cambio en la pauta de lectura y la consiguiente aparición de un codón de parada prematuro, dando lugar a una proteína truncada. Variantes patogénicas en este gen se asocian con “Trastorno congénito de la glicosilación tipo Iq” (OMIM #612379) y “Síndrome de Kahrizi” (OMIM #612713). Gen Posición Variante genética Enfermedad asociada Manifestaciones clínicas Herencia Clasificación ACMG SRD5A3 4q12 NM_02459 2:exon3:c.5 46_547ins ATGG:p.P 182fs Trastorno congénito de la glicosilación de tipo Iq, Sdme de Kahrizi Retraso psicomotor, hipotonía, alteraciones oculares, cutáneas, endocrinas. AR Significado incierto LAMC3 9q34.12 NM_00605 9:exon13:c. 2282C>T:p .S761L Malformaciones corticales occipitales Epilepsia, anomalías oculares, desarrollo psicomotor retrasado AR Significado incierto LGI1 10q23.33 NM_00130 8275:exon6 :c.625C>T: p.R209C,L GI1 Epilepsia familiar en el lóbulo temporal Epilepsia, crisis parciales y generalizadas, auras auditivas AD Significado incierto SLC1A2 11p13 NM_00119 5728:exon9 :c.1090C>T :p.R364C,S LC1A2 Encefalopatía epiléptica infantil temprana Epilepsia, retraso psicomotor y mental, hipotonía AD Significado incierto ALBA BEN RIVAS RESULTADOS 34 Las principales manifestaciones clínicas asociadas al “Trastorno congénito de la glicosilación tipo Iq” descritas en OMIM son las siguientes: braquicefalia, implantación baja de orejas, anomalías oculares (coloboma hipertelorismo, nistagmus, hipoplasia del disco óptico, pérdida visual variable), puente nasal deprimido, alteraciones cutáneas (dermatitis ictiosiforme, hiperqueratosis, pigmentación oscura en rodillas y dorso de manos y pies, hipertricosis) y anomalías neurológicas (retraso mental, hipotonía, desarrollo motor retrasado, hipoplasia de la hipófisis, polimicrogiria, hipoplasia del vermis cerebelar), endocrinológicas (IGF1 y IGFBP3 bajos), hematológicas (anemia microcítica, defectos de la coagulación, deficiencia de antitrombina III) y hepatológicas (transaminasas elevadas). Con respecto al “Síndrome de Kahrizi”, es un trastorno de herencia AR, que se describe con las siguientes manifestaciones clínicas en OMIM: anomalías oculares (coloboma, cataratas), amplio puente nasal, labios gruesos, anomalías esqueléticas (contracturas, cifosis torácica), cutáneas (hemangioma capilar) y alteraciones neurológicas (retraso mental severo, retraso en el desarrollo psicomotor, discurso no adquirido) Así pues, las manifestaciones clínicas que se han descrito en ambos trastornos relacionados con variantes patogénicas en SRD5A3, se asemejan al fenotipo del probando afecto 1, desarrollado en el apartado “Antecedentes” de este trabajo. Este también presenta anomalías oculares (cataratas congénitas bilaterales), déficits de comunicación verbal y no verbal, y dificultades motoras. Esta variante se ha clasificado como “patogénica” en Varsome, según los criterios del ACMG. Sin embargo, al estar asociada a trastornos de herencia AR y no haber detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, esta mutación por sí sola no explica el fenotipo del paciente. Por este motivo, la podemos clasificar como “de significado incierto”.  También encontramos una variante en el gen LAMC3: Se trata de una variante en heterocigosis, heredada de la madre, en el gen LAMC3, que provoca un cambio aminoacídico en la proteína resultante. Variantes patogénicas en este gen se asocian con un trastorno AR, llamado “Malformaciones corticales occipitales” (OMIM #614115). Este se define por las siguientes manifestaciones clínicas en OMIM: anomalías oculares (pérdida de visión episódica, agudeza visual disminuída, estrabismo), neurológicas (ataques epilépticos tónico-clónicos y ausencias, con debut de los 2 a los 11 años, desarrollo psicomotor retrasado, síntomas autonómicos, paquigiria y polimicrogiria occipital, alteraciones del EEG). Coinciden con el fenotipo del probando afecto 1 en cuanto a las anomalías oculares y la epilepsia. Esta variante presenta criterios de patogenicidad. Sin embargo, está asociada a un trastorno AR y no se encontró una segunda variante patogénica. No obstante, se debe destacar el hecho de que se identificaron 3 variantes raras, aunque sin criterios de patogenicidad, que habían sido heredadas del padre y que, por tanto, se localizaron en el otro alelo. Por todo ello, se ha clasificado la variante como “de significado incierto”. ALBA BEN RIVAS RESULTADOS 35  Hallamos una variante en el gen LGI1: Se trata de una variante en heterocigosis, heredada del padre, en el gen LGI1, que provoca un cambio aminoacídico en la proteína resultante. Mutaciones patogénicas asociadas a este gen se relacionan con un trastorno AD (autosómico dominante), denominado “Epilepsia familiar del lóbulo temporal” (OMIM #600512), que se define con las siguientes manifestaciones clínicas en OMIM: epilepsia del lóbulo temporal, crisis epilépticas parciales simples y complejas, crisis tónico-clónicas generalizadas, auras auditivas, sonidos simples no formados (zumbidos, timbres, clics, zumbidos), características auditivas complejas (voces, música), distorsionadas (cambios de volumen, amortiguación), cognitivas (afasia receptiva) y reflejos auditivos (convulsiones precipitadas por sonidos). Coincide con el fenotipo del probando afecto 1 la presencia de epilepsia. Esta variante genética justifica la epilepsia, pero es heredada de un progenitor sano. Teniendo en cuenta que la penetrancia de este trastorno podría ser incompleta, la variante se clasificó como “de significado incierto”.  Por último, encontramos una variante genética en el gen SLC1A2: Se trata de una variante en heterocigosis, heredada del padre, en el gen SLC1A2, que provoca un cambio aminoacídico en la proteína resultante. Mutaciones patogénicas en este gen se asocian a un trastorno AD, denominado “Encefalopatía epiléptica infantil temprana, 41” (OMIM #617105), que se define con las siguiente manifestaciones clínicas en OMIM: crecimiento general pobre, microcefalia, dificultad para el seguimiento y la fijación ocular, dificultades para la alimentación, contracturas musculares, cifoescoliosis, hipotonía muscular, y alteraciones neurológicas (encefalopatía epiléptica, crisis epilépticas de múltiples tipos, alteraciones en el EEG, retraso en el desarrollo global, retraso mental profundo, letargia, irritabilidad, discurso pobre, incapacidad para andar o sentarse, espasticidad, movimientos discinésicos, hipometilación cerebral, atrofia supratentorial, cuerpo calloso fino). Coincide con el fenotipo del probando afecto 1 en la microcefalia, la epilepsia, la agenesia del cuerpo calloso, el déficit de comunicación verbal y las dificultades motoras. Esta variante, como la anterior, justifica la epilepsia, pero es heredada de un progenitor sano. Por tanto, considerando que la penetrancia de este trastorno podría ser incompleta, queda clasificada como “de significado incierto”. 5.2. PROBANDO AFECTO 2 No se identificaron variantes patogénicas. La gran mayoría de las variantes genéticas presentaron criterios de evidencia para su clasificación como “benignas” o “probablemente benignas”. No obstante, podemos destacar la siguiente variante, que fue clasificada como “de significado incierto” por los motivos que se comentarán posteriormente: ALBA BEN RIVAS RESULTADOS 36 Tabla 5: Variante genética susceptible de patogenicidad en el Probando afecto 2  Encontramos una variante en el gen ABAT: Se trata de una variante en heterocigosis, heredada de la madre, en el gen ABAT, que provoca un cambio aminoacídico en le proteína resultante. Mutaciones patogénicas en este gen se asocian a un trastorno AR, denominado “Deficiencia de GABA transaminasa” (OMIM #613163), que se describe con las siguientes manifestaciones clínicas en OMIM: crecimiento lineal acelerado, retrognatia, fisuras palpebrales bajas, hipotonía muscular, anomalías neurológicas (retraso severo en el desarrollo psicomotor, crisis epilépticas refractarias, hiperreflexia, postura tónica, letargia, leucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, hipoplasia cerebelar, quiste de la fosa posterior), llanto agudo y alteraciones analíticas (aumento del ácido gamma-aminobutírico en plasma, en orina y en LCR (líquido cefalorraquídeo), aumento de beta-alanina, aumento de la hormona del crecimiento y disminución de la actividad hepática de GABA). Coincide con el fenotipo del probando afecto 2 en el retraso psicomotor, la hipotonía en los primeros meses de vida y la epilepsia. Esta variante se ha clasificado como “de significado incierto” en ClinVar, según los criterios del ACMG. Sin embargo, al estar asociada a trastornos de herencia AR y no haber detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, esta mutación por sí sola no explica el fenotipo del paciente. Por este motivo, la podemos clasificar como “de significado incierto, probablemente benigna”. 5.3. PROBANDO AFECTO 3 Se ha encontrado una variante que ha sido clasificada como “patogénica” en este paciente. Por lo tanto, conseguimos llegar así a su diagnóstico genético. Tabla 6: Variante genética patogénica en el Probando afecto 3 Gen Posición Variante genética Enfermedad asociada Manifestaciones clínicas Herencia Clasificación ACMG ABAT 16p13.2 NM_0006 63:exon14 :c.1157C> T:p.P386L Deficiencia de GABA transaminasa Epilepsia, retraso psicomotor severo AR Significado incierto, probablemente benigna Gen Posición Variante genética Enfermedad asociada Manifestaciones clínicas Herencia Clasificación ACMG RHOBTB2 8p21.3 NM_001 160037:e xon3:c.31 4G>A:p. G105E Encefalopatía epiléptica infantil temprana Epilepsia, discapacidad intelectual, retraso psicomotor, ausencia de habla AD, de novo Patogénica ALBA BEN RIVAS RESULTADOS 37  Esta variante diagnóstica se encuentra en el gen RHOBTB2: Se trata de una variante en heterocigosis y de novo en el gen RHOBTB2, que provoca un cambio aminoacídico en la proteína resultante. Se puede clasificar como una variante patogénica, porque es de novo, no se ha descrito previamente en la población general, predictores teóricos de su efecto sugieren que sea patogénica y, además, justifica toda la patología. Variantes patogénicas en ese gen se asocian a “Encefalopatía epiléptica infantil temprana, 64” (OMIM #618004), que se define en OMIM como un trastorno del neurodesarrollo de herencia AD, caracterizado por la aparición de crisis epilépticas y status epiléptico (tienden a responder al tratamiento médico), asociado a discapacidad intelectual (desde moderada a profunda), mielinización retrasada, microcefalia, cuerpo calloso fino, ventrículos engrandecidos, atrofia cortical e hipoplasia cerebelar. También se presenta un desarrollo psicomotor deficiente (movimientos anormales, hipotonía, distonía, e incluso hemiparesia en algún caso) y habla pobre o ausente. Además, incluye características dismórficas inespecíficas (micrognatia, orejas grandes, puente nasal deprimido labio superior fino). Dentro de las manifestaciones psiquiátricas, presenta movimientos estereotípicos y anormalidades del comportamiento. Este cuadro presenta gravedad variable y debuta generalmente en el primer año de vida. Suele ser causado por una mutación de novo. Se describe, como vemos, un fenotipo que coincide con la clínica del probando afecto 3, desarrollada en el apartado “Antecedentes” de este trabajo. Esta incluye la epilepsia, el status convulsivo, la atrofia de surcos corticales y la discapacidad intelectual con ausencia del lenguaje. ALBA BEN RIVAS DISCUSIÓN 38 6. DISCUSIÓN 6.1.PROBANDO AFECTO 1 Con la variante identificada en el gen SRD5A3, clasificada como “patogénica” en Varsome, no podemos alcanzar un diagnóstico, ya que al estar asociado a un trastorno AR, necesitaríamos hallar otra variante en el mismo gen para ello. Sin embargo, las manifestaciones clínicas y el fenotipo del probando afecto 1 coinciden con el síndrome asociado a este gen, el “Trastorno congénito de la glicosilación de tipo Iq”. En realidad, ste trastorno engloba a múltiples errores innatos del metabolismo, que se producen por una deficiencia de la enzima esteroide 5-alfa-reductasa 3 (SRD5A3), lo cual conlleva una incorrecta glicosilación de proteínas y lípidos. Debido a las importantes funciones biológicas de los oligosacáridos, tanto en las glucoproteínas como en los glucolípidos, la síntesis incorrecta de estos compuestos da como resultado amplias manifestaciones clínicas multisistémicas. Este amplio espectro fenotípico todavía no se ha caracterizado completamente, ya que solo se han reportado unos pocos individuos afectados (71). Al tratarse de un trastorno multiorgánico, puede haber síntomas descritos dentro de esta entidad que aún no haya manifestado el paciente y que aparezcan a posteriori. Por lo tanto, resulta de vital importancia realizar un seguimiento activo del paciente, para llegar a un diagnóstico precoz, que mejorará el pronóstico y la calidad de vida del paciente. Llegados a este punto, en el que tenemos una sola variante genética en el gen SRD5A3, pero el fenotipo del probando afecto nos coinciden con las manifestaciones clínicas del trastorno asociado al gen, estudiamos la posibilidad de que exista una segunda variante patogénica, que aún no se pudo detectar, por diversas razones: i) que la variante esté localizada en una región no analizada (regiones intrónicas, regiones reguladoras o no accesibles), ii) que esa segunda mutación sea una variante que no podemos detectar con esta aproximación (secuenciación de exoma completo); por ejemplo, podría tratarse de CNVs, inserciones, inversiones, etc. En este caso, podríamos proceder a hacer más pruebas, para completar el estudio. El test de diagnóstico para todos los tipos de Trastornos congénitos de la glicosilación, CDG (Congenital Disorders of N-Linked Glycosylation), es el análisis de las glucoformas de transferrina en suero. Esta prueba de diagnóstico se realiza por enfoque isoeléctrico (IEF) o por electroforesis capilar, para determinar el número y la presencia de residuos de oligosacáridos N-ligados sialilados incompletos unidos a la transferrina sérica (71). Parece la prueba más adecuada para realizar a continuación debido a su buena relación de coste-beneficio. Después de esta prueba, si los resultados obtenidos no resultan suficientemente claros, se podría continuar con otras pruebas moleculares genéticas, con el objetivo de buscar esa segunda variante patogénica. Esto implicaría el uso de pruebas genómicas más completas, incluida la secuenciación del genoma completo (71). Con ella se cubriría el espectro total de la variabilidad genética, podríamos buscar CNVs a mayor resolución que un array, o variantes situadas en regiones que no hayan sido cubiertas en la secuenciación de exoma completo, llevada a cabo en este trabajo. ALBA BEN RIVAS DISCUSIÓN 39 Esta aproximación, aunque conlleva un coste adicional, puede ser importante para los progenitores, pues en caso de encontrar al segundo portador, esto podría ser de ayuda para proporcionarles un consejo genético adecuado, ante la posibilidad de que quieran tener más hijos en un futuro. 6.2. PROBANDO AFECTO 2 En este paciente hallamos una variante en el gen ABAT, pero al asociarse a un trastorno AR (“Deficiencia de GABA transaminasa”), necesitaríamos hallar otra variante genética para alcanzar un diagnóstico. En estos casos, siempre se puede decir que la otra variante podría estar presente, sin haber sido detectada todavía. Sin embargo, este trastorno tiene muchas anomalías metabólicas asociadas que deberían haber sido detectadas en nuestro probando. Entre ellas, destacan las siguientes alteraciones en parámetros analíticos: aumento del ácido gamma-aminobutírico en plasma, en orina y en líquido cefalorraquídeo, aumento de beta-alanina, aumento de la hormona del crecimiento y disminución de la actividad hepática de GABA. Teniendo en cuenta que una metabolopatía es lo primero que se descarta, parece muy poco probable que esta sea la causa de la patología del paciente, ya que no consta que se hayan detectado estas anomalías en analíticas previas. Ante el fenotipo sindrómico del paciente, es probable que la causa del trastorno sea genética. Habiéndose hecho ya todos los test genéticos que se han realizado, la siguiente opción es la de completar el estudio con la secuenciación del genoma completo (WGS, Whole Genome Sequencing). Esta consiste en secuenciar la totalidad del genoma humano, sin limitarnos a las regiones codificantes, es decir, incluyendo también aquellas regiones intrónicas e intergénicas, no codificantes y con funciones reguladoras, que tienen cada vez más importancia (74) y que son excluidas en el caso de la secuenciación de exoma completo (WES). Por lo tanto, la WGS ofrece un análisis genético más completo que la WES, permitiendo el diagnóstico molecular de enfermedades genéticas raras y no diagnosticadas (75). Además, la WGS puede reducir la duración del proceso diagnóstico molecular, lo que proporcionaría beneficios médicos y económicos, así como un profundo impacto psicosocial en el paciente y su familia (75). En un futuro cercano, la WGS probablemente reemplazará a los microarrays como el test genético estándar para los TEA (76). Cabe destacar que la WGS tiene una desventaja, los hallazgos incidentales. La WGS identifica con frecuencia variantes genéticas patogénicas, de potencial importancia para el niño o la familia, pero que no están relacionadas con la patología a estudio (77). Informar hallazgos incidentales es controvertido, especialmente en población pediátrica, ya que los sujetos no se consideran legalmente competentes cuando se les hace la prueba, pero ganarán competencia a medida que crezcan (78). ALBA BEN RIVAS DISCUSIÓN 40 6.3. PROBANDO AFECTO 3 En este paciente hemos conseguido llegar a un diagnóstico genético. Se ha encontrado una variante genética de novo en el gen RHOBTB2, que se asocia a un trastorno, la “Encefalopatía epiléptica infantil temprana”, cuyas manifestaciones clínicas coinciden en su mayoría con el fenotipo del probando afecto. RHOBTB2 codifica para la proteína 2 del dominio BTB relacionada con Rho, una pequeña Rho GTPasa atípica, que es un adaptador específico de sustrato o un sustrato en sí mismo para el complejo ubiquitín ligasa de la proteína Cullin-3 (CUL3) (72). Aunque el papel de las Rho GTPasas típicas y otras proteínas unidas a Rho en la plasticidad sináptica y en la disfunción cognitiva es ampliamente reconocido, el papel de las Rho GTPasas atípicas (como RHOBTB2) en el neurodesarrollo apenas se ha caracterizado (73). Se encontraron mutaciones de novo missense en cierto dominio de RHOBTB2. Los experimentos de transfección en células neuronales revelaron que la forma mutnte de RHOBTB2 era más abundante que la RHOBTB2 de tipo salvaje (wild type), debido al funcionamiento anormal del proteosoma. Este estudio, tanto genético como funcional, parece indicar que las mutaciones en RHOBTB2 son una causa genética rara de encefalopatía epiléptica, en la que la encefalopatía aguda podría ser un rasgo característico. Además, la regulación precisa de los niveles de RHOBTB2 parece ser esencial para un funcionamiento normal del cerebro (72). Por otro lado, se ha visto que cantidades elevadas de RhoBTB (familia de proteínas a la que pertenece RHOBTB2) in vivo se asocian con susceptibilidad a ataques y defectos locomotores severos en Drosophila. La disminución de los niveles de RhoBTB en las dendritas resultó en un menor nivel de desarrollo dendrítico (73). En un estudio reciente (72), se identificaron tres variantes de novo mediante WES en RHOBTB2 en tres pacientes con encefalopatías epilépticas. Curiosamente, los tres pacientes mostraron encefalopatía aguda (estado epiléptico febril), con una RMN en la que se observaba inflamación del hemisferio o difusión reducida en varias regiones del cerebro, seguida de atrofia cerebral posterior (72). Esto coincide con el fenotipo del probando afecto 3, que sufrió a los 5 años un status convulsivo a causa de un infarto isquémico cerebral. En otro estudio relacionado con el mismo gen (73), se han identificado variantes de novo y de cambio de sentido (missense) en la región que codifica el dominio BTB de RHOBTB2 en diez individuos con un fenotipo similar, incluyendo epilepsia de inicio temprano, discapacidad intelectual severa, microcefalia postnatal y trastornos del movimiento. Además, se hallaron imágenes que mostraban anomalías atróficas e infarto cerebral (73). Todas estas manifestaciones clínicas son coincidentes con el fenotipo del probando afecto 3. ALBA BEN RIVAS CONCLUSIONES 41 7. CONCLUSIONES El principal objetivo de este trabajo ha sido realizar un análisis de exoma completo en 3 tríos de TEA (un probando afecto y dos progenitores sanos), en busca de variantes genéticas que sirvan para proporcionar un diagnóstico genético de cada uno de los probandos. Se han utilizado diferentes bases de datos y criterios de filtrado para llevar a cabo la priorización y la clasificación de las variantes, según los criterios del ACMG. Tras estos procesos, obtuvimos los siguientes resultados: En el probando afecto 1, no se identificaron variantes patogénicas. Sin embargo, destacamos una serie de variantes, localizadas en los genes:  SRD5A3: La variante se clasificó como “patogénica” en Varsome. Sin embargo, al estar asociada a trastornos AR (“Trastorno congénito de la glicosilación tipo Iq” y “Síndrome de Kahrizi) y no haber detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, no puede ser diagnóstica, y se clasifica como “de significado incierto”. Puede que exista una segunda variante patogénica aún no detectada, por estar localizada en una región que no hemos analizado con la WES. Por tanto, para completar el estudio, primero se realizaría un análisis de las glucoformas de transferrina en suero, y posteriormente se podría hacer una secuenciación del genoma completo, para cubrir el espectro total de la variabilidad genética.  LAMC3: Esta variante presenta criterios de patogenicidad; sin embargo, al estar asociada a un trastorno AR (“Malformaciones corticales occipitales”) y no encontrarse una segunda variante patogénica, se clasifica como “de significado incierto”.  LGI1: Esta variante genética justifica la epilepsia, pero al estar asociada a un trastorno AD y de penetrancia incompleta (“Epilepsia familiar del lóbulo temporal”) y heredarse de un progenitor sano, se clasificó como “de significado incierto”.  SLC1A2: Esta variante genética justifica la epilepsia, pero al asociarse a un trastorno AD y de penetrancia incompleta (“Encefalopatía epiléptica infantil temprana”), y ser heredada de un progenitor sano, se clasificó como “de significado incierto”. En el probando afecto 2, no se identificaron variantes patogénicas. Sin embargo, se puede destacar una variante localizada en el gen ABAT. Al estar asociada a un trastorno de herencia AR (“Deficiencia de GABA transaminasa”) y no haber detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, esta mutación por sí sola no explica el fenotipo del paciente, por lo que se clasifica como “de significado incierto, probablemente benigna”. El trastorno asociado a este gen tiene muchas anomalías metabólicas asociadas, que no se han detectado en nuestro probando. Por tanto, parece muy poco probable que esta sea la causa de la patología. De todas formas, ante el fenotipo sindrómico que presenta el paciente, la causa de su trastorno probablemente sea genética, por lo que el siguiente paso sería la secuenciación de genoma completo, sin limitarnos a las regiones codificantes únicamente. En el probando afecto 3, conseguimos llegar a su diagnóstico genético. Se ha encontrado una variante patogénica de novo que explica la patología del paciente, localizada en el gen RHOBTB2, asociado a un trastorno AD (“Encefalopatía epiléptica infantil temprana”). Se ha visto en estudios recientes que las mutaciones en RHOBTB2 son una causa genética rara de encefalopatía epiléptica y que es un gen implicado en el desarrollo dendrítico. Además, se ha ALBA BEN RIVAS REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48 (59) Karczewski, K.J., Francioli, L.C., Tiao, G. et al. The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature 581, 434–443 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7 (60) He, X., Sanders, S.J., Liu, L., De Rubeis, S., Lim, E.T., Sutcliffe, J.S., Schellenberg, G.D., Gibbs, R.A., Daly, M.J., Buxbaum, J.D., et al. (2013). Integrated model of de novo and inherited genetic variants yields greater power to identify risk genes. PLoS Genet. 9, e1003671. 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