Detección molecular de Streptococcus downii sp. nov. en la placa dental supragingival de personas con síndrome de Down y de población general no sindrómica

Programa de doctorado en Ciencias Odontológicas ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Eliane García Mato TESIS DE DOCTORADO Detección molecular de Streptococcus downii sp. nov. en la placa dental supragingival de personas con síndrome de Down y de población general no sindrómica Eliane García Mato ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS ODONTOLÓGICAS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2023 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS Dña. Eliane García Mato Título de la tesis: Detección molecular de Streptococcus downii sp.nov. en placa dental supragingival de personas con síndrome de Down y de población general no sindrómica Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, a 22 de agosto de 2023 Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D. Pedro Diz Dios En condición de: Tutor y Director Título de la tesis: Detección molecular de Streptococcus downii sp.nov. en placa dental supragingival de personas con síndrome de Down y de población general no sindrómica INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dña. Eliane García Mato, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 22 de agosto de 2023 Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D. Maximiliano Álvarez Fernández En condición de: Director Título de la tesis: Detección molecular de Streptococcus downii sp.nov. en placa dental supragingival de personas con síndrome de Down y de población general no sindrómica INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dña. Eliane García Mato, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 22 de agosto de 2023 Firma electrónica 17 Agradecimientos A mis directores, Maximiliano y Pedro, por darme esta oportunidad, por creer en mí y guiarme durante estos siete años. Esta tesis jamás hubiera sido posible sin vosotros. Pedro, gracias por todo el tiempo que me has dedicado, tu confianza y paciencia, y por todos los conocimientos que me has regalado, no sólo de odontología, sino de la vida. Tu pasión por la investigación y tu perseverancia han sido una lección de vida. Al Servicio de Microbiología del Hospital de Vigo en especial a Lucía, la microbiología en Galicia está en las mejores manos contigo. A todos mis compañeros de la Unidad de Pacientes Especiales de la USC, los que siguen y los que ya se han ido. A Jacobo por haberme acogido, enseñado tanto y poner en mis manos los medios necesarios para llevar a cabo no sólo esta tesis. A Eva por ser mi apoyo incondicional desde el primer momento, gracias por ser familia. A todos los que fueron mis tutores clínicos y tanto me habéis aportado: A Marta y Gemma, mis descubridoras de la operatoria, echando la vista atrás cuanto os habéis implicado conmigo. A Lucía por hacerme entender el duro camino de la endodoncia. A Marcio gran profesional y aunque de aspecto serio, las mejores bromas de especiales llevan tu firma. Al Dr. Feijoo, ha actuado como voz de la experiencia, preocupándose y solucionando siempre mis dudas, gracias padrino. A Iván, por transmitirme esa necesidad de estar siempre en movimiento de actualizarse y ser el ejemplo a seguir en el área de la odontopediatría. A Maite y Mery, por vuestra inmensa sabiduría y por vuestro apoyo y cario en todo momento. A Ana, por tus sabios consejos, perseverar y hacerme lograr éxitos en momentos complicados. A Carlos, por ser compañero y apoyar siempre hiciera lo que hiciese falta. A mis queridos Candela, María y Jorge, por ser los primeros en dejarme compartir un poco de conocimiento y disfrutar viéndoos despegar. En especial María por los largos viajes de recogidas de muestras haciéndolos cortos siempre con una sonrisa. A Carito, 18 Lu, Raquel y a mis ahijadas. Todo vuestro apoyo ha sido crucial para concluir el arduo camino emprendido. A mi equipo en Caamaño por hacer realidad un sueño y permitirme realizar lo que realmente me complementa. Todo un placer trabajar codo con codo con una de las personas más implicadas a nivel de la ortodoncia y con una entrega y cariño a los pacientes que me provoca total admiración. Muchas gracias Lucía, familia Caamaño, Flor, Maite, Chelo y Andrea el día a día con vosotros es un lujo. A mi equipo en Rueiro, capitaneado por dos grandes líderes, profesionales y sobretodo personas. David Millán y David Fdez espero poder trabajar a vuestro lado hasta jubilarme. Nacho, Belén, Mónica, Miri, Tere, Val, Rocío y Carla muchas gracias por haberme apoyado con vuestro cariño y alegría. A mi equipo en Pobra, muchas gracias por darme la oportunidad de iniciar mis pasos en la odontopediatria. A mis amigos de toda la vida, gracias por seguir ahí. A Vane. aunque a Kms de distancia siempre preocupada e interesada en mi línea de investigación gracias por tu cariño. A Patri, por ser hogar. A Ana Berdu, por encontrar siempre el momento perfecto para desconectar, escucharme y aconsejarme y, sobre todo, por regalarme tan buenos momentos. A Alexia, por tu locura, tus “buenos” planes y hacerme reír tantísimo. A Carlos, porque siempre se necesita a alguien cuerdo cerca. A Gabi, porque aunque tú no lo sepas fuiste la que me contagiaste la ilusión por la investigación, por hacerme la vida mucho más fácil y porque ya sabes que eres mi segunda hermana. A mi familia, a la que tanto quiero, es imposible agradeceros todo. Gracias a mis padres y a mis hermanos, por animarme siempre a hacer lo que me hace feliz. Por aguantar en primera línea todas mis quejas y preocupaciones acerca de esta tesis, y llenarme siempre de palabras de ánimo y buenos consejos. A Ro y Dani por estar siempre ahí, haber sido mis cómplices y creadores de sonrisas desde 1991. A todos mis tíos, padrinos y primos que gastaría una página más para nombraros a todos por su infinita paciencia y todo su amor. Sin vosotros no hubiera sido posible llegar hasta aquí. GRACIAS 19 RESUMEN Introducción Recientemente se ha identificado en la placa dental de un adolescente con síndrome de Down una nueva especie bacteriana que se denominó Streptococcus downii sp. nov. (abreviado a S. downii), que inhibe el crecimiento de S. mutans y de algunos patógenos periodontales. Objetivos El objetivo principal de este trabajo fue determinar la prevalencia de S. downii en la cavidad oral de personas con síndrome de Down y en la población general. Como objetivo secundario se planteó investigar si existía una correlación clínico-microbiológica entre la prevalencia de caries y/o de enfermedad periodontal, y la detección de S. downii. Metodología Se diseñó una PCR específica para el operón de bacteriocina (Clase IIb, familia lactobina A/cereina 7b) de S. downii, que se testó en muestras de placa dental supragingival de personas con síndrome de Down (n= 200) y en la población general (n= 100). Además, para confirmar la prevalencia de S. downii en la población general, se comparó el genoma completo de S. downii y de las regiones relacionadas con sus bacteriocinas, con los metagenomas de placa supragingival depositados en el Proyecto Microbioma Humano. Resultados Se detectó el gen específico de la bacteriocina de S. downii en un individuo con síndrome de Down (valores medios del ciclo umbral 20 (Cq)= 34,52; Equivalentes Genómicos de S. downii (EG)/µl= 13,00) y en un individuo del grupo control no sindrómico (Cq= 34,78; EG/µl= 4,93). La prevalencia de S. downii fue ≤1% tanto en el síndrome de Down como en la población general, lo que no permitió establecer correlaciones clínico-microbiológicas. Este resultado se confirmó al detectar solo un metagenoma con un valor de identidad nucleotídica media (ANI) próximo al 95% y una homología del 100% con los marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican bacteriocinas de clase IIb lactobiocin A/cerein 7B, entre los 127 metagenomas de placa supragingival depositados en el Proyecto Microbioma Humano. Conclusiones La tasa de detección de S. downii en la placa dental supragingival es muy baja, tanto en personas con síndrome de Down como en la población general. Aunque este hallazgo no permite establecer una correlación clínico-microbiológica, podría incluso acrecentar su interés como un potencial probiótico oral. Palabras clave Síndrome de Down; Streptococcus downii; Streptococcus mutans; salud oral; caries; enfermedad periodontal; probiótico 21 ABSTRACT Background A new bacterial species has recently been identified in the dental plaque of an adolescent with Down syndrome. The species is known as Streptococcus downii sp. nov. (abbreviated to S. downii), and it inhibits the growth of S. mutans and certain periodontal pathogens. Objectives The main aim of this study was to determine the prevalence of S. downii in the oral cavity of individuals with Down syndrome as well as in the general population. The secondary objective was to investigate whether there was a clinical-microbiological correlation between the prevalence of caries and/or periodontal disease, and the detection of S. downii. Methods A specific polymerase chain reaction for the operon of bacteriocin (class IIb lactobin A/cerein 7b family) was designed to detect S. downii in supragingival dental plaque specimens of individuals with Down syndrome (n=200) and in the general population (n=100). Moreover, to evaluate the prevalence of S. downii in the supragingival plaque of healthy individuals, we compared the whole genome and the regions related to S. downii bacteriocins against metagenomes of supragingival plaque of the Human Microbiome Project. Results We detected the specific gene of the S. downii bacteriocin in an individual with Down syndrome (Cq, 34.52; GE/uL, 13.00) and in an 22 individual of the nonsyndromic control group (Cq, 34.78 Cq; GE/uL, 4.93). The prevalence of S. downii was ≤1% both in Down syndrome and in the general population, which did not allow for clinicalmicrobiological correlations to be established. This result was confirmed by detecting only one metagenome with an ANIm with approximately 95% homology and with 100% homology with ORFs that code class IIb lactobiocin A/cerein 7B bacteriocins among the 127 metagenomes of the “Human Microbiome Project” tested. Conclusions The detection rate of S. downii in the supragingival dental plaque was very low, both in the Down syndrome individuals and in the nonsyndromic controls. Although this finding does not allow establishing a clinical-microbiological correlation, it could even increase its interest as a potential oral probiotic. Key words Down syndrome; Streptococcus downii; Streptococcus mutans; oral health; caries; periodontal disease; probiotic 23 RESUMO Introdución Recentemente identificouse na placa dental dun adolescente con síndrome de Down unha nova especie bacteriana que se denominou Streptococcus downii sp. nov. (abreviado a S. downii), que inhibe o crecemento de S. mutans e dalgúns patóxenos periodontales. Obxectivos O obxectivo principal deste traballo foi determinar a prevalencia de S. downii na cavidade oral de persoas con síndrome de Down e na poboación xeral. Como obxectivo secundario expúxose investigar se existía unha correlación clínico-microbiolóxica entre a prevalencia de carie e/o de enfermidade periodontal, e a detección de S. downii. Metodoloxía Deseñouse unha PCR específica para o operón de bacteriocina (Clase IIb, familia lactobina A/cereina 7b) de S. downii, que testouse en mostras de placa dental supraxinxival de persoas con síndrome de Down (n= 200) e na poboación xeral (n= 100). Ademais, para confirmar a prevalencia de S. downii na poboación xeral, comparouse o xenoma completo de S. downii e das rexións relacionadas coas súas bacteriocinas, cos metaxenomas de placa supraxinxival depositados no Proxecto Microbioma Humano. Resultados Detectouse o xene específico da bacteriocina de S. downii nun individuo con síndrome de Down (valores medios do ciclo limiar (Cq)= 34,52; Equivalentes Xenómicos de S. downii (EG)/µl= 13,00) e nun individuo do grupo control non sindrómico (Cq= 34,78; EG/µl= 24 4,93). A prevalencia de S. downii foi ≤1% tanto na síndrome de Down como na poboación xeral, o que non permitiu establecer correlacións clínico-microbiolóxicas. Este resultado confirmouse ao detectar só un metaxenoma cun valor de identidade nucleotídica media (ANI) próximo ao 95% e unha homoloxía do 100% cos marcos de lectura abertos (ORF) que codifican bacteriocinas de clase IIb lactobiocin A/cerein 7B, entre os 127 metaxenomas de placa supraxinxival depositados no Proxecto Microbioma Humano. Conclusións A taxa de detección de S. downii na placa dental supraxinxival é moi baixa, tanto en persoas con síndrome de Down como na poboación xeral. Aínda que este achado non permite establecer unha correlación clínico-microbiolóxica, podería mesmo acrecentar o seu interese como un potencial probiótico oral. Palabras chave Síndrome de Down; Streptococcus downii; Streptococcus mutans; saúde oral; carie; enfermidade periodontal; probiótico 25 Abreviaturas CAO-D: Dientes Cariados, Ausentes y Obturados ECC: Caries de Primera Infancia (en inglés) GBD: Estudio sobre la Carga Mundial de las Enfermedades (en inglés) OMS: Organización Mundial de la Salud SD: Síndrome de Down 33 1. INTRODUCCIÓN 1.1. LA CARIES 1.1.1. Definición La importancia del sistema estomatognático radica en su multifuncionalidad, que incluye la capacidad de hablar, sonreír, saborear, masticar, tragar y transmitir una serie de emociones a través de las expresiones faciales (Glick et al., 2016) Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la salud oral es un indicador clave de la salud general, el bienestar y la calidad de vida; las enfermedades orales, que pueden afectar a las personas a lo largo de toda su vida, provocan dolor, alteraciones anatómicas, limitaciones funcionales e incluso la muerte -como en el caso de los procesos oncológicos-, constituyendo una carga sanitaria, social y económica importante (OMS, 2016) La caries dental es una enfermedad infecciosa cuya prevalencia la convierte en la afección crónica más común de la infancia (USDHHS, 2000). Habitualmente se considera una entidad cuya aparición está mediada por la placa dental (biofilm), promovida por azúcares y modulada por múltiples factores de carácter biológico, ambiental y psicosocial, vinculados al entorno del individuo (Pitts et al., 2019). Se trata de una enfermedad dinámica, que resulta en un disbalance entre la desmineralización y la remineralización de los tejidos duros dentales (Pitts et al., 2017). Entre los factores concomitantes que participan en su etiopatogenia se incluyen: la acumulación de placa dental cariogénica, una superficie dental ELIANE GARCÍA MATO 34 susceptible por su morfología, disposición y composición, y la presencia de hidratos de carbono fermentables (Fejerskov et al., 2015). La caries condiciona la calidad de vida de los pacientes y ocasiona infecciones que incluso pueden requerir hospitalización y provocar complicaciones graves (Casamassimo et al., 2009). Un panel de expertos de la Asociación Internacional de Odontopediatría (por sus siglas en inglés, IAPD), en la conocida como declaración de Bangkok, propusieron una definición de Caries de Primera Infancia o Caries de Infancia Temprana (por sus siglas en inglés, ECC), estableciendo la siguiente diferenciación: según la definición común, es la caries dental en preescolares, de aparición frecuente, mayoritariamente no tratada y que tiene un profundo impacto en la vida de los niños; según la definición clínica, es la presencia de una o más superficies cariadas (cavitadas o no cavitadas), perdidas u obturadas (debido a caries), en cualquier diente primario de un niño menor de 6 años (Pitts et al., 2019). Dentro de la ECC, existe una subclasificación que es la Caries Severa de Primera Infancia (por sus siglas en inglés, S-ECC), que se define como cualquier signo de caries de superficies lisas en un niño menor de 3 años, mientras que en niños de 3-5 años se atribuye a la presencia de una o más cavidades de caries, dientes perdidos u obturados debido a caries, caries de superficies lisas en dientes anteriores primarios maxilares o una puntuación del índice cao (dientes temporales cariados, perdidos por caries u obturados) ≥4 (edad 3 años), ≥5 (edad 4 años) o ≥6 (edad 5 años) (Policy on ECC, 2009). La Organización Mundial de la Salud ya en 1987 admitió que la caries se consideraba una enfermedad con repercusión global (OMS, 1987). La estrecha relación bidireccional entre la salud oral y general, y su impacto en la salud y la calidad de vida de un individuo, proporciona una base conceptual sólida para la integración de la Introducción 35 atención médica oral en las estrategias generales de atención médica (Sabbah et al., 2019). 1.1.2. Epidemiología La caries dental se considera la enfermedad crónica más extendida en todo el mundo y constituye un importante desafío de salud pública a nivel mundial. En un estudio sobre la carga global de las enfermedades orales a nivel mundial, se estimó que en 2015 estas afectaban a 3.500 millones de personas y que la caries dental no tratada se encontraba entre las enfermedades no transmisibles más prevalentes (Kassebaum et al., 2015). Estos resultados confirmaron los de estudios epidemiológicos previos, ya que en 2010 se había estimado que 2.300 millones de personas tenían caries en la dentición permanente y más de 530 millones de niños en la dentición temporal (Kassebaum et al., 2015). La caries no tratada de los dientes permanentes tiene una prevalencia global superior al 40% para todas las edades en conjunto y es la afección más frecuente de las 291 enfermedades incluidas en el estudio de la carga global de la enfermedad; la caries dental no tratada afecta a 7 de cada 10 niños en la India, 1 de cada 3 adolescentes en Tanzania y casi 1 de cada 3 adultos en Brasil (FDI, 2015). Comparada con otras enfermedades infantiles, la caries de primera infancia es 5 veces más común que el asma y 7 veces más frecuente que la rinitis alérgica (USDHHS, 2000). En países en vías de desarrollo como la India, la prevalencia de S-ECC en niños entre 12 y 36 meses de vida alcanza el 21% (Mangla et al., 2017). La frecuencia de caries en la infancia ha aumentado en las dos últimas décadas en niños de 2 a 5 años en todo el mundo, convirtiendo las intervenciones en este grupo de edad en una prioridad asistencial a nivel global (AAPD, 2014a; Dye et al., 2010; USDHHS, 2000) ELIANE GARCÍA MATO 36 En noviembre de 2022 la OMS publicó un informe sobre el estado de la salud bucodental a nivel mundial; entre todas las regiones analizadas, la prevalencia más alta de caries en dientes deciduos en 2019 se focalizó en la Región del Pacífico Occidental (46%) y la más baja en la Región de África (39%). El número más alto de casos de caries en dientes deciduos en 2019 correspondió a la Región de Asia Sudoriental, con unos 135 millones de casos, y el más bajo a la Región Europea, con un número estimado de 41 millones de casos (OMS, 2022). Entre 1990 y 2019, la prevalencia global media de caries en dientes temporales disminuyó levemente en un 3% (con las mayores disminuciones en los países con altos ingresos económicos). El número de casos promedio a nivel mundial aumentó un 6%. Sin embargo, esta cifra oculta algunos aumentos significativos en el número de casos, que casi se duplicó (87%) en los países con ingresos bajos y alcanzó el 17% en los países con ingresos medios-bajos. Por el contrario, el número de casos disminuyó un 21% en los países con ingresos medios-altos y un 12% en los países con ingresos altos. Analizando los datos por localización geográfica, aunque se confirmó una disminución global en la prevalencia de caries en los dientes deciduos (la mayor reducción correspondió a la Región de Europa con un 7%), todas las disminuciones registradas fueron en general muy modestas (África 3%, América 2% y Sudeste de Asia 2%). Sólo el Mediterráneo Oriental mostró un ligero incremento en la prevalencia (1%). En cuanto a los cambios estimados en el número de casos, los mayores aumentos se registraron en África (87%) y en la Región del Mediterráneo Oriental (44%), mientras que en todas las demás regiones se detectaron disminuciones, siendo particularmente relevante el 23% de reducción observado en la Región del Pacífico Occidental (OMS, 2022). Introducción 37 En 2015, la Federación Dental Internacional publicó un importante estudio en un intento por ofrecer una visión mundial de la distribución de la caries dental en niños de 12 años, en el que paradójicamente la caries a esta edad era más frecuente en los países con ingresos moderados, en los que aproximadamente 2 de cada 3 caries no reciben tratamiento (FDI, 2015). Si bien esta descripción general resultó muy útil debido a las limitaciones existentes para la recopilación de datos, presentaba algunos sesgos metodológicos que han sido cuestionadas por los expertos: el período de recogida de información fue muy amplio (1994-2014), lo que dificulta realizar comparaciones entre países; el umbral de detección de caries aplicado fue la presencia de cavidades en esmalte o dentina, proporcionando una subestimación muy significativa de la prevalencia real de la enfermedad al excluir las caries en etapas iniciales y moderadas; el rigor en el diseño del muestreo, la capacitación y la calibración de los participantes, así como la representatividad de los grupos diana seleccionados en cada país fueron muy variables (Pitts & Zero, 2016). En la actualidad, la prevalencia global media estimada de caries en dientes permanentes es del 29% y el número de afectados supera los 2.000 millones de casos. La prevalencia estimada de caries en dientes permanentes para las regiones de la OMS oscila entre el 25% de la Región del Pacífico Occidental y el 34% de la Región de Europa. Los números de casos son más altos en la Región de Asia Sudoriental (526 millones) y en la Región del Pacífico Occidental (464 millones). Las diferencias detectadas entre países en función de los ingresos económicos son cada vez menores. Los países con mayor número de casos son los que tienen ingresos medios-bajos (816 millones) y medios-altos (690 millones). En su conjunto, los países con ingresos medios notifican el 75 % de los casos de caries no tratadas en dientes permanentes (Liu et al., 2022). ELIANE GARCÍA MATO 38 Aunque en la primera mitad del siglo XX ya se diseñaron índices y herramientas de registro para realizar estudios epidemiológicos de las enfermedades dentales, no fue hasta 1969 cuando Gimeno de Sande et al. llevaron a cabo el primer estudio epidemiológico de salud oral desarrollado en nuestro país (Gimeno et al., 1971). A partir de esta fecha, periódicamente se han ido realizando encuestas a nivel estatal, la mayoría promovidas por el Consejo General de Dentistas de España, siguiendo los criterios unificados de la OMS para estudios de carácter transversal. Coincidiendo con los resultados europeos de los últimos 30 años publicados por la OMS, en España los índices de salud oral relacionados con la caries dental indican una mejora en todas las franjas etarias. El índice CAOD (dientes cariados, ausentes y obturados) mostró una disminución sustancial de 4,2 a 1,1 en la década 1980-1990, estabilizándose en la primera década del siglo XXI. A pesar de tener uno de los niveles más bajos del mundo del número de dientes afectados a los 12 años, la prevalencia de caries entre los escolares españoles aumenta progresivamente desde el 17% a los 3 años hasta el 55% a los 12 años (Casals & García, 2014). Al analizar dos encuestas de salud oral realizadas en España en 1993 y 2020 por franjas etarias, se observó que en los escolares de 5-6 años el número de dientes afectados por caries permaneció estable en el período de estudio y que entre los adolescentes de 12 años el índice CAO descendió de 2,32 a 1,33; todos los adultos mayores que participaron en el estudió presentaba caries sin alteraciones en términos de prevalencia desde 1993 (Bravo et al., 2020). 1.1.3. Etiopatogenia Aunque durante años se han postulado diferentes teorías sobre la etiología de la caries dental, fundamentalmente se han divulgado tres hipótesis principales: la de la placa específica (Loesche, 1992), la de la Introducción 39 placa inespecífica, (Theilade, 1986) y la de la placa ecológica. (Marsh et al., 1994; Takahashi & Nyvad, 2011). La hipótesis de la placa específica (Loesche, 1992) se basaba en 4 premisas esenciales: 1. Las especies bacterianas Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei y Actinomyces odontolyticus, se aislan con frecuencia en las lesiones de caries cavitadas; 2. Estas bacterias inducen la formación de caries en animales cuando se alimentan con una dieta rica en sacarosa; 3. Son microorganismos muy acidogénicos y acidúricos; y 4. Estas especies bacterianas pueden producir glucano insoluble en agua, que promueve las adhesión bacteriana a la superficie del diente y a otras bacterias. La hipótesis de la placa inespecífica (Theilade, 1986) postulaba que la caries podía ser una consecuencia derivada de la producción de ácido por toda la microbiota y no por una sola especie bacteriana. Además, se sugirió que la caries era una enfermedad que se desarrollaba en dos fases, en las que las bacterias productoras de ácido desmineralizan primero el esmalte y después la dentina subyacente. La hipótesis de la placa ecológica proponía que la caries era el resultado de un cambio en el equilibrio de la microbiota residente, provocado por las alteraciones de las condiciones ambientales locales (Marsh, 2003). Posteriormente, se reconoció que la caries dental era una enfermedad multifactorial, en cuya aparición y desarrollo participan elementos microbianos, genéticos, inmunológicos, conductuales, ambientales y biológicos. La dieta, y en especial el consumo de azúcares, se considera el factor más importante asociado a la colonización de la cavidad bucal por bacterias cariogénicas (Sanz et al., 2013; Struzycka, 2014). La mayoría de las afecciones orales comparten factores de riesgo modificables con las principales enfermedades no transmisibles ELIANE GARCÍA MATO 40 (enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades respiratorias crónicas y diabetes), por lo que la incidencia de enfermedades orales y generales sigue un patrón semejante de disparidad entre diferentes grupos poblacionales (United Nations General Assembly, 2011). Entre estos factores de riesgo modificables se incluyen el consumo de tabaco y de alcohol, y las dietas con alto contenido de azúcares libres, que están aumentando de forma alarmante a nivel mundial. En 2019, se publicó un estudio realizado en Corea en el que se analizó la asociación entre la presencia de caries y la enfermedad coronaria, en una muestra poblacional de 234.597 adultos. En los pacientes con caries avanzada/severa, se obtuvo una relación dosisrespuesta entre el número de visitas al odontólogo y el riego de enfermedad cardiovascular (Kim et al., 2019). Algunos autores han sugerido que en el desarrollo de la caries intervienen factores primarios como el huésped (saliva y dientes), la microflora (microorganismos) y el sustrato (dieta), así como factores moduladores como la edad, el estrato socioeconmico, el nivel educativo, los hbitos alimenticios y la percepcin/procedimientos de higiene oral (Cerón-Bastidas et al., 2015). Kirthiga et al., en una revisión sistemática publicada en 2019, sólo refirieron un estudio previo en el que se habían evaluado los factores de riesgo de la ECC en el primer año de vida y subrayaron la necesidad de identificar y cuantificar los principales factores de riesgo de caries; además, en ese estudio no se hacía referencia a otros factores de riesgo reportados recientemente como el índice de masa corporal, los trastornos cognitivos maternos, el aumento de la permeabilidad del esmalte, la composición del esmalte o la influencia de las actitudes de los padres (Kirthiga et al., 2019). Introducción 41 • Factores ambientales Factores socioeconómicos La caries comparte los mismos determinantes sociales y las mismas desigualdades derivadas que muchas otras enfermedades orales. A pesar de la expansión generalizada de la caries, los estudios epidemiológicos globales estandarizados y confiables son limitados, principalmente porque los datos de salud bucal no están integrados en los sistemas de vigilancia nacional de enfermedades -especialmente en los países con ingresos bajos y medianos-, y porque las encuestas nacionales independientes son complejas y costosas, y en consecuencia no son prioritarias (FDI, 2015). El determinante socioeconómico siempre se ha referenciado como un factor sustancial que causa desigualdades en el estado de salud oral en diferentes países. Sin embargo, en una revisión sistemática publicada en 2014, en la que se evaluó el estado de salud oral en 83 países desarrollados y 66 países en vías de desarrollo, se indicó que el nivel socioeconómico estaba significativamente asociado con el riesgo de caries y que este era más elevado en los países desarrollados (Schwendicke et al., 2015). Según un informe publicado por la FDI en 2015 (FDI, 2015), la carga de caries para los niños de 12 años es más alta en los países con ingresos económicos medianos, en los que aproximadamente dos tercios de las lesiones no están tratadas; si bien los países con bajos ingresos tienen una incidencia menor de caries, estas casi no se tratan, lo que refleja la debilidad de los sistemas de salud bucodental; incluso en países con altos ingresos, más de la mitad de las caries no se tratan. En contraste con los resultados de este trabajo, Babo Soares et al. (Babo Soares et al., 2016) evaluaron el estado de salud oral de niños y adolescentes con edades comprendidas entre los 6 y los 17 años en un área geográfica deprimida (Timor-Leste), y concluyeron que la caries ELIANE GARCÍA MATO 48 riesgo de caries; esta propuesta se fundamenta en numerosos estudios efectuados en diferentes países incluyendo Países Bajos (van der Tas et al., 2016), Noruega (Mock-Munoz de Luna et al., 2019), Serbia (Tušek et al., 2020), Suecia (Julihn A et al., 2021) y España (Rodríguez-Álvarez et al., 2022). En una revisión sistemática en la que se seleccionaron artículos publicados entre 1999 y 2010, se señaló que la frecuencia de caries era mayor en personas de raza negra y en mulatas (Boing et al., 2014). Sin embargo, en una investigación llevada a cabo en Reino Unido se observó que los individuos de raza blanca presentaban una mayor prevalencia de caries, aunque más del 90% de los participantes en este estudio eran de raza blanca, lo que pudo representar un sesgo importante (Hall-Scullin et al., 2017). En un estudio publicado en 2015, se señaló que existía una relación entre el riesgo de caries -evaluado mediante el índice caody el sustrato étnico, en función del país de nacimiento de los padres de los participantes; en Europa, los niveles más elevados de caries se detectaron en los países del Este y Turquía, y los más bajos en los países más Occidentales (Duijster, 2015). Se ha insinuado que la disparidad en la prevalencia de caries en base al sustrato étnico, podría deberse a diferencias en la adquisición de bacterias cariogénicas (Kirthiga et al., 2019). • Factores genéticos En la literatura científica, en la mayoría de los estudios publicados hasta la fecha, se analizaron genes relacionados con la formación del esmalte, su desarrollo y mineralización, como la enamelina (ENAM) (Gerreth et al., 2016; Linhartova et al., 2017), la calicreína (KLK4) (Cavallari et al., 2017) y los genes que expresan metaloproteinasa (Karayasheva et al., 2016). Otros investigadores estudiaron genes relacionados con la respuesta inmune, incluyendo la Introducción 49 lectina de unión a manosa (MBL) (Alyousef et al., 2017) y la defensina beta-1 (DEFB1) (Lips et al., 2017). Por último, también se han analizado genes relacionados con la composición de la saliva como la anhidrasa carbónica salival-6 (CA6) (Li et al., 2015) y la lactotransferrina (LTF) (Doetzer et al., 2015). Cavallari et al. (Cavallari et al., 2019) identificaron hasta 27 genes asociados al desarrollo de la caries, 23 de ellos interactuaban al menos con otro gen y algunos (TUFT1, VDR, TFIP11, LTF, HLADRB1, MMP2, MMP3 y MUC5B9) eran capaces de interaccionar con al menos otros 10 genes. La mayoría de los genes relacionados con la caries también se han asociado con otras expresiones patológicas como amelogénesis (KLK4, MMP20, ENAM, AMBN y AMELX), hipomineralización incisivo-molar (AMBN, MMP20 y AMBN), déficit de esmalte (AMBN), dentinogénesis imperfecta (DSPP) y anomalías morfológicas del diente (AMBN, AMELX, DSPP, ENAM, KLK4 y MMP20). Los genes asociados con caries también mostraron una correspondencia a nivel proteico, donde se demostró que MMP20, ENAM, AMELX y AMBN tienen hasta 6 interacciones, entre las que la más intensa correspondió al par TAS1R3 y TAS1R2. Estos autores investigaron las vías biológicas relacionadas con caries y encontraron varias vías canónicas asociadas con diferentes funciones y procesos celulares, como la de presentación antígena, la de inhibición de las metaloproteasas de la matriz, la señalización L-17 y la señalización HIF1a, que podrían correlacionarse directamente con varios fenotipos de caries, lo que contribuye a una mejor comprensión de esta enfermedad, ampliando las opciones para su control efectivo en el futuro (Cavallari et al., 2019). Se ha señalado que existen diferencias sustanciales en el perfil de los genes que se expresan cuando existen caries en la dentición temporal y en la definitiva (Bayram et al., 2015). Además, mediante estudios de metagenómica, se ha demostrado que en las lesiones de ELIANE GARCÍA MATO 50 esmalte predominan los genes que fermentan el azúcar de la dieta, mientras que en las caries dentinarias los genes preponderantes son los involucrados en el metabolismo de los glucanos (Simón-Soro et al., 2013b). • Factores microbiológicos Aún asumiendo que la caries es una enfermedad crónica multifactorial (Marsh et al., 2018), que se caracteriza por la desmineralización gradual del esmalte, la dentina y el cemento (Fejerskov et al., 2015), la formación de la lesión cariosa requiere de la presencia de bacterias de la placa dental que obtienen energía de los azúcares de la dieta (Fejerskov et al., 2008). Tradicionalmente, se ha considerado que S. mutans es la especie bacteriana directamente implicada en la etiología de caries (Loesche, 1986). Se demostró que los niños que presentaban una colonización oral con genotipos bacterianos coincidentes con los de sus madres tenían una elevada prevalencia de ECC, confirmando la transmisión vertical de S. mutans y la importancia del estado de salud oral de la madre como predictor de la de sus hijos (Childers et al., 2017; Subramaniam & Suresh, 2019). Además de su asociación con la aparición de la caries, S. mutans se ha considerado un patógeno involucrado en su evolución (Kim & Burne, 2017), en base a determinados rasgos celulares fisiológicos relacionados con la acidogenicidad (Valdez et al., 2016). También se acepta que S. mutans forma parte de una compleja comunidad polimicrobiana, en la que participan otras bacterias como S. salivarius o S. sobrinus (Gross et al., 2012). Sin embargo, se ha rebatido que la caries sea una enfermedad infecciosa, porque S. mutans puede estar también presente en localizaciones libres de caries, probablemente como una expresión de la biodiversidad bacteriana oral (Simón-Soro & Mira, 2015). La Introducción 51 composición bacteriana de la caries es tejido-dependiente, ya que en las lesiones no cavitadas del esmalte predominan Haemophilus spp. y Gemella spp., mientras que las caries de dentina presentan un alto porcentaje de Neisseria spp., Lactobacillus spp., Megasphaera spp., y Rothia spp., (Simón-Soro et al., 2014); también se determinó que los estreptococos más abundantes en las caries de esmalte eran S. mitis y en las de dentina S. sanguinis (Simón-Soro et al., 2014). Gracias a las técnicas de secuenciación masiva, se han obtenido nuevas evidencias de que la caries representa una disbiosis del microbioma oral, con una gran variabilidad intere intrapersonal (entre distintas localizaciones) (Mira, 2018). Recientemente, gracias a esta nueva tecnología, se ha podido analizar la organización y las inferencias sobre la dinámica de la comunidad y la ecología microbianas de diferentes partes de la cavidad oral (como el dorso de la lengua) (Wilbert et al., 2020). Recientemente, se ha descrito la microbiota asociada a espacios dentarios interproximales en adolescentes y adultos jóvenes, concluyendo que es una microbiota específica y estable a lo largo del tiempo, por lo que la presencia de bacterias potencialmente patógenas pueden aumentar el riesgo de desarrollo de caries e inflamación gingival en estas localizaciones (Carda-Diéguez et al., 2020). Simón-Soro et al. (Simón-Soro et al., 2013b), identificaron más de 500 especies bacterianas en tejido oral sano; señalaron que en las lesiones de esmalte predominaban S. mutans, S. gordonii, Neisseria spp., Fusobacterium spp. y Capnocytophaga spp., en las de dentina superficial Streptococcus spp. y Prevotella spp., y en las de dentina profunda Lactobacillus spp.. Además, el número de colonias y la variabilidad de especies se redujo significativamente a medida que progresaba la lesión de caries. En base a este y a otros estudios posteriores, se corroboró la etiología polimicrobiana de la caries (Simón-Soro & Mira, 2015), que está ocasionada por patobiontes, ELIANE GARCÍA MATO 52 bacterias endógenas benignas que tienen la capacidad de provocar determinadas patologías cuando se alteran las condiciones de un ecosistema (disbiosis) (Jochum & Stecher, 2020). 1.1.4. Tratamiento Aunque el tratamiento de la caries se puede abordar desde diferentes perspectivas, desde el punto de vista médico consistiría en eliminar el agente infeccioso y los tejidos dentales afectados, y en la restauración del diente remanente. Considerando la etiología bacteriana de la caries, el efecto de la terapia antibiótica sobre la microbiota oral se ha evaluado en pocos estudios, por la aparición temprana de resistencias a los antimicrobianos y porque los antibióticos no consiguen inhibir la desmineralización (Qiu et al., 2020). Un enfoque antimicrobiano alternativo y prometedor es la terapia con bacteriófagos o fagos; se trata de virus que penetran en las bacterias insertándoles su ADN y provocando la lisis celular, cuya principal ventaja es que atacan a cepas bacterianas específicas sin afectar significativamente a la flora oral comensal, con la ventaja añadida de que tienen capacidad para penetrar y desestructurar el biofilm dental (Shlezinger et al., 2017). En la última década, ya se aislaron y caracterizaron varios fagos con actividad anti-S. mutans, como M102 (Van der Ploeg, 2007), M102AD (Delisle et al., 2012), ɸAPCM01 (Dalmasso et al., 2015) y más recientemente SMHBZ8 (Ben-Zaken et al., 2021). Algunos inconvenientes de los fagos son su estabilidad limitada en solución -que puede provocar una reducción significativa en el título de fagos durante su procesamiento y almacenamiento-, y su susceptibilidad a factores de desnaturalización de proteínas, como altas temperaturas, pH y disolventes orgánicos. El proceso de remineralización está indicado para el tratamiento de caries de esmalte sin cavitación, mediante soluciones o geles a base de calcio, fosfatos, flúor o xilitol, o bien mediante laserterapia Introducción 53 (Khoroushi & Kachuie, 2017). Otros agentes como el nitrato de plata, el fluoruro de estaño y el fluoruro diamino de plata, también se han utilizado como cariostáticos, inhibiendo la progresión de la caries, disminuyendo la sensibilidad dental y remineralizando la dentina cariada (Horst, 2018; Mei et al., 2013; Zhi et al., 2013). Para intentar evitar la aparición y la progresión de las lesiones de caries, se han utilizado diferentes agentes con una potencial acción preventiva como el flúor, la clorhexidina, el xilitol y la arginina (Veiga et al., 2023). El flúor aumenta la resistencia del esmalte con la formación de fluoroapatita a partir de la hidroxiapatita e inhibe la producción de ácido proveniente de microorganismos fermentadores; de ahí su expansión mundial en programas preventivos de carácter comunitario (fluorización del agua de bebida), en iniciativas de higiene oral individuales (pastas de dientes fluoradas) y a nivel profesional (aplicación de geles y barnices de flúor) (Tenuta et al., 2023). La clorhexidina es un antimicrobiano catiónico de amplio espectro que reduce la formación de la película adquirida, la adhesión de las bacterias a la superficie dental y previene la transmisión de microorganismos cariogénicos (Autio-Gold., 2008; Dasanayake et al., 2002; Walsh et al., 2015); su acción es indiscriminada y por tanto su uso continuado puede desestabilizar el microbioma oral, con consecuencias que van desde favorecer una infección fúngica hasta provocar un aumento de la tensión arterial al disminuir la producción de óxido nítrico (vasodilatador) por las bacterias orales (Bescos et al., 2020; Bondonno et al., 2015; Bryan et al., 2017). En consecuencia, las estrategias antimicrobianas inespecíficas en general se consideran poco recomendables (Marsh et al., 2015; Mira, 2018). El xilitol es un polialcohol que interrumpe los procesos de producción de energía de S. mutans lo que conduce a la muerte ELIANE GARCÍA MATO 54 bacteriana, reduciendo los niveles de este microorganismo en la placa dental y en la saliva (Trahan et al., 1991). Se ha sugerido que el xilitol favorece la remineralización del esmalte y es eficaz en el control de la caries (Deshpande & Jadad, 2008). En una revisión sistemática publicada recientemente se indicó que los productos que contienen xilitol (pastillas, caramelos y chicles, alimentos, pasta de dientes y colutorios) previenen las caries de forma significativa, y que la posología más adecuada es 3-5 veces al día después de las comidas, con una dosis total de 5-10 g diarios (ALHumaid et al., 2022). Las actividades arginolítica y ureolítica de la microbiota oral se traducen en la producción de amonio, una base con capacidad tampón que puede neutralizar los ácidos, y en consecuencia se han relacionado con una menor incidencia de caries tanto en niños como en adultos (Moncada et al., 2015; Reyes et al., 2014). Las personas que no tienen caries incluso a pesar de tomar azúcares y de no mantener una higiene oral adecuada, aparentemente inmunes a la enfermedad, tienen niveles más altos de bacterias con esta actividad que las personas con caries activas (Moncada et al., 2015; Nascimento et al., 2009; Reyes et al., 2014). Por este motivo, se ha declarado que la arginina puede ser un agente importante de prevención de caries (Nascimento, 2018). La estrategia obvia sería incorporar arginina o urea en los productos de higiene oral para que actúen como un prebiótico (Bijle et al., 2019; Liu et al., 2012b; Santarpia et al., 2014). La arginina incorporada en pastas de dientes alcaliniza la cavidad oral, disminuye la acidogenicidad de la placa, reduce la tasa de desmineralización del esmalte y restringe el número de caries y su progresión, de forma más eficaz que las pastas de dientes fluoradas convencionales (Cantore et al., 2013; Wolff et al., 2013), aunque la mayoría de los estudios que avalan esta propuesta deben interpretarse con cautela porque tienen sesgos considerables (Bijle et al, 2020). Introducción 55 La inmunización contra la caries se dirige a los factores involucrados en la adhesión y la proliferación bacterianas, pero la naturaleza polimicrobiana de las lesiones y la variabilidad intere intraindividual hacen muy difícil la elaboración de una vacuna efectiva. Las vacunas actuales, basadas en los antígenos de superficie de S. mutans son poco eficaces, probablemente por la escasa representación de esta especie bacteriana en el conjunto del microbioma de las lesiones de caries (Mira, 2018; Simón-Soro et al., 2013a; Simón-Soro et al., 2014; Simón-Soro & Mira, 2015). En 2021, la 74th World Health Assembly (OMS, 2021) aprobó una resolución sobre salud oral en la que se recomendó abandonar la tradicional lógica curativa y adoptar una estrategia de promoción preventiva. En este sentido, se ha sugerido que deberíamos tratar de modular el biofilm dental, mediante antimicrobianos a baja dosis o antimicrobianos “inteligentes” dirigidos solo a especies seleccionadas, y promover el crecimiento de bacterias beneficiosas mediante el uso de prebióticos y probióticos (Sanz et al., 2017; Liu et al., 2018). 1.2. LOS PROBIÓTICOS 1.2.1. Probióticos y disbiosis oral Los probióticos son microorganismos vivos que administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del hospedador (FAO/WHO, 2002). Su mayor potencial se focaliza en el manejo de enfermedades multifactoriales como la caries, al abordar la interfaz hospedador-microbioma para restaurar la homeostasis de manera más efectiva que los tratamientos convencionales (Allaker & Stephen, 2017). Las bacterias probióticas pueden producir un amplio rango de compuestos con actividad antimicrobiana como ácido láctico, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas (proteínas o péptidos extracelulares producidos por bacterias que inhiben el crecimiento de ELIANE GARCÍA MATO 56 bacterias similares o de cepas taxonómicamente cercanas a las que las producen), que reducen los niveles de S. mutans en la saliva y en la superficie del diente (Lodi et al., 2015). En los últimos años se han comercializado numerosos probióticos dirigidos al mantenimiento de la salud oral (Terai et al., 2015), fundamentalmente de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (Haukioja, 2010; Wasfi et al., 2018), con actividad inhibitoria frente a S. mutans y consecuentemente con un potencial efecto anti-caries (Nikawa et al., 2004; Caglar et al., 2006; Stecksén-Blicks et al., 2009; Campus et al., 2014; Nishihara et al., 2014) (Tabla 1). Uno de los principales inconvenientes que presentan los Lactobacillus spp. es su limitada capacidad de asentamiento en la cavidad oral, sustancialmente menor que la de los Streptococcus spp. (Marttinen et al., 2012), aunque la potencialidad anti-caries de estos últimos se ha evaluado con mucha menor frecuencia (Seminario et al., 2017) (Tabla 2). Tabla 1. Efecto de los probióticos orales sobre el crecimiento de Streptococcus mutans Referencias Cepa Vehículo Grupo de estudio edad* (n) Período de admon. S. mutans (UFC/ml) Juneja et al., 2012 L. rhamnosus HCT 70 Leche 12-15 (40) 3 s Reducción Cildir et al., 2012 L. reuteri †PTA 5289 L. reuteri DSM 17938 Tableta 4-12 (19) 25 d Similar Taipale et al., 2013 B. animalis BB-12 Tableta 2-24 (160) 14 m Similar Sudhir et al., 2012 L. acidophilus Cuajada 10-12 (40) 30 d Reducción Mortazavi et al., 2012 L. casei Queso 18-37 (60) 2 s Reducción Keller et al., 2012 L. reuteri †PTA 5289 L. reuteri DSM 17938 Tableta 26** (18) 2 s Similar Stensson et al., 2014 L. reuteri DSM 55730 Gotas 1-12 m (113) 1 m Similar Nishihara et al., 2014 L. salivarius WB21 L. salivarius TI 2711 Tableta 22-26 (64) 2 s Reducción Introducción 57 Referencias Cepa Vehículo Grupo de estudio edad* (n) Período de admon. S. mutans (UFC/ml) Teanpaisan et al., 2014 L. paracasei SD1 Leche 18-25 (40) 1 m Reducción Ghasemi et al., 2017 L. acidophilus †4356 B. bifidum †29521 Yogurt 19-27 (50) 1 m Reducción Villavicencio et al., 2018 L. rhamnosus B. longum Leche 3-4 (363) 9 m Reducción Koopaie et al., 2019 Bac. coagulans Snack 15-73 (40) 1 s Similar Manmontri et al., 2019 L. paracasei SD1 Leche 1-6 (268) 6 m Reducción Javid et al., 2019 B. lactis Bb12 Yogurt 18-30 (66) 15 d Reducción Kavitha et al., 2019 L. salivarius subs. salicinius AP-32 L. paracasei ET-66 L. plantarum LPL28 Pastilla 6-12 (179) 1 m Reducción Ferrer et al., 2020 S. dentisani 7746 Gel 18-65 a (59) 1 m Reducción Bolla et al., 2022 L. reuteri UBLRU-87 B. bifidum UBBB-55 Yogurt 6-14 a (60) 14 d Reducción Krupa et al., 2022 L. acidophilus R 0052 L. rhamnosus R 0011 B. longum R 00175 Bac. coagulans SNZ Sacch. boulardii Polvo 5-12 a (10) >60 a (10) 14 d Reducción Janiani et al., 2022 Yakult L. casei shirota (LCS) Enkor-D L. acidophilus UBLA-34 L. salivarius UBLS-22 L. rhamnosus UBLR-58 L. paracasei UBLPc-35 L. plantarum UBLP-40 L. reuteri UBLRu-87 Leche Polvo 3-6 a (30) 7 d Reducción edad*: edad en años; (n): número de participantes; admon.: administración; UFC: Unidades Formadoras de Colonias; L: Lactobacillus; †: ATCC; B: Bifidobacterium; S: Streptococcus; Bac.: Bacillus; Sacch.: Saccharomyces; **edad media; m: meses; s: semanas; d: días ELIANE GARCÍA MATO 64 Actinomyces oris, por lo que se sugirió que S. oralis puede ser eficaz para mantener la homeostasis del bifilm oral (Thurnheer & Belibasakis, 2018). S. oralis (cepa KJ3) se ha utilizado en combinación con S. uberis (cepa JH145) y con S. rattus en forma de probiótico oral liofilizado (ProBiora3®), y se ha demostrado que éste se activa en contacto con la saliva, se adhiere a las superficies de los dientes y de la encía, y las colonias bacterianas que lo integran se multiplican y compiten por los nutrientes favoreciendo el restablecimiento del equilibrio microbiano (Zahradnik et al., 2009).  Streptococcus oligofermentans El primer Streptococcus spp. descrito con capacidad inhibitoria demostrada sobre S. mutans fue S. oligofermentans (Tong et al., 2003). Se trata de un S. no-mutans que se aisla frecuentemente en individuos libres de caries y cuyo mecanismo de acción se fundamenta en la producción de peróxido de hidrógeno, particularmente por la acción de la enzima lactato oxidasa, ya que el ácido láctico está íntimamente asociado al proceso de cavitación de la caries (Tong et al., 2007). Aunque inicialmente se sugirió que el efecto inhibitorio de S. oligofermentans y de S. mutans en cocultivo simultáneo era recíproco (Tong et al., 2007), en estudios posteriores de competencia interespecie se demostró que dicha inhibición puede verse alterada por factores ambientales, tales como el orden de la colonización de cada especie bacteriana, el tipo de carbohidratos del sustrato y el pH (Liu et al., 2012a). Los ensayos de competencia realizados in vitro utilizando placas de Petri con agar deben interpretarse con cautela, ya que no Introducción 65 reproducen la relación interespecie que existe en el biofilm y el crecimiento bacteriano es limitado a pH ácido -que es el que representa las condiciones en las que se origina la caries- (Liu et al., 2014). En un estudio de competencia en el que se inocularon S. oligofermentans y S. mutans solos y en cocultivo a pH neutro y ácido (5.5), se concluyó que S. oligofermentans inhibe el crecimiento de S. mutans independientemente del pH y que la producción de peróxido de hidrógeno tanto del monocultivo como del cocultivo era significativamente mayor a pH ácido que a pH neutro. En consecuencia, se propuso que S. oligofermentans podía ser un candidato probiótico eficaz contra la caries (Bao et al., 2015). Para analizar la influencia de los factores ambientales en la competencia entre S. oligofermentans y S. mutans se cultivaron en un modelo de biofilm modificando el orden de incorporación de ambas especies bacterianas, la composición de azúcares del sustrato y el pH. Cuando se inoculó primero S. oligofermentans, se inhibió claramente el crecimiento de S. mutans y se redujo significativamente la producción de ácido láctico -en base a la producción de peróxido de hidrógeno-, independientemente de los azúcares y del pH. Sin embargo, cuando se inoculó primero S. mutans, el nivel de inhibición por parte de S. oligofermentans fue significativamente menor y dependió del suministro de azúcar y de las condiciones de pH. En conclusión, los autores confirmaron que la inhibición de S. oligofermentans está condicionada por factores ambientales (Bao et al., 2017).  Streptococcus salivarius El potencial inhibitorio de S. salivarius frente a S. mutans se planteó hace casi 40 años (Tanzer et al., 1985), y se considera una ELIANE GARCÍA MATO 66 importante fuente de probióticos eficaces y capaces de fomentar una microbiota oral más equilibrada y asociada a la salud (Wescombe et al., 2009). S. salivarius K12, un colonizador natural de la boca y de las vías aéreas superiores, fue la primera cepa probiótica identificada, a la que se atribuyen efectos inmunomoduladores, en la prevención del cáncer, antiinflamatorios y antibacterianos. En los últimos años se ha ampliado su espectro de acción, demostrando su eficacia para combatir la halitosis (Zupancic et al., 2017; He et al., 2020), las infecciones bacterianas faringoamigdalares Marini et al., 2019) y su potencial para el manejo “in situ” de infecciones multirresistentes o para reconstitiuir la microbiota endógena con fines profilácticos (Hols et al., 2019). Otra cepa de S. salivarius particularmente relevante es la M18, cuya característica diferencial más importante con respecto a la cepa K12 es que produce un gran repertorio de bacteriocinas como las salivaricinas A, M, MPS y 9, que combaten determinadas especies bacterianas asociadas a la caries (Wescombe et al., 2006, 2011). Además, el M18 después de colonizar la mucosa oral produce las enzimas dextranasa y ureasa, que ayudan a reducir la acumulación de placa dental y la acidificación del medio (Burton et al., 2011; Hale et al., 2012). En ensayos clínicos realizados en niños, se ha demostrado que tras la administración de M18 durante 3 meses se reduce significativamente el acúmulo de placa dental y la concentración de S. mutans (Burton et al., 2013), así como el desarrollo de nuevas lesiones de caries por la acción de las bacteriocinas que antagonizaron a las bacterias acidogénicas de la placa dental (Di Pierro et al., 2015). El perfil de seguridad de la cepa M18, sin genes de resistencia antibiótica ni determinantes de virulencia, lo convierte en un probiótico más seguro incluso que la cepa K12 -el prototipo de probiótico de S. salivariuspara su aplicación en humanos (Hale et al., 2022). Introducción 67 La cepa JH del S. salivarius tiene una actividad anti-S. mutans más potente que la cepa K12, por lo que se ha sugerido su aplicación como un probiótico oral, dentro de la estrategia de prevención de caries (Walker et al., 2016). La acción antimicrobiana de la cepa JH se fundamenta en la síntesis de numerosas bacteriocinas como salivaricina A3, salivaricina E, estreptina, y estreptococcina SA-FF22 (Poorni et al., 2019; Suryakant, 2015). Además, esta cepa produce dextranasa, una enzima que hidroliza el dextrano, un importante componente de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares de la placa dental, lo que se traduce en una potente acción inhibitoria frente a S. mutans superior a la de otras bacteriocinas (Wescombe et al., 2006). Otras cepas de S. salivarius con potencial probiótico son la LAB813, que se aisló en la placa dental de niños con buena salud oral y libres de caries (Gong et al., 2019) y la 24SMB, que tiene actividad frente al S. beta-hemolítico del grupo A, principal patógeno responsable de las infecciones de las vías aéreas superiores (Andaloro et al., 2019).  Streptococcus spp. con actividad arginolítica Una forma de incrementar el pH del biofilm oral para crear un ambiente básico es mediante la producción de amonio (NH3). Algunas bacterias orales pueden producir amonio catabolizando la arginina por la vía del sistema arginina-deaminasa (Huang et al., 2012b; Huang et al., 2015), regulando de esta forma el pH de la placa dental y dificultando el desarrollo de la caries (Nascimento & Burne, 2014; Zheng et al., 2017). La actividad del sistema arginina-deaminasa es significantemente mayor en la saliva y en la placa dental de individuos libres de caries que en los que presentan caries activas (Nascimento et al., 2009); en niños, esta actividad es independiente del estado de caries y del tipo de dentición (Nascimento et al., 2012). ELIANE GARCÍA MATO 68 La expresión de los genes que regulan el sistema argininadeaminasa varía con determinadas condiciones ambientales como el pH, la concentración de oxígeno, la disponibilidad de carbohidratos y la presencia de arginina, y se ha detectado una importante variabilidad intrae interespecies (He et al., 2016; Huang et al., 2018). La mayoría de las bacterias orales arginolíticas son colonizadores primarios de la placa dental entre los que se incluyen: S. sanguinis, S. gordonii, S. ratti, S. parasanguinis, S. intermedius, S. australis y S. cristatus (Huang et al., 2015; Huang et al., 2018). En estudios de competencia en placas de agar, se ha demostrado que las bacterias arginolíticas inhiben el crecimiento de S. mutans cuando se inoculan antes o simultáneamente a estas últimas. Uno de sus principales mecanismos de acción es la producción de H2O2 (Kreth et al., 2011), bien por la vía piruvato oxidasa que es la preferente para S. sanguinis y S. gordonii (Kreth et al., 2005; Kreth et al., 2008) o bien por la vía lactato oxidasa en algunas cepas de S. gordonii y S. cristatus (Huang et al., 2018).  Streptococcus rattus JH145 S. rattus JH145 es una subespecie de S. mutans que, comparado con él, produce sólo un 3% de ácido láctico, como consecuencia de una delección en el gen estructural de la enzima lactato deshidrogenasa. Además, mediante un mecanismo de exclusión, compite con S. mutans por los puntos de adhesión a la superficie del diente, por los nutrientes y por otros agentes que participan en el proceso de colonización de la placa dental. Se trata de un microorganismo no patógeno, sin capacidad para transferir genes de resistencia, cuya administración no altera la microflora oral y que es sensible a la mayoría de los antibióticos comúnmente utilizados para el tratamiento de infecciones por Gram-positivos, confirmando su perfil de seguridad para que pueda suministrarse como un probiótico Introducción 69 oral. La administración de S. rattus JH145 en forma de colutorio, ha demostrado que reduce los niveles de microorganismos cariogénicos y consecuentemente el riesgo de caries (Hillman et al., 2009).  Streptococcus dentisani S. dentisani es un nuevo streptococci α-hemolítico, Grampositivo, filogenéticamente próximo a S. oralis y a S. mitis -aunque con un perfil metabólico diferente como su actividad α-galactosidasa-, que se ha aislado en superficies dentarias libres de caries (CameloCastillo et al., 2014). Posteriormente, en base a los resultados del análisis filogenético del genoma completo, se renombró como Streptococcus oralis subsp. dentisani comb. nov. (Jensen et al., 2016). S. dentisani se detecta en la mayoría de las muestras de placa dental de individuos libres de caries, tiene una distribución global y se ha demostrado que no produce metabolitos secundarios tóxicos (López-Santacruz et al., 2021). Además, se le atribuye una acción probiótica, inhibiendo el crecimiento de algunos patógenos orales por la acción de bacteriocinas y neutralizando el pH ácido (López-López et al., 2017). En un ensayo clínico piloto, se demostró que S. dentisani es capaz de colonizar transitoriamente la cavidad oral y de amortiguar el pH oral, especialmente después de administrar dosis múltiples (Ferrer et al., 2020a). La cepa probiótica S. dentisani 7746 demostró su efecto inhibitorio frente a S. mutans procedente de muestras de saliva de individuos sanos, siempre que el número de colonias del test sea bajo o la concentración de bacteriocinas sea elevada, por lo que se ha sugerido que puede antagonizar la iniciación y la progresión de la caries dental (Conrads et al., 2019). También se ha demostrado la eficacia antimicrobiana del sobrenadante de los cultivos de S. dentisani frente a microorganismos habitualmente implicados en ELIANE GARCÍA MATO 70 infecciones de conductos radiculares como S. oralis, S. sobrinus, S. salivarius, P. intermedia, y S. mutans (Llena et al., 2019). La aplicación prolongada de un gel buco-adhesivo de S. dentisani 7746 (5 minutos cada 48 horas durante 1 mes), provocó un aumento significativo en los niveles de amonio y calcio salivales, y un cambio beneficioso en la composición bacteriana de la placa dental a partir del día 30, con una reducción de varios patógenos cariogénicos, probablemente como resultado de la producción de bacteriocinas (Ferrer et al., 2020). 1.3. EL SÍNDROME DE DOWN 1.3.1. Definición y prevalencia El Síndrome de Down (SD) es el desorden genético más común en la población mundial. Está ocasionado por la presencia parcial o total de un cromosoma extra en el par 21. El SD es la causa genética más común y reconocible de discapacidad intelectual. Debe su nombre al médico británico John Langdon Down que describió el síndrome en 1866 (Down, 1866). Según la OMS la prevalencia estimada está en torno a 1 caso por cada 1.100 nacidos vivos en todo el mundo, condicionada por la disponibilidad de detección prenatal y el acceso a la interrupción médica del embarazo (Mai et al., 2019; CDR,2020). La frecuencia de gemelos monocigóticos portadores de SD es baja, con 1 caso por cada 1.000 individuos con SD (Santos et al., 2009). Según la base de datos EUROCAT el SD afecta al 11 de cada 10.000 nacidos vivos en Europa, con una tendencia ascendente significativa desde 1990 a 2009 (Loane et al., 2013). Existen variaciones geográficas importantes en la distribución del SD (Tabla 3), probablemente por condicionantes de carácter religioso, cultural y social; por ejemplo, los países europeos Introducción 71 con mayor prevalencia son Irlanda y Malta, donde la interrupción del embarazo por anomalía fetal es ilegal. La esperanza de vida de las personas con SD ha ido aumentando con el tiempo, desde una media de 9 aos en 1929 a 35 años en 1982, 55 años en 2006 (Barnhart & Connolly, 2007) y aproximadamente 60 años en la actualidad (Glasson et al., 2016). Tabla 3. Número de neonatos con trisomía 21 en Europa (1990-2009) País Casos (n) NV (%) MF (%) AP (%) Austria 381 51,4 2,1 46,5 Dinamarca 209 47,4 5,3 47,4 Francia 2.690 25,2 1,7 73,1 Alemania 559 50,5 2,9 46,7 Irlanda 1.369 94,7 5,1 0,2 Malta 166 99,4 0,6 0 Noruega 1.043 70,2 1,7 28,1 Polonia 515 99,6 0,4 0 España 1.357 32,6 0,8 66,6 Suiza 437 23,3 1,6 75,1 Ucrania 195 86,7 1,5 11,8 Reino Unido 4.550 48,8 3,4 49,8 Total 13.471 50,5 2,6 46,9 NV (Nacidos Vivos); MF (Muerte Fetal); AP (Abortos Provocados por anomalía fetal) 1.3.2. Etiología La etiología del SD se atribuye a una tercera copia del cromosoma 21, que puede producirse fundamentalmente por 3 vías (Antonarakis et al., 2020): ELIANE GARCÍA MATO 72 - La trisomía simple del cromosoma 21 es la forma más común, ya que se le imputan el 95% de los casos. El cromosoma extra es de origen materno y se debe a un error en la división celular conocido como “no disyunción durante la meiosis I materna”. Aunque ocurre esporádicamente, el riesgo de tener un niño con SD aumenta en madres de edad avanzada (Thompson, 2019). - El segundo mecanismo etiopatogénico es la translocación, identificada en el 3-4% de los casos. El cromosoma 21 extra se adhiere a otro cromosoma arocéntrico como el 13, el 14, el 15 o el 21. Aproximadamente en 2 de cada 3 casos la translocación desequilibrada es de novo, mientras que en los demás casos uno de los progenitores es portador. La translocación más común implica a los cromosomas 14 y 21 (Wilch & Morton, 2018). - Por último está la trisomía mosaica. El mosaicismo se define como la presencia de dos o más líneas celulares diferentes en un individuo de un solo óvulo fertilizado. En el SD mosaico, no todas las células tienen una copia adicional del cromosoma 21, algunas tienen una línea celular normal de 46 cromosomas y algunas tienen líneas celulares anormales de 47 cromosomas con un cromosoma extra del 21 (Papavassiliou et al., 2015). Clínicamente, la trisomía del 21 y la translocación son indistinguibles. Sin embargo, los pacientes con SD mosaico pueden tener un fenotipo más leve, dependiendo de la extensión y de la distribución tisular de la línea celular con 46 cromosomas. Introducción 73 1.3.3. Manifestaciones sistémicas Las características fenotípicas orofaciales del SD incluyen: ojos pequeños con la apertura palpebral sesgada hacia arriba y hacia afuera, y con pliegue epicántico; las orejas y la boca también son de tamaño reducido; el seno maxilar y el maxilar superior son hipoplásicos en el 90% de los pacientes, y los huesos de la cara son más pequeños que en la población general. Esta condición suele ir acompañada de discapacidad intelectual y demencia de aparición temprana (Hamlett, 2018), enfermedades cardíacas, disfunción tiroidea, obstrucción de las vías aéreas superiores y otras alteraciones respiratorias, trastornos nutricionales (deficiencias de vitamina B y zinc), baja estatura y sobrepeso (Mazurek & Wyka, 2015). El déficit o en su caso el retraso del lenguaje -con un discurso pobre y en ocasiones inteligiblees una de las principales barreras de comunicación e interacción social. En consecuencia, los niños con SD dependen de sus habilidades no verbales durante períodos de tiempo más largos que los niños no sindrómicos (Buckley, 2000; Roberts et al., 2007). La hipotonía muscular generalizada es otro hallazgo habitual en las personas con SD. La pérdida o reducción del tono muscular de la vía aérea superior favorece la aparición de apnea obstructiva del sueño, induce un patrón de respiración oral e incrementa el riesgo de neumonías por aspiración (Esbensen, 2016; Maris et al., 2016). La hipotonía del geniogloso y otros músculos dilatadores de la vía aérea, fomentan los eventos obstructivos y aumentan el riesgo de morbimortalidad en este colectivo (Kim et al., 2014; Song & Pae, 2001), aunque algunos dispositivos ortopédicos pueden ayudar a mejorar la funcionalidad de la musculatura masticatoria y las variables fisiológicas del sueño (Giannasi et al., 2019). ELIANE GARCÍA MATO 80 - Bioquímica salival La población con SD en comparación con la población general, muestra cambios en la proporción de los electrolitos en saliva, con altos niveles de bicarbonato y consecuentemente un incremento del pH (Areias et al., 2011; Areias el al., 2012; Silva et al., 2020; Mbatna et al., 2020; Pinto et al., 2019), circunstancias que podrían reducir el riesgo cariogénico (Culebras et al., 2012; Jain et al., 2010). La IgA protege contra la caries al inhibir la adhesión bacteriana, contribuyendo así al control de la microbiota cariogénica y se ha señalado que los niños con SD tienen concentraciones salivales de IgA más altas que los niños no sindrómicos (Hashizume et al., 2017). - Otros factores Recientemente, Discepolo et al. (Discepolo et al., 2022) registraron un índice CAOD más bajo en individuos con SD que en un grupo de controles no sindrómicos, pero estos resultados se igualaron cuando tuvieron en cuenta variables socioeconómicas. 1.4. STREPTOCOCCUS DOWNII Streptococcus downii sp. nov. es una nueva especie bacteriana aislada recientemente en la placa dental supragingival de un individuo con síndrome de Down libre de caries (Martínez Lamas et al., 2020), que pertenece al género Streptococcus, a la familia Streptococcaceae y al orden Lactobacillales, y que recibió su nombre en honor al médico británico John Langdon Down, que fue quien describió por primera vez este síndrome. Para delimitar los taxones de esta nueva especie bacteriana se ha empleado la taxonomía polifásica, basada en estudios morfológicos, de fermentación de azúcares y bioquímicos clásicos, junto con un abordaje genético analizando los genes 16S y 23S ARNr y el core- Introducción 81 genoma. Asimismo, tras secuenciar el genoma del nuevo microorganismo, se cálculo el valor de la identidad nucleotídica media (ANI) y el porcentaje de hibridación ADN-ADN estimada in silico (IsDDH). Posteriormente, se procedió a la anotación completa del genoma, realizando además un análisis bioquímico in silico e identificando las rutas metabólicas que diferencian la nueva especie bacteriana de otras especies del género Streptococcus pertenecientes al grupo mitis/oralis (Martínez Lamas et al., 2020). S. downii es un coco alfa-hemolítico esférico que se dispone en cadenas, Gram-positivo, inmóvil, no formador de esporas. Produce ácido a partir de D-glucosa, D-fructosa, D-galactosa, D-manosa, Nacetilglucosamina, maltosa, sacarosa, lactosa y rafinosa. La prueba de Voges-Proskauer, la de la hidrólisis de esculina y la de la hidrólisis de hipurato resultaron negativas. Esta nueva especie bacteriana difiere bioquímicamente de otras especies estrechamente relacionadas pertenecientes al grupo mitis/oralis en la produccin de αgalactosidasa, β-galactosidasa y N-acetil-β-d-glucosaminidasa, así como en la ausencia de arginina dihidrolasa/deiminasa y de proteasa IgA1. Este microorganismo crece en un rango de temperatura de 25 a 40°C (temperatura óptima de crecimiento, 37°C) y en un rango de pH de 4,5 a 8 (pH óptimo, 7,0) (Martínez Lamas et al., 2020). Para identificar su potencialidad como probiótico, se realizaron estudios de competición e interferencia bacteriana que confirmaron su efecto inhibitorio sobre determinados patógenos orales. Concretamente, S. downii demostró capacidad inhibitoria frente a S. mutans, Actinomyces naeslundii, Veillonela parvula y Agregatibacter actinomycetemcomitans, tanto en el crecimiento en placa (Martínez Lamas et al., 2020) como en un modelo de biofilm in vitro (Cuenca et al., 2021). ELIANE GARCÍA MATO 82 También se han analizado los posibles mecanismos involucrados en la inhibición de S. mutans frente a S. downii, habiéndose descartado la competencia por el sustrato (en base al consumo de glucosa y proteínas disponibles en el medio de cultivo), la disminución del pH, la producción de peróxido de hidrógeno o de ácidos orgánicos de cadena corta, y los cambios en el perfil peptídico del halo de inhibición (Martínez Lamas et al., 2023). En consecuencia, la opción más probable resultó la producción de bacteriocinas de naturaleza peptídica con actividad antimicrobiana, una hipótesis sustentada en el hecho de que el efecto inhibitorio de S. downii se redujera significativamente tras la suplementación con proteinasa K y por la identificación, en el genoma bacteriano, de genes relacionados con la familia de bacteriocinas de clase IIb lactobiocin A/cerein 7B (Martínez Lamas et al., 2020). Esta nueva especie bacteriana está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y en la Colección de Cultivos de la Universidad de Gotemburgo, con números de acceso CECT= 9732T y CCUG=73139T, respectivamente. 2. Justificación y Objetivos 85 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Los conocimientos adquiridos sobre el microbioma humano han aumentado exponencialmente en la última década, desvelando el papel de los componentes de la flora oral en situaciones de salud y enfermedad, y con ello determinando que tanto la caries como la enfermedad periodontal - las enfermedades infecciosas orales más prevalentesson el resultado de una alteración de la homeostasis microbiana (disbiosis) del biofilm oral. Se ha sugerido que la modificación de la microbiota empleando microorganismos con características probióticas permite amortiguar la susceptibilidad a la patología oral de etiología infecciosa, impidiendo la colonización del microbioma oral por microorganismos patógenos. El éxito de un microorganismo como probiótico para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas orales está condicionado por su capacidad para adherirse a la mucosa oral y a los tejidos duros del diente, para integrarse en el biofilm oral y para competir con los patógenos orales. En este contexto, se ha constatado la existencia de una pequeña proporción de la población humana adulta que nunca ha padecido caries, lo cual podría estar relacionado, entre otros factores, con la presencia de especies bacterianas comensales con efecto antagonista frente a bacterias cariogénicas, constituyendo en consecuencia una fuente potencial de microorganismos con propiedades probióticas. Lamentablemente, las limitaciones actuales en el conocimiento taxonómico del microbioma dificultan la identificación y la caracterización de microorganismos con propiedades probióticas. ELIANE GARCÍA MATO 86 La caries dental es la enfermedad no-transmisible más prevalente a nivel global, ya que se estima que 2.300 millones de personas tienen caries en los dientes permanentes y más de 530 millones de niños en los dientes temporales (GBD, 2017). Aunque en el desarrollo de la caries intervienen factores genéticos, microbianos, inmunológicos, conductuales y ambientales, las técnicas de secuenciación masiva han permitido establecer que la caries es una expresión de disbiosis del microbioma oral (Mira et al., 2017). Sin embargo, tradicionalmente se ha considerado que el agente etiológico primordial es una comunidad polimicrobiana compleja en la que tiene un papel especialmente relevante el Streptococcus mutans (Gross et al., 2012). Paradójicamente, se han identificado algunas especies bacterianas que inhiben el crecimiento de S. mutans, participan en la homeostasis del biofilm oral y en consecuencia exhiben cierta potencialidad anticaries. Entre estas especies se incluyen algunos estreptococos productores de peróxido de hidrógeno como S. oligofermentans (Tong et al., 2007) y S. A12 (Huang et al., 2016), estreptococos arginolíticos como S. gordonii, S. sanguinis, S. parasanguinis, S. australis y S. cristatus (Huang et al., 2018), estreptococos productores de bacteriocinas y sustancias inhibidoras bacteriocina-like como S. salivarius (Wescombe et al., 2012), y estreptococos que combinan varios de estos mecanismos de acción como S. dentisani que produce bacteriocinas y tiene actividad arginolítica (Camelo-Castillo et al., 2014; López-López et al., 2017). Un hallazgo singular en el SD -la anomalía cromosómica más comúnes que los niveles de caries en niños y adolescentes son menores que en la población general no sindrómica (Deps et al., 2015; Moreira et al., 2016; Robertson et al., 2019; Silva et al., 2020), si bien la calidad de la evidencia disponible no permite realizar una inferencia definitiva (Bhoopathi et al., 2021). Con este argumento, en la Unidad de Justificación y objetivos 87 Odontología para Pacientes con Necesidades Especiales de la Universidad de Santiago de Compostela, se planteó analizar la flora oral de un grupo de pacientes con SD sin evidencia clínica de caries, para buscar cepas bacterianas con efecto antagónico frente a S. mutans, lo que permitió la identificación de una nueva especie que se denominó Streptococcus downii sp. nov. (Martínez-Lamas et al., 2020). El objetivo principal de este trabajo fue determinar la prevalencia de S. downii en la cavidad oral de personas con SD y en la población general. Como objetivo secundario se planteó investigar si existía una correlación clínico-microbiológica entre la prevalencia de caries y/o de enfermedad periodontal, y la detección de S. downii. 3. Material y Métodos ELIANE GARCÍA MATO 96 ORF Cóntigo ORF Inicio ORF Fin Hebra Descripción GO IDs Nombre GO gen_01111 contig_8 277351 277698 - Tiol reductasa tiorredoxina C:GO:0005623 F:GO:0009055 F:GO:0015035 P:GO:0022900 P:GO:0030152 P:GO:0045454 gen_00657 contig_6 307826 309934 - Proteína de la membrana integral asociada a la bacteriocina C:GO:0016021 C: componente integral de la membrana gen_00673 contig_6 326623 326919 - Proteína de inmunidad bacteriocina gen_00402 contig_6 58328 58624 - Proteína de inmunidad bacteriocina gen_01818 contig_9 605338 606096 + Proteína transportadora de ATP de bacteriocina ABC F:GO:0005524 F:GO:0016887 ORF: marco de lectura abierta; Contig: cóntigo; GO ID: Identificación según ontología genética Material y métodos 97 Figura 1. Secuencia de ADN de S. downii donde se indica la posición de los cebadores (marcados en verde) y las dos predicciones de los marcos de lectura abiertos de las bacteriocinas codificadas en este fragmento (marcadas en azul y amarillo) Fuente: Selección de la secuencia de un fragmento de ADN efectuada por la doctoranda, a partir del genoma completo de S. downii, disponible en la base de datos de secuencias genéticas de disponibilidad pública GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MZNX00000000.1?report=genbank). Mediante una amplificación parcial del gen ARNr 16S, se realizó un ensayo de especificidad sobre ADN de 7 especies bacterianas relacionadas con S. downii (S. mitis, S. salivarius, S. dentisani 8313, S. dentisani 8312, S. mutants, S. sobrinus y S. sanguinis DSTIZ 20567), incluyendo un control interno de reacción. Se demostró que los cebadores diseñados eran específicos para S. downii y amplificaban una región incluida en el operón de bacteriocina de 271 pares de bases (Figura 2a). Sobre una cantidad fija de ADN bacteriano (1 ng) se hicieron diluciones seriadas del ADN de S. downii (rango del factor de dilución: 5-390625). El límite inferior de detección fue de aproximadamente 1,63 pg, que corresponden a 736 equivalentes genómicos de ADN de S. downii (Figura 2b). ELIANE GARCÍA MATO 98 Figura 2a. Ensayo de especificidad utilizando cebadores específicos para el operón de bacteriocina de Streptococcus downii (St.1: S. mitis; St.2: S. salivarius; St.3: S. dentisani 8313; St.4: S. dentisani 8312; St.5: S. mutants; St.6: S. sobrinus; St.7: S. sanguinis DSTIZ 20567; St.8: S. downii) Figura 2b. Ensayo de sensibilidad utilizando cebadores específicos para el operón de bacteriocina de Streptococcus downii (St.1: 460,000 copias, 1 ng de ADN bacteriano; St.2: 92,000 copias, 2x10-1 ng; St.3: 18,400 copias, 4x10-2 ng; St.4: 3,680 copias, 8x10-3 ng; St.5: 736 copias, 1.6x10-3 ng; St.6: 147.2 copias, 3.2x10-4 ng; St.7: 29.44 copias, 6.24x10-5 ng; St.8: 5.888 copias, 1.28x10-5; St.9: 1.1776 copias, 2.56x10-6; St.10: no se incluyó ADN de S. downii) 3.4. VALIDACIÓN DE LA PCR ESPECÍFICA Para validar la PCR cuantitativa mediante sondas Taqman específicas para la detección y cuantificación de una región del gen de ARN 16S bacteriano y de una secuencia próxima a un gen de bacteriocina de S. downii, se analizaron 4 muestras de placa dental supragingival sembradas con S. downii a 3000 UFC/ml. Para procesar las muestras primero se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 minutos; se utilizaron 250 µl para la resuspensión de las bacterias y la extracción de ADN utilizando el kit QiaAmp DNA mini blood (Qiagen, Alemania). El volumen de elución de la columna era de 100 µl, por lo que la concentración de ADN fue de 30 Equivalentes Genómicos de S. downii (EG)/µl. Se realizó la amplificación a tiempo real utilizando un Material y métodos 99 duplicado para cada muestra. Para realizar el ensayo se utilizó un volumen de 2 µl por muestra. Para proceder a la cuantificación se incluyó una curva de ADN patrón de S. downii obtenida con el mismo kit de purificación; en la curva se incluyeron 6 determinaciones correspondientes a diluciones seriadas a 1/5 partiendo de 92,000 EG hasta alcanzar 29 EG. En la tabla 5 se muestran los valores medios del ciclo umbral (Cq, por su acrónimo en inglés) y las concentraciones medias alcanzados para los genes diana (bacteriocina) y control (16S ARNr), estimados a partir de la curva patrón obtenida por dilución de ADN bacteriano de S. downii cuantificado mediante fluorimetría (Figura 3). Los EG detectados de S. downii se aproximaron a las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) sembradas en las muestras, con una media de 24 EG/µl. Tabla 5. Valores del ciclo umbral (Cq) y equivalentes genómicos de S. downii (EG)/µl para los genes diana (bacteriocina) y control (16S ARNr), de muestras de placa dental supragingival sembradas con S. downii a 3000 UFC/ml Gen 16S ARNr bacteriano Gen bacteriocina de S. downii Muestra Cq media EG/µl Cq media EG/µl 1. Placa dental 14,05 555.000 32,40 17 2. Placa dental 21,12 13.915 21,06 41 3. Placa dental 16,69 140.250 31,89 24 4. Placa dental 18,31 60.350 32,79 14 ELIANE GARCÍA MATO 100 Figura 3. Curvas de amplificación obtenidas para los genes diana (bacteriocina) y control (16S ARNr) de la muestra (1) de placa dental La cantidad de EG bacterianos obtenido mediante la amplificación de una región del gen 16S ARNr fue variable, aunque constatamos una cierta correlación entre la masa de la muestra después de la centrifugación y los equivalentes genómicos de S. downii. Por ejemplo, la muestra (1) de placa dental era la de mayor masa y la que tenía niveles más altos de EG/µl para el gen 16S ARNr. Aunque la sensibilidad de detección de S. downii podría disminuir cuando hay una gran cantidad de otras bacterias presentes en la muestra, el número limitado de especímenes incluidos en este experimento de validación (n= 4) no permite establecer niveles de significación estadística y no podemos descartar que las diferencias detectadas obedezcan al propio proceso de manipulación de las muestras. Con este resultado se dio por validada la muestra y a continuación se aplicó esta técnica de detección de bacteriocina específica de S. downii a las 200 muestras procedentes de pacientes con SD y a las 100 correspondientes al GC. Material y métodos 101 3.5. PREVALENCIA DE S. DOWNII EN METAGENOMAS DE PLACA SUPRAGINGIVAL DEL PROYECTO MICROBIOMA HUMANO Como no existía una técnica gold standard para la detección de S. downii y la sensibilidad de la qPCR no se había calculado hasta este momento en estudios poblacionales, se planteó otro método de detección que permitiera efectuar validaciones cruzadas y en consecuencia garantizar la fiabilidad de los resultados. El genoma humano solo contiene ~20.000 genes que codifican proteínas, un número parecido al de la mosca de la fruta. Sin embargo, los microbios que viven dentro de nuestro cuerpo y sobre la piel (la microbiota) superan en número a nuestras células somáticas y germinales en aproximadamente 10 veces, y se estima que el número de genes asociados a los genomas de nuestros simbiontes microbianos (el microbioma) están en el orden de 2-20 millones (Turnbaugh et al., 2007). El Proyecto Microbioma Humano nació en 2007 como una extensión del Proyecto Genoma Humano, a propuesta del Instituto Nacional de Salud de EE.UU., con 3 objetivos: (1) Aprovechar las nuevas tecnologías de secuenciación masiva para caracterizar el microbioma humano, analizando muestras procedentes de diferentes localizaciones en al menos 250 voluntarios sanos; (2) Determinar si existen asociaciones entre los cambios del microbioma y los estados de salud/enfermedad, estudiando para ello diferentes entidades patológicas; (3) Proporcionar una base de datos estandarizada y nuevos enfoques tecnológicos que puedan resultar de utilidad para la comunidad científica (NIH HMP Working Group, 2009). En el marco del Proyecto Microbioma Humano se planteó crear la base de datos del microbioma oral humano, con el fin de proporcionar a la comunidad científica un repositorio específico para albergar las más de 600 especies procariotas presentes en la cavidad oral humana en base a la secuencia del gen 16S ARNr e incorporar nuevas secuencias a medida que estas estén disponibles; además, la ELIANE GARCÍA MATO 102 base de datos proporciona una herramienta básica de alineamiento de secuencias (BLAST, por su acrónimo en inglés), para hacer coincidir las secuencias del gen 16S ARNr del usuario con un conjunto de datos de referencia del gen 16S ARNr ensamblado y de longitud completa (Chen et al., 2010). Para evaluar la prevalencia de S. downii en la placa supragingival de individuos sanos, comparamos el genoma completo ensamblado de S. downii (cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo [CECT] con el número 9732T y en la Colección de Cultivos de la Universidad de Gotemburgo [CCUG] con el número 73139T) con los metagenomas de placa dental depositados en los archivos del Proyecto Microbioma Humano (NIH Human Microbiome Project). De los 217 metagenomas iniciales se seleccionaron 127 que se encontraban ensamblados, generados por técnicas de secuenciación del genoma completo y anotados como provenientes de placa supragingival. Para determinar la presencia de S. downii en cada metagenoma se calculó la identidad nucleotídica media (ANI, por sus siglas en inglés) entre el genoma de S. downii y cada metagenoma, aplicando la estrategia utilizada previamente por López-López et al. (López-López et al., 2017). Los valores de ANI se calcularon utilizando la herramienta NUCmer versión 3.23 -un programa para la alineación del genoma completo por pares- (Kurtz et al., 2004) a través del programa pyani (v0.2.7) (Pritchard et al., 2016). El cálculo se basa en restar el número de errores de similaridad (nonpositive match scores) al largo del alineamiento tal y como describieron Richter y Rosselló-Móra (Richter & Rosselló-Móra, 2009), en base al cual un ANI >94% sería un umbral plausible y lo suficientemente estrecho para ayudar a circunscribir las especies procarióticas (al menos 20 secuencias de una longitud mayor o igual a 100 pb). Material y métodos 103 Aplicando los mismos criterios que López-López et al. (2017), se consideró que S. downii estaba presente en el metagenoma solo cuando la homología de nucleótidos con respecto al con los ORF que codifican bacteriocinas de clase IIb lactobiocin A/cerein 7B era >99%. Para confirmar la presencia de genes ortólogos relacionados con bacteriocinas se utilizó el método Blast Best Reciprocal Hits (BBRH), que básicamente consta de 4 pasos: 1. Se realiza una búsqueda BLAST para cada proteína codificada en el genoma problema (A) contra una base de datos que consta de todas las proteínas codificadas en el genoma de referencia (B); 2. Se selecciona el resultado con la puntuación más alta para cada proteína; 3. Se efectúa la búsqueda recíproca (una búsqueda BLAST para cada proteína en el genoma B contra la base de datos de proteínas en el genoma A) y se selecciona el mejor resultado para cada proteína; 4. Se comparan las listas de los mejores resultados de ambas búsquedas y se definen los BBRH como los pares de proteínas de diferentes genomas que, recíprocamente, muestran mayor afinidad entre sí (Gabaldón, 2008). 4. Resultados ELIANE GARCÍA MATO 112 elevada homología de los ORF relacionados con proteínas accesorias a dicha bacteriocina (Tabla 8), lo que se correspondería con una prevalencia de S. downii de 0,78%. Aunque también se obtuvo un alto grado de homología de los genes relacionados con bacteriocinas en otros 4 metagenomas, en todos ellos el valor de ANI fue <99% (Anexo IV). Tabla 8. Resultados del análisis de los genes relacionados con las bacteriocinas de S. downii presentes en el metagenoma SRS013533, utilizando Blast Reciprocal Best Hits (BRBH) ORF1 Cóntigo (Inicio-Fin) Longitud del alineamiento2 Identidad (%)3 SRS013533_PGA_scaffold_29144 contig_1 (13598-13756) 158 96,835 C5197739 contig_1 (14153-14308) 29 100 SRS013533_PGA_scaffold_37401 contig_1 (15745-17898) 131 96,183 SRS013533_PGA_scaffold_39169 contig_8 (277351-277698) 48 100 ORF: marco de lectura abierta; 1Longitud del alineamiento: cantidad de bases en el alineamiento entre los dos genomas; 2Identidad (%): (longitud del alineamientosimilaridad de errores)/longitud del alineamiento 5. Discusión 115 5. DISCUSIÓN 5.1. HALLAZGOS CLÍNICOS El acúmulo de placa dental visible fue sustancialmente mayor en el grupo SD que en el GC, especialmente en la franja etaria de 16 a 20 años. Goud et al también observaron que el índice de placa en niños con SD de 12 a 16 años era significativamente mayor que en niños más jóvenes (Goud et al., 2021). En general, en la literatura se han reportado valores más altos de placa bacteriana en la población con SD que en la población general, lo que podría condicionar la aparición temprana de la periodontitis y su particular agresividad en estos individuos (Scalioni et al., 2018). Anecdóticamente, algunos autores han detectado menores índices de placa y de sangrado entre los niños con SD, que se han atribuido a colectivos con un especial celo por la aplicación rutinaria de medidas de higiene oral, como una mayor frecuencia de cepillado que los niños no sindrómicos del grupo control (Moreira et al., 2015). Aunque se ha especulado que la combinación de un control pobre de la placa dental y de un sistema inmunológico deficitario podrían promover el desarrollo de caries en individuos con SD, en la presente serie se registró una prevalencia de caries menor en el SD que en el GC, confirmando los resultados de estudios previos (Andreeva, 2020; Areias et al., 2011; Deps et al., 2015; Hashizume et al., 2017; Martins et al., 2022; Moreira et al., 2016; Robertson et al., 2019; Silva et al., 2020). Se ha argumentado que este hallazgo podría deberse al retraso de la erupción dentaria, la microdoncia, las agenesias dentarias y la presencia de diastemas (Vigild, 1986). ELIANE GARCÍA MATO 116 La flora bacteriana desempeña un papel primordial en la etiopatogenia de la caries y se ha demostrado que los niños y adolescentes con SD tienen una menor densidad de S. mutans en muestras de saliva que los controles no sindrómicos (Areias, 2012; Scalioni, 2017). Además, la tipificación molecular de S. mutans mediante reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR, por sus siglas en inglés), reveló que las cepas que colonizan las superficies dentarias tienen perfiles dieferentes –presumiblemente menos cariogénicosen el SD que en los controles no sindrómicos (Cogulu, 2006). Paradójicamente, algunos autores han descrito una experiencia de caries mayor en el grupo SD que en la población general (Oredugba, 2007), especialmente en dentición temporal (Cornejo et al., 1996), pero algunos de estos estudios, entre otras limitaciones, no tienen en cuenta las lesiones iniciales de caries, por lo que sus resultados deben ser interpretados con precaución. En la presente serie la gingivitis y la periodontitis fueron más prevalentes en el SD que en el GC, confirmando que en individuos con SD la inflamación gingival y la enfermedad periodontal se presentan con mayor frecuencia, son de aparición más temprana y son más severas que en la población general (Morinushi 1997; Lopez-Pérez et al., 2002; Sakellari et al., 2005). En algunas series, se ha descrito gingivitis generalizada en casi la mitad de los individuos con SD con edades comprendidas entre 2 y 14 años (Amira et al., 2019), y en esa franja etaria se ha sugerido que la gingivitis aumenta progresivamente con la edad (Morinushi et al., 2006). La aparición de gingivitis en el SD se ha relacionado con su condición inmunológica sistémica comprometida, que favorece la colonización subgingival temprana y el crecimiento de bacterias periodontopatógenas (Scalioni et al., 2018). Discusión 117 En una reciente revisión sistemática, se ha confirmado la asociación entre enfermedad periodontal y SD (Scalioni et al., 2018). Se ha sugerido que la prevalencia de periodontitis en individuos con SD es alta y aumenta con la edad, incluso cuando los padres están particularmente concienciados sobre la importancia de la salud oral de sus hijos (Nuernberg et al., 2019). En el SD, la aparición de periodontitis y su pronóstico se han relacionado con la edad del individuo, su coeficiente intelectuaI y el nivel de educación de sus padres (Al-Sufyani et al., 2014). Se ha sugerido que en estos pacientes el desarrollo de periodontitis obedece a una microbiota subgingival específica (Martinez-Martinez et al., 2013), junto con una respuesta inmune alterada del huésped -inherente al síndrome- (Khocht & Albandar, 2014). Además, recientemente se ha determinado que las personas con SD pueden tener una cierta susceptibilidad genética a la enfermedad periodontal (Fernández et al., 2021). En estudios recientes realizados aplicando secuenciación de nueva generación, se ha demostrado que existen diferencias sustanciales en la composición del microbioma oral entre individuos con SD y no sindrómicos, con una diversidad de especies (diversidad alfa) significativamente más baja y una mayor presencia de patógenos periodontales en el SD (Willis, et al., 2020). Además, en los individuos con SD, el microbioma difiere significativamente entre los que tienen enfermedad periodontal y los que no la tienen (Nóvoa et al., 2020). La influencia de las bacterias con potencialidad anti-caries y anti-periodontitis como S. downii en la composición y la homeostasis del microbioma oral en las personas con SD todavía se desconoce. En la presente serie, el 20% de los individuos con SD tenían al menos una ausencia dentaria, siendo más frecuentes por orden decreciente los segundos premolares superiores, los incisivos laterales ELIANE GARCÍA MATO 118 superiores y los segundos premolares inferiores. En estudios previos se ha reportado una tasa de agenesias dentarias todavía mayor en el SD -aunque en una investigación de carácter transversal es muy difícil establecer la etiología de una ausencia dentaria-, que afecta especialmente a los incisivos laterales superiores (27%), los segundos premolares mandibulares (21%) y los segundos premolares maxilares (18%) (Palaska & Antonarakis, 2016). Coincidiendo con otros autores, los valores medios de los índices cod/CAOD fueron mayores en el grupo SD que en el GC (Deps et al., 2015). Paradójicamente, en la mayoría de los estudios publicados hasta la fecha, los individuos con SD tenían un índice CAOD medio significativamente más bajo que los individuos del grupo control (Andreeva, 2020; Hashizume et al., 2017; Robertson et al., 2019; Silva et al., 2020; Subramaniam and Suresh, 2019). En general, esta discrepancia podría achacarse a la falta de control de factores de confusión como el género, el nivel socioeconómico, los hábitos de higiene bucal y particularmente la edad de los participantes. En nuestra serie, los individuos con SD menores de 15 años tenían valores de cod inferiores a los de los controles no sindrómicos, coincidiendo con estudios previos efectuados en esta franja etaria (Bhoopathi y Tellez, 2021; Martins et al., 2022; Scalioni et al., 2023), presumiblemente como consecuencia de una menor prevalencia de caries. Por el contrario, en la edad adulta, el CAOD se incrementó progresivamente en los individuos con SD, como ya se había señalado previamente en la literatura (Deps et al., 2015; Moreira et al., 2015; Santos et al., 2009; Shukla et al., 2014). Este aumento del índice CAOD en adultos mayores con SD podría explicarse por un incremento del número de ausencias dentarias secundarias a procesos de periodontitis agresiva no tratada (RondónAvalo et al., 2023). Discusión 119 En algunos de los participantes en este trabajo pertenecientes al grupo SD, la falta de colaboración dificultó notablemente la realización del examen oral. En estudios previos, se ha señalado que los padres pueden tener dificultades para realizar los cuidados orales rutinarios en niños con SD, que en ocasiones no es fácil encontrar un dentista especializado y además son conscientes de que en el gabinete dental disminuye su cooperación al aumentar los estímulos sensoriales (Stein et al., 2020). En consecuencia, la frecuencia de cepillado en personas con SD es baja y sólo el 30% completa el tiempo recomendado (Schmidt et al., 2022). Sin embargo, en este colectivo se debe insistir en la introducción temprana de los cuidados de salud oral, ya que se ha demostrado que favorece los resultados de los procedimientos preventivos y de los tratamientos periodontales (Ferreira et al., 2016). 5.2. DETECCIÓN DE LA BACTERIOCINA DE STREPTOCOCCUS DOWNII EN MUESTRAS DE PLACA SUPRAGINGIVAL Las bacteriocinas son pequeños péptidos o proteinas de origen bacteriano que inhiben el crecimiento de otras bacterias, favoreciendo la colonización de la especie productora (Kommineni et al., 2015). Las bacteriocinas de clase IIb están constituidas por dos péptidos (<10 kDa), que actúan aumentando la porosidad de la membrana de las células diana (Nissen-Meyer et al., 2009). S. downii produce una bacteriocina de clase IIb lactobin A/cerein 7B que es termoestable y resistente a la acción de la proteinasa K (Martínez Lamas L. Tesis Doctoral, 2022). Utilizando cebadores específicos para el operón de esta bacteriocina, la prevalencia detectada de S. downii en el presente estudio fue ≤1% tanto en SD como en la población general. Esta escasa prevalencia detectada de S. downii obliga a plantear si existen sesgos potenciales ELIANE GARCÍA MATO 120 metodológicos, para descartar que los resultados estén realmente infraestimados. En la secuencia S. downii MZNX00000000.1 se seleccionó el cóntigo correspondiente a la bacteriocina, para la que se diseñaron cebadores específicos. Se demostró que la PCR para detectar el operón de la bacteriocin era un método específico y sensible, de forma que la especie bacteriana identificada es exclusivamente S. downii y no otras especies filogenéticamente próximas (Martínez-Lamas et al., 2020). La bacteriocina de clase IIb lactobin A/cerein 7B se identificó en las dos cepas de S. downii depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y en la colección Sueca (CCUG), con números de acceso CECT:9732T y CCUG:73139T. Esta podría ser una limitación del estudio, ya que la prevalencia de S. downii podría haberse subestimado, si se confirma que no todas las cepas de S. downii expresan las mismas bacteriocinas ni los mismos clústers de genes relacionados con las bacteriocinas como ocurre con S. dentisani (Conrads et al., 2019). La secuenciación del gen 16S ARNr ha sido con diferencia el marcador genético más utilizado en los últimos años para estudiar la filogenia y la taxonomía bacterianas, aunque no está exento de algunas limitaciones como la similitud de la secuencia entre diferentes especies del género Streptococcus (Janda & Abbott, 2007). Esto obliga a interpretar también con cautela los resultados sobre la distribución de otros estreptococos con actividad inhibitoria de S. mutans como el S. dentisani, que podría haberse sobreestimado ya que se ha identificado en la mayoría de los metagenomas de placa dental almacenados en el Human Microbiome Project (López-López et al., 2017) y en todas las muestras de saliva y placa dental analizadas procedentes de diferentes localizaciones geográficas en todo el mundo (López-Santacruz et al., 2021). Discusión 121 Para aumentar la fiabilidad en la asignación taxonómica a nivel de especie del género Streptococcus en la microbiota salival, se ha sugerido que el análisis mediante MALDI-TOF MS (por las siglas en inglés de MALDI que es la desorción/ionización láser asistida por matriz, TOF que es el detector de iones que se acopla al MALDI y MS que es el espectrómetro de masas), es un método preciso y consistente (Złoch et al., 2020). El empleo de herramientas como el servidor web BAGEL4 permite analizar secuencias de ADN bacteriano (meta-) genómico para identificar bacteriocinas (van Heel et al., 2018) y ya se ha incorporado entre los métodos para analizar clústers de bacteriocinas de S. dentisani (Conrads et al., 2019). 5.3. DETECCIÓN DE STREPTOCOCCUS DOWNII EN METAGENOMAS DE PLACA SUPRAGINGIVAL DEL PROYECTO MICROBIOMA HUMANO De los 217 metagenomas depositados en los archivos del Proyecto Microbioma Humano (NIH Human Microbiome Project), seleccionamos los 127 que estaban ensamblados y provenían de muestras de placa supragingival, aunque no podemos confirmar fehacientemente el origen de sus anotaciones. Para determinar la presencia de S. downii en cada metagenoma, se calculó la identidad nucleotídica media entre el genoma de esta bacteria y los metagenomas de la base de datos. Aunque existe cierta controversia sobre los puntos de corte del ANI, en este trabajo aplicamos criterios muy estrictos (ANI >99%), como ya habían hecho previamente otros investigadores para determinar la prevalencia de S. dentisani (López-López et al., 2017), si bien esta estrategia podría favorecer la infraestimación de la presencia de S. downii. Otras limitaciones metodológicas potenciales derivadas de esta propuesta para detectar S. downii en metagenomas del Proyecto 7. Bibliografía 131 7. BIBLIOGRAFÍA - AAPD. American Academy of Pediatric Dentistry. American Academy of Pediatric Dentistry reference manual 2014-2015. Pediatr. Dent. 2014a;36:1-140. - AAPD. American Academy of Pediatric Dentistry. Guidelines of cariesrisk assessment and management for infants, children and adolescents. Reference Manual 2006-2013. Clinical Guidelines 2014b;35(6):123-130. - AAPD. American Academy of Pediatrics. Policy statement: Breastfeeding and the use of human milk. 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